JP2019532651A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019532651A5 JP2019532651A5 JP2019521130A JP2019521130A JP2019532651A5 JP 2019532651 A5 JP2019532651 A5 JP 2019532651A5 JP 2019521130 A JP2019521130 A JP 2019521130A JP 2019521130 A JP2019521130 A JP 2019521130A JP 2019532651 A5 JP2019532651 A5 JP 2019532651A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chain polypeptide
- neurotoxin
- terminal fragment
- cleavage site
- amino acids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 118
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims description 68
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 claims description 68
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 66
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 claims description 62
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 60
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 55
- 231100000618 Neurotoxin Toxicity 0.000 claims description 27
- 108020003835 TX1 Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 210000004898 N-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000004900 C-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 claims description 11
- 102100006320 SV2C Human genes 0.000 claims description 10
- 101700035900 SV2C Proteins 0.000 claims description 10
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004183 Synaptosomal-Associated Protein 25 Human genes 0.000 claims description 7
- 102000004603 Vesicle-Associated Membrane Protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010017743 Vesicle-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 claims description 5
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 4
- 210000003867 nerve cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015799 Qa-SNARE Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 claims description 3
- 108050009583 Synaptobrevin Proteins 0.000 claims description 3
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 claims description 3
- ATCJTYORYKLVIA-SRXJVYAUSA-N Vamp regimen Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1.C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C(C45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C=O)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 ATCJTYORYKLVIA-SRXJVYAUSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 3
- 241000607620 Aliivibrio fischeri Species 0.000 claims description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims description 2
- 240000002863 Viola x wittrockiana Species 0.000 claims description 2
- 235000004031 Viola x wittrockiana Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims 1
- 102100006793 SYT2 Human genes 0.000 claims 1
- 101700016542 SYT2 Proteins 0.000 claims 1
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000254058 Photinus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101700022040 his-42 Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
Description
1つの態様では、a)1つもしくは複数の本明細書に記載の単鎖ポリペプチドであって、単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される単鎖ポリペプチド、b)1つもしくは複数の本明細書に記載の核酸もしくは核酸ベクターであって、核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される核酸もしくは核酸ベクター、及び/またはc)1つもしくは複数の本明細書に記載細胞であって、細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される細胞、を含むキットが本明細書に記載される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む。
[本発明1001]
a.レポータータンパク質のN末端断片と、
b.神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記レポータータンパク質のC末端断片と、
をN末端からC末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記N末端断片及び前記C末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、前記リンカーによって前記N末端断片と前記C末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1002]
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、本発明1001の単鎖ポリペプチド。
[本発明1003]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むN末端ドメイン(N−nano 1〜159 )と、
b.前記N−nano 1〜159 のC末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有するC末端ドメイン(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1004]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対する置換、欠失、または付加が10アミノ酸残基未満である配列を含むN末端ドメイン(N−nano 1〜159 )と、
b.前記N−nano 1〜159 のC末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対する置換、欠失、または付加が3アミノ酸残基未満である配列を有するC末端ドメイン(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1005]
前記N末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159の配列(N−nano 1〜159 )を有し、前記C末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170の配列(C−nano 160〜170 )を有する、本発明1003〜1004のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1006]
前記神経毒素切断部位が、C.ボツリヌム(C.botulinum)神経毒素(BoNT)切断部位及び/または破傷風神経毒素切断部位である、本発明1001〜1005のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1007]
前記リンカーが、前記BoNT切断部位と前記N末端断片もしくはN末端ドメインとの間、前記神経毒素切断部位と前記C末端断片もしくはC末端ドメインとの間、またはそれらの両方に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1008]
