JP2022519597A - Ｃｌｎ６ポリヌクレオチドのアデノ随伴ウイルス送達 - Google Patents
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Abstract
本開示は、神経セロイドリポフスチン症ニューロン６（ＣＬＮ６）ポリヌクレオチドの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達に関する。本開示は、神経セロイドリポフスチン症またはＣＬＮ６－バッテン病のＣＬＮ６遺伝子治療のためのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶの使用方法を提供する。【選択図】なし
Description
本出願は、２０１９年２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／８００，９１５号、２０１９年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８８０，６４１号、２０１９年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／８８１，１５１号、２０１９年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９１２，９７７号、および２０１９年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，１２５号の優先権を主張し、これらの出願は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０２０年１月３１日に作成された５３８９４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２４，９２３バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０２０年１月３１日に作成された５３８９４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２４，９２３バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、セロイドリポフスチン症ニューロン６（ＣＬＮ６）ポリヌクレオチドの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達に関する。本開示は、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）またはＣＬＮ６－バッテン病のＣＬＮ６遺伝子治療のためのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶの使用方法を提供する。
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、まとめてバッテン病と呼ばれる一群の重度の神経変性障害である。これらの障害は神経系に影響を及ぼし、典型的には、例えば、移動および思考能力に関する問題を悪化させる。異なるＮＣＬは、それらの遺伝的原因によって区別される。
ＣＬＮ６－バッテン病は、２つの異なる形態、より一般的な形態の後期乳児変異型（ｖＬＩＮＣＬ）、および成人発症型ＮＣＬ（Ａ型クフス病とも呼ばれる）として起こり得る（Ｃａｎｎｅｌｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００９；３７９（４）：８９２－７、Ａｒｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１１；８８（５）：５６６－７３）。ｖＬＩＮＣＬ（本明細書ではＣＬＮ６－バッテン病と称される）では、発症年齢は１８ヶ月～６歳の間であり、死亡は通常１２～１５歳までに起こる。ＣＬＮ６－バッテン病は最初、幼児期における言語障害および運動／認知発達の遅延として現れ、ほとんどの患者は発症から４年以内に車椅子に拘束される（Ｃａｎａｆｏｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１５；８５（４）：３１６－２４）。この疾患は、視力喪失、重度の運動障害、再発性発作、認知症および他の神経変性症状を含むように進行する。
ＣＬＮ６は、７つの推定膜貫通ドメインを有する３１１個のアミノ酸のタンパク質であり、そして主に小胞体に局在する。他のＣＬＮタンパク質と同様に、その正確な機能は不明のままであるが、それは細胞内輸送およびリソソーム機能に関与している。ＣＬＮ６には現在７０を超える特徴付けられた疾患を引き起こす変異があり（Ｗａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．２０１３；１８３２（１１）：１８２７－３０）、これらの変異の大部分はＣＬＮ６タンパク質の完全な喪失または高度に不安定および／もしくは非機能的であると考えられる切断型ＣＬＮ６タンパク質産物の産生のいずれかをもたらす。ＣＬＮ６－バッテン病のいくつかの天然動物モデルが記載されており、これらには、ヒツジ、イヌ、およびマウスのモデルが含まれる。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスモデル（本明細書では「Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウス」と称される）に見出される自然変異は、この疾患の多くの病理学的および行動的側面を再現する（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３年；８（１１）：ｅ７８６９４）。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、追加のシトシン（ｃ．３０７ｉｎｓＣ、Ｐ１０２後のフレームシフト）の挿入を含み、ＣＬＮ６－バッテン病患者に一般的に見られる変異と相同な未成熟終止コドンが生じる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００２；７０（２）：３２４－３５、Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００２年；７０（２）：５３７－４２）。
現在、ＣＬＮ６－バッテン病の症状を改善することができる治療法はない。したがって、ＣＬＮ６－バッテン病の治療に対する当該技術分野における必要性が残っている。
本明細書に提供されるのは、組換えＡＡＶを使用するＣＬＮ６遺伝子治療のための方法および製品である。
本明細書に提供されるのは、５’から３’の順序でハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢ）プロモーターと、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、ｒＡＡＶ９ゲノムを含む、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）である。場合によっては、ｒＡＡＶ９ゲノムは、自己相補的ゲノムを含む。あるいは、ｒＡＡＶ９ゲノムは、一本鎖ゲノムを含む。
配列番号１に記載のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）が提供され、この中で、ｓｃＡＡＶ９のゲノムは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢ）プロモーター、配列番号２に記載のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも９０％同一であり得る。
また提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、ＣＭＶエンハンサ、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ｃｂ）、ＳＶ４０イントロン、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｃＡＡＶ９；５’～３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｃＡＡＶ９；および配列番号４の核酸配列で記載される遺伝子カセットを含むゲノムを有するｓｃＡＡＶ９である。
また提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、ＣＭＶエンハンサ、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）、ＳＶ４０イントロン、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｓＡＡＶ９；５’～３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むゲノムを有するｓｓＡＡＶ９；または配列番号４の核酸配列で記載される遺伝子カセットを含むゲノムを有するｓｓＡＡＶ９である。
配列番号４に記載の核酸配列は、図１Ａに提供される遺伝子カセットである。提供されるのは、ｓｃＡＡＶ９ゲノムもしくは配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含むｓｓＡＡＶ９ゲノムを含むｒＡＡＶ９である。
さらに提供されるのは、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の核酸配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む核酸分子である。いくつかの実施形態では、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一であり得る。
また提供されるのは、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＣＢプロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む核酸分子である。加えて、提供されるのは、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする核酸、ＢＧＨポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む核酸分子である。提供されるポリヌクレオチドのいずれかにおいて、ＣＬＮ６ポリペプチドは、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列によってコードされ得る。
提供されるのは、ｓｃＡＡＶゲノムまたｓｓＡＡＶゲノムを有するｒＡＡＶであり、ここでゲノムは、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。
提供されるｒＡＡＶは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。加えて、開示された核酸のいずれかを含むウイルス粒子が提供される。自己相補的または一本鎖ゲノムを有するｒＡＡＶもまた提供される。
また提供されるのは、５’から３’の順序で、配列番号６と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサ、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＢプロモーター、および配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ９ゲノムを含むＣＬＮ６ポリペプチドをコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）ウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、提供されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子は、自己相補的ゲノムを含む。あるいは、提供されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子は、一本鎖ゲノムを含む。
さらに提供されるのはｒＡＡＶ９ウイルス粒子であり、ここでｒＡＡＶ９ゲノムは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号６と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサ、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む。提供されるｒＡＡＶ９粒子は、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれも、任意に、ＳＶ４０イントロン、および／またはＢＧＨポリＡ配列をさらに含む。
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ９ウイルス粒子は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、または配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含むＡＡＶ９ゲノムを含む。
提供されるｒＡＡＶ、ｓｓＡＡＶ、またはｓｃＡＡＶのいずれにおいても、ＡＡＶ逆方向末端反復は、ＡＡＶ２逆方向末端反復であり得る。
また提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号６と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサ、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＢプロモーター、および配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む核酸分子である。提供される核酸分子は、自己相補的ゲノムおよび／または一本鎖ゲノムを含む。
さらに提供されるのは、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号６と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサ、配列番号３と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む核酸分子である。提供される核酸分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。加えて、核酸分子は、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一、配列番号４の核酸配列と少なくとも９８％同一である核酸配列を含むＡＡＶ９ゲノムを含むことができる。提供される核酸分子のいずれも、任意に、ＳＶ４０イントロン、および／またはＢＧＨポリＡ配列をさらに含む。
さらに提供されるのは、本明細書に記載のｓｃＡＡＶ９、本明細書に記載の核酸分子、または本明細書に記載のｒＡＡＶウイルス粒子、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む組成物である。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、非イオン性低浸透圧性化合物、緩衝剤、ポリマー、塩、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはコポリマーである。いくつかの実施形態では、コポリマーはポロキサマーである。例えば、組成物は、非イオン性低浸透圧性化合物を含む薬学的に許容される賦形剤を少なくとも含み得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含み得る。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、および約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。別の例示的組成物は、０．００１％プルロニックＦ６８を含む１×ＰＢＳ中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
