CN108531495A - 一种光控基因表达系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光控基因表达系统及其应用，所述光控基因表达系统是由yf1基因、fixJ基因和egfp基因组成，所述yf1基因采用BBa_J23100启动子表达，所述egfp基因采用P’_FixK2启动子表达，并在fixJ基因和egfp基因后分别添加BBa_B0015转录终止子。本发明利用光控系统调控细胞裂解，无需传统细胞裂解工艺必需的设备、场地、人员等，可大幅降低细胞裂解成本；无需高温高压、强碱等高能耗高污染条件，降低环境污染治理成本；此外，光诱导细胞裂解技术可有效地避免了化学诱导剂诱导细胞裂解技术对细胞培养的不利影响，解除对基因诱导表达时空条件的限制，具有重要的应用价值。

Description

一种光控基因表达系统及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用光控细胞裂解的方法。

背景技术

因为基因工程技术开发的许多产品在细胞内生成，不容易跨越细胞膜和细胞壁进入培养液中，所以分离纯化这些产品之前往往需要裂解细胞。传统的生产工艺中，人们需要通过较苛刻的物理或化学手段(如高温、强碱等)破坏细胞壁，从而获得目的产物。然而，这些细胞破裂的方法存在诸多弊端，不仅会降低产品的稳定性，而且对设备、场地、人员、能耗和废弃物治理等方面要求较高。因此，市场迫切需要一种较温和的细胞裂解的方法，从而降低细胞内生成的产品的生产成本以及相应的废弃物治理成本。

自然环境中，病毒(噬菌体)可以高效地降解细胞。这往往和病毒表达的裂解酶相关。例如，大肠杆菌λ噬菌体表达的裂解酶Lysin可以十分迅速地裂解大肠杆菌细胞。因此，通过克隆裂解酶的编码基因并在合适的条件下诱导其表达，将可实现细胞的高效裂解。其中，选择合适的基因诱导条件是制约该细胞裂解工艺生产的关键。

目前，调控基因表达的诱导剂主要为小分子化合物(如：异丙基硫代半乳糖苷、阿拉伯糖、木糖等)。然而，通过化学诱导剂诱导微生物细胞裂解的方法给现有生产工艺带来了较大挑战。因为诱导细胞裂解需要在细胞完成目的产物表达或合成之后进行，所以诱导剂的进料时间需严格控制；细胞培养装置中残留的化学诱导剂将可能导致后续生产中细胞在生长过程中裂解，从而对目的产物的产量造成难以预计的影响。此外，化学诱导剂的价格相对较高，进一步增加了相应的生产成本。

光在自然环境中十分容易获取，相对于传统的化学诱导剂而言，光作为基因表达调控的诱导剂不仅成本低廉，而且还能够实现时空上的精确调控，因此利用光作为诱导剂来调控裂解基因的表达可以解决生产工艺中化学诱导剂带来的诸多问题。本发明利用光控系统调控细胞裂解，其顺利实施将不仅大幅降低传统工艺中细胞裂解的生产成本和环境治理成本，而且避免了化学诱导剂诱导细胞裂解技术对现有生产工艺带来的潜在影响，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明目的是提供一种利用光控制细胞裂解的方法，利用全基因合成技术和基因工程技术建立了一套光控基因表达系统，该光控基因表达系统与裂解基因相连形成一套光控细胞裂解系统，成功应用该光控系统裂解细胞。该发明在基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等领域具有广阔的应用价值。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种光控基因表达系统，所述光控基因表达系统是由yf1基因、fixj基因和egfp基因组成，所述yf1基因采用BBa_J23100启动子(SEQ ID NO.2所示)，所述egfp基因采用P’_FixK2启动子(SEQ ID NO.4所示)，并在fixj基因和egfp基因后分别添加BBa_B0015转录终止子(SEQ ID NO.3所示)。

进一步，所述光控基因表达系统核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供一种所述光控基因表达系统在细胞可控培养中的应用，所述应用是将细胞裂解基因与光控基因表达系统共同导入宿主菌，在37℃进行细胞培养，若光诱导培养，则实现细胞生长；若避光培养，则实现细胞裂解。

进一步，所述细胞裂解基因为lys基因(SEQ ID NO.6所示)。

进一步，所述光控基因表达系统在导入宿主菌前，先将光控基因表达系统导入质粒pUC57后再导入宿主菌。

进一步，所述宿主菌构建方法为：将光控基因表达系统导入载体pUC57，获得重组质粒pZJUTiGEM0001；将细胞裂解基因lys转入质粒pUC57，酶切后与含阿拉伯糖启动子的载体pGLO连接，获得重组质粒pGLO-lys；将lys基因从重组质粒pGLO-lys上克隆至重组质粒pZJUTiGEM0001后转入宿主菌。

进一步，所述的细胞培养是将宿主菌置于光诱导装置中进行培养；所述光诱导装置由筒体和遮光盖构成，所述筒体内壁设有可控光源，筒体顶部设有固定微生物培养瓶的支撑架，所述微生物培养瓶的瓶口有遮光塞，所述支撑架和微生物培养瓶与筒体内壁遮光配合。所述筒体外设有控制光源的开关，打开电源即为光诱导培养，关闭电源则为避光培养。

