CN111733290A

CN111733290A - 一种检测新型冠状病毒及近缘冠状病毒的试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN111733290A
Application number: CN202010688367.2A
Authority: CN
Inventors: 王玲; 徐悦; 高嵩; 樊高君; 田洪池; 闫宝山; 于大为; 邵育晓
Original assignee: BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Current assignee: BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明实施例涉及体外检测领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒及近缘冠状病毒的试剂盒及其制备方法。本发明实施例提供的试剂盒包括：ORF1abA基因反应液：针对ORF1ab基因A位点的上下游引物，针对ORF1ab基因A位点的探针；ORF1abB基因反应液：针对ORF1ab基因B位点的上下游引物，针对ORF1ab基因B位点的探针；N基因反应液：针对N基因的上下游引物，针对N基因的探针；ORF1abA基因反应液、ORF1abB基因反应液、N基因反应液和E基因反应液随机组合于两个反应管中；阴性质控品：无RNA酶的水；阳性质控品：分别含有ORF1ab基因A位点、ORF1ab基因B位点、N基因、E基因的重组假病毒。本发明提供的试剂盒，增加了对近缘冠状病毒核酸的识别，可将新冠病毒与其他冠状病毒进行有效识别。

Description

一种检测新型冠状病毒及近缘冠状病毒的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外检测领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒及近缘冠状病毒的试剂盒及其制备方法。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)为一种β属冠状病毒，为具有29903bp的单链RNA(ss-RNA)，其基因组序列与蝙蝠SARS样冠状病毒同源性达85％以上，共10个基因。其传播途径以呼吸道飞沫传播和密切接触传播为主。

目前，临床规定的确诊方法为：符合疑似病例标准的基础上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物、血液等标本行实时荧光RT-PCR检测，新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性；或病毒基因组测序，与已知的新型冠状病毒2019-nCoV高度同源。

但在实际应用中，核酸检测易出现漏检、灵敏度低，检测结果不准确等问题。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测新型冠状病毒及近缘冠状病毒的试剂盒及其制备方法。本发明提供的试剂盒，选择了4个靶基因位点，分别覆盖了国家疾病预防与控制中心以及WHO推荐的靶检测区域，相对于现有产品(单靶标或双靶标)，扩大了检测靶基因的数量，其不仅设置了2019新冠病毒核酸特异性靶区域 (ORF1ab和N基因)，还设置了冠状病毒的辅助靶区域(ORF1ab，E基因)，增加了对近缘冠状病毒核酸的识别，可将新冠病毒与其他冠状病毒进行有效识别。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：ORF1abA基因反应液，ORF1abB基因反应液，N基因反应液，E基因反应液，RT-PCR酶，阴性质控品和阳性质控品，其中：

ORF1abA基因反应液包括：针对ORF1ab基因A位点的上下游引物，针对ORF1ab基因A位点的探针；

ORF1abB基因反应液包括：针对ORF1ab基因B位点的上下游引物，针对ORF1ab基因B位点的探针；

N基因反应液包括：针对N基因的上下游引物，针对N基因的探针；

E基因反应液包括：针对E基因的上下游引物，针对E基因的探针；

ORF1abA基因反应液、ORF1abB基因反应液、N基因反应液和E基因反应液随机组合于两个反应管中；

所述阴性质控品包括无RNA酶的水；

所述阳性质控品包括：含有ORF1ab基因A位点的重组假病毒、含有ORF1ab基因B 位点的重组假病毒、含有N基因的重组假病毒和含有E基因的重组假病毒。可以为 ORF1abA基因反应液和ORF1abB基因反应液一个反应管，N基因反应液和E基因反应液一个反应管；也可以为ORF1abA基因反应液和N基因反应液一个反应管，ORF1abB基因反应液和E基因反应液一个反应管等。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，ORF1abA基因反应液和ORF1abB基因反应液一个反应管，N基因反应液和E基因反应液一个反应管；此时，所述试剂盒包括： ORF1abA/B基因反应液，N/E基因反应液，RT-PCR酶，阴性质控品和阳性质控品，其中：

