CN116964083A - 用于保护治疗性细胞免于发生同种异体排斥和激活诱导的细胞死亡的FasL表达和FasR基因敲除 - Google Patents

用于保护治疗性细胞免于发生同种异体排斥和激活诱导的细胞死亡的FasL表达和FasR基因敲除 Download PDF

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Abstract

用于改善疗法的组合物、方法、表达载体和经工程化的免疫细胞，所述疗法需要向患者施用同种异体细胞。一种免疫细胞，例如T细胞，所述细胞被修饰以包括和/或表达来自例如表达载体的FasL蛋白或FasL蛋白衍生物，所述表达载体包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸，并且以在降低水平下表达FasR，并且被进一步修饰以包括和/或表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)。一种改善的CAR T细胞治疗方法，所述方法包括施用改善的免疫细胞以及包括所述改善的免疫细胞的组合物。改善施用的细胞的持久性和减少激活诱导的细胞死亡的方法，所述方法包括施用所述改善的细胞。

Description

用于保护治疗性细胞免于发生同种异体排斥和激活诱导的细 胞死亡的FasL表达和FasR基因敲除
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年3月4日提交的美国临时申请第63/156,902号的优先权权益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2022年2月24日的所述ASCII副本命名为AT-040_02WO_SL.txt并且大小为102,560字节。
技术领域
本公开总体上涉及经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞(例如，T细胞)在治疗疾病中的用途。
背景技术
靶向细胞疗法采用基因工程化以用癌症靶向受体(T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))武装免疫效应细胞并且然后将这些经工程化的细胞注入到自体或同种异体癌症患者体内。经基因修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞的过继转移已成为治疗癌症的有效方法(参见例如，Brenner等人,《免疫学新见(Current Opinion in Immunology)》,22(2):251-257(2010)；Rosenberg等人,《自然综述：癌症(Nature Reviews Cancer)》,8(4):299-308(2008))。可以对免疫细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，即包括抗原识别部分和T细胞激活结构域的融合蛋白(参见例如，Eshhar等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993)以及Sadelain等人,《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol)》,21(2):215-223(2009))。将含有CAR的免疫细胞，例如CAR-T细胞(CAR-T)工程化以在保持或增强其识别和杀伤靶细胞的能力的同时赋予其抗原特异性。
然而，CAR修饰的自体细胞疗法的产生是昂贵的，需要数周的过程和质量测试，并且根据所采用的患者特异性T细胞的初始质量和数量产生不同效力的产物。相对于自体疗法，同种异体CAR修饰的细胞疗法——其中来自健康供体的细胞用CAR修饰，并且然后施用于多个患者——有望成为可以在需要时立即提供的更便宜并且更强大的产物(参见例如，Graham等人,《细胞(Cells)》2018,7,155；doi:10.3390/cells7100155)。另外地，同种异体疗法能够选择期望的产物特性(例如，基因编辑效率、整合位点、缺乏有害的脱靶基因编辑、单体型等)，并且促进更复杂的细胞工程化(例如，多个基因编辑改善效力、持久性、归巢等)。实施同种异体CAR修饰的细胞疗法的关键障碍是患者(宿主)的免疫系统对产物(供体)的潜在排斥。
可替代地，并且像自体细胞疗法一样，渗入肿瘤微环境的同种异体效应细胞随时间屈服于激活诱导的细胞死亡(AICD)，从而限制了治疗持久性。
虽然同种异体细胞疗法比自体细胞疗法有许多优点，但同种异体细胞也面临宿主或接受者免疫系统细胞的排斥，所述免疫系统细胞与不同于宿主的同种异体细胞产物的表面上的T和NK表位决定簇具有反应性。本公开提供了改善的同种异体疗法的优点，其提供了所施用细胞的增加的持久性，而不管接受者的天然防御。
发明内容
本公开提供了一种反击策略，通过所述策略，受体修饰的细胞疗法产物(例如，免疫细胞例如经工程化以表达抗原结合蛋白例如CAR的T细胞)在两个方面被进一步基因工程化。首先，将细胞工程化成异源表达Fas配体(也称为FasL或CD178)蛋白或其来自编码所述蛋白的核酸的衍生物。第二，对细胞进行基因修饰，使得Fas受体(也称为Fas、FasR或CD95)基因的表达水平降低(例如通过敲除消除)。FasL的表达使得产物细胞在激活时杀伤表达FasR的同种异体反应性宿主T细胞和自然杀伤(NK)细胞，因为FasL的FasR结合触发表达FasR的细胞中的凋亡。降低细胞的FasR表达水平(例如，消除细胞中的FasR表达)保护产物细胞免于发生FasL诱导的自相残杀和AICD。
除了其它方面，本公开还提供了用于改善需要向患者施用同种异体细胞的疗法的组合物、方法和相关材料，例如表达载体、经工程化的细胞和组合物。本公开的一方面是免疫细胞，例如经修饰以使得其包括和/或表达FasL蛋白或FasL蛋白衍生物(例如，来自包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸的表达载体)的T细胞。本公开的第二方面是免疫细胞，例如经修饰以使得其在降低水平下表达FasR的T细胞(例如，通过使用任何基因突变或基因编辑技术基因修饰细胞)。在这两个方面的实施例中，进一步修饰免疫细胞，例如T细胞以使得其包括和/或表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)(例如来自包括编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸的表达载体)。在一些实施例中，免疫细胞例如T细胞包括这些修饰中的两种或三种。因此，例如，本公开提供了一种CAR T细胞疗法的改善方法，所述方法包括施用免疫细胞，例如已经修饰以表达抗原结合蛋白例如CAR，表达水平降低的FasR或完全不表达FasR(例如FasR敲除)，以及表达FasL蛋白或FasL衍生蛋白的T细胞。因此，本公开进一步提供了一种CAR T细胞疗法的改善方法，其中相对于经修饰仅表达抗原结合蛋白例如CAR的施用细胞，AICD减少和/或持久性例如包括三种修饰的施用细胞的治疗持久性增加。
一方面，本文提供了一种载体，所述载体包括编码抗原结合蛋白的第一多核苷酸和编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的第一多核苷酸。在实施例中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在实施例中，所述FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的氨基酸序列由以下组成或包括以下：UniprotKB-P48023(野生型人FasL，SEQ ID NO:3)、人FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、人FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、人FasL C82A(SEQ ID NO:8)或人FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列。
在实施例中，载体进一步包括编码重组抗原受体的多核苷酸与编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸之间的编码2A肽的序列(SEQ ID NO:2)和/或包括转录后调节元件(PRE)例如WPRE。在实施例中，所述载体是病毒载体例如慢病毒载体。
另一方面，本文提供了一种经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括本文所提供的载体。在实施例中，对经工程化的免疫细胞进行修饰例如基因修饰，使得与未经修饰以降低FasR表达水平的经工程化的免疫细胞相比，FasR表达水平降低。
另一方面，本文提供了经工程化的免疫细胞，例如分离的经工程化的免疫细胞，其包括抗原结合蛋白和FasL蛋白或FasL蛋白衍生物，其中对所述经工程化的免疫细胞进行修饰例如基因修饰，使得与相同但未经基因修饰以降低FasR表达水平的经工程化的免疫细胞相比，FasR表达水平降低。在实施例中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在实施例中，在如本文所公开的经工程化的免疫细胞中，所述FasL蛋白或所述FasL蛋白衍生物是以下中的任何一种或多种：野生型人FasL、人FasLδ2-74、人FasL Q130D、人FasL C82A和人FasL SLEKQ126-130-->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33)。
在各个实施例中，本文所公开的经工程化的免疫细胞是经工程化的T细胞(例如经工程化的α/βT细胞和/或经工程化的γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和/或骨髓源性吞噬细胞。在某些实施例中，所述经工程化的免疫细胞是经工程化的T细胞，例如CAR T细胞。在本文所公开的经工程化的免疫细胞的各个实施例中，经工程化的免疫细胞是人经工程化的免疫细胞例如人经工程化的T细胞。
在本文所公开的经工程化的免疫细胞的各个实施例中，其中所述免疫细胞已如本文所描述被工程化以在降低水平下表达一个或多个基因，如但不限于FasR、CD52和TCR-α，相对于未如此修饰的对应的细胞，即对照细胞中的基因的表达水平，所述基因的表达水平降低或降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％(例如基因敲除)。在一些实施例中，在细胞表面测量基因的表达水平。在一些实施例中，通过流式细胞术测量基因的细胞表面表达水平。
另一方面，本文提供了一种经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括编码抗原结合蛋白的多核苷酸和编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸。在实施例中，对经工程化的免疫细胞进行修饰例如基因修饰，使得与其中基因组未经修饰以降低FasR表达的经工程化的免疫细胞相比，FasR表达水平降低。在实施例中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在实施例中，所述FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的氨基酸序列由以下组成或包括以下：UniprotKB-P48023(SEQ ID NO:3)、FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、FasLQ130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)或FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ IDNO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列。
在实施例中，如本文所公开的经工程化的免疫细胞进一步包括内源性TCRα基因和内源性CD52基因中的一个或多个的一种或多种基因组修饰。
另一方面，本公开提供了一种制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法。在实施例中，所述方法包括使用任何基因编辑技术，如TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统，和/或使用任何已知的基因敲低方法，例如采用各种基于RNA的技术中的任一种的方法(例如，反义RNA、miRNA、siRNA；参见例如，Lam等人,《分子疗法——核酸(Mol.Ther.-NucleicAcids)》4:e252(2015),doi:10.1038/mtna.2015.23；Sridharan和Gogtay,《英国临床药理学杂志(Brit.J.Clin.Pharmacol.)》82:659-72(2016))以减少FasR的功能性表达。在实施例中，所述方法包括或进一步包括将编码如本文所描述的FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和/或抗原结合蛋白，例如CAR或TCR的核酸引入到所述经工程化的免疫细胞中。在实施例中，所述方法包括或进一步包括将内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的一种或多种基因组修饰引入到所述经工程化的免疫细胞的基因组中。在实施例中，所述一种或多种基因组修饰全部或部分地破坏和/或阻止内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的功能性表达。
另一方面，本文提供了一种免疫细胞群体，所述免疫细胞群体包括本文所公开的经工程化的免疫细胞中的一种或多种。在实施例中，如本文所公开的免疫细胞群体包括如本文所公开的经工程化的细胞中的104个或更多个、105个或更多个、106个或更多个或107个或更多个。在实施例中，如本文所公开的免疫细胞群体富集如本文所公开的经工程化的免疫细胞。在各个实施例中，免疫细胞群体是至少20％、30％、40％或50％经工程化的免疫细胞，例如是20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或是超过95％经工程化的免疫细胞，其是例如T细胞(例如α/βT细胞和/或γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和/或骨髓源性吞噬细胞。在各个实施例中，所述免疫细胞群体群是至少20％、30％、40％或50％经工程化的T细胞，例如是20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％经工程化的T细胞。
另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所公开的经工程化的免疫细胞或包括如本文所公开的经工程化的免疫细胞的免疫细胞群体，以及药学上可接受的载体。在实施例中，所述经工程化的免疫细胞包括编码抗原结合蛋白的多核苷酸和编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸并且任选地进一步被修饰，例如基因修饰，使得与其中基因组未经修饰以降低FasR表达的经工程化的免疫细胞相比，经工程化的免疫细胞的FasR表达水平降低。
另一方面，本文提供了一种治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所公开的经工程化的免疫细胞。在所述方法的实施例中，所述经工程化的免疫细胞是源自除所述患者以外的供体的同种异体经工程化的免疫细胞。
另一方面，本文提供了一种治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所公开的免疫细胞群体。在所述方法的实施例中，所述群体的免疫细胞源自除所述患者以外的供体的一种或多种同种异体免疫细胞。
另一方面，本文提供了一种治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所公开的药物组合物。在所述方法的实施例中，所述组合物包括源自除所述患者以外的供体的一种或多种经工程化的同种异体免疫细胞。
在本文所公开的治疗方法的实施例中，病症可以是癌症、自身免疫性疾病或感染。在一些实施例中，施用的细胞、细胞群体或组合物可以施用多于一次。在一些实施例中，细胞、细胞群体或组合物可以间隔至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天向所述受试者施用两次或更多次。在一些实施例中，所述病症可以是病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、炎性疾病、免疫疾病或衰老相关疾病。
在一些实施例中，所述癌症可以是血液恶性肿瘤或实体癌。在一些实施例中，所述血液恶性肿瘤可以是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性嗜酸性白血病(CEL)、骨髓发育不良综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施例中，所述实体癌可以选自胆道癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠腺癌、结直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞瘤、原发性甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤或子宫癌。
另一方面，本文提供了一种用于减少治疗方案中的同种异体细胞的宿主细胞杀伤例如激活诱导的细胞死亡(AICD)的方法，所述方法包括向患者施用同种异体细胞，所述方法包括向所述患者施用如本文所公开的经工程化的免疫细胞、细胞群体或组合物。在一些实施例中，宿主细胞杀伤例如激活诱导的细胞死亡(AICD)减少10％至90％。在一些实施例中，宿主细胞杀伤例如激活诱导的细胞死亡(AICD)减少超过90％。
另一方面，本文提供了增强或增加同种异体细胞在患者体内持久性的方法。在实施例中，所述方法包括向所述患者施用如本文所公开的经工程化的免疫细胞、细胞群体或药物组合物。在一些实施例中，与施用可比细胞、细胞群体或组合物相比，施用本文所公开的细胞、细胞群体或组合物使得持久性改善或增加，或增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，或增加落入其终点为所述百分比中的任何两个的范围内的百分比，其中例如所述细胞包括CAR且不表达FasL且不在降低水平下表达FasR。在一些实施例中，持久性的差异通过比较群体或组合物中施用的细胞的半衰期来测量，其中例如，半衰期增加或增加至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或200％，或增加落入其终点为所述百分比中的任何两个的范围内的百分比。
在一些实施例中，施用如本文所公开的经工程化的免疫细胞例如T细胞、如本文所公开的经工程化的免疫细胞例如T细胞群体或包括如本文所公开的经工程化的免疫细胞的组合物，使得持久性相对于未如此工程化的对应的免疫细胞、免疫细胞群体或包括免疫细胞的组合物的持久性增加。在一些实施例中，持久性增加例如1至7天、1至12周(例如1至4周，4至8周或8至12周)或1至12个月或落入这些范围内的特定时间长度。在一些实施例中，持久性的差异通过比较所施用的细胞在群体或组合物中的半衰期来测量，其中，例如所述半衰期增加了例如1至7天、1至12周(例如，1至4周，4至8周或8至12周)或1至12个月或落入这些范围内的特定时间长度。在一些实施例中，持久性的差异通过比较施用之后可以检测到所施用细胞的时间长度来测量。在一些实施例中，通过比较经工程化的细胞和未经工程化的细胞在存在例如免疫细胞如T细胞或NK细胞的情况下，例如在混合之后约72小时、5天或7天的存活率，在体外测量持久性的改善。在一些实施例中，在此类体外测定中，在测量时，存活的经工程化的细胞是未被工程化的细胞的约1.5至10倍。
在一些实施例中，通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何一种来确定如本文所公开的宿主排斥的减少和/或所施用的细胞的持久性的增加。在一些实施例中，使用以下中的任何一种或组合：流式细胞术、PCR，例如定量PCR，以及与患者肿瘤材料或表达CAR-T细胞靶向的抗原的模型肿瘤细胞系的离体共温育。在一些实施例中，qPCR用于评估具有和不具有所关注敲除的CART细胞的数量，以确定敲除提供存活率优势的程度。
附图说明
图1A-1C.经刺激的T细胞表达FasR，并且重复刺激导致激活诱导的细胞死亡。图1A.在存在100U/mLIL-2的情况下，原代T细胞未经刺激或用TransAct进行重复刺激(时间线上的红点)。基于流式细胞术评估的前向散射、侧向散射和7-AAD摄取，事件被指定为存活、死亡或碎片。图1B.重复刺激的时程中的表面CD69和FasR表达的定量。图1C.重复刺激的时程中的活细胞、死细胞和碎片的定量。图1B和1C中的数据是来自三个技术重复的平均值+SD。
图2.细胞因子激活的NK细胞表达FasR。从收集自三个供体的LRS室纯化NK细胞，用1000U/mL IL-2激活48小时并且然后通过流式细胞术评估FasR的表面表达。将结果与用TransAct刺激并且然后在存在100U/mL IL-2的情况下扩增两周的FasR+T细胞进行比较。
图3A-3B.CRISPR介导的原代T细胞中的FasR基因的敲除。图3A.流式细胞仪伪彩色点图示出了在有或没有Cas9复合的FasR sgRNA电穿孔的情况下，经激活的原代T细胞中的FasR表达。图3B.经激活的原代T细胞中的FasR KO效率的定量。显示了三个技术重复的平均值+SD。
图4.FasR敲除保护Jurkat T细胞免于发生FasR介导的凋亡。流式细胞术伪彩色点图示出了Jurkat细胞或未经纯化的FasR KO Jurkat T细胞与培养基、50ng/mL凋亡诱导抗FasR抗体(克隆CH11)或50ng/mL抗体一起在存在2μg/mLFasR胞外结构域-Fc竞争性阻断剂的情况下温育72小时。
图5A-5B.BFP和表面FasL在经转导的原代T细胞上的表达。图5A.产生野生型FasL载体插入物的示意底图。产生的突变体衍生物在示意图上方标明。图5B.流式细胞术伪彩色点图示出了在同时用Cas9复合的FasR sgRNA电穿孔和用MND驱动的递送BFP和FasL衍生物的慢载体转导(未纯化用于FasR敲除)之后一周的原代T细胞。供体是HLA-A2+。wt，野生型。NTD，未经转导的。
图6A-6B.表达FasL的T细胞杀伤表达FasR的自体和同种异体细胞。流式细胞术伪彩色点图示出了，在图6A中，在同时用Cas9复合的FasR sgRNA电穿孔和用MND启动子驱动的递送BFP和Fas衍生物的慢载体转导(未纯化用于FasR敲除)之后一周的自体FasR+原代T细胞的自相残杀；以及在图6B中，来自6A的FasL修饰的HLA-A2+细胞对FasR+同种异体HLA-A2-原代T细胞的选择性杀伤。NTD，未经转导的。
图7A-7B.CRISPR介导的原代T细胞中的FasR和β2m基因的双重敲除。流式细胞术伪彩色点图示出了在没有(图7A)或有(图7B)Cas9复合的FasR和β2m sgRNA的电穿孔的情况下，经激活的原代T细胞中的FasR和β2m表达。
