BR112019016444A2 - composições úteis no tratamento da atrofia muscular espinhal - Google Patents

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Abstract

é descrito neste documento um vetor raav que tem um capsídeo de aavhu68 e pelo menos um cassete de expressão no capsídeo. o pelo menos um cassete de expressão compreende sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína smn funcional e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão das sequências de smn em uma célula hospedeira. também são fornecidas composições que contêm este raavhu68.vetor para smn e métodos de uso do mesmo para atrofia muscular espinhal em um paciente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÕES ÚTEIS NO TRATAMENTO DA ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL”.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [001] A atrofia muscular espinhal (SMA) é uma doença neuromuscular causada por mutações no SMN1 telomérico, um gene que codifica uma proteína de expressão ubíqua (sobrevivência do neurônio motor SMN) envolvida na biogênese dolorosa. A SMA é um distúrbio autossômico recessivo causado por mutações ou exclusão do gene SMN1. A provisão de um gene SMN1 em funcionamento demonstrou resgatar o fenótipo. Veja, por exemplo, Tanguy et al., Systemic AAVrhIO provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mic, Frontiers in Molecular Neuroscience, 8(36) (julho de 2015).
[002] A classificação do International SMA Consortium define vários graus de gravidade no fenótipo de SMA, dependendo da idade de início e dos marcos do desenvolvimento motor. Propõe-se a designação SMA 0 para refletir o início pré-natal e contraturas articulares graves, diplegia facial e insuficiência respiratória. A SMA tipo 1 (ou I), doença de Werdnig-Hoffmann I, é a forma pós-natal mais grave com início dentro de 6 meses após o nascimento. Os pacientes são incapazes de se sentar e apresentam disfunção respiratória grave. A SMA Tipo 2 (ou II) é a forma intermediária com início dentro dos primeiros 2 anos; as crianças podem se sentar, mas não conseguem andar. O curso clínico é variável. A Tipo 3 (ou III) (também chamado de doença de KugelbergWelander) começa após os 2 anos de idade e geralmente possui uma evolução crônica. As crianças podem ficar de pé e caminhar sem ajuda, pelo menos na infância. A forma adulta (tipo 4 ou IV) é a mais leve, com início após os 30 anos de idade; poucos casos foram relatados e sua prevalência não é conhecida com precisão.
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2/177 [003] Muitas doenças neuromusculares herdadas e adquiridas envolvem degeneração dos neurônios motores inferiores. Um dos exemplos mais comuns e devastadores é a atrofia muscular espinhal (SMA), uma deficiência hereditária da proteína de sobrevivência do neurônio motor (SMN) caracterizada pela morte seletiva de neurônios motores inferiores, fraqueza progressiva e, frequentemente, morte na primeira infância. Por razões pouco claras, a deficiência de SMN resulta em toxicidade seletiva para neurônios motores inferiores, resultando em perda progressiva de neurônios e fraqueza muscular. A gravidade da doença é modificada pelo número de cópias de uma duplicação centromérica do gene homólogo (SMN2), que carrega uma mutação no local da emenda que resulta na produção de apenas pequenas quantidades do transcrito completo do SMN. Pacientes que carregam 1-2 cópias do SMN2 apresentam a forma grave da SMA, caracterizada por aparecimento nos primeiros meses de vida e rápida progressão para insuficiência respiratória. Pacientes com 3 cópias do SMN2 geralmente exibem uma forma atenuada da doença, geralmente apresentando-a após seis meses de idade. Embora muitos nunca consigam caminhar, raramente evoluem para insuficiência respiratória e muitas vezes vivem até a idade adulta. Pacientes com quatro cópias de SMN2 podem não apresentar a doença até a idade adulta com início gradual de fraqueza muscular. Atualmente, não há tratamento para SMA além de cuidados paliativos.
[004] A clara correlação entre a expressão do SMN e a gravidade da doença, bem como o número relativamente pequeno de células afetadas, tornam a SMA um excelente alvo para a terapia genética. Estudos anteriores demonstraram que o fenótipo SMA pode ser resgatado em modelos de camundongos transgênicos usando injeção sistêmica de sorotipos de vetores AAV com a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica. Veja, por exemplo, Tanguy et al., Systemic AAVrhIO provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the
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3/177 spinal cord of neonatal mic, Frontiers in Molecular Neuroscience, 8(36) (julho de 2015). Passini et al, HGT, 2014 relataram um aumento dependente da dose na sobrevida de até 200 dias em camundongos SMNA7 usando um vetor scAAV9.GusB.SMN1. Meyer et al., Molecular Therapy, 2014 relataram um aumento dependente da dose na sobrevida de até 450 dias utilizando um vetor scAAV9.CBA.SMN1 em dosagens de 2,7x109 GC / filhote a 3,3x1010 GC / filhote. No entanto, as doses menores mostraram pouca melhora. Veja também Passini et al., JCI, 2010 e Passini et al., Sci Trans Med, 2011. Cada um destes documentos é incorporado neste documento por referência.
[005] Tratamentos eficazes para SMA ainda são necessários. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Em um aspecto, é fornecido um vetor viral adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um capsídeo AAVhu68 e pelo menos uma cassete de expressão, em que a pelo menos uma cassete de expressão compreende sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína SMN funcional e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão das sequências de SMN em uma célula hospedeira, em que o capsídeo AAVhu68 compreende uma população de proteínas do capsídeo AAVhu68vp1 possuindo uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre uma proteína produzida codificada pela SEQ ID NO: 7 ou possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 possui uma população heterogênea de proteínas vp1. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 possui uma população heterogênea de proteínas vp2. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 possui uma população heterogênea de proteínas vp3. Em uma modalidade, a sequência de codificação da proteína do capsídeo AAVhu68 possui a sequência da SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, a sequência de codificação de SMA possui a sequência da SEQ ID NO: 1.
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4/177 [007] Adicionalmente, é fornecido um vetor rAAV compreendendo um capsídeo AAVhu68 que tem empacotada dentro de si uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma AAV 5 'ITR, um promotor CB7, um íntron, sequências de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, um polyA e uma sequência repetida terminal invertida de AAV 3', em que o capsídeo AAVhu68 compreende uma população de proteínas vp1, uma população de vp2 e uma população de proteínas vp3, em que as proteínas do capsídeo AAVhu68 possuem sequências de aminoácidos independentemente selecionadas dentre proteínas produzidas pelas proteínas do capsídeo da SEQ ID NO: 7 possuindo a sequência de aminoácidos da vp1, vp2 e/ou vp3 da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 possui uma população heterogênea de proteínas vp1. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 possui uma população heterogênea de proteínas vp2. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 possui uma população heterogênea de proteínas vp3.
[008] É fornecida uma composição farmacêutica que contém um vetor AAVhu68 conforme descrito acima. Em adição a pelo menos um estoque de vetores, a composição contém ainda pelo menos um de um veículo, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitável.
[009] É fornecido ainda um método para o tratamento da atrofia muscular espinhal em um sujeito que necessite disso, utilizando um vetor rAAVhu68.SMA ou outro veículo de distribuição para o hSMN projetado neste documento. Em certas modalidades, as composições fornecidas neste documento podem ser administradas intratecalmente. [0010] Em certas modalidades, um rAAVhu68.SMN1 é fornecido conforme descrito neste documento ou uma composição para utilização no tratamento de atrofia muscular espinhal em um paciente, opcionalmente em uma co-terapia. Em certas modalidades, o paciente tem SMA tipo 3. Em certas modalidades, a composição é formulada para distribuição intratecal.
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5/177 [0011] A utilização de um rAAVhu68.SMA conforme descrito neste documento, ou uma composição contendo o mesmo, para o tratamento de um paciente com SMA é fornecida, opcionalmente em um regime coterapêutico. Tal composição pode ser formulada para distribuição intratecal.
[0012] Outros aspectos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0013] A FIGURA 1A é uma representação esquemática do genoma do vetor AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG. ITR representa uma repetição invertida do terminal AAV2. CB7 representa um promotor de beta actina de galinha com potenciador de citomegalovírus. RBG PolyA representa um sinal de poliadenilação de globulina beta de coelho.
[0014] As FIGURAS 1B - 1C são um alinhamento de hSMN1 nativo, variante D (NQ de Acesso NM_000344.3) (SEQ ID NO: 3) vs. a sequência otimizada por códons descrita neste documento (SEQ ID NO: 1).
[0015] A FIGURA 2 é uma avaliação da transdução no cérebro e medula espinhal por imuno-histoquímica (IHC) e hibridização in situ (ISH). A imuno-histoquímica do SMN1 foi realizada nas seções do cortex, cerebelo e medula espinhal e imagens representativas são exibidas nos três painéis superiores. O ISH para o ácido ribonucleico hSMN1 (RNA) otimizado por códon foi conduzido nas seções do córtex e os resultados representativos são mostrados no painel inferior. Foram coletadas amostras de camundongos SMNA7 (KO) tratados com ou sem 3 x 101° GC de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG por filhote. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) e heterozigóticos (Het) serviram como controles positivos.
[0016] A FIGURA 3A é uma curva de sobrevivência de camundongos SMNA7 (KO) tratados com ou sem 3x 101° ou 8,76 x 101° GC/filhote
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6/177 de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT)/heterozigóticos (Het) e os camundongos injetados com PBS serviram como controles.
[0017] A FIGURA 3B é uma tabela de análise estatística da curva de sobrevivência descrita na Figura 3A. A Mediana de Sobrevida foi calculada e listada.
[0018] A FIGURA 4A é um gráfico de linhas de pesos corporais de camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GC/fiIhote de vetores de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG. Camundongos da mesma ninhada de tipo selvagem (WT)/heterozigóticos (Het) injetados com PBS serviram como controles.
[0019] A FIGURA 4B é um gráfico de linhas de pesos corporais no dia pós-natal 15 de camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GC/filhote de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) / heterozigóticos (Het) e os camundongos injetados com PBS serviram como controles.
[0020] A FIGURA 4G é um gráfico de linhas de pesos corporais no dia pós-natal 30 de camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GO /filhote de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) / heterozigóticos (Het) serviram como controles positivos.
[0021] As FIGURAS 4D - 4J são gráficos de linhas de pesos corporais após a normalização por sexo. A experiência foi realizada a cada dois dias, do dia pós-natal 3 a 13 ou 15 em camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GO de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG por filhote. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) / heterozigóticos (Het) e os camundongos injetados com PBS serviram como controles. O valor Pfoi calculado por análise estatística e indicado na figura.
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7/177 [0022] A FIGURA 5A é uma ilustração do sistema de pontuação utilizado no Teste de Suspensão dos Membros Posteriores.
[0023] A FIGURA 5B inclui gráficos da Pontuação dos Membros Posteriores registrada a cada dois dias do dia pós-natal 3 a 13 em camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GC de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG por filhote. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) / heterozigóticos (Het) e os camundongos injetados com PBS serviram como controles.
[0024] As FIGURAS 6A - 6C incluem gráficos mostrando o tempo que um animal levou para retornar à sua posição normal no Teste de Reflexo Postural. A experiência foi realizada a cada dois dias, do dia pós-natal 7 a 17 em camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GC de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG por filhote. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) / heterozigóticos (Het) e os camundongos injetados com PBS serviram como controles.
[0025] As FIGURAS 6D - 6J são gráficos que mostram o tempo que um animal levou para retornar à sua posição normal no Teste de Reflexo Postural após a normalização por sexo. A experiência foi realizada a cada dois dias, do dia pós-natal 7 a 17 em camundongos SMNA7 (KO) tratados com 3 x 101° ou 8,76 x 101° GO de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG por filhote. Os irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) / heterozigóticos (Het) e os camundongos injetados com PBS serviram como controles. O valor Pfoi calculado por análise estatística e indicado na figura.
[0026] A FIGURA 7 é uma imagem de um aparelho para distribuição intracisternal, incluindo agulha introdutora opcional para o método de inserção coaxial, que inclui uma seringa vetorial de 10 cc, uma seringa de descarga pré-cheia de 10 cc, um conjunto de extensão do conector T, uma agulha espinhal de 22G x 5, uma agulha introdutora opcional de 18Gx3,5.
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8/177 [0027] A FIGURA 8A fornece um alinhamento que mostra a sequência de aminoácidos das sequências do capsídeo de vp1 codificadas pelas sequências de ácido nucleico das FIGURAS 8B-8D. O alinhamento inclui a proteína vp1 de AAVhu68 [SEQ ID NO: 8], com AAV9 [SEQ ID NO: 16], AAVhu31 (marcado hu.31 em alinhamento) [SEQ ID NO: 18] e AAVhu32 (marcado hu.32 em alinhamento) [SEQ ID NO: 19]. Comparadas a AAV9, AAVhu31 e AAVhu32, duas mutações (A67E e A157V) foram consideradas críticas no AAVhu68 e estão circuladas na figura.
[0028] As FIGURAS 8B-8D fornecem um alinhamento da sequência de ácido nucleico que codifica o capsídeo de vp1 de AAVhu68 [SEQ ID NO: 7], com AAV9 [SEQ ID NO: 22], AAVhu31 [SEQ ID NO: 20] e AAVhu32 [SEQ ID NO: 21], [0029] As FIGURAS 9A-9B são gráficos que mostram resultados de monitorização do peso em camundongos de tipo selvagem (HET/WT, FIG 9A) ou camundongos SMNA7 (KO, FIGURA 9B) adultos tratados ICV com AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG em doses variadas (1x109 GC, WT, n=7, KO, n=1; 3x109 GC, WT, n=7, KO, n=1; 1x101°GC, WT, n=3, KO, n=5; 3x1010 GC, WT, n=1, KO, n=1; ou 7x1010 GC, WT, n=5, KO, n=3). Animais injetados com PBS (WT, n = 3; KO, n=4) foram fornecidos como controle.
[0030] As FIGURAS 10A-10B são gráficos que mostram resultados de reflexos posturais em camundongos de tipo selvagem (HET/WT, FIG 10A) ou camundongos SMNA7 (KO, FIGURA 10B) adultos tratados ICV com AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG em doses variadas (1x109 GC, WT, n=7, KO, n=1; 3x109 GC, WT, n=7, KO, n=1; 1x101° GC, WT, n=3, KO, n=5; 3x1O10 GC, WT, n=1, KO, n=1;ou 7x101°GC, WT, n=5, KO, n=3). Animais injetados com PBS (WT, n=3; KO, n=5) foram fornecidos como controle.
[0031] As FIGURAS 11A-11H são gráficos mostrando patologia clínica, Química de CSF e citologia de CSF em Macacos Rhesus adultos
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9/177 tratados intratecalmente com AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG conforme descrito no Exemplo 10.
[0032] As FIGURAS 12A-12B fornecem a quantificação da transdução do neurônio motor por ISH (FIGURA 12A) e IHC (FIG 12B) em Macacos Rhesus adultos tratados intratecalmente com AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG conforme descrito no Exemplo 10. Orientação fluoroscópica e material de contraste foram utilizados para confirmar a colocação da agulha na cisterna magna (ICM) ou na cisterna lombar (punção lombar; LP). O volume total de injeção foi de 1,0 mL para o grupo ICM (n=3) e 2,5 mL (n=4) ou 5,0 mL (n=4) para os grupos LP. Um mês após a injeção, os animais foram sacrificados e a transdução de neurônios motores foi quantificada em seções da medula espinhal por hibridização in situ (ISH) para o mRNA do transgene e imuno-histoquimica (IHC) para a proteína SMN humana.
[0033] A FIGURA 13 fornece a biodistribuição em Macacos Rhesus adultos tratados intratecalmente com AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG conforme descrito no Exemplo 10.
[0034] As FIGURAS 14A-14B fornecem resultados de monitorização do peso em camundongos C57BL/6J adultos tratados ICV com AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG conforme descrito no Exemplo 9. A FIGURA 14A fornece resultados de monitoramento de peso em sujeitos do sexo feminino. A FIGURA 14B fornece resultados de monitoramento de peso em sujeitos do sexo masculino.
[0035] As FIGURAS 15A-15B são um fluxograma de fabricação para um vetor AAVhu68.SMN.
[0036] As FIGURAS 16A-16E fornecem gráficos que mostram elevações agudas de transaminase após administração intravenosa de um vetor AAV que expressa SMN humana a primatas não humanos. A FIGURA 16A fornece o desenho do estudo conforme descrito no Exemplo
14. A FIGURA 16B fornece um gráfico de ALT sérico. A FIGURA 16C
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10/177 fornece um gráfico de AST sérico. A FIGURA 16D fornece um gráfico da fosfatase alcalina sérica. A FIG 16E fornece um gráfico da bilirrubina sérica total. Avaliações laboratoriais não programadas foram realizadas para todos os animais no dia 5 do estudo após o animal 16C176 desenvolver insuficiência hepática aguda que requeria eutanásia. A AST não foi realizada no dia 5 do estudo para os animais 16C116 e 16C215. Linhas tracejadas indicam intervalo de referência no laboratório.
[0037] As FIGURAS 17A-17D fornecem imagens representativas de IHC mostrando achados histopatológicos do fígado para o animal 16C176. Necrose hepatocelular aguda maciça (FIGURA 17A) com deposição de fibrina sinusoidal (FIGURA 17B, pontas de seta) e trombos agudos de fibrina (FIGURA 17C) em veias portais (Hematoxilina e eosina; Barra de escala = 10 pm (FIGURAS 17A e 17C), 50 pm (FIGURA 17B)). A imuno-histoquímica para o fibrinogênio representa deposição de fibrina senoidal periportal proeminente (FIGURA 17D) (Fibrinogênio IHC, Barra de escala representa 100 pm (FIGURA 17D)).
[0038] As FIGURAS 18A-18D fornecem achados histopatológicos representativos do sistema nervoso em NHPs infantis tratados com AAVhu68 intravenoso (IV) que expressa SMN humana 28 dias após a injeção. Ambos os animais tinham uma axonopatia dos tratos da substância branca dorsal da medula espinhal (FIG 18A). A axonopatia dorsal era tipicamente bilateral e caracterizada por bainhas de mielina dilatadas com e sem mielomacrófagos, consistentes com degeneração axonal. Os gânglios da raiz dorsal da medula espinhal (FIGURA 18B) exibiram degeneração do corpo celular neuronal mínima a leve, caracterizada por cromatólise central, satelitose e infiltrados celulares mononucleares que cercavam e invadiam os corpos celulares neuronais (neuronofagia). Uma axonopatia semelhante foi observada nos nervos periféricos do membro posterior (nervo ciático, FIGURA 18C) e do membro anterior (nervo mediano, FIGURA 18D). O animal (16C176) que foi sacrificado
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11/177 no dia 5 por insuficiência hepática aguda não teve achados no sistema nervoso. (Coloração com hematoxilina e eosina; Barra de escala = 200 pm (FIGURA 18A), 100 pm (FIGURAS 18B-18D)) [0039] A FIGURA 19 fornece biodistribuição de vetores em macacos rhesus. Macacos Rhesus tratados com AAVhu68 intravenoso expressando SMN humana foram eutanasiados 28 dias após a injeção, exceto pelo animal 16C176, que desenvolveu insuficiência hepática e choque e foi eutanasiado 5 dias após a administração do vetor. Os genomas vetoriais foram detectados em amostras de DNA tecidual por PCR quantitativa. Os valores são expressos como cópias do genoma (GC) do vetor por genoma diploide do hospedeiro. DRG = gânglios da raiz dorsal. Os dados são mostrados para quatro lóbulos do fígado (caudado, esquerdo, meio e direito).
[0040] As FIGURAS 20A-20G mostram a expressão de SMN em macacos rhesus. O RNA humano de SMN foi detectado por ISH no fígado (FIGURA 20A). O fígado foi corado com sondas de controle para albumina (FIGURA 20B) e GFP (FIGURA 20C). Células expressando SMN foram identificadas por ISH na medula espinhal (FIGURA 20D). Os neurônios motores foram identificados por ChAT ISH (FIGURA 20E). Patches raros de neurônios transduzidos foram detectados por SMN ISH no cérebro (FIGURA 20F, coloração nuclear DAPI). A percentagem de neurônios motores ChAT+ transduzida em cada nível da medula espinhal foi quantificada (FIGURA 20G). Barras de erro = SEM.
[0041] As FIGURAS 21A-21D fornecem achados histopatológicos representativos de leitões tratados com AAVhu68 intravenoso que expressa SMN humana aos 7 e 30 dias de idade. Em ambos os grupos, foi observada uma axonopatia dos setores da substância branca dorsal da medula espinhal (FIGURA 21 A). A axonopatia dorsal era bilateral e caracterizada por bainhas de mielina dilatadas com e sem mielomacrófagos, consistentes com degeneração axonal. Os gânglios da raiz dorsal
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12/177 da medula espinhal (FIGURA 21B) exibiram graus variados de degeneração do corpo celular neuronal, caracterizada por cromatólise central, satelitose e infiltrados celulares mononucleares que cercavam e invadiam os corpos celulares neuronais (neuronofagia). Observou-se uma axonopatia semelhante em graus variados nos nervos periféricos do membro anterior (nervo ciático, FIGURA 21C) e do membro posterior (nervo mediano, FIGURA 21 D) na maioria dos leitões. (Hematoxilina e eosina; barra de escala = 200 pm (FIGURA 21 A), 100 pm (FIGURAS 21B-21D)) [0042] A FIGURA 22 fornece biodistribuição de vetores em leitões. Os leitões recém-nascidos tratados com AAVhu68 intravenoso que expressam SMN humana foram sacrificados 13-14 dias após a injeção. Os genomas vetoriais foram detectados em amostras de DNA tecidual por PCR quantitativa. Os valores são expressos como cópias do genoma (GC) do vetor por genoma diploide do hospedeiro. DRG = gânglios da raiz dorsal. Os dados são mostrados para quatro lóbulos do fígado (caudado, esquerdo, meio e direito).
[0043] As FIGURAS 23A-23F fornecem imagens representativas mostrando a expressão de SMN na medula espinhal de leitões. O RNA de SMN humana foi detectado por ISH nos segmentos cervical (FIG 23A), torácico (FIG 23B) e lombar (FIG 23C) da medula espinhal. Os neurônios motores foram identificados por ChAT ISH nas seções correspondentes (FIGs 23D-23F). Imagens representativas são mostradas. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0044] Um vetor AAVhu68 recombinante com um capsídeo AAVhu68 e ácido nucleico que codifica um gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN) sob controle de sequências reguladoras que direcionam a expressão do mesmo em pacientes que necessitem disso é fornecido neste documento. O capsídeo rAAVhu68 contém proteínas independentemente possuindo a sequência de aminoácidos produzida a
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13/177 partir da SEQ ID NO: 7 e/ou possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. São fornecidas composições contendo esses vetores, assim como o uso desses vetores em composições para o tratamento de pacientes com SMA. Embora os exemplos se concentrem no tratamento da SMA 3 (às vezes chamada de doença de Kugelberg-Welander), o uso desses vetores de rAAV sozinhos ou em combinação com outras co-terapias é contemplado para os tipos 1, 2 ou 4 da SMA. A SMA pode ser diagnosticada usando um exame de sangue para detectar uma mutação no gene SMN1 no cromossomo 5. Testes musculares adicionais, como eletromiograma ou biópsia muscular, podem ser utilizados para auxiliar no diagnóstico.
I. AAV [0045] Conforme utilizado neste documento, o termo clade, no que se refere a grupos de AAV, refere-se a um grupo de AAV que são filogeneticamente relacionados entre si, conforme determinado usando um algoritmo Neighbor-Joining por um valor de inicialização de pelo menos 75% (de pelo menos 1000 réplicas) e uma medição da distância de correção de Poisson de, no máximo, 0,05, com base no alinhamento da sequência de aminoácidos AAV vp1. O algoritmo Neighbor-Joining foi descrito previamente na literatura. Veja, por exemplo, M. Nei e S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, Nova York (2000)). Estão disponíveis programas de computador que podem ser usados para implementar esse algoritmo. Por exemplo, o programa MEGA v2.1 implementa o método Nei-Gojobori modificado. Utilizando estas técnicas e programas de computador, e a sequência de uma proteína do capsídeo AAV vp1, um versado na técnica pode prontamente determinar se um AAV selecionado está contido em um dos clades identificados neste documento, em outro clade, ou se encontra fora destes clades. Veja, por exemplo, G Gao, et al., J Virol, 2004 jun; 78(10: 6381-6388, que identifica os Clades A, B, C, D, E e F, e fornece
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14/177 sequências de ácidos nucleicos do novo AAV, números de acesso do GenBank AY530553 a AY530629. Veja também WO 2005/033321.
[0046] Conforme utilizado neste documento, um capsídeo AAV9 é um capsídeo AAV auto-montado composto por várias proteínas AAV9 vp. As proteínas AAV9 vp são tipicamente expressas como variantes de splice alternativas codificadas por uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 22 ou uma sequência pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% idêntica a ela, que codifica a sequência de aminoácidos vp1 da SEQ ID NO: 16 (Acesso do GenBank: AAS99264). Estas variantes de splice resultam em proteínas de diferentes comprimentos da SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, “capsídeo AAV9” inclui um AAV com uma sequência de aminoácidos que é 99% idêntica a AAS99264 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 16. Veja também US7906111 e WO 2005/033321. Conforme utilizado neste documento, variantes de AAV9 incluem as descritas em, por exemplo, WO2016/049230, US 8,927,514, US 2015/0344911 e US 8,734,809.
[0047] Um rAAVhu68 é composto por um capsídeo AAVhu68 e um genoma de vetor. Um capsídeo AAVhu68 é um conjunto de uma população heterogênea de proteínas vp1, uma população heterogênea de proteínas vp2 e uma população heterogênea de proteínas vp3. Conforme utilizado neste documento, quando utilizado para se referir às proteínas do capsídeo vp, o termo heterogêneo ou qualquer variação gramatical dos mesmos, refere-se a uma população que consiste em elementos que não são iguais, por exemplo, possuindo monômeros vp1, vp2 ou vp3 (proteínas) com diferentes sequências de aminoácidos modificadas. A SEQ ID NO: 8 fornece a sequência de aminoácidos codificada da proteína vp1 de AAVhu68. Veja, também, os Pedidos de Patentes Provisórios dos EUA Nos. 62/614,002, 62/591,002 e 62/464,748, sendo cada um dos quais intitulado Novel Adeno-Associated Virus
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15/177 (AAV) Clade F Vector and Uses Therefor”, e que são incorporados neste documento por referência na sua totalidade.
[0048] O capsídeo AAVhu68 contém subpopulações nas proteínas vp1, nas proteínas vp2 e nas proteínas vp3 que possuem modificações a partir dos resíduos de aminoácidos previstos na SEQ ID NO: 8. Essas subpopulações incluem, no mínimo, certos resíduos de asparagina (N ou Asn) desamidada. Por exemplo, certas subpopulações compreendem pelo menos uma, duas, três ou quatro posições de asparaginas (N) altamente desamidadas em pares asparagina-glicina na SEQ ID NO: 8 e opcionalmente compreendendo ainda outros aminoácidos desamidados, em que a desamidação resulta em uma alteração de aminoácidos e outras modificações opcionais. A SEQ ID NO: 26 fornece a sequência de aminoácidos de um capsídeo AAVhu68 modificado, ilustrando posições de resíduos que podem ser desamidadas ou modificadas de outro modo.
