CN114317579A - 一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及其应用，属于基因工程技术领域，本发明对pET系列质粒依次进行第一替换和第二替换；所述第一替换包括使用定点突变的方法将pET系列质粒上的启动子替换为拼合启动子，得重组质粒；所述第二替换包括将重组质粒的复制子替换为目标质粒的复制子，得高表达质粒，本发明的高表达质粒在大肠杆菌代谢菌中的蛋白表达量高达97%，其表达量明显提高。

Description

一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用。

背景技术

pET系列质粒，是一种常用的融合蛋白类型的原核高效表达载体，由T7启动子启动表达，转录和翻译调控系统能使目的蛋白高水平表达。pET系列质粒作为目前应用最广泛的重组蛋白表达载体，表达量在通常情况下可达到总蛋白量的50％，但一般pET系列质粒在宿主大肠杆菌BL21中有较好的表达，而在代谢菌中的表达效果较差，会存在较多的包涵体，导致不能获得较多的可溶性蛋白，严重影响蛋白的活性。因此，对pET系列质粒的改造是不可或缺的一部分。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种适用于大肠杆菌的高表达质粒及应用，本发明显著了提高目的基因的可溶性蛋白的表达量，有效地提高了代谢菌的酶转化效率。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，该质粒的获取为：包括对pET系列质粒依次进行第一替换和第二替换；所述第一替换包括使用定点突变的方法将pET系列质粒上的启动子替换为拼合启动子，得重组质粒；所述第二替换包括将重组质粒的复制子替换为目标质粒的复制子，得高表达质粒；具体步骤如下：

步骤一：以pET系列质粒为模板，以SEQ ID No.6-10所示的任一种拼合启动子的基因序列为目标序列，采用定点突变的方法用目标序列替换pET系列质粒的原有启动子序列；

步骤二：以步骤一所述具有拼合启动子的pET系列质粒作为模板，进行聚合酶链式反应得到第一目的基因片段，采用试剂盒对第一目的基因片段进行DNA纯化，DNA消化酶消化，DNA连接酶环化，获得重组质粒；所述第二替换包括：以重组质粒为模板，通过反式聚合酶链式反应获得HG-02片段，以目标质粒的复制子为模板，所述目标质粒的复制子为高拷贝复制子，经过聚合酶链式反应得到第二目的基因片段；

步骤四：把获得的HG-02片段和高拷贝片段通过In-Fusion的方法进行连接，得到高表达质粒，所述高表达质粒的复制子碱基序列具体如SEQ ID No.11-15所示。

本发明的另一目的是提供一种适用于大肠杆菌的高表达质粒的应用，通过转化法将重组质粒导入宿主大肠杆菌中，得到工程菌株sHG-02，通过转化法将高表达质粒导入宿主大肠杆菌中，得到菌株sHG-03。

优选的，所述大肠杆菌为代谢菌，本发明重组质粒和高表达质粒适用于所有代谢菌。

优选的，所述代谢菌是代谢菌BW25113，本发明重组质粒和高表达质粒在代谢菌BW25113中效果最佳。

本发明的有益效果在于：1、本发明使用拼合启动子替换pET系列质粒的启动子，拼合启动子同样具有比较高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性；2、把原始质粒复制子替换为第二目的基因片段，本发明高表达质粒具有拷贝数高，普适性强的特点，在菌株传代的过程中能够达到高拷贝的效果；3、本发明显著了提高目的基因的可溶性蛋白的表达量，与普通pET系列载体相比提高了47%左右，有效地提高了代谢菌的酶转化效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的所构建的重组质粒蛋白表达结果与未替换启动子的质粒蛋白表达结果的电泳对比图；“1”、“2”、“3”、“4”是未替换启动子的质粒蛋白表达结果；“5”、“6”、“7”、“8”是本发明所构建的重组质粒pHG-02蛋白表达结果，“1”、“3”、“5”、“7”是上清蛋白的灰度值，“2”、“4”、“6”、“8”是沉淀蛋白的灰度值；

图2为本发明的所构建的高表达质粒蛋白表达结果与未替换启动子和复制子的质粒蛋白表达结果的电泳对比图；“1”、“2”是未替换启动子和复制子质粒的蛋白表达结果；“3”、“4”是本发明的所构建的高表达质粒pHG-03的蛋白表达结果的电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本实施例使用的pET系列质粒和拼合启动子均为市售产品，以pET系列质粒为模板，以aroG为工具基因，aroG基因来源于Escherichia coli str. K-12，其碱基序列具体如SEQ ID No.16所示，将基因aroG扩增、连接至质粒模板，作为起始质粒；

