KR20110026965A - 리포터로 사용 가능한 베타 클루코시다아제와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도 1의 b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타 글루코시다아제(cpGluT) 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 인디케이터(indicator)로 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 재조합 유전자 클로닝 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의하면 기존에 널리 사용되는 베타-갈라토시다아제 및 이와 유사한 원리를 이용하는 클로닝 시스템보다 낮은 비용으로 정확하게 재조합 균체를 선별할 수 있고, PCR 증폭 산물을 직접 클로닝 할 수 있는 TA 클로닝 시스템으로 변형한 것까지 포함함으로 상업적으로 판매되는 기존 클로닝 벡터내의 인디케이터(indicator)들을 대체할 수 있을 것이다. 또한 동일 조건에서 특성이 다른 여러 종의 기질을 사용할 수 있는 성질에 근거할 때, 항체와 같이 특정 기질을 인식할 수 있는 생물학적 혹은 화학물질과 융합 또는 접합을 통해 western blot, histochemistry 및 각종 진단 키트 등에 이용되는 기존의 리포터 단백질들을 대체 할 수 있을 것이다.

인디케이터, 다중 클로닝, 리포터 단백질, 베타-글루코시다아제, 클로닝벡터

Description

리포터로 사용 가능한 베타 클루코시다아제와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법{β-glucosidase as a reporter for the gene expression and the production method of cloning vectors available as an indicator}

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-글루코시다아제(cpGluT) 유전자에 관한 것으로, 구체적으로 상기 베타-글쿠코시다아제 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 인디케이터(indicator)로서 사용해 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 재조합 유전자의 제조방법 및 특정 기질을 인식하는 단백질 또는 펩타이드와 접합 또는 융합을 통해 다양한 분야에서 활용 가능한 리포터 단백질에 관한 것이다.

생명 현상을 나타내는 원인이 되는 DNA, RNA 와 단백질은 눈으로 볼 수 없으며, 여러 종류의 전자 현미경 등과 같은 고가의 장비의 활용으로도 만족할 만한 관찰이 어렵다. 이러한 상황에서 세포에서 이뤄지는 여러 가지 반응의 유무, 단백질의 발현 및 이동을 보다 쉽게 관찰할 수 있도록 하는 리포터 시스템은 생명 과학 분야에서 필수 불가결한 존재가 되고 있다. 리포터 시스템은 생물 공학 분야의 가 장 기본적인 기술인 클로닝에서부터 세포내에서 일어나는 단백질 간의 복잡한 상호 작용의 관찰까지 광범위하게 활용되고 있다. 이러한 리포터의 중요성을 알 수 있는 대표적인 사례로, 단백질의 상호 작용을 인식하는 Yeast two-hybrid system이나 특정 파장의 빛에 의해 형광을 보이는 GFP (green fluorescent protein) 와 같은 형광 단백질의 발견은 생명 현상을 연구하는 많은 분야에 널리 활용 되고 있다.

이러한 리포터 시스템은 크게 단백질 자체를 관찰하는 것과, 특정 기질 자체 혹은 효소 반응에 의해 분해 혹은 변형되어 나타나는 착색, 발색, 발광을 측정하는 방법으로 구분 할 수 있다. 전자의 대표적인 예는 특별한 보조인자 없이 단백질 자체가 일정한 파장의 빛을 받아 보다 낮은 에너지를 갖는 파장의 빛을 내는 형광 단백질로, 해파리(jellyfish)인 Aequorea victoria 로부터 유래한 녹색형광단백질(GFP), Discocosoma genus로부터 유래한 DsRed(Discosoma red fluorescent protein)단백질 및 이들을 방향적 분자 진화법(directed molecular evolution)으로 개량한 후 Fluorescence resonance energy transfer (FRET) 기술에 접목하여 이용하는 다양한 리포터시스템이 존재한다. 이들은 프로모터, 전자조절인자 등의 downstream 에 형광 단백질을 coding 하는 유전자를 삽입하여 조절 인자들이 작동하는 시점 또는 조건 등을 관찰하거나, 목적하는 단백질과 융합해 세포내의 이동 경로, 발현 위치, 발현량 및 특정 물질과의 상호작용 등의 관찰에 주로 이용되고 있다. 그러나 단백질이 형광을 발하기 위한 구조가 형성되는데 비교적 많은 시간이 필요하며, 형광을 관찰하기 위해 자외선을 조사하여야 하는 단점이 존재한다.

후자의 경우는 ¹²⁵I 또는 ³²P 등의 동위원소를 이용하여 관찰하는 방법을 제외하고 대부분의 경우 기질을 전환시키기 위해 생촉매인 효소를 주로 이용하고 있으며, western b등의t, ELISA (enzyme linked im5Inosorbent assay)와 같은 im5Inob, 조직화학 (histochemistry), 단백질의 농도 측정 등 많은 분야에 적용되고 있다. 생촉매인 효소를 이용하는 방법으로는 효소 반응에 발생하는 화학에너지를 빛에너지로 전환되는 발광(luminescence)을 측정하는 방법, 효소반응으로 기질로부터 유리된 umbellifenyl 혹은 이rophenyl 등의 잔기로부터 발생하는 형광 및 발색을 관찰하는 방법이 있다. 상기 im5중, 동위 원소를 이용하는 방법은 높은 감도로 측정할 수 있는 반면에 높은 비용과 결과를 얻기까지 소요되는 시간 및 인체의 잠재적 위험성과 발색, 발광 및 형광 기질을 이용한 리포팅 방법의 감도가 높아짐의 따라 점차로 이 범위가 축소되고 있다.

