ES2963830T3 - Ensayos in vitro y basados en células para medir la actividad de las neurotoxinas botulínicas - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se describen medios para la detección y caracterización de neurotoxinas tales como la neurotoxina botulínica (BoNT) o la neurotoxina tetánica. La presente divulgación proporciona métodos para determinar la potencia y actividad de neurotoxinas in vitro e in vivo. También se describen polipéptidos que comprenden fragmentos N- y C-terminales de una proteína informadora que se dividen mediante un conector que comprende un sitio de escisión de neurotoxina. La escisión del conector por una neurotoxina disminuye la actividad de la proteína informadora, indicando así actividad de la neurotoxina. También se describen composiciones y kits que comprenden los polipéptidos divulgados, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos y células que expresan dichos polipéptidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayos in vitro y basados en células para medir la actividad de las neurotoxinas botulínicas
Listado de secuencias
La presente memoria descriptiva hace referencia a un Listado de Secuencias (presentado electrónicamente como un archivo .txt denominado "0342941_0630_SL.TXT"). El archivo .txt se generó el 13 de octubre de 2017 y tiene un tamaño de 34.305 bits.
Campo técnico
La tecnología descrita en la presente memoria se refiere a métodos y composiciones para determinar la actividad de neurotoxinas,e. g ,toxina botulínica.
Antecedentes
La neurotoxina botulínica (BoNT) es un agente de interés tanto para cuestiones de bioterrorismo como para aplicaciones terapéuticas. Tradicionalmente, la detección y caracterización de la BoNT se ha realizado mediante la administración de muestras a ratones, provocando su muerte a dosis significativas. Se han explorado ensayos que pueden realizarse con células o in vitro, pero adolecen de una falta de sensibilidad o especificidad, lo que a menudo provoca señales positivas como resultado de reacciones con componentes comunes de las muestras clínicas.
WO 2005/038029 A2 se refiere a luciferasas de escarabajo modificadas, que comprenden una inserción interna en un residuo o en una región que es tolerante a la modificación, comprendiendo la inserción una secuencia que interacciona directa o indirectamente con una molécula de interés.
Waudet al"Engineering the C-terminus of firefly luciferase as an indicator of covalent modification of proteins ". Biochim Biophys Acta. 1996 describe la ingeniería de secuencias de reconocimiento de proteínas quinasas y sitios de proteinasas en ADNc que codifica la luciferasa de luciérnaga con el fin de establecer si estas proteínas modificadas podrían desarrollarse como indicadores bioluminiscentes de modificación covalente de proteínas.
US6890745B1, y Leng Jet al:"Cleavalite™: A Novel Bioluminescent Caspase Activity Assay", Resúmenes de la reunión anual de la sociedad de neurociencia, 2001, analizan una secuencia de polinucleótidos de luciferasa modificada y un polipéptido de luciferasa que contiene secuencias de reconocimiento de proteasas, en donde la escisión de la secuencia de reconocimiento por una proteasa inhibe la actividad de la luciferasa.
Resumen
En la presente memoria se describen nuevos ensayos desarrollados para detectar y medir la actividad de las BoNT tanto in vitro como in vivo. Los ensayos utilizan polipéptidos de cadena única únicos que presentan, p. ej., una luciferasa dividida unida a través de sustratos de BoNT diseñadas para servir como sensor de la actividad de BoNT. En presencia de BoNT, la toxina escinde la región conectora, lo que produce una disminución de la actividad de la luciferasa, que se detecta fácilmente.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende, desde N-terminal hasta C-terminal: a) un fragmento N-terminal de una proteína informadora; b) un conector que comprende: (i) un sitio de escisión de neurotoxina deC. botulinum(BoNT) y (ii) un fragmento de unión de un receptor de BoNT; y c) un fragmento C-terminal de la proteína informadora; en donde la proteína informadora es una proteína luciferasa y en donde los fragmentos N-terminal y C-terminal comprenden colectivamente una secuencia de proteína luciferasa funcional cuando los fragmentos se unen entre sí mediante el conector y no cuando el conector se ha escindido en el sitio de escisión.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el dominio N-terminal tiene la secuencia de aminoácidos 1 159 de la luciferasa de LA SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>) y el dominio C-terminal tiene la secuencia de aminoácidos 160 170 de la luciferasa de LA SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende además uno o más espaciadores ubicados entre el sitio de escisión de BoNT y el fragmento o dominio N-terminal, entre el sitio de escisión de la neurotoxina y el fragmento de dominio C-terminal, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el fragmento de unión de un receptor de BoNT está ubicado entre el fragmento o dominio N-terminal y el sitio de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende además un espaciador ubicado entre el fragmento de unión y el sitio de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, al menos un espaciador está compuesto por glicina y serina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, al menos un espaciador tiene de 5 a 15 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, al menos un espaciador se selecciona de las SEQ ID NO: 4-9.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la BoNT es A, E, C, B, D, F o G. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sitio de escisión de BoNT es de una proteína SNARE. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la proteína SNARE es SNAP-25, sinaptobrevina (VAMP) o sintaxina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sitio de escisión de BoNT son los aminoácidos 141-206 de SNAP-25b humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sitio de escisión de BoNT es el aminoácido 35-96 de VAMP1 humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el receptor es SV2C humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el fragmento de unión son los aminoácidos 529-566 de SV2C humano, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con los aminoácidos 529-566 de SV2C humano, o una secuencia con no más de 10 sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos con respecto a los aminoácidos 529-566 del SV2C humano.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el polipéptido comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la etiqueta de afinidad de polihistidina está ubicada en el extremo C del polipéptido.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende además un segundo polipéptido de luciferasa intacto ubicado entre el fragmento o dominio N-terminal y el sitio de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el segundo polipéptido de luciferasa es luciferasa de luciérnaga(e. g , Photinus pyralis),luciferasa bacteriana(e.g.,Vibrio fischeri, Vibrio harveyi),luciferasa del pensamiento marino(Renilla reniformis),luciferasa de dinoflagelado, luciferasa deGaussiao luciferasa de copépodos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende además un espaciador ubicado entre el segundo polipéptido de luciferasa y el sitio de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el espaciador tiene de 5 a 15 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el espaciador es GSSGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 4), GSSGGGGSGGGSSG (SEQ ID NO: 5) o GGGGS (SEQ ID NO: 6).
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende: a) los aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>); b) un conector ubicado C-terminal del N-nano<1-159>que comprende: i) un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos<;>ii) un fragmento de unión compuesto por los aminoácidos 529-566 de SV2C ubicado en C-terminal del primer espaciador; iii) un segundo espaciador ubicado en C-terminal del fragmento de unión; iv) un sitio de escisión de BoNT que comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25b humano ubicado en C-terminal del segundo espaciador; v) un tercer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT; y c) los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, uno o más espaciadores son GSSGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 4), GSSGGGGSGGGSSG (SEQ ID NO: 5) o GGGGS (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el polipéptido comprende además una secuencia de His6 (SEQ ID NO: 12) ubicada en el extremo C.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cadena única descrito en la presente memoria. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un vector de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cadena única descrito en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el vector es un vector de expresión y comprende la secuencia de ácido nucleico en forma expresable. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector de expresión viral, un vector de expresión procariota, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto o un vector de expresión de mamífero.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe una célula que comprende un ácido nucleico o vector del párrafo anterior. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la célula expresa un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la célula es una célula procariota, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula animal.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un métodoin vitropara determinar la potencia de una neurotoxina botulínica, que comprende: poner en contacto la neurotoxina con un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con una referencia, determinando así la potencia.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina de C. botulinum (BoNT) en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad luciferasa del polipéptido en ausencia de la muestra, en donde una disminución de la actividad luciferasa indica actividad BoNT en la muestra.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el método se realizain vitro.En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el contacto se produce en un tampón de HEPES 50 mM, ZnCl<2>20 pM, DTT 2 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7,1. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la concentración del polipéptido de cadena única en contacto con la muestra es de aproximadamente 30 nM a 300 nM. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la concentración de polipéptido de cadena única en contacto con la muestra es de aproximadamente 30 nM.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la actividad luciferasa se determina mediante la adición de sustrato de luciferasa al polipéptido de cadena única y la medición cuantitativa de una señal luminiscente producida. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, las condiciones comprenden incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 36 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, las condiciones comprenden incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, las condiciones comprenden incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos, un fragmento de unión de los aminoácidos 529-566 de SV2C humano ubicado en C-terminal del primer espaciador y en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, y un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25 humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, y un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25 humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 35-96 de VAMP1 humano.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el polipéptido de cadena única se expresa por una célula neuronal y el método comprende, además, después de la etapa de contacto: incubar las células neuronales durante un período de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 60 horas y recoger el lisado de las células neuronales.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende además un segundo polipéptido de luciferasa intacto ubicado entre el N-nano<1-159>y el sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el segundo polipéptido de luciferasa, luciferasa de luciérnaga (photinus pyralis), luciferasa bacteriana (vibrio fischiri, vibrio harveyi), luciferasa de pensamiento marino (renilla reniformis), luciferasa de dinoflagelado, luciferasa de gaussia o luciferasa de copépodo. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la actividad luciferasa del segundo polipéptido de luciferasa en la muestra se determina y se usa como indicador del polipéptido de cadena única total presente en el lisado recogido. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, las células neuronales expresan el polipéptido de cadena única de un vector de expresión viral. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el polipéptido de cadena única se expresa durante 6 días antes de la etapa a). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sistema de expresión viral es un sistema de expresión de lentivirus.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la etapa de incubación es de aproximadamente 48 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la etapa de recogida es mediante la adición de un tampón de lisis.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sitio de escisión de BoNT es de SNAP-25, sinaptobrevina (VAMP) o sintaxina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sitio de escisión de BoNT se reconoce específicamente por BoNT A, E y C, o se reconoce específicamente por BoNT B, D, F y G. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, se usa una combinación de polipéptidos de cadena única que tienen diferentes sitios de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sitio de escisión de BoNT es a.a.
141-206 de SNAP-25 humano, o a.a. 35-96 de VAMP1 humano, a.a. 1-206 de SNAP35 humano, o a.a. 1-96 de VAMP1. En estos aspectos, el conector comprende un fragmento de unión de un receptor de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el receptor es SV2C. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el fragmento de unión comprende los aminoácidos 529-566 de SV2C humano.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el conector comprende un segundo polipéptido de luciferasa, un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del segundo polipéptido de luciferasa y en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicados en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 1-206 de SNAP25 humano y está ubicado en C-terminal del primer espaciador.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la medición de la actividad luciferasa se logra mediante la adición de un sustrato específico para la luciferasa y la detección cuantitativa de la señal luminiscente resultante. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el sustrato para la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 es furimazina (2-furanilmetil-desoxi-coelenterazina).
En un aspecto, en la presente memoria se describe un kit que comprende: a) uno o más polipéptidos de cadena única como se describe en la presente memoria, con cada uno o una combinación de los polipéptidos de cadena única envasados en un recipiente separado; b) uno o más ácidos nucleicos o vectores de ácidos nucleicos como se describe en la presente memoria, con cada uno o una combinación de los ácidos nucleicos o vectores de ácidos nucleicos envasados en un recipiente separado; y/o c) una o más células como se describe en la presente memoria con cada una o una combinación de las células envasadas en un recipiente separado. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el kit comprende además un sustrato de luciferasa envasado en un recipiente separado.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa un dibujo esquemático de sensores de toxinas basados en luciferasa dividida.Panel izquierdo:,la luciferasa NANOLUC<™>se separa en dos fragmentos complementarios, N-nano y C-nano. Estos dos fragmentos están unidos entre sí con un conector que se basa en sustratos de toxina (SNAP-25 (también conocido como p25) o VAMP1/2/3(e. g.,sinaptobrevinas)).Panel derecho:la escisión de la región conectora por BoNT separa las dos partes de la luciferasa NANOLUC<™>y suprime las señales luminiscentes.
Las FIG. 2A-FIG. 2B demuestran un ensayo de detección in vitro de BoNT/A. Se diseñaron e investigaron dos proteínas sensoras para la detección de la toxina BoNT/A. Una es N<nano>-SV2C-L4-p25-C<nano>mientras que la otra es N<nano>-p25-C<nano>. Se prepararon a 30 nM en un volumen de 30 ul mientras la BoNT/A se diluía de 1 nM a 1 fM con factor 10. El control negativo fue BoNT/B añadido a la solución de proteína sensora. La curva (FIG. 2A) se trazó en función del porcentaje de luminiscencia de la luciferasa NANOLUC<™>. CE50 del uso de N<nano>-SV2C-p25-C<nano>para BoNT/A es 9,73 pM después de 4 h y 7,86 pM después de 24 h, mientras tanto la CE50 del uso de N<nano>-p25-C<nano>es 48,26 pM después de 4 h y 35,87 pM después de 24 h a 37 °C. La proteína sensora que contenía SV2C-L4, que es un dominio de unión a BoNT/A, mostró un aumento aproximado de 5 veces de CE50 (FIG. 2B).
