KR20090106474A - 혈청-불포함 재조합 단백질의 치료제로서의 제조를 위한 표적화된 프로모터 트랩 전략을 이용한 ｐｒｐ 유전자 세포의 유전적 제거 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프리온 단백질(PrP)-유전자의 두 대립형질이 모두 상동성 재조합에 의해 완전히 결실된 것인 PrP(prion protein)-불포함 불멸화 인간 체세포주(PrP -free immortalized somatic human cell line)를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 세포주를 제조하는 방법 빛 바이오 의약품(biopharmaceutical)으로 적합한 인간 재조합 단백질을 제조하기 위한 그의 용도를 제공한다.

프리온 단백질, 바이오 의약품, 불멸화 인간 체세포주.

Description

혈청-불포함 재조합 단백질의 치료제로서의 제조를 위한 표적화된 프로모터 트랩 전략을 이용한 ＰＲＰ 유전자 세포의 유전적 제거{Genetic ablation of the PRP gene cells using a targeted promoter trap strategy for production of serum-free recombinant proteins as therapeuticals}

본 발명은 프리온 단백질(prion protein, PrP)-유전자의 두 대립형질이 모두 상동성 재조합에 의해 완전히 결실된 것인 PrP-불포함 불멸화 인간 체세포주(PrP-free immortalized somatic human cell line)을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 세포주를 제조하는 방법 빛 바이오 의약품(biopharmaceutical)으로 적합한 인간 재조합 단백질을 제조하기 위한 그의 용도를 제공한다.

프리온(prion)은 동물에서 중추신경계 해면상 뇌병증(spongiform encephalopathies)을 유발하는 감염성 병원체(infectious pathogen)이다. 바이러스 및 바이로이드(viroid)와 대조적으로, 프리온은 핵산을 전혀 포함하지 않고 단백질 분해효소(protease)에 대해 내성을 갖는다. 상기 감염성 입자는 정상적인 세포 프리온 단백질인 PrP^c의 이소형인 PrP^Sc로 확인되었다. 프리온 가설(Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 13363-13383, (1988))은 PrP^Sc 분자 자체가 이형이합체 화(heterodimerisation) 과정을 통해 또는 핵 중합(nuclear polymerization)을 통해, PrP^c를 비정상적인 구조(conformation)로 전환시킨다는 것을 제안한다.

동물의 가장 일반적인 프리온 질환은 양 및 염소의 스크래피(Scrapie), 소의 광우병(bovine spongiform encephalopathy: BSE)이다. 인간에서, 4개의 프리온 질환이 확인되었다: (1) 쿠루병(Kuru), (2) 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease: CJD), (3) 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease: GSS) 및 (4) 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia: FFI). 인간 프리온 질환은 산발성(sporadic), 유전성(genetic) 또는 감염성 기원을 가질 수 있다.

최초로 기술된 감염성 프리온 질환은 250여년 전에 양 및 염소의 질환인 스크래피였다. 스크래피는 50여년 전에 실험에 의해 전파될 수 있는 것으로 입증되었다. 스크래피가 사람에게 전파되었다는 증거는 없다. BSE는 1985년에 최초로 영국 소에서 밝혀지고(Wells et al., Veterinary record 121, 419-420, (1987)) 반추동물-유래 육골분 사료(meat and bone meal )의 경구 섭취를 통해 전파된 것으로 사료된다(Wilesmith et al., Veterinary Record 123, 638-644, (1988)). BSE는 광범위하게 전파되어, 1992년에 영국에서 180,000 건 이상의 임상적 사례로 정점에 이르렀으나, 수학적 추정치는 1백만 내지 2백만두의 소가 감염되었으나, 임상적 질환의 증거를 보일 정도로 자라기 전에, 도살되어 인간의 먹이 사슬에 들어갔을 수 있다는 것을 시사한다(Anderson et al., Nature 382, 779- 788, (1996)). BSE는 국산 소 및 외래 소(Wyatt et al., Veterinary Record 129: 233-236, (1991); Kirk- wood and Cunningham, Veterinary Record 135, 296-303 (1994))와 영국 동물원의 외래 우제류를 포함한 20여종 이하의 다른 종으로 전파되었다. 1988년 7월에, BSE의 전파는 영국 정부가 반추동물-유래 육골분 사료의 동물 사료로서의 이용을 제한하게 하였고, 1989년 11월에 소의 부산물(bovine offal)의 인간 섭취를 금지하게 하였다.

인간 프리온 질환의 전파는 1950년대 말에 파푸아 뉴기니의 Fore인들에서 최초로 보고되었고(Gajdusek & Zigas, New England Journal of Medicine 257, 974-978 (1957)) 의식적인 식인행위(ritualistic cannibalism) 및 산 제물의 장례식(sacrificial funeral rite) 동안 전파된 것으로 사료된다. CJD의 의인성 전파(iatrogenic transmission)가 오염된 의료 장비 및 이식물(graft)을 통한 CNS의 직접적인 접종에 의해 잘 기록되었다. 의의성 전파는 또한 근육내 주사에 의해 투여된 마른 사람의 시상하부 호르몬(cadaverous human pituitary growth hormone) 및 고나도트로핀을 통해 일어났다(Buchanan et al., British Medical Journal 302, 824-824, (1991); Brown et al., Transfusion 38:810-816, (1992)).

변형 CJD(Variant CJD: vCJD)는 BSE(bovine spongiform encephalopathy) 매개체에 대한 노출로부터 초래되는 인간 프리온 질환으로 보인다. vCJD는 영국에서 CJD 발생 및 임상적 표현형의 체계적인 모니터링의 결과로 10년 전에 최초로 기록되었다(Will et al., Lancet 347:921-5, (1996)).

vCJD의 경우, 다른 인간 프리온 질환과 대조적으로, 프리온 단백질 및 감염 성의 질환-연관 형태는 임상적 질환의 발병 전에도(Hilton, D. A. et al., Lancet 352:703-4 (1998)), 전신의 림프 조직에서 용이하게 검출가능하다(Hill, A. F. et al., Lancet 353: 183-9 (1999); Head, M. W. et al., Am. J. Pathol. 164: 142 (2004)). 이는 혈액 및 혈액 제품도 감염성 입자를 포함할 수 있어서, 변형 CJD의 의인성 전파의 가능한 원천일 수 있다는 우려를 가져온다.

이 우려는 BSE의 전임상(preclinical) 단계에서 동물로부터의 혈액 및 백혈구 연층(buffy coat)의 수혈에 의해 양 모델에서 BSE의 실험적 전파 후에 강화되었다(Hunter et al., J. Gen. Virol. 83: 2897-905 (2002)).

동물 모델에서의 연구는 혈액 중의 대부분의 프리온 감염성은 세포와 연관될 수 있고, 혈장에서는 더 낮은 수준이라는 것을 보여주었고(Brown P et al., Transfusion 38:810-816 (1998)), 혈장 분획(plasma fractionation) 과정 동안 존재하는 감염성이 감소될 수 있다는 것을 시사하는 증거가 있다(Stenland, C.J. et al., Transfusion 42: 1497-500 (2002); Gregori, L. et al., Biologicals 32: 1-10 (2004)). vCJD의 혈액 수혈 전파에 반응하여, 1980년 이후 스스로 혈액 성분의 수혈자였던 공여자의 수혈 연기(deferral)가 자가유지형(self-sustaining) 발생을 초래하는 3차 또는 그 이상의 전파 위험을 감소시키기 위해 제도화되었다. 그럼에도 불구하고, 적합한 혈액 테스트가 아직 존재하지 않기 때문에, 혈장 또는 혈액 제품이 상기 질환을 전파시킬 수 있다는 가능성이 배제될 수 없다(Aguzzi, A. & Glatzel M., Nat. Clin. Pract. Neurol. 2: 321-329 (2006)).

인간의 생성물(human product)을 통해 프리온-관련 빌환을 전파할 위험은 심 각한 보건 문제이다. 혈액 제품의 경우, 예방 방법은 한편으로는 혈액을 여과에 의해 정화시키는 것과 조합된 vCJD 공여자의 처리이다.

또 다른 한편으로는, 오염된 공여자에 의한 혈액 수혈을 통한 프리온 전파의 위험을 예방하는 재조합 인간 단백질의 안전한 생산이다. 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 개체에서 인간 단백질의 생성은 대량 합성으로 다수의 인간 단백질의 생성을 가능하게 하나, 플라스미드 안정성 및 원하는 단백질 생성물의 불용성(insolubility)과 같은 인자들이 이 시스템의 유용성을 제한할 수 있다. 대부분의 인간 단백질은 내인성 단백질(endogenous protein)의 기능을 수행하기 위해 번역-후 변형(post-translational modification)을 필요로 하고, 따라서, 생성된 단백질의 혈장-유사 기능수행(plasma-like functioning)을 위해서는 포유동물 세포 또는 심지어 종-특이적 세포주에서의 합성을 필요로 한다.

예를 들면, 인자 VIII의 경우, CHO(Chinses Hamster Ovary) 세포와 같은 비-인간 세포주(non-human cell line)의 이용은 정제된 치료 단백질이 세포 유래 미량 성분들(cellular trace component)에 의해 오염되어 환자에서 항원성 반응을 유발한다는 점에서 치명적인 단점을 갖는다(Refacto, Wyeth, package insert).

또한, 비-인간 발현 시스템에 의해 발현되는 단백질은 비-인간 글리코실화 패턴을 가져서, 환자에서 항원성 반응을 일으킬 수 있다. 응고 인자의 생물학적 안정성 및 효능은 실질적으로 그들의 O-글리코실화 및 N-글리코실화 패턴에 의해 영향을 받는다. 특히, 주변 단당류(peripheral monosaccharie) 및 말단 단당류가 그 들의 분해를 담당하는 세포로부터 특정한 수용체에 의해 검출되기 때문에, 그들은 중요하다. 응고 인자들은 말단 단당류로서 시알산 잔기를 갖는다. 당단백질(glycoprotein)의 안테나에서 시알산의 조성의 변화가 이질적인 글리코실화 패턴을 초래할 수 있다. 따라서, 변형이 일어나는 경우, 생물학적 안정성 및 효능이 크게 영향받는다. 따라서, 비-인간 생산 세포주(non-human production cell line)에서 글리코실화의 영향의 평가가 재조합 응고 인자의 생성에서 중요한 고려사항이다. 일반적으로, 인간 세포주가 비-인간 세포주보다 재조합 응고 인자의 생산을 위해 더 적합하다. 그 이유는 아마도 재조합 단백질의 합성 동안 외래 올리고사카라이드가 올리고사카라이드 모이어티로 도입될 수 없다는 것이다.

이 이유들 때문에, 포유동물, 특히 인간 시스템이 재조합 인간 단백질의 생산을 위해 바람직하다. 특히, 불멸화 세포주 HEK293 및 그의 유도체, 예를 들면, 프리스타일(Freestyle) HEK293F가 재조합 인간 단백질을 발현시킬 수 있다(EP 05 105 965.7). 다수의 치료제가 포유동물 시스템에서 제조되기 때문에, 프리온 단백질의 완전한 부재에 대해, 그와 같은 시스템으로부터 분리된 이 제품들의 안전성을 보장해야 할 요구가 존재한다. 한편으로는 프리온 감염성을 위한 적합한 테스트가 존재하지 않고, 또 다른 한편으로는 프리온 전파 및 감염성이 감염성 프리온 단백질로 전환될 수 있는, 정상적인 세포 프리온 단백질의 발현에 의존적이라는 점을 고려할 때, 그와 같은 시스템에서 프리온 감염성을 제거하는 가장 분명하고 유망한 방법은 프리온 유전자의 완전한 넉아웃(knockout)에 의해 생산 시스템에서 프리온 단백질 유전자의 발현을 완전히 방지하는 것이다.

본 발명에 개시된 것과 같은 넉아웃 세포주 생산 시스템은 프리온 단백질의 발현을 완전히 방지하고, 감염성 프리온 단백질이 완전히 제거되고, 이 프리온-불포함 세포에서 생산된 재조합 의약품을 투여받는 환자에 대한 프리온 감염의 위험이 제거된 재조합 인간 단백질을 제공할 것이다.

