CN114540419A - 一种分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统 - Google Patents
一种分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统。该系统包括第一载体和第二载体，其中所述第一载体为包含有序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的载体，所述第二载体为包含有序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的载体。该系统能够方便快捷地对包膜病毒的膜融合效率进行判断，操作简单省时，结果可视化，可同时定性与定量分析，也为快速判断新冠病毒已知或未知变异株的感染能力提供了新的可靠的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统，以及该三功能报告系统在分析新冠病毒及其变异株膜融合效率中的应用。
背景技术
根据有无包膜，可将病毒分为两大类，即无包膜病毒和包膜病毒。包膜病毒感染宿主细胞的途径通常采用病毒-宿主细胞膜融合机制，即病毒表面糖蛋白结合到宿主细胞表面的受体后，启动病毒糖蛋白的一系列构象变化，拉近两膜之间的距离，此过程释放出来的能量促使两膜发生融合，进而使得病毒基因组被释放到宿主细胞中。膜融合过程是包膜病毒侵染宿主细胞的关键步骤。膜融合速度的快慢与包膜病毒的感染性、传播性、致病性密切相关。监测包膜病毒的膜融合过程对病毒的防控和治疗尤为重要。
在过去几十年里，有一些评价膜融合的方法被发展，如荧光共振能量转移(FRET)、转录因子转移实验、染料转移实验和双分子荧光互补系统等。但这些技术仍存在一些不足之处，如需要精密仪器，需要额外添加外源性荧光团或染料，结果判别太过主观等。
双分子荧光互补系统是近些年发展起来的一种蛋白片段互补技术。其基本原理是将荧光蛋白在合适位点切开，形成不发荧光的两个片段，将这两个片段分别连接到一对能发生相互作用的目标蛋白上。当在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，在目标蛋白的相互作用下，拆分的不发荧光的两个片段就会相互靠近互补，重构成完整的具有活性的荧光蛋白分子，进而发出荧光。
本发明在双分子荧光互补系统的基础上新开发了一种三功能报告系统，用来定性和定量分析包膜病毒的膜融合效率。本系统所使用的蛋白为荧光蛋白mNeonGreen和荧光素酶NanoLuc。mNeonGreen是由四聚体LanYFP蛋白改造而来的单体黄绿色荧光蛋白，共236个氨基酸，能够在37℃下很快产生成熟的完整荧光蛋白并发出荧光。NanoLuc是一种经过基因工程改造的新型荧光素酶，共171个氨基酸，分子量小，光信号强，表达效率高，非特异性自发光背景低。本系统所使用的能相互作用的蛋白为同向平行亮氨酸拉链多肽bFos和bJun。
发明内容
本发明的目的是提供一种用来分析包膜病毒膜融合效率的三功能报告系统。基于蛋白互补原理，本发明将mNeonGreen从氨基酸位点173/174拆分为NG和CG，将NanoLuc从氨基酸位点159/160拆分为LgBiT和SmBiT，然后将bFos和bJun，分别与拆分的片段融合，形成两组融合蛋白(图1)。当bFos和bJun相互作用时，mNeonGreen和NanoLuc各自的两个片段在空间上相互靠近互补，重新构建成完整的具有活性的分子，mNeonGreen可通过荧光显微镜观察，NanoLuc可利用试剂盒检测活性。此外，bFos和bJun本身的核定位功能可将整个蛋白带到细胞核中，因此可观察到发生融合的细胞个数。利用该系统，结合新冠病毒刺突蛋白和其受体ACE2的相互作用，可以检测新冠病毒及其变异株刺突蛋白位点的突变对膜融合效率和速率的影响，原理见图2。该系统操作简单省时，结果可视化，可同时定性与定量分析，为快速判断新冠病毒已知或未知变异株的感染能力，提供了新的可靠的技术手段。
本发明的主要内容如下：(1)第一载体和第二载体的筛选：分别构建两个第一载体和两个第二载体质粒，第一载体包括NGJS(NG-bJun-SmBiT)和SJNG(SmBiT-bJun-NG)，第二载体包括LFCG(LgBiT-bFos-CG)和CGFL(CG-bFos-LgBiT)，通过两两组合的方式共转到HEK293T细胞中，利用荧光显微镜及荧光素酶检测系统筛选出活性最好的一组用于后续实验，结果表明NGJS与CGFL组合的效果最好，同时发现当荧光素酶活性检测值在1.0×103～1.0×106范围内具有良好的线性关系。(2)三功能系统用于评价新冠病毒膜融合效率的验证：将ACE2与NGJS、新冠病毒D614G变异株的刺突蛋白spike质粒与CGFL分别共转到HEK293T细胞中，然后共培养两种细胞，通过共聚焦显微镜观察融合情况，结果表明该系统可用于评价新冠病毒膜融合效率。(3)三功能系统分析新冠及其变异株的膜融合效率和速率：将ACE2与NGJS、新冠病毒各变异株的刺突蛋白与CGFL分别共转染到HEK293T细胞中，然后共培养两种细胞，不同时间点观察融合情况并检测荧光素酶活性，结果显示病毒的融合效率Delta变异株＞Alpha变异株＝Beta变异株＞D614G变异株＞Omicron变异株。
根据本发明，发明中所涉及的三功能报告系统，其特征在于，包括第一载体和第二载体，其中，第一载体为包含有表达氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的载体，所述第二载体为包含有表达氨基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的载体。
在一些实施例中，第一载体用于表达第一融合蛋白，第一融合蛋白为NG、bJun、SmBiT蛋白片段的融合蛋白。所述第二载体用于表达第二融合蛋白，第二融合蛋白为CG、bFos、LgBiT蛋白片段的融合蛋白。当所述bJun与bFos蛋白片段相互作用时，所述NG蛋白片段和所述CG蛋白片段相互靠近，可重构形成所述荧光蛋白mNeonGreen；所述SmBiT蛋白片段和所述LgBiT蛋白片段相互靠近，可重构形成所述荧光素酶NanoLuc。
在一些实施例中，NG蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.1组成的蛋白片段，CG蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.2组成的蛋白片段，SmBiT蛋白片段为由氨基酸序列SEQID NO.5组成的蛋白片段，LgBiT蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.6组成的蛋白片段。
