KR101234583B1 - 형광단백질 ｈｉｓ-ｍＢＦＰ를 이용한 ＮＡＤＰＨ 정량법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형광단백질 his-mBFP를 이용한 NADPH 정량법 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성 또는 정량·정성 분석방법에 관한 것이다.

Description

형광단백질 ｈｉｓ-ｍＢＦＰ를 이용한 ＮＡＤＰＨ 정량법 및 그의 용도{his-mBFP quantitative assay method for NADPH and use thereof}

본 발명은 형광단백질 his-mBFP를 이용한 NADPH 정량법 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체내외 시료에서의 NADPH 정량과, NADPH 또는 NADP+ 의존적 효소의 활성 또는 정량·정성 분석방법에 관한 것이다.

NADPH는 니코틴 아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 구조를 공유하는 NADH와 함께 많은 산화환원효소(oxidoreductase와 dehydrogenase)의 반응에 전자 공여체로 참여해 환원력을 제공하는 조효소의 일종이다. 이들 조효소의 산화물(NAD+와 NADP+)은 생체 이화반응에서 생성되는 에너지를 전자와 프로톤 형태로 수용하는 중요한 기능을 담당하며, 산화환원효소 반응에 전자 수용체로 참여하기도 한다.

잘 알려진 바와 같이 생체 시스템의 주된 대사 체계는 외부로부터 유입된 영양분의 산화(이화 반응)에 의한 주요 전구체와 에너지의 생성, 이를 이용한 생체 구성 분자의 합성과정(환원 성격이 강한 동화 반응)으로 이루어져 있다. 이러한 산화(이화)과정에 생성되어 합성(동화)과정에 소비되는 생체 에너지의 형태는 전자와 프로톤이며, 이들 화합물의 주된 전달자가 NADP(H)와 NAD(H)이다. 화학적으로는 동일한 반응을 매개하는 생체 조효소가 2종류가 존재하는 이유는, 이화과정에 필요한 산화(혹은 환원)력과 동화과정에 필요한 환원(혹은 산화)력의 적절한 분배와 효율적인 에너지 흐름의 조절을 위해 진화적으로 선택된 것으로 알려져 있다.

따라서 이화과정이 주로 산화반응이고 동화과정이 주로 환원 반응의 특성을 지녀 생체내의 몰 구성비는 NADP+ 보다는 NADPH가 NADH 보다는 NAD+가 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 또한 산소를 최종 전자 수용체로 사용하는 보편적인 산소 의존성 세포의 호흡과정은 물론, 무기 호흡이나 발효로서 생장하는 생물, 에너지 공여체(donor)로 무기물을 이용하는 대부분의 생물에서도 이들의 대사/에너지 연계과정에 고에너지 중간 화합물이나 전자수용/공여체로 이용되는 조효소도 NADP(H)이거나 NAD(H)이다.

상기 두 종류의 조효소(NADP(H) 또는 NAD(H))가 지닌 특화된 생체 내 기능으로 인해 이들의 균형을 유지하는 것이 매우 중요하기 때문에 NAD(H)와 NADP(H) 간에는 서로의 산화환원 형태를 유도할 수 있는 salvage 경로(환원된 NADPH가 산화된 NAD+를 산화시키거나 그 역 경로)도 존재하는 것으로 알려져 있다.

따라서 생태계의 모든 세포에서 산화/환원 조효소의 비율은 매우 중요한 생체 활성 지표로 쓰이고 있다. 즉 세포가 정상적인 생리를 유지하느냐와 생리 활성도의 차이를 이들 조효소의 생체 내 농도를 정량하는 방법으로 규정할 수 있는 것이다. 전술한 것처럼 이들의 생리화학적인 연관성 때문에 상기 2종류의 조효소 중 어느 하나의 정확한 정량법이 존재한다면 이들 조효소의 생체 내 농도나 산화/환원 형태 각각의 정량이 모두 가능한 것으로 알려져 있다.

즉, 이들 조효소의 생체 내 기능으로 NAD(H)의 경우, 생체 내 중심대사의 출발이 되는 해당과정이나 펜토오스(pentose) 인산 염 경로, TCA cycle에서 에너지 생성이나 저장에 매우 중요하다. NADP(H)의 경우, 지방산이나 아미노산, 핵산과 같은 생체 중요 고분자의 합성에 이용됨으로 생리 활성도는 물론, 각종 인체 내 세포의 활성도 측정, 이들의 활성 비에 따른 대사 이상 유무나 암세포화 과정 유추나 탐침등에도 매우 중요한 지표를 제공할 수 있는 것으로 알려져 있다. 살아 있는 세포의 경우, 상대적으로 이들 조효소의 생체 내 농도나 산화/환원 비율의 차이가 분명하며 생리활성에 절대적인 요소이기에, 특정 시료에서의 세포의 존재 여부(수질 분석이나 식품 오염 파악)나 정도(질병 유발 가능성)를 파악하는 곳에서도 유용한 지표가 될 수 있다.

따라서 상기 두 종류의 조효소의 정확한 정량 측정법은 다양한 분야에 광범위하게 이용 가능함으로 인해, 조효소 측정법 개발에 많은 연구가 진행되고 있으며, 상대적으로 광학 특성이 우수하고 화합물 자체가 일정한 수준의 형광을 지니는 NADPH의 정량법 개발에 다양한 기법이 동원되고 있다. 상기 이유에서와 같이 NADPH 의 정확한 정량법은 NADPH 자체를 측정하는 것에는 물론, 산화된 NADP+ 또는 salvage 효소의 coupling 의해 NAD+ 또는 NADH의 간접적인 정량법도 제공할 수 있기 때문이다.

이러한 생리활성 주요 지표자인 NADPH 정량에 이용되는 가장 일반적인 전략은 NADPH 자체가 지닌 고유 파장을 이용한 흡광도나 형광을 측정하는 방법이다. 흡광도 측정은 광도분석기(UV spectrophotometer)를 이용해 고유 파장인 340 내지 345 nm에서 빛의 흡수 정도를 측정한 후, 표준 곡선(standard curve)을 이용해 정량하는 방법이다. 형광의 경우는 여기 스캐닝(excitation scanning)을 통해 최대의 형광을 보이는 350 nm 근처에서 빛을 조사한 후, 방출 파장(대략 450 nm)에서의 상대적인 값을 측정해 표준곡선에서 해당되는 양을 결정하는 방법을 이용한다.

상기 분석은 조효소 외에 별도의 기질 첨가를 요구하지 않아 비교적 간단하게 측정할 수 있는 장점을 지니나, NADPH 자체가 지닌 흡광도와 형광 값이 낮아 순수한 반응물(완충용액과 조효소만 포함) 조성에서만 비교적 정확한 값을 측정할 수 있는 단점을 지닌다. 보다 근본적으로는 흡광계수(molecular extinction coefficient)나 양자 수율(quantum yield)이 낮기 때문에 일정한 수준 이상의 상대적으로 많은 시료 양을 필요로 하는 치명적인 단점을 지니고 있다.

상기 문제는 비교적 정확한 조성물의 성분비를 아는 인위적인 실험재료와 달리, 다양한 생체나 환경 시료로의 직접적용이 어렵다는 것을 의미한다. 이는, NADPH 고유 특성으로 알려진 이들 파장에서 빛을 흡수하거나 형광을 띄는 생체 내 물질이나 환경 내 다양한 화학물질이 간섭을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 S/N ratio (신호/간섭 비율)가 낮아지는 문제가 빈번하게 발생해 감도가 떨어져 상대적으로 높은 비율로 NADPH가 존재하는 경우에만 측정이 가능하다.

현재 이용되고 있는 측정법의 또 다른 단점으로는 적은 양의 조효소가 존재할 경우, 낮은 광학 특성을 지닌 NADPH의 구조적인 문제를 해결하기 위해 일반적으로 시도되는 복잡한 전처리 과정에 따른 측정 시간의 지연과정이다. 전술한 바와 같이 측정하고자 하는 조효소의 양이 적을 경우 신호/간섭 비율에 영향을 주는 생체내외 간섭요소들의 제거를 위한 전처리 과정은 필수적이다. 이러한 과정은 원심분리나 간섭물질 응집유도, 농축과 같은 단계를 포함하며, 사용되는 전략에 따라 30분에서 수시간(3 내지 4시간)에 걸친 시간을 필요로 한다.

상기 과정을 통해 부분적으로 간섭을 줄이고 NADPH를 농축하는 효과를 보이지만, 전처리 시간에 따른 NADPH의 자연산화는 또 다른 문제점을 발생시킨다. 잘 알려진 바와 같이 환원력이 강한 NADPH의 경우, 다른 물질에 쉽게 환원력을 제공할 수 있기에 공기에 도출되면 산화가 용이한 화학적 특성을 지닌다.

따라서, 전처리 시간이 길어질수록 공기에 의한 자연 산화나 완충용액의 pH 에 따른 불안정성, 반응액 내의 산화물과의 반응 결과로 인해 상대적으로 측정하기 어려운 NADP+로 전환되는 문제점을 지니고 있다. 이에 NADPH의 산화를 억제하거나 구조적인 안정정을 유도하는 시약의 첨가가 별도로 요구되고 있다.

이들 문제점의 부분적인 보완책으로 현재 시판되는 많은 kit들이 산화된 조효소(NADP+)의 환원 유도를 위한 사이클레이즈(cyclase)나, NADP+를 조효소로 이용해 특정한 기질의 산화반응을 통해 NADPH로 환원을 유도하는 다양한 탈수소효소(dehydrogenase)들이 포함된 커플링 반응(coupling reaction)의 원리를 이용한다. 하지만 이들 반응에 이용되는 효소원이 고가이며, 안정성이 낮고, 조효소 측정을 위해 또 다른 기질을 첨가해야 하는 단점을 지닌다.

특히, 사이클레이즈(cyclase)의 경우, 또 다른 고가의 조효소로 ATP의 첨가가 필수적이다. 예상 할 수 있듯이 이러한 과정에서 시료 내에 기 존재하던 산화된 NADP+도 환원되어 측정되기 때문에, 시료 내의 NADPH 절대양이나 이에 따른 산화된 조효소와의 상대적인 비율 측정이 아니라 NADP+/NADPH 의 총량을 측정하는 결과가 얻어진다.

시판되는 키트(kit)의 또 다른 전략으로는 NADPH가 지닌 낮은 흡(형)광특성의 보완 전략으로 NADPH를 조효소로 이용해 특정 형광기질의 전환을 유도해, 이에 따라 증가하는 특정산물의 형광을 재는 방법을 이용하기도 한다. 상기 방법은 전술한 단점 중에, NADPH 자체를 측정하기에 발생하는 낮은 감도를 양자 수율이 높은 인공 기질을 이용해 상대적으로 높은 감도로 정량할 수 있는 장점을 지니나, 커플링(coupling) 되는 효소가 필요하며 고가의 인공 형광기질을 사용해야 하는 단점을 지녀 사용에 많은 제약이 따른다.