진핵 세포에서 주어진 유전자의 발현을 특이적으로 방지하기 위해, 유전 공학 및 분자 생물학 기법을 이용한 여러 방법들이 개발되었다. 유전자 제거(genetic ablation)(당해 분야에서 전문가에 의해 이용되는 전문용어에서 통상적으로 "유전자 넉아웃(genetic knockout)"으로도 알려짐)는 특정한 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 제거를 의미한다. 이 제거의 결과, 결과물인 "넉아웃 세포(knockout cell)"는 넉아웃된 유전자를 전혀 발현할 수 없다. 대조적으로, "간섭 RNA(interference RNA, RNAi)" 기술은 DNA 서열을 제거하지 않으나, 대신에 안티센스 서열 또는 상보적 서열을 도입하여, 억제된 유전자의 번역을 방지한다. 대부분의 경우에, 결과물인 "넉-다운(knocked-down)" 유전자는 부분적으로만 억제되어, 일부 잔류 발현 수준을 허용한다.

인간 질환 모델로서 마우스의 광범위한 이용, 및 유전적 조작 및 배아 조작을 위해 용이하게 이용가능한 마우스 배아 줄기(murine ES) 세포의 조기 이용가능성 때문에, 넉아웃 기술은 주로 마우스 ES 세포에서 개발되었다(Joyner A. L., Oxford Univ. Press, UK 1993). 오늘날, 마우스에서 넉아웃 기술은 완전한 넉아웃("널 대립형질(null allele)") 및 조건부 돌연변이체(conditional mutant)를 가능하게 할 정도로 개발되었다. 표적화 돌연변이는 예를 들면, 마우스 사료에 테트 라사이클린을 보충하는 것에 의해 일시적으로 유도 또는 억제될 수 있다(tet-on, tet- off systems, Gossen, M, and Bujardf H. Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 5547- 5551 (1992)); 이는 세포-특이적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터에 의해, 또는 배아 발생 동안 차단되나 출생 후에 빠르게 활성화될 수 있는, 발생적으로 조절되는(developmentally regulated) 프로모터에 의해 구동될 수 있다.

넉아웃 ES 세포주의 생성은 항상 동일한 초기 단계를 요구한다: (1) 특정한 유전자를 넉아웃시키도록 특이적으로 설계된 표적화 구조물(targeting construct)의 생성; (2) 상기 구조물의 ES 세포로의 도입 및 (3) 원하는 유전자의 표적화된 결실을 갖는 세포의 선택 및 스크리닝.

표적화 구조물은 항상 선택 카세트와 넉아웃될 유전자에 대해 상동성을 갖는 상당한 영역을 포함해야 한다. 이 두 요소들은 원하는 유전자 좌(locus)에서만 통합(integration)을 달성하고 검출하기 위해 절대적으로 필요하다: 내인성 유전자에 대한 상동성을 갖는 영역이 두 개의 상동성 DNA 단편 간의 상동성 재조합을 유발하고, 선택 카세트는 통합된 구조물을 갖는 세포의 스크리닝을 가능하게 한다. ES 넉아웃 기술에서 가장 널리 이용되는 선택 카세트는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(neomycin phosphotransferase) 카세트("neo")로, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, pGK) 프로모터에 의해 구동되고(Soriano et al., Cell 64, 693-702 (1991)), 하류에서 폴리A 전사 종료 신호에 의해 플랭킹된 이 효소를 코딩하는 ORF로 구성된다. ES 세포로의 표적화 구조물의 도입 및 G418에 의한 선택 후에, 상기 구조물이 안정적으로 통합된 세포들만이 상기 항생제에 대해 내성 을 가질 것이다. 이 내성 세포들 중에서, 일부는 표적화 구조물이 내인성 본래의 서열을 치환한 세포들일 것이다. 그 후, 분리된 클론에서 표적화 이벤트가 게놈 PCR(genomic PCR) 또는 게놈 서던 블롯 분석(genomic Southern blot analysis)에 의해 스크리닝될 수 있다. 마우스 ES 세포에서, 표적화 구조물이 게놈의 원하는 영역으로 통합되는 빈도는 랜덤 통합의 빈도보다 훨씬 낮아서, 일반적으로 정확하게 표적화된 클론을 식별하기 전에 수백개의 항생제-내성 클론을 스크리닝해야 한다.

주어진 구조물의 표적화 빈도를 증가시키는 하나의 가능성은 두 파라미터 간에 선형적 관계가 있기 때문에, 상동성 영역의 길이를 증가시키는 것이다(Hasty et al., MoI Cell Biol. 1991 Nov; 11(11) : 5586-91 (1991)). 대안적으로, 선택 카세트의 효율적 발현을 위해 표적 유전자 좌의 요소의 이용에 의존하는 다수의 "트랩-방식(trap-approach)"이 개발되었다. 예를 들면, 프로모터 트랩 방식에서, 표적화 벡터는 내인성 표적 유전자의 전사 기구(transcriptional machinery)가 표적화 벡터에 클로닝된 선택 카세트의 발현을 구동시키는 방식으로 설계된다. 이 경우, 상기 벡터는 프로모터 활성을 갖지 않는 표적 유전자에 상동성인 영역을 포함하고, 따라서, 통합이 랜덤하게 일어난 클론의 대부분은 항생제에 의한 선택에서 생존할 수 없다. 통상적으로, 프로모터 트랩 선택은 표적화된 클론에 대해 100배의 농축(enrichment)을 달성한다.

RNAi 방법을 이용하여, 현재까지 PrP 유전자의 발현이 배양 중인 스크래피-감염된, 마우스 신경모세포에서 일시적으로 및 부분적으로 침묵되었다(Daude et al., J. Cell. ScL. 2003 Jul l; 116(Pt 13) : 2775-9 (2003)).

기능 상실(loss-of-funciton)의 기능적 결과 및 TSE와의 가능한 관계를 규명하기 위해 다양한 방식(표 1)을 이용하여 마우스 게놈에서 프리온 유전자의 유전적 표적화(genetic targeting)가 성공적으로 보고되었다.

표 1: 문헌으로부터 이용가능한 PrP 마우스 넉아웃(knockout) 데이터

"프리온 단백질-단독 이론(prion protein-only theory)"(Prusiner Nobel Lecture, Dec. 8, 1997)으로부터 예상되는 바와 같이, 불활성화된 유전자에 대해 동형접합인(즉, PrP 발현이 완전히 제거된) 마우스는 실제로 프리온 감염에 대해 내성을 갖는다. 그러나, 가장 두드러지게는, 전술된 PrP 넉아웃 마우스 모두는 생존가능하고 발생학적으로 정상이다. 비교적 경증의 신경학적 표현형(mild neurological phenotype)만이 Nagasaki, RcmO 및 Zurich II 넉아웃에서 규명되어(Rossi et al., EMBO J. 20, 4, 694-702, (2001)), PrP 유전자의 기능이 절대적으로 필수적인 것은 아니라는 것을 나타낸다. 대안적으로, 시사된 바와 같이, PrP 넉아웃 마우스의 CNS에서 상향조절되는, PrP에 대해 상당한 상동성 및 그의 16 Kb 하류의 맵핑을 보이는 유전자인 Dpl에 의한 기능성 유전자 보상(compensation)의 일부 메카니즘일 수 있다(Moore et al., J. MoI. Biol. 292, 797-817 (1999)).

전술된 넉아웃 기술은 체세포에 적용되는 경우, 두 개의 주요한 문제에 직면 했다. 첫째, 이 세포들에서 유전자를 넉아웃시키는 것은 파괴(disruption)의 기능성 결과에 대한 한정된 정보를 제공할 뿐이며, 이는 배양에서 넉아웃 세포의 표현형이 넉아웃 ES 세포로부터 유래된 마우스와 같은 돌연변이 개체에서 최종 효과를 반드시 반영하는 것은 아니기 때문이다. 둘째인, 보다 중요한 문제는 체세포에서 상동성 재조합의 표적화 빈도(targeting frequency)는 ES 세포에서보다 약 2배 정도 더 낮다는 것이다(Hanson and Sedivy, Mol. Cell Biol. 15(1) :45-51 (1995)). 체세포에서 효율적인 유전자 표적화의 경우, 프로모터-불포함 벡터를 이용한 프로모터 트랩 방식이 반드시 필수적이고(Sedivy and Dutriaux, Trends Genet. 15(3) :88-90 (1999)), 이는 그들이 통상적으로 100 내지 500 배의 농축을 달성할 수 있기 때문이다. 체세포로의 도입 및 항생제 선택 후에, 선택 카세트는 상동성 재조합 후, 표적 유전자의 프로모터로부터 발현될 수 있을 뿐이다. 유전자 표적화는 또한 영국의 Genetix로부터 이용가능한 ClonePix 기술에 의해 개선될 수 있다.

프리온 단백질 서열을 코딩하는 유전자가 삼배체 세포에서 하나 이상의 대립형질, 바람직하게는 두개의 대립형질 또는 세개의 대립형질이 불활성화된 체세포성 인간 세포주(somatic human cell line)(예를 들면, HEK293F 세포주로부터 유래된 세포주)가 수립될 수 있었다는 것이 확인되었다. 이는 프로모터-불포함(promoterless) 선택 마커를 갖는 넉아웃 벡터의 상동성 재조합 및 그 후, 게놈으로의 표적화된 통합이 내인성 PrP 프로모터에 의해 상기 선택 마커의 발현을 가능하게 하는 것에 의해 달성되었다. 그와 같은 결과물인 프리온-제거된 세포(prion-ablated cell)는 표적 단백질을 코딩하는 적합한 벡터에 의한 형질감 염(transfection) 후에 인간 표적 단백질의 재조합 생산에 적합하다. 적합한 단백질 정제와 바이러스 불활성화와 조합되면, 이 방법은 인간에서 치료적 용도를 위한 프리온 단백질을 포함하지 않는 안전하고 높은 활성을 갖는 재조합 인간 단백질을 제조하기 위한 효과적인 시스템을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 하기에 관한 것이다:

(1) 프리온 단백질(Prion Protein, PrP) 유전자의 두 대립형질이 완전히 결실된, PrP-불포함, 불멸화 체세포주(immortalized, somatic, cell line);

(2) 개별적인 출발 세포(starting cell)에서 PrP 넉아웃 구조물(knock-out construct)과의 상동성 재조합에 의해 PrP ORF의 두 대립형질의 후속 결실을 포함하는, 상기 (1)에 정의된 바와 같은 PrP 불포함, 불멸화 세포주를 제조하는 방법;

(3) 상기 (2)에 정의된 바와 같은 PrP 넉아웃 구조물;

(4) 인간 단백질 또는 그의 유도체 또는 그의 돌연변이체(이후, "표적 단백질(target protein)"이라 함)의 PrP-불포함 재조합 생산을 위한 상기 (1)에 정의된 바와 같은 PrP-불포함 불멸화 세포주의 용도;

(5) 복제 원점(origin of replication), 및 인간 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질감염(transfection) 벡터에 의해 상기 (1)에 정의된 바와 같은 PrP-불포함 불멸화 숙주 세포주를 형질감염시키고, 그에 의해, 상기 인간 표적 단백질에 대한 유전자가 그의 5' 말단에서 프로모터에 연결되고, 그의 3' 말단에서 폴리A 신호에 연결되는 것인 단계를 포함하는, 표적 단백질의 PrP-불포함 재조합 생산을 위한 세포주를 제조하는 방법;

(6) 상기 (5)에 정의된 바와 같은 형질감염 벡터로, 바람직하게는 무혈청 조건 하에, 안정적으로 형질감염된 PrP-불포함 불멸화 세포주; 및

(7) 상기 (6)에 정의된 바와 같은 PrP-불포함, 불멸화 인간 세포주를 배양하는 단계를 포함하는, 의약품으로 이용될 인간 표적 단백질의 PrP-불포함 재조합 생산 방법.

본 발명의 구체예 (7)의 방법은 인자 VII/a, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand factor, vWF) 및 Adamtsl3과 같은 응고 인자 및 G-CSF(granulocyte colony stimulating factor) 또는 GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor)와 같은 성장 인자를 포함한, 재조합 인간 단백질 및 치료용 항체의 프리온 단백질 오염 불포함 생산을 위해 특히 적합하다. 이 방법을 위해, 본 발명의 결실된(ablated) 프리온 단백질 서열을 갖는, 불멸화 인간 세포주, 예를 들면, HEK 293 세포주가 이용된다. 이 세포주는 자체의 프로모터 및 번역 개시부위를 포함하지 않는, 선택성(selectable) 마커 또는 선택(selection) 마커, 예를 들면, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 ORF를 포함하는 벡터에 의해 불멸화 인간 세포주를 형질감염시키는 것에 의해 수득될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 세포주는 HEK 293F 또는 Per.C6 세포(불멸화된 인간 태아 망막 세포)로부터 유래된 세포주와 같은, 인간 세포주이다. 다른 적합한 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary cell) 및 BHK(Baby Hamster Kidney cell) 세포이다.

