KR102012755B1 - 세포 내 nadph-의존적 실시간 활성 대사 이미징 방법 및 그 용도 - Google Patents

세포 내 nadph-의존적 실시간 활성 대사 이미징 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 내 NADPH-의존적 실시간 활성 대사 이미징 방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메타게놈 유래 단백질인 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)변이체를 이용하여 세포 내 조효소의 농도 구배 및 변화의 실시간 측정이 가능한 이미징 방법 및 이의 응용 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 실시간 조효소 정량방법은 조효소인 NADP(H)를 초 단위의 실시간으로 정량할 수 있고, 기존 방법의 적용이 제한되는 저온, 산성/염기성 조건에서도 정량이 가능할 뿐만 아니라, 시료에 포함된 조효소의 농도가 낮아도 높은 감도로 정확하고 신속한 정량이 가능하다. 특히, 기존의 정량 시스템과 달리 세포의 파괴 없이 조효소 측정 또는 변환에 필요한 기질을 첨가할 필요도 없고, 형광을 발생하기 위한 특수한 구조(fluorophore) 형성에 소요되는 시간 없이, 무산소 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 증진함으로써 다양한 생체 시료에 포함된 조효소의 이미지화 및 정량이 가능하다. 특히 mBFP 의 내재된 효소활성을 제거하여 불순물에 따른 신호간섭이 없이 다양한 복합조성물을 지닌 생체시료에 직접 적용할 수 있는 안정적인 정량/이미지 기술을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 NADP(H) 이미지 분석법은 다양한 숙주에서 높은 발현율을 나타냄으로, 세포 성장에 저해가 없는 리포터로 채용함으로써, 대사 과정을 실시간으로 확인 가능할 것으로 기대된다.

Description

세포 내 NADPH-의존적 실시간 활성 대사 이미징 방법 및 그 용도{Real-time imaging method of NAPDH-dependent metabolic activity in cell and use thereof}
본 발명은 세포 내 NADPH-의존적 실시간 활성 대사 이미징 방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메타게놈 유래 단백질인 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)을 이용하여 세포 내 조효소의 농도 구배 및 변화의 실시간 측정이 가능한 이미징 방법 및 이의 응용 방법에 관한 것이다.
일반적으로 생체 시스템의 주된 대사 체계는 외부로부터 유입된 영양분의 산화 및 이화 반응에 의한 주요 전구체와 에너지의 생성, 이를 이용한 생체 구성 분자의 합성 과정으로 이루어진다. 이러한 과정에서 생성되어 합성 과정에서 소비되는 생체 에너지의 형태는 전자와 양성자이며, 조효소인 NADP(H) 및 NAD(H)가 주요 전달자로 작용한다.
NADP(H) 및 NAD(H)는 생체 내 필수 요소로, NADPH, NADP+, NADH 및 NAD+는 세포 중심 대사(central pathway)에서 소비/재생되며, 산화/환원 형태로 상호 전환될 수 있는 재생 경로(salvage pathway)를 통해서도 상기 요소 간의 산화/환원 비율이 적절히 조절된다.
생체 세포에서 조효소의 산화/환원 비율은 중요한 생체 활성 지표로의 활용이 가능하며, NADP(H) 및 NAD(H)의 정량을 통해 생체 내 정상적 생리 유지 여부 또는 대사 이상 등을 파악할 수 있다. 이는 시료에서 세포 존재 여부, 수질 분석, 식품 오염 여부를 파악하는 데 중요한 지표가 될 수 있으며, 기타 다른 분야에도 광범위한 응용이 가능하다.
조효소의 정량 측정의 유용성을 활용하기 위해, 현재에도 다양한 조효소 측정 방법이 개발되고 있다. 대표적인 방법으로 NADP(H) 또는 NAD(H)가 지닌 고유의 파장을 이용하여 흡광도 또는 형광을 측정하는 방법이 있으나, 상기 조효소 자체가 지닌 흡광도 및 형광 값이 낮아 순수한 반응 조성에서만 비교적 정확한 측정값을 얻을 수 있는 단점이 있어, 다양한 종류의 시료에 직접적으로 적용하기에 어려움이 있다.
이외의 다른 방법 또한 사용되고 있으나, 조효소의 산화/환원 형태인 NADP+/NADPH, NAD+/NADH를 구분하여 측정하기 어렵고, 채취한 시료에서 조효소 농도가 매우 낮은 경우, 효과적인 측정이 어려운 단점이 있다. 일 예로 NADP(H)와 NAD(H)는 서로 유사한 흡광도 및 형광 값을 가지고 있어, 상호 구분이 어렵고, 시료의 양이 적은 경우 신호 대 잡음비(signal to noise ratio; S/N Ratio)가 낮아져 상호 구분이 매우 어렵다. 또한, 산화된 NADP+는 광학 특성이 상대적으로 좋지 않아, 해당 형태의 조효소 자체의 측정이 쉽지 않다.
종래에 알려진 문제점의 보완을 위해 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하거나, 특정 기질의 산화 반응을 통해 조효소 환원을 유도하는 탈수소효소(dehydrogenase)가 포함된 커플링 반응(coupling reaction)을 이용하거나, 인공 형광기질을 이용하는 방법 등이 개발되어 있다. 그러나, 이들 방법은 여러 단계의 전처리 프로토콜이 필요할 뿐만 아니라, 체내에서 조효소 농도 구배를 실시간으로 직접 관찰하거나 정량적 분석에 이용하는 것은 불가능하다.
상기 단점의 해결을 위해, 분자 영상 장비를 이용하는 방법이 개발되었다. 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용하여, 고출력의 연속 파장(continuous wave; CW) 레이저로 조효소 고유 형광 파장을 높은 해상도로 관찰하였으며, 다른 측정장비로서, 두 광양자를 이용한 이광자 현미경(two photon microscopy)은 영상 획득 과정에서 낮은 에너지 준위를 지닌 연속된 두 번의 조사로 인해 고에너지 파장의 단일 조사(radiation)에 따른 세포 손상 또는 탈색(photobleaching)이 최소화되어 조효소 측정이 개선되었다. 그러나, 상기 방법을 통해서도 여전히 NADPH의 고유 파장을 이용한 형광 측정법으로, S/N 비율이 낮아 정확한 정량 분석 수행이나 NADH와의 구분이 어려운 문제가 남아 있어 이에 대한 해결이 절실한 상황이다.