前記リンカーが、前記BoNT及び/または破傷風神経毒素に対する受容体の結合断片をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1009]
前記結合断片が、前記N末端断片またはN末端ドメインと前記BoNT切断部位との間に位置する、本発明1008の単鎖ポリペプチド。
[本発明1010]
前記リンカーが、前記結合断片と前記BoNT切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1008〜1009のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1011]
少なくとも1つのスペーサーが、グリシン及びセリンから構成される、本発明1001〜1010のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1012]
少なくとも1つのスペーサーが、5〜15アミノ酸である、本発明1001〜1011のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1013]
少なくとも1つのスペーサーが、配列番号4〜9から選択される、本発明1001〜1012のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1014]
前記BoNTが、A、E、C、B、D、F、またはGである、本発明1006〜1013のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1015]
前記BoNT切断部位が、SNAREタンパク質に由来する、本発明1006〜1014のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1016]
前記SNAREタンパク質が、SNAP−25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンである、本発明1015の単鎖ポリペプチド。
[本発明1017]
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP−25bのアミノ酸141〜206である、本発明1006〜1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1018]
前記BoNT切断部位が、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96である、本発明1006〜1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1019]
前記受容体が、ヒトSV2Cである、本発明1008〜1017のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1020]
前記結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566であるか、またはヒトSV2Cのアミノ酸529〜566との同一性が少なくとも90%である配列であるか、またはヒトSV2Cのアミノ酸529〜566に対する置換、欠失、もしくは付加が10アミノ酸残基以下である配列である、本発明1019の単鎖ポリペプチド。
[本発明1021]
ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1022]
前記ポリヒスチジン親和性タグが、前記ポリペプチドのC末端に位置する、本発明1021の単鎖ポリペプチド。
[本発明1023]
前記リンカーが、前記N末端断片またはN末端ドメインと前記BoNT切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1001〜1022のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1024]
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(例えば、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis))、細菌ルシフェラーゼ(例えば、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi))、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ(Renilla reniformis))、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1023の単鎖ポリペプチド。
[本発明1025]
前記リンカーが、前記第2のルシフェラーゼポリペプチドと前記BoNT切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1023または本発明1024の単鎖ポリペプチド。
[本発明1026]
前記スペーサーが、5〜15アミノ酸である、本発明1025の単鎖ポリペプチド。
[本発明1027]
前記スペーサーが、
である、本発明1025または本発明1026の単鎖ポリペプチド。
[本発明1028]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、SV2Cのアミノ酸529〜566から構成される結合断片、
iii.前記結合断片のC末端に位置する第2のスペーサー、
iv.前記第2のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸141〜206を含むBoNT切断部位、
v.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第3のスペーサー
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1029]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸141〜206を含むBoNT切断部位、
iii.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1030]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96を含むBoNT切断部位、
iii.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1031]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.第2の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、
ii.前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのC末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
iii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸1〜206を含むBoNT切断部位、
iv.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1032]
1つまたは複数のスペーサーが、
である、本発明1028〜1031のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1033]
前記C末端に位置するHis6配列(配列番号12)をさらに含む、本発明1028〜1032のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1035]
本発明1034の核酸を含む、核酸ベクター。
[本発明1036]
発現ベクターであり、発現可能な形態の前記核酸配列を含む、本発明1035の核酸ベクター。
[本発明1037]
ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターからなる群から選択される、本発明1036の核酸ベクター。
[本発明1038]
本発明1034の核酸または本発明1035〜1037のいずれかの核酸ベクターを含む、細胞。
[本発明1039]
本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1038の細胞。
[本発明1040]
原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である、本発明1039の細胞。
[本発明1041]
ボツリヌス神経毒素の効力を決定するための方法であって、
(a)BoNT活性に適した条件下で本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記神経毒素を接触させること、及び
(b)参照基準と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって前記効力を決定すること、
を含む、前記方法。
[本発明1042]
試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、
(a)BoNT活性に適した条件下で本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させること、及び
(b)前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、
を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるBoNT活性が示される、前記方法。
[本発明1043]
インビトロで実施される、本発明1041〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記接触が、50mMのHEPES、20μMのZnCl 2 、2mMのDTT、1mg/mlのBSAを含む緩衝液(pH7.1)において実施される、本発明1041〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記試料と接触する前記単鎖ポリペプチドの濃度が、約30nM〜300nMである、本発明1041〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度が、約30nMである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ基質を前記単鎖ポリペプチドに添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定される、本発明1041〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記条件が、約37℃で約1時間〜約36時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記条件が、約37℃で約1時間〜約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記条件が、約37℃で約4時間〜約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記リンカーが、