图8A-8B.为了确定FasL表达是否保护这些HLA-A2-模型细胞产物免受同种异体NK细胞的影响，从来自三个HLA-A2+供体的新鲜LRS室中制备NK细胞，用1000U/mL IL-2激活48小时，并且然后与表达FasL的β2m KO细胞一起温育72小时，使用HLA-A2状态以通过流式细胞术辨别同种异体细胞来源。图8A.经激活的NK细胞完全杀伤未经转导或用非活性FasL转导的β2m敲除细胞。相反，当β2m敲除细胞表达FasL的活性衍生物时，其被保护免于发生NK细胞介导的杀伤。图8B.正如假设的那样，这种保护机制是FasL介导的反击，因为在包含用活性FasL武装的T细胞的温育中，活NK细胞计数显著减少。这种杀伤对FasR+NK细胞具有特异性，因为其从这些样品中切除并且所有剩余的NK细胞是FasR-(数据未示出)。
图9A-9B.为了确定FasRKO自身是否保护HLA-A2-模型细胞产物免于发生抗原特异性T细胞介导的杀伤，用TransAct激活HLA-A2+T细胞72小时，随后敲除和TRAC±FasR基因并用mCherry-2A-全长MART1/Melan-A抗原进行转导。这些是有或没有FasRKO的HLA-A2+模拟“移植物”细胞。同时，用TransAct激活HLA-A2-T细胞72小时，随后敲除TRAC并用HLA-A2限制性的MART1抗原特异性F5 TCR进行转导。这些是HLA-A2-模拟“宿主”细胞。转导后四十八小时，将模拟移植物/产物和宿主/效应细胞共温育48小时，并且使用HLA-A2状态对剩余的移植物/产物细胞进行定量，以通过流式细胞术辨别同种异体细胞来源和mCherry/抗原状态。图9A.用所示的基因编辑和经转导的基因的测定中使用的细胞的底图描绘。图9B.非特异性效应细胞(缺乏F5 TCR)不会以3:1的比率消耗抗原+移植物/产物细胞。相反，特异性效应细胞(表达F5 TCR)以剂量依赖性方式消耗抗原+移植物/产物细胞。与充满FasR的细胞群体相比，存在FasR KO细胞的细胞群体的消耗程度显著更低(p<0.01，多重t检验分析)，这表明FasR KO提供了对抗原特异性T细胞介导的杀伤的保护。
具体实施方式
除了其它方面，本公开还提供了用于改善需要向患者施用同种异体细胞的疗法的组合物、方法和相关材料，例如表达载体和组合物。本公开的一方面是免疫细胞例如T细胞，其在两个方面被修饰：首先，其被修饰以使得其表达FasL蛋白或FasL蛋白衍生物(例如来自包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸的表达载体)，以及其次，其被修饰以使得其在降低水平下表达FasR(例如通过使用例如任何已知的基因编辑技术对细胞进行基因修饰，所述基因编辑技术采用包含但不限于已知的同源重组技术和采用大核酸酶、TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统部分或全部缺失FasR基因基因座中的任何一种或多种的技术)。在一些实施例中，免疫细胞例如T细胞在第三方面被修饰，使得其表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)(例如来自包括编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸的表达载体)。因此，例如，本公开提供了一种CART细胞疗法的改善方法，所述方法包括施用免疫细胞例如包括CAR表达、FasL蛋白或FasL衍生蛋白表达和降低的FasR表达的三种修饰的T细胞。因此，本公开进一步提供了一种同种异体CART细胞疗法的改善方法，其中相对于除了在FasR表达方面未被修饰之外相同的施用细胞，AICD减少和/或持久性例如包括三种修饰的施用细胞的治疗持久性增加。
一般技术
除非另有说明，本公开的实施将采用分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。此类技术在以下文献中有充分解释：如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait,编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis,编辑,1998)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney,编辑,1987)；《细胞和组织培养概论(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)普莱纽姆出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Celland Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,编辑,1993-1998)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods inEnzymology)》(学术出版社公司)；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人,编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》,(Mullis等人,编辑,1994)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:apractical approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:apractical approach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:alaboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999))；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,《哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers)》,1995)。采用例如大核酸酶、TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统的基因编辑技术在本领域的技术范围内，并且在文献中充分地解释，所述文献如T.Gaj等人,《基因组编辑技术：原理和应用(Genome-Editing Technologies:Principles and Applications)》,《冷泉港生物学展望(Cold Spring Harb Perspect Biol)》2016；8:a023754和其中的引文。
定义
如本文所使用的，“自体”意指用于治疗受试者的细胞、细胞系或细胞群体源自所述受试者。
如本文所使用的，“同种异体”意指用于治疗受试者的细胞或细胞群体不是源自所述受试者，而是源自供体。
如本文所使用的，术语“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
如本文所使用的，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
如本文所使用的，“免疫细胞”是指造血来源的、在功能上参与先天性免疫应答和/或适应性免疫应答的启动和/或执行的细胞。免疫细胞的实例包含T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
如本文所使用的，术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所使用的，“表达载体”指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与要表达的核苷酸序列操作性地连接的表达控制序列。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所使用的，“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的结合，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列处于启动子的转录控制之下)，启动子与该编码序列可操作地连接。
如本文所使用的，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子、或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
“启动子”和“启动子序列”可互换使用，并且是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或响应于不同的环境或生理条件指导基因的表达。
在本公开的任何载体中，载体任选地包括本文所公开的启动子。
“宿主细胞”包含单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然的、意外的或有意的突变，后代可能不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学上或在基因组DNA互补方面)。宿主细胞包含用本文所公开的多核苷酸体内转染的细胞。
如本文所使用的术语“胞外配体结合结构域”是指能够与配体结合的寡肽或多肽。优选地，该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。术语“茎结构域”在本文中用于指任何具有将跨膜结构域连接到胞外配体结合结构域的功能的寡肽或多肽。特别地，茎结构域用于为胞外配体结合结构域提供更大的柔性和可及性。
术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。
如本文所使用的“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异地结合，从而介导细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包含CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。
“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合T细胞上的同源共刺激信号分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的初级信号之外还介导T细胞反应(包括但不限于增殖激活、分化等)的信号。共刺激配体可以包含但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1 CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别涵盖与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性地结合靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用的，所述术语不仅涵盖完整的多克隆抗体或单克隆抗体，而且还涵盖其抗原结合片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv)，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，包括例如但不限于单链(scFv)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)以及包含抗体的融合蛋白。抗体包括任何类别的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必属于任何特定的类别。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM以及这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgA1和lgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指完整抗体的保留特异性地结合给定抗原的能力的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包含Fab；Fab'；F(ab')2；由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单个结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)和分离的互补决定区(CDR)。
“特异性地结合”靶标的抗体、抗体缀合物或多肽是本领域熟知的术语，并且确定这种特异性结合的方法也是本领域熟知的。如果与替代细胞或物质相比，分子与特定细胞或物质发生反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则所述分子被称为表现出“特异性结合”。如果抗体以比其结合至其它物质更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合靶标，则所述抗体“特异性结合”至靶标。通过阅读此定义还应理解，例如，与第一靶标特异性结合的抗体(或部分或表位)可以或可以不与第二靶标特异性结合。因此，“特异性结合”并不一定需要(尽管其可以包括)排他性结合。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独的或组合的。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也被称为高变区)连接的四个骨架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。至少有两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences ofProteinsofImmunological Interest)》,(第5版,1991,马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人,1997,《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》273:927-948)。如本文所使用的，CDR可以指由任一方法或由两种方法的组合定义的CDR。
可变结构域的“CDR”是可变区内的氨基酸残基，其根据Kabat、Chothia的定义、Kabat和Chothia的积累、AbM、接触和/或构象定义或本领域众所周知的任何CDR测定方法鉴定。抗体CDR可以被鉴定为最初由Kabat等人定义的高变区。参见例如Kabat等人,1992,《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第5版,公共卫生局,国立卫生研究院,华盛顿特区(PublicHealth Service,NIH,Washington D.C.)。CDR的位置也可以鉴定为Chothia等人最初描述的结构环结构。参见例如，Chothia等人,《自然》342:877-883,1989。CDR鉴定的其它方法包含“AbM定义”，其是Kabat与Chothia之间的折衷方案，并且使用牛津分子公司(OxfordMolecular)的AbM抗体建模软件(现为)衍生或基于观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”，所述定义在MacCallum等人,《分子生物学杂志》262:732-745,1996中阐述。在本文称为CDR的“构象定义”的另一种方法中，CDR的位置可以被鉴定为对抗原结合做出热焓贡献的残基。参见例如，Makabe等人,《生物化学杂志(Journal ofBiologicalChemistry)》,283:1156-1166,2008。其它CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可能被缩短或加长。如本文所使用的，CDR可以指通过本领域已知的任何方法定义的CDR，包含方法的组合。本文所使用的方法可以利用根据这些方法中的任何一种定义的CDR。对于任何给定的包含多于一个CDR的实施例，CDR可以根据Kabat、Chothia、延伸、AbM、接触和/或构象定义中的任何一种来定义。
本文所公开的抗体可以使用本领域众所周知的技术产生，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合或本领域熟知的其它技术(参见例如Jayasena,S.D.,《临床化学(Clin.Chem.)》,45:1628-50,1999以及Fellouse,F.A.等人,《分子生物学杂志》,373(4):924-40,2007)。
如本领域已知的，本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶并入到链中的任何取代物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在链的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合后如通过与标记组分结合来进一步修饰。其它类型的修饰包含例如“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如，用不带电键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和用带电键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些核苷酸间修饰、含有侧基部分例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些核苷酸间修饰、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些核苷酸间修饰、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些核苷酸间修饰、含有烷化剂的那些核苷酸间修饰、使用经修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些核苷酸间修饰以及多核苷酸的未修饰形式。此外，糖中通常存在的任何羟基基团可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，被标准保护基团保护，或被激活以制备与其它核苷酸的附加连接，或可以与固体支持物缀合。5'和3'末端OH可以被磷酸化或被1个至20个碳原子的胺或有机封端基团部分取代。其它羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖(anomeric sugar)、差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被替代性连接基团取代。这些替代性连接基团包括但不限于这样的实施例，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)，其中每个R或R'独立地是H或任选地含有醚(-O-)键的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基(araldyl)。多核苷酸中的并非所有键都需要是相同的。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文所使用的，“转染”是指由细胞摄取外源性或异源性RNA或DNA。当外源性或异源性RNA或DNA已被引入细胞内时，所述细胞已被这种RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA引起表型变化时，细胞已被外源性或异源性RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可以整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。
如本文所使用的，“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致基因上稳定的继承。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所使用的，“基本上纯的”是指是至少50％纯的(即，不含污染物)、更优选地至少90％纯的、更优选地至少95％纯的、还更优选地至少98％纯的，以及最优选地至少99％纯的材料。如本文所使用的关于抗体的术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以与第二抗体或其抗原结合部分结合充分类似的方式与表位结合，使得与在不存在第二抗体的情况下第一抗体的结合相比，第一抗体与其同源表位的结合结果在存在第二抗体的情况下可检测地降低。替代方案，其中第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体的情况下也可检测地降低，可以但不一定是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制其它抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论是在相同、更大还是更小的程度上，所述抗体被认为彼此“交叉竞争”以与其相应的表位结合。本公开涵盖竞争抗体和交叉竞争抗体。无论此类竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分的结合)，技术人员将理解，基于本文所提供的教导，此类竞争和/或交叉竞争抗体被涵盖在内并且可以用于本文所公开的方法。
如本文所使用的，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本公开的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一者或多者：减少肿瘤细胞或癌细胞的增殖(或破坏肿瘤细胞或癌细胞)，抑制肿瘤细胞的转移，缩小或减小肿瘤的大小，缓解疾病(例如癌症)，减少由疾病(例如癌症)引起的症状，提高患有疾病(例如癌症)的人的生活质量，降低治疗疾病(例如癌症)所需的其它药物的剂量，延缓疾病(例如癌症)的进展，治愈疾病(例如癌症)，和/或延长患有疾病(例如癌症)的受试者的存活。
“改善”意指如与不施用治疗相比减轻或改善了一种或多种症状。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。如本文所使用的，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益或期望结果的量。对于预防用途，有益或期望的结果包括消除或降低疾病(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、疾病的并发症和疾病发展期间出现的中间病理表型)的风险、减轻其严重性或延迟其发作。对于治疗用途，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少各种疾病或病症(例如癌症)的一种或多种症状的发生或改善，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果，和/或延迟疾病的进展。有效剂量可以在一次或多次施用中进行施用。出于本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接地实现预防性或治疗性治疗的量。正如在临床上所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，在施用一种或多种治疗剂的情况下，可以考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其它药剂联合可以或会实现期望的结果，则可以考虑以有效量给予单一药剂。
