CN104894042B - 一株检测砷的大肠埃希氏菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测水体中类金属砷的微生物学方法，具体涉及利用基因工程改造的大肠埃希氏菌报告菌株构建方法，及建立其在检测水体中砷的方法。本发明所述检测菌株的构建，首先采用Red重组系统敲除野生型大肠杆菌MC4100砷抗性的arsB基因，然后采用基因敲入技术将pars‑arsR‑gfpmut2报告基因置换到araB编码基因位置后获得。本发明所述生物检测菌株名称为E.coli WMC‑011p，对砷的最低检测范围符合《污水综合排放标准》‑‑‑GB8978‑1996。本发明所述菌株克服了基于质粒载体的生物检测菌株具有的荧光本底值高、检测信号不稳定、结果不精确等缺点，具有特异性强、灵敏度高和成本低等特点。

Description

一株检测砷的大肠埃希氏菌

技术领域

本发明涉及一种检测水体中类金属砷的微生物学方法，具体涉及利用基因工程改造的大肠埃希氏菌报告菌株的构建方法，及建立其在检测水体环境中类金属砷的方法。

背景技术

砷，是广泛分布于自然界的非金属元素。地壳中的含量约为2～5mg/kg，为构成地壳元素的20位。类金属砷是被国际癌症研究署(IARC)归类为一级的人类致癌物。世界不同地区的21个国家受到了砷污染的影响，最大的风险群体来自孟加拉国，其次是印度的西孟加拉国，中国也是砷危害最重的国家之一。水体类金属砷污染已经在我国局部地区表现为公害病(如广东英德市横石塘镇龙新村岭下村组发生集体砷中毒事件、四川省凉山州西昌市安宁镇饮用水井砷污染事件、贵州省独山县瑞丰矿业公司违法排污造成砷污染事件、湖南省怀化市辰溪县一家硫酸厂违法排污造成村民砷中毒事件、广西河池市砷污染事件、河南省大沙河两起砷污染事件、苏鲁交界邳苍分洪道两起砷污染重大突发环境事件等)。因此，引起了人们的高度重视。在土壤、水、矿物、植物中都能检测出微量的砷。在正常人体组织中也含有微量的砷。

随着科学技术的迅速发展，大量含砷化工厂建立，砷及其化合物被广泛应用于冶金以及各种除草剂、农药、化肥、杀菌剂的使用，在水体和土壤中的含量逐年增加，继而在一些植物或动物体内积累(如砷污染区的大米、贝壳类海鲜、动物肝肾脏等)，并通过食物链在人体内蓄积，为目前已知的最易在体内蓄积的毒物之一。砷对人体毒性很大，对肾、肺、肝、生殖、脑、皮肤、呼吸、肠道及血液系统均可产生毒性，砷在体内的生化功能还未确定，但研究提示砷可能在某些酶反应中起作用，以砷酸盐替代磷酸盐作为酶的激活剂，以亚砷酸盐的形式与巯基反应作为酶抑制剂，从而可明显影响某些酶的活性。有人观察到，在做血透析的患者其血砷含量减少，并可能与患者中枢神经系统紊乱、血管疾病有关。砷对环境的污染，主要是由工业废水排放引起(我国规定工业废水中砷的最高排放浓度为0.1mg·L^-1)。因此，对环境水体中类金属砷的检测显得尤为必要。

目前监测和检测金属污染物主要有两种方法：(1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)气体氢化原子吸收光潜法(gaseous hydride atomic absorption spectrometry，HGAAS)等，在文献BelkinS.Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants.CurrentOpinion in Microbiology 2003Jun；6(3)：206-12中。其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属 总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；而化学显色法、电化学法等，灵敏度、选择性不高，不易准确定量，特别是针对水体中生物有效性(bioavailability)重金属的检测，可选的特异、敏感、快速和便携的检测方法更少，难以对水体中重金属生物毒性效应进行客观评价。(2)基于生物有机体的微生物法，其一般分为基于质粒和基于基因组整合型两种。质粒整合型具有成本低、特异性强、快速、易操作等优点，但是基于质粒载体的生物检测菌株存在细菌传代后质粒拷贝数不均一(数量过高或丢失)而导致检测信号不稳定、荧光本底值高和独立实验重复性不好等缺陷。利用模式生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)对特定化学物质分子反应的生物检测技术克服了如上不足，因此，建立一种特异、敏感、快速、廉价、稳定及精确的生物检测技术及其产品来评价环境中砷的生物毒性大小已经成为当务之急。在一系列新的检测方法中，生物监测方法，特别是利用微生物全细胞传感器来检测污染物已成为国际环境科学研究的热点之一。