ORF1abA/B基因反应液包括：针对ORF1ab基因A位点的上下游引物，针对ORF1ab 基因B位点的上下游引物，针对ORF1ab基因A位点的探针，针对ORF1ab基因B位点的探针；

N/E基因反应液包括：针对N基因的上下游引物，针对E基因的上下游引物，针对N基因的探针，针对E基因的探针；

所述阴性质控品包括无RNA酶的水；

所述阳性质控品包括：含有ORF1ab基因A位点的重组假病毒、含有ORF1ab基因B 位点的重组假病毒、含有N基因的重组假病毒和含有E基因的重组假病毒。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述ORF1ab基因A位点的序列如SEQ IDNO.1所示；所述ORF1ab基因B位点的序列如SEQ ID NO.2所示；所述N基因的序列如SEQ IDNO.3所示；所述E基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明采用实时荧光RT-PCR方法，将ORF1ab基因(开放阅读框)的两个不同位置的位点(A和B)、N基因(核壳蛋白，nucleoprotein)、E基因(小包膜糖蛋白，envelopeprotein)序列作为靶基因设计引物和探针，通过对病毒核酸反转录和PCR扩增实现对样本中新型冠状病毒2019-nCoV的检测。其中，ORF1ab A位点和N基因为新型冠状病毒 2019-nCoV特异性基因；ORF1ab B位点和E基因除识别新型冠状病毒2019-nCoV外，还可识别其他冠状病毒，如SRAS，NL63，HKU1，229E，MERS，OC43等近缘的冠状病毒。即本发明提供的试剂盒，可有效识别新型冠状病毒2019-nCoV及近缘冠状病毒。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，引物和探针分别来源于4个靶位点的保守区域，长度一般为15-30核苷酸左右，退火温度为50-60℃之间。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，ORF1abA/B基因反应液包括：如SEQ IDNO.5 所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.6所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.9所示序列的探针，如SEQID NO.10所示序列的探针。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，N/E基因反应液包括：如SEQ ID NO.11所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.12所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.13所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.14所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.15所示序列的探针，如SEQ IDNO.16所示序列的探针。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，含有ORF1ab基因A位点的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.17所示，含有ORF1ab基因B位点的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.18所示，含有N基因的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.19所示，含有E基因的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.20所示。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述RT-PCR酶包括DNA聚合酶和反转录酶；可选地，所述RT-PCR酶包括活性单位比例为0.5-5：1的DNA聚合酶和反转录酶；进一步可选地，所述RT-PCR酶包括活性单位比例为2：1的DNA聚合酶和反转录酶。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，ORF1abA/B基因反应液中，针对ORF1ab基因A的探针的5’端的荧光基团为FAM，针对ORF1ab基因B的探针的5’端的荧光基团为 Cy5。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，N/E基因反应液中，针对N基因的探针的5’端的荧光基团为FAM，针对E基因的探针的5’端的荧光基团为Cy5。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，各个探针序列的3’端包括BHQ淬灭基团。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述ORF1abA/B基因反应液和N/E基因反应液还包括荧光RT-PCR预混液，所述荧光RT-PCR预混液包括1.0-5.0mM Mg离子和1.0-10 mMdNTPs混合物。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，采用所述试剂盒进行检测的方法包括下述步骤：

1)对采集的样本使用病毒RNA提取试剂提取核酸，作为模板；

2)配制ORF1abA/B反应管和N/E反应管：

取一反应管，依次加入ORF1abA/B基因反应液，RT-PCR酶，样本或阳性质控品或阴性质控品，即得ORF1abA/B反应管；

取一反应管，依次加入N/E基因反应液，RT-PCR酶，样本或阳性质控品或阴性质控品，即得N/E反应管；

3)进行荧光定量PCR扩增反应；

4)根据各通道的Ct值进行阴阳性判定。

对采集的样本进行核酸提取时，相关操作参照所用的病毒RNA提取试剂盒的要求进行。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述样本的类型包括：咽拭子、痰液、其他下呼吸道分泌物标本、粪便样本、脑脊液样本或血液样本中的一种或多种。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，ORF1abA/B反应管中包括下述终浓度的组分：