대한민국 등록특허공보 제1769789호 (2017.08.14.) 대한민국 등록특허공보 제1234583호 (2013.02.13.) 대한민국 등록특허공보 제0950064호 (2010.03.22).
상기 문제점의 해결을 위해 본 발명에서는 세포 내의 적은 양의 조효소를 높은 감도 및 효율로 이미징 및 정량이 가능하며, 초 단위로 측정이 가능하여 실시간 분석이 가능하며, 세포 성장에 적은 스트레스를 유발하는 연속적인 이미징 측정 방법을 제공하고자 하였다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 변이체의 아미노산 서열을 코팅하는 핵산 서열을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 포함하는 생체 NADP(H) 실시간 정량용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소에 첨가하고, 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 NADP(H)의 실시간 정량 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소에 첨가하고, 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소의 정량 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 포함하는 NADP(H) 실시간 정량용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 실시간 조효소 정량방법은 조효소인 NADP(H)를 초 단위의 실시간으로 정량할 수 있고, 효소의 활성이 저하되는 저온, 산성/염기성 조건에서도 정량이 가능할 뿐만 아니라, 시료에 포함된 조효소의 농도가 낮아도 높은 감도로 정확하고 신속한 정량이 가능하다. 특히, 기존의 정량 시스템과 달리 세포의 파괴 없이 조효소 측정 또는 변환에 필요한 기질을 첨가할 필요도 없고, 형광을 발생하기 위한 특수한 구조(fluorophore) 형성에 소요되는 시간 없이, 무산소 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 증진함으로써 다양한 생체 시료에 포함된 조효소의 이미지화 및 정량이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 NADP(H) 이미지 분석법은 다양한 숙주에서 높은 발현율을 나타냄으로, 세포 성장에 저해가 없는 리포터로 채용함으로써, 대사 과정을 실시간으로 확인 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 청색 형광 단백질 mBFP를 발현하기 위한 벡터에 관한 것이다.
도 2는 청색 형광 단백질 mBFP의 돌연변이들의 NADPH 의존적 형광 활성(a) 및 효소 활성(b)에 관한 것이다.
도 3은 야생형 mBFP와 돌연변이 mBFP를 발현하는 재조합 균주의 성장 곡선 비교 결과이다.
도 4는 SDS-PAGE를 이용하여 순수 분리 정제된 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP 확인 결과이다.
도 5는 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP가 미생물, 동물세포 및 식물세포에서 발현된 SDS-PAGE 결과이다.
도 6은 도 5에서 발현된 결과에 대한 형광 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 도 5에서 발현된 결과에 대한 환원효소 활성을 측정한 결과이다.
도 8은 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP가 발현된 동물 세포의 형광 이미지를 이광자 현미경에서 확인한 결과이다.
도 9는 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP가 발현되는 동물 세포에 특정 산화제를 처리하여 시간에 따른 조효소 형광 이미지를 이광자 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10은 배양 배지에 첨가된 기질의 종류에 따른 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP 발현시NADPH 양의 변화에 관한 결과이다.
도 11은 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP가 발현되는 동물 세포의 형광 이미지를 확인한결과이다.
도 12는 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP가 발현되는 동물 세포에 효소 저해제를 처리하였을 때, NADPH 양의 변화를 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 돌연변이 청색 형광 단백질 mBFP에 의해 세포 내의 NADPH 양을 연속으로 측정하였을 때, 야생형이나 기존 유도체와 달리 효소활성을 지니지 않아 안정적으로 측정되는 정량치를 보여주는 결과이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 세포 내 NADPH-의존적 실시간 활성 대사 이미징 방법 및 그 용도에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명에 있어 “시료” 또는 “샘플”은 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명의 용어 “실시간(real-time)”은 분석 수행시 추가적인 전처리 또는 일정한 대기 시간을 포함하지 않는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보다 구체적으로는 분석 수행이 0.01 내지 100초, 바람직하게는 0.1 내지 60초, 보다 바람직하게는 0.5 내지 30초, 더욱 바람직하게는 1 내지 15초 내에 분석이 이루어지는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP 변이체는 친화성 태그를 포함할 수 있으며, 상기 친화성 태그는 히스티딘 태그(his-tag)를 사용할 수 있다. 이와 함께 본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP 변이체는 특정 산화/환원 효소에 대한 활성을 제거하기 위해, 추가적으로 특정 유전자에 무작위적인 변이를 유발하는 변이유발 숙주를 이용하여 발현된 단백질 라이브러리에서 선택될 수 있으며, 야생형 mBFP와 동일한 수준의 활성을 보이고, 다른 여러 조효소와의 상호 경쟁적 광학 특성에서 간섭을 거의 받지 않으며, 목적하는 조효소가 극소량인 경우에도 정량의 오차를 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 초 단위로의 측정이 가능하여 실시간 정량 및 분석이 가능한 장점이 있어 우수한 리포터로서의 특징을 지닌다. 일 실시예에 따르면 mBFP 단백질의 N-말단에 his-tag가 융합되고, 상기 변이체에서, 야생형 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6) 기준 157번째 아미노산인 티로신(Tyr, Y)이 히스티딘(His, H) 또는 아스파라긴(Asn, N)으로 치환된 변이체의 경우, 다른 변이체 대비 현저히 우수한 NADP(H) 의존적 형광 활성을 나타내면서 알데히드 탈수수효소 활성이 제거되어 NADP(H)의 실시간 이미징 및 정량 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.
또한 본 발명은 상기 변이체의 아미노산 서열을 코팅하는 핵산 서열을 제공한다.