进一步，所述可控光源为40W的LED蓝光灯。

进一步，所述光诱导装置在摇床中180rpm条件下培养。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

传统细胞裂解方法存在高能耗、高成本、高污染等弊端。本发明利用光控系统调控细胞裂解，无需传统细胞裂解工艺必需的设备、场地、人员等，可大幅降低细胞裂解成本；无需高温高压、强碱等高能耗高污染条件，降低环境污染治理成本；此外，光诱导细胞裂解技术可有效地避免了化学诱导剂诱导细胞裂解技术对细胞培养的不利影响，解除对基因诱导表达时空条件的限制，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为光控基因表达系统改造示意图。

图2为细胞裂解光控基因表达系统构建示意图。

图3为用于培养含光控基因表达系统细胞的光诱导装置；A为正面照片；B为顶部照片；C为结构示意图，1-支撑架，2-筒体；3-试管；4-可控光源；5-控制光源的电源及其开关；6-遮光盖；7-试管塞。

图4为实施例1中原光控基因表达系统的活性检测结果图。

图5为实施例1中含新光控基因表达系统的pZJUTiGEM0001质粒图谱。

图6为实施例1中新光控基因表达系统诱导GFP表达的结果图。

图7为实施例2中阿拉伯糖启动子诱导裂解基因lys表达导致细胞裂解结果图。

图8为实施例2中含新光控细胞裂解系统的pZJUTiGEM0002质粒图谱。

图9为实施例2中光控基因表达系统诱导细胞裂解的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1光控基因表达系统构建及其活性检测

1、光诱导装置

参照图3，光诱导装置由筒体2和遮光盖6构成，所述筒体内壁设有可控光源4，筒体顶部设有固定培养微生物试管3的支撑架1，所述微生物试管3的瓶口有遮光塞7，所述支撑架和微生物培养瓶与筒体内壁遮光配合。所述筒体外设有控制光源的电源开关5，所述可控光源为40W的LED蓝光灯。

2、光控基因表达系统的构建

(1)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的原始光控基因表达系统由上海交通大学马钢博士馈赠，基因测序结果表明该系统由yf1、fixj和mrfp报告基因组成，采用P_lacIq启动子启动yf1基因，P_FixK2启动子启动mrfp基因。原始光控基因表达系统存在于中等拷贝质粒载体pBR322上。将上述携带光控基因表达系统的质粒载体通过化学转化的方法导入大肠杆菌BL21中，具体方法如下：生长至对数期的大肠杆菌BL21(1ml)离心获得菌体沉淀，经50mMCaCl₂水溶液洗涤菌体2次后重悬于0.2ml、50mM、CaCl₂水溶液，从而制备相应的感受态细胞；质粒加至50ul感受态细胞重悬液中，经42℃热激90秒后加入950ul LB培养基(酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然)，涂布于含氨苄青霉素抗性的选择性平板上筛选获得含质粒的抗性菌落。采用步骤3的实验条件进行光控基因表达系统活性检测，未能检测出明显的光控效果，与导入了不含光控基因表达系统的空载体pBR322菌液样品相比，无明显的红色荧光检出(图4中A)。

(2)将步骤(1)中P_lacIq启动子更换为核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的启动子BBa_J23100、LacZ启动子或阿拉伯糖启动子，但仍未检出明显的光控效果(图4中B)。

(3)将步骤(1)中红色荧光报告基因mrfp更换为核苷酸序列为SEQ ID NO.7的增强型绿色荧光报告基因egfp(图4中C)，但仍未检出明显的光控效果。

(4)在上述改造无效的情况下，本发明对SEQ ID NO.1光控基因表达系统进行了如下系列改造：a)BBa_J23100启动子替换P_lacIq启动子，b)fixJ基因后添加IGEM标准组件BBa_B0015转录终止子，c)以启动子P’_FixK2(J Mol Biol,2012,416:534-42)替换原启动子P_FixK2，d)报告基因egfp替换mrfp报告基因，e)efgp基因末尾添加IGEM标准组件BBa_B0015转录终止子，最终构建出核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的光控基因表达系统，通过全基因合成的方式完成，并用高拷贝数的pUC复制子替换中等拷贝数的pBR322复制子，将光控基因表达系统导入载体pUC57，相应的重组质粒命名为pZJUTiGEM0001，其质粒图谱见图5，其序列详见SEQ ID NO.8。

3、光控基因表达系统活性检测

下面介绍光控基因表达系统活性的检测方法。

(1)通过化学转化的方法将携带光控基因表达系统的质粒pZJUTiGEM0001导入大肠杆菌BL21宿主菌中，具体方法如下：生长至对数期的大肠杆菌BL21(1ml)离心获得菌体沉淀，经50mM CaCl₂水溶液洗涤菌体2次后重悬于0.2ml、50mM、CaCl₂水溶液，从而制备相应的感受态细胞；质粒加至50ul感受态细胞重悬液中，经42℃热激90秒后加入950ul LB培养基(酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然)，涂布于含氨苄青霉素抗性的选择性平板上筛选获得含质粒的抗性菌落，即可获得携带光控基因表达系统的重组大肠杆菌BL21/pZJUTiGEM0001。

