CN114134175A - 一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法 - Google Patents

一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种同时表达RFP和luciferase的SARS‑CoV‑2假病毒系统的包装和检测方法。本发明包装得到的SARS‑CoV‑2假病毒无自主复制能力，安全性好，不仅表面能表达SARS‑CoV‑2 Spike蛋白，而且该病毒同时携带RFP和luciferase荧光素酶报告基因，可以同时利用流式方法和酶标仪分光光度分析方法进行定性和定量分析，可用于SARS‑CoV‑2中和抗体检测、SARS‑CoV‑2受体和药物筛选以及疫苗效果评价等。

Description

一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的 包装和检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法。
背景技术
RFP(Red Fluorecent Protein,红色荧光蛋白)基因是从海葵Discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因，其蛋白质的最大吸收光谱为583nm，不需要任何预处理便可检测到。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。
luciferase(荧光素酶)是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
现有的基因过表达载体主要有慢病毒载体、还原病毒载体、类腺病毒载体、转座子载体和非整合质粒等，慢病毒载体最大的优点是侵染效率和整合效率高，足够高的滴度条件下几乎可以使全部目标细胞收到转染，包括一些很难转染的细胞型。
SARS-CoV-2病毒自2019年流行以来，对全球造成了重大的公共威胁。虽然目前已经确认SARS-CoV-2的序列，也了解到该病毒与SARS病毒感染机制相似，都是通过与人细胞的ACE2蛋白结合，从而引发感染。但对于病毒进入细胞内之后的一系列生物学反应，对人体其它组织器官的易感性，以及有效治疗方法的选择都有待进一步研究。
SARS-CoV-2通过其编码的刺突蛋白(Spike蛋白，简称为S蛋白)与人类血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme,简称为ACE2)结合来介导病毒侵染人类细胞的过程。SARS-CoV-2刺突蛋白Spike及其受体ACE2的结构已获得解析，Spike蛋白属于冠状病毒的结构蛋白之一，由SARS-CoV-2的SPIKE基因编码，以同源三聚体的形式存在于冠状病毒刺突上，参与受体识别和膜融合等病毒感染过程。在结构上，Spike蛋白分为三个主要结构域：胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区包括S1、S2两个结构域，S1结构域位于Spike蛋白N端，含有宿主受体结构域(receptor binding domain，简称RBD)，SARS-CoV-2通过RBD与ACE2的肽酶结构域(peptidase domain)结合，参与SARS-CoV-2病毒的侵染过程；S2结构域则主要介导病毒包膜与细胞膜融合。
发明内容
本发明旨在提供一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法，本发明构建的假病毒不仅表面能表达SARS-CoV-2Spike蛋白，同时携带RFP和Luciferase荧光素酶报告基因，可以同时利用流式方法和酶标仪分光光度分析方法来对侵染的指标进行定性和定量分析，在SARS-CoV-2的研究中应用广泛。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，包括如下步骤：
(1)扩增FF Luc基因，将扩增产物插入pLVX-EF1a-DsRed-Monmer-C1质粒构建pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒；
(2)将Spike CDS插入pMD2.G质粒构建pMD.Spike质粒；
(3)将所述pMD.Spike质粒、慢病毒包装辅助质粒Ps-PAX2和所述pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒，利用转染试剂介导共转染细胞，包装含Spike刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，具体包括如下步骤：
步骤一、构建pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒：设计上游引物FF Luc5'coding和下游引物FF Luc 3'coding，以pNL4-3-Luc-R-E-载体为模板，扩增FF Luc基因，在扩增产物的5'端引入PmeI位点、T2A序列以及NotI位点，3'端引入AscI位点，PCR片段经过T4 PNK磷酸化后切胶回收，将切胶回收后的产物正向插入pLVX-EF1a-DsRed-Monmer-C1的SmaI位点，用T4 DNA连接酶在14-18℃下进行连接，得到pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒；
步骤二、构建pMD.Spike质粒：在pcDNA3.1-SARS2-Spike载体上，用PmeI和EcoRI切下Spike CDS，将切下的Spike CDS插入pMD2.G质粒的PmlI和EcoRI位点之间，用T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到pMD.Spike质粒；
步骤三、假新冠病毒的包装：将步骤二所述pMD.Spike质粒、慢病毒包装辅助质粒psPAX-2和步骤一所述pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒，利用转染试剂介导共转染野生型293T细胞和/或ACE2转基因293T细胞，包装含Spike刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，步骤一中，引物为：
FF Luc 5'coding+T2A：
5'GGGTTTAAACgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccaGCGGCCGCTgaagacgcc 3'；
FF Luc 3'coding：
5'GGCGCGCCTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGGC 3'。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，所述转染试剂为Lipofectamine 3000 Transfection Reagent。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，将SARS-CoV-2假病毒侵染过表达ACE2的转基因293T细胞系，进行检测分析。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，所述检测分析包括流式检测分析和/或荧光素酶活性分析。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，所述过表达ACE2的转基因293T细胞系的构建方法如下：
(1)扩增人类ACE2基因，将扩增产物插入载体PB513B-1构建PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒；
(2)所述PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒和含有转座酶的辅助载体PB200A-1在转染试剂介导下转染293T细胞，建立过表达ACE2的转基因293T细胞系。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，所述过表达ACE2的转基因293T细胞系的具体构建方法如下：