발명의 상세한 설명

하기의 정의 및 약자가 본 출원에서 이용된다:

"BAC"는 세균 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)를 의미한다. "bp"는 염기쌍(base pair)을 의미한다. "G418" 및 "제오신(zeocin)"은 두 개의 상이한 선택 항생제이고; 그들을 선택 마커로 갖는 구조물로 안정적으로 형질감염된 세포들은 이 항생제들에 대해 내성을 갖게된다("G418^R" 또는 "제오신^R"). "상동성 재조합(homologous recombination)"은 두 개의 상동성 서열의 DNA 단편이 상호간에 재조합하는 메카니즘을 의미한다. "좌측 암(left arm)"은 엑손3의 바로 상류에 위치한 PrP 유전자의 인트론 영역을 의미한다. "우측 암(right arm)"은 PrP 유전자의 엑손3의 바로 하류에 위치한 영역을 의미한다. "Neo"는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(neomycin phosphotransferase) 유전자를 의미한다. "ORF"는 개방 해독 프레임(open reading frame)을 의미한다. "PCR"은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 의미한다. "PrP"는 프리온 유전자 또는 프리온 단백질을 의미한다. "HEK293F"는 특정한 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney cell line)를 의미한다.

따라서, 본 발명의 구체예 (1)은 프리온 단백질(Prion Protein, PrP) 유전자의 두 대립형질이 완전히 결실된, PrP-불포함, 불멸화 인간 체세포주(immortalized, somatic, human cell line)이다.

본 발명에 따라, 상기 세포주는 무혈청 조건 하에 형질감염되고 배양될 수 있다.

또한, 세포주가 그의 게놈 내에 아데노바이러스 서열의 통합에 의해 불멸화(immortal)된 것이 바람직하다. 세포주는 신장, 방광, 간, 폐, 심장근육, 평활근육, 난소 및 위장관 세포의 군으로부터 선택된 출발 세포(starting cell)로부터 유래될 수 있다. 출발 세포가 인간 태아 신장 세포와 같은, 인간 신장 세포주인 것이 바람직하다. 인간 태아 신장 세포(foetal human kidney cell)가 프리스타일(Freestyle) 293 (293F cell; Invitrogen R79007), HEK 293 (293 cell; ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), 또는 293T 세포(DSM ACC 2494), 바람직하게는 293F 세포 (Invitrogen R79007)인 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, PrP ORF는 선택성(selectable) 마커 또는 선택 마커를 갖는 넉아웃 트랩(knockout trap)과의 상동성 재조합에 의해 완전히 결실되어, 상기 선택성 마커 또는 선택 마커의 발현이 내인성(endogenous) PrP 프로모터에 의해 구동된다.

특정한 바람직한 구체예에서, 구체예 (1)의 프리온-불포함 세포주는 프리온-불포함 293F 세포주 pf293F이고, 이는 상기 최종 넉아웃 세포주 및 그로부터 유래된 변형들을 분리하기 위해 필요한, 모든 중간체 혼합 집단(intermediate mixed population)을 포함한다.

본 발명의 구체예 (2)의 방법에서, 넉아웃 구조물은 두 대립형질 모두에서 전체 PrP ORF를 결실시키기 위해 적합할 수 있다. 또한, 넉아웃 구조물은 출발 세포의 PrP 유전자 내의 삽입 부위에 상동성인 두개의 서열에 의해 플랭킹된 동일하거나 또는 상이한 프로모터-불포함(promoterless) 선택 마커 유전자를 가질 수 있다. 그러나, 넉아웃 구조물이 상이한 선택 마커 유전자 또는 선택성 마커를 갖는 것이 바람직하다. 넉아웃 구조물은 하기의 기능성 서열 중 하나를 더 가질 수 있다: 폴리 A 서열, 재조합효소 인식 서열(recombinase recognition sequence), IRES 등.

넉아웃 구조물의 상동성 서열은 1 내지 10 kb, 바람직하게는 약 6 kb의 길이를 가질 수 있고, 바람직하게는 출발 세포주의 PrP ORF의 상류 및 하류 서열과 일치한다. 상기 상동성 서열이 서열번호 2 및 서열번호 3에 표시된 서열인 것이 특히 바람직하다. 적합한 선택 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제, 제오신, 히그로마이신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양성 선택 마커(positive selection marker)를 코딩하고, 상기 선택성 마커는 GFP 및 Dsred와 같은 형광 마커 및 LacZ와 같은 효소를 포함한다.

넉아웃 구조물이 서열번호 1 및 서열번호 16에 표시된 서열 중 하나 이상을 갖는 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 HEK 293 세포 또는 HEK 293F 세포를 참조하여 더 설명된다. 본 발명의 그와 같은 세포주에서, PrP 유전자의 코딩 영역은 프로모터 트랩에 의해 완전히 결실된다. HEK 293F 세포에서 PrP 유전자의 코딩 영역을 결실시키기 위해 3개의 연속적인 단계들이 필요하다:

1. 하나의 대립형질 상의 PrP의 코딩영역을 네오마이신 선택 마커를 포함하는 PrP 넉아웃(이후, "K.O."로 지칭함) 구조물로 표적화하는 단계.

2. 단 하나의 표적화된 PrP 대립형질 및 하나의 야생형 PrP 대립형질을 갖는 클론을 식별하고 분리하는 단계. 이 단계는 집단의 75%에서 3개의 카피의 PrP 유전자를 갖고, 집단의 25%에서 2개의 카피를 갖는, 부모(parental) HEK 293F 세포의 유전적 이질성(genetic heterogeneity)때문에 필요하다.

3. 나머지 대립형질 상의 PrP의 코딩 영역을 제오신 선택 마커를 포함하는 제2의 PrP K.O. 구조물로 표적화하는 단계.

제1 PrP K.O. 구조물(네오마이신을 선택 마커로 가짐, 도 2)의 HEK293F 세포로의 안정적인 형질감염 후에, 여러 상이한 항생제 농도에서 G418^R 클론을 분리하고 표적화된 이벤트(targeted event)를 식별하는 PCR-기반 전략에 의해 스크리닝하였다(도 4, 도 6). 그 후, 하기를 평가하기 위해, 게놈 서던 블롯 분석에 의해, PrP-표적화 통합을 갖는 클론의 특성을 규명하였다:

(a) 표적화 구조물의 통합이 그의 5' 말단 및 3' 말단 모두에서 올바르게 일어났는지 여부

(b) 표적화된 PrP 대립형질의 갯수(한개, 두개 또는 세개), 및 온전한(intact) PrP 대립형질의 갯수(야생형: 한개 또는 두개).

제2 K.O 수행(round)에서, 제2 PrP K.O. 구조물(선택 마커로서 네오마이신 대신 제오신을 가짐)을 이용하여 하나의 대립형질은 네오마이신으로 표적화되었고, 제2 PrP 대립형질은 여전히 온전한 상태인 클론에서 나머지 PrP 대립형질을 넉아웃시켰다. 분리된 zeocin^R 클론의 PCR 스크리닝 및 게놈 서던 분석 후에, PrP mRNA의 결여를 입증하는 RT-PCR 분석 및 PrP 단백질의 완전한 부재를 보여주는 웨스턴 블롯 분석에 의해 PrP 유전자의 완전한 제거를 확인하였다.

그 후, 본 발명에서 개시된, 결과물인 완전한 PrP K.O. 세포주는 인간 재조합 단백질의 보장된 프리온-불포함 발현을 위해 이용될 수 있다.

형질감염, 항생제에 의한 선택, 클론 분리, 스크리닝 및 확장(expansion)의 전 과정 동안, 세포들은 무혈청 조건 하에서(예를 들면, 프리스타일 배지 또는 옥타파마(Octapharma) 자체 배지(in-house media)) 배양되었다. 최종 PrP K.O. 세포 클론의 수립 및 완전한 유전적 및 표현형적 특성 규명 후에, Research Cell Bank가 생성되었다(재료 및 방법의 6.1.에서 293F 세포의 세포 배양 방법 참조). 이하에서 "프리온-불포함 293F 세포주(prion-free 293F cell line)"로 명명된, 이 PrP K.O. 세포주는 그 후, 특허출원(이에 의해 그 개시 전체가 본 명세서에 포함된, 동시 계류중인 EP 05 105 965 참조)에 따른 무혈청 조건 하에 임의의 목적 유전자(gene of interest)(예를 들면, 인자 VIII, 인자 IX, G-CSF, vWF, GM-CSF, 인자 Vll/VIIa 또는 항체)에 의해 안정적으로 형질감염될 수 있다.

무혈청 배지에서 통상적으로 배양된 프리온-불포함 293F 세포 및 목적 유전자를 갖는 pcDNA3.1 구조물로 수행된 안정적인 형질감염으로부터 유래된 세포들이 클론 선택을 위한 적합한 항생제 및 형광을 통해 가장 높은 생산량의 클론(highest producer clone)의 검출을 위한 표지된 항체를 포함하는, 반고체의 메틸셀룰로오스-기반 배지에 접종된다. 그 후, 수백개의 최상의 생산자 클론만을 선별하기 위해 ClonePixFL(Genetix)을 이용하여 세포 수 및 분비된 재조합 단백질에 대해 다수(예를 들면, 수만개)의 클론들이 분석된다. 비-생산자 클론 및 혼합된 클론이 모두 랜덤하게 선별되는 다른 공지된 방법과 대조적으로, ClonePixFL은 최고의 생산자이고, 단일 세포로부터 유래되는 가장 빠르게 성장하는 클론의 동시 식별 및 선별을 가능하게 한다. 선별된 세포들은 완전한 절차를 위해 무혈청 조건 하에 마이크로-타이터 플레이트 및 이후에 스핀 튜브(spin tube), 세포 배양 플라스크 및 발효조(fermentor)에서 확장된다.

또한, 전체 안정적인 형질감염 절차가 무혈청 조건 하에서 생성된다. 추가적으로, 이후의 확장 및 세포 배양 절차 동안, 세포들은 혈청 또는 동물-유래 단백질과 접촉을 갖지 않는다.

확장 동안, 강건성(robustness), 높은 성장률, 생존력(viability), 확장성(scalability), ELISA에 의해 측정된 활성 재조합 단백질(f.e. active recombinant protein)의 생산에 대해 최상의 클론이 선별된다. 이 선택 동안, 그 숫자는 다시 수개의 최상의 생산 클론으로 감소된다. 생산성 외에, 정확한 cDNA 서열, mRNA 함량, 및 발효 동안 세포 거동(cell behavior)이 서브클로닝(subcloning)을 위한 최상의 클론을 식별하는 기준이다. 이를 위해, 선택된 클론의 세포들이 재-플레이팅되고, ClonePixFL로 분석되고 선별되며, 그 후 전술된 바와 같이 확장되고 선택된다. 서브클로닝은 클론의 플레이팅된 서브집단에서 가능한 유전적 변이를 제거하고, 최상의 생산자 클론만을 선택하기 위한 필수적인 단계이다. 서브클로닝 후에, 선택된 클론들이 다시 무혈청 조건 하에 보관(bank)된다. 최종 선택된 서브클론에 의해 발현되는 재조합 인간 단백질이 생화학적으로 보다 상세하게 특성이 규명된다.

또한, PrP 유전자가 완전히 넉아웃된 클론을 검출하는 형광 표지된 항체에 의한 ClonePixFL을 이용하여 반고체 배지에서 K.O. 클론이 분리될 수 있다.

도 1: 인간 PrP 유전자를 제거하기 위한 프로모터 트랩 전략

도 2: 1. PrP K.O. 구조물 pBS_Neo_P^-_R+L_Arm_2B

도 3: 구조물 pBS_Neo_P^-_L+R_Arm_2B를 생성하기 위한 클로닝 전략. pBluescript 벡터 내로 클로닝된 영역의 서열, i) 자체 프로모터 및 ATG를 포함하지 않는 네오마이신 유전자, ii) 상동성 재조합을 위한 좌측 암(left arm for homologous recombination), iii) 상동성 재조합을 위한 우측 암.

도 4: G418 선택 후, PCR-기반 스크리닝 전략.

도 5: 표적화 구조물(targeting construct) pBS_Neo-_P^-_L+R_Arm_2B의 안정한 통합 후 클론의 특성을 규명하는(characterize) 게놈 서던 전략(genome southern strategy).

도 6: 표적화 구조물 pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B의 통합 후 게놈 PCR 스크리닝. DNA 마커: GeneRuler DNA Ladder Mix; 양성 대조군: 표적화된 PrP 세포 혼합 집단으로부터의 게놈 DNA. Al-8 및 Bl-8은 Clone-PixFL에 의해 선별된 세포 클론이다. 녹색 원으로 표지된 클론은 2,3 kb 밴드 때문에 PCR 양성 클론으로 확인되었다.

