CN102108407B - 辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的分子标记、专用引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的分子标记、专用引物及其应用。本发明提供了一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的试剂，是由序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对。本发明还提供了与甘蓝抗枯萎病基因遗传距离约2.87cm的特异基因片段，由序列表的序列1所示核苷酸组成。利用本发明提供的试剂(引物对)或SCAR标记辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝，与田间鉴定结果抗病吻合率达97％。将本发明的试剂、分子标记或方法用于育种，具有准确、快速、可以实现早期选育等优点，具有重大应用前景。

Description

辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的分子标记、专用引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的分子标记、专用引物及其应用。

背景技术

甘蓝(Brassica oleracea)是世界上普遍种植的一种十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)蔬菜作物，中国各地均有栽培，是东北、西北、华北等较冷凉地区春、夏、秋的主要蔬菜，华南等地冬、春也大面积栽培。多数地区选用适宜的品种实行排开播种，分期收获，在蔬菜周年供应中占重要地位，近年来我国每年种植面积稳定在100万公顷左右。

甘蓝枯萎病是由尖孢镰刀菌粘团专化型(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)引起的土传维管束病害。受害甘蓝病株一般在定植后2～4周表现出典型的症状，首先表现出的症状是植株一侧或整个下部叶片黄化，随后向上部叶片发展，叶片和茎部的维管组织变褐，病株逐渐死亡。该病害是我国新发病害，首先于2001年在北京市延庆县甘蓝种植基地发生，随后在山西寿阳、大同阳高、河北张家口等越夏甘蓝种植基地陆续发生。甘蓝枯萎病菌能侵染所有甘蓝类蔬菜，其在我国北方地区的逐年加重，已经对甘蓝生产构成巨大威胁。国内外研究证明，由于枯萎病原菌可以在没有种植甘蓝的土壤中存活多年，传统的病害防治措施如种子处理，轮作和杀菌剂使用对甘蓝类作物枯萎病防治难度较大，利用抗性品种是消除这种毁灭性病害潜在威胁的最有效途径。

常的抗病育种方法虽然发挥了重大作用，但也存在很多缺点。常规抗病育种主要通过杂交和多代自交，抗病材料的选择和田间鉴定过程复杂，周期相对较长，而且易受环境条件影响造成可靠性较差。

利用DNA分子标记进行辅助选择，为育种和品种抗性鉴定提供了新的途径。分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，准确性和可靠性极高。

开发简单有效的分子标记技术鉴定抗性材料和追踪目标抗性基因，在多种作物中都是行之有效的一种方法。与不稳定的RAPD和程序繁琐的AFLP标记相比，简单而特异性强的以PCR为基础的SCAR标记技术在大规模检测方面具有明显优势。与抗性基因紧密连锁的分子标记研究已有大量报道，例如苹果(Xu et al.2007)，辣椒(Arnedo-Andres et al.2002)，以及甜瓜(Takahiro Tezuka et al.2009)等植物中，但与甘蓝枯萎病抗性基因紧密连锁的分子标记目前尚未见报道。在利用分子标记进行甘蓝抗枯萎病鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的分子标记、专用引物及其应用。

本发明提供了一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的试剂，是由序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对。

所述试剂可用于制备辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的试剂盒，包括所述试剂。

所述试剂或所述试剂盒可用于辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝。

本发明还保护一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的方法，包括如下步骤：以待测甘蓝的基因组DNA为模板，用序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对进行PCR扩增；如果没有得到198bp的PCR扩增产物，待测甘蓝具有枯萎病抗性。

本发明还保护一种辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的方法，包括如下步骤：以待测甘蓝的基因组DNA为模板，用序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对进行PCR扩增；如果没有得到198bp的PCR扩增产物，待测甘蓝为候选的具有枯萎病抗性的甘蓝。

所述PCR扩增的反应条件具体可为：预变性94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，38个循环；72℃延伸10min。

所述待测甘蓝具体可为以甘蓝品种夏强(高抗枯萎病的自交系‘R4P1-8024’，韩国兴农种苗株式会社出售的高抗枯萎病甘蓝品种)和甘蓝品种金早生(高感枯萎病的自交系‘R2P2-6A’，中国农业科学院国家蔬菜种质资源中期库，资源编号：V04A0086，来源于中国早熟甘蓝春甘蓝)为亲本得到的子代、甘蓝品种夏强或甘蓝品种金早生。

