EA039761B1 - In vitro и клеточные анализы измерения активности ботулинических нейротоксинов - Google Patents

In vitro и клеточные анализы измерения активности ботулинических нейротоксинов Download PDF

Info

Publication number
EA039761B1
EA039761B1 EA201990929A EA201990929A EA039761B1 EA 039761 B1 EA039761 B1 EA 039761B1 EA 201990929 A EA201990929 A EA 201990929A EA 201990929 A EA201990929 A EA 201990929A EA 039761 B1 EA039761 B1 EA 039761B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bont
luciferase
cleavage site
linker
single chain
Prior art date
Application number
EA201990929A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201990929A1 (ru
Inventor
Минь Дун
Фэйфань Юй
Original Assignee
Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж filed Critical Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж
Publication of EA201990929A1 publication Critical patent/EA201990929A1/ru
Publication of EA039761B1 publication Critical patent/EA039761B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

В документе раскрыты средства обнаружения и определения характеристик нейротоксинов, таких как ботулинический нейротоксин (BoNT) или столбнячный нейротоксин. В документе предложены способы определения силы и активности нейротоксинов in vitro и in vivo. Также раскрыты полипептиды, содержащие N- и C-концевые фрагменты репортерного белка, разделенные линкером, содержащим участок расщепления нейротоксином. Расщепление линкера нейротоксином снижает активность репортерного белка, тем самым указывая на активность нейротоксина. Также раскрыты композиции и наборы, содержащие раскрытые полипептиды, нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие такие полипептиды, и клетки, экспрессирующие такие полипептиды.

Description

документ посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая спецификация ссылается на перечень последовательностей (представлен в электронном виде как файл в формате.txt под названием 0342941 0630 SL.TXT). Файл в формате.txt был создан 13 октября 2017 г. и имеет размер 34305 байт. Полное содержание перечня последовательностей включено в настоящее описание посредством ссылки.
Область техники
Описанная в настоящем документе технология относится к способам и композициям, предназначенным для определения активности нейротоксинов, например ботулинического токсина.
Уровень техники
Ботулинический нейротоксин (BoNT) представляет интерес как с точки зрения проблем использования для биотерроризма, так и с точки зрения терапевтического применения. Традиционно обнаружение и определение характеристик BoNT выполняли путем введения образцов мышам, причем введение значительных доз вызывало гибель животных. Были изучены анализы, которые можно выполнять в клетках или in vitro, но их проблемой является недостаток чувствительности или специфичности, что часто приводит к положительным сигналам в результате реакций с типичными компонентами клинических образцов.
Сущность изобретения
В настоящем документе описаны новые анализы, разработанные для обнаружения и измерения активности BoNT, как in vitro, так и in vivo. В анализах используются уникальные одноцепочечные полипептиды, которые характеризуются, например, наличием сплит-люциферазы, связанной через субстраты BoNT, сконструированные для того, чтобы служить в качестве датчика активности BoNT. В присутствии BoNT линкерная область расщепляется токсином, что приводит к снижению люциферазной активности, и это снижение легко обнаруживается.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий от N-конца к C-концу a) N-концевой фрагмент репортерного белка; b) линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином; и c) С-концевой фрагмент репортерного белка; причем N-концевой и С-концевой фрагменты вместе содержат функциональную последовательность репортерного белка; и при этом линкер функционально соединяет N-концевой фрагмент и C-концевой фрагмент с образованием функционального репортерного гибридного белка. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов репортерный белок представляет собой белок люциферазы.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) N-концевой домен, содержащий последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (Nnano1_159); b) линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином, расположенный на C-конце Nnano1_159; и c) C-концевой домен, имеющий последовательность по меньшей мере с 90% идентичности последовательности с аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160_170), расположенный на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) N-концевой домен, содержащий последовательность, имеющую замены, делеции или вставки менее 10 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano160_170); b) линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином, расположенный на C-конце N-nano160_170; и c) С-концевой домен, имеющий последовательность с заменами, делециями или вставками менее 3 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160_170), расположенный на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов N-концевой домен имеет последовательность аминокислот 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159), а C-концевой домен имеет последовательность аминокислот 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160_170). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления нейротоксином представляет собой участок расщепления нейротоксином C. botulinum (BoNT) и/или столбнячным нейротоксином.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит один или более спейсеров, расположенных между участком расщепления BoNT и N-концевым фрагментом или доменом, между участком расщепления нейротоксином и C-концевым фрагментом или доменом или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит связывающий фрагмент рецептора для BoNT и/или столбнячного нейротоксина. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов связывающий фрагмент расположен между N-концевым фрагментом или
- 1 039761 доменом и участком расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит спейсер, расположенный между связывающим фрагментом и участком расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов по меньшей мере один спейсер состоит из глицина и серина. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов по меньшей мере один спейсер состоит из 5-15 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов по меньшей мере один спейсер выбран из SEQ ID NO: 4-9.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов BoNT представляет собой тип A, E, C, B, D, F или G. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT происходит из белка SNARE. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов белок SNARE представляет собой белок SNAP-25, синаптобревин (VAMP) или синтаксин. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT представляет собой аминокислоты 141-206 белка SNAP-25b человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT представляет собой аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов рецептор представляет собой SV2C человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов связывающий фрагмент представляет собой аминокислоты 529-566 SV2C человека или последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотами 529-566 SV2C человека, или последовательность, имеющую замены, делеции или вставки не более чем 10 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотами 529-566 SV2C человека.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов полипептид дополнительно содержит полигистидиновую аффинную метку. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов полигистидиновая аффинная метка расположена на C-конце полипептида.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит интактный второй люциферазный полипептид, расположенный между N-концевым фрагментом или доменом и участком расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов второй люциферазный полипептид представляет собой люциферазу светлячка (например, Photinus pyralis), бактериальную люциферазу (например, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi), люциферазу полипов Renilla (Renilla reniformis), люциферазу динофлагеллятов, люциферазу Gaussia или люциферазу копеподов. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит спейсер, расположенный между вторым люциферазным полипептидом и участком расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов спейсер состоит из 5-15 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов спейсер представляет собой GSSGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 4), GSSGGGGSGGGSSG (SEQ ID NO: 5) или GGGGS (SEQ ID NO: 6).
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1-159); b) линкер, расположенный на C-конце N-nano1_159, содержащий: i) первый спейсер из 5-15 аминокислот; ii) связывающий фрагмент, состоящий из аминокислот 529-566 SV2C, расположенный на C-конце первого спейсера; iii) второй спейсер, расположенный на C-конце связывающего фрагмента; iv) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 141-206 белка SNAP25b человека, расположенный на C-конце второго спейсера; v) третий спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160_170), расположенные на Cконце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1-159); b) линкер, расположенный на C-конце N-nano1_159, содержащий: i) первый спейсер из 5-15 аминокислот; ii) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 141-206 белка SNAP25b человека, расположенный на Cконце первого спейсера; iii) второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160-170), расположенные на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159); b) линкер, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159, содержащий: i) первый спейсер из 5-15 аминокислот; ii) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека, расположенный на С-конце первого спейсера; iii) второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (Cnano160-170), расположенные на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1-159 и C-nano160-170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1-159); b) линкер, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159, содержащий: i) второй функциональный люциферазный полипептид; ii) первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце
- 2 039761 второго люциферазного полипептида; iii) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 1 -206 белка SNAP25b человека, расположенный на C-конце первого спейсера; iv) второй спейсер из 5-15 аминокислот, на C-конце участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы с SEQ ID NO:
(C-nano160_170), расположенные на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет
N-nano1.159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов один или более спейсеров представляют собой GSSGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 4), GSSGGGGSGGGSSG (SEQ ID NO: 5) или GGGGS (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов полипептид дополнительно содержит последовательность His6 (SEQ ID NO: 12), расположенную на C-конце.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описана нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан вектор из нуклеиновых кислот, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов вектор представляет собой вектор экспрессии и содержит последовательность нуклеиновой кислоты в экспрессируемой форме. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов вектор выбран из группы, состоящей из вирусного вектора экспрессии, прокариотического вектора экспрессии, дрожжевого вектора экспрессии, вектора экспрессии насекомых или вектора экспрессии млекопитающих.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описана клетка, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор из предыдущего абзаца. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов клетка экспрессирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов клетка представляет собой прокариотическую клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого или клетку животного.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности ботулинического нейротоксина, включающий: приведение в контакт нейротоксина с одноцепочечным полипептидом, описанным в настоящем документе, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и определение люциферазной активности полипептида по сравнению с эталоном, определяя таким образом активность.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина C. botulinum (BoNT) в образце, включающий: приведение в контакт образца с одноцепочечным полипептидом, описанным в настоящем документе, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и определение люциферазной активности полипептида по сравнению с люциферазной активностью полипептида при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности указывает на активность BoNT в образце.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов способ выполняют in vitro. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов контактирование происходит в буфере, состоящем из 50 мМ HEPES, 20 мкМ ZnCl2, 2 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов концентрация одноцепочечного полипептида, контактирующего с образцом, составляет от приблизительно 30 до 300 нМ. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов концентрация одноцепочечного полипептида, контактирующего с образцом, составляет приблизительно 30 нМ.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов люциферазную активность определяют посредством добавления субстрата люциферазы к одноцепочечному полипептиду и количественного измерения полученного люминесцентного сигнала. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов условия включают инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от приблизительно 1 до приблизительно 36 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов условия включают инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от приблизительно 1 до приблизительно 24 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов условия включают инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от приблизительно 4 до приблизительно 24 ч.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер содержит первый спейсер из 5-15 аминокислот, связывающий фрагмент из аминокислот 529-566 SV2C человека, расположенный на Cконце первого спейсера и на N-конце участка расщепления BoNT, и второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит аминокислоты 141-206 белка SNAP25 человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер содержит первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на N-конце участка расщепления BoNT, и второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит аминокислоты 141-206 белка SNAP25 человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер содержит первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на N-конце участка расщепления BoNT, и второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит амино- 3 039761 кислоты 35-96 белка VAMP1 человека.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов одноцепочечный полипептид экспрессируется нервной клеткой, и способ после стадии контактирования дополнительно включает: инкубацию нервных клеток в течение периода времени от приблизительно 12 до приблизительно 60 ч, и сбор лизата из нервных клеток.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина C. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с нервной клеткой, которая экспрессирует одноцепочечный полипептид, содержащий аминокислоты 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159), аминокислоты 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160.17o), разделенные и функционально соединенные линкером, содержащим участок расщепления BoNT, расположенный на C-конце N-nano1_159 и на N-конце C-nano160-170; b) инкубацию нервных клеток в течение периода времени от приблизительно 12 до приблизительно 60 ч; с) сбор лизата из нервных клеток; и d) измерение люциферазной активности в лизате по сравнению с люциферазной активностью в обработанных аналогичным образом нервных клетках при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности указывает на активность BoNT в образце.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит интактный второй люциферазный полипептид, расположенный между N-nano1_159 и участком расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов второй люциферазный полипептид представляет собой люциферазу светлячка (Photinus pyralis), бактериальную люциферазу (Vibrio fischiri, Vibrio harveyi), люциферазу полипов Renilla (Renilla reniformis), люциферазу динофлагеллятов, люциферазу Gaussia или люциферазу копеподов. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов определяют люциферазную активность второго люциферазного полипептида в образце и используют в качестве индикатора присутствия общего одноцепочечного полипептида в собранном лизате. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов нервные клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид из вирусного вектора экспрессии. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов одноцепочечный полипептид экспрессируется за 6 дней до стадии a). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов вирусная система экспрессии представляет собой систему экспрессии лентивируса.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов стадия инкубации длится приблизительно 48 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, стадия сбора осуществляется путем добавления буфера для лизиса.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT получен из белка SNAP-25, синаптобревина (VAMP) или синтаксина. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT специфически распознается посредством BoNT A, E и C или специфически распознается посредством BoNT В, D, F и G. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов используют комбинацию одноцепочечных полипептидов, имеющих различные участки расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT состоит из а/к 141-206 белка SNAP-25 человека или а/к 35-96 белка VAMP1 человека, а/к 1-206 белка SNAP35 человека или а/к 1-96 белка VAMP1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер дополнительно содержит связывающий фрагмент рецептора BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов рецептор представляет собой SV2C. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов связывающий фрагмент содержит аминокислоты 529-566 SV2C человека.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов линкер содержит второй люциферазный полипептид, первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце второго люциферазного полипептида и на N-конце участка расщепления BoNT, второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный на C-конце участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит аминокислоты 1-206 белка SNAP25 человека и расположен в направлении C-конца относительно первого спейсера.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов измерение люциферазной активности осуществляют путем добавления субстрата, специфичного для люциферазы, и количественного определения получаемого люминесцентного сигнала. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов субстрат для люциферазы с SEQ ID NO: 1 представляет собой фуримазин (2-фуранилметил-дезоксикоэлентеразин).
В одном аспекте в настоящем документе описан набор, содержащий: a) один или более одноцепочечных полипептидов, описанных в настоящем документе, причем каждый одноцепочечный полипептид или комбинация одноцепочечных полипептидов упакованы в отдельный контейнер; b) одну или более нуклеиновых кислот или векторов из нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, причем каждая нуклеиновая кислота или комбинация нуклеиновых кислот или векторов из нуклеиновых кислот упакованы в отдельный контейнер; и/или c) одну или более клеток, описанных в настоящем документе, причем каждая клетка или комбинация клеток упакованы в отдельный контейнер. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов набор дополнительно содержит субстрат люциферазы, упакованный в отдельный контейнер.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 изображен схематический рисунок датчиков токсинов на основе сплит-люциферазы. Ле- 4 039761 вая панель: люцифераза NANOLUC™ разделена на два комплементарных фрагмента: N-nano и C-nano.
Эти два фрагмента соединяются друг с другом посредством линкера на основе субстратов токсинов (SNAP-25 (также известный, как р25) или VAMP1/2/3 (например, синаптобревины)). Правая панель:
расщепление линкерной области посредством BoNT разделяет две части люциферазы NANOLUC™ и устраняет люминесцентные сигналы.
На фиг. 2A-2B продемонстрирован анализ обнаружения BoNT/A in vitro. Были разработаны и исследованы два сенсорных белка для обнаружения токсина BoNT/A. Один представляет собой NNanoSV2C-L4-p25-CNano, а другой - NNano-p25-CNano. Их готовили в концентрации 30 нМ в объеме 30 мкл, в то время как BoNT/A разводили с 1 нМ до 1 фМ с коэффициентом 10. Отрицательным контролем служил BoNT/B, добавленный в раствор сенсорного белка. Кривую (фиг. 2A) строили на основе процента люминесценции люциферазы NANOLUC™. Значение EC50 используемого NNano-SV2C-p25-CNano для BoNT/A составило 9,73 пМ через 4 ч и 7,86 пМ через 24 ч, в то время как значение EC50 используемого NNano-p25CNano составило 48,26 пМ через 4 ч и 35,87 пМ через 24 ч при температуре 37°С. Сенсорный белок, содержащий SV2C-L4, являющийся связывающим доменом BoNT/A, продемонстрировал приблизительно 5-кратное увеличение значения EC50 (фиг. 2В).
На фиг. 3A-3B продемонстрирован анализ обнаружения BoNT/B in vitro через 4 и 24 ч. Сенсорный белок NNano-VAMP1-CNano готовили в концентрации 30 нМ в объеме 30 мкл, в то время как BoNT/B разводили с 10 нМ до 1 фМ с коэффициентом 10. Отрицательным контролем служил BoNT/A, добавленный в раствор сенсорного белка. Кривую (фиг. 3A) строили на основе процента люминесценции люциферазы NANOLUC™. Значение EC50 для BoNT/B составило 75,7 пМ через 4 ч и 3,9 пМ через 24 ч при температуре 37°С (фиг. 3B).
На фиг. 4 продемонстрирован анализ обнаружения BoNT/A in vivo с использованием нервных клеток, инфицированных вирусом. Для каждого образца лизата нервных клеток измеряли сигналы как люциферазы светлячка, так и люциферазы NANOLUC™, и рассчитывали соотношение (люцифераза NANOLUC™/светлячка). Затем получали процентное соотношение для каждого образца с использованием в качестве эталонного контроля отсутствие воздействия токсинов. Значение EC50=2,9 пМ приравнивается к 30-кратному значению LD50 через 48 ч воздействия токсинными белками.