[0049] Conforme utilizado neste documento, uma subpopulação de proteínas vp refere-se a um grupo de proteínas vp que possui pelo menos uma característica definida em comum e que consiste em pelo menos um membro do grupo a menos do que todos os membros do grupo de referência, a menos que especificado de outra forma. Por exemplo, uma subpopulação de proteínas vp1 é pelo menos uma (1) proteína vp1 e menor que todas as proteínas vp1 em um capsídeo AAV montado, a menos que especificado de outra forma. Uma subpopulação de proteínas vp3 pode ser uma (1) proteína vp3 a menos do que todas as proteínas vp3 em um capsídeo AAV montado, a menos que especificado de outra forma. Por exemplo, as proteínas vp1 podem ser uma subpopulação de proteínas vp; as proteínas vp2 podem ser uma subpopulação separada de proteínas vp, e vp3 são ainda uma subpopulação adicional de proteínas vp em um capsídeo AAV montado. Em
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16/177 outro exemplo, as proteínas vp1, vp2 e vp3 podem conter subpopulações com diferentes modificações, por exemplo, pelo menos uma, duas, três ou quatro asparaginas altamente desamidadas, por exemplo, em pares asparagina-glicina.
[0050] Salvo indicação em contrário, altamente desamidado referese a pelo menos 45% desamidado, pelo menos 50% desamidado, pelo menos 60% desamidado, pelo menos 65% desamidado, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 97%, 99%, até cerca de 100% desamidado em uma posição de aminoácido referenciada, em comparação com a sequência de aminoácidos prevista na posição de aminoácido de referência (por exemplo, pelo menos 80% das asparaginas no aminoácido 57 da SEQ ID NO: 8 podem ser desamidadas com base nas proteínas vp1 totais ou 20% das asparaginas no aminoácido 409 da SEQ ID NO: 8 podem ser desamidadas com base no total de proteínas vp1, vp2 e vp3). Tais percentagens podem ser determinadas utilizando gel 2D, técnicas de espectrometria de massas ou outras técnicas adequadas.
[0051] Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que a desamidação de resíduos pelo menos altamente desamidados nas proteínas vp no capsídeo AAVhu68 seja de natureza principalmente não enzimática, sendo causada por grupos funcionais dentro da proteína do capsídeo que desamidam asparaginas selecionadas e, em menor grau, resíduos de glutamina. A montagem eficiente do capsídeo da maioria das proteínas vp1 de desamidação indica que estes eventos ocorrem após a montagem do capsídeo ou que a desamidação em monômeros individuais (vp1, vp2 ou vp3) é bem tolerada estruturalmente e em grande parte não afeta a dinâmica de montagem. A desamidação extensa na região exclusiva de VP1 (VP1 -u) (~aa 1-137), geralmente considerada como localizada internamente antes da entrada celular, sugere
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17/177 que a desamidação de VP pode ocorrer antes da montagem do capsídeo.
[0052] Sem desejar ser limitado pela teoria, a desamidação das N pode ocorrer quando o átomo de nitrogênio da cadeia principal do seu resíduo C-terminal conduz um ataque nucleofílico ao átomo de carbono do grupo amida da cadeia lateral de Asn. Acredita-se que, assim, um resíduo intermediário de succinimida fechada em anel se forma. O resí duo de succinimida então conduz uma hidrólise rápida para levar ao produto final ácido aspártico (Asp) ou ácido iso aspártico (IsoAsp). Portanto, em certas modalidades, a desamidação de asparagina (N ou Asn) leva a um Asp ou IsoAsp, que pode interconverter através do intermediário succinimida, por exemplo, conforme ilustrado abaixo.
,··'' oh
Figure BR112019016444A2_D0001
Asparagina Intermediário
Í- HB + Η,Ο
..N • A-, / ' Λ o
Succinimida
H,O õ
Ácido aspártico o
Ν’ H .OH
O
Ácido isoaspártico [0053] Conforme fornecido neste documento, cada N desamidada da SEQ ID NO: 8 pode independentemente ser ácido aspártico (Asp), ácido isoaspártico (isoAsp), aspartato e/ou uma mistura de interconversão de Asp e isoAsp, ou combinações dos mesmos. Qualquer proporção adequada de ácido a- e isoaspártico pode estar presente. Por exemplo, em certas modalidades, a proporção pode ser de 10:1 a 1:10 aspártico para iso-aspártico, cerca de 50:50 aspártico: iso-aspártico ou cerca de 1:3 aspártico: iso-aspártico, ou outra proporção selecionada.
[0054] Em certas modalidades, uma ou mais glutamina (Q) na SEQ ID NO: 8 desamida em ácido glutâmico (Glu), ou seja, ácido a-glutâmico, ácido γ-glutâmico (Glu) ou uma mistura de α e γ-glutâmico ácido, que
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18/177 pode se interconverter através de um intermediário comum da glutarinimida. Qualquer proporção adequada de ácido a- e γ-glutâmico pode estar presente. Por exemplo, em certas modalidades, a proporção pode ser de 10:1 a 1:10 α a γ, cerca de 50:50 α: γ, ou cerca de 1:3 α: γ, ou outra proporção selecionada.
ácido glutâmico
Figure BR112019016444A2_D0002
glutamina (Gin) intermediário glutarimida
Figure BR112019016444A2_D0003
ácido isoglutâmico íy.-Gs4 [0055] Assim, um rAAVhu68 inclui subpopulações no capsídeo rAAVhu68 das proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 com aminoácidos desamidados, incluindo, no mínimo, pelo menos uma subpopulação compreendendo pelo menos uma asparagina altamente desamidada. Além disso, outras modificações podem incluir isomerização, particularmente em posições de resíduos de ácido aspártico (D ou Asp) selecionadas. Ainda em outras modalidades, as modificações podem incluir uma amidação em uma posição Asp.
[0056] Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 contém subpopulações de vp1, vp2 e vp3 possuindo pelo menos 4 a pelo menos cerca de 25 posições de resíduos de aminoácidos desamidadas, das quais pelo menos 1 a 10% são desamidadas em comparação com a sequência de aminoácidos codificada da SEQ ID NO: 8. Resíduos N podem ser a maioria destas. Contudo, os resíduos Q também podem ser desamidados.
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19/177 [0057] Em certas modalidades, um capsídeo AAV68 é ainda caracterizado por um ou mais dos seguintes. As proteínas do capsídeo AAV hu68 compreendem: proteínas AAVhu68 vp1 produzidas por expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas vp1 produzidas a partir da SEQ ID NO: 7 ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 8; Proteínas AAVhu68 vp2 produzidas por expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7 ou proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 8, e/ou proteínas AAVhu68 vp3 produzidas por expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 7 ou proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 8.
[0058] Adicionalmente ou alternativamente, é fornecido um capsídeo AAV que compreende uma população heterogênea de proteínas vp1, uma população heterogênea de proteínas vp2 opcionalmente compreendendo uma valina na posição 157 e uma população heterogênea
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20/177 de proteínas vp3, em que pelo menos uma subpopulação das proteínas vp1 e vp2 compreendem uma valina na posição 157 e opcionalmente compreendem ainda um ácido glutâmico na posição 67 com base na numeração do capsídeo vp1 da SEQ ID NO: 8. Adicionalmente ou alternativamente, é fornecido um capsídeo AAVhu68 que compreende uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, uma população heterogênea de proteínas vp2 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 8 e uma população heterogênea de proteínas vp3 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos os aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 8, em que: as proteínas vp1, vp2 e vp3 contêm subpopulações com modificações de aminoácidos. [0059] As proteínas AAVhu68 vp1, vp2 e vp3 são tipicamente expressas como variantes de splice alternativas codificadas pela mesma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos vp1 completa da SEQ ID NO: 8 (aminoácido 1 a 736). Opcionalmente, a sequência de codificação de vp1 é usada sozinha para expressar as proteínas vp1, vp2 e vp3. Alternativamente, esta sequência pode ser coexpressa com uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68vp3 da SEQ ID NO: 8 (cerca de aa 203 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de aa 137) e/ou regiões exclusivas de vp2 (cerca de aa 1 a cerca de aa 202), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO:7), ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica aa 203 a 736 da SEQ ID NO: 8. Adicionalmente, ou alternativamente, a
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21/177 sequência de codificação de vp1 e/ou codificação de vp2 pode ser coexpressa com a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de AAVhu68vp2 da SEQ ID NO: 8 (cerca de aa 138 a 736) sem o região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de 137), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (nt 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7) ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica cerca de aa 138 a 736 da SEQ ID NO: 8.
[0060] Conforme descrito neste documento, um rAAVhu68 possui um capsídeo rAAVhu68 produzido em um sistema de produção que expressa capsídeos de um ácido nucleico de AAVhu68 que codifica a sequência de aminoácidos da vp1 da SEQ ID NO: 8, e opcionalmente sequências adicionais de ácido nucleico, por exemplo, codificando uma proteína vp3 livre das regiões exclusivas de vp1 e/ou vp2. O rAAVhu68 resultante da produção utilizando uma única sequência de ácido nucleico vp1 produz as populações heterogêneas de proteínas vp1, proteínas vp2 e proteínas vp3. Mais particularmente, o capsídeo AAVhu68 contém subpopulações nas proteínas vp1, nas proteínas vp2 e nas proteínas vp3 que possuem modificações a partir dos resíduos de aminoácidos previstos na SEQ ID NO: 8. Essas subpopulações incluem, no mínimo, resíduos de asparagina (N ou Asn) desamidada. Por exemplo, asparaginas em pares asparagina - glicina são altamente desamidadas. [0061] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico de AAVhu68vp1 possui a sequência da SEQ ID NO: 7, ou uma cadeia complementar à mesma, por exemplo, o mRNA ou tRNA correspondente. Em certas modalidades, as proteínas vp2 e/ou vp3 podem ser expressas adicionalmente ou alternativamente a partir de diferentes sequên
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22/177 cias de ácidos nucleicos que a vp1, por exemplo, para alterar a proporção das proteínas vp em um sistema de expressão selecionado. Em certas modalidades, também é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68 vp3 da SEQ ID NO: 8 (cerca de aa 203 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de aa 137) e/ou regiões exclusivas de vp2 (cerca de aa 1 a cerca de aa 202), ou uma cadeia complementar à mesma, o mRNA ou tRNA correspondente (cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7). Em certas modalidades, também é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68 vp2 da SEQ ID NO: 8 (cerca de um a 138 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de um a 1 a cerca de 137) ou uma cadeia complementar à mesma, o mRNA ou tRNA correspondente (nt 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7).
[0062] No entanto, outras sequências de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 podem ser selecionadas para utilização na produção de capsídeos rAAVhu68. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico possui a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência pelo menos 70% a 99% idêntica, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica a SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico possui a sequência de ácido nucleico de cerca de nt 412 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência pelo menos 70% a 99%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, idêntica a cerca de nt 412 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a proteína do capsídeo vp2 (cerca de aa 138 a 736) da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico possui a sequência de ácido nucleico de cerca de nt 607 a
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23/177 cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência pelo menos 70% a 99%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, idêntica a cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a proteína do capsídeo vp3 (cerca de aa 203 a 736) da SEQ ID NO: 8. [0063] É do conhecimento da técnica projetar sequências de ácidos nucleicos que codificam esse capsídeo AAVhu68, incluindo DNA (genômico ou cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA). Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína do capsídeo AAVhu68vp1 é fornecida na SEQ ID NO: 7. Veja também as FIGS 8B-8D. Em outras modalidades, uma sequência de ácido nucleico de 70% a 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 7 pode ser selecionada para expressar as proteínas do capsídeo AAVhu68. Em certas outras modalidades, a sequência de ácido nucleico é pelo menos cerca de 75% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% idêntica, ou pelo menos 99% a 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 7. Tais sequências de ácido nucleico podem ser otimizadas por códon para expressão em um sistema selecionado (isto é, tipo de célula) e podem ser concebidas por vários métodos. Essa otimização pode ser realizada utilizando métodos que estão disponíveis on-line (por exemplo, GeneArt), métodos publicados ou uma empresa que fornece serviços de otimização de códons, por exemplo, DNA2.0 (Menlo Park, CA). Um método de otimização de códons é descrito, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional dos EUA No. WO 2015/012924, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade. Veja também, por exemplo, a Publicação de Patente dos EUA 2014/0032186 e a Publicação de Patente dos EUA 2006/0136184. Adequadamente, o comprimento total da estrutura de leitura aberta (ORF) para o produto é modificado. No entanto, em algumas modalidades, apenas um fragmento da ORF pode ser alterado. Utilizando um
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24/177 destes métodos, podem-se aplicar as frequências a qualquer sequência polipeptídica e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região codificadora optimizada por códons que codifica o polipeptídeo. Estão disponíveis várias opções para efetuar as alterações reais aos códons ou para sintetizar as regiões de codificação otimizadas por códons concebidas como descrito neste documento. Tais modificações ou síntese podem ser realizadas utilizando manipulações biológicas moleculares padrão e de rotina bem conhecidas dos versados na técnica. Em uma abordagem, uma série de pares de oligonucleotídeos complementares de 80-90 nucleotídeos cada um em comprimento e abrangendo o comprimento da sequência desejada são sintetizados através de métodos padrão. Estes pares de oligonucleotídeos são sintetizados de tal modo que após o emparelhamento, formam fragmentos de cadeia dupla de 80-90 pares de bases, contendo extremidades coesivas, por exemplo, cada oligonucleotídeo no par é sintetizado para se estender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, ou mais bases além da região que é complementar ao outro oligonucleotídeo no par. As extremidades de cadeia simples de cada par de oligonucleotídeos são concebidas para emparelhar-se com a extremidade de cadeia simples de outro par de oligonucleotídeos. Os pares de oligonucleotídeos são permitidos emparelharem-se, e aproximadamente cinco a seis destes fragmentos de cadeia dupla são então permitidos emparelharem-se juntos através das extremidades coesivas de cadeia simples, e depois são ligados e clonados em um vetor de clonagem bacteriano padrão, por exemplo, um vetor TOPO® disponível pela Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia. O construto é então sequenciado por métodos padrão. Vários destes construtos consistindo de 5 a 6 fragmentos de fragmentos de 80 a 90 pares de bases ligados entre si, isto é, fragmentos de cerca de 500 pares de bases, são preparados de tal modo que toda a sequência desejada é representada em uma série de construtos plasmáticos. As inserções destes plasmídeos são
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25/177 então cortadas com enzimas de restrição apropriadas e ligadas em conjunto para formar o construto final. O construto final é então clonado em um vetor de clonagem bacteriana padrão e sequenciada. Métodos adicionais seriam imediatamente evidentes para o versado na técnica. Além disso, a síntese genética está prontamente disponível comercialmente.
[0064] Em certas modalidades, a asparagina (N) nos pares N-G nas proteínas AAVhu68 vp1, vp2 e vp3 é altamente desamidada. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 contém subpopulações de proteínas do capsídeo AAV vp1, vp2 e/ou vp3 possuindo pelo menos quatro posições de asparagina (N) nas proteínas do capsídeo AAVhu68 que sejam altamente desamidadas. Em certas modalidades, cerca de 20 a 50% dos pares N-N (exclusivos das trigêmeas N-N-N) apresentam desamidação. Em certas modalidades, a primeira N é desamidada. Em certas modalidades, a segunda N é desamidada. Em certas modalidades, a desamidação está entre cerca de 15% e cerca de 25% de desamidação. A desamidação no Q na posição 259 da SEQ ID NO: 8 é de cerca de 8% a cerca de 42% das proteínas do capsídeo AAVhu68 vp1, vp2 e vp3 de uma proteína AAVhu68.
[0065] Em certas modalidades, o capsídeo rAAVhu68 é ainda caracterizado por uma amidação em D297 das proteínas vp1, vp2 e vp3. Em certas modalidades, cerca de 70% a cerca de 75% do D na posição 297 das proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 em um capsídeo AAVhu68 são amidadas, com base na numeração da SEQ ID NO: 8.
[0066] Em certas modalidades, pelo menos um Asp no vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é isomerizado em D-Asp. Esses isômeros estão geralmente presentes em uma quantidade inferior a cerca de 1 % da Asp em uma ou mais posições de resíduo 97, 107, 384, com base na numeração da SEQ ID NO: 8.
[0067] Em certas modalidades, um rAAVhu68 possui um capsídeo
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AAVhu68 com proteínas vp1, vp2 e vp3 com subpopulações compreendendo combinações de dois, três, quatro ou mais resíduos desamidados nas posições definidas na tabela abaixo. A desamidação no rAAV pode ser determinada usando eletroforese em gel 2D e/ou espectrometria de massas e/ou técnicas de modelagem de proteínas. A cromatografia online pode ser realizada com uma coluna Acclaim PepMap e um sistema Thermo UltiMate 3000 RSLC (Thermo Fisher Scientific) acoplado a um Q Exactive HF com uma fonte NanoFlex (Thermo Fisher Scientific). Os dados da MS são adquiridos usando um método top-20 dependente de dados para o Q Exactive HF, escolhendo dinamicamente os íons precursores ainda não sequenciados mais abundantes das varreduras da pesquisa (200-2000 m/z). O sequenciamento é realizado através de fragmentação de dissociação de colisão de alta energia com um valor alvo de 1e5 íons determinados com controle de ganho automático preditivo e um isolamento de precursores foi realizado com uma janela de 4 m/z. Os exames foram adquiridos com uma resolução de 120.000 a m/z 200. A resolução para os espectros de HCD pode ser configurada para 30.000 a m/z 200, com um tempo máximo de injeção de íons de 50 ms e uma energia de colisão normalizada de 30. O nível de RF da lente S pode ser fixado em 50, para fornecer a transmissão ideal da região m/z ocupada pelos peptídeos da massa digerida. Os íons precursores com estados de carga únicos, não atribuídos ou de seis ou mais podem ser excluídos da seleção de fragmentação. O software BioPharma Finder 1.0 (Thermo Fischer Scientific) pode ser usado para análise dos dados adquiridos. Para o mapeamento peptídico, as buscas são realizadas usando um banco de dados FASTA de proteína de entrada única com um conjunto de carbamidometilação como uma modificação fixa; e oxidação, desamidação e fosforilação ajustadas como modificações variáveis, uma precisão de massa de 10 ppm, uma alta especificidade de protease e um nível de confiança de 0,8 para espectros de MS/MS.
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Exemplos de proteases adequadas podem incluir, por exemplo, tripsina ou quimotripsina. A identificação espectrométrica de massas de peptídeos desamidados é relativamente simples, pois a desamidação aumenta a massa da molécula intacta +0,984 Da (a diferença de massa entre os grupos -OH e -NH2). A percentagem de desamidação de um peptídeo particular é a área de massa determinada do peptídeo desamidado dividida pela soma da área dos peptídeos desamidados e nativos. Considerando 0 número de possíveis sítios de desamidação, as espécies isobáricas que são desamidadas em diferentes sítios podem comigrar em um único pico. Consequentemente, os íons de fragmentos originários de peptídeos com múltiplos sítios potenciais de desamidação podem ser utilizados para localizar ou diferenciar múltiplos sítios de desamidação. Nestes casos, as intensidades relativas dentro dos padrões de isótopos observados podem ser utilizadas para determinar especificamente a abundância relativa dos diferentes isômeros peptídicos desamidados. Este método assume que a eficiência da fragmentação para todas as espécies isoméricas é a mesma e independente do sítio de desamidação. Será entendido por um versado na técnica que podem ser usadas diversas variações destes métodos ilustrativos. Por exemplo, espectrômetros de massas adequados podem incluir, por exemplo, um espectrômetro de massas de tempo de vôo quadrupolo (QTOF), como um Waters Xevo ou Agilent 6530 ou um instrumento orbitrap, como 0 Orbitrap Fusion ou Orbitrap Velos (Thermo Fisher). Os sistemas de cromatografia líquida apropriados incluem, por exemplo, 0 sistema Acquity UPLC dos sistemas Waters ou Agilent (série 1100 ou 1200). O software de análise de dados adequado pode incluir, por exemplo, MassLynx (Waters), Pinpoint e Pepfinder (Thermo Fischer Scientific), Mascote (Matrix Science), Peaks DB (Bioinformatics Solutions). Ainda outras técnicas podem ser descritas, por exemplo, em X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, vol. 28, n° 5, pp. 255-267, publicado online em 16 de
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Desamidação Baseado no AAVHu68 Previsto [SEQ ID NO: 8] % Média com base nas proteínas VP1/VP2/VP3 no capsídeo AAVhu68
Resíduo Desamidado + 1 (AA vizinho) Amplo Intervalo de Percentagens (%) Intervalos estreitos (%)
N57 (N-G) 78 a 100% 80 a 100, 85 a 97
N66 (N-E) 0a5 0, 1 a 5
N94 (N-H) 0 a 15, 0, 1 a 15, 5 a 12, 8
N113 (N-L) 0a2 0, 1 a 2
-N253 (N-N) 10 a 25 15 a 22
Q259 (Q-i) 8 a 42 10 a 40, 20 a 35
-N270 (N-D) 12 a 30 15 a 28
-N304 (N-N) (posição 303 também N) 0a5 1 a4
N319 (N-l) 0a5 0, 1 a 5, 1 a 3
N329 * (N-G)*(posição 328 também N) 65 a 100 70 a 95, 85 a 95, 80 a 100, 85 a 100,
N336 (N-N) 0 a 100 0, 1 a 10, 25 a 100, 30 a 100, 30 a 95
-N409 (N-N) 15 a 30 20 a 25
N452 (N-G) 75 a 100 80 a 100,90 a 100, 95 a 100,
N477 (N-Y) 0a8 0, 1 a 5
N512 (N-G) 65 a 100 70 a 95, 85 a 95, 80 a 100, 85 a 100,
-N515 (N-S) 0 a 25 0, 1 a 10,5 a 25, 15 a 25
-Q599 (Asn-Q-Gly) 1 a 20 2 a 20, 5 a 15
N628 (N-F) 0a 10 0, 1 a 10, 2 a 8
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Desamidação Baseado no AAVHu68 Previsto [SEQ ID NO: 8] % Média com base nas proteínas VP1/VP2/VP3 no capsídeo AAVhu68
Resíduo Desamidado + 1 (AA vizinho) Amplo Intervalo de Percentagens (%) Intervalos estreitos (%)
N651 (N-T) 0a3 0, 1 a 3
N663 (N-K) 0a5 0, 1 a5, 2a4
N709 (N-N) 0 a 25 0, 1 a 22, 15 a 25
N735 0 a 40 0, 1 a 35, 5 a 50, 20 a 35
[0068] Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 é caracterizado por possuir proteínas de capsídeo nas quais pelo menos 45% dos resíduos N são desamidados em pelo menos uma das posições N57, N329, N452 e/ou N512 com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos 90% dos resíduos N em uma ou mais destas posições N-G (isto é, N57, N329, N452 e/ou N512, com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8) são desamidados. Nestas e em outras modalidades, um capsídeo AAVhu68 é ainda caracterizado por ter uma população de proteínas em que cerca de 1% a cerca de 20% dos resíduos N possuem desamidações em uma ou mais posições: N94, N253, N270, N304, N409, N477 e/ou Q599, com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o AAVhu68 compreende pelo menos uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que são desamidadas em uma ou mais das posições N35, N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304. N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, N735, com base na numeração da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, as proteínas do capsídeo podem ter um ou mais aminoácidos amidados.
[0069] Ainda são observadas outras modificações, a maioria das
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30/177 quais não resulta na conversão de um aminoácido em um resíduo de aminoácido diferente. Opcionalmente, pelo menos uma Lys na vp1, vp2 e vp3 do capsídeo é acetilada. Em certas modalidades, pelo menos um Asp na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é isomerizado em D-Asp. Opcionalmente, pelo menos um S (Ser, Serina) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é fosforilado. Opcionalmente, pelo menos um T (Thr, treonina) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é fosforilado. Opcionalmente, pelo menos um W (trp, triptofano) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é oxidado. Opcionalmente, pelo menos um M (Met, Metionina) na vp1, vp2 e/ou vp3 do capsídeo é oxidado. Em certas modalidades, as proteínas do capsídeo possuem uma ou mais fosforilações. Por exemplo, certas proteínas de capsídeo vp1 podem ser fosforiladas na posição 149.
[0070] Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 compreende uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que as proteínas vp1 compreendem um ácido glutâmico (Glu) na posição 67 e/ou uma valina (Vai) na posição 157; uma população heterogênea de proteínas vp2 compreendendo opcionalmente uma valina (Vai) na posição 157; e uma população heterogênea de proteínas vp3. O capsídeo AAVhu68 contém pelo menos uma subpopulação em que pelo menos 65% das asparaginas (N) em pares asparagina - glicina localizados na posição 57 das proteínas vp1 e pelo menos 70% de asparaginas (N) em pares asparagina - glicina nas posições 329, 452 e/ou 512 das proteínas vp1, vp2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração do resíduo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que a desamidação resulta em uma alteração de aminoácidos. Conforme discutido em mais detalhes neste documento, as asparaginas desamidadas podem ser desamidadas em ácido aspártico, ácido iso-aspártico, um par de ácido aspártico/ácido iso-aspártico interconversor ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades,
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31/177 os rAAVhu68 são ainda caracterizados por um ou mais dos seguintes:
(a) cada uma das proteínas vp2 é independentemente o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos a proteína vp2 da SEQ ID NO: 8; (b) cada uma das proteínas vp3 é independentemente o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos a proteína vp3 da SEQ ID NO: 8; (c) a sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas vp1 é a SEQ ID NO: 7, ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos, 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 7, que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Opcionalmente, essa sequência é usada sozinha para expressar as proteínas vp1, vp2 e vp3. Alternativamente, esta sequência pode ser co-expressa com uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos AAVhu68vp3 da SEQ ID NO: 8 (cerca de aa 203 a 736) sem a região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de aa 137) e/ou regiões exclusivas de vp2 (cerca de aa 1 a cerca de aa 202), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7), ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica aa 203 a 736 da SEQ ID NO: 8. Adicionalmente, ou alternativamente, a sequência de codificação de vp1 e/ou codificação de vp2 pode ser co-expressa com a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de AAVhu68vp2 da SEQ ID NO: 8 (cerca de aa 138 a 736) sem o região exclusiva de vp1 (cerca de aa 1 a cerca de 137), ou uma cadeia complementar a esta, o mRNA ou tRNA correspondente (nt 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7) ou uma sequência pelo menos 70% a pelo menos 99% (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo
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32/177 menos 98% ou pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica cerca de aa 138 a 736 da SEQ ID NO: 8.
