JP7227901B2 - ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 - Google Patents
ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年10月20日出願の米国仮出願第62/410558号の利益を主張し、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書は、配列表(「0342941_0630_SL.TXT」という名称の.txtファイルとして電子的に提出される)を参照するものである。この.txtファイルは、2017年10月13に作成されたものであり、そのサイズは、34,305バイトである。配列表の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ボツリヌス神経毒素(BoNT)は、バイオテロの懸念でも治療への応用でも関心を集める物質である。伝統的に、BoNTの検出及び特徴付けは、試料をマウスに投与し、かなりの用量でマウスを死に至らしめることによって実施されている。細胞またはインビトロで実施することができるアッセイが探求されているものの、こうしたアッセイは、感度または特異性が伴わないという問題を抱えており、臨床試料に共通する成分との反応が生じる結果として陽性シグナルを生じさせてしまうことが多い。
インビトロとインビボとの両方においてBoNTの活性を検出及び測定するために開発された新たなアッセイが本明細書に記載される。このアッセイでは、例えばBoNT活性のセンサーとして働くように操作されたBoNT基質を介して分断型ルシフェラーゼが連結されることによって特徴付けられる特有の単鎖ポリペプチドが使用される。BoNTが存在すると、当該毒素によってリンカー領域が切断される結果、ルシフェラーゼ活性が減少し、この活性減少は、容易に検出される。
である。
[本発明1001]
a.レポータータンパク質のN末端断片と、
b.神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記レポータータンパク質のC末端断片と、
をN末端からC末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記N末端断片及び前記C末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、前記リンカーによって前記N末端断片と前記C末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1002]
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、本発明1001の単鎖ポリペプチド。
[本発明1003]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むN末端ドメイン(N-nano 1~159 )と、
b.前記N-nano 1~159 のC末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有するC末端ドメイン(C-nano 160~170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N-nano 1~159 と前記C-nano 160~170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1004]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159に対する置換、欠失、または付加が10アミノ酸残基未満である配列を含むN末端ドメイン(N-nano 1~159 )と、
b.前記N-nano 1~159 のC末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170に対する置換、欠失、または付加が3アミノ酸残基未満である配列を有するC末端ドメイン(C-nano 160~170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N-nano 1~159 と前記C-nano 160~170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1005]
前記N末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159の配列(N-nano 1~159 )を有し、前記C末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170の配列(C-nano 160~170 )を有する、本発明1003~1004のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1006]
前記神経毒素切断部位が、C.ボツリヌム(C.botulinum)神経毒素(BoNT)切断部位及び/または破傷風神経毒素切断部位である、本発明1001~1005のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1007]
前記リンカーが、前記BoNT切断部位と前記N末端断片もしくはN末端ドメインとの間、前記神経毒素切断部位と前記C末端断片もしくはC末端ドメインとの間、またはそれらの両方に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、本発明1001~1006のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1008]
前記リンカーが、前記BoNT及び/または破傷風神経毒素に対する受容体の結合断片をさらに含む、本発明1001~1007のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1009]
前記結合断片が、前記N末端断片またはN末端ドメインと前記BoNT切断部位との間に位置する、本発明1008の単鎖ポリペプチド。
[本発明1010]
前記リンカーが、前記結合断片と前記BoNT切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1008~1009のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1011]
少なくとも1つのスペーサーが、グリシン及びセリンから構成される、本発明1001~1010のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1012]
少なくとも1つのスペーサーが、5~15アミノ酸である、本発明1001~1011のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1013]
少なくとも1つのスペーサーが、配列番号4~9から選択される、本発明1001~1012のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1014]
前記BoNTが、A、E、C、B、D、F、またはGである、本発明1006~1013のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1015]
前記BoNT切断部位が、SNAREタンパク質に由来する、本発明1006~1014のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1016]
前記SNAREタンパク質が、SNAP-25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンである、本発明1015の単鎖ポリペプチド。
[本発明1017]