5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記第1のスペーサーのC末端かつ前記BoNT切断部位のN末端に位置する、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566の結合断片と、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸141〜206を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記リンカーが、
前記BoNT切断部位のN末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸141〜206を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記リンカーが、
前記BoNT切断部位のN末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートすること、及び
前記神経細胞から溶解液を回収すること、
をさらに含む、本発明1041〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、
(a)配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )とが、前記N−nano 1〜159 のC末端かつ前記C−nano 160〜170 のN末端に位置する、BoNT切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に前記試料を接触させること、
(b)前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートすること、
(c)前記神経細胞から溶解液を回収すること、
(d)前記試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるルシフェラーゼ活性と比較して前記溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定すること、
を含み、
前記ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるBoNT活性が示される、前記方法。
[本発明1056]
前記リンカーが、前記N−nano 1〜159 と前記切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1041〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(フォティヌス・ピラリス)、細菌ルシフェラーゼ(ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ)、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ)、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記試料における前記第2のルシフェラーゼポリペプチドの前記ルシフェラーゼ活性が決定され、前記回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される、本発明1056〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記神経細胞が、ウイルス発現ベクターから前記単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1054〜1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記単鎖ポリペプチドが、段階(a)の前の6日間発現する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記ウイルス発現系が、レンチウイルス発現系である、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記インキュベート段階が、約48時間実施される、本発明1054〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記回収段階が、溶解緩衝液を添加することによって実施される、本発明1054〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記BoNT切断部位が、SNAP−25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンに由来するものである、本発明1041〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記BoNT切断部位が、BoNT A、BoNT E、及びBoNT Cによって特異的に認識されるか、またはBoNT B、BoNT D、BoNT F、及びBoNT Gによって特異的に認識される、本発明1041〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
異なるBoNT切断部位を有する単鎖ポリペプチドの組み合わせが使用される、本発明1041〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP−25のアミノ酸141〜206、またはヒトVAMP1のアミノ酸35〜96、ヒトSNAP35のアミノ酸1〜206、またはVAMP1のアミノ酸1〜96である、本発明1041〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記リンカーが、BoNT受容体の結合断片をさらに含む、本発明1041〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記受容体が、SV2Cである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566を含む、本発明1068〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記リンカーが、
第2のルシフェラーゼポリペプチドと、
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのC末端かつ前記BoNT切断部位のN末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸1〜206を含み、前記第1のスペーサーのC末端に位置する、本発明1041〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
ルシフェラーゼ活性の測定が、前記ルシフェラーゼに特異的な基質を添加し、得られる発光シグナルを定量的に検出することによって実施される、本発明1041〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
配列番号1のルシフェラーゼの前記基質が、フリマジン(2−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン)である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
以下を含む、キット:
(a)1つもしくは複数の、本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドであって、前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド、
(b)1つもしくは複数の、本発明1034〜1037のいずれかの核酸もしくは核酸ベクターであって、前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター、及び/または
(c)1つもしくは複数の、本発明1038〜1040のいずれかの細胞であって、前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
[本発明1075]
独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む、本発明1074のキット。
[本発明1001]
a.レポータータンパク質のN末端断片と、
b.神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記レポータータンパク質のC末端断片と、
をN末端からC末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記N末端断片及び前記C末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、前記リンカーによって前記N末端断片と前記C末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1002]
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、本発明1001の単鎖ポリペプチド。
[本発明1003]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むN末端ドメイン(N−nano 1〜159 )と、
b.前記N−nano 1〜159 のC末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を有するC末端ドメイン(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1004]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対する置換、欠失、または付加が10アミノ酸残基未満である配列を含むN末端ドメイン(N−nano 1〜159 )と、