如本文所使用的，“受试者”是任何哺乳动物，例如人或猴子。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在示例性实施例中，受试者是人。在示例性实施例中，受试者是猴子，例如食蟹猴。
如本文所使用的，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一个或多个所关注的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞(诸如生产者细胞)。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时，允许该成分保留生物活性并且不与受试者的免疫系统反应的任何物质。实例包括但不限于任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液)和各种类型的湿润剂。用于气溶胶或胃肠外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理盐水(0.9％)。包括此类载体的本文所公开的组合物通过众所周知的常规方法调配(参见例如，《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第18版,A.Gennaro编辑,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA),1990；以及《雷明顿药学科学与实践(Remington,The Science and PracticeofPharmacy)》第21版马克出版公司,2005)。
如本文所使用的，“同种异体反应性”是指T细胞识别在胸腺发育期间未遇到的MHC复合物的能力。同种异体反应性在临床上表现为宿主抗移植物排斥和移植物抗宿主病。
本文中提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包含“X”的描述。数字范围包括定义所述范围的数字。
应理解的是，当在本文中无论何处用语言“包括”来描述实施例时，还提供了根据“由…组成”和/或“主要由…组成”描述的在其它方面类似实施例。
在根据马库什(Markush)组或其它替代方案分组来描述本公开的方面或实施例的情况下，所公开的主题不仅涵盖整体列出的整个组，而且还涵盖所述组的单独的每个成员和主组的所有可能子组，也涵盖缺少组成员中的一个或多个组成员的主组。本公开还设想明确地排除所公开的主题中的组成员中的任何组成员中的一个或多个组成员。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
本文描述了示例性方法和材料，但是与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本文所公开的主题的实践或测试。材料、方法和实例仅仅是说明性的，而不意图进行限制。
“抗原结合蛋白”包含一个或多个抗原结合结构域。如本文所使用的，“抗原结合结构域”意指结合指定靶抗原的任何多肽。在一些实施例中，抗原结合结构域与肿瘤细胞上的抗原结合。在一些实施例中，抗原结合结构域与涉及过度增殖性疾病的细胞上的抗原结合或与病毒或细菌抗原结合。
抗原结合结构域包括但不限于作为免疫功能片段的抗体结合区。抗原结合结构域的术语“免疫功能片段”(或“片段”)是抗原结合结构域的物种，其包含抗体的一部分(无论如何获得或合成所述部分)，所述部分缺少全长链中存在的至少一些氨基酸，但仍然能够特异性结合于靶抗原。此类片段是生物活性的，因为其结合于靶抗原，并且可以与其它抗原结合结构域，包括完整抗体竞争结合于给定表位。
免疫功能免疫球蛋白片段包括但不限于scFv片段、Fab片段(Fab'、F(ab')2等)、一个或多个互补决定区(“CDR”)、双抗体(通过太短而不能允许同一条链上的两个结构域之间配对的短肽连接子连接的、与轻链可变结构域在同一条多肽上的重链可变结构域)、结构域抗体、二价抗原结合结构域(包含两个抗原结合位点)、多特异性抗原结合结构域和单链抗体。这些片段可以源自任何哺乳动物来源，包括(但不限于)人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。如所属领域的技术人员将了解，抗原结合结构域可以包括非蛋白质组分。
可变区通常展现由3个高变区(CDR)接合的相对保守构架区(FR)的相同通式结构。来自每对两个链中的CDR通常通过骨架区对齐，其可以能够与特异性表位结合。从N端到C端，轻链可变区和重链可变区两者通常均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照惯例，重链中的CDR区通常被称为HC CDR1、CDR2和CDR3。轻链中的CDR区通常被称作LCCDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含存在于抗体的全长轻链或重链中的一个或多个互补结合区(CDR)，并且在一些实施例中包括单链和/或轻链或其部分。这些片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过抗原结合结构域(包括完整抗体)的酶或化学切割产生。
在一些实施例中，抗原结合结构域是抗体或其片段，包括其一个或多个互补决定区(CDR)。在一些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，包含轻链CDR CDR1、CDR2和CDR3以及重链CDR CDR1、CDR2和CDR3。
将氨基酸分配到每个框架、CDR和可变结构域通常是根据以下编号方案进行的：Kabat编号(参见例如，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》第5版,NIH公开号91-3242,马里兰州贝塞斯达1991)、Chothia编号(参见例如，Chothia和Lesk,(1987),《分子生物学杂志》196:901-917；Al-Lazikani等人,(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；Chothia等人,(1992)《分子生物学杂志》227:799-817；Tramontano等人,(1990)《分子生物学杂志》215(1):175-82；以及美国专利第7,709,226号)、接触编号或AbM方案(抗体建模程序，牛津分子公司)。
在一些实施例中，抗原结合结构域是重组抗原受体。如本文所使用的术语“重组抗原受体”泛指非天然存在的表面受体，其包含胞外抗原结合结构域或胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体(CAR)是本领域熟知的。CAR是包括抗原识别部分、跨膜结构域和T细胞激活结构域的融合蛋白(参见例如，Eshhar等人,《美国国家科学院院刊》,90(2):720-724(1993)以及Sadelain等人,《当前免疫学观点)》,21(2):215-223(2009))。
在一些实施例中，重组抗原受体的胞内结构域包括共刺激结构域和含ITAM的结构域。在一些实施例中，重组抗原受体的胞内结构域包括胞内蛋白或其功能变体(例如，截短、插入、缺失或取代)。
如本文所使用的术语“胞外配体结合结构域”或“胞外抗原结合结构域”是指能够结合配体或抗原或能够与细胞表面分子相互作用的多肽，如配体或表面抗原。例如，可以选择胞外配体结合结构域或抗原结合结构域以识别充当与特定疾病状态(例如，肿瘤特异性抗原)相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。在一些实施例中，抗原结合结构域包括抗体、或抗体的抗原结合片段或抗原结合部分。在一些实施例中，抗原结合结构域包括Fv或scFv、Fab或scFab、F(ab')2或scF(ab')2、Fd、单体、亲和体、骆驼抗体、VHH抗体、单结构域抗体或darpin。在一些实施例中，配体结合结构域包括结合对的配偶体，如与表面受体结合的配体、或与配体结合的表面受体的胞外结构域。
术语“茎结构域”或“铰链结构域”在本文中可互换使用以指任何起到将跨膜结构域与胞外配体结合结构域连接作用的多肽。特别地，茎结构域用于为胞外配体结合结构域提供更大的柔性和可及性。
术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。
载体
本文进一步描述了表达载体和多核苷酸组合物的施用。
另一方面，本公开提供了一种制备本文所描述的多核苷酸中的任何多核苷酸的方法。
本公开还涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的(编码的或反义的)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并以一对一的方式与DNA分子对应的HnRNA分子和不含有内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或支持材料。
多核苷酸可以包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源性序列)或可以包含这种序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子没有减弱。通常可以如本文所述评估对编码多肽的免疫反应性的影响。变体优选地表现出与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少约70％的同一性，更优选至少约80％的同一性，还更优选至少约90％的同一性，以及最优选至少约95％的同一性。如果两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列在如下文所述进行最大对应比对时是相同的，则称这两个多核苷酸或多肽序列是“相同的”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口上比较序列来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。如本文所使用的“比较窗口”是指至少约20个(通常30个至约75个或40个至约50个)连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
使用默认参数，可以使用Lasergene生物信息学软件套件(威斯康星州麦迪逊市的DNASTAR公司(DNASTAR,Inc.,Madison,Wl))中的Megalign程序对序列进行最佳比对以进行比较。该程序体现了以下参考文献中所描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,蛋白质中演化变化的模型-用于检测远距离关系的矩阵(A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distantrelationships.)Dayhoff,M.O.(编辑)《蛋白质序列和结构图谱(Atlas ofProtein Sequence and Structure)》,华盛顿特区全国生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation,Washington DC)第5卷,增刊3，第345-358页；Hein J.,1990《比对和发生学的统一方法(Unified Approach toAlignment and Phylogenes)》第626-645页《酶学方法(Methods in Enzymology)》第183卷,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社公司(Academic Press,Inc.,San Diego,CA)；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》5:151-153；Myers,E.W.和MullerW.,1988,《计算机在生物科学中的应用》4:11-17；Robinson,E.D.,1971,《组合理论(Comb.Theor.)》11:105；Santou,N.、Nes,M.,1987,《分子生物学进化(Mol.Biol.Evol.)》4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,《数值分类法-数值分类法的原理与实践(Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumericalTaxonomy)》,加利福尼亚州圣弗朗西斯市弗里曼出版社(Freeman Press,San Francisco,CA)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,《美国国家科学院院刊》80:726-730。
优选地，“序列同一性百分比”通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定，其中为了实现两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含20％或更少(通常5％至15％或10％至12％)的添加或缺失(即缺口)。通过以下方式来计算百分比：确定在两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
变体还可以或可替代地，与天然基因或其部分或补体基本上同源。此类多核苷酸变体能够在适度严格条件下与编码天然抗体的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。
合适的“适度严格条件”包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50℃-65℃、5X SSC下杂交过夜；随后在65℃下用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC洗涤两次，每次20分钟。
如本文所使用的，“高度严格的条件”或“高度严格条件”是指以下那些：(1)采用用于洗涤的低离子强度和高温，例如在50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠：(2)采用在42℃下杂交期间变性剂如甲酰胺，例如，具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH 6.5的磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCI、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、经过超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在55℃下在50％甲酰胺中洗涤，随后在55℃下进行由含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格性洗涤。技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等以适应如探针长度等因素。
本领域普通技术人员将会理解，由于基因密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，本公开具体设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。此外，包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是占据给定染色体基因座的基因的几种形式中的任何一种。本公开涵盖包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。所得mRNA和蛋白质可能但不需要具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
可以使用化学合成、重组方法或PCR获得本公开的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域熟知的，并且无需在本文中详细描述。本领域技术人员可以使用本文所提供的序列和商业DNA合成仪来产生期望的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可以将包括期望的序列的多核苷酸插入到合适的载体中，并且进而可以将所述载体引入到合适的宿主细胞中用于复制和扩增，如本文进一步讨论的。可以通过本领域已知的任何方式将多核苷酸插入到宿主细胞中。通过直接摄取、胞吞作用、转染、F-交配或电穿孔引入外源性多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源性多核苷酸可以作为非整合载体(如质粒)维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域众所周知的方法从宿主细胞中分离出来。参见例如，Sambrook等人,1989。
可替代地，PCR允许复制DNA序列。PCR技术在本领域中是众所周知的并且描述于美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号和第4,683,202号以及《PCR：聚合酶链反应》,Mullis等人编辑,波士顿的博克豪斯出版社(Birkauswer Press,Boston),1994。
可以通过在合适的载体中使用分离的DNA并且将其插入到合适的宿主细胞来获得RNA。当细胞复制并且DNA转录到RNA中时，然后可以使用本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，例如，如Sambrook等人,1989，同上所述。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建或可以选自本领域可用的大量克隆载体。虽然所选择的克隆载体可以根据意欲使用的宿主细胞而变化，但是有用的克隆载体通常将具有自我复制的能力，可以拥有特定限制性核酸内切酶的单一靶标，和/或可以携带可用于选择含有该载体的克隆的标记基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载体可从商业供应商处获得，如伯乐公司(BioRad)、Strategene公司(Strategene)和英杰公司(Invitrogen)。
表达载体通常是含有根据本公开的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。这意味着表达载体在宿主细胞中必须是可复制的，或者作为附加体，或者作为染色体DNA的组成部分。合适的表达载体包含但不限于质粒、病毒载体，包含腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘粒和PCT公开第WO 87/04462号中公开的表达载体。载体组分通常可以包含但不限于以下中的一者或多者：信号序列；复制起点；一种或多种标记基因；合适的转录控制元件(如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即翻译)，通常还需要一种或多种翻译控制元件，如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含有所关注的多核苷酸的载体可以通过多种适当方法中的任何适当方法被引入到宿主细胞中，所述适当方法包含电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(例如，其中载体是如牛痘病毒等感染原)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
编码本文所公开的FasL蛋白、FasL衍生蛋白或抗原结合蛋白，例如CAR的多核苷酸可以存在于表达盒或表达载体(例如，用于引入到细菌宿主细胞中的质粒或用于转染昆虫宿主细胞的如杆状病毒载体等病毒载体或用于转染哺乳动物宿主细胞的如慢病毒等质粒或病毒载体)中。在一些实施例中，多核苷酸或载体可以包括编码核糖体跳跃序列的核酸序列，例如但不限于编码2A肽的序列。在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚群中鉴定的2A肽导致核糖体从一个密码子“跳跃”到下一个密码子，而不在密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见Donnelly和Elliott 2001；Atkins,Wills等人2007；Doronina,Wu等人2008)。“密码子”意指mRNA(或DNA分子的有义链)上被核糖体翻译成一个氨基酸残基的三个核苷酸。因此，当多肽被框中的2A寡肽序列分隔时，可以由imRNA内的单个连续开放阅读框合成两个多肽。此类核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的，并且已知被若干种载体用于表达由单个信使RNA编码的若干种蛋白质。
为了将跨膜多肽引导到宿主细胞的分泌途径中，在一些实施例中，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列与跨膜核酸序列可操作地连接，即两个序列连接在正确的阅读框中并被定位成指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常定位于编码所关注的多肽的核酸序列的5'端，但是某些分泌信号序列可能定位于所关注的核酸序列的其它地方(参见例如，Welch等人,美国专利第5,037,743号；Holland等人,美国专利第5,143,830号)。本领域技术人员将认识到，鉴于基因密码的简并性，这些多核苷酸分子之间可能存在相当大的序列变异。在一些实施例中，本公开的核酸序列针对在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化，优选地针对人细胞中表达。密码子优化是指在所关注的序列中将在给定物种的高表达基因中通常罕见的密码子替换为在这种物种的高表达基因中通常常见的密码子，此类密码子编码与被替换的密码子相同的氨基酸。
本文提供了制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括将FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和抗原结合蛋白例如CAR引入到免疫细胞中以及使细胞扩增。在一些实施例中，本公开涉及一种对免疫细胞进行工程化的方法，所述方法包括：提供细胞并表达FasL蛋白或FasL蛋白衍生物以及在细胞的表面处表达至少一种抗原结合蛋白，例如CAR。在一些实施例中，所述方法包括：用至少一种编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸和至少一种编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸转染细胞；以及在所述细胞中表达所述多核苷酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括：用至少一种编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸、至少一种编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸和至少一种编码NK细胞拮抗剂的多核苷酸转染细胞；以及在所述细胞中表达所述多核苷酸。