生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的生物检测菌株及其产品，如：重金属、甲苯及其衍生物等。

目前对砷在大肠埃希氏菌的具体耐受机制已有大量研究，对砷离子测定的生物检测技术也有所研发，大肠埃希氏菌具有精细的调控系统使得细胞内砷离子保持在较低的水平，有研究已发现大肠埃希氏菌中有两种负责编码将砷离子泵出基因，一种是存在于质粒上的arsA基因和arsB基因共同作用形成膜离子通道蛋白将砷泵出来维持细胞体内平衡，另一种是存在于基因组上的不含arsA基因而只含arsB基因形成膜离子通道蛋白将砷泵出来维持细胞体内平衡。查阅文献，研究人员尝试在DH5α大肠埃希氏菌基础上构建检测砷离子的模式生物。但砷是一种常见的剧毒性环境污染类金属，大部分细菌对砷具有耐受性以及抗性，故其敏感性不高。且这些研究是基于质粒作为表达载体，然而基于质粒载体的生物检测元件存在本底值高，细菌传代后质粒拷贝数不均一(数量过高或丢失)，导致检测信号不稳定等缺陷。其作为检测砷的宿主菌会造成检测的不稳定和最低检测限偏高，这些非常不利于污染物的检测，必须采用新的方法提高生物学检测方法检测砷离子的敏感性，以有效解决当前环境监测工作中遇到的瓶颈问题。Judith Stocker在Development of a Set ofSimple Bacterial Biosensors for Quantitative and Rapid Measurements ofArsenite and Arsenate in Potable Water Environ Sci Technol.2003Oct 15；37(20)：4743-50.中等构建的基于质粒上的大肠埃希氏菌生物传感器，其构 建策略是将大肠埃希氏菌质粒上arsR启动子arsR基因与luxCDABE基因或荧光蛋白基因或萤火虫荧光素酶基因进行基因融合，再连接到pET28b质粒载体上。其能被砷诱导发光，且是在野生大肠埃希氏菌基础上构建检测砷离子的模式生物，存在荧光不稳定性、本低值高等缺陷。在专利《一种检测砷生物可利用度的微生物细胞传感器》CN 102796693A中，大肠埃希氏菌E.coli作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒为含有砷抗性系统ars启动子、砷抗性系统调控基因arsR、荧光素酶基因luc和rrnb终止子串联序列的pUC18质粒。同样是基于质粒的微生物传感器，存在上述基于质粒作为表达载体的多种缺陷。重金属微生物检测技术的应用受到限制而发展缓慢。

发明内容

本发明的目的：1.采用基因工程技术构建一株荧光本底值低、灵敏度高、特异性强、稳定、快速和成本低及定量检测水体中类金属砷浓度的大肠埃希氏菌生物检测菌株；2.建立一种检测水体中类金属砷的微生物学方法。

发明内容之一：提供一株检测水体中类金属砷的大肠埃希氏菌生物检测菌株。

本发明的大肠埃希氏菌是：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-011p CGMCCNo.9760。

本发明的大肠埃希氏菌WMC-011p，已于2014年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(E. coli)，保藏编号为CGMCC No.9760。

本发明所述生物检测菌株E.coli WMC-011p CGMCC No.9760的构建方法是：

1.基因敲除野生型大肠埃希氏菌E.coli MC4100基因组中arsB基因

采用Red重组系统，敲除野生型大肠埃希氏菌E.coli MC4100基因组中砷离子“外排泵”基因arsB(序列如SEQ ID NO.1所示)；

2.构建类金属砷检测元件pars-arsR-gfpmut2融合基因

将大肠埃希氏菌基因组砷离子调节基因arsR(序列如SEQ ID NO.2所示)、启动子ars(序列如SEQ ID NO.3所示)以及荧光报告基因gfpmut2(序列如SEQ ID NO.4所示)通过通过交叉PCR技术，构建对类金属砷离子特异反应的检测元件：pars-arsR-gfpmut2融合基因；

3.采用基因敲入技术构建检测类金属砷的大肠埃希氏菌生物检测菌株

采用基因敲入技术将含有增强型绿色荧光蛋白报告基因pars-arsR-gfpmut2置换到E.coliΔarsB菌株基因组中araB(序列如SEQ ID NO.5所示)基因编码框位置。具体方法为：通过交叉PCR技术，形成含有pars-arsR-gfpmut2和araB基因两侧同源臂的融合片段，该DNA 融合片段大小约为2.3kb，然后用无缝克隆的方法连接到pKOV条件复制质粒，构建pars-arsR-gfpmut2打靶载体，并将该打靶载体转化到E.coli ΔarsB菌株中，通过温度及蔗糖的选择，挑选成功发生两次同源重组的菌株，并进一步通过菌落PCR及测序鉴定筛选目的菌株。