步骤一、构建PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒：设计上游引物hACE2-5'coding和hACE2-3'coding，以293T细胞的总RNA逆转录的cDNA为模板，扩增人类ACE2基因并在5’端引入XbaI和NheI位点，3'端引入NruI位点，PCR片段切胶回收，将切胶回收后的PCR片段插入PB513B-1的XbaI和NruI位点之间，T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒；
步骤二、构建过表达ACE2的转基因293T细胞系：S1所述PB-CMV-ACE2-T2A-puro载体和含有转座酶的辅助载体PB200A-1，以分子mol比例3:1在转染试剂介导下转染293T细胞，用1-3μg/ml嘌呤霉素筛选抗性细胞并建立转基因细胞系。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒的检测方法，步骤一中，引物为：
hACE2-5'coding：
5'gaagattctagagctagcCACCATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCT 3'；
hACE2-3'coding：
5'ATTTAATCGCGAAAGGAGGTCTGAACATCATCAGTGTTTTGG 3'。
本发明提供了一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒的检测方法，其特征在于，所述转染试剂为Lipofectamine 3000 Transfection Reagent。
由于采用了本发明的技术方案，有益效果如下：
1、本发明使用的慢病毒载体侵染效率和整合效率高，可以高效转染大部分目标细胞，包括一些很难转染的细胞型，目标基因是由EF1a启动子表达，抗性基因是由PGK启动子表达，都是持家基因的启动子，没有物种和细胞型的表达特异性，适应面很广。
2、本发明使用的piggyBac载体是以SBI公司生产的PB系列载体为骨架，是目前最高效的转座子载体系统，没有物种和细胞型的限制，可以用多种方法高效转化各种细胞，无需包装步骤省时省力，没有序列和基因特异性问题，载体容积很大，载体相对较小，易于分子克隆操作，转染293T细胞后ACE2表达水平十分稳定。
3、本发明的假病毒体系是基于第三代慢病毒体系，无自主复制能力，安全性好。
4、本发明的假病毒不仅表面能表达SARS-CoV-2Spike蛋白，而且病毒同时携带RFP和Luciferase荧光素酶报告基因，可通过观察荧光蛋白信号和检测荧光素酶活性评价假病毒感染细胞的侵染能力，可以同时利用流式方法和酶标仪分光光度分析方法来对侵染能力进行定性和定量分析，可用于中和抗体检测、SARS-CoV-2受体和药物筛选以及疫苗效果评价等。
附图说明
图1为本发明中基础质粒pNL4-3 Luc R-E-的质粒图谱；
图2为本发明中带有RFP和luciferase荧光素酶报告基因双标记基因的目标质粒pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc的质粒图谱；
图3为本发明中基础质粒pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-C1的质粒图谱；
图4为本发明中基础质粒pcDNA3.1-SARS2-Spike的质粒图谱；
图5为本发明中辅助质粒pMD.Spike的质粒图谱；
图6为本发明中另一辅助质粒psPAX2的质粒图谱；
图7为本发明中转基因293T细胞和野生型293T细胞ACE2表达水平的qPCR检测结果对比图；
图8为本发明中未浓缩假新冠病毒和侵染过表达ACE2的转基因293T细胞系，流式细胞检测结果对比图；
图9为本发明中100×浓缩假新冠病毒和侵染过表达ACE2的转基因293T细胞系，流式细胞检测结果对比图；
图10为本发明中被100×浓缩假新冠病毒侵染过表达ACE2的转基因293T细胞系和没有被侵染的过表达ACE2的转基因293T细胞系的生物发光检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述，其中的分子克隆步骤参照《分子克隆实验指南》相关章节进行，试剂盒试剂等相关材料均为市售商品。
实施例1
构建假新冠病毒
1、构建质粒
a、构建pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒
具体步骤如下：
用上游引物(FF Luc 5'coding+T2A，序列为：5'GGGTTTAAACgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccaGCGGCCGCTgaagacgcc 3')和下游引物(FF Luc3'coding，序列为：5'GGCGCGCCTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGGC 3')，以pNL4-3-Luc-R-E-载体(如图1所示)为模板，扩增FF Luc基因，在扩增产物的5'端引入PmeI位点、T2A序列以及NotI位点，3'端引入AscI位点，PCR片段经过T4 PNK磷酸化后切胶回收，将切胶回收后的产物正向插入pLVX-EF1a-DsRed-Monmer-C1(如图3所示)的SmaI位点，用T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒，如图2所示。将构建的质粒转化感受态细胞Stbl4，并用SmaI和EcoRI进行双酶切鉴定和基因序列测定，证实其正确性。pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
b、构建pMD.Spike质粒
具体步骤如下:
在pcDNA3.1-SARS2-Spike载体(如图4所示)上，用PmeI和EcoRI切下Spike CDS，将切下的Spike CDS插入pMD2.G质粒的PmlI和EcoRI位点之间，用T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到pMD.Spike质粒，如图5所示。将构建的质粒转化感受态细胞Stbl4，用HindIII和EcoRI进行双酶切鉴定和基因序列测定，证实其正确性，构建pMD.Spike质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
c、假新冠病毒的包装及浓缩
在慢病毒载体体系基础上，将pMD.Spike质粒、慢病毒包装辅助质粒Ps-PAX2(如图6所示)、pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒，利用Lipofectamine3000Transfection Reagent(Invitrogen,USA)介导共转染野生型293T细胞或ACE2转基因293T细胞，包装含Spike刺突蛋白的假新冠病毒。在转染后24小时移去上清，换上新鲜的293T培养基，4天后收集病毒上清液，4000◇g，4℃离心15分钟去掉细胞残渣，分装2ml上清(即粗病毒)冻存到-80℃，其余上清加50％PEG6000至终浓度8.5％，同时加4M的NaCl至终浓度0.4M，颠倒混匀后放置4℃冰箱约2小时，每20-30分钟混匀一次，然后7000◇g，4℃离心25分钟，弃掉上清，将得到的沉淀重悬于50mM Tris-HCl(pH7.4)，约浓缩100倍，分装冻存于-80℃。
实施例2
构建过表达ACE2的转基因293T细胞系
1、构建PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒
具体步骤如下：
用上游引物(hACE2-5'coding，序列为：5'gaagattctagagctagcCACCATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCT 3')和下游引物(hACE2-3'coding，序列为：5'ATTTAATCGCGAAAGGAGGTCTGAACATCATCAGTGTTTTGG 3')，以293T细胞的总RNA逆转录的cDNA为模板，扩增人类ACE2基因并在5’端引入XbaI和NheI位点，3'端引入NruI位点，PCR片段切胶回收，将切胶回收后的PCR片段插入PB513B-1(SBI Inc.,USA)的XbaI和NruI位点之间，T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒。将构建的质粒转化感受态细胞Stbl4，用XbaI和NruI进行双酶切鉴定和基因序列测定，证实其正确性。PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2、构建过表达ACE2的转基因293T细胞系
