CN104845998B - 一种检测水体中重金属铜的微生物学方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测重金属铜大肠埃希氏菌工程菌株的制备方法及其检测水体中铜方法的建立。本发明所述工程菌株具备特异、灵敏、快速、廉价、稳定及定量检测水体中铜浓度及其生物有效性的技术特色；本发明所述工程菌株对铜离子的检测线性范围广、灵敏度高，检测线性范围为0.39‑94μM，最低检测限为0.25μM，既适用于对各类污水、生活饮用水、酸性矿山废水和电镀废水等水体中铜的定量检测，也适用于对治理或修复处理过污染铜水体生物毒性大小的评估，因此可与原子吸收光谱法等理化分析法互补分析水体中铜的生物有效性及其总量，从而为客观评价重金属铜的生物毒性大小提供依据。

Description

一种检测水体中重金属铜的微生物学方法

技术领域

本发明涉及一种检测重金属铜大肠埃希氏菌工程菌株的构建方法及其检测水体中重金属铜的具体实施方案，属于环境生物技术领域。

背景技术

铜(Copper，Cu)作为最常见的重金属元素之一，是生物体新陈代谢必须的微量元素。研究发现过量的铜或铜离子对于所有的生命体都是有毒的，其中人体内铜的过量沉积参与了很多疾病的发生和发展，铜可蓄积于人体重要器官，如肝、肾、脑等，特别是某些患有染色体隐性疾病的人。由于胆汁排泄铜的功能紊乱，铜蓄积于肝，引起肝脏损坏，出现慢性、活动性肝炎症状，如印度儿童肝硬化、Tyrolean婴儿慢性间质性肝炎和Wilson病；当铜蓄积于脑部，可引起神经组织病变，出现小脑运动失常甚至出现帕金森综合症或阿尔茨海默病；当铜沉积在近侧肾小管时，则可引起氨基酸尿、糖尿、蛋白尿、磷酸盐尿和尿酸尿；当铜沉积在眼角膜周围时，在后弹力层上出现铁锈样环，影响眼睛的正常功能；铜过量对男性生殖也存在不利影响。最新研究表明，铜对原核细菌作用靶点主要是一些具有重要功能的铁硫蛋白的铁硫中心。

随着工农业的发展，很多含铜污染物被排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是日常食用的粮食蔬菜，比如在金属矿山开采、冶金、金属加工、机械制造、有机合成及其它工业所产生的废水中大多含有铜，其中以金属加工、电镀工厂所排废水中含铜最高，每升废水含铜几十至几百毫克。水体中含铜量达0.01mg/L时对水体自净有明显的抑制作用；超过3mg/L，会产生异味；超过15mg/L，就无法饮用。若用含铜废水灌溉农田，铜在土壤和农作物中积累，会对农作物，特别是对水稻和大麦生长不利，并会污染粮食。还有铜盐的广泛使用，如常见的波尔多液、硫酸铜、氧化铜、王铜、三氯化铜等作为农药会污染蔬菜。人们过多的暴露于高铜的环境以及高铜饮食都是很强的致病因素，给人们的生活和健康造成了巨大的威胁。比如众所周知的紫金山矿业铜污染事件，江西铜业重金属污染事件就是由铜污染引起的。因此，对重金属铜污染的防治已不容忽视，从而对环境中铜的检测尤为重要。

生物有效性(bioavailability)的学术定义最初来源于药物的使用，通常与人体或组织对药物的吸收有关。生物有效性的定义同样适用于环境污染物，其本质在于研究化学物质与生物体的一种潜在的相互作用关系，从而将生物体与周围环境联系起来。重金属生物有效性是指能够被生物体吸收并引起不良反应或影响生物体生存的那一部分形式的重金属，是衡量重金属毒力大小的重要指标。重金属生物有效性与相互联系的化学、物理和生物因素有关，比如pH、吸附重金属物质的浓度、重金属离子的化合价，因此难以明确定义。微生物对保持土壤肥力和水体自净能力是必不可少的，因此研究重金属的生物有效性对环境微生物也是非常重要的。由于不同生物体对重金属的代谢与抗性机制存在差异，因此由一种生物体测定的生物有效性不一定适用于其他生物体。

研究表明重金属在土壤和水体沉积物中是以多种形态存在的，主要包括弱酸溶解态(可交换态及碳酸盐结合态)、可还原态(Fe或Mn氧化物结合态)、可氧化态(有机物及硫化物结合态)和残渣态(存在矿物晶格中)。其中前3种形态统称为可提取态、不稳定，生物有效性也各自不同。残渣态重金属几乎不能被生物体利用。因此仅凭重金属总量难以有效评价环境中重金属的生物有效性和毒性效应。目前测定生物有效性的化学方法很多，其中由欧共体标准物质局提出的三级四步提取法(BCR法)已被科研工作者普遍接受。而在评价生物有效性的生物学方法中以微生物报告菌株/全细胞微生物传感器最受青睐。因为微生物相对高等生物具有传代快、反应快、易培养、易保存和廉价等优势。最重要的是经过基因改造的报告菌株能以剂量依赖方式对特定化学物一类化学物质进行反应和定量，从而提供一个真实的、可测量的生物有效度。目前该方法已被广泛用于评价环境中无机汞、有机汞、镉、铜、锌、铅、铬、钴和镍等多种重金属生物有效性。

研究不同形式重金属生物毒性效应的最终目的是评价其对人体健康的危害风险。因此，学术界在生物有效性的基础上提出了生物可给性这一概念。重金属生物可给性指人类生活环境中的重金属直接进入人体的消化系统并可被人体胃肠道溶解出的部分。从这一概念中我们可以看出进入人体消化系统中重金属不可能被人体100％吸收。并且研究表明同一样品的重金属生物可给性通常大于其生物有效性。因此，重金属总量同样不能客观反映其对人体健康的危害风险。