在一些实施例中，编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和抗原结合蛋白，例如CAR的多核苷酸存在于一个或多个表达载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施例中，多核苷酸存在于病毒载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施例中，病毒载体可以是例如慢病毒载体或腺病毒载体。
在一些实施例中，编码根据本公开的多肽的多核苷酸可以是例如通过电穿孔被直接引入到细胞中的mRNA。在一些实施例中，cytoPulse技术可以用于瞬时透化活细胞，以将物质递送到细胞中。可以修改参数以确定高转染效率和最低死亡率的条件。
本文还提供了转染免疫细胞(例如T细胞)的方法。在一些实施例中，所述方法包括：使T细胞与RNA接触以及向T细胞施加敏捷脉冲序列，所述敏捷脉冲序列由以下组成：(a)电压范围为每厘米约2250至3000V的电脉冲；(b)0.1毫秒的脉冲宽度；(c)步骤(a)和(b)的电脉冲之间约0.2至10毫秒的脉冲间隔；(d)电压范围为每厘米约2250至3000V的电脉冲，以及约100毫秒的脉冲宽度和步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间约100毫秒的脉冲间隔；以及(e)电压为约1600V的三个电脉冲，以及约10毫秒的脉冲宽度和三个电脉冲中的每个电脉冲之间2毫秒的脉冲间隔。在一些实施例中，一种转染T细胞的方法包括使所述T细胞与RNA接触以及向T细胞施加敏捷脉冲序列，所述敏捷脉冲序列包括：(a)电压范围为每厘米约2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲；(b)0.1毫秒的脉冲宽度；(c)以及步骤(a)和(b)的电脉冲之间约0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10毫秒的脉冲间隔；(d)电压范围为每厘米2250至3000V的电脉冲，例如每厘米约2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲，以及100毫秒的脉冲宽度和步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间100毫秒的脉冲间隔；以及(e)电压为约1600V的4个电脉冲，以及约10毫秒的脉冲宽度和三个电脉冲中的每个电脉冲之间约2毫秒的脉冲间隔。在本申请中公开了在上文所述的值范围内包括的任何值。电穿孔介质可以是本领域已知的任何合适的介质。在一些实施例中，电穿孔介质的电导率范围为约0.01至约1.0毫西门子。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包括以下步骤：通过使表达例如但不限于FasR、TCR的组分、免疫抑制剂的靶标、HLA基因和/或免疫检查点蛋白(如例如PDCD1或CTLA-4)的至少一个基因失活或降低所述至少一个基因的表达水平来对细胞进行基因修饰。使基因失活旨在使所关注基因不以功能性蛋白质形式表达。在一些实施例中，待失活的基因选自由以下组成的组：例如但不限于，TCRα、TCRβ、β2-微球蛋白(“β2m”)、CD52、GR、脱氧胞苷激酶(DCK)、PD-1和CTLA-4。在一些实施例中，所述方法包括通过将能够通过选择性DNA切割选择性失活基因的稀切核酸内切酶引入细胞来使一个或多个基因失活或降低其表达水平。在一些实施例中，稀切核酸内切酶可以是例如转录激活因子样效应物核酸酶(TALE-核酸酶或TALEN)、megaTAL核酸酶或Cas9核酸内切酶。
另一方面，基因修饰免疫细胞(例如T细胞)的步骤可以包括：通过使表达免疫抑制剂靶标的至少一个基因失活来修饰免疫细胞(例如T细胞)，和任选地在存在免疫抑制剂的情况下扩增细胞。免疫抑制剂是通过几种作用机制之一抑制免疫功能的药剂。免疫抑制剂可以降低免疫应答的程度和/或贪婪性。免疫抑制剂的非限制性实例包括钙调磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶标、白细胞介素-2α-链阻断剂、肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂、皮质类固醇和免疫抑制抗代谢药。一些细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成起作用。其它可能通过T细胞的激活或通过抑制辅助细胞的激活而起作用。根据本公开的方法允许通过使T细胞中的免疫抑制剂靶标失活来赋予例如T细胞免疫抑制抗性以进行免疫疗法。作为非限制性实例，免疫抑制剂的靶标可以是免疫抑制剂的受体，例如但不限于CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员和亲环蛋白家族基因成员。
在另外的方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括本文所公开的多核苷酸或载体。
本文提供了用于表达FasL蛋白或FasL蛋白衍生物以及下调FasR细胞表面表达的组合物和方法。还提供了此类组合物用于改善免疫细胞(例如T细胞，诸如CAR-T细胞)的功能活性的用途和用于改善免疫细胞(例如T细胞，诸如CAR-T细胞)的功能活性的方法。本文所提供的方法和组合物可用于改善免疫细胞例如T细胞，如CAR-T细胞的体内持久性和治疗功效。
本文所提供的免疫细胞例如T细胞表达：(i)FasL蛋白；以及(ii)抗原结合蛋白例如嵌合抗原受体(CAR)。有利地，相对于不表达病毒蛋白和/或增加的对AICD的抗性的细胞，本文所提供的免疫细胞表现出改善的体内持久性。
在各个实施例中，FasL蛋白由以下组成或包括以下：例如描述为“UniprotKB-P48023”的野生型人FasL蛋白的氨基酸序列。示例性FasL蛋白和/或FasL蛋白衍生物由以下组成或包括以下：UniprotKB-P48023(SEQ ID NO:3)、FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、FasLQ130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)和FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ IDNO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列。
在某些实施例中，FasL蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与FasL野生型UniprotKB-P48023的氨基酸序列至少70％、例如至少80％、或至少90％、95％、97％或99％序列同一性。在某些实施例中，FasL蛋白衍生物包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与FasLΔcyto(又名FasLδ2-74)、FasL C82A、FasL SLEKQ-->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33)(即，FasL SLEKQ126-130->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33))或FasL Q130D的氨基酸序列至少70％、例如至少80％、或至少90％、95％、97％或99％序列同一性。
在某些实施例中，本公开的核酸编码FasL蛋白，所述FasL蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与FasL野生型UniprotKB-P48023的氨基酸序列至少70％、例如至少80％、或至少90％、95％、97％或99％序列同一性。在某些实施例中，本公开的核酸编码FasL蛋白衍生物，所述FasL蛋白衍生物包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与FasLΔcyto(又名FasLδ2-74)、FasL C82A、FasL SLEKQ-->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33)(又名FasLSLEKQ126-130->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33))或FasL Q130D的氨基酸序列至少70％、例如至少80％、或至少90％、95％、97％或99％序列同一性。
在一些实施例中，本文所提供的免疫细胞例如T细胞被进一步修饰，例如基因修饰，以相对于尚未被如此修饰的可比细胞在降低水平下表达FasR。例如，可以对免疫细胞进行基因修饰以敲除全部或部分FasR基因座，使得功能性FasR不在细胞的表面表达，例如，通过缺失或破坏包括FasR的编码序列的基因组DNA和/或包括FasR转录控制和/或启动子和/或激活元件的基因组DNA。
在一些实施例中，相对于未被修饰以减少FasR表达的可比细胞上的细胞表面表达水平，本公开的免疫细胞例如T细胞上的FasR的细胞表面表达水平可以降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。表面FasR表达可以通过结合荧光标记的抗FasR/CD95抗体和流式细胞术来测量，以确定细胞群体中基于每个细胞的平均荧光强度。KO效率为大约50％，其中KO细胞表现出对于FasR染色的低1-2个对数的荧光强度。
在一些实施例中，免疫细胞例如本公开的T细胞包括例如表达由以下组成或包括以下的多肽：表1中列出的一个或多个氨基酸序列。
表1：示例性蛋白质序列
表2.示例性核苷酸序列
在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括表1中列出的序列(例如，表达)中的任何一种或多种的多肽，和/或包括和/或表达包括表2中列出的核酸序列中的任何一种或多种的核酸，例如载体。
在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括(例如，表达)FasL野生型(UniprotKB-P48023)的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括(例如表达)FasLΔcyto(又名FasLδ2-74)的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括(例如，表达)FasL C82A的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括(例如，表达)FasL SLEKQ-->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33)(又名FasLSLEKQ126-130->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33))的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括(例如，表达)FasL Q130D的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括表2中列出的核酸序列中的任何一种或多种的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括FasL野生型的核酸序列的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括FasLΔcyto的核酸序列的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括FasL C82A的核酸序列的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括FasL SLEKQ-->EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33)的核酸序列的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括FasL Q130D的核酸序列的核酸，例如载体。
在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达包括表2中列出的核酸序列中的任何一种或多种的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达编码FasL野生型的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达编码FasLΔcyto的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达编码FasL C82A的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达编码FasL SLEKQ-->EEAAA(分别为SEQ IDNO:32和33)的核酸，例如载体。在一些实施例中，免疫细胞，例如本公开的T细胞包括和/或表达编码FasL Q130D的核酸，例如载体。
本公开涵盖对表1中所示的所公开的实施例的蛋白质进行的修饰，包含具有不显著影响其特性的修饰的功能等同的蛋白质和具有增强的或降低的活性和/或亲和力的变体。多肽的修饰是本领域的常规实践，并且无需在本文中详细描述。经修饰的多肽的实例包含具有不会显著有害地改变功能活性或使多肽对其配体的亲和力成熟(增强)的氨基酸残基保守取代、氨基酸的一个或多个缺失或添加的多肽或使用化学类似物。
氨基酸序列插入包含长度在一个残基至含有一百个或更多的残基的多肽范围内的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。
取代变体去除了蛋白质中的至少一个氨基酸残基，并且在其位置中插入了不同的残基。保守取代示出于表3中的标题“保守取代”下。如果此类取代引起生物活性的变化，那么可以引入表3中命名为“示例性取代”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化且筛选产物。
表3：氨基酸取代
原始残基(天然存在的氨基酸) 保守取代 示例性取代
Ala(A) Val Val；Leu；Ile
Arg(R) Lys Lys；Gln；Asn
Asn(N) Gln Gln；His；Asp；Lys；Arg
Asp(D) Glu Glu；Asn
Cys(C) Ser Sen Ala
Gln(Q) Asn Asn；Glu
Glu(E) Asp Asp；Gln
Gly(G) Ala Ala
His(H) Arg Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I) Leu Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
Leu(L) Ile 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys(K) Arg Arg；Gln；Asn
Met(M) Leu Leu；Phe；Ile
Phe(F) Tyr Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr Tyr；Phe
Tyr(Y) Phe Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V) Leu Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸
在将编码病毒蛋白的多核苷酸引入到细胞中之后，可以在细胞中原位合成FasL蛋白和FasL蛋白衍生物。可替代地，FasL蛋白和FasL蛋白衍生蛋白可以在细胞外产生，并且然后引入到细胞中。将多核苷酸构建体引入细胞中的方法为所属领域中已知的。在一些实施例中，稳定的转化方法可以用于将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施例中，可使用瞬时转化方法来瞬时表达多核苷酸构建体和未整合到细胞的基因组中的多核苷酸构建体。在其它实施例中，可以使用病毒介导方法。可以通过任何合适的方式将多核苷酸引入到细胞中，例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒例如，慢病毒、腺病毒)、脂质体等。瞬时转化方法包括例如但不限于微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可以包括于载体(例如质粒载体或病毒载体)中。
在一些实施例中，本公开的经工程化的免疫细胞，例如T细胞可以包括至少一种FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和至少一种CAR。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞，例如T细胞经修饰，例如经基因修饰以表达水平降低的FasR。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞例如T细胞可以包括至少一种FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和两种或更多种不同的抗原结合蛋白，例如两种或更多种不同的CAR，每种CAR包括不同的胞外配体结合结构域。
在本文所提供的经工程化的免疫细胞，例如T细胞的一些实施例中，CAR可以包括胞外配体结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施例中，胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域在一个多肽中，即在一个单链中。本文还提供了多链CAR和多肽。在一些实施例中，多链CAR包括：含有跨膜结构域和至少一个胞外配体结合结构域的第一多肽，和含有跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域的第二多肽，其中所述多肽组装在一起形成多链CAR。
胞外配体结合结构域与所关注靶标特异性结合。在一些实施例中，所关注的靶标可以是任何所关注的分子，包含例如但不限于BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、Claudin-18.2(Claudin-18A2或Claudin18同种型2)、DLL3(δ样蛋白3、果蝇δ同源物3、δ3)、Muc 7(Mucin17、Muc3、Muc3)、FAPα(成纤维细胞激活蛋白α)、Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合位点蛋白G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、RNF43(E3泛素蛋白连接酶RNF43、环指蛋白43)。
在一些实施例中，胞外配体结合结构域包含scFv，其包含通过柔性连接子连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。单链可变区片段是通过使用短连接肽(Bird等人,《科学(Science)》242:423-426,1988)连接轻链和/或重链可变区来制备的。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO:36)或(GGGGS)4(SEQ ID NO:37)或GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:38)的GS连接子，所述连接子在一个可变区的羧基末端与另一个可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。已经设计并使用其它序列的连接子(Bird等人,1988，同上)。通常，连接子可以是短的柔性多肽并且优选地包含约20个或更少的氨基酸残基。连接子可以进而被修饰以实现另外的功能，诸如附着药物或附着在固体支持物上。单链变体可以通过重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒或其它载体引入合适的宿主细胞(诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等真核细胞或诸如大肠杆菌等原核细胞)中。编码所关注scFv的多核苷酸可以通过如多核苷酸的连接等常规操作来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
根据本公开的CAR的胞内信号传导结构域负责在胞外配体结合结构域与靶标结合之后产生胞内信号传导，从而导致免疫细胞的激活和免疫应答。胞内信号传导结构域能够激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包含细胞因子的分泌)。
在一些实施例中，用于CAR的胞内信号传导结构域可以是例如但不限于T细胞受体和共受体的细胞质序列，所述受体在抗原受体结合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。胞内信号传导结构域包含两类不同的胞质信号传导序列：启动抗原依赖性初级激活的胞质信号传导序列和以抗原非依赖性方式起作用提供次级或共刺激信号的胞质信号传导序列。初级胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，其被称为免疫受体基于酪氨酸的激活基序或ITAM。ITAM是在充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的胞质内尾区发现的明确定义的信号传导基序。本文所公开的CAR中使用的ITAM的实例可以包含作为非限制性实例的源自ΤCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包括共刺激分子的结构域。
在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包括选自由以下组成的组的共刺激分子的一部分：41BB(GenBank：AAA53133)的片段、CD28(NP_006130.1)的片段、OX40的片段、CD40的片段或CD27的片段。
