CN112138152A - 基于aav载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其包括腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的ssAAV载体基因组、启动子、以及适于编码可溶性胞外区ACE2的序列；所述序列编码的蛋白质可分泌到胞外，且具有与S蛋白特异结合的功能域。本发明利用AAV载体将编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列导入靶细胞，使靶细胞分泌可溶性ACE2到细胞外以便与冠状病毒的S蛋白结合，达到拮抗SARS‑CoV感染的目的。所述基因序列是在编码ACE2全长蛋白(1‑805)基因序列的基础上通过删减获得的编码可溶性胞外区ACE2(1‑740)和(1‑620)非全长蛋白的基因片段，两种非全长蛋白均保留了与S蛋白特异结合的功能域，可分泌到胞外，用于抑制新冠病毒侵染。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种基于AAV载体的冠状病 毒感染通用型基因治疗药物。
背景技术
世界卫生组织将SARS-CoV-2引起的疾病正式命名为COVID-19 (coronavirusdisease-2019)。COVID-19感染者中约有25％表现为重症， 典型特征是严重的病毒性肺炎，极重型危及生命，粗病死率约在0.5％-1％。
SARS-CoV-2与SARS相似，具有相似的基因组构成和病毒结构特征， 二者都是通过Spike蛋白的RBD(receptor binding domain)识别和结合位 于靶细胞表面的ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)受体，通过膜融 合，进入内体/溶酶体途径，脱衣壳，病毒基因组RNA释放，在细胞质中， 病毒的全长正链基因组先作为模板翻译少量RNA复制酶，接下来，无论 是完整基因组还是亚基因组(部分基因组区域)，都是先复制成负链RNA，再以负链RNA为模板，复制全长或亚基因组正链RNA，全长正链可包装 到新的病毒粒子中，每个亚基因组正链RNA都带有相同的5’非翻译区， 亚基因组正链RNA作为模板翻译病毒所需的酶和结构蛋白，用以形成病 毒粒子的壳。经复制包装的病毒粒子出芽到胞外，感染新的靶细胞，进入 下一个生活周期。Spike(S)蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，其含有两 个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞 的受体。S1区域可进一步分为N端和C端区域，RBD位于C端区域，是 与ACE2受体直接结合的结构域。人的ACE2基因位于X染色体短臂，编 码含805个氨基酸的羧肽酶，其N端17个氨基酸为信号肽，C端尾部包 含跨膜区，参与肾素/血管紧张素系统的功能调节，其作用与ACE相反， 表现为血管舒张、抗炎和抗凋亡等，且其为跨膜蛋白、不能被分泌到胞外。 基于S蛋白/ACE2的相互作用，ACE2也成为了药物开发的靶点。研究发 现，胞外区ACE2可溶重组蛋白(氨基酸1-740)能够结合S蛋白，可以 起到阻断病毒与胞膜ACE2受体结合的作用，目前临床I期试验在健康受试者表现出一定的安全性，有研究团队计划开展COVID-19的临床安全性 和有效性评估。由此可见，可溶性ACE2蛋白用于拮抗SARS-CoV感染的 重组蛋白药物研究现已有报道，且现有技术大多采用胞外区1-740的片段， 分泌表达到细胞外与冠状病毒的S蛋白结合。相关的基因药物，是将编码 可溶性胞外区ACE2蛋白的序列可通过一定的病毒载体作为基因传送的工 具导入患者体内，拮抗SARS-CoV的感染。
常见的基因药物载体包括慢病毒(lentivirus)载体和腺相关病毒 (adeno-associated virus，AAV)载体，这两种载体是目前基因治疗的两大 类代表性病毒载体。然而，天然AAV基因组是单链DNA，对于单链AAV (Adeno-associated Virus，AAV)载体来说，其容量为4.7kb，能够容纳包 括启动子、可溶性ACE2编码区以及Poly A序列，但其缺点是单链AAV 载体进入细胞后转换为双链需要一定时间，使可溶性ACE2表达较滞后。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种基于AAV载体的冠 状病毒感染通用型基因治疗药物，腺相关病毒AAV9为载体，在该病毒载 体中容纳有组成型启动子(CBA)和编码可溶性胞外区ACE2的序列，通 过该腺相关病毒AAV9将启动子和编码可溶性胞外区ACE2的序列导入到 靶细胞，使细胞分泌可溶性ACE2并表达到胞外，用于拮抗SARS-CoV感染。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一方面，本发明提供一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因 治疗药物，其包括:
腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的 ssAAV载体基因组、启动子和适于编码可溶性胞外区ACE2的序列；所述 序列编码的蛋白质可分泌到胞外，且具有与S蛋白特异结合的功能域。
根据本发明较佳实施例，所述适于编码可溶性胞外区ACE2的序列是 在编码ACE2全长蛋白1-805的基因序列基础上通过删减获得的编码可溶 性胞外区ACE2 1-740和1-620非全长蛋白的基因片段；所述基因片段编码 的蛋白保留了与S蛋白特异结合的功能域。
根据本发明较佳实施例，所述启动子为组成型启动子(CBA)，启动 子用于驱动可溶性胞外区ACE2表达。
其中，所述启动子序列为SEQ ID NO:1。
根据本发明较佳实施例，所述ssAAV载体基因组序列为SEQ ID NO:2。
根据本发明较佳实施例，所述编码可溶性胞外区ACE2 1-740的片段 的基因片段序列为SEQ ID NO:4。
根据本发明较佳实施例，所述编码可溶性胞外区ACE2 1-620片段的 基因片段序列为SEQ ID NO:3。
另一方面，本发明还提供一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型 基因治疗药物的制备方法，其包括：
S1:构建腺相关病毒表达载体质粒，该质粒包含ssAAV载体基因组、 启动子和用于编码可溶性胞外区ACE2的基因序列；
所述基因序列是在编码ACE2全长蛋白1-805的基因序列基础上通过 删减获得的编码可溶性胞外区ACE2 1-740和1-620非全长蛋白的基因片 段；所述基因片段编码的蛋白保留了与S蛋白特异结合的功能域；S2:将上 述的腺相关病毒表达载体质粒、包装质粒pRC9和辅助质粒pHelper经层 析纯化，共转染293T细胞，转染预定时间后，收集细胞并裂解，获得基 于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物。
优选地，步骤S1中，所述启动子为组成型启动子CBA，序列为SEQ ID NO:1。
优选地，步骤S1中，步骤S1中，所述编码可溶性胞外区ACE2 1-740 非全长蛋白的基因片段序列为SEQ ID NO:4；所述编码可溶性胞外区ACE2 的1-620非全长蛋白的基因片段序列为SEQ ID NO:3。
优选地，步骤S1中，所述ssAAV载体基因组序列为SEQ ID NO:2。
根据本发明较佳实施例，步骤S1中，步骤S1中，构建腺相关病毒表 达载体质粒的方法为：将编码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620非 全长蛋白的基因片段亚克隆至ssAAV-CBA-MCS质粒，得到 ssAAV-CBA-ACE2 1-740或ssAAV-CBA-ACE2 1-620质粒；该克隆过程包 括如下步骤：
步骤1：将ssAAV-CBA-MCS用限制性内切酶XhoI和XbaI于37℃± 0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收ssAAV-CBA-MCS载体片 段；
将编码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620非全长蛋白的基因片 段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和XhoI/XbaI酶切位点， 将扩增得到的PCR片段利用XhoI和XbaI于37℃±0.5进行双酶切1h± 0.2，琼脂糖电泳后切胶回收编码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620 非全长蛋白的PCR片段；