检测原理：

本发明所述大肠埃希氏菌菌株定量检测水体中砷离子是采用pars启动子直接启动gfpmut2基因表达模式。在此构建中，当未添加外源性砷离子时，E.coli WMC-011p基因组中arsR基因编码产生的ArsR蛋白结合于pars启动子序列区，阻止GFPmut2表达；当外源性砷离子进入大肠埃希氏菌胞内后，As³⁺与ArsR蛋白结合，使ArsR蛋白从启动子上脱落，激活E.coli WMC-011p基因组中pars-arsR-gfpmut2融合基因的表达，从而产生GFPmut2蛋白，并且产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与砷离子浓度呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以达到定量检测砷离子浓度的目的。

发明内容之二：提供一种检测水体中类金属砷的微生物学方法

本发明所述大肠埃希氏菌菌株检测水体中类金属砷的微生物学方法流程为：

1.环境水体样品测定的准备：

取10-50ml待测环境水体样品，12000g离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为4-8，再用0.22微米的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定。

2.LB培养基的配制：

取步骤1样品或标准品加入300μl-3mL LB培养基的比例配制适当量的LB培养基。LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的无菌MOPS缓冲液(400mmol/L)后均匀混合。

3.标准曲线的制备：

(1)把砷单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。具体的浓度需根据样品中砷的浓度而定。

(2)用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-011p过夜菌种子液加入到上述LB液体培养基中，恒温震荡培养至OD₆₀₀值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD＝0.02-0.5，分装(1mL/管)，加入步骤(1)中等体积不同浓度的As³⁺溶液至各管菌液，使其终浓度在10^-7-10^-4之间，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。每种浓度各做3个平行管；

(3)将步骤(2)菌液于37℃，250rpm振荡培养2-5h后；

(4)将步骤(3)菌液4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1mLDesalting buffer中，然后取50μL重悬菌液20倍稀释于0.95mL Desalting buffer中，混匀；分别测量其稀释液荧光值与OD₆₀₀值。实验结果为三次平行实验的平均值±SD值。

(5)数据处理：

相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFU_M＝F_M/OD_600M，F_M为与砷单元素标准品孵育E.coli WMC-011p菌悬液的荧光值，OD_600M为与砷单元素标准品孵育E.coliWMC-011p菌悬液的吸光度；RFU_W＝F_W/OD_600W，F_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-011p菌悬液的背景荧光值，OD_600W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-011p菌悬液的吸光度；

绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFU_M-RFU_W，RFU_M为与砷单元素标准品孵育E.coli WMC-011p菌悬液的相对荧光值，RFU_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-011p菌悬液的相对背景荧光值。

(6)以砷单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，砷单元素标准品浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合。

4.环境水体中砷浓度的测定：

(1)用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-011p过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值为0.02，37℃，250rpm，震荡培养至OD₆₀₀值在0.02-0.6：OD₆₀₀值0.3时为最佳值，取90-900μl菌液分装至15×150mm规格的无菌试管(1mL/管)或96孔透明底黑色微孔板中，100-200l/孔，选择黑色微孔板的设计是为了降低荧光检测中的背景与减少交叉干扰；同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl水体样品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品各做3个平行孔或3个平行管；

(2)将步骤(1)37℃、250rpm振荡孵育2-5h；

(3)将步骤(2)4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB缓冲液中：含有20μg/mL氯霉素用于阻止新的GFPmut2蛋白的合成；

(4)然后将步骤(3)重悬菌液稀释0-20倍：为了使背景散射和内滤效应最小化，需要E.coli WMC-011p全细胞悬浮液的OD₆₀₀≤0.3，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD₆₀₀值：激发波长为481nm，发射波长为507nm与OD₆₀₀值。

(5)然后根据同批次已知浓度的砷离子标准溶液诱导制作绿色荧光强度标准曲线获得的标准曲线及其方程，将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入步骤3(6)，计算得到未知环境水体样品中砷的浓度。

本发明所述生物检测菌株E.coli WMC-011p CGMCC No.9760，具有以下创新点和技术优势：

1.荧光本底值低：相对于质粒载体的生物检测菌株存在的本底值高，本发明具有优越性；

2.检测信号稳定：相对于质粒载体的生物检测菌株存在的细菌传代后质粒拷贝数不均一(数量过高或丢失)而导致检测信号不稳定的缺陷，本发明具有检测信号稳定，独立实验重复性好、结果可信的特性；

