CN104388461A - 一种以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，其是基于氯霉素的毕赤酵母筛选体系，本发明发现氯霉素对毕赤酵母GS115有明显的抑制作用，在含有氯霉素的YPG抗性固体培养基上不能生长，在此基础上，构建了一种利用氯霉素作为筛选抗生素的毕赤酵母筛选体系。利用含有氯霉素抗性基因CAT的载体，以及本发明中方法制备的毕赤酵母电转感受态和氯霉素筛选固体培养基进行筛选，用EGFP作为报告基因，转化毕赤酵母后在荧光显微镜下能够观察到绿色荧光，表明该载体及筛选体系能够有效地进行毕赤酵母转化筛选及外源蛋白表达。

Description

一种以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体及其应用

技术领域

本发明属于酵母基因工程技术领域，具体涉及以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体及其应用。

背景技术

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源，在20世纪80-90年代发展起来作为一种蛋白表达系统。相比原核表达系统，毕赤酵母具有糖基化修饰的优势，但没有酿酒酵母常见的过糖基化问题。同时相对于其他真核表达系统如昆虫表达系统、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达系统具有可大规模发酵培养的优势。此外，在哺乳动物细胞表达系统，外源基因不能持久表达，且成本、技术背景等问题也制约了哺乳动物细胞表达系统的应用。毕赤酵母表达系统一定程度上可以克服上述问题，因此具有较大的应用潜力，是一种值得关注和发展的真核表达系统。

毕赤酵母最初来自一株野生甲基营养型酵母NRRL-Y11430，由Ogata K等人首次发现(Ogata K et aL, Agric BiolChem, 1969, 33: 1519-1520)。随后的研究表明其含有的甲醇诱导的醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）Ⅰ型启动子对于诱导表达外源蛋白具有巨大优势（Cregg J et aL, Molecular and cellular biology, 1989, 9(3): 1316-1323）。首先是因为其在甲醇诱导性表达量高（Daly R et aL, Journal of Molecular Recognition, 2005, 18(2): 119-138），对于利用真核细胞对外源蛋白进行表达提供了帮助；其次蛋白表达严格受AOX1启动子的启动，有利于外源基因表达的调控；用于毕赤酵母表达的质粒往往为整合型，能够整合在核基因组上，有利于遗传性质的稳定性；毕赤酵母可利用简单合成培养基即可进行高密度发酵，有利于提高产量；此外，毕赤酵母可利用甲醇作为唯一碳源，有利于降低发酵成本。

通常毕赤酵母主要利用氨基酸缺陷型进行筛选转化子，但是有着必须使用基因缺陷工程菌的缺陷，在非缺陷菌上的利用会受到限制。此外，近年发展有利用新霉素作为初始筛选标记的筛选系统，但是毕赤酵母的抗性筛选系统可用抗生素较少，对于某些新霉素不敏感菌株可能会导致筛选失败。本发明建立的基于氯霉素的毕赤酵母表达载体可以用于毕赤酵母转化子筛选。对于新霉素筛选失败的菌株也可以尝试使用氯霉素筛选。另外，利用本发明中的载体除可用来在毕赤酵母中表达外源蛋白，还可以用于抗生素对真核细胞杀伤作用等的机制研究。

发明内容

基于毕赤酵母在氯霉素抗性平板固体培养基下不能生长，本发明的目的是为了解决如何利用氯霉素抗性筛选毕赤酵母转化子筛选的问题；提供了一种新型毕赤酵母表达载体，即以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，如pPIC3.5C、pPIC9C载体，该表达载体是由氯霉素抗性基因CAT替换了现有毕赤酵母表达载体上的真核细胞筛选基因，形成含有氯霉素抗性基因CAT的表达载体；该毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母后可以用氯霉素在YPG培养基上筛选重组毕赤酵母转化子。

本发明是将毕赤酵母表达载体pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC6 A、pPIC6B、pPIC6C、pPIC6αA、pPIC6αB、pPIC6αC、pPICZ A、pPICZ B、pPICZ C、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC等载体中的真核细胞筛选基因Neomycin、Zeocin、Blasticidin或G418替换成氯霉素抗性基因CAT，形成新型表达载体，在毕赤酵母中表达成抗性蛋白，使得毕赤酵母在含有抗生素的培养基中生长。