효소반응에 의한 기질의 전환으로 나타나는 현상 중 화학 에너지가 빛 에너지로 전환되어 발광하는 현상을 루미네센스 (luminescence)라 하며, 이러한 성질을 이용하는 리포팅(reporting) 기술은 크게 생물로부터 유래한 효소의 고유 기질을 사용하는 생물발광(bioluminescence)과 인위적인 기질을 이용하는 화학발광(chemiluminescence)으로 구분되며, in-vivo 조건에서는 주로 luciferase를 이용한 생물 발광이 선호되고 있다. Luciferase는 ATP를 이용해 luciferin 으로부터 생성된 lucifenyl adenylate 가 산화되면서 빛을 발생하게 된다. 이러한 반응이 생명 유지에 중요한 ATP를 기질로 사용한다는 점과 세포에 해롭지 않은 생체 유래 기질 인 luciferin을 사용하기 때문에 세포 내의 전사 및 세포의 활성 정도를 측정하는 등의 세포 내 관찰에 주로 이용되고 있다.

이외에 기질과 효소를 이용하는 리포팅 시스템은 조직화학 분야에서 이용되는 것을 제외하면, 대부분 in-vitro assay 에 주로 이용되고 있다. 대표적인 예로는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase) 등의 효소와 기질로서 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin), 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디옥시제닌(dioxigenin) 등의 화합물이 이용되고 있다.

단백질만으로 형광을 발하는 형광단백질과 달리 기질과 이들의 반응을 위한 효소를 이용하는 경우 기질의 안정성, 효소 활성과 안정성 및 기질 특이성 등의 특성이 민감도에 큰 영향을 미친다. 먼저 기질에 대해 살펴보면, 생물 발광에 이용되는 luciferin의 경우 luciferase 외에 다른 인자들에 의해 반응이 일어날 수 있으며, 다양한 단백질의 형광 기질로 활용되고 있는 umbellifenyl 잔기를 갖는 물질은 가격이 높을 뿐만아니라, 안정성이 낮아 특정한 효소 및 인자 없이 분해되어 형광을 내는 문제가 있어 실험 오차의 주요한 원인이 된다. 형광특성을 갖는 umbellifenyl 외에도 발색 반응을 나타내는 nitrophenyl 잔기를 갖는 합성 기질이 널리 사용되고 있으나, 기질의 분해 정도를 탐색하기 위한 발색을 위해 또 다른 시약을 이용해야 하는 번거로움이 존재한다. 광범위한 분야에서 활용되고 있는 이러한 기질들이 지닌 문제점들은 실험의 민감도를 낮추는 원인이 된다. 뿐만 아니라 기질의 높은 가격 및 luciferin이외의 대부분의 기질이 화학 합성으로 생산됨으로 부산물에 의한 잔류 독성을 지니고 있어 살아있는 세포에 적용하기에 부적합하다. 기질 자체의 문제뿐만 아니라 반응의 주체인 대부분의 효소들이 진핵 생물로부터 유래된 것으로 대량 생산이 어렵다. 또한 융합 단백질의 형태로 생산하기 어려운 특성으로 인해 가격이 높고, 단백질 생산·접합 후 촉매 역할을 수행하는 리포터의 3차 혹은 4차 구조에 미치는 영향의 예측 및 조절이 어려워 동일한 기질에 대한 민감도의 차이를 유발할 가능성이 높은 문제점을 지니고 있다.

앞서 살펴본 것과 같이 현재 이용되는 리포터들은 단백질 또는 생촉매인 효소, 기질들이 갖는 특성으로 인해 나타나는 단점들로 인하여 이용 범위가 제한받기 때문에 새로운 리포터나 탐침시스템의 개발이 계속되고 있다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타 글루코시다아제(cpGluT) 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 또한 다중 클로닝 위치내의 서열을 변형해 PCR 산물을 직접 클로닝할 수 있는 TA 클로닝 시스템을 포함한다.

본 발명은 인디케이터(indicator)로서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 재조합 유전자의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 리포터(reporter)로서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 세포 내 외에서 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 시료 내 특정한 물질의 존재 유무를 판단하는 센서 또는 진단 키트로의 적용에 관한 것이다.

본 발명의 일면은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타 글루코시다아제(cpGluT) 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명은 기존에 널리 활용되는 인디케이터(indicator)인 베타 갈락토시다아제보다 낮은 비용으로 짧은 배양시간을 통해 빠르고 정확하게 재조합 균체의 선별을 가 능하게 할 것이며, PCR 증폭 산물을 직접 클로닝할 수 있는 TA 클로닝 벡터와의 접목을 통해 상업적으로 판매되는 기존의 클로닝 벡터내의 인디케이터(indicator)들을 대체 할 수 있다.

또한 분석 및 단백질 탐색 등을 위한 융합 리포터(fusion reporter)로서의 활용은 본 발명의 구조물이 생물공학, 생명과학 분야에서 기존의 다양한 리포터들(reporter) 보다 폭 넓게 활용할 수 있다.

따라서 생명과학과 공학의 근간이 되는 재조합유전자 조작기술 및 목적 단백질 혹은 탐색, 선별을 포함하는 광범위한 분야에 본 발명의 구조물을 적용함으로써 보다 높은 선별도 및 효율성을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 대상인 베타 글루코시다아제는 체계적인 선별 방법을 이용한 선별을 통해 Shinorhizobium meliloti 로부터 분리한 것으로, 약 52 kDa의 단량체이며, 발색기질인 X-gal, 형광기질인 MUG (4-Methylumbelliferyl-beta-D-glucuronic acid)에 대해 높은 활성을 보일 뿐만 아니라, 본 발명의 베타-글루코시다아제의 경우 유사한 family내의 다른 효소들이 분해하지 못하는 친환경적인 착색기질, 즉 indican 에 대해서도 활성을 지님을 확인하였다.

기질의 일종인 X-gal은 유전자 클로닝 유무를 판단하기 위한 인디케이터로 널리 사용되는 베타-갈락토시다아제의 발색 기질로 이용된다. 베타-갈락토시다아제의 경우 네 개의 단량체가 4차 구조를 형성하여 활성을 갖는 효소로서, 유전자 내 부에 인위적으로 삽입한 다중 클로닝 위치(Multiple cloning sites; MCS)에 외래 유전자의 삽입으로 4차 구조 형성이 저해되어 활성이 사라지는 insertional inactivation 현상을 이용해 리포터로 이용한다. 따라서 삽입된 유전자가 4차구조 형성을 완전하게 저해하지 못하는 경우 유전자가 삽입되었음에도 불구하고 파란색을 보이는 false positive 클론이 나타날 수 있다. 또한 효소의 활성이 낮아 발현 유도제 (IPTG, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 이용한 과발현의 유도 없이는 X-gal의 분해로 나타나는 색이 불분명해(도 4a, b 참조) 유전자가 삽입된 클론과의 구분이 어려울 수 있다.

