KR20210124299A

KR20210124299A - Cln6 폴리뉴클레오티드의 아데노-관련 바이러스 전달

Info

Publication number: KR20210124299A
Application number: KR1020217027481A
Authority: KR
Inventors: 캐스린 마이어; 브라이언 케이. 카스파
Original assignee: 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Priority date: 2019-02-04
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2021-10-14
Also published as: CN113574176A; AU2020218501A1; WO2020163299A1; BR112021015150A2; CA3127801A1; US20220202956A1; SG11202107983TA; CL2021002051A1; TW202033768A; JP2022519597A; EP3921429A1; IL285329A; MX2021009404A

Abstract

본 개시내용은 신경세포 세로이드 리포푸신 6 (ceroid lipofuscinosis neuronal 6) (CLN6) 폴리뉴클레오티드의 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 전달에 관한 것이다. 본 개시내용은 rAAV 및 신경세포 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 또는 CLN6-바텐병(Batten Disease)의 CLN6 유전자 치료를 위한 rAAV 사용 방법을 제공한다.

Description

CLN6 폴리뉴클레오티드의 아데노-관련 바이러스 전달

본 출원은 2019년 2월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/800,915, 2019년 7월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/880,641, 2019년 7월 31일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/881,151, 2019년 10월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/912,977, 및 2019년 10월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/923,125에 대한 우선권 이익을 주장하고, 이들 모든 출원은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

서열목록의 참조문헌으로 인용

본 출원은, 개시내용과 별도의 부분으로서, 컴퓨터-판독가능한 형태로의 서열목록 (파일명: 53894_SeqListing.txt; 24,923 바이트 - 2020년 1월 31일에 생성된 ASCII 텍스트 파일)을 포함하고, 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용은 신경세포 세로이드 리포푸신 6(ceroid lipofuscinosis neuronal 6) (CLN6) 폴리뉴클레오티드의 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 전달에 관한 것이다. 본 개시내용은 rAAV 및 신경세포 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis)(NCL) 또는 CLN6-바텐병(Batten Disease)의 CLN6 유전자 치료를 위한 rAAV 사용 방법을 제공한다.

신경세포 세로이드 리포푸신증 (NCL)은 심각한 신경퇴행성 질환의 군이고, 이는 통칭 바텐병으로 지칭된다. 이러한 장애는 신경계에 영향을 주며 전형적으로 예를 들어, 운동 및 사고 능력과 같은 문제 악화를 유발한다. 다른 NCL은 유전적 원인으로 구별된다.

CLN6-바텐병은 두 개의 서로 다른 형태로 발생할 수 있다: 보다 일반적인 형태로 변이형 후기 유아 NCL (vLINCL), 및 성인 발병 NCL (또한 A형 Kufs 질환으로도 칭함) (문헌 [Cannelii et al., Biochem Biophys Res Commun . 2009;379(4):892-7, Arsov et al., Am J Hum Genet. 2011;88(5):566-73]). vLINCL (본원에서 CLN6-바텐병으로 지칭)의 발병 연령은 18개월에서 6세 사이이며 사망은 전형적으로 12-15세 사이에 발생한다. CLN6-바텐병은 처음에 초기 아동기에 언어 장애 및 운동/인지 발달 지연으로 나타나고, 대부분의 환자는 질병 발병 4년 이내에 휠체어를 타게 된다 (문헌 [Canafoglia et al., Neurology. 2015;85(4):316-24]). 이 질병은 시각 상실, 심한 운동 장애, 재발성 발작, 치매 및 기타 신경퇴행성 증상을 포함하는 것으로 진행된다.

CLN6은 예측된 7개의 트랜스 막인 도메인을 갖는 311개의 아미노산 단백질이며, 소포체에 주로 국재된다. 다른 CLN 단백질과 마찬가지로 그의 정확한 기능은 불분명하지만, 그것은 세포 내 트래피킹과 리소좀 기능에 관련되어 있다. 현재 CLN6에는 70가지 이상의 특징적인 질병 유발 돌연변이가 있고 (문헌 [Warrier et al., Biochimica et Biophysica Acta. 2013;1832(11):1827-30]) 대부분의 이러한 돌연변이는 CLN6 단백질의 완전한 손실, 또는 고도로 불안정하고/하거나 기능이 없는 것으로 여겨지는 절단된 CLN6 단백질 생성물의 생산 중 어느 하나를 초래한다. CLN6-바텐병의 여러 자연 발생 동물 모델이 기재되어 있으며, 여기에는 양, 개 및 마우스 모델이 포함된다. Cln6 ^nclf 마우스 모델 (본원에서 "Cln6 ^nclf 마우스"로 지칭됨)에서 발견되는 자발적인 돌연변이는 질병의 많은 병리적 및 행동적 양상을 재현한다)문헌 [Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694]). Cln6 ^nclf 마우스는 CLN6-바텐병 환자에서 흔히 발견되는 돌연변이와 상동성인 조기 종료 코돈을 유발하여 추가 시토신의 삽입 (c.307insC, P102 이후의 프레임 이동)을 포함한다 (문헌 [Gao et al., Am J Hum Genet. 2002;70(2):324-35, Wheeler et al., Am J Hum Genet. 2002;70(2):537-42]).

현재 CLN6-바텐병의 증상을 역전시킬 수 있는 치료법은 없다. 따라서, CLN6-바텐병에 대한 치료가 당업계에서 요구되고 있다.

재조합 AAV를 이용한 CLN6 유전자 치료법을 위한 방법 및 제품이 본원에 제공된다.

하이브리드 치킨 β-액틴 (CB) 프로모터 및 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 5'에서 3'의 순서로 포함한다. 일부 경우, rAAV9 게놈은 자가-보완적 게놈을 포함하는 rAAV9 게놈을 포함하는, CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)가 본원에 제공된다. 일부 경우, rAAV9 게놈은 단일 가닥 게놈을 포함한다.

서열 번호 1에 기재된 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 자가-보완적 재조합 아데노-관련 바이러스 99 (self-complementary recombinant adeno-associated virus 9)(scAAV9)가 제공되고, 여기서 scAAV9의 게놈은 제1 AAV 역전 말단 반복부(ㅁ first AAV inverted terminal repeat), 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 하이브리드 치킨 β-액틴 (CB) 프로모터, 서열 번호 2에 기재된 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함한다. CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2와 적어도 90% 동일할 수 있다.

또한, 제1 AAV 역전 말단 반복부, CMV 인핸서, 하이브리드 치킨 β-액틴 프로모터 (cb), SV40 인트론, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 게놈을 갖는 scAAV9가 제공되고; 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 폴리 A 서열 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 게놈을 갖는 scAAV9가 제공되고; 서열 번호 4의 핵산 서열에서 기재된 유전자 카세트를 포함하는 게놈을 갖는 scAAV9가 제공된다.

또한, 제1 AAV 역전 말단 반복부, CMV 인핸서, 하이브리드 치킨 β-액틴 프로모터 (CB), SV40 인트론, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 게놈을 갖는 scAAV9; 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 폴리 A 서열 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 게놈을 갖는 scAAV9; 및 서열 번호 4의 핵산 서열에 기재된 유전자 카세트를 포함하는 게놈을 갖는 ssAAV9가 제공된다.

서열 번호 4에 기재된 핵산 서열은 도 1a에 제공된 유전자 카세트이다. 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일하거나, 또는 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 또는 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하는 scAAV9 게놈 또는 ssAAV9 게놈을 갖는 rAAV9가 제공된다.

제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 포함하는 핵산 분자가 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일할 수 있다.

또한, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CB 프로모터, SV40 인트론, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 추가로, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, BGH 폴리-A 서열 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 제공된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것에서, CLN6 폴리펩티드는 서열 번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열로 코딩될 수 있다.

scAAV 게놈 또는 ssAAV 게놈을 갖는 rAAV가 제공되며, 여기서 게놈은 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일하거나, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함한다.

제공된 rAAV는 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 개시된 임의의 핵산을 포함하는 바이러스 입자가 제공된다. 자가-보완적 또는 단일 가닥 게놈을 갖는 rAAV도 제공된다.

또한, 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 5'에서 3' 순서로 포함하는 rAAV9 게놈을 포함하는, CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9 (rAAV9) 바이러스 입자가 제공된다. 일부 실시양태에서, 제공된 rAAV9 바이러스 입자는 자가-보완적 게놈을 포함한다. 대안적으로, 제공된 rAAV9 바이러스 입자는 단일 가닥 게놈을 포함한다.

rAAV9 바이러스 입자가 추가로 제공되며, 여기서, rAAV9 게놈은, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3' 순서로 포함한다. 제공된 rAAV9 입자는 서열 번호 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 임의의 rAAV9 바이러스 입자는 선택적으로 SV40 인트론 및/또는 BGH 폴리-A 서열을 추가로 포함한다.

추가의 실시 양태에서, rAAV9 바이러스 입자는 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일하거나, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하는 AAV9 게놈을 포함한다.

제공된 rAAV, ssAAV 또는 scAAV 중 임의의 것에서, AAV 역전 말단 반복부는 AAV2 역전 말단 반복부일 수 있다.

또한, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 5'에서 3' 순서로 포함하는 rAAV9 게놈을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 제공된 핵산 분자는 자가-보완적 게놈 및/또는 단일 가닥 게놈을 포함한다.

제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 6과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열 번호 3과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3' 순서로 포함하는 rAAV9 게놈을 포함하는 핵산 분자가 추가로 제공된다. 제공된 핵산 분자는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일하거나, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하거나, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하는 AAV9 게놈을 포함할 수 있다. 제공된 임의의 핵산 분자는 선택적으로 SV40 인트론 및/또는 BGH 폴리-A 서열을 추가로 포함한다.

본원에 기재된 scAAV9, 본원에 기술된 핵산 분자, 또는 본원에 기재된 rAAV 바이러스 입자, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 일부 경우에, 약학적으로 허용되는 부형제는 비이온성 저삼투압 화합물, 완충제, 중합체, 염, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체는 공중합체이다. 일부 실시양태에서, 상기 공중합체는 폴록사머이다. 예를 들어, 상기 조성물은 비이온성 저삼투압 화합물을 포함하는 약학적으로 허용되는 부형제를 적어도 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적으로 허용되는 부형제는 약 20 내지 40% 비이온성 저삼투압 화합물 또는 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 조성물은 20 mM 트리스 (pH8.0), 1mM MgCl₂ _, 200mM NaCl, 0.001%의 폴록사머 188 및 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물로 제제화된 scAAV를 포함한다. 또 다른 예시적인 조성물은 0.001% 플루로닉 F68을 포함하는 1X PBS로 제제화된 scAAV를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 rAAV9, 본원에 개시된 임의의 scAAV9, 본원에 개시된 임의의 ssAAV9, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLN6-바텐병을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.

본 개시내용은 또한 CLN6-바텐병 치료용 약제의 생산를 위한 본원에 개시된 임의의 rAAV9, 본원에 개시된 임의의 scAAV9, 본원에 개시된 임의의 ssAAV9, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량의 용도를 제공한다.

또한, 본원에 개시된 임의의 rAAV9, 본원에 개시된 임의의 scAAV9, 본원에 개시된 임의의 ssAAV9, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자 또는 본원에 기재된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 CLN6-바텐병 치료를 위한 조성물을 제공한다.

제공된 CLN6-바텐병 치료용 방법, 용도, 또는 조성물 중 임의의 것에서, 상기 조성물, rAAV9, ssAAV9, 또는 scAAV9 및/또는 핵산 분자는 척수강 내, 뇌실 내, 뇌실질 내, 정맥 내, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여된다.

척수강 내 경로에 의해 투여되는 scAAV9, ssAAV9 또는 rAAV9의 예시적인 투여량은 약 1x10¹¹ vg의 scAAV9, ssAAV9, 또는 rAAV9 바이러스 입자 내지 약 1x10¹⁵ vg의 scAAV9, ssAAV9, 또는 rAAV9 바이러스 입자, 또는 약 1x10¹² vg의 scAAV9, ssAAV9 또는 rAAV9 바이러스 입자 내지 약 1x10¹⁴ vg의 scAAV9, ssAAV9 또는 AAV9 바이러스 입자이다. 예를 들어, 약 1Х 10¹³ vg의 scAAV9, ssAAV9 또는 rAAV9 바이러스 입자를 대상체에 투여할 수 있거나, 약 1.5x10¹³의 scAAV9, ssAAV9 또는 rAAV9 바이러스 입자를 대상체에 투여할 수 있거나, 약 6x10¹³ vg의 scAAV9, ssAAV9 또는 rAAV9 바이러스 입자를 대상에게 투여할 수 있다.

CLN6-바텐병 치료용 방법, 용도, 또는 조성물은 치료 전의 대상체 또는 치료받지 않은 CLN6-바텐병 환자와 비교하여, (a) 자가 형광 저장 물질의 리소좀 축적 감소 또는 둔화, (b) ATP 합성효소 서브유닛 C의 리소좀 축적 감소 또는 둔화, (c) 신경교세포 활성화 (성상교세포 및/또는 미세 신경교세포) 활성화 감소 또는 둔화, (d) 성상교세포증 감소 또는 둔화, (e) MRI에 의해 측정된 뇌 체적 손실 감소 또는 둔화, (f) 발작 발생 감소 또는 둔화, 및 (g) CLN6 바텐병의 진행 및/또는 개선을 평가하는 데 사용되는 하나 이상의 척도, 예를 들어 통합 바텐병 평가 시스템 (UBDRS) 평가 척도 또는 함부르크 운동 및 언어 척도(Hamburg Motor and Language Scale), 또는 초기 학습 뮬렌 척도(Mullen Scales of Early Learning) (MSEL)에서의 안정화, 진행 감소 또는 둔화, 또는 개선, 중 하나 이상의 결과를 대상체에서 초래한다. 대상체는 rAAV9, ssAAV9 바이러스 입자, 또는 scAAV, 또는 본원에 개시된 핵산 분자를 투여한 후 트렌델렌버그(Trendelenberg) 체위로 유지될 수 있다.

본원에 개시된 rAAV 바이러스 입자 중 임의의 하나, 본원에 개시된 임의의 scAAV9, 본원에 개시된 임의의 ssAAV9, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자를 포함하는 조성물, 또는 본원에 기재된 임의의 조성물을 이를 필요로 하는 환자의 뇌 또는 척수에 전달하는 것을 포함하는, CLN6 질병 치료를 필요로 하는 환자에서 CLN6 질병을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.

