BR112021015150A2 - Entrega de vírus adenoassociado de polinucleotídeo de cln6 - Google Patents
Entrega de vírus adenoassociado de polinucleotídeo de cln6 Download PDFInfo
- Publication number
- BR112021015150A2 BR112021015150A2 BR112021015150-8A BR112021015150A BR112021015150A2 BR 112021015150 A2 BR112021015150 A2 BR 112021015150A2 BR 112021015150 A BR112021015150 A BR 112021015150A BR 112021015150 A2 BR112021015150 A2 BR 112021015150A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- nucleic acid
- seq
- acid sequence
- cln6
- aav
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 68
- 208000002537 Neuronal Ceroid-Lipofuscinoses Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 208000031277 Amaurotic familial idiocy Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 208000017476 juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 201000007607 neuronal ceroid lipofuscinosis 3 Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 208000033939 neuronal 6A ceroid lipofuscinosis Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 201000007655 neuronal ceroid lipofuscinosis 6 Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 134
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 81
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 71
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 60
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 56
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 54
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 51
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 44
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 42
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 42
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 41
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 35
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 26
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 24
- 208000033436 CLN6 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 16
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 16
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims description 15
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims description 15
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 13
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 13
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 9
- 230000001934 delay Effects 0.000 claims description 8
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 8
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 claims description 6
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 5
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 4
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 claims description 4
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000857 visual cortex Anatomy 0.000 claims description 4
- AMDBBAQNWSUWGN-UHFFFAOYSA-N Ioversol Chemical compound OCCN(C(=O)CO)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I AMDBBAQNWSUWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000030979 Language Development disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 229960004108 iobitridol Drugs 0.000 claims description 3
- YLPBXIKWXNRACS-UHFFFAOYSA-N iobitridol Chemical compound OCC(O)CN(C)C(=O)C1=C(I)C(NC(=O)C(CO)CO)=C(I)C(C(=O)N(C)CC(O)CO)=C1I YLPBXIKWXNRACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001025 iohexol Drugs 0.000 claims description 3
- NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N iohexol Chemical compound OCC(O)CN(C(=O)C)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000780 iomeprol Drugs 0.000 claims description 3
- NJKDOADNQSYQEV-UHFFFAOYSA-N iomeprol Chemical compound OCC(=O)N(C)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NJKDOADNQSYQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004647 iopamidol Drugs 0.000 claims description 3
- XQZXYNRDCRIARQ-LURJTMIESA-N iopamidol Chemical compound C[C@H](O)C(=O)NC1=C(I)C(C(=O)NC(CO)CO)=C(I)C(C(=O)NC(CO)CO)=C1I XQZXYNRDCRIARQ-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 3
- 229960000824 iopentol Drugs 0.000 claims description 3
- IUNJANQVIJDFTQ-UHFFFAOYSA-N iopentol Chemical compound COCC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I IUNJANQVIJDFTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002603 iopromide Drugs 0.000 claims description 3
- DGAIEPBNLOQYER-UHFFFAOYSA-N iopromide Chemical compound COCC(=O)NC1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)N(C)CC(O)CO)=C1I DGAIEPBNLOQYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004537 ioversol Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 15
- 201000008051 neuronal ceroid lipofuscinosis Diseases 0.000 abstract description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 105
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 61
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 31
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 29
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 101000710215 Homo sapiens Ceroid-lipofuscinosis neuronal protein 6 Proteins 0.000 description 21
- 102000045627 human CLN6 Human genes 0.000 description 21
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 16
- 210000004092 somatosensory cortex Anatomy 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 13
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 13
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 13
- 101710125656 ATP synthase c subunit Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 12
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 10
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 10
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 9
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 9
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 8
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 8
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 6
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 5
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 4
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 4
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 4
- 101150104491 CLN6 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 4
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 4
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 230000004914 glial activation Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 210000003520 dendritic spine Anatomy 0.000 description 3
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007388 microgliosis Effects 0.000 description 3
- 230000004973 motor coordination Effects 0.000 description 3
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000877 corpus callosum Anatomy 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000010825 rotarod performance test Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 210000002071 ventral thalamic nuclei Anatomy 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 125000000981 3-amino-3-oxopropyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 102000013379 Mitochondrial Proton-Translocating ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108010026155 Mitochondrial Proton-Translocating ATPases Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical group C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101100409194 Rattus norvegicus Ppargc1b gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 210000001056 activated astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000017478 adult neuronal ceroid lipofuscinosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000576 arachnoid Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 230000008133 cognitive development Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011833 dog model Methods 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N isoglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CC(O)=O BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000025014 late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 210000005230 lumbar spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010045758 lysosomal proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- HHRZAEJMHSGZNP-UHFFFAOYSA-N mebanazine Chemical compound NNC(C)C1=CC=CC=C1 HHRZAEJMHSGZNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical group [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008111 motor development Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002103 osmometry Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 231100000279 safety data Toxicity 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;prop-2-enamide Chemical compound [Na+].NC(=O)C=C.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002330 subarachnoid space Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
entrega de vírus adenoassociado de polinucleo de cln6. a presente invenção refere-se à entrega de vírus adenoassociado recombinante (raav) de um polinucleotídeo de lipofuscinose ceroide neuronal 6 (cln6). a presente invenção se refere, ainda, a raav e métodos para usar o raav para terapia gênica de cln6 da lipofuscinose ceroide neuronal ou doença de batten cln6.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENTREGA DE VÍRUS ADENOASSOCIADO DE POLINUCLEOTÍDEO DE CLN6".
[0001] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/800.915, depositado em 4 de fevereiro de 2019, Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/880.641, depositado em 30 de julho de 2019, Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/881.151, depositado em 31 de julho de 2019, Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/912.977, depositado em 9 de outubro de 2019, e Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/923.125, depositado em 18 de outubro de 2019, todos esses pedidos são incorporados a este docu- mento a título de referência em sua totalidade.
[0002] Este pedido contém, como uma parte separada da divulga- ção, uma Listagem de Sequências em forma legível por computador (nome do arquivo: 53894 SegqListing.txt; 24.923 bytes — arquivo de texto ASCII criado em 31 de janeiro de 2020) que está incorporada a título de referência ao presente documento em sua totalidade.
[0003] A presente divulgação refere-se à entrega de vírus adeno- associado recombinante (rAAV) de um polinucleotídeo de lipofuscino- se ceroide neuronal 6 (CLN6). A divulgação fornece rAAV e métodos para usar o rAAV para terapia gênica de CLNG6 da lipofuscinose ceroi- de neuronal ou doença de Batten CLN6.
[0004] Lipofuscinoses ceroides neuronais (NCLs) são um grupo de graves distúrbios neurodegenerativos, que são coletivamente denomi- nados doença de Batten. Esses distúrbios afetam o sistema nervoso e provocam, tipicamente, problemas cada vez mais graves com, por exemplo, movimento e capacidade de raciocínio. As NCLs diferentes são distinguidas por sua causa genética.
[0005] A doença de Batten CLN6 pode ocorrer como duas formas diferentes: NCL infantil tardia variante (vVLINCL), a forma mais comum, e de início adulto (também denominada doença de Kufs tipo A) (Can- nelii et al., Biochem Biophys Res Commun. 2009;379(4):892 a 897, Arsov et al., Am J Hum Genet. 2011;88(5):566 a 573). Com vLINCL (denominada, aqui, doença de Batten CLNG6), a idade de início é entre 18 meses e seis anos, e a morte ocorre, tipicamente, pela idade de 12 a 15 anos. A doença de Batten CLN6 se apresenta, inicialmente, como linguagem deficiente e desenvolvimento motor/cognitivo retardado na primeira infância, em que a maioria dos pacientes está de cadeira de rodas dentro de quatro anos do início da doença (Canafoglia et al., Neurology. 2015;85(4):316 a 324). A doença avança para incluir perda visual, graves deficiências motoras, convulsões recorrentes, demência e outros sintomas neurodegenerativos.
[0006] CLN6 é uma proteína de 311 aminoácidos com sete domí- nios de transmembrana previstos, e está predominantemente localiza- da no retículo endoplasmático. Como com outras proteínas de CLN, sua função exata permanece confusa; no entanto, foi implicada no trá- fego intracelular e função lisossômica. Atualmente existem mais de 70 mutações que provocam doenças caracterizadas em CLN6 (Warrier et al., Biochimica et Biophysica Acta. 2013;1832(11):1827 a 1830) em que a maioria dessas mutações resulta em uma perda completa de proteína de CLN6 ou produção de produtos de proteína de CLNG6 trun- cados que são, acredita-se, altamente instáveis e/ou não funcionais. Diversos modelos animais de ocorrência natural de doença de Batten CLNG6 foram descritos; esses incluem modelos de ovelha, caninos e de camundongo. A mutação espontânea encontrada no modelo de ca- mundongo Clin (denominado, no presente documento, "camundon- gos Cln6"*") recapitula diversos dos aspectos patológicos e compor-
tamentais da doença (Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694). Os camundongos Cln6"º* contêm uma inserção de uma citosina adici- onal (c.307insC, mudança de quadro após P102), que resulta em um códon de parada prematura que é homólogo a uma mutação normal- mente encontrada em pacientes com doença de Batten CLNG6 (Gao et al., Am J Hum Genet. 2002;70(2):324 a 335, Wheeler et al., Am J Hum Genet. 2002;70(2):537 a 542).
[0007] Atualmente, não há terapias que possam reverter os sinto- mas de doença de Batten CLN6. Assim, há uma necessidade na técni- ca por tratamentos para doença de Batten CLNG6.
[0008] São fornecidos no presente documento métodos e produtos para terapia gênica de CLN6 com o uso de AAV recombinante.
[0009] São fornecidos no presente documento vírus adenoassoci- ados recombinantes 9 (rAAV9) que codificam um polipeptídeo de CLN6, que compreende um genoma de rAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3': um promotor de B-actina de galinha (CB) híbrido e um polinucleotídeo que codifica o peptídeo de CLN6. Em alguns ca- sos, o genoma de rAAV9 compreende um genoma autocomplemen- tar.Alternativamente, o genoma de rAAV9 compreende um genoma de fita única.
[0010] Vírus adenoassociados recombinantes autocomplementa- res 9 (scAAV9) são fornecidos, os quais codificam o polipeptídeo de CLNG6 definido na SEQ ID NO: 1, em que o genoma do scAAV9 com- preende na ordem de 5' a 3": uma primeira repetição de terminal inver- tido AAV, um promotor de B-actina de galinha híbrido (CB) que com- preende a sequência da SEQ ID NO: 3, um polinucleotídeo que codifi- ca o polipeptídeo de CLN6 definido na SEQ ID NO: 2 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV. O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 pode ser pelo menos 90% idêntico à SEQ ID
NO: 2.
[0011] Também são fornecidos scAAV9 com um genoma que compreende na ordem de 5' a 3': uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um aprimorador de CMV, um promotor de B-Actina de galinha híbrido (cb), um íntron de SV40, um polinucleotídeo que codifi- ca o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV; scAAV9 com um genoma que compreende na ordem de 5' a 3': uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência da SEQ ID NO: 3, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1, uma sequência poli A de poliadenilação de hormônio de cres- cimento bovino e uma segunda repetição de terminal invertido AAV; e SCAAV9 com um genoma que compreende o cassete genético definido na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
[0012] Também são fornecidos sSAAV9 com um genoma que compreende na ordem de 5' a 3': uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um aprimorador de CMV, um promotor de B-Actina de galinha híbrido (CB), um íntron de SV40, um polinucleotídeo que codi- fica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repeti- ção de terminal invertido AAV; ssAAV9 com um genoma que compre- ende na ordem de 5' a 3': uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência da SEQ ID NO: 3, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1, uma sequência poli A de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino e uma segunda repetição de terminal invertido AAV; ou ssAAV9 com um genoma que compreende o cassete genéti- co definido na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
[0013] A sequência de ácido nucleico definida na SEQ ID NO: 4 é O cassete genético que é fornecido na Figura 1A. São fornecidos rA- AV9 que compreendem um genoma de scAAV9 ou um genoma de
SSAAV9 que compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
[0014] São fornecidas adicionalmente moléculas de ácido nucleico que compreendem uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3, uma sequência de ácido nucleico que codifica o poli- peptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de ter- minal invertido AAV. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 pode ser pelo menos 90% idêntico à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
[0015] São também fornecidas moléculas de ácido nucleico que compreendem uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3, um íntron SV40, uma sequência de ácido nucleico que codi- fica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repeti- ção de terminal invertido AAV. Além disso, são também fornecidas mo- léculas de ácido nucleico que compreendem uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a se- quência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3, um ácido nucleico que codi- fica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1, uma sequência poli-A de BGH e uma segunda repetição de terminal invertido AAV. Em qual- quer um dos polinucleotídeos fornecidos, o polipeptídeo de CLN6 pode ser codificado por uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
[0016] São fornecidos rAAV com um genoma de scAAV ou um ge- noma de ssAAV em que o genoma compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou pelo menos 98% idêntica à se- quência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
[0017] Os rAAV fornecidos podem compreender qualquer um dos polinucleotídeos divulgados no presente documento. Adicionalmente, partículas virais que compreendem qualquer um dos ácidos nucleicos divulgados são fornecidas. Os rAAV com genomas autocomplementa- res ou de fita única também são fornecidos.
[0018] Também são fornecidas partículas virais de vírus adenoas- sociado recombinante 9 (rAAV9) que codificam um polipeptídeo de CLN6, que compreende um genoma de rAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3": um aprimorador de CMV que compreende uma se- quência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 6, um promotor de CB que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3 e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, as partículas virais de rAAV9 fornecidas compreendem um genoma auto- complementar. Alternativamente, as partículas virais de rAAVO9 forneci- das compreendem um genoma de fita única.
[0019] São fornecidas adicionalmente partículas virais de rAAVO9, em que o genoma de rAAV9 compreende na ordem de 5' a 3": uma primeira repetição de terminal invertido AAV, o aprimorador de CMV que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 6, o promotor de CB que compreende uma se- quência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma se- gunda repetição de terminal invertido AAV. As partículas de rAAV9 fornecidas compreendem um polinucleotídeo que codifica o polipeptí-
deo de CLN6 que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 1. Qualquer uma das partículas virais de rAAV9 opcionalmente compreendem adicionalmente um fn- tron de SV40 e/ou uma sequência poli-A de BGH.
[0020] Em uma modalidade adicional, as partículas virais de rA- AV9 compreendem um genoma de AAV9 que compreende uma se- quência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, pelo menos 95% idêntica à sequên- cia de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
[0021] Em qualquer um dentre o rAAV, o ssAAV ou o scAAV for- necidos, as repetições de terminal invertido AAV podem ser repetições de terminal invertido AAV2.
[0022] Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que compreendem um genoma de rAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3": uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um aprimorador de CMV que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo me- nos 90% idêntica à SEQ ID NO: 6, um promotor de CB que compreen- de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3 e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
1. As moléculas de ácido nucleico fornecidas compreendem um ge- noma autocomplementar e/ou um genoma de fita única.
[0023] São fornecidas adicionalmente moléculas de ácido nucleico que compreendem um genoma de rAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3': uma primeira repetição de terminal invertido AAV, o aprimo- rador de CMV que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 6, o promotor de CB que compre- ende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de
CLNG6 pelo menos 90% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV. As mo- léculas de ácido nucleico fornecidas podem compreender um polinu- cleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Além disso, as moléculas de ácido nu- cleico podem compreender um genoma de AAV9 que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequên- cia de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 ou pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. Qualquer uma das moléculas de ácido nucleico fornecidas opcionalmente com- preendem adicionalmente um íntron de SV40 e/ou uma sequência poli- A de BGH.
[0024] São fornecidas adicionalmente composições que compre- endem o scAAVO9 descrito no presente documento, moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento ou as partículas virais de rAAV descritas no presente documento e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, o excipiente farmaceu- ticamente aceitável compreende um composto de baixa osmolaridade não iônico, um tampão, um polímero, um sal ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polímero é um copolímero. Em algumas modalidades, o copolímero é um poloxâmero. Por exemplo, a composição pode compreender pelo menos um excipiente farmaceuti- camente aceitável que compreende um composto de baixa osmolari- dade não iônico. Por exemplo, o excipiente farmaceuticamente aceitá- vel pode compreender cerca de 20 a 40% de composto de baixa os- molaridade não iônico ou cerca de 25% a cerca de 35% de composto de baixa osmolaridade não iônico. Uma composição exemplificativa compreende scAAV formulado em Tris a 20 mm (pH 8,0), MgCl2 a 1 mm, NaCl a 200 mm, poloxâmero 188 a 0,001% e cerca de 25% a cer- ca de 35% de composto de baixa osmolaridade não iônico. Outra composição exemplificativa compreende scAAV formulado em 1x PBS que compreende 0,001% de Plurônico F68.