根据现有技术构建重组质粒，获得的重组质粒记为pHG-02，高表达质粒，获得的高表达质粒记为pHG-03，具体包括以下步骤：

1）以pET系列质粒为模板，本实施例选取pET20b (SEQ ID NO.1)质粒为模板，在pET20b的启动子上下游各选取15-20bp，采用定点突变的方法将pET20b质粒上的启动子替换为SEQ ID No.6-10所示的任一种序列的拼合启动子，本实施例选取trc (SEQ ID NO.7)启动子，trc启动子的基因序列为：

TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATG；

2）以步骤1）中具有拼合启动子的pET20b质粒作为模板，根据引物序列进行聚合酶链式反应得到高浓度的第一目的基因片段，采用试剂盒，将高浓度第一目的基因片段进行DNA纯化，DNA消化酶消化，DNA连接酶环化，获得目的重组质粒pHG-02，浓度为102.67ng/ul，再通过转化法导入宿主菌大肠杆菌代谢菌BW25113中，得到菌株sHG-02；

引物序列为：

F端引物是：cattatacgagggatgattaattgtcaaatttcgcgggatcgagatctcgatcctct；

R端引物是：atgtgtaaggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaa；

3）活化保藏有工程菌株sHG-02的甘油种于5mL 含50ug/mL 卡那霉素的LB 培养基之中，于30 ℃，225rpm 摇床中过夜培养12-18 小时，即得工程菌株sHG-02的种子培养液；用移液枪吸取1mL 上述得到的工程菌株sHG-02的种子培养液加入到250mL 含50ug/mL 氨苄青霉素的LB培养基之中，于30℃，225rpm 的摇床中扩大培养；用分光光度计于600nm 波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm 波长下吸光度达到0.6时，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导工程菌株sHG-02表达蛋白酶，终浓度为200mM，然后，将发酵液置于30℃的摇床之中连续培养12 个小时，培养之后定点取样，固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1% ；酵母提取物 0.5% ；NaCl 1% ；琼脂2% ；pH 5.5-6.5 ；高压蒸汽灭菌后添加氨苄霉素50ug/mL。

4）取出菌液，转移至50mL离心管中，4℃，8000rpm，离心5min收集菌种，弃上清液，加入10mL缓冲液，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，整个破碎过程保持在冰上进行，必要时可重复破碎，将破碎好的细胞高速离心20min，4℃，10000rpm，取上清蛋白转移至新的50mL离心管中。取样20μL上清蛋白和沉淀蛋白。

5）将上清蛋白和沉淀蛋白进行热变性，采用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达，并计算蛋白灰度值。SDS-PAGE检测结果如图1所示，蛋白灰度值结果如表2所示。

实施例2：

6）在实施例1的基础上，以步骤2）中的重组质粒pHG-02为模板，通过反式聚合酶链式反应获得HG-03片段，引物序列为：

F端引物是：gaagatcctttgatcttt

R端引物是：aacgccagcaacgcggcc

以目标质粒为的复制子为模板，其中，目标质粒的复制子为高拷贝复制子，目标质粒的复制子的在大肠杆菌内的拷贝数如表1所示，本实施例选取pRSF-Duet为目标质粒，使用RSF ori (SEQ ID NO.13)复制子，以aroG为工具基因，在复制子片段的上下游选取15-20bp，作为上下游引物，通过聚合酶链式反应得到第二目的基因片段；

7）把获得HG-03片段和第二目的基因片段通过In-Fusion的方法进行连接，得到高表达质粒pHG-03，浓度为541.96ng/ul，通过转化法导入宿主大肠杆菌代谢菌BW25113中，得到菌株sHG-03。

8）活化保藏有工程菌株sHG-03的甘油种于5mL 含50ug/mL 氨苄霉素的LB 培养基之中，于30 ℃，2250rpm 摇床中过夜培养12-18 小时，即得工程菌株sHG-03的种子培养液；用移液枪吸取1mL 上述得到的工程菌株sHG-03的种子培养液加入到250mL 含50ug/mL 氨苄青霉素的LB培养基之中，于30℃，225rpm 的摇床中扩大培养；用分光光度计于600nm 波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液在600nm 波长下吸光度达到0.6时，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导工程菌株sHG-03表达蛋白酶，终浓度为200mM，然后，将发酵液置于30℃的摇床之中连续培养12 个小时，培养之后定点取样，固体培养基中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别为：胰蛋白胨 1% ；酵母提取物 0.5% ；NaCl 1% ；琼脂2% ；pH 5.5-6.5 ；高压蒸汽灭菌后添加卡那霉素50ug/mL 。