상기 핵산 서열은 상기 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열이면 특별히 제한되는 것은 아니나, 일예로 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)와 아미노산 보존적 치환(conservative substitution)을 고려하여 상기 서열번호 1 또는 2에 기재된 서열과 80% 상동성, 바람직하게는 85% 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 유전자도 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 벡터의 제작을 위한 플라스미드의 종류는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으며, 숙주 세포에 형질전환되어 mBFP 변이체를 코딩하는 유전자로부터 효율적으로 mBFP 단백질을 발현할 수 있도록 제작된 것이라면 벡터의 크기, 유전자의 위치 등은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, mBFP 야생형과 산화/환원 효소활성이 제거된 돌연 변이체는 대량 분리와 높은 순도의 정제를 위해 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용할 수 있는 폴리 히스티딘(poly histidine) 태그를 각각의 효소 유전자에 부착하여 발현시킬 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 단백질 분리 및 정제에 사용되는 밀도 분획 원심분리나 염석이나 투석(salting out, dialysis)을 거치고 이온교환이나 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(ion-exchange, gel filtration chromatography)를 다단계로 수행한 후 농축하는 방법에서 발생하는 수율의 상대적 저하를 방지할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 상기 형질전환체는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되는 것은아니나 미생물, 동물 세포 또는 식물세포일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 구체예로 대장균(Escherichia coli), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), HeLa 세포(Hela cell), 또는 식물 캘러스 세포(callus cell) 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은 상기 변이체를 포함하는 생체 NADP(H) 실시간 정량용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 NADP(H) 실시간 정량용 조성물은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 보다 더 높은 감도로 조효소를 정량하기 위해 금속이온을 첨가할 수 있다. 금속이온의 종류는 Li+, Hg2 +, Co2 +, Mg2 +, Mn2 +, Zn2 +, K+, Ca2+, Al3 +, Fe3 +, Fe2 +, Ag+, Ni2 +, Pb2 +및 Cu2 +로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속이온이나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 금속이온을 함유하는 금속염을 첨가하는 경우 특히 NADP(H)의 정량시 감도를 2배 이상 증가시킬 수 있어 바람직하다.
또한, 금속이온과 계면활성제를 함께 첨가하는 경우 NADP(H)의 정량 시 감도를 3배 이상 증가시킬 수 있어 바람직하다. 상기 계면활성제의 종류는 제한되지는 않으나 Sodium dodecyl sulfate(SDS), Na-deoxycholate, Cetrimonium bromide(CTAB), dodecyl-trimethylammonium bromide(DTAB) 및 Triton X-100로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이나 이에 제한되지 않으며 일반적으로 본 발명이 속하는 분야에서 사용될 수 있는 계면활성제는 자유롭게 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 변이체를 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소에 기질과 함께 첨가하고, 활성에 따른 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 NADP(H)의 실시간 정량 방법을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 효소 활성 측정법은 반응액 내의 NADPH를 mBFP 변이체의 첨가만으로 초 단위의 실시간으로 측정 가능한 방법임으로, 기존의 형광이나 발광 기질을 이용하는 방법에 비해 추가 기질(발색이나 형광 기질)의 첨가가 필요 없으며, 산소가 없는 조건과 낮은 온도에서도 사용할 수 있기 때문에 효소 활성 측정에 높은 신뢰성과 민감한 장점이 있다.
또한 본 발명은 상기 변이체를 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소에 첨가하고, 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소의 정량 방법을 제공한다.
보다 상세하게, 조효소 의존적인 활성을 지닌 산화환원효소에 기질을 첨가하여 반응을 유도한 후, NAD(P)+에서 NAD(P)H 로 산화되거나 역으로 환원되는 것과 같이 커플링 효소활성에 의해 변화된 NADPH 량을 mBFP 변이체를 통해 형광을 측정하여 효소활성(nmol/min/㎎ 단백질)을 계산한다. 이와 같은 과정은 산화/환원효소의 기질 소비량과 조효소 소비량이 같은 몰비로 소비되는 특성을 이용하기에 기질을 모르는 경우에도 변화된 조효소의 양으로 역가(specific activity)를 측정할 수 있기에 가능한 방법이다. 따라서, 조효소(NAD(H) 와 NADP(H))를 이용하는 모든 효소의 활성 측정을 커플링 효소와 mBFP 변이체를 첨가해 변화된 형광 값을 이용함으로써, 정확하고 신속하게 효소의 비활성 속도(specific activity)를 잴 수 있으며 산소가 없는 조건과 저온, 고온, 산성 및 염기성 조건에서도 사용할 수 있기 때문에 효소 활성 측정에 높은 신뢰성과 민감한 효소 정량 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 변이체를 포함하는 NADP(H) 실시간 정량용 키트를 제공한다.
본원 발명에 따른 실시간 정량 방법을 사용할 수 있는 키트를 이용하여, 생체 시료 내 미생물 조직세포의 조효소 의존적 효소활성을 이용한 질병을 실시간으로 진단할 수 있다. 상기 실시간 진단은 시료 분석에 대기 시간이 거의 없이, 바람직하게는 1 내지 15 초 이내에 진단이 완료될 수 있는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
질병에 따른 특징적인 효소 활성에 따라 다양한 종류의 암 뿐만 아니라, 심장질환, 간질환, 혈액질환 등 다양한 질병을 진단할 수 있다. 예를 들면, 생체 시료의 대상으로 침, 소변, 혈액과 같은 체액을 이용하여 본 발명의 조효소 정량 방법 및 조성물을 통해 조효소 의존적 효소 활성 측정을 통해 시료 내에 질환 마커로써 가능한 효소활성의 존재 여부를 판단하여 질병을 진단할 수 있다. 또한, NADP(H) 의존적 산화/환원 효소로 포도당-6-인산탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 등의 활성 측정을 통해, 암과 같은 질병의 진단 등에 활용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실험재료]
mBFP 유전자: GenBank Accession No. ADG46021.1.
pQE30 (Qiagen, USA)
E. coli XL1-Red (Invitrogen, USA)
[실시예 1] 효소 활성이 제거된 mBFP 돌연변이 제작
1. 돌연변이 라이브러리 제작 및 선별
전형적인 기질인 다양한 알데히드(aldehyde)에 대한 mBEP의 효소 활성 제거를 위해, 특정 유전자에 무작위적인 변이를 유발하는 변이유발 숙주 대장균을 이용하여 무작위 변위를 유발하였다.
pQE30 플라스미드에 mBEP를 클로닝하여, 도 1과 같이 제조된 4,174 bp의 벡터를 XL1-Red 에 통상인 전기충격법을 이용하여 형질전환한 후, 여러 세대(generation) 증식이 가능한 24시간 이상 배양하였다.
배양액을 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니 형태로 생성된 각 클론을 96 웰 플레이트(well plate)로 분주하여 배양한 후, 형광 리더기(M200, Tecan)를 이용하여 mBFP 단백질의 활성을 측정하였다.