目前检测水体重金属污染物的主要方法：原子吸收分光光度法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等，均需要专用仪器设备、专业操作人员，不易在基层和现场应用；而化学显色法、电化学法等，灵敏度、选择性不高，不易准确定量，特别是针对水体中生物有效性重金属的检测，可选的特异、敏感、快速和便携的检测方法更少，难以对水体中重金属生物毒性效应进行客观评价。利用模式生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)对特定化学物质分子反应的生物检测技术克服了如上不足，因此有必要发展一种特异、敏感、快速、廉价、稳定及定量的生物检测技术及其产品来评价环境中铜的生物毒性大小。

微生物报告菌株/全细胞微生物传感器检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器(比如特异识别重金属的转录调控蛋白)；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易改造等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用微生物报告菌株/全细胞微生物传感器来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的微生物报告菌株/全细胞微生物传感器及其产品，如：检测重金属、甲苯及其衍生物等生物传感器细胞。

经检索目前国内外文献中关于检测重金属铜的微生物报告菌株/全细胞微生物传感器的报告基因绝大部分是连接于质粒载体中，因此会存在报告基因的荧光本底值高和细菌传代后子代细胞中质粒拷贝数不均一(数量过高或丢失)，从而导致荧光检测信号稳定性和独立实验重复性不佳等缺陷。此外，当野生型菌株细胞内重金属含量偏高时，细菌会启动表达“外排泵”基因以泵出重金属的自我保护机制，导致检测灵敏度低和线性范围浓度偏高，最低检测限值高于国家标准中针对水体中铜标准限值。由于上述原因，重金属微生物检测技术的应用受到限制而发展缓慢。而本发明综合运用基因敲除与基因敲入技术构建了一种特异、灵敏、快速、廉价、稳定及定量检测水体中铜浓度及其生物有效性的大肠埃希氏菌工程菌株及其产品。经检索本发明构建的大肠埃希氏菌基因工程菌株在国内外均无文献报道。

发明内容

本发明的目的：一、采用基因工程技术改造野生型大肠埃希氏菌，构建一株荧光本底值低、稳定及定量检测水体中重金属铜的大肠埃希氏菌菌株；二、建立微生物法检测水体中重金属铜的应用方案。

发明内容之一：检测重金属铜大肠埃希氏菌工程菌株的构建

本发明的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-007，已于2014年10月08日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.9750。

1.本发明所述大肠埃希氏菌菌株的构建方法如下：

1.1采用Red重组系统，敲除野生型大肠埃希氏菌E.coli MC4100基因组中三个铜离子“外排泵”基因：copA，序列如SEQ ID NO.1所示，cueO，序列如SEQ ID NO.2所示，和cusA，序列如SEQ ID NO 3所示，构建E.coli copA^-cueO^-cusA^-突变菌株；

1.2采用基因敲入技术将增强型绿色荧光蛋白报告基因gfpmut2，序列如SEQ IDNO.5所示，置换到E.coli copA^-cueO^-cusA^-菌株基因组中copA基因编码框位置。具体方法为：通过交叉PCR技术，形成含有报告基因gfpmut2和copA基因两侧同源臂的DNA融合片段，该DNA融合片段大小约为1.7kb，然后酶切连接到pKOV条件复制质粒，构建copA_p：：gfpmut2-pKOV打靶载体，并将该打靶载体转化到E.coli copA^-cueO^-cusA^-菌株中，通过温度及蔗糖的选择，挑选成功发生两次同源重组的菌株，并进一步通过菌落PCR及测序鉴定筛选目的菌株。

2.本发明所述大肠埃希氏菌菌株可以定量检测水体中重金属铜的原理如下：

本发明所述大肠埃希氏菌菌株定量检测水体中铜离子是采用copA_p启动子，序列如SEQ ID NO.4所示，直接启动gfpmut2基因表达模式。在此构建中，当未添加外源性铜离子时，E.coli WMC-007基因组中cueR基因编码产生的CueR蛋白结合于copA_p启动子序列区，阻止GFPmut2表达；当外源性铜离子进入大肠埃希氏菌胞内后，Cu⁺与CueR蛋白结合，使CueR蛋白从启动子上脱落，激活E.coli WMC-007基因组中copA_p：：gfpmut2融合基因的表达，从而产生GFPmut2蛋白，并且产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以达到定量检测铜离子浓度的目的。

发明内容之二：提供一种微生物法检测水体中重金属铜的应用实施方案

本发明所述大肠埃希氏菌菌株检测水体中重金属铜的应用实施方案如下：

1.环境水体样品测定的准备：

取10-50ml待测环境水体样品，12,000g离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为6-8，再用0.2μm的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定。

2.标准曲线测定的准备：

把铜单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。具体的浓度需根据样品中Cu的浓度而定。初次检测可以检测0.025、0.05、0.5、1、2.5、5mg/L这几个标准品浓度，在后续的实验中根据样品中Cu的浓度对标准品的浓度进行适当调节。

3.LB培养基的配制：

按照步骤1每个样品或标准品需300μl-3ml LB培养基的比例配制适当量的LB培养基。LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的无菌MOPS缓冲液(400mmol/L)后均匀混合。

4.标准曲线的制定及步骤1样品Cu浓度的测定：

4.1取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到上述LB培养基中，使菌液起始OD₆₀₀值为0.02，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl水体样品或铜单元素标准品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品或标准品各做3个平行孔或3个平行管；37℃、250rpm振荡孵育2-5h；4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1mlDB(500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素、pH 8.0)缓冲液中；

4.2将步骤4.1重悬菌液稀释0-20倍，使E.coli WMC-007全细胞悬浮液的OD600值小于0.3，混匀，分别测量其稀释液荧光值(激发波长为481nm，发射波长为507nm)与OD600值；

4.3数据处理：

相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFU_M＝F_M/OD600_M，F_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的荧光值，OD600_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的吸光度；RFU_W＝F_W/OD600_W，F_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的背景荧光值，OD600_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的吸光度；

绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFU_M-RFU_W，RFU_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的相对荧光值，RFU_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的相对背景荧光值。

4.4以步骤4.1铜单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，铜单元素标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合获得标准方程，将测得水体样品的绝对荧值代入方程，计算得到水体样品中铜的浓度。

本发明所述一种检测水体中重金属铜的微生物学方法，具备以下创新点和技术优势：

1.本发明所述大肠埃希氏菌菌株对铜离子高度敏感。根据最小抑菌浓度(MIC)试验表明，E.coli copA^-cueO^-cusA^-三突变菌株对Cu²⁺的敏感性约为野生型E.coli MC4100菌株的35倍，因此，以E.coli copA^-cueO^-cusA^-菌株作为重金属铜检测元件copAp：：gfpmut2的宿主菌株，非常有利于其对痕量重金属铜离子的检测；

2.本发明所述大肠埃希氏菌菌株采用增强型绿色荧光蛋白GFPmut2所发荧光作为检测信号，它比野生型GFP的荧光强100多倍，提高了大肠埃希氏菌菌株对Cu²⁺检测的灵敏度。并且以gfpmut2作为报告基因，具备无需底物和辅助因子的参与、检测方便、肉眼便可观察、灵敏度高、荧光稳定、无毒害、通用性、易于构建载体和可进行活细胞定时定位观察等特点；

3.E.coli WMC-007菌株的荧光本底值低。E.coli WMC-007菌株中gfpmut2报告基因位于基因组中，相对于gfpmut2报告基因位于pET28a质粒上的E.coli WMC-006菌株，在未添加外源性铜离子条件下，E.coli WMC-007菌株的荧光本底值明显较低，降低了12倍左右，并且其荧光本底的SD值也显著小于E.coli WMC-006菌株，因此，将gfpmut2报告基因敲入到大肠埃希氏菌基因组中，更有利于提高菌株对nmol数量级铜离子诱导产生荧光信号检测的灵敏度；

4.荧光蛋白表达稳定，独立实验重复性好。荧光分光光度计与流式细胞术分析表明，在固定铜离子浓度条件下，相对E.coli WMC-006菌株，E.coli WMC-007菌株平行实验之间荧光强度值偏差小，独立实验重复性好；

5.检测流程操作简便、检测时间短。Cu²⁺标准品或待检测环境水体样品在开始接种过夜菌种子液时即可加入，孵育2-5h后测量全细胞悬浮液荧光值与OD600值。而gfpmut2报告基因位于质粒上的菌株需要先培养90-120min，至OD600为0.4-0.6左右时，再加入Cu²⁺标准品或待检测环境水体样品，孵育80-240min后测量全细胞悬浮液荧光值与OD600值；

6.E.coli WMC-007菌株中未导入任何外源抗生素抗性基因，不会危及人类健康或污染环境；

7.本发明所述大肠埃希氏菌菌株可用于衡量重金属生物有效性。重金属生物有效性是指能够被生物体吸收并引起不良反应或影响生物体生存的那一部分形式的重金属，是衡量重金属毒力大小的重要指标。重金属在环境中是以多种形态存在的，如残渣态重金属几乎不能被生物体利用，传统的AAS和ICP-MS等理化分析法检测的是样品中重金属总量，而微生物细胞作为一个生命系统，存在重金属的代谢与抗性机制，可以选择性吸收不同形态的重金属，能够有效评价环境中重金属的生物有效性和毒性效应。此外，微生物对保持土壤肥力和水体自净能力是必不可少的，因此研究重金属的生物有效性对环境微生物也是非常重要的。

技术效果：

1.采用本发明所述大肠埃希氏菌菌株检测水体中重金属铜，具有特异、灵敏、快速、低成本、低荧光本底值、稳定及定量检测铜浓度及其生物有效性的技术特色；

2.本发明所述大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007对铜离子的检测范围广、检测灵敏度高，并且能够保持高度专一性，不对其它金属离子，如Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺等产生响应，从而不会影响铜离子的检测，E.coli WMC-007菌株检测Cu²⁺的线性范围为3.9×10^-7-9.4×10^-5mol/L(0.025-6mg/L)，最低检测限为2.45×10^-7mol/L(0.0157mg/L)，最低检测限值低于我国污水综合排放I类标准(GB8978-1996)、地表水质量II类标准(GB3838-2002)、地下水质量II类标准(GB/T14848-93)和生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)中针对铜的标准限值。

附图说明

图1.成功构建大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007的菌落PCR鉴定产物凝胶电泳分析图谱。

M：DL 5000DNA Marke；Lane-1：空白对照；Lane-2：基因敲除菌株，E.coli copA^-cueO^-cusA^-；Lane-3：打靶载体copA_p：：gfpmut2-pKOV导入E.coli copA^-cueO^-cusA^-宿主菌于30℃孵育菌落PCR产物；Lane-4：第一步同源重组成功菌株于42℃孵育PCR产物；Lane-5、7、10、12：蔗糖抵抗和氯霉素敏感菌株的菌落PCR鉴定产物，gfpmut2融合基因敲入未成功，为阴性菌落；Lane-6、8、9、13、14：蔗糖抵抗和氯霉素敏感的菌落PCR鉴定产物，gfpmut2融合基因敲入成功，为阳性菌落；Lane-11：蔗糖和氯霉素抵抗菌株的菌落PCR鉴定产物。

图2.诱导时间对E.coli WMC-007检测不同浓度铜离子的灵敏度和线性范围曲线拟合的影响。

图3.E.coli WMC-007与不同浓度铜离子孵育后全细胞的激光共聚焦成像图谱。

A：E.coli WMC-007菌株细胞与10^-3mol/L铜离子孵育5h后激光共聚焦成像图谱；

B：E.coli WMC-007菌株细胞与0mol/L铜离子孵育5h后激光共聚焦成像图谱；C：E.coli WMC-007菌株细胞与10^-5mol/L铜离子孵育5h后激光共聚焦成像图谱。