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP-25bのアミノ酸141~206である、本発明1006~1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1018]
前記BoNT切断部位が、ヒトVAMP1のアミノ酸35~96である、本発明1006~1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1019]
前記受容体が、ヒトSV2Cである、本発明1008~1017のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1020]
前記結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529~566であるか、またはヒトSV2Cのアミノ酸529~566との同一性が少なくとも90%である配列であるか、またはヒトSV2Cのアミノ酸529~566に対する置換、欠失、もしくは付加が10アミノ酸残基以下である配列である、本発明1019の単鎖ポリペプチド。
[本発明1021]
ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、本発明1001~1020のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1022]
前記ポリヒスチジン親和性タグが、前記ポリペプチドのC末端に位置する、本発明1021の単鎖ポリペプチド。
[本発明1023]
前記リンカーが、前記N末端断片またはN末端ドメインと前記BoNT切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1001~1022のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1024]
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(例えば、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis))、細菌ルシフェラーゼ(例えば、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi))、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ(Renilla reniformis))、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1023の単鎖ポリペプチド。
[本発明1025]
前記リンカーが、前記第2のルシフェラーゼポリペプチドと前記BoNT切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1023または本発明1024の単鎖ポリペプチド。
[本発明1026]
前記スペーサーが、5~15アミノ酸である、本発明1025の単鎖ポリペプチド。
[本発明1027]
前記スペーサーが、
である、本発明1025または本発明1026の単鎖ポリペプチド。
[本発明1028]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159(N-nano 1~159 )と、
b.i.5~15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、SV2Cのアミノ酸529~566から構成される結合断片、
iii.前記結合断片のC末端に位置する第2のスペーサー、
iv.前記第2のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸141~206を含むBoNT切断部位、
v.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第3のスペーサー
を含む、前記N-nano 1~159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170(C-nano 160~170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N-nano 1~159 と前記C-nano 160~170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1029]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159(N-nano 1~159 )と、
b.i.5~15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸141~206を含むBoNT切断部位、
iii.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N-nano 1~159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170(C-nano 160~170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N-nano 1~159 と前記C-nano 160~170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1030]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159(N-nano 1~159 )と、
b.i.5~15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトVAMP1のアミノ酸35~96を含むBoNT切断部位、
iii.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N-nano 1~159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170(C-nano 160~170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N-nano 1~159 と前記C-nano 160~170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1031]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159(N-nano 1~159 )と、
b.i.第2の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、
ii.前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのC末端に位置する5~15アミノ酸の第1のスペーサー、
iii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸1~206を含むBoNT切断部位、
iv.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N-nano 1~159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170(C-nano 160~170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N-nano 1~159 と前記C-nano 160~170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1032]
1つまたは複数のスペーサーが、
である、本発明1028~1031のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1033]
