CN112760297A

CN112760297A - 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用

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Publication number: CN112760297A
Application number: CN202110089069.6A
Authority: CN
Inventors: 秦晓峰; 韦治明; 龙丽梅; 杨仁祥; 李帆
Original assignee: Ruifengkang Biomedical Technology Zhejiang Co Ltd
Current assignee: Ruifengkang Biomedical Technology Zhejiang Co Ltd
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: WO2021254341A1; CN112760297B; US20230332177A1; CN111893097A

Abstract

一种冠状病毒假病毒的包装系统，包括Fluc、EGFP双报告基因置换GP基因的水泡性口炎病毒VSV载体、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞，所述双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白，荧光素酶报告基因优选Fluc基因；上述包装系统采用一步法包装方法可快速包装出单周期感染、低背景值、高滴度、相较于慢病毒介导的假病毒系统具备检测快速特性的假病毒，可用于COVID‑19(SARS‑CoV‑2)、SARS(SARS‑CoV)、MERS等冠状病毒及其他病毒的研究；上述假病毒可通过病毒污染分布模型、搭建场景、取样检测的步骤的评估消杀剂效力，为消杀剂的评价提供安全、便捷、有效的工具方法，具备广泛的应用价值。

Description

一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用

技术领域

本发明涉及基因及细胞工程和病毒学领域，具体涉及假病毒包装载体及包装细胞系统，所述假病毒包装载体及包装系统通过一步法包装方法制备冠状病毒假病毒，所制备的冠状病毒假病毒可以作为生物指示剂用于抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价。

背景技术

新冠病毒COVID-19是一种可使人类感染致命肺炎的病毒。除新冠病毒以外，自21世纪初以来，另外两种冠状病毒，即严重的急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)也在人类中造成致命的肺炎。此外，人类中还流行四种低致病性冠状病毒：HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63和HCoV-229E。国内多地相继确诊新冠病毒感染本土病例，并被证实新冠病毒主要依托冷链物流进行传播。病毒消杀灭活技术是一项传统的技术，根据原理可以简单分为物理、化学灭活方法。常见的病毒消杀剂包括臭氧、紫外光、二氧化氯、过氧乙酸、双氧水、二氯异氰尿酸钠、辐照、负离子等，品种繁多，但病毒灭活能力良莠不齐，适用范围缺乏数据支撑，其主要原因是缺乏统一有效的消杀剂灭活病毒能力评价方法。尤其是针对新冠(SARS-CoV-2)、急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)等具有极强的传播性、危害性的病毒，进行活病毒评价只能选择P3实验室操作。具备生物安全性的试验评价方法的缺失，直接导致适用的新技术或新应用如臭氧、辐照缺乏评价支撑，影响其参数、适用规律确定及推广应用。

已知的假病毒是指一种复制缺陷的病毒能够整合另外一种不同种类病毒的包膜糖蛋白，形成的具有外源性病毒的包膜，而基因组保持着原病毒载体本身基因组特性的病毒。假病毒由于其核酸基因组缺陷而丧失了复制能力，仅具有单周期感染活性，因此具有较高的生物安全性。这对研究具有致病率高，传染性强、不易在体外培养的病毒如新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 等提供了一种安全有效的研究方法。体外构建的假病毒还具有稳定性强、宿主嗜性广等优点，因此被广泛应用于疫苗的研发、评价，中和抗体检测、筛选、评价，中和抗体抗原表位的发现，抑制病毒入侵的抗体与大分子、小分子药物研发，以及物理消杀方法、化学消杀剂等方面的研究工作。

包装制备无生物安全隐患的SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV等假病毒，并将其应用于检查、评价中和、抑制病毒能力及消杀剂灭活病毒的作用与效力具有重要意义。

发明内容

复制缺陷型、不能产生传染性子代的假病毒提供了一种安全、有效地模拟野生病毒侵染宿主过程的方法体系。VSV的组装发生在细胞膜上，涉及从细胞表面出芽的病毒离子。在出芽过程中，VSV获得一个由来自于细胞膜的双层脂质和由VSV糖蛋白(VSV-G)三聚体形成的包膜。当VSV-GP基因部分或全部被双报告基因置换，外源性病毒的包膜蛋白在rVSV-ΔG 感染的细胞中充分表达时，外源病毒糖蛋白可以组装到VSV病毒颗粒的包膜上。本研究比较了全长COVID-19的S蛋白(COVID-19-S)，截短的S蛋白C末端(C19-HA)以及C末端19aa截短并融合HA(C19-HA)包装的假病毒VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA，发现VSVΔ G-COVID-19-S-C19-HA假病毒的感染效率远高于VSVΔG-COVID-19-S，同时也显著优于VSVΔ G-COVID-19-S-C19，同时稳定表达人源ACE2(hACE2)的293T-hACE2细胞对假病毒感染最敏感。相比而言Vero-E6尽有中等的感染效率，而293T细胞对新冠假病毒完全不敏感。以VSV ΔG-COVID-19-S-C19-HA和293T-hACE2细胞为基础，建立了抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价方法(包括臭氧在冷链环境中消杀冠状病毒效力的评价)以及多种冠状病毒疫苗免疫后血清样本中抗体的中和活性评价。本方法体系可用于COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS(SARS-CoV)、MERS等冠状病毒及其他病毒的研究。

一种冠状病毒假病毒包装系统，包括改良型安全、高效水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换部分或全部GP基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔ G-Fluc-EGFP。

优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述双报告基因包括荧光蛋白报告基因和荧光素酶报告基因，所述荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白对应的报告基因；所述荧光素酶报告基因选自萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶对应的报告基因。

优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述荧光蛋白报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，对应基因序列为SEQ ID NO：1；所述荧光素酶报告基因选自密码子优化的萤火虫荧光素酶Fluc基因，所述萤火虫荧光素酶Fluc基因的序列为SEQ ID NO：2。

优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP具有SEQ ID NO：3的基因序列。

优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述装配细胞选自293T，所述装配细胞瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现，对应的所述诱导表达通过四环素调控 tet-on/off载体系统转导细胞实现。

优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述装配细胞表达的包膜蛋白对应冠状病毒SARS或MERS或COVID-19中的S基因，所述SARS冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的 3’端缺失19个氨基酸后对应的序列，即SEQ ID NO：4序列；所述MERS冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸后对应的序列，即SEQ ID NO：5序列；所述COVID-19 冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白3’端缺失19个氨基酸后的序列，即SEQ ID NO：6序列, 或者所述COVID-19冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸且同时融合HA蛋白后对应的序列，即SEQ ID NO：7序列；所述装配细胞表达的包膜蛋白表达为瞬时表达质粒或稳定表达质粒或稳定及诱导表达慢病毒载体介导，包括真核表达载体,且在装配细胞中瞬时表达包膜蛋白的四种质粒分别命名为pCA-SARS-C19、pCA-MERS-C19、 pCA-COVID-19-C19以及pCA-COVID-19-C19-HA的表达质粒以及表达相同编码蛋白的衍生载体。优选的，所述S-C19-HA中S的3’端19aa缺失后融合的对象并不限定于HA，还可以是 flag、myc、his等其它具备标记功能的肽。

一种假病毒包装系统的一步法包装方法，假病毒包装系统包括dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞，其中所述dVSVΔG-Fluc-EGFP表面装配完整的GP囊膜蛋白且遗传物质中GP基因部分或全部被Fluc、EGFP双报告基因置换，所述冠状病毒刺突蛋白S 的表达为pCAGGS介导，所述冠状病毒刺突蛋白S选自S基因的3’端16aa～28aa的截短体，将dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞一步混合，一定时间后收集上清液得到冠状病毒假病毒。优选的，所述冠状病毒刺突蛋白S选自S基因的3’端19aa的截短体时表现最优。

优选的，一步法包装方法一种假病毒包装系统的一步法包装方法，具体实施步骤如下：

(1)在瞬时或稳定或诱导稳定表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP， 24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；

(2)将在瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞293T传代至60mmdish中，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数MOI＝0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养，24h 后收获假病毒上清液，再加入VSV中和抗体处理2h，用0.22um滤膜过滤后即可得到冠状病毒假病毒。