3.不需专用仪器设备、专业操作人员和易在基层和现场应用并且价格低廉，便于推广：相对于传统的检测方法如气体氢化原子吸收光潜法(gaseous hydride atomicabsorption spectrometry，HGAAS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等，本发明操作简便、样品预处理简单、能够批量生产、价格低廉且易于推广实施；

4.E.coli WMC-011p菌株中未导入任何外源抗生素抗性基因；不危及对环境友好无污染

5.实现生物有效性分析检测：相对于传统的检测方法如原子吸收分光光度法(AAS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)以及各种色谱-质谱联用仪等，本发明将类金属砷从总量分析转变到生物有效性分析检测，更能反映生理毒性，是重金属分析检测方法研究的必然趋势。

附图说明

图1.基因敲除流程图

H1：arsB基因两侧的同源臂；H2：arsB基因两侧的同源臂

P1：cat基因两侧同源臂；P2：cat基因两侧同源臂

图2.基因敲入流程图

A：araB基因上游500bp B：araB基因 C：araB基因下游500bp D：pars-arsR-gfpmut2检测元件

图3.融合报告载体pars-arsR-gfpmut2的构建流程图

M：DL 5000DNAMarker l：pars-arsR(mutant)(614bp)2：(arsR)gfpmut2(717bp)

图4.pars-arsR与gfpmut2融合片段电泳图

1：pars-arsR-gfpmut2片段(1298bp)

图5.cat基因PCR电泳图(1115bp)图

图6.cat基因替换arsB基因后PCR电泳图

M：DL 5000DNA Marker 1：替换arsB的MC4100(ΔarsB：：cat)(1115bp)(敲除引物)2：替换arsB的MC4100(ΔarsB：：cat)(1435bp)(鉴定引物)3：野生的MC4100 (1179bp)(敲除引物)

图7.arsB基因敲除PCR电泳图

M：DL 5000DNA Marker 1：敲除arsB的MC4100(505bp)2：敲除arsB的MC4100(505bp)3：野生的MC4100(1499bp)

图8.ars-arsR-GFP/MC4100菌株PCR鉴定电泳图

M：DL 5000DNA Marker 1：pars-arsR(mutant)(614bp)2：(arsR)gfpmut2(717bp)3：A-pars-arsR-gfpmut2-A片段(1298bp)4：pars-arsR-gfpmut2(1298bp)/MC4100菌株5：zntA/MC4100(2499bp)6：zntR/MC4100(726bp)

图9.检测原理图

promoter：为启动子ars基因；arsR：合成调节蛋白的基因；arsB：合成泵出三价砷的蛋白基因；arsC：合成还原蛋白的基因，将五价砷还原成三价砷；gfp：合成绿色蛋白的基因；ArsR：调节蛋白，能与启动子和三价砷结合；ArsB：膜通道蛋白，泵出三价砷的蛋白；ArsC：还原蛋白，将五价砷还原成三价砷；GFP：绿色荧光蛋白

具体实施方式

实施例1.ΔarsB突变菌的制备

1.1 引物信息及合成

基因敲除引物：根据http：//ecogene.org/提供基因敲除的引物序列，Primer5.0及DNAMAN软件，设计同源重组引物(见表1)，5′端为arsB基因两侧的同源臂，3′端为用于扩增氯霉素抗性基因。上游同源臂引物H₁-P₁；下游同源臂引物H₂-P₂。

基因敲除鉴定引物：利用Harvard Molecular Technology Group&Lipper Centerfor Computational Genetics网站

http：//arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/EcoliKO-primers/ EcoliKOprimers.htm提供的一对跨越待敲除基因的外侧设计敲除鉴定引物(见表2)。鉴定arsB基因敲除引物设计：上游引物arsB-jianding-F位于arsB基因上游108bp，下游引物arsB-jianding-R位于arsB基因下游101bp。

引物由Invitrogene生物公司合成。用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为10umol/L。

表1.基因敲除引物

1.2 arsB基因的敲除

1.2.1 pKD46/MC4100制备

用接种针从E.coli MC4100的细菌平板中挑取1个单菌落接种于3ml LB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养过夜并通过冷CaCl₂法制备感受态细胞，将pKD46质粒转化入大肠埃希氏菌MC4100感受态细胞中，然后均匀涂板于LB-Amp⁺平板，待菌液充分吸收后倒置平板，30℃培养过夜。平板上长出菌落说明pKD46已转入MC4100中(基因敲除流程图见图1)。