추가적으로, 본 개시내용은 본원에 개시된 rAAV 바이러스 입자 중 임의의 하나, 본원에 개시된 임의의 scAAV9, 본원에 개시된 임의의 ssAAV9, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자, 또는 본원에 기재된 임의의 조성물을, 상기 이를 필요로 하는 환자의 뇌 또는 척수에 전달하는 데 사용하기 위한 상기 ssAAV9, 핵산 분자, 또는 조성물의 용도를 제공한다.

또한, 본원에 개시된 rAAV 바이러스 입자 중 임의의 하나, 본원에 개시된 임의의 scAAV9, 본원에 개시된 임의의 ssAAV9, 본원에 기재된 임의의 핵산 분자, 또는 본원에 기재된 조성물을 포함하는 조성물이, 상기 ssAAV9, 핵산 분자, 또는 조성물을 필요로 하는 환자의 뇌 또는 척수에 전달하기 위해 제공된다.

제공된 임의의 방법, 용도, 또는 조성물에서, 상기 조성물은 척수강 내, 뇌실 내, 뇌실질 내 또는 정맥 내 주사, 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다. 제공된 임의의 방법은 조성물, rAAV9, ssAAV9, 또는 scAAV, 또는 본원에 개시된 핵산 분자를 척수강 내로 투여한 후 환자를 트렌델렌버그 체위로 배치하는 단계를 추가로 포함한다.

제공된 임의의 방법, 용도, 또는 조성물에서, 조성물 또는 약제는 비이온성 저삼투압 조영제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로미드, 이오베르솔, 이옥실란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비이온성 저삼투압 조영제를 포함할 수 있다.

투여된 조성물 또는 약제는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 부형제는 약 20 내지 40% 비이온성 저삼투압 화합물 또는 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물을 포함할 수 있다. 예시적인 조성물은 20mM 트리스 (pH8.0), 1mM MgCl₂ _, 200mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188 및 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물로 제제화된 scAAV를 포함한다. 또 다른 예시적인 조성물은 1XPBS 및 0.001% 플루로닉 F68로 제제화된 scAAV를 포함한다.

제공된 임의의 방법, 용도 또는 조성물에서, 조성물 또는 약제가 뇌 또는 척수에 전달될 수 있거나, 조성물 또는 약제가 뇌간에 전달될 수 있거나, 또는 소뇌에 전달될 수 있거나, 시각 피질에 전달될 수 있거나, 또는 운동 피질에 전달될 수 있다. 또한, 제공된 임의의 방법에서, 조성물 또는 약제가 뇌 또는 척수에 전달될 수 있고, 조성물이 신경 세포, 신경교세포, 또는 이들 모두에 전달될 수 있다. 예를 들어, 여기서 뇌 또는 척수로의 전달은 뉴런, 하부 운동 뉴런, 미세교세포, 희소 돌기 아교 세포, 성상교세포, 슈반 세포 또는 이들의 조합과 같은 신경계의 세포로의 전달을 포함한다.

본원에 개시된 방법, 용도 및 조성물은 치료 전의 대상체와 비교하여 또는 치료받지 않은 CLN6-바텐병 대상체와 비교하여, (a) 자가 형광 저장 물질의 리소좀 축적 감소 또는 둔화, (b) ATP 합성효소 서브유닛 C의 리소좀 축적 감소 또는 둔화, (c) 신경교세포 활성화 (성상교세포 및/또는 미세교세포) 활성화 감소 또는 둔화, (d) 성상교세포증 감소 또는 둔화, (e) MRI에 의해 측정된 뇌 체적 손실 감소 또는 둔화, (f) 발작 발생 감소 또는 둔화, 및 (g) CLN6 바텐병의 진행 및/또는 개선을 평가하는 데 사용되는 하나 이상의 척도, 예를 들어 통합 바텐병 평가 시스템 (UBDRS) 평가 척도, 함부르크 운동 및 언어 척도, 또는 초기 학습 뮬렌 척도 (MSEL)에서의 안정화, 진행 감소, 또는 개선, 중 하나 이상의 결과를 대상체에서 초래한다.

본원에 기재된 임의의 방법, 조성물 및 용도에서, 치료, 조성물 또는 약제는 CLN-6 바텐병의 질병 진행을 안정화시키거나 느리게 한다. 특히, 질병 진행은 UBDRS 척도, 함부르크 운동 및 언어 척도, 소아 삶의 질(PEDSQOL) 척도를 사용한 삶의 질에 대한 치료의 영향, 조기 학습 뮬렌 척도 (MSEL), 연장된 생존 가능성, 또는 이들의 조합으로 평가된다.

본원에 기재된 임의의 방법, 용도 또는 조성물에서, 치료받지 않은 CLN6-바텐병 환자와 비교했을 때 치료, 조성물 또는 약제는 (a) 뇌 체적 손실; (b) 인지 기능 상실; (c) 언어 지연으로부터 선택되는 CLN-6 바텐병의 하나 이상의 증상을 감소 또는 둔화시킨다. 특히, 치료는 CLN-6 바텐병의 질병 진행을 안정화하거나 둔화시킨다. 예를 들어, 질병 진행은 UBDRS 척도, 함부르크 운동 및 언어 척도, 소아 삶의 질(PEDSQOL) 척도를 사용한 삶의 질에 대한 치료의 영향, 조기 학습 뮬렌 척도 (MSEL), 연장된 생존 가능성, 또는 이들의 조합으로 평가된다.

본원에 기재된 임의의 방법, 용도 또는 조성물에서, 대상체 연령은 80개월 이하, 75개월 이하, 70개월 이하, 65개월 이하, 62개월 이하, 60개월 이하, 55개월 이하 , 50개월 이하 또는 40개월 이하이다.

CLN6-바텐병에 대한 효과적인 치료법이 없다는 것을 감안할 때, Cln6 ^nclf 마우스 모델을 사용하여 아데노-관련 바이러스 (AAV)-매개 유전자 요법을 통해 기능성 인간 CLN6을 도입하는 효능을 시험하였다.본원에서 제공된 전임상 결과는 AAV-혈청형 9의 사용이 가장 영향을 받은 세포가 위치한 CNS 전반에 걸쳐 인간 CLN6 단백질의 효율적인 발현을 가능하게 한다는 것을 암시한다. 더 큰 동물 모델에서 치료의 안전성을 평가하기 위해, 3마리 4세의 시노몰구스 원숭이(Cynomolgus Macaques)에게 척수강 내 요추 CSF 주사로 scAAV9.CB.CLN6을 투여하고 주사 후 최대 6개월 동안 모니터링했다. 어떠한 부작용이나 병리도 관찰되지 않았고, 모든 동물의 뇌와 척수에서 높은 수준의 형질 전환 유전자 발현이 확인되었다. 출생 후 마우스의 CSF로의 scAAV9.CB.CLN6의 뇌실 내 (ICV) 투여는 Cln6 ^nclf 마우스에서 생체 내 형질 전환의 지속적인 발현을 유도하였다. scAAV9.CB.CLN6의 투여가 자가 형광 저장 물질 및 ATP 합성 효소 서브 유닛 C의 축적, 반응성 신경세포증 및 수상 돌기의 손실을 포함하여 질병의 전형적인 특징을 감소시켰다. 중요하게도, 이 유전자 요법 치료는 Cln6 ^nclf 마우스의 많은 운동, 기억 및 학습, 및 생존 장애를 예방하기 때문에 광범위한 기능적 이점을 유도한다. 이러한 결과는 CLN6-바텐병 치료를 위한 CSF-전달 scAAV9.CB.CLN6의 치료적 가능성을 강력하게 강조한다.

본원의 발명의 명칭은 독자의 편의를 위한 것이며 제한하는 것을 의도하지 않는다.

본 명세서에서 '할 수 있다 (may, can)'를 사용하는 것은 청구범위 내에 포함되는 다양한 실시양태를 설명하기 위한 것으로, 청구범위의 불확실성을 나타내려는 것이 아니다.