步骤2：将胶回收试剂盒分别回收的ssAAV-CBA-MCS载体片段和编 码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620非全长蛋白的基因片段，采用 T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
步骤3：将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5α， 轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min， 加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器 将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培 养12-16h；
步骤4：挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中， 37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒ssAAV-CBA-ACE2 1-740或ssAAV-CBA-ACE2 1-620，进行XhoI和XbaI双酶切鉴定后进行 测序鉴定，至此腺相关病毒表达载体质粒构建成功。
其中，步骤1中使用的ssAAV-CBA-MCS质粒的构建方法为：将启动 子CBA promoter亚克隆到ssAAV-MCS质粒，得到载体质粒 ssAAV-CBA-MCS。该克隆过程可以按照如下方式进行：
第一步，将ssAAV-MCS质粒用限制性内切酶KpnI和XbaI于37℃进 行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约为3200bp。
第二步，将CBA promoter进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保 护碱基和KpnI/XbaI酶切位点。PCR片段利用KpnI和XbaI于37℃进行双 酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为900bp。
第三步，胶回收试剂盒分别回收ssAAV载体和CBA启动子片段，用 T4 DNA连接酶连接室温反应15min，连接产物转化至大肠杆菌，转化方 法为：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴 30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培 养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青 霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。
第四步，挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液 中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒ssAAV-CBA-MCS，进 行KpnI和XbaI双酶切鉴定后测序，ssAAV-CBA-MCS载体构建成功。
根据本发明较佳实施例，步骤S2中，包装质粒pRC9所含序列为 Addgene plasmid#112865；辅助质粒pHelper所含序列为Cell Biolabs(Part No.340202)。
根据本发明较佳实施例，步骤S2中，将腺相关病毒表达载体质粒、 包装质粒pRC9和辅助质粒pHelper经层析纯化，在10层细胞工厂中转染 293T细胞，转染68-72h后，收集细胞并裂解，上清液经AAV-X层析柱亲 和纯化，得到基于AAV载体的基因治疗药物，病毒滴度通过real-time PCR 方法测定，以vp/ml(virus particle/ml)表示。
腺相关病毒AAV到目前为止未发现导致人类疾病，AAV载体免疫原 性较低，AAV以染色体外小体(episome)形式存在，极少整合到靶细胞 基因组。因此，AAV载体在基因治疗药物具有很好的安全性。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
(1)本发明的技术创造之一是：本发明利用腺相关病毒AAV9为载 体，携带可编码可溶性胞外区ACE2的基因，借助AAV9病毒感染的方式 将该基因(启动子基因+编码可溶性胞外区ACE2的基因)导入到靶细胞， 使靶细胞产生可溶性的ACE2并分泌表达到细胞外，利用可溶性ACE2蛋 白拮抗SARS-CoV感染。
(2)本发明的技术创造之二是：筛选了合适的启动子，在AAV载体 框架下，利用组成型启动子(CBA)驱动可溶性ACE2表达，驱动可溶性 胞外区ACE2(1-740)和(1-620)蛋白的表达。
(3)本发明的技术创造之三是：本发明在编码ACE2跨膜全长蛋白 1-805的基础上，通过删减获得的ACE2(1-740)和ACE2(1-620)的非 全长蛋白的基因片段，在确认删减后该非全长蛋白具有可溶性、能分泌到 胞外、病仍具有S蛋白特异性结合的前提下，选择在载体中导入较短的 ACE2(1-740)或ACE2(1-620)基因片段，更优选是导入ACE2(1-620) 基因片段，进而提高AAV病毒的包装效率和感染后可溶性ACE2的表达 效率高。
附图说明
图1：AAV病毒载体生产和纯化的流程图。
图2：Western Blot检测可溶性ACE2(1-620)和ACE2(1-740)的外 泌到细胞外的情况。
图3：细胞水平验证可溶性胞外区ACE2(1-620)和ACE2(1-740) 抑制新冠假病毒的感染。
图4：建立新冠易感模型小鼠的示意图。
图5：在动物水平验证携带编码可溶性胞外区ACE2(1-620)和ACE2 (1-740)的AAV载体在动物模型体内抑制新冠假病毒的感染。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施 方式，对本发明作详细描述。
本发明提供一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物， 其包括腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在其中的ssAAV 载体基因组、启动子、以及适于编码可溶性胞外区ACE2的基因序列。利 用腺相关病毒AAV9为载体，携带可编码可溶性胞外区ACE2的基因，本 发明主要借助AAV9病毒感染的方式将该启动子和编码可溶性胞外区ACE2的基因导入到靶细胞中，使靶细胞产生可溶性的ACE2并分泌表达 到细胞外，利用可溶性ACE2蛋白拮抗SARS-CoV感染。腺相关病毒AAV 到目前为止未发现导致人类疾病，AAV载体免疫原性较低，AAV以染色 体外小体(episome)形式存在，极少整合到靶细胞基因组。因此，AAV 载体在基因治疗药物具有很好的安全性。
优选地，本发明确认了表达可溶性ACE2的基因序列为下列两种之一：
第一种，编码可溶性胞外区ACE2 1-740的基因序列。该基因序列编 码的可溶性胞外区ACE2可与冠状病毒的S蛋白特异结合。所述基因序列 为SEQ ID NO:4，序列如下：
ATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCTTCTCAGCCTTGTTGCTGTAACT GCTGCTCAGTCCACCATTGAGGAACAGGCCAAGACATTTTTGGACAA GTTTAACCACGAAGCCGAAGACCTGTTCTATCAAAGTTCACTTGCTT CTTGGAATTATAACACCAATATTACTGAAGAGAATGTCCAAAACATG AATAATGCTGGGGACAAATGGTCTGCCTTTTTAAAGGAACAGTCCAC ACTTGCCCAAATGTATCCACTACAAGAAATTCAGAATCTCACAGTCA AGCTTCAGCTGCAGGCTCTTCAGCAAAATGGGTCTTCAGTGCTCTCA GAAGACAAGAGCAAACGGTTGAACACAATTCTAAATACAATGAGCA CCATCTACAGTACTGGAAAAGTTTGTAACCCAGATAATCCACAAGAA TGCTTATTACTTGAACCAGGTTTGAATGAAATAATGGCAAACAGTTT AGACTACAATGAGAGGCTCTGGGCTTGGGAAAGCTGGAGATCTGAGGTCGGCAAGCAGCTGAGGCCATTATATGAAGAGTATGTGGTCTTGAA