본 발명의 베타 글루코시다아제는 이와 달리 단량체로, 발현 유도제 없이 X-gal을 분해하여 진한 파란색 콜로니를 형성한다. 따라서 베타-갈락토시다아제를 인디케이터로 활용하는 경우에 비해 짧은 시간의 배양으로 형질 전환체를 선별할 수 있을 것으로 예상하였다.

먼저 다중 클로닝 위치의 삽입 위치를 결정하기 위해 베타 글루코시다아제의 아미노산서열을 다양한 2차 구조 예측프로그램을 활용한 조합접근(combinatorial approach)법으로 다중 클로닝 위치의 삽입 부위를 분석하였을 때, 서열 번호 2의 307번 Ala부터 336번의 Tyr의 사이에 긴 gap이 예측되었다. 그러나 서열 번호 2의 307의 상단과 336번 하단에 인접해 beta-sheet와 alpha-helix의 2 차구조가 함께 예측되었다. 따라서 다중 클로닝 위치의 삽입에 의한 상, 하단의 2차 구조에 미치는 영향을 최소화하기 위해 예측된 각 아미노산 잔기로부터 다소 떨어진 313과 327까지의 영역을 다중 클로닝 위치 삽입을 위한 위치로 선정하였다.

다중 클로닝 위치의 삽입은 아미노산 서열 313번과 314번 사이에 삽입하는 방법(cpGlu)과, 314번부터 326번 사이를 다중 클로닝 위치와 치환(cpGluT)하는 두 가지 방법을 시도하였다. 결과적으로 후자의 방법으로 다중 클로닝 위치를 삽입한 변이 효소가 야생형에 근접한 활성을 갖는 것을 확인하였으며, 다중 클로닝 위치를 삽입해도 활성이 유지되는 재조합 구조물(cpGluT)을 얻은 후, 이를 pTrc99A 플라스미드에 삽입하여 E. coli XL1-Blue에 도입한 형질전환 세균 E.coli XL1-Blue[cpGluT]를 대전광역시 유성구 어은동 52번지 생명공학연구원 유전자자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 2009년 4월 24일자로 수탁하여 수탁번호 KCTC 11500BP 를 부여받았다.

상기 제작된 구조물(cpGluT)을 사용하는 벡터와 전형적인 인디케이터(indicator)로 활용되는 GFP와 베타-갈락토시다아제 및 최근 보고된 에스터라아제를 활용하는 클로닝 시스템과 선별능을 비교하여 우수성을 확인하였다.

또 다른 용도의 벡터 시스템으로 PCR을 통해 증폭된 유전자를 제한효소 처리나 정제과정 없이 직접 벡터에 도입할 수 있는 TA 벡터 시스템이 존재하며, 이 시스템을 본 발명에서 제작한 구조물로 구현하기 위해 cpGluT에 삽입된 다중 클로닝 위치를 TA 클로닝 과정에 이용할 수 있는 새로운 T-벡터용 염기서열(서열번호 11)로 이루어진 다중 클로닝 위치로 치환하여 TA 클로닝 시스템을 완성하였으며, 앞서의 결과와 유사한 높은 선별도를 얻을 수 있었다.

또한 베타 글루코시다아제가 모노머(monomer)인 GFP (green fluorescent protein), aminoglycoside adenyltransferase, chloramphenicol acetyltransferase 뿐만 아니라 테트라머(tetramer)로 기능을 하는 FmRed와 융합시킨 경우에도 활성이 유지되는 특성과, 유전자 내부를 절단 및 삽입하는 방법으로 변형된 효소의 제작이 용이한 점, 기존의 리포터(reporter)들과 달리 원핵생물에서 과생산이 가능한 점, 여러 특성을 갖는 기질을 동시에 적용할 수 있어 특정 단백질과의 융합 후 리포팅이 용이한 점, luciferin 과 같은 생물유래의 무독성 친환경 기질(indican)을 이용할 수 있다는 점 등의 장점을 갖는다. 베타-글루코시다아제의 이러한 특징을 근거로 할 때, 기존에 활용되고 있는 리포터들 보다 낮은 가격, 높은 선별도, 민감도를 얻을 수 있어 보다 광범위한 분야에 활용 될 수 있을 것으로 예상된다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[실시예 1] 인디케이터 제작을 위한 베타 글루코시다아제 내부에 다중 클로닝 위치 (Multiple cloning sites, MCS) 삽입

베타 글루코시다아제 유전자 내부에 다중 클로닝 위치를 삽입하기 위해, 본 발명의 대상인 베타 글루코시다아제의 아미노산 서열을 NCBI의 BlastP에 적용하여 GenBank로부터 관련된 단백질 서열정보들을 수집하였다. 수집된 아미노산서열 중 동종으로부터 유래한 파랄로그(paralogue)에 해당하는 서열들을 제외한 후, 최종적으로 101개의 서열을 추출하였다. 이 후에 웹 기반의 복합 정렬 프로그램(multiple alignment program)인 MATFF, T-coffee, ClustaW, MUSCLE에 적용하여, 각각의 프로그램으로 추출한 서열들을 정렬(alignment)한 후 나타난 결과를 JNet 이차구조예측 프로그램을 사용해 특성을 분석하였다 (도 2). 위의 과정에서 아미노산 서열 303과 337 부위에서 2차 구조가 예측되지 않은 긴 갭(gap)이 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 303의 상단과 337 하단에서 beta-sheet와 alpha-helix가 예측되어, 이 들과 인접한 부분을 활용할 때 베타 글루코시다아제의 구조에 영향이 있을 것으로 예상되었다. 따라서 다중 클로닝 위치의 삽입에 의한 이차 구조의 변화를 최소화하기 위해 예측된 갭에서 범위를 좁혀 313 부터 327 사이에 다중 클로닝 위치의 삽입을 고려하였다.