도 1a-1c는 생체 내 인간 CLN6 단백질의 뉴런 표적화 및 발현을 나타낸다. 도 1a는 scAAV.CB.CLN6의 scAAV 게놈의 개략도를 제공한다. 도 1b의 그래프는 scAAV.CB.CLN6 플라스미드로 HEK293 세포를 일시적으로 형질 감염시킨 후의 CNL6 mRNA 및 인간 CLN6 (hCLN6) 단백질 발현 수준을 제공한다. 도 1c의 이미지는 scAAV.CB.CLN6 플라스미드의 자궁 내(in utero ) 전기 천공 후 GFP 및 hCLN6 단백질에 대한 면역조직화학 염색을 제공한다.
도 2a 및 2b 는 scAAV9.CB.CLN6을 주사한 Cln6 ^nclf 마우스의 CNS에서 인간 CLN6 전사체의 광범위한 발현을 보여주는 이미지를 제공한다. 도 2a의 이미지와 그래프는 주사 후 6개월과 18개월에 농도계에 의한 정량화 (GAPDH로 정규화) 및 대표적인 RT-PCR 젤을 제공한다. 이 분석은 야생형 마우스 (WT 또는 WT + PBS) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf + PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 전달 (Cln6 ^nclf +scAAV9) 후 유전자 발현이 증가함을 입증했다. 도 2b의 좌측 패널은 주사 후 6개월 및 18개월에 야생형 마우스 (WT + PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 주사한 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf + scAAV9)의 CNS에서 인간 CLN6 전사체의 광범위한 발현을 입증하는 이미지를 제공한다. 도 2b의 우측 패널은 주사 후 6개월 및 18개월에 야생형 마우스 (WT + PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6-주사된 Cln6 ^nclf 마우스의 다양한 뇌 영역에서의 단백질 발현을 입증하는 면역조직화학 염색을 보여주는 이미지를 제공한다. 스케일 바 50 μm. 평균 +/- SEM. N = 3-9마리 마우스/군. 일원 분산 분석 (ANOVA), 본페로니 보정(Bonferroni correction). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 3a- 3c 는 2개월량 동물에서 단일 scAAV9.CB.CLN6 주사의 효과를 입증한다. 도 3a의 이미지 및 그래프는 주사 후 2 개월에서 농도계에 의한 정량화 (GAPDH로 정규화) 및 대표적인 RT-PCR 겔을 제공한다. 이 분석은 야생형 마우스 (WT + PBS) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf + PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 전달 (Cln6 ^nclf + scAAV9) 후의 증가된 유전자 발현을 입증한다. 도 3b의 상단 패널은 주사 후 2개월에 야생형 마우스 (WT + PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6을 주사한 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf + scAAV9)의 CNS에서의 인간 CLN6 전사체의 광범위한 발현을 입증하는 이미지를 제공한다. 도 3b의 하단 패널은 주사 후 2 개월에 야생형 마우스 (WT + PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스의 다양한 뇌 영역에서의 단백질 발현을 입증하는 면역조직화학 염색을 보여주는 이미지를 제공한다. 스케일 바 200μm. 평균 +/- SEM. N=39. 일원 분산 분석, 본페로니 보정. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 도 3c의 이미지 및 그래프는 P1에서 scAAV9.CB.CLN6의 단일 ICV 주사가 주사 후 2개월에 야생형 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)와 비교하여 Cln6 ^nclf 마우스의 체성 감각 피질 및 VPM/VPL에서의 자가 형광 저장 물질 (ASM; 상단 패널) 및 ATP 합성 효소 서브 유닛 C (SubC; 하단 패널)의 축적을 감소시킨다는 것을 입증한다. Mean +/- SEM, N=3-10. (상단 패널); 평균 +/- SEM, N=21-72, 생물학적 N=3-10 (하단 패널) 일원 분산 분석, 본페로니 보정. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 스케일 바 200μm (상단 패널). 스케일 바 50μm (하단 패널).
도 4a 및 4b는 다음 영역에서 뇌 전체에 걸쳐 CLN6 mRNA 및 hCLN6 단백질의 광범위한 발현을 입증한다: A: 운동 피질, B: 체성 감각 피질; C: 시각 피질; D: 시상; E: 뇌교(pons); F: 소뇌; G: 뇌간. 도 4A에 제공된 이미지는 주사 후 2개월, 6개월 및 18개월에 scAAV9.CB.CLN6 치료된 Cln6 ^nclf 마우스에서 뇌 전체에 걸친 hCLN6 전사체 발현을 입증한다. 도 4b에 제공된 이미지는 주사 후 2개월, 6개월 및 18개월에 scAAV9.CB.CLN6로 치료된 Cln6 ^nclf 마우스에서 뇌 전체에 걸친 hCLN6 단백질 발현을 입증한다. 스케일 바 50 μm.
도 5는 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 치료 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)와 비교하여 주사 후 6개월 및 18개월에 scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)의 VPM/VPL 및 체성 감각 피질에서의 자가 형광 저장 물질 (ASM)의 축적 감소를 입증하는 이미지 및 그래프를 제공한다. 그래프는 ASM⁺ 세포/2500 μm²의 수를 나타낸다. 평균 +/- SEM, 시점에 따라 N=3-10. 일원 분산 분석, 본페로니 보정. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 스케일 바 50 μm.
도 6은 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 치료 Cln6 ^nclf 마우스 ( Cln6 ^nclf PBS)에 비해 주사 후 6개월 및 18개월에 scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)의 VPM/VPL 및 체성 감각 피질에서 미토콘드리아 ATP 합성 효소 서브 유닛 C (SubUnitC)의 감소 축적을 입증하는 이미지 및 그래프를 제공한다. 갈색 염색은 서브 유닛 C를 나타내고, 파란색 염색은 메틸 그린 (핵)을 나타낸다. 그래프는 이미지 필드 당 총 SubC⁺ 영역을 나타낸다. 평균 +/- SEM, N=21-72, 생물학적 N=3-10. 일원 분산 분석, 본페로니 보정. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 스케일 바 50 μm.
도 7은 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)가 야생형 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)에 비해 6 및 18개월에 VPM/VPL 및 체성 감각 피질에서 성상교세포증 (GFAP 반응성)을 덜 발현함을 입증하는 이미지 및 그래프를 제공한다. 그래프는 총 GFAP+ 면역 반응성을 보여준다. 평균 +/- SEM, N= 6-49 섹션, 생물학적 N=3-10마리 마우스/군. 일원 분산 분석, 본페로니 보정. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 스케일 바 50μm. 삽입 스케일 바 10μm.
도 8 은 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV9)가 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)에 비해 주사 후 6개월에 체성 감각 피질에서, 그리고, 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)에 비해 주사 후 18개월에 VPM/VPL 및 체성 감각 피질 모두에서 더 적은 미세아교세포증 (CD68 반응성)을 나타냄을 입증하는 이미지 및 그래프를 제공한다. 그래프는 총 CD68+ 면역반응성을 보여준다. 평균 +/- SEM, N=16-49 섹션, 생물학적 N=3-10 마리 마우스/군. 일원 분산 분석, 본페로니 보정. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 스케일 바 50μm. 삽입 스케일 바 10μm.
도 9a-9e는 CLN6의 지속적인 발현이 Cln6 ^nclf 마우스에서 운동, 기억, 학습 및 생존 장애를 구조한다는 것을 입증하는 그래프를 제공한다. 도 9a는 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)가 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)와 비교하여 8개월령 내지 24개월령에 감소된 로타로드 결손을 가짐을 입증한다. 도 9b는 scAAV9.CB.CLN6 주사가 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)에서 12개월령 및 18개월령에 뒷다리 걸쇠 걸음, 걸음 걸이, 및 렛지 저하 장애를 교정함을 입증한다. 도 9c는 야생형 마우스 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)에서 9개월령 내지 12개월령에 scAAV9.CB.CLN6가 모리스 수중 미로에서 기억 및 학습 장애를 예방한다는 것을 입증한다. 도 9d는 scAAV9.CB.CLN6 주사가 Cln6 ^nclf 동물의 조기 사망을 예방하는 반면에 PBS 주입 Cln6 ^nclf 동물은 15개월령까지 사망함을 입증한다. 도 9e는 야생형 동물 (WT) 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)에 비해 scAAV9.CB.CLN6 치료 마우스 (Cln6 ^nclf scAAV)에서 연구 과정에서의 수컷 (좌측 패널) 및 암컷 (우측 패널)의 체중 증가를 보여준다. 평균 +/- SEM, 로타로드의 경우 N=6-24, 걸쇄 걸음 점수의 경우 N=7-13, 수중 미로의 경우 N=5-15, 생존 곡선의 경우 N=10-15. 무게에 대해 N=3-13. 적절한 경우 본페로니 보정 또는 짝형성되지 않은 t-test가 있는 일원 분산 분석이 사용됨. 생존 곡선 분석에 사용된 log-rank (Mantel-Cox) 시험 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001
도 10은 12-24개월 동물의 추가 행동 데이터를 제공한다. 도 10a에 제공된 그래프는 모리스 수중 미로 시험에서 11개월령 및 12개월령에 비치료된 Cln6 ^nclf 동물이 현저하게 느린 수영 속도를 가짐을 입증한다. 도 10b의 그래프는 scAAV9.CB.CLN6이 12개월, 18개월 및 24개월령에 모리스 수중 미로 역전 태스크에서 Cln6 ^nclf 마우스의 기억 및 학습 장애를 유의하게 개선시키지 않는다는 것을 입증한다. 수영 속도는 대조군으로서 표시된다. 수중 미로에 대한 N=5-15, 짝형성되지 않은 t-test, 평균 +/- SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001
도 11a-11c는 scAAV9.CB.CLN6이 비인간 영장류에서 고도로 발현되고 잘 견딤을 입증하는 데이터를 제공한다. 도 11a는 scAAV9.CB.CLN6 치료 비인간 영장류의 다양한 뇌 및 척수 영역에서 형질 전환 유전자의 높은 발현을 입증하는 웨스턴 블롯을 제공한다. 블롯은 3 마리의 동물을 대표하며, '+'는 scAAV9.CB.CLN6 치료 동물을 나타낸다. 다음과 같은 뇌 영역이 시험되었다: 피질 (Ctx), 뇌량 (C. call), 뇌실 주위 백색질 (P.V.W.M.:), 해마 (Hipp), 소뇌 (Cere), 시상 (Thal), 경부 척수 (Cervical), 흉부 척수 (Thoracic), 요추 척수 (Lumbar). 도 11b의 그래프는 도 1a의 형광 웨스턴 블롯의 정량화를 제공한다. 평균 +/- SEM, N=3. 짝형성되지 않은 학생의 t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 도 11c의 그래프는 scAAV9.CB.CLN6의 전달이 혈소판 농도를 변화시키지 않거나 대부분의 scAAV9.CB.CLN6 치료 비인간 영장류에서 간 효소를 상승시키지 않는다는 것을 입증한다. 적색 데이터 포인트는 scAAV9 CB CLN6 치료 동물을 나타내고; 파란색 데이터 포인트는 PBS 치료 동물을 나타낸다. 테스트 된 효소는 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST), 알칼린 포스파타아제 (Alk Phos), 감마-글루타밀 트랜스퍼라아제 (GGT)이다.
도 12a-12c는 함부르크 운동 및 언어 척도로 측정한 두 명의 연구 내 형제 쌍에서 scAAV9.CB.CLN6 주사 후 질병 진행의 분석을 제공한다.
도 13은 scAAV9.CB.CLN6 유전자 카세트 (서열 번호 4)의 핵산 서열을 제공한다. AAV2 ITR 핵산 서열은 이탤릭체로 표시되고 (5' ITR은 서열 번호 9로서 기재되고, 3' ITR은 서열 번호 8로서 기재됨), CMV 인핸서 핵산 서열 (서열 번호 6)은 점선으로 밑줄 치료되고, CB 프로모터 핵산 서열 (서열 번호 3)은 단일 선으로 밑줄 치료되고, SV40 인트론 핵산 서열 (서열 번호 11)은 이중 선으로 밑줄 치료되고, 인간 CLN6 cDNA 서열의 핵산 서열 (서열 번호 2)은 볼드체로 표기되며, BGH 폴리A 종결 서열의 핵산 서열 (서열 번호 10)은 파선으로 밑줄 치료된다.
도 14는 전장 AAV.CB.CLN6의 핵산 서열 (서열 번호 8)을 제공한다.
도 15는 함부르크 행동 및 언어 척도에 의해 측정된 scAAV9.CB.CLN6으로 치료된 8명의 환자에 대한 효능 데이터를 제공한다.
도 16a-16c는 치료 및 비치료 형제 간의 비교를 제공한다. 한 형제만 scAAV9.CB.CLN6으로 치료를 받았고 함부르크 운동 및 언어 척도로 측정한 이들의 진행을 이들의 비치료 형제의 원래 히스토리와 비교했다. 이 데이터는 시간에 따른 함부르크 점수: 운동 + 언어로 제공된다.
도 17은 함부르크 운동 및 언어 기능에 대한 조합 점수에서 기준선에서 2점 이상 비역전 감소까지의 시간에 대한 카플란 마이어 곡선을 제공한다. 이 수치는 scAAV9.CB.CLN6으로 치료받은 처음 8명의 환자에 대한 데이터를 Nationwide Children's Hospital이 수행한 CLN6 환자 (n=14)에 대한 진행 중인 자연사 연구의 데이터와 비교하였다. 신뢰 구간은 생존 확률 추정치와 표준 오차를 사용하여 계산된다.
도 18은 scAAV9.CB.CLN6으로 치료된 환자 (n=8)의 조합 및 개별 함부르크 운동 및 언어 점수를 제공하며, 이는 CLN6 유전자 요법이 8명의 환자 중 7명에서 운동 및 언어 기능에 긍정적인 영향과 함께 질병 진행을 중단시키거나 실질적으로 늦추는 것을 보여준다.
도 19는 연령 및 기준선 함부르크 운동 및 언어 종합 점수에 대해 일치된 자연사 환자와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6으로 치료된 환자 (n=8) 간의 자연사 일치 비교를 제공한다.
도 20은 CLN6-바텐병 환자 (n=11)에 대한 자연사 데이터를 제공한다. 범례에서 점선 (----)은 언어 저하를 나타내고 회색 실선은 운동 저하를 나타낸다. 파란색 선 (윗줄)은 운동 및 언어 쇠퇴의 합계이다. 평균 함부르크 운동 + 언어 점수는 y축에 표시되고 개월 단위 연령은 x축에 표시된다. 2세에서 7세까지는 상당히 선형적이고 거의 지속적으로 1년에 1점씩 감소한다.
도 21a-21b는 뮬렌 조기 학습 척도의 4개 도메인에 대한 원시 점수를 제공한다. 가로 점선은 스크리닝에 점수를 나타낸다. 더 높은 점수는 더 높은 기능을 나타낸다.

본 개시내용은 CLN6-바텐병을 치료하는 방법 및 제품을 제공한다. 상기 방법은 rAAV를 유전자 전달 벡터로 사용하여 대상체에게 CLN6 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것을 포함한다.

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 복제 결핍 파보바이러스이며, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 2개의 145 뉴클레오티드 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 약 4.7 kb 길이이고, 그의 바이러스 또는 이들의 유도체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 용어는 다르게 명시된 경우를 제외하고 모든 아류형 및 자연 발생 형과 재조합 형을 모두 포함한다. AAV의 다중 혈청형이 존재한다. AAV의 혈청형은 각각 특정 클레드(clade)와 관련되며, 그 구성원은 혈청학적 및 기능적 유사성을 공유한다. 따라서, AAV는 클레드로 칭할 수도 있다. 예를 들어, AAV9 서열은 "클레드 F" 서열로 칭한다 (문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]). 본 개시내용은 특정 클레드, 예를 들어 클레드 F 내의 임의의 서열의 사용을 고려한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_002077에 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_001401 및 문헌 [Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_1829에 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank Accession No. AF085716에 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_00 1862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank Accession Nos. AX753246 및 AX753249에 제공되고; AAV-9 게놈은 문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌 [Mol. Ther ., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌 [Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에 제공되고; AAV-12 게놈의 일부는 Genbank Accession No. DQ813647에 제공되며; AAV-13 게놈의 일부는 Genbank Accession No. EU285562에 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제 9,434,928호에 제공된다. AAV-B1 게놈의 서열은 문헌 [Choudhury et al., Mol . Ther., 24(7): 1247-1257 (2016)]에 제공된다. 바이러스 DNA 복제 (rep), 이입(encapsidation)/포장 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열이 ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터 (이들의 상대적 맵 위치에 대하여 p5, p19, 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론 (뉴클레오티드 2107 및 2227에서)의 차등 스플라이싱과 결합된 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)는 rep 유전자 유래 4개의 rep 단백질 (rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생성을 초래한다. Rep 단백질은 바이러스 게놈 복제에 궁극적인 원인으로 작용하는 다중 효소 특성을 갖는다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 대안적 스플라이싱 및 비-공통 번역 개시 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산에 관여한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 생애 주기 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에서 검토된다.

AAV는, 예를 들어, 유전자 요법에서 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서 이를 매력적으로 만드는 고유 특성을 갖는다. 배양 중인 세포의 AAV 감염은 비-세포변성성이며, 인간과 기타 동물의 자연적 감염은 침묵성이고 무증상성이다. 더욱이, AAV는 생체내 다수의 상이한 조직을 표적화할 가능성이 존재하는 다수의 포유동물 세포를 감염시킨다. 더욱이, AAV는 느리게 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 상기 세포의 생존 기간 동안 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서 유지할 수 있다. 천연(native) AAV 프로바이러스(proviral) 게놈은 재조합 게놈의 구축을 실현가능하게 하는 플라스미드 내 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 또한, AAV 복제, 게놈 이입 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, (복제 및 구조 캡시드 단백질, rep-cap을 코딩하는) 게놈의 내부 약 4.3kb의 일부 또는 전부가 외래 DNA, 예컨대 프로모터를 함유하는 유전자 카세트, 관심 DNA 및 폴리아데닐화 신호에 의해 대체될 수 있다. 일부 경우에, rep 단백질과 cap 단백질이 트랜스로 제공된다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 이것이 매우 안정적이며 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 비활성화시키는 데 사용되는 조건 (수 시간 동안 56°C 내지 65°C)을 용이하게 견딤으로써 AAV의 저온 보존의 중요성을 감소시킨다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염(superinfection)에 내성이 없다.

본원에 사용된 용어 "AAV"는 야생형 AAV 바이러스 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 "AAV", "AAV 바이러스" 및 "AAV 바이러스 입자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "rAAV"는 재조합 AAV 바이러스 또는 재조합 감염성, 캡슐화 된 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 "rAAV", "rAAV 바이러스" 및 "rAAV 바이러스 입자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

용어 "rAAV 게놈"은 변형된 천연 AAV 게놈으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 천연 cap 및 rep 유전자를 제거하도록 변형되었다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 내인성 5 '및 3' 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 AAV 게놈이 유래된 AAV 혈청형과 상이한 AAV 혈청형으로부터의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 역전 말단 반복부 (ITR)에 의해 5 '및 3' 말단에 플랭킹된 관심 형질 도입 유전자 (예: CLN6-코딩 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 "유전자 카세트"를 포함한다. 예시적인 유전자 카세트가 도 1a 및 서열 번호 4의 핵산 서열에 개시된다. rAAV 게놈은 본원에서 "scAAV 게놈"으로 지칭되는 자가-보완적 (sc) 게놈일 수 있다. 대안적으로는, rAAV 게놈은 본원에서 "ssAAV 게놈"이라 칭하는 단일 가닥 (ss) 게놈일 수 있다.

용어 "scAAV"는 자가-보완적 게놈을 포함하는 rAAV 바이러스 또는 rAAV 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 "ssAAV"는 단일 가닥 게놈을 포함하는 rAAV 바이러스 또는 rAAV 바이러스 입자를 지칭한다.

본원에서 제공된 rAAV 게놈은, 일부 경우, CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. CLN6 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 이는 CLN6 활성 (예를 들어, 리소좀 자동 형광 저장 물질의 제거 증가, ATP 합성 효소 서브 유닛 C의 리소좀 축적 감소, 및 예를 들어 치료 전 환자와 비교하여 치료될 때 환자에서 성상교세포 및 미세교세포의 활성화 감소 중 적어도 하나)을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

본원에서 제공된 rAAV 게놈은 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지거나, 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지며, CLN6 활성 (예를 들어, 리소좀 자동 형광 저장 물질의 제거 증가, ATP 합성효소 서브 유닛 C의 리소좀 축적 감소, 및 예를 들어 치료 전 환자와 비교하여 치료될 때 환자에서 성상교세포 및 미세교세포의 활성화 감소 중 적어도 하나)을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 rAAV 게놈은 CLN6 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 엄격한 조건 하에서 서열 번호 2의 핵산 서열 또는 이의 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "엄격한"은 당업계에서 일반적으로 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 혼성화 엄격성은 주로 온도, 이온 강도, 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 결정된다. 혼성화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65-68°C에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산 나트륨, 또는 42°C에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨, 및 50% 포름아미드를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)]을 참고한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 rAAV 게놈은 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 플랭킹한 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. CLN6 폴리뉴클레오티드는 유전자 카세트를 형성하기 위한 표적 세포에서 기능적인 전사 조절 요소 (프로모터, 인핸서 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하지만 이에 한정되지는 않음)에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터의 예는 치킨 β-액틴 프로모터 및 P546 프로모터이다. 본원에서 고려되는 추가의 프로모터는, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 급 초기(immediate-early) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 서열 번호 3으로 기재되는 CB 프로모터 서열 ,및 CB 전사 촉진 활성을 갖는 프로모터인 서열 번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 프로모터 서열이 본원에서 추가적으로 제공된다. 전사 조절 요소의 다른 예는 조직 특이적 조절 요소, 예를 들어 뉴런 내에서 또는 특히 성상교세포 내에서 특이적으로 발현을 허용하는 프로모터이다. 예는 뉴런 특이적 에놀라아제 및 신경교세포 섬유성 산성 단백질 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터 또한 고려된다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린-조절 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 유전자 카세트는 또한 포유류 세포에서 발현될 때 CLN6 RNA 전사체의 가공을 용이하게 하기 위한 인트론 서열을 포함할 수 있다. 그러한 인트론의 한 예는 SV40 인트론이다.