所述试剂或所述试剂盒可用于甘蓝育种。具体来说，可以将以上所述方法筛选得到的候选的具有枯萎病抗性的甘蓝进行育种。

本发明还保护序列表的序列1所示DNA。

序列表的序列1所示DNA可以作为一种分子标记(S46M48₁₉₈标记)，用于辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝。S46M48₁₉₈标记是目前国内外报道的第一个与甘蓝枯萎病抗性基因连锁的SCAR标记，该标记可以有效地用于甘蓝枯萎病抗性的分子标记辅助鉴定和选择。

利用本发明提供的试剂(引物对)或SCAR标记辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝，与田间鉴定结果抗病吻合率达97％。将本发明的试剂、分子标记或方法用于育种，具有准确、快速、可以实现早期选育等优点，具有重大应用前景。

附图说明

图1为实施例1中获得的AFLP分子标记；1-10为抗病单株，11-20为感病单株。

图2为实施例3中应用SCAR引物进行电泳的电泳图；1-10为抗病单株，11-20为感病单株。

图3为鉴定甘蓝枯萎病抗性的SCAR标记与甘蓝枯萎病抗性基因连锁距离图。

图4为第三种技术方案大规模分子鉴定的电泳图；1-34为部分F2代单株。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

高抗枯萎病的自交系‘R4P1-8024’即来源于韩国兴农种苗株式会社出售的高抗枯萎病甘蓝品种夏强。高感枯萎病的自交系‘R2P2-6A’即来源于中国早熟甘蓝春甘蓝品种金早生(供种单位：中国农业科学院国家蔬菜种质资源中期库，资源编号：V04A0086)。上述两个甘蓝品种均已经广泛被甘蓝育种家使用并可以不受限制地从上述2个单位购买或索取。上述两个甘蓝品种的相关抗病性参数参见文献：康俊根等甘蓝抗枯萎病种质资源的筛选及抗性基因分布频率分析.中国蔬菜，2010，(2)：15-20。

将高抗枯萎病的自交系‘R₄P₁-8024’(父本)和高感枯萎病的自交系‘R2P2-6A’(母本)杂交，得到F1代。将F1代自交得到F2代分离群体(142个F2代单株)。F2代单株分别自交获得F3代家系种子，根据F3代每个家系人工接种鉴定的抗性分离特征，推测相应F2代单株基因型。

人工接种鉴定方法如下：甘蓝枯萎病原镰刀菌株GLHW1(来源于山西省寿阳县田间甘蓝病株，康俊根等甘蓝抗枯萎病种质资源的筛选及抗性基因分布频率分析.中国蔬菜，2010，(2)：15-20)接种于装有液体PDB培养基的培养瓶中，28℃、150rpm的恒温振荡培养箱内暗培养7天，得到菌液；菌液用双层纱布过滤后3000r/min离心10分钟，倒掉上清液，将沉淀的孢子重新用无菌水配成1×10⁶个/ml的孢子悬浮液备用；甘蓝种子经0.5％NaClO消毒1小时后播于10cm×10cm育苗杯中，培养基质为高温灭菌后的蛭石和草炭(1∶2)，每品种播种10株，2次重复，播种后置于抗病温室，保持稳定的苗床温度为28±2℃；在甘蓝3叶1心期采用浸根法接种，甘蓝植株接种后14天进行调查，植株真叶变黄或植株枯萎直至死亡为感病，无症状为抗病(参见田仁鹏等(2009)推荐的方法，相关文献发表在期刊<<中国农学通报>>，2009年第4期39-42页)。

实施例1、与甘蓝抗枯萎病基因紧密连锁的AFLP分子标记的获得

分别随机选择纯合基因型的抗病F2单株(10株)和纯合基因型的感病F2单株(10株)用于2个纯合抗病基因池(R1，R2)和2个纯合感病基因池(S1，S2)的构建。分别等量取5株纯合抗病单株和5株纯合感病单株DNA构建2个平行的BSA(Bulksegregant Analysis)抗感池R1/S1和R2/S2。