Las FIG. 3A-FIG. 3B demuestran un ensayo de detección in vitro de BoNT/B después de 4 h y 24 h. La proteína sensora N<nano>-VAMP1-C<nano>se preparó a 30 nM en un volumen de 30 ul mientras que la BoNTB se diluyó de 10 nM a 1 fM con factor 10. El control negativo fue BoNT/A añadido a la solución de proteína sensora. La curva (FIG.
3A) se trazó en función del porcentaje de luminiscencia de la luciferasa NANOLUC<™>. La CE 50 para BoNTB es 75,7 pM después de 4 h y 3,9 pM después de 24 h a 37 °C (FIG. 3B).
La FIG. 4 demuestra un ensayo de detección in vivo de BoNT/A utilizando células neuronales infectadas con virus. Para cada muestra de lisado de células neuronales, se midieron las señales tanto de la luciferasa de luciérnaga como NANOLUC<™>y se calculó la relación (NANOLUC<™>/luciérnaga). Posteriormente, se generó el porcentaje de la relación de cada muestra sin utilizar exposición a toxinas como control de referencia. La CE50 = 2,9 pM es igual a 30 veces la DL50 después de 48 h de exposición a proteínas de toxina.
Descripción detallada
En la presente memoria se describen composiciones y métodos relacionados con la medición y/o detección de la actividad enzimática. En particular, las composiciones y métodos se relacionan con la detección y/o medición de neurotoxinas,e.g., la neurotoxina deC. botulinum(BoNT).
Tal y como se usa en la presente memoria, "neurotoxina deC. botulinum"o "BoNT" se refiere a cualquier polipéptido que puede ejecutar el mecanismo celular general mediante el cual una toxina deC. botulinumentra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores y abarca la unión de una toxina deC. botulinuma un complejo receptor de baja o alta afinidad, la internalización de la toxina, la translocación de la cadena ligera de la toxina al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de la toxina deC. botulinum.
Las cepas deClostridium botulinumproducen siete tipos antigénicamente distintos de toxinas botulínicas (BoNT), que se han identificado mediante la investigación de brotes de botulismo en el hombre (BoNT/A, /B, /E y /F), animales (BoNT/C1 y /D) o aislamiento del suelo (BoNT/G). Si bien los siete serotipos de BoNT tienen una estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno también muestra características bacteriológicas heterogéneas. La diversidad genética de las cepas deC. botulinumse describe en detalle en Hill y et al. (Journal of Bacteriology, Vol.
189, No. 3, p. 818-832 (2007)). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la BoNT es de la cepa A, E, C, B, D, F o G. Varias neurotoxinas deC. botulinumno naturales también se conocen en la técnica y se describen,e.g., en las Publicaciones de Patentes Internacionales. WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 y WO99/17806.
Las toxinas de las diversas cepas deC. botulinumcomparten la misma organización funcional de dominios y arquitectura estructural general. Cada una de las toxinas deC. botulinumse traduce como un polipéptido de cadena única de aproximadamente 150 kDa que posteriormente se escinde mediante escisión proteolítica dentro de un bucle disulfuro mediante proteasas naturales, como,e.g., una proteasa endógena de toxina deC. botulinumo proteasas naturales producidas en el medio ambiente. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa unidas entre sí por un único enlace disulfuro e interacciones no covalentes. Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio proteolítico ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad de endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino terminal de la HC (H<n>) que facilita la liberación de la LC de las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión que se encuentra dentro de la mitad carboxilo terminal de la HC que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina al complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana.
La unión, translocación y actividad proteasa de estos tres dominios funcionales son necesarias para la toxicidad. El mecanismo general de intoxicación celular mediante el cual las toxinas deC. botulinumentran en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, independientemente del serotipo o subtipo. Sin querer limitarse a ninguna teoría, el mecanismo de intoxicación implica al menos cuatro etapas: 1) unión al receptor, 2) internalización del complejo, 3) translocación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana de la proteasa. El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una toxina deC. botulinumse une a un receptor específico de toxina ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la especificidad de unión de un complejo receptor se logra, en parte, mediante combinaciones específicas de gangliósidos y receptores de proteínas. Una vez unidos, los complejos toxina/receptor se internalizan mediante endocitosis y las vesículas internalizadas se clasifican en rutas intracelulares específicas. La etapa de translocación se desencadena por la acidificación del compartimento de las vesículas. Una vez translocada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera de la vesícula intracelular al citosol, donde se dirige específicamente a una de las tres proteínas conocidas como componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores (proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)/sinaptobrevina, proteína asociada sinaptosomal de 25 kDa (SNAP-25) y sintaxina).
Estos componentes centrales son necesarios para el acoplamiento y la fusión de vesículas sinápticas en la terminal nerviosa y constituyen miembros de la familia de receptores de proteínas de unión al factor sensibles a N-etilmaleimida (SNARE) solubles. BoNT/A y BoNT/E escinden SNAP-25 en la región carboxilo terminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1 también escinde SNAP-25 cerca del extremo carboxilo. Los serotipos botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y la toxina tetánica, actúan sobre la porción central conservada de VAMP y liberan la porción amino terminal de VAMP en el citosol. BoNT/C1 escinde la sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana plasmática citosólica. La proteólisis selectiva de las SNARE sinápticas explica el bloqueo de la liberación de neurotransmisores causado por las toxinas deC. botulinumin vivo. Las dianas de proteína SNARE de las toxinas deC. botulinumson comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véase,e. g ,Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11 (9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).
En la presente memoria se describen polipéptidos de cadena única en los que una proteína informadora se divide o interrumpe en su secuencia mediante un segmento conector. La proteína informadora dividida es funcional.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cadena única" cuando se refiere a un polipéptido se refiere a una única molécula polipeptídica que tiene una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de residuos adyacentes. Es decir, cada elemento citado de un polipéptido de cadena única está conectado a los otros elementos mediante un enlace peptídico. Esto contrasta con los polipéptidos de múltiples cadenas que comprenden múltiples polipéptidos de cadena única que pueden unirse entre sí mediante,e.g., enlaces de hidrógeno o enlaces disulfuro para formar un complejo polipeptídico.
Los polipéptidos de cadena única descritos en la presente memoria pueden comprender luciferasa y/o porciones de la misma,e.g., la proteína informadora puede ser luciferasa. Tal y como se usa en la presente memoria, "luciferasa" se refiere a una enzima que cataliza una reacción bioluminiscente,e.g., catalizando la oxidación de luciferina, emitiendo luz y liberando oxiluciferina. Una luciferasa puede ser natural o diseñada por ingeniería. Tal y como se usa en la presente memoria, una luciferasa "funcional" es una luciferasa que es capaz de catalizar una reacción en presencia de un sustrato adecuado. Están disponibles numerosas variaciones y realizaciones de luciferasa, incluida,e.g., la luciferasa de luciérnaga(Photinus pyralis)(véase,e.g., la SEQ ID NO: 13), luciferasa bacteriana(Vibrio fischeri, Vibrio harveyi),luciferasa del pensamiento de mar(Renilla reniformis),luciferasa de dinoflagelado, luciferasa deCypridina,luciferasa deColeoptera,luciferasa deGaussia(véase,e. g ,Heise, K., et al, "Dual luciferase assay for secreted luciferase based on Gaussia and NANOLUC " Assay Drug Dev. Technol. (2013)), luciferasa de copépodos (véase,e.g., Takenaka, Y., et al, "Computational analysis and functional expression of ancestral copepod luciferase" Gene (2013) y luciferasa NANOLUC™.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la luciferasa puede ser luciferasa NANOLUC™. Tal y como se usa en la presente memoria, "luciferasa NANOLUC" se refiere a una luciferasa de 19,1 kDa derivada de la luciferasa deOplophorus gracilirostrisque puede utilizar furimazina o coelenterazina como sustrato y que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1. También pueden usarse variantes de la luciferasa NANOLUC™ en cualquiera de los aspectos y realizaciones de los métodos y composiciones de la presente memoria y se describen,e.g., en la Patente de EE. UU. No. 8.557.970.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende, desde N-terminal hasta C-terminal: un fragmento N-terminal de una proteína informadora; un conector que comprende un sitio de escisión de neurotoxina<;>y un fragmento C-terminal de la proteína informadora. Tal y como se usa en la presente memoria, "fragmento" se refiere a una parte o porción de una molécula,e.g., una parte o porción de un polipéptido. En los polipéptidos de cadena única descritos en la presente memoria, el fragmento N-terminal y los fragmentos C-terminales de una proteína informadora comprenden colectivamente una secuencia de proteína informadora funcional, pero no comprenden individualmente una secuencia de proteína informadora funcional. Cuando están presentes en el mismo polipéptido de cadena única,e.g., unidos funcionalmente por la secuencia conectora, los fragmentos N-terminal y C-terminal de una proteína informadora generan una proteína de fusión informadora funcional. En realizaciones de la invención, la proteína informadora es una proteína luciferasa. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los fragmentos pueden ser variantes o derivados de secuencias naturales, secuencias de proteínas informadoras descritas en la presente memoria y/o secuencias de proteínas informadoras conocidas en la técnica,e. g ,pueden tener al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de proteína informadora o no tener más de 10 sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos con respecto a una secuencia de proteína informadora.
También se describe en la presente memoria un polipéptido de cadena única que comprende un dominio N-terminal que comprende una secuencia con al menos un 90% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO 1 (N-nano<1-159>); un conector que comprende un sitio de escisión de neurotoxina ubicado en C-terminal del N-nano<1-159;>y un dominio C-terminal que tiene una secuencia con al menos un 90% de identidad de secuencia con los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente al N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un dominio o fragmento de una proteína informadora puede tener al menos al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con una secuencia de proteína informadora,e. g ,con los aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>) o los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los aminoácidos variantes pueden ser variaciones de sustitución conservativa.
También se describe en la presente memoria un polipéptido de cadena única que comprende: un dominio N-terminal que comprende una secuencia que tiene menos de 10 sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos con respecto a los aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N- nano<1-159>); un conector que comprende un sitio de escisión de neurotoxina ubicado en C-terminal del N-nano<1-159;>y un dominio C-terminal que tiene una secuencia que tiene menos de 3 sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos con respecto a los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-17ü>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un dominio o fragmento de una proteína informadora puede ser una secuencia con 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 deleciones, inserciones o sustituciones con respecto a una secuencia de proteína informadora,e. g ,a los aminoácidos 1 -159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>) o los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los aminoácidos sustituidos pueden ser variaciones de sustitución conservativa. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende: a) los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1-159>); b) un conector que comprende un sitio de escisión de neurotoxina ubicado en C-terminal del N-nano<1-159;>y c) los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional.
Como se demuestra en la presente memoria, una proteína luciferasa puede ser interrumpida por una secuencia conectora sin dejar de proporcionar una luciferasa funcional. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, se proporciona un conector entre los residuos correspondientes a los residuos 159 y 160 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, se proporciona un conector entre los residuos 159 y 160 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria puede comprender un dominio N-terminal que comprende una secuencia correspondiente a los residuos 1-159 de la SEQ ID NO: 1 y un dominio C-terminal que comprende una secuencia correspondiente a los residuos 160-170 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria puede comprender un dominio N-terminal que consiste esencialmente en una secuencia correspondiente a los residuos 1-159 de la SEQ ID NO: 1 y un dominio C-terminal que consiste esencialmente en una secuencia correspondiente a los residuos 160-170 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria puede comprender un dominio N-terminal que comprende los residuos 1-159 de la SEQ ID NO: 1 y un dominio C-terminal que comprende los residuos 160-170 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria puede comprender un dominio N-terminal que consiste esencialmente en los residuos 1-159 de la SEQ ID NO: 1 y un dominio C-terminal que consiste esencialmente en los residuos 160-170 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria puede comprender un dominio N-terminal que consiste en los residuos 1-159 de la SEQ ID NO: 1 y un dominio C-terminal que consiste en los residuos 160-170 de la SEQ ID NO: 1.
En los polipéptidos de cadena única descritos en la presente memoria, se encuentra un dominio conector entre los dominios N-terminal y C-terminal. Tal y como se usa en la presente memoria, "conector" se refiere a una secuencia exógena a una proteína informadora(e. g ,una enzima luciferasa) y que está diseñado para unir funcionalmente los dominios N-terminal y C-terminal de la proteína informadora. Un conector puede comprender,e. g.,uno o más sitios de escisión, uno o más espaciadores, uno o más fragmentos de unión y una o más enzimas luciferasa adicionales.