"포장"은 AAV 입자의 조립(assembly) 및 이입(encapsidation)을 초래하는 일련의 세포내 사건을 지칭한다. "생산"란 용어는 포장 세포에 의해 rAAV (감염성의 이입된 rAAV 입자)를 생성하는 과정을 지칭한다.

AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 각각 아데노-관련 바이러스의 복제 및 이입 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "포장 유전자"로 지칭된다.

AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV (예를 들어, 야생형 AAV)가 포유류 세포에 의해 복제되고 포장될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 우두 바이러스와 같은 폭스 바이러스를 비롯한 AAV에 대한 다양한 헬퍼 바이러스가 당업계에 공지되어 있다. 서브 그룹 C의 아데노바이러스 유형 5가 가장 보편적으로 사용되지만, 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브 그룹을 포함할 수 있다. 사람, 비인간 포유류, 및 조류 기원의 수 많은 아데노 바이러스가 공지되어 있고 ATCC와 같은 기탁에서 입수할 수 있다. 헤르페스 과의 바이러스는, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 뿐만 아니라 거대 세포 바이러스 (CMV) 및 가성광견병 바이러스 (PRV)를 포함하고, 이들 또한 ATCC와 같은 기탁에서 입수할 수 있다.

"헬퍼 바이러스 기능(들)"이란 AAV 복제 및 포장을 (본원에 기재된 복제 및 포장에 대한 다른 요구 사항과 함께) 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈에서 코딩된 기능을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 헬퍼 바이러스를 제공하거나, 예를 들어 필요한 기능(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 트랜스로 생산자 세포에 제공하는 것을 포함하는 수 많은 방법으로 제공될 수 있다.

본원에서 제공된 rAAV 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 없다. 본원에서 고려되는 rAAV 게놈의 AAV DNA (예를 들어, ITR)는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 및 AAV-B1를 포함하지만 이에 제한되지 않는 재조합 바이러스를 유도하는데 임의의 AAV 혈청형에서 유래될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 또한 고려된다. 예를 들어 문헌 [Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]를 참조한다. 본원에서 변형된 캡시드가 또한 고려되고, 글리코실화 및 탈아미드화와 같은 다양한 번역 후 변형을 갖는 캡시드를 포함한다. 아스파라긴 잔기의 아스파트산 또는 이소아스파트산 잔기로의 전환, 및 글루타민의 글루탐산 또는 이소글루탐산으로의 전환을 초래하는 아스파라긴 또는 글루타민 측쇄의 탈아미드화가 본원에 제공된 rAAV 캡시드에서 고려된다. 예를 들어 문헌 [Giles et al., Molecular Therapy, 26(12): 2848-2862 (2018)]를 참조한다. 본원에서 변형된 캡시드는 또한 치료를 필요로 하는 발병 조직 및 기관으로 rAAV를 향하게 하는 표적화 서열을 포함하는 것으로 고려된다.

본원에서 제공된 DNA 플라스미드는 본원에 기술된 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 AAV9 캡시드 단백질을 갖는 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노 바이러스, E1-결실 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스)로의 감염 가능한 세포로 전달될 수 있다. 포장될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 생산 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV 입자의 생산는 하기의 구성 요소가 단일 세포 (본원에서는 포장 세포로서 지칭됨) 내에 존재할 것을 요구한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 (즉, 이의 내부에 존재하지 않음) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는, 재조합 바이러스가 유도될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 위형(pseudotyped) rAAV의 생산는 예를 들어, 이의 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다양한 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 재조합 rAAV의 전달을 향상시키도록 변형될 수 있다. 캡시드 단백질에 대한 변형은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이들의 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제2005/0053922호 및 제2009/0202490호를 참조한다.

포장 세포를 생성하는 방법은 rAAV 생산에 필요한 모든 구성 요소를 안정적으로 발현하는 세포주를 생산하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택 가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 하나의 플라스미드 (또는 다수의 플라스미드)가 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다. rAAV 게놈은 하기와 같은 절차에 의해 박테리아 플라스미드로 도입될 수 있다: GC 테일링 (문헌 [Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081)]), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 부가 (문헌 [Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73)]) 또는 직접, 블런트(blunt)-말단 결찰 (문헌 [Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)]). 포장 세포주는 이후 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염될 수 있다. 이 방법의 장점은 세포가 선택 가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 포장 세포로 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용한다.

rAAV 입자 생산의 일반 원칙은 예를 들어 문헌 [Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)]에서 검토된다. 다양한 접근법이 문헌 [Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)]에 기재되어 있다. 문헌 [Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)]; 미국 등록 특허 제 5,173,414호; 국제 공개 WO 95/13365호 및 대응 미국 등록 특허 제 5,658.776호; 국제 공개 WO 95/13392; 국제 공개 WO 96/17947; 국제 출원 PCT/US98/18600; 국제 공개 WO 97/09441 (PCT/US96/14423); 국제 공개 WO 97/08298 (PCT/US96/13872); 국제 공개 WO 97/21825 (PCT/US96/20777); 국제 공개 WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); 국제 공개 WO 99/11764; 문헌 [Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250]; 문헌 [Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615]; 문헌 [Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132]; 미국 등록 특허 제 5,786,211호; 미국 등록 특허 제 5,871,982호; 및 미국 등록 특허 제 6,258,595호. 상기 문헌은 rAAV 입자 생산와 관련된 문헌의 해당 부분을 특히 강조하여 이의 전체내용이 본원에서 참조로 포함된다.

감염성 rAAV 입자를 생산하는 포장 세포가 추가로 본원에 제공된다. 일 실시양태에서, 포장 세포는 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포 (동원 293 계열)와 같은 무변성으로 변형된 암세포일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 포장 세포는, 변형된 암 세포, 예컨대 낮은 계대 293 세포 (아데노바이러스의 E1로 변형된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포 (인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포 (인간 태아 섬유아세포), 베로 세포 (원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포 (레서스 태아 폐 세포)가 아닌 세포일 수 있다.

또한, 본 개시내용의 rAAV 게놈을 포함하는 rAAV (예를 들어, 감염성 이입된 rAAV 입자)가 본원에 제공된다. rAAV의 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없으며, 즉 rAAV의 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. rAAV 게놈은 자가-보완적 (sc) 게놈일 수 있다. sc 게놈을 갖는 rAAV는 본원에서 scAAV로 지칭된다. rAAV 게놈은 단일 가닥 (ss) 게놈일 수 있다. 단일 가닥 게놈을 갖는 rAAV는 본원에서 ssAAV로 지칭된다.

본원에서 제공된 예시적 rAAV는 "scAAV9.CB.CLN6"으로 명명된 scAAV이다. 상기 scAAV9.CB.CLN6 scAAV는 하이브리드 치킨 β-액틴 (CB) 프로모터 (서열 번호 3)의 제어 하에 인간 CLN6 cDNA를 포함하는 scAAV 게놈을 함유한다. scAAV 게놈은 또한 SV40 인트론 (인간 CLN6 cDNA의 업스트림) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 (BGH 폴리 A) 종결 서열 (인간 CLN6 cDNA의 다운스트림)을 포함한다. 이 scAAV9.CB.CLN6 유전자 카세트의 서열은 서열 번호 4에 기재되어 있다. scAAV 게놈은 AAV9 캡시드로 포장되며 AAV2 ITR (CB 프로모터의 한 ITR 업스트림과 BGH 폴리 A 종결 서열의 다른 ITR 다운스트림)을 포함한다.

rAAV는 칼럼 크로마토그래피 또는 염화 세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV를 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther ., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol . Med ., 69: 427-443 (2002)]; 미국 등록 특허 제 6,566,118호 및 국제 공개 WO 98/09657호에 기재된 방법을 포함할 수 있다.

rAAV를 포함하는 조성물도 제공된다. 조성물은 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 rAAV를 포함한다. 조성물은 상이한 관심 폴리펩티드를 코딩하는 두 개 이상의 rAAV를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 scAAV 또는 ssAAV이다.

본원에서 제공된 조성물은 rAAV 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 허용가능한 부형제는 수용체에게 비독성이며, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 인산염 [예를 들어, 인산 완충 생리식수염 (PBS)], 시트르산 또는 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 포도당, 만노오스 또는 덱스트린; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 대이온(counterion); 및/또는 Tween, 공중합체, 예컨대 폴록사머 188, 플루로닉스 (예: 플루로닉 F68) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 본원에서 제공되는 조성물은 비이온성 저삼투압 화합물, 예컨대 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로미드, 이오베르솔, 또는 이옥실란을 함유하는 약학적으로 허용되는 수성 부형제를 포함하고, 비이온성 저삼투압 화합물을 포함하는 수성 부형제는 약 180 mgI/mL, 약 322mOsm/kg 물의 증기압 삼투압, 약 273mOsm/L의 삼투압, 20 °C에서 약 2.3cp 및 37 °C에서 약 1.5cp의 절대 점도, 및 37 °C에서 약 1.164의 비중, 중 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 예시적인 조성물은 약 20 내지 40% 비이온성 저삼투압 화합물 또는 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물을 포함한다. 예시적인 조성물은 20mM 트리스 (pH8.0), 1mM MgCl₂ _, 200mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188 및 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물로 제제화된 scAAV 또는 rAAV 바이러스 입자를 포함한다. 또 다른 예시적인 조성물은 1X PBS 및 0.001% 플루로닉 F68로 제제화된 scAAV를 포함한다.

본 개시내용의 방법에서 투여될 rAAV의 투여량은 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 투여 시간, 치료 목표, 개체, 및 표적화되는 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈 (vg)의 단위로 표현될 수 있다. 본원에서 고려되는 투여량은 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³, 약 1.1x10¹³, 약 1.2x10¹³, 약 1.3x10¹³, 약 1.5x10¹³, 약 2 x10¹³, 약 2.5 x10¹³, 약 3 x 10¹³, 약 3.5 x 10¹³, 약 4x 10¹³, 약 4.5x 10¹³, 약 5 x 10¹³, 약 6x10¹³, 약 1x10¹⁴, 약 2 x10¹⁴, 약 3 x 10¹⁴, 약 4x 10¹⁴, 약 5x10¹⁴, 약 1x10¹⁵, 내지 약 1x10¹⁶, 또는 그 이상의 총 바이러스 게놈을 포함한다. 약 1x10¹¹ 내지 약 1x10¹⁵ vg, 약 1x10¹² 내지 약 1x10¹⁵ vg, 약 1x10¹² 내지 약 1x10¹⁴ vg, 약 1x10¹³ 내지 약 6x10¹⁴ vg, 및 약 6x10¹³ 내지 약 1.0x10¹⁴ vg의 투여량이 또한 고려된다. 본원에서 예시된 일 투여량은 6Х10¹³ vg이다. 본원에서 예시된 또 다른 투여량은 1.5x10¹³이다.

rAAV로 표적 세포 (신경계, 신경 또는 신경교세포의 세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않음)를 형질 도입하는 방법이 제공된다. 신경계의 세포는 뉴런, 하부 운동 뉴런, 미세교세포, 희소 돌기 아교 세포, 성상교세포, 슈반 세포 또는 이들의 조합을 포함한다.

용어 "형질도입"은, 수용체 세포에 의한 기능적 폴리펩티드의 발현을 초래하는 본 개시내용의 복제-결여 rAAV를 통한, 생체내 또는 시험관내에서 표적 세포로의 CLN6 폴리뉴클레오티드의 투여/전달을 지칭하기 위하여 사용된다. 본 개시내용의 rAAV로 세포를 형질 도입하면 rAAV에 의해 코딩 된 폴리펩티드 또는 RNA가 지속적으로 발현된다. 따라서, 본 개시내용은 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 대상 rAAV를 척수강 내, 뇌실 내, 뇌실질 내 또는 정맥 내 경로, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 투여/전달하는 방법을 제공한다. 척수강 내 전달은 뇌 또는 척수의 거미 막 아래 공간으로의 전달을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 척수강 내 투여는 대조 내(intracisternal) 투여를 통한 것이다.

척수강 내 투여가 본원에 예시된다. 이들 방법은 본원에 기술된 하나 이상의 rAAV와 함께 표적 세포 (신경 및/또는 신경교세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않음)를 형질 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, CLN3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 바이러스 입자는 환자의 뇌 및/또는 척수에 투여되거나 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 뇌에 전달된다. 전달을 위해 고려되는 뇌의 영역은 운동 피질, 시각 피질, 소뇌 및 뇌간을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 척수로 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 뉴런 또는 하부 운동 뉴런에 전달된다. 폴리뉴클레오티드는 신경 및 신경교세포에 전달될 수 있다. 신경교세포는 미세교세포, 희소 돌기 아교 세포 또는 성상교세포이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 슈반 세포에 전달된다.

본원에서 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 환자는 rAAV의 투여 후 (예를 들어, 약 5분, 약 10분, 약 15분 또는 약 20분 동안) 트렌델렌버그 체위 (헤드 다운 자세)로 유지된다. 예를 들어, 환자는 약 1도 내지 약 30도, 약 15도 내지 약 30도, 약 30도 내지 약 60도, 약 60도 내지 약 90도, 또는 약 90도 내지 약 180 도로 기울어진 헤드 다운 자세일 수 있다.