KR 10-0917657 B1, 2007년 08월 21일

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위한 지속적인 연구를 진행하던 중 시료로부터 추출된 반응액에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는특정 단백질의 첨가만으로 기존의 산화/환원효소나 사이클레이즈(cyclase)와 같은 효소와 기질을 필요로 하는 NADPH 정량 시스템과 달리, 복잡한 전 처리와 기질의 첨가가 필요 없어 신속하며, 산소가 없는 조건에서도 정확하고 높은 감도를 지녀 편리하게 이용할 수 있는 새로운 NADPH 분석방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조효소에 직접 결합하여 형광을 증가시키는 새로운 단백질 his-mBFP를 사용하기에 복잡한 전처리 과정이 필요 없어 신속하고, 산소가 없는 조건에서도 정확도와 감도가 높은 분광학적 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성 또는 정량·정성 분석방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성 또는 정량·정성 분석방법의 응용으로, 추가적인 방법의 접목에 따른 다양한 분야의 생리/생물 활성의 측정법을 제공하며, his-mBFP의 NADPH 결합력을 이용해 NADPH를 회수하는 방법까지도 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 시료로부터 추출한 반응액에 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)를 첨가함으로써 NADPH 형광이 7 내지 20배 증가되는 우수한 측정능을 가진 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 새로운 정량 측정 시스템을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)와 NADPH의 결합으로 mBFP의 형광 변화를 측정하는, NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성 또는 정량·정성 분석방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법은 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 정량, NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소 활성 및 농도의 측정 및 NADP(H)에 의존적 산화환원효소의 억제제(항 미생물 제재)를 효율적으로 선별할 수 있는 시험 방법을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 형광의 변화는 시료 내 존재하는 NADPH에 상기 mBFP가 직접 결합하여 형광을 증가 또는 감소시키고, 상기 증가 또는 감소된 형광의 세기로부터 NADP(H)의 농도 또는 NADP(H) 의존적 산화환원효소의 활성을 측정하는 것을 특징으로 한다. 도 3을 참조한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법은 복잡한 전처리와 기질의 첨가가 필요 없이 생체/환경 내에 존재하는 NADPH에 mBFP가 직접 결합하여 형광을 증가시킴으로써 물리/화학적인 반응 변수에 의존성이 적어 NADPH의 농도에 비례적인 형광 세기를 갖는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법은 단백질의 형광유발 구조(fluoropore) 형성에 소요되는 시간이 극히 짧고 다른 형광단백질이나 기존의 NADPH 정량키트에 커플링(coupling) 되어 발광을 유발하는 효소와 달리 산소에 비의존적인 특성을 지녀 실시간(real time, 즉 on line monitoring 이 가능한)에 가깝게 형광을 발생시키며, 정확도가 우수하고 고감도를 지니는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP는 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 도 1을 참조한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP 유전자는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 mBFP 유전자는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어짐에 있어, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)와 아미노산 보존적 치환(conservative substitution)을 고려하여 서열번호 2에 기재된 서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 mBFP 유전자나 단백질에 포함된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP는 친화성 태그(affinity tag)를 더 포함할 수 있으며, 상기 친화성 태그는 히스티딘 태그(his-tag)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP는 친화성 태그를 포함함으로써 단일 과정으로 고순도로 청색 형광단백질 his-mBFP를 대량 회수가 가능한 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 친화성 태그가 포함되는 mBFP는 서열번호 3에 기재된 염기 서열로 이루어지며, 아미노산 서열은 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 도 2를 참조한다.

보다 상세하게는 mBFP의 대량분리와 높은 순도의 정제를 위해 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용할 수 있는 폴리 히스티딘(poly histidine) 태그를 mBFP 유전자에 부착하였다. 일반적으로 단백질의 순수분리 과정에는 밀도 분획 원심 분리나 염석이나 투석(salting out, dialysis)을 거치고 이온교환이나 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(ion-exchange, gel filtration chromatography)를 다단계로 수행한 후 농축하는 방법이 주로 이용된다. 이러한 과정에서 단백질의 순도는 높아지나 수율의 경우는 극단적으로 낮아지는 문제점이 존재한다. 이러한 방법을 적용하기 어려운 단백질의 순수분리에는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 이용한 컬럼을 이용하거나 전기영동 후에 겔로부터 직접 용출시키는 과정이 이용되기도 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP는 자연적으로 NADPH에 결합하는 능력을 지녀 시바크론 블루 계열의 친화성 컬럼을 이용할 수 있으나, 결합력과 수율을 고려해 poly histidine 태그를 융합해 고순도/대용량의 분리 정제법을 확립하였다. 이러한 전략은 단일과정으로 단백질의 순수분리를 가능하게 하는 것은 물론, 경우에 따라서는 불순물의 제거를 위해 두 개의 친화성 컬럼(시바크론 블루와 Ni-NTA)을 연속해서 이용할 수 있다. 이를 위해 히스티딘 태그(his-tag)가 장착된 pQE30 플라스미드에 mBFP 유전자를 삽입하거나 his-tag를 N-말단에 포함하는 mBFP 유전자를 제작하여 숙주세포에 형질전환하는 방법으로 his-mBFP를 제조하였다. 준비된 유전자로 형질전환된 숙주에서 과발현된 his-mBFP 단백질을 친화 크로마토그래피인 Ni-NTA를 이용하여 분리 정제하였다. 도 4 및 도 5를 참조한다.

상기 분리 정제된 his-mBFP의 경우, 야생형 단백질과 동일한 NADPH 의존적 형광을 보임으로써 N-말단에 융합된 his 태그는 광학특성에 영향이 없음을 확인하였다. 도 6을 참조한다.

본 발명은 상기 친화성 태그를 이용하여 순수 분리된 his-mBFP를 이용하여 생체/환경 시료의 NADPH를 직/간접적으로 정량할 수 있는 방법과 이들을 조효소로 이용하는 다양한 효소 활성 측정을 위한 최적 분석 조건을 제공한다.

첫째) mBFP의 반응온도에 따른 의존성을 확인하였다. 즉, 온도의 변화에 따른 NADPH의 결합에 의한 mBFP의 형광 값을 측정한 결과, 다양한 온도 구간에서 선형의 반응 특성을 확인하였으며, 온도에 따른 형광 최대 값의 차이가 크지 않음을 확인하였다. 이러한 특성은 단백질 자체의 변성이 일어나는 온도를 벗어나지 않는 범위에서 분석 방법을 모두 적용할 수 있음을 보여주는 결과이다.

따라서 본 발명에 따른 his-mBFP의 활용은 기존의 NADPH 정량 키트의 커플링(coupling) 효소가 활성을 지니는 온도범위 이외에, 일반 효소 활성이 극히 저하되어 활용이 어려운 낮은 온도에서도 적용할 수 있음을 의미하며, 이러한 조건에서는 NADPH의 자연 산화가 적기 때문에 산화 억제제나 고정하는 시약이 필요치 않는 장점까지 있다.

둘째) 완충액의 pH에 따른 mBFP의 형광편차와 세기를 분석해 기존 방법이 지닌 완충액의 제한 문제가 해결 가능한지를 확인하였다. 그 결과, 약산성(pH 5.0)에서 염기성(pH 10.0) 완충액까지 NADPH 농도에 의존적인 청색 형광을 확인하였다. 따라서 단백질의 변성이 가능한 강 산성과 강 알칼리성 완충액을 제외한 대부분의 조건에서 본 발명의 분석방법을 활용할 수 있음을 확인하였다.

상기의 특성은 NADPH의 단순결합만이 필요한 분석방법이 지니는 장점으로써, 선형의 반응 특성을 보여주는 완충액의 pH와 염 농도를 고려할 때, 중성 근처의 pH와 염 농도를 지니는 대부분의 생체시료는 물론, 자연 생태계의 대부분의 시료도 희석과 같은 간단한 전처리 과정만으로 분석에 이용할 수 있음을 확인한 결과이다.

셋째) mBFP와 NADPH의 반응시간에 따른 mBFP의 형광능을 조사하였다.

보다 상세하게, his-mBFP 반응 용액에 NADPH의 첨가에 따른 형광 증진 시간을 확인하기 위하여 온도를 30℃로 고정 시키고 반응시간을 달리하여 측정하였다.

그 결과, NADPH의 첨가 후에 즉시 형광이 증진됨을 확인하였다. 1 내지 5분 사이의 반응 시간에서 형광세기가 최대 값에 도달하며 NADPH 농도에 의존적인 형광 세기를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 원하는 반응온도에서 평형에 도달시킨 반응 조성물을 혼합하는 경우, 1분 내외에서 NADPH의 농도를 재현성 있게 측정할 수 있음을 의미한다.

따라서 상기 본 발명의 his-mBFP는 짧은 시간(1 내지 5분)에 넓은 범위의 NADPH 농도(10 nM 내지 15 μM)를 측정할 수 있어, 측정 시간 지연에 따른 NADPH 산화 억제제의 처리나 고정 시약의 첨가가 필요 없다는 사실이 재확인한 결과이다.

또한, 기존에 사용되던 NADPH 분석 키트들이 커플링(coupling) 되어 있는 탈수소효소(dehydrogenase)의 반응 유도에 최소한 30분 이상의 반응 시간이 필요한 단점과, 화학촉매를 이용한 키트의 경우 넓은 NADPH 농도 범위의 측정이 불가능한 단점이 극복되었음을 의미한다. 따라서 본 발명의 분석방법은 다양한 생체/환경 시료에 존재하는 NADPH-의존적 산화환원효소와 같은 유용효소의 발굴과정이, 시료에 his-mBFP 을 첨가한 후, 실시간으로 관련된 효소원들의 선별이 가능하다는 것을 의미한다.

넷째) 다양한 생체/생태 시료에 존재하는 NADPH의 농도를 정확하고 빠르며 경제적으로 측정할 수 있는 his-mBFP의 최적 농도를 조사하였다. 보다 상세하게, 단백질 his-mBFP 농도에 따른 형광세기와 선형 응답 구간(linear range)을 확인하기 위하여 mBFP 농도를 달리하여 측정하였다.

그 결과, 최소 1 μM mBFP 이상에서 재현성 있게 NADPH의 농도가 측정됨을 확인하였다. 이러한 특성은 10 μM까지의 단백질 농도에서 구현됨을 확인할 수 있었으며, 이때 측정 가능한 NADPH 농도 범위는 10 nM 내지 1 mM 농도 범위이다. 이러한 측정범위는 기존의 키트와 비교할 때, 유사하거나 감도가 높은 것으로 측정에 필요한 시간이나 전처리 과정을 고려할 때, 상대적으로 매우 유리한 측정 방법임이 재확인된 결과이다.

상기 결과는 4차구조로 테트라머(tetramer) 구조를 지닌 mBFP 단량체 각각이 하나의 NADPH와 결합할 수 있는 특징에서 비롯된 것이다. NADPH와 결합한 4개의 단량체가 증가된 형광을 나타내기에 이론적으로는 측정에 필요한 몰 비가 4:1(NADPH : mBFP)이다. 따라서 최적화된 1 μM mBFP는 4 μM의 NADPH와 결합할 수 있다. 커플링(Coupling) 되는 단백질로써 촉매 기능을 지닌 산화/환원효소나 시클라아제(cyclase)를 이용하는 기존의 키트들은 이에 비해 상대적으로 많은 단백질을 필요로 한다. 농도 차에 의한 확산과 충돌과정이 촉매 활성에 매우 중요한 인자이며, 상대적으로 낮은 NADPH 친화성을 지니기 때문이다.

상기 장점 외에, his-mBFP가 대장균에서 전체 단백질 함량의 약 25 % 이상으로 과발현되기 때문에 1 L의 전형적인 배지(LB＋50 mg/㎖ 암피실린)로부터 단일과정으로 회수되는 80 mg 의 단백질로 80 내지 800회의 분석이 가능한 점은 경제성에 있어서도 탁월한 방법임을 증명하고 있다. 특히, his-mBFP 단백질 발현을 위한 유도체로 고가의 IPTG가 필요 없는 점은 또 다른 장점으로, 기존의 키트에 커플링(coupling)되는 알칼라인 포스파타제 및 루시퍼라제와 달리 적은 단백질 생산비용만을 필요로 하는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법은 시료와 his-mBFP의 반응시 계면활성제를 더 추가하여 혼합할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 계면활성제는 SDS, Na-deoxycholate, CTAB, DEDAB, 및 CHAPS로터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.