AAATGAGATGGCAAGAGCAAATCATTATGAGGACTATGGGGATTATT GGAGAGGAGACTATGAAGTAAATGGGGTAGATGGCTATGACTACAG CCGCGGCCAGTTGATTGAAGATGTGGAACATACCTTTGAAGAGATTA AACCATTATATGAACATCTTCATGCCTATGTGAGGGCAAAGTTGATG AATGCCTATCCTTCCTATATCAGTCCAATTGGATGCCTCCCTGCTCAT TTGCTTGGTGATATGTGGGGTAGATTTTGGACAAATCTGTACTCTTTG ACAGTTCCCTTTGGACAGAAACCAAACATAGATGTTACTGATGCAAT GGTGGACCAGGCCTGGGATGCACAGAGAATATTCAAGGAGGCCGAG AAGTTCTTTGTATCTGTTGGTCTTCCTAATATGACTCAAGGATTCTGG GAAAATTCCATGCTAACGGACCCAGGAAATGTTCAGAAAGCAGTCTG CCATCCCACAGCTTGGGACCTGGGGAAGGGCGACTTCAGGATCCTTA TGTGCACAAAGGTGACAATGGACGACTTCCTGACAGCTCATCATGAG ATGGGGCATATCCAGTATGATATGGCATATGCTGCACAACCTTTTCT GCTAAGAAATGGAGCTAATGAAGGATTCCATGAAGCTGTTGGGGAA ATCATGTCACTTTCTGCAGCCACACCTAAGCATTTAAAATCCATTGGT CTTCTGTCACCCGATTTTCAAGAAGACAATGAAACAGAAATAAACTT CCTGCTCAAACAAGCACTCACGATTGTTGGGACTCTGCCATTTACTTA CATGTTAGAGAAGTGGAGGTGGATGGTCTTTAAAGGGGAAATTCCCAAAGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGCGAGAGATAGT TGGGGTGGTGGAACCTGTGCCCCATGATGAAACATACTGTGACCCCG CATCTCTGTTCCATGTTTCTAATGATTACTCATTCATTCGATATTACA CAAGGACCCTTTACCAATTCCAGTTTCAAGAAGCACTTTGTCAAGCA GCTAAACATGAAGGCCCTCTGCACAAATGTGACATCTCAAACTCTAC AGAAGCTGGACAGAAACTGTTCAATATGCTGAGGCTTGGAAAATCA GAACCCTGGACCCTAGCATTGGAAAATGTTGTAGGAGCAAAGAACA TGAATGTAAGGCCACTGCTCAACTACTTTGAGCCCTTATTTACCTGGC TGAAAGACCAGAACAAGAATTCTTTTGTGGGATGGAGTACCGACTGG AGTCCATATGCAGACCAAAGCATCAAAGTGAGGATAAGCCTAAAAT CAGCTCTTGGAGATAAAGCATATGAATGGAACGACAATGAAATGTA CCTGTTCCGATCATCTGTTGCATATGCTATGAGGCAGTACTTTTTAAA AGTAAAAAATCAGATGATTCTTTTTGGGGAGGAGGATGTGCGAGTGG CTAATTTGAAACCAAGAATCTCCTTTAATTTCTTTGTCACTGCACCTA AAAATGTGTCTGATATCATTCCTAGAACTGAAGTTGAAAAGGCCATC AGGATGTCCCGGAGCCGTATCAATGATGCTTTCCGTCTGAATGACAA CAGCCTAGAGTTTCTGGGGATACAGCCAACACTTGGACCTCCTAACC AGCCCCCTGTTTCCTAA。
第二种，在上述编码可溶性胞外区ACE2 1-740的基因序列的基础上， 通过删减获得的编码可溶性胞外区ACE2 1-620片段的非全长基因序列， 该非全长基因序列编码的蛋白保留了与S蛋白特异结合的功能域。非全长 基因序列为SEQ ID NO:3，序列如下：
ATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCTTCTCAGCCTTGTTGCTGTAACT GCTGCTCAGTCCACCATTGAGGAACAGGCCAAGACATTTTTGGACAA GTTTAACCACGAAGCCGAAGACCTGTTCTATCAAAGTTCACTTGCTT CTTGGAATTATAACACCAATATTACTGAAGAGAATGTCCAAAACATG AATAATGCTGGGGACAAATGGTCTGCCTTTTTAAAGGAACAGTCCAC ACTTGCCCAAATGTATCCACTACAAGAAATTCAGAATCTCACAGTCA AGCTTCAGCTGCAGGCTCTTCAGCAAAATGGGTCTTCAGTGCTCTCA GAAGACAAGAGCAAACGGTTGAACACAATTCTAAATACAATGAGCA CCATCTACAGTACTGGAAAAGTTTGTAACCCAGATAATCCACAAGAA TGCTTATTACTTGAACCAGGTTTGAATGAAATAATGGCAAACAGTTT AGACTACAATGAGAGGCTCTGGGCTTGGGAAAGCTGGAGATCTGAGGTCGGCAAGCAGCTGAGGCCATTATATGAAGAGTATGTGGTCTTGAA AAATGAGATGGCAAGAGCAAATCATTATGAGGACTATGGGGATTATT GGAGAGGAGACTATGAAGTAAATGGGGTAGATGGCTATGACTACAG CCGCGGCCAGTTGATTGAAGATGTGGAACATACCTTTGAAGAGATTA AACCATTATATGAACATCTTCATGCCTATGTGAGGGCAAAGTTGATG AATGCCTATCCTTCCTATATCAGTCCAATTGGATGCCTCCCTGCTCAT TTGCTTGGTGATATGTGGGGTAGATTTTGGACAAATCTGTACTCTTTG ACAGTTCCCTTTGGACAGAAACCAAACATAGATGTTACTGATGCAAT GGTGGACCAGGCCTGGGATGCACAGAGAATATTCAAGGAGGCCGAG AAGTTCTTTGTATCTGTTGGTCTTCCTAATATGACTCAAGGATTCTGG GAAAATTCCATGCTAACGGACCCAGGAAATGTTCAGAAAGCAGTCTG CCATCCCACAGCTTGGGACCTGGGGAAGGGCGACTTCAGGATCCTTA TGTGCACAAAGGTGACAATGGACGACTTCCTGACAGCTCATCATGAG ATGGGGCATATCCAGTATGATATGGCATATGCTGCACAACCTTTTCT GCTAAGAAATGGAGCTAATGAAGGATTCCATGAAGCTGTTGGGGAA ATCATGTCACTTTCTGCAGCCACACCTAAGCATTTAAAATCCATTGGT CTTCTGTCACCCGATTTTCAAGAAGACAATGAAACAGAAATAAACTT CCTGCTCAAACAAGCACTCACGATTGTTGGGACTCTGCCATTTACTTA CATGTTAGAGAAGTGGAGGTGGATGGTCTTTAAAGGGGAAATTCCCAAAGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGCGAGAGATAGT TGGGGTGGTGGAACCTGTGCCCCATGATGAAACATACTGTGACCCCG CATCTCTGTTCCATGTTTCTAATGATTACTCATTCATTCGATATTACA CAAGGACCCTTTACCAATTCCAGTTTCAAGAAGCACTTTGTCAAGCA GCTAAACATGAAGGCCCTCTGCACAAATGTGACATCTCAAACTCTAC AGAAGCTGGACAGAAACTGTTCAATATGCTGAGGCTTGGAAAATCA GAACCCTGGACCCTAGCATTGGAAAATGTTGTAGGAGCAAAGAACA TGAATGTAAGGCCACTGCTCAACTACTTTGAGCCCTTATTTACCTGGC TGAAAGACCAGAACAAGAATTCTTTTGTGGGATGGAGTACCGACTGG AGTCCATATGCAGACCAAAGCATCAAAGTGTAA。