아세트알데히드 탈수소 효소 활성 측정을 위해 100 mM Tris, 100 mM 염화나트륨, 0.05% Triton X-100, 0.5 mM 아세트알데히드 및 0.5 mM NADPH가 혼합된 pH 7.5의 반응 용액을 각 웰당 10 uL씩 첨가한 후, 10 분간 반응시키고, 상기 형광 리더기로 형광값의 변화를 측정하여 효소반응에 의해 소진되는 NADPH 양을 측정하였다.
이로부터 초기에 측정값에 비해 형광의 변화가 없는 돌연변이체를 대상으로 알데히드 탈수소효소 활성이 감소된 클론 3종을 선별하였다(도 2).
2. 세포 성장 저해 여부
상기 1에서 선별된 클론 3종 및 야생형 균주를 배양하여, 통상적인 방법에 의해 시간별로600 nm에서 광학 밀도(OD600)를 측정하여 성장을 비교하였다.
그 결과를 도 3에 도시하였다.
이로부터, 돌연변이 균주는 성장기의 속도에 있어 일부 차이는 있으나, 대수기(exponential phase)를 지나 정체기(stationary phase) 및 사멸기(death phase)에 접어들면서, 세포의 생장은 야생형과 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 이로부터 재조합 세포의 성장에 있어 돌연변이 유전자의 도입이 성장을 저해하는 요인으로 작용하지 않는다는 것을 확인하였다.
3. mBEP 돌연변이 단백질의 정제
상기 선별된 돌변변이 mBFP 클론 3종을 각각 50 ug/mL 앰피실린이 포함된 5 mL 액체 LB(luria-bertani) 배지에 각각 접종하고, 37 ℃, 200 rpm에서 12 시간동안 전배양하였다.
상기 배양액 1 mL씩을 동일한 100 mL의 배지에 접종하여, 동일 조건에서 3시간 동안 본배양한 후, OD600 값이 0.5~0.6일 때 IPTG(Isopropyl *?*-D-1-thiogalactopyranoside) 첨가 후 4시간 더 배양하였다. 이후 고속 원심분리를 통해 세포를 회수하였다.
mBFP 정제율 향상을 위해, NADPH와 결합하는 단백질의 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)로 이용되는 시바크론 블루(chbacron blue)와 His-tag을 이용한 친화 크로마토그래피를 순차적으로 사용하였다.
이를 위해 상기 방법으로 회수한 세포를 20 mL의 결합 완충액(binding buffer; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)에 현탁한 후, 초음파 분쇄기를 이용하여 5초 동안 초음파를 가하고, 10초 동안 정치하는 과정을 15회 반복하여 세포를 파쇄하였다.
파쇄된 세포를 10,000 x g로 15분간 고속 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한 후, 가용성 단백질이 포함된 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 존재하는 거대 분자 불순물의 제거를 위해 20 mL 당 1 g의 CDR(cell debris remover; Sigma-Aldrich)을 첨가하여, 저온에서 10분간 혼합한 후, 10,000 x g로 45분간 고속 원심분리하고, 0.45 um의 실린지 필터(syringe filter)에 여과하여 남아있는 불순물을 제거하였다.
상기 과정을 통해 전처리된 세포 파쇄액에 5배 부피의 상기와 동일한 결합 완충액을 처리하여 희석하였다. 평형에 도달한 시바크론 블루 레진에 2 mL/분의 유속으로 각 단백질의 부착을 유도한 후, 100 mL 결합 완충액을 3 mL/분의 유속으로 흘려 보내 컬럼에 결합되지 않은 단백질과 비특이적으로 약하게 결합된 불순물을 제거하였다.
부착된 단백질은 용출 완충액(elution buffer; 20 mM Tris-HCl, 2 M 염화나트륨, pH 7.5)을 이용하여 회수하였다.
SDS-PAGE를 통해 mBFP가 회수된 분획 구간 및 순도를 확인한 후, 함께 용출된 오염 단백질의 제거를 위해 금속 친화 수지 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 위해 회수된 단백질이 포함된 용액을 4배로 희석한 후, 결합 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM 염화나트륨, pH 7.5)로 평형에 도달시킨 Ni-NTA 수지에 2mL/분의 유속으로 단백질 부착을 유도하였다.
결합되지 않은 단백질과 비특이적으로 약하게 결합된 불순물들의 제거를 위해 100 mL의 세척 완충액(wash buffer; 20 mM Tris-HCl, 500 mM 염화나트륨, 10 mM 이미다졸, pH 7.5)을 4 mL/분의 속도로 흘려 보냈다. 이후, Ni-NTA 수지에 흡착된 단백질을 용출 완충액(elution buffer; 20 mM Tris-HCl, 500 mM 염화나트륨, 250 mM 이미다졸, pH 7.5)을 이용하여 회수하였다.
형광 감도계를 이용하여 분획 구간을 확인한 후, 용출액에 존재하는 이미다졸 및 염의 제거를 위해 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하였다. 회수된 용액을 SDS-PAGE로 확인하였다
상기 결과를 도 6에 도시하였다.
이로부터, 95% 이상의 고순도를 지닌 단백질이 분리되었음을 확인하였다.
4. 정제된 돌연변이 mBFP의 활성
상기 과정을 통해 분리한 돌연변이 mBFP 단백질의 효소 활성 측정을 위해, NADPH 의존적 형광 활성을 하기와 같이 측정하였다.
정제된 돌연변이 mBFP 단백질 각 10 uM을 96 웰 플레이트에 분주하고, 500 uM NADPH를 각 웰당 10 uL씩 첨가한 후, 형광을 측정하였다.
그 결과, 야생형 단백질에 비해 형광의 변화가 거의 없거나, 15% 이하의 낮은 형광 감소를 나타내는 것을 확인하였다. 이로부터, 활성의 차이가 발생한 변이체라 하더라도, NADPH에 의존적인 형광능을 보유하고 있음을 확인하였다.
정제된 돌연변이 mBFP의 단쇄 디하이드로게나아제/리덕타아제 계열(short chain dehydrogenase/reductase family, SDR family) 효소 활성 측정을 위해, 알데히드 탈수소 효소 측정을 위한 반응 용액(100 mM Tris, 100 mM 염화나트륨, 0.05% Triton X-100, 0.5 mM 아세트알데히드, 0.5 mM NADPH, pH 7.5)을 상기 단백질이 첨가된 웰에 각각 10 uL씩 첨가하고 10분간 반응시킨 후, 형광리더기를 사용하여 감소된 NADPH의 양을 측정하였다.