CAR在细胞的表面膜上表达。因此，CAR可以包括跨膜结构域。本文所公开的CAR的合适跨膜结构域具有以下能力：(a)在细胞表面表达，例如在免疫细胞表面表达，所述免疫细胞如例如但不限于淋巴细胞(例如，T细胞)或自然杀伤(NK)细胞；以及(b)与配体结合结构域和胞内信号传导结构域相互作用，以指导免疫细胞对预定靶细胞的细胞应答。跨膜结构域可以源自天然或合成来源。跨膜结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的结构域，如α、β、γ或δ；构成CD3复合物的多肽；IL-2受体例如，p55(α链)、p75(β链或γ链)；Fc受体，具体地Fcγ受体III的亚基链；或CD蛋白。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域源自人CD8α链(例如，NP_001139345.1)。跨膜结构域可以进一步包括位于胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的茎结构域。茎结构域可以包含多达300个氨基酸，例如10个至100个氨基酸或25个至50个氨基酸。茎区可以源自天然存在的分子的全部或部分，诸如源自CD8、CD4或CD28的胞外区的全部或部分，或源自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，茎结构域可以是对应于天然存在的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。在一些实施例中，所述茎结构域是人CD8α链的一部分(例如，NP_001139345.1)。在另一个具体实施例中，跨膜结构域包含人CD8α链的一部分。在一些实施例中，本文所公开的CAR可以包括与BCMA、CD8α人茎结构域以及跨膜结构域特异性结合的胞外配体结合结构域、CD3ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。在一些实施例中，CAR可以作为转基因通过载体例如质粒载体被引入到免疫细胞中。在一些实施例中，载体例如质粒载体还可以含有，例如，提供用于鉴定和/或选择接受载体的细胞的选择标志物。
在将编码CAR多肽的多核苷酸引入细胞中之后，可在细胞中原位合成CAR多肽。可替代地，CAR多肽可以在细胞外产生，并随后将其引入细胞中。将多核苷酸构建体引入细胞中的方法为所属领域中已知的。在一些实施例中，稳定的转化方法可以用于将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施例中，可使用瞬时转化方法来瞬时表达多核苷酸构建体和未整合到细胞的基因组中的多核苷酸构建体。在其它实施例中，可以使用病毒介导方法。可以通过任何合适的方式将多核苷酸引入到细胞中，例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒)、脂质体等。瞬时转化方法包括例如但不限于微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可以包括于载体(例如质粒载体或病毒载体)中。
本文还提供了免疫细胞，例如T细胞，如根据本文所描述的任一种方法获得的分离的T细胞。任何能够表达异源DNA的免疫细胞可以用于表达FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和所关注的CAR的目的。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，免疫细胞可以源自例如但不限于干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。分离的细胞也可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK-细胞、B细胞或选自由以下组成的组的T细胞：炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。在一些实施例中，细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在一些实施例中，免疫细胞例如T细胞如分离的T细胞被进一步修饰，例如使用任何基因突变或基因编辑技术进行基因修饰，所述基因编辑技术包含但不限于已知的同源重组技术和采用大核酸酶、TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统例如部分或全部缺失FasR基因基因座中的任何一种或多种的技术，和/或使用一种或多种已知的敲除方法，例如那些采用任何基于RNA的技术(例如反义RNA、miRNA、siRNA)的方法，使得其相对于未如此修饰的可比细胞表达水平降低的FasR。
本公开的第二个方面是免疫细胞例如T细胞，其被修饰以使得其在降低水平下表达FasR(例如通过使用任何基因突变或基因编辑技术对细胞进行基因修饰，所述基因编辑技术包含但不限于已知的同源重组技术和采用大核酸酶、TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统例如部分或全部缺失FasR基因基因座中的任何一种或多种的技术)。在这两个方面的实施例中，进一步修饰免疫细胞，例如，T细胞以使得其包括和/或表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)(例如来自包括编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸的表达载体)。
在扩增和基因修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可以从多个非限制性来源获得，所述非限制性来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用任何数目的所属领域的技术人员可获得并已知的T细胞系。在一些实施例中，细胞可以源自健康供体、源自诊断患有癌症的受试者或源自诊断患有感染的受试者。在一些实施例中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。
本文还提供了根据本文所述的任何方法从经修饰的例如转化的免疫细胞(例如T细胞)获得的细胞系。在一些实施例中，根据本公开的免疫细胞，例如T细胞包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸。在一些实施例中，根据本公开的免疫细胞，例如T细胞包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸和编码CAR的多核苷酸。在一些实施例中，根据本公开的免疫细胞，例如T细胞包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸、编码CAR的多核苷酸，并且被修饰，例如基因修饰，使得其在降低水平下表达FasR。
本公开的免疫细胞例如T细胞可以使用如通常描述于例如但不限于美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开第20060121005号中的方法在细胞修饰之前或之后激活和扩增。免疫细胞，例如，T细胞可以在体外或体内扩增。通常，本公开的免疫细胞例如通过与刺激细胞表面上的CD3TCR复合物和共刺激分子的药剂接触以产生免疫细胞的激活信号而扩增。例如，如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝分裂凝集素样植物血凝素(PHA)的化学物质可用于产生免疫细胞例如T细胞的激活信号。
在一些实施例中，可以通过与例如抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白质激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)以及钙离子载体接触，在体外刺激T细胞群体。为了在T细胞的表面上共刺激辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5(龙沙公司(Lonza)))，其可以含有增殖和活性所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ和TNF或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂(诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)培养基可以包括RPMI 1640、AIM V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 10和X-Vivo20、Optimizer，其添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或者补充了适当量的血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量的细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，而不包括在待输注给受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。已经暴露于不同刺激时间的免疫细胞(例如T细胞)可以表现出不同的特征。
在一些实施例中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增本公开的细胞。也可以在体内(例如在将细胞施用于受试者中之后在受试者的血液中)扩增细胞。
另一方面，本公开提供了包括本文所公开的任何细胞的组合物(如药物组合物)。在一些实施例中，所述组合物包括T细胞，所述T细胞包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸和编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸。在一些实施例中，细胞被修饰成表达水平降低的FasR。所述组合物包括例如免疫细胞，例如本公开的T细胞，例如表达抗原结合蛋白例如CAR和FasL蛋白和/或FasL蛋白衍生物的免疫细胞，并且任选地相对于在FasR表达水平方面未经修饰的可比细胞，所述免疫细胞在功能上在降低水平下表达FasR，或者包括细胞群体，所述细胞群体包括免疫细胞，例如本公开的T细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施例中，如本文所描述操作分离自供体的原代细胞以提供细胞群体，其中所得细胞的亚群(例如，比例小于100％，如10％、20％、30％)包括全部或部分期望的修饰。此类所得群体，包括包含所有或部分修饰的细胞和不包含所有或部分修饰的细胞的混合物，可以用于本公开的治疗方法中并且用于制备本公开的组合物。可替代地，此细胞群体(“起始群体”)可以通过已知方法操纵，例如细胞分选和/或具有期望修饰的细胞的扩增，以提供富集包括一种或多种期望修饰的细胞的细胞群体(例如，富集表达期望的抗原结合蛋白的细胞，富集表达FasL蛋白和/或FasL蛋白衍生物的细胞和/或富集相对于就FasR表达水平而言未经修饰的可比细胞，在降低水平下表达FasR的细胞)，即，包括比起始群体更高百分比的此类经修饰的细胞的细胞群体。然后，富集经修饰的细胞的群体可以用于本文所公开的治疗方法中，并且用于制备例如本公开的组合物。在一些实施例中，富集的细胞群包含或含有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的具有一种或多种修饰的细胞。在其它实施例中，包含一种或多种修饰的富集细胞群的细胞比例比包含所需修饰的起始细胞群的细胞比例高至少30％。
治疗方法
通过上文所描述的方法获得的免疫细胞例如T细胞或源自此类免疫细胞，或T细胞的细胞系可以用作药物。在一些实施例中，此类药物可用于治疗病症，如例如病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、炎性疾病、免疫性疾病或衰老相关的疾病。在一些实施例中，所述癌症可以选自由以下组成的组：胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。在一些实施例中，受试者是先前治疗的患有局部晚期或转移性黑素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或复发性或难治性经典霍奇金淋巴瘤(cHL)的成年受试者。
在一些实施例中，免疫细胞，例如根据本公开的T细胞，或源自免疫细胞的细胞系，例如T细胞，可以用于制备用于治疗有需要的受试者的病症的药物。在一些实施例中，病症可以是例如癌症、自身免疫病症或感染。
在某些实施例中，在本公开的经工程化的免疫细胞中，FasR功能性表达水平，或根据本公开被敲低或敲除的任何其它基因的功能性表达水平，相对于未经基因修饰的经工程化的免疫细胞的对应表达水平降低了或降低了至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。在一些实施例中，本文所公开的经工程化的免疫细胞功能性地表达FasR，或根据本公开敲低或敲除的任何其它基因，其水平不大于未经工程化的免疫细胞的表达水平的75％、不大于50％、不大于25％、不大于10％或0％的水平，所述未经工程化的免疫细胞在其它方面与经工程化的免疫细胞相同，例如包括与经工程化的免疫细胞相同的组分。在一些实施例中，一个基因的两个等位基因都被敲除，使得本文所公开的经工程化的免疫细胞的基因表达水平是对应的未经工程化的细胞的基因表达水平的0％。在一些实施例中，基因的两个等位基因之一被敲除，使得本文所公开的经工程化的免疫细胞的基因表达水平为对应的未经工程化的细胞的基因表达水平的50％或约50％(例如，如果补偿机制导致剩余等位基因的表达高于正常水平)。如本文所描述，如果例如通过除敲除之外的一些手段降低表达，可以观察到中等表达水平。在一些实施例中，本发明的经工程化的免疫细胞群体包括细胞的混合物，其中一些细胞两个等位基因被改变或剔除，一些细胞只有一个等位基因被改变或剔除，和/或一些细胞两个等位基因都没有被改变或剔除。
在一些实施例中，FasR表达水平，或其表达水平根据本公开被操纵的任何其它基因在本公开的经工程化的细胞中的表达水平，可以通过使用本领域技术人员已知的标准技术(例如，RT-qPCR、核酸测序、抗体染色或技术的某种组合)测定细胞的基因产物和其性质来直接测量。在一些实施例中，通过本领域已知的标准技术，例如流式细胞术来确定经工程化的免疫细胞的表面上的FasR的表达水平，从而测量FasR的功能性表达水平。可以将这些测量与在没有被工程化以降低FasR的功能性表达水平的可比细胞上进行的对应测量进行比较。在包括经工程化的细胞(例如，本发明的经工程化的免疫细胞)的细胞群体中，被测量的材料(例如，RNA或蛋白质或细胞)的合并样品将反映这样的事实，即一些细胞不表达所关注基因，已经敲除了两个等位基因，例如，一些细胞相对于对应的未经工程化的细胞表达50％或约50％的所关注基因，仅敲除了一个等位基因，并且如果所述群体包括未经工程化的细胞，则一些细胞表达正常水平的所关注基因。
本公开的经工程化的免疫细胞中的FasR表达的功能性表达水平还可以例如通过测量经工程化的免疫细胞在存在效应细胞例如，与T细胞或NK细胞的情况下存活的程度未经工程化但在其它方面相当(例如，相同)的免疫细胞在相同条件下存活的程度进行比较来测定。
在一些实施例中，施用经工程化的免疫细胞，例如本文所公开的经工程化的T细胞，或施用包括此类经工程化的免疫细胞例如经工程化的T细胞的细胞群体，相对于不包括此类经工程化的细胞的可比但未经工程化的细胞或可比群体，降低了所施用细胞或细胞群体的宿主排斥。在一些实施例中，施用包括抗原结合蛋白，例如CAR并且其中FasR表达水平降低的经工程化的免疫细胞，例如本公开的经工程化的T细胞，或施用包括此类经工程化的免疫细胞，例如，经工程化的T细胞的细胞群体，相对于可比但未经工程化的细胞或不包括此类经工程化的细胞的群体，降低了所施用细胞或细胞群体的宿主排斥。例如，与相同但未被工程化为在降低水平下表达FasR的细胞的宿主排斥相比，此类施用将宿主排斥降低了1％至99％，例如5％至95％、10％至90％、50％至90％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，宿主排斥降低超过90％。
在一些实施例中，施用包括抗原结合蛋白，例如CAR并且其中FasR功能性表达水平降低的免疫细胞例如本公开的T细胞，或施用包括此类免疫细胞，例如T细胞的细胞群体，与相同但未被工程化为在降低水平下表达FasR的细胞的持久性相比，增强或改善了持久性和/或增加了细胞的持久性。在一些实施例中，持久性增加例如1至7天、1至12周(例如，1至4周，4至8周或8至12周)或1至12个月或落入这些范围内的特定时间长度。在一些实施例中，持久性的差异通过比较所施用的细胞在群体或组合物中的半衰期来测量，其中，例如所述半衰期增加了例如1至7天、1至12周(例如，1至4周，4至8周或8至12周)或1至12个月或落入这些范围内的特定时间长度。在一些实施例中，持久性的差异通过比较施用之后可以检测到所施用细胞的时间长度来测量。在一些实施例中，通过比较经工程化的细胞和未经工程化的细胞在存在例如免疫细胞如T细胞或NK细胞的情况下，例如，在混合之后约72小时、5天或7天的存活率，在体外测量持久性的改善。在一些实施例中，在此类体外测定中，在测量时，存活的工程化细胞是未被工程化的细胞的约1.5至10倍。
在一些实施例中，通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何一种来确定如本文所公开的宿主排斥的减少和/或所施用的细胞的持久性的增加。在一些实施例中，使用以下中的任何一种或组合：流式细胞术、PCR，例如定量PCR，以及与患者肿瘤材料或表达CAR-T细胞靶向的抗原的模型肿瘤细胞系的离体共温育。在一些实施例中，qPCR用于评估具有和不具有所关注敲除的CART细胞的数量，以确定敲除提供存活率优势的程度。
在一些实施例中，本文所提供的免疫细胞，例如T细胞，可以肠胃外施用于受试者。在一些实施例中，受试者是人。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包括施用有效量的第二治疗剂。在一些实施例中，所述第二治疗剂是例如克唑替尼、帕博昔布、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、PD-1抗体或PD-L1抗体。
本文还提供了任何本文所提供的免疫细胞(例如T细胞)在制备用于治疗有需要的受试者的癌症或抑制肿瘤生长或进展的药物中的用途。
在某些实施例中，本公开的经基因修饰的经工程化的免疫细胞中的FasR表达水平相对于未经基因修饰的经工程化的免疫细胞中的FasR表达水平降低了或降低了至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。在一些实施例中，在细胞表面测量FasR表达水平。在一些实施例中，可以通过流式细胞术测量FasR的细胞表面表达水平。表面FasR可以通过结合荧光标记的抗FasR/CD95抗体和流式细胞术来测量，以确定细胞群体中基于每个细胞的平均荧光强度。KO效率为大约50％，其中KO细胞表现出对于FasR染色的低1-2个对数的荧光强度。
在一些实施例中，施用包括抗原结合蛋白例如CAR和FasL蛋白或FasL蛋白衍生物且其中FasR表达水平降低的免疫细胞例如本公开的T细胞，或施用包括此类免疫细胞，例如T细胞的细胞群体，与相同但不包括FasL蛋白或FasL蛋白衍生物且其中FasR表达水平未降低的细胞中的AICD相比，将AICD和/或排斥降低了10％至90％，例如降低了50％至90％，例如降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，宿主细胞杀伤例如激活诱导的细胞死亡(AICD)减少超过90％。评估AICD的测定包含体外重复刺激测定(例如，重复添加靶肿瘤细胞)或体内肿瘤异种移植物测定，具体地表达FasL的肿瘤。
在一些实施例中，施用包括抗原结合蛋白，例如CAR和FasL蛋白或FasL蛋白衍生物并且其中FasR表达水平降低的免疫细胞例如本公开的T细胞，或施用包括此类免疫细胞，例如T细胞的细胞群体，与相同但不包括FasL蛋白或FasL蛋白衍生物并且其中FasR表达水平未降低的细胞的持久性相比，增强或改善了持久性和/或增加了细胞的持久性。在一些实施例中，持久性增加了25％至100％，例如增加或增加至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，或增加落入其终点为所述百分比中的任何两个的范围内的百分比。在一些实施例中，持久性的差异通过比较群体或组合物中施用的细胞的半衰期来测量，其中例如，半衰期增加或增加至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或200％，或增加落入其终点为所述百分比中的任何两个的范围内的百分比。在一些实施例中，持久性的差异通过比较施用之后可以检测到所施用细胞的时间长度来测量。在一些实施例中，通过比较在将细胞与经激活的NK细胞混合之后某一时间，例如在混合之后约72小时、5天或7天的剩余的细胞百分比，在体外测量持久性的改善。在一些实施例中，在此类体外测定中，包括活性FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的细胞存活数是不包括活性FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的细胞(例如，不包括活性FasL蛋白或FasL蛋白衍生物或包括非活性FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的细胞)存活数的约1.5至10倍。
在一些实施例中，所述治疗可以与一种或多种选自下组的抗癌疗法组合：抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法。
在一些实施例中，治疗可以施用于或施用到经历免疫抑制性治疗的受试者内。实际上，本文所公开的主题可以依赖于由于编码此类免疫抑制剂的受体的基因失活而对至少一种免疫抑制剂产生抗性的细胞或细胞群。在这个方面，免疫抑制性治疗可以有助于在受试者体内选择和扩增免疫细胞，例如根据本公开的T细胞。
根据本公开的细胞或细胞群体的施用可以以任何方便的方式进行，所述方式包含气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以将本文所述的组合物皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内施用于受试者。在一个实施例中，本公开的细胞组合物通过静脉内注射施用。
在一些实施例中，细胞或细胞群体的施用可以包括施用，例如，每kg体重约104至约109个细胞，包含这些范围内的细胞数的所有整数值。在一些实施例中，细胞或细胞群体的施用可以包括施用每kg体重约105至约106个细胞，包含这些范围内的细胞数的所有整数值。细胞或细胞群体可以作为一个或多个剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，有效量的细胞可以在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内并且取决于受试者的临床状况。细胞或细胞群体可以从任何来源(诸如血库或供体)获得。虽然个体需要不同，但确定针对特定疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。有效量意指提供治疗或预防益处的量。所施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同时治疗(如果有的话)的种类、治疗频率以及所期望的效果的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过注射到肿瘤内直接进行。