其中，启动子为组成型启动子(CBA)，用于驱动可溶性胞外区ACE2 表达。所述启动子序列为SEQ ID NO:1，序列如下：
CTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCC CATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCT GGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTA TGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGG TGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTAT CATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGA GCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCC CAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGG CGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCG AGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATC AGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGG CGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTG CGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGC CCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCG GGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGAC GGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGG AGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTCTTTCCTACAGC TCCTGGGCAACGTGCTGGTTGTTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA
其中，ssAAV载体基因组序列为SEQ ID NO:2。
另一方面，本发明还提供一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型 基因治疗药物的制备方法，其包括：
S1:构建腺相关病毒表达载体质粒，该质粒包含ssAAV载体基因组、 启动子和用于编码可溶性胞外区ACE2的基因序列；
所述基因序列是编码可溶性胞外区ACE2 1-740片段的基因序列或在 该基因序列的基础上通过删减获得的编码可溶性胞外区ACE2 1-620片段 的非全长基因序列，所述非全长基因序列编码的蛋白保留了与S蛋白特异 结合的功能域；
S2:将上述的腺相关病毒表达载体质粒、包装质粒pRC9和辅助质粒 pHelper经层析纯化，共转染293T细胞，转染预定时间后，收集细胞并裂 解，获得基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物。
优选地，所述启动子为组成型启动子CBA，序列为SEQ ID NO:1。
优选地，步骤S1中，所述编码可溶性胞外区ACE2 1-740片段的基因 序列为SEQ IDNO:4；所述编码可溶性胞外区ACE2的1-620片段的非全 长基因序列为SEQ ID NO:3。
步骤S1中，构建腺相关病毒表达载体质粒的方法为：将ACE2 1-740 或ACE2 1-620亚克隆至ssAAV-CBA-MCS质粒，得到ssAAV-CBA-ACE2 1-740或ssAAV-CBA-ACE2 1-620质粒；该克隆过程包括如下步骤：
步骤1：将ssAAV-CBA-MCS用限制性内切酶XhoI和XbaI于37℃± 0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收ssAAV-CBA-MCS载体片 段；
将ACE2 1-740或ACE2 1-620进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保 护碱基和XhoI/XbaI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和XbaI 于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收ACE2 1-740或 ACE2 1-620的PCR片段；
步骤2：将胶回收试剂盒分别回收的ssAAV-CBA-MCS载体片段和 ACE2 1-740或ACE2 1-620片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应 10-20min；
步骤3：将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5α， 轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min， 加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器 将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培 养12-16h；
步骤4：挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中， 37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒ssAAV-CBA-ACE2 1-740或ssAAV-CBA-ACE2 1-620，进行XhoI和XbaI双酶切鉴定后进行 测序鉴定，至此腺相关病毒表达载体质粒构建成功。
步骤S2中，包装质粒pRC9所含序列为Addgene plasmid#112865； 辅助质粒pHelper所含序列为Cell Biolabs(Part No.340202)。
步骤S2中，将腺相关病毒表达载体质粒、包装质粒pRC9和辅助质粒 pHelper经层析纯化，在10层细胞工厂中转染293T细胞，转染68-72h后， 收集细胞并裂解，上清液经AAV-X层析柱亲和纯化，得到基于AAV载体 的基因治疗药物，病毒滴度通过real-time PCR方法测定，以vp/ml(virus particle/ml)表示。
以下结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案和效果。
一、基于AAV载体的基因治疗药物的组装过程，如图1，包括以下三 步：
第一步，构建ACE2 1～740和ACE2 1～620质粒载体
将ACE2 1～740和ACE2 1～620亚克隆至ssAAV-CBA-MCS质粒，得 到ssAAV-CBA-ACE2 1～740和ssAAV-CBA-ACE2 1～620克隆。该克隆过 程为：
将ssAAV-CBA-MCS用用限制性内切酶XhoI和XbaI于37℃进行双酶 切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约为4300bp。
将ACE2 1～740和ACE2 1～620进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上 保护碱基和XhoI/XbaI酶切位点，将扩增的PCR片段利用XhoI和XbaI于 37℃进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段。
胶回收试剂盒分别回收ssAAV-CBA-MCS载体和ACE2 1～740，ACE2 1～620片段，用T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟。
将连接产物转化至大肠杆菌，具体地，取连接产物5ul转化感受态 DH5a 100ul，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min， 加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均 匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养 12-16h。
挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃ 振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒ssAAV-CBA-ACE2 1～740或ssAAV-CBA-ACE2 1～620，进行XhoI和XbaI双酶切鉴定后进行测序鉴定， 质粒构建成功。
其中，ssAAV-CBA-MCS质粒的构建方法为：
将启动子CBA promoter亚克隆到ssAAV-MCS质粒，得到载体质粒 ssAAV-CBA-MCS。该克隆过程为：将ssAAV-MCS质粒用限制性内切酶 KpnI和XbaI于37℃进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段， 约为3200bp。
将CBA promoter进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和 KpnI/XbaI酶切位点。PCR片段利用KpnI和XbaI于37℃进行双酶切1小 时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为900bp。
胶回收试剂盒分别回收ssAAV载体和CBA启动子片段，T4 DNA连 接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转 化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s； 立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无 菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃ 倒置培养12-16h。
挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃ 振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒ssAAV-CBA-MCS，进行KpnI和 XbaI双酶切鉴定后测序，ssAAV-CBA-MCS载体构建成功。
第二步，准备质粒pRC9所含序列为Addgene plasmid#112865；辅助 质粒pHelper所含序列为Cell Biolabs(Part No.340202)。其中，质粒pRC9 和辅助质粒pHelper均来自商业购买。
第三步，组装制备AAV载体药物
将4E+08 HEK293T接种于10层细胞工厂。24小时后转染病毒包装质 粒，用量分别为pHelper(643ug)；pRC9(536ug)；ACE2 1～740(322ug)或 ACE2 1～620(322ug)。转染6小时后更换新鲜培养基。
72小时后收获细胞，采用自有AAVectiQTM进行层析纯化。浓缩过 滤除菌后得到1ml高纯度AAV病毒，病毒基因组滴度为1.87E+14vg(ACE2 1～740)和1.41E+14vg(ACE2 1～620)。
第四步，纯化：对上述获得的可表达可溶性(ACE2 1～740)或(ACE2 1～620)的AAV病毒，采用自主研发的AAVectiQTM纯化工艺进行纯化，其 技术流程如下：
①Lysis(裂解):病毒收获液采用经典的细胞裂解方法释放胞内的AAV 载体。由于有部分病毒释放到上清中，上清需酌情考虑回收AAV。
②Benzonase treatment(核酸酶消化)：用50U/ml的Benzonase于37℃ 处理1小时，可以将转染过程残留的质粒DNA和死去的细胞释放的基因 组等污染物去除85％以上，病毒液的粘度也会大幅下降，有利于后续的膜 处理和层析纯化。
③MF+UF(微滤+超滤)：裂解并消化后的病毒液含有大量的细胞碎 片等不溶物，需通过MF去除，提高料液的澄清度。由于料液中病毒含量 较低，还需要对澄清后的料液进行浓缩，提高后续处理的效率。采用300kDa 截留分子量的膜进行超滤，不仅可获得很好的收率，还可以去除大量的小 分子杂质，提高纯度。
④POROS AAVX(AAV亲和层析)：AAVX可以广泛结合AAV载体， 特异性好。采用AAVX纯化AAV9，纯化效果好，一步层析后，AAV9的 纯度可达到电泳纯和HPLC纯。
⑤CIM QA(QA阴离子层析)：亲和层析后的AAV载体纯度虽然很 高，但仍含有大量的空壳载体，不具有递送载体的能力，且容易引起免疫 反应。但是由于空载体和完整病毒的差异很小，在工艺上很难去除。经过 对比优化，选择QA整体柱层析纯化，载体的空载体会下降很多，A260/280 的值升高，表明空载体有大幅下降。
⑥Storage(保存)：离子交换层析液经过适当稀释，0.01％泊洛沙姆 做保护剂，采用0.2um膜过滤，分装，于-80℃保存，可保存1年。
二、确定可溶性胞外区ACE2 1-620和ACE2 1-740编码蛋白的外泌情 况
将表达可溶性胞外区ACE21-620和1-740片段的质粒转染到293T细 胞中，取细胞上清和裂解液进行Western Blot检测。结果如图2显示，在 293T细胞外可检测到ACE2的1-620或1-740的片段，说明ACE2的1-620 或1-740的片段为可溶性，均可分泌到293T细胞外。
三、在细胞水平上验证ACE2(1-620)和ACE2(1-740)抑制新冠感染的 水平
将表达可溶性胞外区ACE21-620和1-740片段的AAV载体质粒转染 到293T细胞中，Luciferase新冠假病毒感染细胞(表面具有与真病毒相同 的S蛋白)，利用荧光素酶报告系统检测ACE2(1-620)和ACE2(1-740)抑 制新冠假病毒的感染水平。结果如图3所示，与控制组C相比，ACE2(1-620) 和ACE2(1-740)均明显地可抑制新冠假病毒的感染。
四、建立hACE小鼠模型，SPIKEYTM新冠假病毒感染
将成年小鼠(250g/只)胸腔注射AAV9-h ACE2病毒载体，向小鼠体 内导入hACE2(人ACE2)受体，从而建立新冠易感模型。注射7天后， 再胸腔注射带Luciferse(荧光蛋白酶)的新冠假病毒(表面具有与真病毒 相同的S蛋白)，同时取野生型小鼠注射同等剂量的新冠假病毒作为对照。
8天后，进行小鼠活体成像检测。结果如图4显示，野生型小鼠不能 感染新冠假病毒，胸腔无信号(左)。注射AAV9-hACE2病毒载体的小鼠 可以感染新冠假病毒，胸腔有显著信号(右)。
五、在模型小鼠体内验证携带编码可溶性胞外区(ACE2 1～740)或 (ACE2 1～620)的基因序列的AAV载体药物对于新冠病毒的阻断效果
成年小鼠胸腔注射AAV9-hACE2病毒载体，注射1天后分别注射PBS, AAV9-hACE2(1-620)【携带编码可溶性胞外区(ACE2 1～620)的基因的AAV9载体】和AAV9-hACE2(1-740)【携带编码可溶性胞外区(ACE2 1～740)的基因的AAV9载体】,注射6天后，胸腔注射带Luciferse(荧光 蛋白酶)的新冠假病毒。8天后，进行小鼠活体成像检测。结果如图5所 示，AAV9-hACE2(1-620)和AAV9-hACE2(1-740)均可以阻断新冠病毒的感 染。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非 对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的 普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进 行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或 者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中吉智药（天津）生物技术有限公司
<120> 基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物及制备方法
<130> EJS200885
<141> 2020-09-08
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 938
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct 660
gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga 720
ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc 780
gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc 840
gggagggccc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctc tttcctacag ctcctgggca 900
acgtgctggt tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaa 938
<210> 2
<211> 4135
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtctagt tattaatagt aatcaattac 180
ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 240
cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 300
catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac 360
tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 420
tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 480
ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt 540
ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 600
ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 660
ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 720
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 780
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 900
gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc 960
ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag ggcccctctg ctaaccatgt 1020
tcatgccttc ttctctttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttgttg tgctgtctca 1080
tcattttggc aaagaattcc ccggggatcc tctagagtcg acctgcagaa gcttatcgat 1140
ggtaccagat ctgctagcct cgagctgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 1200
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 1260
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 1320
ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg 1380
gctctatggg cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 1440
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 1500
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 1560
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 1620
tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 1680
gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 1740
ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 1800
cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 1860
tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 1920
ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 1980
ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 2040
tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 2100
gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 2160
tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 2220
cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 2280
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 2340
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2400
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2460
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 2520
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 2580
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 2640
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 2700
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 2760
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 2820
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 2880
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 2940
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 3000
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 3060
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 3120
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 3180
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 3240
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 3300
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 3360
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3420
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3480
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3540
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3600
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3660
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3720
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3780
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3840
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 3900
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3960
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4020
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4080
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 4135
<210> 3
<211> 1863
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540
gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600
gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080
tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140
tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320
aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
taa 1863
<210> 4
<211> 2223
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
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gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
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tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
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aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920
tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980
cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040
tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100
gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160
agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220
taa 2223
Claims (10)
1.一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其特征在于，其包括:
腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的ssAAV载体基因组、启动子和适于编码可溶性胞外区ACE2的序列；所述序列编码的蛋白质可分泌到胞外，且具有与S蛋白特异结合的功能域。
2.根据权利要求1所述的基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其特征在于，所述适于编码可溶性胞外区ACE2的序列是在编码ACE2全长蛋白1-805的基因序列基础上通过删减获得的编码可溶性胞外区ACE21-740和1-620非全长蛋白的基因片段；所述基因片段编码的蛋白保留了与S蛋白特异结合的功能域。
3.根据权利要求1所述的基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其特征在于，所述启动子为组成型启动子CBA。
4.根据权利要求2所述的基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其特征在于，所述启动子序列为SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求1所述的基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其特征在于，所述编码可溶性胞外区ACE21-740的片段的基因片段序列为SEQ ID NO:4。
6.根据权利要求1所述的基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其特征在于，所述编码可溶性胞外区ACE21-620片段的基因片段序列为SEQ ID NO:3。
7.一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物的制备方法，其特征在于，包括：
S1:构建腺相关病毒表达载体质粒，该质粒包含ssAAV载体基因组、启动子和用于编码可溶性胞外区ACE2的基因序列；
所述基因序列是在编码ACE2全长蛋白1-805的基因序列基础上通过删减获得的编码可溶性胞外区ACE2 1-740和1-620非全长蛋白的基因片段；所述基因片段编码的蛋白保留了与S蛋白特异结合的功能域；S2:将上述的腺相关病毒表达载体质粒、包装质粒pRC9和辅助质粒pHelper经层析纯化，共转染293T细胞，转染预定时间后，收集细胞并裂解，获得基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述启动子为组成型启动子CBA，序列为SEQ ID NO:1。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述编码可溶性胞外区ACE2 1-740非全长蛋白的基因片段序列为SEQ ID NO:4；所述编码可溶性胞外区ACE2的1-620非全长蛋白的基因片段序列为SEQ ID NO:3。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，构建腺相关病毒表达载体质粒的方法为：将编码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620非全长蛋白的基因片段亚克隆至ssAAV-CBA-MCS质粒，得到ssAAV-CBA-ACE2 1-740或ssAAV-CBA-ACE2 1-620质粒；该克隆过程包括如下步骤：
步骤1：将ssAAV-CBA-MCS用限制性内切酶XhoI和XbaI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收ssAAV-CBA-MCS载体片段；
将编码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620非全长蛋白的基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和XhoI/XbaI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和XbaI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收编码可溶性胞外区ACE2 1-740或ACE2 1-620非全长蛋白的PCR片段；
步骤2：将胶回收试剂盒分别回收的ssAAV-CBA-MCS载体片段和编码可溶性胞外区ACE21-740或ACE2 1-620非全长蛋白的基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
步骤3：将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5α，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；