[0025] São ainda fornecidos adicionalmente métodos para tratar doença de Batten CLN6 em um indivíduo que compreendem adminis- trar ao indivíduo uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos rAAV9 divulgados no pre- sente documento, qualquer um dos scAAV9 divulgados no presente documento, qualquer um dos ssAAV divulgados no presente documen- to, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presen- te documento ou qualquer uma das composições descritas no presen- te documento.
[0026] A divulgação também fornece uso de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de qualquer um dos rAAV9 divulgados no presen- te documento, qualquer um dos scAAV9 divulgados no presente do- cumento, qualquer um dos ssAAVS9 divulgados no presente documen- to, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presen- te documento ou qualquer uma das composições descritas no presen- te documento para preparação de um medicamento para tratar doença de Batten CLN6.
[0027] Também são fornecidas composições que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos rAAVO divulgados no presente documento, qualquer um dos scAAV9 divulga- dos no presente documento, qualquer um dos ssAAV divulgados no presente documento, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento ou qualquer uma das composições descritas no presente documento para tratar doença de Batten CLNB6.
[0028] Em qualquer um dos métodos, usos ou composições para tratar doença de Batten CLN6 fornecidos, as composições, rAAV9,
SCAAV9 ou ssAAV e/ou moléculas de ácido nucleico são administra- dos por meio de uma rota selecionada a partir do grupo que consiste em intratecal, intracerebroventricular, intraparenquimático, intravenosa e uma combinação das mesmas.
[0029] Doses exemplificativas dos scAAV9, ssAAV ou rAAV9 ad- ministradas através da rota intratecal são de cerca de 1x10** vg dos SCAAV, ssAAV ou partículas virais de rAAV9 a cerca de 1x10º* vg dos SCAAV ou partículas virais de AAV9, ou cerca de 1x10*? vg dos scAAV, SSAAV ou partículas virais de rAAV9 a cerca de 1x10*º vg dos scAAV, SSAAV ou partículas virais de AAV9. Por exemplo, cerca de 1x10? vg dos scAAV, ssAAV ou partículas virais de rAAV9 podem ser adminis- trados a um indivíduo, ou cerca de 1,5x10*? dos scAAV, ssAAV ou par- tículas virais de rAAV9 podem ser administrados a um indivíduo, ou cerca de 6x10º? vg dos scAAV, ssAAV ou partículas virais de rAAV9 podem ser administrados a um indivíduo.
[0030] Os métodos, usos ou composições para tratar doença de Batten CLNG6 divulgados no presente documento resultam em um indi- víduo, em comparação com o indivíduo antes do tratamento ou um pa- ciente com doença de Batten CLN6 não tratado, em um ou mais den- tre: (a) acúmulo lisossômico reduzido ou retardado de material de ar- mazenamento autofluorescente, (b) acúmulo lisossômico reduzido ou retardado de Subunidade C de ATP Sintase, (c) ativação glial reduzida ou retardada (astrócitos e/ou micróglia), (d) astrocitose reduzida ou retardada, (e) perda de volume cerebral reduzida ou retardada medida por ressonância magnética, (f) início reduzido ou retardado de convul- sões, e (g) estabilização, progressão reduzida ou melhora em uma ou mais dentre as escalas usadas para avaliar progressão e/ou melhora em doença de Batten CLN6, por exemplo, escalas de avaliação de Sistema de Classificação de Doença de Batten Unificado (UBDRS), a Escala de Linguagem e função Motora de Hamburgo ou a Escala Mul-
len de Aprendizagem Precoce (MSEL) O indivíduo pode ser mantido na posição de Trendelenberg após administração do rAAVS9, das partí- culas virais de ssAAV9, do scAAV ou das moléculas de ácido nucleico divulgadas no presente documento.
[0031] São fornecidos, ainda adicionalmente, métodos para tratar doença de CLN6 em um paciente em necessidade, que compreendem entregar uma composição que compreende qualquer uma das partícu- las virais de rAAV divulgadas, fornecidas no presente documento, qualquer um dos scAAV9 divulgados no presente documento, qualquer um dos ssAAVO9 divulgados no presente documento, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento ou qualquer uma das composições descritas no presente documento a um cérebro ou medula espinhal de um paciente em necessidade da mesma.
[0032] Além disso, a divulgação fornece o uso de qualquer uma das partículas virais de rAAV divulgadas fornecidas no presente do- cumento, qualquer um dos scAAVO9 divulgados no presente documen- to, qualquer um dos ssAAVO9 divulgados no presente documento, qual- quer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente do- cumento ou qualquer uma das composições descritas no presente do- cumento para preparação de um medicamento para uso na entrega do dito sSAAV9, molécula de ácido nucleico ou composição a um cérebro ou medula espinhal de um paciente em necessidade da mesma.
[0033] São fornecidas também composições que compreendem qualquer uma das partículas virais de rAAV divulgadas fornecidas no presente documento, qualquer um dos scAAVO9 divulgados no presente documento, qualquer um dos ssAAV9 divulgados no presente docu- mento, qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento ou qualquer uma das composições descritas no presente documento para entregar o dito sSAAV9, molécula de ácido nucleico ou composição a um cérebro ou medula espinhal de um paci- ente em necessidade das mesmas.
[0034] Em qualquer um dos métodos, usos ou composições forne- cidos, a composição pode ser entregue por injeção intratecal, intrace- rebroventricular, intraparenquimático ou intravenosa, ou uma combina- ção das mesmas. Qualquer um dos métodos fornecidos compreende ainda colocar o paciente na posição de Trendelenberg após injeção intratecal da composição, rAAV9, ssAAV9 ou scAAV ou moléculas de ácido nucleico divulgadas no presente documento.
[0035] Em qualquer um dos métodos, usos ou composições forne- cidos, as composições ou medicamento podem compreender um agente de contraste de baixa osmolaridade não iônico. Por exemplo, as composições podem compreender um agente de contraste de baixa osmolaridade não iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em iobitridol, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromida, ioversol, ioxilan e combinações dos mesmos.
[0036] As composições ou medicamentos administrados podem compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exem- plo, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode compreender cer- ca de 20 a 40% de composto de baixa osmolaridade não iônico ou cerca de 25% a cerca de 35% decomposto de baixa osmolaridade não iônico. Uma composição exemplificativa compreende scAAV formulado em Tris a 20 mm (pH 8,0), MgCl2 a 1 mm, NaCl a 200 mm, poloxâmero 188 a 0,001% e cerca de 25% a cerca de 35% de composto de baixa osmolaridade não iônico. Outra composição exemplificativa compre- ende scAAV formulado e 1X PBS e Plurônico F68 a 0,001%.
[0037] Em qualquer um dos métodos, usos ou composições forne- cidos, a composição ou medicamento pode ser entregue ao cérebro ou medula espinhal, a composição ou medicamento pode ser entregue a um tronco encefálico, ou pode ser entregue ao cerebelo, pode ser en-
tregue a um córtex visual, ou pode ser entregue a um córtex motor. Adicionalmente, em qualquer um dos métodos fornecidos, a composi- ção ou medicamento pode ser entregue ao cérebro ou medula espi- nhal, a composição pode ser entregue a uma célula nervosa, uma cé- lula glial ou ambas. Por exemplo, em que a entrega ao cérebro ou me- dula espinhal compreende entrega a uma célula do sistema nervoso, tal como um neurônio, um neurônio motor inferior, uma célula microgli- al, um oligodendrócito, um astrócito, uma célula Schwann ou uma combinação dos mesmos.
[0038] Os métodos, usos e composições divulgados no presente documento resultam em um indivíduo, em comparação com o indiví- duo antes do tratamento ou em comparação com um indivíduo com doença de Batten CLN6 não tratado, em um ou mais dentre: (a) acú- mulo lisossômico reduzido ou retardado de material de armazenamen- to autofluorescente, (b) acúmulo lisossômico reduzido ou retardado de Subunidade C de ATP Sintase, (c) ativação glial reduzida ou retardada (astrócitos e/ou micróglia), (d) astrocitose reduzida ou retardada, (e) perda de volume cerebral reduzida ou retardada medida por ressonân- cia magnética, (f) início reduzido ou retardado de convulsões, e (g) es- tabilização, progressão reduzida ou melhora em uma ou mais dentre as escalas que são usadas para avaliar progressão e/ou melhora em doença de Batten CLN6, por exemplo, as escalas de avaliação de Sis- tema de Classificação de Doença de Batten Unificado (UBDRS),a Es- cala de Linguagem e função Motora de Hamburgo ou a Escala Mullen de Aprendizagem Precoce (MSEL).
[0039] Em qualquer um dos métodos, composições e usos descri- tos no presente documento, o tratamento, composição ou medicamen- to estabiliza ou retarda a progressão da doença de Batten CLN-6. Em particular, a progressão da doença é avaliada com as escalas UBDRS, a Escala da função Motora e de Linguagem de Hamburgo, o impacto do tratamento na qualidade de vida usando a escala de Qualidade de Vida Pediátrica (PEDSQOL), as Escalas de Mullen de Aprendizagem Precoce (MSEL), o potencial para sobrevivência prolongada, ou uma combinação dos mesmos.
[0040] Em qualquer um dos métodos, usos ou composições des- critos no presente documento, o tratamento, composição ou medica- mento reduz ou retarda um ou mais sintomas da doença de Batten CLN-6 selecionados a partir de: (a) perda de volume cerebral; (b) per- da da função cognitiva; e (c) atraso de linguagem; em comparação com um paciente com doença de Batten CLN6 não tratado. Em parti- cular, o tratamento estabiliza ou retarda a progressão da doença de Batten CLN-6. Por exemplo, a progressão da doença é avaliada com as escalas UBDRS, a Escala da função Motora e de Linguagem de Hamburgo, o impacto do tratamento na qualidade de vida usando a escala de Qualidade de Vida Pediátrica (PEDSQOL), as Escalas de Mullen de Aprendizagem Precoce (MSEL), o potencial para sobrevi- vência prolongada, ou uma combinação dos mesmos.
[0041] Em qualquer um dos métodos, usos ou composições des- critos no presente documento, o indivíduo tem 80 meses de idade ou menos, 75 meses ou menos, 70 meses ou menos, 65 meses ou me- nos, 62 meses ou menos, 60 meses ou menos, 55 meses ou menos, 50 meses ou menos, ou 40 meses ou menos.
[0042] Dado que não há cura eficaz para doença de Batten CLN6, o modelo de camundongo ClIn6"* foi usado para testar a eficácia da introdução de CLN6 humano funcional por meio de terapia gênica me- diada por vírus adenoassociado (AAV). Os resultados pré-clínicos for- necidos no presente documento sugerem que o uso de serotipo de AAV 9 permite expressão eficiente da proteína de CLN6 humana por todo o CNS, onde as células mais impactadas estão localizadas. Para avaliar a segurança do tratamento em um modelo animal maior, três macacos cinomolgos de quatro anos de idade foram dosados com ScAAV9.CB.CLNG6 por injeção de CSF lombar intratecal e monitorados por até seis meses após injeção. Nenhum efeito negativo ou patologia foi observado, enquanto altos níveis de expressão transgênica foram encontrados por todo o cérebro e medula espinhal de todos os ani- mais. Uma injeção intracerebroventricular (ICV) pós-natal única de ScAAV9.CB.CLN6 no CSF de camundongos induziu expressão persis- tente do transgene in vivo nos camundongos CIn6". Administração de SCcAAV9.CB.CLN6 reduziu os sinais clássicos da doença, incluindo acúmulo de material de armazenamento autofluorescente e subunida- de C de ATP sintase, gliose reativa e perda de espinhas dendríticas. Sobretudo, esse tratamento de terapia gênica resultou em benefícios funcionais extensivos na medida em que preveniu diversos dos déficits motores, de memória e aprendizagem, e sobrevivência dos camun- dongos CIn6"*. Esses resultados destacam fortemente o potencial te- rapêutico de scAAV9.CB.CLN6 entregue no CSF para tratamento da doença de Batten CLNG6.
[0043] Os títulos no presente documento são para maior conveni- ência do leitor e não se destinam a ser limitantes.
[0044] O uso de '“pode' e “talvez' no presente documento é para descrever as várias modalidades que estão incluídas nas reivindica- ções, e não para indicar incerteza sobre o escopo das reivindicações.
[0045] As Figuras 1A a 1C demonstram alvejamento e expressão neuronal de proteína de CLN6 humana in vivo. A Figura 1A fornece um esquema do genoma de scAAV de scAAV.CB.CLN6. Os gráficos na Figura 1B fornecem o mMRNA de CNL6 e níveis de expressão de prote- ína de CLN6 humana (hCLNG6) depois da transfecção transiente de cé- lulas HEK293 com plasmídeo de scAAV.CB.CLN6. As imagens na Fi- gura 1C fornecem coloração imunoistoquímica para proteína de GFP e hCLNG6 após eletroporação in utero do plasmídeo de scAAV.CB.CLN6.
[0046] As Figuras 2A e 2B fornecem imagens que mostram ex- pressão disseminada da transcrição de CLN6 humana no CNS de ca- mundongos CIn6"* injetados com scAAV9.CB.CLNG6. As imagens e gráficos na Figura 2A fornecem géis de RT-PCR representativos e quantificação por densitometria (normalizada para GAPDH) em 6 meses e 18 meses após injeção. Essa análise demonstrou expressão de gene aumentada depois da entrega de scAAV9.CB.CLNG6 (CIn6""+scAAVO9) em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT ou WT + PBS) e camundongos CIn6"* injetados com PBS (CIn6"""+PBS). Os pai- néis esquerdos da Figura 2B fornecem imagens que demonstram ex- pressão disseminada da transcrição de CLN6 humana no CNS de ca- mundongos Cin6" injetados com scAAV9.CB.CLN6 (CIn6""+scAAV9) em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT + PBS) 6 meses e 18 meses após injeção. Os painéis direitos da Figura 2B for- necem imagens que mostram coloração imunoistoquímica, que de- monstra expressão de proteína em várias regiões do cérebro de ca- mundongos CIn6"* injetados com scAAV9.CB.CLN6 em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT + PBS) 6 meses e 18 meses após injeção. Barra de escala de 50 um. Média +/- SEM. N=3 a 9 ca- mundongos/grupo. ANOVA de uma via, correção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001.
[0047] As Figuras 3A a 3C demonstram o efeito de uma única in- jeção de scAAV9.CB.CLN6 em animais com 2 meses de idade. As imagens e gráficos na Figura 3A fornecem géis de RT-PCR represen- tativos e quantificação por densitometria (normalizada para GAPDH) em 2 meses após injeção. Essa análise demonstra expressão de gene aumentada depois da entrega de scAAV9.CB.CLNG6 (CIn6"""+scAAVO9) em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT + PBS) e camundongos Cln6"* injetados com PBS (CIn6""+PBS). Os painéis superiores na Figura 3B fornecem imagens que demonstram expres- são disseminada da transcrição de CLN6 humana no CNS de camun- dongos CIn6"** injetados com scAAV9.CB.CLNG6 (CIn6""*+scAAV9) em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT + PBS) 2 me- ses após injeção. Os painéis inferiores da Figura 3B fornecem ima- gens que mostram coloração imunoistoquímica, que demonstra ex- pressão de proteína em várias regiões do cérebro de camundongos CIn6"* injetados com scAAV9.CB.CLN6 em comparação com camun- dongos de tipo selvagem (WT + PBS) 2 meses após injeção. Barra de escala de 200 um. Média +/- SEM. N = 39. ANOVA de uma via, corre- ção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. As imagens e gráficos da Figura 3C demonstram que uma única injeção ICV de scAAV9.CB.CLN6 em P1 reduz acúmulo de material de arma- zenamento autofluorescente (ASM; painéis superiores) e subunidade C de ATP sintase (SubC; painéis inferiores) em VPM/VPL e córtex so- matossensorial de camundongos Cin6"º* em comparação com camun- dongos de tipo selvagem (WT) e camundongos CIn6"" injetados com PBS (Cin6"* PBS) 2 meses após injeção. Média +/- SEM, N=3 a 10. (painéis superiores); Média +/- SEM, N = 21 a 72, biológico N=3 a 10 (painéis inferiores) ANOVA de uma via, correção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Barra de escala de 200 um (painéis superiores). Barra de escala de 50 um (painéis inferiores).