图4.E.coli WMC-007菌株细胞中诱导产生的GFPmut2蛋白的荧光强度和表达量与铜离子浓度呈剂量依赖关系图。

A：E.coli WMC-007菌株细胞中GFPmut2蛋白荧光强度对不同浓度铜离子的剂量依赖反应曲线图；B：不同浓度铜离子诱导E.coliWMC-007中GFPmut2蛋白表达水平的Westernblot鉴定图谱。

图5.E.coli WMC-007菌株检测不同金属离子的特异性与选择性实验柱状图。

A：E.coli WMC-007菌株检测不同金属离子的特异性实验柱状图；B：E.coli WMC-007检测不同组合金属离子的选择性实验柱状图，MM表示Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺和Ni²⁺七种金属离子混合液。

图6.E.coli WMC-007菌株检测铜离子线性范围曲线拟合结果。

图7：在固定Cu²⁺浓度条件下，螯合剂EDTA影响Cu²⁺生物有效性的实验图谱。

A：在固定Cu²⁺浓度条件下，不同浓度的螯合剂EDTA影响E.coli WMC-007菌株中GFPmut2荧光表达的发射光谱扫描图；B：在固定Cu²⁺浓度条件下，不同浓度的螯合剂EDTA影响Cu²⁺生物有效性的柱状图。

图8.LB培养基中，E.coli WMC-007菌株和E.coli WMC-006菌株表达GFPmut2蛋白的本底荧光强度的比较图谱。

A：E.coli WMC-007菌株和E.coli WMC-006菌株在LB培养基中孵育5h后全细胞重悬液的发射光谱扫描图。DB为Desalting buffer的缩写，包含500mM NaCl和20mM Tris-HCl(pH8.0)；

B：E.coli WMC-007菌株和E.coli WMC-006菌株表达GFPmut2蛋白的本底荧光强度比较实验柱状图。

图9.流式细胞术分析与不同浓度铜离子孵育后大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007和E.coli WMC-006菌株单细胞的平均荧光强度图谱。

A：大肠埃希氏菌E.coli WMC-006菌株与0、10^-7、10^-5、10^-3mol/L铜离子孵育后的FITC-GFPmut2荧光峰图；

B：大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007与0、10^-7、10^-5、10^-3mol/L铜离子孵育后的FITC-GFPmut2荧光峰图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1.检测重金属铜大肠埃希氏菌菌株的制备：

一、采用Red重组系统构建对铜离子敏感的大肠埃希氏菌突变菌株E.coli copA^-cueO^-cusA^-

以pKD3为模板，PCR扩增带FRT位点(FLP重组酶识别位点)的氯霉素抗性基因，将其电转至含pKD46质粒的MC4100电转感受态中。pKD46/MC4100细菌感受态制备时经30mmol/L阿拉伯糖诱导，使pKD46质粒在菌体内表达Gam、Bet和Exo三种λ噬菌体重组酶，其中Gam重组酶抑制大肠埃希氏菌的RecBCD核酸外切酶V活性，使电转入细菌体内的氯霉素基因不至立即被降解，同时Exo和Bet重组酶引导氯霉素基因与同源区发生重组置换，使其分别与三种待敲除基因copA、cueO、cusA的同源臂发生同源重组，置换出待敲除基因，制备得到copA：：cat/MC4100，cueO：：cat/MC4100，cusA：：cat/MC4100三种突变菌。然后将pCP20(为温度敏感型质粒，42℃诱导FLP重组酶表达的同时质粒也逐渐丢失)转化至以上三种突变菌感受态细胞中，消除FRT位点间的氯霉素抗性基因，得到copA、cueO、cusA基因缺失的单突变菌。同样操做，在单基因突变菌的基础上制备双基因突变菌及三基因突变菌。经PCR鉴定及测序正确后制备得到E.coli copA^-cueO^-cusA^-三基因突变菌株。

二、采用基因敲入技术构建检测重金属铜的大肠埃希氏菌菌株

pKOV为低拷贝质粒，其包含一个温度敏感的PSC101复制起始子-repAts、氯霉素抗性基因-cat和枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因-sacB(该基因的表达可使其宿主菌在高浓度蔗糖环境中无法生长而致死)。

1.基因敲入流程为：

1.1利用聚合酶链反应(PCR)技术将大肠埃希氏菌基因组中待置换目的基因copA两侧DNA片段copA_No-Ni和copA_Ci-Co进行扩增，扩增引物序列如SEQ ID NO.6-9所示，按照经验，需要较大的DNA片段(每段DNA长度为～500bp)才能利用宿主重组酶系统成功进行重组；再对报告基因gfpmut2进行扩增，扩增引物序列如SEQ ID NO.10-11所示。copA_No-Ni片段的5′端引物被设计成含有Not I内切酶位点，而3′端引物含有与gfpmut2基因上游的互补序列。copA_Ci-Co片段的3′端引物被设计成含有Sal I内切酶位点，5′端引物含有与gfpmut2基因下游的互补序列。通过PCR反应先分别扩增出copA_No-Ni、copA_Ci-Co和gfpmut2片段，再通过交叉PCR技术连接构建重金属铜检测元件copA_No-Ni-gfpmut2-copA_Ci-Co；

1.2将检测元件与pMD18-T载体连接，测序无误后，经NotI和SalI双酶切、连接构建基因打靶载体：copA_p：：gfpmut2-pKOV；

1.3采用冷氯化钙法将打靶载体转化到对铜离子高度敏感的E.coli copA^-cueO^-cusA^-感受态细胞中，并涂布于20μg/ml Cm⁺/LB平板，置30℃孵育；

1.4挑取转化成功的菌株分区划线接种于Cm⁺/LB平板，置43℃孵育。平板上存活的菌落表明打靶载体已成功整合到基因组中，因为pKOV的复制起始子不会在非允许温度下复制增殖；