(1)构建过表达ACE2的转基因293T细胞系的具体步骤如下：
PB-CMV-ACE2-T2A-puro载体和含有转座酶的辅助载体transposase(PB200A-1，SBI公司)以分子mol比例3:1在Lipofectamine 3000 Transfection Reagent介导下转染293T细胞，用2μg/ml嘌呤霉素筛选抗性细胞并建立转基因细胞系。
(2)转基因293T细胞系中ACE2转录水平的检测
采用Trizol法分别裂解提取转基因293T细胞和野生型293T细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，逆转录反应体系见表1。以ACE2-Ex1-F(5'CACGAAGCCGAAGACCTGTTCTAT 3')和ACE2-Ex2-R(5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3')作为ACE2基因扩增引物，GADPH-EX7-F(5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3')和GADPH-EX8-R(5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3')作为内参引物，用FastStart Universal SYBR Green Master kit(Roche,cat:04913850001)在荧光定量PCR仪(Bio-rad Q5)上进行实时荧光定量检测(qPCR)，qPCR反应体系见表2，发现转基因293T细胞的ACE2转录水平远高于野生型293T细胞，证实已成功建立了稳定过表达ACE2的转基因293T细胞系，结果见图7。
表1逆转录20μL反应体系
成分 用量(μl)
Mix 4
Reverse transcriptase 1
Nuclease-free water 和RNA体积总共15μl
RNA template 1μg总RNA
其中，逆转录反应程序：25℃5min；42℃30min；85℃5min；4℃保存。获得的cDNA样本分装后-80℃储存。
表2 qPCR反应体系
反应体系(15μl)
Mix(10×) 7.5
F(10μM) 0.4
R(10μM) 0.4
ddH<sub>2</sub>O 3.7
cDNA(1:20稀释) 3
其中，qPCR反应程序：95℃预变性10min；95℃15s，56℃～66℃30s，72℃30s，45个循环，并收集荧光信号；65℃到95℃每隔10s检测融解曲线，共61个循环。
实施例3
假新冠病毒侵染过表达ACE2的转基因293T细胞
过表达ACE2的转基因293T细胞被传代于96孔板和12孔板中，将浓缩后和未浓缩的假新冠病毒加入培养基中，同时添加polybrene至终浓度6μg/ml，16小时之后移走上清，换成新鲜的293培养基，2天之后的细胞进行流式检测分析或荧光素酶活性分析，证实假新冠病毒是否能有效侵染过表达ACE2的转基因293T细胞。
a、流式检测分析
具体方法如下：将12孔板中的细胞用0.025％胰酶37℃处理3-4分钟，将细胞吹散成单细胞后收集到离心管中，1100rpm室温离心5min，弃上清，加200μl SM液(含有2％胎牛血清的D-PBS)重悬于流式上样管中，同时加1μl的7-AAD(标记细胞死活的染料)，70μm滤膜过滤。用BD CantoII流式细胞仪进行检测RFP(PE通道)的荧光强度，实验数据使用Flowjo10软件进行分析。图8和图9显示增加了荧光素酶基因之后，RFP荧光蛋白的表达没有受到显著影响，仍然能够用流式检测方式检测到相似的表达水平。其中，图8是未浓缩病毒，滴定体积为1ml；图9是100◇浓缩病毒，滴定体积为10μl。
b、荧光素酶活性检测
具体方法如下：首先用D-PBS将96孔板中细胞洗一遍，再加100μl 0.5％Triton100裂解细胞至少15min(裂解过程中要用摇床晃动)；时间到后立即吸打两下转入白色专用测量板中，然后加同体积2×(300μg/ml，储存液1：100稀释)配好的荧光素钾盐(终浓度为150μg/ml)，注意不要吹打，立刻上机检测，程序为Luminescence 96，尽快测量，对照组为未滴定病毒的转基因293T细胞，结果见图10。
从图10可知，假病毒侵染过表达ACE2的转基因293T细胞后，荧光素酶在转基因293T细胞内能有效表达并被检测到。
从图8、图9、图10可知，假新冠病毒侵染过表达ACE2的转基因293T细胞是成功的。
其中所用仪器、试剂等材料如下：
1、主要仪器和试剂：
(1)主要仪器及耗材
超净工作台LABCONCO A2，CO2培养箱Thermo HERACSL SD，普通倒置显微镜OLYMPUS CKX31，荧光显微镜及成像系统OLYMPUS DP73，流式细胞仪BD FACSCantoⅡ/Calibur，台式常温高速离心机Thermo LABOFUGE 400，贴壁12孔板CORNING。
(2)主要试剂
DMEM培养基美国Sigma D5796，非必需氨基酸(NEAA)美国Gibco07796，0.25％Trypsin/EDTA Gibco 25200056，胎牛血清(FBS)PAN BIOTECH P30-3302，L-谷氨酰胺Gibco25030081，青霉素/链霉素Gibco 15070063，台盼蓝(Trypan Blue stain)Gibco公司，实时荧光定量PCR试剂盒Roche FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)04913914001，逆转录试剂盒Bio-rad iScript TM Cdna Synthesis Kit 170-8891，染料7-AAD，BDBiosciences，Cat:51-68981E
2.主要溶液的配制
293T培养基配制
成份 体积 终浓度
DMEM 500ml 88％
FBS(PAN血清) 57ml(10％) 10％
10mM NEAA 5.7ml(1％) 0.1mM
Pen&Strep 5.7ml(1％) 1mM
Glutamin 5.7ml 2mM
3.细胞系
Lenti-293T细胞系购自Clontech公司；
4.载体系统
pcDNA3.1-SARS2-Spike和pNL4-3-Luc-R-E-质粒由清华大学所赠，pLVX-EF1a-DsRed-Monmer-C1购自Clontech公司，PMD2.G和Ps-PAX2质粒实验自行保存，通用型载体，和市售载体序列一致。
5.限制性内切酶及DNA修饰酶购自NEB公司，化学感受态细胞Stbl4自己制备，和市售感受态细胞Stbl4一样。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院输血研究所
<120> 一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11216
<212> DNA
<213> 人工合成
<223> pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc 全序列
<400> 1
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgatgagtaa ttcatacaaa aggactcgcc cctgccttgg 2220
ggaatcccag ggaccgtcgt taaactccca ctaacgtaga acccagagat cgctgcgttc 2280
ccgccccctc acccgcccgc tctcgtcatc actgaggtgg agaagagcat gcgtgaggct 2340
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 2400
gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 2460
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 2520