AFLP分子标记分析：选用256对AFLP引物组合扩增抗病基因池、感病基因池和父母本。

引物组合：16对EcoRI+ANN(N：A，G，C和T)及16对MseI+ANN引物组合共256对AFLP引物。

预扩增程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共24个循环；72℃10min。预扩增产物用2％琼脂糖电泳检测。

选择性扩增程序：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，共12个循环，每个循环递减0.7℃；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共24个循环；72℃10min。

酶切和连接：内切酶选用EcoR I和Mse I，酶切和连接同步进行。37℃反应过夜，然后70℃水浴15min使酶失活。将连接产物稀释20倍保存备用

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染：6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，电压2000V，功率70W。选择性扩增产物中加入变性上样缓冲液(98％的甲酰胺，10mmol/L的EDTA，0.25％的溴酚蓝，0.25％的二甲苯青)，然后95℃变性6min，电泳2h左右，电泳完毕后进行银染显色。

特异条带的回收克隆测序：切下多态条带，转入装有50μL重蒸水的离心管中，沸水浴10min，然后12000r/min离心10min。取5μL上清液作为模板再次以相应引物组合，相同条件进行扩增。扩增产物使用2％琼脂糖电泳检测分子量并回收，克隆于pEASY-T1载体上，经蓝白斑筛选挑取白斑后摇菌培养，进行菌液PCR检测，由Genewiz进行DNA测序。

得到一条在抗感自交系之间表现稳定的AFLP片段E-ATT/M-CAC₂₁₁。重复一次，结果一致。在构建BSA抗感池的10个抗病单株和10个感病单株中该标记与枯萎病抗性共分离(见图1)。以上利用AFLP标记技术发展出与枯萎病抗性基因紧密连锁的AFLP标记E-ATT/M-CAC₂₁₁，此标记在感病植株中可扩增出稳定条带。

实施例2、与甘蓝抗枯萎病基因紧密连锁的特异检测基因片段的序列获得

从聚丙烯凝胶上回收和纯化2条目的AFLP条带后用pEASY-T1载体进行连接，连接体系：PCR products 4μl，pMD-T voctor 1μl，solution I 5μl，total volume 10μl。将上述试剂冰浴加入0.5离心管中，轻弹混匀，瞬时离心，过夜连接(4℃)。将50μl感受态菌体悬液的离心管从一80℃冰箱中取出，放于冰盒上慢慢解冻，加入全部连接产物约10μl，轻弹管壁混匀，在冰水混合物上放置30min；迅速于42℃水浴中热击90s；迅速置于冰上进行冰浴3-5min，其间不要摇动离心管；加入700μl不含AmP的LB液体培养基，转移至37℃，150r/min摇床上培养1-1.5h；在室温下10000rpm离心1min，弃去上清约700μl，再重悬沉淀。在超净台中每管加入4μl IPTG(200mg/ml的IPTG水溶液)，40μl X-Gal(20mg/μll的X-Gal二甲基甲酰胺溶液)，充分混匀。将混匀后的全部菌液涂布100ug/ml的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜(约10-12h)。取出后放于4℃冰箱正置显色。利用IPTG诱导X-Gal为底物显色反应筛选可能的重组子，进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，放于含有10μlAMP，10ml LB液体培养基的三角瓶中，于37℃，150r/min的摇床中培养8-10h，然后从每个三角瓶中取出1ml放于密封于4℃冰箱中保存，标好标号，用于测序之用。利用原AFLP引物对菌液直接进行PCR扩增比较扩增片段与AFLP常规扩增产物片段大小，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，验证克隆的重组片段E-ATT/M-CAC211的真实性。将检测得的阳性克隆菌液交奥科公司进行克隆片段的DNA序列测定，获得与甘蓝抗枯萎病基因紧密连锁的特异基因片段的序列(见序列表的序列1)。

实施例3、由特异基因片段序列开发鉴定甘蓝枯萎病抗性的SCAR引物

根据测序结果，去除载体及接头序列，利用剩余的序列结合酶切位点设计SCAR引物，按照AFLP引物编号规则，将此新开发的标记命名为S46M48₁₉₈，其中S表示SCAR标记，46表示E46(E-ATT)，48表示M48(M-CAC)，下标198表示该SCAR标记的扩增片段长度，引物序列为：