1.543℃平板上存活的菌落将会立即被转接到含5％(W/V)蔗糖的LB平板上，置30℃孵育，筛选发生第二次同源重组的目的菌株；

1.6挑取5％蔗糖平板上存活的菌落依次划线接种于Cm⁺/LB平板和5％蔗糖/LB平板，置30℃孵育；

1.7挑取对蔗糖抵抗、且对氯霉素敏感的菌落，采用检测元件的两个外侧引物对其进行菌落PCR鉴定，如果gfpmut2成功敲入到copA位置，则PCR产物为检测元件大小，如果扩增出与copA基因两端同源臂一样大小的PCR产物，则说明两次同源重组发生在同一端，基因敲入未成功。

2.实验结果：采用基因敲除、基因融合、基因敲入和菌落PCR技术成功筛选到目的菌株copA_p：：gfpmut2/E.coli copA^-cueO^-cusA^-，其PCR鉴定产物大小为1708bp，条带单一(如图1所示)，产物测序结果与检测元件序列一致。该菌株与1mM Cu²⁺孵育5h后，菌体呈肉眼可见的黄绿色；在481nm激发光激发下，在507nm处具有最大吸收峰；在激光共聚焦显微镜下观察到整个菌体呈亮绿色，这些特征符合GFPmut2蛋白的荧光特征，充分证明gfpmut2编码框序列已成功投送到copA编码框位置，报告菌株构建成功，命名为E.coli WMC-007。

三、含检测重金属铜报告载体大肠埃希氏菌菌株的构建

1.报告载体的构建

将重金属铜检测元件扩增产物，copA_p：：gfpmut2经电泳、切胶回收、与PMD-19T载体连接、限制性酶切、切胶回收后与pET28a连接，构建成报告载体copA_p：：gfpmut2-pET28a。报告载体转化DH5α后挑取阳性克隆提质粒酶切鉴定并进行测序分析，测序正确的克隆扩大培养用TaKaRa质粒提取试剂盒提取质粒，-20℃冻存备用，同时于-80℃菌种保存。

2.含报告载体宿主菌的构建

将报告载体copA_p：：gfpmut2-pET28a热击转化至E.coli copA^-cueO^-cusA^-突变菌中，然后对筛选到的单菌落分别进行copA_p：：gfpmut2目的基因PCR鉴定与突变菌PCR鉴定，确保重组质粒转化至正确的突变菌中。最终筛选到的copA_p：：gfpmut2-pET28a/E.colicopA^-cueO^-cusA^-报告菌株，命名为E.coli WMC-006，并于2011年2月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.4624。

实施例2.检测重金属铜大肠埃希氏菌菌株性能的测定与参数优化

对构建的大肠埃希氏菌菌株进行测定条件优化及相关参数的确定，以确定一套稳定、敏感、准确的实验测定条件，包括诱导动力学实验、反应曲线的测定、特异性与选择性实验、表征分析、最适检测范围的确定、最低检测限的测定等实施方案。

1.大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007与铜离子孵育时间的优化

1.1在固定Cu²⁺浓度条件下，E.coli WMC-007表达GFPmut2的诱导动力学分析。

用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，同时加入Cu²⁺溶液，使其终浓度为100μM，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照，每种浓度各做3个平行管。将菌液于37℃，250rpm振荡培养，监测其8h内荧光强度与浊度变化，每隔1h取1ml菌液，4000rpm，水平离心10min，弃上清后，重悬于1ml DB(含有20μg/ml氯霉素用于阻止新的GFPmut2蛋白的合成)中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

1.2诱导时间对E.coli WMC-007检测不同浓度铜离子的灵敏度和线性范围曲线拟合的影响。

用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到100ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，分装(1ml/管)，加入10μl不同浓度的Cu²⁺溶液至各管菌液，使其终浓度分别为0.39、0.78、1.56、7.81、15.63、39.06、78.13μM/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。每种浓度各做12个平行管(每次取3个平行管)。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养2h、3h、4h、5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值。

1.3实验数据处理：

相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFU_M＝F_M/OD600_M，F_M为与金属离子孵育E.coli WMC-007的荧光值，OD600_M为与金属离子孵育E.coli WMC-007的吸光度；RFU_W＝F_W/OD600_W，F_W为与MilliQ H₂O孵育E.coli WMC-007的背景荧光值，OD600_W为与MilliQH₂O孵育E.coli WMC-007的吸光度；

绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFU_M-RFU_W，RFU_M为与金属离子孵育E.coli WMC-007的相对荧光值，RFU_W为与MilliQ H₂O孵育E.coli WMC-007的相对背景荧光值。

1.4实验结果：在固定Cu²⁺浓度条件下，E.coli WMC-007表达GFPmut2的诱导动力学曲线趋势与其生长曲线趋势一致，孵育4h后表达GFPmut2的荧光值进入平台期。以铜离子浓度为横坐标，AFU值为纵坐标作图，并进行曲线拟合。结果显示，经过2-5h诱导后曲线拟合，如图2所示，R²都接近于0.9999，故选择2-5h为最佳Cu²⁺诱导时间，此时检测范围为0.4-80μM。

2.E.coli WMC-007菌株与不同浓度铜离子孵育后全细胞的激光共聚焦成像分析

2.1实验步骤：分别收集在LB培养基中与0、1.0×10^-5、1.0×10^-3mol/l Cu²⁺孵育5h后的E.coli WMC-007菌体。收获的菌体用经0.22μm无菌滤膜过滤的生理盐水(含有终浓度为20μg/ml氯霉素)重悬洗涤2-3次，用无菌接种环沾取上述各菌液一环，分别在经泡酸处理的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，让涂片在空气中自然干燥后，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)，然后用激光共聚焦仪进行镜检。

