CN111662884B - 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 - Google Patents

一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种假病毒，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源优化的Spike表达序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。本发明的假病毒能够模拟野生型新型冠状病毒感染细胞的过程，可用于研究病毒与宿主细胞的关系、克隆病毒的受体，替代传统的中和试验，用于疾病的鉴别诊断、抗病毒药物的评估筛选及疫苗免疫效果的评价等研究。本发明还涉及该假病毒的包装方法和包含该假病毒的新冠病毒药物评估系统，其中假病毒用于在药物干扰的情况下感染所述过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞，通过检测假病毒中报告基因的表达量(如检测荧光强度等)，进而初步评估药物的有效性。

Description

一种假病毒及其包装方法和药物评估系统
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种假病毒及其包装方法和药物评估系统。
背景技术
在病毒功能研究中，最直接高效的手段当然是操作野生型活病毒。但对于新型冠状病毒这类致病性和传染性很强的病毒，操作野生型活病毒需要在三级以上生物安全防护(P3)实验室里进行，目前国内只有40多家P3实验室，大多属于CDC系统，非常规科研用途。且P3实验室为了防止生物危害，有非常苛刻的防护条件，极大降低了操作效率。
为了能在二级生物安全实验室进行新冠病毒的相关研究，假病毒技术是一种非常有效的替代研究手段。与活病毒相比，假病毒具有相似的细胞感染特点，可以模拟野生型病毒感染细胞的早期过程，而且假病毒内携带的报告基因，可以快速方便地进行各种检测和分析。因此，假病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的关系、克隆病毒的受体，更重要的是可以替代传统的中和试验，用于疾病的鉴别诊断、抗病毒药物的评估筛选及疫苗免疫效果的评价等研究。
SARS-CoV-2与SARS相似，具有相似的基因组构成和病毒结构特征，二者都是通过其包膜Spike蛋白的RBD(receptor binding domain)识别和结合位于靶细胞表面的ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)受体，通过膜融合，进入内体/溶酶体途径达到感染。Spike(S)蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，其含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。同样地，包装一种用于模拟2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染机制的假病毒，S蛋白也成为其设计的关键要素。
驱动S蛋白表达的启动子的筛选难度大。CMV是人们从人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)中发现的强启动子。因此，只要CMV病毒能够感染的细胞，该启动子都能起始转录过程。是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。然而，在2004年，科学家在包装SARS-CoV假病毒系统时发现，在包装细胞中，CMV启动子无法驱动野生型S蛋白的表达，通过密码子优化，S蛋白的量虽有所增加，但仍无法弥补启动子的不足。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种假病毒及其包装方法，在包装假病毒过程中，通过选择和优化启动子，并结合Spike DNA序列的人源表达优化，高效驱动S蛋白在包装细胞中的表达，极大地提高假病毒的感染活性。此外，本发明还提供了一种包含前述假病毒的药物评估系统。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一方面，本发明提供一种假病毒，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源表达优化的Spike DNA序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。
根据本发明的一较佳实施例，其中，所述报告基因含有用于表达绿色荧光蛋白GFP和/或荧光素酶luciferase的基因序列。
根据本发明的一较佳实施例，其中，所述表达新冠病毒包膜蛋白Spike的质粒的基因序列为SEQ ID NO:1。
根据本发明的一较佳实施例，其中，报告基因质粒的基因序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。所述包装辅助质粒购买自Addgene,商品编号为Addgene plasmid#12260。
另一方面，本发明还提供一种假病毒的包装方法，其包括如下步骤：
S1:将全长编码GFP或luciferase的cDNA亚克隆到pLVX-IRES-Puro质粒中，得到载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro，其中载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro的基因序列为SEQ ID NO:2，载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro的基因序列为SEQ ID NO:3；
S2:将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、pSpike过表达质粒及包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生假病毒；其中pSpike过表达质粒含有CBA启动子和人源表达优化的Spike DNA序列。
根据本发明较佳实施例，其中，S2中，所述pSpike过表达质粒的制备方法为：
(1):将CBA promoter亚克隆到PBSK-MCS质粒中，纯化得到启动子载体质粒PBSK-CBA；
(2):将Spike DNA序列进行人源表达优化，得到Spike-opt DNA序列，然后将Spike-opt DNA序列亚克隆到启动子载体质粒PBSK-CBA中，产生基因序列为SEQ ID NO:1的pSpike过表达质粒。
根据本发明较佳实施例，其中，S2中，将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、所述pSpike过表达质粒及包装辅助质粒psPAX2，共转染前一天接种于10层细胞工厂的293T细胞，转染后6小时更换新鲜培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化，得假病毒。
本发明中用到的包装辅助质粒为购买自Addgene,商品编号为Addgene plasmid#12260。
根据本发明较佳实施例，S2纯化过程是使用GE的AKTA avant层析系统，采用DEAE层析，切向流过滤和core700层析纯化工艺，纯化得假病毒。
再一方面，本发明提供一种新冠病毒药物评估系统，其包括：
上述的假病毒；以及过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株；所述假病毒用于在药物干扰的情况下感染293T单克隆细胞，通过计数GFP阳性抗性克隆数或读取luciferase荧光强度来表征假病毒的感染效率，进而初步评估药物的有效性。
其中，所述过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞还用于评估假病毒的感染效率，对获得的假病毒感染性进行筛选。
根据本发明较佳实施例，其中：过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株采用如下方法制备：
步骤一：制备VSV-G伪型包装的慢病毒载体：
将人ACE2全长编码区亚克隆到慢病毒基因转移载体pLVX-IRES-BSD中，得到编码ACE2受体的载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD，其基因序列为SEQ ID NO:4；将载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD、包膜蛋白质粒和包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD；
步骤二:获得过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株
利用VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD感染293T细胞，加入抗生素blasticidin筛选并单克隆化，获得过量表达ACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株。
其中，所用的包膜蛋白质粒为pMD2.G，购自Addgene，商品编号为Addgeneplasmid#12259；所用的包装辅助质粒为psPAX2，购买自Addgene,商品编号为Addgeneplasmid#12260。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用三质粒包装系统，并以表达新冠病毒包膜蛋白Spike的质粒(pSpike过表达质粒)，替代表达VSV.G蛋白的质粒，最终包装成为可表达Spike蛋白的慢病毒假病毒。
在包装该慢病毒假病毒时选择以CBA为启动子，用于高效驱动人源表达优化的Spike DNA序列(即Spike-opt DNA序列)在包装细胞中的表达，得到高水平表达Spike蛋白的质粒载体，极大地提高了本发明假病毒的感染能力。使用人源表达优化的Spike-opt DNA序列相对于野生型Spike DNA序列，前者在包装细胞中S蛋白表达更强，有利于提高S包膜蛋白的表达量。
(2)本发明的假病毒是复制缺陷型，只能感染一次靶细胞，不能再次产生新的子代病毒，避免了继发感染的危险。在报告基因方面，携带绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶(Luciferase)，适用于不同用途。其中含绿色荧光蛋白GFP基因的假病毒用于药物有效性细胞水平的评估，而含luciferase基因的假病毒,既可用于药物有效性细胞水平的评估，也可用于动物模型的评估。