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt 2580
gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 2640
ccacgcccct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 2700
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 2760
cttgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 2820
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 2880
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 2940
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 3000
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 3060
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 3120
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 3180
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 3240
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 3300
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 3360
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 3420
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 3480
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gatcgctagc gctaccggtc 3540
gccaccatgg acaacaccga ggacgtcatc aaggagttca tgcagttcaa ggtgcgcatg 3600
gagggctccg tgaacggcca ctacttcgag atcgagggcg agggcgaggg caagccctac 3660
gagggcaccc agaccgccaa gctgcaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg 3720
gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac 3780
atccccgact acatgaagct gtccttcccc gagggcttca cctgggagcg ctccatgaac 3840
ttcgaggacg gcggcgtggt ggaggtgcag caggactcct ccctgcagga cggcaccttc 3900
atctacaagg tgaagttcaa gggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt aatgcagaag 3960
aagactgccg gctgggagcc ctccaccgag aagctgtacc cccaggacgg cgtgctgaag 4020
ggcgagatct cccacgccct gaagctgaag gacggcggcc actacacctg cgacttcaag 4080
accgtgtaca aggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggca accactacgt ggactccaag 4140
ctggacatca ccaaccacaa cgaggactac accgtggtgg agcagtacga gcacgccgag 4200
gcccgccact ccggctccca gtccggactc agatctcgag ctcaagcttc gaattctgca 4260
gtcgacggta ccgcgggccc gggtttaaac gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt 4320
gacgtggagg agaatcccgg cccagcggcc gctgaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc 4380
ccggcgccat tctatcctct agaggatgga accgctggag agcaactgca taaggctatg 4440
aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac 4500
atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat 4560
gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta tgcagtgaaa actctcttca attctttatg 4620
ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat 4680
gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa 4740
aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa aaaaaattac caataatcca gaaaattatt 4800
atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct 4860
catctacctc ccggttttaa tgaatacgat tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa 4920
acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt 4980
ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg catgccagag atcctatttt tggcaatcaa 5040
atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt gttccattcc atcacggttt tggaatgttt 5100
actacactcg gatatttgat atgtggattt cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa 5160
gagctgtttt tacgatccct tcaggattac aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc 5220
ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg attgacaaat acgatttatc taatttacac 5280
gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc 5340
ttccatcttc cagggatacg acaaggatat gggctcactg agactacatc agctattctg 5400
attacacccg agggggatga taaaccgggc gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa 5460
gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta 5520
tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc 5580