前記C末端に位置するHis6配列(配列番号12)をさらに含む、本発明1028~1032のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1001~1033のいずれかの単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1035]
本発明1034の核酸を含む、核酸ベクター。
[本発明1036]
発現ベクターであり、発現可能な形態の前記核酸配列を含む、本発明1035の核酸ベクター。
[本発明1037]
ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターからなる群から選択される、本発明1036の核酸ベクター。
[本発明1038]
本発明1034の核酸または本発明1035~1037のいずれかの核酸ベクターを含む、細胞。
[本発明1039]
本発明1001~1033のいずれかの単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1038の細胞。
[本発明1040]
原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である、本発明1039の細胞。
[本発明1041]
ボツリヌス神経毒素の効力を決定するための方法であって、
(a)BoNT活性に適した条件下で本発明1001~1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記神経毒素を接触させること、及び
(b)参照基準と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって前記効力を決定すること、
を含む、前記方法。
[本発明1042]
試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、
(a)BoNT活性に適した条件下で本発明1001~1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させること、及び
(b)前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、
を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるBoNT活性が示される、前記方法。
[本発明1043]
インビトロで実施される、本発明1041~1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記接触が、50mMのHEPES、20μMのZnCl 2 、2mMのDTT、1mg/mlのBSAを含む緩衝液(pH7.1)において実施される、本発明1041~1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記試料と接触する前記単鎖ポリペプチドの濃度が、約30nM~300nMである、本発明1041~1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度が、約30nMである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ基質を前記単鎖ポリペプチドに添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定される、本発明1041~1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記条件が、約37℃で約1時間~約36時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041~1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記条件が、約37℃で約1時間~約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041~1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記条件が、約37℃で約4時間~約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041~1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記リンカーが、
5~15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記第1のスペーサーのC末端かつ前記BoNT切断部位のN末端に位置する、ヒトSV2Cのアミノ酸529~566の結合断片と、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸141~206を含む、本発明1041~1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記リンカーが、
前記BoNT切断部位のN末端に位置する5~15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸141~206を含む、本発明1041~1050のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記リンカーが、
前記BoNT切断部位のN末端に位置する5~15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトVAMP1のアミノ酸35~96を含む、本発明1041~1050のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約12時間~約60時間の期間インキュベートすること、及び
前記神経細胞から溶解液を回収すること、
をさらに含む、本発明1041~1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、
(a)配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159(N-nano 1~159 )と、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170(C-nano 160~170 )とが、前記N-nano 1~159 のC末端かつ前記C-nano 160~170 のN末端に位置する、BoNT切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に前記試料を接触させること、
(b)前記神経細胞を約12時間~約60時間の期間インキュベートすること、
(c)前記神経細胞から溶解液を回収すること、
(d)前記試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるルシフェラーゼ活性と比較して前記溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定すること、
を含み、
前記ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるBoNT活性が示される、前記方法。
[本発明1056]