그 결과, 돌연변이 단백질 2개의 클론에서 알데히드 탈수소효소 활성이 대부분 제거된 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 이 중에서 NADPH 의존적 형광 활성이 가장 높고, 하기 표 1에서와 같이 알데히드 탈수소효소 활성이 제거된 클론인 mBFP2를 선택하여 사용하였다.
돌연변이 mBFP의 효소 활성
U mg-1 피브알데히드(Pivaldehyde) 아세트알데히드(Acetaldehyde) 벤즈알데히드(benzaldehyde) 헥사날(hexanal)
야생형
(wild type)		 14.43 ± 0.68 10.34 ± 0.24 6.41 ± 0.34 4.34 ± 0.14
mBFP1 4.82 ± 0.25 3.32 ± 0.12 0.76 ± 0.02 검출되지 않음
mBFP2 검출되지 않음 검출되지 않음 검출되지 않음 검출되지 않음
mBFP3 2.43 ± 0.68 0.22 ± 0.05 검출되지 않음 검출되지 않음
[실시예 2] mBFP의 형질전환 발현 및 활성 확인
1. 벡터 제작
mBFP 발현을 위한 프라이머를 하기 표 2와 같이 제작한 후, PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다.
이름 서열
X-BFP F AATCTAGAATGCAGAATCTGAACGGCAAAGTG
X-BFP R AAGAATTCTTAAGCGGCGAAGCCGCCGT
HcC-BFP F ATAGAATTCATGCAGAATCTGAACGGCAAAGTG
Hc-BFP R ATAGCGGCCGCTTAAGCGGCGAAGCCGCCG
C-BFP R AATCTAGATTAAGCGGCGAAGCCGCCGT
PCR은 95 ℃에서 30초 변성(denaturation), 58 ℃에서 45초 어닐링(annealing), 72 ℃,에서 90초 연장(extension)으로 총 30 사이클을 수행하였다.
각 프라이머 쌍으로 증폭된 유전자를 상동유전자 재조합 kit (in-fusion HD cloning kit, Clontech, USA) 를 이용하여, 플라스미드 pXMJ19, pPICHoLi, pCDNA3.1 및 pCAMBIA에 각각 클로닝하여 재조합 벡터 pXMJ19-mBFP, pPICHoLi-mBFP, pCDNA3.1-mBFP 및 pCAMBIA-mBFP를 각각 제조하였다.
2. 형질전환 방법
1) 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 재조합 벡터 pXMJ19-mBFP 형질전환
코리네박테리움 글루타미쿰의 컴피턴트 세포(competent cell)는 다음과 같이 제작하였다.
코리네박테리움 글루타이미쿰을 LB(luria-bertani) 배지에서 배양한 후, 단일 콜로니를 2% 글루코스가 포함된 LB 배지에 접종하여 전배양한 후, 배양액을 이소니코틴산 히드라지드(isonicotinic acid hydrazide; 4 ug/mL isoniazid, 25 ug/mL 글리신, 0.1% Tween 80)가 포함된 Epo 배지에 1~2% 접종한 후, 25 ℃에서 배양하여 600 nm에서의 광학 밀도가 0.6일 때 회수하여, 10% 글리세롤로 4회 세척하여 전기 천공능세포(electrocompetent cell)을 제작하였다.
제작된 세포는 100 uL씩 분주하여 -80 ℃에서 보관 후 사용하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환 수율 향상을 위해, 대장균 JM110 strain에 형질전환하여 메틸화 패턴(methylation pattern)에 의해 재조합 유전자가 불안정해지는 현상이 줄어든 재조합 벡터를 회수하여 사용하였다.
상기 전기천공능 세포 100 uL에 재조합 플라스미드 200~500 ng/uL을 첨가하고, 0.2 cm 큐벳(cuvette), 25 uF, 600 Ω, 2.5 kV, 10~12 nm의 조건으로 전기천공장치(Bio-Rad, USA)에서 전류를 가한 후, 바로 46 ℃에서 6 ℃로 급랭하여 열충격을 가하였다(van der Rest ME et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52:541-545, 1999).
이후, 1 mL의 SOC 배지(Sigma-Aldrich)를 첨가하여 32 ℃에서 1.5 시간 배양하고, 앰피실린 항생제(적절한항생제)가 포함된 고체 배지에 도말하여 재조합 균주를 선별하였다.
2) 피키아 파스토리스(Pichia pastoria)에 재조합 벡터 pPICHoLi-mBFP 형질전환
피키아 파스토리스의 컴피턴트 세포(competent cell)는 다음과 같이 제작하였다.
피키아 파스토리스(GS115)를 YPD (Yeast extract-Peptone-Dextrose) 배지(Sigma-Aldrich) 10 mL에 접종하여 30 ℃에서 하룻밤 배양한 다음 100 mL YPD 배지에 0.2 mL의 배양균을 접종하고, 600 nm에서의 광학 밀도가 1.0일 때까지 배양하였다.
배양액을 4℃에서 2,500 x g로 5분간 원심분리한 후, 100 mL의 냉각 멸균 증류수로 현탁하여 동일한 조건으로 원심분리하고, 다시 50 mL의 냉각 멸균 증류수로 같은 과정을 반복하여 최종 부피가 0.5 mL이 되는 컴피턴트 세포를 제작하였다.
DNA는 AvrI 제한 효소로 절단하여 선형으로 만든 후, 상기 제작한 컴피턴트 세포 80 uL 및 선형화된 DNA 10 ug 을 혼합하여 0.2 cm 전기천공용 큐벳(electroporation cuvette)에 넣고, 얼음에서 5분간 정치 후, 1,500 Volt, 200 Ω에서 전기천공하여 형질전환하였다.
이후, 즉시 1 mL의 1 M 솔비톨(sorbitol)을 부어 혼합하고, 멸균된 마이크로 원심분리 튜브(microcentrifuge tube)로 옮긴 후, YPD/zeosin 플레이트에 도포하여 30 ℃에서 콜로니가 형성될 때까지 배양하여 재조합 균주를 선별하였다.
3) 동물세포 HeLa(Hela Cell)에 재조합 벡터 pCDNA3.1-mBFP 형질전환
상기 동물세포를 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Thermo Fisher Scientific, USA) 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 6-웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 다음 날에 형질 감염제인 리포펙타민 2000(Invitrogen)의 존재 하에 발현 벡터 2 ug과 혼합하여 20 분간 반응시켰다.