一种其他假病毒包装系统，包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达其他病毒刺突蛋白S 的装配细胞；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换部分或全部 GP基因的VSV复制缺陷病毒，所述VSV复制缺陷病毒命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP，所述瞬时表达或稳定表达或诱导表达的包装质粒及载体在装配细胞中表达目的病毒的包膜蛋白，所述瞬时表达或稳定表达或诱导表达包装质粒及载体的细胞水平表达的包膜蛋白选自冠状病毒、疱疹病毒、弹状病毒、痘病毒、嗜肝病毒、丝状病毒、棒状病毒、流感病毒、副粘病毒、黄病毒、副粘病毒、黄病毒、包膜病毒、布尼亚病毒或逆转录病毒的一种病毒或多种病毒。

优选的，所述一种其他假病毒包装系统，所述冠状病毒为COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS (SARS-CoV)、MERS(MERS-CoV)、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63或HCoV-229E；所述嗜肝病毒为乙肝病毒或丙肝病毒；所述丝状病毒为Ebola病毒；所述弹状病毒为狂犬病毒；所述副粘病毒为麻疹病毒或呼吸道合胞病毒；所述黄病毒为寨卡病毒或登革热病毒。

优选的，所述一种其他假病毒包装系统，包括dVSVΔG-Fluc-EGFP及装配细胞，所述装配细胞选自转染效率高且稳定性佳的293、293T、293sus、HEK293、HEK293T HEK293FT、BHK 或Vero。即运用本发明涉及的假病毒包装系统可以应用于除本发明详细描述外的其他多种病毒使用，可被广泛推广应用到其他病毒种类的假病毒制备。

上述冠状假病毒包装系统包装出的冠状病毒假病毒作为生物指示剂替代野生型冠状病毒应用于抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价，所述抑制及消杀冠状病毒的物质与方法包括抗冠状病毒中和抗体及药物、化学消毒杀菌剂、物理消毒杀菌手段。

一种冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，步骤如下：

(1)病毒污染环境搭建

通过病毒污染分布模型分析，模拟消杀剂评估场景下目的病毒分布情况，包括存在介质、温度、湿度、气体扰动情况；

将包装得到的冠状病毒假病毒稀释后均匀涂抹在介质上，并设置好评估场景的环境参数；

(2)消杀处理前冠状病毒假病毒浓度测定

根据评价需要，通过取样不同位置、不同点数的冠状病毒假病毒进行处理前标准病毒特性检测；

(3)消杀作用过程中及作用后取样测定

将消毒杀菌剂均匀喷洒或涂抹在介质上；

根据评价需要，选取步骤(2)所选定位置、点数，在不同时刻对冠状病毒假病毒进行取样，并进行冠状病毒假病毒滴度活性检测。

优选的，所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)中的病毒污染环境包括物流环境(例如冷链物流环境等)、居家环境、公共场所、学校等环境。

优选的，所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)中可同时构建多个实验组，避免误差过大，步骤(3)中包括假病毒感染293T-hACE2后观察荧光蛋白和荧光素酶表达情况进行假病毒的侵染能力和生物活性滴度(单位PFU/ml)测算以及假病毒核酸拷贝数检测。

优选的，所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(3)中的所述消毒杀菌剂(过氧化合物类、季铵盐类、含氯化合物类、醇类)及物理处理方法，包括臭氧、过氧乙酸、过氧化氢、二氧化氯、双氧水、二氯异氰尿酸钠、紫外线、负离子、辐照等中的一种或多种的不同组合。

优选的，所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)、步骤(3)中所述介质包括塑料、泡沫、装订纸板、制盒纸板、纺织品、金属箔片中的一种或多种。

利用本发明的包装系统及包装方法可以包装出具有包膜蛋白的多种病毒的假病毒，这些假病毒可安全、快速、准确用于与病毒一一对应的用于抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价。本发明涉及的冠状病毒假病毒可快速包装出单周期感染、具备低背景值、高滴度的假病毒，相较于慢病毒介导的假病毒系统具备检测快速，操作简便的特性包装系统，且本发明涉及的假病毒包装系统具有通用扩展性，不仅仅限定于文中具体描述的冠状病毒，还可扩展延伸到其他种类的病毒，相对应的假病毒包装系统的一步法包装方法也可适用于其他种类的假病毒一步法包装方法。

通过上述包装系统、包装方法包装出的假病毒(不仅限于冠状病毒假病毒)可应用于抑制及消杀对应病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价，有益效果如下：(1) 本发明过对被检抑制及消杀冠状病毒的物质与方法使用环境、剂量进行优化组合设计，可以准确、直观、定性或定量的比对验证被检抑制及消杀冠状病毒的物质与方法的病毒灭活功能； (2)本发明中的假病毒报告系统生物指示剂，具有较高的生物安全性，可模拟多种病毒的传播、致病特性，可以满足不同抑制及消杀病毒的物质与方法在常规生物安全环境下的病毒灭活能力评价需求；(3)本发明中的假病毒荧光报告基因，可以直观的反应被检抑制及消杀病毒的物质与方法的病毒灭活的结果；(4)此发明的应用对抑制及消杀病毒的物质与方法开展技术研发、研究其对冷链传播渠道的阻断作用起到了极大的促进作用与实际可行的有利条件。

附图说明

图1基于dVSVΔG-Fluc-EGFP假病毒构建示意图。

图2 COVID-19/SARS/MERS-S表达质粒构建。

图3不同S截短体包装的新冠假病毒在不同细胞中感染效率的比较。

图4不同新冠假病毒在293T-hACE2检测细胞中滴度测定。

图5不同收样时间对不同类型(S基因3’端不同截短体)假病毒滴度的影响。

图6预转染不同量的包膜质粒(pCA-C19-HA)对假病毒滴度的影响。

图7不同包装细胞中刺突蛋白S的转染量对包装新冠假病毒滴度的影响。

图8 dVSVΔG-Fluc-EGFP按照不同的MOI感染293T细胞后荧光报告基因的表达情况。

图9在293T细胞中加入不同MOI的VSV复制缺陷病毒对装配新冠假病毒的效率影响。

图10新冠包膜质粒(pCA-COVID-19-C19HA)转染不同时间对包装效率的影响。

图11质粒瞬转表达与可诱导表达体系对假病毒包装收样时间对包装假病毒滴度影响。

图12可诱导包装体系中不同DOX浓度对包装假病毒滴度影响

图13不同类型的冠状假病毒在不同温度下的包装滴度测定。

图14 VSV载体介导的不同冠状病毒假病毒的稳定性测试，不同温度对冠状病毒假病毒稳定性的影响。

图15 VSV载体介导的不同冠状假病毒的稳定性测试，反复冻融对冠状病毒假病毒稳定性的影响。

图16 dVSVΔG-Fluc-EGFP双报告基因介导的新冠假病毒体系对比pRV-Fluc(逆转录病毒载体)介导的新冠假病毒体系在4℃保存时间对假病毒稳定性的影响。

图17针对新冠假病毒的中和抗体效价检测(IC90)，293T-hACE2细胞感染-假病毒中和抗体检测。

图18针对新冠假病毒的中和抗体效价检测(IC90)，假病毒中和抗体-检测Fluc酶活检测。

图19针对SARS病毒载体疫苗的中和抗体检测。

图20室温条件下通臭氧灭杀新冠病毒活性变化图。

图21-20℃条件下通臭氧灭杀新冠病毒活性变化图。

附图中COVID19代表COVID-19。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本公开做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而非限定，本公开主要是将COVID-19-S、SARS-CoV-S、MERS-S基因或其截短序列整合到表达系统中，进一步通过构建的dVSVΔG-EGFP-FLuc双报告包装系统可整合该包膜抗原的VSV假病毒，并用于检测相关抗原蛋白在小鼠体内免疫后获得的免疫血清中和抗体生成情况。

本公开采用的试剂及耗材如下：Lipofectamine LTX(Invitrogen 15338100)，PBS(Hyclone SH30256.01)，DMEM高糖培养基(Gibco C11995500)，双抗(Gibco 15140-122)，胎牛血清(Gibco 10091-148)，