1.2.2 带FRT位点的cat基因PCR扩增

取含有pKD3质粒的过夜菌液1mL于1.5mL的EP管中，8000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1mL MilliQ H₂O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12000rpm离心3min，取上清作为模板，混匀。利用引物P₁(arsB-H₁-P₁)和P₂(arsB-H₂-P₂)，按表3配制PCR反应体系。

表3

PCR反应条件如下：95℃5min；95℃40sec；50℃40sec；72℃2min 35个循环；72℃10min；4℃30min。取PCR产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的ddH₂O溶解洗脱备用。如图5所示，已扩增得到1kb左右的cat基因。

1.2.3 pKD46/MC4100电转感受态细胞的制备

(1)种子液制备：从LB-Amp⁺平板上长出的pKD46/MC4100中，用接种针挑取一单菌落接种于5ml LB-Amp⁺液体培养基，30℃，250rpm振荡培养过夜。

(2)取pKD46/MC4100过夜菌10μl于50ml TB-Amp⁺试管中，扩大培养1.5h左右；

(3)加入20％L-Arab 5μl(终浓度为0.02％)诱导1.5h；

(4)取出菌液置冰浴15min，将菌液转移至预冷的15ml离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃上清；

(5)加入预冷10％甘油50ml，4℃，4000rpm离心15min，弃上清，重复上述步骤2次；

(6)加40μl10％甘油重悬，即制备得到pKD46/MC4100电转感受态细胞。

1.2.4 电转化cat基因

取5ul cat(浓度＞100ng/l)基因PCR纯化后产物与40μl感受态细胞混匀，转移至电击杯中(冰上操作)。打开电转仪，调至Manual，参数设置为：电压：2.5kV，电容：25μF，电阻：200Ω，电击杯：2mm。将电击杯推入电击转化仪，按一下pusle键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1ml TB重悬，转移至EP管，37℃，250rpm振荡培养1h进行抗性恢复。然后将菌液于4000rpm，25℃离心5min，取200ul上清重悬沉淀，涂于TB-Cm⁺平板，并标记为arsB：：cat/MC4100，37℃培养过夜。

1.2.5 cat基因的PCR鉴定

从arsB：：cat/MC4100转化平板上取一单菌落接种于5ml TB-Cm⁺试管中，37℃，250rpm振荡培养4h，待菌液出现明显浑浊后取1mL菌液作PCR鉴定。将菌液于1.5mL的EP管中，8000rpm，离心3-5min，弃上清，菌体用1mL MilliQ H₂O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12 000rpm离心3-5min，作为模板，混匀。利用引物arsB-jianding-F和arsB-jianding-R，按表4配制PCR反应体系。

表4

PCR反应条件如下：PCR反应条件如下：95℃5min；95℃40sec；50℃40sec；72℃2min25个循环；72℃10min；4℃30min。取PCR产物5uL以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如图6所示，在1200bp左右出现亮带，证明arsB基因已被cat基因替换。

1.2.6 pCP20的转化

将pCP20质粒转化入通过冷CaCl₂法制备的arsB：：cat/MC4100感受态细胞，菌液均匀涂 板于LB-Amp⁺-Cm⁺板上，待菌液充分吸收后倒置平板，30℃培养过夜。

1.2.7 cat抗性基因的消除

用接种针从pCP20-arsB：：cat/MC4100细菌转化平板上取一个单菌落接种于5mlLB液体培养基中，42℃，250rpm振荡培养4h左右；取一菌环四区划线接种于LB平板上，37℃培养过夜。用接种针分别从37℃培养过夜的细菌(此时cat基因已去除，pCP20质粒已丢失)平板上挑取3个单菌落分别点种于LB-Cm⁺与LB空白平板上，置于37℃培养6h左右；在LB-Cm⁺平板上不生长而LB平板上生长的细菌，cat基因已成功去除。进一步通过PCR鉴定，证明cat基因已完全清除。挑取菌落直接加入100μl水中煮沸10min后，离心作为模板，用鉴定引物按表4配制PCR体系进行PCR扩增。结果如图7所示，基因条带大小与理论值相符，说明已经成功完成arsB基因的敲除，得到ΔarsB突变菌。

1.2.8 ΔarsB突变菌的纯化

从ΔarsB四区划线平板上挑取单菌落，用接种环蘸取少许细菌四区划线于新的LB平板，37℃培养过夜。余下菌落挑至100μl无菌水中，煮沸10min后离心，去上清作为模板按5中步骤进行PCR鉴定，鉴定正确后得到纯化的突变菌。