보다 상세하게는 본 발명은 상기 친화성 태그가 포함된 단백질 his-mBFP가 보다 낮은 NADPH 농도의 시료에서 형광능 감도를 높이는 위한 전략으로 전술한 4차 구조의 탈착(dissociation)을 위한 계면활성제(detergent)를 반응액에 첨가하였다. 잘 알려진 바와 같이 단백질의 4차 구조는 비 공유 결합력(수소, 이온, 소수성 결합력과 반데르발스 힘)에 의해 유지됨으로 3차 구조의 변성을 유발하지 않는 범위에서 계면활성제를 처리할 경우, 단량체로 풀어질 수 있다. 풀어진 각각의 단량체에 결합하는 NADPH는 4차구조에 결합하였을 때와 달리 구조적 방해(structural quenching)가 적음으로 형광이 증가할 가능성이 존재한다. 이를 확인하고자 계면 활성제로 0.1 % 미만의 SDS를 처리할 경우 형광 세기가 처리하지 않는 대조군에 비해 증가(2.5 내지 3배)하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성 또는 정량·정성 분석방법을 이용한 시료(가검물) 검정법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “시료”란 동식물 장내 및 동식물 조직으로부터 추출된 세포 추출물, 물, 토양, 식품, 생필품, 폐기물 등을 포함할 수 있으나, 이한 한정되는 것은 아니다.

생물학적 시료 내의 NADPH 함량을 알아보기 위해 각 시료의 파쇄 후, 원심분리를 통해 NADPH를 함유한 상층액을 분리하여 mBFP를 첨가해 NADPH의 양을 검정하였다. 그 결과, 건조중량(gDCW) 당 NADPH 양은 대장균의 경우는 181.56 nM, 효모의 경우는 154.23 nM 이 재현성 있게 측정되었다. 단백질 첨가 후 1 내지 5분 이내에 최대 값에 도달하였으며, 이러한 값은 문헌 값이나 상용화된 다른 키트를 이용한 비교실험에서도 유의성 있는 값임이 확인되었다. 따라서 상기 본 발명에 따른 생체 시료 내의 NADPH 측정은 세균은 물론 동/식물, 환경시료 등을 모두 이용할 수 있음이 확인할 수 있었다.

본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 his-mBFP를 이용한 NADP(H) 의존적 탈수소효소(dehydrogenase) 또는 산화환원효소(oxidoreductase)의 활성 측정법을 제공한다.

보다 상세하게는 his-mBFP를 이용하여, NADP(H)에 의존적인 활성을 지닌 산화환원효소에 기질을 첨가하여 반응을 유도한 후, 효소 활성에 의해 변화(NADPH 에서 NADP+ 로 산화되거나 역으로 환원)된 NADPH 양을 측정하여 효소활성 (μmol/min/mg 단백질)을 측정하였다. 이러한 과정은 산화/환원효소의 기질 소비량과 NADPH 소비량이 같은 몰 비로 소비되는 특성을 이용하기에 기질을 모르는 경우에도 변화된 NADPH의 양으로 역가(specific activity)를 측정할 수 있기에 가능한 방법이다.

상기 본 발명에 따른 효소 활성 측정법은 반응액 내의 NADPH를 his-mBFP 의 첨가만으로 1분 이내에 측정 가능한 방법임으로, 기존의 형광이나 발광 기질을 이용하는 방법에 비해 추가 기질의 첨가가 필요 없으며, 산소가 없는 조건과 낮은 온도에서도 사용할 수 있기 때문에 효소 활성 측정에 높은 신뢰성과 민감한 장점이 있다.

본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 his-mBFP를 이용하여 미생물의 존재 여부와 간접적인 정량방법을 제공한다. 보다 상세하게, his-mBFP를 이용하여 환경이나 식품 시료내의 NADPH 함량을 측정하여 이를 생산하는 미생물의 존재 여부와, 전술한 과정에서 측정된 특정 세균 당 NADPH 함량 값을 근거로 간접적인 미생물 존재량을 결정할 수 있다. 이는 환원된 NADPH의 경우, 생물이 존재하는 환경이나 생체 내에서만 생성되어지고, 시료 내에 존재하더라도 무생물 조건하에서는 자연산화에 의해 환원된 형태가 사라지기 때문이다.

상기 본 발명에 따른 미생물 존재 여부 확인이나 간접 정량 방법은 콜로니(colony) 생성을 위한 배양 시간이 필요 없고, 미생물 수를 직접 세지 않아 빠른 전 처리와 손쉽게 정량할 수 있는 장점이 있다. 이러한 측정법은 환경오염 정도를 판단하는 중요한 지표로써, 시료 내의 미생물 존재 여부의 즉각적인 확인은 물론, 시료에 세균을 임의로 첨가한 후, 배양에 따른 NADPH 증가 여부로써 잠재적 오염물질의 유무까지도 확인이 가능한 장점이 있다.

본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 his-mBFP를 이용하여 NADPH에 의존적인 탈수소효소(dehydrogenase) 또는 산화환원효소(oxidoreductase)등의 효소를 발굴하는 라이브러리 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 선별된 라이브러리의 탈수소효소 또는 산화환원효소들을 대상으로 NADPH에 의존적인 산화환원효소의 억제제(항 미생물제재) 선별방법을 제공한다.

보다 상세하게, 환경시료 내의 전체 유전체(metagenome)를 추출하여 Sau3A1을 이용해 부분절단을 수행한 후 라이브러리를 제조하였다. 제조한 라이브러리를 지닌 숙주들을 배양한 후, 활성 발굴의 목표가 되는 특정 기질과 NADPH를 첨가해 반응을 유도한 후, his-mBFP를 첨가해 NADPH 변화 양을 대조군과 비교하는 방법으로 관련 유전자원을 지닌 클론을 라이브러리에서 발굴 할 수 있다. 결부되어, 선별된 라이브러리의 탈수소효소 또는 산화환원효소를 지닌 클론들을 배양해 기질과 NADPH를 첨가한 후 다양한 화합물질이 존재하는 환경에서 반응을 유도해 his-mBFP로 NADPH의 변화 양을 정량하면 활성 억제제를 선별할 수 있다. 억제 약물의 상대적인 값은 IC50 값을 계산해 지표로 이용한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 his-mBFP의 안정적인 장기간 보관방법을 제공한다.

순수 분리된 his-mBFP 단백질 수용액의 보관방법에 의한 형광 활성능 감소 여부를 확인한 결과, 보관 첨가제를 처리하지 않고 4℃ 냉장실에 용액 상태로 2개월 보관 시 형광 세기가 약 80% 이상 유지되었고, 최종 농도 50%의 글리세롤(glycerol)이 첨가된 mBFP 용액을 -80℃ 냉동고에 6개월 보관 시 형광 세기가 약 90% 이상 유지되는 것을 관찰 할 수 있었다. 상기 본 발명에 따른 청색 형광 단백질 mBFP는 촉매기능이 있는 효소와 달리, 예민한 활성부위(active site)의 보존을 필요로 하지 않고 NADPH와 결합하는 단백질 구조만이 필요하기 때문에 3차구조의 부분적인 변성이 가능한 조건에서도 장기간 형광능을 유지할 수 있다. 이러한 장점은 키트 보관 방법의 용이함과 개봉 후 단지 냉장 보관만으로도 충분이 재사용할 수 있음을 의미하는 것이다.

본 발명은 메타게놈 유래 NADPH 의존적 청색 형광단백질 mBFP를 포함하는 NADPH 회수용 키트(kit)를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 mBFP는 히스티딘 태그(his-tag)를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 키트는 계면활성제, 환원제 및 세척액을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 키트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 친화도 크로마토그래피 분석법을 이용하여 NADPH를 회수할 수 있다.

보다 상세하게, Ni-NTA와 같은 히스티딘(histidine) 결합 담체를 이용해 his-mBFP를 고정화한 후, NADPH가 함유된 시료를 로딩(loading)하면 단백질이 지닌 NADPH 결합력에 따라 고정화된 단백질을 지닌 담체에 NADPH가 결합한다. 이를 일반적인 완충용액으로 충분히 세척한 후, 환원된 NADPH의 산화를 방지하기 위한 환원제(reducing agent, DTT나 cysteine)가 존재하는 용출 완충액(20 mM Tris-HCl, 1-2 M NaCl, pH 7.5)를 이용해 컬럼에 흡착된 NADPH를 회수한다. 이 때 고농도로 첨가되는 염(NaCl)은 단백질로부터 NADPH를 탈착시키기 위한 것이다. 이러한 방법으로 생체 시료로부터 NADPH를 추출할 경우, 고가로 거래되는 NADPH의 화합합성을 필요로 하지 않으며, 천연물로부터 생체 안정성이 담보된 NADPH의 회수가 가능할 것이다. 고정화된 단백질 담체의 경우, 단백질이 변성되지 않는 조건에서 수십 회 이상 재사용이 가능하기 때문에 매우 효과적으로 대량의 NADPH를 회수 할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 his-mBFP의 우수한 생체 내 발현 양과 NADPH 결합력, 결합 후에 증가 하는 형광세기를 이용하여 세포 활성도의 측정이나 조직, 기관을 염색하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게, his-mBFP를 암호화한 유전자를 특정 벡터에 넣어 미생물, 동물, 식물 세포로 형질전환 시키면 NADPH 농도에 의존적인 형광을 보여줌으로 세포 내의 NADPH 농도구배나, 활성도 차이를 형광세기로써 확인할 수 있다. 이 과정에는 형질전환된 세포 시료나 조직 등을 형광현미경이나 공초점렌즈 현미경(conforcal microscopy)으로 영상화된 이미지를 통화여 확인할 수 있다. 상기 과정에서 정상세포에 비해 상대적으로 활성화된 암세포의 증가된 NADPH로 인해 파란색 형광이 정상세포보다 증가하는 것을 확인할 수 있다. 도 14를 참조한다.

본 발명에 따른 분석방법은 기존의 정량 측정 시스템과 달리, 조효소 측정이나 변환에 필요한 기질을 첨가할 필요가 없으며, 기존 측정 시스템에 채용된 효소의 활성이 저하되는 낮은 온도에서도 이용할 수 있고, 형광을 발생하기 위한 특수한 구조(fluorophore) 형성에 소요되는 시간 없이 산소가 없는 조건에서도 짧은 시간 내에 형광을 증진시킴으로써 다양한 생태/환경시료의 조효소 정량은 물론 생체 내 NADPH 농도 측정이나 이들을 조효소로 이용하는 단백질의 이동 및 발현 량의 측정, 이러한 과정에 증진된 형광을 이용한 투-하이브리드 시스템(two hybrid system) 및 FRET 시스템으로의 접목을 통해 단백질의 상호작용 관찰, 생리활성 키트 및 바이오센서 등의 다양한 정량, 탐침, 진단 분야에 폭넓게 이용될 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 분석방법은 대장균에서 높은 발현율과 가용성을 지닌 his-mBFP 를 NADPH 형광 증진 리포터로 채용함으로써 낮은 단백질 생산비용과 대량 생산이 용이한 경제적인 장점을 지닌다.