I Reduced Serum Medium(Gibco 31985-070)，96孔细胞培养板 (Corning 3599)，6孔细胞培养板(Corning 3516)，6cm细胞培养板(Corning430166)，COVID-19 RBD蛋白(Genescript Biotechnology Ltd Z03485)，COVID-19S1蛋白(Genescript Biotechnology Ltd Z03485)，SARS-CoV S RBD蛋白(Sino Biological40150-V08B2)，MERS-CoV S1蛋白(Sino Biological 40069-V08B1)。

细胞系：

Vero-E6(ATCC、CRL-1586)、293T(ATCC来源)细胞维持在高糖DMEM(SIGMA-ALDRICH) 中，并补充10％FBS(Gibco)、青霉素(100IU/mL)，链霉素(100μg/mL)，在37℃的5％二氧化碳环境中，每2天传代一次，通过感染表达hACE2的慢病毒72h，经嘌呤霉素抗性筛选，获得293T-hACE2细胞。

抗体制备：

用COVID-19刺突蛋白(RBD/S1)、SARS-CoV S RBD、MERS-CoV S1免疫Balb/c小鼠，按 50μg/只，每隔一周免疫一次。初次免疫加入完全佐剂，后续加强免疫加入不完全佐剂，制备COVID-19、SARS-CoV、MERS-CoV刺突蛋白特异性多克隆抗体，并对中和抗体的活性进行鉴定。

不同修饰的包膜表达载体的构建：

分子构建以COVID-19的Spike蛋白(S蛋白)克隆作为重点密码子优化后，分别将S全长序列(1-3822bp)、S缺失C端19个氨基酸序列(1-3765bp)、S缺失C端19个氨基酸序列并加上HA标签(1-3792bp)、S缺失C端27个氨基酸序列(1-3735bp)、S缺失C端53个氨基酸序列(1-3663bp)克隆至pCAGGS载体上，SARS-CoV和MERS-CoV则选取S缺失C端19 个氨基酸作为首选。

实施例1不同类型包膜质粒的构建：

根据NCBI发布的S基因序列经过密码子优化以便于其在细胞内表达，将序列交由南京金斯瑞生物分别合成至pCDNA3.1载体上，PCR扩增目的基因后，经过片段纯化试剂盒回收纯化目的条带，将该片段和pCAGGS载体用限制性核酸内切酶MCS1(Xhol)和MCS2(Nhel)于37℃酶切3h，胶回收载体和目的片段后进行连接反应，再转至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆及酶切和测序验证鉴定质粒构建情况，具体实施步骤如下：1.引物合成及引物信息：引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其中构建扩增COVID-19-S基因所选PCR引物如表 1所示：

表1 COVID-19-S基因扩增与检测引物

1.1扩增COVID-19-S-C19基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表2所示：

表2 COVID-19-S-C19基因扩增

1)扩增COVID-19-S-C27基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表3所示：

表3 COVID-19-S-C27基因扩增

2)扩增COVID-19-S-C53基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表4所示：

表4 COVID-19-S-C53基因扩增

3)扩增COVID-19-S-C19HA基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表5所示：

表5 COVID-19-S-C19HA基因扩增

4)扩增SARS-COV-S-C19基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表6所示：

表6 SARS-COV-S-C19基因扩增

5)扩增MERS-CoV-S-C19基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表7所示：

表7 MERS-CoV-S-C19基因扩增

6)目的基因的获取：以带目的基因序列的pCDNA3.1质粒为模板以表表4引物进行PCR扩增；

7)参照AxyPrep^TM PCR Cleanup kit说明书纯化上述酶切产物，用Nano-300测定产物浓度；

8)将上述纯化产物以及载体进行双酶切(37℃酶切3h)；

9)用1％Agarose gel进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证PCR产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度；

10)将上述纯化产物与载体进行连接(16℃连接过夜，连接比按1:5进行)；

11)参照E.coli DB3.1 Competent Cells(TaKaRa)说明书转化连接产物；

12)挑取LB(Kana)平板上的单克隆到事先加有200μL LB(Kana)培养基的无菌1.5mL 管中，37℃，250rpm，培养3h后，进行Colony PCR筛选阳性克隆；

13)经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，选取阳性克隆按1：500比例转接到15mL摇瓶中，37℃、 250rpm摇床培养14-16h；

14)按照TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒说明书进行质粒提取；

15)将筛选的阳性质粒进行双酶切鉴定(XhoI和NheI在37℃酶切3h)；

16)酶切鉴定后，选取其中鉴定正确的质粒进行质粒测序。

所构建的不同类型假病毒PCR产物如图2所示，根据实验结果可知，六个基因进行PCR 扩增后在相应位置处均出现特异性条带且条带分子大小均正确，表明成功扩增出目的条带，测序结果也表明质粒构建成功。

实施例2 VSV-COVID-19-S-C19-HA在293T-hACE2细胞上的感染显示出更高的效率：

为获得COVID-19不同截短体的刺突蛋白(S)的VSV假病毒，质粒pCAGGS-COVID-19-S、pCAGGS-COVID-19-S-C19、pCAGGS-COVID-19-S-C19-HA、pCAGGS-COVID-19-S-C27、pCAGGS-COVID-19-S-C53分别通过脂质体(lipo2000)转染包装293T)细胞。转染12小时后，将dVSVΔG-Fluc-EGFP(实验室制备保存)即VSV复制缺陷的病毒株分别接种到表达COVID-19 完整刺突蛋白或COVID-19-S-C19/C27/C53/C19-HA截短蛋白的细胞对应的培养基中(真核表达质粒提前瞬转12h)，收集上清液，加入抗VSV-G的中和血清，阻断细胞上清液残留dVSVΔ G-Fluc-EGFP的感染性，收获得到子代病毒，得到病毒表面携带COVID-19不同修饰的刺突蛋白的假病毒，在dVSVΔG-FLuc-EGFP-GP感染后24h、48h、72h收集上清液，然后离心和过滤 (0.45μm孔径，Millipore)以去除细胞碎片，并在-80℃下长期储存。用梯度稀释计数 293T-hACE2假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算假病毒的滴度(单位TU/ml)。

如图3～5所示，通过VSV介导的新冠病毒假病毒的感染效率进行比较发现，全长的S 包装出的假病毒感染效率非常低(EGFP和Fluc双报告基因检测)，表明新冠病毒全长S不适合作为新冠病毒假病毒的包装，而截短的S-C19-HA假病毒比S-C19的感染效率提高了1倍左右，尽管S-C19也可以包装出较高滴度的假病毒，但是在S-C19的3’端融合一个非功能性的标签蛋白(其他短肽亦适用)可以进一步提高包装出的新冠病毒假病毒的滴度，提示融合的短肽发挥了稳定冠状病毒S的空间结构，进一步实验发现MERS或者SARS-S-C19HA的包装滴度显著高于对照组(S基因C端缺失19氨基酸)。

进一步测试293T-hACE2(稳定高表达的hACE2)细胞对新冠假病毒的敏感性，首先在293 细胞和BHK21细胞，新冠假病毒几乎不能感染(图3)，在稳定表达hACE2受体蛋白的细胞系中，新冠假病毒近乎全部感染(荧光显微镜下每个细胞都表达绿色荧光)。进一步在上述一步法包装系统，获得的VSV-COVID-19-S-C19-HA(简写S-C19-HA)假病毒包装滴度是VSV-COVID-19-S全长组的4000倍左右，同样S-C19-HA比VSV-COVID-19-S-C27(简写S-C27)组高15倍。同时新冠病假毒滴度随着收集次数(24h、48h、72h各收集一次)的增加而下降，尤其是第三次收集的上清(72h)中新冠假病毒较低，主要原因是细胞状态不佳以及长时间培养后培养基中pH值的改变导致(图4、图5)，若采取持续灌流培养技术进行补液可以解决上述问题。

实施例3在293T细胞中包装的dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒的滴度最高

新冠假病毒的包装效率的问题是体外进行高通量检测中和抗体试验的主要限制因素之一。为了选择最适合产生新冠假型病毒的细胞系，通过将不同的细胞系预铺在6孔细胞培养板中，在本技术中比较了Vero-E6、BHK21、293T-hACE2和293等常规细胞，首选在上述不同的细胞系中分别转染不同浓度的质粒，然后参照下述的一步法包装方法进行dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA新冠假病毒包装，具体实施步骤如下：

1)Vero/BHK21/293T/293T-hACE2细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70％左右为宜；