(2)光控基因表达系统活性检测：重组大肠杆菌BL21/pZJUTiGEM0001接种至LB培养基中，37℃自然光照条件下过夜培养。次日，按体积浓度1％接种至新鲜LB培养液中，分别置于步骤1所述光诱导装置和黑暗条件下，37℃恒温培养。培养过程中取两种条件下的培养液，通过酶标仪测定各自的绿色荧光值，测定绿色荧光的激发波长(Ex)和发射波长(Em)分别为488nm和516nm。

检测结果显示，光诱导装置中培养的重组大肠杆菌BL21/pZJUTiGEM0001表达的绿色荧光强度显著低于黑暗条件表达的绿色荧光强度(图6)，证明所构建的光控基因表达系统能够调控其下游基因egfp表达。

实施例2光控基因表达系统诱导细胞裂解

(1)检测裂解基因lys的活性：SEQ ID NO.6所示裂解基因lys通过全基因合成的方法获得，采用同源重组介导的一步克隆的方法将该lys基因克隆至pGLO质粒的阿拉伯糖启动子P_ara后，构建受阿拉伯糖启动子调控的裂解系统，具体方法如下：以核苷酸序列为SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物进行PCR扩增lys基因，扩增模板为全基因合成获得的质粒pUC57-lys，PCR产物上携带Nhe I and EcoR I酶切位点；Nhe I and EcoR I酶酶切上述PCR产物和含阿拉伯糖启动子的质粒载体pGLO，二者连接后转化大肠杆菌，所采用的转化方法如实施例1所述，所获得的转化子中含有目的重组质粒pGLO-lys，其上携带受阿拉伯糖启动子调控的裂解基因lys。含pGLO-lys的大肠杆菌在添加2.7mM阿拉伯糖的LB培养基和不添加阿拉伯糖的LB培养基中培养(温度：37℃，转速180rpm)，培养过程中监测细菌培养物的光密度(OD₆₀₀)。检测结果表明，加入阿拉伯糖后细菌培养物的OD₆₀₀值显著降低，表明裂解基因可表达裂解蛋白，导致细胞裂解(图7)。

(2)构建光控细胞裂解系统及其活性检测。采用同源重组介导的一步克隆的方法将lys基因从pGLO-lys质粒上克隆至pZJUTiGEM0001质粒上，使其受光控系统调控，从而构建光控细胞裂解系统。具体方法如下：以核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物，以重组质粒pGLO-lys为模板进行PCR扩增lys基因，使其携带载体上的同源臂，获得PCR产物A；以核苷酸序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物，以质粒pZJUTiGEM0001为模板进行PCR扩增，获得PCR产物B；采用一步克隆试剂盒(Vazyme Biotech公司)，连接PCR产物A和PCR产物B，连接产物转化大肠杆菌，所得转化子的重组质粒pZJUTiGEM0002上携带受光信号调控的裂解基因lys，其质粒图谱见附图8，其序列如SEQ IDNO.15所示。

将pZJUTiGEM0002通过化学转化的方法导入大肠杆菌BL21菌株中，具体方法如实施例1所述，从而构建携带光控细胞裂解系统的重组大肠杆菌BL21/pZJUTiGEM0002。将重组大肠杆菌BL21/pZJUTiGEM0002接种至新鲜LB培养基中，置于光诱导装置中和黑暗条件下37℃恒温培养。培养过程中取两种条件下的培养液，通过酶标仪测定各自在600nm处的吸光值，得到其OD₆₀₀值，据此判断细胞裂解状况。检测结果显示，光诱导装置中培养液的OD₆₀₀值显著高于黑暗条件培养液的OD₆₀₀值，证明所构建的光控系统能够调控其下游基因lys表达(图9)，导致细胞裂解。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种光控基因表达系统及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2967

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 60

tatttcacac cgcatatgga caccatcgaa tggtgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga 120

