CN117265014A - 病毒s蛋白突变体的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种病毒S蛋白突变体的构建方法及应用，涉及病毒S蛋白突变体的构建技术领域，根据基因组序列号GenBank:MN908947，密码子优化合成S蛋白全长基因序列并连接真核表达质粒pcDNA3.1(+)得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)‑Spike；采用点突变的方式对真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑Spike进行反向PCR，正反向扩增引物5’端包含15‑21bp反向互补区域，引物设计时将引入突变包含在互补区域内；对目标质粒扩增后对产物消化，去除甲基化模板质粒后进行重组反应；反应产物转化并进行克隆鉴定，测序正确即为突变成功的S蛋白突变体表达质粒。

Description

病毒S蛋白突变体的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及病毒S蛋白突变体的构建技术领域，具体为病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2入侵宿主细胞主要由刺突蛋白S介导，S蛋白的突变不仅会影响病毒的复制能力和感染能力，其同样可能引起宿主免疫反应变化。尽管SARS-CoV-2的突变频率低于其它无逆转录校正功能的RNA病毒，目前这些突变位点如何影响病毒入侵宿主细胞没有明确结论。另外，病毒表面糖蛋白突变可能发生抗原性漂移(Antigenicdrift)现象，亲本株来源的SARS-CoV-2疫苗交叉免疫保护作用未知。
目前传统疫苗效果检测手段是利用hACE2和RBD的竞争ELISA或者单一的假病毒中和试验确定；同时S蛋白作为冠状病毒的膜蛋白，在病毒传播人类过程中首先受到宿主免疫压力的影响。反之，S蛋白的突变也势必将引起宿主免疫反应的变化。目前，SARS-CoV-2在全球的传播导致大量的突变毒株的产生。虽然最近SARS-CoV-2疫苗有关研究结果令人欣慰，然而不断产生的突变毒株对疫苗设计提出了更高要求，在毒株快速变异的背景下缺少全面的疫苗评估体系，因此设计病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用是很有必要的。
因此，如何提供病毒S蛋白突变体并对其假病毒盘进行构建是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供病毒S蛋白突变体的构建及在假病毒盘的构建及其疫苗评价中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种病毒S蛋白突变体的构建方法，过程包括：
1)根据基因组序列号GenBank:MN908947，密码子优化合成S蛋白全长基因序列并连接真核表达质粒pcDNA3.1(+)得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike；
2)采用点突变的方式对真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike进行反向PCR，正反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，引物设计时将引入突变包含在互补区域内；对目标质粒扩增后对产物消化，去除甲基化模板质粒后进行重组反应；反应产物转化并进行克隆鉴定，测序正确即为突变成功的S蛋白突变体表达质粒。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种病毒S蛋白突变体，所述病毒S突变体由权利要求1所述的方法构建得到。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的病毒S蛋白突变体在构建假病毒盘和对疫苗效价评价中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建和疫苗效价评价方法，包括假病毒体系的构建、假病毒活性的检测和假病毒用于新冠疫苗免疫效果的评估。
优选的，所述假病毒体系的构建为：根据国家生物信息中心新型冠状病毒信息库公布的SARS-CoV-2S蛋白基因突变位点分析数据，S蛋白的突变分为ACE2结合区域-非关键互作氨基酸、AC E2结合区域-关键互作氨基酸和非ACE2结合区域，随后选择数据库中变异位点毒株数量较多且传播范围较广的突变位点进行统计，然后构建病毒S蛋白突变体。
优选的，所述假病毒活性的检测为将构建的不同S蛋白突变位点的表达质粒分别与HIV-1骨架质粒pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞后可包装出不同突变位点的“SARS-CoV-2S蛋白假病毒盘”；由于pNL4-3 Luc+R-E-质粒中带有表达荧光素酶的报告基因，假病毒盘在感染易感细胞后可以使细胞内表达荧光素酶基因；因此在加入荧光素酶底物后根据化学发光仪检测细胞内的RLU，可以判断不同突变位点的假病毒感染能力强弱；在构建假病毒盘之前已经成功构建了SARS-CoV-2易感细胞系HEK293T/hACE2；S蛋白假病毒盘构建成功后，我们将对假病毒盘感染HEK293T/hACE2细胞的能力进行检测：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔密度铺于96孔板，第2天将滴定后的不同S蛋白假病毒标准化后加入到96孔板中，设置不含假病毒的完全培养基作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；根据RLU的数量级即对易感细胞的感染能力将假病毒盘中的不同突变体进行分级，并对这些位点突变导致病毒感染能力改变的原因进行分析并找出与受体作用的主要位点。