b.前記N−nano 1〜159 のC末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対する置換、欠失、または付加が3アミノ酸残基未満である配列を有するC末端ドメイン(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1005]
前記N末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159の配列(N−nano 1〜159 )を有し、前記C末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170の配列(C−nano 160〜170 )を有する、本発明1003〜1004のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1006]
前記神経毒素切断部位が、C.ボツリヌム(C.botulinum)神経毒素(BoNT)切断部位及び/または破傷風神経毒素切断部位である、本発明1001〜1005のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1007]
前記リンカーが、前記BoNT切断部位と前記N末端断片もしくはN末端ドメインとの間、前記神経毒素切断部位と前記C末端断片もしくはC末端ドメインとの間、またはそれらの両方に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1008]
前記リンカーが、前記BoNT及び/または破傷風神経毒素に対する受容体の結合断片をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1009]
前記結合断片が、前記N末端断片またはN末端ドメインと前記BoNT切断部位との間に位置する、本発明1008の単鎖ポリペプチド。
[本発明1010]
前記リンカーが、前記結合断片と前記BoNT切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1008〜1009のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1011]
少なくとも1つのスペーサーが、グリシン及びセリンから構成される、本発明1001〜1010のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1012]
少なくとも1つのスペーサーが、5〜15アミノ酸である、本発明1001〜1011のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1013]
少なくとも1つのスペーサーが、配列番号4〜9から選択される、本発明1001〜1012のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1014]
前記BoNTが、A、E、C、B、D、F、またはGである、本発明1006〜1013のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1015]
前記BoNT切断部位が、SNAREタンパク質に由来する、本発明1006〜1014のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1016]
前記SNAREタンパク質が、SNAP−25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンである、本発明1015の単鎖ポリペプチド。
[本発明1017]
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP−25bのアミノ酸141〜206である、本発明1006〜1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1018]
前記BoNT切断部位が、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96である、本発明1006〜1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1019]
前記受容体が、ヒトSV2Cである、本発明1008〜1017のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1020]
前記結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566であるか、またはヒトSV2Cのアミノ酸529〜566との同一性が少なくとも90%である配列であるか、またはヒトSV2Cのアミノ酸529〜566に対する置換、欠失、もしくは付加が10アミノ酸残基以下である配列である、本発明1019の単鎖ポリペプチド。
[本発明1021]
ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1022]
前記ポリヒスチジン親和性タグが、前記ポリペプチドのC末端に位置する、本発明1021の単鎖ポリペプチド。
[本発明1023]
前記リンカーが、前記N末端断片またはN末端ドメインと前記BoNT切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1001〜1022のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1024]
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(例えば、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis))、細菌ルシフェラーゼ(例えば、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi))、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ(Renilla reniformis))、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1023の単鎖ポリペプチド。
[本発明1025]
前記リンカーが、前記第2のルシフェラーゼポリペプチドと前記BoNT切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1023または本発明1024の単鎖ポリペプチド。
[本発明1026]
前記スペーサーが、5〜15アミノ酸である、本発明1025の単鎖ポリペプチド。
[本発明1027]
前記スペーサーが、
である、本発明1025または本発明1026の単鎖ポリペプチド。
[本発明1028]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、SV2Cのアミノ酸529〜566から構成される結合断片、
iii.前記結合断片のC末端に位置する第2のスペーサー、
iv.前記第2のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸141〜206を含むBoNT切断部位、
v.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第3のスペーサー
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1029]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸141〜206を含むBoNT切断部位、
iii.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1030]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96を含むBoNT切断部位、
iii.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1031]
a.配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、
b.i.第2の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、
ii.前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのC末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
iii.前記第1のスペーサーのC末端に位置し、ヒトSNAP25bのアミノ酸1〜206を含むBoNT切断部位、
iv.前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記N−nano 1〜159 のC末端に位置するリンカーと、
c.前記リンカーのC末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記N−nano 1〜159 と前記C−nano 160〜170 とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1032]
1つまたは複数のスペーサーが、
である、本発明1028〜1031のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1033]
前記C末端に位置するHis6配列(配列番号12)をさらに含む、本発明1028〜1032のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1035]
本発明1034の核酸を含む、核酸ベクター。
[本発明1036]
発現ベクターであり、発現可能な形態の前記核酸配列を含む、本発明1035の核酸ベクター。
[本発明1037]
ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターからなる群から選択される、本発明1036の核酸ベクター。
[本発明1038]
本発明1034の核酸または本発明1035〜1037のいずれかの核酸ベクターを含む、細胞。
[本発明1039]
本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1038の細胞。
[本発明1040]
原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である、本発明1039の細胞。
[本発明1041]
ボツリヌス神経毒素の効力を決定するための方法であって、
(a)BoNT活性に適した条件下で本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記神経毒素を接触させること、及び