2.2激光共聚焦实验条件：激发波长，488nm；电压，598V；像素，1024*1024pixel；放大倍数，600倍。

2.3实验结果：E.coli WMC-007在激光共聚焦显微镜下观察到整个菌体呈现亮绿色(图3)，更进一步验证了荧光蛋白的表达，且菌体的荧光强弱与铜离子浓度呈剂量依赖关系，在检测范围内，呈亮绿色的菌体与白光下观察到的菌体能够一一对应，说明将报告基因GFPmut2整合到基因组上相对整合到质粒载体上能有效提高其表达稳定性。

3.验证E.coli WMC-007菌株中诱导产生的GFPmut2荧光强度和蛋白表达量与铜离子浓度呈剂量依赖关系实验。

3.1确定E.coli WMC-007中GFPmut2蛋白的荧光表达水平对不同浓度铜离子的剂量依赖反应曲线实验

用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，分装(1ml/管)，加入10μl不同浓度的Cu²⁺溶液至各管菌液使其终浓度分别为1.0×10^-9、1.0×10^-8、1.0×10^-7、1.0×10^-6、1.0×10^-5、1.0×10^-4、1.0×10^-3mol/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照，每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

3.2不同浓度铜离子诱导E.coli WMC-007中GFPmut2蛋白表达水平的Westernblot鉴定实验。

分别收集在LB培养基中与0、1.0×10^-9、1.0×10^-8、1.0×10^-7、1.0×10^-6、1.0×10^-5、1.0×10^-4mol/L Cu²⁺孵育5h后的E.coli WMC-007菌体，用DB将各菌液浊度调为OD₆₀₀＝4，采用高压破碎仪破碎上述样品。蛋白抽提物(30μg总蛋白/Lane)经SDS-PAGE分离后湿转至PVDF膜上。GFPmut2的检测采用特异的来源于兔子的多克隆抗体和碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG二抗，至少重复三次实验。

3.3实验结果：根据E.coli WMC-007对Cu²⁺的反映曲线及Western blot实验结果(如图4)，可以看出，E.coli WMC-007中GFPmut2蛋白的表达量和荧光强度都与铜离子浓度呈剂量依赖关系，在10^-7-10^-3mol/L Cu²⁺浓度范围内，AFU值相对铜离子浓度的曲线拟合度高。

4.E.coli WMC-007菌株检测不同金属离子的特异性与选择性实验。

4.1E.coli WMC-007菌株检测不同金属离子的特异性实验。

用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值为0.02，分装(1ml/管)，分别加入10μl不同金属离子(Ag⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺)使其终浓度为5μM/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照，各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后(Ag⁺和Pb²⁺离子为避光孵育)，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。

4.2实验数据处理：

将Cu²⁺的AFU值定义为100％，并以其它各金属离子的AFU值相对Cu²⁺AFU值的百分比表示copA_p启动子对各金属离子选择的特异性。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

4.3E.coli WMC-007菌株检测不同金属离子的选择性实验。

用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，分装(0.96mL/管)，对照组同时加入35μl无菌MilliQH₂O和5μl Cu²⁺溶液，实验组同时加入30μl无菌MilliQ H₂O、5μl Cu²⁺溶液和分别加入5μl不同金属离子(Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Ag⁺、Pb²⁺)，另设一实验组为同时加入30μl无菌MilliQ H₂O、5μl Cu²⁺溶液和除Ag⁺、Pb²⁺以外上述其它七种金属离子各5μl，阴性对照组为每管加入40μl无菌MilliQ H₂O，上述各种金属离子终浓度都为5μM/L，各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。

4.4实验数据处理：

将只加Cu²⁺对照组的AFU值定义为100％，并以其它实验组的AFU值相对Cu²⁺对照组AFU值的百分比表示E.coli WMC-007对各种金属离子的选择性。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

4.5实验结果：从图5-A中可以看出浓度为5μM的Pb²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ni^{2 +}、Co²⁺都不能启动GFPmut2蛋白的表达，说明报告菌株E.coli WMC-007对铜离子具有很好的特异性；从图5-B中可以看出浓度为5μM的Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺七种金属离子分别和同时与5μM Cu²⁺孵育时都对Cu²⁺诱导的GFPmut2荧光表达几乎没有干扰，说明报告菌株E.coli WMC-007对Cu²⁺具有较好的选择性与特异性。

5.大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007最适检测范围的确定

5.1用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，分装(0.99ml/管)，加入10μl不同浓度的铜单元素标准溶液至各管菌液，使其终浓度分别为0.039、0.078、0.12、0.16、0.39、0.78、1.56、7.81、15.63、31.25、39.06、78.13、117.19μM，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值。

5.2实验结果：如图6所示，生物检测菌株E.coli WMC-007对铜离子检测的线性范围为3.9×10^-7-9.4×10^-5mol/L(0.025-6mg/L)，且回归方程为y＝198.95log(x)+361.41，相关系数R²＝0.9982，线性好，相关性很强。

6.大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007最低检测限(Determine the Limit ofDetection，LOD)的确定

6.1用移液枪分别吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到20ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，分装(1ml/管)，每管加入10μl无菌MilliQH₂O，做10个平行管，37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。

6.2实验数据处理：

X_W为生物检测菌株背景荧光值的平均值(10个平行管)，SD值为生物检测菌株背景荧光值的标准差。由LOD_AFU代入Cu²⁺标准曲线计算出的LOD值的单位为mg/L Cu²⁺。

6.3实验结果：E.coli WMC-007菌株对Cu²⁺的LOD值为2.45×10^-7mol/L或0.0157mg/L，LOD值低于我国污水综合排放I类标准(GB8978-1996)、地表水质量II类标准(GB3838-2002)、地下水质量II类标准(GB/T14848-93)和生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)中针对铜标准限值。