针对ORF1ab基因A位点的上下游引物各200nM，针对ORF1ab基因B位点的上下游引物各200nM，针对ORF1ab基因A位点的探针200nM，针对ORF1ab基因B位点的探针 200nM，RT-PCR酶1μl，1×的荧光RT-PCR预混液，样本或阳性质控品或阴性质控品10μl，总体积为25μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，N/E基因反应管中包括下述终浓度的组分：

针对N基因的上下游引物各200nM，针对E基因的上下游引物各200nM，针对N 基因的探针200nM，针对E基因的探针200nM，RT-PCR酶1μl，1×的荧光RT-PCR预混液，样本或阳性质控品或阴性质控品10μl，总体积为25μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应条件如下：42-50℃逆转录30min；95℃，预变性3min；95℃，15s，55℃，30s，共40个循环。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，步骤4)中，进行阴阳性判定的方法为：

检测结果有效的前提：阴性质控品应无明显S型扩增曲线，或Ct值显示为无值、None，或Ct值大于38；同时，阳性质控品应有典型的S型扩增曲线，且Ct值＜30；

靶基因位点的Ct值＜38时，报告该位点为阳性“+”，Ct值＞38或无值时，报告该位点为阴性“-”；

样本检测结果的判断方法如下：

本发明实施例还提供了上述试剂盒的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

合成各引物和探针；

合成4个重组假病毒，混合，得到阳性质控品；

将无RNA酶的水分装，制成阴性质控品；

将质检合格的RT-PCR酶进行分装。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，所述制备方法还包括下述步骤：

将荧光RT-PCR预混液与各引物和探针混合，配制成ORF1abA/B基因反应液和N/E基因反应液，分装。

有益效果

(1)本发明实施例中提供的试剂盒，通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法，同时检测新型冠状病毒的3个靶基因：开放性阅读框ORF1ab基因、核壳蛋白编码基因(N基因)、包膜糖蛋白编码基因(E基因)，且对ORF1ab基因检测2个不同的位点ORF1ab基因A位点和ORF1ab基因B位点；4个特异性靶位点的检测可有效减少由于病毒变异、引物探针设计等因素导致的漏检问题，提高了检测的灵敏度和结果的准确度。所选择的4个靶基因位点，分别覆盖了国家疾病预防与控制中心以及WHO推荐的靶检测区域，相对与现有产品(单靶标或双靶标)，扩大了检测靶基因的数量，其不仅设置了2019新冠病毒核酸特异性靶区域(ORF1ab和N基因)，还设置了冠状病毒的辅助靶区域(ORF1ab，E基因)，增加了对近缘冠状病毒(SRAS、NL63、HKU1、229E、MERS、OC43)核酸的识别，以辅助临床检验人员在流行期时对检测结果做出判读。

其中，ORF1ab基因位点A为国家疾病预防控制中心推荐，经测试具有高度特异性；ORF1ab基因位点B为WHO所推荐，经测试可以识别2019-nCoV核酸和其他冠状病毒；N 基因对2019-nCoV核酸检测的特异性被国家疾病预防中心确认；E基因与2019-nCoV核酸检测的有效性被WHO所确认，可以识别2019-nCoV和其他冠状病毒。

采用国内权威的新型冠状病毒模拟临床样本对本发明的试剂盒进行评价，结果显示，本发明的试剂盒除可以检测新型冠状病毒2019-nCOV外，还可以将该病毒与其他冠状病毒进行有效识别。

(2)本发明实施例中提供的试剂盒，阳性质控品为四种重组假病毒的混合物，模拟病毒基因组，可以对试剂质量，以及操作过程进行质控；四种重组假病毒混合于1管内，可避免试剂的浪费，节约成本。

此外，对ORF1abA/B基因反应液、N/E基因反应液的具体组成进行了进一步选择，使用本发明提供的ORF1abA/B基因反应液、N/E基因反应液，检测效果更好。

(3)本发明实施例中提供的试剂盒，检测时，采用双管双通道的方法，ORF1ab基因A位点、ORF1ab基因B位点、N、E基因随机组合于两个反应管中进行检测；与混合于 1管的3通道或4通道反应相比，可有效降低引物探针之间的相互干扰，各通道信号强度更高，特异性更好。