在一些实施例中，bJun和bFos为一对有相互作用的碱性亮氨酸拉链短肽。
根据本发明，发明中所涉及的三功能报告系统可用于分析包膜病毒的膜融合效率。其中，三功能报告系统为以上所述的三功能报告系统。
在一些实施例中，发明中所涉及的三功能报告系统可用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株细胞膜融合效率的评价。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施例或实施方式，下面将对实施例或实施方式描述中所用到的附图做简单介绍。本发明的附图仅用于描述实施例或实施方式，以展示为目的。在不偏离本发明的原理的条件下，本领域技术人员能够在不付出创造性劳动的前提下，根据以下附图获得其他的附图。
图1为四组融合蛋白的组成示意图。
图2为三功能系统用于评价新冠病毒膜融合效率的原理图。
图3为筛选融合蛋白组合的荧光显微镜照片及荧光素酶活性检测结果。
图4为三功能系统检测数值的线性范围。
图5为三功能系统用于评价新冠病毒D614G变异株细胞膜融合的共聚焦照片。
图6为利用三功能系统分析新冠D614G变异株的膜融合效率随时间变化曲线。
图7为利用三功能系统比较新冠及其变异株的膜融合效率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本申请相关的部分而非全部结构。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例1：融合蛋白组合的筛选及三功能系统的构建
1材料和方法
1.1质粒构建及细胞培养：
构建两个第一载体NGJS(NG-bJun-SmBiT)和SJNG(SmBiT-bJun-NG)，两个第二载体LFCG(LgBiT-bFos-CG)和CGFL(CG-bFos-LgBiT)，用于表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，载体组成示意图见图1。其中第一载体为包含有表达氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5的载体，第二载体为包含有表达氨基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6的载体。这些序列可通过双酶切位点将其插入到质粒pcDNA3等真核表达载体的多克隆位点中。在不同的真核表达载体中，可选择合适的双酶切位点将序列插入，本申请对真核表达载体的选择以及酶切位点的选择不做限制。HEK293T细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中(补充青、链霉素各100uL/mL)，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。
1.2质粒转染及荧光素酶检测：
转染前，将HEK293T细胞按2×105个/孔的密度接种于24孔板中，培养18小时使其贴壁。利用GenJet Ver.II转染试剂按照试剂说明书将NGJS、LFCG、SJNG、CGFL、NGJS+CGFL、NGJS+LFCG、SJNG+CGFL、SJNG+LFCG分别转染到HEK293T细胞中，增加空白对照组。10小时后更换新鲜培养液。转染24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光并拍照，并使用Nano-Glo荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。
1.3三功能系统检测结果线性范围的检测：
质粒转染同实施例1中1.2所述。转染24小时后将细胞进行梯度稀释，然后检测荧光素酶活性。
2实验结果
荧光显微镜下观察结果如图3左图所示，发现各融合蛋白单独转染均未见绿色荧光，在组合转染中，NGJS+CGFL的绿色荧光细胞数最多，荧光强度最亮。荧光素酶活性检测结果如图3右图所示，同样各融合蛋白单独转染未见显著荧光素酶活性，在组合转染中，NGJS+CGFL的荧光素酶活性最强，因此选择NGJS和CGFL作为最优第一载体和第二载体，来构建三功能系统并用于后续实验。细胞梯度稀释结果显示，当荧光素酶活性检测值在1.0×103～1.0×106范围内，其具有良好的线性关系，表明在该范围内可获得更可靠的数据(图4)。以上结果证明了该三功能系统的可行性。
实施例2：三功能系统用于新冠病毒膜融合效率评价的可行性验证实验
1材料和方法
1.1质粒构建及细胞培养：
新冠病毒D614G变异株刺突蛋白表达质粒pD614G，带红色荧光标记的ACE2表达质粒pACE2-tdTomato通过普通分子克隆方法构建完成，且经测序验证正确。HEK293T细胞培养同实施例1中1.1所述。
1.2质粒转染及膜融合结果观察：
转染前，将HEK293T细胞按2×105个/孔的密度接种于24孔板中，培养18小时使其贴壁。利用GenJet Ver.II转染试剂按照试剂说明书将pD614G+CGFL、pACE2-tdTomato+NGJS分别转染到HEK293T细胞中。10小时后更换新鲜培养液。转染24小时后收集转染了pACE2-tdTomato+NGJS的细胞，并接种于共聚焦小皿中，于细胞培养箱培养6小时。收集转染了pD614G+CGFL的细胞，并按1∶1的细胞数加到上述共聚焦小皿中，继续培养6小时。在共聚焦显微镜下观察细胞膜融合情况并拍照。
1.3动态膜融合效率检测：
质粒转染同实施例2中1.2所述。转染24小时后分别收集两组细胞，并按照1∶1的数量比接种于96孔板中，1×104个/孔，放于细胞培养箱中共培养。分别于共培养后0.5、1、2、3、4、6、8、10小时检测荧光素酶活性。
2实验结果
共聚焦结果如图5所示，结果表明通过spike蛋白和ACE2受体的相互作用，两种细胞发生了膜融合，使得绿色荧光蛋白mNeonGreen结构得以完整，活性恢复。此外由于核定位信号的存在，可清晰观察到具体有几个细胞发生了膜融合，如图5所示既有两个细胞融合为合胞体，也有三个细胞融合为合胞体。动态膜融合效率检测结果如图6所示，结果表明随着时间的延长，spike蛋白介导的膜融合效率也随之增加，最后趋于平衡。因此，利用此三功能报告系统，可对膜融合效率进行实时观察和检测。