7.在固定Cu²⁺浓度条件下，研究EDTA对Cu²⁺的生物有效性的影响

7.1用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，分装(1ml/管)，加入等体积的铜单元素标准溶液至各管菌液，使其终浓度都为16μM，然后再分别加入等体积的EDTA(铜离子螯合剂)至各管菌液使其终浓度分别为0、200、400、800μM，每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。然后根据标准曲线的回归方程计算样品中被检测到Cu²⁺的含量。将未添加EDTA对照组中Cu²⁺的生物有效性定义为100％，并以其它实验组中被检测到Cu²⁺的含量占对照组Cu²⁺含量的百分比表示各实验组中Cu²⁺的生物有效性。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

7.2实验结果：如图7所示，E.coli WMC-007对0-200μM EDTA具有较强的抗干扰能力，但随着EDTA浓度继续增加，EDTA大量螯合培养基中Cu²⁺，使其不能进入细胞内诱导GFPmut2的表达，从而使检测值低于环境真实值，降低了Cu²⁺的生物有效性，说明E.coliWMC-007具备客观评价水体中游离和或复合形式铜的生物有效性和生物毒性效应的应用前景。

实施例3.一种大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007检测水体中重金属铜方法学的建立及其应用实施方案

1.培养基的配制：1g/L胰蛋白胨、0.5g/L酵母膏、1g/L NaCl，先加50ml MilliQH₂O，振荡至完全融解后加MilliQ H₂O定容至80ml，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)，再加入10ml400mM无菌MOPS缓冲液(pH 7.2)，混匀。

2.标准曲线的制定：

用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到50ml新鲜LB液体培养基(含终浓度为40mmol/L的MOPS)中，使起始菌液OD600值约为0.02，分装(1ml/管)，加入等体积不同浓度的Cu²⁺溶液至各管菌液，使其终浓度分别为0.16、0.39、0.78、1.56、7.81、15.63、31.25、39.06、78.13μmol/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次平行实验的平均值±SD值。

3.大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007对强酸强碱样品中铜离子的回收实验

用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到上述90ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02(按100ml体积计算)，分装(0.9ml/管)，分别加入100μl六种不同pH值(0.87、10.8、12.84、14.7)的样品，然后再分别加入等体积铜单元素标准溶液至各管菌液使其终浓度都为15.63μM，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为空白对照。每种pH值样品各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。然后根据上述标准曲线的回归方程计算样品中Cu²⁺的加标回收率。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。(如表1)。

表1：报告菌株E.coli WMC-007检测强酸强碱样品中Cu²⁺的加标回收率

pH¹为强酸强碱样品的pH值；pH²为LB(含40mM MOPS)中加入强酸强碱样品后测量所得pH值，样品1为等体积无菌MilliQ H₂O。Cu²⁺added栏浓度为采用原子吸收光谱法测量所得，Cu²⁺found栏浓度为

采用E.coli WMC-007菌株测量所得。

4.大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007对湖水标本中铜离子的回收实验

从温州医科大学茶山校区采集一个湖水样品，经0.22μm的无菌过滤器过滤。用移液枪吸取计算好的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到上述90ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，分装(0.9ml/管)，加入等体积不同浓度的铜单元素标准溶液至各管菌液，使其终浓度分别为0、0.78、7.81、15.63μM，然后再分别加入100μl过滤后的湖水至每管菌液，每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值。然后根据上述标准曲线的回归方程计算样品中Cu²⁺的加标回收率。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。(如表2)。

表2：报告菌株E.coli WMC-007检测湖水样品中Cu²⁺的加标回收率

ND，not detectable(Below the limit of determination of the E.coli WMC-007)；样品1为未添加外源性Cu²⁺的湖水样品，采用原子吸收光谱法测量其Cu²⁺本底值为0.02μM。Cu²⁺added栏浓度为采用原子吸收光谱法测量所得，Cu²⁺found栏浓度为采用E.coliWMC-007菌株测量所得。

5.实验结果：从表1-2中回收实验结果来看，在含有40mM MOPS缓冲成分的LB中，报告菌株E.coli WMC-007对酸碱样品pH值的抗干扰范围为0.87～12.84，对湖水样品中Cu²⁺也具有较好的加标回收率。其中表2中5号样品的检测值偏低，是因为当培养基pH值偏碱性时，Cu²⁺易沉淀，不易被微生物摄取，从而降低其生物有效性。综上所述，可初步确定该生物检测菌株E.coli WMC-007具备检测各类环境水体中铜浓度及其生物有效性的应用前景。

实施例4.在LB培养基中，分析大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007的本底荧光强度。

1.用移液枪分别吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到10ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，分装(1ml/管)，每管加入10μl无菌MilliQH₂O，做3个平行管，37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，根据其OD600值，用DB将各菌液浊度调为OD600＝0.25，分别测量其稀释液荧光值(以DB为空白对照)。

2.用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-006过夜菌种子液加入到10ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，加入5μl Kanal00，37℃，250rpm扩大培养至OD₆₀₀为0.6左右，分装(1ml/管)，每管加入10μl无菌MilliQ H₂O，做3个平行管，37℃，250rpm振荡培养3h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，根据其OD600值，用DB将各菌液浊度调为OD600＝0.25，分别测量其稀释液荧光值(以DB为空白对照)。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

3.实验结果：如图8所示，在LB培养基中，不添加外源铜离子条件下，E.coli WMC-006菌株产生的荧光本底值约为E.coli WMC-007菌株的12倍，并且其荧光本底的SD值也显著大于E.coli WMC-007菌株，说明将检测元件整合到基因组上能显著降低其荧光本底表达，提高大肠埃希氏菌生物检测菌株对nmol数量级铜离子诱导产生荧光信号的检出。

实施例5.流式细胞术分析大肠埃希氏菌菌株E.coli WMC-007检测铜离子荧光信号的稳定性。

1.用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到10ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，分装(1ml/管)，加入10μl不同浓度的Cu²⁺溶液至各管菌液，使其终浓度分别为1.0×10^-8、1.0×10^-7、1.0×10^-6、1.0×10^-5、1.0×10^-4、1.0×10^-3mol/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养5h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体用经0.22μm无菌滤膜过滤的生理盐水(含有终浓度为20μg/ml氯霉素)重悬洗涤2-3次后，根据其OD600值将菌液浓度大致调为5×10⁶CFU/ml，并于37℃震荡孵育15min以获得浓度均一的菌悬液。然后取1ml样品移入流式管中。以激发光波长为488nm，发射光波长为505-545nm的检测参数对样本进行分析测试。仪器设定为每个样本检测10,000个细胞。