본원에서 제공된 방법은 본원에 제공된 rAAV를 포함하는 조성물의 유효량 또는 유효 다중 투여량을 필요로 하는 대상체 (예를 들어 인간 환자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 동물)에게 투여하는 단계를 포함한다. 용량이 CL6-바텐병의 발병 이전에 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 용량이 CL6-바텐병의 발병 후에 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 유효량은 치료되는 질병과 관련된 적어도 하나의 증상을 경감 (제거, 안정화 또는 감소)시키고, 질병의 진행을 늦추거나 예방하고, 질병의 범위를 감소시키고, 질병의 (부분 또는 전체) 차도를 유발하고/하거나 생존을 연장시키는, 용량이다. 치료 전의 대상체 또는 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 본원에서 제공되는 방법은 CLN6 바텐병의 진행 및/또는 개선을 평가하는데 사용되는 하나 이상의 척도, 예를 들어 통합 바텐병 평가 시스템 (UBDRS), 함부르크 운동 및 언어 척도, 또는 초기 학습 뮬렌 척도 (MSEL)에서의 안정화, 감소된 진행, 또는 개선을 초래한다. UBDRS 평가 척도는 (문헌 [Marshall et al., Neurology.2005 65(2):275-279]에 기재된 바와 같이) UBDRS 신체 평가 척도, UBDRS 발작 평가 척도, UBDRS 행동 평가 척도, UBDRS 능력 평가 척도, UBDRS 증상 발현 순서 및 UBDRS 임상적 세계 노출수 (CGI : Clinical Global Impressions)]; 인생 척도의 소화기 질(Pediatric Quality of Life Scale) (PEDSQOL) 척도, 운동 기능, 언어 기능, 인지 기능, 및 생존을 포함한다. 치료 전의 대상체 또는 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 본원에서 제공되는 방법은 자가 형광 저장 물질의 감소 또는 둔화된 리소좀 축적, ATP 합성효소 서브 유닛 C의 감소 또는 둔화된 리소좀 축적, 감소 또는 둔화된 신경교세포 활성화 (성상교세포 및/또는 미세교세포) 활성화; 감소 또는 둔화된 성상세포증 중 하나 이상을 초래할 수 있고, MRI로 측정한 뇌 용량 손실의 감소 또는 지연을 나타냈다.

조합 요법도 제공된다. 본원에서 사용된 조합은 동시 치료 또는 순차 치료 중 어느 하나를 포함한다. 본원에 기재된 방법과 표준 의학 치료법의 조합이 구체적으로 고려된다. 추가로, 동시 치료 또는 순차적 치료 중 어느 하나가 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 조성물의 조합 (예를 들어, scAAV9.P546.CLN6과 본원에 개시된 조영제의 조합)이 구체적으로 고려된다.

출생 후 이를 필요로 하는 대상체로의 전달이 고려되지만, 태아로의 자궁 내 전달도 고려된다.

실시예

다음 실시예는 구체적인 실시양태를 기재하지만, 변화 및 변형이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일어날 것으로 이해된다. 따라서, 청구범위에 나타난 바와 같은 이러한 제한만은 본 개시내용에 적용되어야 한다.

실시예에서, 하이브리드 치킨 β-액틴 (CB) 프로모터의 제어 하에 CLN6 cDNA를 갖는 자가-보완적 AAV (scAAV9.CB.CLN6으로 명명됨)가 생산되었다. 생후 1일 마우스의 CSF로의 IVC 주사 (6x10¹³ vg/동물)는 18개월까지 CNS 전체에 걸쳐 안정하고 견고한 발현 CLN6 단백질을 유도하기에 충분했다. CLN6-바텐병의 진행은 ASM의 축적, ATP 합성 효소 서브유닛 C의 응집, 시냅스 척추 밀도 감소, 성상교세포에서의 GFAP 반응성 증가, 및 미세교세포에서의 CD68 염색 증가와 관련된다. Cln6 ^nclf 마우스는 ASM 및 ATP 합성 효소 서브 유닛 C에서 증가를 나타내었고 2개월에서 수지상 척주가 감소하였고, 6개월령까지 GFAP 및 CD68 반응성이 증가하였다. Cln6 ^nclf 마우스에서 scAAV9.CB.CLN6의 주사는 ASM 및 ATP 합성 효소 서브 유닛 C의 축적을 감소시켰고, 수지상 척주 밀도를 증가시켰고, CD68+ 미세교세포 및 GFAP+ 성상교세포 반응성의 수준을 감소시켰다.

실시예 1

scAAV9.CB.CLN6 생산

인간 CLN6 cDNA 클론은 Origene, Rockville, MD로부터 수득하였다. hCLN6 cDNA를 하이브리드 치킨 β-액틴 프로모터 (CB)하에 AAV9 게놈에 추가로 서브 클로닝하고 시험관 내 및 생체 내에서 시험하였다. 치킨 β-액틴 (CB) 하이브리드 프로모터의 조절 하에 인간 CLN6 (hCLN6) 유전자를 포함하는 자가 보완적 아데노-관련 바이러스 (scAAV) 혈청형 9 바이러스 게놈이 생성되었다. AAV2 ITR 사이에 삽입된 CLN6 cDNA를 나타내는 플라스미드 구조체의 개략도가 도 1a에 제공된다. 플라스미드 작제물(construct)은 또한 CP 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 키메라 인트론 및 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 (BGH PolyA)를 포함한다.

scAAV9.CB.CLN6은 문헌 [Gao et al., J. Virol ., 78: 6381-6388 (2004)]에서 앞서 기술된 바와 같이 Rep2Cap9 서열을 코딩하는 플라스미드를 갖는 이중 가닥 AAV2-ITR-기반 CB-CLN6 벡터를 HEK293 세포(36)에서 아데노 바이러스 헬퍼 플라스미드 pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA)와 함께 사용하여 일시적인 삼중 플라스미드 형질감염 절차에 의해 cGMP 조건 하에 생산되었다. 벡터의 순도 및 역가를 4-12%의 도데실 황산나트륨-아크릴아미드 겔 전기 영동 및 은 염색 및 qPCR 분석에 의해 평가하였다. 클로닝 후, 형질 전환 유전자 발현은 배아 15.5일 (도 1b 및 도 1c 참조)에서 utero ICV 전기 천공에서 HEV293 세포의 생체 내뿐만 아니라 체외에서도 확인되었다. 이 분석은 생체 내에서 인간 CLN6 단백질의 뉴런 표적화 및 발현을 확인시켜 주었다.

실시예 2

CLN6 ^nclf 마우스에서의 CSF-전달된 scAAV9.CB.CLN6의 발현 분석

세포 표적화 및 발현

마우스에서 바이러스성 도입 인간 CLN6의 발현 및 생체 분포를 확인하기 위해, scAAV9.CB.CLN6을 CLN6 ^nclf 마우스에 생후 24시간 이내에 단일 뇌실 내 (ICV) 주사를 통해 투여하고 발현을 2개월에 걸쳐 다양한 시점에서 모니터링 하였다. 동일한 부피의 PBS를 주사한 야생형 및 CLN6 ^nclf 마우스가 대조군으로 사용되었다. 유효 투여 량은 NCH 바이러스 벡터 코어 역가를 사용하여 5Х10¹⁰ vg/마우스였다. scAAV9.CB.CLN6은 1x PBS 및 0.001% 플루로닉 F68로 제제화되거나 20mM 트리스 (pH8.0), 1mM MgCl₂, 200mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188로 제제화되었다.

주사 후 2, 6, 18개월에 RT-PCR에 의한 hCLN6 발현을 조사한 결과, PBS 주입 대조군에 비해 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스의 피질에서 지속적이고 견고한 hCLN6 발현이 입증되었다 (도 2a ,도 3a). 이러한 결과는 이전에 보고된 scAAV9-CB-GFP 발현 수준과 유사했다 (예를 들어, 문헌 [Foust et al. Mol Ther. 2013;21(12):2148-59, Foust et al., Nat Biotechnol. 2010;28(3):271-4, Meyer et al., Mol Ther. 2015;23(3):477-87] 참조). 도 2a에서, 상부 겔 및 그래프는 대표적인 RT-PCR 겔 및 농도계 (GAPDH로 정규화)이다. 이 데이터는 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 전달 후 증가된 유전자 발현을 입증하였다. 하부 겔 및 그래프는 웨스턴 블롯팅으로 측정한 CLN6 단백질 발현을 나타낸다. scAAV9.CB.CLN6 벡터의 ICV 전달은 Cln6 ^nclf 마우스의 대뇌 피질에서 hCLN6 단백질 발현의 현저한 증가를 보여준다.

도입 유전자 발현의 지역적 분포를 조사하기 위해, RNAScopeⓒ라고 명명된 변형된 현장(in situ) 혼성화 방법을 사용하여 hCLN6 전사체를 시각화하였다. scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스는 체성 감각 피질 및 시상의 VPM/VPL 핵을 포함하여 2개월, 6개월 및 18개월에 뇌의 모든 영역에 걸쳐 hCLN6의 광범위한 형질 도입을 유지하였으며, 두 영역은 Cln6 ^nclf 마우스의 질병 진행에서 가장 먼저 발병함을 나타낸다 (도 2b, 좌측 패널;도 3b 상단 패널, 도 4A).

CNS 내에서 hCLN6 단백질의 발현을 조사하기 위해, scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 및 PBS 주입 대조군으로부터 수거한 피질 뇌 용해질의 면역 블롯팅을 항-hCLN6 항체를 사용하여 수행하였다. RNA 발현에서 보이는 것과 동일하게 2, 6, 및 18개월에 CNS 전반에 걸쳐 견고한 hCLN6 단백질 발현이 나타났다 (도 2b, 우측 패널, 도 3b, 하단 패널). 또한, 항-hCLN6 항체를 사용하여 뇌 조직을 면역 표지하면 scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스의 뇌 전반에 걸쳐 발현이 확인되었다 (도 4b). 더불어, 이러한 결과는 ICV 주사를 통한 scAAV9.CB.CLN6의 CSF 전달이 CNS의 질병 관련 영역에서 hCLN6 전사체 및 단백질을 안정적으로 제조할 수 있음을 입증하였다.

scAAV9.CB.CLN6 전달 후 병리 개선

자가 형광 저장 물질 (ASM)의 축적

자가 형광 저장 물질 (ASM)의 축적은 바텐병 진행에 대한 특징적인 조직학적 마커이다 (문헌 [Mole et al., Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis. 2015;1852(10):2237-2241; Cotman et al., Clin Lipidol. 2012 Feb;7(1):79-91; Seehafer et al., Neurobiol Aging. 2006;27:576-588]). ASM의 축적은 많은 형태의 바텐병에 대한 질병 진행에 대한 강력한 지표이다 (문헌 [Bosch et al., J Neurosci. 2016;36(37):9669-9682; Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694]). 본원에서 ASM의 감소가 성공적인 치료의 지표로서 사용되는 것으로 고려된다.

치료 후 2, 6, 및 18개월에 scAAV9.CB.CLN6을 주사한 Cln6 ^nclf 마우스는 PBS 주입 마우스에 비해 뇌의 시상의 VPM/VPL 핵 및 체성 감각 피질 내에서 ASM의 축적을 감소시켰다 (도 5, 도 3C). PBS 치료 Cln6nclf 마우스가 15개월령에 죽기 때문에 (도. 9D), 18개월령 scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스에 비해 12-14개월령 PBS 치료 Cln6 ^nclf 마우스가 사용되었다. 특히, 이 18개월령 scAAV9.CB.CLN6 주사 Cln6 ^nclf 마우스의 ASM 축적량은 연령이 일치하는 비치료 야생형 마우스에 필적했다. 도 9e 는 수컷 (좌측 패널) 및 암컷 (우측 패널) scAAV9.CB.CLN6 치료 마우스가 연령별로 야생형 마우스와 유사한 체중을 갖지만, 치료되지 않은 Cln6 ^nclf 마우스는 연구 과정 동안 감소된다는 것을 입증한다. PBS 주사 Cln6 ^nclf 마우스 (Cln6 ^nclf PBS)는 10-11개월령 (수컷) 및 13-14개월령 (암컷) 근처에서 체중을 손실하기 시작했다.

미토콘드리아 단백질 ATP 합성 효소 소 서브 유닛 C의 축적

ATP 합성 효소 서브 유닛 C의 축적은 야생형, PBS 주입 CLN6^nlcf 마우스 또는 scAAV9.CB.CLN6 주입 Cln6 ^nclf 마우스에서 분석되었다. 건강한 개체의 경우, 이 단백질은 미토콘드리아 막의 호흡 사슬의 일부이지만 바텐병을 앓는 환자에서는 상기 단백질이 리소좀에 비정상적으로 축적된다 (문헌 [Palmer et al., Am J Med Genet.1992;42(4):561-567]). Cln6 ^nclf 마우스에서는 야생형 동물에 비해 서브 유닛 C의 축적은 시상의 복부 후내측 핵 및 복부 후외측 핵 (VPM/VPL 영역)에서 2개월령까지 명백하였고, 뇌 영역은 종종 NCL 마우스 모델에서 초기에 영향을 미쳤다 (문헌 [Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694; Pontikis et al., Neurobiol Dis. 2005;20(3):823-836]). 2, 6, 및 18개월령에, PBS를 주사한 Cln6 ^nclf 대조군 마우스와 비교하여 scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스는 뇌의 VPM/VPL 및 체성 감각 피질 내 ATP 합성 효소 서브 유닛 C 축적이 상당히 감소된 수준이었다 (도 6; 도 3c; 하단 패널).

신경교세포와 성상교세포 활성화

저장 물질의 비정상적인 축적 및 ATP 합성 효소 서브 C의 축적 외에도, 인간 환자 및 동물 모델 모두에서 질병 진행의 다른 조직학적 마커는 성상교세포 및 미세교세포의 활성화를 포함한다 (문헌 [Cotman et al., Hum Mol Genet. 2002;11(22):2709-2721; Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694; Pontikis et al., Neurobiol Dis. 2005;20(3):823-836; Palmer et al., Am J Med Genet. 1992;42(4):561-567]). 특히, 반응성 미세교세포는 IL1-β

26과 같은 전염증성 매개체를 방출하도록 프라이밍되어 있고, 이는 CLN6-바텐병의 후기 단계에서 뉴런 세포 사멸의 주요 기여 원인이 될 수 있다. 6개월령 및 18개월령에 scAAV9.CB.CLN6을 주사한 Cln6 ^nclf 마우스는 빈사 상태의 PBS 치료 Cln6 ^nclf 마우스와 비교하여 VPM/VPL 및 체성 감각 피질에서 성상교세포 활성화 (GFAP) 및 미세교세포증 (CD68)을 유의하게 감소시켰다 (각각 도 7 및 도 8).