Подробное описание изобретения
В настоящем документе описаны композиции и способы, относящиеся к измерению и/или обнаружению ферментативной активности. В частности, композиции и способы относятся к обнаружению и/или измерению нейротоксинов, например нейротоксина C. botulinum (BoNT).
В контексте настоящего документа нейротоксин C. botulinum или BoNT относится к любому полипептиду, который может осуществлять общий клеточный механизм, посредством которого токсин C. botulinum проникает в нейрон и ингибирует высвобождение нейротрансмиттера, и охватывает связывание токсина C. botulinum с рецепторным комплексом с низкой или высокой аффинностью, интернализацию токсина, транслокацию легкой цепи токсина в цитоплазму и ферментативную модификацию субстрата токсина С. botulinum.
Штаммы Clostridium botulinum продуцируют семь антигенно различающихся типов ботулинических токсинов (BoNT), которые были идентифицированы путем изучения вспышек ботулизма у людей (BoNT/A, /B, /E и /F), животных (BoNT/C1 и /D) или были выделены из почвы (BoNT/G). Хотя все семь серотипов BoNT имеют сходную структуру и фармакологические свойства, каждый из них также проявляет гетерогенные бактериологические характеристики. Генетическое разнообразие штаммов C. botulinum подробно описано в публикации Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 3, p. 818-832 (2007)), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, тип BoNT относится к штамму A, E, C, B, D, F или G. В данной области техники также известны различные не встречающиеся в природе нейротоксины C. botulinum, описанные, например, в международных патентных публикациях WO 95/32738, WO 96/33273, WO 98/07864 и WO 99/17806, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки.
Токсины из различных штаммов C. botulinum имеют одинаковую организацию функциональных доменов и общую структурную конструкцию. Каждый из токсинов C. botulinum транслируется в виде одноцепочечного полипептида с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, который впоследствии расщепляется путем протеолитического расщепления в пределах дисульфидной петли с помощью встречающихся в природе протеаз, таких как, например, эндогенная протеаза токсина C. botulinum или встречающихся в природе протеаз, продуцируемых в окружающей среде. Эта посттрансляционная обработка приводит к образованию двухцепочечной молекулы, содержащей легкую цепь (LC) с молекулярной массой приблизительно 50 кДа и тяжелую цепь (HC) с молекулярной массой приблизительно 100 кДа, удерживаемые вместе с помощью одной дисульфидной связи и нековалентных взаимодействий. Каждая зрелая двухцепочечная молекула содержит три функционально различных домена: 1) протеолитический домен, расположенный в LC, который включает в себя область металлопротеазы, содержащую цинкзависимую эндопептидазную активность, которая специфически нацелена на основные компоненты ап- 5 039761 парата высвобождения нейротрансмиттера; 2) домен транслокации, содержащийся в аминоконцевой половине HC (HN), который способствует высвобождению LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени; и 3) домен связывания, находящийся в карбоксиконцевой половине HC, который определяет активность связывания и специфичность связывания токсина с рецепторным комплексом, расположенным на поверхности клетки-мишени.
Все характеристики: связывание, транслокация и протеазная активность этих трех функциональных доменов необходимы для токсичности. Общий механизм клеточной интоксикации, посредством которого токсины C. botulinum проникают в нейрон и ингибируют высвобождение нейротрансмиттера, одинаковы, независимо от серотипа или подтипа. Не ограничиваясь теорией, механизм интоксикации включает по меньшей мере четыре стадии: 1) связывание с рецептором, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи и 4) модификация мишени протеазой. Процесс начинается, когда домен HC токсина C. botulinum связывается с токсин-специфическим рецептором, расположенным на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Считается, что специфичность связывания рецепторного комплекса частично достигается за счет специфических комбинаций ганглиозидов и белковых рецепторов. После связывания комплексы токсин/рецептор интернализуются посредством эндоцитоза, а интернализованные везикулы сортируются по специфическим внутриклеточным путям.
Стадия транслокации запускается подкислением компартмента везикулы. После транслокации эндопептидаза легкой цепи токсина высвобождается из внутриклеточной везикулы в цитозоль, где оказывает специфическое целевое воздействие на один из трех белков, известных как основные компоненты аппарата высвобождения нейротрансмиттера (мембранный белок, ассоциированный с везикулами (VAMP)/синаптобревин, белок, ассоциированный с синаптосомами с молекулярной массой 25 кДа (SNAP-25) и синтаксин).
Эти основные компоненты необходимы для стыковки и слияния синаптических везикул на нервном окончании и являются членами семейства растворимого N-этилмалеимид-чувствительного фактора, обеспечивающего прикрепление к белковым рецепторам (SNARE). BoNT/A и BoNT/E расщепляют белок SNAP-25 в карбоксиконцевой области, высвобождая сегмент из девяти или двадцати шести аминокислот, соответственно, a BoNT/C1 также расщепляет белок SNAP-25 возле карбоксиконца. Ботулинические серотипы BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G и токсин столбняка действуют на консервативную центральную часть белка VAMP и высвобождают аминоконцевую часть VAMP в цитозоль. BoNT/C1 расщепляет синтаксин на одном участке вблизи поверхности цитозольной плазматической мембраны. Селективный протеолиз синаптических белков SNARE вносит вклад в блокирование высвобождения нейротрансмиттера, вызываемое токсинами C. botulinum in vivo. Мишени токсинов С. Botulinum - белки SNARE - являются общими для экзоцитоза во множестве типов клеток, не относящихся к нервным клеткам; в этих клетках, так же как и в нервных клетках, активность пептидазы легкой цепи ингибирует экзоцитоз, см., например, публикацию Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).
В настоящем документе описаны одноцепочечные полипептиды, в которых последовательность репортерного белка разделена или прервана линкерным сегментом. Разделенный репортерный белок является функциональным.
В контексте настоящего документа термин одноцепочечный в отношении полипептида относится к одной молекуле полипептида, содержащей ряд аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями между α-амино- и карбоксигруппами соседних остатков. То есть каждый указанный элемент одноцепочечного полипептида связан с другим(и) элементом(ами) посредством пептидной связи. Это является полной противоположностью многоцепочечных полипептидов, содержащих множество одноцепочечных полипептидов, которые могут связываться друг с другом, например, посредством водородных или дисульфидных связей с образованием полипептидного комплекса.
Одноцепочечные полипептиды, описанные в настоящем документе, могут содержать люциферазу и/или ее участки, например, репортерный белок может представлять собой люциферазу. В контексте настоящего документа термин люцифераза относится к ферменту, который катализирует биолюминесцентную реакцию, например, катализируя окисление люциферина, излучая свет и высвобождая оксилюциферин. Люцифераза может быть природной или сконструированной. В контексте настоящего документа термин функциональная люцифераза представляет собой люциферазу, которая способна катализировать реакцию в присутствии подходящего субстрата. Доступны многочисленные разновидности и варианты реализации люциферазы, включая, например, люциферазу светлячка (Photinus pyralis) (см., например, SEQ ID NO: 13), бактериальную люциферазу (Vibrio fischeri, Vibrio harveyi), люциферазу полипов Renilla (Renilla reniformis), люциферазу динофлагеллятов, люциферазу Cypridina, люциферазу Coieoptera, люциферазу Gaussia (см., например, публикацию Heise, K., et al., Dual luciferase assay for secreted luciferase based on Gaussia and NANOLUC Assay Drug Dev. Technol. (2013); полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки), люциферазу копеподов (см., например,
- 6 039761 публикацию Takenaka, Y., et al., Computational analysis and functional expression of ancestral copepod luciferase Gene (2013); полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки) и люциферазу NANOLUC™.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, люцифераза может представлять собой люциферазу NANOLUC™. В контексте настоящего документа люцифераза NANOLUC относится к люциферазе с молекулярной массой 19,1 кДа, полученной из люциферазы Oplophorus gracilirostris, которая может использовать в качестве субстрата фуримазин или коэлентеразин и имеет последовательность SEQ ID NO: 1. В любом из аспектов и вариантов реализации способов и композиций настоящего изобретения могут также использоваться варианты люциферазы NANOLUC™, и они описаны, например, в патенте США № 8557970; полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий в направлении от N-конца к C-концу N-концевой фрагмент репортерного белка; линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином, и C-концевой фрагмент репортерного белка. В контексте настоящего документа термин фрагмент относится к части или участку молекулы, например к части или участку полипептида. В одноцепочечных полипептидах, описанных в настоящем документе, N-концевой фрагмент и C-концевые фрагменты репортерного белка вместе содержат функциональную последовательность репортерного белка, но при этом по отдельности не содержат функциональную последовательность репортерного белка. При наличии в одном и том же одноцепочечном полипептиде, например, функционально соединенном линкерной последовательностью, N-концевой и Cконцевой фрагменты репортерного белка образуют функциональный репортерный гибридный белок. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов репортерный белок представляет собой белок люциферазы. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов фрагменты могут представлять собой варианты или производные встречающихся в природе последовательностей, последовательности репортерного белка, описанные в настоящем документе, и/или последовательности репортерного белка, известные в данной области техники, например, они могут иметь по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью репортерного белка или иметь замены, делеции или вставки не более 10 аминокислотных остатков по сравнению с последовательностью репортерного белка.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий N-концевой домен, который содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159); линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином, расположенный на Cконце N-nano1_159; и C-концевой домен, имеющий последовательность по меньшей мере с 90% идентичности последовательности с аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160_170), расположенный на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов домен или фрагмент репортерного белка может иметь по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с последовательностью репортерного белка, например с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159) или аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (Cnano160-170). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов вариант аминокислот может представлять собой варианты с консервативной заменой.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: N-концевой домен, содержащий последовательность, имеющую замены, делеции или вставки менее 10 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159); линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином, расположенный на C-конце N-nano1_159; и C-концевой домен, имеющий последовательность с заменами, делециями или вставками менее 3 аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160-170), расположенный на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1.159 и C-nano160-170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов домен или фрагмент репортерного белка может представлять собой последовательность, имеющую 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее или 1 делецию, вставку или замену по сравнению с последовательностью репортерного белка, например с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nano1_159) или аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano160_170). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов замещенные аминокислоты могут представлять собой варианты с консервативной заменой. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159); b) линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином, расположенный на C-конце N-nano1.159; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170), расположенные на C-конце линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159
- 7 039761 и C-nano16o-17o с образованием функционального люциферазного гибридного белка.
Как показано в настоящем документе, белок люциферазы может быть прерван линкерной последовательностью, обеспечивая при этом функциональную люциферазу. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, предоставлен линкер между остатками, соответствующими остаткам 159 и 160 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер предоставлен между остатками 159 и 160 SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе, может содержать N-концевой домен, содержащий последовательность, соответствующую остаткам 1-159 SEQ ID NO: 1, и C-концевой домен, содержащий последовательность, соответствующую остаткам 160-170 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе, может содержать N-концевой домен, состоящий, по существу, из последовательности, соответствующей остаткам 1-159 SEQ ID NO: 1, и C-концевой домен, состоящий, по существу, из последовательности, соответствующей остаткам 160-170 SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе, может содержать N-концевой домен, содержащий остатки 1-159 SEQ ID NO: 1, и C-концевой домен, содержащий остатки 160-170 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе, может содержать N-концевой домен, состоящий, по существу, из остатков 1-159 SEQ ID NO: 1, и C-концевой домен, состоящий, по существу, из остатков 160-170 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе, может содержать N-концевой домен, состоящий из остатков 1-159 SEQ ID NO: 1, и C-концевой домен, состоящий из остатков 160-170 SEQ ID NO: 1.
В одноцепочечных полипептидах, описанных в настоящем документе, линкерный домен находится между N-концевым и С-концевым доменами. В контексте настоящего документа термин линкер относится к последовательности, экзогенной для репортерного белка (например, фермента люциферазы), которая сконструирована так, чтобы функционально соединять N-концевой и C-концевой домены репортерного белка. Линкер может содержать, например, один или более участков расщепления, один или более спейсеров, один или более связывающих фрагментов и один или более дополнительных ферментовлюцифераз.
В контексте настоящего документа термин функционально соединяет относится к соединению двух фрагментов репортерного белка, например люциферазы, таким образом, что промежуточная последовательность не препятствует образованию этими двумя фрагментами активной и функциональной третичной структуры. Два фрагмента, которые функционально соединены, будут проявлять активность, которая характеризует белок в отсутствие линкерной последовательности.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать один или более участков расщепления, например аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется под действием одного или более ферментов. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, участок расщепления может представлять собой участок расщепления нейротоксином. Соответственно, участок расщепления нейротоксином содержит последовательность, которая специфически расщепляется по меньшей мере одним нейротоксином. Нейротоксины представляют собой соединения, которые ингибируют функцию нервной ткани и/или уничтожают нервную ткань. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нейротоксин может быть ингибитором высвобождения синаптических везикул. Не имеющие ограничительного характера примеры участков расщепления нейротоксином могут включать участок расщепления нейротоксином C. botulinum (BoNT) и/или столбнячным нейротоксином. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать множество участков расщепления нейротоксином, например, он может расщепляться множеством нейротоксинов, что позволяет обнаруживать и/или измерять множество нейротоксинов.
BoNT действует посредством расщепления белков SNARE. Соответственно, участок расщепления BoNT может происходить из белка SNARE. В контексте настоящего документа термин белок SNARE относится к суперсемейству белков, которые опосредуют слияние везикул, включая слияние синаптических везикул пресинаптической мембраны в нейронах. В качестве не имеющих ограничительного характера примеров белок SNARE включает белок SNAP-25 (например, идентификационный номер гена в базе данных NCBI: 6616, см. также эталонную последовательность NCBI: NP_570824.1 для SNAP25b человека и эталонную последовательность NCBI: NP_112253.1 для крысиного SNAP25b), синаптобревины (VAMP) (например, идентификационные номера генов в базе данных NCBI: 6843; 6844; 6845; 8673; 8674; 9341; 9554; 10652; 10791 и 26984) и синтаксины (например, идентификационные номера генов в базе данных NCBI: 2054; 6804; 6809; 6810; 6811; 8417; 8675; 8676; 8677; 9482; 10228; 23673; 53407; 55014; 112755 и 415177). Расщепляемые связи белка SNARE, которые расщепляются клостридиальными нейротоксинами, описаны, например, в публикации Binz, Th. et al. Clostridial neurotoxins: mechanism of
- 8 039761
SNARE cleavage and outlook on potential substrate specificity reengineering. Toxins 2.4 (2010): 665-682.
Предпочтительно, участок расщепления BoNT происходит из белка SNARE человека. Примеры расщепляемых связей белка SNARE человека представлены в табл. 1.
Таблица 1
Расщепляемые связи белка SNARE человека, которые расщепляются клостридиальными нейротоксинами
Нейротоксин SNARE Расщепляемая связь
BoNT/A SNAP2 5 (SEQ ID NO: 23) . Glnl97-Argl98
BoNT/B VAMP-1 (SEQ ID NO:24). VAMP-2 (SEQ ID NO:25). VAMP-3 (SEQ ID NO:26). Gln78-Phe79 Gln7 6-Phe7 7 Gln59-Phe60
BoNT/Cl SNAP25 (SEQ ID NO: 23). Синтаксин 1A (SEQ ID NO: 27) . Синтаксин IB (SEQ ID NO: 28) . Argl98-Alal99 Lys253-Ala254 Lys252-Ala253
BoNT/D VAMP-1 (SEQ ID NO:24). VAMP-2 (SEQ ID NO: 25). Lys 61-Leu62 Lys59-Leu60
VAMP-3 (SEQ ID NO: 26). Lys42-Leu43
BoNT/E SNAP2 5 (SEQ ID NO: 23) . Argl80-Ilel81
BoNT/F VAMP-1 (SEQ ID NO: 24) . VAMP-2 (SEQ ID NO: 25). VAMP-3 (SEQ ID NO: 26). Gln60-Lys 61 Gln58-Lys59 Gln41-Lys42
BoNT/G VAMP-1 (SEQ ID NO: 24). VAMP-2 (SEQ ID NO: 25). VAMP-3 (SEQ ID NO: 26). Ala83-Ala84 Ala81-Ala82 Ala64-Ala65
TeNT VAMP-1 (SEQ ID NO: 24). VAMP-2 (SEQ ID NO: 25). VAMP-3 (SEQ ID NO: 26). Gln7 8-Phe7 9 Gln7 6-Phe77 Gln59-Phe60
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления клостридиальным нейротоксином, предпочтительно человеческий участок расщепления нейротоксином. Участок расщепления клостридиальным нейротоксином может быть определен как последовательность, содержащая, по меньшей мере, аминокислотные остатки P3P2P1P1'P2'P3' белка SNARE, предпочтительно SNARE человека, где P1 и P1' представляют собой остатки, расположенные на любой стороне от расщепляемой пептидной связи, которая расщепляется клостридиальным нейротоксином, например Gln197 и Arg198 в белке SNAP25 человека для BoNT/A.