在本公开的一些实施例中，将细胞与任何数量的相关治疗模态联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者，包含但不限于用如单克隆抗体疗法、CCR2拮抗剂(例如INC-8761)、抗病毒疗法、西多福韦(cidofovir)和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)等药剂的治疗或用于MS受试者的那他利珠单抗(nataliziimab)治疗或用于银屑病受试者的依法替单抗(efaliztimab)的治疗或用于PML受试者的其它治疗。在一些实施例中，将BCMA特异性CAR-T细胞与以下中的一种或多种联合施用于受试者：抗PD-1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或PF-06801591)、抗PD-L1抗体(例如，阿维单抗(avelumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab))、抗OX40抗体(例如，PF-04518600)、抗4-1BB抗体(例如，PF-05082566)、抗MCSF抗体(例如，PD-0360324)、抗GITR抗体和/或抗TIGIT抗体。在另外的实施例中，免疫细胞例如本公开的T细胞可以与可以与化学疗法、放射、如环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、麦考酚酯(mycophenolate)和FK506等免疫抑制剂、抗体或其它免疫去除剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycoplienolic acid)、类固醇、FR901228、细胞因子和/或辐射组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Henderson,Naya等人《免疫学(Immunology.)》1991年7月；73(3):316-321；Liu,Albers等人《生物化学(Biochemistry)》1992年4月28日；31(16):3896-901；Bierer,Hollander等人《当代免疫学观点(Curr OpinImmunol.)》1993年10月；5(5):763-73)。
在另外的实施例中，本公开的细胞组合物与骨髓移植、使用如氟达拉滨等化疗药剂的T细胞消融疗法、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或如OKT3或CAMPATH等抗体联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者。在一些实施例中，在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如美罗华(Rituxan)后，施用本公开的细胞组合物。例如，在一个实施例中，受试者可以经历高剂量化学疗法的标准治疗，随后经历外周血干细胞移植。在某些实施例中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在一些实施例中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
试剂盒
本公开还提供了用于本发明方法的试剂盒。本文所公开的试剂盒包含一个或多个容器，所述一个或多个容器包括本公开的组合物或免疫细胞，例如本公开的T细胞或包括免疫细胞例如本公开的T细胞的细胞群体。在各个实施例中，免疫细胞，例如T细胞包括一种或多种编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物和抗原结合蛋白，例如本文所描述的CAR的多核苷酸，并且进一步被修饰以表达如本文所描述的水平降低的FasR。所述试剂盒进一步包括根据本文所公开的任何方法的使用说明。通常，这些说明书包括对用于上文所描述的治疗性处理的组合物、免疫细胞(例如，T细胞)或细胞群体的施用的描述。
与试剂盒组分的使用相关的说明书通常包括关于剂量、给药方案和针对预期治疗的施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
本公开的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器还可以具有无菌进入端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。根据本公开，组合物中的至少一种活性剂是免疫细胞或此类细胞的群体。容器可以进一步包括第二药物活性剂。
试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。
分选和消耗方法
在一些实施例中，提供了用于体外分选免疫细胞群体的方法，其中所述免疫细胞群体的亚群包括如本文所描述的经工程化的免疫细胞，其在降低水平下表达FasR和/或表达抗原结合蛋白，例如CAR。所述方法包括使所述免疫细胞群体与对经工程化的细胞独特的表位(例如，模拟表位)(例如抗原结合蛋白的表位或掺入到抗原结合蛋白中的模拟表位)具有特异性的单克隆抗体接触，并且选择与单克隆抗体结合的免疫细胞，以获得在表达抗原结合蛋白的经工程化的免疫细胞中富集的细胞群体。
在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与荧光团缀合。在此实施例中，选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过荧光激活细胞分选(FACS)来完成。
在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与磁颗粒缀合。在此实施例中，选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过磁激活细胞分选(MACS)来完成。
在一些实施例中，对表达抗原结合蛋白例如CAR的免疫细胞进行分选的方法中所使用的mAb选自阿仑单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、聚乙二醇化赛妥珠单抗、达利珠单抗、艾库组单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、雷珠单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、维多珠单抗、阿达木单抗、贝利木单抗、康纳单抗、地诺单抗、戈利木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10和/或优特克单抗。在一些实施例中，所述mAb是利妥昔单抗。在另一个实施例中，所述mAb是QBEND-10。
在一些实施例中，当使用上文所描述的用于体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包括至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的表达CAR的免疫细胞。在一些实施例中，当使用用于体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包括至少85％的表达CAR的免疫细胞。
在一些实施例中，当使用上文所描述的用于体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体与初始(未分选的)细胞群体相比，在体外显示出增强的细胞毒性活性。在一些实施例中，所述体外细胞毒性活性增加了10％、20％、30％或50％。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞。
施用于接受者的表达CAR的免疫细胞可以在体外从来源群体中富集。扩增源群体的方法可包括使用密度离心、免疫磁珠纯化、亲和色谱和荧光激活细胞分选的组合来选择表达抗原(如CD34抗原)的细胞。
流式细胞测量术可用于定量细胞群体内的特定细胞类型。一般来说，流式细胞测量术是一种主要通过光学手段对细胞的组分或结构特征进行定量的方法。由于可以通过定量结构特征来区分不同的细胞类型，因此流式细胞术和细胞分选可以用于对混合物中不同表型的细胞进行计数和分选。
流式细胞术分析涉及两个主要步骤：1)用一种或多种标记的标志物来标记所选细胞类型，以及2)确定标记的细胞相对于群体中细胞的总数的数量。在一些实施例中，标记细胞类型的方法包括使所标记的抗体与特定细胞类型表达的标志物结合。抗体可直接标记有荧光化合物或使用例如，识别第一抗体的荧光标记的第二抗体间接标记。
在一些实施例中，用于对表达CAR的T细胞进行分选的方法为磁性激活细胞分选(MACS)。磁性激活细胞分选(MACS)是一种取决于细胞群体表面抗原(CD分子)，通过使用超顺磁纳米粒子和柱分离多种细胞群体的方法。MACS可用于获得纯细胞群体。单细胞悬浮液中的细胞可用微珠磁性标记。将样品施加于由铁磁性球体构成的柱，其覆盖有允许快速和平缓分离细胞的细胞友好型涂层。未经标记的细胞会通过而磁标记的细胞保留在柱中。流过物可收集作为未标记的细胞部分。洗涤步骤之后，从分离器去除所述柱，并使磁标记的细胞从柱洗脱。
可以在Basu S等人(2010)中找到用于纯化特定细胞群体(如T细胞)的详细方案。(Basu S,Campbell HM,Dittel BN,Ray A.《通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化特定细胞群(Purification of specific cell population by fluorescence activated cellsorting)》,《可视化实验期刊(J.Vis.Exp.)》(41):1546)。
实例
提供以下实例仅出于说明性目的，并且不旨在以任何方式限制本公开的范围。实际上，除了本文所示出和所描述的那些之外，本公开的各种修改对于本领域的技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
实例1：经激活的T和NK细胞上的FasR表达的验证
进行了两个实验来证实同种异体反应性T和NK细胞在激活后易受FasL介导的杀伤。
A.在第一实验中，在评估激活诱导的细胞死亡(通过7-氨基放线菌素D(7-AAD))和FasR和CD69的表面表达之前，在存在100U/mL IL-2的情况下用TransAct重复刺激原代T细胞至多八天(参见图1A-1C)。未经刺激的T细胞对CD69呈阴性，大约40％FasR+，并且在解冻之后表现出高活性。单个刺激导致>80％的表达CD69的细胞，>95％的表达FasR的细胞，并且活性损失最小。
重复刺激——模拟疗法过程中CAR T细胞对癌细胞的连续杀伤——导致CD69+细胞逐渐减少至约40％，FasR在>95％的细胞上稳定表达，以及深度(约70-80％)细胞死亡(参见图1A-1C)。基于这些结果，经激活的T细胞(包含攻击细胞疗法的同种异体反应性T细胞)应该易受FasCART细胞的FasL介导的杀伤。另外地，基于这些结果，预计敲除FasCART细胞中的FasR对于预防FasL介导的自相残杀是必要的并可能根据肿瘤细胞参与改善对AICD的抗性。
B.在第二实验中，用1000U/mL IL-2激活从新鲜收集的白细胞减少系统(LRS)室制备的NK细胞48小时，并且然后通过流式细胞术将其FasR表达与经激活的FasR+T细胞进行比较(图2)。细胞因子激活的NK细胞表现出表面FasR表达，尽管水平低于经激活的T细胞。基于这些结果，经激活的NK细胞应该易受FasCART细胞的FasL介导的杀伤。
实例2：FasR敲除、表达FasL的细胞的衍生
A.FasR敲除
进行了两种修饰以改善T细胞持久性并降低AICD：FasR基因敲除和FasL基因递送。
CRISPR介导的基因组编辑用于敲除FasR基因。Synthego公司(Synthego)的网络工具用于设计靶向人FasR基因的单向导RNA(sgRNA)分子，用于CRISPR介导的敲除。将sgRNA和Cas9酶电穿孔到经激活的FasR+原代T细胞中导致约50％的FasR基因敲除(图3A和3B)。
为了证明FasR KO保护T细胞免于发生FasR介导的凋亡，在Jurkat T细胞中敲除FasR，并且在与凋亡激活抗FasR抗体(克隆CH11，50ng/mL)或抗体加竞争性阻断剂(2μg/mLFasR胞外结构域-Fc)温育72小时之后，在FasR+与FasR KO Jurkat细胞中评估细胞死亡(图4)。与抗FasR抗体温育完全杀伤FasR+Jurkat T细胞。竞争性阻断抗体-FasR与可溶性FasR胞外结构域的结合阻止了FasR+Jurkat细胞的杀伤，证明了通过凋亡的死亡是通过FasR特异性介导的。相反，FasR敲除的Jurkat T细胞在不存在竞争性阻断的情况下在抗体温育中存活，表明敲除有效地保护了这些细胞免于发生FasR介导的凋亡。
B.FasL表达
为了能够进行FasL基因递送，设计并制备了慢载体，所述慢载体将蓝色荧光蛋白(BFP)作为转导标志物与FasL的各种衍生物共递送，包含野生型人FasL(来自UniprotKB-P48023的序列)、非活性突变体(F275L)(Schneider,P.等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》272,18827-18833(1997))、缺乏细胞质结构域的截短形式(Δaa 2-74)和三种设计用于破坏FasL上的ADAM10和SPPL2a切割位点的突变体(Q130D、C82A和SLEKQ126-130→EEAAA(分别为SEQ ID NO:32和33))。慢病毒是从这些细胞的亚群中制备的并在FasR敲除之后立即用于转导原代T细胞。流式细胞术评估经转导的T细胞上的BFP的表达和FasL的表面表达(图5A和5B)。所有载体成功转导了原代T细胞，BFP在30-70％的事件中的表达证明了这一点，这取决于构建体。另外地，在细胞表面上观察到所有四种活性形式的FasL，尽管在FasL野生型的情况下细胞性明显较低。值得注意的是，尽管BFP表达强烈，但在细胞表面上没有检测到非活性(F275L)FasL，这表明该点突变破坏了生物发生并输出到细胞表面，或者使其失去功能的突变也破坏了用于流式细胞术染色的抗FasL抗体对其的识别。
实例3：检测表达FasL的FasRKO T细胞的功能的试点实验
A.表达FasL的T细胞杀伤表达FasR的自体和同种异体细胞。
重要的是，FasR+细胞(其中没有发生FasR敲除的细胞)占未经转导的(NTD)细胞的约50％，但在用活性形式的FasL转导的那些样品中完全不存在(图6A)，这表明FasR敲除是防止表达FasL的T细胞产物自相残杀所必需的。为了研究基于FasL-FasR参与的同种异体细胞杀伤，将图6A中产生的来自HLA-A2+供体的FasL+、FasR KO(也称为“FasR–”)T细胞与来自HLA-A2–供体的FasR+和FasR–T细胞一起温育，并在流式细胞术分析中使用HLA-A2状态来分辨同种异体细胞。正如在6A中观察到的自体自相残杀所预测的，表达FasL活性形式的A2+FasRKO细胞杀伤FasR+同种异体细胞，但不杀伤FasR–同种异体细胞(图6B)。这表明表达FasL+、FasR–、CAR的细胞产物可以选择性地杀伤经激活的同种异体T细胞(例如攻击细胞产物的同种异体反应性T细胞)，同时不伤害非同种异体反应性宿主T细胞。因此，与对应的非FasL+、FasR–的表达CAR的细胞产物相比，表达FasL+、FasR–、CAR的细胞产物预期持续更长时间和/或遭受更少AICD。
B.CRISPR介导的原代T细胞中的FasR和β2m基因的双重敲除。
同种异体宿主T细胞排斥基于TCR介导的对非自身主要组织相容性复合体(MHC)分子上存在的表位的识别的细胞产物。同种异体宿主NK细胞也可能导致排斥，具体地如果细胞疗法产物被工程化成MHC向宿主T细胞的呈递(例如，通过敲除MHCI分子中不变的β2m组分)。为了产生作为同种异体NK细胞的靶标的模型表达FasL的细胞，使用CRISPR介导的基因敲除来产生对FasR和β2m呈阴性的HLA-A2–T细胞(图7A和7B)，并且然后用FasL衍生物转导这些细胞。FasR敲除的效率为约65％并且β2m敲除的效率为约75％，其中>50％的细胞表现出两种基因的敲除，如图7B所示。
为了确定FasL表达是否保护这些HLA-A2–模型细胞产物免受同种异体NK细胞的影响，从来自三个HLA-A2+供体的新鲜LRS室中制备NK细胞，将其用1000U/mL IL-2激活48小时，并且然后将其与表达FasL的β2m KO细胞一起温育72小时，使用HLA-A2状态以通过流式细胞术辨别同种异体细胞来源(图8A-8B)。经激活的NK细胞完全杀伤未经转导或用非活性FasL转导的β2m敲除细胞。相反，当β2m敲除细胞表达FasL的活性衍生物时，其被保护免于发生NK细胞介导的杀伤(图8A)。正如假设的那样，这种保护机制是FasL介导的反击，因为在包含用活性FasL武装的T细胞的温育中，活NK细胞计数显著减少(图8B)。这种杀伤对FasR+NK细胞具有特异性，因为其从这些样品中切除并且所有剩余的NK细胞是FasR–(数据未示出)。
序列表
<110> 艾洛基治疗公司（ALLOGENE THERAPEUTICS, INC.）
<120> 用于保护治疗性细胞免受同种异体排斥和激活诱导的细胞死亡影响的
FasL表达和FasR基因敲除
<130> AT-040/02WO
<140>
<141>
<150> 63/156,902
<151> 2021-03-04
<160> 38
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 1
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<213> 捷申病毒属A（Teschovirus A）
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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20
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 人工序列
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Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Leu Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 12
<211> 197
<212> PRT
<213> 土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus）
<400> 12
Asn Gln Pro Leu Asp Tyr Lys Ile Cys Glu Arg Leu Thr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Asn Tyr Val Ala Pro Phe Thr Leu Cys Gly Tyr Ala Ala Leu Met Pro
20 25 30
Leu Tyr His Ala Ile Ala Ser Arg Met Ala Phe Ile Phe Ser Ser Leu
35 40 45
Tyr Lys Ser Trp Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Glu Leu Trp Pro Val Val
50 55 60
Arg Gln Arg Gly Val Val Cys Thr Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr
65 70 75 80
Gly Trp Gly Ile Ala Thr Thr Cys Gln Leu Leu Ser Gly Thr Phe Ala
85 90 95
Phe Pro Leu Pro Ile Ala Thr Ala Glu Leu Ile Ala Ala Cys Leu Ala
100 105 110
Arg Cys Trp Thr Gly Ala Arg Leu Leu Gly Thr Asp Asn Ser Val Val
115 120 125
Leu Ser Gly Lys Leu Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Ala Cys Val Ala
130 135 140
Thr Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Cys Tyr Val Pro Ser Ala Leu
145 150 155 160
Asn Pro Ala Asp Leu Pro Ser Arg Gly Leu Leu Pro Ala Leu Arg Pro
165 170 175
Leu Pro Arg Leu Arg Leu Arg Pro Gln Thr Ser Arg Ile Ser Leu Trp
180 185 190
Ala Ala Ser Pro Pro
195
<210> 13
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 13
tagtccaatt tgttaaagac aggatatcag tggtccaggc tctagttttg actcaacaat 60
atcaccagct gaagcctata gagtacgagc catagataaa ataaaagatt ttatttagtc 120
tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta ggatcaaggt 180
caggaacaga gaaacaggag aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240
ccccgctcag ggccaagaac agttggaaca ggagaatatg ggccaaacag gatatctgtg 300
gtaagcagtt cctgccccgc tcagggccaa gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc 360
ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg ccccaaggac ctgaaatgac 420
cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg 480
ctccccgagc tcaataaaag agcccacaac ccctcactcg gcgcgatc 528
<210> 14
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 14
atgagcgagc tgattaagga gaacatgcac atgaagctgt acatggaggg caccgtggac 60
aaccatcact tcaagtgcac atccgagggc gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc 120
atgagaatca aggtggtcga gggcggccct ctccccttcg ccttcgacat cctggctact 180