附图说明
图1为不同启动子(CBA、CMV、EF1a)驱动野生型S蛋白表达的Western Blot检测结果。
图2为Western Blot检测野生型和密码子优化的S蛋白表达情况。
图3为采用DEAE纯化慢病毒图谱【纯化的第三步】。
图4为采用Core 700纯化慢病毒图谱【纯化的第五步】。
图5Luciferase假病毒感染细胞表达荧光素酶的活性检测。
图6为GFP假病毒感染细胞表达绿色荧光蛋白的荧光强度检测。
图7为过表达ACE2受体的pLVX-ACE2-IRES-BSD质粒的结构示意图。
图8为混合克隆和单克隆细胞株中hACE2的表达图。
图9为假病毒感染不同细胞株的克隆形成试验。
图10是以DLVT001和DLVT002两种药物感染后，GFP假病毒对过量表达人ACE2基因的293T细胞的感染能力；Ctrl为对照组，DLVT001组和DLVT002组为药物处理组。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明的主要创新点在于：在包装假病毒时，选择以CBA为启动子驱动包膜蛋白Spike的表达、以人源表达优化的Spike DNA序列取代野生型Spike DNA序列，借此获得可高表达S包膜蛋白的慢病毒假病毒。在构建本发明新冠肺炎药物评估系统时，还构建了可过量、稳定表达hACE2受体的单克隆293T的细胞株，以放大假病毒对细胞的感染效应，有助于利用该系统做药效评估时，获得较准确的评估结果。在克隆纯化过程中，本发明独创了“澄清→核酸酶消化→阴离子交换层析→浓缩换液→分子排阻层析”五步式慢病毒载体的纯化方法，可获得高纯度的慢病毒假病毒，置于DMEM培养基或1mg/ml的BSA中于-80℃保存，可较长时间保存的病毒载体。
以下结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案和效果。
一、GFP假病毒的构建
(1)将启动子CBA promoter亚克隆到PBSK-MCS质粒，得到载体质粒PBSK-CBA。该克隆过程为：将PBSK-MCS质粒用限制性内切酶KpnI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约为2900bp。将CBA promoter进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和KpnI/XbaI酶切位点。PCR片段利用KpnI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为900bp。胶回收试剂盒分别回收PBSK载体和CBA启动子片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒PBSK-CBA，进行KpnI和XbaI双酶切鉴定后测序，PBSK-CBA载体构建成功。
(2)将Spike DNA序列进行人源表达优化，得到Spike-opt DNA序列。优化方法为：在苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成并对全序列进行人源表达优化。
原始Spike DNA序列(WT)参见SEQ ID No:7，优化后Spike-opt DNA序列(opt)参见SEQ ID No:8所列序列。原始S蛋白表达序列和人源表达优化后的S蛋白表达序列的比对如下：
Figure BDA0002544332210000081
Figure BDA0002544332210000091
Figure BDA0002544332210000101
Figure BDA0002544332210000111
Figure BDA0002544332210000121
Figure BDA0002544332210000131
Figure BDA0002544332210000141
(3)将Spike-opt DNA序列亚克隆到PBSK-CBA载体质粒中，pSpike过表达质粒。克隆的操作过程为：
将PBSK-CBA质粒用限制性内切酶XbaI和XhoI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约4000bp。将Spike-opt进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和XbaI/XhoI酶切位点。PCR片段利用XbaI和XhoI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为3800bp。胶回收试剂盒分别回收PBSK-CBA载体和Spike-opt片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行XbaI和XhoI双酶切鉴定后测序，PBSK-CBA-Spike-opt构建成功。
经测序可知，PBSK-CBA-Spike-opt质粒的基因序列为SEQ ID NO:1。
(4)将全长编码GFP的cDNA亚克隆到pLVX-IRES-Puro载体质粒中得到报告基因载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro。上述过程条件为：将pLVX-IRES-Puro质粒用限制性内切酶EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约8800bp。将GFP进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/XbaI酶切位点。PCR片段利用EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为720bp。胶回收试剂盒分别回收pLVX-IRES-Puro载体和GFP片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定后测序，pLVX-GFP-IRES-Puro构建成功。
经测序可知，报告基因载pLVX-GFP-IRES-Puro体质粒的基因序列为SEQ ID NO:2。
(5)将步骤(3)的载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro、步骤(3)的pSpike过表达质粒(PBSK-CBA-Spike-opt质粒)和包装辅助质粒psPAX2(购自Addgene，商品编号Addgeneplasmid#12260)，共转染前一天接种于10层细胞工厂的293T细胞，转染后6小时更换新鲜DMEM培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化。
转染条件和过程的条件为：转染前24小时接种1.00E+09 293T细胞于10层细胞工厂中。配置转染体系含80ml opti-MEM培养基，750ug pLVX-luciferase-IRES-Puro质粒，500ug psPAX2质粒，250ug pSpike质粒和转染试剂。转染体系加入10层细胞工厂，轻柔混匀。转染6小时后更换新鲜的DMEM 1000ml。继续培养细胞，转染完72小时后收获培养基(含假病毒)。
纯化采用GE的AKTA avant层析系统，采用DEAE层析，切向流过滤和core700层析纯化工艺，纯化得GFP假病毒，具体纯化过程如下：
①MF(澄清):病毒收获液经过滤(0.45μm)的处理，以除去293T细胞及碎片等不溶性微粒，提高溶液的澄清度，以便后续的层析纯化处理。
②Benzonase treatment(核酸酶消化)：用25U/ml的Benzonase于37℃处理1小时，将转染过程残留的质粒DNA和死去的细胞释放的基因组等污染物去除85％以上。也可以将第一步的澄清液进行浓缩以后，再进行本步骤，如此既可以降低消化酶的使用成本，亦可进一步提高核酸的去除率。
③IEX(阴离子交换层析)：采用整体柱CIM DEAE，进行阴离子交换层析，该步骤可以去除99％的蛋白和DNA污染物，病毒收率很高达80％以上，且可在高流速下保持更高的载量。如图3所示，为本步骤的DEAE纯化慢病毒图谱，图谱显示杂质蛋白在第一个峰出现，收集病毒峰(如图中箭头所指)。
④UF/DF(浓缩换液)：IEX层析的洗脱液经浓缩换液后，再进行最后的分子排阻层析纯化。由于慢病毒的颗粒较大，直径约80-120nm，需要采用截留分子量500kDa的膜做TFF(切相流过滤)。在浓缩换液过程，一些小分子杂质可以有效去除，从而达到了提纯的目的。
⑤SEC(分子排阻层析)：采用Core 700层析填料，将大于700kDa的病毒等粒子经外水体积排出，而分子量更小的杂质则进入填料的孔内，被吸附于其中，上样量大，除杂能力好。该步骤收率可达到40％。如图4所示，为本步骤的Core 700纯化慢病毒图谱，图谱显示病毒在第一个峰出现(如图中箭头所指)，杂质蛋白在第二个峰出现。
⑥Storage(保存)：SEC纯化液，采用0.2um膜过滤，分装，于-80℃保存。由于在反复冻融中假病毒的感染能力会极大降低，因此将其置于DMEM培养基或1mg/ml的BSA中保存，提供冻融过程的保护。
二、Luciferase假病毒的构建
采用上述相同的方法和条件，只是将第(4)步中，将“全长编码GFP的cDNA”替换为“全长编码luciferase的cDNA”，亚克隆到pLVX-IRES-Puro，得到报告基因载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro。其余步骤则均按照第“一”部分的(1)—(3)、(5)的方法操作。
上述过程条件为：将pLVX-IRES-Puro质粒用限制性内切酶EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约8800bp。将luciferase进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/XbaI酶切位点。PCR片段利用EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为1650bp。胶回收试剂盒分别回收pLVX-IRES-Puro载体和luciferase片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定后测序，pLVX-luciferase-IRES-Puro构建成功。
经测序可知，报告基因载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro的基因序列为SEQID NO:3。其余操作步骤和条件参照第“一”部分的(1)-(3)、(5)进行，最终包装得luciferase假病毒。