またさらに提供されるのは、治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれか、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶのいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含む組成物、または本明細書に記載の組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ６－バッテン病の治療方法である。
また本開示で提供されるのは、治療有効量の、本明細書に開示されるｒＡＡＶ９ウイルス粒子のいずれか、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶのいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかの、ＣＬＮ６－バッテン病の治療用の薬剤の調製のための使用である。
またさらに提供されるのは、治療有効量の、本明細書に開示されるｒＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶのいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかを含む、ＣＬＮ６－バッテン病を治療するための組成物である。
提供されるＣＬＮ６－バッテン病を治療するための方法、使用、または組成物のいずれにおいても、組成物、ｒＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ９、もしくはｓｓＡＡＶおよび／または核酸分子は、髄腔内、脳室内、脳実質内、静脈内、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される経路を介して投与される。
髄腔内経路により投与されるｓｃＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶまたはｒＡＡＶ９の例示的用量は、約１×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ、ｓｓＡＡＶもしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子から約１×１０１５ｖｇのｓｃＡＡＶもしくはＡＡＶ９ウイルス粒子、または約１×１０１２ｖｇのｓｃＡＡＶ、ｓｓＡＡＶもしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子から約１×１０１４ｖｇのｓｃＡＡＶ、ｓｓＡＡＶもしくはＡＡＶ９ウイルス粒子である。例えば、約１×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ、ｓｓＡＡＶもしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子が対象に投与されてもよく、または約１．５×１０１３のｓｃＡＡＶ、ｓｓＡＡＶもしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子が対象に投与されてもよく、または約６×１０１３ｖｇのｓｃＡＡＶ、ｓｓＡＡＶもしくはｒＡＡＶ９ウイルス粒子が対象に投与されてもよい。
本明細書で開示されるＣＬＮ６－バッテン病を治療するための方法、使用または組成物は、処置前の対象または未処置のＣＬＮ６－バッテン病患者と比較して、（ａ）自己蛍光貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｂ）ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｃ）グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、（ｄ）星状細胞増加症の減少または遅延、（ｅ）ＭＲＩにより測定した脳容積損失の減少または遅延、（ｆ）発作の発症の減少または遅延、および（ｇ）ＣＬＮ６バッテン病の進行および／または改善を評価するために使用される尺度、例えば、統一バッテン病評価システム（ＵＢＤＲＳ）評価尺度、ハンブルグ運動および言語尺度またはＭｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）のうちの１つ以上の安定化、進行の減少、または改善、のうちの１つ以上を対象にもたらす。対象は、本明細書に開示されるｒＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９ウイルス粒子、ｓｃＡＡＶまたは核酸分子を投与した後にトレンデレンベルク体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に保持され得る。
またさらに提供されるのは、本明細書に提供された開示されるｒＡＡＶウイルス粒子のいずれか１つ、本明細書で開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれか、を含む組成物を、それを必要とする患者の脳または脊髄に送達することを含む、治療を必要とする患者におけるＣＬＮ６疾患の治療方法である。
加えて、本開示は、本明細書に提供された開示されるｒＡＡＶウイルス粒子のいずれか１つ、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかの、当該ｓｓＡＡＶ９、核酸分子、または組成物をそれを必要とする患者の脳または脊髄に送達するのに使用するための薬剤の調製のための、使用を提供する。
さらに提供されるのは、本明細書に提供された開示されるｒＡＡＶウイルス粒子のいずれか１つ、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶ９のいずれか、本明細書に開示されるｓｓＡＡＶ９のいずれか、本明細書に記載の核酸分子のいずれか、または本明細書に記載の組成物のいずれかを含み、当該ｓｓＡＡＶ９、核酸分子、または組成物をそれを必要とする患者の脳または脊髄に送達するための、組成物である。
提供される方法、使用または組成物のいずれにおいても、組成物は、髄腔内、脳室内、脳実質内、または静脈内注射、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。提供される方法のいずれも、本明細書に開示される組成物、ｒＡＡＶ９、ｓｓＡＡＶ９もしくはｓｃＡＡＶ、または核酸分子の髄腔内注射後に、患者をトレンデレンベルク体位に置くことをさらに含む。
提供される方法または使用のいずれにおいても、組成物または薬剤は、非イオン性低浸透圧性造影剤を含み得る。例えば、組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性低浸透圧性造影剤を含み得る。
投与される組成物または薬剤は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含み得る。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、および約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。別の例示的組成物は、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
提供される方法、使用または組成物のいずれにおいても、組成物または薬剤が脳または脊髄に送達されてもよく、組成物もしくは薬剤は脳幹に送達されてもよく、または小脳に送達されてもよく、視覚野に送達されてもよく、または運動皮質に送達されてもよい。さらに、提供される方法のいずれにおいても、組成物または薬剤は脳または脊髄に送達されてもよく、組成物は神経細胞、グリア細胞、またはその両方に送達されてもよい。例えば、脳または脊髄に送達することは、ニューロン、下位運動ニューロン、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、またはこれらの組み合わせなどの神経系の細胞への送達を含む。
本明細書で開示される方法、使用および組成物は、処置前の対象または未処置のＣＬＮ６－バッテン病患者と比較して、（ａ）自己蛍光貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｂ）ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、（ｃ）グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、（ｄ）星状細胞増加症の減少または遅延、（ｅ）ＭＲＩにより測定した脳容積損失の減少または遅延、（ｆ）発作の発症の減少または遅延、および（ｇ）ＣＬＮ６バッテン病の進行および／または改善を評価するために使用される尺度、例えば、統一バッテン病評価システム（ＵＢＤＲＳ）評価尺度、ハンブルグ運動および言語尺度またはＭｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）のうちの１つ以上の安定化、進行の減少、または改善、のうちの１つ以上を対象にもたらす。
本明細書に記載の方法、組成物、および使用のいずれにおいても、治療、組成物、または薬剤は、ＣＬＮ－６バッテン病の疾患進行を安定化または遅延させる。特に、疾患進行は、ＵＢＤＲＳ尺度、ハンブルグ運動および言語尺度、小児の生活の質（ＰＥＤＳＱＯＬ）尺度を使用した生活の質に対する治療の影響、Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）、長期生存の可能性、またはそれらの組み合わせで評価される。
本明細書に記載の方法、使用または組成物のいずれにおいても、治療、組成物または薬剤は、未処置のＣＬＮ６－バッテン病患者と比較して、以下から選択されるＣＬＮ－６バッテン病の１つ以上の症状を軽減または遅延させる：（ａ）脳容積損失、（ｂ）認知機能の喪失、および（ｃ）言語の遅れ。特に、治療はＣＬＮ－６バッテン病の疾患進行を安定化または遅延させる。例えば、疾患進行は、ＵＢＤＲＳ尺度、ハンブルグ運動および言語尺度、小児の生活の質（ＰＥＤＳＱＯＬ）尺度を使用した生活の質に対する治療の影響、Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）、長期生存の可能性、またはそれらの組み合わせで評価される。
本明細書に記載の方法、使用または組成物のいずれにおいても、対象の年齢は、８０ヶ月以下、７５ヶ月以下、７０ヶ月以下、６５ヶ月以下、６２ヶ月以下、６０ヶ月以下、５５ヶ月以下、５０ヶ月以下、または４０ヶ月以下である。
ＣＬＮ６－バッテン病に対する効果的な治療法がないことを考慮して、Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスモデルを使用して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子治療による機能的ヒトＣＬＮ６の導入の有効性を試験した。本明細書に提供される前臨床結果は、ＡＡＶ血清型９の使用が、最も影響を受けた細胞が位置するＣＮＳ全体にわたってヒトＣＬＮ６タンパク質の効率的な発現を可能にすることを示唆する。大型動物モデルにおける治療の安全性を評価するために、３匹の４歳のカニクイザルにｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を髄腔内腰椎ＣＳＦ注射で投与し、注射後６ヶ月まで監視した。高レベルの導入遺伝子発現が全動物の脳および脊髄全体に見られたが、有害作用または病理は観察されなかった。マウスのＣＳＦへのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の出生後脳室内（ＩＣＶ）注射は、Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスにおいてインビボで導入遺伝子の持続的発現を誘導した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の投与は、自己蛍光貯蔵物質およびＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積、反応性神経膠症、ならびに樹状突起棘の喪失を含む、この疾患の古典的な特徴を軽減した。重要なことに、この遺伝子治療は、それがＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスの運動、記憶および学習、ならびに生存障害の多くを妨げるので、広範な機能的利益をもたらす。これらの結果は、ＣＬＮ６－バッテン病の治療に対するＣＳＦ送達ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の治療的可能性を強く強調している。
本明細書中の見出しは、読者の便宜のためであり、限定的であることを意図しない。
本明細書における「ｍａｙ」および「ｃａｎ」の使用は、請求項内に含まれる様々な実施形態を説明するためのものであり、請求項の範囲についての不確実性を示すためのものではない。
本開示は、ＣＬＮ６－バッテン病を治療するための方法および製品を提供する。本方法は、遺伝子送達ベクターとしてｒＡＡＶを使用して対象にＣＬＮ６ポリヌクレオチドを送達することを伴う。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５個のヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さであり、ウイルスそれ自体またはその誘導体を指すように使用することができる。この用語は、他に特定されない限り、全てのサブタイプおよび天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶの血清型はそれぞれ特定のクレードと関連しており、そのメンバーは血清学的および機能的類似性を共有している。したがって、ＡＡＶはクレードによって称されてもよい。例えば、ＡＡＶ９配列は「クレードＦ」配列と呼ばれる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４））。本開示は、特定のクレード、例えばクレードＦ内の任意の配列の使用を企図する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は知られている。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１２ゲノムの一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されており、ＡＡＶ－１３ゲノムの一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ＡＡＶ－Ｂ１ゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的である固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。天然のＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成および組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつかまたは全てを置換することができるプロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットのような外来ＤＮＡと接触させる。場合によっては、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供される。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性でない。