2)pCAGGS-S/pCAGGS-S-C19/pCAGGS-S-C19-HA/pCAGGS-S-C27/pCAGGS-S-C53/pCAGGS-VSVG (阳性包膜质粒)分别取0ug、0.25ug、0.5ug、1ug、2ug稀释于100ul opti-MEM并混匀， Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀(质粒：转染试剂＝1：3)；

3)将质粒稀释液与Lipofectamine LTX稀释液缓慢混匀，混匀后室温静置20min；

4)将完全培养基更换成opti-MEM，将混合液加入到培养基中轻轻混匀，37℃，5％CO2培养6h后更换成完全培养基；

5)细胞培养12h后按MOI＝1加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；

6)病毒感染24h、48h、72h各收集一次病毒上清液，按每1mL病毒液加入1ul抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；

7)梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算假病毒的滴度(单位TU/ml)；

8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况；

9)根据假病毒包装滴度确定最适的包装用细胞类型。

统计结果表明，293T-hACE2在包装过程中产生了较为强烈的细胞融合(图6)，其他几种细胞则较为少见，并且病毒滴度随着转染质粒量的增加而逐步提高，转染2μg时包装得到的假病毒滴度最高，但是高浓度的质粒也对细胞的状态产生影响(过量的S蛋白聚集对细胞产生一定的毒性)，标准的TCID50(Karber法)统计结果显示dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒滴度最高(图7)，同时得出在24h收集的包装上清液中含有约每毫升5E5个有效的病毒颗粒。

实施例4一步式假病毒包装方法中，VSV复制缺陷病毒的起始接毒量(MOI)对新冠假病毒产量的影响：

为了进一步提升包装系统获得更高的假病毒包装滴度，进一步测试了VSV复制缺陷病毒 (dVSVΔG-Fluc-EGFP)的起始接毒量，首先按不同MOI感染293T装配细胞(稳定表达COVID-S-C19-HA蛋白)，感染24h后收取病毒液，测定病毒滴度，具体实施步骤如下：

1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70％左右为宜；

2)取pCAGGS-S-C19-HA质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，LipofectamineLTX稀释于100ul opti-MEM并混匀(质粒：转染试剂＝1：3)；

5)细胞培养12h后按MOI＝0、0.01、0.1、0.5、1、2、5加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；

6)病毒感染24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1μL抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；

8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况；

9)根据假病毒包装滴度确定最适的包装用细胞类型。

结果表明，随着加入的dVSVΔG-Fluc-EGFP复制缺陷病毒MOI值的升高，细胞感染逐步增强(图8)，且收获的新冠假病毒滴度逐渐升高，当起始MOI＝1后包装得到的新冠假病毒滴度逐步进入平台期(图9)，因此起始感染复数MOI可以控制在0.1～5的区间，最佳选自MOI＝1。

实施例5预转染冠状病毒包膜表达质粒的时间对包装假病毒滴度的影响

在冠状病毒假病毒包装系统中，冠状病毒包膜质粒的预转染时间也是影响假病毒滴度的另一个因素，进一步测试包膜真核表达质粒的预转染时间对假病毒滴度的影响，第一步在质粒转染12h、24h后按MOI＝1感染dVSVΔG-Fluc-EGFP复制缺陷病毒，24h后收取病毒液，并测定包装出的假病毒滴度，具体实施步骤如下：

1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70％左右为宜；

5)细胞分别培养12h、24h后按最适MOI＝1的条件加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；

7)梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算新冠假病毒的滴度(单位TU/mL)；

8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况。

结果表明，在包膜质粒预转染12h时，假病毒滴度略高于转染24h时的病毒滴度(图10)，当预转染时间持续延长后，发现收毒时细胞状态较差，培养基pH改变影响细胞产毒，因此最适预转染时间在12h,同时，瞬时表达系统的最优预转染时间在12h附近，当采取TetOn诱导表达冠状病毒S蛋白时，需要提前12h加入诱导剂，诱导细胞稳定表达包膜蛋白，之后再加入VSV复制缺陷病毒进行冠状病毒假病毒的包装。

实施例6可诱导体系和质粒瞬转的包装对比，可诱导体系包装的DOX不同浓度摸索

在冠状病毒假病毒包装系统中，装配细胞通过瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白 S，其中，瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现；稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现；诱导表达通过四环素调控tet-on/off载体系统转导细胞实现。

可诱导体系的假病毒包装流程如下：

1)提前40h进行细胞293T-19HA的铺板(铺板可为6孔板、T75瓶、T175瓶、细胞工产等，根据实际需求选择)；

2)提前24h将铺板的细胞换液成含500ng/ml DOX的完全培养基后37度，5％CO2培养

3)加入MOI＝0.5-5的VSV囊膜假病毒

4)24h、48h和72h分别收获第一次、第二次和第三次上清，收获上清后都需要离心2000g， 10min后取上清后4度保存

当采取TetOn诱导表达冠状病毒S蛋白时，需要提前12h加入诱导剂，诱导细胞稳定表达包膜蛋白，之后再加入VSV复制缺陷病毒进行冠状病毒假病毒的包装。本实施例对可诱导体系和质粒瞬转的包装结果进行对比。

质粒瞬转的包装流程如下：

1)提前24h进行细胞293T的铺板(铺板可为6孔板、T75瓶、T175瓶、细胞工产等，根据实际需求选择)

2)提前8h将铺板的细胞先换成无血清培养基后进行质粒转染通过转染试剂PEI和待转质粒pcDNA-19HA以3:1混合后室温孵育15min后加入到已换成无血清的细胞培养基中

3)加入MOI＝0.5-5的VSV囊膜假病毒

根据结果图11可知，可诱导体系的包装相对质粒瞬转的包装收获的24h、48h、72h的上清滴度都较好。图中X轴展示的为可诱导体系的包装何质粒瞬转的包装的24h、48h、72h上清收样，Y轴展示的为对上清进行TCID50检测后的病毒滴度pfu/ml。同时收获的24h、48h、72h的上清都是收获后放入4度保存，以同一时间进行的滴度检测。

应用上述步骤，本实施例还研究了可诱导体系中不同DOX浓度对包装假病毒滴度影响。

结果如图12所示，图中X轴展示的为可诱导体系的包装中DOX的浓度为0ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml。Y轴展示的为对上清进行TCID50检测后的病毒滴度pfu/ml。收获病毒时间都为48h。从图12可以看出DOX为500ng/ml包装出新冠假病毒的滴度最高。

实施例7培养温度对不同包膜改良的假病毒的产毒滴度的影响：

病毒包装时的温度可以影响细胞状态，也会影响培养基pH的变化，对某些病毒的稳定性也会造成巨大的影响，因而进一步检测了假病毒包装的关键因素，即装配细胞的培养温度，具体实施步骤如下：

1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70％左右为宜；

2)取pCAGGS-COVID-19-C19-HA、pCAGGS-SARS-CoV-C19、pCAGGS-MERS-CoV-C19、VSVG质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀(质粒：转染试剂＝1：3)；

5)细胞培养12h后按MOI＝0.5加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；

6)将感染后的细胞分别放置在37℃、35℃、32℃培养箱中培养24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1μL抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；

8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况；

结果表明，对于新冠假病毒而言，温度能够极大的影响病毒滴度，随着温度的降低，病毒滴度逐步升高，在包装新冠假病毒时，最适培养装配细胞的温度是32℃，而SARS、MERS、 VSV复制缺陷假病毒则在35℃时就能获得较为理想的病毒载量(图13)。

实施例8不同包膜修饰型的新冠假病毒稳定性测试：

已知包装出的假病毒的原液滴度和稳定性是影响病毒长期储存和病毒载量的重要因素，将基于VSV复制缺陷载体包装出的新冠假病毒和RV(逆转录病毒载体系统)体系包装出的新冠假病毒滴度和储存稳定性进行平行对比实验，具体实施步骤如下：

1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70％左右为宜；

2)取pCAGGS-COVID-19-C19-HA、质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀(质粒：转染试剂＝1：3)；取pCAGGS-COVID-19-C19-HA 1ug、 pcgp 1.5ug、pRV 2ug稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM 并混匀(质粒：转染试剂＝1：3)；

5)VSV型假病毒在细胞培养12h后按MOI＝0.5加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；