三、采用不同启动子构建假病毒时S蛋白的表达量比较
采用上述相同的方法和条件，只是替换利用不同的启动子(CBA、CMV、EF1a)和野生型Spike DNA序列(未进行人源表达优化)来构建假病毒。
分别将启动子CBA、CMV、EF1a亚克隆到PBSK-MCS质粒，分别纯化得到载体质粒PBSK-CBA、PBSK-CMV和PBSK-EF1a。
将野生型Spike DNA序列分别亚克隆到载体质粒PBSK-CBA、PBSK-CMV和PBSK-EF1a中，得到PBSK-CBA-Spike质粒(基因序列为SEQ ID No:5)、PBSK-CMV-Spike质粒和PBSK-EF1a-Spike质粒(CMV和EF1a为现有常用启动子)。
采用Western Blot检测，上述三种不同质粒包装的假病毒中，S蛋白的表达情况，结果如图1所示。结果证明以CMV,CBA和EF1a三种不同启动子比较，以CBA promoter为启动子驱动S蛋白表达最强。
四、野生型Spike DNA和人源表达优化型Spike-opt DNA构建假病毒时S蛋白的表达量比较
采用上述相同的方法和条件，只是在第(2)步中，采用野生型的(WT)Spike DNA序列亚克隆到PBSK-CBA载体质粒中，再利用GE的AKTA avant层析系统纯化，得到PBSK-CBA-Spike质粒(其序列为SEQ ID No:5)，比较野生型Spike DNA和优化型Spike-opt DNA构建的假病毒中S蛋白的表达情况。
采用Western Blot检测，检测由PBSK-CBA-Spike质粒和PBSK-CBA-Spike-opt(其序列为SEQ ID No:1)质粒包装的假病毒中S蛋白的表达情况，其结果如图2所示。结果证明以，野生型的(WT)Spike DNA与密码子优化的Spike DNA-opt相比，经过密码子优化后的S蛋白表达更强。
五、GFP假病毒和Luciferase假病毒感染活力的检测
(1)Luciferase假病毒：将高表达hACE2的293T细胞接种在培养皿中,感染前1小时更换含polybrene培养基。分别以0.05μL、0.5μL、5μL的Luciferase假病毒感染细胞。16小时后，换新鲜培养基。感染72小时后，利用荧光素酶报告系统检测病毒感染活力，荧光素酶活性与假病毒用量呈正比。结果如图5所示，Luciferase假病毒的感染活性为5E+10RLU/ml。
(2)GFP假病毒：将高表达hACE2的293T细胞接种在培养皿中,感染前1小时更换含polybrene培养基。分别以0.0005μL、0.005μL、0.05μL、0.5μL、5μL的GFP假病毒感染细胞。16小时后，换新鲜培养基。感染72小时后，利用荧光显微镜检测病毒感染活力，荧光强度与假病毒用量呈正比。结果如图6所示，GFP假病毒感染活性为7E+07TU/ml。
以上结果表明，本发明所包装的Luciferase假病毒和GFP假病毒都对细胞具有很强的病毒感染活力，且感染活力可直接采用荧光检测设备得到直观体现。
六、新冠病毒药物评估系统的构建
(1)慢病毒载体制备
将pLVX-IRES-Puro质粒用限制性内切酶EcoRI和MluI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约7600bp。将ACE2-IRES-BSD进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上25bp同源臂。PCR片段琼脂糖电泳后切胶回收，约为3500bp。胶回收试剂盒分别回收pLVX载体和ACE2-IRES-BSD片段，加入10ul无缝克隆体系，50摄氏度反应15分钟，无缝克隆产物转化至大肠杆菌：取5ul产物转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定后测序，pLVX-ACE2-IRES-BSD构建成功(结构如图7所示)。经测序，载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD的基因序列为SEQ ID NO:4。然后，以载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD、包膜蛋白质粒pMD2.G(购自Addgene，商品编号为Addgene plasmid#12259)和包装质粒psPAX2(购买自Addgene,商品编号为Addgeneplasmid#12260)，转染293T，包装得到hACE2慢病毒载体。
(2)基于LentiQ工艺的慢病毒载体纯化
hACE2慢病毒载体的纯化，按照第“一”部分步骤(5)中①-⑥所列的“澄清→核酸酶消化→阴离子交换层析→浓缩换液→分子排阻层析”五步式纯化方法进行纯化，使产物纯度极高；同时采用0.2um膜过滤，分装，置于DMEM培养基或1mg/ml的BSA中于-80℃保存，可较长时间保存的病毒载体。
(3)获得稳定表达hACE2的单克隆293T的细胞株
利用VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD感染293T细胞，感染24小时后更换新鲜培养基，加入抗生素blasticidin(浓度为30ug/ml)筛选10-12天并利用无限稀释法使细胞单克隆化，已经获得过量表达hACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株。
通过Western Blot验证hACE2的表达，结果如图8所示，图示结果可知，混合克隆和单克隆细胞株中hACE2均有稳定表达。
(4)筛选感染灵敏度提高数倍的单克隆细胞株
通常情况下，经过上述第(3)步，已获得了稳定高表达hACE2基因的混合克隆和单克隆细胞株。本步骤是优选步骤而非必经步骤。
本步骤进一步筛选感染灵敏度更高的单克隆细胞株。具体是：
①将过表达和ACE2的293T细胞混合克隆和单克隆细胞株利用胰蛋白酶消化并计数，接种于1.5E+5个细胞于12孔板每孔中。
②24小时后，更换含有8ug/ml polybrene的新鲜DMEM新鲜培养基500ul。加入2E+6vg携带报告基因GFP的假病毒(前述制备的GFP假病毒)。
③感染24小时后更换含有2ug/ml puromycin的新鲜培养基，继续培养，每2-3天更换培养基。
④培养一周以后，筛选计数GFP阳性集落数，获得比混合细胞克隆感染灵敏度提高数倍的单克隆细胞株。
结果如图9所示，经进一步筛选后，得到表达ACE2受体能力最强的YJ1B09单克隆细胞株。相比混合克隆和其它单克隆细胞株，YJ1B09更容易被假病毒感染。因此，本发明的评估系统中，优选以本步骤筛选的YJ1B09细胞株作为药物评估假病毒试剂盒中的固定搭配。
七、新冠病毒药物评估系统的应用
现以DLVT001和DLVT002两种药物为例，举例说明本发明的包含“GFP假病毒或luciferase假病毒、过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株”的药物评估系统(试剂盒)，在评估新冠肺炎药物有效性中，应用方法如下：
(1)、细胞接种：接种过量表达人ACE2基因的293T细胞株于六孔板中，至过夜20-30％密度为宜。
(2)、药物提前处理：感染前1小时更换含polybrene培养基，同时加入阳性对照(Ctrl组)和合适浓度药物(分别是DLVT001和DLVT002)。
(3)、假病毒感染：加入层析纯化的高滴度GFP假病毒，24小时后更换含有抗生素的新鲜培养基。每三天更换一次。
(4)、显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的细胞。细胞筛选7-10天后，观察细胞集落，待肉眼可见后，吸光培养基，进行结晶紫染色。
结果如图10所示，与Ctrl组相比，DLVT001和DLVT002两组的绿色荧光强度明显减弱，由此说明，这两种药物均能明显抑制假病毒对细胞的感染。
序列表
<110> 中吉当康（北京） 基因技术有限公司
<120> 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统
<130> EJS200357I
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8113
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60
ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180
ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240
accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300
gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360
gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420
caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600
ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacccg 660
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 720
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgtcaatagg gactttccat tgacgtcaat 780
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 840
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 900
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 960
tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc 1020
caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg 1080
gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag 1140
gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc 1200
ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgcgctgcc 1260
ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg 1320
cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct 1380
tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag gggctccggg 1440
agggcccctc tgctaaccat gttcatgcct tcttctcttt cctacagctc ctgggcaacg 1500
tgctggttgt tgtgctgtct catcattttg gcaaatctag agccaccatg tttgtgtttc 1560
ttgtgcttct tcctcttgtg tcatcacaat gcgtgaacct tacaacaaga acacaacttc 1620
ctcctgcata cacaaactca tttacaagag gtgtatatta tccagacaaa gtgtttagat 1680
catcagtgct tcactcaaca caagatttat ttctaccgtt cttctcgaac gtgacatggt 1740
ttcacgcaat ccacgtgtca ggaacaaacg gaacaaagcg attcgataac cctgtgcttc 1800
ctttcaatga cggagtgtac tttgcatcaa cagagaagtc caatatcatc agaggatgga 1860
tctttggaac aacacttgat tctaagactc agtcacttct tatcgtgaac aacgcaacaa 1920
acgtggtgat caaagtgtgc gaatttcagt tctgtaatga cccattccta ggcgtatact 1980
accacaagaa caacaagtca tggatggaat cagaatttcg agtatattct agcgccaaca 2040
actgcacatt tgaatacgtg tcacaacctt tcttaatgga cctagagggt aaacaaggta 2100
atttcaagaa tttgcgcgag ttcgtcttta agaacatcga tggatacttt aagatatatt 2160
caaagcatac tccgataaac cttgtgagag atcttcctca aggattctcg gcccttgaac 2220
ctcttgtgga tcttcctatc ggaatcaaca tcacaagatt tcaaacactt cttgcacttc 2280
acagatcata ccttacacct ggagattcat catcaggatg gacagcagga gcagcagcat 2340
actacgtggg ataccttcaa cctagaacat ttcttcttaa atacaacgag aatggtacaa 2400
tcactgacgc ggttgactgt gcacttgatc ctctttcaga aacaaagtgt acccttaaat 2460
catttacagt ggagaaggga atttatcaaa catcaaactt tagagtgcaa cctacagaat 2520
caatcgtgag atttcctaac atcacaaacc tttgcccttt cggagaagtc tttaacgcaa 2580
caagatttgc atcagtgtac gcatggaaca gaaagaggat ttcaaactgc gtggcagatt 2640
actcagtgct ttacaactca gcatcattct ctactttcaa gtgttacgga gtgtcaccta 2700
caaagctgaa tgatctttgc tttacaaacg tgtacgcaga ttcatttgtg atcagaggag 2760
atgaagtgag acaaatcgca cctggacaaa caggaaagat agctgattac aactacaaac 2820
ttcctgatga tttcacgggc tgtgtcatcg catggaactc aaacaacctt gattcaaagg 2880
tgggcgggaa ttataattat ttgtataggt tattccgaaa gtctaattta aagccctttg 2940
agcgtgatat ctcaacagaa atctaccaag caggatcaac accttgcaac ggagtggaag 3000
gatttaactg ctactttcct cttcaatcat acggatttca acctacaaac ggagtgggat 3060
accaacctta cagagtggtg gtgctttcat ttgaacttct tcacgcacct gcaacagtgt 3120
gcggacctaa gaagtctact aaccttgtga agaataagtg cgtgaacttt aactttaacg 3180
gacttacagg aacaggagtg cttacagaat caaacaagaa gtttctacca tttcaacaat 3240
ttggaagaga tatcgcagat acaacggacg ctgtccgcga ccctcaaaca cttgaaatcc 3300
ttgatatcac accttgctca tttggaggag tgtcagtgat cacacctgga acaaacacat 3360
caaaccaagt ggcagtgctt taccaagatg tgaactgcac agaagtgcct gtggcaatcc 3420
acgcagatca acttacacct acatggcggg tctatagcac cggctcaaac gtgtttcaaa 3480
caagagcagg atgccttatc ggagcagaac acgtgaacaa ctcatacgaa tgcgatatcc 3540
ctatcggagc aggaatctgc gcatcatacc aaacacaaac aaactcacct agaagagcaa 3600
gatcagtggc atcacaatca atcatcgcat acacaatgtc acttggagca gagaatagtg 3660
tggcatactc aaacaactca atcgcaatcc ctacaaactt tacaatctca gtgacaacag 3720
agatcctacc ggttagtatg acaaagactt ctgtggattg cacaatgtac atctgcggag 3780
attcaacaga atgctcaaac cttcttcttc aatacggatc attctgtacg caacttaaca 3840
gagcacttac aggaatcgca gtggaacaag ataagaatac tcaagaagtg tttgcacaag 3900
tgaaacaaat ctacaagacg ccgccgataa aggactttgg tggtttcaat ttcagccaga 3960
tcctgccaga cccgtcaaag ccctccaaga ggtcgtttat cgaagatcta ctgttcaata 4020
aggtgacact tgcagatgca ggatttatca aacaatacgg agattgcttg ggtgacattg 4080
ccgccagaga tcttatctgc gcacagaagt tcaatggact tacagtgctt cctcctcttc 4140
ttacagatga aatgatcgca caatacacat cagcacttct tgcaggaaca atcacatcag 4200
gatggacatt tggagcagga gcagcacttc aaatcccttt cgccatgcaa atggcataca 4260
gatttaacgg aatcggagtg acacagaatg ttctttacga gaatcagaaa ctgattgcaa 4320
accaatttaa ctcagcaatc ggaaagatac aggattcact ttcatcaaca gcatcagcac 4380
ttggaaagct ccaggatgtg gtgaaccaga atgcccaagc acttaacaca cttgtgaaac 4440
aactttcatc aaactttgga gcaatctcat cagtgcttaa cgatatcctt tcaagacttg 4500
ataaagtgga agcagaagtg cagattgacc gtctgataac tggaagactt caatcacttc 4560
aaacatacgt cactcagcag ctgattagag cagcagaaat cagagcatca gcaaaccttg 4620
cagcaacaaa gatgagcgaa tgcgtgcttg gacaatcaaa gcgtgttgat ttctgtggca 4680
agggctatca ccttatgtca tttcctcaat cagcacctca cggagtggtg tttcttcacg 4740
tgacatacgt gcctgcacaa gagaagaatt tcacaacagc acctgcaatc tgccacgatg 4800
gaaaggcgca tttcccgaga gagggagtgt ttgtgtcaaa cggaacacac tggtttgtga 4860
cacaaagaaa cttctatgag cctcaaatca tcacaacaga taacacattt gtgtcaggaa 4920
actgcgatgt ggtgatcgga atcgtgaata ataccgtata tgaccctctt caacctgaac 4980
ttgattcatt taaagaagaa cttgataaat actttaagaa tcatacatca cctgatgtgg 5040
atttgggtga cataagcggc atcaacgcat cagtggtgaa catccagaag gaaattgacc 5100
ggttgaatga ggtggcaaag aatctgaacg aatcacttat cgatcttcaa gaacttggaa 5160
agtatgagca atacatcaaa tggccttggt acatctggct tggatttatc gcaggactta 5220