实施例2.融合报告基因pars-arsR-gfpmut2的构建

2.1 引物信息及合成

根据GenBank公布的目的基因pars和arsR序列及已知的gfpmut2基因序列，使用Primer5.0软件设计引物(见表5)，部分引物在基因的5′端或3′端引入酶切位点，设计pars-arsR基因5′端引物(P₃：pars-arsR-F)和3′端引物(P₄：pars-arsR-R)，使P₄与P₅之间存在互补序列，P₅(gfpmut2-F)与P₆(gfpmut2-R)为一对扩增gfpmut2基因引物，M13F和M13R为鉴定pMD19-T载体上pars-arsR-gfpmut2片段的引物。设计pars-arsR-gfpmut2基因N末端和C末端的内侧引物(P₇：araB-Ni和P₈：araB-Ci)和外侧引物(P₉：araB-No和P₁₀：araB-Co)，基因敲除两个外侧引物不变，P₇与P₈为一对扩增pars-arsR-gfpmut2的基因引物，P₁₁与P₁₂为一对扩增pKOV的基因引物。具体信息见表5，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用无菌ddH₂O将引物溶解，配成浓度为10umoL/L的储存液，-20℃保存。

表5.基因融合引物详细信息表

注：下划线基因序列为酶切位点

2.2 pars-arsR-gfpmut2基因的融合及与pMD 19-T载体连接

2.2.1 pars-arsR的扩增

取E.coli MC4100的过夜菌液1mL于1.5mL的EP管中，8000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1mL MilliQ H₂O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12000rpm离心3min，取15μL上清加入200μL PCR反应管中。另取以下配好体系5μL加入该PCR管中，混匀。

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，50℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定见图3。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

2.2.2 gfpmut2基因的扩增

取含有pGFPmut2质粒(CLonetech)的过夜菌液1mL于1.5mL的EP管中，6000rpm，离心5min，弃上清，菌体用1mL MilliQ H₂O重悬洗涤两次，沸水煮10min，12000rpm离心5min，取15μL上清加入200μL PCR反应管中。另取以下配好体系5μL加入该PCR管中， 混匀。

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，50℃、3min，35个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定见图3。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

2.2.3 pars-arsR和gfpmut2基因的融合

按下表配制体系，接着再按下表6在原来基础上添加体系

PCR反应条件如下：95℃、3min；95℃、40sec，62℃、40sec、-1℃，72℃、3min，8个循环；72℃、2min，4℃保存。

表6

PCR反应条件如下：95℃、3min；95℃、40sec，52℃、40sec，72℃、2min，35个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如图4所示。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

2.2.4 PCR产物加A反应与纯化

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：72℃、1h，4℃保存。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。结果如图4所示。

2.2.5 目的片段与pMD19-T simple载体连接

按TaKaRa公司的pMD19-T simpLe Vector试剂盒说明书进行T载体与目的基因的连接。连接反应体系如下：

16℃，连接过夜。

2.2.6 转化

通过冷CaCl₂法将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH-5α感受态细胞中。

2.2.7 测序

挑选一个经M13F/R引物，PCR鉴定正确的单克隆菌株送上海捷瑞生物工程有限公司测序，测序结果与NCBI上提供的标准参考序列比对。

2.2.8 转化

(1)经测序正确的菌株提取质粒，质粒的提取采用TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.3.0试剂盒小提质粒；

(2)通过冷CaCl₂法将质粒分别转化入E.coliΔarsB-感受态细胞中，命名为WMC-011-p，和野生菌MC4100感受态细胞中。并PCR鉴定转化菌种的正确性。

实施例3 基因敲入

3.1 基因敲入片段的融合

3.1.1 两个同源臂的扩增：

取E.coli MC4100的过夜菌液1mL于1.5mL的EP管中，8000rpm，离心3min，弃上清，菌体用1mL MilliQ H₂O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12000rpm离心3min，取24μL上清作为模板。按下表配成体系，做PCR鉴定。

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

3.1.2 pars-arsR-gfpmut2基因的扩增：

取含有pars-arsR-gfpmut2质粒的过夜菌液1mL于1.5mL的EP管中，6000rpm，离心5min，弃上清，菌体用1mL MilliQ H₂O重悬洗涤两次，沸水煮10min，12000rpm离心5min，取24μL上清作为模板。按下表配成体系，做PCR鉴定。

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，35个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定见图8。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

3.2 pars-arsR-gfpmut2基因与araB基因C/N端融合

3.2.1 一侧同源臂与pars-arsR-gfpmut2基因融合。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：94C、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