6)VSV型假病毒将感染后的细胞分别放置在37℃培养箱中培养24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；

7)VSV包装的新冠假病毒反复冻融0次、1次、2次、3次，以及病毒原液储存至4℃、-20℃、 -80℃3d、7d，梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目(VSV 假病毒体系)；pRV包装得到的新冠假病毒则在感染后36h收取样本，完毕后储存在4℃、-80℃不同时间，然后根据TCID50(Karber法)计算病毒滴度。

结果表明，如图14～图16所示，两种假病毒在冻融3次后病毒滴度变化较小，保存在 4℃、-20℃、-80℃的新冠滴度在第7天时滴度影响不大，由pRV系统介导的新冠假病毒滴度较低并且保存时间较短，不适合大规模检测使用，同时起始病毒滴度低会影响病毒长久储存的稳定性，而基于VSV系统一步法包装得到的dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒起始滴度 6E5pfu/ml，高于pRV系统的假病毒近100倍，同时在4℃放置7天时间仍保持滴度的稳定性。

实施例9基于假病毒的中和抗体检测

预先在96孔板中的接种293T-hACE2细胞，通过眼眶静脉取血的方式，收集小鼠血清，分别用DMEM完全培养基进行稀释，然后按照2倍的梯度稀释，分别与 dVSV-COVID-19-S-C19-HA病毒(6000TU)、dVSV-SARS-CoV-S-C19(500TU)、dVSV-MERS-CoV-S-C19 (500TU)进行混合，37℃孵育2h，用10％FBS-DMEM重悬病毒和抗体的混合物，将混合物添加到293T-hACE2待检测的细胞悬液中。培养48h后，用荧光拍照设备(Nikon显微镜)拍照获得绿色荧光图像。为了定量检测，测定Fluc报告基因的冷萤光读值，计算出抗体的中和效价。

为了验证包制备的假病毒能否通过中和实验进行抗体中和活性的检测，利用制备的 COVID-19、SARS-CoV、MERS-CoV抗血清进行假病毒中和实验验证，具体操作步骤如下：

1)293T-hACE2细胞铺96孔板，以24h后细胞在70％左右；

2)将血清进行梯度稀释后与等体积的假病毒混合，设置复孔，同时设置未与血清混合的假病毒对照和只加培养基的空白细胞对照；

3)于37℃，5％CO₂培养箱中放置2h；

4)将上一步中的血清-假病毒混合液接种至96孔板中，37℃，5％CO2培养48h；

5)拍照及计算检测萤火虫荧光素酶活性(FLuc)；

根据结果可知(如图17～图19)，利用本专利涉及的包装SARS的假病毒分别用来检测不同类型的疫苗产生的具备病毒中和效力的抗体，由图18可知本次S1蛋白疫苗的血清IC50为 56.9；RBD蛋白疫苗IC50为68.35(定义为血清样本稀释68.35倍后可以有效组织E3的病毒粒子的感染)，新冠假病毒系统使用的是COVID-19-S-C19-HA，对照组背景值很低，同时不同稀释度的稳定性高。在本实施例中，设计路线参照附图1所示的方法，利用dVSVΔG-Fluc-EGFP 一步法包装假病毒的技术，持续开发出SARS-CoV假病毒，如图19所示，利用上述已操作技术包装的SARS假病毒检测了候选疫苗产生的中和抗体的活性，SARS病毒载体疫苗免疫小鼠血清中的IC50约为864.3(图19)，在本技术方案中，SARS假病毒使用的是dVSVΔG-Fluc-EGFP-SARS-C19,使用293T-hACE2细胞来检测中和抗体的活性，与新冠中和抗体的测定方法一致，同时进一步分析发现，SARS疫苗免疫的血清与新冠假病毒没有明显的交叉反应， SARS的假病毒在本实施例中，展现了极佳的置信区间，同时对照血清检测得到的本底Fluc 数值趋于平行线，表明了假病毒进行中和抗体活性检测的稳定性和可重复性，与VSV介导的新冠假病毒的结论一致，同时基于dVSVΔG-Fluc-EGFP包装系统开发的SARS假病毒保持了较高的生物学滴度(SARS假病毒滴度为8E6pfu/ml)，滴度显著高于新冠假病毒，而稳定性与其他冠状假病毒保持一致，进一步推断dVSVΔG-Fluc-EGFP包装系统可适用于开发已知的其他冠状病毒假病毒。

下面通过两个实施例将冠状病毒假病毒作为生物指示剂用来评价消毒杀菌剂的效力：

实施例10新冠COVID-19及其变体假病毒用于检查、评价臭氧消杀能力：

(1)制备新冠假病毒报告系统生物指示剂

a.在稳定表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；

b.将表达新冠COVID-19的Spike蛋白(S蛋白)的装配细胞293T传代至60mm dish中，利用脂质体LipoLTX转染真核表达质粒，转染12h后，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数 MOI＝0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养，24h后收获假病毒上清液，再加入抗VSV的中和抗体处理2h，用0.22um滤膜过滤后即可得到新冠COVID-19假病毒。

(2)病毒污染环境搭建采用冰箱模拟低温冷链运输的环境温度为-40℃～-20℃，将50ul 包装所得初始滴度为2*10⁶TU/ml的新冠假病毒稀释后均匀涂抹在6个6cm塑料基质的培养皿上，在每块dish里面加入50ul的新冠假病毒，初始滴度为2*106TU/ml。

(3)在-40℃～-20℃的实验冰箱内通入臭氧，通30min待检测臭氧浓度稳定在1-50ppm 时，放入3块6cm培养皿作为实验组，另外三块6cm培养皿放入未通入臭氧的同温度环境的对照冰箱内。

(4)在三个不同的时刻，10min、30min、60min分别从实验冰箱和对照冰箱内各取一块6cm培养皿进行滴度测试：

1)将dish中的病毒进行稀释，稀释梯度为10^-1-10^-6，加入到96孔板中。

2)将293T-ACE2细胞按照每孔20000个100ul铺在96孔板中与稀释好的病毒进行混合。

3)37℃5％CO₂培养24h后用荧光拍照设备拍照及计算检测萤火虫荧光素酶活性(FLuc)，计算滴度。

根据结果可知(如图20～21)，臭氧浓度维持在1-200ppm，温度设定为低温冷链温度 (-40℃～-20℃)和室温的条件下，臭氧对新冠假病毒均有较好的消杀能力。且随着臭氧灭活时间的延长，消杀将持续作用，病毒滴度显著降低。对温度的影响进行分析可知，消杀时的环境温度越高，臭氧对新冠病毒的消杀能力越强，在室温条件下，消杀持续10min后，新冠假病毒几乎被完全灭活。对于模拟低温冷链环境的-20℃温度下，由实验结果可知，臭氧在该环境下对新冠假病毒的瞬间消杀率非常可观，时间越长，消杀效果越好，并且滴度均处于较低的状态，在持续一定时间后，臭氧同样可以实现病毒的完全灭活，展现了较好的消杀能力。

序列表

<110> 睿丰康生物医药科技（浙江）有限公司

<120> 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用

<130> 2021

<141> 2021-01-22

<150> 2020105457856

<151> 2020-06-16

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 2

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

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acagccggcg agcagctgca caaggccatg aagagatacg ccctggtgcc cggcaccatc 120

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gtgcggctgg ccgaggccat gaaacgctac ggcctgaaca ccaaccaccg gatcgtggtg 240