도 7: 제1 K.O. 구조물 pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B의 표적화된 통합 후 PrP K.O. 세포의 서던 분석: 하기를 이용하였다: DNA 마커: GeneRuler DNA Ladder Mix; WT: 293F 야생형: K.O.: 제1 K.O. 구조물 pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B의 표적화된 통합 후 확인된 K.O. 클론. K.O. 클론 및 293F WT 세포로부터의 게놈 DNA를 5'-프로브, 3'-프로브 및 Neo-프로브와 혼성화시켰다. 예상되는 바와 같이, WT 293F 세포는 5'-프로브 및 3'-프로브에 의해 10,8 kb WT 밴드를 보여주나, Neo-프로브에 의한 신호는 없었다. K.O. 클론의 경우, 3'-프로브에 의한 4,2 kb 밴드 및 3'-프로브에 의한 6,5 kb 밴드가 검출되었으나, 추가적으로, Neo-프로브에 의해 6,5 kb 밴드가 검출되었다.

도 8: 하나의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 PrP K.O. 세포의 FISH 분석: 패턴 a: chr20 및 Bac의 두 개의 신호; 패턴 b: chr20 및 Bac의 3개의 신호; 패턴 c: chr20의 3개의 신호, 그러나, 단 2개의 Bac 신호.

도 9: 하나의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 PrP K.O. 세포 및 293F 세포의 ELISA 분석: 하나의 PrP 표적화된 대립형질을 갖는 2개의 K.O. 세포주(K.O. 1 및 K.O. 6)를 분석하고 야생형 293F 세포와 비교하였다.

도 10: 2. PrP K.O. 구조물 pBS_Zeo_P^-_R+L_Arm.

도 11: 두 개의 PrP K.O. 통합을 갖는 세포 클론 또는 혼합된 세포 집단의 PCR 스크리닝: 겔에서 하기를 이용하였다: DNA 마커: GeneRuler DNA Ladder Mix; 양성 대조군: 표적화된 PrP 세포 혼합 집단으로부터의 게놈 DNA. T3-1은 제오신(zeocin)에 의해 선택된 혼합된 세포 집단이다. T3-2은 제오신 및 G418로 선택된 혼합된 세포 집단이다. 두 혼합된 세포 집단 모두 양성으로 확인되었다.

도 12: 표적화 구조물 pBS_Neo-_P-_L+R_Arm_의 안정적인 통합 후 클론의 특성을 규명하기 위한 게놈 서던 전략.

도 13: 하나의 PrP 표적화 대립형질에 의한 PrP KO 세포의 형질감염 효율. 동일한 양의 세포를 발현 플라스미드로 형질감염시키고 형질감염 효율을 비교하였다.

도 14: 하나의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 PrP K.O. 세포에서 FVIII (도 14a), FIX (도 14b) 및 G-CSFb (도 14c)의 발현. 293F 야생형 세포 대비, 10E6 세포당 FVIII, FIX 및 G-CSFb의 임의 단위(arbitrary unit)의 발현.

재료 및 방법

1. 분자 생물 기법을 위해 이용된 장치

2. 분자 생물 기법용 시약 및 키트

3. 세균 배양 배지

LB 배지: 1l의 H₂O에 트립톤 10 g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g을 용해시킨 후 가압증기멸균(autoclave)함.

LB/amp 아가 플레이트: lOO㎍/ml의 암피실린을 포함하는 LB 배지에 1.5% 아가를 첨가함.

4. 293/293F 세포 배양을 위한 재료

4.1. 세포주

293 세포주: 293 세포주는 혈청의 존재 하에 부착성으로(adherently) 증식하는 영구 세포(permanent cell)이다. 293 세포주는 절단된(sheared) 인간 아데노바이러스 타입 5 DNA에 의해 형질전환된 일차 배아 인간 신장(primary embryonic human kidney)으로부터 수립되었다(Graham et al., 1977; Harrison et al., 1977). ElA 아데노바이러스 유전자가 이 세포들에서 발현되고 일부 바이러스 프로모터의 트랜스활성화(transactivation)에 참여하여, 이 세포들이 매우 높은 수준의 단백질을 생성할 수 있게 한다.

293F 세포주: 프리스타일(Freestyle) 293F 세포주는 프리스타일 293 발현 배지에서 현탁 성장(suspension growth)에 적응된 293 세포주의 변이체이다. 본래의 세포주는 1988년에 Pharmacopeia의 Robert Horlick으로부터 수득되었다. 프리스타일 293 세포주는 293 세포주로부터 유래되고 Invitrogen으로부터 구입가능한 프리 스타일 293 발현 시스템(Invitrogen Catalog no. K9000-01) 또는 옥타파마 자체 배지와 같은 다른 무혈청 배지와 함께 이용되도록 의도된다. 프리스타일 293F 세포는 프리스타일 293 발현 배지에서의 현탁 배양에 적응된다. 프리스타일 293 세포주는 하기의 특징을 보인다:

- 한정적인 희석(limiting dilution)에 의해 재-클로닝된 부모 293F 세포로부터 유래된 낮은 계대 매스터 세포 은행(low passage Master Cell Bank) 배양물로부터 제조된다. 293F 클론 유래 배양물은 총 30 내지 35의 계대 동안만 무혈청 조건에서 유지된다.

- 고밀도, 무혈청, 현탁 성장에 적응되었다: 프리스타일 293 발현 배지에서 유지될 수 있다.

- 293fectin에 의한 높은 형질감염 효율

- 현탁 배양물은 배지 교체의 필요 없이 프리스타일 293 발현 배지에서 형질감염될 수 있다.

- 대량으로 세포의 형질감염을 허용한다.

4.2. 293/293F 세포 배양을 위한 장치

4.5. 293F 세포를 위한 개시(initiation) 및 표준 배양 배지

프리스타일293 배지, 첨가제 불포함.

프리스타일 293 발현 배지는 프리스타일 293F 세포를 성장, 유지, 및 형질감염시킬 수 있게 한다. Invitrogen으로부터 입수가능한 프리스타일 293 발현 배지는 293 세포의 고밀도, 현탁 배양 및 형질감염을 위해 특별히 개발된 제한, 무혈청 제제(defined, serum-freem formulation)이다. 상기 배지는 인간 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않고 안정성을 증가시키고 보관 수명(shelf life)을 최대화하기 위해 Glutamax-I과 함께 제제화된다.

4.6. 293F 세포를 위한 동결 배지

프리스타일 293 배지 + 10% DMSO

5. 분자 생물학 방법

5.1 PCR 및 서던 분석을 위한 QIAGEN DNAeasy Blood & Tissue 키트(cat No. 69504) 또는 Gentra 세포 키트(QIAGEN Cat No. 158767)에 의한 세포 펠렛으로부터의 게놈 DNA의 분리.

5.2 PCR 분석을 위한 96-웰 플레이트로부터 게놈 DNA의 분리:

- 세포를 PBS로 2회 세정하였다.

- 50㎕의 용해 완충액(lysis buffer)(0,6ml 프로테이나아제 K가 12ml의 용해 완충액[1OmM Tris, lOmg EDTA, 1OmM NaCl, 0,5% 사르코실]에 첨가되어야 함)을 하기의 표에 따라 각 웰에 첨가하였다.

- 상기 플레이트를 50℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이 때, 상기 플레이트는 파라필름(Parafilm)으로 뒤덮여야 한다.

- 2500rpm 에서 1분동안 스핀 다운시켰다(spin down). lOO㎕의 NaCl/ETOH (150㎕의 5M NaCl을 10ml의 차가운 무수 에탄올(absolute ethanol)에 첨가함)을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 핵산은 사상형 네트워크(filamentous network)로 침전되었다.

- 2500 rpm으로 1분 동안 스핀 다운시키고, 용액을 제거하기 위해 플레이트를 조심스럽게 뒤집었다(invert); 핵산은 상기 플레이트에 부착된 상태로 남는다. 과량의 액체를 종이 타월 상에 흡수시켰다(blot).

- 멀티-채널 피펫을 이용하여 웰당 lOO㎕의 80% 에탄올을 떨어뜨리는 것에 의해 핵산을 3회 세정하였다. 각 세척 단계 동안 상기 프레이트를 30분동안 진탕시켰다. 2500rpm에서 1분동안 스핀 다운하고 매회 각 플레이트를 뒤집는 것에 의해 알코올을 조심스럽게 제거하였다.

- 50 ㎕의 TE에 게놈 DNA를 용해시키고 파라필름으로 덮었다. 완전한 용해를 위해 상기 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 밤새 방치하거나 또는 1-2 시간 동안 50℃에서 방치하였다. .

- 게놈 DNA를 포함하는 플레이트를 사용을 위해 4℃에 또는 보관을 위해 -20℃에 보관했다.

6. 리포펙타민(Lipofectamin) 2000CD에 의한 세포의 형질감염:

시작 전에, 세포들이 건강하고 >90% 생존가능한지 여부를 확인했다.

1. 형질감염 전날에, 항생제를 포함하지 않는 성장 배지 중 0.8-1.1x1O⁶ 세포/ml의 세포 밀도를 갖는 현탁 배양액을 준비했다.

2. 형질감염 당일에 1.1x1O⁶ 생존 세포/ml의 현탁 배양물을 준비했다.

3. 각 형질감염을 위해, 성장 배지 중에 보충물로 Al-부미나티 브(buminative)의 존재 또는 부재 하에 형질감염된 세포 1 ml 당 하기의 시약의 양 및 부피를 이용하여 복합체를 제조하였다:

- 0.5-1.5㎍ DNA를 34㎕의 OptiMEM™ SFM 또는 OptiPRO™ SFM에 희석시켰다.

- l-10㎕의 Lipofectamin™ 2000 CD를 34㎕의 OptiMEM™ SFM 또는 OptiPro™ SFM에 희석시켰다.

4. 상기 복합물(complex)을 세포 및 배지를 담은 플라스크/플레이트에 첨가했다.

5. 상기 세포를 37℃에서 플레이트 상에서 또는 CO₂ 인큐베이터에서 24-96 시간 동안 125 rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 현탁 배양으로 인큐베이션시켰다.

6.3. 형질감염의 선택, 배양물의 확장, 96-웰 프레이트 상으로의 세포 접종 및 ClonePixFL에 의한 클론 선별의 준비:

1. 형질감염 후에, 선택을 위해 항생제인 제오신 또는 G418을 형질감염된 배양물에 첨가하였다.

2. 선택 후에, 게놈 DNA의 분리를 위해 항생제-내성 세포들을 회수하고 PCR 분석에 의해 스크리닝하였다.

3. 양성 PCR 스크리닝 결과를 갖는 배양물을 5xlO⁵ 세포/ml에 도달할 때까지 확장시켰다.

4. 상기 세포를 성장 배지를 담은 96웰 플레이트에 1000개의 세포/웰로 접종하였다.

5. 세포 밀도가 50%에 도달한 경우, PCR 및 세포 동결(cell freezing)을 위한 레플리카 플레이트(replica plate)를 제조하였다.

6. 80% 세포 밀도에 도달된 경우, PCR 스크리닝을 위해 플레이트를 준비시켰다.

7. PCR 양성 세포를 모으고(pool), 96-웰 플레이트에서 웰 당 200 내지 250개의 세포를 다시 접종하였다; 또는 별도로 PCR 양성 세포를 확장시키고 96-웰 플레이트에 200 내지 250개의 세포/웰로 접종하였다.

8. 세포 밀도가 50%에 도달한 경우, PCR 및 세포 동결을 위한 레플리카 플레이트를 제조하였다.

9. 80% 세포 밀도에 도달된 경우, PCR 스크리닝을 위해 플레이트를 준비시켰다.

10. 접종 테스트(seeding test)를 위해 PCR 양성 세포를 5xl0⁵ 세포/ml까지 확장시켰다.

11. 다른 콜로니를 접촉하지 않으면서, ClonePixFL에 의해 용이하게 단일 콜로니들이 선별될 수 있게 하기 위한 최적의 세포 밀도를 파악하기 위해, 반-고체 배지(Semi-Solid-Medium)에 상기 세포들을 상이한 밀도로 접종하였다.

12. ClonePixFL로 단일 세포 콜로니들을 선별하였다.

13. 96-웰 플레이트에서 선별된 콜로니들을 동기화시키고 확장시키고, 동결 및 PCR 분석을 위해 세포로부터 레플리카를 준비하였다.

7. FISH 분석: 293F 세포 및 pf293F 세포에서 염색체 20(chromosome 20)의 갯수 결정:

시작 전에, 세포들이 건강하고 >85% 생존가능하다는 것을 확인하였다.