또한, 본 발명에 따른 분석방법은 기존에 광범위하게 활용되고 있는 효소 활성를 이용한 측정 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결한 것으로, 다양한 세포생리, 면역, 공학, 의학 분야에 적용함으로써 보다 높은 효율과 신뢰도를 빠른 시간 내에 구현할 수 있어 폭 넓은 활용이 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 형광단백질 mBFP의 염기서열(A) 및 아미노산 서열(B)을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 염기서열(A) 및 아미노산 서열(B)을 나타낸 것이며,
도 3은 기존의 NADP(H) 분석방법(A)과 본 발명에 따른 NADP(H) 분석방법(B)을 비교하여 보여주는 도면이고,
도 4는 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 mBFP 발현벡터의 모식도이며,
(A: pQE30-mBFP, B: pTrc99A-his-mBFP)
도 5는 SDS-PAGE를 이용하여 친화 크로마토그래프로 분리된 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 순도를 분석한 도면이고,
(Lane 1, size marker; lane 2, cibacron blue 수지로 분리한 his-mBFP; lane 3, Ni-NTA 로 분리한 his-mBFP; lane 4, cibacron Blue 수지와 Ni-NTA 수지로 연속 분리한 his-mBFP)
도 6은 야생형의 청색 형광단백질 mBFP과 본 발명에 따른 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 형광 변화를 비교한 도면이며,
도 7은 온도 변화에 따른 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 형광 변화를 측정한 결과이고,
도 8은 완충액의 pH 변화에 따른 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 형광 변화를 측정한 결과이며,
도 9는 반응 시간에 따른 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 형광 변화를 측정한 결과이고,
도 10은 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 농도에 따른 형광 변화를 측정한 결과이며,
도 11은 계면활성제(SDS) 첨가에 따른 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 형광 변화를 측정한 결과이고,
도 12는 보관에 따른 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP의 형광활성 유지 정도를 확인한 결과이며,
도 13은 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP을 이용한 NAD(P)H 의존적 효소의 활성을 확인한 결과이고,
도 14는 잠재적 오염물질(유기/염류 등)로 인해 성장이 유도되어 과발현된 본 발명의 히스티딘 태그(his-tag)를 포함하는 청색 형광단백질 his-mBFP를 포함하는 세포의 형광 이미지이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[ 실시예 1] his - tag 이 융합된 his - mBFP 제작

단백질 과발현 유도와 효율적인 순수분리 정제를 위한 친화 태그 융합을 위해 his-tag이 장착된 pQE30(Clonetech, USA, GenBank No. AF485783)벡터에 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP 유전자(서열번호 2)를 삽입하여 pQE30-mBFP를 제조하였다.

mBFP는 Sph1 인식 부위를 포함하며 스타트 코돈을 제거한 프라이머(5'-ATAGCATGCCAGAATCTGAACG-3')와 BamHI 인식 부위를 지닌 프라이머(5'-ATAAAGCTTTCAAGCGGCGAAGCCG-3')를 이용해 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 단편을 제한효소 Sph1 및 BamHI으로 자른 후, 동일한 효소로 절단한 pQE30 벡터에 삽입하여 his-mBFP 유전자(서열번호 3)를 지닌 벡터 pQE30-mBFP를 제작하였다(도 4의 A).

상기 과정으로 제작한 his-mBFP는 히스티딘 태그(his-tag)와 단백질 암호화 부위에 있어 벡터에 존재하는 불필요한 아미노산 잔기가 포함된다. 이러한 구조가 단백질의 발현이나 기능에 영향을 줄 수 있기에, 프라이머에 직접 6개의 히스티딘(histidine) 잔기를 단백질 암호화 부위 앞에 융합시킨 재조합 단백질의 제작을 병행하였다. 이를 위해 EcoRⅠ 인식부위와 his-tag을 포함한 프라이머와 HindⅢ 부위만을 포함한 프라이머를 제작하여, pQE30-mBFP를 주형으로 PCR 증폭을 수행하였다.

상기 증폭된 단편은 제한효소 EcoRⅠ과 HindⅢ로 절단한 후, 동일한 효소로 절단한 pTrc99A 벡터(Pharmacia)에 삽입하여 pTrc99A-his-mBFP를 제작하였다(도 4의 B). 상기 제조한 2종류의 his-mBFP를 지닌 벡터(pQE30-mBFP, pTrc99A-his-mBFP)는 숙주로써 대장균 XL1-blue와 BL21에 형질전환 시켰다.

상기 숙주 세포는 2종류의 his-mBFP를 지닌 벡터를 안정적이면서 연속적으로 발현시킬 수 있는 공지된 어떠한 숙주세포에도 사용할 수 있다. 예컨대, E. coli JM109 나 RR1, LE392 나 W3110 등도 숙주로 이용할 수 있다. His-mBFP 유전자의 경우, 진핵 세포인 효모 사카로마이세스(Saccharomyces)나 피키아(Phichia)에서도 안정적으로 과발현됨으로 이들 세포도 숙주로 이용할 수 있다.

상기 본 발명의 his-tag mBFP를 갖는 2종류의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂방법 이나 FSB 용액 처리법 또는 전기 충격법에 의해 실시될 수 있다.

또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는 전기 충격법이나 리포좀-매개 형질전환법 등으로 상기 2종류의 his-mBFP 유전자를 지닌 벡터를 숙주 세포로 주입할 수 있다.

[ 실시예 2] his - mBFP 의 순수분리

(1) 균주 배양

상기 실시예 1에서 pQE30-mBFP로 형질전환된 단일 콜로니를 5 ㎖ 액체 배지(LB + 50 mg/㎖ 암피실린)에 접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 전배양하였다. 상기 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)값이 2.0 에 도달하였을 때, 1 L의 액체 배지(LB + 50 mg/㎖ 암피실린)에 접종하여 동일한 조건에서 8시간 동안 본 배양한 후, 고속 원심분리기를 이용해 세포를 회수하였다. 이때 his-tag을 지닌 mBFP의 경우, 특별한 유도제(inducer)의 첨가 없이 과발현되는 특성을 지녀 발현유도에 필요한 화학첨가제는 필요로 하지 않는 장점이 있다.

(2) his - mBFP 의 NADPH 결합능을 이용한 단백질 분리

NADPH와 결합하는 단백질의 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)로 이용되는 시바크론 블루(cibacron Blue)를 이용해 mBFP를 순수분리 하였다.

상기 시바크론 블루는 클로로트리아딘 색소의 일종으로 NAD(H) 나 NADP(H) 등을 이용하는 효소 등과 특이적으로 결합하는 능력을 지녀 단백질 정제에 흔히 이용되는 리간드이다. 상기한 방법으로 회수한 세포를 50 ㎖ 결합 완충액(binding buffer)(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)에 현탁한 후, 초음파 분쇄기를 이용하여 저온에서 10초 동안 초음파를 가하고 30초 동안 정치하는 과정을 10회 반복하여 세포를 파쇄하였다.

상기 파쇄된 세포를 고속 원심분리기(15,000 rpm, 15 min)를 이용해 불용성의 침전물을 제거한 후, 가용성 단백질이 포함된 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 잔존하는 염색체와 다당류 등의 거대 분자들의 제거를 위하여 20 ㎖ 당 1 g의 CDR(cell debris remover)을 첨가하여 저온에서 10분간 혼합한 후, 원심분리 (15,000 rpm, 30 min)하고 0.45 μm의 실린지 필터(syringe filter)를 이용하여 남아있는 불순물들을 제거하였다. 상기와 같이 전 처리된 세포 파쇄액에 10배 부피의 결합 완충액을 첨가하여 희석하였다.

상기 희석된 용액으로부터 his-mBFP를 정제하는 과정은 하기와 같다.

우선 친화 담체가 평형에 도달하도록 50 ㎖의 결합 완충액으로 충분히 세척하였다. 여기에 세포 파쇄액을 2 ㎖/min 의 유속으로 흘려보내 단백질의 부착을 유도한 후, 100 ㎖의 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)를 4 ㎖/min의 유속으로 흘려보내 컬럼에 결합되지 않은 단백질과 비 특이적으로 약하게 결합된 불순물들을 제거하였다. 준비된 시료에 같은 유속으로 용출 완충액(elution buffer)(20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7.5)을 흘려보내 친화 수지에 흡착된 단백질들을 회수하였다.

형광감도계(fluorometer) 분석으로 his-mBFP가 회수된 분획구간을 확인한 후, 용출 용액 내에 포함되어 있는 고농도의 염화나트륨을 제거할 목적으로 centri-prep(cut-off size 10 kDa)을 이용해 완충액을 교환하였다.

회수된 용액을 SDS-PAGE로 확인한 결과, 도 5의 2번 lane 확인할 수 있듯이 80% 이상의 순도를 지닌 his-mBFP를 분리할 수 있었다.

(3) 금속 친화 크로마토그래피( affinity chromatography )를 이용한 his - mBFP 순수분리

전술한 과정과 같이 단백질은 3차 구조와 특정 기질과의 결합력, 표면 전하, 소수성 등의 특성을 이용하거나 친화성 태그를 융합하는 방법으로 정제할 수 있다.

그 중 his-tag은 금속 친화능이 있어, 다양한 단백질에 융합해 친화 크로마토그래피(Ni-NTA)를 이용하는 대표적인 태그로 알려져 있다. NADPH 결합력을 이용하는 정제방법의 보완 또는 독립된 과정으로 mBFP 단백질을 분리할 수 있도록 his-tag을 mBFP에 융합한 후 하기와 같은 방법으로 순수 분리 정제하였다.

상기한 과정에 따라 회수한 세포를 50 ㎖ 결합 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM Nacl, pH 7.5)에 현탁한 후, 초음파 분쇄기를 이용하여 저온에서 10초 동안 초음파를 가하고 30초 동안 정치하는 과정을 10회 반복하여 세포를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 세포를 고속으로 원심분리(15,000 rpm, 10 min)해 불용성 침점물을 제거한 후, 가용성 단백질이 포함된 상등액을 회수하였다. 상기 회수된 상등액에 잔존하는 염색체와 다당류 등의 거대 분자들은 20 ㎖ 당 1 g의 CDR(cell debris remover)을 첨가해 반응을 유도한 후, 상기 방법으로 원심분리하거나 0.45 μm의 실린지 필터(syringe filter)를 이용해 불순물을 제거하였다.

상기 불순물이 제거된 상등액에 10배 부피의 결합 완충액을 첨가하여 희석하였다. 친화 크로마토그래프로 이용될 Ni-NTA 수지는 평형에 도달하도록 50 ㎖의 결합 완충액으로 충분히 세척하였다. 평형에 도달한 수지에 단백질 용액을 2 ㎖/min 의 유속으로 흘려 보내 부착을 유도한 후, 100 ㎖의 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH 7.5)를 4 ㎖/min의 유속으로 흘려 보내 결합되지 않은 단백질과 비 특이적으로 약하게 결합된 불순물들을 제거하였다. 단백질의 용출은 용출 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH 7.5)을 2 ㎖/min 으로 흘려보내 수행하였다.

분석은 형광감도계 분석을 통해 형광단백질이 회수된 분획구간을 확인하고, 용출 완충액에 첨가된 이미다졸(imidazole)과 비 특이적인 단백질 상호작용을 줄이기 위해 첨가된 염화나트륨의 제거에는 cut-off size 10 kDa인 필터를 이용하였다. 분리된 용액을 SDS-PAGE로 확인한 결과, 도 5의 3번 lane에서도 확인할 수 있듯이 85 % 이상의 순수한 단백질을 확인할 수 있었다.