[0071] Adicionalmente ou alternativamente, o capsídeo rAAVhu68 compreende pelo menos uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que são desamidadas em uma ou mais das posições N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N512, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, com base na numeração da SEQ ID NO: 8 ou combinações das mesmas; (e) o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que compreendem desamidação de 1% a 20% em uma ou mais das posições N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, com base na numeração da SEQ ID NO: 8 ou combinações das mesmas; (f) o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de vp1 na qual são desamidadas 65% a 100% das N na posição 57 das proteínas vp1, com base na numeração da SEQ ID NO: 8; (g) o capsídeo rAAVhu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1 na qual são desamidadas 75% a 100% das N na posição 57 das proteínas vp1; (h) o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 80% a 100% das N na posição 329, com base na numeração da SEQ ID NO: 8, são desamidadas; (i) o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 80% a 100% das N na posição 452, com base na numeração da SEQ ID NO: 8, são desamidadas; (j) o capsídeo rAAVhu68 compreende subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 80% a 100% das N na posição 512, com base na numeração da SEQ ID NO: 8, são desamidadas; (k) o rAAV compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 a 1,5 vp2 a 3 a 10 proteínas vp3; (I)
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33/177 o rAAV compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 vp2 a 3 a 9 proteínas vp3.
[0072] Em certas modalidades, o AAVhu68 é modificado para alterar a glicina em um par asparagina-glicina, para reduzir a desamidação. Em outras modalidades, a asparagina é alterada para um aminoácido diferente, por exemplo, uma glutamina que desamida a uma velocidade menor; ou a um aminoácido que não possui grupos amida (por exemplo, glutamina e asparagina contêm grupos amida); e/ou a um aminoácido que não possui grupos amina (por exemplo, lisina, arginina e histidina contêm grupos amida). Conforme utilizado neste documento, aminoácidos que não possuem grupos laterais amida ou amina referem-se a, por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cistina, fenilalanina, tirosina ou triptofano e/ou prolina. Modificações como as descritas podem estar em um, dois ou três dos pares asparagina-glicina encontrados na sequência de aminoácidos AAVhu68 codificada. Em certas modalidades, essas modificações não são feitas em todos os quatro pares de asparagina - glicina. Assim, um método para reduzir a desamidação de AAVhu68 e/ou variantes de AAVhu68 manipuladas com taxas de desamidação mais baixas. Adicionalmente ou alternativamente, um ou mais outros aminoácidos amidos podem ser alterados para um aminoácido não amida para reduzir a desamidação do AAVhu68.
[0073] Essas modificações de aminoácidos podem ser feitas por técnicas convencionais de engenharia genética. Por exemplo, pode ser gerada uma sequência de ácido nucleico contendo códons de AAVhu68 modificados, em que um a três dos códons que codificam glicina na posição 58, 330, 453 e/ou 513 na SEQ ID NO: 8 (pares de arginina-glicina) são modificados para codificar um aminoácido diferente de glicina. Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico contendo códons de arginina modificados pode ser manipulada em um a três dos pares
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34/177 de arginina-glicina localizados na posição 57, 329, 452 e/ou 512 na SEQ ID NO: 8, de modo que o códon modificado codifique um aminoácido diferente de arginina. Cada códon modificado pode codificar um aminoácido diferente. Alternativamente, um ou mais dos códons alterados podem codificar o mesmo aminoácido. Em certas modalidades, estas sequências de ácido nucleico de AAVhu68 modificadas podem ser utilizadas para gerar um rAAVhu68 mutante possuindo um capsídeo com desamidação inferior ao capsídeo de hu68 nativo. Tal rAAVhu68 mutante pode ter imunogenicidade reduzida e/ou estabilidade aumentada durante o armazenamento, particularmente armazenamento na forma de suspensão. Conforme utilizado neste documento, um códon refere-se a três nucleotídeos em uma sequência que codifica um aminoácido.
[0074] Em uma modalidade, é fornecido um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende: (A) um capsídeo AAV68 compreendendo um ou mais dentre: (1) proteínas do capsídeo AAV hu68 compreendendo: proteínas AAVhu68 vp1 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas vp1 produzidas a partir da SEQ ID NO: 7 ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas AAVhu68 vp2 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7, ou proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas
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AAVhu68 vp3 produzidas por expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 8, proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 7, ou proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica a pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de pelo menos cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 8; e/ou (2) proteínas do capsídeo AAV compreendendo uma população heterogênea de proteínas vp1 opcionalmente compreendendo uma valina na posição 157 e/ou um ácido glutâmico na posição 67, uma população heterogênea de proteínas vp2 opcionalmente compreendendo uma valina na posição 157 e uma população heterogênea de proteínas vp3, em que pelo menos uma subpopulação das proteínas vp1 e vp2 compreende uma valina na posição 157 e opcionalmente compreendendo ainda um ácido glutâmico na posição 67 com base na numeração do capsídeo vp1 da SEQ ID NO: 8; e/ou (3) uma população heterogênea de proteínas vp1 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, uma população heterogênea de proteínas vp2 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de pelo menos cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO: 8 e uma população heterogênea de proteínas vp3 que são o produto de uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos os aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO: 8, em que: as proteínas vp1, vp2 e vp3 contêm subpopulações com modificações de aminoácidos compreendendo pelo menos duas asparaginas (N) altamente desamidadas em pares asparagina-glicina na SEQ ID NO: 8 e, opcionalmente, compreendendo subpopulações compreendendo outros aminoácidos desamidados, em que a desamidação resulta em
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36/177 uma alteração de aminoácidos; e (B) um genoma de vetor no capsídeo AAVhu68, o genoma de vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo sequências repetidas terminais invertidas AAV e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifica um produto operacionalmente ligado a sequências que direcionam a expressão do produto em uma célula hospedeira. Por exemplo, quatro resíduos (N57, N329, N452, N512) exibem rotineiramente altos níveis de desamidação. Resíduos adicionais (N94, N253, N270, N304, N409, N477 e Q599) também exibem níveis de desamidação de até -20% em vários lotes.
[0075] Em certas modalidades, as asparaginas desamidadas são desamidadas em ácido aspártico, ácido iso-aspártico, um par de ácido aspártico interconversor/ácido iso-aspártico, ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a(s) glutamina(s) desamidada(s) é(são) desamidada(s) em ácido (a)-glutâmico, ácido γ-glutâmico, um par de interconversão de ácido (a)-glutâmicoZácido γ-glutâmico ou combinações dos mesmos.
[0076] Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 compreende subpopulações possuindo um ou mais de: (a) pelo menos 65% das asparaginas (N) em pares asparagina-glicina localizados nas posições 57 das proteínas vp1 são desamidadas, com base na numeração de SEQ ID NO: 8; (b) pelo menos 75% das N em pares asparagina-glicina na posição 329 das proteínas vp1, vp2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (c) pelo menos 50% das N em pares asparagina-glicina na posição 452 das proteínas vp1, vp2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; e/ou (d) pelo menos 75% das N em pares asparagina-glicina na posição 512 das proteínas vp1, vp2 e vp3 são desamidadas, com base na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
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8. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de vp1 na qual 75% a 100% das N na posição 57 das proteínas vp1 são desamidadas, conforme determinado por espectrometria de massas. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 75% a 100% das N na posição 329, com base na numeração da SEQ ID NO: 8, são desamidadas conforme determinado usando espectrometria de massas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 75% a 100% das N na posição 452, com base na numeração da SEQ ID NO: 8, são desamidadas conforme determinado usando espectrometria de massas. Em certas modalidades, o capsídeo hu68 compreende uma subpopulação de proteínas vp1, proteínas vp2 e/ou proteínas vp3 nas quais 75% a 100% das N na posição 512, com base na numeração da SEQ ID NO: 8, são desamidadas. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas é SEQ ID NO: 7, ou uma sequência pelo menos 80% a pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a sequência é pelo menos 80% a 97% idêntica à SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, o capsídeo rAAVhu68 compreende ainda pelo menos uma subpopulação de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 possuindo modificações de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 8 compreendendo pelo menos cerca de 50% a 100% de desamidação de pelo menos quatro posições selecionadas de uma ou mais dentre N57, 329, 452, 512, ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 compreende subpopulações de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que compreendem ainda de 1% a cerca de 40% de desamidação em pelo menos uma ou mais das posições N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663,
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N709, ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, o capsídeo rAAVhu68 compreende as subpopulações de proteínas vp1, vp2 e/ou vp3 que compreendem ainda uma ou mais modificações selecionadas dentre uma ou mais modificações em um ou mais dos seguintes: lisina acetilada, serina e/ou treonina fosforilada, ácido aspártico isomerizado, triptofano e/ou metionina oxidada, ou um aminoácido amidado. Em certas modalidades, o rAAVhu68 compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 a
1,5 vp2 a 3 a 10 proteínas vp3. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 vp2 a 3 a 9 proteínas vp3. Em certas modalidades, o genoma do vetor compreende sequências AAV ITR de uma fonte de AAV diferente de AAVhu68.
[0077] Em certas modalidades, é fornecida uma composição que compreende uma população mista de vírus adenoassociado recombinante hu68 (rAAVhu68), em que cada um dos rAAVhu68 é selecionado independentemente a partir de um rAAVhu68, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 regular compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 a 1,5 vp2 a 3 a 10 proteínas vp3. Em certas modalidades, o capsídeo AAVhu68 regular compreende cerca de 60 proteínas totais do capsídeo em uma proporção de cerca de 1 vp1 a cerca de 1 vp2 a 3 a 6 proteínas vp3. Em certas modalidades, a composição é formulada para distribuição intratecal. Em certas modalidades, a composição é formulada para distribuição intranasal ou intramuscular. Em certas modalidades, uma composição compreende pelo menos um estoque de vetores rAAVhu68 e um carreador, excipiente e/ou conservante opcional.
[0078] Qualquer sistema de produção de rAAV adequado útil para produzir um AAVhu68 recombinante pode ser usado. Por exemplo, tal
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39/177 sistema de produção pode compreender: (a) uma sequência de ácido nucleico do capsídeo AAVhu68 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) uma molécula de ácido nucleico adequada para o empacotamento no capsídeo AAVhu68, a referida molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma repetição terminal invertida de AAV (ITR) e uma sequência de ácido nucleico não-AAV que codifique um produto genético operativamente ligado a sequências que expressam diretamente o produto em uma célula hospedeira; e (c) funções de rep e funções auxiliares do AAV suficientes para permitir o empacotamento da molécula de ácido nucleico no capsídeo AAVhu68 recombinante. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico de (a) compreende pelo menos a SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de pelo menos 70% a pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 7 que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o sistema opcionalmente compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de cerca de nt 607 a cerca de nt 2211 da SEQ ID NO: 7 que codifica a AAVhu68 vp3 de cerca de aa 203 a cerca do aminoácido 736 da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o sistema compreende células 293 de rim embrionário humano ou um sistema de baculovírus.
[0079] Em certas modalidades, é fornecido um método para reduzir a desamidação de um capsídeo AAVhu68. O método compreende a produção de um capsídeo de AAVhu68 a partir de uma sequência de ácido nucleico contendo códons de vp de AAVhu68 modificados, com a sequência de ácido nucleico compreendendo códons de glicina independentemente modificados em de um a três dos pares de arginina glicina localizados nas posições 58, 330, 453 e/ou 513 na SEQ ID NO: 8, de modo que o códon modificado codifique um aminoácido diferente de glicina. Em certas modalidades, o método compreende a produção de um capsídeo AAVhu68 a partir de uma sequência de ácido nucleico contendo códons de vp de AAVhu68, com a sequência de ácido nucleico
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40/177 compreendendo códons de arginina independentemente modificados em de um a três dos pares de arginina - glicina localizados nas posições 57, 329, 452 e/ou 512 na SEQ ID NO: 8, de modo de que o códon modificado codifique um aminoácido diferente de arginina. Em certas modalidades, cada códon modificado codifica um aminoácido diferente. Em certas modalidades, dois ou mais códons modificados codificam o mesmo aminoácido. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 mutante, conforme descrito neste documento, contém uma mutação em um par arginina - glicina, de modo que a glicina seja alterada para uma alanina ou serina. Um capsídeo AAVhu68 mutante pode conter um, dois ou três mutantes, onde o AAVhu68 de referência contém nativamente quatro pares NG. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 mutante contém apenas uma única mutação em um par NG. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 mutante contém mutações em dois pares de NG diferentes. Em certas modalidades, um capsídeo AAVhu68 mutante contém mutações em dois pares NG diferentes que estão localizados em uma localização estruturalmente separada no capsídeo AAVhu68. Em certas modalidades, a mutação não está na região exclusiva de VP1. Em certas modalidades, uma das mutações está na região exclusiva de VP1. Opcionalmente, um capsídeo AAVhu68 mutante não contém modificações nos pares NG, mas contém mutações para minimizar ou eliminar a desamidação em uma ou mais asparaginas, ou uma glutamina, localizadas fora de um par NG.
[0080] Conforme utilizado neste documento, sequência de aminoácidos codificada refere-se ao aminoácido que é previsto com base na tradução de um códon de DNA conhecido de uma sequência de ácido nucleico referenciada sendo traduzida em um aminoácido. A tabela a seguir ilustra os códons de DNA e vinte aminoácidos comuns, mostrando o código de uma letra (SLC) e o código de três letras (3LC).
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Aminoácido | SLC 3 LC 1 Códons de DNA
(Isoleucina 1 lie ATT. ATC. ATA
(Leucina Leu CTT. CTC. CTA. CTG. TTA. TTG
(Valina V Vai GTT. GTC. GTA. GTG
(Fenilalanina F Phe (TTT, ttc
(Metionina Met ATG
(Cisteína C Cys TGT. TGC
(Alanina Ala GCT. GCC. GCA. GCG
(Glicina Gly GGT. GGC. GGA. GGG
(Prolina P Pro (CCT, CCC, CCA, CCG
(Treonina T Thr ACT.ACC.ACA.ACG
(Serina s Ser TCT. TCC. TCA. TCG. AGT. AGC
(Tirosina γ Tyr
Triptofano w Trp TGG
(Glutamina Q Gin (CAA, CAG
(Asparagina Âsn AAT. AAC
(Histidina H His CAT. CÁC
(Ácido glutâmico Glu GAA. GAG
(Ácido aspártico Ásp GAT. GAC
(Lisina K Lys (AAA, aag
(Arginina Ãrg CGT. CGC. CGA. CGG. AGA. AGG
(Códons de Parada Parada TAA. TAG. TGÁ
[0081] Métodos para gerar capsídeos, e, portanto, sequências de codificação, e métodos para a produção de vetores virais de rAAV foram descritos. Veja, por exemplo, Gao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) e US 2013/0045186A1. Outros capsídeos, como, por exemplo, aqueles descritos em WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2, que são incorporados neste documento por referência, podem ser utilizados em seres humanos. Em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula manipulada compreendendo uma sequência espaçadora entre a sequência de codificação AAVhu68 vp1 e as sequências de codificação de rep de AAVhu68.
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42/177 [0082] Como indicado acima, as sequências e proteínas de AAVhu68 são úteis na produção de rAAV. Os exemplos abaixo descrevem a produção de vetores rAAV com vetores AAVhu68 ou AAV9. No entanto, em outras modalidades, outro capsídeo AAV é selecionado. A especificidade do tecido é determinada pelo tipo de capsídeo. Por exemplo, um vetor viral com um AAVhu68 é ilustrado nos exemplos abaixo como sendo útil para a transdução de células epiteliais nasais. As sequências de AAVhu68 são descritas neste documento. Além disso, foram descritos métodos de geração de vetores contendo o capsídeo AAV9 e capsídeos quiméricos derivados de AAV9. Veja, por exemplo, US 7,906,111, que é incorporado neste documento por referência. Outros sorotipos de AAV que transduzem células nasais ou outro alvo adequado (por exemplo, músculo ou pulmão) podem ser selecionados como fontes para capsídeos de vetores virais de AAV (partículas virais resistentes a DNase), incluindo, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8 (veja, por exemplo, Pedido de Patente Publicado nos EUA 2007-0036760-A1; Pedido de Patente Publicado nos EUA 20090197338-A1; e EP 1310571). Veja também WO 2003/042397 (AAV7 e outros AAV símios), Patente dos EUA 7790449 e Patente dos EUA 7282199 (AAV8), WO 2005/033321 (AAV9) e WO 2006/110689, ou ainda a ser descoberto, ou um AAV recombinante com base no mesmo, pode ser usado como fonte para o capsídeo AAV. Estes documentos também descrevem outros capsídeos AAV que podem ser selecionados para gerar AAV e são incorporados por referência. Em algumas modalidades, um capsídeo (cap) AAV para uso no vetor viral pode ser gerado por mutagênese (isto é, por inserções, deleções ou substituições) de um dos capsídeos AAV supracitados ou do seu ácido nucleico de codificação. Em algumas modalidades, o capsídeo AAV é quimérico, compreendendo domínios de duas ou três ou quatro ou mais das proteínas do
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43/177 capsídeo AAV supracitadas. Em algumas modalidades, o capsídeo AAV é um mosaico de monômeros Vp1, Vp2 e Vp3 de dois ou três AAVs diferentes ou AAVs recombinantes. Em algumas modalidades, uma composição de rAAV compreende mais de um dos caps supracitados.
[0083] Os capsídeos AAVhu68 podem ser úteis em certas modalidades. Por exemplo, esses capsídeos podem ser utilizados na geração de anticorpos monoclonais e/ou na geração de reagentes úteis em ensaios para monitorar os níveis de concentração de AAVhu68 em pacientes de terapia gênica. As técnicas para gerar anticorpos anti-AAVhu68 úteis, marcar esses anticorpos ou capsídeos vazios e formatos de ensaio adequados são conhecidos pelos versados na técnica.
[0084] Mais tipicamente, os capsídeos AAVhu68 fornecidos neste documento são úteis na geração de vetores AAV recombinantes, nos quais uma sequência de ácido nucleico manipulada é empacotada no capsídeo AAVhu68. Esses vetores AAV recombinantes, denominados vetores rAAVhu68 ou rAAVhu68, e seus usos são discutidos em mais detalhes em outra seção deste pedido. Estes vetores rAAVhu68 são úteis para gerar vetores AAV recombinantes (rAAV) que fornecem bom rendimento e/ou eficiência de empacotamento e fornecem vetores rAAV úteis na transdução de vários tipos diferentes de células e tecidos. Tais células e tipos de tecidos incluem, sem limitação, pulmão, coração, músculo, fígado, pâncreas, rim, cérebro, hipocampo, córtex motor, cerebelo, células epiteliais nasais, células musculares cardíacas ou cardiomiócitos, hepatócitos, células endoteliais pulmonares, miócitos, pulmões células epiteliais, células de ilhotas, células acinares, células renais e/ou neurônios motores.
[0085] Em certas modalidades, os vetores possuindo os capsídeos AAVhu68 fornecem pelo menos um aumento de 15% no rendimento do vetor empacotado em comparação com os vetores baseados no AAV9.
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Em uma comparação entre AAVhu68 e AAVrhl 0, verificou-se que o AAVhu68 fornece melhor eficiência de transdução que o AAVrhl 0 em doses baixas (por exemplo, cerca de 1 x 109) após administração intracerebroventricular. Em uma comparação adicional entre AAVhu68 e AAV9, verificou-se que o AAVhu68 fornece melhor eficiência de transdução do que o AAV9 no cerebelo, córtex motor e hipocampo do cérebro (por exemplo, cerca de 1 x 1011 GC) após administração intracerebroventricular.
[0086] Um “AAV recombinante” ou “rAAV” é uma partícula viral resistente a DNAse contendo dois elementos, um capsídeo AAV e um genoma de vetor contendo pelo menos sequências de codificação nãoAAV empacotadas dentro do capsídeo AAV. Em certas modalidades, o capsídeo contém cerca de 60 proteínas compostas por proteínas vp1, proteínas vp2 e proteínas vp3, que se auto-montam para formar o capsídeo. A menos que especificado de outra forma, “AAV recombinante” ou “rAAV” podem ser usados de forma intercambiável com a frase “vetor rAAV”. O rAAV é um vírus deficiente na replicação ou vetor viral, uma vez que não possui qualquer gene AAV rep funcional ou gene AAV cap funcional e não pode gerar descendência. Em certas modalidades, as únicas sequências de AAV são as sequências repetidas terminais invertidas (ITRs) de AAV, tipicamente localizadas nas extremidades 5 'e 3' extremas do genoma do vetor, a fim de permitir que as sequências reguladoras e de genes localizadas entre as ITRs sejam empacotadas dentro do capsídeo AAV.
[0087] O termo resistentes às nucleases indica que o capsídeo AAV foi completamente montado em torno da cassete de expressão, que é concebida para distribuir um transgene para uma célula hospedeira e protege essas sequências genômicas da degradação (digestão) durante as etapas de incubação de nuclease concebidas para remover ácidos nucleicos que possam estar presentes no processo de produção.
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45/177 [0088] Em certas modalidades, os elementos genéticos não virais usados na fabricação de um rAAV serão referidos como vetores (por exemplo, vetores de produção). Em certas modalidades, esses vetores são plasmídeos, mas é contemplada a utilização de outros elementos genéticos adequados. Tais plasmídeos de produção podem codificar sequências expressas durante a produção de rAAV, por exemplo, capsídeo AAV ou proteínas rep necessárias para a produção de um rAAV, que não são empacotadas no rAAV. Alternativamente, esse plasmídeo de produção pode transportar o genoma do vetor que é empacotado no rAAV.
[0089] Conforme utilizado neste documento, um genoma de vetor refere-se à sequência de ácido nucleico empacotada dentro do capsídeo rAAV que forma uma partícula viral. Tal sequência de ácido nucleico contém sequências repetidas terminais invertidas AAV (ITRs). Nos exemplos apresentados neste documento, um genoma de vetor contém, no mínimo, de 5 'a 3', uma AAV 5' ITR, sequência(s) de codificação e uma AAV 3' ITR. Podem ser selecionadas ITRs do AAV2, um AAV de origem diferente do capsídeo ou que não sejam as ITRs completas. Em certas modalidades, as ITRs são da mesma fonte de AAV que o AAV, que fornece a função rep durante a produção ou um AAV transcomplementar. Além disso, outras ITRs podem ser utilizadas. Além disso, o genoma do vetor contém sequências reguladoras que direcionam a expressão dos produtos gênicos. Os componentes adequados de um genoma de vetor são discutidos em mais detalhes neste documento.
[0090] Em certas modalidades, o termo cassete de expressão refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende as sequências de hSMN e, portanto, sequências reguladoras (por exemplo, promotor, intensificador, polyA), cuja cassete pode ser empacotada no capsídeo de um vetor viral (por exemplo, uma partícula viral). Em geral,
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46/177 essa cassete de expressão para gerar um vetor viral contém as sequências de hSMN descritas neste documento, flanqueadas por sinais de empacotamento do genoma viral e outras sequências de controle de expressão, conforme descritas neste documento. Por exemplo, para um vetor viral AAV, os sinais de empacotamento são a repetição terminal invertida 5' (ITR) e a 3' ITR. Em certas modalidades, o termo “transgene” pode ser usado de forma intercambiável com “cassete de expressão”. Em outras modalidades, o termo transgene refere-se apenas às sequências de codificação para um gene selecionado, por exemplo, hSMN1.
[0091] Conforme utilizado neste documento, o termo SMN inclui qualquer isoforma de SMN que restaure uma função desejada, reduza um sintoma ou forneça outro resultado fisiológico desejado, quando distribuída uma composição ou método fornecido neste documento. Os exemplos fornecidos neste documento utilizam a isoforma mais longa, a Isoforma D, que se acredita ser o transcrito predominante produzido pelo gene em um paciente não afetado por uma deficiência ou defeito de SMN. A Isoforma D fornece uma proteína de 294 aminoácidos [veja, por exemplo, acesso NCBI NM_000334 / NP_000335; ENSEMBL ID ENST00000380707], a sequência de proteínas é reproduzida na SEQ ID NO: 2 e a sequência de codificação é reproduzida na SEQ ID NO: 3. No entanto, outra isoforma pode ser selecionada. Por exemplo, a isoforma B tem um éxon alternativo enquadrado na sequência de codificação 3', resultando em uma proteína que é mais curta em comprimento (262 aminoácidos) do que a Isoforma D, mas com os mesmos terminais N e C que essa isoforma. Veja, No. de Acesso NCBI NM_022874 / NP_075012; ENSEMBL ID ENST00000503079. As sequências de codificação e proteínas da Isoforma B são reproduzidas nas SEQ ID NO: 11 e 12, respectivamente. A Isoforma A não possui o penúltimo éxon, o que resulta em um códon de parada de tradução alternativo em comparação
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47/177 com a Isoforma D. Portanto, a Isoforma A é mais curta (282 aminoácidos) e possui um terminal C distinto em comparação com a isoforma D. Veja No. de Acesso NCBI NM_001297715 / NP_001284644; ENSEMBL ID ENSTL00000506163. As sequências de codificação e proteínas da Isoforma A são reproduzidas nas SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente.
[0092] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um cDNA de sobrevivência do neurônio motor (SMN) humano (h) manipulado, que foi concebido para maximizar a tradução em comparação com a sequência hSMN nativa (SEQ ID NO: 3). Um íntron pode ser incorporado a montante da sequência de codificação para melhorar o capeamento em 5' e a estabilidade do mRNA. Veja, por exemplo, as SEQ ID NOs: 15 e 25. Estas composições podem ser utilizadas em métodos para o tratamento de atrofia muscular espinhal, conforme descrito neste documento. Para fins de comparação, um alinhamento da sequência de codificação SMN humana nativa e um cDNA modificado é ilustrado nas FIGURAS 1B-1C.
[0093] As sequências de cDNA de hSMN descritas neste documento podem ser geradas in vitro ou sinteticamente, ou por qualquer outro método adequado, utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a síntese precisa baseada em PGR (PAS) do método da sequência longa de DNA pode ser utilizada, conforme descrito por Xiong et al, PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences, Nature Protocols 1, 791 - 797 (2006). Um método que combina os métodos PGR de assimetria dupla e PGR de extensão de sobreposição é descrito por Young e Dong, Two-step total gene synthesis method, Nucleic Acids Res. 2004; 32(7): e59. Veja também Gordeeva et al, J Microbiol Methods. Improved PCR-based gene synthesis method and its application to the Citrobacterfreundii phytase gene codon modification. Maio de 2010;
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81(2): 147-52. Epub 2010 10 de março; veja também as seguintes patentes sobre síntese de oligonucleotídeos e síntese de genes, Gene Seq. Abril de 2012; 6(1): 10-21; US 8008005; e US 7985565. Cada um destes documentos é incorporado neste documento por referência. Além disso, kits e protocolos para gerar DNA via PCR estão disponíveis comercialmente. Estes incluem a utilização de polimerases incluindo, sem limitação, polimerase Taq; OneTaq® (New England Biolabs); Polimerase de ADN de Alta-Fidelidade Q5® (New England Biolabs); e Polimerase GoTaq® G2 (Promega). O DNA pode também ser gerado a partir de células transfectadas com plasmídeos contendo as sequências de hOTC descritas neste documento. Os kits e protocolos são conhecidos e estão comercialmente disponíveis e incluem, sem limitação, kits de plasmídeos da QIAGEN; Kits de Plasmídeo de Filtro Chargeswitch® Pro (Invitrogen); e GenElute ™ Plasmid Kits (Sigma Aldrich). Outras técnicas úteis neste documento incluem métodos de amplificação isotérmica específicos de sequência que eliminam a necessidade de termociclagem. Em vez de calor, estes métodos empregam tipicamente uma polimerase de DNA de deslocamento de cadeia, como Bst DNA Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs), para separar o DNA duplex. O DNA pode também ser gerado a partir de moléculas de RNA através da amplificação através da utilização de Transcriptases Inversas (RT), que são Polimerases de DNA dependentes de RNA. Os RTs polimerizam uma fita de DNA que é complementar ao modelo de RNA original e é referida como cDNA. Este cDNA pode então ser ainda mais amplificado através de métodos isotérmicos ou de PCR, conforme descrito acima. DNA personalizado também pode ser gerado comercialmente por empresas, incluindo, sem limitação, GenScript; GENEWIZ®; GeneArt® (Life Technologies); e Integrated DNA Technologies.