实施例3：三功能系统分析新冠及其变异株的膜融合效率和速率实验
1材料和方法
1.1质粒构建及细胞培养：
新冠病毒D614G、Alpha、Beta、Delta、Omicron变异株刺突蛋白表达质粒，带红色荧光标记的ACE2表达质粒pACE2-tdTomato通过普通分子克隆方法构建完成，且经测序验证正确。HEK293T细胞培养同实施例1中1.1所述。
1.2质粒转染及膜融合结果检测：
转染前，将HEK293T细胞按2×105个/孔的密度接种于24孔板中，培养18小时使其贴壁。利用GenJet Ver.II转染试剂按照试剂说明书将各变异株刺突蛋白质粒+CGFL、pACE2-tdTomato+NGJS分别共转染到HEK293T细胞中。10小时后更换新鲜培养液。转染24小时后分别收集各组细胞。按照1∶1的数量比将转染了各刺突蛋白的细胞与转染了pACE2-tdTomato+NGJS的细胞接种于96孔板中，1×104个/孔，放于细胞培养箱中共培养。共培养4小时后在荧光显微镜下观察融合情况并拍照，同时检测荧光素酶活性。
2实验结果
荧光显微镜观察结果如图7左图所示，荧光素酶活性检测结果如图7右图所示，结果表明融合效率方面Delta变异株＞Alpha变异株＝Beta变异株＞D614G变异株＞Omicron变异株，该结果与其他团队的研究结果一致，进一步证明了该三功能系统的可行性。
以上仅为本申请的较佳实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种分析病毒膜融合效率的三功能报告系统，其特征在于，包括第一载体和第二载体，其中，所述第一载体为包含有表达氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.5的载体，所述第二载体为包含有表达氨基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.6的载体。
2.根据权利要求1所述，所述第一载体用于表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白为所述NG、bJun、SmBiT蛋白片段的融合蛋白。所述第二载体用于表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白为所述CG、bFos、LgBiT蛋白片段的融合蛋白。当所述bJun与bFos蛋白片段相互作用时，所述NG蛋白片段和所述CG蛋白片段相互靠近，可重构形成所述荧光蛋白mNeonGreen；所述SmBiT蛋白片段和所述LgBiT蛋白片段相互靠近，可重构形成所述荧光素酶NanoLuc。
3.根据权利要求2所述，其特征在于，所述NG蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.1表达的蛋白片段，所述CG蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.2表达的蛋白片段，所述SmBiT蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.5表达的蛋白片段，所述LgBiT蛋白片段为由氨基酸序列SEQ ID NO.6表达的蛋白片段。
4.根据权利要求2所述，其特征在于，所述bJun和bFos为一对有相互作用的碱性亮氨酸拉链短肽。
5.根据权利要求4所述，其特征在于，所述有相互作用的蛋白对也可以是其他细胞核定位的蛋白质。
6.一种三功能报告系统在分析包膜病毒融合效率方面的应用，其特征在于，所述三功能报告系统为如权利要求1-5中任意一项所述的三功能报告系统。
7.根据权利要求6所述，其特征在于，所述包膜病毒包括冠状病毒、狂犬病毒、艾滋病毒、流感病毒等。
8.根据权利要求7所述，其特征在于，所述冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株。
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Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101620233A (zh) * | 2009-05-27 | 2010-01-06 | 华中科技大学 | 一种蛋白质相互作用的检测方法 |
| JP2011211983A (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Osaka Prefecture Univ | タンパク質分子対、タンパク質分子対をコードする遺伝子および遺伝子導入ベクターとタンパク質分子対を産生する細胞 |
| CN107034228A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-08-11 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法 |
| CN108503701A (zh) * | 2017-02-24 | 2018-09-07 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用 |
| CN108796040A (zh) * | 2018-06-27 | 2018-11-13 | 中南民族大学 | 一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针及其构建方法及应用 |
| CN110088624A (zh) * | 2016-10-20 | 2019-08-02 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定 |
| CN110491447A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-22 | 浙江省农业科学院 | 一种用于异源基因体外表达的密码子优化方法及应用 |
| WO2020220136A1 (en) * | 2019-05-02 | 2020-11-05 | The Hospital For Sick Children | Detection of biomarkers associated with brugada syndrome |