tagcgcccta ctagaaagag gagaaatact agatggctag ttttcaatca tttgggatac 180

caggacagct ggaagtcatc aaaaaagcac ttgatcacgt gcgagtcggt gtggtaatta 240

cagatcccgc acttgaagat aatcctattg tctacgtaaa tcaaggcttt gttcaaatga 300

ccggctacga gaccgaggaa attttaggaa agaactgtcg cttcttacag gggaaacaca 360

cagatccggc agaagtggac aacatcagaa ccgctttaca aaataaagaa ccggtcaccg 420

ttcagatcca aaactacaaa aaagacggaa cgatgttctg gaatgaatta aatattgatc 480

caatggaaat agaggataaa acgtattttg tcggcattca gaatgatatc accgagcacc 540

agcagaccca ggcgcgtctc caggaactgc aatccgagct cgtccacgtc tccaggctga 600

gcgccatggg cgaaatggcg tccgcgctcg cgcacgagct caaccagccg ctggcggcga 660

tcagcaacta catgaagggc tcgcggcggc tgcttgccgg cagcagtgat ccgaacacac 720

cgaaggtcga aagcgccctg gaccgcgccg ccgagcaggc gctgcgcgcc ggccagatca 780

tccggcgcct gcgcgacttc gttgcccgcg gcgaatcgga gaagcgggtc gagagtctct 840

ccaagctgat cgaggaggcc ggcgcgctcg ggcttgccgg cgcgcgcgag cagaacgtgc 900

agctccgctt cagtctcgat ccgggcgccg atctcgttct cgccgaccgg gtgcagatcc 960

agcaggtcct ggtcaacctg ttccgcaacg cgctggaagc gatggctcag tcgcagcgac 1020

gcgagctcgt cgtcaccaac acccccgccg ccgacgacat gatcgaggtc gaagtgtccg 1080

acaccggcag cggtttccag gacgacgtca ttccgaacct gtttcagact ttcttcacca 1140

ccaaggacac cggcatgggc gtgggactgt ccatcagccg ctcgatcatc gaagctcacg 1200

gcgggcgcat gtgggccgag agcaacgcat cgggcggggc gaccttccgc ttcaccctcc 1260

cggcagccga cgagaattaa taatactaga gaaagaggag aaatactaga tgacgaccaa 1320

gggacatatc tacgtcatcg acgacgacgc ggcgatgcgg gattcgctga atttcctgct 1380

ggattctgcc ggcttcggcg tcacgctgtt tgacgacgcg caagcctttc tcgacgccct 1440

gccgggtctc tccttcggct gcgtcgtctc cgacgtgcgc atgccgggcc ttgacggcat 1500

cgagctgttg aagcggatga aggcgcagca aagccccttt ccgatcctca tcatgaccgg 1560

tcacggcgac gtgccgctcg cggtcgaggc gatgaagtta ggggcggtcg actttctgga 1620

aaagcctttc gaggacgacc gcctcaccgc catgatcgaa tcggcgatcc gccaggccga 1680

gccggccgcc aagagcgagg ccgtcgcgca ggatatcgcc gcccgcgtcg cctcgttgag 1740

ccccagggag cgccaggtca tggaagggct gatcgccggc ctttccaaca agctgatcgc 1800

ccgcgagtac gacatcagcc cgcgcaccat cgaggtgtat cgggccaacg tcatgaccaa 1860

gatgcaggcc aacagccttt cggagctggt tcgcctcgcg atgcgcgccg gcatgctcaa 1920

cgattaataa tactagaggc cggagccgat tatccgcacc cgtccttggt cttggacaca 1980

ctcgctcgcg atccgaagcc gcctttcaaa gatactccgc agtgaaacgc atcttttaag 2040

cgcgacttgt cgccttcgcg cagcagaaca ctcgtatggc actcaatcca tgatcgcttc 2100

gttcgctccg acgcgcgttg cggggccccc ctcgaccgga tgacaacaca ttgcgtcacc 2160

tcaactgctg cgcgcgcact gcgtcacagg tacccgggga tcctctagat cacacaggaa 2220

agtactagat ggcttcctcc gaagacgtta tcaaagagtt catgcgtttc aaagttcgta 2280

tggaaggttc cgttaacggt cacgagttcg aaatcgaagg tgaaggtgaa ggtcgtccgt 2340

acgaaggtac ccagaccgct aaactgaaag ttaccaaagg tggtccgctg ccgttcgctt 2400

gggacatcct gtccccgcag ttccagtacg gttccaaagc ttacgttaaa cacccggctg 2460

acatcccgga ctacctgaaa ctgtccttcc cggaaggttt caaatgggaa cgtgttatga 2520

acttcgaaga cggtggtgtt gttaccgtta cccaggactc ctccctgcaa gacggtgagt 2580

tcatctacaa agttaaactg cgtggtacca acttcccgtc cgacggtccg gttatgcaga 2640

aaaaaaccat gggttgggaa gcttccaccg aacgtatgta cccggaagac ggtgctctga 2700

aaggtgaaat caaaatgcgt ctgaaactga aagacggtgg tcactacgac gctgaagtta 2760

aaaccaccta catggctaaa aaaccggttc agctgccggg tgcttacaaa accgacatca 2820

aactggacat cacctcccac aacgaagact acaccatcgt tgaacagtac gaacgtgctg 2880

aaggtcgtca ctccaccggt gcttaataac gctgatagtg ctagtgtaga tcgctctaga 2940

gtcgacctgc aggcatgcaa gctggct 2967

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

<210> 3

<211> 129

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60

gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120

gcgtttata 129

<210> 4

<211> 247

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

acgcccgtga tcctgatcac cggctatccg gacgaaaaca tctcgacccg ggccgccgag 60

gccggcgtaa aagacgtggt tttgaagccg cttctcgacg aaaacctgct caagcgtatc 120

cgccgcgcca tccaggaccg gcctcgggca tgacctacgg ggttctacgt aaggcacccc 180

ccttaagata tcgctcgaaa ttttcgaacc tcccgatacc gcgtaccaat gcgtcatcac 240

aacggag 247

<210> 5

<211> 2278

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagctacta gaaagaggag aaatactaga 60