다중 클로닝 위치의 삽입은 예측된 갭내의 보존성이 가장 낮은 313과 314번에 삽입하는 방법(도 3A)과 갭의 길이가 길며, 비 보존적인 점을 근거로 314번부터 326번 사이의 아미노산을 제거 후 삽입하는 두 가지 방법(도 3B)으로 시도하였다. 먼저 다중 클로닝 위치를 삽입 전에 인위적인 염기서열 혹은 아미노산 서열의 삽입 혹은 제거에 상관없이 베타 글루코시다아제의 활성이 유지 되는지 여부와 다중 클로닝 위치의 삽입을 용이하게 할 목적으로 제한 효소인 NheI 이 인식하며 Ala-Ser 로 번역되는 6개 염기서열(GCTAGC)을 예측된 위치에 도입하였다. Ala 과 Ser 아미노산은 곁사슬이 비교적 작으며, 전하를 띄지 않아 베타 글루코시다아제 구조에 적은 영향을 줄 것이라 예상되었다. NheI 인식서열을 313과 314번에 삽입하기 위해 1번부터 313 번과 314번부터 474번까지의 두 개의 단편과, NheI 인식서열과 314번과 326번 아미노산의 제거를 동시에 수행하기 327번부터 474번의 단편을 다음의 합성 프라이머로 PCR을 수행해 획득하였다.: (1) 베타 글루코시다아제 증폭용 프라이머, 정방향(서열번호 3: 5′-ATCCATGGTGATCGAAGCCAAGA-3′)와 역방향 프라이머(서열번호 4: 5′-ATAAGCTTTCATCCCGGCTTGT-3′); (2) 313과 314번 사이에 NheI 인식 부위를 삽입하기 위한 프라이머, 정방향(서열번호 5: 5′-ATAGCTAGCGGCGCCTTTCGCG GGG-3′)와 역방향 (서열번호 6: 5′-ATAGCTAGCGAATATCCGGCGACCGTCAATG-3′); (3) 327번부터 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머, 역방향 (서열번호 7: 5′-ATAGCTAGC GTGAAGACCGATATTGGCTGGG-3′).

PCR 기법으로 획득한 각각의 두 개의 DNA 단편의 접합(ligation)을 통해 앞서 예측한 위치에 두 개의 아미노산을 암호화하는 NheI 인식서열을 삽입하였다(도 3). 결과적으로 313번과 314번 아미노산 사이에 삽입한 경우(cpGlu)에는 발색기질인 X-gal(bromo-chloro-indolyl- galactopyranoside)에 대해 야생형과 유사한 활성이 관찰되었으나, 314번부터 326번 아미노산을 제거한 후 삽입한 변이효소(cpGlu-1)는 야생형에 비하여 다소 낮은 활성을 갖는 것이 확인되었다 (도 4a). 제안한 두 가지 방법을 이용하여 예측한 위치에 두 개의 아미노산을 삽입한 후에도 활성이 나타나는 것을 바탕으로, 제작된 변이 효소 cpGlu 과 cpGlu-1 의 NheI 인식서열에 다중 클로닝 위치의 삽입을 시도하였다. 베타 글루코시다아제에 삽입할 합성 다중클로닝 위치(서열번호 8)는 상업적으로 판매되는 클로닝 벡터들의 인디케이터로 이용되는 베타 갈락토시다아제의 다중 클로닝위치와 같이 여러 종의 제한효소가 인식할 수 있는 인식서열 외에도, T7과 T3 프로모터가 첨가되도록 설계하였다.

합성 다중 클로닝 위치(MCS)(서열번호 8)

5'GCTAGCCAATTAACCCTCACTAAAGGGATCCCGGGAATTCTAGAGCTCGAGCTGCAGACTAGTCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCTAGC3'

3'CGATCGGTTAATTGGGAGTGATTTCCCTAGGGCCCTTAAGATCTCGAGCT CGACGTCTGATCAGGGATATCACTCAGCATAATACGATCG 5'

설계한 합성 다중 클로닝 위치(multi cloning site)는 내부를 절단하는 제한효소로 처리하는 경우, 생성된 말단의 형태가 점착성(sticky) 이거나 비점착성(blunt)인 NheI, BamHI, XamI, SmaI, EcoRI, XbaI, XhoI, SacI, PstI 및 SpeI 인식서열을 포함하고 있으며, 5' 부분에 T3 프로모터 (서열 번호 9; CAATTAACCCTC ACTAAAGGG) 와 3' 부분에 T7 프로모터(서열 번호 10; GGATATCACTCAGCATAATAC)를 포함한다. 또한, 다중 클로닝 위치가 삽입되는 위치 상단과 하단 부분 또는 제거된 314과 326번 부분의 아미노산 특성(주로, 소수성)과 유사하도록 제작하였다. 다중 클로닝 위치를 두 개의 아미노산이 삽입된 변이 효소 cpGlu 와 cpGlu-1에 도입한 후 각각의 활성을 측정하였을 때 313과 314번에 삽입된 변이효소(cpGluM)는 활성이 사라졌으나, 314번부터 226번 아미노산을 제거 후 삽입한 변이효소의 경우(cpGluT) 는 야생형과 유사한 활성으로 복구 되는 것이 관찰되었다(도 4b). 다중 클로닝 위치 삽입 후 활성이 관찰되는 구조물(cpGluT)를 인디케이터(indicator)로 사용할 후보로 선정하고 염기 서열을 분석하였다. 분석결과 본래의 염기서열이 보존된 형태로 인위적으로 삽입한 다중 클로닝 위치가 정확한 위치에 존재하고 있음이 확인할 수 있었다(도 5).