本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、野生型ＡＡＶウイルスまたはウイルス粒子を指す。「ＡＡＶ」、「ＡＡＶウイルス」、および「ＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「ｒＡＡＶ」という用語は、組換えＡＡＶウイルスまたは組換え感染性のカプセル化ウイルス粒子を指す。「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶウイルス」、および「ｒＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、修飾されている天然のＡＡＶゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、天然のｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を除去するために修飾されている。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは内因性５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムが由来するＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端に隣接した目的の導入遺伝子（例えばＣＬＮ６をコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは「遺伝子カセット」を含む。例示的な遺伝子カセットを図１Ａに記載し、そして核酸配列を配列番号４に記載する。ｒＡＡＶゲノムは、本明細書で「ｓｃＡＡＶゲノム」と呼ばれる自己相補的（ｓｃ）ゲノムであり得る。あるいは、ｒＡＡＶゲノムは、本明細書で「ｓｓＡＡＶゲノム」と呼ばれる一本鎖（ｓｓ）ゲノムであり得る。
「ｓｃＡＡＶ」という用語は、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶウイルス粒子を指す。「ｓｓＡＡＶ」という用語は、一本鎖ゲノムを含むｒＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶウイルス粒子を指す。
本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。ＣＬＮ６ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ＣＬＮ６活性（例えば、リソソーム自己蛍光貯蔵物質のクリアランスの増加、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少、および例えば治療前の患者と比較して治療した場合の患者における星状細胞ならびにミクログリアの活性化の減少のうちの少なくとも１つ）を有するポリペプチドをコードする。
本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、場合によっては、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチドであり、ＣＬＮ６活性（例えば、リソソーム自己蛍光貯蔵物質のクリアランスの増加、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少、および例えば治療前の患者と比較して治療した場合の患者における星状細胞ならびにミクログリアの活性化の減少のうちの少なくとも１つ）を有するポリペプチドをコードする。
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、ＣＬＮ６活性を有するポリペプチドをコードし、かつストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列、またはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃での０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または４２℃での０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＣＬＮ６ポリヌクレオチドは、遺伝子カセットを形成するために標的細胞内で機能的である転写制御要素（プロモーター、エンハンサおよび／またはポリアデニル化シグナル配列が含まれるが、これらに限定されない）に作動可能であるように結合されている。プロモーターの例は、ニワトリβアクチンプロモーターおよびＰ５４６プロモーターである。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない追加のプロモーターが本明細書で企図される。本明細書にさらに提供されるのは、ＣＢ転写促進活性を有するプロモーターである、配列番号３に記載のＣＢプロモーター配列、および配列番号３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のプロモーター配列である。転写制御要素の他の例は、組織特異的制御要素、例えば、ニューロン内での特異的発現を可能にするか、または星状細胞内での特異的発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターもまた企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞中で発現されたときにＣＬＮ６ ＲＮＡ転写産物のプロセシングを容易にするためのイントロン配列を含んでもよい。このようなイントロンの一例は、ＳＶ４０イントロンである。
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の組立およびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。「産生」という用語は、充填細胞によるｒＡＡＶ（感染性のカプセル化されたｒＡＡＶ粒子）の産生プロセスを指す。
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれアデノ随伴ウイルスの複製タンパク質およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。
ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶに対する様々なこのようなヘルパーウイルスは、当該技術分野において既知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含し得るが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、およびトリ起源の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらはＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手可能である。
「ヘルパーウイルス機能」とは、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされている機能を指す。本明細書中に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランスでプロデューサー細胞に提供することによることを含む多くの方法で提供され得る。
本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く。本明細書に企図されるｒＡＡＶゲノム（例えば、ＩＴＲ）内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスを導出するのに好適な任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、およびＡＡＶ－Ｂ１が挙げられるが、これらに限定されない。上記に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。キャプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。本明細書中の修飾キャプシドもまた企図され、グリコシル化および脱アミド化などの種々の翻訳後修飾を有するキャプシドを含む。アスパラギンまたはグルタミン側鎖を脱アミド化してアスパラギン残基をアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸残基に変換すること、およびグルタミンをグルタミン酸またはイソグルタミン酸に変換することは、本明細書に提供されるｒＡＡＶキャプシドにおいて企図される。例えば、Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２６（１２）：２８４８－２８６２（２０１８）を参照されたい。本明細書中の修飾キャプシドはまた、治療を必要とする罹患組織および臓器にｒＡＡＶを指向させる標的化配列を含むと企図される。
本明細書に提供されるＤＮＡプラスミドは、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を用いて感染性ウイルス粒子中にｒＡＡＶゲノムを組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）による感染を許容できる細胞に導入される。パッケージングされるべきｒＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶを産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶ粒子の産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々な実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えｒＡＡＶの送達を増強するために修飾され得る。キャプシドタンパク質に対する修飾は、一般的に当該技術分野において既知である。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＵＳ２００５／００５３９２２およびＵＳ２００９／０２０２４９０を参照されたい。
パッケージング細胞を生成する方法は、ｒＡＡＶの産生に必要な成分を全て安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ｒＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されてもよい。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させられ得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
ｒＡＡＶ粒子産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ粒子産生に関する文書の部分を特に強調する。
本明細書でさらに提供されるのは、感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するパッケージング細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）であり得る。
本開示のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ（例えば、感染性キャプシド化ｒＡＡＶ粒子）も本明細書に提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。ｒＡＡＶゲノムは自己相補的（ｓｃ）ゲノムであり得る。ｓｃゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｃＡＡＶと称される。ｒＡＡＶゲノムは一本鎖（ｓｓ）ゲノムであり得る。一本鎖ゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｓＡＡＶと称される。
本明細書に提供される例示的なｒＡＡＶは、「ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６」と命名されるｓｃＡＡＶである。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６ ｓｃＡＡＶは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢ）プロモーター（配列番号３）の制御下にあるヒトＣＬＮ６ ｃＤＮＡを含むｓｃＡＡＶゲノムを含有する。ｓｃＡＡＶゲノムはまた、ＳＶ４０イントロン（ヒトＣＬＮ６ ｃＤＮＡの上流）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリＡ）ターミネーター配列（ヒトＣＬＮ６ ｃＤＮＡの下流）を含む。このｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子カセットの配列を配列番号４に記載する。ｓｃＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージ化されており、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１つのＩＴＲはＣＢプロモーターの上流にあり、他のＩＴＲはＢＧＨポリＡターミネーター配列の下流にある）を含む。
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含み得る。
ｒＡＡＶを含む組成物もまた提供される。組成物は、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。組成物は、対象とした異なるポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの態様では、ｒＡＡＶはｓｃＡＡＶまたはｓｓＡＡＶである。
本明細書で提供される組成物は、ｒＡＡＶと、薬学的に許容される１つまたは複数の賦形剤を含む。許容される賦形剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量および濃度で不活性であり、リン酸塩［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］、クエン酸塩、もしくは他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、ポロキサマー１８８などのコポリマー、プルロニック（例えば、プルロニックＦ６８）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、またはイオキシランなどの非イオン性低浸透圧性化合物を含有する薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性低浸透圧性化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性：約１８０ｍｇｌ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法による重量オスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐのおよび３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、ならびに３７℃で約１．１６４の比重、のうちの１つ以上を有することができる。例示的な組成物は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、約２５％～約３５％の非イオン性の低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス粒子を含む。別の例示的組成物は、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの投薬量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、投与の時間、治療目標、個体、および標的とされる細胞型に応じて異なることになり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。本明細書で企図される投薬量は、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１．１×１０１３、約１．２×１０１３、約１．３×１３、約１．５×１０１３、約２×１０１３、約２．５×１０１３、約３×１０１３、約３．５×１０１３、約４×１０１３、約４．５×１０１３、約５×１０１３、約６×１０１３、約１×１０１４、約２×１０１４、約３×１０１４、約４×１０１４、約５×１０１４、約１×１０１５、約１×１０１６まで、またはそれ以上の総ウイルスゲノムを含む。約１×１０１１～約１×１０１５ｖｇ、約１×１０１２～約１×１０１５ｖｇ、約１×１０１２～約１×１０１４ｖｇ、約１×１０１３～約６×１０１４ｖｇ、および約６×１０１３～約１．０×１０１４ｖｇの投薬量も企図される。本明細書中に例示される１用量は、６×１０１３ｖｇである。本明細書に例示される他の用量は、１．５×１０１３である。