В предпочтительном варианте реализации участок расщепления клостридиальным нейротоксином содержит, по меньшей мере, аминокислотные остатки P4P3P2P1P1'P2'P3'P4' белка SNARE. В более предпочтительном варианте реализации участок расщепления клостридиальным нейротоксином содержит, по меньшей мере, аминокислотные остатки P5P4P2P1P1'P2'P3'P4'P5' белка SNARE, более предпочтительно, по меньшей мере, аминокислотные остатки P6P5P4P3P2P1P1'P2'P3'P4'P5'P6'.
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/A, причем указанный участок расщепления BoNT/A содержит остатки 195-200, предпочтительно 194-201, 193-202 или 192-203 белка SNAP25 человека (SEQ ID NO: 23).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/B, причем указанный участок расщепления BoNT/B содержит остатки 76-81, предпочтительно 7582, 74-83 или 73-84 белка VAMP-1 человека (SEQ ID NO: 24).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/B, причем указанный участок расщепления BoNT/B содержит остатки 74-79, предпочтительно 7380, 72-81 или 71-82 белка VAMP-2 человека (SEQ ID NO: 25).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/B, причем указанный участок расщепления BoNT/B содержит остатки 57-62, предпочтительно 5663, 55-64 или 54-65 белка VAMP-3 человека (SEQ ID NO: 26).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/C1, причем указанный участок расщепления BoNT/C1 содержит остатки 196-201, предпочтительно
- 9 039761
195-202, 194-203 или 193-204 белка SNAP25 человека (SEQ ID NO: 23).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления
BoNT/C1, причем указанный участок расщепления BoNT/C1 содержит остатки 251-256, предпочтительно
250-257, 249-258 или 148-259 синтаксина 1A человека (SEQ ID NO: 27).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/C1, причем указанный участок расщепления BoNT/C1 содержит остатки 252-257, предпочтительно 251-258, 249-259 или 149-260 синтаксина 1В человека (SEQ ID NO: 28).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/D, причем указанный участок расщепления BoNT/D содержит остатки 59-64, предпочтительно 5865, 57-66 или 56-67 белка VAMP-1 человека (SEQ ID NO: 24).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/D, причем указанный участок расщепления BoNT/D содержит остатки 57-62, предпочтительно 5663, 55-64 или 54-65 белка VAMP-2 человека (SEQ ID NO: 25).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/D, причем указанный участок расщепления BoNT/D содержит остатки 40-45, предпочтительно 3946, 38-47 или 37-48 белка VAMP-3 человека (SEQ ID NO: 26).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/E, причем указанный участок расщепления BoNT/E содержит остатки 178-183, предпочтительно 177-184, 176-185 или 175-186 белка SNAP25 человека (SEQ ID NO: 23).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/F, причем указанный участок расщепления BoNT/F содержит остатки 58-63, предпочтительно 5764, 56-65 или 55-66 белка VAMP-1 человека (SEQ ID NO: 24).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/F, причем указанный участок расщепления BoNT/F содержит остатки 56-61, предпочтительно 5562, 54-63 или 53-64 белка VAMP-2 человека (SEQ ID NO: 25).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/F, причем указанный участок расщепления BoNT/F содержит остатки 39-44, предпочтительно 3845, 37-46 или 36-47 белка VAMP-3 человека (SEQ ID NO: 26).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/G, причем указанный участок расщепления BoNT/G содержит остатки 81-86, предпочтительно 8087, 79-88 или 78-89 белка VAMP-1 человека (SEQ ID NO: 24).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/G, причем указанный участок расщепления BoNT/G содержит остатки 79-84, предпочтительно 7885, 77-86 или 76-87 белка VAMP-2 человека (SEQ ID NO: 25).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/G, причем указанный участок расщепления BoNT/G содержит остатки 62-67, предпочтительно 6168, 60-69 или 59-70 белка VAMP-3 человека (SEQ ID NO: 26).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления BoNT/B, причем указанный участок расщепления TeNT содержит остатки 76-81, предпочтительно 75-82, 74-83 или 73-84 белка VAMP-1 человека (SEQ ID NO: 24).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления TeNT, причем указанный участок расщепления TeNT содержит остатки 74-79, предпочтительно 73-80, 72-81 или 71-82 белка VAMP-2 человека (SEQ ID NO: 25).
В одном варианте реализации линкер содержит по меньшей мере один участок расщепления TeNT, причем указанный участок расщепления BoNT/B содержит остатки 57-62, предпочтительно 56-63, 55-64 или 54-65 белка VAMP-3 человека (SEQ ID NO: 26).
Примеры подходящих участков расщепления BoNT в белках SNARE включают в качестве не имеющих ограничительного характера примеров аминокислоты 141-206 белка SNAP-25b человека (например, SEQ ID NO: 10); и аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека (например, идентификационный номер гена в базе данных NCBI: 6843). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека могут представлять собой аминокислоты 35-96 SEQ ID NO: 16. Дополнительные не имеющие ограничительного характера примеры участков расщепления BoNT в белках SNARE включают аминокислоты 60-87 белка VAMP2 человека, аминокислоты 43-70 белка VAMP3 человека и аминокислоты 62-89 белка VAMP1 человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов аминокислоты 60-87 белка VAMP2 человека могут представлять собой последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов аминокислоты 43-70 белка VAMP3 человека могут представлять собой последовательность SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов аминокислоты 62-89 белка VAMP1 человека могут представлять собой последовательность SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может представлять собой вариант любой из специфических последовательностей, указанных в настоящем документе, например, вариант природного участка расщепления BoNT, находящегося в белке SNARE. В некото- 10 039761 рых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может представлять собой вариант аминокислот 141-206 SEQ ID NO: 10 или аминокислот 35-96 SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может иметь по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с природным участком расщепления BoNT, находящимся в белке SNARE. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может иметь по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с аминокислотами 141-206 SEQ ID NO: 10 или аминокислотами 35-96 SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов вариант может представлять собой вариант с консервативной заменой.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может представлять собой последовательность, имеющую 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее или 1 делецию, вставку или замену по сравнению с природным участком расщепления BoNT, находящемся в белке SNARE. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может представлять собой последовательность, имеющую 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее или 1 остаток, отличающийся по сравнению с природным участком расщепления BoNT, находящимся в белке SNARE. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может представлять собой последовательность, имеющую 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее или 1 делецию, вставку или замену по сравнению с аминокислотами 141-206 SEQ ID NO: 10 или аминокислотами 35-96 SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов участок расщепления BoNT может представлять собой последовательность, имеющую 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, 2 или менее или 1 остаток, отличающийся по сравнению с аминокислотами 141-206 SEQ ID NO: 10 или аминокислотами 35-96 SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, участок расщепления BoNT может содержать аминокислоты 141-206 белка SNAP-25b человека (например, SEQ ID NO: 10); аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека; аминокислоты 1-96 белка VAMP1; SNAP25 человека; и/или аминокислоты 1-206 белка SNAP25b человека (SEQ ID NO: 14).
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, участок расщепления BoNT может специфически распознаваться (например, расщепляться) посредством BoNT A, B, C, D, E, F, и/или G. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, участок расщепления BoNT может специфически распознаваться (например, расщепляться) посредством BoNT A, E и C. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, участок расщепления BoNT может специфически распознаваться (например, расщепляться) посредством BoNT B, D, F и G.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать один или более спейсеров. В контексте настоящего документа термин спейсер относится к аминокислотной последовательности, которая служит структурной цели разделения двух других последовательностей в одной и той же пептидной цепи. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсерная последовательность может быть гибкой пептидной последовательностью. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может содержать остатки глицина и серина. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может, по существу, состоять из остатков глицина и серина. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может состоять из остатков глицина и серина.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может иметь длину от приблизительно 2 до приблизительно 30 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может иметь длину от 2 до 30 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может иметь длину от приблизительно 3 до приблизительно 20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может иметь длину от 3 до 20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может иметь длину от приблизительно 5 до приблизительно 15 аминокислот. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, спейсер может иметь длину от 5 до 15 аминокислот.
Типичные не имеющие ограничительного характера примеры спейсеров могут включать GSSGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 4); GSSGGGGSGGGSSG (SEQ ID NO: 5); GGGGS (SEQ ID NO: 6); (GGGGS)n (n=1-3) (SEQ ID NO: 7); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 8) и EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 9). Конструкция, выбор линкеров и дополнительные примеры линкеров хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в публикации Chen, X., et al., Fusion protein linkers: pro- 11 039761 terty, design and functionality Adv. Drug Deliv. Rev. (2013); полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать фрагмент, связывающийся с нейротоксином, например, последовательность, с которой связывается нейротоксин и/или которая связывается с нейротоксином, и которая не расщепляется нейротоксином. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, фрагмент, связывающийся с нейротоксином, может представлять собой фрагмент нейротоксинового рецептора, например рецептора для BoNT и/или столбнячного нейротоксина.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нейротоксиновый рецептор может представлять собой нейротоксиновый рецептор человека, мыши, крысы или примата. В предпочтительном варианте реализации нейротоксиновый рецептор представляет собой нейротоксиновый рецептор человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нейротоксиновый рецептор может представлять собой SV2C, например SV2C человека (идентификационный номер гена в базе данных NCBI: 22987; номер в базе данных GenBank: AAI00828.1). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, связывающийся с нейротоксином фрагмент рецептора может содержать последовательность, соответствующую аминокислотам 529-566 SV2C человека (SV2C-L4, например, SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, фрагмент, связывающийся с нейротоксином, может содержать аминокислоты 529-566 SV2C человека (SV2C-L4, например, SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нейротоксиновый рецептор может представлять собой SYTI (идентификационный номер гена в базе данных NCBI: 6857) или SYT2 (идентификационный номер гена в базе данных NCBI: 127833). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, связывающийся с нейротоксином фрагмент рецептора может содержать последовательность, соответствующую аминокислотам 32-52 SYTI (например, SEQ ID NO: 17) или аминокислотам 40-60 SYT2 (SEQ ID NO: 18).
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать интактный второй люциферазный полипептид. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вторая люцифераза является активной перед и/или после расщепления одноцепочечного полипептида, например нейротоксином. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вторая люцифераза отличается от первой люциферазы, например, она оказывает действие на другой субстрат и/или производит другую длину волны света. Например, если первая люцифераза представляет собой люциферазу NANOLUC, вторая люцифераза может представлять собой люциферазу светлячка (например, Photinus pyralis), бактериальную люциферазу (например, Vibrio fischieri, Vibrio harveyi), люциферазу полипов Renilla (например, Renilla reniformis), люциферазу динофлагеллятов или люциферазу Gaussia. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вторая люцифераза может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вторая люцифераза может содержать SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать интактный второй люциферазный полипептид, расположенный между N-концевым доменом репортерного белка и по меньшей мере одним участком расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать интактный второй люциферазный полипептид, расположенный между N-nano1_159 и участком расщепления BoNT.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, связывающий фрагмент может быть расположен в направлении N-конца относительно по меньшей мере одного участка расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, связывающий фрагмент может быть расположен между N-nano1_159 и участком расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере один связывающий фрагмент, по меньшей мере один спейсер и по меньшей мере один участок расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере один связывающий фрагмент, по меньшей мере один спейсер и по меньшей мере один участок расщепления BoNT.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать в направлении от N-конца к C-концу один или более спейсеров и по меньшей мере один участок расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать в направлении от N-конца к C-концу один или более спейсеров, по меньшей мере один участок расщепления и один или более спейсеров. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать в направлении от N-конца к C-концу по меньшей мере один участок расщепления и один или более спейсеров. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать один или более спейсеров, расположенных между участком расщепления BoNT и N-nano1_159,
- 12 039761 между участком расщепления нейротоксином и C-nano160-170, или их комбинацию.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать спейсер, расположенный между вторым люциферазным полипептидом и участком расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать в направлении от N-конца к C-концу второй люциферазный полипептид, по меньшей мере один спейсер и по меньшей мере один участок расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер может содержать спейсер, расположенный между вторым люциферазным полипептидом и участком расщепления BoNT.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид может дополнительно содержать полигистидиновую аффинную метку, например His 6 (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полигистидиновая аффинная метка расположена на C-конце полипептида, например на C-конце C-концевого домена репортерного белка.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159); b) линкер, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159, содержащий: i) первый спейсер из 5-15 аминокислот; ii) связывающий фрагмент, состоящий из аминокислот 529-566 SV2C, расположенный в направлении C-конца относительно первого спейсера; iii) второй спейсер, расположенный в направлении С-конца относительно связывающий фрагмент; iv) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 141-206 белка SNAP25b человека, расположенный в направлении C-конца относительно второго спейсера; iv) третий спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170), расположенные в направлении C-конца относительно линкера; причем линкер функционально соединяет Nnano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид дополнительно содержит полигистидиновую аффинную метку, расположенную в направлении С-конца относительно аминокислот 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170).
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе, описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159); b) линкер, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159, содержащий: i) первый спейсер из 5-15 аминокислот; ii) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 141-206 белка SNAP25b человека, расположенный в направлении C-конца относительно первого спейсера; iii) второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160-170), расположенные в направлении C-конца относительно линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160_170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид дополнительно содержит полигистидиновую аффинную метку, расположенную в направлении C-конца относительно аминокислот 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160-170).
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159); b) линкер, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159, содержащий: i) первый спейсер из 5-15 аминокислот; ii) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека, расположенный в направлении C-конца относительно первого спейсера; iii) второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170), расположенные в направлении C-конца относительно линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и C-nano160-170 с образованием функционального люциферазного гибридного белка. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид дополнительно содержит полигистидиновую аффинную метку, расположенную в направлении C-конца относительно аминокислот 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160-170).
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе, описан одноцепочечный полипептид, содержащий: a) аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159); b) линкер, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159, содержащий: i) второй функциональный люциферазный полипептид; ii) первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно второго люциферазного полипептида; iii) участок расщепления BoNT, содержащий аминокислоты 1-206 белка SNAP25b человека (например SEQ ID NO: 14), расположенный в направлении C-конца относительно первого спейсера; iv) второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT; и c) аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170), расположенные в направлении C-конца относительно линкера; причем линкер функционально соединяет N-nano1_159 и С-nano160.170 с образованием функционального люцифе- 13 039761 разного гибридного белка.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид дополнительно содержит полигистидиновую аффинную метку, расположенную в направлении Cконца относительно аминокислот 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160-170).