[0094] Também são fornecidos neste documento vetores virais que incluem as sequências de hSMN manipuladas. Em uma modalidade, um
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49/177 rAAVhu68.SMN é um vetor viral que consiste em um componente externo e genoma interne do DNA. O componente externo do vetor é um capsídeo AAVhu68 conforme definido neste documento. O capsídeo contém um genoma de DNA de cadeia simples que consiste em um transgene de Sobrevivência do Neurônio Motor humano (hSMN) flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV. Um potenciador, promotor, íntron, sequência de codificação de hSMN1 e sinal de poliadenilação (polyA) compreendem o transgene hSMN. As ITRs são os elementos genéticos responsáveis pela replicação e empacotamento do genoma durante a produção vetorial e são os únicos elementos cis virais necessários para gerar o rAAV. A expressão da sequência de codificação de hSMN conduzida por um promotor CB7, um híbrido entre um potenciador precoce imediato (C4) de citomegalovírus (CMV) e o promotor de beta-actina de galinha. A transcrição deste promotor é aprimorada pela presença do Cl. Um sinal rBG polyA é incluído para mediar a terminação de transcritos de mRNA de hSMN humano. Em algumas modalidades, o hSMN é hSMN1.
[0095] Em um aspecto, é fornecida uma sequência de codificação que codifica uma proteína SMN funcional. Por hSMN funcional, entende-se um gene que codifica uma proteína SMN que fornece pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou aproximadamente o mesmo, ou mais de 100% do nível de atividade biológica da proteína nativa da sobrevivência do neurônio motor ou uma variante ou polimorfo natural da mesma que não esteja associado à doença. Além disso, o homólogo de SMN1, SMN2, também codifica a proteína SMN, mas processa a proteína funcional com menos eficiência. Com base no número de cópias de SMN2, sujeitos sem um gene hSMN funcional demonstram SMA em graus variados. Assim, para alguns sujeitos, pode ser desejável que a proteína SMN forneça menos de 100% da atividade biológica da proteína SMN
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50/177 nativa. Em certa modalidade, os termos hSMN1, hSMN e hSMN funcional são usados de forma intercambiável.
[0096] Existe uma variedade de ensaios para medir a expressão de SMN e os níveis de atividade in vitro. Veja, por exemplo, Tanguy et al, 2015, citado acima. Os métodos descritos neste documento também podem ser combinados com qualquer outra terapia para tratamento de SMA ou seus sintomas. Em certas modalidades, o padrão de atendimento pode incluir nusinersen, que é um oligonucleotídeo antisense (ASO) direcionado ao ácido ribonucleico pré-mensageiro (mRNA) SMN2aceito pelo FDA e EMA [SPINRAZA ™, Biogen]. Veja, por exemplo, as Patentes dos EUA Nos. 6,166,197, US 6,210,892, US 7,101,993; US 7,838,657; US 8,110,560; US 8,361,977; US 8,980,853. Este é um oligonucleotídeo antisense direcionado a SMN2 que é administrado por via intratecal. A dosagem recomendada é de 12 mg (5ml_ por administração). O tratamento é iniciado com 4 doses de carga; as três primeiras doses de carga sendo administradas em intervalos de 14 dias, a 4a dose de carga administrada 30 dias após a 3a e uma dose de manutenção administrada uma vez a cada 4 meses posteriormente.
[0097] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos da SMN funcional é a da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência partilhando 95% de identidade com a mesma. Em uma modalidade, é fornecida uma sequência de codificação de hSMN modificada. Preferencialmente, a sequência de codificação de hSMN modificada possui menos do que 80% de identidade, preferencialmente cerca de 75% de identidade ou menos para a sequencia de codificação de hSMN nativa completa.
[0098] Em uma modalidade, a sequência de codificação de hSMN modificada é caracterizada por uma taxa de tradução aprimorada em comparação com o hSMN nativo após a entrega mediada por AAV (por exemplo, rAAV). Em uma modalidade, a sequência de codificação de hSMN modificada compartilha menos de cerca de 80%, 79%, 78%,
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77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% ou menos de identidade com a sequência de codificação nativa de hSMN1 de comprimento total. Em uma modalidade, a sequência de codificação de hSMN modificada é SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que compartilha 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade com SEQ ID N°: 1. Em outras modalidades, é selecionada uma sequência de codificação de SMN diferente.
[0099] Ainda em outras modalidades, uma sequência de codificação para uma isoforma SMN diferente da isoforma D é selecionada. Adicional ou alternativamente, uma composição ou regime proporcionado neste documento pode combinar um tratamento utilizando um AAVhu68. Estoque de SMN que codifica a proteína SMN da isoforma D em combinação com uma reserva vetorial que codifica uma proteína de SMN diferente. Esse estoque de vetores pode ter um capsídeo AAVhu68 ou um capsídeo diferente.
[00100] Os termos “percentual (%) de identidade”, “identidade de sequência”, “percentual de identidade de sequência” ou “percentual idêntico” no contexto de sequências de ácidos nucleicos referem-se aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência. O comprimento da comparação de identidade de sequência pode ser ao longo do comprimento completo do genoma, o comprimento total de uma sequência de codificação de gene ou um fragmento de pelo menos cerca de 500 a 5000 nucleotídeos, é desejado. No entanto, a identidade entre fragmentos menores, por exemplo, de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 20 a 24 nucleotídeos, pelo menos cerca de 28 a 32 nucleotídeos, pelo menos cerca de 36 ou mais nucleotídeos, também pode ser desejada.
[00101] A identidade percentual pode ser prontamente determinada para sequências de aminoácidos ao longo de todo o comprimento de
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52/177 uma proteína, polipeptídeo, cerca de 32 aminoácidos, cerca de 330 aminoácidos, ou um fragmento peptídico dos mesmos ou as sequências de codificação da sequência de ácido nucleico correspondente. Um fragmento de aminoácido adequado pode ter pelo menos cerca de 8 aminoácidos de comprimento e pode ter até cerca de 700 aminoácidos. Geralmente, quando se refere a “identidade”, “homologia” ou “semelhança” entre duas sequências diferentes, “identidade”, “homologia” ou “semelhança” é determinada em referência a sequências “alinhadas”. Sequências “alinhadas” ou “alinhamentos” referem-se a sequências de múltiplos ácidos nucleicos ou sequências de proteínas (aminoácidos), frequentemente contendo correções para bases ou aminoácidos ausentes ou adicionais em comparação com uma sequência de referência.
[00102] A identidade pode ser determinada preparando um alinhamento das sequências e através do uso de uma variedade de algoritmos e/ou programas de computador conhecidos na técnica ou comercialmente disponíveis [por exemplo, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; usando, por exemplo, algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmo de Smith-Waterman]. Os alinhamentos são realizados usando qualquer um dos vários Programas de Alinhamento de Sequência Múltipla disponíveis publicamente ou comercialmente. Programas de alinhamento de sequências estão disponíveis para sequências de aminoácidos, por exemplo, os programas Clustal Omega, Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, MEME e Match Box. Geralmente, qualquer um destes programas é usado nas configurações padrão, embora um versado na técnica possa alterar estas configurações conforme necessário. Alternativamente, um versado na técnica pode usar outro algoritmo ou programa de computador que forneça pelo menos o mesmo nível de identidade ou alinhamento que aquele fornecido pelos algoritmos e programas referenciados. Veja, por exemplo, JD Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,
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27(13):2682-2690 (1999).
[00103] Programas de alinhamento de múltiplas sequências também estão disponíveis para sequências de ácido nucleico. Exemplos de tais programas incluem “Clustal Omega” “Clustal W”, “CAP Sequence Assembly”, “BLAST”, “MAP” e “MEME”, que são acessíveis através de servidores da Web na Internet. Outras fontes para tais programas são conhecidas dos versados na técnica. Alternativamente, os utilitários vetor NTI também são usados. Existem também vários algoritmos conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos, incluindo os contidos nos programas descritos acima. Como outro exemplo, as sequências polinucleotídicas podem ser comparadas utilizando o Fasta™, um programa no GCG Versão 6.1. O Fasta™ fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e busca. Por exemplo, a identidade de sequência percentual entre as sequências de ácido nucleico pode ser determinada usando Fasta™ com seus parâmetros padrão (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) conforme fornecidos no GCG Versão 6.1, incorporado neste documento por referência.
II. Cassete de expressão e vetores [00104] Em uma modalidade, os genes hSMN descrito neste documento são manipulados em um elemento genético adequado (vetor) útil para gerar vetores virais e / ou para distribuição a uma célula hospedeira, por exemplo, DNA nu, fago, transposon, cosmídeo, epissoma etc. que transfere as sequências de hSMN1 ali transportadas. O vetor selecionado pode ser distribuído por qualquer método adequado, incluindo transfecção, eletroporação, distribuição de lipossomas, técnicas de fusão de membrana, grânulos revestidos com DNA de alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplasto. Os métodos usados para fazer tais construtos são conhecidos daqueles versados na manipulação de ácido
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54/177 nucleico e incluem manipulação genética, manipulação recombinante e técnicas sintéticas. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Em um aspecto, é fornecido um cassete de expressão compreendendo as sequências de ácidos nucleicos de hSMN.
[00105] Assim, em um aspecto, é fornecido um vetor viral adeno-associado que compreende um capsídeo AAV e pelo menos um cassete de expressão, em que a pelo menos um cassete de expressão compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam SMN e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão das sequências SMN em uma célula hospedeira. O vetor AAV também compreende sequências AAV ITR. Em uma modalidade, as ITRs são de um AAV diferente daquele que fornece um capsídeo. Em uma modalidade preferida, as sequências da ITR de AAV2, ou sua versão excluída (AITR), que pode ser usado por conveniência e para acelerar a aprovação regulatória. No entanto, pode ser selecionado um AAV de outras fontes adequadas. Quando a fonte das ITRs vier de AAV2 e o capsídeo de AAV for de outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado. Tipicamente, genoma do vetor AAV compreende uma ITR 5' de AAV, as sequências codificadoras de hSMN e quaisquer sequências reguladoras, e uma ITR 3' de AAV. No entanto, outras configurações desses elementos podem ser adequadas. Uma versão abreviada da ITR 5', denominada AITR, foi descrita, em que o local da resolução terminal (tsr) e a sequência D são excluídos. Em outras modalidades, são utilizadas ITRs 5' e 3' completas.
[00106] Em um aspecto, é fornecido um construto que é uma molécula de DNA (por exemplo, um plasmídeo) útil para gerar vetores virais. O cassete de expressão contém tipicamente uma sequência promotora como parte das sequências de controle da expressão, por exemplo, lo
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55/177 calizada entre a sequência ITR 5' selecionada e a sequência de codificação hSMN. O plasmídeo e vetor ilustrativos descritos neste documento utilizam o promotor ubíquo de β-actina de frango (CB) com potenciador imediato do CMV (CMV IE). Como alternativa, podem ser utilizados promotores específicos de neurônios [ver, por exemplo, o banco de dados de promotores específicos de neurônios do Lockery Lab, acessado em chinook.uoregon.edu/promoters.html]. Tais promotores específicos de neurônios incluem, sem limitação, por exemplo, sinapsina I (SYN), proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina, tubulina alfa I, enolase específica de neurônio e promotores de cadeia beta de fator de crescimento derivado de plaquetas. Veja-se, Hioki et al, Gene Therapy, June 2007, 14 (11): 872-82, que é incorporado neste documento por referência. Outros promotores específicos de neurônios incluem os decarboxilase de ácido glutâmico de 67 kDa (GAD67), homeobox Dlx5/6, promotor de receptor 1 de glutamato (GluR1), promotor de pré-prototiquiquinina 1 (Tad), promotores de enolase específica de neurônio (NSE) e receptor dopaminérgico 1 (Drdla). Ver, por exemplo, Delzor et al., Human Gene Therapy Methods. Agosto de 2012, 23 (4): 242-254. Noutra modalidade, o promotor é um promotor GUSb www.jci.org/articles/view/41615#B30.
[00107] Outros promotores, tais como promotores constitutivos, promotores reguláveis [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/04943], ou um promotor responsive a estímulos fisiológicos podem ser utilizados nos vetores descritos neste documento. O(s) promotores) pode(m) ser selecionado(s) de diferentes fontes, por exemplo, potenciador/promotor imediato e precoce do citomegalovírus humano (CMV), promotor/potenciador precoce do SV40, promotor do polimovírus JC, proteína básica de mielina (MBP) ou promotores de proteína ácida fibrilar glial (GFAP), promotor associado à latência do vírus herpes simplex (HSV-1) (LAP), promotor de repetição terminal longa (LTR) do
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56/177 virus do sarcoma maligno (RSV), promotor específico de neurônio (NSE), promotor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), hSYN, promotor do hormônio concentrador de melanina (MCH), CBA, promotor de metaloproteína de matriz (MPP) e promotor de beta-actina de frango.
[00108] Além de um promotor, um cassete de expressão e/ou um vetor podem conter um ou mais outros sequências apropriadas de iniciação, terminação, potenciador de transcrição, sinais de processamento de RNA eficientes, como sinais de emenda e poliadenilação (polyA); sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático, por exemplo, WPRE; sequências que aumentam a eficiência da tradução (ou seja, sequência de consenso de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade das proteínas; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção do produto codificado. Exemplos de sequências poliA adequadas incluem, por exemplo, SV40, SV50, hormônio do crescimento bovino (bGH), hormônio do crescimento humano e poliAs sintéticos. Um exemplo de um potenciador adequado é o potenciador de CMV. Outros potenciadores adequados incluem aqueles que são apropriados para as indicações do SNC. Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende um ou mais potenciadores de expressão. Em uma modalidade, o cassete de expressão contém dois ou mais potenciadores de expressão. Esses potenciadores podem ser os mesmos ou podem diferir um do outro. Por exemplo, um potenciador pode incluir um potenciador precoce imediato de CMV. Esse potenciador pode estar presente em duas cópias que estão localizadas adjacentemente entre si. Alternativamente, as cópias duplas do potenciador podem ser separadas por uma ou mais sequências. Ainda em outra modalidade, o cassete de expressão contém ainda um intron, por exemplo, o íntron beta-actina de frango. Outros introns adequados incluem aqueles conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descritos em WO 2011/126808. Opcionalmente, uma ou
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57/177 mais sequências podem ser selecionadas para estabilizar o mRNA. Um exemplo dessa sequência é uma sequência WPRE modificada, que pode ser manipulada a montante da sequência poliA e a jusante da sequência de codificação [ver, por exemplo, MA Zanta-Boussif, et al., Gene Therapy (2009) 16: 605-619.
[00109] Estas sequências de controle estão ‘Operacionalmente ligadas” às sequências do gene hSMN. Tal como utilizado neste documento, o termo ‘Operacionalmente ligado refere-se às sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e as sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.
[00110] Em uma modalidade, é fornecido um AAV auto complementar. A abreviação sc neste contexto refere-se a auto complementar. AAV auto complementar refere-se a um construto em que uma região de codificação transportada por uma sequência de ácidos nucleicos de AAV recombinante foi concebida para formar um molde de DNA de cadeia dupla intra-molecular. Após a infecção, em vez de esperar pela síntese mediada por células da segunda cadeia, as duas metades complementares de scAAV irão se associar para formar uma unidade de DNA de cadeia dupla (dsDNA) que está pronta para replicação e transcrição imediatas. Ver, por exemplo, DM McCarty et al. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis, Gene Therapy, (agosto de 2001), vol. 8, número 16, páginas 1248-1254. Os AAVs auto complementares são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 6,596,535; 7,125,717; e 7,456,683, cada uma delas sendo incorporadas a este documento por referência em sua totalidade.
[00111] Os métodos para gerar e isolar vetores virais de AAV adequados para distribuição a um sujeito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente Publicado US N°. 2007/0036760 (15
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58/177 de fevereiro de 2007), Patente US 7790449; Patente US 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; e US 7588772 B2]. Em um sistema, uma linha de células produtora é transientemente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITRs e um construto (s) que codifica rep e cap. Em um segundo sistema, uma linhagem celular de empacotamento que supre de forma estável rep e cap é transientemente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITRs. Em cada um destes sistemas, os virions de AAV são produzidos em resposta a infecção com adenovirus auxiliar ou herpesvirus, requerendo a separação dos rAAV de vírus contaminantes. Mais recentemente, foram desenvolvidos sistemas que não requerem infecção com vírus auxiliar para recuperar o AAV - as funções auxiliares necessárias (isto é, adenovirus E1, E2a, VA e E4 ou herpesvirus UL5, UL8, UL52 e UL29 e polimerase de herpesvirus) também são fornecidos, in trans, pelo sistema. Nestes sistemas mais recentes, as funções auxiliares podem ser fornecidas por transfecção transiente das células com construtos que codificam as funções auxiliares necessárias, ou as células podem ser manipuladas para conter de forma estável os genes que codificam as funções auxiliares, cuja expressão pode ser controlada no nível transcricional ou pós-transcricional. Ainda em um outro sistema, o transgene flanqueado por ITRs e genes rep / cap é introduzida em células de inseto por infecção com vetores baseados em baculovírus. Para revisões sobre estes sistemas de produção, ver geralmente, por exemplo, Zhang et al., 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929, o conteúdo de cada urn dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Métodos de produção e utilização destes e de outros sistemas de produção de AAV são também descritos nas seguintes patentes US, o con
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59/177 teúdo de cada um das quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade: 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; e 7,439,065.
[00112] Opcionalmente, os genes de hSMN descritos neste documento podem ser manipulados em outros sistemas de entrega, incluindo vetores virais diferentes de rAAV. Esses outros vetores virais podem incluir quaisquer vírus adequados para terapia gênica podem ser usados, incluindo, mas não limitando o adenovirus; vírus do herpes; lentivírus; retrovirus; bocavírus; etc. Adequadamente, quando um destes outros vetores é gerado, é produzido como um vetor viral com replicação deficiente.
[00113] Em certas modalidades, AAVhu68 manipulado. São fornecidos vetores SMN. Em uma modalidade, o genoma do vetor de rAAVhu68SMN possui uma sequência da SEQ ID N°: 15. Noutra modalidade, o genoma do vetor de rAAVhu68SMN possui uma sequência da SEQ ID N°: 25. Em certas modalidades, os termos “rAAVhu68.SMN1” e “rAAVhu68.SMN” são usados de forma intercambiável.
III. Composições e Usos [00114] Também são fornecidas composições farmacêuticas neste documento. As composições farmacêuticas descritas neste documento são projetadas para serem distribuídas a sujeitos em necessidade respectiva por qualquer via adequada ou por uma combinação de diferentes vias.
[00115] Estes meios de distribuição são projetados para evitar a distribuição sistêmica direta da suspensão contendo a(s) composição(ões) de AAV descrita(s) neste documento. Adequadamente, isto pode ter o benefício de reduzir a dose em comparação com a administração sistêmica, reduzindo a toxicidade e/ou reduzindo respostas imunológicas indesejáveis ao produto de AAV e/ou transgene.
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60/177 [00116] Alternativamente, outras vias de administração podem ser selecionadas (por exemplo, oral, inalação, intranasal, intratraqueal, intra-arterial, intra-ocular, intravenosa, intramuscular e outras vias parentais).
[00117] Opcionalmente, uma coterapia imunossupressora pode ser usada em um sujeito em necessidade. Os imunossupressores a essa coterapia incluem, mas não estão limitados a um glicocorticoide, esteroides, antimetabólitos, inibidores de células T, um macrolídeo (por exemplo, uma rapamicina ou um rapogênio) e agentes citostáticos, incluindo um agente alquilante, um antimetabólito, um antibiótico citotóxico, um anticorpo ou um agente ativo na imunofilina. O imunossupressor pode incluir mostarda nitrogenada, nitrosoureia, composto de platina, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, fluorouracil, dactinomicina, antraciclina, mitomicina C, bleomicina, mitramicina, receptor de IL2 (CD25-) ou anticorpos dirigidos contra CD3, anticorpos anti-IL-2, ciclosporina, tacrolimo, sirolimo, IFN-β, IFN-γ, um opioide ou um agente de ligação de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa). Em certas modalidades, a terapia imunossupressora pode ser iniciada 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, ou mais dias antes ou depois da administração da terapia gênica. Tal terapia imunossupressora pode envolver a administração de um, dois ou mais medicamentos (por exemplo, glicocorticoides, prednisona, micofenolato mofetil (MMF) e/ou sirolimo (isto é, Rapamicina)). Tais drogas imunossupressoras podem ser administradas a um sujeito necessitado uma vez, duas ou mais vezes na mesma dose ou em uma dose ajustada. Tal terapia pode envolver a co-administração de duas ou mais drogas (por exemplo, prednisona, micofenolato de mofetil (MMF) e/ou sirolimo (isto é, rapamicina)) no mesmo dia. Uma ou mais dessas drogas podem ser continuadas após a administração da terapia gênica, na mesma dose ou em uma dose ajustada. Essa terapia pode durar cerca de 1 semana (7 dias), cerca de 60 dias ou mais, conforme necessário.
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Em certas modalidades, é selecionado um regime sem tacrolimo.
[00118] Os vetores rAAVhu68.hSMN descritos neste documento podem ser doseados em uma única composição ou em várias composições. Opcionalmente, dois ou mais rAAV diferentes podem ser entregues [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/049493]. Em outra modalidade, esses vírus múltiplos podem conter vírus diferentes com defeito de replicação (por exemplo, AAV, adenovirus e/ou lentivírus). Alternativamente, a entrega pode ser mediada por construtos não virais, por exemplo, DNA nu, DNA plasmídeo nu, RNA e mRNA; acoplado a várias composições de distribuição e nano partículas, incluindo, por exemplo, micelas, lipossomas, lipídios catiônicos - composições de ácidos nucleicos, composições de poliglicanas e outros polímeros, conjugados de ácidos nucleicos baseados em lipídios e / ou colesterol - e outros construtos como descrito neste documento. Ver, por exemplo, X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; publicação na Web: 21 de março de 2011; WO2013/182683, WO 2010/053572 e WO 2012/170930, ambos incorporados neste documento por referência, podem ser administrados pelas vias descritas anteriormente. Os vetores virais, ou frações de transferência de RNA ou DNA não virais, podem ser formulados com um carreador fisiologicamente aceitável para utilização em aplicações de transferência gênica e terapia gênica.
[00119] Em certas modalidades, o rAAVhu68.SMA é purificada de quaisquer contaminantes associados à produção antes do armazenamento e/ou formulação para entrega a um sujeito. Podem ser selecionados vários métodos de purificação adequados. Exemplos de métodos de purificação adequados são descritos, por exemplo, Pedido de Patente Internacional N° PCT/US2016 /065970, depositado em 9 de dezembro de 2016, e seus documentos prioritários, Pedido de Patente US No. 62/322.071, depositado em 13 de abril de 2016 e 62/226.357, depositado em 11 de dezembro de 2015 e intitulado Scalable Purification
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Method for AAV9, incorporado a este documento por referência. Métodos de purificação de AAV8, Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016/065976, depositado em 9 de dezembro de 2016 e os documentos prioritários dos Pedidos de Patente US Nos. 62/322,098, depositado em 13 de abril de 2016, e 62/266,341, depositado em 11 de dezembro de 2015, e rh10, Pedido de Patente Internacional No. PCT/US16/66013, depositado em 9 de dezembro de 2016, e seus documentos de prioridade, o Pedido de Patente N°. 62/322,055, depositado em 13 de abril de 2016, e 62/266,347, intitulado Scalable purificação método para AAVrhl 0, também depositado em 11 de dezembro de 2015, e para AAV1, o Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2016/065974, depositado em 9 de dezembro de 2016, e seus documentos prioritários, os Pedidos de Patente US Nos. 62/322,083, depositado em 13 de abril de 2016, e 62/26,351, intitulado Scalable Purification Method for AAV1, depositado em 11 de dezembro de 2015, todos incorporados a este documento por referência.
[00120] Para os vetores rAAVhu68.SMN1 descritos neste documento podem quantificar as cópias do genoma (GC) como a medida da dose contida na formulação. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para determinar o número de cópias do genoma (GC) das composições de vírus com defeito de replicação da invenção. Um método para realizar a titulação do número de GC de AAV é o seguinte: as amostras de vetor de AAV purificadas são primeiro tratadas com DNase para eliminar o DNA do hospedeiro contaminante do processo de produção. As partículas resistentes à DNase são então submetidas a tratamento térmico para liberar o genoma do capsídeo. Os genomas liberados são então quantificados por PCR em tempo real utilizando conjuntos de primer/sonda direcionados para a região específica do genoma viral (por exemplo, sinal de poli A). Outro método adequado para determinar cópias de genoma é o PCR quantitativo (qPCR), particularmente o
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63/177 qPCR otimizado ou o PCR de gota digital [Lock Martin, et al., Human Gene Therapy Methods. Abril de 2014, 25 (2): 115-125. doi: 10.1089/hgtb.2013.131, publicado on-line antes da edição de 13 de dezembro de 2013]. Como alternativa, o ViroCyt3100 pode ser usado para quantificação de partículas ou citometria de fluxo.
[00121] As composições de rAAVhu68.SMN1 podem ser formuladas em unidades de dosagem para conter uma quantidade de rAAV na faixa de cerca de 1,0 x 109 GC a cerca de 9 x 1015 GC (por exemplo, com base em cerca de 2,5 kg a cerca de 70 kg em peso corporal), incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo e, de preferência, 1,0 x 1012 GC a 1,0 x 1014 GC para um paciente humano. Em uma modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109 ou 9x109 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1010, 2x1010, 3x101°, 4x1O10, 5x1O10, 6x101°, 7x1O10, 8x101° ou 9x101° GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1 x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011 ou 9x1011 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012 ou 9x1012 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013 ou 9x1013 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou fracionários dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1x1014, 2x1014,
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3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014 ou 9x1014 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em outra modalidade, as composições são formuladas para conter pelo menos 1 x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015 ou 9x1015 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo. Em uma modalidade, para aplicação humana, a dose pode variar de 1x1010 a cerca de 1 x1015 GC por dose, incluindo todos os números inteiros ou quantidades fracionárias dentro do intervalo.