[0048] As Figuras 4A e 4B demonstram expressão disseminada de mRNA de CLNG6 e proteína de hCLN6 por todo o cérebro nas se- guintes regiões: A: córtex motor, B: córtex somatossensorial; C: córtex visual; D: tálamo; E: pons; F: cerebelo; G: tronco encefálico.Imagens fornecidas na Figura 4A demonstram expressão de transcrição de hCLNG6 por todo o cérebro em camundongos CIn6"* tratados com SCcAAV9.CB.CLN6 em 2 meses, 6 meses e 18 meses após injeção. Imagens fornecidas na Figura 4B demonstram expressão de proteína de hCLNG6 por todo o cérebro em camundongos Cin6" tratados com SCcAAV9.CB.CLN6 em 2 meses, 6 meses e 18 meses após injeção. Barra de escala de 50 um.
[0049] A Figura 5 fornece imagens e gráficos que demonstram acúmulo reduzido de material de armazenamento autofluorescente (ASM) em VPM/VPL e córtex somatossensorial de camundongos CIn6"* tratados com scAAV9.CB.CLN6 (CIn6"* scAAV) em compara- ção com camundongos de tipo selvagem (WT) e camundongos Cln6" tratados com PBS (Cin6""* PBS) 6 meses e 18 meses após injeção. Gráficos mostram diversas células ASM*/2.500 um?. Média +/- SEM, N = 3 a 10 com base em ponto no tempo. ANOVA de uma via, correção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Barra de escala de 50 um.
[0050] A Figura 6 fornece imagens e gráficos que demonstram acúmulo reduzido de subunidade C de ATP sintase (SubUnitC) mito- condrial em VPM/VPL e córtex somatossensorial de camundongos CIn6"* tratados com scAAV9.CB.CLN6 (CIn6"* scAAV) em compara- ção com camundongos de tipo selvagem (WT) e camundongos Cln6" tratados com PBS (Cin6""* PBS) 6 meses e 18 meses após injeção. À mancha marrom representa subunidade C, enquanto a mancha azul representa verde de metila (núcleos). Gráficos mostram a área de SubC* total por campo de imagem. Média +/- SEM, N = 21 a 72, bioló- gico N = 3 a 10. ANOVA de uma via, correção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Barra de escala de 50 um.
[0051] A Figura 7 fornece imagens e gráficos que demonstram que camundongos Cin6"* injetados com scAAV9.CB.CLN6 (Cln6n ScAAV) exibem menos astrogliose (reatividade de GFAP) em VPM/VPL e córtex somatossensorial em 6 e 18 meses em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT) e camundongos Cin6" in- jetados com PBS (Cin6"* PBS). Gráficos mostram imunorreatividade de GFAP+ total. Média +/- SEM, N = 16 a 49 seções, biológico N= 3 a camundongos/grupo. ANOVA de uma via, correção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Barra de escala de 50 um. Barra de escala de inserção de 10 um.
[0052] A Figura 8 fornece imagens e gráficos que demonstram que camundongos Cin6"* injetados com scAAV9.CB.CLN6 (Cln6n SCAAV9) exibem menos microgliose (reatividade de CD68) no córtex somatossensorial 6 meses após injeção em comparação com camun- dongos de tipo selvagem (WT) e camundongos Cin6" injetados com PBS (CIn6"** PBS), e tanto em VPM/VPL quanto em córtex somatos- sensorial 18 meses após injeção em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT) e camundongos Cln6"“* injetados com PBS (Cin6"* PBS). Gráficos mostram imunorreatividade de CD68+ total. Média +/- SEM, N = 16 a 49 seções, biológico N = 3 a 10 camundon- gos/grupo. ANOVA de uma via, correção de Bonferroni. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Barra de escala de 50 um. Barra de escala de inserção de 10 um.
[0053] As Figuras 9A a 9E fornecem gráficos que demonstram que expressão prolongada de CLN6 recupera défices motor, de me- mória, aprendizado e sobrevivência em camundongos Clin6"º, A Figu- ra 9A demonstra que camundongos Cin6"* injetados com scA- AV9.CB.CLNG6 (CIn6"* scAAV) tiveram défices de rotarod reduzidos de 8 a 24 meses de idade em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT) e camundongos CIn6"“ injetados com PBS (Cin6" PBS). A Figura 9B demonstra que injeção de scAAV9.CB.CLNG corrige défices de agarramento de membro posterior, passo e se abaixar em borda em 12 e 18 meses de idade em camundongos Cln6"* injetados com scAAV9.CB.CLNG6 (CIn6"* scAAV) em comparação com camun- dongos de tipo selvagem (WT) e camundongos CIn6"" injetados com PBS (CIn6"º* PBS). A Figura 9C demonstra que scAAV9.CB.CLNG6 evi-
ta défices de memória e aprendizado no labirinto aquático de Morris de 9 a 12 meses de idade em camundongos Cin6"* injetados com scA- AV9.CB.CLNG6 (CIn6"** scAAV) em comparação com camundongos de tipo selvagem (WT) e camundongos CIn6"** injetados com PBS (Cin6""* PBS). A Figura 9D demonstra que injeção de scA- AV9.CB.CLN6 evita morte precoce de animais CIn6"**, enquanto ani- mais CIn6"** injetados com PBS morrem com 15 meses de idade. À Figura 9E mostra desenvolvimento de peso corporal para machos (painel esquerdo) e fêmeas (painel direito) durante o período do estu- do em camundongos tratados com scAAV9.CB.CLNG6 (CIn6"“* scAAV) em comparação com animais de tipo selvagem (WT) e camundongos CIn6"* injetados com PBS (CIn6"* PBS). Média +/- SEM, N= 6 a 24 para rotarod, N = 7 a 13 para pontuação de agarramento, N= 5 a15 para labirinto aquático, N = 10 a 15 para curva de sobrevivência. N=3 a 13 para peso. ANOVA de uma via com correção de Bonferroni ou teste t não pareado usado onde for apropriado. Teste Log-rank (Man- tel-Cox) usado para análise de curva de sobrevivência *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001
[0054] A Figura 10 fornece dados de comportamento adicionais em animais de 12 a 24 meses. O gráfico fornecido na Figura 10A de- monstra que animais CIn6"* não tratados têm velocidades de nado significativamente menores com 11 e 12 meses de idade no teste de labirinto aquático de Morris. O gráfico na Figura 10B demonstra que SCcAAV9.CB.CLN6 não melhora significativamente défices de memória e aprendizado de camundongos CIn6"* na tarefa reversa de labirinto aquático de Morris em 12, 18 e 24 meses de idade. Velocidades de nado são mostradas como um controle. N = 5 a 15 para labirinto aquá- tico, teste t não pareado, Média +/- SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001
[0055] As Figuras 11A a 11C fornecem dados que demonstram que scAAV9.CB.CLNG é altamente expresso e bem tolerado em prima- tas não humanos. A Figura 11A fornece Western blots que demons- tram alta expressão do transgene em várias regiões de cérebro e me- dula espinhal de primatas não humanos tratados com scA- AV9.CB.CLN6. Amostras são representativas de 3 animais, em que “+ indica um animal com tratamento de scAAV9.CB.CLN6. As seguintes regiões do cérebro foram testadas, Córtex (Ctx), Corpo Caloso (C. Call), Matéria Branca Periventricular (P.V.W.M.:), Hipocampo (Hipp), Cerebelo (Cere), Tálamo (Thal), Medula Cervical (Cervical), Medula Torácica (Torácica), Medula Lombar (Lombar). O gráfico na Figura 11B fornece quantificação de western blots fluorescentes na Figura 1A. Média +/- SEM, N = 3. Teste t de Student não pareado. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Os gráficos na Figura 11C de- monstram que a entrega de scAAV9.CB.CLNG6 não altera a concentra- ção de plaqueta ou eleva enzimas do fígado na maior parte de prima- tas não humanos tratados com scAAV9.CB.CLN6. Pontos de dados vermelhos indicam animais tratados com scAAV9.CB.CLNG6; pontos de dados azuis indicam animais tratados com PBS. As enzimas testadas foram as seguintes: Alanina Aminotransferase (ALT), Aspartato Amino- transferase (AST), Fosfatase Alcalina (Fos Alc) Gama-Glutamil Trans- ferase (GGT).
[0056] As Figuras 12A a 12C fornecem análise de progressão de doenças após injeção de scAAV9.CB.CLN6 em dois pares de irmãos em estudo, conforme medido pela Escala de Linguagem e função Mo- tora de Hamburgo.
[0057] A Figura 13 fornece a sequência de ácido nucleico de cas- sete genético de scAAV9.CB.CLN6 (SEQ ID NO: 4). A sequência de ácido nucleico AAV2 ITR está em itálico (5' ITR é definida como SEQ ID NO: 9; 3' ITR é definida como SEQ ID NO: 8), a sequência de ácido nucleico de aprimorador de CMV (SEQ ID NO: 6) é sublinhada com uma linha pontilhada, a sequência de ácido nucleico de promotor de CB (SEQ ID NO: 3) é sublinhada com uma linha única, a sequência de ácido nucleico de íntron de SV40 (SEQ ID NO: 11) é sublinhada com uma linha dupla, a sequência de ácido nucleico da sequência de cDNA de CLN6 humana (SEQ ID NO: 2) está em negrito, a sequência de ácido nucleico do terminador de poliA de BGH (SEQ ID NO: 10) está sublinhada com uma linha tracejada.
[0058] A Figura 14 fornece a sequência de ácido nucleico de AAV.CB.CLN6 completo (SEQ ID NO: 8).
[0059] A Figura 15 fornece dados de eficácia para 8 dos pacientes tratados com scAAV9.CB.CLNG6 conforme medido pela Escala da fun- ção Motora e Linguagem de Hamburgo.
[0060] As Figuras 16A a 16C fornecem comparação entre irmãos tratados e não tratados. Um irmão foi tratado com scAAV9.CB.CLN6 e sua progressão medida pela Escala da função Motora e de Linguagem de Hamburgo foi comparada com o histórico natural de seu irmão não tratado. Esses dados são fornecidos como Pontuação de Hamburgo: Função Motora + Linguagem ao longo do tempo.
[0061] A Figura 17 fornece uma curva de Kaplan-Meier para o tempo até a diminuição não revertida a partir da linha de base de 2 ou mais pontos na pontuação combinada para a função Motora e de Lin- guagem de Hamburgo. Esta figura compara os dados dos primeiros 8 pacientes tratados com scAAV9.CB.CLN6 com os dados de um estudo de histórico natural em andamento de pacientes CLN6 conduzido pelo Hospital Nationwide Children's Hospital (n = 14). As bandas de confi- ança são calculadas usando as estimativas de probabilidade de sobre- vivência e seu erro padrão.
[0062] A Figura 18 fornece pontuações combinadas e individuais Motoras e de Linguagem de Hamburgo de pacientes tratados com ScAAV9.CB.CLNG6 (n = 8), mostrando que a terapia gênica CLNG6 inter-
rompe ou retarda substancialmente a progressão da doença com um impacto positivo na função motora e de linguagem em 7 de 8 pacien- tes.
[0063] A Figura 19 fornece comparações correspondidas de histó- rico natural entre pacientes tratados com scAAV9.CB.CLNG6 (n = 8) em comparação com pacientes com histórico natural correspondidos por idade e pontuações agregadas da função Motora e de Linguagem de Hamburgo de linha de base.
[0064] A Figura 20 fornece dados de histórico natural para pacien- tes com doença de Batten CLN6 (n = 11). Na legenda, a linha ponti- lhada (----) indica declínio da linguagem e a linha cinza contínua indica declínio da função motora. A linha azul (linha superior) é a soma do declínio da função motora e da linguagem. A pontuação média da fun- ção Motora + Linguagem de Hamburgo é plotada no eixo y, e a idade em meses é plotada no eixo x. Há um declínio bastante linear e quase sustentado de um ponto por ano dos dois aos sete anos de idade.
[0065] As Figuras 21A a 21B fornecem pontuações brutas para 4 domínios da Escala de Aprendizagem Precoce de Mullen. As linhas horizontais pontilhadas indicam pontuações na triagem. Pontuações mais altas indicam função superior.
[0066] A presente divulgação fornece métodos e produtos para tratar doença de Batten CLN6. Os métodos envolvem entrega de um polinucleotídeo de CLN6 a um indivíduo com o uso de rAAV como um vetor de entrega genética.
[0067] Vírus adenoassociado (AAV) é um parvovírus deficiente de replicação, em que o genoma de DNA de fita única do mesmo tem cerca de 4,7 kb em comprimento que inclui duas repetições de termi- nal invertido (ITRs) de 145 nucleotídeos e pode ser usado para se re- ferir ao próprio vírus ou derivados do mesmo. O termo cobre todos os subtipos e ambas as formas de ocorrência natural e recombinante, ex- ceto quando especificado de outra forma.
Há múltiplos serotipos de AAV.
Os serotipos de AAV estão, cada um, associados a um clado es- pecífico, em que os membros dos mesmos compartilham similaridades serológicas e funcionais.
Assim, AAVs também podem ser indicados pelo clado.
Por exemplo, sequências de AAV9 são denominadas se- quências de "clado F" (Gao et al., J.
Virol., 78: 6.381 a 6.388 (2004). À presente divulgação contempla o uso de qualquer sequência dentro de um clado específico, por exemplo, clado F.
As sequências de nucleotí- deos dos genomas dos serotipos de AAV são conhecidas.
Por exem- plo, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no nº de acesso Gen- Bank NC 002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no nº de acesso GenBank NC 001401 e Srivastava et al., J.
Virol., 45: 555 a 564 (1983); o genoma completo de AAV-3 é fornecido no nº de acesso GenBank NC 1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no nº de acesso GenBank NC 001829; o genoma de AAV-5 é fornecido no nº de acesso GenBank AFO85716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no nº de acesso GenBank NC 00 1862; pelo menos porções de genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos nº de acesso Gen- Bank AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma de AAV-9 é fornecido em Gao et al., J.
Virol., 78: 6.381 a 6.388 (2004); o genoma de AAV-10 é fornecido em Mol.
Ther., 13(1): 67 a 76 (2006); o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375 a 383 (2004); porções do genoma de AAV-12 são fornecidas no nº de acesso Genbank DQ813647; porções do genoma de AAV-13 são fornecidas no nº de acesso Genbank EU285562. A sequência do genoma rh.74 de AAV é fornecida em, consultar o documento de Patente nº U.S. 9.434.928, incorporado no presente documento a título de referência.
A sequência do genoma de AAV-B1 é fornecida em Choudhury et al., Mol.
Ther., 24(7): 1.247 a 1.257 (2016). Sequências de atuação Cis que direcio-
nam replicação (rep) de DNA viral, encapsidação/embalagem e inte- gração de cromossomo de célula hospede estão contidas nas ITRs. Três promotores de AAV (nomeados p5, p19 e p40 por suas relativas localizações no mapa) conduzem a expressão dos dois quadros de leitura aberta internos de AAV que codificam genes de rep e cap. Os dois promotores de rep (p5 e p19), acoplados ao splicing diferencial do íntron de AAV único (nos nucleotídeos 2.107 e 2.227), resultam na produção de quatro proteínas de rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) do gene de rep. Proteínas de rep têm múltiplas propriedades enzimáti- cas que são, por fim, responsáveis por replicar o genoma viral. O gene de cap é expresso a partir do promotor p40 e o mesmo codifica as três proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3. Splicing alternativo e sítios de início translacional não consensuais são responsáveis pela produção das três proteínas de capsídeo relacionadas. Um único sítio de polia- denilação consensual está localizado na posição 95 no mapa do ge- noma de AAV. O ciclo de vida e a genética de AAV são revistos em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97 a 129 (1992).