tggctagttt tcaatcattt gggataccag gacagctgga agtcatcaaa aaagcacttg 120

atcacgtgcg agtcggtgtg gtaattacag atcccgcact tgaagataat cctattgtct 180

acgtaaatca aggctttgtt caaatgaccg gctacgagac cgaggaaatt ttaggaaaga 240

actgtcgctt cttacagggg aaacacacag atccggcaga agtggacaac atcagaaccg 300

ctttacaaaa taaagaaccg gtcaccgttc agatccaaaa ctacaaaaaa gacggaacga 360

tgttctggaa tgaattaaat attgatccaa tggaaataga ggataaaacg tattttgtcg 420

gcattcagaa tgatatcacc gagcaccagc agacccaggc gcgtctccag gaactgcaat 480

ccgagctcgt ccacgtctcc aggctgagcg ccatgggcga aatggcgtcc gcgctcgcgc 540

acgagctcaa ccagccgctg gcggcgatca gcaactacat gaagggctcg cggcggctgc 600

ttgccggcag cagtgatccg aacacaccga aggtcgaaag cgccctggac cgcgccgccg 660

agcaggcgct gcgcgccggc cagatcatcc ggcgcctgcg cgacttcgtt gcccgcggcg 720

aatcggagaa gcgggtcgag agtctctcca agctgatcga ggaggccggc gcgctcgggc 780

ttgccggcgc gcgcgagcag aacgtgcagc tccgcttcag tctcgatccg ggcgccgatc 840

tcgttctcgc cgaccgggtg cagatccagc aggtcctggt caacctgttc cgcaacgcgc 900

tggaagcgat ggctcagtcg cagcgacgcg agctcgtcgt caccaacacc cccgccgccg 960

acgacatgat cgaggtcgaa gtgtccgaca ccggcagcgg tttccaggac gacgtcattc 1020

cgaacctgtt tcagactttc ttcaccacca aggacaccgg catgggcgtg ggactgtcca 1080

tcagccgctc gatcatcgaa gctcacggcg ggcgcatgtg ggccgagagc aacgcatcgg 1140

gcggggcgac cttccgcttc accctcccgg cagccgacga gaattaataa tactagagaa 1200

agaggagaaa tactagatga cgaccaaggg acatatctac gtcatcgacg acgacgcggc 1260

gatgcgggat tcgctgaatt tcctgctgga ttctgccggc ttcggcgtca cgctgtttga 1320

cgacgcgcaa gcctttctcg acgccctgcc gggtctctcc ttcggctgcg tcgtctccga 1380

cgtgcgcatg ccgggccttg acggcatcga gctgttgaag cggatgaagg cgcagcaaag 1440

cccctttccg atcctcatca tgaccggtca cggcgacgtg ccgctcgcgg tcgaggcgat 1500

gaagttaggg gcggtcgact ttctggaaaa gcctttcgag gacgaccgcc tcaccgccat 1560

gatcgaatcg gcgatccgcc aggccgagcc ggccgccaag agcgaggccg tcgcgcagga 1620

tatcgccgcc cgcgtcgcct cgttgagccc cagggagcgc caggtcatgg aagggctgat 1680

cgccggcctt tccaacaagc tgatcgcccg cgagtacgac atcagcccgc gcaccatcga 1740

ggtgtatcgg gccaacgtca tgaccaagat gcaggccaac agcctttcgg agctggttcg 1800

cctcgcgatg cgcgccggca tgctcaacga ttaataacgc tgatagtgct agtgtagatc 1860

gctactagag ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 1920

tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt 1980

gggcctttct gcgtttatat actagagacg cccgtgatcc tgatcaccgg ctatccggac 2040

gaaaacatct cgacccgggc cgccgaggcc ggcgtaaaag acgtggtttt gaagccgctt 2100

ctcgacgaaa acctgctcaa gcgtatccgc cgcgccatcc aggaccggcc tcgggcatga 2160

cctacggggt tctacgtaag gcacccccct taagatatcg ctcgaaattt tcgaacctcc 2220

cgataccgcg taccaatgcg tcatcacaac ggagtactag aaagaggaga aatactag 2278

<210> 6

<211> 884

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

atggtgagca agggcgagga gctatgcctc catcattacg aaaagccgtt gctgctgcta 60

ttggtggcgg agcaattgct atagcatcag tgttaatcac tggcccaagt ggtaacgatg 120

gtctggaagg tgtcagctac ataccataca aagatattgt tggtgtatgg actgtatgtc 180

acggacacac cggaaaagac atcatgctcg gtaaaacgta taccaaagca gaatgcaaag 240

cactcttgaa taaagacctt gccactgtcg ccagacaaat taacccgtat atcaaagtcg 300

atataccgga aacaacgcgc ggcgctcttt actcattcgt ttacaacgtg ggtgctggca 360