[00122] Em certas modalidades, a dose pode estar na faixa de cerca de 1 χ 109 GC/g de massa cerebral a cerca de 1 χ 1012 GC/g de massa cerebral. Em certas modalidades, a dose pode estar na faixa de cerca de 3 χ 101° GC/g de massa cerebral a cerca de 3 χ 1011 GC/g de massa cerebral. Em certas modalidades, a dose pode estar na faixa de cerca de 5 χ 101° GC/g de massa cerebral a cerca de 1,85 χ 1011 GC/g de massa cerebral.
[00123] Em uma modalidade, o rAAVhu68.SMN1 pode ser administrado em doses de pelo menos cerca de 1x109 GCs a cerca de 1 χ 1015 ou cerca de 1 χ 1011 a 5 χ 1013 GC. Os volumes adequados para administrar estas doses e concentrações podem ser determinados por alguém versado na técnica. Por exemplo, podem ser selecionados volumes de cerca de 1 pL a 150 mL, com os volumes mais altos sendo selecionados para os adultos. Em geral, para recém-nascidos, um volume adequado é de cerca de 0,5 mL a cerca de 10 mL, para crianças mais velhas, de cerca de 0,5 mL a cerca de 15 mL podem ser selecionados. Para crianças pequenas, um volume de cerca de 0,5 mL a cerca de 20 mL pode ser selecionado. Para crianças, volumes de até 30 mL podem ser selecionados. Para pré-adolescentes e adolescentes, volumes até cerca de 50 mL podem ser selecionados. Em outras modalidades, ainda, um paciente pode receber uma administração intratecal em um
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65/177 volume de cerca de 5 mL a cerca de 15 mL selecionados ou cerca de
7,5 mL a cerca de 10 mL. Outros volumes e doses adequados podem ser determinados. A dosagem será ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais e tais dosagens podem variar dependendo da aplicação terapêutica para a qual o vetor recombinante é empregado.
[00124] O rAAVhu68.SMN1 acima descrito pode ser entregue às células hospedeiras de acordo com os métodos publicados. Em certas modalidades, para administração a um paciente humano, o rAAV é adequadamente suspenso em uma solução aquosa contendo solução salina, um tensoativo e um sal ou mistura de sais fisiologicamente compatível. Adequadamente, a formulação é ajustada a um pH fisiologicamente aceitável, por exemplo, no intervalo de pH de 6 a 9 ou pH de 6,5 a 7,5, pH de 7,0 a 7,7 ou pH de 7,2 a 7,8. Na medida em que o pH do fluido cérebro-espinhal é de cerca de 7,28 a cerca de 7,32, para administração intratecal, pode ser desejável um pH dentro deste intervalo; enquanto que para administração intravenosa, um pH de 6,8 a cerca de 7,2 pode ser desejável. No entanto, outros pHs dentro dos intervalos mais amplos e esses subintervalos podem ser selecionados para outra via de administração.
[00125] Um tensoativo adequado, ou uma combinação de tensoativos, pode ser selecionado dentre tensoativos não iônicos que não sejam tóxicos. Em uma modalidade, um tensoativo de copolímero em bloco difuncional que termina em grupos hidroxil primários é selecionado, por exemplo, como Pluronic® F68 [BASF], também conhecido como Poloxamer 188, que tem um pH neutro e um peso molecular médio de 8400. Outros tensoativos e outros poloxâmeros podem ser selecionados, quais sejam, copolímeros tribloco não iônicos compostos por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (óxido de polipropileno) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de
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66/177 etileno)), SOLUTOL HS 15 (Macrogol-15 Hidroxiestearato), LABRASOL (glicero poli-caprilico), éter de polioxi-10 oleil, TWEEN (ésteres de ácido graxo e polioxietileno sorbitano), etanol e polietilenoglicol. Em uma modalidade, a formulação contém um poloxâmero. Esses copolimeros geralmente são nomeados com a letra P (de poloxâmero) seguidos de três dígitos: os dois primeiros dígitos x 100 dão a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno e o último dígito x 10 indica o percentual de polioxietileno. Em uma modalidade, o Poloxamer 188 é selecionado. O tensoativo pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,0005% até cerca de 0,001% da suspensão.
[00126] Em um exemplo, a formulação pode conter, por exemplo, uma solução salina tamponada contendo um ou mais dentre: cloreto de sódio, bicarbonate de sódio, dextrose, sulfato de magnésio (por exemplo, sulfato de magnésio VhW), cloreto de potássio, cloreto de cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio-2H2O), fosfato de sódio dibásico, e suas misturas, em água. Adequadamente, para a administração intratecal, a osmolaridade está dentro de um intervalo compatível com o líquido cefalorraquidiano (por exemplo, de cerca de 275 a cerca de 290); ver, por exemplo, emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview. Opcionalmente, para a administração intratecal, pode ser utilizado um diluente comercialmente disponível como agente de suspensão ou em combinação com outro agente de suspensão e outros excipientes opcionais. Ver, por exemplo, a solução Elliotts B® [Lukare Medicai]. Cada 10 mL de solução de Elliotts B contém:
Cloreto de Sódio, USP73 mg
Bicarbonate de sódio, USP19 mg
Dextrose, USP8 mg
Sulfato de Magnésio · 7H2O, USP3 mg
Cloreto de Potássio, USP3 mg
Cloreto de Cálcio · 2H2O, USP2 mg
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Fosfato de sodio, dibasico · 7H2O, USP 2 mg
Água para Injeção, USP qs 10 mL [00127] Concentração de eletrólitos:
Sódio 149mEq/litro
Potássio 4,0 mEq/litro
Cálcio 2,7 mEq/litro
Magnésio 2,4 mEq/litro
Bicarbonate 22,6 mEq/litro
Cloreto 132 mEq/litro
Sulfate 2,4 mEq/litro
Fosfato 1,5 mEq/litro [00128] As fórmulas e pesos moleculares dos ingredientes são:
INGREDIENTE FÓRMULA MOLECULAR PESO MOLECULAR
Cloreto de Sódio NaCI 58,44
Bicarbonato de Sódio NaHCO3 84,01
Dextrose C6H12O6 180,16
Sulfato de magnésio· 7H2O Mg2SO4 · 7H2O 246,48
Cloreto de Potássio KCI 74,55
Cloreto de Cálcio · 2H2O CaCI2 · 2H2O 147,01
Fosfato de Sódio, Dibásico· 7H2O Na2HPO4 · 7H2O 268,07
00129] O pH da solução de E liot B é de 6 a 7,5 e a osmolaridade é
de 288 mOsmol por litro (calculada). Em certas modalidades, a composição contendo o rAAVhu68.O gene SMN1 é entregue a um pH na faixa de 6,8 a 8, ou 7,2 a 7,8, ou 7,5 a 8. Para entrega intratecal, um pH acima de 7,5 pode ser desejado, por exemplo, 7,5 a 8 ou 7,8.
[00130] Em certas modalidades, a formulação pode conter uma solução aquosa salina tamponada que não compreende bicarbonato de sódio. Essa formulação pode conter uma solução aquosa salina tamponada compreendendo um ou mais fosfato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio e suas misturas, em água, como um tampão de Harvard. A solução aquosa pode
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68/177 ainda conter Kolliphor® P188, um poloxâmero comercialmente disponível na BASF, que foi anteriormente vendido sob o nome comercial de Lutrol® F68. A solução aquosa pode ter um pH de 7,2.
[00131] Em outra modalidade, a formulação pode conter uma solução aquosa salina tamponada compreendendo 1 mM de fosfato de sódio (NasPOzí), 150 mM de cloreto de sódio (NaCI), 3 mM de cloreto de potássio (KCI), 1,4 mM de cloreto de cálcio (CaCh), 0,8 mM de cloreto de magnésio (MgCh) e Kolliphor® 0,001% 188. Veja, por exemplo, harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html. Em certas modalidades, o tampão de Harvard é preferido devido à melhor estabilidade do pH observada com o tampão de Harvard. A tabela abaixo fornece uma comparação do tampão de Harvard e do Tampão B de Elliot. [00132] Composições do líquido cefalorraquidiano (CSF)
Componente Unidades CSF B de Elliot Harvard
Na+ mEq/L 117-137 149 150
K+ mEq/L 2,3-4,6 4,0 3,0
Mg+ mEq/L 2,2 2,4 0,8
Ca2 + mEq/L 2,2 2,7 1,4
Cl- mEq/L 113-127 132 155
HCO3- mEq/L 22,9 22,6 0
Fos mg/dL 1.2-2.1 1,5 1,0
Glicose mg/dL 45-80 80 -
Plurônico % - 0,001% (adicionado) 0,001% (adicionado)
Osmolaridade mOsm/L 295 288 290
pH 7,31 6,0-7,5 * Deriva para 9+ (8,2+ w/o titulado) 7,2 (titulado para)
[00133] Em outras modalidades, a formulação pode conter um ou
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69/177 mais potenciadores de permeação. Exemplos de potenciadores de permeação adequados podem incluir, por exemplo, manitol, glicolato de sódio, taurocolato de sódio, desoxicolato de sódio, salicilato de sódio, caprilato de sódio, caprato de sódio, lauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurel ou EDTA.
[00134] Noutra modalidade, a composição inclui um transportador, diluente, excipiente e/ou adjuvante. Os carreadores adequados podem ser facilmente selecionados por um versado na técnica em vista da indicação para a qual o vírus de transferência é direcionado. Por exemplo, um carreador adequado inclui solução salina, que pode ser formulada com uma variedade de soluções tampão (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Outros veículos exemplificativos incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim e água. O tampão/carreador deve incluir um componente que impede que o rAAV cole na tubulação de infusão, mas não interfira com a atividade de ligação in vivo a rAAV.
[00135] Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, além do rAAV e carreador(es), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes ou estabilizadores químicos. Preservantes exemplares adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, gaiato de propil, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.
[00136] As composições de acordo com a presente invenção podem compreender um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como definido acima. Adequadamente, as composições descritas neste documento compreendem uma quantidade eficaz de um ou mais AAV suspensos em um carreador farmaceuticamente adequado e / ou misturado com excipientes adequados projetados para distribuição ao sujeito por
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70/177 injeção, bomba osmótica, cateter intratecal, ou para entrega por outro dispositivo ou via. Em um exemplo, a composição é formulada para entrega intratecal. Em uma modalidade, a administração intratecal abrange uma injeção no canal espinhal, por exemplo, o espaço subaracnoide.
[00137] Os vetores virais descritos neste documento podem ser utilizados na preparação de um medicamento para a administração de hSMN a um sujeito (por exemplo, um paciente humano) que dele necessite, fornecendo SMN funcional a um sujeito e/ou para o tratamento de atrofia muscular espinhal. Um curso de tratamento pode opcionalmente envolver a administração repetida do mesmo vetor viral (por exemplo, um vetor AAVhu68) ou de um vetor viral diferente (por exemplo, um AAVhu68 e um AAVrhIO). Ainda outras combinações podem ser selecionadas usando os vetores virais e sistemas de entrega não virais descritos neste documento.
[00138] Conforme usados neste documento, o termo administração intratecal refere-se a uma via de administração de drogas através de uma injeção no canal espinhal, mais especificamente no espaço subaracnoide, para que elas alcancem o fluido cerebrospinal (CSF). A administração intratecal pode incluir punção lombar, intraventricular (incluindo intracerebroventricular (ICV)), suboccipital/intracisternal e/ou C1-2. Por exemplo, o material pode ser introduzido para difusão ao longo do espaço subaracnoide por meio de punção lombar. Em outro exemplo, a injeção pode ser na cisterna magna.
[00139] Como usado neste documento, o termo administração intracisternal refere-se a uma via de administração de drogas diretamente no líquido cefalorraquidiano da cisterna magna cerebelomedular, mais especificamente através de uma punção suboccipital ou por injeção direta na cisterna magna ou por tubo posicionado permanentemente.
[00140] Em uma modalidade, a entrega pode ser realizada usando o
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71/177 dispositivo descrito neste documento.
IV. Aparelho e método para entrega de uma composição farmacêutica no líquido cefalorraquidiano [00141] Em um aspecto, os vetores fornecidos neste documento podem ser administrados por via intratecal através do método e/ou do dispositivo proporcionado nesta seção e descritos adicionalmente nos Exemplos e na FIG. 7. Em alternativa, outros dispositivos e métodos podem ser selecionados. O método compreende as etapas de avanço de uma agulha raquidiana na cisterna magna de um paciente, ligação de um comprimento de tubulação flexível em um cubo próximo da agulha raquidiana e uma portal de saída de uma válvula para uma extremidade próxima da tubulação flexível, e após as referidas etapas de avanço e ligação e após permitir à tubulação se autoativar com o fluido cérebro espinhal do paciente, ligar um primeiro recipiente contendo uma quantidade de solução isotônica a uma porta de entrada de descarga da válvula e, a partir disso, ligar um segundo recipiente contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica a uma porta de entrada de vetor da válvula. Depois de ligar o primeiro e segundo recipientes à válvula, abre-se um caminho para o fluxo de fluido entre a porta de entrada do vetor e a porta de saída da válvula, e a composição farmacêutica é injetada no paciente através da agulha raquidiana, e, após a injeção da composição farmacêutica, abre-se um caminho para o fluxo de fluido pela porta de entrava de descarga e a porta de saída da válvula, e a solução isotônica é injetada na agulha raquidiana para descarga da composição farmacêutica no paciente.
[00142] Em outro aspecto, é proporcionado um dispositivo para administração intracisternal de uma composição farmacêutica. O dispositivo inclui um primeiro recipiente contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica, um segundo recipiente contendo uma solução
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72/177 isotônica e uma agulha raquidiana através da qual a composição farmacêutica pode ser ejetada diretamente do dispositivo para o fluido cérebro espinhal, dentro da cisterna magna de um paciente. O dispositivo inclui ainda uma válvula que tem uma primeira porta de entrada interligada ao primeiro vaso, uma segunda porta de entrada interligada ao segundo vaso, uma porta de saída interligada à agulha raquidiana e um fecho luer para controlar o fluxo da composição farmacêutica e da solução isotônica através da agulha raquidiana.
[00143] Conforme usado neste documento, Tomografia Computadorizada (CT) refere-se a uma radiografia em que uma imagem tridimensional de uma estrutura corporal é construída por computador a partir de uma série de imagens transversais planas feitas ao longo de um eixo.
[00144] O aparelho ou dispositivo médico 10, como mostrado na FIG. 7, inclui um ou mais vasos, 12 e 14, interligados através de uma válvula
16. Os vasos 12 e 14 proporcionam uma nova fonte de uma composição farmacêutica, droga, vetor ou substância semelhante e uma nova fonte de uma solução isotônica, tal como solução salina, respectivamente. Os vasos 12 e 14 podem ser qualquer forma de dispositivo médico que permita a injeção de fluidos em um paciente.
[00145] A título de exemplo, cada recipiente, 12 e 14, pode ser fornecido na forma de uma seringa, cânula ou semelhante. Por exemplo, na modalidade ilustrada, o recipiente 12 é fornecido como uma seringa separada, contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica e é referido neste documento como uma seringa de vetor. Apenas para fins de exemplo, o recipiente 12 pode conter cerca de 10 cc de uma composição farmacêutica ou semelhante.
[00146] Do mesmo modo, o recipiente 14 pode ser proporcionado na forma de uma seringa, célula ou semelhante separada que contém uma quantidade de solução salina e pode ser referida como uma seringa de
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73/177 descarga. Apenas para fins de exemplo, o recipiente 14 pode conter cerca de 10 cc de uma solução salina.
[00147] Como alternativa, os vasos 12 e 14 podem ser fornecidos em formas diferentes de seringas e podem ser integrados em um único dispositivo, tal como um dispositivo de injeção médica integrado que tem um par de câmaras separadas, uma para a composição farmacêutica e outra para solução salina. Além disso, o tamanho das câmaras ou dos vasos pode ser proporcionado conforme necessário para conter uma quantidade desejada de fluido.
[00148] Na modalidade ilustrada, a válvula 16 é fornecida na forma de uma torneira de 4 vias com uma seringa luer-lock macho giratória 18. A válvula 16 interliga os vasos 12 e 14 (isto é, a seringa de vetor e a seringa de descarga na modalidade ilustrada), e a luer-lock macho giratória abre um caminho pela válvula 16, a ser aberto e fechado para cada um dos vasos 12 e 14. Deste modo, o caminho pela válvula 16 pode ser fechado tanto para a seringa de vetor quanto para a seringa de descarga ou pode ser aberto para uma seringa de vetor ou para uma seringa de descarga selecionada. Como alternativa a uma torneira de 4 vias, a válvula pode ser uma torneira de 3 vias ou um dispositivo de controle de fluido.
[00149] Na modalidade ilustrada, a válvula 16 está ligada a uma extremidade de um comprimento de uma tubulação de extensão 20 ou a um duto semelhante para fluidos. A tubulação 20 pode ser selecionada com base em um comprimento desejado ou em um volume interno. Apenas a título de exemplo, a tubulação pode ter cerca de 6 a 7 polegadas de comprimento.
[00150] Na modalidade ilustrada, uma extremidade oposta 22 da tubulação 12 é conectada a um conjunto de extensão de conector em T 24, que, por sua vez, é conectada a uma agulha raquidiana 26. A título
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74/177 de exemplo, a agulha 26 pode ser uma agulha raquidiana de cinco polegadas de calibre 22 ou 25. Além disso, como opção, a agulha raquidiana 26 pode ser ligada a uma agulha introdutora 28, tal como uma agulha introdutora de calibre 18 de três polegadas e meia.
[00151] Em uso, a agulha raquidiana 26 e/ou a agulha introdutora opcional 28 pode ser avançada no paciente até a cisterna magna. Após o avanço da agulha, podem ser obtidas imagens da Tomografia Computadorizada (TC) que permitem a visualização da agulha 26 e/ou 28 e dos tecidos moles relevantes (por exemplo, músculos paravertebrais, ossos, tronco cerebral e medula espinhal). A colocação correta da agulha será confirmada pela observação do fluido cérebro espinhal (CSF) no centro da agulha e pela visualização da ponta da agulha dentro da cisterna magna. Depois disso, a tubulação de extensão relativamente curta 20 pode ser ligada à agulha raquidiana inserida 26 e a torneira de 4 vias 16 pode então ser ligada à extremidade oposta da tubulação 20. [00152] Deixa-se a montagem acima se tornar autoativada com o CSF do paciente. Posteriormente, a seringa de descarga da solução salina normal preenchida 14 é ligada a uma porta de entrada de descarga da torneira de 4 vias 16 e depois a seringa de vetor 12 contendo uma composição farmacêutica é ligada a uma porta de entrada de vetor da torneira de 4 vias 16. Posteriormente, a porta de saída da torneira 16 é aberta para a seringa de vetor 12 e o conteúdo da seringa de vetor pode ser lentamente injetado através da válvula 16 e do aparelho montado e para o paciente ao longo de um período de tempo. Apenas para fins de exemplo, esse período de tempo pode ser de cerca de 1 -2 minutos e/ou qualquer outro período de tempo desejado.
[00153] Depois de o conteúdo da seringa de vetor 12 ser injetado, a fechadura giratória 18 na torneira 16 é girada para uma segunda posição de modo que a torneira 16 e o conjunto de agulha possam ser lavados com uma quantidade desejada de solução salina normal utilizando
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ΊΒΙΥΠ a seringa de lavagem preenchida 14. Apenas a título de exemplo, 1 a 2 cc de solução salina normal podem ser usados, embora quantidades maiores ou menores possam ser usadas conforme a necessidade. A solução salina normal assegura que toda a ou a maior parte da composição farmacêutica seja forçada a ser injetada através do dispositivo montado e no paciente, e de modo que pouco ou nada da composição farmacêutica permaneça no dispositivo montado.
[00154] Depois que o dispositivo montado tiver sido lavado com a solução salina, o dispositivo montado em sua totalidade, incluindo a(s) agulha(s), a tubulação de extensão, a torneira e as seringas são removidos lentamente do indivíduo e colocadas em uma bandeja cirúrgica para descartar em um recipiente de resíduos de risco biológico ou um contêiner rígido (para a(s) agulha(s)).
[00155] Um processo de triagem pode ser realizado por um investigador principal, o que pode levar a um procedimento intracisternal (IC). O investigador principal pode descrever o processo, o procedimento, o procedimento de administração em si e todos os possíveis riscos de segurança para que o indivíduo (ou responsável designado) seja totalmente informado. O histórico médico, as medicações concomitantes, o exame físico, os sinais vitais, o eletrocardiograma (ECG) e os resultados de exames laboratoriais são obtidos ou realizados e fornecidos a um neurorradiologista, neurocirurgião e anestesista para uso na avaliação de triagem da elegibilidade do paciente para o procedimento IC.
[00156] A fim de permitir tempo adequado para analisar a elegibilidade, os seguintes procedimentos devem ser realizados a qualquer momento entre a primeira visita de triagem e até uma semana antes da visita do estudo. Por exemplo, no Dia 0, podem ser obtidas as Imagens de Ressonância Magnética (MRI) de cabeça/pescoço com e sem gadolínio (ou seja, eGRF> 30 mL/min/1,73 m2). Além da ressonância magnética de cabeça/pescoço, o investigador determinará a necessidade de
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76/177 avaliações adicionais do pescoço através de estudos de flexão/extensão. O protocolo de MRI incluirá imagens dos protocolos T1, T2, DTI, FLAIR e CINE.
[00157] Ademais, o MRA/MRV de cabeça/pescoço, de acordo com o protocolo institucional (isto é, indivíduos com um histórico de operações intra/transdurais podem ser excluídos ou precisar de outros testes (por exemplo, cisternografia de radionucleotídeos)) que permitam uma avaliação adequada do fluxo de CSF e a identificação de possíveis bloqueios ou falta de comunicação entre os espaços de CSF.
[00158] O neurorradiologista, o neurocirurgião e o anestesiologista discutem e determinam a elegibilidade de cada indivíduo para os procedimentos IC com base em todas as informações disponíveis (exames, histórico médico, exames físicos e laboratoriais, etc.). Uma avaliação pré-operatória de anestesia também pode ser obtida do Dia -28 ao Dia 1, o que possibilita uma avaliação detalhada das vias aéreas, pescoço (encurtado/engrossado) e da amplitude de movimento da cabeça (grau de flexão do pescoço), mantendo em mente as necessidades fisiológicas especiais de um sujeito com MPS.
[00159] Antes de um procedimento de IC, o CT Suite confirmará que os seguintes equipamentos e medicamentos estão presentes: Kit de punção lombar (LP) para adultos (fornecido por instituição); BD (Becton Dickinson) calibre 22 ou 25 x 3 - 7” agulha raquidiana (Quincke bisel); Agulha introdutora coaxial, usada a critério do intervencionista (para introdução de agulha raquidiana); torneira de 4 furos pequeno com trava luer macho giratório (Spin); Conjunto de extensão do conector em T (tubulação) com adaptador de trava luer fêmea, comprimento aproximado de 6,7 polegadas; Omnipaque 180 (iohexol), para administração intratecal; Contraste iodado para administração intravenosa (IV); Solução injetável de lidocaína a 1% (se não for fornecida em kit de LP adulto); Seringa pré-preenchida de 10 cc salina normal (estéril); Marcador (s)
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77/177 radiopaco (s); Equipamento de preparação cirúrgica/lâmina de barbear; Almofadas/suportes para permitir o posicionamento adequado do sujeito intubado; Equipamento de intubação endotraqueal, máquina de anestesia geral e ventilador mecânico; Equipamento de monitorização neurofisiológica intraoperatória (IONM) (e pessoal necessário); e vetor contendo seringa 10cc; preparado e transportado para a sala CT/sala de cirurgia (OR) de acordo com o Manual de Farmácia separado.
[00160] O consentimento informado para o procedimento será confirmado e documentado no prontuário e/ou arquivo de estudo. O consentimento separado para o procedimento da equipe de radiologia e anestesiologia será obtido conforme os requisitos institucionais. O indivíduo tem um acesso intravenoso colocado dentro da unidade hospitalar apropriada de acordo com as diretrizes institucionais (por exemplo, dois locais de acesso IV). Os fluidos intravenosos serão administrados a critério do anestesiologista. A critério do anestesiologista e de acordo com as diretrizes institucionais, o indivíduo pode ser induzido e submetido a intubação endotraqueal com a administração de anestesia geral em uma unidade de cuidado adequada ao paciente, área de espera ou procedimento cirúrgico/tomografia computadorizada.
[00161] Uma punção lombar é realizada, primeiramente para remover 5 cc de líquido cefalorraquidiano (CSF) e, posteriormente, para injetar contraste (Omnipaque 180) por via intratecal, para auxiliar a visualização da cisterna magna. Podem ser realizadas manobras adequadas de colocação no indivíduo a fim de facilitar a difusão do contraste na cisterna magna.
[00162] O equipamento de monitoramento neurofisiológico intraoperatório (IONM) está ligado ao indivíduo. O indivíduo é colocado na mesa do scanner de CT na posição decúbito lateral ou de bruços. Uma equipe adequada deve estar presente para garantir a segurança do indivíduo durante o transporte e a colocação. Se considerado apropriado, o sujeito
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78/177 pode ser posicionado de uma maneira que forneça a flexão do pescoço para o grau determinado como seguro durante a avaliação pré-operatória e com os sinais do monitor neurofisiológico normal documentados após o posicionamento.
[00163] A equipe a seguir pode ser confirmada como presente e identificada no local: O intervencionista/neurocirurgião que realizam o procedimento; o anestesiologista e a(s) técnica(s) respiratória(s); as enfermeiras e os assistentes médicos; os técnicos de CT (ou OR); os técnicos de neuropsicologia; e o coordenador local. Um intervalo pode ser completado pelo protocolo do hospital/de uma comissão conjunta a fim de verificar o indivíduo, o procedimento, o local, o posicionamento e a presença corretos de todos os equipamentos necessários na sala. O investigador local principal pode então confirmar com a equipe se ele/ela pode continuar com a preparação do indivíduo.
[00164] A pele do indivíduo sob a base craniana é raspada, conforme necessário. As imagens da tomografia computadorizada são realizadas, seguidas por tomografia computadorizada de planejamento pré-procedimento com contraste IV, se considerado necessário pelo intervencionista para localizar o local alvo e para visualizar a vascularização. Uma vez que o local do alvo (cisterna magna) é identificado e a trajetória da agulha é planejada, a pele é preparada e coberta usando uma técnica estéril de acordo com as diretrizes institucionais. Um marcador radiopaco é colocado na localização da pele desejada, conforme indicado pelo intervencionista. A pele sob o marcador é anestesiada através de infiltração com lidocaína a 1%. Uma agulha raquidiana de 22G ou 25G é avançada na direção da cisterna magna, com a opção de usar uma agulha introdutora coaxial.