2.用移液枪吸取一定体积的E.coli WMC-006过夜菌种子液加入到20ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值为0.02，加入10μl Kana100，37℃，250rpm扩大培养至OD600为0.5左右，分装(1ml/管)，加入10μl不同浓度的Cu²⁺溶液至各管菌液，使其终浓度分别为1.0×10^-8、1.0×10^-7、1.0×10^-6、1.0×10^-5、1.0×10^-4、1.0×10^-3mol/L，另加等体积无菌MilliQ H₂O作为阴性对照。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养3h后，4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体用经0.22μm无菌滤膜过滤的生理盐水(含有终浓度为20μg/ml氯霉素)重悬洗涤2-3次后，根据其OD600值将菌液浓度大致调为5×10⁶CFU/ml，并于37℃震荡孵育15min以获得浓度均一的菌悬液。然后取1ml样品移入流式管中。以激发光波长为488nm，发射光波长为505-545nm的检测参数对样本进行分析测试。仪器设定为每个样本检测10,000个细胞。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。

3.实验结果：如图9所示，将反应报告元件(copA_p：：gfpmut2)敲入基因组之后，相对E.coli WMC-006菌株，E.coli WMC-007对铜离子反应的均一性明显提高，表现为FITC-GFPmut2荧光峰图的离散度明显变小，说明E.coli WMC-007具有更好的检测稳定性和精确度。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WMC-007 CGMCC No.9750应用于水体重金属铜的检测。

2.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-007工程菌株的构建方法如下：

2.1采用Red重组系统，敲除野生型大肠埃希氏菌E.coli MC4100基因组中三个铜离子外排泵基因：copA、cueO和cusA，构建对铜离子高度敏感的E.coli copA-cueO-cusA-突变菌株；copA，序列如SEQ ID NO.1所示，cueO，序列如SEQ ID NO.2所示，cusA，序列如SEQ ID NO3所示；

2.2采用基因融合和基因敲入技术将不含启动子的增强型绿色荧光蛋白gfpmut2报告基因置换到E.coli copA^-cueO^-cusA^-菌株基因组中copA基因编码框位置，并通过菌落PCR及测序鉴定筛选获得目的菌株；copA_p启动子序列为SEQ ID NO.4所示，gfpmut2序列为SEQ IDNO.5所示，基因copA两侧DNA片段copA_No-Ni和copA_Ci-Co进行扩增，扩增引物序列为SEQ IDNO.6-9所示，基因gfpmut2进行扩增，扩增引物序列为SEQ ID NO.10-11所示。

3.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-007性能的测定与参数优化如下：

3.1 E.coli WMC-007菌株对铜离子的检测线性范围广，可以检测0.0157-6mg/L范围的铜离子，并且能够保持高度专一性；

3.2荧光分光光度计与流式细胞术分析表明，大肠埃希氏菌工程菌株E.coli WMC-007具有荧光本底值低、操作简便、检测时间短、检测信号稳定和独立实验重复性好的优势。

4.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-007的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-007检测水体中重金属铜的微生物方法，包含以下步骤：

4.1环境水体样品测定的准备：

取10-50ml待测环境水体样品，12,000g离心5min，取上清，用0.5M稀盐酸或氢氧化钠溶液调节上清样品的pH值为6-8，再用0.2微米的无菌针头滤器过滤，过滤后样品用于后续的测定；

4.2标准曲线测定的准备：

把铜单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度； 具体的浓度需根据样品中Cu的浓度而定； 初次检测可以检测0.025、0.05、0.5、1、2.5、5mg/L这几个标准品浓度，在后续的实验中根据样品中Cu的浓度对标准品的浓度进行适当调节；

4.3 LB培养基的配制：

按照步骤4.1每个样品或标准品需300μl-3ml LB培养基的比例配制适当量的LB培养基；LB培养基组份浓度为1％(W/V)Tryptone、0.5％(W/V)Yeast Extract、1％(W/V)NaCl、80％(V/V)去离子水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入10％(V/V)体积pH 7.2的无菌400mmol/L MOPS缓冲液后均匀混合；

4.4标准曲线的制定及步骤4.1样品Cu浓度的测定：

4.4.1取一定体积的E.coli WMC-007过夜菌种子液加入到上述LB培养基中，使菌液起始OD600值为0.02，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入10-100μl水体样品或铜单元素标准品，另加等体积无菌MilliQ级纯水作为阴性对照，每种水体样品或标准品各做3个平行孔或3个平行管；37℃、250rpm振荡孵育2-5h；4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml含500mM NaCl，20mM Tris-HCl和20μg/ml氯霉素的pH 8.0 DB缓冲液中；

4.4.2将步骤4.4.1重悬菌液稀释0-20倍，使E.coli WMC-007全细胞悬浮液的OD600小于0.3，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD600值；

4.4.3数据处理：

相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFU_M＝F_M/OD600_M，F_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的荧光值，OD600_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的吸光度；RFU_W＝F_W/OD600_W，F_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的背景荧光值，OD600_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的吸光度；

绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFU_M-RFU_W，RFU_M为与水体样品或铜单元素标准品孵育E.coli WMC-007菌悬液的相对荧光值，RFU_W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-007菌悬液的相对背景荧光值；

4.4.4以步骤4.4.1铜单元素标准品诱导的绝对荧光值为纵坐标，铜单元素标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，并进行曲线拟合获得标准方程，将测得水体样品的绝对荧值代入方程，计算得到水体样品中铜的浓度。