(b)参照基準と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって前記効力を決定すること、
を含む、前記方法。
[本発明1042]
試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、
(a)BoNT活性に適した条件下で本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させること、及び
(b)前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、
を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるBoNT活性が示される、前記方法。
[本発明1043]
インビトロで実施される、本発明1041〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記接触が、50mMのHEPES、20μMのZnCl 2 、2mMのDTT、1mg/mlのBSAを含む緩衝液(pH7.1)において実施される、本発明1041〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記試料と接触する前記単鎖ポリペプチドの濃度が、約30nM〜300nMである、本発明1041〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度が、約30nMである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ基質を前記単鎖ポリペプチドに添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定される、本発明1041〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記条件が、約37℃で約1時間〜約36時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記条件が、約37℃で約1時間〜約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記条件が、約37℃で約4時間〜約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記リンカーが、
5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記第1のスペーサーのC末端かつ前記BoNT切断部位のN末端に位置する、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566の結合断片と、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸141〜206を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記リンカーが、
前記BoNT切断部位のN末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸141〜206を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記リンカーが、
前記BoNT切断部位のN末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートすること、及び
前記神経細胞から溶解液を回収すること、
をさらに含む、本発明1041〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、
(a)配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159(N−nano 1〜159 )と、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170(C−nano 160〜170 )とが、前記N−nano 1〜159 のC末端かつ前記C−nano 160〜170 のN末端に位置する、BoNT切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に前記試料を接触させること、
(b)前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートすること、
(c)前記神経細胞から溶解液を回収すること、
(d)前記試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるルシフェラーゼ活性と比較して前記溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定すること、
を含み、
前記ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるBoNT活性が示される、前記方法。
[本発明1056]
前記リンカーが、前記N−nano 1〜159 と前記切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1041〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(フォティヌス・ピラリス)、細菌ルシフェラーゼ(ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ)、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ)、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記試料における前記第2のルシフェラーゼポリペプチドの前記ルシフェラーゼ活性が決定され、前記回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される、本発明1056〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記神経細胞が、ウイルス発現ベクターから前記単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1054〜1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記単鎖ポリペプチドが、段階(a)の前の6日間発現する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記ウイルス発現系が、レンチウイルス発現系である、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記インキュベート段階が、約48時間実施される、本発明1054〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記回収段階が、溶解緩衝液を添加することによって実施される、本発明1054〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記BoNT切断部位が、SNAP−25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンに由来するものである、本発明1041〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記BoNT切断部位が、BoNT A、BoNT E、及びBoNT Cによって特異的に認識されるか、またはBoNT B、BoNT D、BoNT F、及びBoNT Gによって特異的に認識される、本発明1041〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
異なるBoNT切断部位を有する単鎖ポリペプチドの組み合わせが使用される、本発明1041〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP−25のアミノ酸141〜206、またはヒトVAMP1のアミノ酸35〜96、ヒトSNAP35のアミノ酸1〜206、またはVAMP1のアミノ酸1〜96である、本発明1041〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記リンカーが、BoNT受容体の結合断片をさらに含む、本発明1041〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記受容体が、SV2Cである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記結合断片が、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566を含む、本発明1068〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記リンカーが、
第2のルシフェラーゼポリペプチドと、
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのC末端かつ前記BoNT切断部位のN末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記BoNT切断部位のC末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記BoNT切断部位が、ヒトSNAP25のアミノ酸1〜206を含み、前記第1のスペーサーのC末端に位置する、本発明1041〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
ルシフェラーゼ活性の測定が、前記ルシフェラーゼに特異的な基質を添加し、得られる発光シグナルを定量的に検出することによって実施される、本発明1041〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
配列番号1のルシフェラーゼの前記基質が、フリマジン(2−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン)である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
以下を含む、キット:
(a)1つもしくは複数の、本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドであって、前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド、