標的細胞（神経系の細胞、神経細胞またはグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない）にｒＡＡＶを形質導入する方法が提供される。神経系の細胞は、ニューロン、下位運動ニューロン、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、またはこれらの組み合わせを含む。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による機能性ポリペプチドの発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、標的細胞へのＣＬＮ６ポリヌクレオチドの投与／送達を指すように使用される。本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチドまたはＲＮＡの持続的発現をもたらす。したがって、本開示は、髄腔内、脳室内、脳実質内、または静脈内経路、またはこれらの任意の組み合わせによって、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを対象に投与／送達する方法を提供する。髄腔内送達は、脳または脊髄のくも膜の下の空間への送達を指す。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は槽内投与による。
髄腔内投与が本明細書に例示される。これらの方法は、標的細胞（神経細胞および／またはグリア細胞を含むが、これらに限定されない）に本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶウイルス粒子は、患者の脳および／または脊髄に投与もしくは送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脳に送達される。送達が企図される脳の領域としては、運動皮質、視覚野、小脳、および脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、下位運動ニューロンに送達される。ポリヌクレオチドは、神経細胞およびグリア細胞に送達され得る。グリア細胞は、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、または星状細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シュワン細胞に送達される。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、患者は、ｒＡＡＶの投与後トレンデレンベルク体位（頭低位）に保持される（例えば、約５、約１０、約１５または約２０分間）。例えば、患者は、頭を下げた位置で約１度～約３０度、約１５～約３０度、約３０～約６０度、約６０～約９０度、または約９０～約１８０度傾けられてもよい。
本明細書で提供される方法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数用量をそれを必要とする対象（例えば、ヒト患者を含むが、これに限定されない動物）に投与する工程を含む。用量がＣＬＮ６－バッテン病の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量がＣＬＮ６－バッテン病の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除、安定化または低減）する用量であり、疾患の進行を遅らせ、または予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的または完全な）をもたらす用量であり、および／または生存を延長させる用量である。処置前の対象と比較して、または未処置の対象と比較して、本明細書で提供される方法は、ＣＬＮ６バッテン病の進行および／または改善を評価するために使用される尺度、例えば、統一バッテン病評価システム（ＵＢＤＲＳ）またはハンブルグ運動および言語尺度、またはＭｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）のうちの１つ以上の安定化、進行の減少、または改善をもたらす。ＵＢＤＲＳ評価尺度（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００５ ６５（２）：２７５－２７９）［ＵＢＤＲＳ身体評価尺度、ＵＢＤＲＳ発作評価尺度、ＵＢＤＲＳ行動評価尺度、ＵＢＤＲＳ能力評価尺度、ＵＢＤＲＳ症状発現順序、およびＵＢＤＲＳ臨床全般印象（ＣＧＩ）を含む］、小児科の生活の質の尺度（ＰＥＤＳＱＯＬ）は、運動機能、言語機能、認知機能、および生存を量る。処置前の対象と比較して、または未処置の対象と比較して、本明細書で提供される方法は、以下の：自己蛍光貯蔵物質のリソソーム蓄積の減少または遅延、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣのリソソーム蓄積の減少または遅延、グリア活性化（星状細胞および／またはミクログリア）活性化の減少または遅延、星状細胞増加症の減少または遅延、およびＭＲＩによって測定された脳容積損失の減少または遅延のうちの１つ以上をもたらし得る。
併用療法も提供される。本明細書で使用される併用は、同時治療または連続治療のいずれかを含む。本明細書に記載の方法と標準的な薬物療法との組み合わせが特に企図される。さらに、同時治療または連続治療のいずれかでの、本発明に従って使用するための組成物の組み合わせ（例えば、ｓｃＡＡＶ９．Ｐ５４６．ＣＬＮ６と本明細書に開示される造影剤との組み合わせ）が具体的に企図される。
出生後の送達を必要とする対象への送達が企図されるが、胎児への子宮内送達も企図される。
以下の実施例は特定の実施形態を説明するが、当業者には変形および修正が発生するであろうことが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。
実施例では、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢ）プロモーターの制御下でＣＬＮ６ ｃＤＮＡを保有する自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６と命名）を産生した。生後１日目のマウスのＣＳＦへのＩＶＣ注射（６×１０１３ｖｇ／動物）は、最長１８ヶ月間、ＣＮＳを通して安定した頑強な発現ＣＬＮ６タンパク質を誘導するのに十分であった。ＣＬＮ６－バッテン病の進行は、ＡＳＭの蓄積、ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの凝集、シナプス棘密度の減少、星状細胞におけるＧＦＡＰ反応性の増加、およびミクログリアにおけるＣＤ６８染色の増加に関連付けられる。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、２ヶ月間でのＡＳＭおよびＡＴＰシンターゼサブユニットＣの増加および樹状突起棘の減少、ならびに６ヶ月齢までのＧＦＡＰおよびＣＤ６８反応性の増加を示す。ＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスへのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の注射は、ＡＳＭおよびＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積を減少させ、樹状突起棘密度を増加させ、ならびにＣＤ６８＋ミクログリアおよびＧＦＡＰ＋星状細胞反応性のレベルを減少させた。
実施例１
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の産生
ヒトＣＬＮ６ ｃＤＮＡクローンは、Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。ｈＣＬＮ６ ｃＤＮＡをハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）の下でＡＡＶ９ゲノムにさらにサブクローニングし、インビトロおよびインビボで試験した。ニワトリβ－アクチン（ＣＢ）ハイブリッドプロモーターの制御下にあるヒトＣＬＮ６（ｈＣＬＮ６）遺伝子を含む自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）血清型９ウイルスゲノムを生成した。ＡＡＶ２ ＩＴＲ間に挿入されたＣＬＮ６ ｃＤＮＡを示すプラスミド構築物の概略図を図１Ａに提供する。プラスミド構築物はまた、ＣＰプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）キメライントロン、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）も含む。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の産生
ヒトＣＬＮ６ ｃＤＮＡクローンは、Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。ｈＣＬＮ６ ｃＤＮＡをハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）の下でＡＡＶ９ゲノムにさらにサブクローニングし、インビトロおよびインビボで試験した。ニワトリβ－アクチン（ＣＢ）ハイブリッドプロモーターの制御下にあるヒトＣＬＮ６（ｈＣＬＮ６）遺伝子を含む自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）血清型９ウイルスゲノムを生成した。ＡＡＶ２ ＩＴＲ間に挿入されたＣＬＮ６ ｃＤＮＡを示すプラスミド構築物の概略図を図１Ａに提供する。プラスミド構築物はまた、ＣＰプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）キメライントロン、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）も含む。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を、ＨＥＫ２９３細胞（３６）中のアデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）とともに、前述のとおり（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４））、二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースのＣＢ－ＣＬＮ６ベクターと、Ｒｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを用いて、一過性トリプルプラスミドトランスフェクション法により、ｃＧＭＰ条件下で産生した。ベクターの純度および力価は、４～１２％ドデシル硫酸ナトリウム－アクリルアミドゲル電気泳動法および銀染色法ならびにｑＰＣＲ分析によって評価した。クローニング後、導入遺伝子の発現を、ＨＥＫ２９３細胞においてインビトロで、ならびに胎生１５．５日目にて子宮ＩＣＶ電気穿孔法を介してインビボで確認した（図１Ｂおよび図１Ｃを参照）。この分析により、インビボでのニューロン標的化およびヒトＣＬＮ６タンパク質の発現を確認した。
実施例２
ＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスにおけるＣＳＦ送達ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の発現解析
細胞標的化および発現
マウスにおけるウイルス導入ヒトＣＬＮ６の発現および体内分布を確認するために、生後２４時間以内にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を、単回脳室内（ＩＣＶ）注射を介してＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスに投与し、発現を２ヶ月間の様々な時点で監視した。等量のＰＢＳを注射した野生型マウスおよびＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスを対照とした。有効投与量は、ＮＣＨウイルスベクターコアタイターを使用して５×１０１０ｖｇ／マウスであった。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合するか、または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８中に配合した。
ＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスにおけるＣＳＦ送達ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の発現解析
細胞標的化および発現
マウスにおけるウイルス導入ヒトＣＬＮ６の発現および体内分布を確認するために、生後２４時間以内にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を、単回脳室内（ＩＣＶ）注射を介してＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスに投与し、発現を２ヶ月間の様々な時点で監視した。等量のＰＢＳを注射した野生型マウスおよびＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスを対照とした。有効投与量は、ＮＣＨウイルスベクターコアタイターを使用して５×１０１０ｖｇ／マウスであった。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合するか、または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８中に配合した。