优选的，新冠疫苗免疫效果的评估为：将对接种过各品牌疫苗的人群进行血清收集并记录血样采集距离疫苗接种的时间，记录血样采集距离疫苗接种的时间为0-12个月，同时采集未接种人群血清作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，假病毒盘测试收集血清的中和实验结果，综合评估各疫苗对SARS-CoV-2突变后的交叉免疫保护效果；另外根据各样本采集时间确定疫苗接种人群体内产生抗体可以维持的时间，为后续SARS-CoV-2疫苗的接种方案提供理论参考；中和实验流程如下：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔密度铺于96孔板，第二天将疫苗第二次接种后2周的血清使用完全培养基按照2倍梯度稀释，初始稀释度为1:2，共设置8个梯度(1：2到1:256)；上述稀释后的血清与50μl滴定后的假病毒等体积混合，37℃孵育1h后加入预先铺好含有HEK293T/hACE2细胞的96孔板中，设置不含假病毒的50μl完全培养基和只加50μl假病毒组作为对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；根据检测出的RLU值可以有效评估疫苗对不同突变毒株的交叉免疫保护效果。
优选的，新冠疫苗免疫效果的评估过程中，初始稀释倍数为1:2，稀释范围为1:2到1:256共8个梯度，设置3个平行。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：该利用S蛋白假病毒评估新冠疫苗效果的方法，通过直接在真核表达质粒中进行突变构建，无需对S蛋白基因进行突变扩增后连接表达质粒，同时避免在扩增S蛋白基因过程中出现错配，且该发明通过S蛋白主要突变位点进行分类统计后构建各种突变的新冠假病毒，并将组成的假病毒盘应用于SARS-CoV-2疫苗效果评估；因此该发明有利于更为全面的涵盖目前新冠突变株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为是本发明的方法流程图；
图2附图为本发明中SARS-CoV-2S蛋白氨基酸突变位点统计图；
图3附图为本发明的技术路线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：
一种病毒S蛋白突变体的构建方法，过程包括：
1)根据基因组序列号GenBank:MN908947，密码子优化合成S蛋白全长基因序列并连接真核表达质粒pcDNA3.1(+)得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike；
2)采用点突变的方式对真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike进行反向PCR，正反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，引物设计时将引入突变包含在互补区域内；对目标质粒扩增后对产物消化，去除甲基化模板质粒后进行重组反应；反应产物转化并进行克隆鉴定，测序正确即为突变成功的S蛋白突变体表达质粒。
实施例2
一种病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建和疫苗效价评价方法，包括假病毒体系的构建、假病毒活性的检测和假病毒用于新冠疫苗免疫效果的评估；
假病毒体系的构建为：根据国家生物信息中心新型冠状病毒信息库公布的SARS-CoV-2S蛋白基因突变位点分析数据，S蛋白的突变分为ACE2结合区域-非关键互作氨基酸、ACE2结合区域-关键互作氨基酸和非ACE2结合区域，随后选择数据库中变异位点毒株数量较多且传播范围较广的突变位点进行统计，然后构建病毒S蛋白突变体。
假病毒活性的检测为将构建的不同S蛋白突变位点的表达质粒分别与HIV-1骨架质粒pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞后可包装出不同突变位点的“SARS-CoV-2S蛋白假病毒盘”；由于pNL4-3 Luc+R-E-质粒中带有表达荧光素酶的报告基因，假病毒盘在感染易感细胞后可以使细胞内表达荧光素酶基因；因此在加入荧光素酶底物后根据化学发光仪检测细胞内的RLU，可以判断不同突变位点的假病毒感染能力强弱；在构建假病毒盘之前已经成功构建了SARS-CoV-2易感细胞系HEK293T/hACE2；S蛋白假病毒盘构建成功后，我们将对假病毒盘感染HEK293T/hACE2细胞的能力进行检测：提前24h将HEK293T/hAC E2细胞以1×104/孔密度铺于96孔板，第2天将滴定后的不同S蛋白假病毒标准化后加入到96孔板中，设置不含假病毒的完全培养基作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；根据RLU的数量级即对易感细胞的感染能力将假病毒盘中的不同突变体进行分级，并对这些位点突变导致病毒感染能力改变的原因进行分析并找出与受体作用的主要位点。
新冠疫苗免疫效果的评估为：将对接种过各品牌疫苗的人群进行血清收集并记录血样采集距离疫苗接种的时间，记录血样采集距离疫苗接种的时间为0-12个月，同时采集未接种人群血清作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，假病毒盘测试收集血清的中和实验结果，综合评估各疫苗对SARS-CoV-2突变后的交叉免疫保护效果；另外根据各样本采集时间确定疫苗接种人群体内产生抗体可以维持的时间，为后续SARS-CoV-2疫苗的接种方案提供理论参考；中和实验流程如下：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔密度铺于96孔板，第二天将疫苗第二次接种后2周的血清使用完全培养基按照2倍梯度稀释，初始稀释度为1:2，共设置8个梯度(1：2到1:256)；上述稀释后的血清与50μl滴定后的假病毒等体积混合，37℃孵育1h后加入预先铺好含有HEK293T/hACE2细胞的96孔板中，设置不含假病毒的50μl完全培养基和只加50μl假病毒组作为对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；根据检测出的RLU值可以有效评估疫苗对不同突变毒株的交叉免疫保护效果。新冠疫苗免疫效果的评估过程中，初始稀释倍数为1:2，稀释范围为1:2到1:256共8个梯度，设置3个平行。