tcgcaatcgt gatggtgaca atcatgcttt gctgcatgac atcatgctgc agctgcctga 5280
aaggatgctg ctcgtgcgga tcgtgctgca aatttgatga agatgattca gaacctgtgc 5340
ttaaaggagt gaaacttcac tacacataac tcgagagatc tacgggtggc atccctgtga 5400
cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca ccagccttgt 5460
cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg 5520
gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag acaacctgta gggcctgcgg 5580
ggtctattgg gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct tggctcactg caatctccgc 5640
ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag ttgttgggat tccaggcatg 5700
catgaccagg ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga cggggtttca ccatattggc 5760
caggctggtc tccaactcct aatctcaggt gatctaccca ccttggcctc ccaaattgct 5820
gggattacag gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt ctgattttgt aggtaaccac 5880
gtgcggaccg agcggccgcc accgcggtgg agctccagct tttgttccct ttagtgaggg 5940
ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 6000
ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 6060
tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 6120
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 6180
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 6240
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 6300
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 6360
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 6420
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6480
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 6540
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6600
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 6660
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 6720
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 6780
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 6840
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 6900
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 6960
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 7020
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 7080
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 7140
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 7200
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 7260
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 7320
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 7380
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 7440
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 7500
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 7560
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 7620
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 7680
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 7740
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 7800
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 7860
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 7920
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 7980
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 8040
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 8100
ccccgaaaag tgc 8113
<210> 2
<211> 9588
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
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aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
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gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgatgagtaa ttcatacaaa aggactcgcc cctgccttgg 2220
ggaatcccag ggaccgtcgt taaactccca ctaacgtaga acccagagat cgctgcgttc 2280
ccgccccctc acccgcccgc tctcgtcatc actgaggtgg agaagagcat gcgtgaggct 2340
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 2400
gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 2460
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 2520
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt 2580
gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 2640
ccacgcccct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 2700
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 2760
cttgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 2820
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 2880
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 2940
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 3000
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 3060
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 3120
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 3180
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 3240
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 3300
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 3360
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 3420