attttagaac atcgacgctt cttcgcaaaa taaaccaggg cgatatcaaa ggcgcatgtg 420

atcagctgcg tcgctggaca tacgctggcg gtaagcaatg gaaaggcctg atgactcgtc 480

gtgagattga gcgtgaagtc tgtttgtggg ggcaacagga gttctggctg tccgtgcacg 540

atgttgaaac catcgacagt acgtcccagc cgaccacgcc ggcgaaaagc tatgtggtta 600

aacaaggtga taccctgagt ggcatcgcgt ccaactgggg cacgaattgg caggaactgg 660

cccgtcaaaa ttcactgtcg aacccgaata tgatttatgc gggtcaggtg atcagcttta 720

ccggcggtca atctggtgca accgcacgcg cttacacggt tcagtcaggt gataacctga 780

gctctattgc catcctgctg ggcaccacgg tccaatcact ggtgtcgatg aatggtattt 840

ctaacccgaa tctgatctat gcaggccaga ccctgaacta ctaa 884

<210> 7

<211> 720

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 8

<211> 5602

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgtt gacggctagc tcagtcctag gtacagtgct agctactaga aagaggagaa 240

atactagatg gctagttttc aatcatttgg gataccagga cagctggaag tcatcaaaaa 300

agcacttgat cacgtgcgag tcggtgtggt aattacagat cccgcacttg aagataatcc 360

tattgtctac gtaaatcaag gctttgttca aatgaccggc tacgagaccg aggaaatttt 420

aggaaagaac tgtcgcttct tacaggggaa acacacagat ccggcagaag tggacaacat 480

cagaaccgct ttacaaaata aagaaccggt caccgttcag atccaaaact acaaaaaaga 540

cggaacgatg ttctggaatg aattaaatat tgatccaatg gaaatagagg ataaaacgta 600

ttttgtcggc attcagaatg atatcaccga gcaccagcag acccaggcgc gtctccagga 660

actgcaatcc gagctcgtcc acgtctccag gctgagcgcc atgggcgaaa tggcgtccgc 720

gctcgcgcac gagctcaacc agccgctggc ggcgatcagc aactacatga agggctcgcg 780

gcggctgctt gccggcagca gtgatccgaa cacaccgaag gtcgaaagcg ccctggaccg 840

cgccgccgag caggcgctgc gcgccggcca gatcatccgg cgcctgcgcg acttcgttgc 900

ccgcggcgaa tcggagaagc gggtcgagag tctctccaag ctgatcgagg aggccggcgc 960

gctcgggctt gccggcgcgc gcgagcagaa cgtgcagctc cgcttcagtc tcgatccggg 1020

cgccgatctc gttctcgccg accgggtgca gatccagcag gtcctggtca acctgttccg 1080

caacgcgctg gaagcgatgg ctcagtcgca gcgacgcgag ctcgtcgtca ccaacacccc 1140

cgccgccgac gacatgatcg aggtcgaagt gtccgacacc ggcagcggtt tccaggacga 1200

cgtcattccg aacctgtttc agactttctt caccaccaag gacaccggca tgggcgtggg 1260

actgtccatc agccgctcga tcatcgaagc tcacggcggg cgcatgtggg ccgagagcaa 1320

cgcatcgggc ggggcgacct tccgcttcac cctcccggca gccgacgaga attaataata 1380

ctagagaaag aggagaaata ctagatgacg accaagggac atatctacgt catcgacgac 1440

gacgcggcga tgcgggattc gctgaatttc ctgctggatt ctgccggctt cggcgtcacg 1500

ctgtttgacg acgcgcaagc ctttctcgac gccctgccgg gtctctcctt cggctgcgtc 1560

gtctccgacg tgcgcatgcc gggccttgac ggcatcgagc tgttgaagcg gatgaaggcg 1620

cagcaaagcc cctttccgat cctcatcatg accggtcacg gcgacgtgcc gctcgcggtc 1680

gaggcgatga agttaggggc ggtcgacttt ctggaaaagc ctttcgagga cgaccgcctc 1740

accgccatga tcgaatcggc gatccgccag gccgagccgg ccgccaagag cgaggccgtc 1800

gcgcaggata tcgccgcccg cgtcgcctcg ttgagcccca gggagcgcca ggtcatggaa 1860

gggctgatcg ccggcctttc caacaagctg atcgcccgcg agtacgacat cagcccgcgc 1920

accatcgagg tgtatcgggc caacgtcatg accaagatgc aggccaacag cctttcggag 1980

ctggttcgcc tcgcgatgcg cgccggcatg ctcaacgatt aataacgctg atagtgctag 2040

tgtagatcgc tactagagcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 2100

cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcta ctagagtcac actggctcac 2160