8 시간 경과 후, 배지를 제거하고, PBS 완충액(Phosphate-buffered saline, WelGene Inc.)으로 3회 세척한 후, 10% 우태아 혈청만을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 37 ℃, 5% CO2 분위기에서 48 시간 동안 더 배양하여 형질도입된 세포를 수득하였다.
4) 식물세포 캘러스에 재조합 벡터 pCAMBIA-mBFP 형질전환
아그로박테륨 법을 이용하여 플라스미드 식물 벡터(pCAMBIA1300)에 삽입된 mBFP 유전자를 아그로박테륨 EHA105 균주에 형질전환 후, 항생제 카나마이신 50 mg/L가 첨가된 LB 배지에 28 ℃ 조건 하에서 2 일간 배양하였다.
600 nm에서의 광학 밀도 측정에 따른 아그로박테륨 균주 농도가 0.5 정도 되었을 때 아그로박테륨을 100 uM의 아세토시린곤(acetosyringone)이 첨가된 EME 액체 배지(pH 5.2)로 현탁한 후, 캘러스 세포와 함께 28 ℃, 100 rpm으로 20분간 배양하였다.
배양한 캘러스 세포를 메쉬로 수거한 후, 멸균한 여지에서 건조시키고, pH 5.2로 보정한 아가(agar) 8%가 첨가된 EME 배지에 치상한 후, 25 ℃ 배양기에서 5일간 암배양하였다.
배양한 캘러스 세포를 10 mg/L 하이그로마이신(hygromycin) 및 250 mg/L 세포탁심(cefotaxime)이 첨가된 EME 배지(pH 5.7)에서 100 rpm으로 2주간 배양하였다. 2주 경과 후 메쉬를 이용하여 수거한 캘러스 세포를 70 g/L 락토오스(lactose), 250 mg/L 세포탁심, 25 mg/L 하이그로마이신 및 1.8% 아가(pH 5.8)가 첨가된 EME 배지에 치상한 후 배양하여, 4주 후 녹색을 띄는 체세포배를 선별하였다.
산별된 체세포배를 1 mg/L GA3(gibberellic acid), 34 mg/L 아데닌, 500 mg/L 맥아 추출물, 0.2% 겔라이트(gelrite; pH 5.8)가 첨가된 MT 기본 배지에 치상하고, 암조건에서 8주간 배양하여 형질전환된 체세포배로부터 형질전환 캘러스 세포를 유도하였다.
3. mBFP 단백질의 발현 및 활성
1) 세포 배양
상기와 같이 형질전환된 각 세포를 다음과 같은 방법으로 배양하였다.
대장균 배양
대장균은 상기 실시예 1의 3 에서와 같이 항생제가 포함된 LB 배지에서 배양하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 배양
코리네박테리움 글루타미쿰은 혐기성 조건에서의 배양을 위해 이산화탄소 발생 키트(OXOID Limited Kit, UK)와 함께 밀봉된 혐기성 장치 (anaerobic jar) 내에서 항생제가 포함된 LB 배지 플레이트 상에 균주를 스트리킹한 후, 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다.
그 후, 아르곤으로 완전히 충전된 17.5 mL 실험관(Hungate 관, 벨코글라스, USA)에 접종하여 배양하였다.
동물세포 배양
상기와 같이 형질전환된 동물세포를 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 하루동안 배양하였다.
피키아 파스토리스 배양
상기와 같이 형질전환된 피키아 파스토리스는 BNK 배지(1.34% yeast nitrogen base, 4x10-5 % 바이오틴, 1% 글리세롤, 0.1 M K-phosphate, pH 6.0)에서 250 rpm, 30 ℃로 하루동안 배양한 후, BMM 배지(1.34% yeast nitrogen base, 4x10-5 % 바이오틴, 0.5% 메탄올, 0.1 M K-phosphate, pH 6.0)로 옮겨 매일 0.5% 메탄올을 첨가하며 배양하였다.
캘러스 배양
상기와 같이 형질전환된 캘러스는 MT(Murashige-Tucker) 배지에 수크로스(sucrose) 50 g/L가 첨가된 현탁 배지 100 mL에 형질전환 캘러스 세포 22 g을 첨가한 후, 15 ℃에서 150 rpm으로 하루동안 배양하였다.
2) 형질전환 세포의 mBFP 발현 확인
상기 세포들의 mBFP 단백질 발현을 확인하기 위해, 통상적인 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(western blotting)법을 사용하였다. 그 결과를 도 5a 및 5b에 도시하였다.
그 결과, 각 세포 내에 mBFP 단백질이 발현되어 있음을 확인하였다.
배양된 세포를 파쇄한 후 회수하여 His-tag을 이용한 정제를 하기와 같이 수행하였다.
PBS(phosphate buffered saline) 완충액으로 파쇄한 세포 상층액을 Ni-NTA Spin Columns(Qiagen)에 주입하여 통과시키고, 세척 완충액(PBS, 10 mM 이미다졸)로 세척한 후, 용출 완충액(PBS, 100 mM 이미다졸)로 mBFP 단백질을 회수하였다.
각 세포에서 정제된 mBFP를 96 웰 플레이트(well plate)에 각각 주입하고, NADPH와 반응시킨 후 형광을 측정하였다.
결과를 도 6에 도시하였다.
이로부터 각 세포의 종류에 따른 형광 활성의 강도에는 차이가 있으나, 정제된 mBFP가 NADPH에 의존적인 형광 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
3) 돌연변이 mBFP 단백질의 환원효소 활성
mBFP 단백질이 돌연변이를 통해 환원효소로서의 활성을 지니고 있는지 확인을 위해, 상기 실시예 1의 알데히드 탈수소 효소활성 측정을 위한 반응 용액을 사용하여 mBFP의 환원효소 활성을 측정하였다.
그 결과를 도 7에 도시하였다.
이로부터, 야생형은 환원효소 활성을 나타내는 반면, 본 발명을 통한 돌연변이 mBFP 단백질은 각각 환원효소로의 활성이 제거된 것을 확인하였다.