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 3480
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gatctatttc cggtgaattc 3540
gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 3600
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 3660
gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 3720
tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 3780
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 3840
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 3900
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 3960
ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 4020
cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 4080
cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 4140
gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 4200
cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 4260
tacaagtcta gaggcgcgcc ttaattaagt ttaaacatgc attacgtaca tatggttaac 4320
gcgggccgcg gatcccgccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc 4380
ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt 4440
ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 4500
tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 4560
gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 4620
cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 4680
gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 4740
tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 4800
gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta 4860
ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata agcttgccac 4920
aacccacaag gagacgacct tccatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc 4980
gcgacgacgt cccccgggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca 5040
cgcgccacac cgtcgacccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct 5100
tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg 5160
tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc 5220
cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc 5280
tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg 5340
accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc 5400
gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc 5460
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gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt 5820
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cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc 6060
ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg 6120
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gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc aataaaggag 6540
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tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga gagctgcatc 6660
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ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga tcctgcatat 6780
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caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 6960
tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta 7020
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cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 7440
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gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 7560
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 7620
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ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 7740
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 7800
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 7860
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 7920
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 7980
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 8040
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 8100
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 8160
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aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 8280
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 8340
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 8400
gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 8460
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aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 8580
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 8640
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 8700
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 8760
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 8820
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 8880
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 8940
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 9000
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 9060