(4) 친화 크로마토그래피를 연속으로 이용한 his - mBFP 의 순수분리

상기 전술한 친화 크로마토그래프 각각의 방법은 충분한 분리능을 보여주지만, 필요에 따라 100 % 순도에 가까운 절대 정제가 필요한 경우가 있다. 이러한 순도는 생체내의 간섭물질이 존재하는 각각의 과정으로는 쉽게 얻을 수 없으나 위의 과정을 연속으로 수행하면 가능한 것으로 알려져 있다. 따라서 두 개의 친화 크로마토그래피, 즉 시바크론 블루와 Ni-NTA 수지를 연속으로 수행해 his-mBFP 의 순수 정제를 수행하였다.

가용성 단백질이 존재하는 상등액 시료는 상기 과정과 동일하게 준비하여, 결합 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)로 평형에 도달시킨 시바크론 블루에 2 ㎖/min 의 유속으로 단백질의 부착을 유도한 후, 100 ㎖ 의 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)를 4 ㎖/min의 유속으로 흘려보내 컬럼에 결합되지 않은 단백질과 비 특이적으로 약하게 결합된 불순물들을 제거하였다. 부착된 단백질은 고농도의 염이 포함된 완충액(20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7.5)을 이용해 회수하였다.

SDS-PAGE 분석을 통해 mBFP가 회수된 분획구간과 순도를 확인한 후, 같이 용출된 오염 단백질의 제거를 위한 금속친화 수지 컬럼을 수행하였다. 이를 위해 회수된 단백질 용액을 4배로 희석한 후, 50 ㎖ 의 결합 완충액으로 평형에 도달시킨 Ni-NTA 수지에 2 ㎖/min 의 유속으로 단백질 부착을 유도하였다. 결합되지 않은 단백질과 비 특이적으로 약하게 결합된 불순물들을 제거는 100 ㎖ 의 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.5)을 4 ㎖/min의 유속으로 흘려 보내 수행하였다. Ni-NTA 수지에 흡착된 단백질들을 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH 7.5)을 이용해 회수하였다.

분석은 형광감도계를 이용해 분획구간을 확인한 후, 용출액에 존재하는 imidazole과 염화나트륨의 제거에는 desalting column을 이용하였다. 회수된 용액을 SDS-PAGE로 확인한 결과, 도 5의 4번 lane에서도 확인할 수 있듯이 최소 95% 이상의 고순도를 지닌 단백질을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6에서도 확인할 수 있듯이 상기 95% 이상의 순도를 지닌 his-mBFP의 형광능은 친화 태그가 융합되지 않은 야생형 단백질과 차이를 지니지 않아 NADP(H), 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성 측정 과정에 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3] his - mBFP 를 이용한 NADPH 정량 최적 반응조건 확립

(1) 온도 변화에 따른 his - mBFP 의 형광능 측정

NADPH와의 결합에 의한 his-mBFP 형광의 온도에 대한 의존성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 순수 분리된 mBFP 용액(5 μM, 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5) 0.9 ㎖을 각각의 온도(4, 10, 20, 30, 37, 45, 55℃)로 조절된 항온기(Water bath)에 한 시간 정치한 후, NADPH 농도 별로 0.1 ㎖를 혼합하여 반응시켰다.

형광의 측정은 형광감도계를 이용하여 350 nm 에서 여기(excitation) 하고 450 nm에서 방출(emission) 되는 값으로 결정하였다.

그 결과 도 7에서 확인할 수 있듯이, 각 온도에 따른 형광세기는 온도가 올라감에 따라 감소하는 것을 볼 수 있었다.

보다 상세하게, NADPH 농도에 따른 선형의 반응 특성을 확인할 수 있는 구간은 4℃ 내지 10℃에서 NADPH 10 nM 내지 10μM 농도, 20℃ 와 37℃에서 NADPH 10 nM 내지 5 μM 농도, 45℃와 55℃에서 NADPH 100 nM 내지 1 μM 농도였다.

(2) 완충액의 pH 에 따른 his - mBFP 의 형광능 측정

his-mBFP를 이용한 NADPH 측정과정에서 완충용액에 따른 형광편차와 세기를 확인하기 위하여, 순수 분리된 his-mBFP 용액(5 μM, 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5) 0.5 ㎖에 각 완충액(100 mM) 0.4 ㎖ 와 NADPH를 농도별로 0.1 ㎖ 를 혼합하여 반응시켰다. 이때 이용한 완충액의 최종 농도는 하기와 같다.

- 완충액의 최적 농도 및 pH-

40 mM Tris-HCl(pH 7.5), 40 mM sodium-phosphate(pH 6.01), 40 mM carbonate-bicarbonate(pH 10.37), 40 mM PBS(pH 7.2), 40 mM glycine-NaOH(pH 9.0), 40 mM citric acid-sodium citrate(pH 4.71), 40 mM acetic acid-sodium acetate(pH 3.95), 40 mM citric acid-phosphate buffer(pH 2.65)

그 결과 도 8에서 확인할 수 있듯이, 각 완충액에 따른 mBFP 형광세기는 약산성 완충액에서 염기성 완충액까지 넓은 범위에서 NADPH 농도에 따라 뚜렷한 선형 구간을 보여 주었다. 또한, 유의성을 벗어나지는 않으나 산성 완충액에서는 형광이 감소하여 선형구간의 기울기가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

형광 세기는 40 mM Tris-HCl(pH 7.5) 에서 가장 높았다. NADPH 농도에 대한 유의성 있는 선형의 반응 특성을 확인할 수 있는 구간은 40 mM Tris-HCl(pH 7.5), 40 mM glycine-NaOH(pH 9.0), 40 mM PBS(pH 7.2)에서 10 nM 내지 10 μΜ 로 나타났으며, 40 mM sodium-phosphate(pH 6.01)와 40 mM carbonate-bicarbonate(pH 10.37) 완충액에서는 10 nM 내지 1 μM 농도범위의 NADPH를 재현성 있게 측정할 수 있었다. 각각의 완충액의 농도를 최종 20 mM 로 보정해 실시한 실험에서도 같은 결과를 보여, pH 를 결정하는 염농도는 20-40 mM 범위에서 안정적으로 반응함이 확인되었다.

(3) 반응시간에 따른 his - mBFP 의 형광능 측정

NADPH의 결합에 따른 his-mBFP의 최대 형광을 띄는 시간을 측정하기 위하여 순수 분리된 his-mBFP 용액(5 μM, 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5) 0.9 ㎖을 30℃ 항온기에 정치시켜 평형에 도달시킨 후, NADPH 농도 별로 0.1 ㎖를 첨가해 반응 시간에 따른 형광세기를 측정하였다.

그 결과 도 9에서 확인할 수 있듯이, 최대 형광을 유도하는데 필요한 반응시간은 30초에서 5분 사이면 충분했으며, 대략 1분 내외의 시간에서 안정적으로 재현성 있게 측정됨이 확인되었다.

이는 발색반응이나 활성을 지닌 효소들이 coupling 되는 다른 기존의 공지의 방법들과 다르게, 시간의 경과에 따라 절대 값이 감소하는 경향을 보여 주었다. 이러한 특성은 반응시간에 경과함에 따라 오히려 화학적인 안정성이 적은 NADPH의 자연산화와 결부되어 있는 현상으로써, 본 발명의 신속 측정법이 지닌 장점을 잘 설명해주는 결과이기도 하다.

시간의 경과에 따른 형광세기의 감소는 감도를 낮추는 효과를 지니지만, 정해진 시간에서의 선형 직선 값들은 유의성 있게 확인되었다. 따라서 본 발명의 방법은 1분 내외에서 최대 감도를 지니지만, 다른 시간 범위에서도 유의성 있게 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 결국, 시료의 양에 따라 정해진 반응 시간을 규정한 후, 이에 맞는 표준곡선(standard curve)을 구해 실험에 이용할 경우, 시간에 따른 정량 값의 차이가 없음을 의미하는 것이다.

(4) 단백질 농도에 따른 청색 형광능 측정

his-mBFP의 단백질 농도에 따른 형광세기와 NADPH 측정 감도를 확인하기 위하여, 각각 농도(0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM)를 달리한 his-mBFP 용액(20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5) 0.9 ㎖과 NADPH를 농도 별로 0.1 ㎖ 씩 혼합하여 반응시켰다.

그 결과 도 10에서 확인할 수 있듯이, 각 mBFP 농도에 따른 형광세기는 농도가 낮아짐에 따라 감소하는 것을 볼 수 있었다.

보다 상세하게, 7 μM 과 10 μM 농도의 단백질 농도에서 형광세기는 유의성 있게 측정되었으며, 1 μM 이하의 단백질에서의 형광세기는 크게 감소하였다.

NADPH 농도에 따른 선형의 반응 특성을 확인할 수 있는 구간은 his-mBFP의 단백질 농도 7 μM 내지 10 μM에서 NADPH 10 nM 내지 10 μM, his-mBFP의 단백질 농도 5 μM에서 NADPH 10 nM 내지 5 μM, his-mBFP의 단백질 농도 1 μM에서 NADPH 10 nM 내지 1 μM, his-mBFP의 단백질 농도 0.1 μM과 0.5 μM에서 NADPH 10 nM 내지 0.5 μM이었다.

상기의 결과는 측정하려는 시료 내에 추정되는 NADPH의 농도에 따라 최대 100배의 희석된 단백질을 이용해, 손실을 최소로 하며 재현성 있게 NADPH를 측정할 수 있거나, his-mBFP 단백질의 농도를 최소로 한 후, 시료를 희석해 사용할 수 있는 장점을 모두 지닌 것을 확인한 결과이다.

[ 실시예 4] 낮은 NADPH 농도 시료에서 his - mBFP 의 측정 감도를 높이는 방법

상기 실시예에서 보는 바와 같이 his-mBFP의 경우, 다양한 농도 범위에서 최소 10 nM NADPH 농도까지 정확하게 측정할 수 있는 것이 확인되었다.

하지만 시료의 양이 제한적이거나 활성이 낮은 NADPH-의존적 효소 활성 측정 시, 보다 적은 양의 NADPH를 예민하게 측정할 수 있는 방법이 요구될 수 있다.

상기 방법을 모색하던 중, 본 발명자들은 his-mBFP의 경우, 4개의 소단위체를 지닌 테트라머(tetramer)라는 구조에 착안해 감도를 높이는 방법을 고안하였다. 즉, 4개의 소단위체를 NADPH 결합부위의 변형이 유도되지 않는 방법으로 유리(dissociation) 시키면 NADPH 각각이 결합된 4개의 분자 구조물이 생길 수 있으며, 이는 4개의 소단위체가 결합된 원형의 단백질에 비해 형광간섭이나 소강(quenching) 이 줄어드는 효과로 나타나 형광세기가 증가할 것이라는 가정을 한 것이다. 이를 확인하기 위하여 순수 분리된 mBFP 용액(5 μM, 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5)에 단백질 사량체를 분리시킬 수 있는 소량의 SDS(0.01%)를 첨가하고, NADPH 1 μM을 0.1 ㎖ 혼합하여 반응시켰다.

그 결과 도 11에서 확인할 수 있듯이, SDS를 첨가함으로써 같은 양의 his-mBFP와 NADPH를 지닌 대조군에 비해 2.4 내지 3.1배 형광 값이 상승하는 것을 확인할 수 있었다.

보다 상세하게, SDS가 포함되지 않은 대조군의 형광과 비교하여 50 nM NADPH에서 3.1배, 10 nM NADPH에서 2.4배의 형광세기가 증가됨을 관찰할 수 있었다.