1. 5-10ml의 성장 배지 중 l-3xl0⁶ 세포의 세포 밀도를 갖는 현탁 배양액을 준비하였다.

2. 배지에 0,2㎍/ml Colcemid를 첨가하고 30분 내지 1시간 동안 125 rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기에서 인큐베이션시켰다.

3. 1100 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포들을 회수하였다.

4. 상층액을 500㎕만 남기고 제거하고 펠렛(pellet)을 재현탁시켰다.

5. 실온에서 5-10ml의 75mM KCl 중에서 8-10분간 인큐베이션시켰다. KCl 용액의 최초 1 ml는 상기 세포들에 소량씩 점적되어야 했다(drop wise).

6. 2-3ml의 고정액(fixative solution)을 첨가하고 1100 rpm에서 10분간 원심분리하였다.

7. 세포 펠렛을 소형 마이크로퓨지 바이알(microfuge vial)로 옮기고 이 바이알에서 모든 후속 고정액 세척(fixative wash)을 수행하였다. 세포들을 완전히 재현탁시키는 것이 중요하다.

8. 세포들을 고정액으로 3-6회 세척하고, 각 세척 단계 후에, 세포들을 마이크로퓨지에서 6000rpm으로 1분간 원심분리시켰다.

9. 슬라이드는 실온이어야 하며, 슬라이드의 표면에 습기를 공급하기 위해 슬라이드를 2-3초 동안 고온 증기를 통해 통과시켰다(75-80℃의 수조)

10. 슬라이드 상에 10-30㎕의 세포 현탁액을 적용하고, 상기 액체가 건조되지 않게 하였다.

11. 표면이 흐릿하게(grainy) 된 후, 상기 슬라이드를 다시 1-2초 동안 고온의 증기를 통해 통과시켰다.

12. 그 표면 상에 온도 구배를 갖는 금속 플레이트 상에서 즉시 건조시켰다.

13. 슬라이드를 실온에서 2-3일 동안 인큐베이션시키거나 또는 65℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.

14. 슬라이드를 2XSSC, pH 7.0에 2분 동안 침지시켰다.

15. 상기 슬라이드를 일련의 농도의 에탄올(70%, 85% 및 100%)에서 각각 2분 동안 탈수시켰다.

16. 프로브(Chromosome painting probe, Cytocell/Aquarius, LPP20G)를 -20℃로부터 꺼내어 실온까지 가온되게 하였다.

17. 반복적인 피펫팅 혼합에 의해 프로브 용액이 균일해지게 하였다.

18. 5-10㎕의 프로브를 취하여 슬라이드 상에 적용하고, 24x24mm 유리 커버 슬립으로 덮고 고무 용액 접착제 또는 투명 메니큐어(nail polish)로 밀봉하였다.

19. 75℃ (+/- 1℃)에서 2분동안 변성시키고 37℃(+/- 1℃)에서 밤새 혼성화 시켰다.

20. 커버 슬립 및 접착제의 모든 잔류물을 조심스럽게 제거하였다.

21. 슬라이드를 72℃(+/- 1℃)에서 0.4XSSC (pH 7.0)로 2분 동안 세척하였다.

22. 슬라이드를 배수시키고 실온에서 2XSSC, 0.005% Tween 20(pH 7.0)으로 30초 동안 세척하였다.

23. 슬라이드를 배수키시고 lO㎕의 DAPI 안티페이드(antifade)를 적용하였다.

24. 커버 슬립으로 덮고 암소에서 10분간 발색시켰다.

25. 형광 현미경으로 관찰하였다.

8. 면역염색: 293F 세포 및 pf293F 세포의 세포 표면 상에서 PrP 단백질의 양 분석:

시작 전에, 세포들이 건강하고 >85% 생존가능하다는 것을 확인하였다.

1. 웰(lμ Slide, Ibidi) 당 30-100㎕ 성장 배지 중의 1-3 xl0⁵ 세포를 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.

2. 세포가 잘 성장하고 부착되면, 염색을 개시했다.

3. 조심스럽게 배양 배지를 흡인하고 진탕하지 않으면서, 조심스럽게 PBS로 세포들을 세정하였다.

4. 빙냉(ice-cold) 고정액(50% 에탄올, 50% 메탄올)을 실온에서 1분 동안 첨가하였다.

5. 즉시 세포들을 PBS로 5분 동안 2회 세척하였다.

6. 세포들을 8% BSA/PBS로 덮고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 세포들의 자연건조(air-drying)를 방지하기 위해 밀봉된 습기 챔버(sealed humidity chamber)에서 인큐베이션을 수행하였다.

7. 세포들을 5분 동안 1xPBS로 2회 세척하였다.

8. 과량의 PBS를 서서히(gently) 제거하고 세포를 1% BSA/PBS에 희석된 일차 항체(3F4, POM12, POM17, SAF32, SAF32FITC, 6H4)로 뒤덮고 실온에서 1-2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 조직 절편의 자연 건조를 방지하기 위해 밀봉된 습기 챔버에서 인큐베이션을 수행하였다.

9. 세포들을 5분동안 PBS로 2회 세척하였다.

10. 과량의 PBS를 서서히 제거하고 1% BSA/PBS에 희석된 이차 항체(염소 항-마우스-FITC)로 뒤덮고 실온에서 1-2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 조직 절편의 자연 건조를 방지하기 위해 밀봉된 습기 챔버에서 인큐베이션을 수행하였다.

11. 세포들을 암소에서 5분 동안 PBS로 3회 세척하였다.

12. Dapi-안티-페이드를 슬라이드에 첨가하고, 커버 슬립을 덮고, 형광 현미경 하에서 표본을 검사하였다.

9. ELISA 분석: 하나 또는 두 개의 PrP 대립형질을 포함하는 293F 세포 및 pf293F 세포에서 PrP 단백질 수준의 정량:

1. 2xlO⁷ 세포를 수집하고 800 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다.

2. 배지를 제거하였다.

3. 세포 펠렛을 5 ml의 차가운 PBS로 세척하였다.

4. 세포들을 800 rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다.

5. PBS를 제거하였다.

6. 세포 펠렛을 1 ml의 차가운 PBS로 세척하고 6000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS를 제거하였다.

7. 세포 펠렛을 직접 용해시키거나 또는 보관을 위해 -80℃에서 동결시켰다.

8. 1000 ㎕의 차가운 용해 완충액(lysis buffer)을 상기 세포 펠렛에 첨가하였다.

9. 용해물(lysate)을 20, 23 및 26 게이지의 주사 바늘을 통해 통과시켰다.

10. 브래드포드 분석법(Bradford Assay)에 의해 세포 용해액의 단백질 농도를 측정하였다.

실시예 1: 네오마이신을 함유한 PrP K.O. 구조물 pBS_Neo_P^-_R+L_Arm_2B (서열번호 1)에 의한 제1차 넉 아웃의 상세한 설명.

A. 표적화(targeting) 전략: 프로모터 트랩에 의해 인간 HEK 293 세포 또는 HEK 293F 세포에서 PrP 발현을 완전히 제거시켰다. 이 전략(도 1에 요약됨)은 PrP 유전자의 ORF가 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 ORF(PrP 유전자에 속하는, 번역 개시 코돈 제외)에 의해 치환된 것인 세포들을 특이적으로 선택하도록 설계되었다.

플라스미드 구조물 2B(도 2에 도시됨)는 4개의 주요 성분으로 구성된다: 1. 벡터 백본(상기 도면에 도시되지 않음): pBluescript, 2. 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자의 번역 개시 코돈 및 뒤이은 전사 종료 신호를 제외한, 이 유전자에 대한 완전한 ORF로 구성된, "네오(neo)"(= 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제) 절단(truncated) 카세트(서열번호 1 참조). 중요한 이슈: 이 neo 절단 카세트는 그 자체의 프로모터를 갖지 않는다. neo ORF는 PrP 유전자에 속하는 개시 ATG 코돈으로부터 번역되도록 설계되었다. 3. E2와 E3 사이에 위치한 PrP 인트론과 동일한 서열을 갖는, 네오의 상류인 "좌측 암(left arm)" 영역(서열번호 2 참조). 4. PrP ORF의 하류에 위치한 PrP 영역와 동일한 서열을 갖는, 네오의 하류인 "우측 암(right arm)" 영역(서열번호 3 참조).

(a) 이 구조물의 숙주 293F 세포로의 형질감염, (b) 뒤이은 그들의 게놈으로의 통합 및 (c) G418에 의한 선택 후, 이 방식의 목표는 상동성 재조합(도 1에서 두 개의 흑색 "X"로 상징됨)이 PrP 전사 및 번역 조절 서열(P, E1, E2)의 하류에 네오 ORF의 통합을 가져온 것인 세포들의 비율을 높이는 것이었다(enrich).

상기 구조물이 기능성 프로모터의 하류에 통합된 것인 형질감염된 세포들만이 G418 선택에서 생존할 것이다. 따라서, 모든 생존 세포들은 기능성 프로모터로부터 하류에 통합을 가질 것으로 기대된다(따라서, "프로모터 트랩(promoter trap)"). PrP 유전자에 대한 상기 구조물 암의 긴 상동성(총 ~6 kb 상동성 서열) 때문에, 상동성 재조합은 이 통합을 PrP 유전자 좌(locus)로 특이적으로 표적화시켜서, 도 1의 제3열에 도시된 통합을 가져올 것으로 예상되었다.

B: 표적화 PrP K.O. 구조물(pBS Neo P ^- R+L Arm 2B)의 생성: 표적화 구조물의 생성은 3개의 연속적인 클로닝 단계들로 구성되고(도 3), 각각은 하기를 포함했다: "삽입물(insert)"을 생성하기 위한 PCR 증폭 단계, 그와 같은 삽입물의 벡터로의 라이게이션(ligation) 단계, 및 라이게이션 혼합물의 대장균으로의 형질전환 및 제한효소 처리에 의한 올바른 클론의 선택.

1. pBS_Neo_P-_2B 구조물의 생성: EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위(밑줄로 표시됨)를 갖는, 하기의 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하고 pcDNA3.1+ 벡터(Invitrogen)를 주형으로 이용한 PCR에 의해 네오(neo) ORF를 증폭시켰다:

2B-Neo-F: 5'-GGCAAGAATTC GCAG AGCAGTCATT ATG ATTGAACAAGATGGATTGCAC-GCAG-3'

(서열번호 4)

2B-Neo-R: 5'-GGACCGCTCGAG-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT-3' (서열번호 5). 증폭된 산물(1244 bp)을 EcoRI 및 XhoI으로 처리하고 EcoRI/XhoI-처리된 pBluescript II KS+ (Stratagene)에 라이게이션시켰다. 그 후, 라이게이션 혼합물을 One shot Top1OF' 적격 세포(competent cell)(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 개별적인 콜로 니로부터 준비된 플라스미드 DNA의 EcoRI/XhoI 제한효소 처리에 의해 스크리닝을 수행하였다.

2. pBS_Neo_P-_L_Arm_2B 구조물의 생성: BAC DNA 클론 186(BACPAC Resources Center, BPCR, http://bacpac.chori.org/)을 주형으로 이용하고 각각 NotI 및 EcoRI 제한효소 인식부위(밑줄로 표시됨)를 갖는 하기의 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 표적화 구조물의 좌측 암을 증폭시켰다:

2B-L-F: 5'- GGCAAGCGGCCGC-CTCTGTCTAGGAACACTGCTGTG-3' (서열번호 6)

2B-L-R: 5'- GGCAAGAATTC-AAAATGAAGAGGAGAACGTCAGAGTC-B' (서열번호 7). 증폭된 산물(1929 bp)을 EcoRI 및 NotI으로 처리하고 EcoRI/NotI-처리된 pBS_Neo_P-_2B에 라이게이션시켰다. 그 후, 라이게이션 혼합물을 One shot Top1OF' 적격 세포(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 개별적인 콜로니로부터 준비된 플라스미드 DNA의 EcoRI/XhoI 제한효소 처리에 의해 스크리닝을 수행하였다.

3. pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B 구조물의 생성: 상기 B.2에서와 동일한 BAC DNA 클론 186을 주형으로 하고, 각각 XhoI 및 KpnI 부위(밑줄로 표시됨)를 갖는 하기의 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 표적화 구조물의 우측 암을 증폭시켰다:

2B-R-F: 5'- GGACCGCTCGAG-TGTGTACCGAGAACTGGGGTGATG-3' (서열번호 8)

2B-R-R: 5'- GGCGGGGTACC-GCAGAATCTCTGAGCTCACCTCAG-3' (서열번호 9).