(b)1つもしくは複数の、本発明1034〜1037のいずれかの核酸もしくは核酸ベクターであって、前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター、及び/または
(c)1つもしくは複数の、本発明1038〜1040のいずれかの細胞であって、前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
[本発明1075]
独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む、本発明1074のキット。
Claims (36)
- a.レポータータンパク質のN末端断片と、
b.神経毒素切断部位を含むリンカーと、
c.前記レポータータンパク質のC末端断片と
をN末端からC末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記N末端断片及び前記C末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、
前記リンカーによって前記N末端断片と前記C末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。 - 前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記N末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159の配列(N−nano1〜159)を有し、前記C末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170の配列(C−nano160〜170)を有する、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記N末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列(N−nano 1〜159 )を含み、前記C末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列(C−nano 160〜170 )を含む、請求項3に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記N末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対する置換、欠失、または付加が10アミノ酸残基未満である配列(N−nano 1〜159 )を含み、前記C末端断片が、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対する置換、欠失、または付加が3アミノ酸残基未満である配列(C−nano 160〜170 )を含む、請求項3に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素切断部位が、C.ボツリヌム(C.botulinum)神経毒素(BoNT)切断部位及び/または破傷風神経毒素切断部位である、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNT切断部位が、セロタイプA、E、C、B、D、F、またはGのBoNTによって認識される、請求項6に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記BoNT切断部位が、SNAREタンパク質に由来する、請求項6に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、SNAP−25、シナプトブレビン(VAMP)、またはシンタキシンである、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、ヒトSNAP−25bのアミノ酸141〜206である、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、ヒトVAMP1のアミノ酸35〜96である、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記SNAREタンパク質が、ヒトSNAP25bのアミノ酸1〜206である、請求項8に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、神経毒素結合断片をさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素結合断片が、前記N末端断片と前記神経毒素切断部位との間に位置する、請求項13に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素結合断片が、ヒト、マウス、ラット、または霊長類の神経毒素受容体である、請求項13に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素受容体が、SV2Cである、請求項15に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素受容体が、ヒトSV2Cのアミノ酸529〜566を含む、請求項15に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素受容体が、SYTIである、請求項15に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素受容体が、SYTIのアミノ酸32〜52を含む、請求項15に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素受容体が、SYT2である、請求項15に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記神経毒素受容体が、SYT2のアミノ酸40〜60を含む、請求項15に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記N末端断片と前記神経毒素切断部位との間に位置するインタクトな第2のレポーターポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記第2のレポーターポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ(例えば、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis))、細菌ルシフェラーゼ(例えば、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)、ビブリオ・ハーベイ(Vibrio harveyi))、ウミシイタケルシフェラーゼ(ウミシイタケ(Renilla reniformis))、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、請求項22に記載の単鎖ポリペプチド。
- ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記神経毒素切断部位と前記N末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサー、前記神経毒素切断部位と前記C末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサー、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記神経毒素結合断片と前記N末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記神経毒素結合断片と前記神経毒素切断部位との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項14に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記第2のレポーターポリペプチドと前記N末端断片との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項22に記載の単鎖ポリペプチド。
- 前記リンカーが、前記第2のレポーターポリペプチドと前記神経毒素切断部位との間に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項22に記載の単鎖ポリペプチド。
- 請求項1に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項30に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
- 請求項30に記載の核酸を含む、細胞。
- C.ボツリヌム神経毒素(BoNT)の効力を決定するための方法であって、以下の段階を含む、方法:
(a)BoNT活性に適した条件下で単鎖ポリペプチドに前記BoNTを接触させる段階であって、前記単鎖ポリペプチドが、
(i)レポータータンパク質のN末端断片と、
(ii)BoNT切断部位を含むリンカーと、
(iii)前記レポータータンパク質のC末端断片と
を含む、段階;および
(b)参照基準と比較して前記ポリペプチドのレポーター活性を決定し、それによって効力を決定する段階。 - 試料におけるC.ボツリヌム神経毒素(BoNT)活性を検出するための方法であって、以下:
(a)BoNT活性に適した条件下で単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させる段階であって、前記単鎖ポリペプチドが、
(i)レポータータンパク質のN末端断片と、
(ii)BoNT切断部位を含むリンカーと、
(iii)前記レポータータンパク質のC末端断片と
を含む、段階;および
(b)前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのレポーター活性と比較して前記ポリペプチドのレポーター活性を決定する段階
を含み、レポーター活性の減少が、前記試料における神経毒素の活性を示す、方法。 - 前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートする段階;及び
前記神経細胞から溶解液を回収する段階
をさらに含む、請求項34に記載の方法。 - 以下を含む、キット:
(a)1つもしくは複数の、請求項1に記載の単鎖ポリペプチドであって、
前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド;
(b)前記1つもしくは複数の(a)の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、1つもしくは複数の、核酸もしくは核酸ベクターであって、