agcttcctct acggcagcaa gaccttcatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttc 240
aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg gagagagtca ccacatacga agacgggggc 300
gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc caggacggct gcctcatcta caacgtcaag 360
atcagagggg tgaacttcac atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg 420
gaggccttca ccgagacgct gtaccccgct gacggcggcc tggaaggcag aaacgacatg 480
gccctgaagc tcgtgggcgg gagccatctg atcgcaaaca tcaagaccac atatagatcc 540
aagaaacccg ctaagaacct caagatgcct ggcgtctact atgtggacta cagactggaa 600
agaatcaagg aggccaacaa cgagacctac gtcgagcagc acgaggtggc agtggccaga 660
tactgcgacc tccctagcaa actggggcac aagcttaat 699
<210> 15
<211> 84
<212> DNA
<213> 捷申病毒属A（Teschovirus A）
<400> 15
ggaggctccg gcggccgcgc aaaacgtgca acgaatttca gcctgctgaa gcaggccggg 60
gacgtcgagg agaatcccgg gcca 84
<210> 16
<211> 843
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60
tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120
ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180
cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240
ctctgcctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 300
atgttccagc tgttccactt gcagaaggag ttggcagaac tgagggaaag cactagccag 360
atgcacaccg cctcaagctt ggagaagcag atcggtcacc caagcccccc cccagaaaag 420
aaggagctga ggaaggtcgc acacctcacc ggtaaatcca attcccggtc aatgcccctg 480
gagtgggaag acacctatgg catcgttctg ctttcaggcg tcaaatacaa gaaaggaggg 540
ctggttatca atgaaacagg gctgtatttc gtttattcca aggtctactt tcgggggcag 600
tcctgtaaca atctccctct cagccacaaa gtctacatga ggaacagcaa atacccccag 660
gatctggtta tgatggaagg gaagatgatg agctactgca ctaccggcca gatgtgggcc 720
aggagttcct acctgggtgc cgtcttcaac cttacttccg cagaccatct gtacgtcaac 780
gtgagtgaac tgtccctggt gaactttgag gagagtcaga cctttttcgg gctgtataaa 840
ctg 843
<210> 17
<211> 240
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60
tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120
ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180
cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
ctctgcctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 60
atgttc 66
<210> 19
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 19
cagctgttcc acttgcagaa ggagttggca gaactgaggg aaagcactag ccagatgcac 60
accgcctcaa gcttggagaa gcagatcggt cacccaagcc cccccccaga aaagaaggag 120
ctgaggaagg tcgcacacct caccggtaaa tccaattccc ggtcaatgcc cctggagtgg 180
gaagacacct atggcatcgt tctgctttca ggcgtcaaat acaagaaagg agggctggtt 240
atcaatgaaa cagggctgta tttcgtttat tccaaggtct actttcgggg gcagtcctgt 300
aacaatctcc ctctcagcca caaagtctac atgaggaaca gcaaataccc ccaggatctg 360
gttatgatgg aagggaagat gatgagctac tgcactaccg gccagatgtg ggccaggagt 420
tcctacctgg gtgccgtctt caaccttact tccgcagacc atctgtacgt caacgtgagt 480
gaactgtccc tggtgaactt tgaggagagt cagacctttt tcgggctgta taaactg 537
<210> 20
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 20
atgggcaacc acagcaccgg cctgtgcctg ctggtgatgt tcttcatggt gctggtggcc 60
ctggtgggcc tgggcctggg catgttccag ctgttccacc tgcagaagga gctggccgag 120
ctgagagaga gcaccagcca gatgcacacc gccagcagcc tggagaagca gatcggccac 180
cccagccccc cccccgagaa gaaggagctg agaaaggtgg cccacctgac cggcaagagc 240
aacagcagaa gcatgcccct ggagtgggag gacacctacg gcatcgtgct gctgagcggc 300
gtgaagtaca agaagggcgg cctggtgatc aacgagaccg gcctgtactt cgtgtacagc 360
aaggtgtact tcagaggcca gagctgcaac aacctgcccc tgagccacaa ggtgtacatg 420
agaaacagca agtaccccca ggacctggtg atgatggagg gcaagatgat gagctactgc 480
accaccggcc agatgtgggc cagaagcagc tacctgggcg ccgtgttcaa cctgaccagc 540
gccgaccacc tgtacgtgaa cgtgagcgag ctgagcctgg tgaacttcga ggagagccag 600
accttcttcg gcctgtacaa gctg 624
<210> 21
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 21
atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60
tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120
ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180
cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240
ctcgccctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 300
atgttccagc tgttccactt gcagaaggag ttggcagaac tgagggaaag cactagccag 360
atgcacaccg cctcaagctt ggagaagcag atcggtcacc caagcccccc cccagaaaag 420
aaggagctga ggaaggtcgc acacctcacc ggtaaatcca attcccggtc aatgcccctg 480
gagtgggaag acacctatgg catcgttctg ctttcaggcg tcaaatacaa gaaaggaggg 540
ctggttatca atgaaacagg gctgtatttc gtttattcca aggtctactt tcgggggcag 600
tcctgtaaca atctccctct cagccacaaa gtctacatga ggaacagcaa atacccccag 660
gatctggtta tgatggaagg gaagatgatg agctactgca ctaccggcca gatgtgggcc 720
aggagttcct acctgggtgc cgtcttcaac cttacttccg cagaccatct gtacgtcaac 780
gtgagtgaac tgtccctggt gaactttgag gagagtcaga cctttttcgg gctgtataaa 840
ctg 843
<210> 22
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 22
atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60
tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120
ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180
cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240
ctctgcctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 300
atgttccagc tgttccactt gcagaaggag ttggcagaac tgagggaaag cactagccag 360
atgcacaccg cctcagagga agccgctgcc atcggtcacc caagcccccc cccagaaaag 420
aaggagctga ggaaggtcgc acacctcacc ggtaaatcca attcccggtc aatgcccctg 480
gagtgggaag acacctatgg catcgttctg ctttcaggcg tcaaatacaa gaaaggaggg 540
ctggttatca atgaaacagg gctgtatttc gtttattcca aggtctactt tcgggggcag 600
tcctgtaaca atctccctct cagccacaaa gtctacatga ggaacagcaa atacccccag 660
gatctggtta tgatggaagg gaagatgatg agctactgca ctaccggcca gatgtgggcc 720
aggagttcct acctgggtgc cgtcttcaac cttacttccg cagaccatct gtacgtcaac 780
gtgagtgaac tgtccctggt gaactttgag gagagtcaga cctttttcgg gctgtataaa 840
ctg 843
<210> 23
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 23
atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60
tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120
ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180
cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240
ctctgcctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 300
atgttccagc tgttccactt gcagaaggag ttggcagaac tgagggaaag cactagccag 360
atgcacaccg cctcaagctt ggagaaggac atcggtcacc caagcccccc cccagaaaag 420
aaggagctga ggaaggtcgc acacctcacc ggtaaatcca attcccggtc aatgcccctg 480
gagtgggaag acacctatgg catcgttctg ctttcaggcg tcaaatacaa gaaaggaggg 540
ctggttatca atgaaacagg gctgtatttc gtttattcca aggtctactt tcgggggcag 600
tcctgtaaca atctccctct cagccacaaa gtctacatga ggaacagcaa atacccccag 660
gatctggtta tgatggaagg gaagatgatg agctactgca ctaccggcca gatgtgggcc 720
aggagttcct acctgggtgc cgtcttcaac cttacttccg cagaccatct gtacgtcaac 780
gtgagtgaac tgtccctggt gaactttgag gagagtcaga cctttttcgg gctgtataaa 840
ctg 843
<210> 24
<211> 592
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus）
<400> 24
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 25
ggaggctccg gcggccgcgc aaaacgt 27
<210> 26
<211> 8425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 26
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgattagtcc aatttgttaa agacaggata tcagtggtcc 2220
aggctctagt tttgactcaa caatatcacc agctgaagcc tatagagtac gagccataga 2280
taaaataaaa gattttattt agtctccaga aaaagggggg aatgaaagac cccacctgta 2340
ggtttggcaa gctaggatca aggtcaggaa cagagaaaca ggagaatatg ggccaaacag 2400
gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgc tcagggccaa gaacagttgg aacaggagaa 2460
tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccgctcaggg ccaagaacag 2520
atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag 2580
ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt 2640
ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca caacccctca 2700
ctcggcgcga tcggatctat ttccggtgaa ttccgccacc atgagcgagc tgattaagga 2760
gaacatgcac atgaagctgt acatggaggg caccgtggac aaccatcact tcaagtgcac 2820
atccgagggc gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga 2880
gggcggccct ctccccttcg ccttcgacat cctggctact agcttcctct acggcagcaa 2940
gaccttcatc aaccacaccc agggcatccc cgacttcttc aagcagtcct tccctgaggg 3000
cttcacatgg gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga 3060
caccagcctc caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttcac 3120
atccaacggc cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggccttca ccgagacgct 3180
gtaccccgct gacggcggcc tggaaggcag aaacgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg 3240
gagccatctg atcgcaaaca tcaagaccac atatagatcc aagaaacccg ctaagaacct 3300
caagatgcct ggcgtctact atgtggacta cagactggaa agaatcaagg aggccaacaa 3360
cgagacctac gtcgagcagc acgaggtggc agtggccaga tactgcgacc tccctagcaa 3420
actggggcac aagcttaatg gaggctccgg cggccgcgca aaacgtgcaa cgaatttcag 3480
cctgctgaag caggccgggg acgtcgagga gaatcccggg ccaatgcagc agcctttcaa 3540
ctatccttat cctcagatct attgggtcga ttctagcgcc tcttctcctt gggcaccacc 3600
agggactgtc ttgccatgcc cgactagcgt gccacggaga ccaggccagc gtcgacctcc 3660
cccacctcca cccccccctc ccctgccacc accaccccca ccacctcccc ttccaccctt 3720
gccacttcct ccgcttaaga aacggggaaa ccacagcact ggcctctgcc tgttggtcat 3780
gttcttcatg gtgctggttg cactggtggg actgggattg gggatgttcc agctgttcca 3840
cttgcagaag gagttggcag aactgaggga aagcactagc cagatgcaca ccgcctcaag 3900
cttggagaag cagatcggtc acccaagccc ccccccagaa aagaaggagc tgaggaaggt 3960
cgcacacctc accggtaaat ccaattcccg gtcaatgccc ctggagtggg aagacaccta 4020
tggcatcgtt ctgctttcag gcgtcaaata caagaaagga gggctggtta tcaatgaaac 4080
agggctgtat ttcgtttatt ccaaggtcta ctttcggggg cagtcctgta acaatctccc 4140
tctcagccac aaagtctaca tgaggaacag caaatacccc caggatctgg ttatgatgga 4200
agggaagatg atgagctact gcactaccgg ccagatgtgg gccaggagtt cctacctggg 4260
tgccgtcttc aaccttactt ccgcagacca tctgtacgtc aacgtgagtg aactgtccct 4320
ggtgaacttt gaggagagtc agaccttttt cgggctgtat aaactgtgat agggcgcgcc 4380
acgcgtctgg aacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct 4440
taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc 4500
tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 4560
ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga 4620
cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc 4680
tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 4740
aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt 4800
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<210> 29
<211> 8425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 29
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cctggaatta attctgcagt cgagacctag aaaaacatgg agcaatcaca agtagcaata 5040