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ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaag accatcgccc tgatcatgaa cagcagcggc 600

agcaccggcc tgcctaaagg cgtggccctg cctcaccgga ccgcctgcgt gcggttcagc 660

cacgcccggg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgccat cctgagcgtg 720

gtgcccttcc accacggctt cggcatgttc accaccctgg gctacctgat ctgcggcttc 780

cgggtggtgc tgatgtaccg gttcgaggaa gagctgttcc tgcggagcct gcaggactac 840

aagatccaga gcgccctgct ggtgcccacc ctgttcagct ttttcgccaa gagcaccctg 900

atcgacaagt acgacctgag caacctgcac gagatcgcca gcggcggagc ccccctgtcc 960

aaagaagtgg gcgaagccgt cgccaagcgg ttccacctgc ccggcatccg gcagggctat 1020

ggcctgaccg agaccacaag cgccattctg atcacccccg agggcgacga caagcctggc 1080

gccgtgggca aggtggtgcc tttcttcgag gccaaggtgg tggacctgga caccggcaag 1140

accctgggcg tgaaccagcg gggcgagctg tgcgtgaggg gccccatgat catgagcggc 1200

tacgtgaaca accccgaggc caccaacgcc ctgattgaca aggacggctg gctgcacagc 1260

ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320

ctgatcaagt acaagggcta ccaggtggcc ccagccgagc tggaaagcat cctgctgcag 1380

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cctgccgccg tggtggtgct ggaacacggc aaaaccatga ccgagaaaga aatcgtggac 1500

tacgtggcca gccaggtgac caccgccaag aaactgagag gcggcgtggt gtttgtggac 1560

gaggtgccca agggcctgac aggcaagctg gacgcccgga agatccggga gatcctgatc 1620

aaggccaaga agggcggcaa gggcggcggc ggcagctaa 1659

<210> 3

<211> 15443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tttaattttt atgaaaaaaa ctaacagcaa tcatggaagt ccacgatttt gagaccgacg 60

agttcaatga tttcaatgaa gatgactatg ccacaagaga attcctgaat cccgatgagc 120

gcatgacgta cttgaatcat gctgattaca acctgaattc tcctctaatt agtgatgata 180

ttgacaattt aatcaggaaa ttcaattctc ttccaattcc ctcgatgtgg gatagtaaga 240

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aattccctca ttttgaaaat catatcaaga cttctgttga tgaaggggca aaaattgacc 1020

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tgatttatgg atcgttcaga cattggggtc atccttttat agattattac actggactag 1140

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ttaaagagat tgatgagaag ggcttagatg atgatgatct aattattggt cttaaaggaa 1620

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tgacaatggc ggacgatcta actgcagtca ttaaaaagat gttagattcc tcatccggcc 1800