9）取出菌液，转移至50mL离心管中，4℃，8000rpm，离心5min收集菌种，弃上清，加入10mL缓冲液，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，整个破碎过程保持在冰上进行，必要时可重复破碎，将破碎好的细胞高速离心20min，4℃，10000rpm，取上清蛋白转移至新的50mL离心管中。取样20μL上清蛋白和沉淀蛋白。

10）将上清蛋白和沉淀蛋白变性，采用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达，并计算蛋白灰度值，检测结果如图2所示，蛋白灰度值结果如表4所示。

实施例3：

本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pET20b(SEQ ID NO.1)质粒作为模板，tac（SEQ ID NO.6）启动子，蛋白灰度值结果如表6所示。

实施例4：

本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pet23a_RBPMS_FL（SEQ ID NO.2）质粒作为模板，PBAD（SEQ ID NO.8）启动子，所用大肠杆菌代谢菌为W3110，蛋白灰度值结果如表6所示。

实施例5：

本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pET16B.Pfu（SEQ ID NO.3）质粒作为模板，rhaPBAD（SEQ ID NO.9）启动子，蛋白灰度值结果如表6所示。

实施例6：

本实施例与实施例1操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例选取pET28a（SEQID NO.4）质粒作为模板，PL/PR（SEQ ID NO.10）启动子，所用大肠杆菌代谢菌为MG1655，蛋白灰度值结果如表6所示。

实施例7：

本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例3中的重组质粒为模板，选取pBR322（SEQ ID NO.11）复制子，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。

实施例8：

本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例4中的重组质粒为模板，选取pMB1（SEQ ID NO.12）复制子，所用大肠杆菌代谢菌为W3110，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。

实施例9：

本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例5中的重组质粒为模板，选取pMB1*（SEQ ID NO.14）复制子，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。

实施例10：

本实施例与实施例2操作，测试步骤相同，不同之处在于本实施例以实施例6中的重组质粒为模板，选取ColE（SEQ ID NO.15）复制子，所用大肠杆菌代谢菌为MG1655，质粒浓度和蛋白灰度值结果如表7所示。

表1 目标质粒的复制子在大肠杆菌内的拷贝数

载体	pET	pUC	pRSF-Duet	pUC	pBLUEscript
						序列表序号	11	12	13	14	15
复制子	pBR322	pMB1	RSF ori	pMB1*	ColE
						拷贝数	30-40	120	300-500	500-700	300-500

表2 替换启动子的质粒蛋白表达量的灰度值

序号	1	2	3	4	5	6	7	8
									灰度值	9315	389	13309	402	960243	28952	1255782	28952

此表对应图1，数据标记：1：空白对照;3：空白对照;5: sHG-02/pHG-02;7：sHG-02/pHG-02;“1”、“3”、“5”、“7”是上清蛋白的灰度值，“2”、“4”、“6”、“8”是沉淀蛋白的灰度值。

表3 替换启动子后的质粒表达蛋白中可溶蛋白量占比

序号	5	7
			占比（%）	97.07%	97.59%

根据表2中的数据计算的可溶度，可溶度（%）为重组蛋白上清中的表达量占（上清表达量+沉淀中的表达量）的百分比。

表4 替换复制子的质粒蛋白表达量的灰度值

	1	2	3	4
					灰度值	13283	15672	895304	928597

此表对应图2，数据标记：1：空白对照；2：空白对照；3: sHG-03/pHG-03；4: sHG-03/ pHG-03

表5 替换复制子前后的质粒浓度

序号	1	2	3
				pHG-02质粒(替换前质粒) 浓度(ng/ul)	102.67	105.78	99.68
pHG-03(替换后质粒) 浓度(ng/ul)	541.96	549.84	539.38

表6 不同重组质粒表达的蛋白上清蛋白灰度值

序号	载体质粒	拼合启动子	代谢菌	空白对照上清蛋白灰度值	重组质粒上清蛋白灰度值
						实施例3	SEQ ID NO.1	SEQ ID NO.6 (tac)	BW25113	9469	935836
实施例4	SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.8 (PBAD)	W3110	8436	894768
						实施例5	SEQ ID NO.3	SEQ ID NO.9 (rhaPBAD)	BW25113	9036	953299
实施例6	SEQ ID NO.4	SEQ ID NO.10 (PL/PR)	MG1655	9261	906543