ttgattgaca aggatggatg gctacattct ggagacatag cttactggga cgaagacgaa 5640
cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc 5700
cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca 5760
ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga 5820
aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa 5880
aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc 5940
gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg 6000
taaggcgcgc cgggatccac cggatctaga taactgatca taattctacc gggtagggga 6060
ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg 6120
ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc 6180
tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc 6240
ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag 6300
tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg 6360
ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg 6420
gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc 6480
ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc 6540
gggcctttcg acctgcagcc caagcttacc atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc 6600
gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac 6660
cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa 6720
gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc 6780
gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag 6840
atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa 6900
ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc 6960
tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg 7020
gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc 7080
tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc 7140
tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga ccgcgtctgg aacaatcaac ctctggatta 7200
caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg 7260
atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc 7320
ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca 7380
acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac 7440
cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact 7500
catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc 7560
cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg 7620
gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc 7680
ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac 7740
gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt aattctgcag tcgagaccta 7800
gaaaaacatg gagcaatcac aagtagcaat acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg 7860
ctagaagcac aagaggagga ggaggtgggt tttccagtca cacctcaggt acctttaaga 7920
ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa gaggggactg 7980
gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatatccttg atctgtggat ctaccacaca 8040
caaggctact tccctgatta gcagaactac acaccagggc caggggtcag atatccactg 8100
acctttggat ggtgctacaa gctagtacca gttgagccag ataaggtaga agaggccaat 8160
aaaggagaga acaccagctt gttacaccct gtgagcctgc atgggatgga tgacccggag 8220
agagaagtgt tagagtggag gtttgacagc cgcctagcat ttcatcacgt ggcccgagag 8280
ctgcatccgg agtacttcaa gaactgctga tatcgagctt gctacaaggg actttccgct 8340
ggggactttc cagggaggcg tggcctgggc gggactgggg agtggcgagc cctcagatcc 8400
tgcatataag cagctgcttt ttgcctgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc 8460
ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg 8520
agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag 8580
acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca 8640
gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggccttgac attgctagcg 8700
ttttaccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 8760
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 8820
cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 8880