| US20200363424A1 (en) * | 2019-05-16 | 2020-11-19 | Duke University | Complex bret technique for measuring biological interactions |
| CN112352055A (zh) * | 2018-02-26 | 2021-02-09 | 艾恩德霍芬技术大学 | 用于检测和定量溶液中的生物分子或配体的生物发光生物传感器 |
| CN112592936A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-04-02 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用 |
| CN112813049A (zh) * | 2019-11-18 | 2021-05-18 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 用于活细胞rna标记的融合蛋白及应用 |
| WO2021254327A1 (zh) * | 2020-06-15 | 2021-12-23 | 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 | 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 |
-
2022
- 2022-03-04 CN CN202210205772.3A patent/CN114540419A/zh active Pending
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101620233A (zh) * | 2009-05-27 | 2010-01-06 | 华中科技大学 | 一种蛋白质相互作用的检测方法 |
| JP2011211983A (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Osaka Prefecture Univ | タンパク質分子対、タンパク質分子対をコードする遺伝子および遺伝子導入ベクターとタンパク質分子対を産生する細胞 |
| CN107034228A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-08-11 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法 |
| CN110088624A (zh) * | 2016-10-20 | 2019-08-02 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定 |
| CN108503701A (zh) * | 2017-02-24 | 2018-09-07 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用 |
| CN112352055A (zh) * | 2018-02-26 | 2021-02-09 | 艾恩德霍芬技术大学 | 用于检测和定量溶液中的生物分子或配体的生物发光生物传感器 |
| US20210215682A1 (en) * | 2018-02-26 | 2021-07-15 | Technische Universiteit Eindhoven | Bioluminescent biosensor for detecting and quantifying biomolecules |
| CN108796040A (zh) * | 2018-06-27 | 2018-11-13 | 中南民族大学 | 一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针及其构建方法及应用 |
| WO2020220136A1 (en) * | 2019-05-02 | 2020-11-05 | The Hospital For Sick Children | Detection of biomarkers associated with brugada syndrome |
| US20200363424A1 (en) * | 2019-05-16 | 2020-11-19 | Duke University | Complex bret technique for measuring biological interactions |
| CN110491447A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-22 | 浙江省农业科学院 | 一种用于异源基因体外表达的密码子优化方法及应用 |
| CN112813049A (zh) * | 2019-11-18 | 2021-05-18 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 用于活细胞rna标记的融合蛋白及应用 |
| WO2021254327A1 (zh) * | 2020-06-15 | 2021-12-23 | 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 | 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 |
| CN112592936A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-04-02 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "A robust reporting system for measurement of SARS-CoV-2 spike fusion efficiency", SIGNAL TRANSDUCTION AND TARGETED THERAPY, vol. 7, no. 179, pages 1 - 3 * |
| 严闯: "基于mNeonGreen和mNeptune的双分子荧光互补系统的研究", 中国硕士学位论文全文数据库, pages 10 - 11 * |
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