도 7은 활성화된 성상교세포가 6개월 및 18개월 시점에서 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP)을 염색하여 VPM/VPL 시상 및 체성 감각 피질 섹션에서 확인되었음을 입증한다. 그래프는 총 GFAP+ 면역반응성을 보여준다.

또한, 활성화된 미세교세포에 대한 마커로서 항-CD68 염색을 사용하여 VPM/VPL 및 체성 감각 피질 섹션에서 신경교세포 활성화를 측정하였다. CD68은 식균 작용과 같은 전염증성 기능을 위해 프라이밍된 세포에서 상향 조절되는 리소좀성 단백질이다 (문헌 [Seehafer et al., J Neuroimmunol. 2011;230:169-172]). 도 8은 scAAV9.CB.CLN6 주사가 6M Cln6 ^nclf 마우스의 체성 감각 피질 및 18M Cln6 ^nclf 마우스의 VPM/VPL 및 체성 감각 피질 모두에서 미세교세포증 (CD68 반응성)을 감소시킨다는 것을 입증한다. 그래프는 총 CD68+ 면역반응성을 보여준다. 도 8의 유입구는 미세교세포의 형태를 나타내었다. 이 연구에서 분석된 비치료 Cln6 ^nclf 마우스는 빈사 상태였고 많은 미세교세포가 죽거나 죽을 가능성이 높다는 사실은 주목할 가치가 있다. 더불어, 이 결과는 출생 후 1일째에 scAAV9.CB.CLN6을 CSF에 전달하는 단일 주사가 ClN6 ^nclf 마우스의 뇌에서 많은 고전적 CLN6-바텐병 병리를 감소 또는 지연시킬 수 있다는 것을 나타내었다.

scAAV9.CB.CLN6 전달 후 행동 개선

2개월령에서 시작하여 2개월 간격으로 지속되는 scAAV9.CB.CLN6의 효능 연구에서, 및 마우스는 가속 로타로드 검증, 및 운동 기능 및 협응을 시험하기 위한 기둥 등반뿐만 아니라 학습 및 기억을 평가하기 위한 모리스 수중 미로를 포함하는 일련의 행동 테스트 패러다임을 받았다. 주사 후 24개월 동안 동물을 추적하여 연구를 진행했다.

로타로드 검증

이전 연구는 CLN6-바텐병의 Cln6 ^nclf 마우스 모델은 인간에서 보이는 많은 행동, 인지 및 생존 결함을 되풀이함을 입증하였다 (문헌 [Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694]). 로타로드를 운동 협응의 고전적 척도로 사용한 효능 연구에서, PBS 주입 Cln6^nclf 마우스는 야생형에 비해 8개월령에 로타로드 성능의 감소를 보이기 시작했다. 그러나, Cln6^nclf 마우스에 scAAV9.CB.CLN6을 주사하면 이 감소를 막을 수 있었으며, 효과는 전체 연구 기간 (24 개월)의 기간 동안 지속되었다 (도 9a). 운동 협응의 효과를 보다 자세히 연구하기 위해, 동물들은 12, 18, 및 24개월령에 다양한 운동 과제 (뒷다리 걸쇄 걸음, 렛지로부터 자신을 내릴 수 있는 능력, 보행 평가)를 받고 점수 매트릭스를 사용하여 평가했으며, 가장 높은 점수는 최악의 예후였다 (문헌 [Guyenet et al., Journal of visualized experiments: JoVE. 201039]). PBS 치료 Cln6^nclf 마우스와 비교하여, scAAV9.CB.CLN6으로 치료한 마우스는 모든 시점에서 유의하게 더 낮은 조합 점수를 나타내었으며, 24개월령에서만 약간의 점수 증가를 보였다 (도 9b).

모리스 수중 미로 시험

모리스 수중 미로 시험에서 동물을 숨겨진 플랫폼이 포함된 물이 가득 찬 수영장에 두었다. 트레이닝 후, 동물들이 방향에 대한 환경적 신호를 사용하여 숨겨진 플랫폼을 발견하는 데 걸리는 시간을 학습 및 기억 능력의 신호로서 측정하였다.

PBS 치료 Cln6 ^nclf 마우스는 숨겨진 플랫폼을 발견할 수 있는 능력 감소가 나타내는 바와 같이, 9개월령부터 작업 수행 저하가 시작되었다 (도 9C). PBS 치료 Cln6 ^nclf 마우스의 수영 속도가 11개월령과 12개월령에 현저하게 감소했기 때문에, 이 후기 시점에서 기억 및 학습 능력에 대한 어떤 결론을 도출할 수 없었다 (도 10a). scAAV9.CB.CLN6에 의한 Cln6 ^nclf 마우스의 치료는 주사 후 최대 12개월까지 기억 및 학습 결함을 교정하였다 (도 9C). 야생형 마우스를 scAAV9.CB.CLN6 치료 동물과 모리스 수중 미로 테스트의 후기 시점에서만 비교했을 때, 치료받은 마우스조차도 18개월과 24개월에 플랫폼을 발견하는 데 더 많은 시간이 필요하였고 수영 속도는 모든 시험 군 사이에 동일하였다 (도 9C, 도 10). 후기 시점에서 기억 및 학습을 평가하기 위해, 플랫폼을 새로운 위치로 옮긴 12, 18, 24개월령에 마우스에게 수중 미로 역전 테스트를 실시했다. scAAV9.CB.CLN6로 치료받은 Cln6 ^nclf 마우스는 이 시험에서 또한 야생형 마우스에 비해 새로운 플랫폼의 위치를 찾는데 상당히 더 오래 걸렸다 (도 10). 종합적으로 말하면, 이들 결과는, scAAV9.CB.CLN6의 단일 치료가 이 동물에서 볼 수 있는 많은 운동 감퇴를 예방할 수 있었지만, 후기 시점에서 마우스를 시험했을 때 기억 및 학습 결함을 완전히 줄이지는 못했다.

scAAV9.CB.CLN6 전달 후 생존 개선

Cln6 ^nclf 마우스는 야생형 대조군에 비해 감소된 생존을 갖는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Guyenet et al., Journal of visualized experiments: JoVE. 201039]). scAAV9.CB.CLN6 및 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스의 생존을 PBS 주입 야생형 마우스와 비교하였다. scAAV9.CB.CLN6를 Cln6 ^nclf 마우스의 CSF에 단일 ICV 주사하면 PBS 주입 Cln6 ^nclf 마우스에 비해 생존이 유의하게 증가했다 ( 도 9d). PBS 치료 마우스의 중앙값(median) 생존 기간은 14개월 이었지만, scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스의 평균 생존은 21.5개월이었다. 이 생존율의 65% 증가는 매우 중요했다. 또한, scAAV9.CB.CLN6 치료 Cln6 ^nclf 마우스의 생존 곡선은 야생형 동물과 유의한 차이가 없었다.

또한 전반적인 건강 상태를 측정하기 위해 체중을 매월 기록했다. 야생형 동물에 비해 차이가 관찰되지 않았기 때문에 scAAV9.CB.CLN6 치료 마우스의 체중을 유지하는 능력에 의해 건강 및 생존율에서의 개선이 강조된 반면 PBS 치료 Cln6 ^nclf 는 10-12개월 부근에 체중이 감소하기 시작했다 (도 9e).

PBS로 치료된 172마리 야생형 마우스 및 5x10¹⁰ vg/동물로 치료된 223마리 야생형 마우스로 안전성 연구를 수행하였다. 이 연구는 scAAV9.CB.CLN6가 바이러스에 기인한 부작용 없이 24주까지 잘 견디었다는 것을 입증하였다 (데이터는 표시되지 않음). 종합하면, 이는 Cln6 ^nclf 마우스 모델에서의 가장 긴 생존 연장이며, CLN6-바텐병의 세포 및 기능 결함 모두를 복구하기 위한 scAAV9.CB.CLN6의 단일 치료의 유용성을 나타낸다.

실시예 3

비인간 영장류에서의 scAAV9.CB.CLN6의 안전성 연구

인간 환자와 관련이 있는 대형 동물 모델에서 이 치료의 안전성을 시험하기 위해 3 명의 4년령 수컷 시노몰구스 원숭이에 1x PBS 및 0.001% 플루로닉 F68®로 제제화된 scAAV9.CB.CLN6을 투여하였다.

주사 후 1, 3 또는 6개월에 동물을 희생시켰다. 각 개체는 동물 당 6 x 10¹³ 바이러스 입자의 용량으로 CSF에 바이러스 벡터를 직접 전달하면서 단일 요추 척수강 내 주사를 투여받았다. 주사 후, 뇌 및 상부 척수 영역의 표적화를 용이하게 하기 위해 머리를 45도 각도로 아래쪽으로 향하게 하여 동물을 트렌델렌버그 체위에서 15분 동안 유지시켰다.

모든 대상체는 주사로부터 잘 회복되어 비정상적인 행동을 보이지 않았다. 혈액학 및 혈청 화학은 연구 중 5개 시점 (기준선, 1, 2, 3 및 6개월)까지에서 수행되었으며 주요 이상을 나타내지 않았다. 특히 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST) 또는 알칼린 인산 효소 수준의 상승에 대한 증거는 발견되지 않았지만, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT)는 주사 후 1개월에 한 동물에서 약간 증가하였다 (200 단위/리터 미만) (도 11c) .

총 단백질 수준, 크레아티닌, 중성 지방, 포도당 또는 이온, 예컨대 인, 칼 슘, 마그네슘 또는 나트륨 수준에는 변화가 없었다. 광범위한 조직 병리뿐만 아니라 형질 전환 유전자 발현 분석이 희생된 시점에서 각 동물에 대해 수행되었다. 부검시 방광 감염을 나타낸 한 동물을 제외한, 다양한 뇌 및 척수 영역, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 소장, 골격근 (횡격막, 삼두근, TA, 비복근), 생식선을 포함하여 분석된 모든 조직에서 이상이 발견되지 않았다.

뇌척수액에 scAAV9.CB.CLN6을 전달한 단일 요추 척수강 내 주사는 형광 웨스턴 블롯으로 나타낸 바와 같이 비인간 영장류의 뇌 및 척수 전체에 걸쳐 형질 전환 유전자의 높은 발현을 유도하였다. 도 11a의 블롯은 모든 3마리 동물에서 피질, 뇌량, 뇌실 주위 백색 물질, 해마, 소뇌, 시상, 경추 척수, 흉추 척수, 요추 척수에서의 CLN6 발현을 나타내었고, 높은 형질 전환 유전자 발현이 뇌 및 척수 전체에 걸쳐 발견되었다 (도 11a-b). 종합하여, 이 데이터는 scAAV9.CB.CLN6 치료를 세 개체 모두가 잘 견딜 수 있었고 안전하였음을 나타내었다.

실시예 4

scAAV9.CB.CLN6 유전자 치료의 임상 시험

scAAV9.CB.CLN6은 CLN6-바텐병을 가진 인간 환자에게 척수강 내로 전달된다.

임상 시험을 위한 scAAV는 실시예 1에 기술된 바와 같이 cGMP 조건 하에 HEK293 세포의 삼중 형질 감염 방법을 이용하여 네이션와이드 칠드런스 병원 임상 생산 설비(Nationwide Children 's Hospital Clinical Manufacturing Facility)에 의해 생산된다.

참여를 위해 선택된 환자는 유전자형에 의해 결정된 CLN3 질병의 진단을 받은 1세 이상이었다. 제1 코호트 (n=12)는 환자 당 1.5x 10¹³ vg 총 scAAV의 용량으로 1회의 유전자 전달을 받았다. scAAV9.CB.CLN6가 20mM 트리스 (pH8.0), 1mM MgCl₂, 200mM NaCl, 0.001%.폴록사머 188 및 약 20% 내지 약 40% 비이온성 저삼투압 화합물로 제제화되어, 극돌간으로의 요추 천공에 의해 삽입된 척수강 내 카테터를 통해 요추 척수낭의 지주막하강으로 1회 전달되었다. 안전성은 임상 근거 및 안전성 수준 검사를 통해 평가되었다. 유전자 전달 후 30일째 안전성 데이터를 검토할 수 있도록 각 대상체 등록 사이에는 최소 4 주가 있었다.

본원에 제공된 예비 자료는 치료받은 10명의 환자를 보고하고 평균 추적 기간은 12개월 (치료 후 1-24개월 범위)이었다. 예비 데이터는 scAAV9.CB.CLN6의 투여를 일반적으로 잘 견딤을 입증하였다. 대부분의 부작용은 경미하고 치료와 무관하였다. 관찰된 임의의 T 세포 반응 및 항체 상승은 임상 양상과 관련이 없었으며 치료에 변화가 요구되지 않았다.

도 12는 2명의 연구 형제 쌍에서 주사 후 함부르크 운동 및 언어 척도로 측정 한 질병 진행을 보고하는 예비 데이터를 제공한다. 이 형제 쌍은 동일한 gCLN6 돌연변이 유전자형을 갖는다.

24개월 단계 효능 연구

진행 중인 임상 연구를 위해 치료받은 8명의 환자에 대한 데이터가 본원에 제공된다. 본원에 기재된 8명의 환자는 적어도 17개월 동안 scAAV9.CB.CLN6을 투여받고 그에 노출되었다. 이 8명의 환자에 대한 기준 정보는 하기에 제공된다.

진행 중인 24개월 임상 연구의 데이터는 scAAV9.CB.CLN6의 단일 척수강 내 투여를 일반적으로 잘 견디었음을 나타냈다. 보고된 부작용은 137건이었다. 대부분의 부작용 (AE)은 경미하고 치료와 무관하였다. 4명의 환자 (SAE로 표시됨)에서 9개의 등급 3 (심각한) 부작용이 보고되었다. 9개의 SAE 중 3개는 치료와 관련이 있을 수 있는 것으로 간주되었다. 관련 부작용에는 구토 (2), 상복부 통증 (1) 및 발열 (1)이 포함되었으며 4명의 환자 모두 회복되었다. 등급 4 (생명 위협) 또는 등급 5 (사망) 부작용은 보고되지 않았다. 항-AAV9 캡시드 또는 항-CLN6 면역원성과 관련된 부작용의 양상은 없었다.

도 15는 운동 및 언어 기능에 긍정적인 영향을 나타내는 효능 데이터를 제공한다. scAAV9.CB.CLN6으로 치료한 환자 8명 중 7명에서 함부르크 점수가 유지되었거나 초기 변화 (+1에서 -1점) 후 안정화가 있었다. 이 연구에서 가장 나이가 많은 환자 (79개월에 치료받음)는 2점 감소했다. 자연사 데이터는 증상 발병 후 24개월 동안 함부르크 운동 및 언어에서 2-3점 감소를 시사했다.