[0068] AAV tem recursos únicos que tornam o mesmo atrativo co- mo um vetor para entregar DNA estranho às células, por exemplo, em terapia gênica. Infecção de AAV de células em cultura é não citopática, e a infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, AAV infecta diversas células de mamífero, o que permite a possibilidade de alvejar diversos tecidos diferentes in vivo. Além disso, AAV transduz lentamente células de divisão e sem divisão, e pode persistir essencialmente pela vida útil dessas células como um epissoma nuclear transcricionalmente ativo (elemento extra- cromossômico). O genoma pró-viral de AAV nativo é infeccioso como DNA clonado em plasmídeos, o que torna a construção de genomas recombinantes confiável. Ademais, devido aos sinais que direcionam replicação de AAV, encapsidação e integração de genoma estarem contidos nas ITRs do genoma de AAV, alguma parte ou todo o interior, aproximadamente 4,3 kb do genoma (que codifica replicação e proteí- nas de capsídeo estruturais, rep-cap) pode ser substituído por DNA estranho, tal como um cassete genético que contém um promotor, um DNA de interesse e um sinal de poliadenilação. Em alguns casos, as proteínas de rep e cap são fornecidas in trans. Outro recurso significa- tivo de AAV é que o mesmo é um vírus extremamente estável e sau- dável. O mesmo suporta facilmente as condições usadas para inativar o adenovírus (56 a 65 ºC durante algumas horas), tornando a preser- vação a frio de AAV menos crítica. O AAV pode até ser liofilizado. Fi- nalmente, células infectadas com AAV não são resistentes à superin- fecção.
[0069] O termo "AAV", conforme usado no presente documento, se refere ao vírus ou partículas virais de AAV de tipo selvagem. Os termos "AAV", "vírus AAV" e "partícula viral de AAV" são usados inter- cambiavelmente no presente documento. O termo "rAAV" se refere a um vírus AAV recombinante ou recombinante infeccioso, partículas virais encapsuladas. Os termos "rAAV", "vírus rAAV" e "partícula viral de rAAV" são usados intercambiavelmente no presente documento.
[0070] O termo "genoma de rAAV" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que é derivada de um genoma de AAV nativo que foi modificado. Em algumas modalidades, o genoma de rAAV foi modifi- cado para remover os genes de cap e rep nativos. Em algumas moda- lidades, o genoma de rAAV compreende as repetições de terminal in- vertido (ITRs) 5' e 3' invertidas. Em algumas modalidades, o genoma de rAAV compreende ITRs de um serotipo de AAV que é diferente do serotipo de AAV do qual o genoma de AAV foi derivado. Em algumas modalidades, o genoma de rAAV compreende um transgene de inte- resse (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica CLN6) flanqueado nas extremidades 5' e 3' por repetição de terminal invertido (ITR). Em algumas modalidades, o genoma de rAAV compreende um "cassete genético". Um cassete genético exemplificativo é definido na Figura 1A e a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. O genoma de rAAV pode ser um genoma autocomplementar (sc), que é denominado, no presente documento, "genoma de scAAV". Alternativamente, o geno- ma de rAAV pode ser um genoma de fita única (ss), que é denomina- do, no presente documento, "genoma de ssAAV".
[0071] O termo "scAAV" se refere a um vírus rAAV ou partícula viral de rAAV que compreende um genoma autocomplementar. O ter- mo "ssAAV" se refere a um vírus rAAV ou partícula viral de rAAV que compreende um genoma de fita única.
[0072] Genomas de rAAV fornecidos no presente documento po- dem compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLNG6. Polipeptídeos de CLN6 compreendem a sequência de aminoá- cidos definida na SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo com uma sequên- cia de aminoácidos que é pelo menos: 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e que codifica um polipeptídeo com ati- vidade de CLNG6 (por exemplo, pelo menos uma dentre aumentar folga de material de armazenamento autofluorescente lisossômico, reduzir acúmulo lisossômico de subunidade C de ATP sintase e reduzir ativa- ção de astrócitos e micróglia em um paciente quando tratado em com- paração com, por exemplo, o paciente antes do tratamento).
[0073] Genomas de rAAV fornecidos no presente documento, em alguns casos, compreendem um polinucleotídeo que codifica um poli- peptídeo de CLN6, em que o polinucleotídeo tem a sequência de nu- cleotídeos definida na SEQ ID NO: 2, ou um polinucleotídeo pelo me- nos: 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%
idêntico à sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2 e codifica um polipeptídeo com atividade de CLN6 (por exemplo, pelo menos uma dentre aumentar folga de material de armazenamento au- tofluorescente lisossômico, reduzir acúmulo lisossômico de subunida- de C de ATP sintase e reduzir ativação de astrócitos e micróglia em um paciente quando tratado em comparação com, por exemplo, o pa- ciente antes do tratamento).
[0074] Genomas de rAAV fornecidos no presente documento, em algumas modalidades, compreendem uma sequência de polinucleotí- deos que codifica um polipeptídeo com atividade de CLN6 e que hibri- diza sob condições estringentes para a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 ou o complemento da mesma. O termo "estringente" é usado para se referir às condições que são normalmente entendidas na técnica como estringentes. Estringência de hibridização é princi- palmente determinada pela temperatura, força iônica e pela concen- tração de agentes desnaturantes, tais como formamida. Exemplos de condições estringentes para hibridização e lavagem incluem, porém, sem limitação a cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M em 65 a 68 ºC ou cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M e formamida a 50% a 42 ºC. Consultar, por exemplo, Sam- brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).
[0075] Os genomas de rAAV fornecidos no presente documento, em algumas modalidades, compreendem uma ou mais ITRs de AAV que flanqueiam o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6. O polinucleotídeo de CLN6 é operativamente ligado aos ele- mentos controle transcricional (que incluem, porém, sem limitação a promotores, aprimoradores e/ou sequências de sinal de poliadenila- ção) que são funcionais em células-alvo para formar um cassete gené- tico. Exemplos de promotores são o promotor de B-actina de galinha e o promotor P546. Promotores adicionais são contemplados no presen- te documento, os quais incluem, porém, sem limitação o promotor pre- coce de vírus símio 40 (SV40), vírus de tumor mamário de camundon- go (MMTV), promotor de repetição de terminal longa (LTR) de vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor de vírus de leucemia aviária, um promotor precoce imediato de vírus Epstein-Barr, um promotor de vírus sarcoma Rous, assim como pro- motores de gene humano, tais como, porém, sem limitação o promotor de actina, o promotor de miosina, o promotor de fator-1a de alonga- mento, o promotor de hemoglobina e o promotor de creatina quinase. São adicionalmente fornecidos, no presente documento, uma sequên- cia de promotor de CB definida na SEQ ID NO: 3 e sequências de promotor pelo menos: 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 3 que são promotores com atividade promotora de transcrição de CB. Outros exemplos de elementos de controle de transcrição são elementos de controle de tecido específico, por exem- plo, promotores que permitem expressão especificamente dentro de neurônios ou especificamente dentro de astrócitos. Exemplos incluem promotores de proteína ácida fibrilar glial e enolase neurônio- específica. Promotores induzíveis também são contemplados. Exem- plos sem limitação de promotores induzíveis incluem, porém, sem limi- tação a um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor regulado por tetraciclina. O cassete genético também pode incluir sequências de íntron para fa- cilitar o processamento de uma transcrição de RNA de CLN6 quando expressa em células mamíferas. Um exemplo de tal íntron é o íntron de SV40.
[0076] "Embalagem" se refere a uma série de eventos intracelula-
res que resultam na montagem e encapsidação de uma partícula de AAV. O termo "produção" se refere ao processo de produzir o rAAV (as partículas de rAAV infecciosas e encapsuladas) pelas células de embalagem.
[0077] Genes de "rep" e "cap" de AAV se referem às sequências de polinucleotídeos que codificam proteínas de replicação e encapsi- dação, respectivamente, de vírus adenoassociado. Rep e cap de AAV são denominados, no presente documento, "genes de embalagem" de AAV.
[0078] Um "vírus auxiliar" para AAV se refere a um vírus que per- mite que AAV (por exemplo, AAV de tipo selvagem) seja replicado e embalado por uma célula mamífera. Uma variedade de tais vírus auxi- liares para AAV são conhecidos na técnica, que incluem adenovírus, herpesvírus e poxvírus, tal como vaccinia. Os adenovírus podem en- globar diversos subgrupos diferentes, embora Adenovírus tipo 5 de subgrupo C normalmente seja mais usado. Diversos adenovírus de origem humana, mamífera não humana e aviária são conhecidos e es- tão disponíveis a partir de depósitos, tais como o ATCC. Vírus da famí- lia herpes incluem, por exemplo, vírus herpes simplex (HSV) e vírus de Epstein-Barr (EBV), assim como citomegalovírus (CMV) e vírus da pseudorraiva (PRV); que também estão disponíveis a partir de depósi- tos, tais como ATCC.
[0079] "A função (ou funções) de vírus auxiliar" se refere à função (ou funções) codificada em um genoma de vírus auxiliar que permite replicação e embalagem de AAV (em combinação com outros requisi- tos para replicação e embalagem descritos no presente documento). Conforme descrito no presente documento, a "função de vírus auxiliar" pode ser fornecida de diversas maneiras, que incluem, fornecendo-se vírus auxiliar ou, por exemplo, fornecendo-se sequências de polinucle- otídeos que codificam a função (ou funções) necessária para uma cé-
lula produtora in trans.
[0080] Os genomas de rAAV fornecidos no presente documento carecem de DNA de rep e cap de AAV. DNA de AAV nos genomas de rAAV (por exemplo, ITRs) contemplados no presente documento po- dem ser de qualquer serotipo de AAV adequado para derivar um vírus recombinante que inclui, porém, sem limitação a serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 e AAV-B1. Conforme notado acima, as sequências de nucleotídeos dos genomas de vários serotipos de AAV são conhecidas na técnica. rAAV com mutações de capsídeo, também são contemplados. Consultar, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1.900 a 1.909 (2014). Capsídeos modificados no presente documento também são contemplados e in- cluem capsídeo que têm várias modificações pós-translacionais, tais como glicosilação e desamidação. Desamidação de cadeias laterais de asparagina ou glutamina que resultam na conversão de resíduos de asparagina em resíduos de ácido aspártico ou ácido isoaspártico, e conversão de glutamina em ácido glutâmico ou ácido isoglutâmico é contemplada em capsídeos de rAAV fornecidos no presente documen- to. Consultar, por exemplo, Giles et al., Molecular Therapy, 26(12):
2.848 a 2.862 (2018). Capsídeos modificados no presente documento também são contemplados por compreender sequências de alveja- mento que direcionam o rAAV para os tecidos alvejados e órgãos que necessitam de tratamento.
[0081] Plasmídeos de DNA fornecidos no presente documento compreendem genomas de rAAV descritos no presente documento. Os plasmídeos de DNA podem ser transferidos para células permissí- veis para infecção com um vírus auxiliar de AAV (por exemplo, adeno- vírus, adenovírus de E1 deletado ou herpesvírus) para montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas com proteínas de capsídeo de AAV9. Técnicas para produzir rAAV, em que um genoma de rAAV a ser embalado, genes de rep e cap, e funções de vírus auxi- liar são fornecidos a uma célula são padrão na técnica. A produção de partículas de rAAV necessita que os seguintes componentes estejam presentes dentro de uma única célula (denotada no presente docu- mento como uma célula de embalagem): um genoma de rAAV, genes de rep e cap de AAV separados do (isto é, não dentro do) genoma de rAAV e funções de vírus auxiliar. Os genes de rep e cap de AAV po- dem ser de qualquer serotipo de AAV para o qual vírus recombinante pode ser derivado e podem ser de um serotipo de AAV diferente das ITRs de genoma de rAAV. A produção de rAAV pseudotipado é divul- gada, por exemplo, no documento nº WO 01/83692 que é incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade. Em várias modalidades, proteínas de capsídeo de AAV podem ser modifi- cadas para aprimorar a entrega do rAAV recombinante. Modificações em proteínas de capsídeo são geralmente conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, os documentos nº U.S. 2005/0053922 e nº U.S. 2009/0202490, em que as divulgações dos mesmos estão incor- poradas a título de referência no presente documento em sua totalida- de.
[0082] Um método para gerar uma célula de embalagem é para criar uma linha celular que expressa de maneira estável todos os com- ponentes necessários para produção de rAAV. Por exemplo, um plas- mídeo (ou múltiplos plasmídeos) que compreende um genoma de rA- AV que carece de genes de rep e cap de AAV, genes de rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV e um marcador selecionável, tal como um gene de resistência à neomicina, pode ser integrado ao ge- noma de uma célula. Genomas de rAAV podem ser introduzidos em plasmídeos bacterianos através de procedimentos, tais como produ- ção de cauda de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6.
E.U.A., 79:2.077 a 2.081), adição de ligantes sintéticos que contêm sítios de clivagem de endonuclease de restrição (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65 a 73) ou por ligação de extremidade direta (Senapathy e Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4.661 a 4.666). A linha de célula de embalagem pode, então, ser infectada com um vírus auxiliar, tal como adenovírus. As vantagens desse método são que as células são sele- cionáveis e são adequadas para produção em grande escala de rAAV. Outros exemplos sem limitação de métodos adequados empregam adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir ge- nomas de rAAV e/ou genes de rep e cap em células de embalagem.
[0083] Princípios gerais de produção de partícula de rAAV são re- vistos em, por exemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechno- logy, 1.533 a 1.539; e Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97 a 129). Várias abordagens são descritas em Rats- chin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2.072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 81:6.466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3.251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1.963 (1988); e Le- bkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3.822 a 3.828); Patente nº U.S. 5.173.414; docu- mento nº WO 95/13365 e Patente nº U.S. 5.658.776 correspondente; documento nº WO 95/13392; documento nº WO 96/17947; documento nº PCT/US98/18600; documento nº WO 97/09441 (PCT/US96/14423); documento nº WO 97/08298 (PCT/US96/13872); documento nº WO 97/ 21825 (PCT/US96/20777); documento nº WO 97/06243 (PCT/FR96/ 01064); documento nº WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1.244 a 1.250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609 a 615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1.124 a 1.132; Patente nº U.S.
5.786.211; Patente nº U.S. 5.871.982; e Patente nº U.S. 6.258.595. Os documentos supracitados estão incorporados aqui a título de referên- cia em sua totalidade no presente documento, com ênfase particular naquelas seções dos documentos com relação à produção de partícu- la de rAAV.
[0084] São adicionalmente fornecidas no presente documento cé- lulas de embalagem que produzem partículas de rAAV infecciosas. Em uma modalidade, as células de embalagem podem ser células cance- rígenas estavelmente transformadas, tais como células HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linha 293 cognata). Em outra modalidade, células de embalagem podem ser células que não são transformadas células cancerígenas, tais como células 293 de passagem baixa (célu- las renais fetais humanas transformadas com E1 de adenovírus), célu- las MRC-5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), células Vero (células renais de macaco) e células FRhL-2 (células de pulmão fetal de rhesus).
[0085] Também são fornecidos no presente documento rAAV (por exemplo, partículas de rAAV encapsidadas infecciosas) que compre- endem um genoma de rAAV da divulgação. Os genomas do rAAV ca- recem DNA de rep e cap de AAV, isto é, não há DNA de rep ou cap de AAV entre as ITRs dos genomas do rAAV. O genoma de rAAV pode ser um genoma autocomplementar (sc). Um rAAV com um genoma sc é denominado no presente documento um scAAV. O genoma de rAAV pode ser um genoma de fita única (ss). Um rAAV com um genoma de fita única é denominado no presente documento um ssAAV.
[0086] Um rAAV exemplificativo fornecido no presente documento é o ScCAAV nomeado "scAAV9.CB.CLN6". O scAAV de scAAV9.CB.CLN6 contém um genoma de scAAV que compreende um cDNA de CLN6 humano sob o controle de um promotor de B-Actina de galinha híbrido (CB) (SEQ ID NO: 3). O genoma de scAAV também compreende uma sequência terminadora de Íntron de SV40 (a montante do cCDNA de CLN6 humano) e poliadenilação de Hormônio de Crescimento Bovino (Poli A de BGH) (a jusante do cDNA de CLN6 humano). A sequência desse cassete genético scAAV9.CB.CLNG6 é definida na SEQ ID NO:
4. O genoma de scAAV é embalado em um capsídeo de AAVO9 e inclui ITRs de AAV2 (uma ITR a montante do promotor de CB e a outra ITR a jusante da sequência terminadora de Poli A de BGH).