[실시예 2] 다중 클로닝 위치(multi cloning site,MCS)가 장착된 베타 글루코시다아제의 인디케이터(indicator) 로서의 성능평가

염기서열 분석으로 다중 클로닝 위치의 정확한 삽입이 확인(도 5)된 cpGluT 를 NcoI 과 HindⅢ 로 절단한 후 같은 제한효소로 절단한 pTrc99A에 도입하여 도 6의 클로닝 벡터(pTrc99A[cpGluT])를 완성하였다. 현재 인디케이터로 주로 사용되는 GFPuv를 pTrc99A로 서브 클로닝한 pTGFPuv와 베타-갈락토시다아제를 인디케이터로 지닌 pBluscriptII-SK 및 본 실험실에서 제작한 에스터라아제를 인디케이터로 사용하는 pTcp216M-MCS를 대조군으로 외래유전자의 도입에 의한 인디케이터의 불활성화현상을 이용한 선별능을 비교하였다. 선별능의 비교를 위해 메타게놈 유전체를 4bp cutter인 Sau3AI으로 부분 절단한 유전자 단편을 BamHI으로 절단한 각각의 벡터에 도입한 후 37℃에서 14시간 동안 배양하였다. 인디케이터(Indicator)로서 녹색형광단백질(GFP)과 베타-갈락토시다아제 및 베타 글루코시다아제의 선별능은 14시간 배양한 후 UV hand lamp 및 육안으로 콜로니를 관찰하였을 때 형광을 나타내지 않거나 무색을 띄는 클론을 선별한 후 18시간 후에 형광을 갖거나 파란색으로 변한 클 론(false positive)의 비율 측정 또는 플라스미드를 분리해 검증하였다. 에스테라아제 cp216M-MCS 의 선별능은 16시간 배양 후 α-naphtylacetate 와 Fast Blue RR을 이용해 활성을 측정한 후, 갈색으로 변화하지 않는 콜로니를 선별하여 플라스미드를 분리하거나 콜로니 PCR 을 통해 외래유전자가 삽입된 비율로 결정하였다.

각각의 클로닝벡터를 지닌 재조합균주를 14시간 배양한 시점에서 선별능을 비교하였을 때 발현유도제(IPTG)를 이용하지 않은 베타 갈락토시다아제를 제외한 모든 경우에서 재조합 균체를 선별할 수 있었으며, cpGluT를 인디케이터로 이용한 벡터(pTrc99A[cpGluT])의 선별능이 일반적으로 이용되는 인디케이터 및 본 실험실에서 제작한 클로닝 벡터에 비해 유사하거나 다소 높은 선별도를 보이는 것이 확인되었다 (도 7).

[실시예 3] 베타 글루코시다아제 유전자를 이용한 TA-클로닝벡터 시스템 제작

TA 클로닝 벡터의 제작을 위해 고안된 다중 클로닝 위치는 3’말단에 기존의 TA 시스템과 동일한 말단구조를 갖도록 XcmI 제한효소가 인식하는 특이서열 두 개를 삽입하였다. XcmI은 5’말단의 CCA와 3’말단의 TGG 사이에 9개의 무작위서열을 포함하여 총 15개의 염기 서열을 인식한 후 상위가닥의 8번째, 하위가닥의 7번째 인산에스테르결합을 절단한다. 절단부위 내부에 무작위 서열조합이 가능한 특성을 이용해 절단 부위에 티아민(thiamine) 및 아데닌(adenine)이 위치하도록 배열함으로써 기존의 TA 클로닝 벡터와 동일한 말단을 갖도록 할 수 있다. 따라서 절단위치에 BamHI과 NsiI 인식서열을 삽입하여 말단이 티아민(thiamine)이 되도록 하였으 며, 절단효율을 높이기 위해 두 개의 XcmI 인식서열 사이에 ApaI 인식서열을 삽입한 T-vector용 다중 클로닝 위치(MCS)를 설계하였다. 이는 cpGluT의 다중 클로닝 위치에서 T3 와 T7 프로모터는 유지하며, 여러 종의 제한효소가 인식하는 영역만이 치환된 형태이다.

T-vector용 다중 클로닝 위치(MCS)(서열번호 11)

5’GCTAGCCAATTAACCCTCACTAAAGGGCCAGGGATCCGTTGGGCCCCAATGCATCAGTGG AGTCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCTAGC 3’

3’CGATCGGTTAATTGGGAGTGATTTCCCGGTCCCTAGGCAACCCGGGGTTACGTAGTCACCTCAGGGATATCACTCAGCATAATACGATCG 5’

제작된 T-벡터용 다중 클로닝 위치(MCS)는 cpGlu-1를 NheI으로 절단하여 기 삽입된 다중 클로닝 위치를 제거한 후 전형적인 클로닝 방법을 사용해 TA-cloning vector를 위한 다중 클로닝 위치로 치환하였다. 이때 앞서 사용한 pTrc99A 플라스미드에 XcmI 인식서열이 존재해 T-벡터 시스템을 구축하는 목적에는 적합지 않아 XcmI 인식서열이 없는 pQE30 플라스미드를 기본벡터로 이용하였다. 제작된 구조물을 pQE30으로 옮기기 위해 SacI과 HindIII 인식서열을 갖는 베타 글루코시다아제의 정방향 프라이머 (서열 번호 12; 5′-ATGAGCTCTGATCGAAGCCAAGA-3′)와 역방향 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 PCR을 수행한 후 서브 클로닝해 pQE30-cpGluTV를 얻었다. 제작된 플라스미드를 XcmI으로 절단하여 PCR로 증폭된 유전자를 클로닝하였 을 때 외래 유전자의 삽입이 용이하며 활성이 사라짐을 확인 할 수 있었다 (도 8).