所述氯霉素抗性基因CAT序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明另一目的是将以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体应用在筛选重组毕赤酵母转化子中，筛选时使用的培养基（YPG培养基）组成及配比为在100ml的水中含有：蛋白胨2g、酵母膏1g、甘油3g、氯霉素为200mg；YPG固体培养基组成及配比为在100ml的水中含有：为蛋白胨2g、酵母膏1g、甘油3g、琼脂2g、氯霉素为200mg。

本发明所述以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母后可以用氯霉素在上述培养基上筛选重组毕赤酵母转化子，转化的毕赤酵母为GS115、SM1168、KM71或X33。

基于以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，如pPIC3.5C、pPIC9C载体，本发明提供了一种基于氯霉素或氨苄青霉素抗性筛选重组大肠杆菌的方法；同时提供了一种基于氯霉素抗性筛选毕赤酵母转化子的方法。

本发明提供了一种基于氯霉素筛选的毕赤酵母电转化感受态的制备方法。本发明还提供了用于鉴定氯霉素筛选载体pPIC3.5C转化效果的重组载体EGFP-pPIC3.5C。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明中提供的以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，使用氯霉素进行筛选。氯霉素较为稳定，且仅使用含有氯霉素的YPG培养基，便于抗性平板固体培养基的制备及相关操作，避免了缺陷筛选中培养基配置繁琐的的问题。

2、在现有的毕赤酵母筛选系统中常用的抗生素种类较少，仅有G418、Neomycin、Zeocin、Blasticidin等，且价格较贵。而本发明中使用的氯霉素价格便宜，易于获得，且较为稳定，能够明显降低实验或生产成本。另外，如利用其它抗生素筛选毕赤酵母失败，本发明提供的筛选系统可以作为有效的补充。

附图说明

图1为本发明以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体pPIC3.5C图谱示意图；

图2为本发明以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体pPIC9C图谱示意图；

图3为本发明毕赤酵母GS115在不同固体培养基上生长情况；图中A为无抗性YPG；B为含有2％氯霉素YPG；

图4为本发明毕赤酵母GS115在不同浓度氯霉素抗性YPG下生长情况；

图5为本发明重组毕赤酵母GS115在氯霉素抗性YPG培养基下生长情况；图中3.5K是转化有pPIC3.5K的GS115毕赤酵母；CAT-3.5K是转化有CAT-3.5K的GS115毕赤酵母；

图6为本发明荧光显微镜观察EGFP的表达的结果示意图；图中A为EGFP-3.5C/GS115在激发光下；B为EGFP-3.5C/GS115在白光下；C为3.5C/GS115在激发光下；D为3.5C/GS115在白光下；

图7为本发明western blot检测EGFP的表达结果示意图；图中：3.5C为3.5C/GS115；EGFP-3.5C为EGFP-3.5C/GS115；空白为GS115；阳性为EGFP-3.5/GS115K。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，稍微更改载体骨架pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC6 A, B, & C、pPIC6α A, B, & C、pPICZ A, B, & C、pPICZα A, B, & C、pAO815等载体或菌株改为SM1168、KM71、X33等毕赤酵母菌株。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例1：毕赤酵母GS115电转化感受态的制备