3.2.2 两侧同源臂与pars-arsR-gfpmut2基因融合

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、3min，30个循环；72℃、10min，4℃保存。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果显示，两侧同源臂与pars-arsR-gfpmut2基因成功融合。

3.3 pKOV载体片段的制备

取15ml TB培养基生长的含pKOV质粒的过夜菌，采用TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.5.0试剂盒抽提质粒。

pKOV质粒的单酶切

37℃，酶切2h。

酶切反应后产物于65℃加热5min，灭活酶的活性，再以酶切产物为模板扩增pKOV载体片段，PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：PCR反应条件如下：94℃、5min；94℃、40s；63℃、40sec，72℃、6min，30个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H₂O溶解洗脱备用。

3.4 打靶载体pKOV-araBNo-Ni-ars-arsR-gfpmut2-araBCi-Co的构建

3.4.1 目的片断与载体的连接反应

连接反应体系如下：

(1)16℃，连接过夜(gfpmut2片断与pKOV载体的摩尔比为10∶1)。

(2)将连接好的产物转入E.coli arsB感受态细胞中。

(3)阳性克隆的鉴定

PCR鉴定

用接种针挑取上述LB Cm⁺平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个新的无菌LB Cm⁺平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB Cm⁺平板上生长的单菌落少许，混于含50μL无菌水的EP管中，沸水煮10min，12000rpm离心3min后，取上清15μL加入200μLPCR反应管中作为PCR鉴定模板。取以下体系加入该管中，混匀。

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃10sec，66℃5min，25个循环；72℃10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。电泳显示PCR片断长度在1.7kb左右的单克隆被挑选出来，进行下面的质粒提取和双酶切鉴定。

3.4.2 第一步同源重组-pKOV-araBNo-Ni-ars-arsR-gfpmut2-araBCi-Co整合到大肠埃希氏菌的基因组中

取于30℃孵育的pKOV-araBNo-Ni-ars-arsR-gfpmut2-araBCi-Co/arsB-过夜菌液10μL接种于42℃预热的含5mL Cm⁺/LB培养基的试管中，于42℃，250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取42℃孵育2h后的菌液20μL分区划线接种于3-4个42℃预热的LB Cm⁺的平板上。待菌液完全吸收后，倒置于42℃恒温培养箱中培养过夜。

用接种针挑取经42℃孵育的LB Cm⁺平板上生长的单菌落少许分别划线接种于一个新的42℃预热的LB Cm⁺平板上，42℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB Cm⁺平板上生长的单菌落少许，混于含50μL无菌水的EP管中，沸水煮10min，12000rpm离心3min后，取上清15μL加入200μL PCR反应管中作为PCR鉴定模板。PCR反应体系同上表。

PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、5min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物为两条带，其亮度相当，约1000bp和1700bp左右的长度，证明已经发生了第一步同源重组，片断及质粒已经整合到基因组上。

3.4.3 第二步同源重组-pKOV质粒与基因组分离并丢失

选取一株第一步同源重组成功的菌株于42℃孵育过夜培养的菌液50μL接种于30℃预热的5mL含5％蔗糖的LB培养液的试管中，于30℃，250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取30℃孵育2h后的菌液进行十倍系列稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4三个稀释梯度的菌液各0.1mL分别涂布于30℃预热的含5％蔗糖的LB平板上。待菌液完全吸收后，倒置培养皿，30℃过夜。

(1)氯霉素(Cm⁺)平板的负筛选

用接种针挑取30℃、5％蔗糖LB平板上生长的单菌落，分别划线接种于一个LB Cm⁺平板和5％蔗糖LB平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

(2)基因敲入阳性菌株的PCR鉴定

挑取在5％蔗糖LB平板上生长，对应于Cm⁺/LB平板上不生长的单菌落做菌落PCR鉴定，PCR反应体系，取5μL产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物约为1700bp的菌落初步证实为已经发生基因敲入的阳性菌落(如图2)。分纯菌落，PCR进一步鉴定证实基因敲入成功。并置于-80℃保存，备用。

实施例4.生物检测菌株检测水体中类金属砷浓度流程的制定

4.1 LB培养基的配制：

按照每个样品或标准品需300μl-3ml LB培养基的比例配制适当量的LB培养基。LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的无菌MOPS缓冲液(400mmol/L)后均匀混合。

4.2 标准曲线的制定：

(1)把砷单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。具体的浓度需根据样品中砷的浓度而定。

(2)用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-011p过夜菌种子液加入到上述LB液体培养基中，恒温震荡培养至OD₆₀₀值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD＝0.02-0.5，分装(1mL/管)，加入步骤(1)等体积不同浓度的As³⁺溶液至各管菌液，使其终浓度在10^-7-10^-4之间， 另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。每种浓度各做3个平行管；