S46M48₁₉₈-F：5’-ATTGGTGGCCTGCACTTTGAGCATC-3’(序列表的序列2)；

S46M48₁₉₈-R：5’-ACAACAAACTAATCTCAAACATGTC-3’(序列表的序列3)。

利用抗病基因池、感病基因池和父母本DNA以及组成抗感池的各个单株的DNA，利用新合成的S46M48₁₉₈进行扩增，只在感病基因池和母本中扩增出大小为198bp的特异条带，初步验证SCAR标记转化成功。进一步在组成抗感池的各单株中对SCAR标记验证，结果与预期完全相同(图2)，表明AFLP标记E-ATT/M-CAC₂₁₁已被成功转化成SCAR标记。进一步在142个已知基因型的F₂分离群体中，利用Joinmap3.0计算S46M48₁₉₈与枯萎病基因的连锁距离，其遗传距离约为2.87cM(见图3)。SCAR标记为相斥相连锁(repulsion-phase marker)，与感病基因在同一染色体上。S46M48₁₉₈标记是目前国内外报道的第一个与甘蓝枯萎病抗性基因连锁的SCAR标记，该标记可以有效地用于甘蓝枯萎病抗性的分子标记辅助鉴定和选择。

实施例4、应用S46M48₁₉₈-F/R鉴定甘蓝品种或育种材料的枯萎病抗性

将142个F2代单株分别进行如下检测：

1、提取基因组DNA。

2、以基因组DNA为模板(10-30ng)，用S46M48₁₉₈-F和S46M48₁₉₈-R组成的引物对(上下游引物各10-20ng)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应条件：预变性94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共38个循环；72℃延伸10min。

3、将PCR扩增产物用进行2％琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察。

如果没有扩增出198bp的PCR扩增产物，该植株为候选的抗病植株。部分结果见图4。人工接种鉴定为纯合基因型(F3代没有发生抗性分离)的抗病F2单株(28株)中，27株都没有扩增出198bp的PCR扩增产物，只有一株扩增出了198bp的PCR扩增产物。

结果表明，采用S46M48₁₉₈-F和S46M48₁₉₈-R组成的引物对辅助鉴定与田间鉴定结果抗病吻合率达97％。

Claims (11)

1.辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的试剂，是由序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对。

2.权利要求1所述试剂在制备辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的试剂盒中的应用。

3.一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的试剂盒，包括权利要求1所述的试剂。

4.权利要求1所述试剂或权利要求3所述试剂盒在辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝中的应用；所述甘蓝为以甘蓝品种夏强和甘蓝品种金早生为亲本得到的子代、甘蓝品种夏强或甘蓝品种金早生。

5.一种辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性的方法，包括如下步骤：以待测甘蓝的基因组DNA为模板，用序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对进行PCR扩增；如果没有得到198bp的PCR扩增产物，待测甘蓝具有枯萎病抗性；所述待测甘蓝为以甘蓝品种夏强和甘蓝品种金早生为亲本得到的子代、甘蓝品种夏强或甘蓝品种金早生。

6.一种辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝的方法，包括如下步骤：以待测甘蓝的基因组DNA为模板，用序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的特异性引物对进行PCR扩增；如果没有得到198bp的PCR扩增产物，待测甘蓝为候选的具有枯萎病抗性的甘蓝；所述待测甘蓝为以甘蓝品种夏强和甘蓝品种金早生为亲本得到的子代、甘蓝品种夏强或甘蓝品种金早生。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：预变性94℃，5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，38个循环；72℃延伸10min。

8.权利要求1所述试剂或权利要求3所述试剂盒在甘蓝育种中的应用；所述甘蓝为以甘蓝品种夏强和甘蓝品种金早生为亲本得到的子代。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：将权利要求6或权利要求7所述方法筛选得到的候选的具有枯萎病抗性的甘蓝进行育种。

10.序列表的序列1所示DNA。

11.序列表的序列1所示DNA在辅助鉴定甘蓝枯萎病抗性和/或辅助筛选具有枯萎病抗性甘蓝中的应用；所述甘蓝为以甘蓝品种夏强和甘蓝品种金早生为亲本得到的子代、甘蓝品种夏强或甘蓝品种金早生。 

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