Таблица 2
Описание полипепти да Последовательность SEQ ID NO:
Люцифераз а NANOLUC™ MVFTLEDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIQRI VRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKV ILPYGTLVIDGVTPNMLNYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNK IIDERLITPDGSMLFRVTINSVTGYRLFEEIL 1
N-nanol- 159 MVFTLEDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIQRI VRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKV ILPYGTLVIDGVTPNMLNYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNK IIDERLITPDGSMLFRVTINS 2
C-nanoi60- 170 VTGYRLFEEIL 3
141-206 белка ARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKAD SNKTRIDEANQRATKMLGSG 10
- 14 039761
SNAP25b (человека и крысы)
529-566 белка SV2C человека NTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNK 11
Люцифераз а светлячка MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAH IEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIWCSENSLQFFMPV LGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQРТWFVSKKGLQKILN VQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPE S FDRDKTIALIMNS S GS TGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQ IIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRS LQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKE VGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKWPF FEAKWDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDK DGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQ HPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVWLEHGKTMTEKEIVDYVASQV TTAKKLRGGWFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV 13
Белок SNAP25b человека (эталонна я последова тельность NCBI: NP_570824 .1) МАЕ DADMRNE LEEMQRRADQLADE S LE S TRRMLQLVEE S KDAGIRT LVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPC NKLKS S DAYKKAWGNNQDGWAS QPARWDERE QMAIS GG FIRRVT NDARENEMDENLE QVS G11GNLRHMALDMGNEIDT QNRQIDRIMEK ADSNKTRIDEANQRATKMLGSG 14
ДНКпоследова тельность датчика 1 ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGGAACAGACAG CCGCCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAG TTTGCTGCAGAATCTCGCCGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATT GTCCGGAGCGGTGAAAATGCCCTGAAGATCGACATCCATGTCATCA TCCCGTATGAAGGTCTGAGCGCCGACCAAATGGCCCAGATCGAAGA GGTGTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTG 15
- 15 039761
ATCCTGCCCTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACA TGCTGAACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGA CGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAA ATTATCGACGAGCGCCTGATCACCCCCGACGGCTCCATGCTGTTCC GAGTAACCATCAACAGtgggagttccGGTGGTGGCGGGAGCGGAGG TGGAGGctcgAGCGGTgGAGCTCagAACACCTACTTCAAGAACTGC ACAT T TAT T GAGAC T G T T T T T GACAACACAGATТ Т Т GAGССАТАТА ААТТСАТТGACAGТGAATТТАААААСТGСТСGТТТТТТСАСААСАА GGGGGGCGGAGGTTCCGCCCGGGAAAATGAAATGGATGAAAACCTA GAGCAGGTGAGCGGCATCATCGGAAACCTCCGTCATATGGCCCTAG АСАТ GGGCAATGAGAT Т GACACCCAGAAT CGCCAGATТ GACAGGAT CAT GGAGAAGGC ТGAC Т CCAACAAAACCAGAATТ GAT GAAGCCAAC CAACGTGCAACAAAGATGCTGGGAAGTGGTggGAATTCtggcTCGA GcGGTGGTGGCGGGAGCGGAGGTGGAGGGtcgtcaGGTGTGACCGG CTACCGGCTGTTCGAGGAGATTCTGGCGGCCGCACTCGAGCACCAC САС САС САС САС Т GA
Белок VAMP1 человека MSAPAQPPAE GTEGTAPGGG PPGPPPNMTS NRRLQQTQAQ VEEWDIIRV NVDKVLERDQ KLSELDDRAD ALQAGASQFE SSAAKLKRKY WWKNCKMMIM LGAICAIIW VIVIYFFT 16
Аминокисл оты 32-52 SYT1 GEGKEDAFSKLKQKFMNELHK 17
Аминокисл оты 40-60 SYT2 GE S QE DM FAKLKE К F FNEINK 18
Аминокисл оты 60-87 белка VAMP 2 человека LSELDDRADAL QAGASQFETS AAKLKRK 19
Аминокисл оты 43-70 белка VAMP3 человека LSELDDRA DALQAGASQFETSAAKLKRK 20
- 16 039761
Аминокисл ОТЫ 62-89 белка VAMP1 человека LSELDDRAD ALQAGASQFE SSAAKLKRK 21
ДНКпоследова тельности датчика 2 ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGGAACAGACAG CCGCCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAG TTTGCTGCAGAATCTCGCCGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATT GTCCGGAGCGGTGAAAATGCCCTGAAGATCGACATCCATGTCATCA TCCCGTATGAAGGTCTGAGCGCCGACCAAATGGCCCAGATCGAAGA GGTGTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTG ATCCTGCCCTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACA TGCTGAACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGA CGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAA ATTATCGACGAGCGCCTGATCACCCCCGACGGCTCCATGCTGTTCC GAGTAACCATCAACAGtgggagttccGGTGGTGGCGGGAGCGGAGG TGGAGGctcgAGCGGTgGAGCTCagGCCCGGGAAAATGAAATGGAT GAAAACCTAGAGCAGGTGAGCGGCATCATCGGAAACCTCCGTCATA TGGCCCTAGACATGGGCAATGAGATTGACACCCAGAATCGCCAGAT TGACAGGAT CAT GGAGAAGGC TGAC T CCAACAAAACCAGAAT T GAT GAAGCCAACCAACGTGCAACAAAGATGCTGGGAAGTGGTggGAATT CtggcTCGAGcGGTGGTGGCGGGAGCGGAGGTGGAGGGtcgtcaGG TGTGACCGGCTACCGGCTGTTCGAGGAGATTCTGGCGGCCGCACTC GAG САС САС САС САС САС САС T GA 29
ДНКпоследова тельности датчика 3 ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGGAACAGACAG CCGCCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAG TTTGCTGCAGAATCTCGCCGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATT GTCCGGAGCGGTGAAAATGCCCTGAAGATCGACATCCATGTCATCA TCCCGTATGAAGGTCTGAGCGCCGACCAAATGGCCCAGATCGAAGA GGTGTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTG ATCCTGCCCTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACA TGCTGAACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGA CGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAA ATTATCGACGAGCGCCTGATCACCCCCGACGGCTCCATGCTGTTCC GAGTAACCATCAACAGtgggagttccGGTGGTGGCGGGAGCGGAGG 30
- 17 039761
TGGAGGctcgAGCGGTgGAGCTCagCAGCAAACCCAGGCACAAGTG GAGGAGGTGGTGGACATCATACGTGTGAACGTGGACAAGGTCCTGG AGAGGGACCAGAAGCTGTCAGAGCTGGATGACCGAGCTGATGCCTT GCAGGCAGGAGCATCACAATTTGAGAGCAGTGGTGCCAAGCTAAAG AGGAAGTATTGGTGGAAAAACTGCAAGggGAATTCtggcTCGAGcG GTGGTGGCGGGAGCGGAGGTGGAGGGtcgtcaGGTGTGACCGGCTA CCGGCTGTTCGAGGAGATTCTGGCGGCCGCACTCGAGCACCACCAC САС САС САС T GA
днкпоследова тельности конструкц ии in vivo ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGGAACAGACAG CCGCCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAG TTTGCTGCAGAATCTCGCCGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATT GTCCGGAGCGGTGAAAATGCCCTGAAGATCGACATCCATGTCATCA TCCCGTATGAAGGTCTGAGCGCCGACCAAATGGCCCAGATCGAAGA GGTGTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTG ATCCTGCCCTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACA TGCTGAACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGA CGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAA ATTATCGACGAGCGCCTGATCACCCCCGACGGCTCCATGCTGTTCC GAGTAACCATCAACAGtgggagttccGGTGGTGGCGGGAGCGGAGG TGGAGGctcgAGCGGTgGAGCTCagGAAGATGCCAAAAACATTAAG AAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCG AGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCAC CATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCC GAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCT ATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAG CTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTG GCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGA ACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAA AGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATA CAAAAGAT CAT CAT CAT GGATAGCAAGACCGAC TACCAGGGC T T CC AAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAA CGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATC GCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCG TAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCG CGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTC 31
- 18 039761
AGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGG GCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGA GGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCT GCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTC TCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGG CGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGC TTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAA CCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGC AGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTG GACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCG TCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGC TACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGAC ATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGC TGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGA ACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGG GTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAG TCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGT GGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGT GGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGT TGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGG CGGCAAGATCGCCGTGGGGGGCGGAGGTTCCGCCGAGGACGCAGAC ATGCGTAATGAACTGGAGGAGATGCAGAGGAGGGCTGACCAGCTGG CTGATGAGTCCCTGGAAAGCACCCGTCGCATGCTGCAGCTGGTCGA AGAGAGTAAAGATGCTGGCATCAGGACTTTGGTTATGTTGGATGAG CAAGGCGAACAACTGGAACGCATTGAGGAAGGGATGGACCAAATCA ATAAGGATAT GAAAGAAGCAGAAAAGAAT T T GACGGACC TAGGAAA ATTCTGCGGGCTTTGTGTGTGTCCCTGTAACAAGCTTAAATCCAGT GATGCTTACAAAAAAGCCTGGGGCAATAATCAGGATGGAGTAGTGG CCAGCCAGCCTGCCCGTGTGGTGGATGAACGGGAGCAGATGGCCAT CAGTGGTGGCTTCATCCGCAGGGTAACAAACGATGCCCGGGAAAAT GAAATGGATGAAAACCTAGAGCAGGTGAGCGGCATCATCGGAAACC TCCGTCATATGGCCCTAGACATGGGCAATGAGATTGACACCCAGAA TCGCCAGATTGACAGGATCATGGAGAAGGCTGACTCCAACAAAACC AGAATTGATGAAGCCAACCAACGTGCAACAAAGATGCTGGGAAGTG GTggGAATTCtggcTCGAGcGGTGGTGGCGGGAGCGGAGGTGGAGG GtcgtcaGGTGTGACCGGCTACCGGCTGTTCGAGGAGATTCTGTAA
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описана нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нуклеиновая кислота может содержать SEQ ID NO: 15, 29, 30 или 31.
Другой аспект изобретения относится к вектору из нуклеиновых кислот, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем документе. В одном варианте реализации вектор представляет собой вектор экспрессии. Такой вектор экспрессии упоминается в настоящем документе как конструкция экспрессии и содержит молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном описании, функционально связанную с вектором экспрессии, подходящем для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке или в бесклеточном экстракте. Для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечный полипептид по настоящему изобретению, можно использовать широкий спектр векторов экспрессии, включая, без ограничения, вирусный вектор экспрессии; прокариотический вектор экспрессии; эукариотические векторы экспрессии, такие как, например, дрожжевой вектор экспрессии, вектор экспрессии насекомых, вектор экспрессии млекопитающих; а также вектор экспрессии бесклеточного экстракта. Также понятно, что векторы экспрессии, пригодные для применения на практике аспектов этих способов, могут включать векторы, которые экспрессируют одноцепочечный полипептид под контролем конститутивного, тканеспецифичного, клеточноспецифичного или индуцибельного промоторного элемента, энхансерного элемента или обоих. Не имеющие ограничительного характера при
- 19 039761 меры векторов экспрессии, наряду с хорошо известными реагентами и условиями для изготовления из таких векторов экспрессии и использования конструкции экспрессии, легко доступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничения, компании BD Biosciences-Clontech, г. Пало-Альто, штат Калифорния, США; BD Biosciences Pharmingen, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США; Invitrogen, Inc, г. Карлсбад, штат Калифорния, США; EMD Biosciences-Novagen, г. Мадисон, штат Висконсин, США; QIAGEN, Inc., г. Валенсия, штат Калифорния, США; и Stratagene, г. Ла-Холья, штат Калифорния, США. Выбор, создание и использование подходящего вектора экспрессии являются стандартными процедурами, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники и понятны из идей, приведенных в настоящем описании.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан вектор из нуклеиновых кислот, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нуклеиновая кислота может содержать SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вектор может представлять собой вектор экспрессии и содержать последовательность нуклеиновой кислоты в экспрессируемой форме. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вектор может представлять собой вирусный вектор экспрессии, прокариотический вектор экспрессии, дрожжевой вектор экспрессии, вектор экспрессии насекомых или вектор экспрессии млекопитающих.
В контексте настоящего документа термин вектор относится к конструкции нуклеиновой кислоты, предназначенной для доставки в клетку или для переноса между разными клетками. Доступны многие векторы, подходящие для переноса экзогенных генов в клетки-мишени, например, векторы могут быть эписомальными, например плазмидами, полученными из вирусов векторами, или могут быть интегрированы в геном клетки-мишени посредством гомологичной рекомбинации или случайной интеграции. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вектор может представлять собой вектор экспрессии. В контексте настоящего документа термин вектор экспрессии относится к вектору, обладающему способностью встраивать и экспрессировать в клетке гетерологичные фрагменты нуклеиновой кислоты. Вектор экспрессии может содержать дополнительные элементы. Нуклеиновая кислота, встроенная в вектор, может быть функционально связана с последовательностью контроля экспрессии, когда последовательность контроля экспрессии контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию этой полинуклеотидной последовательности.
Другой аспект изобретения относится к клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию экспрессии, описанную в настоящем документе. Клетка может быть предназначена для воспроизведения нуклеиновой кислоты, или для экспрессии нуклеиновой кислоты, или для того и другого. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описана клетка, содержащая нуклеиновую кислоту и/или вектор, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, клетка экспрессирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, клетка может представлять собой прокариотическую клетку, клетку E.coli, дрожжевую клетку, клетку насекомого, клетку животного, клетку млекопитающего, клетку человека, клетку мыши, клетку примата и/или нервную клетку. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов клетка представляет собой нервную клетку, в частности клетку с высокой чувствительностью к BoNT.
Клетка с высокой чувствительностью к BoNT представляет собой клетку, чувствительную к интоксикации BoNT. В некоторых вариантах реализации клетка с высокой чувствительностью к BoNT представляет собой клетку, чувствительную к интоксикации BoNT в количестве, например, приблизительно 500 пМ или менее, приблизительно 400 пМ или менее, приблизительно 300 пМ или менее, приблизительно 200 пМ или менее, приблизительно 100 пМ или менее, приблизительно 90 пМ или менее, приблизительно 80 пМ или менее, приблизительно 70 пМ или менее, приблизительно 60 пМ или менее, приблизительно 50 пМ или менее, приблизительно 40 пМ или менее, приблизительно 30 пМ или менее, приблизительно 20 пМ или менее, приблизительно 10 пМ или менее, приблизительно 9 пМ или менее, приблизительно 8 пМ или менее, приблизительно 7 пМ или менее, приблизительно 6 пМ или менее, приблизительно 5 пМ или менее, приблизительно 4 пМ или менее, приблизительно 3 пМ или менее, приблизительно 2 пМ или менее, приблизительно 1 пМ или менее, приблизительно 0,9 пМ или менее, приблизительно 0,8 пМ или менее, приблизительно 0,7 пМ или менее, приблизительно 0,6 пМ или менее, приблизительно 0,5 пМ или менее, приблизительно 0,4 пМ или менее, приблизительно 0,3 пМ или менее, приблизительно 0,2 пМ, приблизительно 0,1 пМ или менее BoNT, приблизительно 90 фМ или менее BoNT, приблизительно 80 фМ или менее BoNT, приблизительно 70 фМ или менее BoNT, приблизительно 60 фМ или менее BoNT, приблизительно 50 фМ или менее BoNT, приблизительно 40 фМ или менее BoNT, приблизительно 30 фМ или менее BoNT, приблизительно 20 фМ или менее BoNT или приблизительно 10 фМ или менее BoNT.
В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой первичную нервную клетку с высо- 20 039761 кой чувствительностью к BoNT, например нейроны коры головного мозга, нейроны гиппокампа и/или нейроны спинного мозга.
В некоторых вариантах реализации клетка является клеткой из линии нервных клеток с высокой чувствительностью к BoNT, например ВЕ(2)-М17, Kelly, LA1-55n, N1 E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a,
NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa и/или SK-N-BE(2)-C.
В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой нервную клетку, полученную из стволовой клетки, в частности из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (iPS-клетки), например, нейронов i-Cell®, допаминергических нейронов i-Cell®, глутаматергических нейронов iCell, мотонейронов iCell (Cellular dynamics Inc), нейронов коры головного мозга, нервных стволовых клеток (Axol Biosciences), нейронов Peri.4U, нейронов CNS.4U, нейронов Dopa.4UNeurons (Axiogenesis), клеток MNP (Lonza), нейронов коры головного мозга, двигательных нейронов (iStem) и/или iPSC-производных нервных клеток (MTI-GlobalStem).
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов клетка может представлять собой прокариотическую клетку, включая, без ограничения, штаммы аэробных, микроаэрофильных, капнофильных, факультативных анаэробных, грамотрицательных и грамположительных бактериальных клеток, такие как клетки, полученные, например, из Escherichia coh, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens и Salmonella typhimurium; и эукариотическую клетку, включая, без ограничения, дрожжевые штаммы, такие как, например, полученные из Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica; клетку насекомого или клеточную линию, полученную от насекомых, такую как, например, полученную из Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster и Manduca sexta; или клетку млекопитающего или клеточную линию, полученную из клеток млекопитающего, такую как, например, полученную от мыши, крысы, хомяка, свиньи, крупного рогатого скота, лошади, примата и человека. Клеточные линии могут быть получены из Американской коллекции типовых культур, Европейской коллекции клеточных культур и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур. Не имеющие ограничительного характера примеры конкретных протоколов для выбора, создания и использования подходящей клеточной линии описаны, например, в публикациях INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F.A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J.M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, выше, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002); и CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, выше, (2004). Эти протоколы являются стандартными процедурами в пределах объема, определенного специалистом в данной области техники, и приведенных в настоящем описании идей.
Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в способах обнаружения и/или измерения наличия, силы и/или активности, например, нейротоксина (например, BoNT). В присутствии BoNT одноцепочечный полипептид с участком расщепления BoNT будет расщепляться в последовательности линкера, нарушая активность разделенного репортерного белка (например, люциферазы). Соответственно, снижение активности репортерного белка указывает на наличие BoNT. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина C. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с одноцепочечным полипептидом, описанным в настоящем документе, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и определение люциферазной активности полипептида по сравнению с люциферазной активностью полипептида при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности указывает на активность BoNT в образце. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности ботулинического нейротоксина, включающий: a) приведение в контакт нейротоксина с одноцепочечным полипептидом, описанным в настоящем документе, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и b) определение люциферазной активности полипептида по сравнению с эталоном, определяя таким образом активность. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов способы подходят для предоставления разрешения на выпуск партии, например, для тестирования партии для выпуска и/или тестирования серии для выпуска. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, описанные в настоящем документе способы можно осуществлять in vitro.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина C. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с одноцепочечным полипептидом, описанным в настоящем документе, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и b) определение люциферазной активности полипептида по сравне- 21 039761 нию с люциферазной активностью полипептида при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности указывает на активность BoNT в образце. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина C. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с одноцепочечным полипептидом, содержащим: аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159), аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160-170), разделенные и функционально соединенные линкером, содержащим участок расщепления BoNT, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159; и в направлении N-конца относительно C-nano160_170, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и b) определение люциферазной активности полипептида по сравнению с люциферазной активностью полипептида при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности указывает на активность BoNT в образце.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина С. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с одноцепочечным полипептидом, содержащим: аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1_159), аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170), разделенные и функционально соединенные линкером, содержащим участок расщепления BoNT, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1_159; и в направлении N-конца относительно С-nano160.170, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; и b) определение люциферазной активности полипептида по сравнению с активностью полипептида при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности является показателем активности BoNT в образце. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер содержит первый спейсер из 5-15 аминокислот, связывающий фрагмент из аминокислот 529-566 SV2C человека, расположенный в направлении C-конца относительно первого спейсера и в направлении N-конца относительно участка расщепления BoNT, и второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит аминокислоты 141-206 белка SNAP25 человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер содержит первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении N-конца относительно участка расщепления BoNT, и второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит аминокислоты 141-206 белка SNAP25 человека. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер содержит первый спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении N-конца относительно участка расщепления BoNT, второй спейсер из 5-15 аминокислот, расположенный в направлении C-конца относительно участка расщепления BoNT, причем участок расщепления BoNT содержит аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения показателя EC50 BoNT, включающий: a) приведение в контакт одноцепочечного полипептида, описанного в настоящем документе, в условиях, подходящих для проявления активности BoNT, с BoNT в первой концентрации; и определение люциферазной активности полипептида по сравнению с люциферазной активностью полипептида при отсутствии образца; b) повторение стадии a) с другой концентрацией BoNT до тех пор, пока не будет определен показатель EC50. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, различные концентрации BoNT охватывают по меньшей мере один порядок разности величин.
Как известно в данной области техники, половина максимальной эффективной концентрации (EC50) относится к концентрации лекарственного средства, антитела или токсического вещества, которая после некоторого определенного времени воздействия вызывает ответную реакцию посредине между исходным уровнем и максимумом. Этот показатель обычно используется в показателя активности препарата. Следовательно, EC50 на градуированной кривой зависимости доза-ответ представляет концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. Показатель EC50 на дискретной кривой зависимости доза-ответ представляет концентрацию соединения, при которой после определенной продолжительности воздействия у 50% популяции наблюдается ответ.
В контексте настоящего документа выражение условия, подходящие для проявления активности BoNT относится к условиям (например температуре, уровню pH, кофакторам и т.п.), в которых BoNT может специфическим образом расщеплять участок расщепления BoNT. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия, подходящие для проявления активности BoNT, могут включать: наличие буфера HEPES, 20 мкМ ZnCl2, 2 мМ ДТТ, 1 мг/мл БСА, рН 7,1. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия, подходящие для проявления активности BoNT, могут включать наличие буфера HEPES, 10-30 мкМ ZnCl2, 1-3 мМ ДТТ, 0,5-2 мг/мл БСА, рН 6,5-7,5. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия, подходящие для проявления активности BoNT, могут включать наличие буфера HEPES, 5-50 мкМ ZnCl2, 0,1-10 мМ ДТТ, 0,1-10 мг/мл БСА, рН 6,5-7,5.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, усло
- 22 039761 вия могут включать инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от приблизительно 1 до приблизительно 36 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия могут включать инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от 1 до 36 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия могут включать инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от приблизительно 1 до приблизительно 24 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия могут включать инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от 1 до 24 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия могут включать инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от приблизительно 4 до приблизительно 24 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, условия могут включать инкубацию при температуре приблизительно 37°C в течение периода времени от 4 до 24 ч.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид присутствует в концентрации от приблизительно 3 до приблизительно 300 нМ. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид присутствует в концентрации от 3 до 300 нМ. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид присутствует в концентрации от приблизительно 30 до приблизительно 300 нМ. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид присутствует в концентрации от 30 до 300 нМ. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид присутствует в концентрации приблизительно 30 нМ. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид присутствует в концентрации 30 нМ.
Активность BoNT можно также определять в клетках, например в нервных клетках. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина С. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с нервной клеткой, которая экспрессирует одноцепочечный полипептид, описанный в настоящем документе; b) инкубацию нервных клеток в течение периода времени от приблизительно 12 до приблизительно 60 ч; c) сбор лизата из нервных клеток; и d) измерение активности люциферазы NANOLUC™ в лизате по сравнению с активностью люциферазы NANOLUC™ в обработанных аналогичным образом нервных клетках при отсутствии образца, причем снижение активности люциферазы NANOLUC™ указывает на активность BoNT в образце. В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан способ определения активности нейротоксина С. botulinum (BoNT) в образце, включающий: a) приведение в контакт образца с нервной клеткой, которая экспрессирует одноцепочечный полипептид, содержащий аминокислоты 1-159 люциферазы NANOLUC™ (N-nano1.159), аминокислоты 160-170 люциферазы NANOLUC™ (C-nano160_170), разделенные и функционально соединенные линкером, содержащим участок расщепления BoNT, расположенный в направлении C-конца относительно N-nano1.159 и N-конца относительно C-nano160_170; b) инкубацию нервных клеток в течение периода времени от приблизительно 12 до приблизительно 60 ч; c) сбор лизата из нервных клеток; и d) измерение активности люциферазы NANOLUC™ в лизате по сравнению с активностью люциферазы NANOLUC™ в обработанных аналогичным образом нервных клетках при отсутствии образца, причем снижение активности люциферазы NANOLUC™ указывает на активность BoNT в образце. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, линкер дополнительно содержит интактный второй люциферазный полипептид, расположенный между N-nano1.159 и участком расщепления. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нервные клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид из вирусного вектора экспрессии. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нервные клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид из вирусного вектора экспрессии в течение по меньшей мере 3 дней до стадии приведения в контакт. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нервные клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид из вирусного вектора экспрессии в течение по меньшей мере 4 дней до стадии приведения в контакт. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нервные клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид из вирусного вектора экспрессии в течение по меньшей мере 6 дней до стадии приведения в контакт. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, нервные клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид из вирусного вектора экспрессии в течение 6 дней до стадии приведения в контакт. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вирусная система экспрессии представляет собой систему экспрессии лентивируса. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, стадия инкубации b) составляет от приблизительно 12 до приблизительно 72 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, стадия инкубации b) составляет приблизи- 23 039761 тельно 48 ч. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, стадия инкубации b) составляет 48 ч.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, стадия сбора лизата может включать добавление буфера для лизиса. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, стадия сбора лизата может включать центрифугирование и/или осаждение.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, способ может включать использование комбинации одноцепочечных полипептидов, в которой каждый полипептид имеет отличный участок расщепления BoNT и/или комбинацию участков расщепления BoNT.
В контексте настоящего документа фраза определение люциферазной активности относится к количественному или качественному определению уровня света, генерируемого люциферазой (или образцом, который может содержать функциональную люциферазу) в присутствии субстрата люциферазы. Люминесценцию можно выявлять любыми способами, известными в данной области техники, например, с помощью люминесцентной микроскопии, фотометров, спектрофотометров для считывания люминесценции с планшетов, детекторов фотоумножителей и т.п.
Субстраты люциферазы могут включать природные люциферины, а также сконструированные субстраты. Люциферины, например, включают люциферин светлячка, люциферин [коэлентеразин] Cypridina [также известного как Vargula], бактериальный люциферин, а также синтетические аналоги этих субстратов. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, люциферин представляет собой коэлентеразин и его аналоги, включающие молекулы, описанные в патенте США № 6436682, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки, а также, например, см. публикацию Zhao et al., (2004), Mol. Imaging, 3; 43-54. Дополнительные субстраты описаны, например, в патентах США №№ 5374534; 5098828; 6436682; 5004565; 5455357 и 4950588, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов люциферазную активность можно определить посредством добавления субстрата люциферазы к одноцепочечному полипептиду и количественного измерения полученного люминесцентного сигнала. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, субстрат для люциферазы NANOLUC™ может представлять собой фуримазин (2-фуранилметил-дезокси-коэлентеразин).
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, способ может дополнительно включать измерение активности второй люциферазы, содержащейся в одноцепочечном полипептиде. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, активность второй люциферазы можно измерять в клеточном лизате. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, активность второй люциферазы может позволить нормализацию экспрессии одноцепочечного полипептида в образцах, клетках, популяциях клеток и/или лунках. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, определяют люциферазную активность второго люциферазного полипептида в образце и используют в качестве индикатора присутствия общего одноцепочечного полипептида в собранном лизате.
В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе описан набор, содержащий: a) один или более одноцепочечных полипептидов, описанных в настоящем документе, причем каждый одноцепочечный полипептид или комбинация одноцепочечных полипептидов упакованы в отдельный контейнер; одну или более нуклеиновых кислот или векторов из нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, причем каждая нуклеиновая кислота или комбинация нуклеиновых кислот или векторов из нуклеиновых кислот упакованы в отдельный контейнер; и/или одну или более клеток, описанных в настоящем документе, причем каждая клетка или комбинация клеток упакованы в отдельный контейнер.
Набор представляет собой любое изделие (например, упаковку или контейнер), содержащее по меньшей мере один реагент, например одноцепочечный полипептид, нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечный полипептид, или клетку, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую одноцепочечный полипептид, как описано в настоящем документе, причем изделие рекламируется, распространяется или продается как один элемент для осуществления способов или анализов, описанных в настоящем документе.
Наборы, описанные в настоящем документе, содержат реагенты и/или компоненты, которые позволяют оценивать уровень активности репортера, например одного или более типов люциферазы. Такие реагенты содержат в дополнение к одноцепочечным полипептидам, например, буферные растворы, субстраты или промывные жидкости и т.п. Кроме того, набор может содержать некоторое количество нейротоксина, например BoNT, или люциферазы, которое можно использовать для калибровки набора или в качестве внутреннего контроля. Кроме того, набор может содержать брошюру с инструкциями и/или может предоставлять информацию относительно актуальности полученных результатов.
Для удобства ниже приведены значения некоторых терминов и фраз, использованных в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если не указано иное или иное не подразумевается из контекста, следующие термины и фразы имеют значения, приведенные ниже. Определения предоставле- 24 039761 ны для помощи в описании конкретных вариантов реализации и не предназначены для ограничения заявленного изобретения, поскольку объем изобретения ограничен только формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится данное изобретение. Если существует очевидное несоответствие между использованием термина в данной области техники и его определением, приведенным в настоящем документе, определение, приведенное в данном описании, имеет преимущество.
Для удобства здесь собраны определенные термины, употребляемые в настоящем описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения.
Термины уменьшение, снижение, сокращение или ингибирование используются здесь для обозначения уменьшения на статистически значимую величину. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, снижение, сокращение, или уменьшение, или ингибирование обычно означает уменьшение по меньшей мере на 10% по сравнению с эталонным уровнем (например, отсутствием данного лечения или агента) и может включать, например, уменьшение по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или более.
Термины увеличение, повышение, усиление или активация используются здесь для обозначения увеличения на статистически значимое значение. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, термины повышение, усиление или активация могут означать увеличение по меньшей мере на 10% по сравнению с эталонным уровнем, например, увеличение по меньшей мере на приблизительно 20%, или по меньшей мере приблизительно 30%, или по меньшей мере приблизительно 40%, или по меньшей мере приблизительно 50%, или по меньшей мере приблизительно 60%, или по меньшей мере приблизительно 70%, или по меньшей мере приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или увеличение до 100% включительно, или любое увеличение в диапазоне 10-100% по сравнению с эталонным уровнем, или по меньшей мере приблизительно 2-кратное, или по меньшей мере приблизительно 3-кратное, или по меньшей мере приблизительно 4-кратное, или по меньшей мере приблизительно 5-кратное, или по меньшей мере приблизительно 10кратное увеличение, или любое увеличение в диапазоне между 2-кратным и 10-кратным или более по сравнению с эталонным уровнем. В контексте маркера увеличение является статистически значимым увеличением уровня такого маркера.
В контексте настоящего документа термин субъект означает человека или животное. Обычно животное представляет собой позвоночное животное, такое как примат, грызун, домашнее животное или дикое животное. Приматы включают шимпанзе, яванских макак, паукообразных обезьян и макак, например макаку Резус. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и дикие животные включают коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, представителей семейства кошачьих, например домашнюю кошку, представителей семейства собачьих, например, собаку, лису, волка, представителей семейства птиц, например, курицу, эму, страуса, и рыб, например форель, сома и лосось. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, субъект представляет собой млекопитающее, например примата, например человека. Термины индивид, пациент и субъект применяют в данном документе взаимозаменяемо.
Предпочтительно субъект является млекопитающим. Млекопитающее может представлять собой человека, примата, не являющегося человеком, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову, но не ограничивается этими примерами. Отличные от людей млекопитающие могут быть преимущественно использованы в качестве субъектов, которые представляют животные модели ботулинической активности. Субъект может быть мужского или женского пола.
В контексте настоящего документа термин активность связывания означает, что одна молекула контактирует с другой молекулой посредством по меньшей мере одной межмолекулярной или внутримолекулярной силы, включая, без ограничения, ковалентную связь, ионную связь, металлическую связь, водородную связь, гидрофобное взаимодействие, взаимодействие Ван-дер-Ваальса и т.п. или любую их комбинацию. Связанный и связывать считаются терминами, относящимися к связыванию.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, одноцепочечный полипептид может быть выделенным или очищенным. Определение выделенный означает материал, который в той или иной степени свободен от компонентов, которые обычно присутствуют в его природном состоянии. Термин выделить обозначает степень отделения от исходного источника или окружения, например, из клетки или клеточного лизата.
Термин очищенный используется для обозначения вещества, такого как полипептид, которое яв
- 25 039761 ляется по существу чистым по отношению к другим компонентам препарата (например, другим полипептидам). Он может относиться к полипептиду, который с учетом иных компонентов имеет чистоту по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70% или 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%. Говоря иначе, термины по существу чистый или по существу очищенный в отношении полипептида относятся к препарату, который содержит менее чем приблизительно 20%, более предпочтительно менее чем приблизительно 15%, 10%, 8%, 7%, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее чем 1% одного или более других компонентов (например, других полипептидов или клеточных компонентов).
В контексте настоящего документа термин приведение в контакт относится к любому подходящему средству доставки или экспозиции образца или агента для воздействия одноцепочечного полипептида, описанного в настоящем документе (или клетки, содержащей указанный полипептид). Примеры способов доставки включают, без ограничений, непосредственную доставку к образцу или среде для культивирования клеток, перфузию, инъекцию или другой способ доставки, хорошо известный специалисту в данной области техники.
Термин образец или исследуемый образец в контексте настоящего документа обозначает образец, полученный или выделенный из любого источника, например биологического, относящегося к окружающей среде, промышленного или иного. Термин также включает смесь вышеупомянутых образцов. Термин исследуемый образец также включает необработанные или предварительно обработанные (или прошедшие предварительную обработку) образцы. Исследуемый образец может быть получен путем извлечения образца из источника, но также может быть получен с использованием ранее выделенного образца (например, выделенного в предшествующий момент времени тем же или другим лицом).