(3)将步骤(2)以上菌液于37℃，250rpm振荡培养2-5h后；

(4)将步骤(3)的菌液4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1mLDesalting buffer中，然后取50μL重悬菌液20倍稀释于0.95mL Desalting buffer中，混匀：

分别测量其稀释液荧光值与OD₆₀₀值。实验结果为三次平行实验的平均值±SD值。

(5)数据处理：相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFU_M＝F_M/OD_600M，F_M为与砷单元素标准品孵育E.coli WMC-011p菌悬液的荧光值，OD_600M为与砷单元素标准品孵育E.coli WMC-011p菌悬液的吸光度；RFU_W＝F_W/OD_600W，F_W为与MilliQ级纯水孵育E.coliWMC-011p菌悬液的背景荧光值，OD_600W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-011p菌悬液的吸光度；

绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFU_M-RFU_W，RFU_M为与砷单元素标准品孵育E.coli WMC-011p菌悬液的相对荧光值，RFU_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-011p菌悬液的相对背景荧光值。

(6)以砷单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，砷单元素标准品浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合。

4.3 环境水体中砷浓度检测步骤：

(1)用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-011p过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值为0.02，37℃，250rpm，震荡培养至OD₆₀₀值在0.02-0.6(OD₆₀₀值0.3时为最佳值)，取90-900μl菌液分装至15×150mm规格的无菌试管(1ml/管)或96孔透明底黑色微孔板中：100-200l/孔，选择黑色微孔板的设计是为了降低荧光检测中的背景与减少交叉干扰，同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl水体样品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品各做3个平行孔或3个平行管；

(2)将步骤(1)的菌液37℃、250rpm振荡孵育2-5h；

(3)将步骤(2)的菌液4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB(含有20μg/ml氯霉素用于阻止新的GFPmut2蛋白的合成)缓冲液中；

(4)然后将将步骤(3)的菌液重悬菌液稀释0-20倍：为了使背景散射和内滤效应最小化，需要E.coli WMC-011p全细胞悬浮液的OD₆₀₀≤0.3，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD₆₀₀值：激发波长为481nm，发射波长为507nm。

(5)然后根据同批次已知浓度的砷离子标准溶液诱导制作绿色荧光强度(荧光产生原理见图9)标准曲线获得的标准曲线及其方程，将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入步 骤3(6)，计算得到未知环境水体样品中砷的浓度。

实施例5.本发明检测水体中类金属砷浓度的方法学评估及应用实例

5.1生物检测菌株E.coli WMC-011p对强酸强碱模拟标本中砷离子的回收实验

用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-011p过夜菌种子液加入到上述90mL新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值约为0.02(按100mL体积计算)，37℃，250rpm诱导至OD₆₀₀＝0.02-0.5，分装(0.9mL/管)，分别加入100μL六种不同pH值(-0.3、0.87、10.8、12.84)的样品，然后再分别加入等体积As³⁺溶液至各管菌液使其终浓度都为1mg/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为空白对照。每种pH值样品各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养2-6h后，4 000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1mL Desalting buffer中，然后取50μL重悬菌液20倍稀释于0.95mL Desalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD₆₀₀值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

实验结果：E.coli WMC-011p对强酸强碱模拟标本中砷离子的回收率均在87.9％-120％之间。用该方法测定的结果与采用原子吸收光谱法(AAS)测定的结果相接近。说明E.coli WMC-011p具备客观检测水体中砷的含量而不受水体中强酸强碱的影响。

5.2 生物检测菌株E.coli WMC-011对湖水标本中砷离子的回收实验

从温州医科大学茶山校区采集一个湖水样品，经0.22μm的无菌过滤器过滤。用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-011p过夜菌种子液加入到上述90mL新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD₆₀₀＝0.02-0.5，分装(0.9mL/管)，加入等体积不同浓度的As³⁺溶液至各管菌液，使其终浓度在10^-7-10^-4M/L之间取四个值，然后再分别加入100μL过滤后的湖水至每管菌液，每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养2-6h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1mLDesalting buffer中，然后取50μL重悬菌液20倍稀释于0.95mL Desalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD₆₀₀值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

实验结果：E.coli WMC-011p对湖水中砷离子的回收率均在90.4％-120％之间。用该方法测定的结果与采用原子吸收光谱法(AAS)测定的结果相接近。说明E.coli WMC-011p具备客观检测实际水体中砷的含量的应用前景。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-011p，保藏号为CGMCC No.9760。