상기의 결과로부터 형광의 증가는 측정 범위의 확장을 유도해 SDS를 포함한 계면활성제를 처리할 경우, 같은 단백질 농도에서 최소 100 pM까지의 NADPH가 측정 가능함이 확인한 결과이다. 이러한 과정에 사용 가능한 계면활성제는 SDS로 대표되는 이온 디터젼트(ionic detergent)와 트리톤 X-100(Triton X-100) 이나 트윈 20(Tween 20)으로 대표되는 비이온 디터젼트(non-ionic detergent)들이 적절한 농도 범위(0.01 내지 1%)에서 모두 유사한 효과를 지님이 확인하였다.

[ 실시예 5] 보관방법에 따른 his - mBFP 형광능 유지

형광 활성에 매우 중요한 구조 유지가 필요한 his-mBFP의 장기 보관 방법을 알아보기 위하여, 적절한 단백질 보관 방법들을 조사하였다. 보관조건을 온도(4℃, -20℃, -80℃)와 보관을 위한 첨가제의 첨가 농도(최종 농도 기준 5% 트레할로스, 25% glycerol, 50% glycerol)를 달리하여 시간에 따른 형광능의 감소 정도를 확인하였다.

각각 조건에서 보관한 his-mBFP 시료는 냉동 시료의 경우에는 사용 전에 구조 재구성이나 복원에 필요한 시간 등을 고려해 5 내지 45분 동안 냉장 완충액에서 충분히 수화시킨 후 실험에 이용하였다.

그 결과 도 12에서 확인할 수 있듯이, 냉장이나 냉동 조건 모두에서 보관된 단백질의 형광능이 6개월이 지난 후에도 약 80% 이상 유지되는 것이 확인되었다.

보다 상세하게, 보관을 위한 첨가제를 처리하지 않고, 4℃ 냉장실에 용액 상태로 2개월 보관 시 단백질의 형광능은 80% 이상 유지되었고, 보관을 위한 첨가제 첨가 하에 20 내지 80℃에서 2개월 보관 시에는 95% 이상 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

6개월이 경과한 시료의 경우, 첨가제가 첨가(25 내지 50%)된 경우에는 90% 이상이 유지되었으나 냉장 시료의 경우 65 내지 70% 수준으로 형광세기가 감소하는 것이 관찰되었다.

상기의 결과는 2개월 이내의 단기보관에는 냉장으로 충분하며, 장기간 보관하는 방법으로는 첨가제와 함께 냉동하는 것이 유리함을 확인한 결과이다. 따라서 제작되는 NADPH 분석을 위한 키트를 용액으로 구성하느냐와 동결건조물로 구성하느냐에 따라 보관방법을 달리할 수 있으며, 동결 건조된 시료의 경우에도 수화 후에는 2개월 정도 냉동 보관하며 NADPH 측정에 재사용할 수 있음을 알 수 있었다.

첨가제는 상기한 첨가제 외에 EDTA, NaCl, KCl, 시스테인, 디티오트레이톨(DTT) 등이 부분적인 효과를 지닌 것이 확인하였고, 보관 용기나 완충용액에는 큰 편차를 보이지 않는 것을 확인하였다.

[ 실시예 6] 생체시료 내의 NADPH 농도 검정법

(1) his - mBFP 를 이용한 생체 내 NADPH 농도 정량법

상기한 최적 반응조건에서 생체시료 내의 NADPH 함량을 정확하게 잴 수 있는지를 확인하기 위해, 시료로 대장균(Escherichia coli XLΙ-blue)과 효모(Candida albicans NUM678)와 같은 단세포와 콩잎과 토끼 조직과 같은 다세포 조직을 준비하여 파쇄를 유도한 후, 원심분리를 통해 NADPH를 함유한 상층액을 분리하여 his-mBFP를 첨가해 NADPH의 양을 검정하였다.

보다 상세하게, 대장균과 효모의 경우 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세균을 배양하여 액화질소로 급속 냉동시키고 얼음에서 해동하는 과정을 3회 반복한 후 초음파기(sonicator)를 이용해 세포를 파쇄한 후 고속 원심분리기를 이용해 상등액을 분리(15,000 rpm, 30 min)하였다.

상기 분리된 상등액에 3배 부피의 완충액 20 mM Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 희석한 후 검정 시료로 이용하였다.

다른 생체시료(동식물의 조직)의 경우, 조직을 세절한 후 액화질소에 급속 냉동한 후, 각 조직 30 mg 당 1 ㎖의 균질화 완충액(10 mM 인산 완충용액, pH 7.4)을 첨가하여 조직균질기(homogenizer)로 1 내지 5분간 갈아서 파쇄를 유도하였다. 준비된 시료를 고속 원심분리(15,000 rpm, 30 min)하여 상등액을 회수해 시료로 이용하였다.

상기 모든 시료의 경우, 문헌에 알려진 NADPH 추정치를 근거로 희석하거나 농축하여 측정에 이용하였고, 측정된 값은 건조중량 당 몰수로 계산하였다.

그 결과 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 건조중량 당 NADPH량은 기존 추정치와 유사하거나 더 높게 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 방법의 신뢰도를 담보하는 것은 물론, 신속 측정(자연산화가 유도되지 않게 빠른 시간 안에 측정)에 따른 기존 값과의 차별성을 보여주는 결과이다.

(2) 기존 상용화되어 시판중인 NADPH 측정 키트와의 신뢰도와 반응 시간비교

본 발명의 his-mBFP를 이용한 NADPH 정량 방법과 기존에 상용화된 NADPH 정량 키트와의 비교를 위해, 대장균과 효모를 시료로 하여 NADPH가 포함된 상층액을 추출하여 측정능을 비교하였다.

비교 대상으로는 2 종류의 상용화된 NADPH정량 키트(BioVision사 Catalog K347-100 와 EnzyChrom사 Catalog ECNP-100)를 이용하였다.

보다 상세하게 각각의 키트를 설명하면, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세균을 배양한 후, BioVision사가 제공하는 설명서에 따라 세균의 샘플들을 PBS 용액에 넣고, 원심분리하여 세척한 후, NADPH 추출 완충용액을 넣은 다음 세포를 파쇄하여 상층액을 회수하였다.

상기 샘플을 항온기(60℃)에 30분간 정치시키고, 96웰 플레이트에 상기 전 처리한 상층액과 NADP Cycling Buffer 98 ㎕와 NADP Cycling Enzyme Mix 2 ㎕을 혼합한 NADP Cycling Mix를 넣어 5분간 반응시킨 후 10 ㎕ NADPH developer 첨가하여 4시간 반응을 유도해 분광감도계로 특정 파장(OD 450 nm)의 빛에서 흡광도를 측정하였다.

EnzyChrom사가 제공하는 키트의 경우에는 상기 방법으로 세균으로부터 NADPH가 포함된 시료를 추출한 후, 96웰 플레이트에 추출한 샘플과 상온에서 준비한 효소 반응 완충액(60 ㎕ assay bffer, 1 ㎕ enzyme mix, 10 ㎕ glucose and 14 ㎕ MTT)을 넣고 혼합해 30분간 반응 시킨 후, OD 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명의 분석방법은 전술한 최적 조건(1 내지 5 μM 의 단백질만을 첨가)에 따라 his-mBFP 만을 첨가한 후, 추가의 반응시간 없이(<1 min 이내) 즉시 형광값을 측정하였다.

그 결과 하기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 기존의 키트들에서 평균적으로 확인 가능한 정량 값에 비해 본 발명의 분석방법은 약 129 내지 132% 정도의 높은 형광값을 반복적으로 보여 주었다.

상기의 결과는 본 발명의 his-mBFP를 이용한 분석방법이 지닌 장점으로 즉, 신속하게 측정할 수 있으며, 복잡한 전/후처리가 필요 없고, 촉매 효소가 추가되지 않아 반응 유도에 필요한 시간이 필요치 않는 결과로 인해 자연산화나 다른 간섭효소의 반응에 따른 NADPH의 소실이 일어나지 않아 얻어진 결과이다.

따라서 기존의 상용화된 키트들이 지닌 시료 초기에 존재하는 NADPH의 직접 정량이 불가능한 단점이 본 발명의 방법으로 해결되었음을 의미하며, 보다 실제 값에 가까운 정량치를 구현할 수 있게 되었음을 보여주는 것이다.

또한, 본 결과 값의 실제 값의 구현 정도는 spiking assay(알고 있는 NADPH의 농도를 일정량 시료에 첨가 한 후, 키트에 따라 재측정하여 추가된 NADPH의 양을 정확하게 잴 수 있는 능력의 비교)를 통해 재확인하였다.

[실시예 7] NADPH에 의존적 활성을 지닌 특정 효소의 활성 측정 방법

his-mBFP가 지닌 NADPH 의존적 형광세기의 증가를 이용하여 이들 NADPH를 활성 보조인자(전자 공여체 NADPH를 쓰는 경우에는 감소된 형광을, 전자 수용체로 NADP+를 이용하는 경우에는 증가된 형광을 측정)로 이용하는 유용효소나 생체 효소의 생리 활성도를 측정할 수 있는 활성 측정법을 구축하였다.

이를 위해 NADP(H)에 의존적인 활성을 지닌 산화환원효소에 기질을 첨가하여 반응을 유도한 후, 효소 활성에 의해 변화(NADPH 에서 NADP+ 로 산화되거나 역으로 환원)된 NADPH량을 측정하여 효소활성(μmol/min/mg 단백질)을 측정하였다. 동시에, 반응액 내의 특정 기질의 존재 유무의 확인과 이에 따른 정량 방법으로, his-mBFP 와 적정량의 NADPH를 시료에 첨가한 후 산화환원효소의 반응을 유도해 변화된 NADPH의 양을 계산하여 존재하는 기질을 정량할 수 있는 방법을 구축하였다. 이는 NADPH 의존적 산화환원효소의 모든 반응동력학적(kinetics) 특성이 소모되는 기질과 NADPH의 몰비가 같다는 사실에 근거를 하는 것이다. 이들 활성 측정법의 구축과 신뢰도 평가는 하기의 상용화된 효소를 이용해 검증하였다. 반응속도는 일정 시간 (5-20분) 동안 형광 감소가 일정한 시점에서 보여지는 기울기를 이용해 계산하였다.

전형적인 반응의 예로 우선, 0.02 unit 글루타치온 환원효소를 5 mM 산화형 글루타티온(GSSG)과 2 mM의 NADPH를 포함하는 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.5)과 상온에서 반응시켜 형광을 측정하였다. 또한 0.03 unit 이소시트릭산 탈수소화 효소를 5 mM isocitrate, 2 mM MgCl₂와 2 mM NADP+를 포함하는 50 mM 인산염완충용액(pH 7.2)과 상온에서 반응시켜 형광을 측정하였다. 또한 0.02 unit 포도당-6 인산 탈수소효소를 5 mM 포도당 6-인산(glucose 6-phosphate), 50 mM MgCl₂와 2 mM NADP+를 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)과 상온에서 반응시켜 형광을 측정하였다. 또한 0.04 unit 말레이트 탈수소 효소를 5 mM L-말레이트, 50 mM MgCl₂와 2 mM NADP+를 포함하는 50 mM Tis-HCl 완충용액(pH 7.5)과 상온에서 반응시켜 형광을 측정하였다. 또한 0.02 unit NADPH Oxidase를 50 mM MgCl₂와 2 mM NADP+를 포함하는 50 mM 인산완충액(PBS, phosphate buffered saline)과 상온에서 반응시켜 형광을 측정하였다. 형광 측정 시, 반응액을 희석해 his-mBFP 와의 몰비를 고려해 이용하였다.