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 8940
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 9000
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 9060
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 9120
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 9180
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 9240
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 9300
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 9360
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 9420
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 9480
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 9540
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 9600
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 9660
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 9720
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 9780
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 9840
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 9900
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 9960
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 10020
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 10080
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 10140
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 10200
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 10260
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 10320
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 10380
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 10440
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gtctggatca actggataac tcaagctaac caaaatcatc ccaaacttcc caccccatac 11100
cctattacca ctgccaatta cctgtggttt catttactct aaacctgtga ttcctctgaa 11160
ttattttcat tttaaagaaa ttgtatttgt taaatatgta ctacaaactt agtagt 11216
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<211> 8025
<212> DNA
<213> 人工合成
<223> pMD.Spike全序列
<400> 2
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aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgt 8025
<210> 3
<211> 8334
<212> DNA
<213> 人工合成
<223> PB-CMV-ACE2-T2A-puro全序列
<400> 3
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
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gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 1500
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 1560
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 1620
tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat 1680
ccacgctgtt ttgacctcca tagaagattc tagagctagc caccatgtca agctcttcct 1740
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gagatcggaa gaagaaaaat aaagcaagaa gtggagaaaa tccttatgcc tccatcgata 4080
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gcgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctatga 4200
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ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc 4320
acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg 4380
gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg 4440
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cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg 4620
ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga 4680
cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg 4740
tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaaatc 4800
aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt 4860
ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgttaacttg tttattgcag 4920
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 4980
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggaatt 5040
gactcaaatg atgtcaatta gtctatcaga agctatctgg tctcccttcc gggggacaag 5100
acatccctgt ttaatattta aacagcagtg ttcccaaact gggttcttat atcccttgct 5160