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, исследуемый образец может представлять собой необработанный исследуемый образец. В контексте настоящего документа фраза необработанный исследуемый образец относится к исследуемому образцу, который не подвергался предварительной обработке, за исключением разведения и/или суспендирования в растворе. Примеры способов обработки исследуемого образца включают, без ограничения, центрифугирование, фильтрацию, обработку ультразвуком, гомогенизацию, нагревание, замораживание и оттаивание и их комбинации. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, исследуемый образец может представлять собой замороженный исследуемый образец, например замороженный образец из окружающей среды, замороженный промышленный образец или замороженную ткань. Перед использованием способов, анализов и систем, описанных в настоящем документе, замороженный образец можно разморозить. После размораживания и перед использованием в способах, анализах и системах, описанных в настоящем документе, замороженный образец можно центрифугировать. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, исследуемый образец представляет собой осветленный исследуемый образец, полученный, например, посредством центрифугирования и сбора супернатанта. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, исследуемый образец может представлять собой предварительно обработанный исследуемый образец, например супернатант или фильтрат, полученный в результате обработки, выбранной из группы, состоящей из центрифугирования, фильтрации, размораживания, очистки и любых их комбинаций. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, исследуемый образец может быть обработан химическим и/или биологическим реагентом. Химические и/или биологические реагенты могут быть использованы для защиты и/или сохранения стабильности образца, в том числе находящихся в нем биомолекул (например, белка), во время обработки. Специалист в данной области техники хорошо знает способы и процессы, подходящие для предварительной обработки биологических образцов, необходимых для определения уровня продукта экспрессии, как описано в настоящем документе.
В контексте настоящего документа термин нервная клетка или нейрон относится к клеткам нервной системы, которые специализируются на приеме, обработке и передаче информации в виде нервных сигналов. Нейроны могут включать центральное тело клетки или сому и два типа отростков: дендриты, с помощью которых, как правило, большинство нервных сигналов передаются в тело клетки; и аксоны, с помощью которых, как правило, большинство нервных сигналов передаются от тела клетки к эффекторным клеткам, таким как нейроны-мишени или мышцы. Нейроны могут передавать информацию из тканей и органов в центральную нервную систему (афферентные или чувствительные нейроны) и передавать сигналы от центральной нервной системы к эффекторным клеткам (эфферентные или двигательные нейроны). Другие нейроны, называемые интернейронами, соединяют нейроны в пределах нервной системы.
В контексте настоящего документа термин специфический относится к конкретному взаимодействию между двумя молекулами (например, связыванию и/или расщеплению), где первый объект взаимодействует со вторым объектом-мишенью с большей специфичностью и аффинностью, чем он взаимодействует с третьим объектом, не являющимся мишенью. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, определение специфическое может относиться к взаимо
- 26 039761 действию первого объекта со вторым объектом-мишенью, которое по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз или больше превышает взаимодействие с третьим объектом, не являющимся мишенью. Реагент, специфичный для данной мишени, представляет собой реагент, который демонстрирует, например, специфическое связывание с этой мишенью в условиях используемого анализа или специфическое расщепление последовательности-мишени в условиях используемого анализа.
В контексте настоящего документа термины белок и полипептид используются взаимозаменяемо для обозначения ряда аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями между α-амино- и карбоксигруппами соседних остатков. Термины белок и полипептид относятся к полимеру из аминокислот, включающему модифицированные аминокислоты (например, фосфорилированные, гликированные, гликозилированные и т.п.) и аналоги аминокислот, независимо от их размера или функции. Термины белок и полипептид часто используются в отношении относительно крупных полипептидов, тогда как термин пептид часто используется в отношении небольших полипептидов, но использование этих терминов в данной области техники частично совпадает. Термины белок и полипептид при ссылке на генный продукт и его фрагменты используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Таким образом, примеры полипептидов или белков включают генные продукты, встречающиеся в природе белки, гомологи, ортологи, паралоги, фрагменты и другие эквиваленты, варианты, фрагменты и аналоги вышеизложенного.
В различных вариантах реализации, описанных в настоящем документе, дополнительно предусмотрено включение вариантов (природных или иных), аллелей, гомологов, консервативно модифицированных вариантов и/или вариантов с консервативной заменой любого из конкретных описанных полипептидов. В отношении аминокислотных последовательностей специалисту будет понятно, что отдельные замены, делеции или добавления к последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, являются консервативно модифицированным вариантом, в котором изменение приводит к замене аминокислоты химически сходной аминокислотой и сохраняет желаемую активность полипептида. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнением и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели, согласующиеся с настоящим раскрытием.
Данную аминокислоту можно заменить остатком, имеющим сходные физико-химические характеристики, например заменить один алифатический остаток другим (например, заменить друг на друга Ile, Val, Leu или Ala), или заменить один полярный остаток другим (например, провести замену между Lys и Arg; Glu и Asp; или Gln и Asn). Хорошо известны другие такие консервативные замены, например замены целых областей, имеющих сходные характеристики гидрофобности. Полипептиды, содержащие консервативные аминокислотные замены, можно протестировать в любом из описанных в настоящем документе, анализов, чтобы подтвердить сохранение желаемой активности, например активности связывания полипептида, и специфичности природного или эталонного полипептида.
Аминокислоты могут быть разделены на группы на основании сходства свойств их боковых цепей (описано в публикации A.L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) кислые: Asp (D), Glu (E); (4) основные: Lys (K), Arg (R), His (H). В качестве альтернативы встречающиеся в природе аминокислотные остатки могут быть разделены на группы на основании общих свойств боковых цепей: (1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислые: Asp, Glu; (4) основные: His, Lys, Arg; (5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Неконсервативные замены влекут за собой замену представителя одного из данных классов на представителя другого класса. Конкретные консервативные замены включают, например, замену Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Ile или на Leu.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид, описанный в настоящем документе (или нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид), может представлять собой функциональный фрагмент одной из аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе. В контексте настоящего документа термин функциональный фрагмент представляет собой фрагмент или сегмент пептида, который по результатам анализов, описанных ниже в настоящем документе, сохраняет по меньшей мере 50% активности эталонного полипептида дикого типа. Функциональный фрагмент может содержать консервативные замены последовательностей, раскрытых в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид, описанный в настоящем документе, может представлять собой вариант последовательности, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вариант представляет собой консервативно модифицированный вариант. Вариан
- 27 039761 ты с консервативной заменой могут быть получены, например, посредством мутаций нуклеотидных последовательностей. Вариант, упомянутый в настоящем документе, представляет собой полипептид, по существу, гомологичный природному или эталонному полипептиду, но имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности природного или эталонного полипептида одним или множеством из делеций, вставок или замен. Последовательности ДНК, кодирующие вариант полипептида, охватывают последовательности, содержащие одно или более добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с природной или эталонной последовательностью ДНК, но которые кодируют вариантный белок или его фрагмент, который при этом сохраняет активность. В данной области техники известно широкое разнообразие подходов сайт-специфического мутагенеза на основе ПЦР, которые могут применять специалисты в данной области.
Вариант аминокислотной или ДНК-последовательности может быть идентичен природной или эталонной последовательности по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или более.
Степень гомологии (процентной идентичности) между природной и мутантной последовательностями можно определить, например, путем сравнения двух последовательностей с использованием свободно доступных в сети Интернет компьютерных программ, обычно используемых для этой цели (например, BLASTp или BLASTn с настройками по умолчанию).
Изменения природной аминокислотной последовательности могут быть выполнены любым из ряда способов, известных специалисту в данной области техники. Мутации могут быть введены, например, в определенные локусы посредством синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированных сайтами рестрикции, позволяющими лигирование с фрагментами природной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует аналог, имеющий желаемую аминокислотную вставку, замену или делецию.
Альтернативно, процедуры олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза могут быть использованы для получения измененной нуклеотидной последовательности, имеющей конкретные кодоны, измененные в соответствии с необходимостью замены, делеции или вставки. Методы выполнения таких изменений очень хорошо разработаны и включают, например, те, которые раскрыты в публикации Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); и в патентах США №№ 4518584 и 4737462, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании надлежащей конформации полипептида, также может быть замещен, как правило, серином, для улучшения устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного сшивания. И наоборот, цистеиновая(ые) связь(и) может(могут) быть добавлена(ы) к полипептиду для улучшения его стабильности или облегчения олигомеризации.
В контексте настоящего документа термин нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относится к любой молекуле, предпочтительно полимерной молекуле, включающей звенья рибонуклеиновой кислоты, дезоксирибонуклеиновой кислоты или их аналога. Нуклеиновая кислота может быть либо одноцепочечной, либо двухцепочечной. Одноцепочечная нуклеиновая кислота может представлять собой одну цепь нуклеиновой кислоты из денатурированной двухцепочечной ДНК. Альтернативно, она может представлять собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту, не происходящую из какой-либо двухцепочечной ДНК. В одном аспекте нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК. В другом аспекте нуклеиновая кислота может представлять собой РНК. Подходящая ДНК может представлять собой, например, геномную ДНК или кДНК. Подходящая РНК может представлять собой, например, мРНК.
В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, полипептид, нуклеиновая кислота или клетка, описанная в настоящем документе, может быть сконструированной. В контексте настоящего документа термин сконструированный относится к аспекту вмешательства человека. Например, полипептид рассматривается как сконструированный, когда по меньшей мере один аспект полипептида, например, его последовательность, подвергался вмешательству человека для получения отличий от этого аспекта в том виде, в котором он существует в природе. Как обычно применяется на практике и понятно специалистам в данной области техники, потомство сконструированной клетки обычно все еще называют сконструированным, даже если фактическое вмешательство выполняли на предшествующем объекте.
В контексте настоящего документа термин вектор относится к конструкции нуклеиновой кислоты, предназначенной для доставки в клетку-хозяина или для переноса между разными клеткамихозяевами. В контексте настоящего документа вектор может быть вирусным или невирусным. Термин вектор охватывает любой генетический элемент, который способен к репликации, когда связан с надлежащими контрольными элементами, и который может переносить последовательности генов в клетки. Вектор может представлять собой, без ограничения, вектор клонирования, вектор экспрессии, плазмиду, фаг, транспозон, космиду, хромосому, вирус, вирион и т.п.
- 28 039761
В контексте настоящего документа термин вектор экспрессии относится к вектору, который направляет экспрессию РНК или полипептида из последовательностей, связанных с транскрипционными регуляторными последовательностями в векторе. Экспрессируемые последовательности часто, но не обязательно, будут гетерологичными для клетки. Вектор экспрессии может содержать дополнительные элементы, например, вектор экспрессии может иметь две системы репликации, что позволяет поддерживать его в двух организмах, например в клетках человека для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Термин экспрессия относится к клеточным процессам, участвующим в продуцировании РНК и белков и, при необходимости, секретирующих белков, включая, где это применимо, без ограничений, например, транскрипцию, процессинг транскрипта, трансляцию и укладку белка, модификацию и процессинг. Продукты экспрессии включают РНК, транскрибируемую с гена, и полипептиды, полученные путем трансляции мРНК, транскрибированной с гена. Термин ген означает последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК), которая при функциональной связи с соответствующими регуляторными последовательностями транскрибируется в РНК in vitro или in vivo. Ген может содержать или не содержать области, предшествующие кодирующей области и следующие за ней, например 5'-нетранслируемые (5'UTR) или лидерные последовательности и 3'UTR или конечные последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).
В контексте настоящего документа термин вирусный вектор относится к векторной конструкции из нуклеиновых кислот, которая содержит по меньшей мере один элемент вирусного происхождения и обладает способностью упаковываться в частицу вирусного вектора. Вирусный вектор может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, описанный в настоящем документе, вместо несущественных вирусных генов. Вектор и/или частица могут быть использованы с целью переноса любых нуклеиновых кислот в клетки in vitro или in vivo. В данной области техники известны многочисленные формы вирусных векторов.
Под рекомбинантным вектором подразумевается вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты или трансген, который способен к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в настоящем документе, в некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, могут комбинироваться с другими подходящими композициями и терапевтическими средствами. В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, описанных в настоящем документе, вектор является эписомальным. Использование подходящего эписомального вектора обеспечивает средства поддержания интересующего нуклеотида в организме субъекта или в клетке во внехромосомной ДНК с высоким числом копий, таким образом устраняя потенциальные эффекты интеграции хромосом.
Термин статистически значимый или значительный относится к статистической значимости и, по существу, означает различие, соответствующее двум стандартным отклонениям (2 CO) или больше.
За исключением рабочих примеров или там, где указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов или условия реакции, использованные в настоящем документе, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином приблизительно. Термин приблизительно при использовании с процентными величинами может означать ±1%.
В контексте настоящего документа термин содержащий или содержит используется в отношении композиций, способов и их соответствующего(их) компонента(ов), важного(ых) для способа или композиции, но является открытым для включения неуточненных элементов, существенных или несущественных.
Термин состоящий из относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам, описанным в настоящем документе, которые исключают любой элемент, не указанный в этом описании варианта реализации.
В контексте настоящего документа термин состоящий по существу из относится к тем элементам, которые требуются для данного варианта реализации. Этот термин допускает присутствие элементов, которые не оказывают существенного влияния на основную(ые) и новую(ые) или функциональную(ые) характеристику(и) этого варианта реализации.
В контексте настоящего документа термин соответствующий относится к аминокислоте или нуклеотиду в пронумерованном положении в первом полипептиде или нуклеиновой кислоте, или к аминокислоте или нуклеотиду, который эквивалентен пронумерованной аминокислоте или нуклеотиду во втором полипептиде или нуклеиновой кислоте. Эквивалентные пронумерованные аминокислоты или нуклеотиды могут быть определены путем выравнивания последовательностей-кандидатов с использованием программ определения степени гомологии, известных в данной области, например BLAST.
Формы единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, если в контексте явно не указано иное. Подобным образом, слово или предназначено для охвата и, если в контексте явно не указано иное. Хотя на практике или при тестировании этого изобретения могут использоваться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, ниже описываются подходящие способы и материалы. Слово например используется в настоящем документе для обозначения примера, не имеющего ограничительного характера. Таким образом, слово например
- 29 039761 является синонимом выражения в качестве примера.
Если в настоящем документе не дано другое определение, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящей заявкой, имеют значения, обычно принятые специалистами в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, реагентами и т.п., описанными в данном документе, поскольку таковые могут изменяться. Используемая в настоящем документе терминология применяется только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определен исключительно формулой изобретения. Определения общепринятых терминов в области иммунологии и молекулярной биологии можно найти в публикациях The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, опубликованной Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, опубликованной Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, опубликованной Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CpMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; и Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Другие термины определены в настоящем документе в описании различных аспектов изобретения.
Все патенты и другие публикации, включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки, процитированные в настоящей заявке, специально включены в настоящее описание посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут использоваться в связи с технологией, описанной в настоящем документе. Эти публикации представлены исключительно с целью их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этом отношении не следует интерпретировать как признание того, что изобретатели не имеют права датировать такое описание более ранним числом в силу более раннего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или представления содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не представляют собой какого-либо признания в отношении правильности дат или содержания этих документов.
Описание вариантов реализации изобретения не предназначено для того, чтобы быть исчерпывающим или ограничивать изобретение его точной раскрытой формой. Хотя конкретные варианты реализации и примеры раскрытия описаны в настоящем документе в иллюстративных целях, возможны различные эквивалентные модификации в пределах объема раскрытия, как будет понятно специалистам в соответствующей области техники. Например, в то время как стадии способа или функции представлены в заданном порядке, альтернативные варианты реализации могут выполнять функции в другом порядке, или функции могут выполняться, по существу, одновременно. При необходимости, идеи изобретения, предоставленные в настоящем документе, могут быть применены к другим процедурам или способам. Различные варианты реализации, описанные выше, можно объединять, получая дополнительные варианты реализации. Аспекты изобретения могут быть, при необходимости, модифицированы для использования композиций, функций и концепций вышеупомянутых ссылок и видов применения, чтобы обеспечить дополнительные варианты реализации изобретения. Кроме того, из соображений биологической функциональной эквивалентности могут быть сделаны некоторые изменения в структуре белка, не влияющие на биологическое или химическое действие в качественном или количественном отношении. В свете подробного описания в данное изобретение можно вносить указанные и другие изменения. Подразумевается, что такие модификации включены в объем прилагаемой формулы изобретения.
Конкретные элементы любого из вышеупомянутых вариантов реализации могут быть объединены или заменены элементами из других вариантов реализации. Кроме того, в то время как преимущества, связанные с некоторыми вариантами реализации изобретения, были описаны в контексте этих вариантов реализации, другие варианты реализации также могут демонстрировать такие преимущества, и при этом не все варианты реализации обязательно должны демонстрировать такие преимущества, чтобы попадать в пределы объема изобретения.
Описанная в настоящем документе технология дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не следует истолковывать как дополнительные ограничения.
- 30 039761
Примеры
Пример 1. Новые in vitro и клеточные анализы измерения активности ботулинических нейротоксинов.