前記リンカーが、前記N-nano 1~159 と前記切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1041~1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(フォティヌス・ピラリス)、細菌ルシフェラーゼ(ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ)、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ)、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記試料における前記第2のルシフェラーゼポリペプチドの前記ルシフェラーゼ活性が決定され、前記回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される、本発明1056~1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記神経細胞が、ウイルス発現ベクターから前記単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1054~1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記単鎖ポリペプチドが、段階(a)の前の6日間発現する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記ウイルス発現系が、レンチウイルス発現系である、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記インキュベート段階が、約48時間実施される、本発明1054~1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記回収段階が、溶解緩衝液を添加することによって実施される、本発明1054~1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記BoNT切断部位が、SNAP-25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンに由来するものである、本発明1041~1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記BoNT切断部位が、BoNT A、BoNT E、及びBoNT Cによって特異的に認識されるか、またはBoNT B、BoNT D、BoNT F、及びBoNT Gによって特異的に認識される、本発明1041~1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
異なるBoNT切断部位を有する単鎖ポリペプチドの組み合わせが使用される、本発明1041~1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP-25のアミノ酸141~206、またはヒトVAMP1のアミノ酸35~96、ヒトSNAP35のアミノ酸1~206、またはVAMP1のアミノ酸1~96である、本発明1041~1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記リンカーが、BoNT受容体の結合断片をさらに含む、本発明1041~1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記受容体が、SV2Cである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529~566を含む、本発明1068~1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記リンカーが、
第2のルシフェラーゼポリペプチドと、
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのC末端かつ前記BoNT切断部位のN末端に位置する5~15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5~15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸1~206を含み、前記第1のスペーサーのC末端に位置する、本発明1041~1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
ルシフェラーゼ活性の測定が、前記ルシフェラーゼに特異的な基質を添加し、得られる発光シグナルを定量的に検出することによって実施される、本発明1041~1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
配列番号1のルシフェラーゼの前記基質が、フリマジン(2-フラニルメチル-デオキシ-セレンテラジン)である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
以下を含む、キット:
(a)1つもしくは複数の、本発明1001~1033のいずれかの単鎖ポリペプチドであって、前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド、
(b)1つもしくは複数の、本発明1034~1037のいずれかの核酸もしくは核酸ベクターであって、前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター、及び/または
(c)1つもしくは複数の、本発明1038~1040のいずれかの細胞であって、前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
[本発明1075]
独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む、本発明1074のキット。
酵素活性の測定及び/または検出に関する組成物及び方法が本明細書に記載される。具体的には、組成物及び方法は、神経毒素の検出及び/または測定に関し、こうした神経毒素は、例えば、C.ボツリヌム神経毒素(BoNT)である。
が含まれ得る。リンカーの設計、選択、及び別のリンカーの例は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Chen,X.,et al,“Fusion protein linkers:proterty,design and functionality”Adv.Drug Deliv.Rev.(2013)に記載されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
異なるインビトロプロトタイプ毒素センサーを3つ創出し、試験した(図2A~図2B、図3A~図3B)。第1のセンサーは、BoNT/A、BoNT/E、及びBoNT/Cが切断できるSNAP-25断片を2つの分断型NANOLUC(商標)断片(それぞれN-nano及びC-nano、図2A~図2B)の間に含む。第2のセンサーは、毒素受容体として働くSV2Cの断片を追加で含んでおり、この断片を含むことで、毒素とセンサーとの間の相互作用が増進することによって切断効率が高まり得る。第3のバージョンは、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、及びBoNT/Gが切断できるシナプトブレビン断片を含む(図3A~図3B)。
ルシフェラーゼに基づくこうした毒素センサーからは、蛍光に基づくセンサーと同様の感度が得られる。分断型ルシフェラーゼに基づくこうしたセンサーの主な利点は、血清アルブミンタンパク質の存在によってこうしたセンサーが影響を受けないことである。
細胞ベースのアッセイのためのセンサーの例示の実施形態は、図4に示される。この実施形態は、分断型NANOLUC(商標)ルシフェラーゼ断片の間に全長SNAP-25を含む。さらに、この実施形態は、N-nanoとSNAP-25との間にホタルルシフェラーゼも含んでおり、このホタルルシフェラーゼは、細胞におけるセンサータンパク質の発現レベルに対する内部標準となる。このセンサータンパク質は、レンチウイルス介在性の感染を介して神経細胞において発現する。その後、さまざまな濃度のBoNT/Aに神経細胞を曝露した。48時間後に細胞溶解液を収集し、ホタルルシフェラーゼとNANOLUC(商標)ルシフェラーゼとの両方のルシフェラーゼ活性を測定した。NANOLUC(商標)ルシフェラーゼのレベルは、ホタルルシフェラーゼシグナルを使用して正規化され、次に、いずれの毒素にも曝露されなかった対照神経細胞に正規化される(図4)。毒素と共に神経細胞をインキュベートすると、NANOLUC(商標)ルシフェラーゼのシグナルは減少し(図4)、EC50は、2.9pMであった。