[0087] O rAAV pode ser purificado por métodos padrão na técnica, tal como por cromatografia de coluna ou gradientes de cloreto de cé- sio. Métodos para purificar rAAV de vírus auxiliar são conhecidos na técnica e podem incluir métodos divulgados, por exemplo, em Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1.031 a 1.039 (1999); Schenpp e Clark, Methods Mol. Med., 69: 427 a 443 (2002); Patente nº U.S. 6.566.118 e documento nº WO 98/09657.
[0088] Composições que compreendem rAAV também são forne- cidas. Composições compreendem um rAAV que codifica um polipep- tídeo de CLN6. Composições podem incluir dois ou mais rAAV que codificam diferentes polipeptídeos de interesse. Em algumas modali- dades, o rAAV é scAAV ou ssAAV.
[0089] Composições fornecidas no presente documento compre- endem rAAV e um excipiente farmaceuticamente aceitável ou excipi- entes. Excipientes aceitáveis não são tóxicos para recipientes e são preferencialmente inertes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, porém, sem limitação a, tampões, tais como fosfato [por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)], citrato ou ou- tros ácidos orgânicos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico; poli- peptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina sé- rica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como po- livinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagi- na, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros car- boidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelan- tes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons de formação de sal, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais como Tween, copolímeros, tais como poloxâmero 188, plurônicos (por exemplo, Plurônico F68) ou polietilenoglicol (PEG). Composições fornecidas no presente documento podem compreender um excipiente aquoso farmaceuticamente aceitável que contém um composto de baixa osmolaridade não iônico, tal como iobitridol, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromida, ioversol ou ioxilan, em que o excipiente aquoso que contém o composto de baixa osmolaridade não iônico pode ter uma ou mais dentre as seguintes características: cerca de 180 mg/ml, uma osmolalidade por osmometria de pressão e vapor de cerca de 322 mOsm/kg de água, uma osmolaridade de cerca de 273 mOsm/l, uma viscosidade absoluta de cerca de 0,0023 Pas (2,3 cp) a 20ºC e cerca de 0,0015 Pas (1,5 cp) a 37ºC, e uma gravidade específica de cerca de 1,164 a 37ºC. Composições exemplificativas compreendem cerca de 20 a 40% de composto de baixa osmolaridade não iônico ou cerca de 25% a cerca de 35% decomposto de baixa os- molaridade não iônico. Uma composição exemplificativa compreende SCAAV ou partículas virais de rAAV formuladas em Tris a 20 mm (pH 8,0), MgCl2 a 1 mm, NaCl a 200 mm, poloxâmero 188 a 0,001% e cer- ca de 25% a cerca de 35% de composto de baixa osmolaridade não iônico. Outra composição exemplificativa compreende scAAV formu- lado e 1X PBS e Plurônico F68 a 0,001%.
[0090] Dosagens de rAAV a serem administradas em métodos da divulgação variarão dependendo, por exemplo, do rAAV particular, do modo de administração, do tempo de administração, do objetivo de tratamento, do indivíduo e do tipo (ou tipos) de célula que é alvejado, e podem ser determinadas por métodos padrão na técnica. Dosagens podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg). Dosagens contempladas no presente documento incluem cerca de 1x10!, cerca de 1x10"?, cerca de 1x10%3, cerca de 1,1x103, cerca de 1,2x103, cer- ca de 1,3x10%3, cerca de 1,5x10%3, cerca de 2x103, cerca de 2,5x10"3,
cerca de 3x10º3, cerca de 3,5x10"%, cerca de 4x10º3, cerca de 4,5x10%3, cerca de 5x103, cerca de 6x10*3, cerca de 1x10º%, cerca de 2x10%4, cerca de 3x10%, cerca de 4x10%, cerca de 5x10%%, cerca de 1x10%5, a cerca de 1x10'8, ou mais genomas virais totais. Dosagens de cerca de 1x10'' a cerca de 1x10'* vg, cerca de 1x10º? a cerca de 1x10*º vg, cerca de 1x10? a cerca de 1x10** vg, cerca de 1x10"º a cerca de 6x10* vg, e cerca de 6x10? a cerca de 1,0x10** vg também são contemplados. Uma dose exemplificada no presente documento é 6x10º*? vg. Outra dose exemplificada no presente documento é 1,5x1083.
[0091] Métodos para transduzir células-alvo (que incluem, porém, sem limitação à célula do sistema nervoso, células nervosas ou gliais) com rAAV são fornecidos. As células do sistema nervoso incluem neu- rônios motores inferiores, células microgliais, oligodendrócitos, astróci- tos, células Schwann ou combinações dos mesmos.
[0092] O termo "transdução" é usado para se referir à administra- ção/entrega do polinucleotídeo de CLN6 a uma célula-alvo in vivo ou in vitro, por meio de um rAAV deficiente em replicação da divulgação que resulta em expressão de um polipeptídeo funcional pela célula de reci- piente. Transdução de células com rAAV da divulgação resulta em ex- pressão prolongada de polipeptídeo ou RNA codificado pelo rAAV. À presente divulgação fornece, assim, métodos para administrar/entre- gar a um indivíduo rAAV que codifica um polipeptídeo de CLN6 por uma rota intratecal, intracerebroventricular, intraparequímica ou intra- venosa, ou qualquer combinação das mesmas. Entrega intratecal se refere à entrega no espaço sob a membrana aracnoide do cérebro ou medula espinhal. Em algumas modalidades, administração intratecal é por meio da administração intracisternal.
[0093] Administração intratecal é exemplificada no presente do- cumento. Esses métodos incluem transduzir células-alvo (que incluem,
porém, sem limitação às células nervosas e/ou gliais) com um ou mais rAAV descritos no presente documento. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV que compreende um polinucleotídeo que codifi- ca um polipeptídeo de CLN6 é administrada ou entregue ao cérebro e/ou medula espinhal de um paciente. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é entregue ao cérebro. Áreas do cérebro contempladas para a entrega incluem, porém, sem limitação ao córtex motor, córtex visual, cerebelo e ao tronco encefálico. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é entregue à medula espinhal. Em algumas modalida- des, o polinucleotídeo é entregue a um neurônio motor inferior. O poli- nucleotídeo pode ser entregue às células nervosas e gliais. A célula glial é uma célula microglial, um oligodendrócito ou um astrócito. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é entregue a uma célula Schwann.
[0094] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos no pre- sente documento, o paciente é mantido na posição de Trendelenberg (posição de cabeça para baixo) após administração do rAAV (por exemplo, durante cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15 ou cerca de 20 minutos). Por exemplo, o paciente pode estar inclinado na posição de cabeça para baixo em cerca de 1 grau a cerca de 30 graus, cerca de a cerca de 30 graus, cerca de 30 a cerca de 60 graus, cerca de 60 a cerca de 90 graus, ou cerca de 90 a cerca de 180 graus.
[0095] Os métodos fornecidos no presente documento compreen- dem a etapa de administrar uma dose eficaz, ou múltiplas doses efica- zes, de uma composição que compreende um rAAV fornecido no pre- sente documento a um indivíduo (por exemplo, um animal que inclui, porém, sem limitação a, um paciente humano) em necessidade da mesma. Se a dose for administrada antes do desenvolvimento da do- ença de Batten CLNG6, a administração é profilática. Se a dose for ad- ministrada após o desenvolvimento da doença de Batten CLNG6, a ad-
ministração é terapêutica. Uma dose eficaz é uma dose que alivia (eli- mina, estabiliza ou reduz) pelo menos um sintoma associado à doen- ça, que retarda ou evita progressão da doença, que diminui o grau da doença, que resulta em remissão (parcial ou total) da doença e/ou que prolonga sobrevivência. Em comparação com o indivíduo antes do tra- tamento ou em comparação com um indivíduo não tratado, métodos fornecidos no presente documento resultam em estabilização, pro- gressão reduzida ou melhora em uma ou mais das escalas que são usadas para avaliar a progressão e/ou melhora em doença de Batten CLNG6, por exemplo, o Sistema de Classificação de Doença de Batten Unificado (UBDRS), a Escala de Linguagem e função Motora de Ham- burgo ou as Escalas de Mullen de Aprendizado Precoce (MSEL). As escalas de avaliação do UBDRS (conforme descritas em Marshall et al., Neurology. 2005 65(2):275 a 279) [que incluem a escala de avalia- ção física de UBDRS, a escala de avaliação de convulsão de UBDRS, a escala de avaliação comportamental de UBDRS, a escala de avalia- ção de capacidade de UBDRS, a sequência de UBDRS de início de sintoma e as Impressões Clínicas Globais de UBDRS (CGlI)]; a escala da Qualidade Pediátrica de Escala de Vida (PEDSQOL), função moto- ra, função de linguagem, função cognitiva, e sobrevivência. Em com- paração com o indivíduo antes do tratamento ou em comparação com um indivíduo não tratado, métodos fornecidos no presente documento podem resultar em um ou mais dentre os seguintes: acúmulo lisossô- mico reduzido ou retardado de material de armazenamento autofluo- rescente, acúmulo lisossômico reduzido ou retardado de Subunidade C de ATP Sintase, ativação glial reduzida ou retardada (astrócitos e/ou micróglia); astrocitose reduzida ou retardada, e mostraram uma redu- ção ou atraso em perda de volume cerebral medido por ressonância magnética.
[0096] Terapias de combinação também são fornecidas. Combina-
ção, conforme usado no presente documento, inclui tratamento simul- tâneo ou tratamento sequencial. Combinações de métodos descritos no presente documento com tratamentos médicos padrão são especi- ficamente contempladas. Além disso, combinações de composições (por exemplo, uma combinação de scAAV9.P546.CLN6 e um agente de contraste divulgado no presente documento) para uso de acordo com a invenção - seja tratamento simultâneo ou tratamento sequencial - são especificamente contempladas.
[0097] Embora a entrega a um indivíduo em necessidade da mesma após o nascimento seja contemplada, entrega intrauterina a um feto também é contemplada.
[0098] Embora os seguintes exemplos descrevam modalidades específicas, entende-se que variações e modificações ocorrerão para aqueles versados na técnica. Consequentemente, apenas tais limitações como aparecem nas reivindicações deveriam ser colocadas na invenção.
[0099] Nos Exemplos, um AAV autocomplementar (denominado SCcAAV9.CB.CLN6) que carrega um cDNA de CLNG6 sob o controle de um promotor de B-actina de galinha (CB) híbrido foi produzido. Injeção de IVC (6x10'? vg/animal) em CSF de camundongos de 1 dia pós-natal foi suficiente para induzir proteína de CLN6 de expressão robusta es- tável pelo CNS durante até 18 meses. A progressão da doença de Bat- ten CLN6 é associada ao acúmulo de ASM, agregação de subunidade C de ATP sintase, densidade de espinha sináptica diminuída, reativi- dade de GFAP aumentada em astrócitos e coloração de CD68 aumen- tada em micróglia. Camundongos CIn6"* exibem aumentos em ASM e subunidade C de ATP sintase, e espinhas dendríticas diminuídas em dois meses, e reatividade de GFAP e CD68 aumentada em seis meses de idade. Injeção de scAAV9.CB.CLN6 em camundongos Cin6"“ re- duziu acúmulo de ASM e subunidade C de ATP sintase, aumentou a densidade de espinha dendrítica e reduziu níveis de reatividade micro- glial de CD68+ e astocítica de GFAP+. EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE scAAV9.CB.CLN6
[00100] Um clone de cDNA de CLN6 humano foi obtido a partir de Origene, Rockville, MD. cDNA de hCLNG6 foi adicionalmente subclona- do em um genoma de AAV9 sob o promotor de B-Actina de galinha híbrido (CB) e testado in vitro e in vivo. Um genoma viral de serotipo 9 de vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV) que compreende o gene de CLN6 humano (hCLN6) sob controle do promotor de B- actina de galinha (CB) híbrido foi gerado. Um esquema do construto de plasmídeo que mostra o cDNA de CLNG6 inserido entre ITRs de AAV?2 é fornecido na Figura 1A. O construto de plasmídeo também inclui o promotor de CP, um íntron quimérico de vírus símio 40 (SV40) e um sinal de poliadenilação (PoliA de BGH) de Hormônio de Cresci- mento Bovino (BGH).
[00101] scAAV9.CB.CLNG6 foi produzido sob condições de cGMP por procedimentos de transfecção de plasmídeo triplo transientes com o uso de um vetor de CB-CLNG6 à base de ITR de AAV? de fita dupla, com um plasmídeo que codifica sequência de Rep2Cap9, conforme anteriormente descrito (Gao et al., J. Virol., 78: 6.381 a 6.388 (2004)) juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA) em células HEK293 (36). A pureza e titulação do ve- tor foram avaliadas por 4 a 12% de eletroforese de gel de acrilamida- dodecil sulfato de sódio e coloração de prata e análise de qPCR. Após clonagem, expressão transgênica foi verificada in vitro em células HEK293, assim como in vivo por meio de eletroporação de ICV in ute- ro no dia 15,5 embriônico (consultar a Figura 1B e a Figura 1C). Essa análise confirmou alvejamento e expressão neuronal da proteína de CLNG6 humana in vivo.
EXEMPLO 2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE scAAV9.CB.CLN6 ENTREGUE EM CSF EM CAMUNDONGOS CLN6"º
[00102] Para confirmar a expressão e biodistribuição de CLN6 hu- mano introduzido viralmente em camundongos, scAAV9.CB.CLNG foi administrado em camundongos ClIn6"* por meio de uma injeção intra- cerebroventricular (ICV) única dentro de 24 horas após nascimento e expressão foi monitorada em vários pontos no tempo durante um perí- odo de dois meses. Camundongos de tipo selvagem e Cin6"“ injeta- dos com um volume igual de PBS serviram como controles. A dose administrada eficaz foi 5x10º*º vg/camundongo com o uso da titulação de núcleo de vetor viral de NCH. O scAAV9.CB.CLNG foi formulado em 1x PBS e Plurônico F68 a 0,001% ou formulado em Tris a 20 mm (pH 8,0), MgCI2 a 1 mm, NaCl a 200 mm, poloxâmero 188 a 0,001%.
[00103] Exame de expressão de hCLN6 por RT-PCR em 2,6 e 18 meses após injeção demonstrou expressão de hCLNG6 robusta e pro- longada, e no córtex de camundongos Cin6"* injetados com scA- AV9.CB.CLN6 em comparação com controles injetados com PBS (Fi- gura 2A, Figura 3A). Esses resultados foram similares aos níveis de expressão de scAAV9-CB-GFP anteriormente relatados (Consultar, por exemplo, Foust et al. Mol Ther. 2013; 21(12): 2.148 a 2.159, Foust et al., Nat Biotechnol. 2010; 28(3): 271 a 274, Meyer et al., Mol Ther. 2015; 23(3): 477 a 487). Na Figura 2A, os géis superiores e gráficos são géis de RT-PCR representativos e densitometria (normalizada pa- ra GAPDH). Esses dados demonstraram expressão de gene aumenta- da depois de entrega de scAAV9.CB.CLN6 em comparação com ca- mundongos Clin6"* injetados com PBS. Os géis inferiores e gráficos mostram expressão de proteína de CLN6 conforme medida por wes- tern blotting. Entrega de ICV do vetor de scAAV9.CB.CLN6 mostra um aumento marcado em expressão de proteína de hCLN6 no córtex ce- rebral de camundongos Clin6"º',
[00104] Para examinar a distribuição regional de expressão trans- gênica, um método de hibridização modificado in situ denominado RNAScopeoO foi usado para visualizar transcrição de hCLN6. Camun- dongos CIn6"* injetados com scAAV9.CB.CLN6 mantiveram uma transdução de difundida de hCLNG6 por todas as regiões do cérebro em 2, 6 e 18 meses, que incluem o córtex somatossensorial e núcleos de VPM/VPL do tálamo, duas regiões que foram se mostraram afetadas mais cedo na progressão de doença dos camundongos Cln6"** (Figura 2B, painéis esquerdos; Figura 3B; painéis superiores, Figura 44).