并且，两反应管不同基因的检测结果之间可相互印证，提高检测结果的准确性。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中试剂盒制备的工艺流程。

图2是本发明测试例中实施例1提供的试剂盒对不同稀释比例的4靶基因混合RNA进行检测时Orf1ab A基因的扩增曲线。

图3是本发明测试例中实施例1提供的试剂盒对不同稀释比例的4靶基因混合RNA进行检测时Orf1ab B基因的扩增曲线。

图4是本发明测试例中实施例1提供的试剂盒对不同稀释比例的4靶基因混合RNA进行检测时N基因的扩增曲线。

图5是本发明测试例中实施例1提供的试剂盒对不同稀释比例的4靶基因混合RNA进行检测时E基因的扩增曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

下述实施例中，

1.新型冠状病毒2019-nCoV的4个靶基因的引物和探针的设计与合成：

本发明的4个靶基因分别为ORF1ab基因A位点、ORF1ab基因B位点、核壳蛋白N基因，小包膜糖蛋白E基因，分别针对以上4个位点设计引物和探针。引物探针长度一般为15-30核苷酸左右，退火温度为50-60℃之间，且应该属于该位点基因序列的保守区域，委托探针合成公司根据现有技术进行合成，合成的探针为PAGE纯或HPLC纯。

其中，所述ORF1ab基因A位点的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述ORF1ab基因B位点的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述N基因的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述E基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明实施例中，所合成的引物和探针序列分别如表1所示：

表1

2.合成含有新型冠状病毒2019-nCoV靶基因位点的重组假病毒：

本实施例涉及的重组假病毒为重组假病毒A(含有ORF1ab基因A位点)、重组假病毒B(含有ORF1ab基因B位点)、重组假病毒N(含有N基因)和重组假病毒E(含有E基因)，分别覆盖本品涉及的4个靶基因位点；重组假病毒的制备方法为本领域常规方法，也可以商购获得。本发明实施例中，重组假病毒由北京大弘生物技术有限公司合成，重组假病毒A的序列如SEQ ID NO.17所示，重组假病毒B的序列如SEQ ID NO.18所示，重组假病毒N的序列如SEQ ID NO.19所示，重组假病毒E的序列如SEQ ID NO.20所示。

实施例1

1.一种试剂盒，所述试剂盒包括：ORF1abA/B基因反应液，N/E基因反应液，RT-PCR酶，阴性质控品和阳性质控品，其中：

ORF1abA/B基因反应液包括：如SEQ ID NO.5所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.6所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.9所示序列的探针，如SEQ ID NO.10所示序列的探针，荧光 RT-PCR预混液；

N/E基因反应液包括：如SEQ ID NO.11所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.12所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.13所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.14所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.15所示序列的探针，如SEQ ID NO.16所示序列的探针，荧光RT-PCR预混液；

所述荧光RT-PCR预混液为2×缓冲液，包含4mM Mg离子和4mM dNTPs混合物；

所述阴性质控品包括无RNA酶的水；

所述阳性质控品包括：等体积混合的浓度均为3.0×10⁶拷贝/ml的重组假病毒A、重组假病毒B、重组假病毒N和重组假病毒E；

所述RT-PCR酶包括活性单位比例为2：1的DNA聚合酶和反转录酶。

2.上述试剂盒的制备流程图如图1所示，所述制备方法包括下述步骤：

合成各引物和探针，对探针进行修饰；配制荧光RT-PCR预混液，分别混合得到ORF1abA/B基因反应液和N/E基因反应液，分装；

合成4个重组假病毒，等体积混合，得到阳性质控品；

将无RNA酶的水分装，制成阴性质控品；

将质检合格的RT-PCR酶进行分装。

实施例2样本检测

1.样本核酸提取：采样后，使用病毒RNA提取试剂盒提取核酸；所用的病毒核酸提取试剂应获得国家食品药品监督管理局证书，或行业公认、或国家相关机构指定的病毒RNA提取试剂，如使用德国Qiagen公司生产的微量病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNAMini Kit，Cat 52904)，提取过程按说明书进行操作；