基于上述，本发明的优点在于，本发明，通过S蛋白主要突变位点进行分类统计后构建各种突变的新冠假病毒，并将组成的假病毒盘应用于SARS-CoV-2疫苗效果评估；有利于更为全面的涵盖目前新冠突变株，同时直接在真核表达质粒中进行突变构建，无需对S蛋白基因进行突变扩增后连接表达质粒，因此降低了在扩增S蛋白基因过程中出现错配率。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种病毒S蛋白突变体的构建方法，其特征在于，过程包括：
1)根据基因组序列号GenBank:MN908947，密码子优化合成S蛋白全长基因序列并连接真核表达质粒pcDNA3.1(+)得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike；
2)采用点突变的方式对真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Spike进行反向PCR，正反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，引物设计时将引入突变包含在互补区域内；对目标质粒扩增后对产物消化，去除甲基化模板质粒后进行重组反应；反应产物转化并进行克隆鉴定，测序正确即为突变成功的S蛋白突变体表达质粒。
2.一种病毒S蛋白突变体，其特征在于，所述病毒S突变体由权利要求1所述的方法构建得到。
3.权利要求2所述的病毒S蛋白突变体在构建假病毒盘和对疫苗效价评价中的应用。
4.一种病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建和疫苗效价评价方法，其特征在于，包括假病毒体系的构建、假病毒活性的检测和假病毒用于新冠疫苗免疫效果的评估。
5.根据权利要求4所述的一种病毒S大白突变体假病毒盘的构建方法，其特征在于，所述假病毒体系的构建为：根据国家生物信息中心新型冠状病毒信息库公布的SARS-CoV-2S蛋白基因突变位点分析数据，S蛋白的突变分为ACE2结合区域-非关键互作氨基酸、ACE2结合区域-关键互作氨基酸和非ACE2结合区域，随后选择数据库中变异位点毒株数量较多且传播范围较广的突变位点进行统计，然后构建病毒S蛋白突变体。
6.根据权利要求5所述的一种病毒S大白突变体假病毒盘的构建方法，其特征在于，所述假病毒活性的检测为：
将构建的不同S蛋白突变位点的表达质粒分别与HIV-1骨架质粒pNL4-3 Luc+R-E-(荧光素酶基因替换HIV-1的Env包膜蛋白基因)共转染293T细胞后可包装出不同突变位点的“SARS-CoV-2S蛋白假病毒盘”；根据化学发光仪检测细胞内的RLU，判断不同突变位点的假病毒感染能力强弱；在构建假病毒盘之前已经成功构建了SAR S-CoV-2易感细胞系HEK293T/hACE2；
S蛋白假病毒盘构建成功后，对假病毒盘感染HEK293T/hACE2细胞的能力进行检测：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔密度铺于96孔板，第2天将滴定后的不同S蛋白假病毒标准化后加入到96孔板中，设置不含假病毒的完全培养基作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；
根据RLU的数量级即对易感细胞的感染能力将假病毒盘中的不同突变体进行分级，并对这些位点突变导致病毒感染能力改变的原因进行分析并找出与受体作用的主要位点。
7.根据权利要求6所述的一种病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建方法，其特征在于，新冠疫苗免疫效果的评估为：
将对接种过各品牌疫苗的人群进行血清收集并记录血样采集距离疫苗接种的时间，记录血样采集距离疫苗接种的时间为0-12个月，同时采集未接种人群血清作为阴性对照；50μl假病毒组作为阳性对照，假病毒盘测试收集血清的中和实验结果，综合评估各疫苗对SARS-CoV-2突变后的交叉免疫保护效果；
根据各样本采集时间确定疫苗接种人群体内产生抗体可以维持的时间，为后续SARS-CoV-2疫苗的接种方案提供理论参考；中和实验流程如下：提前24h将HEK293T/hACE2细胞以1×104/孔密度铺于96孔板，第二天将疫苗第二次接种后2周的血清使用完全培养基按照2倍梯度稀释，初始稀释度为1:2，共设置8个梯度(1：2到1:256)；上述稀释后的血清与50μl滴定后的假病毒等体积混合，37℃孵育1h后加入预先铺好含有HEK293T/hACE2细胞的96孔板中，设置不含假病毒的50μl完全培养基和只加50μl假病毒组作为对照，同时加入5μg/mL感染增强剂polybrene；假病毒感染细胞6h后换完全培养基，继续培养48h后使用化学发光酶标仪检测RLU；
根据检测出的RLU值可以有效评估疫苗对不同突变毒株的交叉免疫保护效果。
8.根据权利要求7所述的一种病毒S蛋白突变体假病毒盘的构建方法，其特征在于，新冠疫苗免疫效果的评估过程中，初始稀释倍数为1:2，稀释范围为1:2到1:256共8个梯度，设置3个平行。
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