Tal y como se usa en la presente memoria, "unir funcionalmente" se refiere a unir los dos fragmentos de una proteína informadora,e.g., una luciferasa de tal manera que la secuencia intermedia no impida que los dos fragmentos formen una estructura terciaria activa y funcional. Dos fragmentos que están unidos funcionalmente exhibirán la actividad que caracteriza a la proteína en ausencia de la secuencia conectora.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender uno o más sitios de escisión,e.g., una secuencia de aminoácidos que se escinde específicamente mediante la acción de una o más enzimas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el sitio de escisión puede ser un sitio de escisión de neurotoxina. Por consiguiente, un sitio de escisión de neurotoxina comprende una secuencia que es escindida específicamente por al menos una neurotoxina. Las neurotoxinas son compuestos que inhiben la función de y/o matan el tejido nervioso. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la neurotoxina puede ser un inhibidor de la liberación de vesículas sinápticas. Los sitios de escisión de neurotoxinas ejemplares no limitantes pueden incluir un sitio de escisión de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) y/o de la toxina del tétanos. En realizaciones de la invención, el conector comprende un sitio de escisión de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender múltiples sitios de escisión de neurotoxinas,e.g., puede ser escindido por múltiples neurotoxinas, permitiendo así la detección y/o medición de múltiples neurotoxinas.
La BoNT actúa escindiendo las proteínas SNARE. Por consiguiente, un sitio de escisión de BoNT puede ser de una proteína SNARE. Tal y como se usa en la presente memoria, "proteína SNARE" se refiere a una superfamilia de proteínas que median en la fusión de vesículas, incluida la fusión de vesículas sinápticas de la membrana presináptica en las neuronas. Las proteínas SNARE incluyen, a modo de ejemplos no limitantes, SNAP-25(e.g., ID de gen NCBI: 6616, véase también Secuencia de referencia NCBI: NP_570824.1 para SNAP25b humano y Secuencia de referencia NCBI: NP_112253.1 para SNAP25b de rata), sinaptobrevinas (VAMP)(e.g., ID de Gen NCBI: 6843; 6844; 6845; 8673; 8674; 9341; 9554; 10652; 10791; y 26984) y sintaxinas (e. g., ID de Gen NCBI 2054; 6804; 6809; 6810; 6811; 8417; 8675; 8676; 8677; 9482; 10228; 23673; 53407; 55014; 112755; y 415177). Los enlaces escindibles SNARE escindidos por neurotoxinas clostridiales se describen, por ejemplo, en Binz, Th. et al. "Clostridial neurotoxins: mechanism of SNARE cleavage and outlook on potential substrate specificity reengineering". Toxins 2.4 (2010): 665-682. Preferiblemente, el sitio de escisión de BoNT es de una proteína SNARE humana. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de enlaces escindibles de SNARE humano.
Tabla 1 - enlaces escindibles de SNARE humano escindidos por neurotoxinas clostridiales
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de neurotoxina clostridial, preferiblemente un sitio de escisión de neurotoxina humana. Un sitio de escisión de neurotoxina clostridial puede definirse como una secuencia que comprende al menos los residuos de aminoácidos P3P2P1P1 'P2'P3' de una SNARE, preferiblemente una SNARE humana, en donde P1 y P1' son los residuos ubicados a cada lado del enlace peptídico escindible escindido por la neurotoxina clostridial, por ejemplo, Gln197 y Arg198 en SNAP25 humano para BoNT/A.
En una realización preferida, un sitio de escisión de neurotoxina clostridial comprende al menos los residuos de aminoácidos P4P3P2P1P1 'P2'P3'P4' de SNARE. En una realización más preferida, un sitio de escisión de neurotoxina clostridial comprende al menos los residuos de aminoácidos P5P4P3P2P1P1'P2'P3'P4'P5' de SNARE, más preferiblemente al menos los residuos de aminoácidos P6P5P4P3P2P1P1 'P2'P3'P4'P5'P6'.
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/A en donde dicho sitio de escisión de BoNT/A comprende los residuos 195 a 200, preferiblemente 194 a 201,193 a 202 o 192 a 203 de SNAP25 humano (SEQ ID NO: 23).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/B en donde dicho sitio de escisión de BoNT/B comprende los residuos 76 a 81, preferiblemente 75 a 82, 74 a 83 o 73 a 84 de VAMP-1 humano (SEQ ID NO: 24).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/B en donde dicho sitio de escisión de BoNT/B comprende los residuos 74 a 79, preferiblemente 73 a 80, 72 a 81 o 71 a 82 de VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 25).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/B en donde dicho sitio de escisión de BoNT/B comprende los residuos 57 a 62, preferiblemente 56 a 63, 55 a 64 o 54 a 65 de VAMP-3 humano (SEQ ID NO: 26).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/C1 en donde dicho sitio de escisión de BoNT/C1 comprende los residuos 196 a 201, preferiblemente 195 a 202, 194 a 203 o 193 a 204 de SNAP25 humano (SEQ ID NO: 23).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/C1 en donde dicho sitio de escisión de BoNT/C1 comprende los residuos 251 a 256, preferiblemente 250 a 257, 249 a 258 o 148 a 259 de la sintaxina 1A humana (SEQ ID NO: 27).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/C1 en donde dicho sitio de escisión de BoNT/C1 comprende los residuos 252 a 257, preferiblemente 251 a 258, 249 a 259 o 149 a 260 de la sintaxina 1B humana (SEQ ID NO: 28).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/D en donde dicho sitio de escisión de BoNT/D comprende los residuos 59 a 64, preferiblemente 58 a 65, 57 a 66 o 56 a 67 de VAMP-1 humano (SEQ ID NO: 24).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/D en donde dicho sitio de escisión de BoNT/D comprende los residuos 57 a 62, preferiblemente 56 a 63, 55 a 64 o 54 a 65 de VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 25).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/D en donde dicho sitio de escisión de BoNT/D comprende los residuos 40 a 45, preferiblemente 39 a 46, 38 a 47 o 37 a 48 de VAMP-3 humano (SEQ ID NO: 26).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/E en donde dicho sitio de escisión de BoNT/E comprende los residuos 178 a 183, preferiblemente 177 a 184, 176 a 185 o 175 a 186 de SNAP25 humano (SEQ ID NO: 23).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/F en donde dicho sitio de escisión de BoNT/F comprende los residuos 58 a 63, preferiblemente 57 a 64, 56 a 65 o 55 a 66 de VAMP-1 humano (SEQ ID NO: 24).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/F en donde dicho sitio de escisión de BoNT/F comprende los residuos 56 a 61, preferiblemente 55 a 62, 54 a 63 o 53 a 64 de VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 25).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/F en donde dicho sitio de escisión de BoNT/F comprende los residuos 39 a 44, preferiblemente 38 a 45, 37 a 46 o 36 a 47 de VAMP-3 humano (SEQ ID NO: 26).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/G en donde dicho sitio de escisión de BoNT/G comprende los residuos 81 a 86, preferiblemente 80 a 87, 79 a 88 o 78 a 89 de VAMP-1 humano (SEQ ID NO: 24).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/G en donde dicho sitio de escisión de BoNT/G comprende los residuos 79 a 84, preferiblemente 78 a 85, 77 a 86 o 76 a 87 de VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 25).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/G en donde dicho sitio de escisión de BoNT/G comprende los residuos 62 a 67, preferiblemente 61 a 68, 60 a 69 o 59 a 70 de VAMP-3 humano (SEQ ID NO: 26).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de BoNT/B en donde dicho sitio de escisión de TeNT comprende los residuos 76 a 81, preferiblemente 75 a 82, 74 a 83 o 73 a 84 de VAMP-1 humano (SEQ ID NO: 24).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de TeNT en donde dicho sitio de escisión de TeNT comprende los residuos 74 a 79, preferiblemente 73 a 80, 72 a 81 o 71 a 82 de VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 25).
En una realización, el conector comprende al menos un sitio de escisión de TeNT en donde dicho sitio de escisión de BoNT/B comprende los residuos 57 a 62, preferiblemente 56 a 63, 55 a 64 o 54 a 65 de VAMP-3 humano (SEQ ID NO: 26).
Un ejemplo de sitios de escisión de BoNT adecuados en proteínas SNARE incluyen, a modo de ejemplo no limitante, los aminoácidos 141-206 de SNAP-25b humano(e.g., la SEQ ID NO: 10); y el aminoácido 35-96 de VAMP1 humano(e. g ,ID de Gen NCBI: 6843). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, los aminoácidos 35-96 de VAMP1 humano pueden ser los aminoácidos 35-96 de la SEQ ID NO: 16. Otros ejemplos no limitantes de sitios de escisión de BoNT en proteínas SNARE incluyen los aminoácidos 60-87 de VAMP2 humano, aminoácidos 43-70 de VAMP 3 humano y aminoácidos 62-89 de VAMP1 humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los aminoácidos 60-87 de VAMP2 humano pueden ser la secuencia de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los aminoácidos 43-70 de VAMP3 humano pueden ser la secuencia de la SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los aminoácidos 62-89 de VAMP1 humano pueden ser la secuencia de la SEQ ID NO: 21
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede ser una variante de cualquiera de las secuencias específicas enumeradas en la presente memoria,e. g ,una variante de un sitio de escisión de BoNT nativo que se encuentra en una proteína SNARE. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede ser una variante de los aminoácidos 141-206 de la SEQ ID NO: 10 o los aminoácidos 35-96 de la SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede tener al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con un sitio de escisión de BoNT nativo encontrado en una proteína SNARE. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede tener al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 141-206 de la SEQ ID NO: 10 o los aminoácidos 35-96 de la SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la variante puede ser una variante de sustitución conservativa.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede ser una secuencia con 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 deleciones, inserciones o sustituciones con respecto a un sitio de escisión de BoNT nativo encontrado en una proteína SNARE. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede ser una secuencia con 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 residuo que varía con respecto a un sitio de escisión de BoNT nativo encontrado en una proteína SNARE. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede ser una secuencia con 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1 deleción, inserción o sustitución con respecto a los aminoácidos 141-206 de la SEQ ID NO: 10 o los aminoácidos 35-96 de la SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un sitio de escisión de BoNT puede ser una secuencia con 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos o 1 residuo que varía con respecto a los aminoácidos 141-206 de la SEQ ID NO: 10 o los aminoácidos 35-96 de la SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un sitio de escisión de BoNT puede comprender los aminoácidos 141-206 de SNAP-25b humano(e.g., la SEQ ID NO: 10); aminoácido 35-96 de VAMP1 humano; aminoácidos 1-96 de VAMP1; SNAP25 humano; y/o aminoácidos 1-206 de SNAP25b humano (SEQ ID NO: 14).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un sitio de escisión de BoNT puede ser reconocido específicamente(e.g., escindido) por BoNT A, B, C, D, E, F y/o G. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un sitio de escisión de BoNT puede ser reconocido específicamente(e.g., escindido) por BoNT A, E y C. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un sitio de escisión de BoNT puede ser reconocido específicamente(e.g., escindido) por BoNT B, D, F y G.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender uno o más espaciadores. Tal y como se usa en la presente memoria, "espaciador" se refiere a una secuencia de aminoácidos que cumple el propósito estructural de separar otras dos secuencias en la misma cadena peptídica. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la secuencia espaciadora puede ser una secuencia peptídica flexible. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede comprender residuos de glicina y serina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede consistir esencialmente en residuos de glicina y serina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede consistir en residuos de glicina y serina.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede tener una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede tener una longitud de 2 a 30 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede tener una longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede tener una longitud de 3 a 20 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede tener una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un espaciador puede tener una longitud de 5 a 15 aminoácidos.