cagcagctac caatgctgat tgtgcctggc tagaagcaca agaggaggag gaggtgggtt 5100
ttccagtcac acctcaggta cctttaagac caatgactta caaggcagct gtagatctta 5160
gccacttttt aaaagaaaag aggggactgg aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag 5220
atatccttga tctgtggatc taccacacac aaggctactt ccctgattag cagaactaca 5280
caccagggcc aggggtcaga tatccactga cctttggatg gtgctacaag ctagtaccag 5340
ttgagccaga taaggtagaa gaggccaata aaggagagaa caccagcttg ttacaccctg 5400
tgagcctgca tgggatggat gacccggaga gagaagtgtt agagtggagg tttgacagcc 5460
gcctagcatt tcatcacgtg gcccgagagc tgcatccgga gtacttcaag aactgctgat 5520
atcgagcttg ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc agggaggcgt ggcctgggcg 5580
ggactgggga gtggcgagcc ctcagatcct gcatataagc agctgctttt tgcctgtact 5640
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 5700
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 5760
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 5820
agtagtagtt catgtcatct tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca 5880
gagagtgaga ggccttgaca ttgctagcgt ttaccgtcga cctctagcta gagcttggcg 5940
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 6000
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 6060
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 6120
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 6180
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6240
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6300
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 6360
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 6420
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6480
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6540
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6600
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6660
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 6720
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 6780
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 6840
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6900
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6960
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 7020
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 7080
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 7140
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 7200
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 7260
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 7320
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 7380
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 7440
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 7500
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 7560
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 7620
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 7680
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 7740
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 7800
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 7860
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7920
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7980
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 8040
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 8100
gacgtcgacg gatcgggaga tcaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 8160
caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 8220
gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcaac tggataactc aagctaacca 8280
aaatcatccc aaacttccca ccccataccc tattaccact gccaattacc tgtggtttca 8340
tttactctaa acctgtgatt cctctgaatt attttcattt taaagaaatt gtatttgtta 8400
aatatgtact acaaacttag tagt 8424
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Ser Leu Glu Lys Gln
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 33
Glu Glu Ala Ala Ala
1 5
<210> 34
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 34
atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60
tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120
ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180
cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240
ctctgcctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 300
atgttccagc tgttccactt gcagaaggag ttggcagaac tgagggaaag cactagccag 360
atgcacaccg cctcaagctt ggagaagcag atcggtcacc caagcccccc cccagaaaag 420
aaggagctga ggaaggtcgc acacctcacc ggtaaatcca attcccggtc aatgcccctg 480
gagtgggaag acacctatgg catcgttctg ctttcaggcg tcaaatacaa gaaaggaggg 540
ctggttatca atgaaacagg gctgtatttc gtttattcca aggtctactt tcgggggcag 600
tcctgtaaca atctccctct cagccacaaa gtctacatga ggaacagcaa atacccccag 660
gatctggtta tgatggaagg gaagatgatg agctactgca ctaccggcca gatgtgggcc 720
aggagttcct acctgggtgc cgtcttcaac cttacttccg cagaccatct gtacgtcaac 780
gtgagtgaac tgtccctggt gaactttgag gagagtcaga ccctgttcgg gctgtataaa 840
ctg 843
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 35
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 38
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (39)

1.一种载体，其包括编码抗原结合蛋白的多核苷酸和编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的载体，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的载体，其中所述FasL蛋白或FasL蛋白衍生物包括UniprotKB-P48023(SEQ ID NO:3)、FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)或FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包括编码重组抗原受体的多核苷酸与所述编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸之间的编码2A肽的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
6.一种经工程化的免疫细胞，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的载体。
7.根据权利要求6所述的经工程化的免疫细胞，与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞进一步包括水平降低的FasR表达。
8.根据权利要求6所述的经工程化的免疫细胞，其中与未经基因修饰以在降低水平下表达FasR的经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞已被基因修饰以在降低水平下表达FasR。
9.一种经工程化的免疫细胞，其包括抗原结合蛋白和FasL或FasL衍生物，其中与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞进一步包括水平降低的FasR表达。
10.一种经工程化的免疫细胞，其包括抗原结合蛋白和FasL或FasL衍生物，其中与未经基因修饰以在降低水平下表达FasR的经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞已被基因修饰以在降低水平下表达FasR。
11.根据权利要求8或权利要求10所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞使用TALEN、CRISPR/Cas9和megaTAL核酸酶中的任一种进行基因修饰，或表现出使用例如shRNA或微RNA实现的降低的表达水平。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中FasL或FasL衍生物选自由以下组成的组：野生型FasL(SEQ ID NO:3)、FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)和FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)。
14.根据权利要求6至13中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞表现出相对于第二经工程化的免疫细胞改善的体内持久性，其中所述第二经工程化的免疫细胞包括分离的T细胞的所有组分，除了所述第二经工程化的免疫细胞不包括病毒蛋白之外。
15.一种经工程化的免疫细胞，其包括编码抗原结合蛋白的多核苷酸和编码FasL或FasL衍生物的多核苷酸，其中与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞包括降低的FasR表达。
16.根据权利要求15所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中FasL或FasL衍生物选自由以下中提供的序列编码的氨基酸序列组成的组：UniprotKB P48023(SEQ ID NO:3)、FasL、FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)和FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)。
18.根据权利要求6至17中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞进一步包括对内源性TCRα基因和内源性CD52基因中的一个或多个进行的一种或多种基因组修饰。
19.根据权利要求6至18中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞是T细胞。
20.一种经工程化的免疫细胞群体，其包括根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞中的一种或多种经工程化的免疫细胞。
21.一种经工程化的免疫细胞群体，其包括根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞中的104个或更多个、105个或更多个或106个或更多个经工程化的免疫细胞。
22.一种经工程化的免疫细胞群体，其富集根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞。
23.一种药物组合物，其包括根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞或根据权利要求20至22中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体以及药学上可接受的载体。
24.一种治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞、根据权利要求20至22中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体或根据权利要求23所述的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述免疫细胞是源自除所述患者以外的供体的同种异体免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞群体中的所述经工程化的免疫细胞源自来自除所述患者以外的供体的一种或多种同种异体免疫细胞，或者所述组合物包括来自除所述患者以外的供体的一种或多种同种异体免疫细胞。
26.一种用于减少治疗方案中的同种异体细胞的宿主细胞杀伤的方法，所述方法包括向患者施用同种异体细胞，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞、根据权利要求20至22中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体或向所述患者施用根据权利要求23所述的药物组合物。
27.一种增强患者的同种异体细胞的持久性的方法，所述方法包括向患者施用同种异体细胞，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求6至19中任一项所述的经工程化的免疫细胞、根据权利要求20至22中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体或向所述患者施用根据权利要求23所述的药物组合物。
28.一种经工程化的免疫细胞，其包括第一FasR等位基因的第一基因组修饰以及任选地第二FasR等位基因的第二基因组修饰，并且进一步包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物并且任选地进一步编码抗原结合蛋白的载体。
29.根据权利要求28所述的经工程化的免疫细胞，其中所述第一基因组修饰是功能丧失基因组修饰。
30.根据权利要求28所述的经工程化的免疫细胞，其中所述细胞包括所述第一基因组修饰和所述第二基因组修饰，并且进一步其中所述第一基因组修饰和所述第二基因组修饰是功能丧失基因组修饰。
31.根据权利要求28所述的经工程化的免疫细胞，其中所述第一基因组修饰是敲除。
32.根据权利要求28所述的经工程化的免疫细胞，其中所述细胞包括所述第一基因组修饰和所述第二基因组修饰，并且进一步其中所述第一基因组修饰和所述第二基因组修饰是敲除。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述载体编码包括UniprotKB-P48023(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的FasL蛋白。
34.根据权利要求28至32中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述载体编码包括FasLδ2-74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)或FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列的FasL蛋白衍生物。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述载体进一步编码抗原结合蛋白。
36.根据权利要求35所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述细胞进一步包括内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的基因组修饰。
38.根据权利要求37所述的经工程化的免疫细胞，其中所述细胞包括TCRa的功能丧失基因组修饰。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的经工程化的免疫细胞，其中所述细胞包括CD52的功能丧失基因组修饰。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024193714A1 (zh) * 2023-03-23 2024-09-26 科济生物医药（上海）有限公司 细胞免疫疗法的组合物和方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
WO2001062895A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2002072798A1 (en) * 2001-03-13 2002-09-19 Johns Hopkins University School Of Medicine Fas ligand-expressing hematopoietic cells for transplantation
CA2491864C (en) 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
CN114836385A (zh) * 2014-10-31 2022-08-02 宾夕法尼亚大学董事会 改变cart细胞中的基因表达及其用途
JP2021502122A (ja) * 2017-11-10 2021-01-28 ジュラ バイオ，インコーポレイテッド 主要組織適合複合体ベースのキメラ受容体および自己免疫疾患を治療するためのその使用
TW202031894A (zh) * 2018-11-01 2020-09-01 中國大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司 用於t細胞工程之組合物及方法
CN110790842B (zh) * 2019-11-25 2021-03-30 贵州康钦承平生物科技有限公司 一种FasL-CAR融合蛋白和表达融合蛋白的T细胞及其制备方法和应用
US20230133554A1 (en) * 2020-04-09 2023-05-04 Autolus Limited Molecule
WO2022012531A1 (zh) * 2020-07-14 2022-01-20 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种经修饰的免疫细胞的制备方法

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