cttcgggtgg gcctttctgc gtttatatac tagagacgcc cgtgatcctg atcaccggct 2220

atccggacga aaacatctcg acccgggccg ccgaggccgg cgtaaaagac gtggttttga 2280

agccgcttct cgacgaaaac ctgctcaagc gtatccgccg cgccatccag gaccggcctc 2340

gggcatgacc tacggggttc tacgtaaggc acccccctta agatatcgct cgaaattttc 2400

gaacctcccg ataccgcgta ccaatgcgtc atcacaacgg agtactagaa agaggagaaa 2460

tactagatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 2520

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 2580

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 2640

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 2700

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 2760

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 2820

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 2880

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 2940

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 3000

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 3060

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 3120

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 3180

aagtaatact agagccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 3240

tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctctactag agtcacactg gctcaccttc 3300

gggtgggcct ttctgcgttt ataatcggat gccgggaccg acgagtgcag aggcgtgcaa 3360

gcgagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 3420

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 3480

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 3540

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 3600

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 3660

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 3720

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 3780

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 3840

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 3900

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 3960

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 4020

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 4080

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 4140

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 4200

cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 4260

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 4320

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 4380

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 4440

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 4500

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 4560

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 4620

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 4680

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 4740

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 4800

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 4860

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 4920

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 4980

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 5040

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 5100

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 5160

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 5220

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 5280

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 5340

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 5400

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 5460

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 5520

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 5580

cgtatcacga ggccctttcg tc 5602

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

ggagatatac atatggctag cggatccatg cct 33

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

ccgggtaccg agctcgaatt cttagtagtt cagggtctgg 40

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

agccaggcat caaataaaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

agctcctcgc ccttgctcac 20

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

gcaagggcga ggagctatgc ctccatcatt acgaaa 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

tatttgatgc ctggctttag tagttcaggg tctggc 36

<210> 15

<211> 5760

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgtt gacggctagc tcagtcctag gtacagtgct agctactaga aagaggagaa 240

atactagatg gctagttttc aatcatttgg gataccagga cagctggaag tcatcaaaaa 300

agcacttgat cacgtgcgag tcggtgtggt aattacagat cccgcacttg aagataatcc 360

tattgtctac gtaaatcaag gctttgttca aatgaccggc tacgagaccg aggaaatttt 420

aggaaagaac tgtcgcttct tacaggggaa acacacagat ccggcagaag tggacaacat 480

cagaaccgct ttacaaaata aagaaccggt caccgttcag atccaaaact acaaaaaaga 540

cggaacgatg ttctggaatg aattaaatat tgatccaatg gaaatagagg ataaaacgta 600

ttttgtcggc attcagaatg atatcaccga gcaccagcag acccaggcgc gtctccagga 660

actgcaatcc gagctcgtcc acgtctccag gctgagcgcc atgggcgaaa tggcgtccgc 720

gctcgcgcac gagctcaacc agccgctggc ggcgatcagc aactacatga agggctcgcg 780

gcggctgctt gccggcagca gtgatccgaa cacaccgaag gtcgaaagcg ccctggaccg 840

cgccgccgag caggcgctgc gcgccggcca gatcatccgg cgcctgcgcg acttcgttgc 900

ccgcggcgaa tcggagaagc gggtcgagag tctctccaag ctgatcgagg aggccggcgc 960

gctcgggctt gccggcgcgc gcgagcagaa cgtgcagctc cgcttcagtc tcgatccggg 1020

cgccgatctc gttctcgccg accgggtgca gatccagcag gtcctggtca acctgttccg 1080

caacgcgctg gaagcgatgg ctcagtcgca gcgacgcgag ctcgtcgtca ccaacacccc 1140

cgccgccgac gacatgatcg aggtcgaagt gtccgacacc ggcagcggtt tccaggacga 1200

cgtcattccg aacctgtttc agactttctt caccaccaag gacaccggca tgggcgtggg 1260

actgtccatc agccgctcga tcatcgaagc tcacggcggg cgcatgtggg ccgagagcaa 1320

cgcatcgggc ggggcgacct tccgcttcac cctcccggca gccgacgaga attaataata 1380

ctagagaaag aggagaaata ctagatgacg accaagggac atatctacgt catcgacgac 1440

gacgcggcga tgcgggattc gctgaatttc ctgctggatt ctgccggctt cggcgtcacg 1500

ctgtttgacg acgcgcaagc ctttctcgac gccctgccgg gtctctcctt cggctgcgtc 1560

gtctccgacg tgcgcatgcc gggccttgac ggcatcgagc tgttgaagcg gatgaaggcg 1620

cagcaaagcc cctttccgat cctcatcatg accggtcacg gcgacgtgcc gctcgcggtc 1680

gaggcgatga agttaggggc ggtcgacttt ctggaaaagc ctttcgagga cgaccgcctc 1740

accgccatga tcgaatcggc gatccgccag gccgagccgg ccgccaagag cgaggccgtc 1800

gcgcaggata tcgccgcccg cgtcgcctcg ttgagcccca gggagcgcca ggtcatggaa 1860

gggctgatcg ccggcctttc caacaagctg atcgcccgcg agtacgacat cagcccgcgc 1920

accatcgagg tgtatcgggc caacgtcatg accaagatgc aggccaacag cctttcggag 1980

ctggttcgcc tcgcgatgcg cgccggcatg ctcaacgatt aataacgctg atagtgctag 2040

tgtagatcgc tactagagcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 2100

cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcta ctagagtcac actggctcac 2160