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 9120
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 9180
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 9240
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatcaact tgtttattgc 9300
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 9360
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 9420
caactggata actcaagcta accaaaatca tcccaaactt cccaccccat accctattac 9480
cactgccaat tacctgtggt ttcatttact ctaaacctgt gattcctctg aattattttc 9540
attttaaaga aattgtattt gttaaatatg tactacaaac ttagtagt 9588
<210> 3
<211> 10524
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
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caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
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tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
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ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
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ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
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aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
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ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 3480
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gatctatttc cggtgaattc 3540
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ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc 3720
gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg 3780
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atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc 3960
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taccagggct tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac 4080
gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac 4140
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cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc 4260
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caagactata agattcaatc tgccctgctg gtgcccacac tatttagctt cttcgctaag 4440
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ccgctcagca aggaggtagg tgaggccgtg gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc 4560
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ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc ggggtcgccg gcctgcccga cgacgatgcc 4980
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ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa 5460
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gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca 6060
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gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 9960
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aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 10080
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 10140
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 10200
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 10260
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ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 10920
caactggata actcaagcta accaaaatca tcccaaactt cccaccccat accctattac 10980
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180
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caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg 1080
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tcaaacaaat ttacaaaaca ccaccaatta aagattttgg tggttttaat ttttcacaaa 3960
tattaccaga tccatcaaaa ccaagcaaga ggtcatttat tgaagatcta cttttcaaca 4020
aagtgacact tgcagatgct ggcttcatca aacaatatgg tgattgcctt ggtgatattg 4080
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tgtaccctta aatcatttac agtggagaag ggaatttatc aaacatcaaa ctttagagtg 960
caacctacag aatcaatcgt gagatttcct aacatcacaa acctttgccc tttcggagaa 1020
gtctttaacg caacaagatt tgcatcagtg tacgcatgga acagaaagag gatttcaaac 1080
tgcgtggcag attactcagt gctttacaac tcagcatcat tctctacttt caagtgttac 1140
ggagtgtcac ctacaaagct gaatgatctt tgctttacaa acgtgtacgc agattcattt 1200
gtgatcagag gagatgaagt gagacaaatc gcacctggac aaacaggaaa gatagctgat 1260
tacaactaca aacttcctga tgatttcacg ggctgtgtca tcgcatggaa ctcaaacaac 1320
cttgattcaa aggtgggcgg gaattataat tatttgtata ggttattccg aaagtctaat 1380
ttaaagccct ttgagcgtga tatctcaaca gaaatctacc aagcaggatc aacaccttgc 1440
aacggagtgg aaggatttaa ctgctacttt cctcttcaat catacggatt tcaacctaca 1500
aacggagtgg gataccaacc ttacagagtg gtggtgcttt catttgaact tcttcacgca 1560
cctgcaacag tgtgcggacc taagaagtct actaaccttg tgaagaataa gtgcgtgaac 1620
tttaacttta acggacttac aggaacagga gtgcttacag aatcaaacaa gaagtttcta 1680
ccatttcaac aatttggaag agatatcgca gatacaacgg acgctgtccg cgaccctcaa 1740