Los espaciadores ejemplares y no limitantes pueden incluir GSSGGGGSGGGGSSG (SEQ ID NO: 4); GSSGGGGSGGGSSG (SEQ ID NO: 5); GGGGS (SEQ ID NO: 6); (GGGGS)n (n=1-3) (SEQ ID NO: 7); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 8); y EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 9). El diseño y la selección de conectores y otros conectores ejemplares son bien conocidos en la técnica y se describen,e. g.,en Chen, X., et al, "Fusion protein linkers: property, design and functionality " Adv. Drug Deliv. Rev. (2013).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender un fragmento de unión a neurotoxina,e.g., una secuencia que está unida y/o se une a una neurotoxina y que no es escindida por la neurotoxina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un fragmento de unión a neurotoxina puede ser un fragmento de un receptor de neurotoxina,e.g., un receptor para BoNT y/o una neurotoxina tetánica. En realizaciones de la invención, el conector comprende un fragmento de unión de un receptor de BoNT.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el receptor de neurotoxina puede ser un receptor de neurotoxina humano, de ratón, de rata o de primate. En una realización preferida, el receptor de neurotoxina es un receptor de neurotoxina humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el receptor de neurotoxina puede ser SV2C,e.g., SV2C humano (ID de Gen NCBI: 22987; GenBank: AAI00828.1). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el fragmento de unión a neurotoxina de un receptor puede comprender una secuencia correspondiente a los aminoácidos 529-566 de SV2C humano (SV2C-L4,e. g ,la SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el fragmento de unión a neurotoxina puede comprender los aminoácidos 529-566 de SV2C humano (SV2C-L4,e. g ,la SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el receptor de neurotoxina puede ser SYTI (ID de Gen NCBI: 6857) o SYT2 (ID de Gen NCBI: 127833). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el fragmento de unión a neurotoxina de un receptor puede comprender una secuencia correspondiente a los aminoácidos 32-52 de SYTI(e. g.,la SEQ ID NO: 17) o los aminoácidos 40-60 de SYT2 (SEQ ID NO: 18).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender un segundo polipéptido de luciferasa intacto. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la segunda luciferasa es activa antes y/o después de la escisión del polipéptido de cadena única,e. g.,por una neurotoxina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la segunda luciferasa se distingue de la primera luciferasa,e.g., actúa sobre un sustrato diferente y/o produce una longitud de onda de luz diferente. Por ejemplo, si la primera luciferasa es NANOLUC, la segunda luciferasa puede ser luciferasa de luciérnaga(e. g., Photinus pyralis),luciferasa bacteriana(e.g.,Vibrio fischieri, Vibrio harveyi),luciferasa del pensamiento marino(e.g.,Renilla reniformis),luciferasa de dinoflagelado, o luciferasa deGaussia.En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la segunda luciferasa puede comprender una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la segunda luciferasa puede comprender la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender un segundo polipéptido de luciferasa intacto ubicado entre el dominio de la proteína informadora N-terminal y al menos un sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender un segundo polipéptido de luciferasa intacto ubicado entre el N-nano<1-159>y el sitio de escisión de BoNT.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el fragmento de unión puede ubicarse en N-terminal de al menos un sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el fragmento de unión puede ubicarse entre el N-nano<1-159>y el sitio de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector puede comprender, desde el N-terminal al C-terminal, al menos un fragmento de unión, al menos un espaciador y al menos un sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector puede comprender, desde el N-terminal al C-terminal, al menos un fragmento de unión, al menos un espaciador y al menos un sitio de escisión de BoNT.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender, desde el extremo N al extremo C, uno o más espaciadores y al menos un sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender, desde el extremo N al extremo C, uno o más espaciadores, al menos un sitio de escisión y uno o más espaciadores. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender, desde el extremo N al extremo C, al menos un sitio de escisión y uno o más espaciadores. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un conector puede comprender uno o más espaciadores ubicados entre el sitio de escisión de BoNT y el N-nano<1-159>, entre el sitio de escisión de la neurotoxina y el C-nano<160-170>, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector puede comprender un espaciador ubicado entre un segundo polipéptido de luciferasa y un sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector puede comprender, desde el N-terminal al C-terminal, un segundo polipéptido de luciferasa, al menos un espaciador y al menos un sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector puede comprender un espaciador ubicado entre el segundo polipéptido de luciferasa y el sitio de escisión de BoNT.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única puede comprender además una etiqueta de afinidad de polihistidina,e.g., His6 (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la etiqueta de afinidad de polihistidina está ubicada en el extremo C del polipéptido,e. g.,C-terminal del dominio C-terminal de la proteína informadora.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende: a) los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1-159>); b) un enlazador ubicado en C-terminal del N-nano<1-159>que comprende: i) un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos<;>ii) un fragmento de unión compuesto por los aminoácidos 529-566 de SV2C ubicado en C-terminal del primer espaciador; iii) un segundo espaciador ubicado en C-terminal del fragmento de unión; iv) un sitio de escisión de BoNT que comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25b humano ubicado en C-terminal del segundo espaciador; iv) un tercer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT; y c) los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina C-terminal de los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>).
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende: a) los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1-159>); b) un conector ubicado en Cterminal del N-nano<i-159>que comprende: i) un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos<;>ii) un sitio de escisión de BoNT que comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25b humano ubicado en C-terminal del primer espaciador; iii) un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT; y c) los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina C-terminal de los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>).
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende: a) los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1-159>); b) un conector ubicado en C-terminal del N-nano<1-159>que comprende: i) un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos<;>ii) un sitio de escisión de BoNT que comprende los aminoácidos 35-96 de VAMP1 humano ubicado en C-terminal del primer espaciador; iii) un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT; y c) los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina en C-terminal de los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>).
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un polipéptido de cadena única que comprende: a) los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1-159>); b) un conector ubicado en C-terminal del N-nano<1-159>que comprende: i) un segundo polipéptido de luciferasa funcional; ii) un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del segundo polipéptido de luciferasa; iii) un sitio de escisión de BoNT que comprende los aminoácidos 1-206 de SNAP25b humano(e.g., la SEQ ID NO: 14) ubicado en C-terminal del primer espaciador; iv) un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT; y c) los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>) ubicado en C-terminal del conector; en donde el conector une funcionalmente el N-nano<1-159>y el C-nano<160-170>para generar una proteína de fusión de luciferasa funcional.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina C-terminal de los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>).
Tabla 2
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el ácido nucleico puede comprender las SEQ ID NO: 15, 29, 30 o 31.
Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria. En una realización, el vector es un vector de expresión. Dicho vector de expresión se denomina en la presente memoria una construcción de expresión y comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria unida operativamente al vector de expresión útil para expresar la molécula de ácido nucleico en una célula o en un extracto libre de células. Se puede emplear una amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena única de la presente invención incluyendo, sin limitación, un vector de expresión viral; un vector de expresión procariota; vectores de expresión eucariotas, tales como,e. g ,un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero; y un vector de expresión de extracto libre de células. Se entiende además que los vectores de expresión útiles para practicar aspectos de estos métodos pueden incluir aquellos que expresan el polipéptido de cadena única bajo el control de un elemento promotor constitutivo, específico de tejido, específico de célula o inducible, elemento potenciador o ambos. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con reactivos y condiciones bien establecidos para elaborar y utilizar una construcción de expresión a partir de dichos vectores de expresión, están disponibles fácilmente a través de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, Calif.; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.; y Stratagene, La Jolla, Calif. La selección, elaboración y uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos de rutina que están dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un vector de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el vector puede ser un vector de expresión y comprender la secuencia de ácido nucleico en forma expresable. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el vector puede ser un vector de expresión viral, un vector de expresión procariota, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto o un vector de expresión de mamífero.
El término "vector", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para su administración a una célula o transferencia entre diferentes células. Están disponibles muchos vectores útiles para transferir genes exógenos a células diana,e. g ,los vectores pueden ser episomales,e. g.,plásmidos, vectores derivados de virus o pueden integrarse en el genoma de la célula diana, mediante recombinación homóloga o integración aleatoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un vector puede ser un vector de expresión. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ácido nucleico heterólogos en una célula. Un vector de expresión puede comprender elementos adicionales. El ácido nucleico incorporado en el vector puede unirse operativamente a una secuencia de control de la expresión, donde la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótidos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico o construcción de expresión descrita en la presente memoria. La célula puede ser para la propagación del ácido nucleico o para la expresión del ácido nucleico, o ambos. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe una célula que comprende un ácido nucleico y/o vector como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la célula expresa un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la célula puede ser una célula procariota, una célula deE. coli,una célula de levadura, una célula de insecto, una célula animal, una célula de mamífero, una célula humana, una célula de ratón, una célula de primate y/o una célula neuronal. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la célula es una célula neuronal, en particular, células con una alta sensibilidad a BoNT.
Una célula con una alta sensibilidad a la BoNT es una célula susceptible a la intoxicación por BoNT. En algunas realizaciones, una célula con una alta sensibilidad a BoNT es una célula que es susceptible a la intoxicación por BoNT en,e.g., aproximadamente 500 pM o menos, aproximadamente 400 pM o menos, aproximadamente 300 pM o menos, aproximadamente 200 pM o menos, aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 90 pM o menos, aproximadamente 80 pM o menos, aproximadamente 70 pM o menos, aproximadamente 60 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 40 pM o menos, aproximadamente 30 pM o menos, aproximadamente 20 pM o menos, aproximadamente 10 pM o menos, aproximadamente 9 pM o menos, aproximadamente 8 pM o menos, aproximadamente 7 pM o menos, aproximadamente 6 pM o menos, aproximadamente 5 pM o menos, aproximadamente 4 pM o menos, aproximadamente 3 pM o menos, aproximadamente 2 pM o menos, aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 0,9 pM o menos, aproximadamente 0,8 pM o menos, aproximadamente 0,7 pM o menos, aproximadamente 0,6 pM o menos, aproximadamente 0,5 pM o menos, aproximadamente 0,4 pM o menos, aproximadamente 0,3 pM o menos, aproximadamente 0,2 pM, aproximadamente 0,1 pM o menos de una BoNT, aproximadamente 90 fM o menos de una BoNT, aproximadamente 80 fM o menos de una BoNT, aproximadamente 70 fM o menos de una BoNT, aproximadamente 60 fM o menos de una BoNT , aproximadamente 50 fM o menos de una BoNT, aproximadamente 40 fM o menos de una BoNT, aproximadamente 30 fM o menos de una BoNT, aproximadamente 20 fM o menos de una BoNT, o aproximadamente 10 fM o menos de una BoNT.
En algunas realizaciones, la célula es una célula neuronal primaria con una alta sensibilidad a BoNT,e.g., neuronas corticales, neuronas del hipocampo y/o neuronas de la médula espinal.
En algunas realizaciones, la célula proviene de una línea celular neuronal con una alta sensibilidad a BoNT,e.g., BE(2)-M17, Kelly, LA1-SSn, N1 E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa y/o SK-N-BE(2)-C.
En algunas realizaciones, la célula es una célula neuronal derivada de una célula madre, en particular de una célula madre pluripotente inducida (célula iPS),e.g., Neuronas i-Cell®, DopaNeuronas i-Cell® Neuronas glutamatérgicas iCell, MotoNeuronas iCell (Cellular Dynamics Inc) Neuronas corticales cerebrales, Células madre neurales (Axol Biosciences), Neuronas Peri.4U, Neuronas CNS.4U, Dopa.4UNeuronas (Axiogénesis) células MNP (Lonza), Neuronas corticales, Neuronas Motoras (iStem) y/o células neurales derivadas de iPSC (MTI-GlobalStem).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la célula puede ser una célula procariota, incluyendo, sin limitación, cepas de células bacterianas aeróbicas, microaerófilas, capnófilas, facultativas, anaeróbicas, gramnegativas y grampositivas tales como las derivadas de, p.ej.,Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescensySalmonella typhimurium;y una célula eucariota que incluye, sin limitación, cepas de levadura, tales como,e.g., las derivadas dePichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiaeyYarrowia lipolytica;una célula de insecto o línea celular derivada de insectos, tales como,e. g ,las derivadas deSpodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogasteryManduca sexta;o una célula o línea celular de mamífero derivada de células de mamífero, tales como,e.g., aquellas derivadas de ratón, rata, hámster, porcino, bovino, equino, primate y ser humano. Las líneas celulares pueden obtenerse de la American Type Culture Collection, la Colección Europea de Cultivos Celulares y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares. Los ejemplos no limitantes de protocolos específicos para seleccionar, preparar y usar una línea celular apropiada se describen,e. g ,en INSECT C<e>LL CULT<u>R<e>ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison e Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4a ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3a ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2a ed. 2002); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004). Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.
Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden usar en métodos para detectar y/o medir la presencia, potencia y/o actividad de,e. g ,una neurotoxina(e.g., BoNT). En presencia de BoNT, un polipéptido de cadena única con un sitio de escisión de BoNT se escindirá en la secuencia conectora, interrumpiendo la actividad de la proteína informadora dividida(e.g., luciferasa). En consecuencia, una disminución en la actividad de la proteína informadora indica la presencia de BoNT. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria, en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad luciferasa del polipéptido en ausencia de la muestra, en donde una disminución de la actividad luciferasa indica actividad BoNT en la muestra. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un métodoin vitropara determinar la potencia de una neurotoxina botulínica, que comprende: a) poner en contacto la neurotoxina con un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y b) determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con una referencia, determinando así la potencia. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, los métodos son adecuados para la liberación de lotes,e.g., para pruebas de liberación de lotes y/o pruebas de liberación de remesas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizarin vitro.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria, en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y b) determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad luciferasa del polipéptido en ausencia de la muestra, en donde una disminución de la actividad luciferasa indica actividad BoNT en la muestra. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido de cadena única que comprende: los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1-159>), los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>), separados y unidos funcionalmente por un conector que comprende un sitio de escisión de BoNT ubicado en C-terminal del N-nano<1-159>; y N-terminal del C-nano<160-170>, en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y b) determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad luciferasa del polipéptido en ausencia de la muestra, en donde una disminución de la actividad luciferasa indica actividad BoNT en la muestra.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido de cadena única que comprende: los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC<™>(N-nano<1 -159>), los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC<™>(C-nano<160-170>), separados y unidos funcionalmente por un conector que comprende un sitio de escisión de BoNT ubicado en C-terminal del N-nano<1-159>; y N-terminal del C-nano<160-170>, en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT; y b) determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad del polipéptido en ausencia de la muestra, en donde una disminución en la actividad luciferasa es una indicación de la actividad BoNT en la muestra. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector comprende un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos, un fragmento de unión de los aminoácidos 529-566 de SV2C humano ubicado en C-terminal del primer espaciador y en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, y un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25 humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector comprende un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, y un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 141-206 de SNAP25 humano. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector comprende un primer espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en N-terminal del sitio de escisión de BoNT, un segundo espaciador de 5 a 15 aminoácidos ubicado en C-terminal del sitio de escisión de BoNT, en donde el sitio de escisión de BoNT comprende los aminoácidos 35-96 de VAMP1 humano.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para determinar la CE50 de una BoNT, que comprende: a) poner en contacto un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria, en condiciones apropiadas para la actividad de BoNT con la BoNT a una primera concentración; y determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad luciferasa del polipéptido en ausencia de la muestra; b) repetir la etapa a) a una concentración diferente de BoNT hasta que se pueda determinar la CE50. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las diferentes concentraciones de BoNT abarcan al menos un orden de magnitud de diferencia.
Como se sabe en la técnica, la "concentración efectiva mitad de la máxima (CE50)" se refiere a la concentración de un fármaco, anticuerpo o tóxico que induce una respuesta a medio camino entre el valor de la línea base y el máximo después de un tiempo de exposición específico. Se utiliza comúnmente como medida de la potencia del fármaco. Por lo tanto, la CE50 de una curva graduada de respuesta a la dosis representa la concentración de un compuesto en la que se observa el 50 % de su efecto máximo. La CE50 de una curva de respuesta a la dosis cuántica representa la concentración de un compuesto en la que el 50 % de la población muestra una respuesta, después de una duración de exposición específica.
Tal y como se usa en la presente memoria, "condiciones apropiadas para la actividad de BoNT" se refiere a condiciones(e.g., temperatura, pH, cofactores, etc.) bajo las cuales BoNT puede escindir específicamente un sitio de escisión de BoNT. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones apropiadas para la actividad de BoNT pueden comprender un tampón de HEPES, ZnCl<2>20 pM, DTT 2 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7,1. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones apropiadas para la actividad de BoNT pueden comprender un tampón de HEPES, ZnCh 10 30 pM, DTT 1 -3 mM, 0,5-2 mg/ml de BSA, pH 6,5-7,5. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones apropiadas para la actividad de BoNT pueden comprender un tampón de HEPES, ZnCl<2>5-50 pM, DTT 0,1-10 mM, 0,1-10 mg/ml de BSA, pH 6,5-7,5.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones pueden comprender incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 36 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones pueden comprender incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de 1 hora a 36 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones pueden comprender incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones pueden comprender incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de 1 hora a 24 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones pueden comprender incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las condiciones pueden comprender incubación a aproximadamente 37 °C durante un período de 4 horas a 24 horas.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única está presente a una concentración de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 300 nM. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única está presente a una concentración de 3 nM a 300 nM. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única está presente a una concentración de aproximadamente 30 nM a aproximadamente 300 nM. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única está presente a una concentración de 30 nM a 300 nM. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única está presente a una concentración de aproximadamente 30 nM. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido de cadena única está presente a una concentración de 30 nM.
La actividad de BoNT también puede detectarse en células,e. g ,en células neuronales. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con células neuronales que expresan un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria; b) incubar las células neuronales durante un período de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 60 horas; c) recoger el lisado de las células neuronales; y d) medir la actividad de la luciferasa NANOLUC™ en el lisado, en comparación con la actividad de la luciferasa n An Ol UC™ en células neuronales tratadas de manera idéntica en ausencia de la muestra, en donde una disminución en la actividad de la luciferasa NANOLUC™ indica actividad BoNT en la muestra. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un método para detectar la actividad de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con células neuronales que expresan un polipéptido de cadena única que comprende: los aminoácidos 1-159 de la luciferasa NANOLUC™ (N-nano1-159), los aminoácidos 160-170 de la luciferasa NANOLUC™ (C-nano160-170), separados y unidos funcionalmente por un conector que comprende un sitio de escisión de BoNT ubicado en C-terminal del N-nano1-159 y N-terminal del C-nano160-170; b) incubar las células neuronales durante un período de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 60 horas; c) recoger el lisado de las células neuronales; y d) medir la actividad de la luciferasa NANOLUC™ en el lisado, en comparación con la actividad de la luciferasa NANOLUC™ en células neuronales tratadas de manera idéntica en ausencia de la muestra, en donde una disminución en la actividad de la luciferasa NANOLUC™ indica actividad BoNT en la muestra. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el conector comprende además un segundo polipéptido de luciferasa intacto ubicado entre el N-nano1-159 y el sitio de escisión. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las células neuronales expresan el polipéptido de cadena única de un vector de expresión viral. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las células neuronales expresan el polipéptido de cadena única de un vector de expresión viral durante al menos 3 días antes de la etapa de contacto. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las células neuronales expresan el polipéptido de cadena única de un vector de expresión viral durante al menos 4 días antes de la etapa de contacto. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las células neuronales expresan el polipéptido de cadena única de un vector de expresión viral durante al menos 6 días antes de la etapa de contacto. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, las células neuronales expresan el polipéptido de cadena única de un vector de expresión viral durante 6 días antes de la etapa de contacto. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el sistema de expresión viral es un sistema de expresión de lentivirus. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la etapa de incubación b) es de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la etapa de incubación b) es de aproximadamente 48 horas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la etapa de incubación b) es de 48 horas.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la etapa de recogida del lisado puede comprender la adición de un tampón de lisis. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la etapa de recogida del lisado puede comprender centrifugación y/o sedimentación.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, un método puede comprender el uso de una combinación de polipéptidos de cadena única, teniendo cada polipéptido diferentes sitios de escisión de BoNT y/o una combinación de sitios de escisión de BoNT.
Tal y como se usa en la presente memoria, "determinar la actividad de la luciferasa" se refiere a detectar, cuantitativa o cualitativamente, el nivel de luz que genera una luciferasa (o una muestra que puede contener luciferasa funcional) en presencia de un sustrato de luciferasa. La luminiscencia puede detectarse mediante cualquier medio conocido en la técnica,e. g ,mediante microscopía de luminiscencia, fotómetros, lectores de placas de luminiscencia, detectores fotomultiplicadores y similares.
Los sustratos de luciferasa pueden incluir luciferinas naturales, así como sustratos diseñados. Las luciferinas, por ejemplo, incluyen la luciferina de luciérnaga, luciferina deCypridina[también conocido comoVargula][coelenterazina], luciferina bacteriana, así como análogos sintéticos de estos sustratos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la luciferina es coelenterazina y análogos de la misma, que incluyen moléculas de la Pat. de EE. UU. No. 6.436.682, y, por ejemplo, véase Zhao et al, (2004), Mol Imaging, 3;43-54. Los sustratos adicionales se describen en,e.g., las Pat. de e E. Uu . No. 5.374.534; 5.098.828; 6.436.682; 5.004.565; 5.455.357; y 4.950.588.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la actividad luciferasa se puede determinar mediante la adición de sustrato de luciferasa al polipéptido de cadena única y medición cuantitativa de una señal luminiscente producida. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el sustrato para la luciferasa NANOLUC™ puede ser furimazina (2-furanilmetil-desoxi-coelenterazina).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el método puede comprender además medir la actividad de una segunda luciferasa comprendida por el polipéptido de cadena única. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la actividad de la segunda luciferasa se puede medir en el lisado celular. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la actividad de la segunda luciferasa puede permitir la normalización de la expresión del polipéptido de cadena única en muestras, células, poblaciones celulares y/o pocillos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la actividad luciferasa del segundo polipéptido de luciferasa en la muestra se determina y se utiliza como indicador del polipéptido de cadena única total presente en el lisado recogido.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones, en la presente memoria se describe un kit que comprende: a) uno o más polipéptidos de cadena única como se describe en la presente memoria, con cada uno o una combinación de los polipéptidos de cadena única envasados en un recipiente separado; uno o más ácidos nucleicos o vectores de ácidos nucleicos como se describe en la presente memoria, con cada uno o una combinación de los ácidos nucleicos o vectores de ácidos nucleicos envasados en un recipiente separado; y/o una o más células como se describe en la presente memoria con cada una o una combinación de las células envasadas en un recipiente separado.
Un kit es cualquier fabricación(e.g., un envase o recipiente) que comprende al menos un reactivo,e.g., un polipéptido de cadena única, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena única o una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria, siendo la fabricación promovida, distribuida o vendida como una unidad para realizar los métodos o ensayos descritos en la presente memoria.
Los kits descritos en la presente memoria incluyen reactivos y/o componentes que permiten ensayar el nivel de actividad de un informador,e. g.,uno o más tipos de luciferasa. Dichos reactivos comprenden, además de polipéptidos de cadena única, por ejemplo, soluciones tampón, sustratos o líquidos de lavado, etc. Además, el kit puede comprender una cantidad de una neurotoxina,e.g., BoNT o luciferasa que puede usarse para una calibración del kit o como control interno. Además, el kit puede comprender un folleto de instrucciones y/o puede proporcionar información sobre la relevancia de los resultados obtenidos.
Por conveniencia, a continuación, se proporciona el significado de algunos términos y frases utilizados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. A menos que se indique lo contrario, o que esté implícito en el contexto, los siguientes términos y frases incluyen los significados que se proporcionan a continuación. Las definiciones se proporcionan para ayudar a describir realizaciones particulares y no pretenden limitar la invención reivindicada, porque el alcance de la invención está limitado únicamente por las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Si existe una discrepancia aparente entre el uso de un término en la técnica y su definición proporcionada en la presente memoria, prevalecerá la definición proporcionada en la memoria descriptiva.
Por conveniencia, aquí se recopilan ciertos términos empleados en la presente memoria, en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
Los términos "disminuir", "reducir", "reducción" o "inhibir" se utilizan en la presente memoria para referirse a una disminución en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, "reducir", "reducción" o "disminuir" o "inhibir" normalmente significa una disminución de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia(e.g., la ausencia de un tratamiento o agente dado) y puede incluir, por ejemplo, una disminución de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o más.
Los términos "aumentado", "aumentar", "mejorar" o "activar" se utilizan en la presente memoria para significar un aumento en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, los términos "aumentado", "aumentar", "mejorar" o "activar" pueden significar un aumento de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente un 20 %, o al menos aproximadamente un 30 %, o al menos aproximadamente un 40 %, o al menos aproximadamente un 50 %, o al menos aproximadamente un 60 %, o al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % o hasta e incluyendo un aumento del 100 % o cualquier aumento entre 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, o un aumento de al menos aproximadamente 2 veces, o al menos aproximadamente 3 veces, o al menos aproximadamente 4 veces, o al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 10 veces, o cualquier aumento entre 2 veces y 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia. En el contexto de un marcador, un "aumento" es un aumento estadísticamente significativo en dicho nivel de marcador.
Tal y como se usa en la presente memoria, un "sujeto" significa un ser humano o un animal. Normalmente, el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cynomologous, monos araña y macacos,e. g ,Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas,e. g ,gatos domésticos, especies caninas,e. g ,perros, zorros, lobos, especies de aves,e.g., pollos, emúes, avestruces y peces,e. g ,trucha, bagre y salmón. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el sujeto es un mamífero,e. g ,un primate,e.g., un ser humano. Los términos "individuo", "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente en la presente memoria.
Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero no se limita a estos ejemplos. Pueden usarse ventajosamente mamíferos distintos de los seres humanos como sujetos que representan modelos animales de actividad botulínica. Un sujeto puede ser macho o hembra.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "actividad de unión" significa que una molécula está en contacto con otra molécula a través de al menos una fuerza intermolecular o intramolecular, incluyendo, sin limitación, un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, una interacción hidrófoba, una interacción de van der Waals y similares, o cualquier combinación de las mismas. "Unido" y "unir" se consideran términos para la unión.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, se puede aislar o purificar un polipéptido de cadena única. Por "aislado" se entiende un material que está libre en diversos grados de los componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentran en su estado nativo. "Aislar" denota un grado de separación de la fuente o el entorno original,e. g.,de una célula o lisado celular.