2.配制ORF1abA/B反应管和N/E反应管：

ORF1abA/B反应管：依次加入ORF1abA/B基因反应液和RT-PCR酶；ORF1abA/B反应管的组成如表2所示；

N/E反应管：依次加入N/E基因反应液和RT-PCR酶，N/E反应管的组成如表3所示；

3)加样

待测样本提取的核酸、阴性质控品和阳性质控品分别取10μl，分别加入到ORF1abA/B反应管和N/E反应管中，盖紧管盖，离心10秒，转移至扩增区。

表2 ORF1abA/B反应管的组成

表3 N/E反应管的组成

4)进行荧光定量PCR扩增反应；

将反应管按顺序放入实时荧光定量PCR仪的样品槽内，记录每个反应管的位置及对应的样本名称；

设置荧光信号通道和反应程序，其中：

ORF1ab A/B反应管：ORF1ab基因A位点选择FAM通道；ORF1ab基因B位点选择Cy5 通道；淬灭基选择None；

N/E基因反应管：N基因选择FAM通道；E基因选择Cy5通道；淬灭基选择None；

反应程序如表4所示；

表4

试验结束后，根据仪器配套软件的分析结果，记录每个基因位点的Ct值。

4)根据各通道的Ct值进行阴阳性判定。

同一次试验中，以下要求需同时满足，否则视为无效，全部试验应重新进行：

阴性质控品：应无明显S型扩增曲线，或CT值显示为无值、None，或Ct值大于38。

阳性质控品：应有典型的S型扩增曲线，且Ct值＜30。

根据表5对样本检测结果进行判定：

表5

ORF1ab A	ORF1ab B	N基因	E基因	结果判定
					+	+/-	+	+/-	2019-nCoV RNA阳性
+	+	+/-	+/-	2019-nCoV RNA阳性
					+	-	-	-	2019-nCoV RNA阳性
-	-	+	-	复检，仍阳性，则报告2019-nCoV RNA阳性
					-	+	-	+	其他冠状病毒RNA阳性
-	+	-	-	复检，仍阳性，则报告其他冠状病毒RNA阳性
					-	-	-	+	复检，仍阳性，则报告其他冠状病毒RNA阳性
-	-	-	-	2019-nCoV RNA阴性

测试例

1、试剂盒的检测范围

a.制备4种靶基因混合RNA：以分别含有ORF1ab基因A位点、ORF1ab基因B位点、N基因和E基因的人工质粒或重组假病毒为模板，进行体外转录，制备的转录产物经 Dnase I处理后，对RNA回收纯化，测定OD260值，计算获得的RNA的理论浓度(拷贝数/mL)，等比例混合四种RNA。

b.使用实施例1提供的试剂盒对不同稀释比例的4靶基因混合RNA进行检测，结果见图2(Orf1ab A)、图3(Orf1ab B)、图4(N基因)、图5(E基因)和表6。由图和表6结果可知，本发明的试剂盒可检测出1.0×10²-1.0×10⁸拷贝/ml的RNA，检测区间跨越7个数量级，最低可检测出样品中约1.0×10²拷贝/ml的RNA。

表6

浓度(拷贝/ml)	1.0×10<sup>8</sup>	1.0×10<sup>7</sup>	1.0×10<sup>6</sup>	1.0×10<sup>5</sup>	1.0×10<sup>4</sup>	1.0×10<sup>3</sup>	1.0×10<sup>2</sup>	1.0×10<sup>1</sup>
									Orf1ab A	20.13	23.46	26.81	29.68	33.12	35.58	38.07	0
Orf1ab B	17.64	21.04	24.35	27.64	30.68	34.70	38.01	0
									N基因	21.43	24.87	28.41	30.93	33.94	35.70	36.41	0
E基因	19.90	23.52	26.96	30.21	34.22	36.68	37.19	0