도 16a-16c는 모두 CLN6 질병이 있는 형제 비교 데이터를 제공한다. 치료를 받은 환자는 운동 및 언어 능력의 상당한 감소를 경험했거나 같은 기간 동안 사망한 비치료 형제에 비해 안정화를 입증하였다. 이 데이터는 시간에 따른 함부르크 점수: 운동 + 언어로 제공된다. 도 16a는 종합 점수를 제공하고, 도 16b는 함부르크 운동 하위 점수를 제공하고, 도 16c는 함부르크 언어 하위 점수를 제공한다.

도 12a-12c는 scAAV9.CB.CLN6으로 둘 다 치료된 연구 내 쌍에 대한 연구 내 형제 비교 데이터를 제공한다. 이 데이터는 손아래 형제가, 초기 변화 후 안정화된 손위 형제에 비해 함부르크 운동 및 언어 점수가 증가하거나 안정화되었음을 나타내었다. 도 12a는 종합 점수를 제공하고, 도 12b는 함부르크 운동 하위 점수를 제공하고, 도 12c는 함부르크 언어 하위 점수를 제공한다.

도 17은 scAAV9.CB.CLN6으로 치료된 처음 8명의 환자에 대한 데이터를 네이션와이드 어린이 병원(Nationwide Children's Hospital)에서 수행된 CLN6 환자 (n=14)의 진행 중인 자연사 연구로부터의 데이터와 비교한다. 함부르크 운동 및 언어 기능에 대한 조합 점수에서 기준선에서 2점 이상의 역전되지 않은 감소까지의 시간에 대한 카플란-마이어 곡선이 표시된다. 신뢰 구간은 생존 확률 추정치와 표준 오차를 사용하여 계산된다. 도면은 2년 동안 치료군 대 자연사 군에서 조합 함부르크 운동 및 언어 점수에서의 2점 이상 감소한 환자를 비교하고 다음을 포함하여 본 개시내용의 요법의 효능을 뒷받침하는 결과를 전달한다: (i) 1명의 치료 받은 환자는 치료를 받지 않은 14명의 모든 자연사 환자와 비교하여 해당 기간 동안 2점 이하 감소를 달성하였음, (ii) 치료를 받지 않은 환자의 치료를 받은 환자의 실질적인 분리.

요약하면, 24개월 효능 데이터는 다음을 입증하였다: i) 운동 및 언어 능력의 급격한 감소를 경험한 치료받지 않은 형제와 대조적으로 질병의 안정화, ii) 더 어린 환자는 점수 또는 안정화의 증가를 보임, iii) 대부분의 더 나이 많은 환자는 초기 변화 후 안정화를 보임. 또한, 치료를 일반적으로 잘 견뎠다.

용량 증량 연구

안전 문제가 없다면 주사 후 1개월 후에 제1 코호트가 평가된 후 추가 대상체가 등록된다. 코호트 2의 각 대상체 (n=4)는 증가된 용량의 바이러스 벡터를 투여 받았다. 다음 대상체의 투여 전에 DSMB 검토뿐 아니라 5개 시점 (1, 2, 7, 14 및 21일)의 안전성 분석의 검토가 가능하도록 코호트 1의 완료와 코호트 2의 시작 사이에 적어도 6주간의 기간 이 있다.

질병 진행은 UBDRS 척도 또는 함부르크 운동 및 언어 척도 (위의 상세한 설명에서 참조) 및 소아의 삶의 질 (PEDSQOL) 척도를 사용한 삶의 질에 대한 치료의 영향 및 연장된 생존 가능성으로 측정된다.

효능에 대한 제1 분석은 모든 환자가 3년 연구를 완료했을 때 평가된다. 효능을 결정하는 기준은 CLN6-바텐병을 위해 특별히 개발된 잘 확립된 통합 바텐병 평가 척도 (UBDRS) 또는 함부르크 운동 및 언어 척도를 기반으로 질병의 안정화 또는 감소된 진행에 의한 것이다. 3년간의 연구 기간이 완료되면 환자는 FDA 지침에 따라 5년 동안 매년 모니터링 된다.

실시예 5

자연사 연구 scAAV9.CB . CLN6 유전자 요법을 입증하고 운동 및 언어 점수를 개선한다

시간 경과에 따른 임상 경과와 관련하여 연구 대상체 (CLN6 유전자 전달 연구의 첫 환자 (n=8))와 자연사 대상체의 비교를 용이하게 하기 위해, 유전자 전달 환자의 조합된 함부르크 척도 운동 (M) 및 언어 (L) 점수를 후향적 CLN6 자연사 연구 (PI: Emily de los Reyes, MD; ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03285425)에서 환자에 대해 수집된 조합 함부르크 척도 운동 및 언어 점수 데이터와 매칭하였다. 유전자 전달 환자를 기준선 함부르크 운동 및 언어 점수 및 비교 시점의 연령 (12개월 이내)을 기준으로 자연사 환자와 매칭하였다.

함부르크 운동 및 언어 점수에 대한 조합 및 개별 데이터 (n=8)는 CLN6 유전자 요법이 환자 8명 중 7명에서 운동 및 언어 기능에 긍정적인 영향을 미치면서 질병 진행을 중단시키거나 실질적으로 늦추는 것으로 나타났다 (도 18). 긍정적인 영향은 조합 함부르크 점수를 유지하거나 초기 변화(+1에서 -1점) 후 안정화가 있는 환자를 나타낸다. 개별 운동 및 언어 점수는 각각의 조합 점수와 일치했다.

자연사 매칭 비교에 대한 데이터는 함부르크 운동 및 언어 점수에서의 개선도 보여준다 (도 19). 다 대 일 매칭 방법론을 통해, 비교 기간의 마지막 시점에서 (각 유전자 전달 환자에 대해) 매칭된 자연사 환자의 평균 함부르크 운동 및 언어 점수는 마지막 시점에서 유전자 전달 환자의 각각의 함부르크 운동 및 언어 값 (녹색으로 플롯팅)에 대해 빨간색으로 플롯팅 된다 (도 19). 각 비교에서 자연사 환자의 수는 마지막 시점에서 (유전자 전달 환자와 NH 환자의 평균값 사이) 함부르크 운동 및 언어 점수의 차이와 함께 각 도면에 제공된다. 네이션와이드 어린이 병원(Nationwide Children's Hospital)과 Dr. Emily de los Reyes의 연구에서 CLN6-바텐병 환자 (n=11)에 대해 수집된 자연사 데이터는 2세부터 7세까지 년당 함부르크 운동 + 언어 점수에서 상당히 선형적이고 거의 지속적인 1점 감소가 있음을 나타낸다. (도 20).

전반적으로, 이러한 연구의 데이터는 대부분의 CLN6 유전자 전달 환자가 매칭되는 자연사 환자와 비교하여 운동 및 언어 점수의 개선을 입증함을 나타낸다.

실시예 6

조기 학습 뮬렌 척도 분석

조기 학습 뮬렌 척도 (MSEL)을 사용하여 scAAV.CB.CLN6 유전자 요법이 12 내지 24개월에 걸쳐 환자의 학습 능력을 향상시켰는지 여부를 평가했다. MSEL은 출생부터 68개월까지의 어린이에게 사용하도록 설계된 개별적으로 관리되고, 표준화된 인지 기능 측정이다. MSEL의 하위 척도는 대근육 운동, 소근육 운동, 수용 언어, 표현 언어 및 조기 학습 복합이다. (Mullen EM. (1995). Mullen Scales of Early Learning (AGS ed.). Circle Pines, MN: American Guidance Service Inc 참조).

8명의 환자에서 시각 수용, 소근육 운동, 수용 언어 및 표현 언어의 4개 영역이 분석되었다. 도 21a 및 21b는 4개 영역에 대한 원시 점수를 제공한다. 더 높은 점수는 더 높은 기능을 나타낸다.

요약

중간 안전성 및 효능 데이터는 AAV9-CLN6 유전자 요법이 변이형 후기 유아 발병 CLN6 바텐병의 진행을 안정화할 가능성이 있음을 시사한다. 효능 결과는 운동 및 언어 기능에서 의미 있는 치료 효과를 입증했다. AAV9-CLN6 치료 환자는 치료받지 않은 형제와 비교하여 함부르크 운동 및 언어 점수에서 개선을 입증하였고, 연령과 함부르크 운동 및 언어 기준 점수에 대해 매칭된 자연사 환자의 평균 값을 보여주었다. 치료를 받은 더 어린 형제와 나이 많은 형제를 비교하면 AAV9-CLN6을 사용한 유전자 요법의 조기 개입의 잠재적 이점이 더욱 뒷받침된다. 더 어린 치료 환자는 MSEL 척도에서 볼 수 있듯이 인지 능력의 개선 또는 안정화를 보여주었다.

본 개시내용의 바람직한 실시양태가 도시되고 기술되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서만 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않고 당업자에게 다양한 변형, 변경 및 대체가 이루어질 것이다. 본원에 기술된 실시양태에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고, 이들 청구범위 및 이들의 균등물의 범위 내에 있는 방법 및 구조가 이해 의해 커버되도록 의도된다.