[실시예 4] 리포터(reporter)로서 베타 글루코시다아제 유전자의 활용

베타 글루코시다아제의 민감성과 높은 활성, 다양한 성질을 갖는 기질에 대해 높은 활성을 갖는 점과 유전자 조작을 통한 단백질의 개량에 용이함 등은 인디케이터(indicator)로서의 기능뿐만 아니라 생명공학의 여러 분야에 적용 가능한 범용의 리포터로 적합할 것이라 예상하였다. 범용 리포터로서의 활용을 위해 기본적으로 요구되는 특징인 fusion ability 를 확인하기 위해 모노머(monomer)인 GFP, aminoglycoside adenyltransferase (Kanamycin 저항성 유전자가 암호화하는 단백질) 및 chloramphenicol acetyltransferase (chloramphenicol 저항성 유전자가 암호화하는 단백질)와 테트라머(tetramer)로 활성을 갖는 FmRed (DsRed의 maturation 위한 시간을 감소시킨 변이소시)를 융합하였다. 베타-글루코시다아제 유전자의 3‘ 말단과 위의 각 유전자의 5’말단에 NotI 인식서열을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭한 후 전형적인 유전자조작 과정을 통해 단백질을 융합하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이 단량체(monomer) 또는 다량체 (multimer, 본 실험에서는 tetramer를 갖는 FmRed)의 융합 후에도, 베타-글루코시다아제에 융합된 단백질이 kanamycin 및 chloramphenicol 이 포함된 LB 배지에서의 성장하며 345 nm의 UV를 조사하였을 때 형광을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 베타-글루코시다아제 역시 X-gal, MUG 4-Methylumbelliferyl-beta-D-glucuronic acid) 및 indican 3종의 기질에 대한 활성이 유지되는 것이 확인되었다(도 9).

추가적으로, LB 고체 배지에서 4종의 단백질이 C-말단에 융합된 후 베타-글루코시다아제의 기질 선호도가 변화되는 것이 관찰 되었으며, 도 9c 에서 보듯이 융합 단백질의 전체 발현량 및 가용성 단백질의 양에 큰 차이가 없음에도 불구하고 Native PAGE 상에서 MUG를 기질로 이용하여 Zymogram을 수행한 결과, 각 융합 단백질 내에서 베타-글루코시다아제의 활성에 차이가 나타나는 것을 확인할 수 있다 (도 9b). 이는 리포터 단백질 탐색을 위해 한 종의 기질을 활용하는 현행 시스템에서 종종 관찰되는 문제점을 간접적으로 보여주는 결과이다. 즉, 리포터 단백질이 목적하는 단백질과의 융합 후 활성변화 가능성이 높으며, 이 경우 기질 농도 조절 등의 탐색 조건의 최적화가 요구되어지며, 극단적인 경우 리포터 단백질의 낮아진 활성으로 인하여 탐색이 불가능 할 수도 있다. 따라서 착색, 발색 및 형광의 각기 다른 구조와 성질을 갖는 기질에 대한 활성이 있고, 동일한 용매에 세 개의 기질을 동시에 녹여 사용할 수 있는 특징에 근거할 때, 베타-글루코시다아제가 기존에 활용되는 여러 리포터들 보다 넓은 범위에서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

[실시예 5] 리포터로서 효율적인 활용을 위한 베타 글루코시아제의 down sizing

베타 글루코시다아제는 SDS-PAGE 및 superose^TM High performance column 12 10/300GL 을 이용한 gel filtration을 통해 52 kDa 의 모노머(monomer)로 활성을 갖는 것이 확인되었다. 이 크기는 40 kDa 이하 혹은 내외의 크기를 갖는 일반적인 리포터(reporter)들과 비교하였을 때 다소 크며, 여러 영역으로 구성된 융합 단백 질의 형태로 발현을 유도하는 경우 불리할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 야생형의 베타-글루코시다아제 크기의 줄이는 시도를 하였다.

베타-글루코시다아제 크기를 줄이기 위해, 내부에 다중 클로닝 위치를 삽입한 변이 효소 중 13개의 아미노산 (아미노산 314번부터 326번)이 제거된 CpGlu-1을 이용하였다. 변이 효소 cpGlu-1로부터 베타-글루코시다아제의 내부에서 추가적인 아미노산을 제거하기 위해 앞서 활용한 복합 정렬 프로그램의 결과로부터 비 보존영역을 검색하였다. 검색 결과 베타-글루코시다아제의 N-과 C-말단부위의 넓은 범위에서 아미노산의 비 보존성이 확인되었으며, 이를 근거로 N-말단의 비 보존영역의 일부 아미노산을 제거하기 위한 프라이머 (서열 번호 13; 5′-AACATATGACCGAGAA CGCCGAAAAGTTTGTCTTCGGCGTTGCAACC-3′)와 베타 글루코시다아제 역방향 프라이머(서열번호 6)로 PCR을 수행해 N-말단의 7개의 아미노산이 제거된 변이효소 N7RcpGlu-1를 얻었다. 이렇게 N-말단의 아미노산이 제거된 N7RcpGlu-1역시 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 이 결과로부터 N-말단 및 C-말단으로부터 더 많은 수의 아미노산을 제거 할 수 있을 것이라 예상하고, 정방향 프라이머 (서열 번호 14 ;5′-CAGATCGAGGGAGCCACCATGGCGGATG-3′)와 역방향 프라이머 (서열 번호 15 ; 5′-CCCGGCTTGTGTCTAGAGCTTGGAAACCG-3′)를 이용해 최종적으로 N-말단으로부터 32개를 C-말단으로부터 6개를 제거하였다.

야생형의 베타-글로코시다아제의 N-(31개)과 C-(4개)말단, ORF 내부(11개)로부터 총 48개의 아미노산을 제거한 TcpGluT(Truncated cpGluT)를 pTrc99A에 클로닝 하여, 75 ug/ml Ampicillin 포함한 LB agar에 50 ul 2 % X-gal을 도말한 조건에서 배양해 보았으나 활성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이 TcpGluT의 사라진 활성을 회복시키기 위하여 기존에 알려진 PCR을 이용한 전형적인 단백질공학 기법 이용해 TcpGluT 유전자에 무작위 돌연변이를 유발하였다. 돌연변이가 유도된 유전자를 pTrc99A 플라시미드에 삽입하고 대장균(XL1-Blue)에 형질전환한 후 LB(Luria Broth) 고체배지에 도말하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하는 방법으로 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. X-gal 분해로 다양한 진하기의 푸른색을 띄는 콜로니를 선별하여, 다시 무작위 돌연변이를 유발하는 과정을 반복하여 최종적으로 야생형에 유사한 활성을 가지며, 약 5 KDa 크기가 작아진 TcpGluT을 획득하였다.