상기로부터, 돌연변이된 mBFP 단백질은 다양한 종류의 세포에서 각각 NADPH에 의존적인 형광 활성을 나타내며, 발현이 용이하여 범용 바이오리포터로의 활용이 가능한 장점이 있음을 확인하였다.
[실시예 3] 세포 내 mBFP 단백질에 의한 NADPH 이미지화
1. 세포 내 NADPH 이미지화
상기 동물 세포 내 mBFP 형광 활성 확인을 위해 이광자 현미경(two-photon microscopy)을 이용하여, 10 nm 단위로 스크리닝하면서 초당 1 프레임 단위로 연속촬영하였다.
상기 결과를 도 8에 도시하였다.
이로부터, 대조군에 비해 뚜렷한 형광 활성을 확인할 수 있으며, 지속적인 관찰을 수행하더라도 세포 생장이 저해되거나, 형광 값이 변화하는 문제점이 발생하지 않았다.
이를 통해, 종래의 형광 현미경 이용시의 낮은 해상도 문제 또는, 보다 높은 해상도를 얻기 위한 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscopy) 사용시에 짧은 파장의 레이저 조사에 따른 세포 생장 저해 문제로 인한 지속적 관찰의 어려움을 모두 해결하는 것이 가능하였다.
또한 이광자를 이용하는 경우 여기 파장이 종래보다 2배 이상 높기 때문에, 약한 에너지를 이용한 자극을 부여함으로써 세포에 영향이 적고, 지속적으로 세포 내의 mBFP 형광 활성을 확인하는 것이 가능하여, NADPH의 용이한 측정이 가능한 것으로 판단된다.
2. 세포 내 NADPH 이미지화의 재현성 평가 및 정량적 측정
1) 형광 및 NADPH와의 의존성
상기 실시예를 통해 제작한 재조합 동물세포에 대해 산화제인 디아미드(diamide)를 처리하여, 세포 내 NADPH의 양을 줄인 후 하기와 같이 형광의 변화를 관찰하였다.
먼저, 재조합 동물 세포를 관찰하기 전, NADPH의 지속적 과량 생산 방지를 위해 글루코스(glucose)가 제거된 배양 배지로 교체하여 1시간 동안 배양한 후, 이미지를 관찰하였다.
여기에 40 uM 디아미드를 처리 후, 이광자 현미경을 이용한 실시간 이미지 측정 방법을 이용하여, 매 초당 형광 이미지를 촬영하였다.
그 결과를 도 9에 도시하였다.
이로부터, 산화제인 디아미드를 상기 농도로 처리한 결과, 형광 세기가 일정 시간 경과 후 급격히 감소하였다가 산화제 농도가 감소하여 NADPH 농도가 증가함에 따라 점차 형광이 회복되는 것을 확인하였다. 이로부터, 상기 형광 이미지의 세기는 세포 내 mBFP에 의한 NADPH의 양에 의존적인 것을 확인하였다.
2) 형광 세기 및 NADPH 양의 정량적 측정
동물 세포의 배양을 위한 기질로 글루코스(glucose), 글루타메이트(glutamate), 말레이트(malate), 숙시네이트(succinate), 피루베이트(pyruvate), 락테이트(lactate), 및 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate, G6P)를 각각 배지에 공급하여, 동물 세포를 배양하고 각각의 기질을 첨가한 후, NADP(H) assay kit(NADPH assay kit, SigmaAldrich , USA)을 이용하여, NADPH 양을 정량한 후, 현미경을 통해 측정한 형광 수준과 비교하여, 형광 세기의 변화에 따른 NADPH의 변화량을 측정하였다.
그 결과를 도 10에 도시하였다.
이로부터 기질로 글루코스(glucose)를 이용하였을 때 NADPH의 변화량이 가장 크게 나타남을 알 수 있으며, 형광 세기 변화량에 따른 NADPH 변화량의 상관관계를 통상적인 회귀분석을 통해 분석한 결과 선형의 상관관계 분포를 보이는 것을 확인하였다(도 11). 즉, 세포 내 형광 세기는 mBFP에 의한 NADPH의 양에 대해 선형의존적인 것을 상기 분석을 통해 확인하였다.
[실시예 4] 조효소 의존적 대사 기반 NADPH 이미지화
mBFP가 형질전환된 동물 세포를 배양한 후, 하기 표 3의 NADPH 탈수소효소 저해제를 각각 처리하여 NADPH 변화량을 측정하였다.
NADPH-탈수소효소 저해제(NADPH dehydrogenase inhibitor)
저해제 관련 효소
Dehydroepiandrosterone; DHEA Glucose-6-phosphate dehydrogenase
Auranofin Thioredoxin reductase(TrxR)
AGI-6780(CAS No. 1432660-47-3) Isocitrate dehydrogenases
Galloflavin Lactate dehydrogenase
Methylmalonate; MMA Succinate dehydrogenase
CPI-613
(CAS No. 95809-78-2)		 Pyruvate dehydrogenase
6-Aminonicotinamide; 6-ANA 6-phosphogluconate dehydrogenase
R162(CAS No. 64302-87-0) Glutamate dehydrogenase
저해제 처리 후 실시간 이미지를 측정하여 변화한 형광 세기를 측정하여 NADPH를 정량한 결과를 도 12에 도시하였다.
이로부터, DHEA, 6-ANA 등을 처리하여 글루코스 관련 효소가 저해되었을 때 mBFP에 의한 형광 세기의 차이가 가장 크게 나타났으며, NADPH 양의 변화도 형광 세기와 변화와 같은 양상을 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 5] 기존 야생형 mBFP 나 his-, Ramp tag 유도체와의 조효소 측정 안정성 비교
본 발명의 mBFP 변이체(Y157H 와 Y157N) 를 이용하여 실시간으로 측정되는 조효소 NADPH 에 따른 형광값의 변화를 일정한 시간의 경과에 따라 연속적으로 측정하여 분석시스템의 안정성(stability)을 비교하였다. 실험의 경우, 상기 예에서 기술한 반응 조건에 기존 발명의 야생형 mBFP 와 His- 및 Ramp-mBFP를 같은 조건하에서 같은 양을 처리하여 분석을 수행하였다.