본 출원에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS DELIVERY OF CLN6 POLYNUCLEOTIDE <130> 33057/53894 <150> US 62/800,915 <151> 2019-02-04 <150> US 62/880,641 <151> 2019-07-30 <150> US 62/881,151 <151> 2019-07-31 <150> US 62/912,977 <151> 2019-10-09 <150> US 62/923,125 <151> 2019-10-18 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 311 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CLN6 Polypeptide Sequence <400> 1 Met Glu Ala Thr Arg Arg Arg Gln His Leu Gly Ala Thr Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gln Leu Gly Ala Ser Phe Leu Gln Ala Arg His Gly Ser Val 20 25 30 Ser Ala Asp Glu Ala Ala Arg Thr Ala Pro Phe His Leu Asp Leu Trp 35 40 45 Phe Tyr Phe Thr Leu Gln Asn Trp Val Leu Asp Phe Gly Arg Pro Ile 50 55 60 Ala Met Leu Val Phe Pro Leu Glu Trp Phe Pro Leu Asn Lys Pro Ser 65 70 75 80 Val Gly Asp Tyr Phe His Met Ala Tyr Asn Val Ile Thr Pro Phe Leu 85 90 95 Leu Leu Lys Leu Ile Glu Arg Ser Pro Arg Thr Leu Pro Arg Ser Ile 100 105 110 Thr Tyr Val Ser Ile Ile Ile Phe Ile Met Gly Ala Ser Ile His Leu 115 120 125 Val Gly Asp Ser Val Asn His Arg Leu Leu Phe Ser Gly Tyr Gln His 130 135 140 His Leu Ser Val Arg Glu Asn Pro Ile Ile Lys Asn Leu Lys Pro Glu 145 150 155 160 Thr Leu Ile Asp Ser Phe Glu Leu Leu Tyr Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu 165 170 175 Gly His Cys Met Trp Tyr Ile Pro Phe Phe Leu Ile Leu Phe Met Tyr 180 185 190 Phe Ser Gly Cys Phe Thr Ala Ser Lys Ala Glu Ser Leu Ile Pro Gly 195 200 205 Pro Ala Leu Leu Leu Val Ala Pro Ser Gly Leu Tyr Tyr Trp Tyr Leu 210 215 220 Val Thr Glu Gly Gln Ile Phe Ile Leu Phe Ile Phe Thr Phe Phe Ala 225 230 235 240 Met Leu Ala Leu Val Leu His Gln Lys Arg Lys Arg Leu Phe Leu Asp 245 250 255 Ser Asn Gly Leu Phe Leu Phe Ser Ser Phe Ala Leu Thr Leu Leu Leu 260 265 270 Val Ala Leu Trp Val Ala Trp Leu Trp Asn Asp Pro Val Leu Arg Lys 275 280 285 Lys Tyr Pro Gly Val Ile Tyr Val Pro Glu Pro Trp Ala Phe Tyr Thr 290 295 300 Leu His Val Ser Ser Arg His 305 310 <210> 2 <211> 936 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CLN6 polynucleotide sequence <400> 2 atggaggcga cgcggaggcg gcagcacctg ggagcgacgg gcggcccagg cgcgcagctg 60 ggcgcctcct tcctgcaggc caggcatggc tctgtgagcg ctgatgaggc tgcccgcacg 120 gctcccttcc acctcgacct ctggttctac ttcacactgc agaactgggt tctggacttt 180 gggcgtccca ttgccatgct ggtattccct ctcgagtggt ttccactcaa caagcccagt 240 gttggggact acttccacat ggcctacaac gtcatcacgc cctttctctt gctcaagctc 300 atcgagcggt ccccccgcac cctgccacgc tccatcacgt acgtgagcat catcatcttc 360 atcatgggtg ccagcatcca cctggtgggt gactctgtca accaccgcct gctcttcagt 420 ggctaccagc accacctgtc tgtccgtgag aaccccatca tcaagaatct caagccggag 480 acgctgatcg actcctttga gctgctctac tattatgatg agtacctggg tcactgcatg 540 tggtacatcc ccttcttcct catcctcttc atgtacttca gcggctgctt tactgcctct 600 aaagctgaga gcttgattcc agggcctgcc ctgctcctgg tggcacccag tggcctgtac 660 tactggtacc tggtcaccga gggccagatc ttcatcctct tcatcttcac cttcttcgcc 720 atgctggccc tcgtcctgca ccagaagcgc aagcgcctct tcctggacag caacggcctc 780 ttcctcttct cctccttcgc actgaccctc ttgcttgtgg cgctctgggt cgcctggctg 840 tggaatgacc ctgttctcag gaagaagtac ccgggtgtca tctacgtccc tgagccctgg 900 gctttctaca cccttcacgt cagcagtcgg cactga 936 <210> 3 <211> 270 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> hybrid chicken B -Actin promoter <400> 3 ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60 ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag 120 gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 180 atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 240 ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 270 <210> 4 <211> 2343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> Gene Cassette <400> 4 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120 tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg gtcgttacat aacttacggt 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ctgggagcga cgggcggccc aggcgcgcag ctgggcgcct ccttcctgca ggccaggcat 1080 ggctctgtga gcgctgatga ggctgcccgc acggctccct tccacctcga cctctggttc 1140 tacttcacac tgcagaactg ggttctggac tttgggcgtc ccattgccat gctggtattc 1200 cctctcgagt ggtttccact caacaagccc agtgttgggg actacttcca catggcctac 1260 aacgtcatca cgccctttct cttgctcaag ctcatcgagc ggtccccccg caccctgcca 1320 cgctccatca cgtacgtgag catcatcatc ttcatcatgg gtgccagcat ccacctggtg 1380 ggtgactctg tcaaccaccg cctgctcttc agtggctacc agcaccacct gtctgtccgt 1440 gagaacccca tcatcaagaa tctcaagccg gagacgctga tcgactcctt tgagctgctc 1500 tactattatg atgagtacct gggtcactgc atgtggtaca tccccttctt cctcatcctc 1560 ttcatgtact tcagcggctg ctttactgcc tctaaagctg agagcttgat tccagggcct 1620 gccctgctcc tggtggcacc cagtggcctg tactactggt acctggtcac cgagggccag 1680 atcttcatcc tcttcatctt caccttcttc gccatgctgg ccctcgtcct gcaccagaag 1740 cgcaagcgcc tcttcctgga cagcaacggc ctcttcctct tctcctcctt cgcactgacc 1800 ctcttgcttg tggcgctctg ggtcgcctgg ctgtggaatg accctgttct caggaagaag 1860 tacccgggtg tcatctacgt ccctgagccc tgggctttct acacccttca cgtcagcagt 1920 cggcactgag tctctagaaa gcttatcgat accgtcgact agagctcgct gatcagcctc 1980 gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 2040 cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 2100 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 2160 ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga gagatcgatc tgaggaaccc ctagtgatgg 2220 agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 2280 cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag 2340 tgg 2343 <210> 5 <211> 6028 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAV.CB.CLN6 <400> 5 ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 60 tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 120 gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 180 ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 240 cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 300 tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 360 ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 420 ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 480 tttaacaaaa tattaacgct tacaatttaa atatttgctt atacaatctt cctgtttttg 540 gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt acgattaccg 600 ttcatcgccc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg 660 gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggaattc 720 acgcgtggat ctgaattcaa ttcacgcgtg gtacctctgg tcgttacata acttacggta 780 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 840 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 900 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 960 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 1020 cctacttggc agtacatcta ctcgaggcca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 1080 cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 1140 cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg 1200 cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta 1260 tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg 1320 gatcagccac cgcggtggcg gcctagagtc gacgaggaac tgaaaaacca gaaagttaac 1380 tggtaagttt agtctttttg tcttttattt caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc 1440 aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt tacttctagg cctgtacgga agtgttactt 1500 ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc ggccgatcca ccggtcttaa gggccgaggc 1560 ggccagatct ttcgaagata tcggcgccgc tagcgcggcc gcatggaggc gacgcggagg 1620 cggcagcacc tgggagcgac gggcggccca ggcgcgcagc tgggcgcctc cttcctgcag 1680 gccaggcatg gctctgtgag cgctgatgag gctgcccgca cggctccctt ccacctcgac 1740 ctctggttct acttcacact gcagaactgg gttctggact ttgggcgtcc cattgccatg 1800 ctggtattcc ctctcgagtg gtttccactc aacaagccca gtgttgggga ctacttccac 1860 atggcctaca acgtcatcac gccctttctc ttgctcaagc tcatcgagcg gtccccccgc 1920 accctgccac gctccatcac gtacgtgagc atcatcatct tcatcatggg tgccagcatc 1980 cacctggtgg gtgactctgt caaccaccgc ctgctcttca gtggctacca gcaccacctg 2040 tctgtccgtg agaaccccat catcaagaat ctcaagccgg agacgctgat cgactccttt 2100 gagctgctct actattatga tgagtacctg ggtcactgca tgtggtacat ccccttcttc 2160 ctcatcctct tcatgtactt cagcggctgc tttactgcct ctaaagctga gagcttgatt 2220 ccagggcctg ccctgctcct ggtggcaccc agtggcctgt actactggta cctggtcacc 2280 gagggccaga tcttcatcct cttcatcttc accttcttcg ccatgctggc cctcgtcctg 2340 caccagaagc gcaagcgcct cttcctggac agcaacggcc tcttcctctt ctcctccttc 2400 gcactgaccc tcttgcttgt ggcgctctgg gtcgcctggc tgtggaatga ccctgttctc 2460 aggaagaagt acccgggtgt catctacgtc cctgagccct gggctttcta cacccttcac 2520 gtcagcagtc ggcactgagt ctctagaaag cttatcgata ccgtcgacta gagctcgctg 2580 atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 2640 ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 2700 atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 2760 gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag agatcgatct gaggaacccc 2820 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 2880 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 2940 gagagggagt ggcccccccc cccccccccc cggcgattct cttgtttgct ccagactctc 3000 aggcaatgac ctgatagcct ttgtagagac ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatg 3060 aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt 3120 tctcacccgt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag 3180 ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag 3240 ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat 3300 tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat ttattggatg ttggaatcgc ctgatgcggt 3360 attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa 3420 tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacacta tggtgcactc 3480 tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 3540 ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 3600 tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa 3660 agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 3720 cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 3780 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 3840 gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 3900 cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 3960 atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 4020 agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 4080 gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 4140 ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 4200 cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 4260 ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 4320 atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 4380 gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 4440 tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 4500 gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 4560 gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 4620 tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 4680 ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 4740 tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 4800 ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 4860 ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 4920 tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 4980 ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 5040 tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 5100 tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 5160 actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 5220 cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 5280 gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 5340 tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 5400 ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 5460 ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 5520 cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 5580 cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 5640 gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 5700 attaatgcag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 5760 gcagcctgaa tggcgaatgg cgattccgtt gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat 5820 attaccagca aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat 5880 caaagaagta ttgcgacaac ggttaatttg cgtgatggac agactctttt actcggtggc 5940 ctcactgatt ataaaaacac ttctcaggat tctggcgtac cgttcctgtc taaaatccct 6000 ttaatcggcc tcctgtttag ctcccgct 6028 <210> 6 <211> 280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> CMV Sequence <400> 6 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 280 <210> 7 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> scAAV9 seuqence <400> 7 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 8 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAV2 3' ITR <400> 8 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg g 141 <210> 9 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> AAV2 5' ITR <400> 9 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgg 106 <210> 10 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polyucleotide <220> <221> misc_feature <223> BGH Poly A <400> 10 cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 60 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 120 attgtctgag taggtgtcat tctattc 147 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <223> SV40 intron <400> 11 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60

Claims

CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 자가-보완적 재조합 아데노-관련 바이러스 9 (scAAV9)로서, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 scAAV9 게놈을 포함하는, scAAV9.
제1항에 있어서, 상기 scAAV9 게놈이 제1 AAV 역전 말단 반복부, CMV 인핸서, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CB 프로모터, SV40 인트론, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 것인, scAAV9.
제1항에 있어서, 상기 scAAV9 게놈이 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 폴리 A 서열, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 5'에서 3'의 순서로 포함하는 것인, scAAV9.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, scAAV9.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것인, scAAV9.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scAAV9 게놈이 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인, scAAV9.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scAAV9 게놈이 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인, scAAV9.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scAAV9 게놈이 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것인, scAAV9.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 역전 말단 반복부가 AAV2 역전 말단 반복부인, scAAV9.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 단일 가닥 게놈을 포함하는 것인, scAAV9.
제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 포함하는 핵산 분자.
제11항에 있어서, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CB 프로모터, SV40 인트론, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 포함하는, 핵산 분자.
제11항에 있어서, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CB 프로모터, 서열 번호 1의 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 폴리 A 서열, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를 포함하는, 핵산 분자.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 서열 번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 역전 말단 반복부가 AAV2 역전 말단 반복부인, 핵산 분자.
제11항 내지 제19항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 자가-보완적 재조합 아데노-관련 바이러스 9 (scAAV9).
제20항에 있어서, 단일 가닥 게놈을 포함하는 scAAV9.
제11항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 입자.
제22항에 있어서, 단일 가닥 게놈을 포함하는 rAAV 입자.
CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9 (rAAV9) 바이러스 입자로서, 서열 번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열 번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 치킨 β-액틴 프로모터, 및 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 5'에서 3'의 순서로 포함하는 rAAV9 게놈을 포함하는, rAAV9 바이러스 입자.
제24항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 자가-보완적 게놈을 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 단일 가닥 게놈을 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열 번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 치킨 β-액틴 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를, 5'에서 3'의 순서로 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 서열 번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 역전 말단 반복부가 AAV2 역전 말단 반복부인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 SV40 인트론을 추가로 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 BGH 폴리-A 서열을 추가로 포함하는 것인, rAAV9 바이러스 입자.
rAAV9 게놈을 포함하는 핵산 분자로서, rAAV9 게놈이, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 CMV 인핸서, 서열 번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 치킨 β-액틴 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를, 5'에서 3'의 순서로 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 자가-보완적 게놈을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 단일 가닥 게놈을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이, 제1 AAV 역전 말단 반복부, 서열 번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 CMV 인핸서, 서열 번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 치킨 β-액틴 프로모터, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 AAV 역전 말단 반복부를, 5'에서 3'의 순서로 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 서열 번호 4와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 역전 말단 반복부가 AAV2 역전 말단 반복부인, 핵산 분자.
제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 SV40 인트론을 추가로 포함하는 것인, 핵산 분자.
제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 게놈이 BGH 폴리-A 서열을 추가로 포함하는 것인, 핵산 분자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 scAAV, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는, 조성물.
제44항에 있어서, 상기 부형제가 비이온성 저삼투압 화합물, 완충제, 중합체, 염 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
대상체에서 CLN6-바텐병을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 scAAV, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제44항 또는 제45항의 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 조성물이 척수강 내, 뇌실 내, 뇌실질 내, 정맥 내 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되는 것인, 방법.
제47항에 있어서, 상기 조성물이 척수강 내로 투여되는 것인, 방법.
제47항에 있어서, 상기 조성물을 뇌실 내로 투여되는 것인, 방법.
제4746항에 있어서, 상기 조성물이 정맥 내로 투여되는 것인, 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1x11¹¹ 내지 약 1x10¹⁵ vg의 rAAV9 바이러스 입자가 투여되는 것인, 방법.
제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1x11¹² 내지 약 1x10¹⁴의 rAAV9 바이러스 입자가 투여되는 것인, 방법.
제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 비치료 CLN6-바텐병 환자와 비교했을 때,
(a) 뇌 체적 감소;
(b) 인지 기능의 상실; 및
(c) 언어 지연
으로부터 선택되는 CLN6-바텐병의 하나 이상의 증상을 안정화 또는 둔화시키는 것인, 방법.
제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 CLN-6 바텐병의 질병 진행을 안정화 또는 둔화시키는 것인, 방법.
제54항에 있어서, 상기 질병 진행이 UBDRS 척도, 함부르크 운동 및 언어 척도, 소아 삶의 질(PEDSQOL) 척도를 사용한 삶의 질에 대한 치료의 영향, 조기 학습 뮬렌 척도 (MSEL), 연장된 생존 가능성, 또는 이들의 조합으로 평가되는 것인, 방법.
제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 나이가 80개월 이하, 75개월 이하, 70개월 이하, 65개월 이하, 62개월 이하, 60개월 이하, 55개월 이하, 50개월 이하, 또는 40개월 이하인, 방법.
제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV9 바이러스 입자를 투여한 후 대상체를 트렌델렌버그 체위로 위치시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
환자에서 CLN6 질병을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 scAAV, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제4334항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제44항 또는 제45항의 조성물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자의 뇌 또는 척수로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
제55항에 있어서, 상기 조성물이 척수강 내 주사, 뇌실 내 주사, 뇌실질 내 주사, 또는 정맥 내 주사, 또는 이들의 조합에 의해 전달되는 것인, 방법.
제56항에 있어서, 상기 조성물의 척수강 내 주사 후 환자를 트렌델렌버그 체위로 위치시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 비이온성 저삼투압 조영제를 포함하는 것인, 방법.
제5861항에 있어서, 상기 비이온성 저삼투압 조영제는 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로미드, 이오베르솔, 이옥실란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 또는 척수로 전달하는 단계는 뇌간으로의 전달을 포함하는 것인, 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 또는 척수로 전달하는 단계는 소뇌로의 전달을 포함하는 것인, 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 또는 척수로 전달하는 단계는 시각 피질로의 전달을 포함하는 것인, 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 또는 척수로 전달하는 단계는 운동 피질로의 전달을 포함하는 것인, 방법.
제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 또는 척수로 전달하는 단계는 신경 세포, 신경교세포 또는 이들 모두로의 전달을 포함하는 것인, 방법.
제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 또는 척수로 전달하는 단계는 뉴런, 하부 운동 뉴런, 미세교세포, 희소 돌기 아교 세포, 성상교세포, 슈반 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 신경계의 세포로의 전달을 포함하는 것인, 방법.
제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 비치료 CLN6-바텐병 환자와 비교했을 때,
(a) 뇌의 체적 감소;
(b) 인지 기능 상실; 및
(c) 언어 지연
으로부터 선택되는 CLN6-바텐병의 하나 이상의 증상을 안정화 또는 둔화시키는 것인, 방법.
제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 CLN-6 바텐병의 질병 진행을 안정화 또는 둔화시키는 것인, 방법.
제70항에 있어서, 상기 질병 진행이 UBDRS 척도, 함부르크 운동 및 언어 척도, 소아 삶의 질(PEDSQOL) 척도를 사용한 삶의 질에 대한 치료의 영향, 조기 학습 뮬렌 척도 (MSEL), 연장된 생존 가능성, 또는 이들의 조합으로 평가되는 것인, 방법.
제58항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 나이가 80개월 이하, 75개월 이하, 70개월 이하, 65개월 이하, 62개월 이하, 60개월 이하, 55개월 이하, 50개월 이하, 또는 40개월 이하인, 방법.
대상체에서 CLN-6 바텐병을 치료하기 위한 약제 생산를 위한 용도로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 scAAV, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제44항 또는 제45항의 조성물의 치료적 유효량의, 용도.
대상체에서 CLN-6 바텐병을 치료하기 위한 조성물서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 scAAV, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제44항 또는 제45항의 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 것인, 조성물.
rAAV 바이러스 입자, 핵산, 또는 조성물을 환자의 뇌 또는 척수로 전달하기 위한 약제의 생산를 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 scAAV, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제4334항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제44항 또는 제45항의 조성물을 포함하는 것인, 용도.
환자에서 CLN6 질병을 치료하기 위한 조성물로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 scAAV, 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV9 바이러스 입자, 제11항 내지 제19항, 제31항 또는 제34항 내지 제4334항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제44항 또는 제45항의 조성물을 이를 필요로 하는 환자의 뇌 또는 척수에 포함하는 것인, 조성물.