步骤4：挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取质粒ssAAV-CBA-ACE2 1-740或ssAAV-CBA-ACE2 1-620，进行XhoI和XbaI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此腺相关病毒表达载体质粒构建成功。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112680466A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-20 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种表达人源ace2的动物模型及其用途 |
| CN113171471A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-07-27 | 中山大学 | 一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物及应用 |
| CN113234744A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-08-10 | 深圳市人民医院 | 一种编码分泌型血管紧张素转换酶2的mRNA及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030129164A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-07-10 | Flannery John G. | Expression of glial-derived neurotrophic factor for treatment of diseases of the eye |
| US20030138894A1 (en) * | 2001-06-04 | 2003-07-24 | Parry Tom J. | Methods and compositions for modulating ACE-2 activity |
| JP2020037538A (ja) * | 2018-09-05 | 2020-03-12 | 国立大学法人秋田大学 | アンジオテンシン変換酵素２活性を有する原核微生物由来ポリペプチドの医薬用途 |
| CN111529685A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-08-14 | 厦门诺康得生物科技有限公司 | 抗呼吸道病毒感染的鼻腔喷雾制剂 |
| CN111549064A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-08-18 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 应用腺病毒转导制备能够表达人源ace2转基因非人动物的方法，及所得动物的应用 |
| CN111662884A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-15 | 中吉当康(北京)基因技术有限公司 | 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 |
-
2020
- 2020-09-21 CN CN202010992085.1A patent/CN112138152A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030138894A1 (en) * | 2001-06-04 | 2003-07-24 | Parry Tom J. | Methods and compositions for modulating ACE-2 activity |
| US20030129164A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-07-10 | Flannery John G. | Expression of glial-derived neurotrophic factor for treatment of diseases of the eye |
| JP2020037538A (ja) * | 2018-09-05 | 2020-03-12 | 国立大学法人秋田大学 | アンジオテンシン変換酵素２活性を有する原核微生物由来ポリペプチドの医薬用途 |
| CN111549064A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-08-18 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 应用腺病毒转导制备能够表达人源ace2转基因非人动物的方法，及所得动物的应用 |
| CN111529685A (zh) * | 2020-04-21 | 2020-08-14 | 厦门诺康得生物科技有限公司 | 抗呼吸道病毒感染的鼻腔喷雾制剂 |
| CN111662884A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-15 | 中吉当康(北京)基因技术有限公司 | 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ERIC SONG等: "Immunologically distinct responses occur in the CNS of COVID-19 patients", 《BIORXIV》 * |
| JAMES BRETT CASE等: "Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2", 《BIORXIV》 * |
| VANESSA MONTEIL等: "Inhibition of SARS-CoV-2 Infections in Engineered Human Tissues Using Clinical-Grade Soluble Human ACE2", 《CELL》 * |
| YIGUO QIU等: "AAV8-Mediated Angiotensin-Converting Enzyme 2 Gene Delivery Prevents Experimental Autoimmune Uveitis by Regulating MAPK, NF-κB and STAT3 Pathways", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112680466A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-20 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种表达人源ace2的动物模型及其用途 |
| CN112680466B (zh) * | 2021-01-21 | 2023-08-18 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种表达人源ace2的动物模型及其用途 |
| CN113171471A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-07-27 | 中山大学 | 一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物及应用 |
| CN113171471B (zh) * | 2021-04-02 | 2022-02-15 | 中山大学 | 一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物及应用 |
| CN113234744A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-08-10 | 深圳市人民医院 | 一种编码分泌型血管紧张素转换酶2的mRNA及其应用 |
| CN113234744B (zh) * | 2021-05-20 | 2024-05-17 | 深圳市人民医院 | 一种编码分泌型血管紧张素转换酶2的mRNA及其应用 |
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