2、试剂盒的最低检测限

(1)本发明提供的试剂盒包括4个靶基因位点，对于每个靶基因的检测最低检测限存在不同。采用国家卫生健康委临床检验中心2020年3月下发的全国新型冠状病毒核酸检测室间质控品对本发明实施例1提供的试剂盒的最低检测限进行评价，样本编号分别为202011(2019-nCOV，8.0×10⁴拷贝/ml)，202008(2019-nCOV，1.6×10⁴拷贝/ml)， 202004(2019-nCOV，3.2×10³拷贝/ml)，202002(2019-nCOV，640拷贝/ml)，202010 (2019-nCOV，128拷贝/ml)。

测试结果如表7所示，其中，ORF1ab基因位点A，最低检测限为128拷贝/ml；ORF1ab基因位点B，最低检测限为640拷贝/ml；N基因，最低检测限为640拷贝/ml；E基因，最低检测限为3.2×10³拷贝/ml。结果完全符合质控品对灵敏度的合格要求。

表7 2020年3月全国室间质控品的测试结果

(2)采用新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质(NCRM)对本发明实施例1提供的试剂盒的最低检测限进行评价，NCRM由中国计量科学研究院提供，标准物质编号： GBW(E)091099(批次编号：2001，定值日期：2020/02/27)。NCRM包括核壳蛋白N基因(全长，1.73×10³拷贝/μl)、包膜蛋白E基因(全长，1.06×10³拷贝/μl)和开放阅读框lab(ORF1ab，8.96×10²拷贝/μl)基因全长，采用绝对定量方法-数字PCR方法对N、 E和ORF1ab基因进行拷贝数测定。

表8新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质的测试结果

结果见表8，ORF1ab位点A最低检测限为1：10000倍稀释(89.6拷贝/ml)，ORF1ab 位点B的最低检测限为1：1000倍稀释(896拷贝/ml)，N基因的最低检测限为1：10000 倍稀释(89.6拷贝/ml)，E基因的最低检测限为1：100000倍稀释(8.96拷贝/ml)。综合4个靶位点的检测结果，以1：1000倍稀释产物作为本品的最低检测限。

3、特异性检验

使用实施例1提供的试剂盒，分别检测含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌病毒的灭活培养物或冻存样本(核酸提取物)，检测结果均显示为新型冠状病毒2019-nCoV核酸阴性；说明本发明提供的试剂盒特异性好，不受其他种类病毒的干扰。

4、同源冠状病毒验证

本发明提供的试剂盒共含有2套检测系统：一套为新型冠状病毒2019-nCOV核酸特异性的检测系统(ORF1ab位点A和N基因)，一套为近源冠状病毒检测系统(ORF1ab 位点B和E基因)。

由于大多新冠状病毒都具有类似的呼吸道相关临床症状，部分已知属于高生物危害物质，无法采用实际临床样本对本品进行评价，因此采用国家卫生健康委临床检验中心2020年3月下发的全国新型冠状病毒核酸检测室间质控品进行同源的冠状病毒分析(该批室间质评物质为非传染性样品)，样本编号分别为202001(SARS，3.0×10⁶拷贝/ml)，202006(NL63，1.6×10⁶拷贝/ml)，202007(HKU1，9.4×10⁵拷贝/ml；229E，2.7×10⁶拷贝/ml)，202012(MERS，1.0×10⁴拷贝/ml；OC43，1.0×10⁶拷贝/ml)。HCoV-229E、 HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV均为已知的感染人的冠状病毒，其中，前四种在人群中较为常见。

使用实施例1提供的试剂盒对以上近缘的冠状病毒样本进行测试，结果(表9)均显示为：新型冠状病毒2019-nCoV核酸阴性，其他冠状病毒核酸阳性结果；说明本发明实施例提供的试剂盒可以有效识别新型冠状病毒和近缘冠状病毒。