El término "purificado" se usa para referirse a una sustancia tal como un polipéptido que es "sustancialmente pura", con respecto a otros componentes de una preparación(e. g ,otros polipéptidos). Puede referirse a un polipéptido que es al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 % o 75 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 85 %, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % puro, con respecto a otros componentes. Reformulados, los términos "sustancialmente puro" o "esencialmente purificado", con respecto a un polipéptido, se refiere a una preparación que contiene menos de aproximadamente un 20 %, más preferiblemente menos de aproximadamente un 15 %, 10 %, 8 %, 7 %, lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos de un 1 %, de uno o más de otros componentes(e.g., otros polipéptidos o componentes celulares).
Tal y como se usa en la presente memoria, "poner en contacto" se refiere a cualquier medio adecuado para administrar o exponer una muestra o agente a un polipéptido de cadena única como se describe en la presente memoria (o una célula que comprende dicho polipéptido). Los métodos de administración ejemplares incluyen, pero no se limitan a, administración directa a una muestra o a un medio de cultivo celular, perfusión, inyección u otro método de administración bien conocido por un experto en la técnica.
El término "muestra" o "muestra de ensayo", tal y como se usa en la presente memoria, denota una muestra tomada o aislada de cualquier fuente,e.g., biológica, ambiental, industrial o de otro tipo. El término también incluye una mezcla de las muestras mencionadas anteriormente. El término "muestra de ensayo" también incluye muestras no tratadas o pretratadas (o preprocesadas). La muestra de ensayo se puede obtener retirando una muestra de la fuente, pero también se puede lograr usando una muestra previamente aislada(e. g ,aislada en un momento anterior y aislada por la misma persona u otra persona).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la muestra de ensayo puede ser una muestra de ensayo no tratada. Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "muestra de ensayo no tratada" se refiere a una muestra de ensayo que no ha tenido ningún pretratamiento previo de la muestra excepto dilución y/o suspensión en una solución. Los métodos ejemplares para tratar una muestra de ensayo incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, sonicación, homogeneización, calentamiento, congelación y descongelación, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la muestra de ensayo puede ser una muestra de ensayo congelada,e. g ,una muestra ambiental congelada, una muestra industrial congelada o tejido congelado. La muestra congelada se puede descongelar antes de emplear los métodos, ensayos y sistemas descritos en la presente memoria. Después de la descongelación, una muestra congelada se puede centrifugar antes de someterla a los métodos, ensayos y sistemas descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la muestra de ensayo es una muestra de ensayo clarificada preparada, por ejemplo, mediante centrifugación y recogida de un sobrenadante. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, una muestra de ensayo puede ser una muestra de ensayo preprocesada, por ejemplo, sobrenadante o filtrado resultante de un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en centrifugación, filtración, descongelación, purificación y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la muestra de ensayo se puede tratar con un reactivo químico y/o biológico. Se pueden emplear reactivos químicos y/o biológicos para proteger y/o mantener la estabilidad de la muestra, incluidas las biomoléculas(e. g ,proteínas) que contiene, durante el procesamiento. El experto conoce bien los métodos y procesos apropiados para el preprocesamiento de muestras biológicas requeridas para la determinación del nivel de un producto de expresión como se describe en la presente memoria.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "célula neuronal" o "neurona" se refiere a células que se encuentran en el sistema nervioso y que están especializadas para recibir, procesar y transmitir información como señales nerviosas. Las neuronas pueden incluir un cuerpo celular central o soma, y dos tipos de proyecciones: dendritas, mediante las cuales, en general, se transmiten la mayoría de las señales neuronales al cuerpo celular; y axones, mediante los cuales, en general, se transmiten la mayoría de las señales neuronales desde el cuerpo celular a las células efectoras, como las neuronas diana o los músculos. Las neuronas pueden transmitir información desde tejidos y órganos al sistema nervioso central (neuronas aferentes o sensoriales) y transmitir señales desde el sistema nervioso central a las células efectoras (neuronas eferentes o motoras). Otras neuronas, denominadas interneuronas, conectan las neuronas dentro del sistema nervioso.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "específico" se refiere a una interacción particular(e. g ,unión y/o escisión) entre dos moléculas en donde una primera entidad interacciona con una segunda entidad diana con mayor especificidad y afinidad con la que interacciona con una tercera entidad que no es una diana. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, específico puede referirse a una interacción de la primera entidad con la segunda entidad diana que es al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 1.000 veces o más que la interacción con la tercera entidad no diana. Un reactivo específico para una diana dada es aquel que presenta,e.g., unión específica para esa diana en las condiciones del ensayo que se están utilizando o escisión específica de una secuencia diana en las condiciones del ensayo que se están utilizando.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa amino y carboxi de residuos adyacentes. Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a un polímero de aminoácidos, incluidos aminoácidos modificados(e. g ,fosforilados, glicados, glicosilados, etc.) y análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. "Proteína" y "polipéptido" se utilizan a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes, mientras que el término "péptido" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, pero el uso de estos términos en la técnica se superpone. Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria cuando se refieren a un producto génico y fragmentos del mismo. Por lo tanto, los polipéptidos o proteínas ejemplares incluyen productos génicos, proteínas naturales, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes, fragmentos y análogos de los anteriores.
En las diversas realizaciones descritas en la presente memoria, se contempla además que se abarcan variantes (de origen natural o no), alelos, homólogos, variantes modificadas de forma conservativa y/o variantes de sustitución conservativa de cualquiera de los polipéptidos particulares descritos. En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservativa", donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar y conserva la actividad deseada del polipéptido. Dichas variantes modificadas de forma conservativa son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos consistentes con la divulgación.
Un aminoácido dado puede reemplazarse por un residuo que tenga características fisicoquímicas similares,e.g., sustituyendo un residuo alifático por otro (como Ile, Val, Leu o Ala entre sí), o sustituyendo un residuo polar por otro (como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn). Son bien conocidas otras sustituciones conservativas de este tipo,e. g ,sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares. Los polipéptidos que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas se pueden ensayar en cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria para confirmar que se conserva una actividad deseada,e. g ,la actividad de unión del polipéptido y la especificidad de un polipéptido nativo o de referencia.
Los aminoácidos se pueden agrupar según similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., p. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polares sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácidos: Asp (D), Glu (E); (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H). Alternativamente, los residuos naturales se pueden dividir en grupos según las propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones conservativas particulares incluyen, por ejemplo; Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; Ile en Leu o en Val; Leu en Ile o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en Ile; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp; y/o Phe en Val, en Ile o en Leu.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido descrito en la presente memoria (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido) puede ser un fragmento funcional de una de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, un "fragmento funcional" es un fragmento o segmento de un péptido que retiene al menos el 50 % de la actividad del polipéptido de referencia de tipo salvaje según los ensayos que se describen a continuación en la presente memoria. Un fragmento funcional puede comprender sustituciones conservativas de las secuencias divulgadas en la presente memoria.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el polipéptido descrito en la presente memoria puede ser una variante de una secuencia descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, la variante es una variante modificada de forma conservativa. Las variantes de sustitución conservativa pueden obtenerse, por ejemplo, mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos nativas. Una "variante", como se menciona en la presente memoria, es un polipéptido sustancialmente homólogo a un polipéptido nativo o de referencia, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la del polipéptido nativo o de referencia debido a una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos variantes abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con una secuencia de ADN nativa o de referencia, pero que codifican una proteína variante o un fragmento de la misma que conserva la actividad. En la técnica se conoce una amplia variedad de enfoques de mutagénesis específica de sitio basados en PCR y pueden ser aplicados por el experto en la técnica.
Una secuencia de aminoácidos o de ADN variante puede ser al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o más, idéntica a una secuencia nativa o de referencia. El grado de homología (porcentaje de identidad) entre una secuencia nativa y una mutante se puede determinar, por ejemplo, comparando las dos secuencias usando programas informáticos disponibles gratuitamente empleados comúnmente para este fin en la red mundial(e. g ,BLASTp o BLASTn con ajustes por defecto).
Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa se pueden lograr mediante cualquiera de varias técnicas conocidas por un experto en la técnica. Se pueden introducir mutaciones, por ejemplo, en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada. Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar una secuencia de nucleótidos alterada que tenga codones particulares alterados según la sustitución, deleción o inserción requerida. Las técnicas para realizar dichas alteraciones están muy bien establecidas e incluyen, por ejemplo, las divulgadas por Walder et al. (Gen 42:133, 1986); Bauer et al. (Gen 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las Pat. de EE. UU. No. 4.518.584 y 4.737.462. Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del polipéptido también puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar una reticulación aberrante. Por el contrario, se pueden añadir enlace(s) de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad o facilitar la oligomerización.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula, preferiblemente una molécula polimérica, que incorpora unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico o un análogo de los mismos. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Un ácido nucleico monocatenario puede ser una cadena de ácido nucleico de un ADN bicatenario desnaturalizado. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico monocatenario que no derive de ningún ADN bicatenario. En un aspecto, el ácido nucleico puede ser ADN. En otro aspecto, el ácido nucleico puede ser ARN. El ADN adecuado puede incluir, por ejemplo, ADN genómico o ADNc. El ARN adecuado puede incluir, por ejemplo, ARNm.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, se puede diseñar un polipéptido, ácido nucleico o célula como se describe en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, "diseñado" se refiere al aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, se considera que un polipéptido está "diseñado" cuando al menos un aspecto del polipéptido,e.g., su secuencia, ha sido manipulado por la mano del hombre para diferir del aspecto tal como existe en la naturaleza. Como es una práctica común y lo entienden los expertos en la técnica, la progenie de una célula diseñada normalmente todavía se denomina "diseñada" incluso aunque la manipulación real se haya realizado en una entidad anterior.
El término "vector", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para su administración a una célula huésped o para la transferencia entre diferentes células huésped. Tal y como se usa en la presente memoria, un vector puede ser viral o no viral. El término "vector" abarca cualquier elemento genético que sea capaz de replicarse cuando se asocie con los elementos de control adecuados y que pueda transferir secuencias génicas a las células. Un vector puede incluir, pero no se limita a, un vector de clonación, un vector de expresión, un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "vector de expresión" se refiere a un vector que dirige la expresión de un ARN o polipéptido a partir de secuencias unidas a secuencias reguladoras de la transcripción en el vector. Las secuencias expresadas serán a menudo, pero no necesariamente, heterólogas para la célula. Un vector de expresión puede comprender elementos adicionales, por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así mantenerse en dos organismos, por ejemplo, en células humanas para expresión y en un huésped procariota para clonación y amplificación. El término "expresión" se refiere a los procesos celulares implicados en la producción de ARN y proteínas y, según sea apropiado, en la secreción de proteínas, incluyendo, cuando sea aplicable, pero sin limitarse a, por ejemplo, transcripción, procesamiento de transcritos, traducción y plegamiento, modificación y procesamiento de proteínas. Los "productos de expresión" incluyen ARN transcrito de un gen y polipéptidos obtenidos mediante traducción de ARNm transcrito de un gen. El término "gen" significa la secuencia de ácido nucleico que se transcribe (ADN) a ARN in vitro o in vivo cuando se une operativamente a secuencias reguladoras apropiadas. El gen puede incluir o no regiones que preceden y siguen a la región codificante,e. g ,secuencias en 5' no traducidas (5'UTR) o "líderes" y secuencias en 3' UTR o "remolque", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "vector viral" se refiere a una construcción de vector de ácido nucleico que incluye al menos un elemento de origen viral y tiene la capacidad de empaquetarse en una partícula de vector viral. El vector viral puede contener el ácido nucleico que codifica un polipéptido como se describe en la presente memoria en lugar de genes virales no esenciales. El vector y/o partícula se puede utilizar con el fin de transferir cualquier ácido nucleico al interior de las células, ya seain vitrooin vivo.En la técnica se conocen numerosas formas de vectores virales.
Por "vector recombinante" se entiende un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heteróloga, o "transgén" que es capaz de expresarsein vivo.Debe entenderse que los vectores descritos en la presente memoria pueden, en algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, combinarse con otras composiciones y terapias adecuadas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, el vector es episomal. El uso de un vector episomal adecuado proporciona un medio para mantener el nucleótido de interés en un sujeto o célula en ADN extracromosómico con un número elevado de copias, eliminando así los efectos potenciales de la integración cromosómica.