本明細書に記載のアッセイからは、Allerganによって確立されたELISAベースのアッセイと同様の感度が得られる。本アッセイの主な利点は、本アッセイではいずれの特殊な抗体も必要ないことである。本アッセイは、ELISAアッセイと比較して、より簡単、安価、かつ迅速でもある。
BoNT/Aの検出については、NocI/NotIを有するpET28aベクターにコンストラクトをクローニングし、Nnano-SV2C(529-566)-G4S-SNAP25(141-206)-Cnano及びNnano-SNAP25(141-206)-Cnano(「G4S」は、配列番号6として開示のものである)を挿入断片とした。分断型NANOLUC(商標)ルシフェラーゼ配列は、Promegaから利用可能である。全挿入断片を得るためにオーバーラップPCRを使用した後、挿入断片を切断ベクターにライゲーションした。BoNT/Bの検出については、Nnano-VAMP(35-96)-Cnanoをコンストラクトとした。
センサー1:NNano-SV2C-p25-CNano
は、配列番号4として開示のものであり、
“GGGGS”は、配列番号6として開示のものであり、
は、配列番号5として開示のものであり、
“His6”は、配列番号12として開示のものである。)
固定化金属親和性カラム(Immobilized Metal Affinity Column)(IMAC)を使用してセンサータンパク質の異なるコンストラクトを精製した。C末端に配置されるようにHis6タグ(配列番号12)をpET28aベクターにクローニングした。インビトロコンストラクトの正しいプラスミドを含むBL21を植菌して一晩保持し、光学濃度(O.D.)がおよそ0.6~0.8となるまで37℃で培養した後、20℃で一晩、0.25mM(最終濃度)のIPTGで誘導をかけた。4500gで10分間遠心分離することによって細胞を収集した。その後、50mMのHEPES及び150mMのNaClを含む緩衝液(pH7.4)に細胞のペレットを溶解した後、超音波で3分間処理した。細胞溶解液の上清を回収し、4℃で回転させながらNi2+ビーズと共に1時間混合した。その後、混合物をカラムに負荷し、50mMのHEPES及び150mMのNaClを含む緩衝液(pH7.4)に含めた20mMのイミジゾール(Imidizole)を使用し、カラム総容量の10倍量で樹脂を洗浄した。最終的に、50mMのHEPES及び150mMのNaClを含む緩衝液(pH7.4)に含めた500mMのイミジゾール(Imidizole)を使用し、カラム総容量の4倍量でタンパク質を溶出した。アッセイの即時実施のために、精製センサータンパク質を透析して50mMのHEPESを含む緩衝液(pH7.1)に含めた。
標準BSAを参照として使用し、SDS-PAGEによってセンサータンパク質の濃度を推定した。50mMのHEPES、20μMのZnCl2、2mMのDTT、1mg/mlのBSAを含む緩衝液(pH7.1)において30nMのセンサータンパク質を調製した。ボツリヌス毒素Aを希釈し、1nM~1fMの10倍希釈濃度系列としてセンサータンパク質溶液に添加した。37℃で4時間及び24時間インキュベートした後、それぞれの試料に対して等量のNano-Glo(商標)基質(Promega)を添加した。発光シグナルは、プレートリーダーで測定した。アッセイは、2連で実施した。負の対照も設計して実施した。BoNT/Aは、Nnano-VAMP-Cnanoセンサータンパク質と混合し、BoNT/Bは、Nnano-SV2C-p25-Cnanoセンサータンパク質と混合した。
二重ルシフェラーゼコンストラクト(内部標準としてのホタル及び切断を検出するための分断型NANOLUC(商標))のウイルスを7日目の神経細胞に添加した後、300pM~1pMの濃度系列のボツリヌス毒素Aを13日目の神経細胞に3連で添加した。毒素を48時間負荷した後、200μlの受動溶解緩衝液(passive lysis buffer)(Promega)を添加することによって神経細胞を溶解し、室温で20分間インキュベートした。50μlのホタルルシフェラーゼ基質(ONE-Glo(商標)EX試薬)と50μlの細胞溶解液を混合し、光の放出を測定した。その後、50μlのNANOLUC(商標)ルシフェラーゼ基質(NanoDLR(商標)Stop&Glo(登録商標)試薬)を添加し、光の放出を測定した。
Claims (35)
- a.レポータータンパク質のN末端断片と、
b.(i)神経毒素切断部位および(ii) C.ボツリヌム(C.botulinum)神経毒素(BoNT)に対する受容体またはその結合断片を含むリンカーと、
c.前記レポータータンパク質のC末端断片と
をN末端からC末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記N末端断片及び前記C末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、
前記リンカーによって前記N末端断片と前記C末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、
前記単鎖ポリペプチド。 - 前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記N末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159の配列(N-nano1~159)を有し、前記C末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170の配列(C-nano160~170)を有する、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記N末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列(N-nano1~159)を含み、前記C末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列(C-nano160~170)を含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記N末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1~159に対する置換、欠失、または付加が10アミノ酸残基未満である配列(N-nano1~159)を含み、前記C末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160~170に対する置換、欠失、または付加が3アミノ酸残基未満である配列(C-nano160~170)を含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素切断部位が、C.