注射後２、６および１８ヶ月目のＲＴ－ＰＣＲによるｈＣＬＮ６発現の検査は、ＰＢＳ注射対照と比較してｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの皮質において持続的で頑強なｈＣＬＮ６発現を示した（図２Ａ、図３Ａ）。これらの結果は、以前に報告されたｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ発現レベルと類似していた（例えば、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３；２１（１２）：２１４８－５９、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０：２８（３）：２７１－４、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５；２３（３）：４７７－８７を参照されたい）。図２Ａにおいて、上部のゲルおよびグラフは、代表的なＲＴ－ＰＣＲゲルおよび濃度測定（ＧＡＰＤＨに対して正規化）である。これらのデータは、ＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較して、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６送達後の遺伝子発現の増加を実証した。下部のゲルおよびグラフは、ウエスタンブロッティングによって測定されたＣＬＮ６タンパク質発現を示す。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６ベクターのＩＣＶ送達は、ＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスの大脳皮質におけるｈＣＬＮ６タンパク質発現の顕著な増加を示す。
導入遺伝子発現の局所的分布を調べるために、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（著作権）と呼ばれる修正インサイチューハイブリダイゼーション法を使用して、ｈＣＬＮ６転写産物を可視化した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、体性感覚皮質および視床のＶＰＭ／ＶＰＬ核（Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの疾患進行において最も早期に冒されることが示されている２つの領域）を含む、２、６、および１８ヶ月間での脳の全ての領域にわたってｈＣＬＮ６の広範な形質導入を維持した（図２Ｂ、左パネル；図３Ｂ；上部パネル、図４Ａ）。
ＣＮＳ内のｈＣＬＮ６タンパク質の発現を調べるために、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆおよびＰＢＳ注射対照から採取した皮質脳溶解物の免疫ブロッティングを、抗ｈＣＬＮ６抗体を使用して行った。ＲＮＡ発現で見られたものと同じで、２、６、および１８ヶ月齢のＣＮＳ全体に、頑強なｈＣＬＮ６タンパク質発現が見られた（図２Ｂ、右パネル、図３Ｂ、下部パネル）。さらに、抗ｈＣＬＮ６抗体を使用した脳組織の免疫標識は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの脳全体での発現を確認した（図４Ｂ）。まとめると、これらの知見は、ＩＣＶ注射によるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６のＣＳＦ送達が、ＣＮＳの疾患関連領域においてｈＣＬＮ６転写産物およびタンパク質を安定的に産生することができることを実証した。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の送達後の病理の改善
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積はバッテン病の進行に対する顕著な組織学的マーカーである（Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ－Ｍｏｌ Ｂａｓｉｓ Ｄｉｓ．２０１５；１８５２（１０）：２２３７－２２４１、Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０１２ Ｆｅｂ；７（１）：７９－９１、Ｓｅｅｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２００６；２７：５７６－５８８）。ＡＳＭの蓄積は、バッテン病の多くの形態に対する疾患進行の強力な指標である（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；３６（３７）：９６６９－９６８２、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４）。本明細書では、ＡＳＭの減少が治療の成功の指標として使用されることが企図される。
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積
自己蛍光貯蔵物質（ＡＳＭ）の蓄積はバッテン病の進行に対する顕著な組織学的マーカーである（Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ－Ｍｏｌ Ｂａｓｉｓ Ｄｉｓ．２０１５；１８５２（１０）：２２３７－２２４１、Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０１２ Ｆｅｂ；７（１）：７９－９１、Ｓｅｅｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２００６；２７：５７６－５８８）。ＡＳＭの蓄積は、バッテン病の多くの形態に対する疾患進行の強力な指標である（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；３６（３７）：９６６９－９６８２、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４）。本明細書では、ＡＳＭの減少が治療の成功の指標として使用されることが企図される。
処置後２、６、および１８ヶ月目に、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を注射したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、ＰＢＳ注射マウスと比較して、視床のＶＰＭ／ＶＰＬ核および脳の体性感覚皮質内のＡＳＭの蓄積を減少させた（図５、図３Ｃ）。ＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは１５ヶ月齢までに死亡するので（図９Ｄ）、瀕死の１２～１４ヶ月齢のＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスを、１８ヶ月齢のｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスとの比較として使用した。特に、これらの１８ヶ月齢のｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスにおけるＡＳＭ蓄積の量は、年齢マッチングした未処置野生型マウスと同程度であった。図９Ｅは、雄（左パネル）および雌（右パネル）ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置マウスが、年齢別に、野生型マウスと同様の体重を有するが、未処置のＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、研究の過程で減少することを実証している。ＰＢＳを注射したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウス（Ｃｌｎ６ｎｃｌｆＰＢＳ）は、およそ１０～１１ヶ月齢（雄）および１３～１４ヶ月齢（雌）で体重が減り始めた。
ミトコンドリアタンパク質ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積
ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積を、野生型、ＰＢＳ注射ＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスまたはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射Ｃｌｎ６ｎｌｃｆマウスからの脳組織において分析した。健康な個体では、このタンパク質はミトコンドリア膜の呼吸鎖の一部であるが、バッテン病を患っている患者では、このタンパク質はリソソームに異常に蓄積する（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスでは、野生型動物と比較して、視床の後内側腹側核および後外側腹側核（ＶＰＭ／ＶＰＬ領域）においてサブユニットＣの蓄積が２ヶ月齢までに明らかになり、これは、ＮＣＬマウスモデルでは多くの場合早期に影響を受ける脳領域である（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６）。２ヶ月、６ヶ月、および１８ヶ月齢で、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、ＰＢＳを注射したＣｌｎ６ｎｃｌｆ対照マウスと比較して、ＶＰＭ／ＶＰＬおよび脳の体性感覚皮質内のＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積のレベルを有意に減少した（図６；図３Ｃ；下部パネル）。
ＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積を、野生型、ＰＢＳ注射ＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスまたはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射Ｃｌｎ６ｎｌｃｆマウスからの脳組織において分析した。健康な個体では、このタンパク質はミトコンドリア膜の呼吸鎖の一部であるが、バッテン病を患っている患者では、このタンパク質はリソソームに異常に蓄積する（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスでは、野生型動物と比較して、視床の後内側腹側核および後外側腹側核（ＶＰＭ／ＶＰＬ領域）においてサブユニットＣの蓄積が２ヶ月齢までに明らかになり、これは、ＮＣＬマウスモデルでは多くの場合早期に影響を受ける脳領域である（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６）。２ヶ月、６ヶ月、および１８ヶ月齢で、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、ＰＢＳを注射したＣｌｎ６ｎｃｌｆ対照マウスと比較して、ＶＰＭ／ＶＰＬおよび脳の体性感覚皮質内のＡＴＰシンターゼサブユニットＣの蓄積のレベルを有意に減少した（図６；図３Ｃ；下部パネル）。
グリア細胞および星状細胞の活性化
貯蔵物質の異常な蓄積およびＡＴＰシンターゼサブＣの蓄積に加えて、ヒト患者および動物モデルの両方における疾患進行の他の組織学的マーカーには、星状細胞およびミクログリアの活性化が含まれる（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６、Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。特に、反応性ミクログリアは、ＣＬＮ６－バッテン病の後期における神経細胞死の主な原因であり得る、ＩＬ１－β２６などの炎症誘発性メディエーターを放出するようにプライミングされる。６ヶ月および１８ヶ月齢で、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、瀕死のＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較して、ＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質における星状細胞活性化（ＧＦＡＰ）およびミクログリア症（ＣＤ６８）を有意に減少した（それぞれ、図７および図８）。
貯蔵物質の異常な蓄積およびＡＴＰシンターゼサブＣの蓄積に加えて、ヒト患者および動物モデルの両方における疾患進行の他の組織学的マーカーには、星状細胞およびミクログリアの活性化が含まれる（Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１（２２）：２７０９－２７２１、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４、Ｐｏｎｔｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２００５；２０（３）：８２３－８３６、Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．１９９２；４２（４）：５６１－５６７）。特に、反応性ミクログリアは、ＣＬＮ６－バッテン病の後期における神経細胞死の主な原因であり得る、ＩＬ１－β２６などの炎症誘発性メディエーターを放出するようにプライミングされる。６ヶ月および１８ヶ月齢で、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、瀕死のＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較して、ＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質における星状細胞活性化（ＧＦＡＰ）およびミクログリア症（ＣＤ６８）を有意に減少した（それぞれ、図７および図８）。
図７は、活性化星状細胞が、６ヶ月および１８ヶ月の時点でグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について染色することによって、視床のＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質切片において特定されたことを実証している。グラフは、総ＧＦＡＰ＋免疫反応性を示す。
グリア活性化はまた、活性化ミクログリアのマーカーとして抗ＣＤ６８染色を使用して、ＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質切片において決定した。ＣＤ６８は、食作用などの炎症誘発性機能について初回刺激された細胞において上方制御されるリソソームタンパク質である（Ｓｅｅｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；２３０：１６９－１７２）。図８は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６注射が、６ヶ月齢のＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスの体性感覚皮質、ならびに１８ヶ月齢のＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスのＶＰＭ／ＶＰＬおよび体性感覚皮質の両方においてミクログリア症（ＣＤ６８反応性）を減少させることを実証する。グラフは、総ＣＤ６８＋免疫反応性を示す。図８の入口は、ミクログリアの形態を示した。これらの研究で分析された未処理のＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは瀕死であり、ミクログリアの多くはおそらく死にかけているか、または死んでおり、これがそれらの異常な形態に寄与することは注目に値する。まとめると、これらの結果は、出生後１日目にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６をＣＳＦに送達する単回注射が、Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの脳における古典的なＣＬＮ６－バッテン病の病状の多くを軽減または遅延させ得ることを示した。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の送達後の行動の改善