Ботулинические нейротоксины - это семейство, состоящее из семи бактериальных токсинов (BoNT/A-G). Они являются одним из шести потенциальных агентов биотерроризма категории A. Эти токсины также широко используются для лечения растущего списка заболеваний, причем спрос на них составляет более двух миллиардов долларов. Обнаружение и определение характеристик BoNT основывались на классическом анализе с летальной дозой у мышей (LD50). Как в целях биологической защиты, так и для разработки лекарственных препаратов, существует острая необходимость заменить анализ на животных более удобными, чувствительными и точными анализами in vitro и клеточными анализами.
В настоящее время доступны разработанные анализы для обнаружения и определения характеристик активности токсинов in vitro, имеющие различную чувствительность. Существует два основных коммерческих анализа, оба из которых основаны на обнаружении флуоресценции при расщеплении субстратов ферментативным доменом токсинов. Первым из этих анализов является SNAPtide™ (List Biologics), включающий использование синтетических пептидов, содержащих природный участок расщепления для BoNT и меченных двумя флуоресцентными красителями. Сигналы флуоресценции между двумя красителями обычно гасятся, а когда пептид расщепляется BoNT, сигналы усиливаются. Второй анализ BoTest™ (BioSentinel LLC). Голубой флуоресцентный белок (CFP) через пептидную последовательность связан с желтым флуоресцентным белком (YFP). Расщепление линкера нейротоксином BoNT прекращает резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) между CFP и YFP, что можно обнаруживать.
Оба анализа обеспечивают чувствительные и удобные способы обнаружения токсинов и определения характеристик активности токсинов и в настоящее время широко используются в лабораториях. Существенным недостатком этих анализов является то, что эти флуоресцентные анализы подвержены влиянию белков сывороточного альбумина, присутствующих в высоких концентрациях в фармацевтических препаратах токсинов и клинических образцах. Текущее решение состоит в том, чтобы перед проведением анализов флуоресценции очищать образцы от этих токсинов с помощью специфических антител к токсинам, но это значительно увеличивает стоимость анализа и требует применения специальных агентов (антител к токсинам), которые не являются легкодоступными.
В настоящее время для количественной оценки активности токсинов фармацевтические компании ежегодно используют большое количество мышей. Существует острая необходимость в разработке клеточного анализа для замены биоанализа, проводимого на мышах, чтобы уменьшить использование животных для производства BoNT. Клеточные анализы дают возможность исследовать все аспекты активности токсина, включая связывание рецептора, транслокацию мембраны и ферментативную активность. Эти аспекты не учитываются ни одним из анализов in vitro. В настоящее время существует только один хорошо зарекомендовавший себя клеточный анализ, разработанный крупной фармацевтической компанией (Allergan). Этот анализ представляет собой анализ типа иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на использовании моноклонального антитела, которое распознает белок SNAP-25, расщепленный BoNT/A. Коротко, клетки подвергают воздействию BoNT/A, и расщепленный SNAP-25 извлекают и иммобилизуют с помощью специального антитела, которое распознает только расщепленный SNAP-25, но не полноразмерный белок. После этого иммобилизованный SNAP-25 обнаруживают с помощью второго антитела к SNAP-25. Этот анализ обеспечивает хорошую чувствительность и потенциально может заменить анализ на мышах. Он был одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для количественного определения токсинных продуктов. Основным недостатком является то, что этот анализ основан на применении специализированного антитела, производимого компанией Allergan.
Альтернативные анализы, которые находятся в стадии разработки, включают использование в клетках в качестве субстрата CFP-SNAP-25-YFP (BioSentinel LLC). Расщепление этого гибридного белка в клетках прекращает сигналы FRET между CFP и YFP. Основным недостатком является то, что для проведения этого анализа также требуется сложное оборудование, такое как флуоресцентный микроскоп.
В настоящем документе описан новый анализ, разработанный для обнаружения и измерения активности BoNT in vitro и in vivo. Анализ основан на разработке сплит-формы люциферазы. Люцифераза NANOLUC™ представляет собой новое поколение люциферазы с превосходной стабильностью белка и значительным усилением люминесцентных сигналов (>100-кратное усиления по сравнению с классической люциферазой светлячка). Эта люцифераза может разделяться на две части. Когда эти две части находятся близко друг к другу, они могут воссоздавать полную активную форму, генерирующую люминесцентные сигналы. При отделении этих двух частей друг от друга люминесцентные сигналы прекращаются. В иллюстративном варианте реализации, показанном на фиг. 1, линкерную область, полученную из субстратов токсинов (SNAP-25 для BoNT/A, E и C, синаптобревин для BoNT/B, D, F, G) вставляют между двумя фрагментами люциферазы NANOLUC™ . Расщепление этой линкерной области нейротоксинами BoNT разделяет два фрагмента люциферазы NANOLUC™ и устраняет их активность, что приводит к ослаблению люминесцентных сигналов. Чтобы продемонстрировать осуществимость этого подхо
- 31 039761 да, были разработаны и испытаны представленные ниже датчики токсинов.
In vitro датчики токсинов. Были созданы и испытаны три различных прототипа датчиков токсинов in vitro (фиг. 2A-2B, 3A-3B). Первый датчик содержит фрагмент SNAP-25, который может быть расщеплен BoNT/A, E и C между двумя фрагментами сплит-люциферазы NANOLUC™ (N-nano и C-nano соответственно, фиг. 2A-2B). Второй датчик содержит дополнительный фрагмент SV2C, служащий рецептором токсина, который может повышать эффективность расщепления за счет усиления взаимодействия между токсинами и датчиком. Третий вариант содержит фрагмент синаптобревина, который может расщепляться посредством BoNT/B, D, F и G (фиг. 3A-3B).
Эти сенсорные белки были очищены как рекомбинантные белки. Два варианта датчиков, содержащих SNAP-25, инкубировали с градиентом концентраций BoNT/A в течение 4 или 24 ч. Измеряли оставшуюся люциферазную активность и строили график, как показано на фиг. 2A. В качестве контроля было обнаружено, что BoNT/B не влиял на люциферазную активность этих двух датчиков, демонстрируя специфичность этих двух датчиков для BoNT/A. Как показано на фиг. 2B, датчик, содержащий фрагмент SV2C имел после 4 ч инкубации значение EC50 на уровне 9,7 пМ. Это приблизительно в 5 раз превышает чувствительность датчика без SV2C, что указывает на то, что включение фрагмента токсинных рецепторов может привести к получению более чувствительного датчика токсинов.
Третий сенсорный белок инкубировали с градиентом BoNT/B. Измеряли оставшуюся люциферазную активность и строили график, как показано на фиг. 3A. Значение EC50, представленное на фиг. 3B, составляло после 4 ч инкубации 75,7 пМ. Инкубация токсинов с датчиком в течение 24 ч значительно улучшила показатель EC50 до 3,9 пМ.
Преимущество по сравнению с доступными датчиками in vitro. Эти датчики токсинов на основе люциферазы обеспечивает ту же чувствительность, что и датчики на основе флуоресценции. Основным преимуществом этих датчиков на основе сплит-люциферазы является то, что на них не влияет присутствие белков сывороточного альбумина.
Клеточный анализ. Иллюстративный вариант реализации датчика для клеточных анализов показан на фиг. 4. Между фрагментами сплит-люциферазы NANOLUC™ он содержит полноразмерный белок SNAP-25. Кроме того, между N-nano и SNAP-25 он также содержит люциферазу светлячка, которая обеспечивает внутренний контроль уровней экспрессии сенсорных белков в клетках. Этот сенсорный белок экспрессируется в нейронах посредством инфекции, опосредованно лентивирусом. Затем нейроны подвергали воздействию различных концентраций BoNT/A. Через 48 ч собирали клеточные лизаты и измеряли люциферазную активность как для люциферазы светлячка, так и для люциферазы NANOLUC™. Уровни люциферазы NANOLUC™ нормализовали с использованием сигналов люциферазы светлячка, а затем нормализовали по контрольным нейронам, которые не подвергались воздействию каких-либо токсинов (фиг. 4). Инкубация нейронов с токсинами уменьшает сигналы люциферазы NANOLUC™ (фиг. 4) с показателем EC50 2,9 пМ.
Преимущества по сравнению с доступными клеточными анализами. Описанный в настоящем документе анализ обеспечивает чувствительность, подобную чувствительности анализа не основе ИФА, разработанного компанией Allergan. Основным преимуществом данного анализа является то, что для его проведения не требуется наличие каких-либо специальных антител. Его выполнение также является более простым, дешевым и быстрым, чем выполнение анализа ИФА.
В настоящем документе конкретно предполагается, что анализы на основе датчиков токсинов и клеточные анализы, описанные в настоящем документе, предлагают фармацевтическим компаниям более быстрые, дешевые и более простые способы измерения и количественного определения активности BoNT/A и BoNT/B, потенциально заменяя биоанализ на мышах.
In vitro и in vivo конструкции для обнаружения BoNT. Для обнаружения BoNT/A конструкцию клонировали в вектор рЕТ28а с NocI/NotI, и при этом вставки представляли собой Nnano-SV2C(529-566)G4S-SNAP25(141-206)-Cnano и Nnano-SNAP25(141-206)-Cnano (G4S раскрыт как SEQ ID NO: 6). Последовательность сплит-люциферазы NANOLUC™ доступна от компании Promega. Для получения полных вставок использовали ПЦР с перекрытием, а после этого вставки лигировали в разрезанный вектор. Для обнаружения BoNT/B конструкция представляла собой Nnano-VAMP(35-96)-Cnano.
Для обнаружения BoNT/A были разработаны конструкции либо с использованием сплитлюциферазы светлячка, либо сплит-люциферазы NANOLUC, затем в качестве внутреннего контроля по отдельности применяли люциферазу полипов Renilla и люциферазу светлячка. Внутренний контроль расположен прямо перед белком SNAP25 (полноразмерным). Вектор был основан на pcDNA3.1 и лентивирусных векторах syn-lox.
Клонирование конструкций для анализа in vitro.
Датчик 1: NNano-SV2C-p25-Cnano.
NcoI-Nnano(1-159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-SV2C(529-566)-GGGGS-P25(141-206)-EcoRIGSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-стоп (GSSGGGGSGGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 4, GGGGS раскрыт как SEQ ID NO: 6, GSSGGGGSGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 5 и His6 раскрыт как SEQ ID NO: 12).
- 32 039761
Датчик 2: NNano-p25-Cnano.
NcoI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-p25(141-206)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSGCnano(160-170)-NotI-His6-стoп (GSSGGGGSGGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 4, GSSGGGGSGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 5 и His6 раскрыт как SEQ ID NO: 12).
Датчик 3: NNano-hVAMP1-Cnano.
NcoI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-челoвечесkий VAMP1(35-96)-EcoRIGSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-стoπ (GSSGGGGSGGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 4, GSSGGGGSGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 5 и His6 раскрыт как SEQ ID NO: 12).
Клонирование конструкции для анализа in vivo.
BamHI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGSSG-SacI-Firefly(пoлнoразмерн.)-GGGGS-p25(пoлнoразмерн.)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI (стоп-кодон) (GGGGS раскрыт как SEQ ID NO: 6 и GSSGGGGSGGGSSG раскрыт как SEQ ID NO: 5).
Очистка сенсорных белков с помощью IMAC для анализа in vitro. Очищали различные конструкции сенсорных белков, используя колонки для металл-аффинной хроматографии (IMAC). Метку His6 (SEQ ID NO: 12) клонировали в вектор рЕТ28а на С-конце. BL21, содержащий правильную плазмиду конструкции in vitro, инокулировали в течение ночи и культивировали при 37°C до ОП около 0,6-0,8, затем индуцировали с использованием 0,25 мМ IPTG (конечная концентрация) в течение ночи при 20°C. Клетки собирали посредством центрифугирования с ускорением 4500 g в течение 10 мин. После этого осадки клеток растворяли в буфере 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4 с последующей обработкой ультразвуком в течение 3 мин. Сохраняли супернатант клеточного лизата и смешивали с помощью сфер Ni2+B течение 1 ч с вращением при 4°C. Позже смесь загружали в колонку, и промывали смолу 10-кратным объемом буфера 20 мМ имидизола в 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4 в сравнении со слоем колонки. Наконец, белок элюировали в 4-кратном объеме буфера 500 мМ имидизола в 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4 в сравнении со слоем колонки. Очищенный сенсорный белок подвергали диализу в 50 мМ буфере HEPES, pH 7,1, для немедленного проведения анализа.
In vitro анализ обнаружения токсинов. Концентрацию сенсорного белка оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) с использованием в качестве эталона стандартного БСА. Готовили 30 нМ сенсорного белка в буфере 50 мМ HEPES, 20 мкМ ZnCl2, 2 мМ ДТТ, 1 мг/мл БСА, рН 7,1. Ботулинический токсин A разбавляли и добавляли в раствор сенсорного белка с рядом концентраций от 1 нМ до 1 фМ с коэффициентом разведения 10. После 4 и 24 ч инкубации при 37°C в каждый образец добавляли одинаковый объем субстрата NanoGlo™ (Promega). Люминесцентный сигнал измеряли в спектрофотометре для считывания планшетов. Анализ был выполнен в двух повторах. Также были разработаны и получены отрицательные контроли. BoNT/A смешивали с сенсорным белком Nnano-VAMP-Cnano, или BoNT/B смешивали с сенсорным белком Nnano-SV2C-p25-Cnano.
In vivo анализ (клеточный анализ) обнаружения токсинов. Вирус двойной конструкции люциферазы (люциферазы светлячка в качестве внутреннего контроля и сплит-люциферазы NANOLUC™ для обнаружения расщепления) добавляли в 7-дневные нейронные клетки, а затем в 13-дневные нейронные клетки добавляли ботулинический токсин A с последовательностью разведений концентрации от 300 до 1 пМ в трех повторах. После 48 ч воздействия токсином нейронные клетки подвергали лизису путем добавления 200 мкл буфера для пассивного лизиса (Promega) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. 50 мкл клеточного лизата смешивали с 50 мкл субстрата люциферазы светлячка (реагент ONE-Glo (TM) EX) и измеряли испускание света. Затем добавляли 50 мкл субстрата люциферазы NANOLUC™ (реагент NanoDLR™ Stop & Glo (R)) и измеряли испускание света.
SEQ ID NO: Описание Последовательность
23 Белок SNAP25 человека UniProtKB - Р60880 (SNP25_HUMAN) MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEES KDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNL TDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGWASQP ARWDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGI IGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEA NQRATKMLGSG
24 Белок VAMP-1 человека MSAPAQPPAEGTEGTAPGGGPPGPPPNMTSNRRLQQTQA QVEEWDIIRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQ
- 33 039761
UniProtKB Р23763 (VAMP1_HUMAN) : FESSAAKLKRKYWWKNCKMMIMLGAICAIIWVIVIYFF T
25 Белок VAMP-2 человека UniProtKB P63027 (VAMP2_HUMAN) MSATAATAPPAAPAGE GGPPAP P PNL T SNRRLQQT QAQV DEWDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFE T SAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST
26 Белок VAMP-3 человека UniProtKB Q15836 (VAMP3_HUMAN) : MSTGPTAATGSNRRLQQTQNQVDEWDIMRVNVDKVLER DQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNCKM WAIGITVLVIFI1111VWVVS S
27 Синтаксин IA человека UniProtKB Q16623 (STX1A_HUMAN) MKDRTQELRTAKDSDDDDDVAVTVDRDRFMDEFFEQVEE IRGFIDKIAENVEEVKRKHSAILASPNPDEKTKEELEEL MSDIKKTANKVRSKLKSIEQSIEQEEGLNRSSADLRIRK TQHSTLSRKFVEVMSEYNATQSDYRERCKGRIQRQLEIT GRTTTSEELEDMLESGNPAIFASGIIMDSSISKQALSEI ETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIE YNVEHAVDYVERAVSDTKKAVKYQSKARRKKIMIIICCV ILGIVIASTVGGIFA
28 Синтаксин IB человека mkdrtqelrs akdsddeeev vhvdrdhfmd effeqveeir gcieklsedv eqvkkqhsai laapnpdekt kqeledltad ikktankvrs klkaieqsie qeeglnrssa dlrirktqhs tlsrkfvevm teynatqsky rdrckdriqr qleitgrttt neeledmles gklaiftddi kmdsqmtkqa Ineietrhne iikletsire Ihdmfvdmam Ivesqgemid rieynvehsv dyveravsdt kkavkyqska rrkkimiiic cvvlgvvlas siggtlgl
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Одноцепочечный полипептид для обнаружения и/или измерения наличия, силы и/или активности нейротоксина, содержащий от N-конца к С-концу
    а) N-концевой фрагмент репортерного белка;
    Ь) линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином С. Botulinum (BoNT); и
    с) С-концевой фрагмент репортерного белка;
    причем N-концевой и С-концевой фрагменты вместе содержат функциональную последовательность репортерного белка, когда фрагменты объединены линкером, и не содержат ее, когда линкер был расщеплен на участке расщепления.