ctggtcaacc aggttgcagg gtttcctgtc ctcacaggaa cgaagtccct aaagaaacag 5220
tggcagccag gtttagcccc ggaattgact ggattccttt tttagggccc attggtatgg 5280
ctttttcccc gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga 5340
ggaaagcgat cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg 5400
gggatgcggg gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta 5460
gcgggggagg gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc cctgatatct 5520
ataacaagaa aatatatata taataagtta tcacgtaagt agaacatgaa ataacaatat 5580
aattatcgta tgagttaaat cttaaaagtc acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac 5640
tcacgcggtc gttatagttc aaaatcagtg acacttaccg cattgacaag cacgcctcac 5700
gggagctcca agcggcgact gagatgtcct aaatgcacag cgacggattc gcgctattta 5760
gaaagagaga gcaatatttc aagaatgcat gcgtcaattt tacgcagact atctttctag 5820
ggttaatcta gctgcatcag gatcatatcg tcgggtcttt tttccggctc agtcatcgcc 5880
caagctggcg ctatctgggc atcggggagg aagaagcccg tgccttttcc cgcgaggttg 5940
aagcggcatg gaaagagttt gccgaggatg actgctgctg cattgacgtt gagcgaaaac 6000
gcacgtttac catgatgatt cgggaaggtg tggccatgca cgcctttaac ggtgaactgt 6060
tcgttcaggc cacctgggat accagttcgt cgcggctttt ccggacacag ttccggatgg 6120
tcagcccgaa gcgcatcagc aacccgaaca ataccggcga cagccggaac tgccgtgccg 6180
gtgtgcagat taatgacagc ggtgcggcgc tgggatatta cgtcagcgag gacgggtatc 6240
ctggctggat gccgcagaaa tggacatgga taccccgtga gttacccggc gggcgcgctt 6300
ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 6360
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 6420
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 6480
gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 6540
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 6600
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 6660
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 6720
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 6780
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 6840
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 6900
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 6960
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 7020
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 7080
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 7140
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 7200
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 7260
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 7320
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 7380
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 7440
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 7500
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 7560
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 7620
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 7680
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 7740
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 7800
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 7860
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 7920
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 7980
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 8040
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 8100
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 8160
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 8220
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 8280
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcat 8334

Claims (10)

1.一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)扩增FF Luc基因，将扩增产物插入pLVX-EF1a-DsRed-Monmer-C1质粒构建pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒；
(2)将Spike CDS插入pMD2.G质粒构建pMD.Spike质粒；