２ヶ月齢から開始し、２ヶ月間隔で継続するｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の有効性試験では、マウスは、運動機能および協調運動を試験するための加速ロータロッドアッセイおよびポールクライミング、ならびに学習および記憶を評価するためのモリス水迷路を含む、一連の行動試験パラダイムを受けた。動物は注射後２４ヶ月間追跡調査されており、研究は進行中である。
２ヶ月齢から開始し、２ヶ月間隔で継続するｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の有効性試験では、マウスは、運動機能および協調運動を試験するための加速ロータロッドアッセイおよびポールクライミング、ならびに学習および記憶を評価するためのモリス水迷路を含む、一連の行動試験パラダイムを受けた。動物は注射後２４ヶ月間追跡調査されており、研究は進行中である。
ロータロッドアッセイ
以前の研究は、ＣＬＮ６－バッテン病のＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスモデルが、ヒトに見られる運動障害、認知障害、および生存障害の多くを再現することを実証した（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４）。有効性試験において、協調運動の古典的な尺度としてロータロッドを使用して、ＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、野生型と比較して８ヶ月齢でロータロッド遂行能力の低下を示し始めた。しかし、Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６による注射は、この低下を防止し、効果は試験期間（２４ヶ月間）全体にわたって持続した（図９Ａ）。協調運動の効果をさらに詳細に研究するために、動物を、１２、１８、および２４ヶ月齢で様々な運動課題（後肢の握り、レッジ（ｌｅｄｇｅ）から自身を下降させる能力、および歩行評価）にかけ、スコア行列を使用して評価し、最も高いスコアが最悪の予後であった（Ｇｕｙｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１０３９）。ＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較して、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したマウスは、全ての時点で有意に低い総合スコアを示し、それらのスコアは２４ヶ月齢でわずかに増加した（図９Ｂ）。
以前の研究は、ＣＬＮ６－バッテン病のＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスモデルが、ヒトに見られる運動障害、認知障害、および生存障害の多くを再現することを実証した（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１１）：ｅ７８６９４）。有効性試験において、協調運動の古典的な尺度としてロータロッドを使用して、ＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、野生型と比較して８ヶ月齢でロータロッド遂行能力の低下を示し始めた。しかし、Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６による注射は、この低下を防止し、効果は試験期間（２４ヶ月間）全体にわたって持続した（図９Ａ）。協調運動の効果をさらに詳細に研究するために、動物を、１２、１８、および２４ヶ月齢で様々な運動課題（後肢の握り、レッジ（ｌｅｄｇｅ）から自身を下降させる能力、および歩行評価）にかけ、スコア行列を使用して評価し、最も高いスコアが最悪の予後であった（Ｇｕｙｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１０３９）。ＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較して、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したマウスは、全ての時点で有意に低い総合スコアを示し、それらのスコアは２４ヶ月齢でわずかに増加した（図９Ｂ）。
モリス水迷路試験
モリス水迷路試験では、動物を、隠れたプラットフォームを含む水で満たされたプールに置いた。訓練の後、方向定位のために環境の手がかりを使って隠されたプラットフォームを見つけるのに動物がかかった時間を、学習および記憶能力の兆候として測定した。
モリス水迷路試験では、動物を、隠れたプラットフォームを含む水で満たされたプールに置いた。訓練の後、方向定位のために環境の手がかりを使って隠されたプラットフォームを見つけるのに動物がかかった時間を、学習および記憶能力の兆候として測定した。
ＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、９ヶ月齢で開始する課題ではうまく機能せず、これは、隠れたプラットフォームを見つけるこれらの能力の低下により示された（図９Ｃ）。ＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの水泳速度は、１１および１２ヶ月齢で有意に低下したので、これらの後の時点では、それらの記憶および学習能力についていかなる結論も引き出すことができなかった（図１０Ａ）。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６によるＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスの処置は、注射後最長１２ヶ月までにこの記憶および学習障害を矯正した（図９Ｃ）。野生型マウスをｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置動物とモリス水迷路試験のより遅い時点でのみ比較した場合、処置マウスでさえも１８ヶ月および２４ヶ月の時点でプラットフォームを見つけるのにより多くの時間が必要であり、一方水泳速度は、全ての試験群間で同じであった（図９Ｃ、図１０）。後の時点で記憶および学習を評価するために、マウスに、１２ヶ月、１８ヶ月、および２４ヶ月齢で、プラットフォームを新しい場所に移動した水迷路反転試験を受けさせた。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で処置したＣｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、この試験と同様に、野生型マウスと比較して新しいプラットフォームの場所を見つけるために、かなり時間がかかった（図１０）。まとめると、これらの結果は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の単回処置が、これらの動物で見られる運動低下の多くを防止したが、マウスをその後の時点で試験したときに記憶および学習障害を完全に回避しないことを示す。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の送達後の生存における改善
Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、それらの野生型対応物と比較して生存が低下していることが知られている（Ｇｕｙｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１０３９）。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６およびＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの生存を、ＰＢＳ注射野生型マウスと比較した。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスのＣＳＦへのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の単回ＩＣＶ注射は、ＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較してそれらの生存を有意に増加させた（図９Ｄ）。ＰＢＳ処置マウスの生存期間中央値は１４ヶ月であったが、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは２１．５ヶ月の生存期間中央値を有した。生存率のこの６５％の増加は非常に有意であった。さらに、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの生存曲線は、野生型動物と有意差がなかった。
Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは、それらの野生型対応物と比較して生存が低下していることが知られている（Ｇｕｙｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１０３９）。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６およびＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの生存を、ＰＢＳ注射野生型マウスと比較した。Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスのＣＳＦへのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の単回ＩＣＶ注射は、ＰＢＳ注射Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスと比較してそれらの生存を有意に増加させた（図９Ｄ）。ＰＢＳ処置マウスの生存期間中央値は１４ヶ月であったが、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスは２１．５ヶ月の生存期間中央値を有した。生存率のこの６５％の増加は非常に有意であった。さらに、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆマウスの生存曲線は、野生型動物と有意差がなかった。
さらに、全体的な健康の尺度として、体重を毎月記録した。野生型動物と比較して差は観察されなかったが、健康状態および生存の改善はまた、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６処置マウスのそれらの体重を維持する能力によっても強調されたが、一方ＰＢＳ処置Ｃｌｎ６ｎｃｌｆは、約１０～１２ヶ月で減量し始めた（図９Ｅ）。
ＰＢＳで処置した１７２匹の野生型マウスおよび５×１０１０ｖｇ／動物で処置した２２３匹の野生型マウスを用いた安全性試験を行った。この試験は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６が最長２４週間まで良好な耐容性を示し、ウイルスに起因する悪影響がないことを実証した（データは図示せず）。まとめると、これは現在までのＣＬＮ６ｎｃｌｆマウスモデルにおける最長の生存期間延長であり、ＣＬＮ６－バッテン病の細胞障害および機能障害の両方を回復させるためのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の単回治療の有用性を示している。
実施例３
非ヒト霊長類におけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の安全性試験
ヒト患者により関連性のある大型動物モデルにおいてこの治療の安全性を試験するために、３匹の４歳の雄カニクイザルに、１×ＰＢＳおよび０．００１％のプルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を投与した。
非ヒト霊長類におけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の安全性試験
ヒト患者により関連性のある大型動物モデルにおいてこの治療の安全性を試験するために、３匹の４歳の雄カニクイザルに、１×ＰＢＳおよび０．００１％のプルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を投与した。
動物を注射後１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月で殺処分した。各個体に１回の腰椎髄腔内注射を行い、動物１匹あたり６×１０１３ウイルス粒子の用量でウイルスベクターをＣＳＦに直接送達した。注射後、脳および上部脊髄領域の標的化を容易にするために、動物をトレンデレンブルグ体位に１５分間、頭を４５度の角度で下向きにして、保持した。
全ての対象は注射からよく回復し、異常な行動を示さなかった。血液学および血清化学的検査を、試験の間の最大で５つの時点（ベースライン、１、２、３および６ヶ月）で行い、大きな異常は明らかにはならなかった。特に、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはアルカリリン酸酵素レベルの上昇の証拠は見られなかったが、一方アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は注射後１ヶ月で１匹の動物においてわずかに増加した（１リットルあたり２００単位未満）（図１１Ｃ）。
総タンパク質レベル、クレアチニン、トリグリセリド、グルコース、またはリン、カルシウム、マグネシウムもしくはナトリウムレベルなどのイオンに変化は見られなかった。殺処分した時点で、各動物について広範な病理組織学ならびに導入遺伝子発現解析を行った。剖検時に、様々な脳および脊髄領域、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、骨格筋（横隔膜、上腕三頭筋、ＴＡ、腓腹筋）、膀胱感染症を示した動物以外の性腺を含む、分析した組織に異常は見られなかった。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を脳脊髄液に送達する単回の腰椎髄腔内注射は、蛍光ウエスタンブロットによって示されるように、非ヒト霊長類の脳および脊髄全体に導入遺伝子の高発現を誘導した。図１１Ａのブロットは、皮質、脳梁、脳室周囲白質、海馬、小脳、視床、頸髄、胸髄、腰髄中のＣＬＮ６発現を示し、導入遺伝子の高発現は、全ての３匹の動物において、脳および脊髄全体で見られた（図１１Ａ～Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６による治療が、試験された３つの個体全てで良好な耐容性を示し、かつ安全であった。
実施例４
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子治療の臨床試験
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６は、ＣＬＮ６－バッテン病のヒト患者に髄腔内で送達される。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子治療の臨床試験
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６は、ＣＬＮ６－バッテン病のヒト患者に髄腔内で送達される。
臨床試験用のｓｃＡＡＶは、実施例１に記載されているようにＧＭＰ条件下で、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクション法を利用して、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ臨床製造施設により製造された。