cttcgggtgg gcctttctgc gtttatatac tagagacgcc cgtgatcctg atcaccggct 2220

atccggacga aaacatctcg acccgggccg ccgaggccgg cgtaaaagac gtggttttga 2280

agccgcttct cgacgaaaac ctgctcaagc gtatccgccg cgccatccag gaccggcctc 2340

gggcatgacc tacggggttc tacgtaaggc acccccctta agatatcgct cgaaattttc 2400

gaacctcccg ataccgcgta ccaatgcgtc atcacaacgg agtactagaa agaggagaaa 2460

tactagatgg tgagcaaggg cgaggagcta tgcctccatc attacgaaaa gccgttgctg 2520

ctgctattgg tggcggagca attgctatag catcagtgtt aatcactggc ccaagtggta 2580

acgatggtct ggaaggtgtc agctacatac catacaaaga tattgttggt gtatggactg 2640

tatgtcacgg acacaccgga aaagacatca tgctcggtaa aacgtatacc aaagcagaat 2700

gcaaagcact cttgaataaa gaccttgcca ctgtcgccag acaaattaac ccgtatatca 2760

aagtcgatat accggaaaca acgcgcggcg ctctttactc attcgtttac aacgtgggtg 2820

ctggcaattt tagaacatcg acgcttcttc gcaaaataaa ccagggcgat atcaaaggcg 2880

catgtgatca gctgcgtcgc tggacatacg ctggcggtaa gcaatggaaa ggcctgatga 2940

ctcgtcgtga gattgagcgt gaagtctgtt tgtgggggca acaggagttc tggctgtccg 3000

tgcacgatgt tgaaaccatc gacagtacgt cccagccgac cacgccggcg aaaagctatg 3060

tggttaaaca aggtgatacc ctgagtggca tcgcgtccaa ctggggcacg aattggcagg 3120

aactggcccg tcaaaattca ctgtcgaacc cgaatatgat ttatgcgggt caggtgatca 3180

gctttaccgg cggtcaatct ggtgcaaccg cacgcgctta cacggttcag tcaggtgata 3240

acctgagctc tattgccatc ctgctgggca ccacggtcca atcactggtg tcgatgaatg 3300

gtatttctaa cccgaatctg atctatgcag gccagaccct gaactactaa agccaggcat 3360

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg 3420

gtgaacgctc tctactagag tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat 3480

aatcggatgc cgggaccgac gagtgcagag gcgtgcaagc gagcttggcg taatcatggt 3540

catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 3600

gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 3660

tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 3720

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3780

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3840

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3900

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3960

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 4020

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 4080

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 4140

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4200

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4260

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4320

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4380

gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4440

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4500

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4560

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4620

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4680

agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 4740

gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 4800

agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 4860

cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 4920

ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 4980

cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 5040

cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 5100

ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 5160

tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 5220

catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 5280

gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 5340

gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 5400

tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 5460

catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 5520

aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 5580

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 5640

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 5700

aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 5760

Claims (10)

1.一种光控基因表达系统，其特征在于所述光控基因表达系统是由yf1基因、fixJ基因和egfp基因组成，所述yf1基因采用BBa_J23100启动子表达，所述egfp基因采用P’_FixK2启动子表达，并在fixJ基因和egfp基因后分别添加BBa_B0015转录终止子。

2.如权利要求1所述光控基因表达系统，其特征在于所述光控基因表达系统核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

3.一种权利要求1所述光控基因表达系统在细胞可控培养中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用是将细胞裂解基因与光控基因表达系统共同导入宿主菌，在37℃进行细胞培养，若光诱导培养，则实现细胞生长；若避光培养，则实现细胞裂解。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述细胞裂解基因为lys基因。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述光控基因表达系统在导入宿主菌前，先将光控基因表达系统导入质粒pUC57后再导入宿主菌。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述宿主菌构建方法为：将光控基因表达系统导入载体pUC57，获得重组质粒pZJUTiGEM0001；将细胞裂解基因lys转入质粒pUC57，酶切后与含阿拉伯糖启动子的载体pGLO连接，获得重组质粒pGLO-lys；将lys基因从重组质粒pGLO-lys上克隆至重组质粒pZJUTiGEM0001后转入宿主菌。

8.如权利要求4所述应用，其特征在于所述的细胞培养是将宿主菌置于光诱导装置中进行培养；所述光诱导装置由筒体和遮光盖构成，所述筒体内壁设有可控光源，筒体顶部设有固定微生物培养瓶的支撑架，所述微生物培养瓶的瓶口有遮光塞，所述支撑架和微生物培养瓶与筒体内壁遮光配合。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述可控光源为40W的LED蓝光灯。

10.如权利要求8所述应用，其特征在于所述光诱导装置在摇床中180rpm条件下培养。