상기 효소들의 1 unit는, 25℃에서 1 μmole NADPH를 NADP+로 산화시킬 수 있거나 반대로 환원시킬 수 있는 효소의 양이다.

결과적으로 모든 실험과정에서 초기에 넣어준 모든 효소의 역가에 해당되는 형광의 증가나 감소가 정확하게 측정되었다. 최종적으로 활성을 모르는 효소를 동일한 과정으로 변화된 형광 값을 측정하여 기질의 산화속도로 환산해 역가를 결정한 후, 실제 감소한 기질을 HPLC와 MS로 분석한 결과와 비교하면, 형광 값의 변화에 의해 계산된 활성 값과 기질의 변화에 의해 측정된 활성 값이 동일한 것이 확인되었다.

상기의 결과는 NADPH 나 NADP+를 이용하는 어떤 효소의 활성 측정에도, 단지 1 내지 5 μM의 his-mBFP 만을 첨가해 변화된 형광 값을 측정하면 정확하고 신속하게 효소의 비활성 속도(specific activity)를 잴 수 있음이 검증된 것이다. 이러한 과정으로 측정 가능한 중요한 효소로는 NAD(P)H:quinone oxidoreductase 이외에, nitric oxide synthase, thioredoxin reductase, glutathione dependent oxidoreductase, NADPH dehydrogenase, succinate:ubiquinone oxidoreductase, plasma membrane oxidoreductase, cytochrome c oxidoreductase, oxoglutarate oxidoreductase, ferredoxin-NADP+ reductase, D-xylulose reductase, aldose reductase, alcohol dehydrogenase, glucose-fructose oxidoreductase, 2,5-DGK reductase, sorbitol dehydrogenase, mailc enzyme등이 있다.

[실시예 8] 시료 내 NADPH 농도 측정에 의한 미생물 간접 정량과 환경 오염 측정 방법

(1) 세포내 NADPH를 분석하여 세포량을 간접적으로 정량하는 방법

다양한 환경 생태 시료에 세포가 존재할 경우, 생리활성 지표 물질인 NADPH 의 존재는 필수적이다. 세포가 존재하지 않거나 사멸되었을 경우, 측정할 수 있는 NADPH의 양은 기저 수준(basal level)보다 낮게 측정되기 때문이다.

따라서 기존의 시료희석, 고체 배지 도말, 세균 수 관찰, 희석 배율 역산의 과정에 의한 총 세균 수 산정으로 이루어지던 미생물 존재나 오염 정도의 확인을 실시간에 가깝게 정량할 수 있는 his-mBFP 의 활용 방법을 고안하였다.

보다 상세하게, 생태 환경 시료(토양, 해수, 담수 등)나 검체(오염이 쉬운 생필품 등)는 무균조작을 행하며 멸균한 용기에 채취하여 급속 동결하거나 냉장을 유지시키면서 빠른 시간 내에(냉장 보관의 경우는 1 시간 이내) 시험 하였다.

곡분이나 분유와 같이 건조되어 잘 변질 또는 부패되지 않는 검체는 냉동상태에서 운반할 필요는 없으나 2차 오염을 방지하기 위하여 밀봉 또는 밀폐하였다. 검체 시료가 얼음이나 빙과류일 경우에는 멸균된 유리용기에 넣어 용해시킨 뒤 액체 시료와 같은 방법으로 처리하였다. 시료의 냉각 보관이 1일 이상이 되면 시료 중의 저온성 세균의 증가, 중온 세균이나 고온세균이 사멸하는 결과를 가져오므로 유의해야 한다. 냉장을 위하여 얼음을 사용할 때에는 2차 오염을 방지하기 위하여 얼음이나 그 녹은 물이 검체에 직접 접촉되지 않도록 한다. 검체 채취 기구는 미리 건열 및 화염멸균한 후 검체마다 바꾸어 가면서 사용하였다.

상기 준비한 다양한 생태 환경 시료나 검체 등은 무균조작 하에 적당한 멸균수로 희석한 후, 균질기(homogenizer)로 2 내지 10분간 파쇄를 유도하였다.

보다 상세한 시험 용액의 제조예로는, 액상 검체(채취된 검체를 강하게 진탕하여 혼합한 것), 반유동상검체(채취된 검체를 멸균 유리봉과 멸균 수저 등으로 잘 혼합한 후, 그 일정량을 멸균 생리식염수와 혼합해 균질화해 상등액을 회수한 것), 고체검체(채취된 검체의 일정량을 잘게 자른 후 멸균 생리식염수를 가해 균질기로 분쇄한 후, 상등액을 회수한 것), 분말상 검체(검체를 멸균 유리봉과 수저 등으로 잘 혼합한 후 일정량을 멸균 생리식염수와 혼합하고 균질화한 후, 상등액을 분리한 것), 버터와 유지류(65℃ 이하의 온탕에서 15분 내에 용해시켜 멸균 생리식염수를 가하고 균질화해 상등액을 취한 것)등이 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 준비된 시료들의 상등액을 필요에 따라 희석한 후, his-mBFP(1 내지 5 μM)를 첨가한 후, 즉시 형광 값을 측정한 결과, 시료 내에 존재하는 NADPH의 양을 정량할 수 있고, 이를 전형적인 오염원으로써 미생물의 NADPH 함유량으로 나누면 상대적인 오염 정도를 쉽게 판단할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

오염원으로써 매우 다양한 종이 존재하나 미생물의 경우는 종간 NADPH의 농도편차가 크지 않아 모든 종에 대한 표준곡선이나 검증표는 필요로 하지 않는다. 상기의 결과는 본 발명의 his-mBFP를 이용한 분석방법이 실시간에 가깝게 미생물의 오염정도를 판단 할 수 있을 뿐 아니라, 기존의 평판배양법이나 현미경 관찰법 등에 비해 상대적으로 유리한 장점이 있는 것을 확인한 결과이다. 특히 시료의 전/후처리에 따른 NADPH의 자연산화 또는 2차 오염의 문제로 인해 발생하는 편차를 근본적으로 해결할 수 있는 방법임을 증명하였다.

(2) 잠재적 오염물질을 지닌 시료를 첨가하여 배양된 미생물의 NADPH를 이용한 오염 측정법

시료 내에 기 존재하는 다양한 유기물질이나 염류 등은 다양한 생물, 특히 미생물의 영양분으로 이용될 수 있어 잠재적인 오염물질로 인식되어 진다. 이러한 오염원에 의한 부영양화나 식품 변질/부패 등은 명확한 지표를 근거로 잠재적 오염물질로써의 관리가 필요하다. 이러한 판단의 근거를 his-mBFP 를 이용해 제공할 수 있는 시험법을 고안하였다.

보다 상세하게는, 미생물을 상기 실시예 2와 동인한 방법으로 배양할 때 최소 배지(C 와 N-source 가 결여 되어 있는)를 이용하고 시료(식수, 담수, 해수, 식품, 생필품, 토양 등)의 일정 양을 첨가하여, 세포 성장이 유도될 수 있는 충분한 배양을 유도(1 내지 2일)하였다. 배양 조건은 대장균과 같은 중온균의 성장이 유리하도록 상기 실시예 2와 동일한 조건을 사용한다. 배양 과정 중에 배양액의 일정량을 회수해 전술한 방법대로 시료를 처리하여 시간의 경과에 따른 NADPH 농도의 변화량을 모니터링 하였다. 얻어진 측정치를 근거로 시료 내에 잠재적 오염물질로써 가능한 유기/염류 등의 존재 여부를 판단하였다.

이러한 과정에 본 발명의 재조합 벡터 pQE-mBFP로 형질전환된 대장균을 이용하면 상기 과정을 이용하지 않고도 배양액 자체의 형광 측정만으로도 균의 성장 여부를 확인할 수 있다.

즉, 도 14의 결과에서도 확인할 수 있듯이 배지에 존재하는 오염 물질이 영양분으로 이용되어 재조합 균체의 생장이 유도되고, 결과적으로 세포질의 단백질 발현양도 증가되고 결국 형광의 세기가 크게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 과정에서는 세포 자체의 형광 값을 재거나 회수한 후, 파쇄하여 상등액의 형광을 측정하는 어느 하나의 방법을 이용하여 시료의 오염 정도를 측정할 수 있다.

[실시예 9] NADPH에 의존적 효소(dehydrogenase와 oxidoreductase등)를 라이브러리에서 선별하는 방법

DNA 추출 키트(genomic DNA isolation kit, promega)를 사용하여 환경시료 내의 전체 유전체(metagenome)를 추출하고, 제한효소 BamH1이나 GATC를 인지 절단하는 Sau3A1을 이용해 부분절단을 수행하였다. 절단된 DNA 단편을 전형적인 클로닝 벡터(pBluscript II SK)에 도입하여 대장균 숙주(BL21)에 도입하는 방법으로 라이브러리를 구축하였다.

형질전환에는 전형적인 과정에 따라 전기천공법(electrophoration)을 이용하였다. 제조한 라이브러리를 지닌 숙주들을 50 ㎍/㎖ 앰피실린(ampicillin)을 함유하는 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 16h 배양한 후, 각각의 콜로니를 같은 조성의 배지 350 ㎕를 지닌 96웰 플레이트에 옮겨 일정 시간(24-48 hr) 같은 조건에서 진탕 배양한다. 배양 후, 세포 용균에 필요한 lysis 용액(0.1% SDS 또는 1% triton X-100 과 0.5 % lysozyme 포함)을 처리하여 세포를 파쇄하였다.

상기세포 파쇄액에 발굴의 대상이 되는 기질(1 내지 5 mM)과 NADPH(1 mM)를 첨가해 반응을 유도하였다. 10 내지 60 분간의 반응 경과 후, his-mBFP(1 내지 5 μM)를 첨가해 형광을 측정하는 방법으로 NADP(H)의 변화량을 계산하였다. 이때, his-mBFP 와의 반응 몰비를 고려하여 반응액을 희석해 이용하였다.

NADP(H) 정량 결과, 다른 플레이트의 대장균에 비해 NADPH 잔존량의 변화가 ±15%이상 차이 나는 것을 선별하였다. 선별된 균주로부터 플라스미드를 분리(plasmid DNA isolation kit, promega)한 후, 서열분석을 통해 선별 대상이 되는 유전자의 존재 여부를 확인하였고 그 결과, 93% 이상의 비율로 positive 클론의 선별할 수 있었다.

본 발명은 상기 실시예와 같이 라이브러리 벡터제작에 사용될 수 있는 적합한 벡터, 선별마커(selectable marker), 숙주 세포, 숙주 세포 내로 운반하는 방법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 전술한 과정의 라이브러리를 산화/환원 효소군(enzyme family)을 지닌 클론으로 제한한 후, 이들 효소의 활성 측정 과정에 기질 외의 특정 화합물을 첨가하고 NADP(H)의 변화량을 계산해 대조군(기질만을 첨가한)과 비교하면 활성 억제제를 선택적으로 선별할 수 있다. 이러한 과정은 관련 효소 활성을 지닌 클론들을 배양해 기질과 NADP(H)를 첨가한 후, 다양한 화합물질이 존재하는 환경에서 반응을 유도하며 NADPH의 변화량을 정량하는 것을 의미한다.