参加のために選択された患者は、遺伝子型によって決定されるＣＬＮ６疾患と診断された１歳またはそれ以上であった。第１のコホート（ｎ＝１２）は、患者あたり１．５×１０１３ｖｇの総ｓｃＡＡＶの一回限りの遺伝子導入用量を受けた。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、および約２０％～約４０％の非イオン性低浸透圧性化合物に配合され、腰椎穿刺によって挿入された髄腔内カテーテルを介して、腰椎嚢（ｌｕｍｂａｒ ｔｈｅｃａｌ ｓａｃ）のくも膜下腔に至る棘突起間へ一回だけ送達された。安全性は、臨床的根拠に基づき、かつ安全性ラベルを検討することにより評価された。遺伝子導入後３０日目の安全性データの検討を可能にするために、各被験者の登録の間に最低４週間があった。
本明細書に提供された予備データは、治療された１０人の患者について報告し、平均追跡期間は１２ヶ月間（治療後１～２４ヶ月間の範囲）であった。予備データは、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の投与が一般に耐容性が良好であることを実証した。有害事象の大部分は軽度であり、治療とは無関係であった。観察されたいかなるＴ細胞応答および抗体上昇も、臨床症状とは関係がなく、治療における変更は必要とされなかった。
図１２は、研究中の２つの研究中の兄弟ペアにおける注射後のハンブルグ運動および言語尺度によって測定された疾患進行を報告する予備的データを提供する。これらの兄弟ペアは同じｇＣＬＮ６変異遺伝子型を有する。
２４ヶ月のフェーズ有効性研究
本明細書に提供されているのは、進行中の臨床研究のために治療された８人の患者のデータである。本明細書に記載の８人の患者は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を投与され、少なくとも１７ヶ月間曝露された。これらの８人の患者のベースライン情報を以下に示す。
本明細書に提供されているのは、進行中の臨床研究のために治療された８人の患者のデータである。本明細書に記載の８人の患者は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６を投与され、少なくとも１７ヶ月間曝露された。これらの８人の患者のベースライン情報を以下に示す。
進行中の２４か月の臨床研究からのデータは、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６の単回髄腔内投与が一般的に耐容性良好であったことを示した。１３７件の有害事象が報告された。有害事象（ＡＥ）の大部分は軽度であり、治療とは無関係であった。４人の患者で報告された９つのグレード３（重度）の有害事象（ＳＡＥとして示される）があった。９つのＳＡＥのうち３つは、治療に関連している可能性があると考えられた。関連する事象には、嘔吐（２）、上腹部痛（１）、および発熱（１）が含まれ、４人の患者全員が回復した。グレード４（生命を脅かす）またはグレード５（死亡）の有害事象は報告されなかった。抗ＡＡＶ９キャプシドまたは抗ＣＬＮ６免疫原性に関連する有害事象のパターンはなかった。
図１５は、運動機能および言語機能へのプラスの影響を示す有効性データを示している。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で治療された患者の８人中７人では、ハンブルグスコアが維持されたか、または最初の変化（＋１～－１ポイント）に続いて安定した。この研究の最年長の患者（７９ヶ月齢で治療）は２ポイント低下した。自然歴データは、症状の発症後２４ヶ月間で、ハンブルグ運動および言語が２～３ポイント低下することを示唆している。
図１６Ａ～Ｃは、全てＣＬＮ６疾患を患っている兄弟の比較データを提供する。治療を受けた患者は、運動能力および言語能力の大幅な低下を経験した、または同じ期間に死亡した未治療の兄弟と比較して安定化を示した。これらのデータは、経時的なハンブルグスコア：運動＋言語として提供される。図１６Ａは、集計スコアを提供し、図１６Ｂはハンブルグ運動サブスコアを提供し、図１６Ｃはハンブルグ言語サブスコアを提供する。
図１２Ａ～Ｃは、両方ともｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で治療された研究中ペアの研究中の兄弟比較データを提供する。これらのデータは、より若い兄弟が、最初の変化に続いて安定したより年上の兄弟と比較して、ハンブルグ運動および言語スコアの増加または安定化を実証したことを示した。図１２Ａは、集計スコアを提供し、図１２Ｂはハンブルグ運動サブスコアを提供し、図１２Ｃはハンブルグ言語サブスコアを提供する。
図１７は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６で治療された最初の８人の患者のデータを、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ｎ＝１４）が実施したＣＬＮ６患者の進行中の自然歴研究のデータと比較している。示されているのは、ハンブルグ運動および言語機能の総合スコアで２ポイント以上のベースラインから逆転せずに減少するまでの時間のカプランマイヤー曲線である。信頼帯は、生存確率の推定値およびその標準誤差を使用して計算される。この図は、２年間にわたって治療群と自然歴群のハンブルグ運動および言語の総合スコアが≧２ポイント低下した患者を比較し、（ｉ）１４人の自然歴の未治療の患者全てと比較して、治療を受けた患者１人のみが期間に２ポイント以上の低下を達成した、および（ｉｉ）治療を受けた患者の未治療の患者からの実質的な分離、を含めて、本発明の治療の有効性を裏付ける結果を伝えている。
要約すると、２４か月の有効性データは、以下を示した：ｉ）運動能力および言語能力の急速な低下を経験した未治療の兄弟とは対照的に、疾患の安定化、ｉｉ）より若い患者はスコアの増加または安定化を示した、ｉｉｉ）より年長の患者の大多数は、最初の変化とそれに続く安定化を示した。加えて、治療は一般的に耐容性良好であった。
用量漸増試験
安全性の懸念がなければ、注射後１ヶ月で第１のコホートが評価された後、追加被験者が登録されることになる。コホート２における各被験者（ｎ＝４）は、ウイルスベクターの漸増用量を受けることになる。次の被験者への投与の前に、５つの時点（１、２、７、１４、および２１日目）からの安全性分析の検討ならびにＤＳＭＢ検討を可能にするために、コホート１の完了からコホート２の開始までの間に少なくとも６週間のウィンドウがある。
安全性の懸念がなければ、注射後１ヶ月で第１のコホートが評価された後、追加被験者が登録されることになる。コホート２における各被験者（ｎ＝４）は、ウイルスベクターの漸増用量を受けることになる。次の被験者への投与の前に、５つの時点（１、２、７、１４、および２１日目）からの安全性分析の検討ならびにＤＳＭＢ検討を可能にするために、コホート１の完了からコホート２の開始までの間に少なくとも６週間のウィンドウがある。
疾患進行は、ＵＢＤＲＳ尺度またはハンブルグ運動および言語尺度（上記の発明を実施するための形態において言及した）および小児生活の質（ＰＥＤＳＱＯＬ）尺度を使用する生活の質に対する治療の影響、および長期生存の可能性を用いて測定される。
全ての患者が３年間の試験を完了したときに、有効性に関する一次分析が評価される。有効性を決定する根拠は、ＣＬＮ６－バッテン病のために特別に開発された確立された統一バッテン病評価尺度（ＵＢＤＲＳ）またはハンブルグ運動および言語尺度に基づいて、疾患の安定化または進行の減少によるものである。３年間の研究期間が完了すると、ＦＤＡガイダンスに従って、患者は５年間にわたって毎年監視される。
実施例５
自然歴研究は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子治療が運動および言語スコアを改善することを立証する
経時的な臨床経過に関して、研究対象（ＣＬＮ６遺伝子導入研究の最初の患者（ｎ＝８））と自然歴対象との比較を容易にするために、遺伝子導入患者の総合したハンブルグ尺度運動（Ｍ）および言語（Ｌ）スコアを、後向きなＣＬＮ６自然歴研究（ＰＩ：Ｅｍｉｌｙ ｄｅ ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ、ＭＤ；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３２８５４２５）で患者について収集された総合したハンブルグ尺度運動および言語スコアデータとマッチングさせた。遺伝子導入患者は、ベースラインのハンブルグ運動および言語スコアならびに比較時（１２ヶ月以内）の年齢に基づいて、自然歴患者とマッチングされた。
自然歴研究は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子治療が運動および言語スコアを改善することを立証する
経時的な臨床経過に関して、研究対象（ＣＬＮ６遺伝子導入研究の最初の患者（ｎ＝８））と自然歴対象との比較を容易にするために、遺伝子導入患者の総合したハンブルグ尺度運動（Ｍ）および言語（Ｌ）スコアを、後向きなＣＬＮ６自然歴研究（ＰＩ：Ｅｍｉｌｙ ｄｅ ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ、ＭＤ；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３２８５４２５）で患者について収集された総合したハンブルグ尺度運動および言語スコアデータとマッチングさせた。遺伝子導入患者は、ベースラインのハンブルグ運動および言語スコアならびに比較時（１２ヶ月以内）の年齢に基づいて、自然歴患者とマッチングされた。
ハンブルグ運動および言語スコア（ｎ＝８）の総合データおよび個別データのデータは、ＣＬＮ６遺伝子治療が疾患の進行を停止または大幅に遅らせ、８人中７人の患者の運動および言語機能にプラスの影響を与えることを示している（図１８）。プラスの影響とは、ハンブルグ総合スコアを維持した患者、または最初の変化（＋１～－１ポイント）に続いて安定した患者を指す。個別の運動および言語スコアは、それぞれの総合スコアと一致していた。
自然歴マッチングした比較のデータは、ハンブルグ運動および言語のスコアの改善も示している（図１９）。多対１（ｍａｎｙ－ｔｏ－ｏｎｅ）のマッチング方法論により、最後の時点での遺伝子導入患者の、それぞれのハンブルグ運動および言語値（緑色でプロット）に対し、（それぞれの遺伝子導入患者に対する）比較期間の最後の時点でマッチングされた自然歴患者の平均のハンブルグ運動および言語スコアが赤でプロットされる（図１９）。各比較における自然歴患者の数は、最後の時点でのハンブルグ運動および言語スコアの差（遺伝子導入患者とＮＨ患者の平均値との間）とともに各図に示される。Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＤｒ．Ｅｍｉｌｙ ｄｅ ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓによる研究でＣＬＮ６－バッテン病患者（ｎ＝１１）について収集された自然歴データは、２歳から７歳までの１年ごとのハンブルグ運動＋言語スコアが、かなり直線的でほぼ持続的に１ポイント低下することを示している（図２０）。
全体として、これらの研究からのデータは、ＣＬＮ６遺伝子導入患者の大多数が、マッチングした自然歴患者と比較して運動および言語スコアの改善を示していることを示している。
実施例６
Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度解析
Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）を使用して、ｓｃＡＡＶ．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子治療が１２～２４ヶ月にわたって患者の学習能力を改善したかどうかを評価した。ＭＳＥＬは、出生から６８ヶ月までの子供に使用されるように設計された、個別に管理され、標準化された認知機能の測定値である。ＭＳＥＬの下位尺度は、粗大運動、微細運動、受容言語、表出言語、および早期学習コンポジットである。（Ｍｕｌｌｅｎ ＥＭ．（１９９５）．Ｍｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇ（ＡＧＳ ｅｄ．）．Ｃｉｒｃｌｅ Ｐｉｎｅｓ，ＭＮ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃを参照されたい）。
Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度解析
Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）を使用して、ｓｃＡＡＶ．ＣＢ．ＣＬＮ６遺伝子治療が１２～２４ヶ月にわたって患者の学習能力を改善したかどうかを評価した。ＭＳＥＬは、出生から６８ヶ月までの子供に使用されるように設計された、個別に管理され、標準化された認知機能の測定値である。ＭＳＥＬの下位尺度は、粗大運動、微細運動、受容言語、表出言語、および早期学習コンポジットである。（Ｍｕｌｌｅｎ ＥＭ．（１９９５）．Ｍｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇ（ＡＧＳ ｅｄ．）．Ｃｉｒｃｌｅ Ｐｉｎｅｓ，ＭＮ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃを参照されたい）。
次の４つのドメインが８人の患者で分析された：視覚受容、微細運動、受容言語、および表出言語。図２１Ａおよび２１Ｂは、４つのドメインの生のスコアを提示する。スコアが高いほど、機能が高いことを示す。
概要
暫定的な安全性および有効性のデータは、ＡＡＶ９－ＣＬＮ６遺伝子治療が異型の乳児期後期発症ＣＬＮ６バッテン病の進行を安定化させる可能性があることを示唆している。有効性の結果は、運動および言語機能における有意義な治療効果を示した。ＡＡＶ９－ＣＬＮ６治療を受けた患者は、未治療の兄弟および、年齢とハンブルグ運動および言語のベースラインスコアをマッチングした自然歴患者の平均値と比較してハンブルグ運動および言語スコアの改善を示した。治療を受けたより若い兄弟とより年長の兄弟の比較は、ＡＡＶ９－ＣＬＮ６による遺伝子治療の早期介入の潜在的な利点をさらに裏付けている。より若い治療を受けた患者は、ＭＳＥＬスケールで示されるように認知技能の改善または安定化を示した。
暫定的な安全性および有効性のデータは、ＡＡＶ９－ＣＬＮ６遺伝子治療が異型の乳児期後期発症ＣＬＮ６バッテン病の進行を安定化させる可能性があることを示唆している。有効性の結果は、運動および言語機能における有意義な治療効果を示した。ＡＡＶ９－ＣＬＮ６治療を受けた患者は、未治療の兄弟および、年齢とハンブルグ運動および言語のベースラインスコアをマッチングした自然歴患者の平均値と比較してハンブルグ運動および言語スコアの改善を示した。治療を受けたより若い兄弟とより年長の兄弟の比較は、ＡＡＶ９－ＣＬＮ６による遺伝子治療の早期介入の潜在的な利点をさらに裏付けている。より若い治療を受けた患者は、ＭＳＥＬスケールで示されるように認知技能の改善または安定化を示した。
本明細書では本発明の好ましい実施形態を示し、記載してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を思い付くであろう。本明細書に記載の実施形態に対する様々な代替形態を採用してもよいことを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Claims (76)
- ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）であって、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１の前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むｓｃＡＡＶ９ゲノムを含む、自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）。