aaggattgaa gtcatatgag gcaatttgca tagccaatca cattgattac gaaaaatgga 1860

ataaccacca aaggaagtta tcaaacggcc cagtgttccg agttatgggc cagttcttag 1920

gttatccatc cttaatcgag agaactcatg aattttttga gaaaagtctt atatactaca 1980

atggaagacc agacttgatg cgtgttcaca acaacacact gatcaattca acctcccaac 2040

gagtttgttg gcaaggacaa gagggtggac tggaaggtct acggcaaaaa ggatggagta 2100

tcctcaatct actggttatt caaagagagg ctaaaatcag aaacactgct gtcaaagtct 2160

tggcacaagg tgataatcaa gttatttgca cacagtataa aacgaagaaa tcgagaaacg 2220

ttgtagaatt acagggtgct ctcaatcaaa tggtttctaa taatgagaaa attatgactg 2280

caatcaaaat agggacaggg aagttaggac ttttgataaa tgacgatgag actatgcaat 2340

ctgcagatta cttgaattat ggaaaaatac cgattttccg tggagtgatt agagggttag 2400

agaccaagag atggtcacga gtgacttgtg tcaccaatga ccaaataccc acttgtgcta 2460

atataatgag ctcagtttcc acaaatgctc tcaccgtagc tcattttgct gagaacccaa 2520

tcaatgccat gatacagtac aattattttg ggacatttgc tagactcttg ttgatgatgc 2580

atgatcctgc tcttcgtcaa tcattgtatg aagttcaaga taagataccg ggcttgcaca 2640

gttctacttt caaatacgcc atgttgtatt tggacccttc cattggagga gtgtcgggca 2700

tgtctttgtc caggtttttg attagagcct tcccagatcc cgtaacagaa agtctctcat 2760

tctggagatt catccatgta catgctcgaa gtgagcatct gaaggagatg agtgcagtat 2820

ttggaaaccc cgagatagcc aagtttcgaa taactcacat agacaagcta gtagaagatc 2880

caacctctct gaacatcgct atgggaatga gtccagcgaa cttgttaaag actgaggtta 2940

aaaaatgctt aatcgaatca agacaaacca tcaggaacca ggtgattaag gatgcaacca 3000

tatatttgta tcatgaagag gatcggctca gaagtttctt atggtcaata aatcctctgt 3060

tccctagatt tttaagtgaa ttcaaatcag gcactttttt gggagtcgca gacgggctca 3120

tcagtctatt tcaaaattct cgtactattc ggaactcctt taagaaaaag tatcataggg 3180

aattggatga tttgattgtg aggagtgagg tatcctcttt gacacattta gggaaacttc 3240

atttgagaag gggatcatgt aaaatgtgga catgttcagc tactcatgct gacacattaa 3300

gatacaaatc ctggggccgt acagttattg ggacaactgt accccatcca ttagaaatgt 3360

tgggtccaca acatcgaaaa gagactcctt gtgcaccatg taacacatca gggttcaatt 3420

atgtttctgt gcattgtcca gacgggatcc atgacgtctt tagttcacgg ggaccattgc 3480

ctgcttatct agggtctaaa acatctgaat ctacatctat tttgcagcct tgggaaaggg 3540

aaagcaaagt cccactgatt aaaagagcta cacgtcttag agatgctatc tcttggtttg 3600

ttgaacccga ctctaaacta gcaatgacta tactttctaa catccactct ttaacaggcg 3660

aagaatggac caaaaggcag catgggttca aaagaacagg gtctgccctt cataggtttt 3720

cgacatctcg gatgagccat ggtgggttcg catctcagag cactgcagca ttgaccaggt 3780

tgatggcaac tacagacacc atgagggatc tgggagatca gaatttcgac tttttattcc 3840

aagcaacgtt gctctatgct caaattacca ccactgttgc aagagacgga tggatcacca 3900

gttgtacaga tcattatcat attgcctgta agtcctgttt gagacccata gaagagatca 3960

ccctggactc aagtatggac tacacgcccc cagatgtatc ccatgtgctg aagacatgga 4020

ggaatgggga aggttcgtgg ggacaagaga taaaacagat ctatccttta gaagggaatt 4080

ggaagaattt agcacctgct gagcaatcct atcaagtcgg cggatgtata ggttttctat 4140

atggagactt ggcgtataga aaatctactc atgccgagga cagttctcta tttcctctat 4200

ctatacaagg tcgtattaga ggtcgaggtt tcttaaaagg gttgctagac ggattaatga 4260

gagcaagttg ctgccaagta atacaccgga gaagtctggc tcatttgaag aggccggcca 4320

acgcagtgta cggaggtttg atttacttga ttgataaatt gagtgtatca cctccattcc 4380

tttctcttac tagatcagga cctattagag acgaattaga aacgattccc cacaagatcc 4440

caacctccta tccgacaagc aaccgtgata tgggggtgat tgtcagaaat tacttcaaat 4500

accaatgccg tctaattgaa aagggaaaat acagatcaca ttattcacaa ttatggttat 4560

tctcagatgt cttatccata gacttcattg gaccattctc tatttccacc accctcttgc 4620

aaatcctata caagccattt ttatctggga aagataagaa tgagttgaga gagctggcaa 4680

atctttcttc attgctaaga tcaggagagg ggtgggaaga catacatgtg aaattcttca 4740

ccaaggacat attattgtgt ccagaggaaa tcagacatgc ttgcaagttc gggattgcta 4800

aggataataa taaagacatg agctatcccc cttggggaag ggaatccaga gggacaatta 4860

caacaatccc tgtttattat acgaccaccc cttacccaaa gatgctagag atgcctccaa 4920

gaatccaaaa tcccctgctg tccggaatca ggttgggcca attaccaact ggcgctcatt 4980

ataaaattcg gagtatatta catggaatgg gaatccatta cagggacttc ttgagttgtg 5040

gagacggctc cggagggatg actgctgcat tactacgaga aaatgtgcat agcagaggaa 5100

tattcaatag tctgttagaa ttatcagggt cagtcatgcg aggcgcctct cctgagcccc 5160

ccagtgccct agaaacttta ggaggagata aatcgagatg tgtaaatggt gaaacatgtt 5220

gggaatatcc atctgactta tgtgacccaa ggacttggga ctatttcctc cgactcaaag 5280

caggcttggg gcttcaaatt gatttaattg taatggatat ggaagtgcgg gattcttcta 5340

ctagcctgaa aattgagacg aatgttagaa attatgtgca ccggattttg gatgagcaag 5400

gagttttaat ctacaagact tatggaacat atatttgtga gagcgaaaag aatgcagtaa 5460

caatccttgg tcccatgttc aagacggtcg acttagttca aacagaattt agtagttctc 5520

aaacgtctga agtatatatg gtatgtaaag gtttgaagaa attaatcgat gaacccaatc 5580

ccgattggtc ttccatcaat gaatcctgga aaaacctgta cgcattccag tcatcagaac 5640

aggaatttgc cagagcaaag aaggttagta catactttac cttgacaggt attccctccc 5700

aattcattcc tgatcctttt gtaaacattg agactatgct acaaatattc ggagtaccca 5760

cgggtgtgtc tcatgcggct gccttaaaat catctgatag acctgcagat ttattgacca 5820

ttagcctttt ttatatggcg attatatcgt attataacat caatcatatc agagtaggac 5880

cgatacctcc gaacccccca tcagatggaa ttgcacaaaa tgtggggatc gctataactg 5940

gtataagctt ttggctgagt ttgatggaga aagacattcc actatatcaa cagtgtttag 6000

cagttatcca gcaatcattc ccgattaggt gggaggctgt ttcagtaaaa ggaggataca 6060

agcagaagtg gagtactaga ggtgatgggc tcccaaaaga tacccgaatt tcagactcct 6120

tggccccaat cgggaactgg atcagatctc tggaattggt ccgaaaccaa gttcgtctaa 6180

atccattcaa tgagatcttg ttcaatcagc tatgtcgtac agtggataat catttgaaat 6240

ggtcaaattt gcgaagaaac acaggaatga ttgaatggat caatagacga atttcaaaag 6300

aagaccggtc tatactgatg ttgaagagtg acctacacga ggaaaactct tggagagatt 6360

aaaaaatcat gaggagactc caaactttaa gtatgaaaaa aactttgatc cttaagaccc 6420

tcttgtggtt tttatttttt atctggtttt gtggtcttcg tgggtcggca tggcatctcc 6480

acctcctcgc ggtccgacct gggcatccga aggaggacgt cgtccactcg gatggctaag 6540

ggaggggccc ccgcggggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 6600

ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 6660

tgctgaaagg aggaactata tccggatcga gacctcgata ctagtattgc gttgcgctca 6720

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 6780

gcggggagag gcggtttgcg tagagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa 6840

accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc 6900

atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg 6960

acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag 7020

cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc 7080

ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg 7140

ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta 7200

acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc 7260

agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc 7320

gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa tcccccttac 7380

acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg ctttatcaga 7440

agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga acaggcagac 7500

atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct cgcgcgtttc 7560

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 7620

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 7680

cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg 7740

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 7800

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 7860

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 7920

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 7980

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 8040

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 8100

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 8160

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 8220

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 8280

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 8340

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 8400

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 8460

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 8520

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 8580

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 8640

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 8700

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 8760

ggtctgacag ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag 8820

gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga 8880

ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat 8940

caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat 9000

gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagtttatg catttctttc cagacttgtt 9060

caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca 9120

ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa 9180

caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg 9240

aatcaggata ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc agggatcgca gtggtgagta 9300

accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg 9360

tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat 9420

gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg 9480

attgcccgac attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat 9540

ttaatcgcgg cctagagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcatactc ttcctttttc 9600