[00165] Após o avanço da agulha, as imagens de CT são obtidas usando a espessura de corte CT mais fina possível, usando equipamento institucional (idealmente < 2,5 mm). Imagens de tomografia computacional
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79/177 em série usando a dose de radiação mais baixa possível, que permita a visualização adequada da agulha e dos tecidos moles relevantes (por exemplo, dos músculos para espinhais, ósseos, do tronco cerebral e da medula espinhal) são obtidos. A colocação correta da agulha é confirmada pela observação do CSF no centro da agulha e visualização da ponta da agulha dentro da cisterna magna.
[00166] O intervencionista confirma que a seringa de vetor está posicionada próxima, mas fora do campo estéril. Antes de manusear ou administrar a composição farmacêutica na seringa do vetor, luvas, uma máscara e uma proteção para os olhos são colocados pela equipe que auxilia o procedimento dentro do campo estéril.
[00167] A tubulação de extensão é anexada à agulha raquidiana inserida, que é então anexada à torneira do tipo stopcock de 4 vias. Uma vez que este aparelho esteja autoativado com o CSF do indivíduo, a seringa de descarga com solução salina normal preenchida de 10cc é fixada à porta de abertura de descarga da torneira do tipo stopcock de 4 vias. A seringa do vetor é então fornecida ao intervencionista e fixada a uma porta de entrada do vetor na torneira do tipo stopcock de 4 vias. [00168] Após a porta de saída da torneira do tipo stopcock ser aberta para a seringa de vetor, colocando o fecho giratório da torneira do tipo stopcock em uma primeira posição, os conteúdos da seringa do vetor são injetados lentamente (em aproximadamente 1-2 minutos), com o cuidado de não aplicar um excesso de força no êmbolo da seringa durante a injeção. Depois de o conteúdo da seringa do vetor ser injetado, o fecho com cabeça injetora da torneira do tipo stopcock é girada até uma segunda posição para que a torneira do tipo stopcock e o conjunto de agulhas possam ser descarregados com 1-2cc de solução salina usando a seringa de descarga preenchida fixada.
[00169] Quando estiver pronto, o interventor alertará os funcionários de que ele ou ela removerá o aparelho do indivíduo. Em um único movimento,
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80/177 a agulha, a tubulação de extensão, a torneira do tipo stopstock e as seringas serão removidos lentamente do paciente e colocados em uma bandeja cirúrgica para serem descartados em um receptáculo de resíduos com risco biológico ou recipiente rígido (para a agulha).
[00170] O local de inserção da agulha será examinado quanto a sinais de sangramento ou vazamento de CSF e tratado conforme indicado pelo investigador. O local é envolvido com gaze, fita cirúrgica e/ou curativo de Tegaderm, conforme indicado. O indivíduo é então removido do scanner de CT e colocado sobre uma maca. Uma equipe adequada deve estar presente para garantir a segurança do indivíduo durante o transporte e a colocação.
[00171] A anestesia é descontinuada e os indivíduos serão cuidados seguindo as diretrizes institucionais para os cuidados pós-anestésicos. Os monitores neurofisiológicos são removidos do indivíduo. A cabeça da maca sobre a qual o indivíduo se encontra deve ser ligeiramente levantada (~ 30 graus) durante a recuperação. O indivíduo é transportado para uma unidade de cuidados pós-anestésicos adequada, de acordo com as diretrizes institucionais. Depois que o indivíduo tiver recuperado a consciência adequadamente e estiver em condição estável, ele ou ela será admitido no andar/na unidade apropriados para as avaliações obrigatórias do protocolo. As avaliações neurológicas serão seguidas de acordo com o protocolo e o Investigador Principal supervisionará os cuidados do paciente em colaboração com a equipe do hospital e da pesquisa.
[00172] Em uma modalidade, um método de administração de uma composição fornecida neste documento compreende as etapas de: avançar uma agulha raquidiana na cisterna magna de um paciente; conectar um comprimento de tubulação flexível a um centro próximo da agulha raquidiana e uma porta de saída de uma válvula para a extremidade próxima da tubulação flexível; depois do referido avanço e das etapas de conexão e depois de permitir que a tubulação seja autoativada com
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81/177 o fluido cérebro espinhal do paciente, conectar um primeiro vaso contendo uma quantidade de solução isotônica a uma porta de entrada de descarga da válvula e, em seguida, conectar um segundo vaso contendo uma quantidade de uma composição farmacêutica a uma porta de entrada do vetor da válvula; depois de conectar o primeiro e o segundo vaso à válvula, abrir o caminho para que o fluido flua entre a porta de entrada do vetor e a porta de saída da válvula e injetar a composição farmacêutica no paciente pela agulha raquidiana; e, depois de injetar a composição farmacêutica, abrir um caminho para o fluido fluir pela porta de entrada de descarga e a porta de saída da válvula e injetar a solução isotônica na agulha raquidiana para descarregar a composição farmacêutica no paciente. Em certas modalidades, o método também compreende conformar a colocação apropriada de uma ponta distai da agulha raquidiana na cisterna magna antes de ligar a tubulação e a válvula ao centro da agulha raquidiana. Em certas modalidades, a etapa de confirmação inclui visualizar a ponta distai da agulha raquidiana na cisterna magna com imagens de tomografia computadorizada (CT). Em certas modalidades, a etapa de confirmação inclui observar a presença do fluido cefalorraquidiano do paciente no centro da agulha raquidiana.
[00173] No método descrito anteriormente, a válvula pode ser uma torneira do tipo stopcock com um fecho luer giratório adaptada para girar a uma primeira posição, permitindo o fluxo da porta de entrada do vetor para a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela porta de entrada de descarga e para uma segunda posição, o que permite o fluxo da porta de entrada de descarga para a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela porta de entrada do vetor e em que o fecho luer giratório é posicionado na referida primeira posição na referida segunda posição quando a referida composição farmacêutica estiver sendo descarregada no referido paciente pela solução isotônica. Em certas modalidades, depois de injetar a solução isotônica na
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82/177 agulha raquidiana para descarregar a composição farmacêutica no paciente, a agulha raquidiana é removida do paciente com a tubulação, a válvula e o primeiro e segundo vasos ligados a eles na forma de um conjunto. Em certas modalidades, a válvula é uma torneira do tipo stopcock de 4 vias com um fecho luer macho giratório. Em certas modalidades, o primeiro e segundo vasos são seringas separadas. Em certas modalidades, um conector em T está situado no centro da agulha raquidiana e interliga a tubulação à agulha raquidiana. Opcionalmente, a agulha raquidiana inclui uma agulha introdutora na extremidade distai da agulha raquidiana. A agulha raquidiana pode ser uma agulha raquidiana de cinco polegadas de agulha raquidiana de calibre 22 ou 24. Em certas modalidades, a agulha introdutora é uma agulha introdutora de
3,5 polegadas de calibre 18.
[00174] Em certos aspectos, o método utiliza um dispositivo que é composto, no mínimo, por um primeiro recipiente para conter uma quantidade de uma composição farmacêutica; um segundo recipiente para conter uma solução isotônica; uma agulha raquidiana através da qual a composição farmacêutica pode ser ejetada diretamente do dispositivo para o fluido cefaloraquidiano dentro da cisterna magna de um paciente; e uma válvula que tem uma primeira porta de entrada interligada ao primeiro recipiente, uma segunda porta de entrada interligada ao segundo recipiente, uma porta de saída interligada à agulha raquidiana e um fecho luer para controlar o fluxo da composição farmacêutica e a solução isotônica através da agulha raquidiana. Em certas modalidades, a válvula é uma torneira do tipo stopcock com um fecho luer giratório adaptado para girar até uma primeira posição, permitindo o fluxo da primeira porta de entrada até a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela segunda porta de entrada e até uma segunda posição, permitindo o fluxo da segunda porta de entrada até a porta de saída, ao mesmo tempo em que bloqueia o fluxo pela primeira porta de entrada.
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Opcionalmente, a válvula é uma torneira de 4 vias com um fecho luer macho giratório. Em certas modalidades, o primeiro e segundo recipientes são seringas separadas. Em certas modalidades, a agulha raquidiana é interligada à válvula através de um comprimento de tubulação flexível. Um conector em T pode interligar a tubulação à agulha raquidiana. Em certas modalidades, a agulha raquidiana é uma agulha raquidiana de cinco polegadas de calibre 22 ou 24. Em certas modalidades, o dispositivo compreende ainda uma agulha introdutora ligada a uma extremidade distai da agulha raquidiana. Opcionalmente, a agulha introdutora é uma agulha introdutora de 3,5 polegadas de calibre 18.
[00175] Este método e este dispositivo podem, cada um, opcionalmente, ser utilizados para administração intratecal das composições fornecidas neste documento. Em alternativa, outros métodos e dispositivos podem ser usados para essa administração intratecal.
[00176] Em uma modalidade, uma dose única de AAVhu68.SMA como fornecida neste documento é administrada a adultos (pelo menos 18 anos de idade (> 18)) com SMA 5q geneticamente confirmada e/ou uma história clínica de SMA Tipo 3. Em outras modalidades, os doentes podem ser mais jovens (por exemplo, dos 12 anos aos 18 anos, dos 6 aos 12 anos, dos 3 aos 6 anos, dos 18 meses aos 3 anos, dos 6 meses aos 18 meses, do recém-nascido). Os pacientes podem ser pacientes não ambulatoriais ou ambulatoriais. A dosagem pode ser via uma dose única de vetor por injeção de ICM (intra-cisterna magna). Em uma modalidade, a dose varia de cerca de 3 x 1013 GC a uma dose alta de 1 x 1014 GC. No entanto, outros intervalos adequados são fornecidos neste documento. As avaliações de eficácia podem incluir uma ou mais das seguintes: avaliações motoras, como o teste de seis minutos de Walt (6MWT), tempo de caminhada de 10 metros, pontuação RULM, subida de 4 degraus, teste de encaixe de 9 buracos; testes de função pulmonar, como capacidade vital forçada (FVC), pressão expiratória máxima
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84/177 (MEP) e pressão inspiratória máxima (MIP); medidas da função respiratória, PedsQL (escala de fadiga), SMA-FRS (escala de classificação funcional), eletrofisiologia, como teste de condução nervosa, CMAP (por exemplo, amplitude de CMAP ulnar e peroneal e testes sensoriais, concentração de proteína SMN e outros biomarcadores exploratórios ser avaliado no CSF.
[00177] Em uma modalidade, é utilizada uma seringa contendo o vetor na concentração apropriada. Antes da administração do vetor em estudo, é realizada uma punção lombar para remover um volume predeterminado de CSF e, em seguida, injetar contraste iodado por via intratecal (IC) para ajudar na visualização da anatomia relevante da cisterna magna. O contraste intravenoso (IV) pode ser administrado antes ou durante a inserção da agulha como alternativa ao contraste intratecal. A decisão de usar contraste IV ou IC fica a critério do intervencionista. O paciente é anestesiado, intubado e posicionado na mesa de procedimentos. O equipamento de monitoramento neurofisiológico intraoperatório (IONM) está ligado ao participante. O local da injeção é preparado e coberto por técnica estéril. Uma agulha raquidiana (22-25 G) é avançada na cisterna magna sob orientação fluoroscópica. Uma agulha introdutora maior é usada para ajudar na colocação da agulha. Após a confirmação da colocação da agulha, o conjunto de extensão é anexado à agulha espinhal e deixado preencher com o CSF do paciente. A critério do intervencionista, uma seringa contendo material de contraste pode ser conectada ao conjunto de extensão e uma pequena quantidade injetada para confirmar a colocação da agulha na cisterna magna. Depois que a colocação da agulha é confirmada pela orientação por CT +/- injeção de contraste, uma seringa contendo o vetor (por exemplo, 5,6 mL) é conectada ao conjunto de extensão. O conteúdo da seringa é lentamente injetado durante 1-2 minutos, fornecendo um volume de 5 mL. A agulha é removida lentamente do paciente.
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85/177 [00178] Como usado neste documento, o sujeito é um mamífero, por exemplo, um humano, camundongo, rato, porquinho da índia, cachorro, gato, cavalo, vaca, porco ou primata não humano, como um macaco, chimpanzé, babuíno ou gorila. Em uma modalidade, o sujeito é um paciente humano que tem SMA.
[00179] A classificação do International SMA Consortium define vários graus de gravidade no fenótipo de SMA, dependendo da idade de início e dos marcos do desenvolvimento motor. Propõe-se a designação SMA 0 para refletir o início pré-natal e contraturas articulares graves, diplegia facial e insuficiência respiratória. A SMA tipo I, doença de Werdnig-Hoffmann I, é a forma pós-natal mais grave com início dentro de 6 meses após o nascimento. Os pacientes são incapazes de se sentar e apresentam disfunção respiratória grave. A SMA Tipo II é a forma intermediária com início dentro dos primeiros 2 anos; as crianças podem se sentar, mas não conseguem andar. O curso clínico é variável. A Tipo III (também chamado de doença de Kugelberg-Welander) começa após os 2 anos de idade e geralmente possui uma evolução crônica. As crianças podem ficar de pé e caminhar sem ajuda, pelo menos na infância. A forma adulta (tipo IV) é a mais leve, com início após os 30 anos de idade; poucos casos foram relatados e sua prevalência não é conhecida com precisão.
[00180] Em alguns casos, a SMA é detectada em um feto por volta de 30 a 36 semanas de gravidez. Nesta situação, pode ser desejável tratar o recém-nascido assim que possível após o parto. Também pode ser desejável tratar o feto no útero. Assim, é fornecido um método de resgate e/ou tratamento de um sujeito neonatal com SMA, compreendendo a etapa de entrega de um gene hSNM1 às células neuronais de um sujeito recém-nascido (por exemplo, um paciente humano). É proporcionado um método de salvamento e/ou tratamento de um feto com SMA, compreendendo a etapa de entregar um gene hSMN às células
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86/177 neuronais do feto no útero. Em uma modalidade, o gene é entregue em uma composição descrita neste documento por injeção intratecal. Este método pode utilizar qualquer sequência de ácido nucleico que codifique uma proteína hSMN funcional, seja um hSMN otimizado por códon, como descrito neste documento ou um hSMN nativo, ou um alelo hSMN com atividade potencializada, em comparação com uma proteína tipo selvagem ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o tratamento no útero é definido como a administração de um construto de hSMN como descrito neste documento após a detecção de SMA no feto. Ver, por exemplo, David et al, Recombinant adeno- associated virus-mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgene expression in the sheep, Hum Gene Ther. Abril de 2011; 22 (4): 419-26. doi: 10.1089/hum.2010.007. Epub de 2 de fevereiro de 2011, que é incorporado neste documento por referência.
[00181] Em uma modalidade, o tratamento neonatal é definido como sendo administrado um construto hSMN como descrito neste documento dentro de 8 horas, as primeiras 12 horas, as primeiras 24 horas ou as primeiras 48 horas da entrega. Noutra modalidade, particularmente para um primata (humano ou não humano), a distribuição neonatal está dentro do período de cerca de 12 horas a cerca de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, ou cerca de 1 mês, ou após de cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Noutra modalidade, para SMA de início tardio, a composição é administrada após o início dos sintomas. Em uma modalidade, o tratamento do paciente (por exemplo, uma primeira injeção) é iniciado antes do primeiro ano de vida. Em certas modalidades, por exemplo, com bebês, o construto é readministrado, por exemplo, após 1 ano de idade. Opcionalmente, mais de uma readministração é permitida. Tal readministração pode ser com o mesmo tipo de vetor, um vetor viral diferente, ou via distribuição não viral como descrita neste documento. Noutra modalidade, o tratamento é iniciado após o 1Q ano, ou
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87/177 após os primeiros 2 a 3 anos de idade, após os 5 anos de idade, após os 11 anos de idade ou em uma idade mais avançada.
[00182] De acordo com a presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz do AAV.hSMN é entregue como descrito neste documento para alcançar um resultado desejado, isto é, tratamento de SMA ou um ou mais sintomas do mesmo. Outros resultados desejados incluem redução da fraqueza muscular, aumento da força e tônus muscular, prevenção ou redução da escoliose, manutenção ou aumento da saúde respiratória ou redução de tremores ou espasmos. Outros pontos finais desejados podem ser determinados por um médico.
[00183] Em certas modalidades, a eficácia terapêutica de uma composição contendo o AAV.hSMN como proporcionada neste documento pode ser avaliada por um ou mais dos seguintes parâmetros. Essas pontuações podem ser de 52 semanas ou em um intervalo maior ou menor, por exemplo, 8 semanas, 12 semanas, 36 semanas, 48 semanas ou momentos entre elas. As pontuações RULM em um tempo prédeterminado após a administração são comparadas às pontuações da linha de base. Função motora pode ser medida pelo teste de 6MWT e 10 metros de caminhada em sujeitos ambulatoriais. Função motora pode ser medida pelo teste de peg de 9 orifícios (ambulatorial e não ambulatorial) e teste de subida de 4 degraus (somente ambulatorial). A função pulmonar pode ser medida pela capacidade vital forçada (FVC), pressão expiratória máxima (MEP), pressão inspiratória máxima (MIP). Alterações da linha de base na ulnar e na amplitude peroneal do CMAP podem ser avaliadas. Escala de fadiga multidimensional do PedQLVersion 3.0, módulo de relatório para adultos pode ser avaliado. O SMAFRS (escala de classificação funcional) pode ser avaliado. A farmacocinética do vetor no DNA e outros componentes de medicamentos baseados em AAV no CSF, soro e urina pode ser medida.
[00184] Como usado neste documento, o 6MWT é uma medida da
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88/177 distância percorrida por um sujeito ambulatório em um 6MWT. O 6MWT será realizado em um longo corredor reto de baixo tráfego localizado dentro de casa. Uma distância de 30 metros será marcada com cones laranja em cada extremidade. Uma linha de partida será marcada com fita colorida.
[00185] RULM: O módulo de membro superior revisado consiste em 20 tarefas motoras realizadas com uma extremidade superior selecionada pelo sujeito. O desempenho em cada tarefa é avaliado em uma escala de 0-2 pelo avaliador.
[00186] Teste de peg de 9 orifícios: O 9-HPT é um teste quantitativo breve e padronizado da função dos membros superiores. As mãos dominantes e não dominantes são testadas duas vezes. O sujeito está sentado a uma mesa com um pequeno recipiente raso com nove estacas e um bloco de madeira ou plástico contendo nove orifícios vazios. Em um comando de partida, quando um cronômetro é iniciado, o sujeito pega os nove pegs um de cada vez o mais rápido possível, coloca-os nos nove orifícios e, uma vez que estão nos orifícios, os remova novamente o mais rápido possível um de cada vez, substituindo-os no recipiente raso. O tempo total para concluir a tarefa é registrado. Dois ensaios consecutivos com a mão dominante são imediatamente seguidos por dois ensaios consecutivos com a mão não dominante. A pontuação para o 9-HPT é uma média dos quatro ensaios. As duas tentativas para cada mão são calculadas, convertidas para os recíprocos dos tempos médios para cada mão e, em seguida, as duas recíprocas são calculadas.
[00187] Tempo de caminhada de 10 metros: O tempo de caminhada de 10 metros é uma medida do tempo necessário para caminhar 10 metros. O teste será realizado em um longo corredor reto de baixo tráfego localizado dentro de casa. Uma distância de 10 metros será marcada com cones laranja em cada extremidade. Uma linha de partida será marcada com fita colorida.
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89/177 [00188] Subida de 4 escadas: O teste de 4 degraus de subida avalia o tempo necessário para que um sujeito suba e desça 4 degraus. A tarefa será executada por um avaliador treinado que garantirá que o sujeito possa concluir com segurança a tarefa. As escadas devem ter um aumento de 16 a 20 cm e um corrimão. Os sujeitos são instruídos a subir e descer o mais rápido possível de maneira segura. Tanto o tempo necessário para concluir a tarefa quanto a necessidade do uso do corrimão serão registrados.
[00189] Estudos de eletrofisiologia são realizados para avaliar a função das unidades motoras. CMAP: Estudos de condução nervosa motora do nervo ulnar devem ser realizados preferencialmente no braço direito, a menos que haja uma razão convincente para evitar o estudo desse membro (por exemplo, lesão do nervo sobreposta pré-mórbida). Isso envolve fornecer corrente ao nervo e registrar a resposta motora no músculo. Essa resposta é chamada de potencial de ação muscular composto. Tanto a altura quanto a área do CMAP (amplitude e AUC) podem ser medidas.
Escalas funcionais e de fadiga:
[00190] Escala de Fadiga do PedsQL, relatório adulto: A Escala de Fadiga Multidimensional PedsQL é um questionário de 18 itens que avalia a fadiga geral (6 itens), sono e repouso (6 itens) e fadiga cognitiva (6 itens).
[00191] SMA-FRS: O SMA-FRS é uma escala de classificação ordinal de fácil administração baseada em 10 aspectos das atividades da vida diária. Cada subconjunto é pontuado de 0 (totalmente dependente) a 5 (totalmente independente) pelo sujeito ou cuidador, com uma pontuação máxima de 50.
[00192] Em uma modalidade, a sequência de avaliações é realizada na seguinte ordem para um doente como se segue: PedsQL (escala de fadiga), SMA-FRS (escala funcional de avaliação), 6MWT, 15 min descanso
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90/177 (mínimo), RULM, Teste de peg de 9 orifícios, caminhada de 10 metros, descanso de 15 min (mínimo), subida de 4 degraus, PFTs* e CMAP* ulnar e peroneal. *Pode ser realizado em qualquer ordem. Testes que não podem ser realizados com segurança pelo paciente serão omitidos. [00193] Antes do tratamento, o paciente com SMA pode ser avaliado quanto a anticorpos neutralizantes (Nab) do capsídeo do vetor de rAAV utilizado para administrar o gene hSMN-1. Esses Nabs podem interferir na eficiência da transdução e reduzir a eficácia terapêutica. Pacientes com SMA que têm um título de linha de base de Nab sérico < 1:5 a <1:20, ou < 1: 2,5 a <1: 10 são bons candidatos para o tratamento com o protocolo de terapia gênica rAAV.hSMNI. O tratamento de pacientes com SMA I com títulos de Nab sérico 1:5 pode precisar de uma terapia combinada, tal como co-tratamento transitório com um imunossupressor antes do e/ou durante o tratamento com administração do vetor de rAAV.hSMN. Opcionalmente, a co-terapia imunossupressora pode ser utilizada como medida de precaução, sem avaliação prévia de anticorpos neutralizantes contra o capsídeo do vetor de AAV e/ou outros componentes da formulação. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão prévia pode ser desejável para prevenir uma potencial reação imunológica adversa ao produto transgênico de hSMN, especialmente em pacientes que praticamente não têm níveis de atividade de SMN, onde o produto transgênico pode ser visto como estranho.
[00194] Os imunossupressores a essa co-terapia incluem, mas não estão limitados a um glicocorticoide, esteroides, antimetabólitos, inibidores de células T, um macrolídeo (por exemplo, uma rapamicina ou um rapogênio) e agentes citostáticos, incluindo um agente alquilante, um antimetabólito, um antibiótico citotóxico, um anticorpo ou um agente ativo na imunofilina. O imunossupressor pode incluir mostarda nitrogenada, nitrosoureia, composto de platina, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, fluorouracil, dactinomicina, antraciclina, mitomicina C, bleomicina,
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91/177 mitramicina, receptor de IL-2 (CD25-) ou anticorpos dirigidos contra CD3, anticorpos anti-IL-2, ciclosporina, tacrolimo, sirolimo, IFN-β, IFN-γ, um opioide ou um agente de ligação de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa). Em certas modalidades, a terapia imunossupressora pode ser iniciada antes da administração da terapia gênica. Tal terapia pode envolver a coadministração de duas ou mais drogas (por exemplo, prednisona, micofenolato de mofetil (MMF) e/ou sirolimo (isto é, rapamicina)) no mesmo dia. Uma ou mais dessas drogas podem ser continuadas após a administração da terapia gênica, na mesma dose ou em uma dose ajustada. Essa terapia pode durar cerca de uma semana, cerca de 15 dias, cerca de 30 dias, cerca de 45 dias, 60 dias ou mais, conforme necessário. Em certas modalidades, um paciente recebendo o rAAVhu68.A terapia gênica de SMA descrita neste documento recebeu tratamentos anteriores com nusinersen. Em outras modalidades, o paciente recebe tratamentos contínuos com nusinersen e é monitorizado após terapia gênica para uma redução ou eliminação na necessidade de tal tratamento nusinersen. Pacientes recebendo rAAVhu68.A SMA pode receber outras terapias, incluindo, sem limitação, piridostigmina [UMC Ultrecht], R07034067 [Hoffman-LaRoche], celecoxib, CK2127107 [Astellas Pharma]. Em certas modalidades, eficácia do rAAVhu68.A SMA é medida por uma diminuição na frequência e/ou dose dessas coterapias. Em certas modalidades, uma vez que a terapia com AAVhu68-SMN1, embora durável, pode não resultar em uma correção tão alta quanto o desejado para um paciente selecionado, então a rolagem para a terapia nusinersen (Spinraza™) pode ser desejada assim que 6 meses após o tratamento com AAVhu68-SMN1, a administração de nusinersen (Spinraza™) a pacientes pode ser considerada coadministração dos dois agentes. Veja também Wang etal, Consensus Statement for Standard of Care in Spinal Muscular Atropy, which provides a discussion of the present standard of care for SMA and
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92/177 www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1352/.
[00195] Por exemplo, quando a nutrição é uma preocupação na SMA, a colocação de um tubo de gastrostomia é apropriada. À medida que a função respiratória se deteriora, é oferecida traqueotomia ou suporte respiratório não invasivo. A respiração desordenada do sono pode ser tratada com o uso noturno de pressão positiva contínua nas vias aéreas. A cirurgia para escoliose em sujeitos com SMA II e SMA III pode ser realizada com segurança se a capacidade vital forçada for superior a 30% -40%. Uma cadeira elétrica e outros equipamentos podem melhorar a qualidade de vida. Ver também a patente US N° 8211631, que é incorporada neste documento por referência.
[00196] É de notar que o termo um ou uma se refere a um ou mais. Desse modo, os termos um (ou uma), um ou mais e pelo menos um são utilizados neste documento de forma intercambiável.
[00197] As palavras compreendem, compreende e compreendendo devem ser interpretadas inclusivamente em vez de exclusivamente. As palavras consistir, consistindo e suas variantes devem ser interpretadas exclusivamente, e não de forma inclusiva. Embora várias modalidades na especificação sejam apresentadas utilizando o termo compreendendo, em outras circunstâncias uma modalidade relacionada também deve ser interpretada e descrita utilizando a linguagem consistindo em ou consistindo essencialmente em.
[00198] Conforme usado neste documento, o termo cerca de significa uma variabilidade de 10% (±10%) em relação à referência dada, salvo especificado em contrário.