[실시예 6] 항체와 같이 특정 물질과 결합할 수 있는 능력을 지닌 단백질 또는 펩타이드와 융합한 베타 글루코시다아제의 활용

Western blot, 단백질 간의 상호작용, 조직 및 환경 내 존재하는 오염 물질의 탐색 등의 면역학, 생화학, 의학 및 환경 분야에서 목적하는 물질의 존재 유무를 판단하기 위해 많은 수의 리포터 단백질이 활용되고 있다. 이러한 탐침자는 대부분의 경우 특정 물질과 상호작용하는 부분과 활성을 확인할 수 있는 리포터로 구성되며, 이러한 구성을 갖는 탐침자들 중 많은 수가 항체와 효소의 융합단백질이다.

현재의 대다수의 탐침자의 제조는 항체 와 효소를 독립적으로 생산한 후 화학적인 접합을 통해 이뤄지고 있으며, 효소의 생산을 위하여 진핵 세포를 숙주로 이용하기 때문에 고가로 판매되고 있다. 또한 화학적 방법의 접합으로 인한 비 특 이적 접합 또는 접합 후 효소의 기질 특이성 및 활성의 불균일성이 나타나기 쉽다. 그러나 베타-글루코시다아제의 경우 대표적인 원핵세포인 대장균에서 발현이 비교적 쉬우며, 앞서의 실험결과에서 볼 수 있듯이 여러 특징을 갖는 기질을 활용할 수 있어 활성의 불균일로 인하여 발생하는 문제들을 피할 수 있을 것이라 생각하였다.

이러한 탐침자의 제작 가능성을 확인하기 위해 도 10과 같이 전형적인 western blot에 활용할 수 있는 탐침자를 생산하고자 하였다. 이를 위해 야생형의 베타-글루코시다아제 또는 크기를 줄인 돌연변이 효소의 N- 과 C-말단에 항체를 코딩하는 유전자를 접합하여 효소와 항체가 융합된 형태로 생산되게 설계하였다.

일반적으로 적용되는 항체는 light chain과 heavy chain이 이황화 결합으로 연결된 큰 단백질로 mulitdomain 을 갖는 단백질의 생산능력이 낮으며, 환원력을 갖는 대장균의 세포질 내에서 정확한 구조를 형성하기 어렵다. 따라서 본 발명에서는 이러한 문제들을 피하기 위해 항체가 항원을 인식할 때 불필요한 Fc region이 축소되거나 제거된 형태의 크기가 작은 minibody 혹은, 항원을 인식하는 최소 부분으로 구성된 scFV (Single chain Fv)의 활용을 계획하였다.

많은 수의 항체 서열들 중 널리 알려져 있어 시작품으로 활용하기 적합한 FLAG 또는 Myc tag을 인식하는 항체의 서열을 NCBI로부터 획득하여 야생형 베타 글루코시다아제 또는 TcpGluT의 N- 또는 C- 말단에 융합되어 발현 될 수 있도록 linker와 함께 클로닝 하였다. 제작한 베타 글루코시다아제와 항체 융합 단백질의 두 영역이 정확한 활성을 갖는지 확인하기 위한 항원으로, GFP (grenn fluorescent protein)에 FLAG 또는 Myc tag이 융합된 단백질을 제작하여 대장균에서 발현을 유 도하였다. 베타 글루코시다아제에 항체가 융합된 단백질과 GFP-Myc 또는 GFP-FLAG이 발현된 대장균을 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄한 후 13200 rpm, 4 ℃에서 30 분간 원심 분리하여 불용성 단백질을 제거하였다. 이후에 태그된 단백질 (GFP-Myc 와 GFP-FLAG)을 SDS-PAGE를 이용하여 전개한 후 western blotting의 전형적인 방법에 이용하기 위해 nitrocellulose membrane 으로 단백질을 이동시켰다. 단백질의 이동이 완료된 후 nitrocellulose membrane을 sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 두 번 세척하고 1% BSA를 첨가해 비특이적인 결합의 감소 혹은 방지를 유도하였다. 이후에 탐침자로서 베타 글루코시다아제와 항체가 융합된 단백질이 포함된 세포 파쇄액을 첨가해 항체와 FLAG 또는 myc tag 과의 결합을 유도하였다. FLAG 또는 Myc tag된 단백질과 결합한 글루코시다아제-항체 융합단백질을 확인하기 위해 indican, X-gal 과 MUG를 개별적으로 혹은 혼합한 용액에 nitrocelluose membrane 을 넣고 발색, 착색 또는 형광이 발하는 것을 관찰함으로서 제안된 탐침자가 예상한 것과 같은 기능을 지는 것을 확인하였다.

뿐만 아니라, 베타-글루코시다아제 내부를 제거 후에도 활성이 나타나는 점은 융합 단백질 제작을 위하여 사용하는 end-to-end 융합 외에 insertional fusion이 용이 할 수 있음을 예측 할 수 있다 (도 11). 후자의 융합 방법의 경우 전자의 end-to-end 융합에 비하여 융합된 두 개의 단백질이 더 민감하게 상호작용을 할 수 있다. 따라서 scFv 또는 최근에 제안되고 있는 engineered protein scaffold와 같은 크기가 작으며 특정 물질을 인식 가능한 영역을 insertional fusion 방법을 이용하여 융합 단백질을 제작한다면, GFP의 circular permissive site에 calmodulin을 insertional fusion 방법으로 제작한 융합 단백질을 Ca²⁺ 농도 탐침자로 활용한 예와 같이 민감도가 높은 센서 시스템으로도 활용할 수 있을 것이다.