보다 상세하게, 실시예 7과 같은 NADPH에 의존적인 산화환원효소 반응액에 활성 저해제로써 가능성이 있는 화합물을 농도별 (0.1 내지 10 mM)로 반응 용액에 첨가하였다. 반응이 진행되는 동안 각 화합물 첨가에 따른 NADPH의 생성량을 정량하였으며, 상기 화합물을 첨가한 경우(시험군)와 첨가하지 않은 경우(대조군)의 NADPH 생성량을 비교함으로써 특정효소 활성의 억제 정도를 확인하였다.

일차 선별한 화합물의 농도변화에 따른 NADPH 생성(감소) 반응 속도를 측정한 후, 시그마 플롯 프로그램(sigma plot program)을 이용하여 각 화합물의 IC50 값을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 his-mBFP를 이용한 분석방법은 NADPH에 의존적 산화환원효소의 억제제(항 미생물 제재)를 효율적으로 선별할 수 있고, 다양한 생리활성 키트 등의 다양한 정량, 탐침, 진단 분야에 폭넓게 이용될 수 있는 장점이 있다.

상기 예는 본 발명의 신뢰성 평가를 목표로 고안한 것이라 활성 저해제를 상기 실시예에 포함하나 이에 한정하지 않는다.

[실시예 10] his-mBFP의 친화력을 이용한 생체 시료나 합성시료로부터의 NADPH 회수

(1) 고정화 친화 크로마토그래피(IMAC)를 이용한 his-mBFP 컬럼 제작

친화 크로마토그래피에 his-mBFP를 결합시켜 NADPH 분리/회수용 컬럼을 제작하였다. 이를 위해 Chelating Sepharose Fast Flow (BioProcess ™) 레진을 50 ㎖ 결합 완충액(50 mM 인산완충용액 pH 7.4, 200mM NaCl)로 충분히 세척하였다. Chelating Sepharose 수지가 평형에 도달했을 때, 금속이온(Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺ 또는 Co²⁺)이 첨가된 결합 완충액을 2 ㎖/min 의 유속으로 흘려보내 부착을 유도한 후, 100 ㎖의 결합 완충액을 4 ㎖/min의 유속으로 흘려보내 컬럼에 결합되지 않은 이온들을 제거하였다.

다음으로 2 ㎖/min유속으로 준비된 수지가 평형에 도달하도록 50 ㎖의 mBFP 결합 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 세척하였다. 수지가 평형에 도달했을 때, his-mBFP가 첨가(10 mg)된 mBFP 결합 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5)을 2 ㎖/min 의 유속으로 흘려보내 단백질 부착을 유도하였다. 100 ㎖의 mBFP 결합 완충용액을 4 ㎖/min의 유속으로 흘려보내 컬럼에 결합되지 않은 단백질을 제거한 후, NADPH 친화 컬럼(his-mBFP가 부착된 Chelating Sepharose 컬럼)을 제조하였다.

(2) his-mBFP가 고정화된 컬럼을 이용한 NADPH 회수

시료 내 포함되어있는 NADPH를 상기 (1)에서 제조한 NADPH 친화 컬럼을 이용하여 회수하기 위해서, NADPH가 함유된 시료의 상층액을 실시예 6과 동일한 방법으로 준비하였다.

이때 결합/용출과정에서 비특이적인 산화에 의한 NADPH 손실을 방지하기 위해 완충액에 환원제(reducing agent)를 처리하거나 잔존하는 산소를 질소로 flushing(N₂ gas를 5분간 완충액에 도입)하였다. 이를 이용해 상기 제작한 NADPH 친화 컬럼이 평형에 도달하도록 충분히 세척(50 ㎖, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5)하였다. 컬럼이 평형에 도달한 후, NADPH가 포함된 시료를 2 ㎖/min 의 유속으로 흘려보내 NADPH의 부착을 유도한 후, 100 ㎖ 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl)를 4 ㎖/min의 유속으로 흘려보내 컬럼에 결합되지 않은 불순물들을 완전히 제거하였다. 준비된 수지에 동일한 유속으로 용출 완충액(20 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, pH 7.5)을 흘려보내 his-mBFP 에 결합되어 있던 NADPH를 회수하였다.

이 때, 각각의 과정에서 흘러나온 용액을 모두 회수하여 NADPH의 흡착 유무와 정도를 확인하였다. 또한 NADPH 친화 컬럼을 통해 회수된 NADPH 양은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과 대장균이나 식물 조직(콩 등)에서 측정된 NADPH의 70 내지 85% 정도를 안정적으로 회수할 수 있었다. 본 발명은 상시 실시예와 같이 IMAC 수지를 his-mBFP를 부착시킨 고정화 컬럼을 이용하는 방법을 포함하나 시바크론 수지에도 같은 정도로 결합할 수 있어 이에 한정되지 않는다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> his-mBFP quantitative assay method for NADPH and use thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mBFP protein <400> 1 Met Gln Asn Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp 20 25 30 Ile Ala Phe Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Val Gln Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln 50 55 60 Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala 65 70 75 80 Ile Val Gln Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Phe Leu Ala Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg 100 105 110 Thr Met Asn Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala 115 120 125 Gln Ala Ser Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Glu Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Ala Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly 165 170 175 Ala Arg Gly Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr 180 185 190 Asp Met Asn Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val 195 200 205 Leu Ser Leu Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val 210 215 220 Ala Phe Leu Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Val Asp Gly Gly Phe Ala Ala 245 <210> 2 <211> 747 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mBFP seq <400> 2 atgcagaatc tgaacggcaa agtggctttc gtgaccggcg gcagccgcgg catcggcgcg 60 gcgatcgtcc gccgcttggc ggcggacggc gccgacatcg cgttcaccta tgtcagcgcc 120 tcgtcgaaaa acgtggccac cgccctggtg caagaactcg aggccaaggg ccgccgcgct 180 cgcgccatcc aggcggactc ggcggatccg gcccaggtgc ggcaggcggt cgagcaggcc 240 atcgtgcaac tggggccggt ggacgtgctg gtgaacaacg ccggcatctt cctggccggc 300 cccttgggcg aggtgacgct ggacgactac gaacgcacga tgaacatcaa tgtgcgcgcg 360 cctttcgtgg ccatccaggc cgcgcaggcc tcgatgccgg acggcggccg catcatcaac 420 atcggcagct gcctggcgga acgcgccggc cgagccgggg taacgctgta tgccgccagc 480 aagtcggcgc tgctgggcat gacgcgcggc ctggcgcgcg acctgggcgc gcgcggcatc 540 accgccaacg tcgtgcaccc gggcccgatc gacaccgaca tgaatcccgc agatggcgaa 600 cgctcgggcg aactggtggc cgtgctgtcc ttgcctcatt acggcgaggt gcgcgacatc 660 gccggcatgg tggctttcct ggccgggccg gatgggcgct acgtgaccgg tgcgagtctg 720 gcggtggacg gcggcttcgc cgcttga 747 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> his-mBFP protein <400> 3 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys Gln Asn 1 5 10 15 Leu Asn Gly Lys Val Ala Phe Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 20 25 30 Ala Ala Ile Val Arg Arg Leu Ala Ala Asp Gly Ala Asp Ile Ala Phe 35 40 45 Thr Tyr Val Ser Ala Ser Ser Lys Asn Val Ala Thr Ala Leu Val Gln 50 55 60 Glu Leu Glu Ala Lys Gly Arg Arg Ala Arg Ala Ile Gln Ala Asp Ser 65 70 75 80 Ala Asp Pro Ala Gln Val Arg Gln Ala Val Glu Gln Ala Ile Val Gln 85 90 95 Leu Gly Pro Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Leu Ala 100 105 110 Gly Pro Leu Gly Glu Val Thr Leu Asp Asp Tyr Glu Arg Thr Met Asn 115 120 125 Ile Asn Val Arg Ala Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Ala Gln Ala Ser 130 135 140 Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Ile Asn Ile Gly Ser Cys Leu Ala Glu 145 150 155 160 Arg Ala Gly Arg Ala Gly Val Thr Leu Tyr Ala Ala Ser Lys Ser Ala 165 170 175 Leu Leu Gly Met Thr Arg Gly Leu Ala Arg Asp Leu Gly Ala Arg Gly 180 185 190 Ile Thr Ala Asn Val Val His Pro Gly Pro Ile Asp Thr Asp Met Asn 195 200 205 Pro Ala Asp Gly Glu Arg Ser Gly Glu Leu Val Ala Val Leu Ser Leu 210 215 220 Pro His Tyr Gly Glu Val Arg Asp Ile Ala Gly Met Val Ala Phe Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Asp Gly Arg Tyr Val Thr Gly Ala Ser Leu Ala Val Asp 245 250 255 Gly Gly Phe Ala Ala 260 <210> 4 <211> 786 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> his-mBFP seq <400> 4 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccgcat gccagaatct gaacggcaaa 60 gtggctttcg tgaccggcgg cagccgcggc atcggcgcgg cgatcgtccg ccgcttggcg 120 gcggacggcg ccgacatcgc gttcacctat gtcagcgcct cgtcgaaaaa cgtggccacc 180 gccctggtgc aagaactcga ggccaagggc cgccgcgctc gcgccatcca ggcggactcg 240 gcggatccgg cccaggtgcg gcaggcggtc gagcaggcca tcgtgcaact ggggccggtg 300 gacgtgctgg tgaacaacgc cggcatcttc ctggccggcc ccttgggcga ggtgacgctg 360 gacgactacg aacgcacgat gaacatcaat gtgcgcgcgc ctttcgtggc catccaggcc 420 gcgcaggcct cgatgccgga cggcggccgc atcatcaaca tcggcagctg cctggcggaa 480 cgcgccggcc gagccggggt aacgctgtat gccgccagca agtcggcgct gctgggcatg 540 acgcgcggcc tggcgcgcga cctgggcgcg cgcggcatca ccgccaacgt cgtgcacccg 600 ggcccgatcg acaccgacat gaatcccgca gatggcgaac gctcgggcga actggtggcc 660 gtgctgtcct tgcctcatta cggcgaggtg cgcgacatcg ccggcatggt ggctttcctg 720 gccgggccgg atgggcgcta cgtgaccggt gcgagtctgg cggtggacgg cggcttcgcc 780 gcttga 786

Claims (12)

1. 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein)와 NADP(H)의 결합으로 mBFP의 발색에 의한 형광의 변화를 측정하는,
   생체내외 시료의 NADP(H) 정량법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 형광의 변화는 시료 내 존재하는 NADPH에 상기 mBFP가 직접 결합하여 형광을 증가 또는 감소시키고, 상기 증가 또는 감소된 형광의 세기로부터 NADP(H)의 농도 또는 NADP(H) 의존적 효소의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 정량법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 2항에 있어서,
   상기 효소는 NADP(H) 의존적 탈수소효소(dehydrogenase) 또는 산화환원효소(oxidoreductase)인 것을 특징으로 하는 정량법.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 정량법은 시료와 mBFP의 반응시 계면활성제를 더 추가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 정량법.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 계면활성제는 SDS, Na-deoxycholate, CTAB, DEDAB, 및 CHAPS로터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 정량법.
9. 히스티딘 태그(his-tag)가 융합된 메타게놈 유래의 청색 형광단백질 mBFP(metagenome-derived blue fluorescent protein) 포함하는 효소 측정용 단백질을 포함하는 NADPH 회수용 키트.
10. 삭제
11. 제 9항에 있어서,
    상기 키트는 계면활성제, 환원제 및 세척액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
12. 제 9항에 있어서,
    상기 키트는 친화도 크로마토그래피 분석법을 이용하여 NADPH를 회수하는 것을 특징으로 하는 키트.

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