[00199] Como utilizados neste documento, doença, distúrbio e condição são utilizados alternadamente, para indicar um estado anormal em um sujeito.
[00200] O termo expressão é utilizado neste documento no seu sentido mais amplo e compreende a produção de RNA ou de RNA e
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93/177 proteína. No que diz respeito ao RNA, o termo “expressão” ou “tradução” refere-se em particular à produção de peptídeos ou proteínas. A expressão pode ser transitória ou estável.
[00201] O termo tradução refere-se a um processo no ribossoma, em que uma cadeia de mRNA controla a montagem de uma sequência de aminoácidos para gerar uma proteína ou um peptídeo.
[00202] Salvo definido em contrário neste relatório descritivo, os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que aquele entendido na técnica e por referência a textos publicados que proporcionem àqueles versados na técnica uma orientação geral para vários dos termos usados no presente pedido.
[00203] Os exemplos a seguir são apenas ilustrativos e não pretendem limitar a presente invenção.
Exemplo 1 - Clade F AAV - AAVhu68 Inventivo [00204] O DNA tecidual foi extraído de amostras de tecido humano como modelo de PCR com colunas QIAamp (Qiagen) seguindo as recomendações do fabricante com as seguintes modificações. A DNA polimerase Q5 (Mistura Principal de Alta Fidelidade 2X Q5® Hot Start, NEB) foi escolhida por sua extraordinária alta fidelidade e eficiência robusta para recuperar o gene VP1 de AAVs nas amostras, conforme descrito por Gao, et al [Proc Natl Acad Sei USA, 2002 Sep 3, 99(18): 1185411859 (Epub 2002 Aug 21)] com o conjunto de primer modificado como se segue: no lugar do AV1NS, primer, prm504, [GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC, SEQ ID NO: 23] foi utilizado e no lugar do iniciador reverso AV2CAS, prm505 [CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA, SEQ ID NO: 24], foi utilizado. As condições de PCR foram modificadas da seguinte forma:
μΙ-
Água 9
prm504 1,25
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94/177
prm505 1,25
modelo 1
2X Q5 12,5
programa PCR
Tempo (segundos) Ciclo (s)
98 30 1
98 10 50
59 10
72 93
72 120 1
[00205] As bandas de ~ 3 kb da PCR foram cortadas do gel; O DNA foi extraído com o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) e clonado no kit de clonagem Zero Blunt® TOPO® PCR (Thermo Fisher Scientific). Os plasmídeos foram sequenciados para obter o comprimento total do gene AAV VP1. Para a maioria das amostras, pelo menos três plasmídeos foram totalmente sequenciados e sequências de consenso foram desenhadas como a sequência final do AAV para essa amostra.
[00206] A sequência de ácido nucleico adquirida que codifica a proteína da capsídeo vp1 de AAVhu68 fornecida na SEQ ID NO: 7. Veja, também, as FIGs 8B-8D. A sequência de aminoácidos da vp1 de AAVhu68 fornecida na FIG. 8A e SEQ ID NO: 8. Em comparação com AAV9, AAVhu31 e AAVhu32, duas mutações (A67E e A157V) foram identificadas críticas em AAVhu68 (circulado na FIG. 8A).
[00207] O plasmídeo pAAV2/hu68 trans foi então produzido carregando o gene VP1 de hu68 em uma estrutura principal pAAV2/9 no lugar do gene AAV9 VP1, a fim de avaliar a eficiência de empacotamento, rendimento e propriedades de transdução. O plasmídeo pAAV2/9 contém ITRs 5' e 3' de AAV2 flanqueando o gene de capsídeo e está disponível no Penn Vector Core [Universidade da Pensilvnia, Phila, PA US, pennvectorcore.med.upenn.edu].
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Exemplo 2 - vetores AAVhu68 [00208] Foram gerados e avaliados os vetores AAVhu68 e AAV9 portando vários marcadores, como GFP e LacZ. Cada um dos vetores foi gerado usando a técnica de transfecção tripla em células 293, como descrito por Gao et al [Gao, Guang-Ping, et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18 (2002): 1185411859].
1. Produção de plasmideo trans pAAVhu68 [00209] A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína da capsídeo vp1 fornecida na SEQ ID NO: 7.
[00210] O plasmideo pAAV2/hu68 trans foi produzido carregando ο gene VP1 de hu68 em uma estrutura principal pAAV2/9 no lugar do gene AAV9 VP1, a fim de avaliar a eficiência de empacotamento, rendimento e propriedades de transdução. O plasmideo pAAV2/9 contém ITRs 5' e 3' de AAV2 flanqueando o gene de capsídeo e está disponível no Penn Vector Core [Universidade da Pensilvnia, Phila, PA US, pennvectorcore.med.upenn.edu].
2. Rendimento de vetores AAVhu68 [00211 ] 293 células foram cultivadas e mantidas em DMEM, 1X (Modificação do Meio de Águia de Dulbecco) com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina & piruvato de sódio suplementado com 10% de soro fetal bovino sob a atmosfera com 5% de CO2 at 37°C. As transfecções foram realizadas como descrito por Gao et al [Gao, Guang-Ping, et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18 (2002): 11854-11859] com 0 plasmideo do vetor substituído por pAAV2/hu68 ou pAAV2/9. O cassete de transgene utilizada foi CB7.CI.ffl_uciferase.RBG. As células transfectadas foram ainda cultiva
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96/177 das em placas de 6 poços. O lisado total das células, bem como o sobrenadante, foram coletados para quantificação do vírus através da análise de TaqMan (Applied Biosystems) utilizando sondas e primers direcionando a região poli A da beta-globina de coelho do cassete do transgene como descrito em Gao et al [Gao, Guangping, et al. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Human gene therapy 11.15 (2000): 2079-2091.]. Os rendimentos de seis plasmideos pAAV2/9 e seis pAAV2/hu.Foram comparados 68 plasmideos em uma placa de 6 poços, cabeça a cabeça, em termos de título do sobrenadante e do título total do lisado. Cada plasmídeo foi de uma colônia de bactérias individual. [00212] Verificou-se que o rendimento de AAVhu68 era semelhante ao de AAV9 em termos de lisado total. No entanto, no sobrenadante, o rendimento de AAVhu68 foi significativamente maior do que o de AAV9. Assim, o AAVhu68 foi demonstrado como um vetor melhor comparado ao AAV9 em termos de produção, uma vez que o sobrenadante é preferido para a produção de vírus em larga escala.
3. Transdução in vivo de AAVhu68.LacZ [00213] AAVhu68.CB7.nl_acZ (também referido como AAVhu68.LacZ) foi gerado através da inserção de uma sequência que codifica a β-galactosidase bacteriana localizada no núcleo (nLacZ) como transgene e depois produzida como descrito acima. Para avaliar a eficiência de embalagem, rendimento, propriedades de transdução, eficiência de transdução e tropismo de AAVhu68 in vivo, os camundongos foram injetados com 5 x 1011 cópias do genoma do AAVhu68. Vetor LacZ via vários métodos de administração, tais como administração intravenosa, intramuscular e intranasal. Músculo, pulmão, fígado e coração foram coletados após o sacrifício dos camundongos duas semanas após a administração do vetor. Secções congeladas de cada órgão foram pre
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97/177 paradas, processadas e analisadas como protocolo convencional detectando a expressão do gene LacZ [Bell, Peter, et al. An optimized protocol for detection of E. coli β-galactosidase in lung tissue following gene transfer. Histochemistry and cell biology 124.1 (2005): 77-85.]. Esses resultados revelaram que o AAVhu68 demonstrou alta eficiência de transdução e um amplo tropismo de tecidos/órgãos.
4. Transdução in vivo de AAVhu68.GFP comparada a AAV9.GFP [00214] AAVhu68.GFP e AAV9.GFP foram gerados através da inserção de um gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP) como transgene e, em seguida, produzido como descrito acima. Para avaliar a eficiência da embalagem, rendimento, propriedades de transdução, eficiência de transdução e tropismo de AAVhu68 e AAV9 in vivo, os camundongos foram administrados com AAVhu68.GFP ou AAV9. GFP nas doses de 1x1010 GC ou 1x1011 GC. Seções de várias regiões do cérebro (hipocampo, córtex motor e cerebelo) de camundongos com administração intracerebroventricular dos vetores foram investigadas. A transdução dos vetores de AAV foi observada em todas as amostras de hipocampo testadas, exceto uma de camundongos injetados com 1x1010 GC de AAV9.GFP. Uma melhor transdução de AAVhu68.GFP comparado com o AAV9 foi observado no córtex motor. Além disso, a transdução no cerebelo de AAVhu68. Foi observada GFP quando os camundongos foram injetados com 1x1011 GC do vetor apenas. Nestes camundongos, o AAVhu68 exibia uma eficiência de transdução mais alta, além de um tropismo mais amplo no cérebro em comparação ao AAV9.
[00215] Em outra experiência, vários órgãos, como fígado, rim, coração e pâncreas, de camundongos administrados com AAVhu68.GFP intravenosamente foram preparados e processados como descrito por Wang et al [Wang L, Calcedo R, Bell P, J Lin, Grant RL, Siegel DL, Wilson JM, Hum Gene Ther. 2011 Nov; 22(11 ):1389-401; Wang L, Calcedo
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R, Wang H, Bell P, Grant R, Vandenberghe LH, Sanmiguel J, Morizono
H, BatshawML, Wilson JM, Mol Then 2010 Jan; 18(1):126-34]. Um forte sinal positivo foi observado no fígado, enquanto rim, coração e pâncreas também demonstraram transdução do vetor, indicando um amplo tropismo de tecido/órgão do vetor AAVhu68.
Exemplo 3 - Vetores AAV Contendo hSMN [00216] O AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG consiste em um componente externo e genoma interno do DNA. O componente externo do vetor é um sorotipo hu68, T = 1 capsídeo icosaédrico que consiste em 60 cópias de três proteínas virais de AAV, VP1, VP2 e VP3, em uma proporção de aproximadamente 1:1:8-10. O capsídeo contém um genoma de DNA de cadeia simples que consiste na sobrevivência humana de um neurônio motor (hSMN1) transgene flanqueado por duas repetições terminais invertidas de AAV (ITRs). Um potenciador, promotor, íntron, sequência de codificação de hSMN1 e sinal de poliadenilação (poliA) compreendem o transgene SMN1 humano. As ITRs são os elementos genéticos responsáveis pela replicação e empacotamento do genoma durante a produção vetorial e são os únicos elementos cis virais requeridos para gerar o rAAV. A expressão da sequência de codificação de hSMN1 conduzida por um promotor CB7, um híbrido entre um potenciador precoce imediato (C4) de citomegalovírus (CMV) e o promotor da beta-actina de galinha. A transcrição deste promotor é aumentada pela presença do beta actina íntron (Cl). Um sinal poliA de beta globina de coelho é incluído para mediar a terminação de transcritos de mRNA de hSMN1 humano. Um esquema do AAVhu68.CB7.O genoma do vetor CI.hSMN1co.RBG é mostrado na FIG. 1A.
[00217] Descrição dos Elementos de Sequência:
I. Repetições de terminal invertidas (ITR): ITRs AAV (GenBank # NC001401) são sequências idênticas em ambas as extremidades, mas em orientação oposta. As sequências de ITR de AAV2 funcionam tanto
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99/177 como origem da replicação do DNA do vetor quanto do sinal de empacotamento do genoma do vetor, quando as funções auxiliares do AAV e do adenovirus são fornecidas in trans. Como tal, as sequências ITR representam as únicas sequências cis necessárias para a replicação e empacotamento do genoma vectorial.
2. Potenciador imediato do CMV (382 pb, GenBank# K03104.1).
3. Promotor de β-actina de galinha (282 pb; GenBank # X00182.1) e é utilizado para conduzir a expressão humana de sobrevivência de neurônios motores 1 (hSMN1) de alto nível.
4. íntron de β-actina de galinha: O íntron de 973 pb do gene da beta actina de galinha (GenBank # X00182.1) está presente no cassete de expressão vetorial. O íntron é transcrito, mas removido do RNA mensageiro maduro (mRNA) por splicing, reunindo as sequências em ambos os lados do mesmo. A presença de um íntron em um cassete de expressão demonstrou facilitar o transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma, aumentando assim a acumulação do nível estável de mRNA para tradução. Esta é uma característica comum em vetores genéticos destinados ao aumento do nível de expressão gênica.
5. Sequência de codificação: A sequência hSMN1: (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000344.3) foi otimizada por códon e sintetizada (UPenn). A atrofia muscular espinhal (SMA) é causada por mutações no gene telomérico Survival of Motor Neuron 1 (SMN1). Mutações no SMN1 resultam em toxicidade seletiva para neurônios motores inferiores, levando à perda progressiva de neurônios e fraqueza e degeneração muscular associadas. O transgene que estamos usando é SMN1, isoforma D. A isoforma D codifica a isoforma mais longa e acredita-se que esta variante seja a transcriptase/isoforma predominante produzida por SMN1 tanto no CNS como ubiquamente.
6. Sinal de Poliadenilação: O sinal de poliadenilação de β-globina de coelho de 127 pb de coelho (GenBank # V00882.1) fornece sequências
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100/177 cis para poliadenilação eficiente do mRNA de anticorpo. Este elemento funciona como um sinal para a terminação de transcrição, um evento de divagem específico na extremidade 3' do transcrito nascente e adição de uma cauda longa de poliadenil.
[00218] O vetor foi preparado usando técnicas convencionais de transfecção tripla em 293 células conforme descrito [Mizukami, Hiroaki et al. A Protocol for AAV vector production and purification. Diss. Division of Genetic Therapeutics, Center for MolecularMedicine, 1998.]. Todos os vectores foram produzidos pelo Núcleo de vetor na Universidade da Pensilvânia como descrito anteriormente [Lock, M., et al., Hum Gene Ther, 21: 1259-1271 (2010)].
[00219] Foi realizada uma técnica baseada na reação em cadeia de polimerase digital (ddPCR) de gota para determinar o título de cópia do genoma (GC) para vetores de AAV como descrito anteriormente (Lock, Martin, et al. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Human gene therapy methods 25.2 (2013): 115-125). O método é prático, relata títulos equivalentes ou melhores que o qPCR e não requer uma curva padrão de plasmídeo. O ensaio utilizado envolve a digestão com DNase I, seguido por análise de PCR digital para medir as cópias genéticas vetoriais encapsuladas. A detecção de DNA foi realizada usando primers específicos para sequências direcionadas à região poliA em combinação com uma sonda fluorescente marcada, hibridizando para essa mesma região.
Exemplo 4 - AAVhu68.CB7.CI.hSMN.RBG no modelo de SMA [00220] Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Pensilvânia. Todos os camundongos foram mantidos no Animal Facility dos Laboratórios de Pesquisa Translacional da Universidade da Pensilvânia.
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101/177 [00221] Nos camundongos, existe um gene SMN que é equivalente ao SMN1 humano (hSMN1). A perda completa desse gene resulta em um fenótipo letal embrionário (Monani UR, Sendtner M, Coovert DD et al. O gene do neurônio motor de sobrevivência centromérica humano (SMN2) resgata a letalidade embrionária em camundongos Smn (-/-) e resulta em um camundongo com atrofia muscular espinhal. Hum Mol Genet 2000; 9:333-9; Schrank B, Getz R, Gunnersen JM et al. A inativação do gene do neurônio motor de sobrevivência, um gene candidato à atrofia muscular espinhal, humana, leva à morte celular maciça em embriões de camundongo precoces. Proc Natl Acad Sei U S A 1997;94:9920-5.). Um dos modelos pré-clínicos mais comuns de SMA para avaliar a terapêutica é o modelo de camundongo SMNA7. O modelo de camundongo SMNA7 é um camundongo transgênico desenvolvido no fundamento FVB que possui 2 cópias de SMN2 humano (hSMN2) e 2 cópias de hSMN2 com o éxon 7 removido (SMNA7). Os camundongos SMNA7 selvagens (WT) comportam 2 cópias de SMN murino (mSMN), os camundongos heterozigóticos (HET) possuem 1 cia de mSMN e os camundongos de nocaute (KO) SMNA7 não possuem cópias de mSMN. Os camundongos SMNA7 KO têm uma expectativa de vida média de 13-15 dias e exibem contagem reduzida de neurônios motores na medula espinhal, tamanho reduzido de miofibras, peso reduzido, endireitamento e deambulação prejudicados, e um aumento no número de junções neuro-musculares e não inervados parcialmente. Uma grande vantagem do modelo de camundongos SMNA7 é uma janela de tratamento aumentada em relação aos modelos severos de SMA, com uma vida útil média de aproximadamente 5 dias, além de exibir um fenótipo suficientemente grave para discernir rapidamente se as intervenções terapêuticas estão afetando a atenuação da doença. Por favor, veja Le TT, Pham LT, Butchbach ME et al. O SMNDelta7, o
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102/177 principal produto do gene do neurônio motor de sobrevivência centromérico (SMN2), prolonga a sobrevida em camundongos com atrofia muscular raquidiana e associa-se à SMN de comprimento total. Hum Mol Genet 2005; 14: 845-57.
[00222] No exemplo 4, foram utilizados os camundongos mSMN-/hSMN2+/+SMNA7+/+(KO SMNA7, também anotado como SMNA7 nos exemplos a seguir). A imuno-histoquímica para SMN demonstrou que no córtex, cerebelo e medula espinhal, os filhotes de SMNA7 não exibiam expressão de SMN1 (FIG 2). 23 dias após a injeção de 3 x 1010 GC do AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1. Observaram-se vetores RBG ao nascimento, filhotes de SMNA7, filhotes de ninhada silvestres e heterozigotos com aumento da expressão de SMN. A administração foi realizada por injeção intracerebroventricular no ventrículo lateral esquerdo.
[00223] A transdução viral do vetor testado foi ainda avaliada por hibridação in situ (ISH) para o ácido ribonucleico hSMN1 otimizado por códon (RNA) no córtex de AAVhu68.CB7.Animais tratados com CI.hSMN1co.RBG. Animais do tipo selvagem e SMNA7 foram fornecidos como controle. O resultado mostrado no painel inferior da FIG 2 demonstra uma taxa de transdução elevada na dose teste.
[00224] Uma análise para determinar a porcentagem de transdução de neurônios motores via imuno-histoquímica é realizada. Uma análise adicional via western blot para detectar a expressão de SMN dos homogeneizados do cérebro e medula espinhal é realizada.
Exemplo 5 - AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG aumenta a sobrevida em um modelo de roedores da SMA [00225] A eficácia da injeção intracerebroventricular de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .A RBG foi avaliada em recém-nascidos mSMNT Λ hSMN2+/+ SMNA7+/+ (SMNA7), companheiros de ninhada heterozigotos (HET) e filhotes do tipo selvagem C57BL/6J (WT). Os camundongos testados receberam uma única injeção intracerebroventricular (ICV) no
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103/177 ventrículo lateral esquerdo com 3 χ 101° ou 8,76 χ 101° GC de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG dentro de 24 horas após o nascimento com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filhotes injetados com PBS foram servidos como controles (FIG 3A). Os camundongos foram monitorados diariamente. Todos os camundongos que atendiam aos critérios de eutanásia (perda de peso de 20% por pesagem anterior ou necrose digital) ou encontrados mortos antes do desmame foram genotipados e todos os camundongos que sobreviveram até o desmame foram genotipados.
[00226] Durante o período de observação de dois meses, as taxas de sobrevivência do tipo selvagem, filhotes heterozigotos injetados com PBS e filhotes heterozigotos injetados com o vetor foram semelhantes, indicando que não há toxicidade relacionada ao vetor ou via de administração (FIG 3A). Não foram observadas diferenças significativas no reflexo de endireitamento entre os animais WT tratados com PBS e os camundongos WT tratados com 3x1010 GC ou ~9x101° GC de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG (FIG. 3A). Asobrevida média dos filhotes SMNA7 injetados apenas com PBS (n = 8) foi de 15 dias. No entanto, após o tratamento com uma dose mais baixa do vetor (3x1010 GC/1,5g filhote), a sobrevida média aumentou significativamente para 37 dias (n = 7). Se a dose do vetor foi aumentada para 8,76 χ 101° GC por filhote (n = 10), a sobrevida média foi de 23 dias (FIG 3B). Este resultado indicou uma injeção intracerebroventricular de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG com ambas as doses ao nascimento melhorou com sucesso a sobrevivência dos filhotes SMNA7 enquanto a toxicidade mínima foi detectada.
Exemplo 6 - AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG promove crescimento em um modelo de roedores da SMA [00227] A partir do dia pós-natal (PND) 3, os camundongos foram
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104/177 pesados a cada 2 dias até atenderem aos critérios de eutanásia ou foram encontrados mortos e o resultado foi plotado na FIG 4A. A mudança geral da variável em todos os momentos foi comparada entre cada dois grupos.
[00228] Filhotes do tipo selvagem e heterozigotos tratados com PBS ou os vetores em doses baixas e altas mostraram uma curva de crescimento semelhante, indicando nenhuma toxicidade relacionada ao vetor ou via de administração. Os filhotes SMNA7 tratados com PBS exibiram perda de peso progressiva e sobrevida mediana de 15 dias. No entanto, quando injetado com os vetores AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG, os pesos corporais dos filhotes aumentaram lenta, mas progressivamente após o nascimento. No dia pós-natal15 (P15), enquanto os filhotes do tipo selvagem dos três grupos eram comparáveis em peso, o filhote de 8ΜΝΔ7 resgatado com vetor era significativamente mais pesado em comparação com o grupo único de PBS (FIG 4B). No dia pós-natal 30 (P30), os filhotes 8ΜΝΔ7 e os companheiros de ninhada de tipo selvagem/heterozigotos não demonstraram diferença no peso corporal entre a dose alta e a dose baixa dos tratamentos de vetores (FIG 40).
[00229] Comparações adicionais foram realizadas usando a modelagem linear de efeitos mistos no Programa R (versão 3.3.1; cran.r-project.org) usando a função “Ime” no pacote “nlme”. O sexo foi incluído como covariável na análise. O modelo linear de efeito misto é responsável pela dependência das observações em diferentes pontos do tempo de cada sujeito e é um método preferível para a análise de dados de curso temporal. Não foram observadas diferenças significativas no peso entre os animais WT tratados com PBS e os camundongos WT tratados com 3x1010 GC ou ~ 9x1010 GC de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG (FIGs 4D & 4E), indicando não haver toxicidade relacionada ao vetor ou via de administração. Comparados aos companheiros de ninhada saudáveis, os filhotes 8ΜΝΔ7 demonstraram
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105/177 uma taxa de crescimento mais lenta dos pesos corporais (FIG 4F), enquanto os tratamentos com 3 x 101° GC/filhote ou 8,76 x 101° GC/filhote de AAVhu68. CB7.CI.hSMN1co.RBG em filhotes SMNA7 aumentou significativamente o ganho de peso corporal (FIGs 4I & 4J).
[00230] Estes resultados sugerem que o AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG melhorou o crescimento de filhotes SMNA7 indicados por pesos corporais.
Exemplo 7 - Avaliações Funcionais Revelam Efeitos Positivos de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG em um modelo de roedores da SMA [00231] Foram realizadas duas avaliações funcionais, o Teste de Suspensão da Liga Inferior e o Teste do Reflexo de Endireitamento, para avaliar o desenvolvimento e a progressão da SMA após tratamento do vetor descrito neste documento.
[00232] Para avaliar a força e a fadiga muscular proximal dos membros posteriores no modelo neonatal de camundongo da SMA, o protocolo para o teste de suspensão de membros inferiores foi adotado e otimizado do Fenótipo Comportamental para neonatos: Teste de Suspensão do Membro Superior (SOP # SMA_M).2,2.001 de TREAT-NMD (El-Khodor et al.). A pontuação da suspensão dos membros posteriores (HLS) e o tempo gasto em suspensão (TSH) foram incluídos como parâmetros para medir a força e a fadiga muscular dos membros posteriores. O teste foi realizado em 2 ensaios consecutivos a cada 2 dias após o nascimento. Cada tentativa durou no máximo 60 segundos. Tanto o HLS quanto o TSH foram medidos no mesmo estudo. Os primeiros 15 segundos foram utilizados para determinar a pontuação do HLS. Para o TSH, o tempo continuou a contar até o animal cair ou o tempo atingir 60 segundos, o que fosse o primeiro. Além disso, uma ninhada de mais de 10 animais foi excluída deste estudo para evitar um viés devido à competição nutricional. Ninhadas com menos de 5 filhotes foram excluídas deste estudo, pois o aumento do cuidado materno podería causar um
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106/177 fenótipo mais leve e levar ao viés do estudo.
[00233] Em vez de uma pontuação HLS crescente após o crescimento observado nos filhotes selvagens ou heterozigotos tratados com PBS ou vetor, os filhotes SMNA7 injetados com PBS exibiram um declínio na pontuação do HLS indicando comprometimento da força muscular dos membros posteriores (Figura 5B). No entanto, com uma única injeção de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1. RBG na dose de 3 χ 101° GC por filhote, a pontuação HLS permaneceu estável durante o desenvolvimento dos filhotes SMNA7. Além disso, se a dose aumentasse para 8,76 x 1010 GC por filhote, foi observado um ligeiro aumento da pontuação HLS ao longo do tempo. Esses resultados indicaram que o AAVhu68.CB7.O vetor CI.hSMN1co.RBG melhorou o desenvolvimento funcional dos filhotes SMNA7.
[00234] O tempo gasto pendurado (TSH) foi registrado como descrito acima e serviu como um indicador para a latência cair, não havendo diferença entre os filhotes SMNA7 e seus companheiros de ninhada saudáveis. Este resultado indicou que o TSH não revelou a função muscular comprometida no modelo SMNA7, sendo assim excluída de avaliação adicional.
[00235] Para testar as habilidades locomotoras e avaliar a força muscular no modelo de camundongos neonatos da SMA, adotou-se um protocolo do Teste do Reflexo de endireitamento, otimizado a partir do Fenótipo Comportamental para neonatos: Reflexo de endireitamento, SOP # MD_M.2,2.002 de TREAT-NMD (Didonato et al.). Ele examinou a força geral do corpo, que podería ser afetada pela fraqueza muscular e/ou problemas de saúde geral, medindo a capacidade dos camundongos de corrigir a orientação do corpo quando este era retirado da posição vertical normal. O animal foi removido de sua gaiola e colocado em decúbito dorsal, de modo que as quatro patas estavam voltadas para cima. Um dedo foi colocado no peito para estabilizar os animais na posição
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107/177 invertida. O dedo foi então removido e um temporizador foi iniciado. O cronômetro parou quando o animal virou de bruços e tinha as quatro patas achatadas contra a superfície em que estava. Após cada tentativa, o animal foi devolvido à sua gaiola e deixado em repouso por 5 minutos. [00236] Os filhotes SMNA7 foram testados a cada dois dias, do dia pós-natal 7 ao dia pós-natal 17. Cada tentativa teve 60 segundos no máximo. O tempo que um animal levou para retornar à posição normal dentro desse período foi usado para quantificar a força muscular. Se um animal não conseguisse acertar no prazo determinado, o julgamento seria encerrado e o tempo para acertar seria registrado em 60 segundos. [00237] Além disso, uma ninhada de mais de 10 animais foi excluída deste estudo para evitar um viés devido à competição nutricional. Ninhadas com menos de 5 filhotes foram excluídas deste estudo, pois o aumento do cuidado materno podería causar um fenótipo mais leve e levar ao viés do estudo. Quando o teste do reflexo de endireitamento foi utilizado em conjugação com o teste de suspensão dos membros posteriores no mesmo dia, sempre foi realizado primeiro para evitar que o animal se esgotasse.