[실시예 7] 세포 내 유전자 발현 및 발현양의 확인을 위한 탐침자로서 베타-글루코시다아제

현재까지 여러 종류의 리포터 단백질이 특정 분야에서 제한적으로 활용되고 있지만, 세포 내 특정 유전자의 발현 정도, 혹은 발현 시점들의 확인을 위한 리포터는 극히 적은 것으로 알려져 있다. 그 원인은 먼저 탐침자로서 활용되는 효소의 기질이 세포에 해로운 경우가 많으며, 특히 탐침자로 활용되는 효소 외에도 세포 유래의 효소가 기질을 분해하기 때문이다. 따라서 세포 내에서 활용되는 리포터 단백질은 앞서 언급한 것과 같이 탐색을 위해 기질이 요구되지 않고 자체적으로 형광을 나타내는 형광 단백질 혹은 그들의 변이 효소들과 세포에 무해하며 세포 유래의 다른 효소작용에 의해 분해되지 않는 기질을 이용하는 luciferase 정도가 주로 활용되고 있는 실정이다. 그러나 이들은 앞서 언급한 것과 같은 형광을 발생하기 위해서 일정 시간이 요구되는 점과 자외선의 조사, 기질의 낮은 안전성은 실험 결과의 오차를 유발하는 원인이 되고 있다.

본 발명의 베타-글루코시다아제의 경우 세포에 무해하며 매우 안정한 indican 을 기질로 활용 가능 할뿐만 아니라, indican 은 매우 많은 대립형질의 베타-글루코시다아제들이 분해하지 못하는 물질임이 선별과정 중에 확인되었다. 또한 indican 은 베타-글루코시다아제에 의해 분해되어 안정하며 세포 독성이 없으며 물에 녹지 않는 지용성 물질인 indigo blue 를 생성하기 때문에, 세포에 해로운 UV 조사없이 관찰 가능하며, 비교적 긴 기간 동안의 반응을 관찰 할 수 있다. 따라서 세포 내에서 특정 프로모터의 작동 유무 및 특정 단백질의 발현 유무를 판단하기 위하여 형광 단백질 및 luciferase를 활용하는 전형적인 방법들을 모태로 도 12와 같은 구조로 베타-글루코시다아제를 삽입하여 transduction 한 후, indican이 첨가된 배지를 활용하는 것으로도 맨눈으로 발현 유무를 확인 할 수 있을 것이다. 발현 정도의 측정은 세포 배양액으로부터 indigo blue 를 회수하여 spectrophotometer 또는 HPLC(High pressure liquid chromatograph)등으로 정량할 수도 있다. 뿐만 아니라 현재 활용되는 대다수의 리포터 단백질이 동일 계열 효소의 탐색에 적합하지 못하나, 본 제안서의 베타-글루코시다아제의 경우는 글루코시다아제-글루코시다아제 융합에서도 융합파트너와는 반응하지 않는 기질 (indican) 의 활용이 가능해, 기존의 리포터 단백질들보다 넓은 범위의 단백질과의 융합이 가능한 것으로 확인되었다.

도 1은 다중 클로닝 위치(multiple cloning sites)가 삽입된 베타-글루코시다아제의 (a)염기(서열번호 1)와 (b)아미노산(서열번호 2) 서열을 나타낸 것이다.

도 2은 단백질 복합정렬 프로그램으로 blastp로부터 추출한 여러 종의 베타-글루코시다아제를 정렬한 결과이다.

도 3은 베타-글루코시다아제에 NheI 인식서열의 삽입을 위하여 사용한 방법의 두 가지 방법에 대한 모식도이다.

도 4는 베타-글루코시다아제에 NheI 인식서열(a) 및 다중 클로닝 위치 삽입(b) 후 활성을 관찰한 그림이다.

도 5는 다중 클로닝 위치가 삽입된 베타-글루코시다아제의 염기서열 분석 결과이다.

도 6은 다중 클로닝 위치가 삽입된 베타-글루코시다아제를 클로닝 인디케이터로 활용한 벡터의 모식도이다.

도 7은 cpGluT를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터와 다른 인디케이터들을 이용하는 클로닝 벡터의 선별도를 비교한 그림이다.

도 8은 cpGlT의 다중 클로닝 위치를 TA-클로닝을 위한 것으로 치환 후 삽입 불활성화를 관찰한 그림이다. 그림에서 흰색 콜로니가 클로닝된 경우이다.

도 9는 베타-글루코시다아제의 X-gal, MUG 및 indican의 3종류의 기질에 대한 활성과 융합 파트너로서의 가능성 (a) LB 고체 배지에서의 각 기질에 대한 활성 (b) MUG를 기질로 Zymogram 수행 결과 (c) 대장균에서의 발현 양상을 나타내는 그 림이다.

도 10은 베타-글루코시다아제를 리포터로 활용하는 방법들 중 Western blot에서 이용하는 것을 나타내는 그림이다.

도 11은 베타-글루코시다아제를 융합 파트너로 활용하는 방법을 나타내는 그림이다.

도 12는 베타-글루코시다아제를 유전자 발현 및 단백질 발현을 위해 활용하는 방법에 대한 모식도 이다.

Claims (17)

1. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타 글루코시다아제(cpGluT) 유전자.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타 글루코시다아제(cpGluT) 유전자.
3. 베타 글루코시다아제 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드.
4. 제3항에 있어서, 베타 글루코시다아제 유전자가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
5. 제4항에 있어서, 베타 글루코시다아제 유전자가 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
6. 제4항에 있어서, 서열번호 2의 314 번과 326번 아미노산 사이가 제거된 재조합 폴리뉴클레오티드.
7. 제4항에 있어서, 서열번호 2의 1번부터 31번과 454 번부터 458번의 아미노산이 제거된 재조합 폴리뉴클레오티드
8. 제3항에 있어서, 다중 클로닝 위치가 TA 클로닝(TA cloning)이 가능한 염기서열을 갖는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
9. 제7항에 있어서, 다중 클로닝 위치가 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
11. 제10항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터인 재조합 벡터.
12. 제10항에 있어서, 상기 벡터는 TA 클로닝(TA cloning) 벡터인 재조합 벡터.
13. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 미생물.
14. 제13항에 있어서, 수탁번호 KCTC 11500BP로 기탁된 형질전환 미생물.
15. 제 3항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 리포터(reporter) 로서 포함하는 융합 단백질
16. 인디케이터(indicator)로서 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는, 재조합 유전자의 제조방법.
17. 리포터(reporter) 로서 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 화합물, 단백질, 유전자를 분석하기 위하여 사용하는 방법

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