증폭된 산물(4.6 Kb)을 XhoI 및 KpnI으로 처리하고 XhoI/KpnI-처리된 pBS_Neo_P-_L_Arm_2B에 라이게이션시켰다. 그 후, 결과물인 라이게이션 혼합물을 SURE 2 수퍼적격(supercompetent) 세포(Stratagene)에 형질전환시켰다. 개별적인 콜로니로부터 준비된 플라스미드 DNA의 XhoI/KpnI 제한효소 처리에 의해 스크리닝을 수행하였다. 결과물인 구조물, pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B(클로닝된 영역의 서열은 서열번호 1로 표시됨)에서, 네오 ORF(프로모터 서열을 갖지 않으며 자체의 번역 개시 코돈을 갖지 않는 선택 카세트)는:

- 상류는 인간 게놈에서 PrP 유전자의 엑손3에 선행하는 인트론 영역에 의해 플랭킹되고; 및

- 하류는 인간 게놈에서 PrP ORF에 이어지는 PrP 영역에 의해 플랭킹되었다.

4. pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B 구조물의 선형화(linearization): KpnI에 의한 제한효소 처리에 의해 상기 표적화 구조물을 선형화시키고, QIA quick gel extraction 키트(분자 생물학 방법, 5.2 참조)를 이용하여 정제하고, 5 ㎕의 SmartLadder 마커(Eurogentec)와 함께 0.8% 아가로오스 겔 상에서 1 ㎕ 분량을 전개시키는 것에 의해 정량하였다.

C. pBS Neo P- R+L Arm 2B 구조물의 인간 세포로의 도입: 리포펙타민 2000CD 시약(Invitrogen, 형질감염 방법, 6.2 참조)을 이용하여 숙주 세포(293F, Invitrogen)로 표적화 구조물 pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B를 도입하였다. 형질감염 48시 간 후에, 세포들을 10 cm 디쉬에 1.25 내지 1.5 x 10⁶ 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 30 내지 120 ㎍ G418/ml 범위의 농도로 접종시 항생제에 의한 선택(antibiotic selection)을 개시하였다. 14-21일 동안 2/3일 단위로 배지 교환을 수행하였다.

D. 표적화된 클론의 스크리닝: 항생제 선택 하에서 세포들이 합류점(confluent)에 도달했을 때, QIA DNAeasy tissue 키트(분자 생물학 방법, 5.3 참조)를 이용하여 1 x 10⁶ - 1 x 10⁷ G418^R 세포로부터, 또는 96-웰 플레이트 상에 플레이팅된 ES세포로부터 게놈 DNA를 분리하기 위해 개발된 전술된 방법을 이용하여(Ramirez-Solis et al.,1992) 게놈 DNA를 분리하였다. 각각의 게놈 DNA 분리물(preparation)로부터, 80-300 ng 게놈 DNA, 1x PCR 완충액, 200 nM의 각 올리고뉴클레오티드 프라이머, 5 mM MgCl₂, 200 nM dNTP 및 1,33 유닛의 Expand Fidelity Polymerase (Roche)를 포함하는 PCR 믹스(mix)를 준비하였다. 스크리닝을 위해 사용된 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같았다:

K.O.-Fl: 5' CGACTCAGTGTCATTCCCTGCAGTCTC 3' (서열번호 10)

K.O.-Rl: 5' CATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAG 3' (서열번호 11)

사이클 파라미터는 하기와 같았다: 94℃ 2 분; [94℃, 15초; 71,6℃, 30초; 72℃ 100초] x l6회의 사이클; [94℃, 15초; 71,6℃, 30초; 72℃ 100초 + 각각의 연속된 사이클에서 3초씩 연장] x 26회의 사이클; 72℃ 7분. 2.3 kb PCR 산물을 생성하는 게놈 DNA 시료는 세포 집단 내에 하나 또는 수개의 표적화된 대립형질의 존재를 나타낸다. 표적화된 클론을 서던-블롯(Southern-blot) 분석에 의해 더 분석하였다.

E. 하나의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 표적화된 클론의 특성 규명:

1. 게놈 PCR 스크리닝(도 4): 상기 D에 기재된 바와 같이, 혼합된 세포 집단 또는 분리된 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 모든 PrP K.O. 스크리닝 PCR 반응은 양성 대조군 및 음성 대조군과 함께 수행하였다. 양성 대조군을 위한 주형은 표적화된 PrP 대립형질이 PrP K.O. PCR 스크리닝 방법에 의해 이전에 검출되었던 세포 집단 혼합물(cell population mix)로부터 수득된 200 ng의 게놈 DNA였다; 음성 대조군은 주형으로 게놈 DNA 대신 물을 사용하였다. 전기영동 후 아가로오스 겔 상에서 2.2 kb PCR 산물의 존재는 상응하는 세포 콜로니가 하나 이상의 표적화된 PrP 세포 대립형질을 갖는다는 것을 나타낸다. 이 방법으로, ClonePixFL에 의해 선별된 클론을 분석하고 결과를 도 6에 표시하였다.

2. 게놈 서던 분석(도 7): 전술된 바와 같은 게놈 PCR에 의해 확인된 PrP-표적화 293F 세포 클론을 서던 블롯 분석에 의해 유전학적으로 그 특성을 더 규명하였다. EcoRI-처리 게놈 DNA의 전기영동에 의한 분리 및 Hybond+ 막으로의 모세관 이동(capillary transfer) 후에, 네오 ORF의 정확하고 온전한 통합을 확인하기 위해, 블롯을 특별하게 설계된 DNA 프로브(도 5에서 적색 화살표로 표시됨)와 방사성으로 검출되도록(radioactively) 혼성화시켰다. 5'-프로브 및 3'-프로브는 예상되 는 통합 부위의 5'- 및 3'-외부 영역(external region)에 상동성을 갖는다. 네오-프로브는 K.O. 구조물이 표적 유전자 좌(locus)에 통합되는지 또는 랜덤하게 통합되는지 여부를 확인하기 위해 이용되었다. 본 실시예의 섹션 B.2에 기재된 BAC DNA 클론 186을 이용한 PCR 증폭에 의해 5'-프로브 및 3'-프로브를 생성하였다. 네오-프로브는 하기의 표에 요약된, 네오마이신 카세트를 포함하는 플라스미드 pcDNA3.1(+)로부터 증폭되었다:

구조물 pBS_Neo-_P-_L+R_Arm_2B에 의한 게놈 서던 전략이 도 5에 도시된다. EcoRI에 의한 게놈 처리 및 방사성 프로브와의 혼성화(radioactive hybridization) 후에, 표적화된 PrP 클론은 5'-DNA 프로브에 의한 4.2 kb 밴드 및 3'-DNA 프로브에 의한 6.5 kb 밴드를 보였고, 비-표적화 대립형질로부터, 각 프로브에 의해 검출된 야생형 밴드는 10.8 kb였다. 네오 프로브로, PrP 표적화된 대립형질에 대해 6.5 kb DNA 밴드가 검출되고, 야생형 293F 세포에 대해서는 밴드가 검출되지 않아야 한다.

3개의 프로브 모두에 대한 PCR 및 서던 블롯에서 올바른 패턴을 보이는 클론을 하나의 대립 형질에서 표적화된 PrP K.O. 세포로 식별하였다. 이 양성 클론들을 FISH, ELISA 및 면역염색(immunostaining)에 의해 더 분석하였다.

3. FISH 분석(도 8) :

인간 PrP 유전자는 염색체 20에 위치한다. 염색체 20의 페인팅(painting)을 위해 293F 세포를 WCP(whole chromosome painting) 프로브와 혼성화시켰다. 이 FISH 분석은 293F 야생형 세포의 25%가 2 카피의 염색체 20을 가지며, 293F 세포의 75%가 3 카피의 염색체 20을 갖는다는 것을 보여주었다. 기술적으로, 현재의 기술을 이용하여 3개의 PrP 유전자를 넉아웃시키는 것은 매우 어렵고 거의 불가능한다. 따라서, chr20 WCP 페인팅 프로브에 의한 FISH 분석은 이미 하나의 PrP 표적화 대립형질을 갖는 세포 클론이 두개 또는 세개의 염색체 20을 갖는지 여부를 구별할 수 있게 한다. 추가적으로, PrP 유전자를 포함한, 100kb에 걸치고, 염색체 20의 일부인 BAC DNA 클론 186 프로브를 또한 가능한 염색체 결실 및 전위(translocation)의 검출을 위한 FISH 혼성화를 위해 이용하였다.

제1 K.O. 구조물 pBS_Neo_P-_R+L_arm_2B의 표적화된 통합 후에 PrP K.O. 세포주에 대해 3개의 상이한 FISH 패턴을 관찰할 수 있었다:

a. 두개의 염색체/중기(metaphase)가 염색체 20 프로브로 페인팅되었고 두개 모두 BAC 신호를 보였다(도 8a).

b. 세개의 염색체/중기가 페인팅되었고 세개 모두 BAC 신호를 보였다(도 8b).

c. 세개의 염색체/중기가 페인팅되었고(하나의 염색체는 염색체 20의 하나의 암이 또 다른 염색체로 전위되었기 때문에 부분적으로만 페인팅됨) 두 개의 완전한 염색체 20만이 BAC 신호를 보였다(도 8c).

여러 PrP K.O. 세포주의 통계 분석이 하기의 표에 요약된다:

세포당 2 카피 또는 3 카피의 chr20의 존재에 관계없이, 제2의 PrP 유전자를 넉아웃시키기 위해 두 개의 BAC 신호를 갖는 K.O. 세포를 취하였다. 따라서, 하기의 두 개의 K.O. 세포주가 선택되었다:

K.O. 1: 이 세포주는 2개의 카피의 페인팅된 염색체 20을 갖는 하나의 집단을 가졌고 2개는 모두 BAC의 FISH 신호를 가졌다(세포의 12%에서 검출됨). 더 큰 집단(85%)은 3개의 카피의 페인팅된 염색체 20을 보였다. 이 염색체들 중 하나는 부분적으로만 페인팅되었고 또 다른 염색체로 전위되었다. 두 개의 완전히 페인팅된 염색체 20만이 BAC의 FISH 신호를 보였다.

K.O. 6: 96%의 세포가 3개의 염색체 20 신호 및 2개의 BAC 신호를 가졌다.

K.O. 1 및 K.O. 6의 PrP 단백질 수준이 야생형 293F 세포의 약 절반인지 여부를 결정하기 위해 K.O. 1 및 K.O. 6를 ELISA에 의해 더 분석하였다.

4. ELISA 테스트 (도 9)

야생형 293F 세포 대비 PrP K.O. 세포에서 PrP 단백질 농도를 정량하기 위해 ELISA를 수행하였다. 하나의 PrP K.O. 대립형질을 갖는 세포주 K.O.1 및 K.O.6은 WT 293F 세포에 비해 지속적으로 절반의 PrP 단백질을 발현했다(도 9). 이 데이터는 FISH 분석 후의 결론을 추가적으로 뒷받침하고 확인했다.

실시예 2: 제오신을 함유한 PrP K.O. 구조물에 의한 제2차 넉아웃의 상세한 설명.

표적화 전략은 항생제가 상이한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 것과 동일했다. 즉, 제2의 PrP K.O. 구조물에 네오마이신 대신 제오신이 포함되고 따라서, 항생제-내성 클론의 선택이 G418 대신 제오신에 의해 수행되었다.

A. 제오신 카세트를 포함하는 제2의 PrP K.O. 구조물의 클로닝: 제1 PrP K.O. 구조물 pBS_Neo_P-_L+R_Arm_2B에서 네오마이신 ORF가 자체의 프로모터 및 ATG 번역 개시 코돈을 갖지 않는 제오신 ORF에 의해 치환되었다. 제오신 카세트는 하기의 PCR 프라이머에 의해 플라스미드 pcDNA3.1-Zeo(+)로부터 그 자신의 ATG 없이 PCR에 의해 증폭되었다.

Zeo-F: 5'-GGCAAGAATTCGCAGAGCAGTCATTATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCC-B'

(서열번호 27)

Zeo-R: 5'-GGACCGCTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCAC-B' (서열번호 18)

결과물인 PCR 산물은 길이가 412 bp였다.

pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B 플라스미드를 EcoRI 및 XhoI으로 처리하고 그의 말단에 EcoRI 및 XhoI의 제한효소 인식 부위를 포함하는, PCR-증폭된 제오신 카세트와 라이게이션시켰다. 이 라이게이션으로부터 생성된 플라스미드를 pBS_Zeo_P-_R+L_Arm(도 10) (서열번호 16)으로 명명하고 제2 PrP 대립형질을 표적화하기 위해 이용하였다. 이 제2의 PrP K.O. 구조물 pBS_Zeo_P- _R+L_Arm을 B.4에 기재된 바와 같이, 형질감염을 위해 BamHI에 의해 선형화시켰다.