前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター;及び/または
(c)前記1つもしくは複数の(a)の単鎖ポリペプチドを発現する1つもしくは複数の細胞であって、
前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022169039A JP2023011700A (ja) | 2016-10-20 | 2022-10-21 | ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662410558P | 2016-10-20 | 2016-10-20 | |
US62/410,558 | 2016-10-20 | ||
PCT/US2017/057411 WO2018075783A2 (en) | 2016-10-20 | 2017-10-19 | In vitro and cell based assays for measuring the activity of botulinum neurotoxins |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022169039A Division JP2023011700A (ja) | 2016-10-20 | 2022-10-21 | ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019532651A JP2019532651A (ja) | 2019-11-14 |
JP2019532651A5 true JP2019532651A5 (ja) | 2020-11-19 |
JP7227901B2 JP7227901B2 (ja) | 2023-02-22 |
Family
ID=60413254
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019521130A Active JP7227901B2 (ja) | 2016-10-20 | 2017-10-19 | ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 |
JP2022169039A Withdrawn JP2023011700A (ja) | 2016-10-20 | 2022-10-21 | ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022169039A Withdrawn JP2023011700A (ja) | 2016-10-20 | 2022-10-21 | ボツリヌス神経毒素の活性を測定するためのインビトロアッセイ法及び細胞ベースのアッセイ法 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11306347B2 (ja) |
EP (1) | EP3529616B1 (ja) |
JP (2) | JP7227901B2 (ja) |
KR (1) | KR102556363B1 (ja) |
CN (1) | CN110088624B (ja) |
AU (1) | AU2017345560A1 (ja) |
BR (1) | BR112019007831A2 (ja) |
CA (1) | CA3040507A1 (ja) |
DK (1) | DK3529616T3 (ja) |
EA (1) | EA039761B1 (ja) |
ES (1) | ES2963830T3 (ja) |
FI (1) | FI3529616T3 (ja) |
HU (1) | HUE064332T2 (ja) |
MX (2) | MX2019004431A (ja) |
PL (1) | PL3529616T3 (ja) |
PT (1) | PT3529616T (ja) |
SA (1) | SA519401607B1 (ja) |
SG (1) | SG11201903523YA (ja) |
WO (1) | WO2018075783A2 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2011348204B2 (en) | 2010-12-22 | 2017-03-02 | President And Fellows Of Harvard College | Continuous directed evolution |
US10920208B2 (en) | 2014-10-22 | 2021-02-16 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of proteases |
WO2016168631A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Vector-based mutagenesis system |
US10392674B2 (en) | 2015-07-22 | 2019-08-27 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of site-specific recombinases |
US11524983B2 (en) | 2015-07-23 | 2022-12-13 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of Bt toxins |
WO2017019895A1 (en) | 2015-07-30 | 2017-02-02 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of talens |
UA127310C2 (uk) * | 2016-05-16 | 2023-07-19 | Презідент Енд Феллоуз Оф Гарвард Колледж | Спосіб очищення і активації ботулінічного нейротоксину |
DK3529616T3 (da) | 2016-10-20 | 2023-12-11 | Harvard College | In vitro- og cellebaserede assays til måling af aktiviteten af botulinum-neurotoksiner |
US11447809B2 (en) | 2017-07-06 | 2022-09-20 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of tRNA synthetases |
WO2019056002A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | President And Fellows Of Harvard College | CONTINUOUS EVOLUTION FOR STABILIZED PROTEINS |
US11913044B2 (en) | 2018-06-14 | 2024-02-27 | President And Fellows Of Harvard College | Evolution of cytidine deaminases |
WO2021011579A1 (en) * | 2019-07-15 | 2021-01-21 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved botulinum neurotoxins and uses thereof |
US20210301319A1 (en) * | 2020-03-26 | 2021-09-30 | Cellex, Inc. | Protease assays and their applications |
CN114540419A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-05-27 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统 |
GB202213479D0 (en) | 2022-09-14 | 2022-10-26 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-free clostridial neurotoxin assays |
GB202404021D0 (en) | 2024-03-20 | 2024-05-01 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-based neurotoxin assay |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4737462A (en) | 1982-10-19 | 1988-04-12 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β |
US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
US4950588A (en) | 1985-07-10 | 1990-08-21 | Molecular Diagnostics, Inc. | Prolonged enhanced chemiluminescence |
DE3537877A1 (de) | 1985-10-24 | 1987-04-30 | Geiger Reinhard | Luciferin-derivate und immunoassays unter einsatz derartiger luciferin-derivate |
US5004565A (en) | 1986-07-17 | 1991-04-02 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes |
US5374534A (en) | 1990-07-19 | 1994-12-20 | Charm Sciences, Inc. | Method of preparing D-luciferin derivatives |
DE4210759A1 (de) | 1992-04-01 | 1993-10-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Substituierte Thiazolin-Dioxetan-Substrate, Verfahren zur Herstellung und Verwendung |