El término "estadísticamente significativo" o "significativamente" se refiere a significancia estadística y generalmente significa una diferencia de dos desviaciones estándar (2SD) o más.
Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente memoria deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente", cuando se utiliza en relación con porcentajes, puede significar ±1 %.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos, que son esenciales para el método o composición, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.
El término "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos como se describe en la presente memoria, que excluyen cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a aquellos elementos necesarios para una realización dada. El término permite la presencia de elementos que no afectan materialmente la o las características básicas y novedosas o funcionales de esa realización.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "correspondiente a" se refiere a un aminoácido o nucleótido en la posición enumerada en un primer polipéptido o ácido nucleico, o un aminoácido o nucleótido que es equivalente a un aminoácido o nucleótido enumerado en un segundo polipéptido o ácido nucleico. Los aminoácidos o nucleótidos enumerados equivalentes pueden determinarse mediante alineamiento de secuencias candidatas usando programas de grado de homología conocidos en la técnica,e. g ,BLAST.
Los términos singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de esta divulgación, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. La abreviatura"e.g." se deriva del latínexempli gratia,y se utiliza en la presente memoria para indicar un ejemplo no limitativo. Por tanto, la abreviatura"e. g."es sinónimo del término "por ejemplo".
A menos que se defina lo contrario en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos, etc. particulares, descritos en la presente memoria y, como tales, pueden variar. La terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones. Las definiciones de términos comunes en inmunología y biología molecular se pueden encontrar en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19a Edición, publicado por Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porteret al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology por Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green y Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE. UU. (2012) (ISBN 1936113414); Daviset al.,Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, EE. UU. (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; y Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).
Otros términos se definen en la presente memoria dentro de la descripción de los diversos aspectos de la invención.
Todas las patentes y otras publicaciones; incluidas referencias bibliográficas, patentes emitidas, solicitudes de patente publicadas y solicitudes de patente pendientes; citadas a lo largo de esta solicitud se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteceder dicha divulgación en virtud de una invención anterior o por cualquier otro motivo. Todas las declaraciones sobre la fecha o representación sobre el contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión sobre la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.
La descripción de las realizaciones de la divulgación no pretende ser exhaustiva ni limitar la divulgación a la forma precisa divulgada. Si bien en la presente memoria se describen realizaciones específicas de, y ejemplos para, la divulgación con fines ilustrativos, son posibles varias modificaciones equivalentes dentro del alcance de la divulgación, como reconocerán los expertos en la técnica relevante. Por ejemplo, aunque las etapas o funciones del método se presentan en un orden dado, las realizaciones alternativas pueden realizar funciones en un orden diferente, o las funciones pueden realizarse sustancialmente al mismo tiempo. Las enseñanzas de la divulgación proporcionada en la presente memoria se pueden aplicar a otros procedimientos o métodos según sea apropiado. Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria se pueden combinar para proporcionar realizaciones adicionales. Se pueden modificar aspectos de la divulgación, si es necesario, para emplear las composiciones, funciones y conceptos de las referencias y aplicaciones anteriores para proporcionar aún más realizaciones de la divulgación. Además, debido a consideraciones de equivalencia funcional biológica, se pueden realizar algunos cambios en la estructura de la proteína sin afectar la acción biológica o química en tipo o cantidad. Estos y otros cambios se pueden realizar en la divulgación a la luz de la descripción detallada. Se pretende que todas estas modificaciones se incluyan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Los elementos específicos de cualquiera de las realizaciones anteriores se pueden combinar o sustituir por elementos en otras realizaciones. Además, si bien las ventajas asociadas con ciertas realizaciones de la divulgación se han descrito en el contexto de estas realizaciones, otras realizaciones también pueden exhibir tales ventajas, y no todas las realizaciones necesitan necesariamente exhibir tales ventajas para encontrarse dentro del alcance de la divulgación.
La tecnología descrita en la presente memoria se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos que de ninguna manera deben interpretarse como limitantes adicionales.
Ejemplos
Ejemplo 1:Ensayos novedososin vitroy basados en células para medir la actividad de las neurotoxinas botulínicas
Las neurotoxinas botulínicas son una familia de siete toxinas bacterianas (BoNT/A-G). Son uno de los seis agentes potenciales de bioterrorismo de categoría A. Estas toxinas también se han utilizado ampliamente para tratar una lista cada vez mayor de afecciones médicas, con un mercado de más de dos mil millones de dólares. La detección y caracterización de las BoNT se han basado en el ensayo clásico de dosis letal en ratón (DL50). Existe una necesidad apremiante, tanto para fines de biodefensa como para el desarrollo de productos médicos, de reemplazar el ensayo en animales con métodosin vitroy basados en células más convenientes, sensibles y precisos.
Se han desarrollado ensayos in vitro disponibles actualmente para detectar y caracterizar la actividad de las toxinas, con diversas sensibilidades. Hay dos ensayos comercializados principales, ambos basados en la detección por fluorescencia de la escisión de los sustratos por el dominio enzimático de las toxinas. El primero de estos ensayos es SNAPtide™ (List Biologies), que implica el uso de péptidos sintéticos que contienen el sitio de escisión nativo de las BoNT y marcados con dos tintes fluorescentes. Las señales de fluorescencia normalmente se apantallan entre dos tintes y las señales aumentan una vez que las BoNT escinden el péptido. El segundo ensayo es BoTest™ (BioSentinel LLC). Una proteína fluorescente cian (CFP) está unida mediante una secuencia peptídica a una proteína fluorescente amarilla (YFP). La escisión del conector por parte de las BoNT elimina la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre CFP e YFP que puede detectarse.
Ambos ensayos proporcionan formas sensibles y convenientes de detectar toxinas y caracterizar las actividades de las toxinas y ahora se utilizan ampliamente en los laboratorios. Un inconveniente importante de estos ensayos es que estos ensayos fluorescentes son propensos a la interferencia de las proteínas de albúmina sérica que se presentan en niveles elevados en los productos farmacéuticos de toxinas y muestras clínicas. Una solución actual es purificar las toxinas de estas muestras con anticuerpos específicos frente a las toxinas antes de estos ensayos de fluorescencia, pero agrega un costo significativo al ensayo y requiere agentes especiales (anticuerpos frente a las toxinas) que no están fácilmente disponibles.
Actualmente, las empresas farmacéuticas utilizan numerosos ratones cada año para cuantificar la actividad de las toxinas. Existe una necesidad apremiante de desarrollar un ensayo basado en células que reemplace el bioensayo en ratones, con el fin de reducir el uso de animales en la producción de las BoNT. Los ensayos basados en células ofrecen la capacidad de examinar todos los aspectos de la actividad de las toxinas, incluyendo la unión al receptor, la translocación de membrana y las actividades enzimáticas. Estos aspectos no son capturados por ninguno de los ensayosin vitro.Actualmente, sólo existe un ensayo basado en células bien establecido por una importante empresa farmacéutica (Allergan). Este ensayo es un ensayo de tipo ELISA basado en el uso de un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína SNAP-25 escindida por BoNT/A. Brevemente, las células se exponen a BoNT/A y el SNAP-25 escindido es sedimentado e inmovilizado por un anticuerpo especial que solo reconoce el SNAP-25 escindido, pero no la proteína de longitud completa. Luego, un segundo anticuerpo de SNAP-25 detecta el SNAP-25 inmovilizado. Este ensayo ofrece buena sensibilidad y potencialmente puede reemplazar el ensayo en ratón. Está aprobado por la FDA para cuantificar productos de toxinas. El principal inconveniente es que depende de un anticuerpo especializado generado por Allergan.
Los ensayos alternativos que están en desarrollo incluyen el uso de CFP-SNAP-25-YFP como sustratos en células (BioSentinel LLC). La escisión de esta proteína de fusión en las células suprime las señales FRET entre CFP e YFP. El principal inconveniente es que este ensayo también requiere equipos complicados, como un microscopio de fluorescencia.
En la presente memoria se describe un nuevo ensayo desarrollado para detectar y medir la actividad de las BoNTin vitroein vivo.El ensayo se basa en el desarrollo de una forma dividida de luciferasa. La luciferasa NANOLUC™ es una nueva generación de luciferasa con una excelente estabilidad proteica y señales luminiscentes muy aumentadas (>100 veces más que la luciferasa clásica de luciérnaga). Esta luciferasa se puede dividir en dos partes. Cuando estas dos partes están cerca una de la otra, pueden reconstituirse en una forma completamente activa que genera señales luminiscentes. Las señales luminiscentes quedan suprimidas cuando estas dos partes se separan entre sí. En una realización ilustrativa representada en la FIG. 1, se inserta una región conectora derivada de los sustratos de las toxinas (SNAP-25 para BoNT/A, E y C, sinaptobrevina para BoNT/B, D, F, G) entre dos fragmentos de la luciferasa NANOLUC™. La escisión de esta región conectora por las BoNT separa los dos fragmentos de la luciferasa NANOLUC™ y suprime su actividad, lo que resulta en una reducción de las señales luminiscentes. Para demostrar la viabilidad de este enfoque, se diseñaron y ensayaron los siguientes sensores de toxinas.
Sensores de toxinasin vitro:se crearon y ensayaron tres prototipos de sensores de toxinas in vitro diferentes (FIG.
2A-FIG. 2B, FIG. 3A-FIG. 3B). El primer sensor contiene un fragmento de SNAP-25 que puede ser escindido por BoNT/A, E y C entre los dos fragmentos de NANOLUC™ divididos (N-nano y C-nano, respectivamente, FIG. 2A-FIG.
2B). El segundo sensor contiene un fragmento adicional de SV2C que sirve como receptor de toxinas, lo que puede aumentar la eficiencia de la escisión al mejorar las interacciones entre las toxinas y el sensor. La tercera versión contiene un fragmento de sinaptobrevina que puede escindirse por BoNT/B, D, F y G (FIG. 3A-FIG. 3B).
Estas proteínas sensoras se purificaron como proteínas recombinantes. Las dos versiones de sensores que contenían SNAP-25 se incubaron con un gradiente de concentraciones de BoNT/A durante 4 o 24 horas. Las actividades de luciferasa restantes se midieron y representaron gráficamente como se muestra en la FIG. 2A. Como control, se encontró que BoNT/B no afectaba la actividad luciferasa de estos dos sensores, lo que demuestra la especificidad de estos dos sensores para BoNT/A. Como se muestra en la FIG. 2B, el sensor que contiene el fragmento SV2C tiene una CE50 de 9,7 pM después de cuatro horas de incubación. Este es aproximadamente 5 veces más sensible que el sensor sin SV2C, lo que indica que incluir el fragmento de receptores de toxinas puede dar como resultado un sensor de toxinas más sensible.
La tercera proteína sensora se incubó con un gradiente de BoNT/B. Las actividades de luciferasa restantes se midieron y representaron gráficamente como se muestra en la FIG. 3A. La CE50, enumerada en la FIG. 3B, es aproximadamente 75,7 pM después de 4 horas de incubación. La incubación de toxinas con el sensor durante 24 horas mejoró significativamente la CE50 a 3,9 pM.
Ventaja en comparación con los sensores in vitro disponibles:estos sensores de toxinas basados en luciferasa proporcionan una sensibilidad similar a la de los sensores basados en fluorescencia. La principal ventaja de estos sensores basados en luciferasa dividida es que no se ven afectados por la presencia de proteínas de albúmina sérica.
Ensayo basado en células:en la FIG. 4 se ilustra una realización ilustrativa de un sensor para ensayos basados en células. Contiene un SNAP-25 de longitud completa entre fragmentos de la luciferasa NANOLUC™ divididos. Además, también contiene una luciferasa de luciérnaga entre N-nano y SNAP-25, que proporciona un control interno para los niveles de expresión de las proteínas sensoras en las células. Esta proteína sensora se expresa en las neuronas mediante una infección mediada por lentivirus. Luego, las neuronas se expusieron a diversas concentraciones de BoNT/A. Los lisados celulares se recogieron 48 horas después y se midieron las actividades de luciferasa tanto de la luciferasa de luciérnaga como de la luciferasa NANOLUC™. Los niveles de la luciferasa NANOLUC™ se normalizan utilizando las señales de la luciferasa de luciérnaga y luego se normalizan respecto a las neuronas de control que no estuvieron expuestas a ninguna toxina (FIG. 4). La incubación de neuronas con toxinas redujo las señales de la luciferasa NANOLUC™ (FIG. 4), con una CE50 de 2,9 pM.
Ventaja en comparación con los ensayos basados en células disponibles:el ensayo descrito en la presente memoria proporciona una sensibilidad similar al ensayo basado en ELISA establecido por Allergan. La principal ventaja del presente ensayo es que no requiere ningún anticuerpo especial. También es más fácil, económico y rápido que el ensayo ELISA.