ボツリヌム(C.botulinum)神経毒素(BoNT)切断部位である、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNT切断部位が、セロタイプA、E、C、B、D、F、またはGのBoNTによって認識される、請求項6に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNT切断部位が、SNAREタンパク質に由来する、請求項6に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、SNAP-25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンである、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、ヒトSNAP-25bのアミノ酸141~206である、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、ヒトVAMP1のアミノ酸35~96である、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、ヒトSNAP25bのアミノ酸1~206である、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体またはその結合断片が、前記N末端断片と前記神経毒素切断部位との間に位置する、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体またはその結合断片が、ヒト、マウス、ラット、または霊長類のBoNTに対する受容体である、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体が、SV2Cである、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体の結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529~566に対応する配列番号11に示されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体が、SYTIである、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体の結合断片が、SYTIのアミノ酸32~52に対応する配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体が、SYT2である、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNTに対する受容体の結合断片が、SYT2のアミノ酸40~60に対応する配列番号18に示されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記N末端断片と前記神経毒素切断部位との間に位置するインタクトな第2のレポーターポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記第2のレポーターポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(例えば、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis))、細菌ルシフェラーゼ(例えば、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi))、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ(Renilla reniformis))、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、請求項21に記載の単鎖ポリペプチド。
- ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記神経毒素切断部位と前記N末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサー、前記神経毒素切断部位と前記C末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサー、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記BoNTに対する受容体またはその結合断片と前記N末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項13に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記BoNTに対する受容体またはその結合断片と前記神経毒素切断部位との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項13に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記第2のレポーターポリペプチドと前記N末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項21に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記第2のレポーターポリペプチドと前記神経毒素切断部位との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項21に記載の単鎖ポリペプチド。
- 請求項1に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項29に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
- 請求項29に記載の核酸を含む、細胞。
- C.ボツリヌム神経毒素(BoNT)の効力を決定するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(a)BoNT活性に適した条件下で単鎖ポリペプチドに前記BoNTを接触させる段階であって、前記単鎖ポリペプチドが、
(i)レポータータンパク質のN末端断片と、
(ii)(i)BoNT切断部位および(ii) 前記BoNTに対する受容体またはその結合断片を含むリンカーと、
(iii)前記レポータータンパク質のC末端断片と
を含む、段階;および
(b)参照基準のレポーター活性と比較して前記ポリペプチドのレポーター活性を決定し、それによって効力を決定する段階、
ここで、
前記参照基準はBoNTを含まない。 - 試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、以下:
(a)BoNT活性に適した条件下で単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させる段階であって、前記単鎖ポリペプチドが、
(i)レポータータンパク質のN末端断片と、
(ii)(i)BoNT切断部位および(ii) 前記BoNTに対する受容体またはその結合断片を含むリンカーと、
(iii)前記レポータータンパク質のC末端断片と
を含む、段階;および
(b)前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのレポーター活性と比較して前記ポリペプチドのレポーター活性を決定する段階
を含み、レポーター活性の減少が、前記試料における神経毒素の活性を示す、
方法。 - 前記接触させる段階が、前記単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に前記試料を接触させることを含み、前記方法が、前記接触段階の間に、
前記神経細胞を約12時間~約60時間の期間インキュベートする段階;及び
前記神経細胞から溶解液を回収する段階
をさらに含む、請求項33に記載の方法。 - 以下を含む、キット:
(a)1つもしくは複数の、請求項1に記載の単鎖ポリペプチドであって、
前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド;
(b)前記1つもしくは複数の(a)の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、1つもしくは複数の、核酸もしくは核酸ベクターであって、
前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター;及び/または
(c)前記1つもしくは複数の(a)の単鎖ポリペプチドを発現する1つもしくは複数の細胞であって、
前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
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