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 9660

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgcga 9720

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 9780

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 9840

ttgtaatacg actcactata ggacgaagac aaacaaacca ttattatcat taaaaggctc 9900

aggagaaact ttaacagtaa tcaaaatgtc tgttacagtc aagagaatca ttgacaacac 9960

agtcgtagtt ccaaaacttc ctgcaaatga ggatccagtg gaatacccgg cagattactt 10020

cagaaaatca aaggagattc ctctttacat caatactaca aaaagtttgt cagatctaag 10080

aggatatgtc taccaaggcc tcaaatccgg aaatgtatca atcatacatg tcaacagcta 10140

cttgtatgga gcattaaagg acatccgggg taagttggat aaagattggt caagtttcgg 10200

aataaacatc gggaaagcag gggatacaat cggaatattt gaccttgtat ccttgaaagc 10260

cctggacggc gtacttccag atggagtatc ggatgcttcc agaaccagcg cagatgacaa 10320

atggttgcct ttgtatctac ttggcttata cagagtgggc agaacacaaa tgcctgaata 10380

cagaaaaaag ctcatggatg ggctgacaaa tcaatgcaaa atgatcaatg aacagtttga 10440

acctcttgtg ccagaaggtc gtgacatttt tgatgtgtgg ggaaatgaca gtaattacac 10500

aaaaattgtc gctgcagtgg acatgttctt ccacatgttc aaaaaacatg aatgtgcctc 10560

gttcagatac ggaactattg tttccagatt caaagattgt gctgcattgg caacatttgg 10620

acacctctgc aaaataaccg gaatgtctac agaagatgta acgacctgga tcttgaaccg 10680

agaagttgca gatgaaatgg tccaaatgat gcttccaggc caagaaattg acaaggccga 10740

ttcatacatg ccttatttga tcgactttgg attgtcttct aagtctccat attcttccgt 10800

caaaaaccct gccttccact tctgggggca attgacagct cttctgctca gatccaccag 10860

agcaaggaat gcccgacagc ctgatgacat tgagtataca tctcttacta cagcaggttt 10920

gttgtacgct tatgcagtag gatcctctgc cgacttggca caacagtttt gtgttggaga 10980

taacaaatac actccagatg atagtaccgg aggattgacg actaatgcac cgccacaagg 11040

cagagatgtg gtcgaatggc tcggatggtt tgaagatcaa aacagaaaac cgactcctga 11100

tatgatgcag tatgcgaaaa gagcagtcat gtcactgcaa ggcctaagag agaagacaat 11160

tggcaagtat gctaagtcag aatttgacaa atgaccctat aattctcaga tcacctatta 11220

tatattatgc tacatatgaa aaaaactaac agatatcatg gataatctca caaaagttcg 11280

tgagtatctc aagtcctatt ctcgtctgga tcaggcggta ggagagatag atgagatcga 11340

agcacaacga gctgaaaagt ccaattatga gttgttccaa gaggatggag tggaagagca 11400

tactaagccc tcttattttc aggcagcaga tgattctgac acagaatctg aaccagaaat 11460

tgaagacaat caaggcttgt atgcaccaga tccagaagct gagcaagttg aaggctttat 11520

acaggggcct ttagatgact atgcagatga ggaagtggat gttgtattta cttcggactg 11580

gaaacagcct gagcttgaat ctgacgagca tggaaagacc ttacggttga catcgccaga 11640

gggtttaagt ggagagcaga aatcccagtg gctttcgacg attaaagcag tcgtgcaaag 11700

tgccaaatac tggaatctgg cagagtgcac atttgaagca tcgggagaag gggtcattat 11760

gaaggagcgc cagataactc cggatgtata taaggtcact ccagtgatga acacacatcc 11820

gtcccaatca gaagcagtat cagatgtttg gtctctctca aagacatcca tgactttcca 11880

acccaagaaa gcaagtcttc agcctctcac catatccttg gatgaattgt tctcatctag 11940

aggagagttc atctctgtcg gaggtgacgg acgaatgtct cataaagagg ccatcctgct 12000

cggcctgaga tacaaaaagt tgtacaatca ggcgagagtc aaatattctc tgtagactat 12060

gaaaaaaagt aacagatatc acgatctaag tgttatccca atccattcat catgagttcc 12120

ttaaagaaga ttctcggtct gaaggggaaa ggtaagaaat ctaagaaatt agggatcgca 12180

ccaccccctt atgaagagga cactagcatg gagtatgctc cgagcgctcc aattgacaaa 12240

tcctattttg gagttgacga gatggacacc tatgatccga atcaattaag atatgagaaa 12300

ttcttcttta cagtgaaaat gacggttaga tctaatcgtc cgttcagaac atactcagat 12360

gtggcagccg ctgtatccca ttgggatcac atgtacatcg gaatggcagg gaaacgtccc 12420

ttctacaaaa tcttggcttt tttgggttct tctaatctaa aggccactcc agcggtattg 12480

gcagatcaag gtcaaccaga gtatcacgct cactgcgaag gcagggctta tttgccacat 12540

aggatgggga agacccctcc catgctcaat gtaccagagc acttcagaag accattcaat 12600

ataggtcttt acaagggaac gattgagctc acaatgacca tctacgatga tgagtcactg 12660

gaagcagctc ctatgatctg ggatcatttc aattcttcca aattttctga tttcagagag 12720

aaggccttaa tgtttggcct gattgtcgag aaaaaggcat ctggagcgtg ggtcctggac 12780

tctatcggcc acttcaaatg agctagtcta acttctagct tctgaacaat ccccggttta 12840

ctcagtctcc cctaattcca gcctctcgaa caactaatat cctgtctttt ctatccctat 12900

gaaaaaaact aacagagatc gatctgttta cgcgtcacta tggaagatgc caagaacatc 12960

aagaaaggcc ctgccccctt ctaccccctg gaagatggca cagccggcga gcagctgcac 13020

aaggccatga agagatacgc cctggtgccc ggcaccatcg ccttcaccga cgcccacatc 13080

gaggtggaca tcacctacgc cgagtatttc gagatgagcg tgcggctggc cgaggccatg 13140

aaacgctacg gcctgaacac caaccaccgg atcgtggtgt gcagcgagaa cagcctgcag 13200

ttcttcatgc ccgtgctggg cgccctgttc atcggcgtgg ccgtggcccc tgccaacgac 13260

atctacaacg agcgggagct gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtggtgttc 13320

gtgagcaaga agggcctgca gaaaatcctg aacgtgcaga agaagctgcc catcatccag 13380

aaaatcatca tcatggacag caagaccgac taccagggct tccagagcat gtacaccttc 13440

gtgaccagcc acctgccccc tggcttcaac gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac 13500

cgggacaaga ccatcgccct gatcatgaac agcagcggca gcaccggcct gcctaaaggc 13560

gtggccctgc ctcaccggac cgcctgcgtg cggttcagcc acgcccggga ccccatcttc 13620

ggcaaccaga tcatccccga caccgccatc ctgagcgtgg tgcccttcca ccacggcttc 13680

ggcatgttca ccaccctggg ctacctgatc tgcggcttcc gggtggtgct gatgtaccgg 13740

ttcgaggaag agctgttcct gcggagcctg caggactaca agatccagag cgccctgctg 13800

gtgcccaccc tgttcagctt tttcgccaag agcaccctga tcgacaagta cgacctgagc 13860

aacctgcacg agatcgccag cggcggagcc cccctgtcca aagaagtggg cgaagccgtc 13920

gccaagcggt tccacctgcc cggcatccgg cagggctatg gcctgaccga gaccacaagc 13980

gccattctga tcacccccga gggcgacgac aagcctggcg ccgtgggcaa ggtggtgcct 14040

ttcttcgagg ccaaggtggt ggacctggac accggcaaga ccctgggcgt gaaccagcgg 14100

ggcgagctgt gcgtgagggg ccccatgatc atgagcggct acgtgaacaa ccccgaggcc 14160

accaacgccc tgattgacaa ggacggctgg ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac 14220

gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg ctgaagagcc tgatcaagta caagggctac 14280

caggtggccc cagccgagct ggaaagcatc ctgctgcagc accccaacat cttcgatgcc 14340

ggggtggccg gactgcccga cgacgatgcc ggcgagctgc ctgccgccgt ggtggtgctg 14400

gaacacggca aaaccatgac cgagaaagaa atcgtggact acgtggccag ccaggtgacc 14460

accgccaaga aactgagagg cggcgtggtg tttgtggacg aggtgcccaa gggcctgaca 14520

ggcaagctgg acgcccggaa gatccgggag atcctgatca aggccaagaa gggcggcaag 14580

ggcggcggcg gcagctaact caaatcctgc taggtatgaa aaaaactaac agatatcacg 14640

ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 14700

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 14760

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 14820

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 14880

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 14940

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 15000

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 15060

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 15120

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 15180

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 15240

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 15300

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 15360

aagtaagcta gccagattct tcatgtttgg accaaatcaa cttgtgatac catgctcaaa 15420

gaggcctcaa ttatatttga gtt 15443

<210> 4

<211> 1236

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu

1 5 10 15

Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln

20 25 30

His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg

35 40 45

Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser

50 55 60

Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val

65 70 75 80

Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn

85 90 95

Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln

100 105 110

Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys

115 120 125

Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met

130 135 140

Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr

145 150 155 160

Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser

165 170 175

Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly

180 185 190

Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp

195 200 205

Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu

210 215 220

Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro

225 230 235 240

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Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1025 1030 1035 1040

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1125 1130 1135

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1140 1145 1150

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1155 1160 1165

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1170 1175 1180

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile

1205 1210 1215

Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

1220 1225 1230

Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1250 1255 1260

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ctagctagct taggtgtagt gcagcttcac 30

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ctagctagct taacagcagc ttccacaaga aca 33

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ctagctagct tagcccttca ggcaggaaca gcag 34

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

ctagctagct tagaagccca gccagatgta cc 32

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ctagctagct taggcataat ctggcacatc ataagggtaa cagcagcttc cacaagaaca 60

gca 63

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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ccgctcgaga tgttcatctt tctgctgttc 30

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

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ctagctagct taacagcaag atccacagga gca 33

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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ccgctcgaga tgatacactc agtgtttc 28

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

ctagctagct taattacact taagttttcc c 31

Claims

1.一种冠状病毒假病毒包装系统，其特征在于：包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述冠状病毒为SARS、MERS或COVID-19病毒，所述刺突蛋白S的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换结构基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP，所述VSV的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的基因序列为SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述一种冠状病毒假病毒包装系统,其特征在于：所述装配细胞选自293、293T、293sus、HEK293、HEK293T、HEK293FT、BHK或Vero，所述装配细胞瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现，所述诱导表达通过四环素调控tet-on/off载体系统转导细胞实现。

3.一种假病毒包装系统的一步法包装方法，其特征在于：假病毒包装系统包括权利要求1或2中所述的冠状病毒假病毒包装系统，所述冠状病毒刺突蛋白S的表达为瞬时表达质粒或稳定表达质粒或稳定及诱导表达慢病毒载体介导，将dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞一步混合，一定时间后收集上清液得到冠状病毒假病毒。

4.如权利要求3所述一种假病毒包装系统的一步法包装方法，具体实施步骤如下：

(1)在瞬时或稳定或诱导表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；

(2)将瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞293T传代至60mm dish中，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数MOI＝0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养，24h后收获假病毒上清液，再加入抗VSV的中和抗体处理2h，用0.22um滤膜过滤后即可得到冠状病毒假病毒。

5.如权利要求1或2中所述冠状假病毒包装系统包装出的冠状病毒假病毒作为生物指示剂替代野生型冠状病毒应用于抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价，所述抑制及消杀冠状病毒的物质与方法包括抗冠状病毒中和抗体及大分子、小分子药物、物理消毒杀菌方法、化学消毒杀菌剂。

6.一种冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，步骤如下：

(1)病毒污染环境搭建

(2)消杀处理前冠状病毒假病毒浓度测定

(3)消杀作用过程中及作用后取样测定

将消毒杀菌剂均匀喷洒或涂抹在介质上；

7.权利要求6所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)中的病毒污染环境包括物流环境、居家环境、公共场所环境、学校。

8.权利要求6所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)中可同时构建多个实验组，避免误差过大，步骤(3)中包括假病毒感染293T-hACE2后观察荧光蛋白和荧光素酶表达情况进行假病毒的侵染能力和生物活性滴度(TCID50法，单位PFU/ml)测算以及假病毒核酸拷贝数检测(PCR法)。

9.权利要求6所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(3)中的所述消毒杀菌剂(过氧化合物类、季铵盐类、含氯化合物类、醇类)及物理处理方法，包括臭氧、过氧乙酸、过氧化氢、二氧化氯、双氧水、二氯异氰尿酸钠、紫外线、负离子、辐照等中的一种或多种的不同组合。

10.权利要求6所述冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)、步骤(3)中所述介质包括塑料、泡沫、装订纸板、制盒纸板、纺织品、金属箔片中的一种或多种。