  2. 2. Одноцепочечный полипептид по п.1, отличающийся тем, что репортерный белок представляет собой белок люциферазы.
  3. 3. Одноцепочечный полипептид по п.1, в котором
    i) N-концевой фрагмент содержит последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью последовательности с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nanoi.159); и
    С-концевой фрагмент содержит последовательность по меньшей мере с 90% идентичностью последовательности с аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano^o-uo);
    ii) N-концевой фрагмент содержит последовательность, имеющую замены, делеции или вставки менее чем в 10 аминокислотных остатках по сравнению с аминокислотами 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (N-nanoi.159); и
    С-концевой фрагмент содержит последовательность, имеющую замены, делеции или вставки менее чем в 3 аминокислотных остатках по сравнению с аминокислотами 160-170 люциферазы с SEQ ID NO: 1 (C-nano 160-170) ·
  4. 4. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что N-концевой фрагмент имеет последовательность аминокислот 1-159 люциферазы с SEQ ID NO: 1
    -34039761 (N-nano1.159), а C-концевой фрагмент имеет последовательность аминокислот 160-170 люциферазы с SEQ
    ID NO: 1 (C-nano160.170).
  5. 5. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что участок расщепления BoNT распознается BoNT серотипа A, E, C, B, D, F или G.
  6. 6. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что
    i) участок расщепления BoNT получен из белка SNARE;
    ii) участок расщепления BoNT получен из белка SNARE, и белок SNARE представляет собой SNAP-25, синаптобревин (VAMP) или синтаксин;
    iii) участок расщепления BoNT представляет собой аминокислоты 141-206 белка SNAP-25b человека;
    iv) участок расщепления BoNT представляет собой аминокислоты 35-96 белка VAMP1 человека; или
    v) участок расщепления BoNT представляет собой аминокислоты 1-206 белка SNAP-25b человека.
  7. 7. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что
    i) линкер дополнительно содержит фрагмент, связывающий нейротоксин; или ii) линкер дополнительно содержит фрагмент, связывающий нейротоксин, и фрагмент, связывающий нейротоксин, расположен между N-концевым фрагментом и сайтом расщепления BoNT.
  8. 8. Одноцепочечный полипептид по п.7, отличающийся тем, что фрагмент, связывающий нейротоксин, представляет собой рецептор BoNT человека, мыши, крысы или примата.
  9. 9. Одноцепочечный полипептид по п.8, отличающийся тем, что рецептор BoNT
    i) представляет собой SV2C;
    ii) содержит аминокислоты 529-566 SV2C;
    iii) содержит аминокислоты 32-52 SV2C;
    iv) представляет собой SV2C или
    v) содержит аминокислоты 40-60 SV2C.
  10. 10. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что
    i) линкер дополнительно содержит интактный второй люциферазный полипептид, расположенный между N-концевым фрагментом или доменом и участком расщепления BoNT; или ii) линкер дополнительно содержит интактный второй люциферазный репортерный полипептид, расположенный между N-концевым фрагментом и сайтом расщепления BoNT, и отличающийся тем, что второй люциферазный репортерный полипептид представляет собой люциферазу светлячка (например, Photinus pyralis), бактериальную люциферазу (например, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi), люциферазу полипов Renilla (Renilla reniformis), люциферазу динофлагеллятов, люциферазу Gaussia или люциферазу копеподов.
  11. 11. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий полигистидиновую аффинную метку.
  12. 12. Одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что линкер дополнительно содержит один или более спейсеров, расположенных между сайтом расщепления BoNT и N-концевым фрагментом, один или более спейсеров, расположенных между сайтом расщепления BoNT и C-концевым фрагментом, или их комбинацию.
  13. 13. Одноцепочечный полипептид по п.7, отличающийся тем, что линкер дополнительно содержит:
    i) один или болеее спейсеров, расположенных между фрагментом, связывающим нейротоксин, и Nконцевым фрагментом; или ii) один или более спейсеров, расположенных между фрагментом, связывающим нейротоксин, и сайтом расщепления BoNT.
  14. 14. Одноцепочечный полипептид по п.10, отличающийся тем, что линкер дополнительно содержит один или более спейсеров, расположенных между вторым люциферазным репортерным полипептидом и участком расщепления BoNT.
  15. 15. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный полипептид по любому из предшествующих пунктов.
  16. 16. Полинуклеотидный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.15.
  17. 17. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.15.
  18. 18. Способ определения активности нейротоксина С. Botulinum (BoNT), включающий:
    а) приведение в контакт BoNT с одноцепочечным полипептидом в условиях, подходящих для проявления активности BoNT; где одноцепочечный полипептид содержит:
    i) N-концевой фрагмент репортерного белка;
    ii) линкер, содержащий участок расщепления BoNT;
    iii) C-концевой фрагмент репортерного белка;
    причем N-концевой и C-концевой фрагменты вместе содержат функциональную последовательность репортерного белка, когда фрагменты объединены линкером, и не содержат ее, когда линкер был расщеплен на участке расщепления; и
    b) определение репортерной активности полипептида по сравнению с эталоном, определяя таким
    - 35 039761 образом активность.
  19. 19. Способ определения активности нейротоксина С. botulinum (BoNT) в образце, включающий:
    а) приведение в контакт образца с одноцепочечным полипептидом в условиях, подходящих для проявления активности BoNT, где одноцепочечный полипептид содержит:
    i) N-концевой фрагмент репортерного белка;
    ii) линкер, содержащий участок расщепления BoNT;
    iii) C-концевой фрагмент репортерного белка;
    причем N-концевой и C-концевой фрагменты вместе содержат функциональную последовательность репортерного белка, когда фрагменты объединены линкером, и не содержат ее, когда линкер был расщеплен на участке расщепления; и
    b) определение репортерной активности полипептида по сравнению с люциферазной активностью полипептида при отсутствии образца, причем снижение люциферазной активности указывает на активность BoNT в образце.
  20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что одноцепочечный полипептид экспрессируется нервной клеткой, и способ после стадии контактирования дополнительно включает инкубацию нервных клеток в течение периода времени от приблизительно 12 ч до приблизительно 60 ч и сбор лизата из нервных клеток.
  21. 21. Набор для обнаружения и/или измерения наличия, силы и/или активности нейротоксина, содержащий:
    а) один или более одноцепочечных полипептидов, описанных в любом из пп.1-14, причем каждый одноцепочечный полипептид или комбинация одноцепочечных полипептидов упакованы в отдельный контейнер;
    b) одну или более нуклеиновых кислот или нуклеотидных векторов, содержащих нуклеотидную последовательность, которая кодирует один или более одноцепочечных полипептидов из a), причем каждая нуклеиновая кислота или комбинация нуклеиновых кислот или нуклеотидных векторов упакованы в отдельный контейнер; и/или
    c) одну или более клеток, которые экспрессируют один или более одноцепочечных полипептидов из a), причем каждая клетка или комбинация клеток упакованы в отдельный контейнер.
  22. 22. Применение одноцепочечного полипептида для обнаружения и/или измерения наличия, силы и/или активности нейротоксина, содержащего от N-конца к C-концу
    a) N-концевой фрагмент репортерного белка;
    b) линкер, содержащий участок расщепления нейротоксином С. Botulinum (BoNT); и
    c) С-концевой фрагмент репортерного белка;
    причем N-концевой и C-концевой фрагменты вместе содержат функциональную последовательность репортерного белка, когда фрагменты объединены линкером, и не содержат ее, когда линкер был расщеплен на участке расщепления.
EA201990929A 2016-10-20 2017-10-19 In vitro и клеточные анализы измерения активности ботулинических нейротоксинов EA039761B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662410558P 2016-10-20 2016-10-20
PCT/US2017/057411 WO2018075783A2 (en) 2016-10-20 2017-10-19 In vitro and cell based assays for measuring the activity of botulinum neurotoxins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201990929A1 EA201990929A1 (ru) 2019-10-31
EA039761B1 true EA039761B1 (ru) 2022-03-10

Family

ID=60413254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201990929A EA039761B1 (ru) 2016-10-20 2017-10-19 In vitro и клеточные анализы измерения активности ботулинических нейротоксинов

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11306347B2 (ru)
EP (1) EP3529616B1 (ru)
JP (2) JP7227901B2 (ru)
KR (1) KR102556363B1 (ru)
CN (1) CN110088624B (ru)
AU (1) AU2017345560A1 (ru)
BR (1) BR112019007831A2 (ru)
CA (1) CA3040507A1 (ru)
DK (1) DK3529616T3 (ru)
EA (1) EA039761B1 (ru)
ES (1) ES2963830T3 (ru)
FI (1) FI3529616T3 (ru)
HU (1) HUE064332T2 (ru)
MX (2) MX2019004431A (ru)
PL (1) PL3529616T3 (ru)
PT (1) PT3529616T (ru)
SA (1) SA519401607B1 (ru)
SG (1) SG11201903523YA (ru)
WO (1) WO2018075783A2 (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9394537B2 (en) 2010-12-22 2016-07-19 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
US10920208B2 (en) 2014-10-22 2021-02-16 President And Fellows Of Harvard College Evolution of proteases
US11299729B2 (en) 2015-04-17 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
US10392674B2 (en) 2015-07-22 2019-08-27 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
US11524983B2 (en) 2015-07-23 2022-12-13 President And Fellows Of Harvard College Evolution of Bt toxins
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
CA3024331A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 President And Fellows Of Harvard College Method for purification and activation of botulinum neurotoxin
KR102556363B1 (ko) 2016-10-20 2023-07-18 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 시험관내 및 세포 기반 검정
WO2019010164A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 President And Fellows Of Harvard College EVOLUTION OF ARNT SYNTHÉTASES
US11624130B2 (en) 2017-09-18 2023-04-11 President And Fellows Of Harvard College Continuous evolution for stabilized proteins
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
WO2021011579A1 (en) * 2019-07-15 2021-01-21 President And Fellows Of Harvard College Evolved botulinum neurotoxins and uses thereof
WO2021195479A1 (en) * 2020-03-26 2021-09-30 Cellex, Inc. Protease assays and their applications
CN114540419A (zh) * 2022-03-04 2022-05-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统
GB202213479D0 (en) 2022-09-14 2022-10-26 Ipsen Biopharm Ltd Cell-free clostridial neurotoxin assays

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005038029A2 (en) * 2003-10-10 2005-04-28 Promega Corporation Luciferase biosensor
US6890745B1 (en) * 2000-07-19 2005-05-10 Chemicon International, Inc. Protease specific cleavable luciferases and methods of use thereof

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4950588A (en) 1985-07-10 1990-08-21 Molecular Diagnostics, Inc. Prolonged enhanced chemiluminescence
DE3537877A1 (de) 1985-10-24 1987-04-30 Geiger Reinhard Luciferin-derivate und immunoassays unter einsatz derartiger luciferin-derivate
US5004565A (en) 1986-07-17 1991-04-02 The Board Of Governors Of Wayne State University Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes
US5374534A (en) 1990-07-19 1994-12-20 Charm Sciences, Inc. Method of preparing D-luciferin derivatives
DE4210759A1 (de) 1992-04-01 1993-10-07 Boehringer Mannheim Gmbh Substituierte Thiazolin-Dioxetan-Substrate, Verfahren zur Herstellung und Verwendung
AU695623B2 (en) 1994-05-31 1998-08-20 Allergan, Inc. Modification of clostridial toxins for use as transport proteins
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
GB9617671D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
DE69938293T2 (de) 1998-03-27 2009-03-12 Bruce J. Beverly Hills Bryan Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose
US8753831B2 (en) 2007-06-05 2014-06-17 City Of Hope Methods for detection of botulinum neurotoxin
DK2990478T3 (en) 2009-05-01 2017-05-15 Promega Corp SYNTHETIC OPLOPHORUS LUCIFERASES WITH IMPROVED LIGHT EMISSION
US20140287433A1 (en) * 2011-07-19 2014-09-25 ETH Zürich Means and methods for determining clostridial neurotoxins
EP2823053B1 (en) 2012-03-07 2017-08-23 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Means and methods for determining neurotoxin activity based on a modified luciferase
KR102073111B1 (ko) * 2012-10-16 2020-02-04 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성의 결정을 위한 세포 테스트 시스템
AU2013349725B2 (en) * 2012-11-21 2016-05-12 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Means and methods for determination of botulinum neurotoxin biological activity
BR112015023394B8 (pt) * 2013-03-15 2023-09-26 Promega Corp Sistema e complexo bioluminescente
LT3014267T (lt) * 2013-06-28 2018-12-10 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Priemonės ir būdai, skirti neurotoksinių polipeptidų nustatymui
CN107548402B (zh) * 2015-03-26 2022-08-19 哈佛大学校长及研究员协会 工程改造的肉毒杆菌神经毒素
KR102556363B1 (ko) 2016-10-20 2023-07-18 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 시험관내 및 세포 기반 검정
MX2021006930A (es) * 2018-12-11 2021-11-17 Q32 Bio Inc Construcciones de proteínas de fusión para enfermedades asociadas al complemento.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6890745B1 (en) * 2000-07-19 2005-05-10 Chemicon International, Inc. Protease specific cleavable luciferases and methods of use thereof
WO2005038029A2 (en) * 2003-10-10 2005-04-28 Promega Corporation Luciferase biosensor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Society for Neuroscience ; 1 January 2001 (2001-01-01), LENG J, ET AL.: "CLEAVALITETM: A NOVEL BIOLUMINESCENT CASPASE ACTIVITY ASSAY", XP008005347 *
TURTON, K. CHADDOCK, J.A. ACHARYA, K.R.: "Botulinum and tetanus neurotoxins: structure, function and therapeutic utility", TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 27, no. 11, 1 November 2002 (2002-11-01), AMSTERDAM, NL , pages 552 - 558, XP004390740, ISSN: 0968-0004, DOI: 10.1016/S0968-0004(02)02177-1 *
WAUD J P, ET AL: "Engineering the C-terminus of firefly luciferase as an indicator of covalent modification of proteins", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA., ELSEVIER, NL, vol. 1292, no. 1, 1 January 1996 (1996-01-01), NL , pages 89 - 98, XP002325291, ISSN: 0006-3002 *

Also Published As

Publication number Publication date
FI3529616T3 (fi) 2023-12-04
US20190276873A1 (en) 2019-09-12
CN110088624A (zh) 2019-08-02
US11306347B2 (en) 2022-04-19
AU2017345560A1 (en) 2019-05-02
WO2018075783A2 (en) 2018-04-26
EP3529616B1 (en) 2023-09-06
ES2963830T3 (es) 2024-04-02
KR20190068582A (ko) 2019-06-18
KR102556363B1 (ko) 2023-07-18
PL3529616T3 (pl) 2024-03-18
HUE064332T2 (hu) 2024-03-28
US11788069B2 (en) 2023-10-17
JP2019532651A (ja) 2019-11-14
SG11201903523YA (en) 2019-05-30
MX2023004733A (es) 2023-05-10
SA519401607B1 (ar) 2022-08-04
WO2018075783A3 (en) 2018-06-21
BR112019007831A2 (pt) 2019-10-01
JP7227901B2 (ja) 2023-02-22
CA3040507A1 (en) 2018-04-26
EA201990929A1 (ru) 2019-10-31
DK3529616T3 (da) 2023-12-11
MX2019004431A (es) 2019-08-14
CN110088624B (zh) 2024-01-16
JP2023011700A (ja) 2023-01-24
PT3529616T (pt) 2023-12-06
EP3529616A2 (en) 2019-08-28
US20220356508A1 (en) 2022-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11788069B2 (en) In vitro and cell based assays for measuring the activity of botulinum neurotoxins
US7838260B2 (en) GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum toxin protease activity
KR101442246B1 (ko) 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기 위한 형광 편광에세이
EP2823053B1 (en) Means and methods for determining neurotoxin activity based on a modified luciferase
JP6682532B2 (ja) 神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法
EP3529371B1 (en) A functional detection assay devoid of antibodies for serotyping of botulinum neurotoxins
AU2018265070A1 (en) Genetically encoded potassium ion indicators
CA3142567A1 (en) Genetically engineered cells sensitive for clostridial neurotoxins
KR20110026965A (ko) 리포터로 사용 가능한 베타 클루코시다아제와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법