- 前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、ＣＭＶエンハンサ、配列番号３の前記ヌクレオチド配列を含むＣＢプロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１の前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項１に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の前記配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１の前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項１に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ｓｃＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の前記核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、一本鎖ゲノムを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３の配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む核酸分子。
- 第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＣＢプロモーター、ＳＶ４０イントロン、配列番号１の前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする核酸配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
- 第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号３のヌクレオチド配列を含むＣＢプロモーター、配列番号１の前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする核酸配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
- 前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記核酸が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 配列番号４の核酸配列を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項１１～１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む自己相補的組換えアデノ随伴ウイルス９（ｓｃＡＡＶ９）。
- 前記ｓｃＡＡＶ９が、一本鎖ゲノムを含む、請求項２０に記載のｓｃＡＡＶ９。
- 請求項１１～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ粒子。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、一本鎖ゲノムを含む、請求項２２に記載のｒＡＡＶ粒子。
- ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）ウイルス粒子であって、５’から３’の順序で、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むＣＭＶエンハンサ、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含むニワトリβ－アクチンプロモーター、および配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、自己相補的ゲノムを含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、一本鎖ゲノムを含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む前記ＣＭＶエンハンサ、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む前記ニワトリβ－アクチンプロモーター、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＳＶ４０イントロンをさらに含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＢＧＨポリＡ配列をさらに含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子。
- ５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を有するＣＭＶエンハンサ、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を有するニワトリβ－アクチンプロモーター、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含むｒＡＡＶ９ゲノムを含む、核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、自己相補的ゲノムを含む、請求項３４に記載の核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、一本鎖ゲノムを含む、請求項３４に記載の核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、５’から３’の順序で、第１のＡＡＶ逆方向末端反復、配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を有する前記ＣＭＶエンハンサ、配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の核酸配列を有する前記ニワトリβ－アクチンプロモーター、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、および第２のＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ＣＬＮ６ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、配列番号４と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ＡＡＶ逆方向末端反復が、ＡＡＶ２逆方向末端反復である、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＳＶ４０イントロンをさらに含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが、ＢＧＨポリＡ配列をさらに含む、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９、請求項１１～１９、３１または３４～４３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、組成物。
- 前記賦形剤が、非イオン性低浸透圧性化合物、緩衝剤、ポリマー、塩、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４４に記載の組成物。
- 対象におけるＣＬＮ６－バッテン病を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項１１～１９、３１もしくは３４～４３のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４４もしくは請求項４５に記載の組成物、を含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記組成物が、髄腔内、脳室内、脳実質内、静脈内、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される経路を介して投与される、請求項４６に記載の方法。
- 前記組成物が、髄腔内投与される、請求項４７に記載の方法。
- 前記組成物が、脳室内投与される、請求項４７に記載の方法。
- 前記組成物が、静脈内投与される、請求項４７４６に記載の方法。
- 約１×１０１１～約１×１０１５ｖｇの前記ｒＡＡＶ９ウイルス粒子が投与される、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 約１×１０１２～約１×１０１４の前記ｒＡＡＶ９ウイルス粒子が投与される、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療が、未治療のＣＬＮ－６バッテン病患者と比較すると、
（ａ）脳容積の減少、
（ｂ）認知機能の喪失、および
（ｃ）言語の遅れから選択される、
ＣＬＮ６－バッテン病の１つ以上の症状を安定化または遅延させる、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記治療が、ＣＬＮ－６バッテン病の疾患進行を安定化または遅延させる、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患進行が、ＵＢＤＲＳ尺度、ハンブルグ運動および言語尺度、小児の生活の質（ＰＥＤＳＱＯＬ）尺度を使用した生活の質に対する治療の影響、Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）、長期生存の可能性、またはこれらの組み合わせで評価される、請求項５４に記載の方法。
- 前記対象が、８０ヶ月以下、７５ヶ月以下、７０ヶ月以下、６５ヶ月以下、６２ヶ月以下、６０ヶ月以下、５５ヶ月以下、５０ヶ月以下、または４０ヶ月以下の年齢である、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ９ウイルス粒子の投与後に、前記対象をトレンデレンベルク体位に置くことをさらに含む、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
- ＣＬＮ６疾患の治療を必要とする患者におけるＣＬＮ６疾患を治療する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項１１～１９、３１もしくは３４～４３３４のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４４もしくは請求項４５に記載の組成物、を含む組成物を、それを必要とする患者の脳または脊髄に送達することを含む、方法。
- 前記組成物が、髄腔内、脳室内、脳実質内、もしくは静脈内注射、またはこれらの組み合わせによって送達される、請求項５５に記載の方法。
- 前記組成物の髄腔内注射後に、前記患者をトレンデレンベルク体位に置くことをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
- 前記組成物が、非イオン性低浸透圧性造影剤を含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非イオン性低浸透圧性造影剤が、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５８６１に記載の方法。
- 脳または脊髄に前記送達することが、脳幹への送達を含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 脳または脊髄に前記送達することが、小脳への送達を含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 脳または脊髄に前記送達することが、視覚野への送達を含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 脳または脊髄に前記送達することが、運動皮質への送達を含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 脳または脊髄に前記送達することが、神経細胞、グリア細胞、または両方への送達を含む、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の方法。
- 脳または脊髄への前記送達することが、神経系の細胞への送達を含み、前記神経系の前記細胞が、ニューロン、下位運動ニューロン、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療が、未治療のＣＬＮ－６バッテン病患者と比較すると、
（ａ）脳容積の減少、
（ｂ）認知機能の喪失、および
（ｃ）言語の遅れから選択される、
ＣＬＮ６－バッテン病の１つ以上の症状を安定化または遅延させる、請求項５８～６８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記治療が、ＣＬＮ－６バッテン病の疾患進行を安定化または遅延させる、請求項５８～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患進行が、ＵＢＤＲＳ尺度、ハンブルグ運動および言語尺度、小児の生活の質（ＰＥＤＳＱＯＬ）尺度を使用した生活の質に対する治療の影響、Ｍｕｌｌｅｎの早期学習尺度（ＭＳＥＬ）、長期生存の可能性、またはこれらの組み合わせで評価される、請求項７０に記載の方法。
- 前記患者が、８０ヶ月以下、７５ヶ月以下、７０ヶ月以下、６５ヶ月以下、６２ヶ月以下、６０ヶ月以下、５５ヶ月以下、５０ヶ月以下、または４０ヶ月以下の年齢である、請求項５８～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 対象におけるＣＬＮ６－バッテン病を治療するための薬剤を調製するための、治療有効量の、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項１１～１９、３１もしくは３４～４３のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４４もしくは請求項４５に記載の組成物、の使用。
- 対象におけるＣＬＮ６－バッテン病を治療するための、治療有効量の、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ９、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項１１～１９、３１もしくは３４～４３のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４４もしくは請求項４５に記載の組成物を含む、組成物。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項１１～１９、３１もしくは３４～４３３４のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４４もしくは請求項４５に記載の組成物、を含む組成物の使用であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子、核酸、または組成物を、それを必要とする患者の脳または脊髄に送達するための薬剤を調製するための、使用。
- ＣＬＮ６疾患の治療を必要とする患者におけるＣＬＮ６疾患を治療するための組成物であって、前記組成物が、組成物を必要とする患者の脳または脊髄に対する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＡＡＶ、請求項２２～３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ９ウイルス粒子、請求項１１～１９、３１または３４～４３３４のいずれか一項に記載の核酸、または請求項４４もしくは請求項４５に記載の組成物、を含む、組成物。
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