[00105] Para examinar expressão de proteína de hCLN6 dentro do CNS, imunoblotting de lisados cerebrais corticais coletados a partir de controles injetados com PBS e CIn6"* injetados com scAAV9.CB.CLN6 foi realizada com o uso de anticorpos anti-hCLN6. Idêntica àquela que foi vista com expressão de RNA, expressão de proteína de hCLNG6 ro- busta foi vista por todo o CNS em 2, 6 e 18 meses de idade (Figura 2B, painéis direitos, Figura 3B, painéis inferiores). Ademais, imu- nomarcação de tecido cerebral com o uso de anticorpos anti-hCLN6 con- firmou expressão por todo o cérebro de camundongos Clin6"* tratados com scAAV9.CB.CLN6 (Figura 4B). Em conjunto, essas constatações demonstraram que a entrega de CSF de scAAV9.CB.CLNG6 por meio de injeção ICV teve capacidade para produzir de maneira estável trans- crição de hCLN6 e proteína nas regiões relevantes de doença do CNS. MELHORAS DE PATOLOGIA DEPOIS DA ENTREGA DE SCA- AV9.CB.CLN6 ACÚMULO DE MATERIAL DE ARMAZENAMENTO AUTOFLUORES- CENTE (ASM)
[00106] Acúmulo de material de armazenamento autofluorescente (ASM) é o marcador histológico do marco para a progressão de doença de Batten (Mole et al., Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis. 2015;
1.852(10):2.237 a 2.241; Cotman et al., Clin Lipidol. fevereiro de 2012; 7(1):79 a 91; Seehafer et al., Neurobiol Aging. 2006;27:576 a 588). Acú- mulo de ASM é um indicador forte para progressão de doença para di- versas formas de doença de Batten (Bosch et al., J Neurosci. 2016; 36(37):9.669 a 9.682; Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11): e78694). É contemplado no presente documento que a redução de ASM seja usada como indicador de tratamento bem-sucedido.
[00107] Em2,6e18 meses após tratamento, camundongos Cln6" injetados com scAAV9.CB.CLN6 reduziu acúmulo de ASM dentro dos núcleos de VPM/VPL do tálamo e córtex somatossensorial do cérebro em comparação com camundongos injetados com PBS (Figura 5, Fi- gura 3C). Visto queos camundongos Clin6nclf tratados com PBS mor- reram com 15 meses de idade (Figura 9D), camundongos Cln6"* tra- tados com PBS de 12 a 14 meses de idade moribundos foram usados como uma comparação com camundongos Cin6"* tratados com scA- AV9.CB.CLNG6 de 18 meses de idade. Notavelmente, a quantidade de acúmulo de ASM nesses camundongos ClIn6"* injetados com scA- AV9.CB.CLN6 de 18 meses de idade foi comparável aos camundon- gos de tipo selvagem não tratados de idade correspondida. A Figura 9E demonstra que camundongos tratados com scAAV9.CB.CLN6 ma- chos (painel esquerdo) e fêmeas (painel direito) têm pesos corporais similares aos camundongos de tipo selvagem, de idade para idade, enquanto camundongos CIn6"* não tratados diminuem ao longo do período do estudo. Camundongos Cin6"* injetados com PBS (Cin6" PBS) começaram a perder peso por volta dos 10 a 11 meses de idade (machos) e 13 a 14 meses de idade (fêmeas).
[00108] —Acúmulo de subunidade C de ATP sintase foi analisado no tecido cerebral dos camundongos CIn6"** injetados com PBS ou ca- mundongos CIn6"* injetados com scAAV9.CB.CLNG de tipo selvagem. Em indivíduos saudáveis, essa proteína é parte da cadeia respiratória na membrana mitocondrial, porém, em pacientes que sofre da doença de Batten, a proteína se acumula de maneira aberrante em lisossomas (Palmer et al., Am J Med Genet.1992;42(4):561 a 567). No camundon- go CIn6"**”, em comparação com animais de tipo selvagem, acúmulo de subunidade C é aparente em 2 meses de idade no núcleo póstero- medial ventral e núcleo póstero-lateral ventral do tálamo (região de VPM/VPL), uma região do cérebro frequentemente afetada precocemen- te em modelos de camundongo NCL (Morgan et al, PLoS One. 2013;8(11):e78694; Pontikis et al., Neurobiol Dis. 2005;20(3):823 a 836). Em 2, 6 e 18 meses de idade, camundongos Cin6" tratados com scA- AV9.CB.CLNG6 tiveram níveis significativamente reduzidos de acúmulo de subunidade C de ATP sintase dentro de VPM/VPL e córtex somatossen- sorial do cérebro, em comparação com camundongos Cln6"** de contro- le injetados com PBS (Figura 6; Figura 3C; painéis inferiores).
[00109] Além do acúmulo aberrante de material de armazenamento e acúmulo de sub C de ATP sintase, outros marcadores histológicos de progressão de doença tanto em pacientes humanos quanto em modelos animais incluem ativação de astrócitos e micróglia (Cotman et al., Hum Mol Genet. 2002;11(22):2.709 a 2.721; Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694; Pontikis et al., Neurobiol Dis. 2005;20(3):823 a 836; Palmer et al., Am J Med Genet. 1992;42(4):561 a 567). Em par- ticular, micróglia reativas são preparadas para liberar mediadores pró- inflamatórios, tais como IL1-B26, que pode ser uma causa de contri- buição chave de morte de célula neuronal nos estágios posteriores de doença de Batten CLN6. Em 6 e 18 meses de idade, camundongos ClIn6"* que foram injetados com scAAV9.CB.CLNG6 tiveram ativação de astrócito significativamente reduzida (GFAP) e microgliose (CD68) em VPM/VPL e córtex somatossensorial em comparação com camundon- gos CIn6"* tratados com PBS moribundos (Figura 7 e Figura 8; res- pectivamente).
[00110] A Figura 7 demonstra que astrócitos ativados foram identi- ficados em seções de tálamo de VPM/VPL e córtex somatossensorial através de coloração para proteína ácida fibrilar glial (GFAP) em pon- tos no tempo de 6 e 18 meses. Gráficos mostram imunorreatividade de GFAP+ total.
[00111] A ativação glial também foi determinada em seções de VPM/VPL e córtex somatossensorial com o uso de coloração anti- CD68 como um marcador para micróglia ativadas. CD68 é uma proteí- na lisossômica que é regulada de maneira ascendente em células pre- paradas para funções pró-inflamatórias, tal como fagocitose (Seehafer et al., J] Neuroimunol. 2011;230:169 a 172). A Figura 8 demonstra que injeção de scAAV9.CB.CLNG6 reduz microgliose (reatividade de CD68) no córtex somatossensorial de 6 M de camundongos CIn6"** e tanto em VPM/VPL quanto em córtex somatossensorial de 18 M de camun- dongos Cin6"f. Gráficos mostram imunorreatividade de CD68+ total. As entradas na Figura 8 mostraram morfologia de micróglia. Vale no- tar que os camundongos Cin6"" não tratados analisados nesses estu- dos eram moribundos e muitas das micróglias estavam morrendo ou mortas, o que contribui para sua morfologia incomum. Em conjunto, esses resultados indicaram que uma única injeção que entrega scA- AV9.CB.CLN6 no CSF no dia 1 pós-natal pode reduzir ou atrasar di- versas das patologias clássicas de doença de Batten CLN6 nos cére- bros de camundongos Cin6"", MELHORAS COMPORTAMENTAIS DEPOIS DA ENTREGA DE scA- AV9.CB.CLN6
[00112] No estudo de eficácia para scCAAV9.CB.CLN6, ao começar em 2 meses de idade, e continuar em intervalos de 2 meses, camun- dongos foram submetidos a uma bateria de paradigmas de teste com- portamental que incluem: ensaios rotarod de aceleração e escalada de poste para testar função e coordenação motora, assim como labirinto aquático de Morris para avaliar o aprendizado e a memória. Animais foram acompanhados por 24 meses após injeção e estudos estão em andamento.
[00113] Trabalho anterior demonstrou que o modelo de camundon- go CIn6"** da doença de Batten CLNG6 recapitula diversos dos défices motor, cognitivo e de sobrevivência vistos em seres humanos (Morgan et al., PLoS One. 2013;8(11):e78694). No estudo de eficácia, usar o rotarod como uma medida clássica de coordenação motora, camun- dongos CIn6"º* injetados com PBS começam a mostrar um declínio em desempenho de rotarod com 8 meses de idade em comparação com o tipo selvagem. No entanto, injeção de camundongos CIn6"º* com scA- AV9.CB.CLNG6 evitou esse declínio, um efeito que continuou pela du- ração do período de estudo inteiro (24 meses) (Figura 9A). Para estu- dar mais os efeitos da coordenação motora em detalhes, animais fo- ram submetidos a várias tarefas motoras (avaliação de agarramento de membro posterior, habilidade em se abaixar a partir de uma borda e passo) em 12, 18 e 24 meses de idade e avaliados com o uso de uma matriz de pontuação, em que a maior pontuação é o pior prognóstico (Guyenet et al., Journal of visualized experiments: JoVE. 201039). Em comparação com camundongos CIn6"º* tratados com PBS, camun- dongos tratados com scAAV9.CB.CLN6 mostraram pontuações com- binadas significativamente menores em todos os pontos no tempo, com um leve aumento em sua pontuação apenas aos 24 meses de idade (Figura 9B).
[00114] Noteste de Labirinto Aquático de Morris, animais foram co- locados em uma piscina cheia de água que contém uma plataforma oculta. Após treinamento, o tempo que levou para os animais encon- trarem a plataforma oculta com o uso de estímulos ambientais para orientação foi medido como um sinal de capacidades de aprendizado e memória.
[00115] — Camundongos CiIn6"** tratados com PBS tiveram desempe- nho fraco na tarefa começando aos nove meses de idade, indicado por sua habilidade reduzida em encontrar a plataforma oculta (Figura 9C). Visto que as velocidades de nado de camundongos Cln6"* tratados com PBS foram significativamente reduzidas em 11 e 12 meses de idade, não foi possível chegar a nenhuma conclusão sobre suas capa- cidades de memória e aprendizado nesses pontos no tempo posterio- res (Figura 10A). Tratamento de camundongos CIn6"** com scA- AV9.CB.CLNG6 corrigiu esse défice de memória e aprendizado até 12 meses após injeção (Figura 9C). Ao comparar camundongos de tipo selvagem com animais tratados com scAAV9.CB.CLN6 apenas em pontos no tempo posteriores no teste de labirinto aquático de Morris, constatou-se que mesmo os camundongos tratados precisaram de mais tempo para encontrar a plataforma aos 18 e 24 meses, enquanto a velocidade de nado foi a mesma entre todos os grupos de teste (Fi- gura 9C, Figura 10). Para avaliar memória e aprendizado em pontos no tempo posteriores, camundongos foram submetidos a um teste in- verso de labirinto aquático aos 12, 18 e 24 meses de idade em que a plataforma foi movida para um local novo. Camundongos Cln6" trata- dos com scAAV9.CB.CLN6 também demoraram significativamente mais para encontrar o novo local de plataforma em comparação com camundongos de tipo selvagem nesse teste (Figura 10). Tidos em conjunto, esses resultados indicaram que um único tratamento de
ScAAV9.CB.CLNG6 evitou diversos dos declínios de função motora vis- tos nesses animais, porém, não evita completamente défices de me- mória e aprendizado quando os camundongos foram testados em pon- tos no tempo posteriores. MELHORA EM SOBREVIVÊNCIA DEPOIS DA ENTREGA DE scA- AV9.CB.CLN6
[00116] “Camundongos CIn6"* são conhecidos por ter sobrevivência reduzida em comparação com seus homólogos de tipo selvagem (Gu- yenet et al., Journal of visualized experiments: JoVE. 201039). A so- brevivência de camundongos CIn6"** injetados com PBS e scA- AV9.CB.CLNG6 foi comparada com camundongos de tipo selvagem in- jetados com PBS. Uma única injeção ICV de scAAV9.CB.CLN6 no CSF de camundongos Cln6"* aumentou significativamente sua sobre- vivência em comparação com camundongos CIn6"** injetados com PBS (Figura 9D). Embora a mediana de sobrevivência de camundon- gos tratados com PBS tenha sido de 14 meses, camundongos Clin6" tratados com scAAV9.CB.CLNG6 tiveram uma mediana de sobrevivên- cia de 21,5 meses. Esse aumento de 65% na taxa de sobrevivência foi altamente significativa. Além disso, a curva de sobrevivência de ca- mundongos Cin6" tratados com scAAV9.CB.CLNG6 não foi significati- vamente diferente de animais de tipo selvagem.
[00117] — Adicionalmente, como uma medição de saúde geral, o peso corporal foi gravado mensalmente. A melhora em saúde e sobrevivên- cia também foi destacada pela habilidade de camundongos tratados com scAAV9.CB.CLN6 em manter seu peso corporal, na medida em que nenhuma diferença foi observada em comparação com animais de tipo selvagem, enquanto Cin6" tratados com PBS começaram a per- der peso por volta de 10 a 12 meses (Figura 9E).
[00118] Um estudo de segurança com 172 camundongos de tipo selvagem tratados com PBS e 223 camundongos de tipo selvagem tratados com 5x10*º vg/animal foi realizado. Esse estudo demonstrou que scAAV9.CB.CLNG6 foi bastante tolerado até 24 semanas sem efei- tos negativos atribuíveis ao vírus (dados não mostrados). Tidos em conjunto, essa é a extensão de sobrevivência mais longa no modelo de camundongo Cin6"* até hoje, e indicam a utilidade de um único tratamento de scAAV9.CB.CLNG6 para recuperar ambos défices celular e funcional da doença de Batten CLN6. EXEMPLO 3 ESTUDO DE SEGURANÇA DE scAAV9.CB.CLN6 EM PRIMATAS
[00119] Para testar segurança desse tratamento em um modelo animal grande mais relevante aos pacientes humanos, 3 macacos ci- nomolgos machos de quatro anos de idade foram administrados com SCcAAV9.CB.CLNG6 formulado em 1x PBS e Plurônico F68 a 0,001%.
[00120] Os animais foram sacrificados 1, 3 ou 6 meses após inje- ção. Cada indivíduo recebeu uma única injeção intratecal lombar, que entrega o vetor viral diretamente no CSF a uma dose de 6 x 10º partí- culas virais por animal. Após a injeção, os animais foram mantidos em uma posição de Trendelenburg por 15 minutos com a cabeça voltada para baixo em um ângulo de 45 graus para facilitar alvejamento do cé- rebro e áreas da medula espinhal superiores.
[00121] Todos os indivíduos se recuperaram bem da injeção e não mostraram qualquer comportamento anormal. Hematologia e Química Sérica foram realizadas em até 5 pontos no tempo durante o estudo (linha de base, 1, 2, 3 e 6 meses) e não revelaram grandes anormali- dades. Em particular, nenhuma evidência de elevação em níveis de enzima aspartato aminotransferase (AST) ou fosfato alcalino foi encon- trada, enquanto alanina aminotransferase (ALT) foi levemente aumen- tada em um animal em 1 mês após injeção (abaixo de 200 unidades por litro) (Figura 11C).
[00122] “Nenhuma alteração foi encontrada em níveis de proteína total, creatinina, triglicerídeos, glicose ou íons, tais como níveis de fós- foro, cálcio, magnésio ou sódio. Histopatologia extensiva, assim como análise de expressão transgênica foi realizada para cada animal no momento em que foram sacrificados. Nenhuma anormalidade foi en- contrada em nenhum tecido analisado que inclui várias regiões do cé- rebro e medula espinhal, coração, pulmão, fígado, baço, rim, intestino delgado, músculos esqueléticos (diafragma, tríceps, TA, gastrocnê- mio), gônadas exceto um animal que exibiu uma infecção na bexiga no momento da necropsia.
[00123] A única injeção intratecal lombar que entrega scAAV9.CB. CLNG6 no fluido cérebro-espinhal induziu alta expressão do transgene por todo o cérebro e medula espinhal de primatas não humanos, con- forme mostrado por western blot fluorescente. As manchas na Figura 11A mostram expressão de CLN6 no córtex, no corpo caloso, matéria branca periventricular, hipocampo, cerebelo, tálamo, cervical medula espinhal, medula espinhal torácica, alta expressão de medula espinhal lombar do transgene foi encontrada por todo o cérebro e medula espi- nhal em todo os três animais (Figuras 11A a 11B). Em conjunto, es- ses dados indicaram que o tratamento com scAAV9.CB.CLNG6 foi bem tolerado e seguro em todos os três indivíduos testados. EXMEPLO 4 ENSAIO CLÍNICO DE TERAPIA GÊNICA DE scAAV9.CB.CLN6
[00124] OscAAV9.CB.CLNG6 é entregue intratecalmente a pacientes humanos com doença de Batten CLNG6.