表9

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝尔生物工程股份有限公司

<120> 一种检测新型冠状病毒及近缘冠状病毒的试剂盒

<130> 200090F

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 119

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<400> 1

ccctgtgggt tttacactta aaaacacagt ctgtaccgtc tgcggtatgt ggaaaggtta 60

tggctgtagt tgtgatcaac tccgcgaacc catgcttcag tcagctgatg cacaatcgt 119

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<400> 2

gacacgtgaa atggtcatgt gtggcggttc actatatgtt aaaccaggtg gaacctcatc 60

aggagatgcc acaactgctt atgctaatag tgtttttaac atttggacac 110

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<400> 3

ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc 60

tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctg 99

<210> 4

<211> 113

<212> DNA

<213> 2019-nCoV

<400> 4

acaggtacgt taatagttaa tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta 60

gttacactag ccatccttac tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tat 113

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gtgaratggt catgtgtggc gg 22

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

caratgttaa asacactatt agcata 26

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

caggtggaac ctcatcagga gatgc 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

<210> 17

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

agttgacttc gcagtggcta actaacatct ttggcactgt ttatgaaaaa ctcaaacccg 60

tccttgattg gcttgaagag aagtttaagg aaggtgtaga gaccctgtgg gttttacact 120

taaaaacaca gtctgtaccg tctgcggtat gtggaaaggt tatggctgta gttgtgatca 180

actccgcgaa cccatgcttc agtcagctga tgcacaatcg tttttactcc aggcagcagt 240

aggggaactt ctcctgctag aatggctggc aatggcggtg atgctgctct tgctttgctg 300

ctgcttgaca gattgaacca gcttgagagc aaaatgtctg gtaaa 345

<210> 18

<211> 2814

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gactgtcaca 60

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 120

ggcgggtgtc ggggctggct taattatgcg gcatcagagc agatggtaga cagagtgcac 180

cagatgcggt gagaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 240

tcgccattca ggctgcgcag ctgttgggaa gggcggtcgg tgcgggcctc ttcgctatta 300

cgccagctgg cgaaaggcgg atgtgctgcc aggcgattca gttgggtaac gccagggttt 360

tcccagtcac gacgttgcag aacgacggcc agagagttag aggacggaac ctcgcgaata 420

caacgagata tcgggtcccg acacgtgaaa tggtcatgtg tggcggttca ctatatgtta 480

aaccaggtgg aacctcatca ggagatgcca caactgctta tgctaatagt gtttttaaca 540

tttggacacg ggcacgacga gaacacaggc ctgcgtgcag agatggcgta atcatggtca 600

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 660

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 720

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 780

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 840

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 900

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 960

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 1020

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 1080

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 1140

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 1200

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 1260

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 1320

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 1380

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 1440

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 1500

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 1560

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 1620

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 1680

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 1740

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 1800

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 1860

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 1920

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 1980

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 2040

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 2100

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 2160

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 2220

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 2280

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 2340

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 2400

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 2460

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 2520

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 2580

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 2640

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 2700

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 2760

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc cttt 2814

<210> 19

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca cagctgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 20

<211> 2826

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gactgtcaca 60

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 120

ggcgggtgtc ggggctggct taattatgcg gcatcagagc agatggtaga cagagtgcac 180

cagatgcggt gagaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 240

tcgccattca ggctgcgcag ctgttgggaa gggcggtcgg tgcgggcctc ttcgctatta 300

cgccagctgg cgaaaggcgg atgtgctgcc aggcgattca gttgggtaac gccagggttt 360

tcccagtcac gacgttgcag aacgacggcc agagagttag aggacggaac ctcgcgaata 420

caacgagata tcgggtccca cacacaggta cgttaatagt taatagcgta cttctttttc 480

ttgctttcgt ggtattcttg ctagttacac tagccatcct tactgcgctt cgattgtgtg 540

cgtactgctg caatatgaca cgggcacgac gagaacacag gcctgcgtgc agagatggcg 600

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 660

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 720

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 780

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 840

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 900

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 960

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 1020

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 1080

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1140

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1200

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1260

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1320

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1380

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1440

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1500

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1560

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1620

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1680

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1740

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1800

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1860

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1920

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1980

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 2040

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 2100

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2160

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2220

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2280

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2340

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2400

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2460

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2520

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2580

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2640

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2700

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2760

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2820

cccttt 2826

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：ORF1abA基因反应液，ORF1abB基因反应液，N基因反应液，E基因反应液，RT-PCR酶，阴性质控品和阳性质控品，其中：