B. 제2 PrP K.O. 구조물, pBS Zeo P R+L Arm의 PrP 유전자의 하나의 대립형질을 갖는 PrP K.O.세포로의 도입: 제2 PrP K.O. 구조물, pBS_Zeo_P_R+L-Arm을 리포펙타민 2000 CD 시약을 이용하여 하나의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 확인된 표적화된 세포로 도입하였다(제19면 형질감염 방법 참조). 형질감염 48시간 후에, 세포들을 10 cm 디쉬에 플레이팅하거나 또는 125 ml 진탕용 플라스크(shaker flask)에서 1.25 내지 1.5x1O⁶ 세포/ml의 밀도로 더 배양하였다. 항생제 선택을 위해, 하기의 농도로 G418 및 제오신을 배양액에 첨가하였다: G418 0-30㎍/ml 및 제오신 0-30 ㎍/ml. 14-30일 동안 2/3일 간격으로 배지 교환을 수행하였다.

C. 제오신-표적화된 클론의 스크리닝: 항생제 선택 하에 세포가 합류점에 도달했을 때, 정확하게 제1 K.O.의 스크리닝에 대해 기재된 바와 같이 게놈 DNA를 분리하였다(제25면,D).

PCR 스크리닝 전략은 PCR을 위한 역방향 프라이머가 제오신 ORF에 상동성이 되도록 설계된 것을 제외하고는 실시예 1D의 PCR 스크리닝 전략과 유사했다.

20-300 ng 게놈 DNA, 1x PCR 완충액, 200 nM의 각 올리고뉴클레오티드 프라이머, 1,25 mM MgCl₂, 200 nM dNTP 및 1,33 유닛의 Expand Fidelity Polymerase (Roche)을 포함하는 PCR 믹스를 제조하였다. 스크리닝을 위해 이용된 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같았다:

Zeo-K.O.-F2: 5' CTCCTCTTCCTCCCATCTTACC 3' (서열번호 19)

Zeo-K.O.-R2: 5' CGAAGTCGTCCTCCACGAAGTC 3' (서열번호 20)

사이클 파라미터는 하기와 같았다: 94℃ 4분; [94℃, 15초; 63℃, 30초; 72℃ 100초 x 16회의 사이클; [94℃, 15초; 63℃, 30초; 72℃ 100초 + 각 연속적인 사이클에서 3초씩 길어짐] x 24회의 사이클; 72 ℃ 7분. 2.3 kb PCR 산물을 생성하는 게놈 DNA 시료는 세포 집단에 하나 또는 수개의 표적화된 대립형질의 존재를 나타낸다.

D. 두 개의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 표적화된 클론의 특성 규명:

1. 게놈 PCR 스크리닝(도 11) : 세포 또는 세포 혼합 집단이 두개의 표적화 된 PrP 대립형질을 갖는지 여부를 확인하기 위해, 두 개의 독립적인 PCR 스크리닝을 수행해야 했다. 제2 PrP K.O. 구조물(pBS_Zeo_P-_R+L_Arm)의 표적화된 통합을 입증하기 위해 PCR 프라이머 쌍 Zeo-K.O.-F2와 Zeo-K.O.-R2를 사용하였고, 프라이머 쌍 K.O.-Fl 및 K.0.-F2는 제1 PrP K.O. 구조물(pBS_Neo_P-_R+L_Arm_2B)의 표적화된 통합을 입증하였다.

상기 C에 기재된 바와 같이, 혼합된 세포 집단 또는 분리된 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 모든 PrP K.O. 스크리닝 PCR 반응은 양성 대조군 및 음성 대조군과 함께 수행하였다. 양성 대조군을 위한 주형은 표적화된 PrP 대립형질이 먼저 Zeo-K.0.-F2 및 Zeo-K.0.-R2의 프라이머 쌍에 의한 PrP K.O. PCR 스크리닝 방법에 의해 이전에 검출되었던 세포 집단 혼합물(cell population mix)로부터 수득된 200 ng의 게놈 DNA였다; 음성 대조군은 주형으로 게놈 DNA 대신 물을 사용하였다. 전기영동 후 아가로오스 겔 상에서 2.3 kb PCR 산물의 존재는 상응하는 세포 콜로니가 제2차 K.O. 수행의 결과 PrP 유전자 대신 제오신 카세트를 갖는 세포를 갖는다는 것을 나타낸다. 결과를 도 11에 표시하였다. 프라이머 Zeo-K.0.-F2 및 Zeo-K.O.-R2에 의한 PCR에서 양성으로 확인된 클론을 제1 K.O. 구조물의 표적 통합이 여전히 존재하는지 여부 또는 제1 K.O. 구조물이 제2 K.O. 구조물에 의해 치환되었는지 여부를 결정하기 위해 K.O.-Fl 및 K.O.-Rl에 의한 PCR에 의해 더 분석하였다(도 11).

두 PCR이 모두 양성인 경우, 이 클론은 서던-블롯 분석에 의해 더 분석하였다.

2. 서던 블롯 스크리닝 전략(도 12)은 실시예 1에 기재된 것과 유사했다.

구조물 pBS_Zeo-_P-_L+R_Arm에 의한 게놈 서던 전략이 도 11에 도시된다. EcoRI에 의한 게놈의 처리 및 방사성 표지된 프로브와의 혼성화 후에, 표적화된 PrP 클론은 5'-DNA 프로브에 의해 4,2 kb 밴드 및 3'-DNA 프로에 의해 5,7 kb 밴드를 보였고, 비-표적화된 대립형질로부터 유래되고, 두 프로브에 의해 검출된, 야생형 밴드는 10.8 kb였다. 제오-프로브에 의해, PrP 표적화된 대립형질에서 5,7 kb DNA 밴드가 검출되고 야생형 293F 세포에서는 밴드가 검출될 수 없다.

두 K.O. 구조물의 표적화된 통합에 대한 서던 패턴의 차이는 3'-프로브 및 제오-프로브 또는 네오-프로브에 의해 검출될 수 있었다.

- 3'-프로브에 의해: 제1 K.O 구조물의 경우, 6,5 kb 밴드가 검출되고, 제2 K.O. 구조물의 경우, 5,7 kb 밴드가 추가적으로 검출되어야 한다. 두 경우 모두에서, WT 밴드는 10,8 kb이다.

- 네오-프로브에 의해: 제1 K.O. 구조물의 통합 후, 6,5kb 밴드가 검출되어야 한다.

- 제오-프로브에 의해: 제1 K.O 구조물의 표적화된 통합의 경우, 신호가 검출되지 않고, 제2 K.O. 구조물의 경우, 5,7 kb 밴드가 나타난다.

- 서던 분석용 DNA 프로브 및 그들의 예상되는 패턴이 하기의 표에 요약된다:

3. FISH 분석: 자체(in house) 무혈청 적응된 야생형 293F 세포에서 염색체 20의 카피 수가 배양 시간에 따라 증가된다는 것을 관찰하였다. 두 개의 PrP 표적화된 대립형질을 갖는 K.O. 세포는 여전히 야생형 유전자 좌 PrP를 갖는 제3의 온전한 염색체 20을 포함한다는 것을 배제하는 것이 중요하다. 따라서, 두 개의 표적화된 PrP 대립형질을 갖는 확인된 K.O.세포는 BAC 186 프로브 및 chr20 WCP 페인팅 프로브와 더 혼성화되어야 한다. 완전한 PrP K.O.의 경우, 2개 이하의 BAC 신호들이 관찰된다.

4. ELISA 분석: 방법 9에 기재된 바와 같이 수행하였다. pf293F 세포에서 PrP 단백질을 검출할 수 없었다.

5. 면역염색: pf293F 세포의 경우, 세포 표면 상에 항체 염색에 의한 신호가 없었다.

실시예 3: 프리온-불포함 재조합 단백질의 생성을 위한 프리온-불포함 293F 세포주 pf293F의 무혈청 형질감염(serum-free transfection).

3.1 하나의 PrP 표적화된 대립형질에 의한 pf293F 세포의 형질감염.

인간 FVIII, FIX 및 G-CSFb 단백질을 발현시키기 위해 하나의 PrP 표적화된 대립형질을 갖는 PrP KO 클론을 pcDNA3.1-FVIII (서열번호 26), pcDNA3.1-FIX (서열번호 17) 및 pcDNA3.1-hyg( + )-G-CSFb (서열번호 25) 벡터로 형질감염시켰다.

도 13에서, 제1 PrP 대립형질의 결실 시 형질감염 효율성은 야생형 293F 세포(도 10)와 유사하다는 것이 도시된다. 10E6 세포에서 FVIII, FIX 및 G-CSFb의 활성 유닛의 발현은 293F 야생형 세포와 유사했다(도 14). 이는 하나의 PrP 유전자의 넉아웃이 세포의 형질감염 능력에 영향을 미치지 않고 생성된 재조합 단백질의 양을 감소시키지도 않는다는 것을 나타낸다.

3.2 완전한 프리온-불포함 293F 세포주에서 무혈청 형질감염 및 인간 재조합 단백질의 생산

프리온 ORF의 성공적인 제거는 완전히 프리온이 불포함된(prion-free) 치료제를 생성할 수 있는, 신규한 세포주 pf293F의 생성을 가져왔다. 새로운 세포주의 배지 물질로부터 초래된 프리온에 의한 오염을 방지하기 위해, 전체 절차(안정적인 형질감염, 세포 배양 및 발효)를 무혈청 조건 하에서(PCT/EP2006063705 참조) ClonePixFL 방식을 이용하여 수행하였다.

특히, WO01/70968에 개시된 벡터 pTG3 및 pcDNA3.1-FIX로부터, 인간 응고 인자 IX의 개방 해독 프레임(ORF)를 포함하는 1,4 kb 단편을 HindIII 및 NotI에 의한 이중-처리(double-digestion)에 의해 절제하였다. 이 단편을 HindIII 및 NotI에 의해 이중-처리된 벡터 pcDNA3.1Hygro(+)-zz (Invitrogen의 V870-20으로부터 유래됨)에 라이게이션시켜서, 서열번호 17에 표시된 벡터 pcDNA3.1-FIX를 형성했다. 28 ml의 현탁 배양액을 10⁶개의 생존가능한 pf293F 세포의 세포 밀도로 준비하였다. 30 ㎍의 플라스미드 DNA를 Opti- MEM® I (Invitrogen)에서 1 ml의 최종 부피까지 희석하는 것에 의해 액체-DNA 복합체(liquid-DNA complex)를 제조하고, 40 ㎕의 293fectin®을 Opti-MEM® I에서 1 ml의 최종 부피까지 희석하였다. 실온에서 5분의 인큐베이션 후에, 희석된 DNA를 293fectin®에 첨가하여 2 ml의 최종 부피를 수득하였다. 형질감염된 시료를 암소에서 실온에 20분간 인큐베이션시켰다. 2 ml의 형질감염 믹스를 28 ml의 pf293F 현탁배양액에 첨가하였다(최종 세포 밀도는 1 x 10⁶ 세포/ml였음). 형질감염된 pf293F 세포를 37℃/공기 중의 8% CO₂의 가습된 대기 하에서 125 rpm에서 회전하는 오비탈 진탕기 상에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다.

전술된 바와 같이 형질감염된 pf293F 세포를 클론의 선택을 위해 적합한 항 체, 및 형광을 통해 가장 높은 생산량을 갖는 클론의 검출을 위한 표지된 항체를 포함하는 반-고체 메틸셀룰로오스 기반 배지에 접종하였다. 뒤이어 수백개의 최상의 FIX 생산자 클론을 선별하기 위해 세포 갯수 및 표적 FIX 단백질의 분비에 대해, ClonePixFL (Genetix)을 이용하여 다수(수천개)의 클론을 분석하였다. 비-생산자 클론 및 혼합된 클론이 랜덤하게 선별되는 다른 공지된 방법과 대조적으로, ClonePixFL의 이용은 단일 세포로부터 유래된, 높은 생산자인 빠르게 성장하는 클론을 선별할 수 있게 한다. 선별된 세포들을 완전한 절차를 위해 무혈청 조건 하에, 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 및 뒤이어 스핀 튜브, 세포 배양 클라스크 및 발효조에서 확장시켰다.