[00125] O scAAV para o ensaio clínico foi produzido pela Instalação de Fabricação Clínica do Hospital Nacional das Crianças com o uso de um método de tripla transfecção de células HEK293, sob condições de GMP, conforme descrito no Exemplo 1.
[00126] Pacientes selecionados para participação tinham um ano ou mais com um diagnóstico de doença CLN6 conforme determinado por genótipo. O primeiro coorte (n = 12) recebeu uma transferência de gene de uma vez, uma dose de 1,5x10? vg total de scAAV por pacien- te. O seé«AAV9.CB.CLNG foi formulado Tris a 20 mm (pH 8,0), MgCl2 a 1 mm, NaCl a 200 mm, poloxâmero 188 a 0,001% e cerca de 20% a cer- ca de 40% de composto de baixa osmolaridade não iônico e foi entre- gue uma vez através de um cateter intratecal inserido por uma perfu- ração lombar na interespinhosa no espaço subaracnoide do saco tecal lombar. A segurança foi avaliada em bases clínicas, e por exame de marcas de segurança. Houve um mínimo de quatro semanas entre inscrições de cada indivíduo para permitir revisão dos dados de segu- rança de transferência pós-gene no Dia 30.
[00127] Dados preliminares fornecidos no presente documento rela- tam sobre dez pacientes que foram tratados e a duração de acompa- nhamento média foi de 12 meses (na faixa de 1 a 24 meses após tra- tamento). Os dados preliminares demonstraram que a administração de scAAV9.CB.CLNG6 foi geralmente bem tolerada. A maior parte dos eventos adversos foram leves e não relacionados ao tratamento. Qualquer resposta de célula T e elevação de anticorpo observadas não estavam associadas às manifestações clínicas e nenhuma altera- ção no tratamento foi necessária.
[00128] A Figura 12 fornece dados preliminares que relatam pro- gressão de doença conforme medido pela Escala de função Motora e Linguagem de Hamburgo após injeção em dois pares de irmãos em estudo. Esses pares de irmãos têm o mesmo genótipo de mutação gCLN6.
[00129] São fornecidos no presente documento os dados de oito dos pacientes tratados para o estudo clínico em andamento. Os 8 pa- cientes descritos no presente documento foram administrados e ex-
postos a scAAV9.CB.CLNG6 por pelo menos 17 meses. As informações de linha de base para esses 8 pacientes são fornecidas abaixo. Paciente Gênero Idade, na oo Duração da feição TETE dadas ns SRA TA SA Ar De efONST) 1 F 63 39 3 25 2 F 30 38 6 23 3 M 36 36 5 24 4 M 66 28 4 24 F 79 27 3 24 6 M 56 26 5 24 7 M 19 20 5 19 8 M 61 17 4 16
[00130] Os dados do estudo clínico de 24 meses em andamento indicaram que uma única administração intratecal de scAAV9.CB. CLNG foi, em geral, bem tolerada. Houve 137 eventos adversos relata- dos. A maior parte dos eventos adversos (AEs) foi leve e não relacio- nada ao tratamento. Houve 9 eventos adversos de grau 3 (graves) re- latados em 4 pacientes (denotados como EAGs). Três dos 9 SAEs fo- ram considerados possivelmente relacionados ao tratamento. Os eventos relacionados incluíram vômito (2), dor epigástrica (1) e febre (1) e todos os quatro pacientes se recuperaram. Não houve eventos adversos de grau 4 (risco de vida) ou grau 5 (morte) relatados. Ne- nhum padrão de eventos adversos relacionados ao capsídeo anti- AAV9 ou imunogenicidade anti-CLN6.
[00131] A Figura 15 fornece dados de eficácia que mostram um im- pacto positivo na função motora e da linguagem. Em 7 de 8 dos paci- entes tratados com scAAV9.CB.CLN6, a pontuação de Hamburgo foi mantida ou teve uma mudança inicial (+1 a -1 pontos) seguida de es- tabilização. O paciente mais velho neste estudo (tratado aos 79 meses de idade) teve um declínio de dois pontos. Os dados de histórico natu- ral sugeriram um declínio de 2 a 3 pontos na Escala de função Motora e Linguagem de Hamburg ao longo de 24 meses após o início dos sin- tomas.
[00132] As Figuras 16A a 16C fornecem dados de comparação de irmãos, todos com doença CLNG6. Os pacientes tratados demonstraram estabilização em relação aos irmãos não tratados que experimentaram declínios substanciais na habilidade motora e de linguagem ou morre- ram no mesmo período de tempo. Esses dados são fornecidos como Pontuação de Hamburgo: Função Motora + Linguagem ao longo do tempo. A Figura 16A fornece as pontuações agregadas, enquanto a Figura 16B fornece a Subpontuação de função Motora de Hamburgo e a Figura 16C fornece a Subpontuação da Linguagem de Hamburgo.
[00133] As Figuras 12A a 12C fornecem dados de comparação de irmãos em estudo para pares em estudo que foram ambos tratados com scAAV9.CB.CLN6. Esses dados indicaram que os irmãos mais novos demonstraram um aumento ou estabilização nas pontuações de função Motora e Linguagem de Hamburgo em comparação com os irmãos mais velhos que tiveram uma mudança inicial seguida de esta- bilização. A Figura 12A fornece as pontuações agregadas, enquanto a Figura 12B fornece a Subpontuação de função Motora de Hamburg e a Figura 12 C fornece a Subpontuação da Linguagem de Hamburg.
[00134] A Figura 17 compara os dados dos primeiros 8 pacientes tratados com scAAV9.CB.CLN6 com os dados de um estudo de histó- rico natural em andamento de pacientes CLN6 conduzido pelo Hospital Nationwide Children's Hospital (n = 14). É mostrada uma curva de Ka- plan-Meier para o tempo até a diminuição não revertida a partir da li- nha de base de 2 ou mais pontos na pontuação combinada para a fun- ção Motora e Linguagem de Hamburgo. As bandas de confiança são calculadas usando as estimativas de probabilidade de sobrevivência e seu erro padrão. A figura compara os pacientes com 22 pontos de de- clínio na pontuação combinada de função Motora e de Linguagem de Hamburgo no grupo tratado versus grupo de histórico natural ao longo de um período de 2 anos e transmite resultados que suportam a eficá-
cia da terapia da presente invenção, incluindo: (i) apenas 1 paciente tratado atingiu um declínio 22 pontos durante esse período em compa- ração com todos os 14 pacientes não tratados com histórico natural; e (ii) uma separação substancial dos pacientes tratados daqueles que não são tratados.
[00135] Em suma, os dados de eficácia de 24 meses demonstraram o seguinte: i) estabilização da doença, em contraste com irmãos não tratados que experimentaram rápido declínio em sua habilidade moto- ra e de linguagem, ii) pacientes mais jovens mostraram um aumento na pontuação ou estabilização, e ili) a maioria dos pacientes mais ve- lhos apresentou mudança inicial seguida de estabilização. Além disso, o tratamento foi, em geral, bem tolerado.
[00136] Se não houver preocupação de segurança, após o primeiro coorte ser avaliado um mês após injeção, indivíduos adicionais serão inscritos. Cada indivíduo em coorte 2 (n = 4) recebe uma dose escala- da de vetor viral. Há pelo menos uma janela de seis semanas entre a conclusão de Coorte 1 e o início de Coorte 2, para permitir a revisão da análise de segurança dos cinco pontos no tempo (dias 1, 2,7, 14 e 21) assim como revisão de DSMB antes da dosagem do próximo indi- víduo.
[00137] A progressão de doença é medida com as escalas UBDRS ou a Escala de função Motora e Linguagem de Hamburgo (citada na Descrição Detalhada acima) e o impacto de tratamento na qualidade de vida com o uso da escala de Qualidade de Vida Pediátrica (PEDSQOL), e potencial para sobrevivência prolongada.
[00138] A análise primária para eficácia é avaliada quando todos os pacientes concluíram o estudo de três anos. A base de determinação de eficácia é por estabilização ou progressão reduzida da doença com base na Escala de Classificação da Doença de Batten Unificada (UB-
DRS) bem estabelecida que foi desenvolvida especificamente para doença de Batten CLN6 ou a Escala de função Motora e Linguagem de Hamburgo. Após conclusão do período de estudo de três anos, pa- cientes serão monitorados anualmente por 5 anos conforme orienta- ção do FDA. EXEMPLO 5
ESTUDO DE HISTÓRICO NATURAL DEMONSTRA QUE A TERAPIA GÊNICA COM scAAV9.CB.CLN6 MELHORA AS PONTUAÇÕES DA
[00139] Para facilitar a comparação dos indivíduos do estudo (pri- meiros pacientes (n = 8) no estudo de transferência de gene CLN6) com indivíduos de histórico natural com relação ao curso clínico ao longo do tempo, pontuações da função motora (M) e de linguagem (L) da Escala de Hamburgo combinadas de pacientes com transferência de genes foram correspondidas aos dados combinados das pontua- ções de função motora e de linguagem da Escala de Hamburgo cole- tados de pacientes em um estudo retrospectivo de histórico natural CLN6 (Pl: Emily de los Reyes, MD; ClinicalTrials.gov Identifier: NCTO03285425). Pacientes com transferência de genes foram parea- dos com pacientes com histórico natural com base nas pontuações da função Motora e Linguagem de Hamburgo de linha de base e idade no momento da comparação (dentro de 12 meses).
[00140] Os dados para dados combinados e individuais para pontu- ações da função Motora e Linguagem de Hamburgo (n = 8) mostram que a terapia gênica CLN6 interrompe ou retarda substancialmente a progressão da doença com um impacto positivo na função motora e de linguagem em 7 de 8 pacientes (Figura 18). Um impacto positivo refe- re-se a pacientes que mantiveram a pontuação combinada de Ham- burgo ou tiveram uma alteração inicial (+1 a -1 pontos) seguida de es- tabilização. As pontuações de função motora e de linguagem separa-
das foram consistentes com a respectiva pontuação combinada.
[00141] Os dados para comparações combinadas de histórico natu- ral também mostram melhorias nas pontuações de funçãoMotora e de Linguagem de Hamburgo (Figura 19). Por meio de uma metodologia de correspondência muitos-para-um, as pontuações médias de função Motora e de Linguagem de Hamburgo dos pacientes com histórico na- tural correspondido no último ponto de tempo do período de compara- ção (para o respectivo paciente de transferência de gene) são plotados em vermelho versus o respectivo valor de função motora e de lingua- gem de Hamburgo do paciente com transferência de genes no último ponto no tempo (plotado em verde) (Figura 19). O número de pacien- tes com histórico natural em cada comparação é fornecido em cada figura junto com a diferença entre a pontuação de função motora e de linguagem de Hamburgo no último ponto no tempo (entre o paciente com transferência de gene e o valor médio do paciente com NH). Os dados de histórico natural coletados para pacientes com a doença CLN6-Batten (n = 11) em um estudo do Nationwide Children's Hospital e da Dra. Emily de los Reyes indicam que há um declínio bastante |i- near e quase sustentado de um ponto na pontuação de função Motora + Linguagem de Hamburgo por ano, dos dois aos sete anos de idade (Figura 20).
[00142] No geral, os dados desses estudos indicam que a maioria dos pacientes com transferência do gene CLN6 demonstra melhora nas pontuações de função motora e de linguagem em comparação com pacientes com histórico natural compatível. EXEMPLO 6
[00143] As Escalas de Mullen de Aprendizado Precoce (MSEL) fo- ram usadas para avaliar se a terapia gênica seAAV.CB.CLN6 melhora- va a capacidade de aprendizagem dos pacientes ao longo de 12 a 24 meses. A MSEL é uma medida padronizada e administrada individu- almente do funcionamento cognitivo, projetada para ser usada em cri- anças do nascimento aos 68 meses de idade. As subescalas do MSEL são função motora grossa, função motora fina, linguagem receptiva, linguagem expressiva e composição de aprendizagem precoce. (Con- sulte Mullen EM. (1995). Mullen Scales of Early Learning (AGS ed.). Circle Pines, MN: American Guidance Service Inc).
[00144] Os seguintes 4 domínios foram analisados em 8 pacientes: recepção visual, função motora, linguagem receptiva e linguagem ex- pressiva. As Figuras 21A e 21B fornecem as pontuações brutas para os 4 domínios. Pontuações mais altas indicam função superior.
[00145] Os dados provisórios de segurança e eficácia sugerem que a terapia gênica AAV9-CLN6 tem o potencial de estabilizar a progres- são da variante da doença de Batten CLNG6 de início infantil tardio. Os resultados de eficácia demonstraram um efeito significativo do trata- mento na função motora e da linguagem. Pacientes tratados com AAV9-CLN6 demonstraram melhora nas pontuações de função Motora e de Linguagem de Hamburgo em comparação com irmãos não trata- dos e valores médios de pacientes com histórico natural pareados por idade e pontuação de linha de base de função Motora e de Linguagem de Hamburgo. A comparação de irmãos mais novo e mais velho trata- dos sustenta ainda mais o benefício potencial da intervenção precoce da terapia gênica com AAV9-CLNG6. Pacientes mais jovens tratados demonstraram melhora ou estabilização nas habilidades cognitivas, conforme mostrado com a escala MSEL.
[00146] Embora modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas no presente documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas a título de exemplo apenas. Diversas variações, alterações e substitui- ções ocorrerão agora para aqueles versados na técnica sem que se afaste da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades descritas no presente documento podem ser emprega- das. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas inseridos do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes estejam cobertos desse modo.
[00147] Todos os documentos citados neste pedido estão incorpo- rados aqui a título de referência em sua totalidade.
Claims (76)
1. Vírus adenoassociado recombinante autocomplementar 9 (SCAAVO9), caracterizado pelo fato de que codifica o peptídeo de CLNG6, que compreende um genoma de scAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3": uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um pro- motor de CB que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
2. ScCAAV9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma de scAAV9 compreende na ordem de 5' a 3": uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um aprimorador de CMV, um promotor de CB que compreende a sequência de nucleo- tídeos da SEQ ID NO: 3, um íntron de SV40, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda re- petição de terminal invertido AAV.
3. SscCAAV9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma de scAAV9 compreende na ordem de 5' a 3": uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência da SEQ ID NO: 3, um polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1, uma se- quência poli A de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
4. scAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifi- ca o polipeptídeo de CLN6 compreende uma sequência pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2.
5. SscCAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
6. SscAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que o genoma de scAAV9 compreen- de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à se- quência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
7. ScCAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que o genoma de scAAV9 compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 95% idêntica à se- quência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
8. SscCAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o genoma de scAAV9 compreen- de a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
9. scAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as repetições de terminal inverti- do AAV são repetições de terminal invertido AAV2.
10. scAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o genoma de rAAV9 com- preende um genoma de fita única.
11. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência da SEQ ID NO: 3, uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
12. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindi- cação 11, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compre- ende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, um íntron SV40, uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
13. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica- ção 11, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira repe-
tição de terminal invertido AAV, um promotor de CB que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CLN6 da SEQ ID NO: 1, uma sequência poli A de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino e uma segun- da repetição de terminal invertido AAV.
14. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CLN6 compreende uma se- quência pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
15. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CLN6 compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
16. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que com- preende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 4.
17. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que com- preende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 4.
18. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que com- preende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
19. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizada pelo fato de que as re- petições de terminal invertido AAV são repetições de terminal invertido AAV?2.
20. Vírus adenoassociado recombinante autocomplementar
9 (scAAVO9), caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 11a19.
21. scAAV9, de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que compreende um genoma de fita única.
22. Partícula de rAAV, caracterizada pelo fato de que com- preende uma sequência de polinucleotídeos, como definida em qual- quer uma das reivindicações 11 a 19.
23. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que compreende um genoma de fita única.
24. Partícula viral de vírus adenoassociado recombinante 9 (rAAVO9), caracterizada pelo fato de que codifica um peptídeo de CLNG6, que compreende um genoma de rAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3: um aprimorador de CMV que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 6, um promotor de B-actina de galinha que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequên- cia de ácido nucleico SEQ ID NO: 3 e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
25. Partícula viral de rAAV9, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreende um genoma autocomplementar.
26. Partícula viral de rAAV9, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreende um genoma de fita única.
27. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreende na ordem de 5' a 3': uma primeira repetição de terminal invertido AAV, o aprimorador de CMV que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 6, o promotor de B-actina de galinha que compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idênti- ca à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
28. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizada pelo fato de que o polinucle- otídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 compreende uma sequên- cia de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
29. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 4.
30. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 4.
31. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizada pelo fato de que as repeti- ções de terminal invertido AAV são repetições de terminal invertido AAV?2.
32. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 31, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 ainda compreende um íntron de SV40.
33. Partícula viral de rAAV9, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 32, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 ainda compreende uma sequência poli-A de BGH.
34. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um genoma de rAAV9 que compreende na ordem de 5' a 3: uma primeira repetição de terminal invertido AAV, um aprimo- rador de CMV que tem uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6, um promotor de B-actina de galinha que tem uma sequência de ácido nu- cleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
35. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica- ção 34, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreen- de um genoma autocomplementar.
36. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica- ção 34, caracterizada pelo fato de que o genoma de rAAV9 compreen- de um genoma de fita única.
37. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizada pelo fato de que o ge- noma de rAAV9 compreende na ordem de 5' a 3': uma primeira repeti- ção de terminal invertido AAV, o aprimorador de CMV que tem uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6, o promotor de B-actina de galinha que tem uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CLN6 pelo menos 90% idêntico à sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e uma segunda repetição de terminal invertido AAV.
38. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizada pelo fato de que o poli- nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de CLN6 compreende uma se-
quência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de áci- dos nucleicos da SEQ ID NO: 2.
39. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizada pelo fato de que o ge- noma de rAAV9 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 4.
40. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizada pelo fato de que o ge- noma de rAAV9 compreende uma sequência pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 4.
41. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizada pelo fato de que as re- petições de terminal invertido AAV são repetições de terminal invertido AAV?2.
42. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 41, caracterizada pelo fato de que o ge- noma de rAAV9 ainda compreende um íntron de SV40.
43. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 42, caracterizada pelo fato de que o ge- noma de rAAV9 ainda compreende uma sequência poli-A de BGH.
44. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de um scAAV9, decomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 43, a partícula viral de rAAV9, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, e um ex- cipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que o excipiente compreende um composto de baixa osmolaridade não iônico, um tampão, um polímero, um sal ou uma combinação dos mesmos.
46. Método para tratar doença de Batten CLN6 em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indi- víduo uma composição que compreende uma quantidade terapeutica- mente eficaz do scAAV9, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, da partícula viral de rAAV9, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, do ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 43, ou da com- posição, como definida na reivindicação 44 ou 45.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que a composição é administrada por meio de uma ro- ta selecionada a partir do grupo que consiste em intratecal, intracere- broventricular, intraparenquimático, intravenosa e uma combinação das mesmas.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a composição é administrada intratecalmente.
49. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a composição é administrada intracerebroventricu- larmente.
50. Método, de acordo com a reivindicação 4746, caracteri- zado pelo fato de que a composição é administrada intravenosamente.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 50, caracterizado pelo fato de que cerca de 1x10! a cerca de 1x10** vg da partícula viral de rAAV9 é administrado.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 51, caracterizado pelo fato de que cerca de 1x10? a cerca de 1x10*º* da partícula viral de rAAV9 é administrado.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 52, caracterizado pelo fato de que o tratamento estabiliza ou retarda um ou mais sintomas de doença de Batten CLN-6 seleciona- dos a partir de:
(a) perda de volume cerebral; (b) perda de função cognitiva; e (c) atraso de linguagem; em comparação com um paciente com doença de Batten CLNG6 não tratado.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 52, caracterizado pelo fato de que o tratamento estabiliza ou retarda progressão de doença da doença de Batten CLN-6.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que a progressão da doença é avaliada com as esca- las UBDRS, a Escala da função Motora e de Linguagem de Hamburgo, o impacto do tratamento na qualidade de vida usando a escala de Qualidade de Vida Pediátrica (PEDSQOL), as Escalas de Mullen de Aprendizagem Precoce (MSEL), o potencial de sobrevivência prolon- gada ou uma combinação dos mesmos.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 55, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem 80 meses de idade ou menos, 75 meses ou menos, 70 meses ou menos, 65 me- ses ou menos, 62 meses ou menos, 60 meses ou menos, 55 meses ou menos, 50 meses ou menos, ou 40 meses ou menos.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 56, caracterizado pelo fato de que compreende ainda colo- car o indivíduo na posição de Trendelenberg após administrar a partí- cula viral de rAAV9.
58. Método para tratar uma doença CLN6 em um paciente que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende entregar uma composição que compreende o scAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a partícula viral de rA- AV9, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 4334, ou a composição, como definida na reivindica- ção 44 ou 45, em um cérebro ou medula espinhal de um paciente em necessidade da mesma.
59. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que a composição é entregue por injeção intratecal, intracerebroventricular, intraparenquimático ou intravenosa, ou uma combinação das mesmas.
60. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda colocar o paciente na posição de Trendelenberg após injeção intratecal da composição.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a composição compreen- de um agente de contraste baixa osmolaridade não iônico.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5861, caracterizado pelo fato de o agente de contraste de baixa osmolaridade não iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em iobitridol, ioexol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromida, ioversol, ioxilan e combinações dos mesmos.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a entrega ao cérebro ou medula espinhal compreende entrega a um tronco encefálico.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a entrega ao cérebro ou medula espinhal compreende entrega a um cerebelo.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a entrega ao cérebro ou medula espinhal compreende entrega a um córtex visual.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a entrega ao cérebro ou medula espinhal compreende entrega a um córtex motor.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 63, caracterizado pelo fato de que a entrega ao cérebro ou medula espinhal compreende entrega a uma célula nervosa, uma célu- la glial ou ambas.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 63, caracterizado pelo fato de que a entrega ao cérebro ou medula espinhal compreende entrega à célula do sistema nervoso, em que a célula do sistema nervoso é um neurônio, um neurônio motor inferior, uma célula microglial, um oligodendrócito, um astrócito, uma célula Schwann ou uma combinação dos mesmos.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 58 a 68, caracterizado pelo fato de que o tratamento estabiliza ou retarda um ou mais sintomas da doença de Batten CLN-6 seleciona- dos a partir de: (a) perda de volume cerebral; (b) perda de função cognitiva; e (c) atraso de linguagem; em comparação com um paciente com doença de Batten CLNG6 não tratado.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 58 a 68, caracterizado pelo fato de que o tratamento estabiliza ou retarda progressão de doença da doença de Batten CLN-6.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteriza- do pelo fato de que a progressão da doença é avaliada com as esca- las UBDRS, a Escala da função Motora e de Linguagem de Hamburgo, o impacto do tratamento na qualidade de vida usando a escala de Qualidade de Vida Pediátrica (PEDSQOL), as Escalas de Mullen de Aprendizagem Precoce (MSEL), o potencial de sobrevivência prolon- gada ou uma combinação dos mesmos.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 58 a 71, caracterizado pelo fato de que o paciente tem 80 meses de idade ou menos, 75 meses ou menos, 70 meses ou menos, 65 me- ses ou menos, 62 meses ou menos, 60 meses ou menos, 55 meses ou menos, 50 meses ou menos, ou 40 meses ou menos.
73. Uso, caracterizado pelo fato de que é de uma quantida- de terapeuticamente eficaz do SscAAV9, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, da partícula viral de rAAV9, como defi- nida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, do ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 43, ou da composição, como definida na reivindicação 44 ou 45, pa- ra a preparação de um medicamento para tratar doença de Batten CLN6 em um indivíduo.
74. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de uma quantidade terapeuticamente eficaz do scAAV9, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, da partícula viral de rA- AV9, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, do ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 43, ou da composição, como definida na reivindicação 44 ou 45, para tratar doença de Batten CLN6 em um indivíduo.
75. Uso, caracterizado pelo fato de que é de uma composi- ção que compreende o scAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a partícula viral de rAAV9, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, o ácido nucleico, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 4334 ou a composição, como definida na reivindicação 44 ou 45, para a prepa- ração de um medicamento para entregar a dita partícula viral de rAAV, ácido nucleico ou composição a um cérebro ou medula espinhal de um paciente em necessidade do mesmo.
76. Composição para tratar uma doença de CLN6 em um paciente em necessidade da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende o scAAV, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, a partícula viral de rAAV9, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 33, o ácido nucleicocomo definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 19, 31 ou 34 a 4334, ou a com- posição, como definida na reivindicação 44 ou 45, em um cérebro ou medula espinhal de um paciente em necessidade da mesma.
Applications Claiming Priority (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962800915P | 2019-02-04 | 2019-02-04 | |
| US62/800,915 | 2019-02-04 | ||
| US201962880641P | 2019-07-30 | 2019-07-30 | |
| US62/880,641 | 2019-07-30 | ||
| US201962881151P | 2019-07-31 | 2019-07-31 | |
| US62/881,151 | 2019-07-31 | ||
| US201962912977P | 2019-10-09 | 2019-10-09 | |
| US62/912,977 | 2019-10-09 | ||
| US201962923125P | 2019-10-18 | 2019-10-18 | |
| US62/923,125 | 2019-10-18 | ||
| PCT/US2020/016541 WO2020163299A1 (en) | 2019-02-04 | 2020-02-04 | Adeno-associated virus delivery of cln6 polynucleotide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112021015150A2 true BR112021015150A2 (pt) | 2021-09-28 |
Family
ID=69771088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112021015150-8A BR112021015150A2 (pt) | 2019-02-04 | 2020-02-04 | Entrega de vírus adenoassociado de polinucleotídeo de cln6 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220202956A1 (pt) |
| EP (1) | EP3921429A1 (pt) |
| JP (1) | JP2022519597A (pt) |
| KR (1) | KR20210124299A (pt) |
| CN (1) | CN113574176A (pt) |
| AU (1) | AU2020218501A1 (pt) |
| BR (1) | BR112021015150A2 (pt) |
| CA (1) | CA3127801A1 (pt) |
| CL (1) | CL2021002051A1 (pt) |
| IL (1) | IL285329A (pt) |
| MX (1) | MX2021009404A (pt) |
| SG (1) | SG11202107983TA (pt) |
| TW (1) | TW202033768A (pt) |
| WO (1) | WO2020163299A1 (pt) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2684222T3 (es) | 2012-08-01 | 2018-10-01 | Nationwide Children's Hospital | Administración intratecal de virus adenoasociado 9 recombinante |
| WO2023018674A1 (en) * | 2021-08-09 | 2023-02-16 | Amicus Therapeutics, Inc. | Determination of gene transduction potency in neuron-like cells |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| AU688428B2 (en) | 1993-11-09 | 1998-03-12 | Johns Hopkins University, The | Generation of high titers of recombinant AAV vectors |
| PT728214E (pt) | 1993-11-09 | 2004-11-30 | Ohio Med College | Linhas celulares estaveis capazes de expressar o gene de replicacao do virus adeno-associado |
| US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
| US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
| WO1996017947A1 (en) | 1994-12-06 | 1996-06-13 | Targeted Genetics Corporation | Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors |
| FR2737730B1 (fr) | 1995-08-10 | 1997-09-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de purification de virus par chromatographie |
| CA2625279A1 (en) | 1995-08-30 | 1997-03-06 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adenovirus and aav |
| EP1983057A3 (en) | 1995-09-08 | 2009-01-07 | Genzyme Corporation | Improved AAV vectors for gene therapy |
| US5910434A (en) | 1995-12-15 | 1999-06-08 | Systemix, Inc. | Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant |
| KR20000068501A (ko) | 1996-09-06 | 2000-11-25 | 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 재조합 아데노-관련 바이러스 지정 유전자 요법을 위한 방법 |
| US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| EP1009808B1 (en) | 1997-09-05 | 2012-12-05 | Genzyme Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors |
| US6258595B1 (en) | 1999-03-18 | 2001-07-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses |
| WO2001083692A2 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids |
| US9441244B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-09-13 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
| US9233131B2 (en) | 2003-06-30 | 2016-01-12 | The Regents Of The University Of California | Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof |
| US9434928B2 (en) | 2011-11-23 | 2016-09-06 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides |
| DE102012007232B4 (de) | 2012-04-07 | 2014-03-13 | Susanne Weller | Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen |
| JP2015092462A (ja) | 2013-09-30 | 2015-05-14 | Tdk株式会社 | 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池 |
| WO2015141521A1 (ja) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | 株式会社日立国際電気 | 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体 |
| JP6197169B2 (ja) | 2014-09-29 | 2017-09-20 | 東芝メモリ株式会社 | 半導体装置の製造方法 |
| WO2016100575A1 (en) * | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Gene therapy for juvenile batten disease |
| WO2017136536A1 (en) * | 2016-02-02 | 2017-08-10 | University Of Massachusetts | Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system |
| PL3411484T3 (pl) * | 2016-02-05 | 2024-02-19 | Emory University | Wstrzykiwanie jednoniciowego lub samokomplementarnego wirusa adenosatelitarnego 9 do płynu mózgowego |
-
2020
- 2020-02-04 KR KR1020217027481A patent/KR20210124299A/ko active Search and Examination
- 2020-02-04 AU AU2020218501A patent/AU2020218501A1/en active Pending
- 2020-02-04 CA CA3127801A patent/CA3127801A1/en active Pending
- 2020-02-04 JP JP2021545402A patent/JP2022519597A/ja active Pending
- 2020-02-04 TW TW109103421A patent/TW202033768A/zh unknown
- 2020-02-04 WO PCT/US2020/016541 patent/WO2020163299A1/en unknown
- 2020-02-04 CN CN202080012159.9A patent/CN113574176A/zh active Pending
- 2020-02-04 SG SG11202107983TA patent/SG11202107983TA/en unknown
- 2020-02-04 EP EP20709849.2A patent/EP3921429A1/en active Pending
- 2020-02-04 US US17/426,993 patent/US20220202956A1/en active Pending
- 2020-02-04 BR BR112021015150-8A patent/BR112021015150A2/pt unknown
- 2020-02-04 MX MX2021009404A patent/MX2021009404A/es unknown
-
2021
- 2021-08-03 IL IL285329A patent/IL285329A/en unknown
- 2021-08-03 CL CL2021002051A patent/CL2021002051A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210124299A (ko) | 2021-10-14 |
| CN113574176A (zh) | 2021-10-29 |
| AU2020218501A1 (en) | 2021-08-19 |
| WO2020163299A1 (en) | 2020-08-13 |
| CA3127801A1 (en) | 2020-08-13 |
| US20220202956A1 (en) | 2022-06-30 |
| SG11202107983TA (en) | 2021-08-30 |
| CL2021002051A1 (es) | 2022-04-08 |
| TW202033768A (zh) | 2020-09-16 |
| JP2022519597A (ja) | 2022-03-24 |
| EP3921429A1 (en) | 2021-12-15 |
| IL285329A (en) | 2021-09-30 |
| MX2021009404A (es) | 2021-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6708686B2 (ja) | 組換えアデノ随伴ウイルス９の髄腔内送達 | |
| JP2018537984A (ja) | 脊髄性筋萎縮症の処置において有用なアデノ−関連ウイルスベクター | |
| BR112021009739A2 (pt) | Vetores virais aav e usos dos mesmos | |
| BR112019016444A2 (pt) | composições úteis no tratamento da atrofia muscular espinhal | |
| US20190343920A1 (en) | Aav-mediated gene therapy for nphp5 lca-ciliopathy | |
| US20220127641A1 (en) | Adeno-Associated Virus Delivery of CLN3 Polynucleotide | |
| US20230321164A1 (en) | Intrathecal Delivery of Recombinant Adeno-Associated Virus Encoding Methyl-CPG Binding Protein 2 | |
| US20220202956A1 (en) | Adeno-associated virus delivery of cln6 polynucleotide | |
| EP4142759A1 (en) | Modified nucleic acids encoding aspartoacylase (aspa) and vector for gene therapy | |
| WO2022170038A1 (en) | Adeno-associated virus delivery of cln3 polynucleotide | |
| WO2024011115A1 (en) | Adeno-associated virus delivery of cln1 polynucleotide | |
| CA3216711A1 (en) | Recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg binding protein 2 for treating pitt hopkins syndrome via intrathecal delivery | |
| BR112013021318B1 (pt) | Vetor e usos de um vetor |