所述阴性质控品包括无RNA酶的水；

所述阳性质控品包括：含有ORF1ab基因A位点的重组假病毒、含有ORF1ab基因B位点的重组假病毒、含有N基因的重组假病毒和含有E基因的重组假病毒。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，ORF1abA基因反应液和ORF1abB基因反应液一个反应管，N基因反应液和E基因反应液一个反应管；此时，所述试剂盒包括：ORF1abA/B基因反应液，N/E基因反应液，RT-PCR酶，阴性质控品和阳性质控品，其中：

ORF1abA/B基因反应液包括：针对ORF1ab基因A位点的上下游引物，针对ORF1ab基因B位点的上下游引物，针对ORF1ab基因A位点的探针，针对ORF1ab基因B位点的探针；

所述阴性质控品包括无RNA酶的水；

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ORF1ab基因A位点的序列如SEQ IDNO.1所示；所述ORF1ab基因B位点的序列如SEQ ID NO.2所示；所述N基因的序列如SEQ IDNO.3所示；所述E基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，ORF1abA/B基因反应液包括：如SEQ IDNO.5所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.6所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.9所示序列的探针，如SEQID NO.10所示序列的探针；

和/或，N/E基因反应液包括：如SEQ ID NO.11所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.12所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.13所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.14所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.15所示序列的探针，如SEQ ID NO.16所示序列的探针；

和/或，所述RT-PCR酶包括DNA聚合酶和反转录酶。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，含有ORF1ab基因A位点的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.17所示，含有ORF1ab基因B位点的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.18所示，含有N基因的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.19所示，含有E基因的重组假病毒的序列如SEQ ID NO.20所示。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，ORF1abA/B基因反应液中，针对ORF1ab基因A的探针的5’端的荧光基团为FAM，针对ORF1ab基因B的探针的5’端的荧光基团为Cy5；

N/E基因反应液中，针对N基因的探针的5’端的荧光基团为FAM，针对E基因的探针的5’端的荧光基团为Cy5；

和/或，所述ORF1abA/B基因反应液和N/E基因反应液还包括荧光RT-PCR预混液，所述荧光RT-PCR预混液包括1.0-5.0mM Mg离子和1.0-10mM dNTPs混合物。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒进行检测的方法包括下述步骤：

1)对采集的样本使用病毒RNA提取试剂提取核酸，作为模板；

2)配制ORF1abA/B反应管和N/E反应管：

3)进行荧光定量PCR扩增反应；

4)根据各通道的Ct值进行阴阳性判定。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样本的类型包括：咽拭子、痰液、粪便样本、脑脊液样本或血液样本中的一种或多种；

和/或，ORF1abA/B反应管中包括下述终浓度的组分：

针对ORF1ab基因A位点的上下游引物各200nM，针对ORF1ab基因B位点的上下游引物各200nM，针对ORF1ab基因A位点的探针200nM，针对ORF1ab基因B位点的探针200nM，RT-PCR酶1μl，1×的荧光RT-PCR预混液，样本或阳性质控品或阴性质控品10μl，总体积为25μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整；

和/或，N/E基因反应管中包括下述终浓度的组分：

针对N基因的上下游引物各200nM，针对E基因的上下游引物各200nM，针对N基因的探针200nM，针对E基因的探针200nM，RT-PCR酶1μl，1×的荧光RT-PCR预混液，样本或阳性质控品或阴性质控品10μl，总体积为25μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整；

和/或，步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应条件如下：42-50℃逆转录30min；95℃，预变性3min；95℃，15s，55℃，30s，共40个循环。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，步骤4)中，进行阴阳性判定的方法为：

检测结果有效的前提：阴性质控品无明显S型扩增曲线，或Ct值显示为无值、None，或Ct值大于38；同时，阳性质控品有典型的S型扩增曲线，且Ct值＜30；

样本检测结果的判断方法如下：

10.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：

合成各引物和探针；

合成4个重组假病毒，混合，得到阳性质控品；

将无RNA酶的水分装，制成阴性质控品；

将质检合格的RT-PCR酶进行分装。