acacttgaaa tccttgatat cacaccttgc tcatttggag gagtgtcagt gatcacacct 1800
ggaacaaaca catcaaacca agtggcagtg ctttaccaag atgtgaactg cacagaagtg 1860
cctgtggcaa tccacgcaga tcaacttaca cctacatggc gggtctatag caccggctca 1920
aacgtgtttc aaacaagagc aggatgcctt atcggagcag aacacgtgaa caactcatac 1980
gaatgcgata tccctatcgg agcaggaatc tgcgcatcat accaaacaca aacaaactca 2040
cctagaagag caagatcagt ggcatcacaa tcaatcatcg catacacaat gtcacttgga 2100
gcagagaata gtgtggcata ctcaaacaac tcaatcgcaa tccctacaaa ctttacaatc 2160
tcagtgacaa cagagatcct accggttagt atgacaaaga cttctgtgga ttgcacaatg 2220
tacatctgcg gagattcaac agaatgctca aaccttcttc ttcaatacgg atcattctgt 2280
acgcaactta acagagcact tacaggaatc gcagtggaac aagataagaa tactcaagaa 2340
gtgtttgcac aagtgaaaca aatctacaag acgccgccga taaaggactt tggtggtttc 2400
aatttcagcc agatcctgcc agacccgtca aagccctcca agaggtcgtt tatcgaagat 2460
ctactgttca ataaggtgac acttgcagat gcaggattta tcaaacaata cggagattgc 2520
ttgggtgaca ttgccgccag agatcttatc tgcgcacaga agttcaatgg acttacagtg 2580
cttcctcctc ttcttacaga tgaaatgatc gcacaataca catcagcact tcttgcagga 2640
acaatcacat caggatggac atttggagca ggagcagcac ttcaaatccc tttcgccatg 2700
caaatggcat acagatttaa cggaatcgga gtgacacaga atgttcttta cgagaatcag 2760
aaactgattg caaaccaatt taactcagca atcggaaaga tacaggattc actttcatca 2820
acagcatcag cacttggaaa gctccaggat gtggtgaacc agaatgccca agcacttaac 2880
acacttgtga aacaactttc atcaaacttt ggagcaatct catcagtgct taacgatatc 2940
ctttcaagac ttgataaagt ggaagcagaa gtgcagattg accgtctgat aactggaaga 3000
cttcaatcac ttcaaacata cgtcactcag cagctgatta gagcagcaga aatcagagca 3060
tcagcaaacc ttgcagcaac aaagatgagc gaatgcgtgc ttggacaatc aaagcgtgtt 3120
gatttctgtg gcaagggcta tcaccttatg tcatttcctc aatcagcacc tcacggagtg 3180
gtgtttcttc acgtgacata cgtgcctgca caagagaaga atttcacaac agcacctgca 3240
atctgccacg atggaaaggc gcatttcccg agagagggag tgtttgtgtc aaacggaaca 3300
cactggtttg tgacacaaag aaacttctat gagcctcaaa tcatcacaac agataacaca 3360
tttgtgtcag gaaactgcga tgtggtgatc ggaatcgtga ataataccgt atatgaccct 3420
cttcaacctg aacttgattc atttaaagaa gaacttgata aatactttaa gaatcataca 3480
tcacctgatg tggatttggg tgacataagc ggcatcaacg catcagtggt gaacatccag 3540
aaggaaattg accggttgaa tgaggtggca aagaatctga acgaatcact tatcgatctt 3600
caagaacttg gaaagtatga gcaatacatc aaatggcctt ggtacatctg gcttggattt 3660
atcgcaggac ttatcgcaat cgtgatggtg acaatcatgc tttgctgcat gacatcatgc 3720
tgcagctgcc tgaaaggatg ctgctcgtgc ggatcgtgct gcaaatttga tgaagatgat 3780
tcagaacctg tgcttaaagg agtgaaactt cactacacat aa 3822

Claims (10)

1.一种假病毒，其特征在于，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源表达优化的Spike DNA序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。
2.根据权利要求1所述的假病毒，其特征在于，所述报告基因含有用于表达绿色荧光蛋白GFP和/或荧光素酶luciferase的基因序列。
3.根据权利要求1所述的假病毒，其特征在于，所述表达新冠病毒包膜蛋白Spike的质粒的基因序列为：SEQ ID NO:1。
4.根据权利要求1或2所述的假病毒，其特征在于，报告基因质粒的基因序列为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3。
5.一种假病毒的包装方法，其包括如下步骤：
S1:将全长编码GFP或luciferase的cDNA亚克隆到pLVX-IRES-Puro质粒中，得到载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro，其中载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro的基因序列为SEQ ID NO:2，载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro的基因序列为SEQID NO:3；
S2:将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、pSpike过表达质粒及包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生假病毒；其中pSpike过表达质粒含有CBA启动子和人源表达优化的Spike DNA序列。
6.根据权利要求5所述的假病毒，其特征在于，S2中，所述pSpike过表达质粒的制备方法为：
(1):将CBA promoter亚克隆到PBSK-MCS质粒中，纯化得到启动子载体质粒PBSK-CBA；
(2):将Spike DNA序列进行人源表达优化，得到Spike-opt DNA序列，然后将Spike-optDNA序列亚克隆到启动子载体质粒PBSK-CBA中，产生基因序列为SEQ ID NO:1的pSpike过表达质粒。
7.根据权利要求5所述的假病毒，其特征在于，S2中，将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、所述pSpike过表达质粒及包装辅助质粒psPAX2，共转染前一天接种于10层细胞工厂的293T细胞，转染后6小时更换新鲜培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化，得假病毒。
8.根据权利要求7所述的假病毒，其特征在于，S2中，纯化过程是使用GE的AKTA avant层析系统，采用DEAE层析，切向流过滤和core700层析纯化工艺，纯化得假病毒。
9.一种新冠病毒药物评估系统，其特征在于，其包括：
权利要求1-4任一项所述的假病毒或权利要求5-8任一项包装方法获得假病毒；以及过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株；
所述假病毒用于在药物干扰的情况下感染293T单克隆细胞，通过计数GFP阳性抗性克隆数或读取luciferase荧光强度来表征假病毒的感染效率，进而初步评估药物的有效性。
10.根据权利要求9所述的一种新冠病毒药物评估系统，其特征在于，所述过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株采用如下方法制备：
步骤一：制备VSV-G伪型包装的慢病毒载体：
将人ACE2全长编码区亚克隆到慢病毒基因转移载体pLVX-IRES-BSD中，得到编码ACE2受体的载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD，其基因序列为SEQ ID NO:4；将载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD、包膜蛋白质粒和包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD；
步骤二:获得过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株
利用VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD感染293T细胞，加入抗生素blasticidin筛选并单克隆化，获得过量表达ACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株。
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