EP0760681B1 (en) | 1994-05-31 | 1999-09-01 | Allergan, Inc | Modification of clostridial toxins for use as transport proteins |
GB9508204D0 (en) | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
GB9721189D0 (en) | 1997-10-08 | 1997-12-03 | Speywood Lab The Limited | Analgesic conjugates |
EP1064360B1 (en) | 1998-03-27 | 2008-03-05 | Prolume, Ltd. | Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics |
US6890745B1 (en) * | 2000-07-19 | 2005-05-10 | Chemicon International, Inc. | Protease specific cleavable luciferases and methods of use thereof |
EP1673459B1 (en) * | 2003-10-10 | 2012-06-27 | Promega Corporation | Luciferase biosensor |
US8753831B2 (en) | 2007-06-05 | 2014-06-17 | City Of Hope | Methods for detection of botulinum neurotoxin |
PL2990478T3 (pl) | 2009-05-01 | 2017-08-31 | Promega Corporation | Syntetyczna lucyferaza z oplophorus o wzmocnionej emisji światła |
US20140287433A1 (en) * | 2011-07-19 | 2014-09-25 | ETH Zürich | Means and methods for determining clostridial neurotoxins |
JP2015509372A (ja) | 2012-03-07 | 2015-03-30 | メルツ ファルマ ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーアーアー | 修飾ルシフェラーゼに基づいて神経毒活性を測定するための手段および方法 |
WO2014060373A1 (en) * | 2012-10-16 | 2014-04-24 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Cellular test systems for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides |
BR112015011255A2 (pt) * | 2012-11-21 | 2018-09-25 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fusão, vetor, polipeptídeo de fusão, célula hospedeira, método para determinar a atividade de neurotoxina, uso do polinucleotídeo e kit. |
US9797889B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-10-24 | Promega Corporation | Activation of bioluminescence by structural complementation |
CN105339790B (zh) * | 2013-06-28 | 2018-04-17 | 莫茨制药有限及两合公司 | 用于确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的工具和方法 |
DK3274364T3 (da) * | 2015-03-26 | 2021-10-18 | Harvard College | Modificeret botulinumneurotoksin |
DK3529616T3 (da) | 2016-10-20 | 2023-12-11 | Harvard College | In vitro- og cellebaserede assays til måling af aktiviteten af botulinum-neurotoksiner |
KR20210148076A (ko) * | 2018-12-11 | 2021-12-07 | 큐32 바이오 인크. | 보체 연관 질환을 위한 융합 단백질 작제물 |
-
2017
- 2017-10-19 DK DK17801528.5T patent/DK3529616T3/da active
- 2017-10-19 WO PCT/US2017/057411 patent/WO2018075783A2/en unknown
- 2017-10-19 CN CN201780077166.5A patent/CN110088624B/zh active Active
- 2017-10-19 EP EP17801528.5A patent/EP3529616B1/en active Active
- 2017-10-19 HU HUE17801528A patent/HUE064332T2/hu unknown
- 2017-10-19 BR BR112019007831A patent/BR112019007831A2/pt unknown
- 2017-10-19 PT PT178015285T patent/PT3529616T/pt unknown
- 2017-10-19 KR KR1020197013429A patent/KR102556363B1/ko active IP Right Grant
- 2017-10-19 ES ES17801528T patent/ES2963830T3/es active Active
- 2017-10-19 MX MX2019004431A patent/MX2019004431A/es unknown
- 2017-10-19 AU AU2017345560A patent/AU2017345560A1/en active Pending
- 2017-10-19 SG SG11201903523YA patent/SG11201903523YA/en unknown
- 2017-10-19 US US16/343,513 patent/US11306347B2/en active Active
- 2017-10-19 CA CA3040507A patent/CA3040507A1/en active Pending
- 2017-10-19 PL PL17801528.5T patent/PL3529616T3/pl unknown
- 2017-10-19 JP JP2019521130A patent/JP7227901B2/ja active Active
- 2017-10-19 EA EA201990929A patent/EA039761B1/ru unknown
- 2017-10-19 FI FIEP17801528.5T patent/FI3529616T3/fi active
-
2019
- 2019-04-15 MX MX2023004733A patent/MX2023004733A/es unknown
- 2019-04-18 SA SA519401607A patent/SA519401607B1/ar unknown
-
2022
- 2022-03-10 US US17/691,848 patent/US11788069B2/en active Active
- 2022-10-21 JP JP2022169039A patent/JP2023011700A/ja not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2019532651A5 (ja) | ||
US11788069B2 (en) | In vitro and cell based assays for measuring the activity of botulinum neurotoxins | |
CA2500040C (en) | Cell-based fluorescence resonance energy transfer (fret) assays for clostridial toxins | |
US20180203017A1 (en) | Protein-protein interaction detection systems and methods of use thereof | |
EP2922866B1 (en) | Means and methods for determination of botulinum neurotoxin biological activity | |
JP6682532B2 (ja) | 神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法 | |
US20220196634A1 (en) | Assay with Synaptobrevin Based Moiety | |
JP2015509372A (ja) | 修飾ルシフェラーゼに基づいて神経毒活性を測定するための手段および方法 | |
US12019066B2 (en) | Assay with synaptobrevin based moiety | |
US10429374B2 (en) | Genetically encoded potassium ion indicators | |
EP3529371B1 (en) | A functional detection assay devoid of antibodies for serotyping of botulinum neurotoxins | |
Cleveland et al. | Reprogramming the cleavage specificity of botulinum neurotoxin serotype B1 | |
Marshall et al. | Analytical biotechnology |