전술된 방법에 의해 식별된 FIX 생산 클론을 무혈청 프리스타일(Freestyle) 293 확장 배지에서 배양하였다. 표준 절차에 따라 표적 단백질을 분리하고 정제하였다. 추가적으로, 안전한 치료제의 생산을 위해, SD-처리를 포함한, PCT/EP 2006/061148에 개시된 바와 같은 최적화된 정제를 이용할 수 있었다.

Pf293F 세포는 또한 발현 벡터 pcDNA3.1-hyg(+)-G-CSFb (서열번호 25) 및 pcDNA3.1-FVIII (서열번호 26)에 의한 재조합 인간 FVIII 및 G-CSF의 무혈청 생산을 위해 이용될 것이다.

서열목록:

SEQUENCE LISTING <110> Octapharma AG <120> Genetic Ablation of the PrP Gene in Cells Using a Targeted Promoter Trap Strategy for production of serum-free recombinant proteins as therapeuticals <130> 072819WO <160> 29 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10622 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> KO vector pBS_NEO_P-_R+L_Arm_2B <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660 ccgcggtggc ggccgcctct gtctaggaac actgctgtga acaaaaccaa actcccgccc 720 taaaggagcc tgcactcccg tggagaacat gaataataag cacagaggaa ataacataat 780 atctcaagta gctgtaactg ctccagagaa taatgaagcc aggaaagggg gtgggctagg 840 gggtgctgtt ttaggtagag tgatgggaac agccccactg agcaaacttt agccacatga 900 gtagctggaa gaaaagcctt ctaggaccag ggaacagcaa gtgcaacagc cctgagacag 960 gatgggcttg tcagtttgag gagcagtggg aggcctgaac caggttacat ggggcccagc 1020 cagtatggcc acgactttgt gttttatcca gagtacaaag gagcctcact gagggacaag 1080 ggaagtggca tgatgtgacc cgcatattaa gaggagagcg ctcaatggca gccaggggag 1140 gagcagggag gctggttggg aggctgttga agaaatcagg tgagaagtga tggaagcacc 1200 gaataagatg gtcatgttgg aaaaattgag aagctgaggt gcttagcatt gattttcaag 1260 gtagagctac tgagatttgc tgatagatcc aatgtatgct gggagagaaa attcagtcac 1320 tctagagcat tggctggatt tgtcacccat tgcagcgaat ggagaaggtg ctgacataaa 1380 agccctttag actgaaagct actgactgag gggatggtgc cctagtttga tttcctgggg 1440 tgtatgagta gcagggaggc caagagctgg gcctcacgag attgtgggga ctacatcagg 1500 gaagcaggcc tgcaaagaac ctgcaccaca gacccccacc taaaagagcc tccaaaaacc 1560 ctaactggca tgacctgagt actttaactc tgcttgtaac tttcaaatat attttgattt 1620 gcttatgacc accaaggcaa aacttcccat ttcaataatg ttagtagaaa cataaacagg 1680 atgttaattt atttatttgg taattctttt tatgaatatt atccagttta atcattagct 1740 ctgaaggaga tgaaaaataa ttttctaatt tttagaaaaa tttgcagcta attgggtgat 1800 aaaggtaagg ggtttctgag ttcacaaaaa tgttctaaaa ttggcaacag tttcggttgc 1860 acgtttcatt aaatgtacta aaaaccattg aactgtacat ggtatatggt gaattatatg 1920 gtatgtgaat tatatctcaa caagctgggt attgtttttt taaaaaataa aaataaaaaa 1980 ggagaaagag agagagaaaa acaattgcag atcatcccag cactgaggac aagactaact 2040 tcagtgttcc agtatatgcc attataggtt ttacggcaca cagtgatgat ttggagccta 2100 tgatttgacc tagggtacag caggtactgt ttagcaatca ttttactatt gtcataggtc 2160 tctgctcttg gagctaagtg cccagggtaa atgagatctt taatttgaaa agagattttt 2220 gatttgatga atgtacattc tccaaagggt cataaattgt cattctggat gtttgatctg 2280 tttgttgttt tggtacaaaa attagaagaa aataattcac tcataaaatg ttaaataatg 2340 aactaaaagt cattcatcaa gtccataact tagggtcaca tttgtccttg gagcaggaga 2400 aagagttgtg ttcacccttt tcttactttt gcttttgtcc taagtgcttc agagaagtac 2460 agggtggcaa cagtgtttct actgagcagc tgataccatt gctatgcact cattcattat 2520 gcaggaaaca tttagtaatt tcaacataaa tatgggactc tgacgttctc ctcttcattt 2580 tgaattcgca gagcagtcat tatgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 2640 gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 2700 gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 2760 tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 2820 ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 2880 ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 2940 tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 3000 gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 3060 gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 3120 ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 3180 ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 3240 gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 3300 ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 3360 atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga 3420 ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg 3480 aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg 3540 atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 3600 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 3660 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct 3720 agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 3780 ttccacacaa catacgagcc ggaagcatct cgagtgtgta ccgagaactg gggtgatgtt 3840 ttacttttca cagtatgggc tacacagcag ctgttcaaca agagtaaata ttgtcacaac 3900 actgaacctc tggctagagg acatattcac 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ctttactggg agccaggatg gaggacacaa 6480 gcacaaggtg taaggggatc tcactggtgt gtttgaatgt cactaagtca cagtcagggg 6540 aagacaagaa gtggaacttg tggcagggac cagccttatt acactggcac ctggttacct 6600 ggacagggtg cccactgcct atttgtagga tgtcaaggta tcaggaaaat atgaagtttt 6660 taaaaattta caatataatg ccaacctcct acggtgatca gaggatcagc tttgtattaa 6720 agatggaaag ataccaatca tcacccacaa aactactaaa acagaaagaa tgacaaatac 6780 aattctcggc caggcacagt tgctcacgcc tgtaatccct gcactttggg aggccgaggc 6840 aggcagatca cttgaggtca ggagttcaag accagcctgg ccaacatggt gaaaccccca 6900 ttccctacta aaattacaaa aaattagctg ggtgtggtcg cacgtgcctg taatcccagc 6960 tactcaggag gctgaggcag gagaatcgct tataaccggg aggcagaggc tgcagtgagc 7020 cgagatcccg ccattgcact ccagcctggc ggtaagagcg aaactccgtc tcaaaaaaat 7080 aaaataaaat aaacttttca ttacctgcct ataataattt ctcaaaaaga gtcaactgag 7140 gagacttaaa gtgttcgaag catagctact tgtaggacca gagtgaataa tatccacctg 7200 tatctttccc aggcctcatg tttcctttgt tatttcaaac gtgtgagtca tgcaaaagga 7260 atttttacta aaaaggaaaa gaaaaaaatt 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21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 28 ctagaggtcc aggtcatctt g 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 29 tcagggaaat tggggatcct g 21

Claims (17)

1. 프리온 단백질(Prion Protein: PrP) 유전자의 두 대립형질이 완전히 결실된 것인, 프리온 단백질(PrP)-불포함, 불멸화, 인간 체세포주(immortalized, somatic, human cell line).
2. 제1항에 있어서,

   (i) 형질감염될 수 있고 무혈청 조건 하에서 배양될 수 있으며, 및/또는

   (ii) 게놈에 통합된 아데노바이러스 서열을 가지며, 및/또는

   (iii) 신장, 방광, 간, 폐, 심장근육, 평활근육, 난소 및 위장세포로 구성된 군으로부터 선택되는 출발 세포(starting cell)로부터 유래되며, 바람직하게는, 상기 출발 세포는 인간 신장 세포주이고, 및/또는

   (iv) 재조합 단백질의 생성을 위해 적합한 것인 세포주.
3. 제2항에 있어서, 상기 신장 세포는 인간 태아 신장 세포이고, 바람직하게는 상기 인간 태아 신장 세포는 293 세포(ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), 프리스타일(Freestyle) 293 세포(293F 세포; Invitrogen R79007) 및 293T 세포(DSM ACC 2494)로부터 선택되고, 바람직하게는 293F 세포(Invitrogen R79007)인 것인 세포주.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PrP 유전자의 대립형질은 선택성 마커 또는 선택 마커 유전자를 갖는 넉아웃 트랩(knock-out trap)과의 상동성 재조합에 의해 완전히 결실되어, 상기 선택성 마커 또는 선택 마커의 발현이 내인성(endogenous) PrP 프로모터에 의해 구동되는 것인 세포주.
5. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 프리온-불포함 293F 세포주 pf293F 및 모든 중간체의 혼합된 집단(intermediate mixed population) 및 상기 세포주를 분리하기 위해 필요한 분리된 클론을 포함하나 이에 한정되지 않는 것인 세포주.
6. 개별적인 출발 세포(starting cell)에서 여러 개의 상이한 PrP 넉아웃 구조물(knock-out construct)과의 상동성 재조합체 의해 또는 동일한 구조물과의 상동성 재조합에 의해 PrP ORF를 연속적으로(subsequently) 결실시키는 단계, 및 점진적으로 증가되는 농도의 항생제에 의한 선택을 수행하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 PrP-불포함, 불멸화 인간 체세포주를 제조하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 넉아웃 구조물은 상기 출발 세포의 PrP 유전자 내에 있는 삽입 부위에 상동성인 두 개의 서열에 의해 플랭킹(flanking)된, 동일한 또는 상이한, 프로모터 불포함(promoterless) 선택 마커 유전자 또는 선택성 마커를 갖는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 넉아웃 구조물은

   (i) 상이한 선택 마커 유전자를 가지며; 및/또는

   (ii) 폴리 A 서열, 재조합효소(recominase) 인식 서열, IRES 중 하나의 기능성 서열을 더 갖고;

   (iii) 상기 상동성 서열은 1 내지 10 kb의 길이, 바람직하게는 6 kb의 길이이고, 및/또는 상기 출발 세포주의 PrP ORF의 상류 및 하류 서열과 일치하고, 가장 바람직하게는 상기 상동성 서열은 서열번호 2 및 3에 표시된 서열이며; 및/또는

   (iv) 상기 선택 마커는 네오마이신, 제오신, 하이그로마이신(hygromycin)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양성 선택 마커를 코딩하고, 및 상기 선택성 마커는 GFP, Dsred와 같은 형광 마커 및 LacZ와 같은 효소를 포함하는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 넉아웃 구조물은 서열번호 1 및 16에 표시된 서열 중 하나 이상을 갖는 것인 방법.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 PrP 넉아웃 구조물.
11. 인간 단백질, 또는 그의 항체, 또는 유도체 또는 돌연변이체(표적 단백질)의 PrP-불포함 재조합체 생산을 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 PrP-불포함 불멸화 인간 세포주의 용도.
12. 인간 단백질, 또는 그의 항체 또는 유도체 또는 돌연변이체(표적 단백질)의 PrP-불포함 재조합 생산을 위한 인간 세포주를 제조하는 방법으로서,

    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 PrP-불포함 불멸화 인간 숙주 세포주를 복제원점(origin of replicaton) 및 상기 인간 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질감염 벡터로 형질감염시켜서, 그에 의해 상기 인간 표적 단백질을 코딩하는 유전자가 그의 5' 말단에서 프로모터에 연결되고, 그의 3' 말단에서 폴리 A 신호에 연결되는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서,

    (i) 상기 형질감염은 무혈청 조건 하에서 수행되고, 및/또는

    (ii) 상기 형질감염 벡터는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 공급된 pcDNA3.1 벡터로부터 유래되고, 및/또는

    (iii) 혈액 응고 인자 VIII(wt 인자 VIII 또는 B 도메인-결실 인자 VIII 포함), 혈액 응고 인자 IX, 인자 VII/VIIa와 같은 혈액 응고 인자, G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 인간 성장 인자, vWF 또는 알파-1-안티트립신 (AlAT) 또는 인간 항체인 것인 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 형질감염 벡터로, 바람직하게는 무혈청 조건 하에, 안정적으로 형질감염된 PrP-불포함 불멸화 인간 생산 세포주(PrP- free immortalized human production cell line).
15. 제14항의 PrP-불포함 불멸화 인간 생산 세포주를, 바람직하게는 무혈청 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 인간 표적 단백질의 PrP-불포함 재조합 생산 방법.
16. HEK 293F 또는 Per.C6 세포(불멸화 인간 태아 망막 세포), CHO (Chinese Hamster Ovary cell) 및 BHK (Baby Hamster Kidney cell) 세포로부터 선택된, 프리온 단백질(Prion Protein: PrP) 유전자의 두 개의 대립형질이 완전히 결실된, PrP-불포함 불멸화 세포주.
17. 인간 단백질, 또는 그의 항체, 또는 유도체 또는 돌연변이체(표적 단백질)의 PrP-불포함 재조합 생산을 위한, 제16항의 PrP-불포함 불멸화 세포주의 용도.

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