결과적으로 도 13에 도시한 바와 같이, 기존의 야생형이나 유도체와는 달리 본 발명의 변이체의 경우, 내재된 효소활성이 완전히 제거되어 시간의 경과에 따른 조효소 측정값의 변화가 없는 안정적인 시스템임이 확인되었다. 이와 달리 기존 단백질의 경우, 내재된 효소활성과 생체시료내에 존재하는 다양한 알데히드(aldehyde)에 의해 조효소가 소비되어 형광값이 감소하는 불안정한 특성을 보여 주었다.
따라서, 상대적으로 구성물의 성분이 확인된 순수한 반응 용액에서와 달리, 복잡한 성분으로 구성된 생체 내 환경이나 정제되지 않은 추출물을 이용하는 경우, 본 발명의 변이체를 이용하는 경우에만 실시간으로 안정적이고 정확한 조효소 정량 및 이미지화가 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
<110> University Industry Liaison Office Of Chonnam National University <120> Real-time imaging method of NAPDH-dependent metabolic activity in cell and use thereof <130> P18060200575 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mBFP Y157H with his-tag <400> 1 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Gln Asn 1 5 10 15 Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 20 25 30 Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp Ile Ala Phe 35 40 45 Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala Leu Val Gln 50 55 60 Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln Ala Asp Ser 65 70 75 80 Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala Ile Val Gln 85 90 95 Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Leu Ala 100 105 110 Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg Thr Met Asn 115 120 125 Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala Gln Ala Ser 130 135 140 Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys Leu Ala Glu 145 150 155 160 Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu His Ala Ala Ser Lys Ser Ala 165 170 175 Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly Ala Arg Gly 180 185 190 Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr Asp Met Asn 195 200 205 Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val Leu Ser Leu 210 215 220 Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val Ala Phe Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu Ala Val Asp 245 250 255 Gly Gly Phe Ala Ala 260 <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mBFP Y157N with his-tag <400> 2 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Gln Asn 1 5 10 15 Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 20 25 30 Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp Ile Ala Phe 35 40 45 Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala Leu Val Gln 50 55 60 Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln Ala Asp Ser 65 70 75 80 Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala Ile Val Gln 85 90 95 Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Leu Ala 100 105 110 Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg Thr Met Asn 115 120 125 Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala Gln Ala Ser 130 135 140 Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys Leu Ala Glu 145 150 155 160 Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Asn Ala Ala Ser Lys Ser Ala 165 170 175 Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly Ala Arg Gly 180 185 190 Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr Asp Met Asn 195 200 205 Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val Leu Ser Leu 210 215 220 Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val Ala Phe Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu Ala Val Asp 245 250 255 Gly Gly Phe Ala Ala 260 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mBFP Y157 with his-tag <400> 3 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Gln Asn 1 5 10 15 Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 20 25 30 Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp Ile Ala Phe 35 40 45 Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala Leu Val Gln 50 55 60 Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln Ala Asp Ser 65 70 75 80 Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala Ile Val Gln 85 90 95 Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Leu Ala 100 105 110 Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg Thr Met Asn 115 120 125 Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala Gln Ala Ser 130 135 140 Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys Leu Ala Glu 145 150 155 160 Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Tyr Ala Ala Ser Lys Ser Ala 165 170 175 Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly Ala Arg Gly 180 185 190 Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr Asp Met Asn 195 200 205 Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val Leu Ser Leu 210 215 220 Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val Ala Phe Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu Ala Val Asp 245 250 255 Gly Gly Phe Ala Ala 260 <210> 4 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mBFP Y157H w/o his-tag <400> 4 Met Gln Asn Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp 20 25 30 Ile Ala Phe Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Val Gln Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln 50 55 60 Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala 65 70 75 80 Ile Val Gln Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Phe Leu Ala Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg 100 105 110 Thr Met Asn Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala 115 120 125 Gln Ala Ser Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Glu Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu His Ala Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Ala Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly 165 170 175 Ala Arg Gly Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr 180 185 190 Asp Met Asn Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val 195 200 205 Leu Ser Leu Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val 210 215 220 Ala Phe Leu Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Val Asp Gly Gly Phe Ala Ala 245 <210> 5 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mBFP Y157N w/o his-tag <400> 5 Met Gln Asn Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp 20 25 30 Ile Ala Phe Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Val Gln Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln 50 55 60 Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala 65 70 75 80 Ile Val Gln Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Phe Leu Ala Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg 100 105 110 Thr Met Asn Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala 115 120 125 Gln Ala Ser Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Glu Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Asn Ala Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Ala Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly 165 170 175 Ala Arg Gly Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr 180 185 190 Asp Met Asn Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val 195 200 205 Leu Ser Leu Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val 210 215 220 Ala Phe Leu Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Val Asp Gly Gly Phe Ala Ala 245 <210> 6 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BFP wild type Y157 w/o his-tag <400> 6 Met Gln Asn Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp 20 25 30 Ile Ala Phe Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Val Gln Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln 50 55 60 Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala 65 70 75 80 Ile Val Gln Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Phe Leu Ala Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg 100 105 110 Thr Met Asn Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala 115 120 125 Gln Ala Ser Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Glu Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Ala Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly 165 170 175 Ala Arg Gly Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr 180 185 190 Asp Met Asn Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val 195 200 205 Leu Ser Leu Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val 210 215 220 Ala Phe Leu Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Val Asp Gly Gly Phe Ala Ala 245 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X-BFP F <400> 7 aatctagaat gcagaatctg aacggcaaag tg 32 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X-BFP R <400> 8 aagaattctt aagcggcgaa gccgccgt 28 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HcC-BFP F <400> 9 atagaattca tgcagaatct gaacggcaaa gtg 33 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hc-BFP R <400> 10 atagcggccg cttaagcggc gaagccgccg 30 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-BFP R <400> 11 aatctagatt aagcggcgaa gccgccgt 28

Claims (11)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체.
  2. 제 1항의 아미노산 서열을 코딩하는, 청색 형광 단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체의 유전자.
  3. 제 2항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제 3항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 형질전환체는 미생물, 동물 세포 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 형질전환체.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), HeLa 세포(Hela cell), 또는 캘러스 세포(callus cell)인 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 형질전환체.
  7. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 포함하는 생체 NADP(H) 실시간 정량용 조성물.
  8. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소에 첨가하고, 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 NADP(H)의 실시간 정량 방법.
  9. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소에 첨가하고, 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 NADP(H) 의존적 산화/환원 효소의 정량 방법.
  10. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 청색 형광 단백질mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)의 변이체를 포함하는 NADP(H) 실시간 정량용 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 실시간은 분석이 1 내지 15초 경과시까지 이루어지는 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 NADP(H) 실시간 정량용 키트.
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