本发明需要配合专门的电转化感受态制备方法，本方法与经典的电转化感受态制备方法有一定的不同，主要区别在与使用的培养基及部分试剂，具体步骤如下：

1）在含5ml YPG培养基（蛋白胨 2g/100ml、酵母膏 1 g/100ml、甘油3g/100ml）的50ml三角瓶中培养毕赤酵母，30℃过夜；

2）取1-5ml过夜培养物，接种于含500ml新鲜YPG培养基的2L摇瓶中，过夜生长至OD₆₀₀在1.3-1.5之间；

3）4℃，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的无菌水悬浮细胞；

4）4℃，1500g离心5min收集细胞，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；

5）4℃，1500g离心5min收集细胞，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

6）4℃，1500g离心5min收集细胞，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；

7）按照电转化要求分装，备用。

实施例2：毕赤酵母对氯霉素的敏感性检测

本发明首次发现氯霉素对毕赤酵母具有抑制作用，在YPG固体培养基（蛋白胨 2 g/100ml、酵母膏 1 g/100ml、甘油3g/100ml、Agar 2g/100ml）上，在添加了氯霉素（购买于生工生物公司，0692C503）的抗性平板固体培养基上毕赤酵母不能生长，而在非抗性平板固体培养基上则生长正常（图3）。本发明进一步摸索了毕赤酵母GS115（购买于Novagen公司，K1750-01）最佳抗性浓度，在YPG培养基中分别加入不同浓度的氯霉素，发现氯霉素对GS115的抑制作用有着剂量依赖性（图4），并且在浓度为2mg/ml及以上时，毕赤酵母GS115便基本上不能够生长。

实施例3：转化氯霉素抗性基因并验证其对氯霉素抑制作用的解除

为了验证氯霉素对毕赤酵母的抑制作用能够在氯霉素抗性基因（CAT）存在的情况下能够通过基因表达降解氯霉素而得到解除，本发明从pACYC184质粒（购买于New England

游引物各0.25pm/μL，0.4mmol/μL的dNTP，2 ng/μL的DNA模板，5 U/100 μL taq DNA聚合酶，1×taq buffer，总体积为25μL。按下面进行反应：93℃，3min预变性；93℃，30s；50℃，40s；72℃，1min反应30个循环；最后72℃延伸10min）获得氯霉素抗性基因CAT，通过BamHⅠ（购买于TAKARA，1001A）、Not Ⅰ（购买于TAKARA，1166A）连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K（购买于Novagen公司，K1750-01）上，构建成为检测载体CAT-3.5K。通过电转化（电击参数：1500V，200V，25μF）的方法转化到毕赤酵母GS115中获得转化子。经过甲醇（终浓度0.5％）诱导后，添加2％氯霉素到YPG培养基中，30℃培养24h，测定OD600，发现转化有CAT-3.5K的GS115毕赤酵母（CAT-3.5K组）CAT组能够在氯霉素抗性培养基中正常生长（图5）。说明CAT基因能够解除氯霉素对毕赤酵母GS115的抑制作用。

实施例4：基于氯霉素筛选的毕赤酵母表达载体pPIC3.5C、pPIC9C的构建

基于以上的发现，本发明设计引物pCATL1：5’-AGTAATACAAGGGGTGTTATGGAGA

AAAAAATCACT-3’；pCATL2：5’-CCAATTAACCAATTCTGATTACGCCCCGCCCTGCCA

-3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。从pACYC184质粒上，通过PCR扩增的方法获得氯霉素抗性基因CAT，利用引物pC1：5’-GCATGCAAGGAGATGGCG-3’；pC2：5’AACACCCCTTGTATTACT-3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。从载体pPIC3.5K扩增获得上游调控序列，利用引物pC3：5’-ATCAGAATTGGTTAATTG-3’；pC4：5’-ATCGTGGCCGACCTGCAG-3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。从载体pPIC3.5K（购买于Novagen公司，K1750-01）扩增获得下游调控序列。最后利用上述引物pC1、pC4融合PCR扩增得到含有调控序列及CAT基因的基因片段，最终利用Sph Ⅰ（购买于TAKARA，1246A）、Pst Ⅰ（购买于TAKARA，1073A）酶切将目的基因连接到pPIC3.5K、pPIC9K（购买于Novagen公司，K1750-01）载体骨架上，置换原有的Kan^r基因，最终构建成基于氯霉素筛选的毕赤酵母表达载体pPIC3.5C、pPIC9C（如图1、2），其序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。该载体能够表达CAT基因及Amp^r基因，在大肠杆菌中表现出氯霉素、氨苄青霉素抗性。还含有HIS4基因，在毕赤酵母中配合组氨酸缺陷培养基能够进行组氨酸缺陷筛选；也可以通过氯霉素抗性筛选获得重组子。