(3)将所述pMD.Spike质粒、慢病毒包装辅助质粒Ps-PAX2和所述pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒，利用转染试剂介导共转染细胞，包装含Spike刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒。
2.如权利要求1所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤一、构建pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒：设计上游引物FF Luc 5'coding和下游引物FF Luc 3'coding，以pNL4-3-Luc-R-E-载体为模板，扩增FF Luc基因，在扩增产物的5'端引入PmeI位点、T2A序列以及NotI位点，3'端引入AscI位点，PCR片段经过T4PNK磷酸化后切胶回收，将切胶回收后的产物正向插入pLVX-EF1a-DsRed-Monmer-C1的SmaI位点，用T4 DNA连接酶在14-18℃下进行连接，得到pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒；
步骤二、构建pMD.Spike质粒：在pcDNA3.1-SARS2-Spike载体上，用PmeI和EcoRI切下Spike CDS，将切下的Spike CDS插入pMD2.G质粒的PmlI和EcoRI位点之间，用T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到pMD.Spike质粒；
步骤三、假新冠病毒的包装：将步骤二所述pMD.Spike质粒、慢病毒包装辅助质粒psPAX-2和步骤一所述pLVX-EF1a-DsRed-Monomer-T2A-FF-luc质粒，利用转染试剂介导共转染野生型293T细胞和/或ACE2转基因293T细胞，包装含Spike刺突蛋白的SARS-CoV-2假病毒。
3.如权利要求2所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，其特征在于，步骤一中，引物为：
FF Luc 5'coding+T2A：
5'GGGTTTAAACgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccaGCGGCCGCTgaagacgcc 3'；
FF Luc 3'coding：
5'GGCGCGCCTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGGC 3'。
4.如权利要求1或2所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装方法，其特征在于，所述转染试剂为Lipofectamine 3000 Transfection Reagent。
5.一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，其特征在于，将SARS-CoV-2假病毒侵染过表达ACE2的转基因293T细胞系，进行检测分析。
6.如权利要求5所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，其特征在于，所述检测分析包括流式检测分析和/或荧光素酶活性分析。
7.如权利要求5所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，其特征在于，所述过表达ACE2的转基因293T细胞系的构建方法如下：
(1)扩增人类ACE2基因，将扩增产物插入载体PB513B-1构建PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒；
(2)所述PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒和含有转座酶的辅助载体PB200A-1在转染试剂介导下转染293T细胞，建立过表达ACE2的转基因293T细胞系。
8.如权利要求7所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的检测方法，其特征在于，所述过表达ACE2的转基因293T细胞系的具体构建方法如下：
步骤一、构建PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒：设计上游引物hACE2-5'coding和hACE2-3'coding，以293T细胞的总RNA逆转录的cDNA为模板，扩增人类ACE2基因并在5’端引入XbaI和NheI位点，3'端引入NruI位点，PCR片段切胶回收，将切胶回收后的PCR片段插入PB513B-1的XbaI和NruI位点之间，T4 DNA连接酶在16℃下进行连接，得到PB-CMV-ACE2-T2A-puro质粒；
步骤二、构建过表达ACE2的转基因293T细胞系：S1所述PB-CMV-ACE2-T2A-puro载体和含有转座酶的辅助载体PB200A-1，以分子mol比例3:1在转染试剂介导下转染293T细胞，用1-3μg/ml嘌呤霉素筛选抗性细胞并建立转基因细胞系。
9.如权利要求8所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒的检测方法，其特征在于，步骤一中，引物为：
hACE2-5'coding：
5'gaagattctagagctagcCACCATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCT 3'；
hACE2-3'coding：
5'ATTTAATCGCGAAAGGAGGTCTGAACATCATCAGTGTTTTGG 3'。
10.如权利要求7或8所述的一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒的检测方法，其特征在于，所述转染试剂为Lipofectamine 3000 Transfection Reagent。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
CN111662884A (zh) * 2020-06-18 2020-09-15 中吉当康(北京)基因技术有限公司 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN112760297A (zh) * 2020-06-16 2021-05-07 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
CN113444745A (zh) * 2021-05-25 2021-09-28 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) 病毒s蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
CN112760297A (zh) * 2020-06-16 2021-05-07 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
CN111662884A (zh) * 2020-06-18 2020-09-15 中吉当康(北京)基因技术有限公司 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN113444745A (zh) * 2021-05-25 2021-09-28 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) 病毒s蛋白突变体假病毒盘的构建及其疫苗评价应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李宁: "《动物克隆与基因组编辑》", 30 June 2012 *
郑梅等: "蝙蝠来源的重症急性呼吸综合征样冠状病毒WIV1刺突蛋白利用浣熊狗血管紧张素转换酶Ⅱ受体侵入细胞能力的研究", 《中华实验和临床感染病杂志(电子版)》 *
陶永光: "《肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册》", 30 November 2014 *

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