此表使用的空白对照为未替换启动子的pET系列质粒

表7 不同高表达质粒替换复制子前后的上清蛋白表达量和质粒浓度

序号

重组质粒来源

目标质粒复制子

代谢菌

高表达质粒上清蛋白表达量

替换复制子前质粒浓度(ng/ul)

替换复制子后质粒浓度(ng/ul)

实施例7

实施例3

SEQ ID NO.11

BW25113

1023416

126.27

526.94

实施例8

实施例4

SEQ ID NO.12

W3110

1056935

114.65

534.92

实施例9

实施例5

SEQ ID NO.14

BW25113

1046894

108.64

535.68

实施例10

实施例6

SEQ ID NO.15

MG1655

1063548

112.58

542.67

从表2和4中结果可以看出，针对重组质粒和高表达质粒，其蛋白表达量均显著提高，本发明的重组质粒和高表达质粒在宿主代谢菌中均有较好的表达，由表3结果可以看出，本发明显著了提高目的基因的可溶性蛋白的表达量，与普通pET系列载体相比提高了47%左右，有效地提高了代谢菌的酶转化效率，由表5的结果可以看出，复制子替换后，高表达质粒浓度明显提高，表明本发明的高表达质粒在菌株传代的过程中能够达到高拷贝的效果；由表6和表7的结果可知，重组质粒和高表达质粒均适用于不用种类的代谢菌，重组质粒在不同的代谢菌中可溶性蛋白表达量高，高表达质粒在不用的代谢菌株传代的过程中能够达到高拷贝的效果。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京合谷生命生物科技有限公司

<120> 一种适用于大肠杆菌的高表达质粒交底书

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3716

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgaattaa ttccgatatc catggccatc gccggctggg 240

cagcgaggag cagcagacca gcagcagcgg tcggcagcag gtatttcata tgtatatctc 300

cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggaaaccg ttgtggtctc cctatagtga 360

gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg 420

catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 480

gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 540

gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 600

gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc 660

ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct 720

ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc 780

atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac 840

ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc 900

ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga 960

gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct 1020

ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 1080

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 1140

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 1200

cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 1260

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 1320

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 1380

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 1440

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 1500

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 1560

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 1620

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 1680

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 1740

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 1800

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 1860

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 1920

actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 1980

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 2040

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 2100

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 2160

tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 2220

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 2280

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 2340

agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 2400

acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 2460

gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 2520

ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca 2580

tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 2640

ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 2700

tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata 2760

attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 2820

agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 2880

ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 2940

ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 3000

cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 3060

gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 3120

tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 3180

tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 3240

tgccacctga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 3300

tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 3360

agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 3420

tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 3480

catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 3540

aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 3600

ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 3660

taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 3716

<210> 2

<211> 4250

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840

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tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960

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<211> 8032

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<213> 人工合成

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taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640

atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700

gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760

aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020

ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080

tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140

gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800

gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369

<210> 5

<211> 5857

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccctcgagt cattcaatgt tgattccttt cttaattgag 240

gattctgcct ttggtaatat aactgataaa acaccatttt caaacttagc tgaggcattt 300

tcttccttaa cagttgcagg aagttttatt gttctatata tttcttcctc ttctggaatt 360

tctgagtaga taattctttc actctcagtt atcattaatg ggcttctctt agctctaatc 420

tctaatgtat ctccaactgc atttaaaatt atgtcctctt tattaacccc tggcaaccat 480

gcaataactt ttatatgctg gtctccttca ataattgaga ttggcatgaa cccttttcca 540

gaaatttgta ttcctgttga gctttgaatc attgtggttc ctgtcattgg tgttgcaaaa 600

aactctttaa acattctttc aaataatgaa tcaaatgggt ctcttccgaa catatgtata 660

tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctagagggga attgttatcc gctcacaatt 720

cccctatagt gagtcgtatt aatttcgcgg gatcgagatc tcgatcctct acgccggacg 780

catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 840

caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 900

tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 960

ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga 1020

gtcgcataag ggagagcgtc gagatcccgg acaccatcga atggcgcaaa acctttcgcg 1080

gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa 1140

cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga 1200

accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc 1260

tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg 1320

gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat 1380

ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg 1440

aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta 1500

actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg 1560

cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc tcccatgaag 1620

acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt 1680

tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc 1740

tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg 1800

gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg 1860

ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg 1920

gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc 1980

cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc 2040

tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga 2100

aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 2160

cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 2220

attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccgggatctc gaccgatgcc cttgagagcc 2280

ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg 2340

actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc 2400

ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga 2460

atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag 2520

aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc ccacgggtgc gcatgatcgt gctcctgtcg 2580

ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga atcaccgata 2640

cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc aacaacatga 2700

atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc gccctgcacc 2760

attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct 2820

gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg ccgcatccat 2880

accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc atcagtaacc 2940

cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa cagaaatccc 3000

ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt 3060

atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag 3120

gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg 3180

cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 3240

tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 3300

gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta 3360

actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatatgcggt gtgaaatacc 3420

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga 3480

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3540

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3600

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3660

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3720

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3780

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 3840

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3900

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3960

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 4020

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4080

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4140

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4200

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4260

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4320

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4380

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 4440

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 4500

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 4560

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 4620

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 4680

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 4740

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 4800

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 4860

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 4920

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 4980

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 5040

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 5100

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 5160

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 5220

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 5280

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 5340

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg aaattgtaaa 5400

cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca 5460

ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag 5520

tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg 5580

gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt 5640

tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag 5700

agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc 5760

gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc 5820

gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgcca 5857

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 30

<210> 8

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccat 285

<210> 9

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

caccacaatt cagcaaattg tgaacatcat cacgttcatc tttccctggt tgccaatggc 60

ccattttcct gtcagtaacg agaaggtcgc gaattcaggc gctttttaga ctggtcgta 119

<210> 10

<211> 244

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcatgta ctaaggaggt tgtatggaac 60

aacgcataac cctgaaagat tatgcaatgc gctttgggca aaccaagaca gctaaagatc 120

tctcacctac caaacaatgc ccccctgcaa aaaataaatt catataaaaa acatacagat 180

aaccatctgc ggtgataaat tatctctggc ggtgttgaca taaataccac tggcggtgat 240

actg 244

<210> 11

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaa 589

<210> 12

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

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gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589

<210> 13

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

aacggaatag ctgttcgttg acttgataga ccgattgatt catcatctca taaataaaga 60

aaaaccaccg ctaccaacgg tggttttctc aaggttcgct gagctaccaa ctctttgaac 120

caaggtaagt gggttggagg accgcactca ccaaaatctg ttctttcagt ttagccttaa 180

caggtgcata acttcaagac aaagtcctct aaatcagtta ccaatggctg ctgccagtgg 240

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 300

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 360

actgagatac caacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 420

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 480

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atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgcctgcg gcgttggctt 600

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ataaccgtat taccgctttt gagtgagctg acaccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc 720

gtagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 750

<210> 14

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480

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tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589

<210> 15

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589

<210> 16

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

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tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

Claims (10)

1.一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，其特征在于，包括对pET系列质粒依次进行第一替换和第二替换；所述第一替换包括使用定点突变的方法将pET系列质粒上的启动子替换为拼合启动子，得重组质粒；所述第二替换包括将重组质粒的复制子替换为目标质粒的复制子，得高表达质粒。

2.如权利要求1所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，其特征在于，所述第一替换还包括：以具有拼合启动子的pET系列质粒作为模板，进行聚合酶链式反应得到第一目的基因片段，对第一目的基因片段依次进行纯化，DNA消化酶消化，DNA连接酶环化，获得重组质粒；所述第二替换包括：以重组质粒为模板，通过反式聚合酶链式反应获得HG-02片段，以目标质粒的复制子为模板，经过聚合酶链式反应得到第二目的基因片段，把HG-02片段和第二目的基因片段进行连接，得到高表达质粒。

3.如权利要求1或2所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，所述pET系列质粒碱基序列具体如SEQ ID No.1-5所示。

4.如权利要求1或2所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，其特征在于，所述拼合启动子碱基序列具体如SEQ ID No.6-10所示。

5.如权利要求1或2所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，其特征在于，所述目标质粒的复制子为高拷贝复制子。

6.如权利要求2所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，其特征在于，所述第二替换采用In-Fusion连接。

7.如权利要求2所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒，其特征在于，所述高表达质粒的复制子碱基序列具体如SEQ ID No.11-15所示。

8.如权利要求1或2所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒的应用，其特征在于，将重组质粒和高表达质粒分别通过转化法导入宿主大肠杆菌中，分别得到菌株sHG-02，sHG-03。

9.如权利要求8所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为代谢菌。

10.如权利要求9所述的一种适用于大肠杆菌的高表达质粒的应用，其特征在于，所述代谢菌是代谢菌BW25113。

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