实施例5：利用EGFP作为报告基因检测利用pPIC3.5C进行氯霉素筛选的表达效果

为了检测利用氯霉素进行抗性筛选的效果，本发明构建了重组载体EGFP-3.5C作为检测载体。通过PCR方法（反应体系：上、下游引物各0.25pm/μL，0.4mmol/μL的dNTP，2 ng/μL的DNA模板，5 U/100 μL taq DNA聚合酶，1×taq buffer，总体积为25μL。按下面Laboratories, Inc, PT3053-5）作为模板，扩增获得在C端含有6个HIS标签的EGFP基因，利用BamHⅠ、Not Ⅰ连接到pPIC3.5C构建成为EGFP-3.5C检测载体。利用实施例1中的电转化感受态制备方法获得电转化感受态，电转后涂布于含有2mg/ml氯霉素抗性的YPG固体培养基中。30℃倒置培养3-5天，挑取单菌落，接种于含有2mg/ml氯霉素的YPG液体培养基中，并添加终浓度为0.5％甲醇，进行诱导。诱导表达48h后，荧光显微镜下观察（图6）。此外，用鼠抗HIS抗体（购买于北京中杉金桥生物技术）作为一抗，HRP标记的兔抗鼠抗体（购买于Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc）作为二抗，通过western blot检测EGFP的表达（图7）。结果表明：EGFP组能够看到荧光，并且western blot也能检测到与预期大小一致的目的条带。说明本发明中的pPIC3.5C能够利用氯霉素作为筛选抗性进行一种有效表达外源蛋白的毕赤酵母表达筛选载体。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

 

<210> 1

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 1

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa         60

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat         120

attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt         180

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gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa         300

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tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag         420

aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg         480

gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc         540

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gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa         660

 

<210> 2

<211> 8848

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 2

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<210> 3

<211> 9120

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 3

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agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc      7980

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact      8040

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc      8100

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt      8160

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta      8220

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg      8280

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt      8340

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc      8400

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt      8460

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc      8520

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc      8580

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa      8640

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac      8700

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa      8760

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt      8820

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa      8880

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct      8940

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg      9000

ccctttcgtc ttcaagaatt aattctcatg tttgacagct tatcatcgat aagctgactc      9060

atgttggtat tgtgaaatag acgcagatcg ggaacactga aaaataacag ttattattcg      9120

 

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 4

ggatccatgg agaaaaaaat cact                                               24

 

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 5

gcggccgctt agtggtggtg gtggtggtgc gccccgccct gccactc                      47

 

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 6

gcatgcaagg agatggcg                                                      18

 

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 7

aacacccctt gtattact                                                      18

 

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 8

agtaatacaa ggggtgttat ggagaaaaaa atcact                                  36

 

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 9

ccaattaacc aattctgatt acgccccgcc ctgcca                                  36

 

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 10

atcagaattg gttaattg                                                      18

 

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 11

atcgtggccg acctgcag                                                      18

 

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 12

cgggatccaa acgatggtga gcaagggcga g                                       31

 

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 13

ataagaatgc ggccgcttag tggtggtggt ggtggtgctt gtacagctcg tccat             55

 

Claims (4)

1.一种以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，其特征在于：由氯霉素抗性基因CAT替换了毕赤酵母表达载体上的真核细胞筛选基因，形成含有氯霉素抗性基因CAT的表达载体。

2.根据权利要求1所述的以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，其特征在于：毕赤酵母表达载体为pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC6 A、pPIC6B、pPIC6C、pPIC6αA、pPIC6αB、pPIC6αC、pPICZ A、pPICZ B、pPICZ C、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pAO815中的一种。

3.根据权利要求1所述的以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体，其特征在于：氯霉素抗性基因CAT序列如SEQ ID NO：1所示。

4.权利要求1、2或3中所述的以氯霉素为筛选标记的毕赤酵母表达载体在筛选重组毕赤酵母转化子中的应用，其特征在于用于筛选的培养基的组成及配比为在100ml的水中含有：蛋白胨2g、酵母膏1g、甘油3g、氯霉素为200mg。