Se contempla específicamente en la presente memoria que los sensores de toxinas y los ensayos basados en células como se describen en la presente memoria ofrecen formas más rápidas, económicas y sencillas para que las compañías farmacéuticas midan y cuantifiquen la actividad de BoNT/A y BoNT/B, reemplazando potencialmente el bioensayo en ratón.
Construcciones in vitro e in vivo para la detección de las BoNT.Para la detección de BoNT/A, la construcción se clonó en el vector pET28a con NocI/NotI y los insertos fueron Nnano-SV2C(529-566)-G4S-SNAP25(141-206)-Cnano y Nnano-SNAP25(141-206)-Cnano ("g 4s " divulgado como SEQ ID NO: 6). La secuencia de la luciferasa n An OLUC™ dividida está disponible en Promega. Se utilizó PCR superpuesta para obtener insertos completos y luego los insertos se ligaron en un vector cortado. Para la detección de BoNT/B, la construcción fue Nnano-VAMP(35-96)-Cnano.
Para la detección in vivo de BoNT/A, las construcciones se diseñaron utilizando luciérnaga dividida o NANOLUC dividida, luego la renilla y luciérnaga como controles internos se aplicaron por separado. El control interno está ubicado justo enfrente del SNAP25 (longitud completa). El vector se basó en vectores lentivirales pcDNA3.1 y syn-lox.
Clonación de construcciones de ensayo in vitro.
Sensor 1: NNano-SV2C-p25-CNano
NcoI-Nnano(1 -159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-SV2C(529-566)-GGGGS-P25(141 -206)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano (160-170)-NotI-His6-parada ("GSSGGGGSGGGGSSG" divulgado como SEQ ID NO: 4, "GGGGS" divulgado como SEQ ID NO: 6, "GSSGGGGSGGGSSG" divulgado como SEQ ID NO: 5 e "His6" divulgado como SEQ ID NO: 12)
Sensor 2: NNano-p25-CNano
NcoI-Nnano-(1 -159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-p25(141 -206)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-parada ("GSSGGGGSGGGGSSG" divulgado como SEQ ID NO: 4, "GSSGGGGSGGGSSG" divulgado como S<e>Q ID NO: 5 e "His6" divulgado como SEQ ID NO: 12)
Sensor 3: NNano-hVAMP1-CNano
Ncol-Nnano-(1 -159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-VAMP1 humano(35-96)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-parada ("GSSGGGGSGGGGSSG" divulgado como SEQ ID NO: 4, "GSSGGGGSGGGSSG" divulgado como SEQ ID NO: 5 e "His6" divulgado como SEQ ID NO: 12)
Clonación de la construcción de ensayo in vivo
BamHI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGSSG-SacI-Luciérnaga (longitud completa)-GGGGS-p25(longitud completa)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI (codón de parada) ("G<g>G<g>S" divulgado como SEQ ID NO: 6 y "GSSGGGGSGGGSSG" divulgado como SEQ ID NO: 5)
Purificación por IMAC de proteínas sensoras para ensayo in vitro.Se purificaron diferentes construcciones de proteínas sensoras utilizando columnas de afinidad de metales inmovilizados (IMAC). La etiqueta His6 (SEQ ID NO: 12) se clonó en el vector pET28a en el extremo C. Se inoculó BL21 que contenía el plásmido correcto de la construcción in vitro durante la noche y se cultivó a 37 °C hasta una D.O. de alrededor de 0,6-0,8, luego se indujo con 0,25 mM de IPTG (concentración final) durante la noche a 20 °C. Las células se recogen mediante centrifugación a 4.500 g, 10 minutos. Después de eso, los sedimentos celulares se disolvieron en tampón HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y seguido de sonicación durante 3 minutos. El sobrenadante del lisado celular se guardó y se mezcló con perlas de Ni2+ durante 1 h con rotación a 4 °C. Posteriormente, la mezcla se cargó en la columna y la resina se lavó 10 veces con un lecho de columna de imidizol 20 mM en tampón HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Finalmente, la proteína se eluyó en 4 veces de la columna de lecho de imidizol 500 mM en tampón HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. La proteína sensora purificada se dializó en tampón HEPES 50 mM, pH 7,1 para realizar el ensayo inmediatamente.
Ensayo in vitro de detección de toxinas.La concentración de proteínas sensoras se estima mediante SDS-PAGE con BSA estándar como referencia. Se prepararon 30 nM de proteína sensora en tampón HEPES 50 mM, ZnCl<2>20 |uM, DTT 2 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7,1. La toxina botulínica A se diluyó y se añadió a una solución de proteína sensora con una serie de concentraciones de 1 nM a 1 fM con factor de dilución 10. Después de 4 h y 24 h de incubación a 37 °C, se añadió el sustrato Nano-Glo™ (Promega) a cada muestra en igual volumen. La señal luminiscente se midió en un lector de placas. El ensayo se realizó por duplicado. También se diseñaron y realizaron controles negativos. BoNT/A se mezcló con la proteína sensora Nnano-VAMP-Cnano o BoNT/B se mezcló con la proteína sensora Nnano-SV2C-p25-Cnano.
Ensayo in vivo (ensayo basado en células) de detección de toxinas.Se añadió virus de construcción dual de luciferasa (luciérnaga como control interno y NANOLUC™ dividida para la detección de escisión) a células neuronales de 7 días y luego se añadió toxina botulínica A de una concentración en serie de 300 pM a 1 pM a células neuronales de 13 días por triplicado. Después de 48 h de exposición a la toxina, las células neuronales se lisaron añadiendo 200 |ul de tampón de lisis pasivo (Promega) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se mezclaron 50 |ul de lisado celular con 50 |ul de sustrato de luciferasa de luciérnaga (reactivo ONE-Glo (TM) EX) y se midieron las emisiones de luz. Posteriormente, se añadieron 50 |ul del sustrato de la luciferasa NANOLUC™ (NanoDLR™ reactivo Stop & Glo (R)) y se midieron las emisiones de luz.
Claims (20)
1. Un polipéptido de cadena única que comprende, desde el N-terminal al C-terminal:
a. un fragmento N-terminal de una proteína informadora;
b. un conector que comprende: (i) un sitio de escisión de neurotoxina deC. botulinum(BoNT) y (ii) un fragmento de unión de un receptor de BoNT; y
c. un fragmento C-terminal de la proteína informadora;
en donde la proteína informadora es una proteína luciferasa, y en donde los fragmentos N-terminal y C-terminal comprenden colectivamente una secuencia de proteína luciferasa funcional cuando los fragmentos se unen entre sí mediante el conector y no cuando el conector se ha escindido en el sitio de escisión.
2. El polipéptido de cadena única según la reivindicación 1, en donde:
i) el fragmento N-terminal comprende una secuencia con al menos un 90 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>), y el fragmento C-terminal comprende una secuencia con al menos un 90 % de identidad de secuencia con los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>); o
ii) el fragmento N-terminal comprende una secuencia que tiene menos de 10 sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos con respecto a los aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>), y el fragmento C-terminal comprende una secuencia que tiene menos de 3 sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos con respecto a los aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>).
3. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, en donde el fragmento N-terminal tiene la secuencia de aminoácidos 1-159 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (N-nano<1-159>) y el fragmento C-terminal tiene la secuencia de aminoácidos 160-170 de la luciferasa de la SEQ ID NO: 1 (C-nano<160-170>).
4. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, en donde el sitio de escisión de BoNT es reconocido por BoNT de serotipo A, E, C, B, D, F o G.
5. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, en donde:
i) el sitio de escisión de BoNT es de una proteína SNARE;
ii) el sitio de escisión de BoNT es de una proteína SNARE y la proteína SNARE es SNAP-25, sinaptobrevina (VAMP) o sintaxina;
iii) el sitio de escisión de BoNT son los aminoácidos 141-206 de SNAP-25b humano;
iv) el sitio de escisión de BoNT son los aminoácidos 35-96 de VAMP1 humano; o
v) el sitio de escisión de BoNT son los aminoácidos 1-206 de SNAP-25b humano.
6. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, en donde el fragmento de unión de un receptor de BoNT está ubicado entre el fragmento N-terminal y el sitio de escisión de BoNT.
7. La cadena polipeptídica única de la reivindicación 6, en donde el fragmento de unión de un receptor de BoNT es un fragmento de un receptor de BoNT humano, de ratón, de rata o de primate.
8. El polipéptido de cadena única de la reivindicación 7, en donde el receptor de BoNT:
i) es SV2C;
ii) comprende los aminoácidos 529-566 de SV2C humano;
iii) es SYTI;
iv) comprende los aminoácidos 32-52 de SYTI;
v) es SYT2; o
vi) comprende los aminoácidos 40-60 de SYT2.
9. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, en donde:
i) el conector comprende además un segundo polipéptido informador de luciferasa intacto ubicado entre el fragmento N-terminal y el sitio de escisión de BoNT; o
ii) el conector comprende además un segundo polipéptido informador de luciferasa intacto ubicado entre el fragmento N-terminal y el sitio de escisión de BoNT, y en donde el segundo polipéptido informador de luciferasa es luciferasa de luciérnaga(e. g , Photinus pyralis),luciferasa bacteriana(e. g , Vibrio fischeri, Vibrio harveyi),luciferasa del pensamiento de mar(Renilla reniformis),luciferasa de dinoflagelado, luciferasa deGaussiao luciferasa de copépodos.
10. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, que comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina.
11. El polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior, en donde el conector comprende uno o más espaciadores ubicados entre el sitio de escisión de BoNT y el fragmento N-terminal, uno o más espaciadores ubicados entre el sitio de escisión de BoNT y el fragmento C-terminal, o una combinación de los mismos.
12. El polipéptido de cadena única de la reivindicación 6, en donde el conector comprende además uno o más espaciadores ubicados entre el fragmento de unión de un receptor de BoNT y el sitio de escisión de BoNT.
13. El polipéptido de cadena única de la reivindicación 9, en donde el conector comprende además uno o más espaciadores ubicados entre el segundo polipéptido informador de luciferasa y el sitio de escisión de BoNT.
14. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cadena única de cualquier reivindicación anterior.
15. Un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 14.
16. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 14.
17. Un métodoin vitropara determinar la potencia de la neurotoxina deC. botulinum(BoNT), que comprende:
a) poner en contacto la BoNT con un polipéptido de cadena única en condiciones apropiadas para la actividad de la BoNT, en donde el polipéptido de cadena única comprende:
i) un fragmento N-terminal de una proteína informadora;
ii) un conector que comprende: (i) un sitio de escisión de neurotoxina de C.botulinum(BoNT), (ii) un fragmento de unión de un receptor de BoNT; y
iii) un fragmento C-terminal de la proteína informadora;
en donde la proteína informadora es una proteína luciferasa, y en donde los fragmentos N-terminal y C-terminal comprenden colectivamente una secuencia de proteína luciferasa funcional cuando los fragmentos se unen entre sí mediante el conector y no cuando el conector se ha escindido en el sitio de escisión; y
b) determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con una referencia, determinando así la potencia.
18. Un método para detectar la actividad de la neurotoxina de C.botulinum(BoNT) en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido de cadena única, en condiciones apropiadas para la actividad de la BoNT, en donde el polipéptido de cadena única comprende:
i) un fragmento N-terminal de una proteína informadora;
ii) un conector que comprende: (i) un sitio de escisión de neurotoxina de C.botulinum(BoNT) y (ii) un fragmento de unión de un receptor de BoNT; y
iii) un fragmento C-terminal de la proteína informadora;
en donde la proteína informadora es una proteína luciferasa, y en donde los fragmentos N-terminal y C-terminal comprenden colectivamente una secuencia de proteína luciferasa funcional cuando los fragmentos se unen entre sí mediante el conector y no cuando el conector se ha escindido en el sitio de escisión; y
b) determinar la actividad luciferasa del polipéptido, en comparación con la actividad luciferasa del polipéptido en ausencia de la muestra, en donde una disminución de la actividad luciferasa indica actividad BoNT en la muestra.
19. El método de la reivindicación 18, en donde el polipéptido de cadena única es expresado por una célula neuronal y el método comprende, además, después de la etapa de contacto:
incubar las células neuronales durante un periodo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 60 horas y recoger el lisado de las células neuronales.
20. Un kit que comprende:
a) uno o más polipéptidos de cadena única descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, estando cada uno o una combinación de los polipéptidos de cadena única envasados en un recipiente separado;
b) uno o más ácidos nucleicos o vectores de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el uno o más polipéptidos de cadena única de a), con cada uno o una combinación de los ácidos nucleicos o vectores de ácidos nucleicos envasados en un recipiente separado; y/o
c) una o más células que expresan el uno o más polipéptidos de cadena única de a), con cada una o una combinación de las células envasadas en un recipiente separado.
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