[00238] Uma análise mais aprofundada foi realizada para fornecer comparações detalhadas entre os grupos e reduzir a variação causada pelo gênero. A mudança geral da variável em todos os momentos foi comparada entre cada dois grupos. Comparações foram realizadas usando a modelagem linear de efeitos mistos no Programa R (versão 3.3.1; cran.r-project.org) usando a função “Ime” no pacote “nlme”. O sexo foi incluído como covariável na análise. O tempo registrado que um animal levou para retornar à posição ereta foi normalizado por gênero e os dados foram plotados na Figura 6D a 6J. Não foram observadas diferenças significativas no reflexo de endireitamento entre os animais WT tratados com PBS e os camundongos WT tratados com 3x1010 GC ou -9x1010 GC de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG (FIGs 6D &
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6E).
[00239] O resultado demonstrou que os filhotes do tipo selvagem ou heterozigotos levaram um tempo limitado para retornar à posição vertical e esse período de tempo foi reduzido após o crescimento, enquanto os filhotes do 8ΜΝΔ7 não foram capazes de corrigir sua orientação durante o tempo determinado (figura 6). Com uma injeção de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG ao nascimento com 3 x 101° GC por filhote ou 8,76 x 101° GC por filhote, o tempo gasto na correção da posição diminuiu significativamente em filhotes 8ΜΝΔ7 e retornou ao nível normal indicado por filhotes do tipo selvagem e heterozigotos no dia pósnatal 17, indicando AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG melhora com sucesso o desenvolvimento funcional em um modelo de roedores da SMA. [00240] Curiosamente, em KOs, a sobrevida mediana e o ganho de peso não melhoraram de maneira dependente da dose, enquanto o reflexo de endireitamento melhorou de maneira dependente da dose. Com base nesses dados, conclui-se que 3x1010 GC e ~ 9x1010 GC de AAVhu68. CB7.CI.hSMN1co.RBG estão acima da dose mínima efetiva (MED) em 8ΜΝΔ7 KOs.
[00241] Em conclusão, uma única injeção intracerebroventricular do vetor AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG resultou em transdução substancial do neurônio motor e correção funcional concomitante quando administrado por via intratecal (intracerebroventricular) em camundongos neonatais 8ΜΝΔ7.
Exemplo 8 - Análise Histológica Revela Efeitos Positivos de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG em um modelo de roedores da SMA [00242] Um estudo mais aprofundado é realizado para avaliar o comprometimento histológico e morfológico de miofibras no modelo SMA e a recuperação devido à injeção de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG. A miofibra no tibial anterior, quadriceps, diafragma, intercostal, capilar longissimus e língua é revelada por coloração com hematoxilina e eosina
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109/177 e coloração imuno-histoquímica para α-distrofina. A área da seção transversal (CSA), o diâmetro da fibra e a porcentagem de fibras centronucleadas (CNF) são utilizados como parâmetros. Para a determinação da CSA, apenas fibras de formato redondo ou poligonal são levadas em consideração.
Exemplo 9 - Eficiência de variação de dose e de transdução de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG em camundongos de tipo selvagem e SMNA7 [00243] Para determinar a potencial toxicidade da dose mais elevada, a expressão dependente da dose de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG, bem como para determinar a dose mínima eficaz (MED) de AAVhu68.CB7. Cl.hSMNIco.RBG em camundongos SMNA7, ninhadas inteiras produzidas a partir do acasalamento HET/HET são injetadas no ventrículo lateral esquerdo (intracerebroventricular) (ICV) dentro de 24 horas após o nascimento com solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x109 GC, 3x109 GC, 1x1010 GC, 3x1010 GC ou 7x1010 GC de AAVhu68. CB7.Cl.hSMNIco.RBG por camundongo. Os camundongos foram monitorados diariamente durante todo o estudo. Todos os camundongos que atendiam aos critérios de eutanásia (perda de peso de 15% por pesagem anterior ou incapacidade de amamentar) foram sacrificados. Nenhum camundongo encontrado morto ou sacrificado antes do Dia 13 do Estudo foi necropsiado.
[00244] Nos dias 3, 5, 7, 9, 11 e 13 de estudo, os camundongos foram pesados. No Dia 3 do Estudo, os camundongos foram tatuados e genotipados. Nos dias 7 e 13 de estudo, os camundongos foram submetidos a três rodadas de testes de reflexo de correção. No dia 9 do estudo, as ninhadas foram selecionadas para manter o tamanho uniforme da ninhada. As ninhadas foram abatidas para incluir todos os KOs e um número correspondente de HETs e WTs, para que o tamanho da ninhada seja igual a 4 animais. No dia 13 do estudo, os animais foram
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110/177 eutanasiados e necropsiados para análise da transdução do neurônio motor e do tamanho das fibras musculares.
[00245] Todas as doses de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG foram bem tolerados em camundongos HET/WT e KO 8ΜΝΔ7. Os dados nas FIGS 9A e 9B representam apenas 2 litros por dose, portanto, o peso significativamente reduzido em animais HET/WT tratados com 1x109 GC foi pensado como sendo devido à variabilidade nas mães e nos tamanhos das ninhadas (FIG 9B). Além disso, o único KO inscrito no grupo 1x109 GC teve que ser sacrificado devido a uma perda de peso superior a 15% no Dia do Estudo 9. Doses mais altas de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 co.RBG não alterou o ganho de peso nos animais HET/WT, e melhorou o ganho de peso em animais KO em relação aos controles KO tratados com PBS (FIGs 9A e 9B). Com base nesses dados, conclui-se que o 1x1010 GC representa o MED do AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG em camundongos 8ΜΝΔ7.
[00246] Para o reflexo de endireitamento, no Dia do Estudo 7 houve uma variação apreciável entre os animais HET/WT nos vários nos vários grupos de dose (FIG. 10A). No entanto, no Dia do Estudo 13, os animais HET/WT em todos os grupos de doses tiveram um tempo médio de correção de ~ 1 segundo (FIG 10A). Pensa-se que esta variação no Dia do Estudo 7 se deva à variabilidade nas mães e no tamanho da ninhada. Semelhante aos dados de monitoramento de peso, em doses de 1 x1010 GC e acima, AAVhu68. CB7.Os KO tratados com Cl.hSMN1 co.RBG exibiram uma melhoria significativa no tempo de endireitamento no Dia de Estudo 13 relativamente aos controles de KO tratados com PBS (FIG. 10B).
[00247] Portanto, com base nas medições em vida da monitorização do peso e do reflexo de endireitamento, concluiu-se que o MED atual de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 co.RBG em camundongos 8ΜΝΔ7 é 1x1010 GC.
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111/177 [00248] Medições histológicas da transdução de neurônios motores e tamanho da miofibra são avaliadas. Ninhadas adicionais são registradas na experiência descrita acima no Exemplo 9.
[00249] Além disso, nas ninhadas matriculadas, não foram observados sinais de toxicidade aguda relacionada a qualquer dose do vetor e, durante o período de 13 dias do estudo, não houve sinais de toxicidade relacionada ao vetor.
[00250] Para avaliar melhor o potencial de toxicidade e tolerabilidade do AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG em camundongos adultos após a administração ICV, foram injetados machos e fêmeas adultos C57BL/6J com AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG intratecalmente. As doses totais usadas neste estudo foram equivalentes às usadas no experimento neonatal descrito acima, enquanto as doses por grama de massa cerebral foram duas vezes diferentes devido à massa cerebral estimada de 0,4 g para um camundongo adulto, em comparação com um cérebro estimado massa de 0,2 g para um camundongo neonatal. Todas as doses foram incluídas no período do Dia do Estudo 14, enquanto apenas o veículo e o 7x1010 GC foram duplicados no período do Dia do Estudo 28.
[00251] Os pesos foram monitorados no Dia de Estudo 0, 7, 14, 21 e 28, conforme aplicável. A química clínica é realizada no soro coletado na necropsia (Dia do Estudo 14 ou Dia do Estudo 28, conforme aplicável). Cérebro, medula espinhal, coração, pulmões, fígado, baço, rins, nervo ciático e quadriceps femoral foram coletados para avaliação histopatológica microscópica. Todos os parâmetros foram comparados com animais tratados com veículo.
[00252] Até o dia 14 do estudo, não houve morbidade ou mortalidade em nenhum grupo. Todas as doses de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG não teve impacto na trajetória do peso em comparação com o controle tratado com veículo do mesmo sexo
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112/177 (Figuras 14A-14B).
[00253] Um estudo adicional é realizado para avaliar o comprometimento histológico e morfológico de miofibras nos modelos descritos acima no Exemplo 9 e a recuperação devido à injeção de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 .RBG. A miofibra no tibial anterior, quadriceps, diafragma, intercostal, capilar longissimus e língua é revelada por coloração com hematoxilina e eosina e coloração imuno-histoquímica para adistrofina. A área da seção transversal (CSA), o diâmetro da fibra e a porcentagem de fibras centronucleadas (CNF) são utilizados como parâmetros. Para a determinação da CSA, apenas fibras de formato redondo ou poligonal são levadas em consideração.
Exemplo 10 - Vetores AAV contendo hSMN1 em macacos Rhesus [00254] O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes vias intratecais de administração em macacos rhesus para determinar qual rota resulta na transdução mais robusta do neurônio motor da medula espinhal, bem como avaliar o perfil farmacocinético e a segurança do AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG em Macacos Rhesus. Os macacos rhesus foram usados neste estudo porque seu tamanho e a anatomia do sistema nervoso central servem como uma aproximação muito melhor dos seres humanos do que os camundongos.
[00255] Orientação fluoroscópica e material de contraste foram usados para confirmar a colocação da agulha na cisterna magna (ICM) ou na cisterna lombar (LP) no espaço intervertebral entre L4 e L5. Os grupos foram de 1,0 mL de ICM (n = 3), 2,5 mL de LP (n = 4) e 5,0 mL de LP (n = 4). Cada grupo continha animais com uma gama de títulos de anticorpos neutralizantes (NAb) para AAV9 de indetectável a maior que 1:20. Todos os grupos receberam 3,3x1011 GC/g de cérebro (3x1013 GC total) de AAVhu68. CB7.CI.hSMN1co.RBG. Não houve grupo controle de veículo incluído neste estudo.
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113/177 [00256] Os animais foram observados diariamente quanto a comportamento anormal e sinais de angústia por pessoal dedicado durante o estudo. A patologia clínica foi realizada no início do estudo, no dia da administração AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG (Dia de Estudo 0), Dia de Estudo 3, Dia de Estudo 7 e semanalmente após a conclusão do estudo. A química e citologia do CSF foram realizadas no Dia do Estudo 0, Dia do Estudo 7 e semanalmente depois até a conclusão do estudo. Os animais foram sacrificados e necropsiados no Dia 28 do Estudo para avaliação histológica da transdução de neurônios motores na medula espinhal, biodistribuição e avaliação histopatológica preliminar.
[00257] Nenhum animal exibiu comportamento anormal ou sinais de sofrimento ao longo do estudo. 1 animal (RA1871) teve um aumento no nível de ALT de 55 U/L para ~ 80 U/L entre o Dia 0 do Estudo e o Dia 21 do Estudo, embora isto não correspondesse com quaisquer sinais clínicos (FIG. 11B). Nenhum outro animal exibiu tendências de aumento de ALT (FIG 11B), AST (FIG 11 A), linfócitos (FIG 11C) ou monócitos (FIG 11 D) após administração de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG.
[00258] Não pareceu haver nenhuma tendência de proteína ou glicose no CSF alterada em nenhum animal durante o estudo (FIG. 11E11H). No dia 28 do estudo, 1 animal (RA1327) tinha 17 glóbulos brancos/pL no CSF (FIG 11E). No exame macroscópico, o CSF não parecia ter contaminação sanguínea, mas continha 250 glóbulos vermelhos/pL. Não está claro se isso foi verdade pleocitose ou uma torneira CSF impuro. A citologia do CSF de estudos intratecais anteriores mostrou um aumento gradual na contagem de glóbulos brancos no CSF de um para dois dígitos ao longo de semanas (dados não mostrados), levando a concluir que essa ocorrência única de 17 glóbulos brancos/pL no dia do estudo 28 (a partir de 0 glóbulos brancos/pL no dia 21 do estudo) provavelmente ocorreu devido a uma torneira imune do CSF, em oposição a uma verdadeira pleocitose.
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114/177 [00259] Na necropsia, cada medula espinhal foi dividida em seções cervical, torácica e lombar. Cada nível da medula espinhal foi subsequentemente dividido em 4 partes. 1 peça foi congelada para biodistribuição, 1 peça foi colocada em formalina para avaliação histopatológica, e as 2 peças restantes foram colocadas em formalina para avaliação da transdução do neurônio motor.
[00260] A transdução do neurônio motor foi medida por ISH (3 lâminas/pedaço de nível da medula espinal/animal igual a 6 lâminas/nível da medula espinal/animal) para o ácido ribonucleico hSMN1 (RNA) e IHC (2 lâminas/peça do nível da medula espinal/animal igual a 4 lâminas/nível da medula espinhal/animal) para a proteína hSMN1. Os neurônios motores foram marcados com uma mancha de Nissl para determinar a porcentagem de neurônios motores transduzidos. Administração ICM de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG resultou em transdução do neurônio motor significativamente maior do que a administração LP do AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 co.RBG medida por ISH e IHC em todos os níveis da medula espinal (FIGs 12A & 12B). Houve concordância na eficiência da transdução entre ISH e IHC dentro de cada grupo, embora a porcentagem de neurônios motores transduzidos fosse maior quando medida por IHC (FIGS. 12A e 12B). Enquanto a reatividade cruzada do anticorpo com a proteína SMN do rhesus pode ocorrer, a sonda de RNA usada para ISH foi específica para o RNA hSMN1 otimizado por códon produzido a partir de AAVhu68.CB7.Cl.hSMN1 co.RBG, que eliminou a possibilidade de reatividade cruzada com RNA de SMN rhesus. De acordo com os dados publicados, o percentual de neurônios motores transduzidos aumentou em um padrão caudal para rostral (cervical a lombar) em todos os grupos (Hinderer C, Bell P, Vite CH et al. Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna. Molecular therapy Methods & clinical development 2014;1:14051) (FIGs 12A &
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12B).
[00261] A entrega intratecal de AAV pode ser realizada utilizando uma variedade de vias para o acesso ao CSF. A punção lombar é o método mais comum para acessar o CSF e, portanto, foi avaliada como uma via de administração de AAV em primatas não humanos. Notavelmente, a entrega de um vetor AAV9 no CSF por punção lombar mostrou ser pelo menos 10 vezes menos eficiente na transdução de células do cérebro e da medula espinhal em comparação com a injeção do vetor mais superiormente ao nível da cisterna magna [Hinderer C, etal. (2014) Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna. Mol Ther Methods Clin Dev 1: 14051]. Esta descoberta foi confirmada em um estudo do NHP usando o vetor AAVhu68-SMN1. Os macacos rhesus adultos injetados com o vetor candidato clínico por punção suboccipital na cisterna magna (n = 3) exibiram transdução de neurônios motores em todos os níveis da medula espinhal, como mostra a hibridização in situ (ISH) para mRNA do transgene e coloração imuno-histoquímica (IHC) para a proteína SMN humana. Em contraste, animais recebendo injeção de vetor via punção lombar apresentaram transdução substancialmente menor em todos os níveis da medula espinhal, mesmo quando o volume de injeção foi aumentado para 5 mL - aproximadamente 40% do volume de CSF do animal - para promover a distribuição rostral. Este estudo ilustrou a necessidade de fornecer vetor ao nível da cisterna magna e apoiou a seleção da punção suboccipital como via clínica de administração.
[00262] A biodistribuição foi realizada em tecidos selecionados do estudo para determinar a transdução seguindo diferentes vias de administração intratecal. Diferenças substanciais na transdução do cérebro e da medula espinhal após a administração de vetor de MCI e LP em estudos anteriores podem ser devidas ao baixo volume utilizado para
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LP (Hinderer C, Bell P, Vite CH et al. Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna. Molecular therapy Methods & clinical development 2014; 1:14051). No presente estudo, a transdução do cérebro e medula espinhal foi equivalente após a administração de ICA e LP de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG (FIG 13).
[00263] Curiosamente, os NAbs parecem ter um impacto na transdução de órgãos periféricos. Em cada grupo, o animal com NAbs maior que 1:20 teve a menor transdução no coração, fígado e baço (FIG 13). [00264] A avaliação histopatológica preliminar foi realizada no cérebro, medula espinhal, gânglios da raiz dorsal (DRG), nervo ciático e fígado. No cérebro, os principais achados foram infiltração e gliose de células mononucleares mínimas a leves. Esses achados foram igualmente distribuídos em todos os grupos. Na medula espinhal, os achados estavam presentes principalmente no grupo da ICM, com um aumento na frequência de achados na medula espinhal lombar. Os achados mais comuns foram mínimos para degeneração axonal discreta nos funículos dorsais e infiltração de células mononucleares e histiocíticas mínimas a suaves. No DRG cervical, torácico e lombar, os achados primários foram infiltração de células mononucleares mínimas a leves, vacuolização neuronal mínima a leve e degeneração axonal mínima a moderada. Esses achados estavam presentes em uma prevalência mais alta no grupo ICM em comparação aos dois grupos LP.
[00265] No nervo ciático, houve degeneração axonal de mínima a moderada e infiltração mínima de macrófagos. Esses achados estavam presentes principalmente no grupo ICM. No fígado, houve infiltração de células mononucleares de mínima a leve e micro-granulomas mínimos em todos os grupos.
[00266] Além disso, glândula adrenal, aorta ascendente, medula ós
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117/177 sea, cérebro, ceco, colo do útero, epidídimo, esôfago, olho, vesícula biliar, coração, rim, intestino grosso, pulmão, glândula lacrimal, linfonodo, músculo, ovários, pâncreas, próstata, reto, glândula salivar, vesícula seminal, pele, intestino delgado, medula espinhal, baço, estômago, testículos, bexiga urinária, útero, hipófise, timo, glândula tireoide, traqueia, vagina e lesões grosseiras (se houver) foram coletadas para análise histopatológica. Os tecidos são corados com hematoxilina e eosina (H&E) e / ou outras colorações imuno-histoquímicas para identificar / esclarecer características histológicas.
Exemplo 11 - Estudos de Toxicidade e Biodistribuição de Vetores de AAV Contendo hSMN1 em Macacos Rhesus [00267] Um estudo de GLP de 180 dias é realizado em macacos rhesus para investigar a farmacologia e a toxicologia de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG após a administração do ICM. Macacos rhesus recebem uma de três doses, 1,85x1010 GC / g cérebro, 5,56x1010 GC / g cérebro, ou 1,85x1011 GC / g cérebro (n=3 / grupo / ponto de tempo - ambos os sexos) ou veículo (Formulação de Tampão de Elliot, EFB) (n=1 / grupo / ponto de tempo - qualquer sexo). A patologia clínica de base (contagens celulares com diferenciais, químicas clínicas e painel de coagulação), química do CSF e citologia do CSF são realizadas. Depois de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG ou administração do veículo, os animais são monitorados diariamente em busca de sinais de sofrimento e comportamento anormal. A patologia clínica é realizada semanalmente seguindo a AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG ou administração do veículo. A química e a citologia do líquido cefalorraquidiano (CSF) são realizadas semanalmente nos primeiros 30 dias após o AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG ou administração do veículo e mensalmente depois disso. Na linha de base e, posteriormente, mensalmente, os anticorpos neutralizantes para AAVhu68 e as respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL) a AAVhu68 e o transgene hSMN1 são avaliados pelo
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118/177 ensaio IFN-γ ELISPOT.
[00268] 14 dias, 90 dias e 180 dias depois de AAVhu68.CB7.Cl.hSMNIco.RBG ou administração do veículo, os animais são eutanasiados e os tecidos são coletados para um exame histopatológico microscópico abrangente. O exame histopatológico é particularmente focado nos tecidos do sistema nervoso central (cérebro, medula espinhal e gânglios da raiz dorsal), pois estes são os mais fortemente transduzidos após a administração intratecal de AAVhu68.CB7.Cl.hSMNIco.RBG. Além disso, os linfócitos são coletados do fígado, baço e medula óssea para examinar a presença de CTLs nestes órgãos no momento da necropsia.
[00269] Um estudo de toxicologia de GLP realizado usando a administração de ICM de AAVhu68.CB7.Cl.hSMNIco.RBG em 30 primatas não humanos identificou déficits neurológicos transitórios em 1/30 animais após a administração do vetor, o que foi atribuído à punção direta do tronco cerebral durante o procedimento causada pelo movimento espontâneo do animal sob anestesia. Não houve outros eventos adversos clínicos neste estudo durante período de acompanhamento de 180 dias, e os exames neurológicos padronizados realizados durante todo o estudo não identificaram anormalidades. A histopatologia revelou axonopatia neuronal sensitiva dependente da dose que não estava associada a sequelas clínicas. A quantificação da transdução dos neurônios motores da coluna vertebral indicou que uma dose de X GC alcançou a transdução de X% dos neurônios motores da coluna vertebral, um nível de transdução que foi associado à função motora melhorada no modelo de camundongo SMNA7. Portanto, esta dose foi selecionada como MED (atualização com resultados finais de toxicidade).
[00270] Em um estudo não clínico em macacos rhesus juvenis, administração intravenosa de AAVhu68.CB7. Cl.hSMNIco.RBG a uma dose extremamente alta (2 χ 1014 GC/kg) resultou em toxidade hepática
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119/177 aguda em 3/3 animais, com um animal precisando de eutanásia 5 dias após administração do vetor. Toxicidade semelhante não foi observada em 9 adultos e 5 jovens dos macacos rhesus tratados por injeção intratecal em doses de até 3 x 1013 GC, a dose mais alta avaliada usando esta rota de administração ou nos 27 macacos rhesus adultos tratados com AAVhu68. CB7.CI.hSMN1co.RBG por injeção de ICM no estudo toxicológico de GLP.
Exemplo 12 - Estudo Clínico
A. Recém-nascidos [00271] Um primeiro ensaio em humanos é iniciado correspondendo à dose MED dose de 5x1010 GC / g de massa cerebral, que se traduz em ~5x1013 GC total para um humano e está 3 vezes abaixo da dose baixa proposta para o estudo de toxicologia mostrado no Exemplo 11 mas ainda 3 vezes abaixo da dose alta (Dekaban AS. Alterações nos pesos cerebrais durante o período da vida humana: relação dos pesos cerebrais com as alturas e pesos corporais. Ann Neurol 1978; 4: 34556.). A dose máxima para administrar no primeiro ensaio humano deve ser equivalente à dose mais alta no estudo de toxicologia descrito no Exemplo 11,1,85x1011 GC / g cérebro, correspondendo a 1,85x1014 GC total.
[00272] Determinar a segurança de 2 doses de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG em participantes com atrofia muscular vertebral verificada por DNA (SMA), duas administrações de dose única diferentes do referido vetor AAV em um carreador/solução farmacêutica adequado são investigadas.
[00273] O desenvolvimento subsequente inclui grupos populacionais expandidos e doses para estabelecer uma dose eficaz.
[00274] O objetivo principal é avaliar qualquer toxicidade relacionada ao estudo, grau III ou superior, relacionada ao tratamento.
[00275] Os Objetivos Secundários incluem
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120/177 • Incidência de eventos adversos (AEs) e / ou eventos adversos graves (SAEs) • Avaliação da obtenção dos marcos motores do desenvolvimento do Exame Neurológico Infantil de Hammersmith (HINE) • Alteração da linha de base na escala de função motora do Teste de Distúrbios Neuromusculares do Children's Hospital of Philadelphia Infant (CHOP-INTEND) • Percentagem de participantes que desenvolvem atrofia muscular espinhal clinicamente manifestada • Percentagem de participantes vivos em pontos de tempo notados • Mudança da linha de base nas medições físicas:
Peso por idade / comprimento; circunferência da cabeça, tórax e braço, relação cabeça-perímetro torácico • Mudança da linha de base nos sinais vitais em repouso:
Pulso, pressão arterial, respiração, temperatura, oximetria de pulso e dióxido de carbono transcutâneo • Alteração da linha de base em parâmetros laboratoriais clínicos: [00276] Avaliada pelos seguintes testes laboratoriais: Hematologia: glóbulos vermelhos, hemoglobina, hematócrito, plaquetas, glóbulos brancos, glóbulos brancos, química do sangue: proteínas totais, albumina, creatinina, cistatina C, creatina fosfoquinase, nitrogênio ureico no sangue, bilirrubina total (direta e indireta), fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, glicose, cálcio, fósforo, cloreto, sódio, potássio. Exame de urina: gravidade específica, pH, proteína, glicose, cetonas, bilirrubina, glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, células epiteliais, bactérias, cilindros, cristais • Alteração na linha de base do potencial de ação muscular composto ulnar (CMAP) • Líquido cerebrospinal (CSF) e concentrações plasmáticas de proteína SMN
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121/177 [00277] População alvo é de crianças <6 semanas de idade com SMA pré-sintomática, geneticamente documentada e 2 cópias do gene do neurônio motor de sobrevivência 2 (SMN2).
[00278] Os critérios de inclusão estão listados abaixo.
1. Idade de nascimento: <6 semanas, com idade gestacional de 37 a 42 semanas para partos únicos; idade gestacional de 34 a 42 semanas para gêmeos.
2. SMA pré-sintomática com documentação genética da deleção homozigótica do gene 5q do neurônio motor 1 (SMN1) ou mutação ou mutação heterozigótica composta.
3. Documentação genética de 2 cópias do neurônio motor de sobrevivência 2 (SMN2).
4. Acompanhamento pós-procedimento com neurologista com experiência em estudo SMA.
[00279] Os critérios de exclusão estão listados abaixo.
1. Tratamento com qualquer droga, agente biológico ou dispositivo comercializado ou de investigação administrado para SMA, incluindo uma história de terapia genética, tratamento anterior com oligonucleotídeo antisense (ASO) ou transplante de células.
2. Quaisquer sinais ou sintomas clínicos na triagem ou imediatamente antes da primeira dosagem (Dia 1) que, na opinião do Investigador, sejam fortemente sugestivos de SMA.
3. Valores laboratoriais anormais considerados clinicamente significativos (GGT> 3XULN, bilirrubina > [X] mg / dL, creatinina > [Y] mg / dL, Hgb <[Z] ou > [A] g / Dl; WBC> [B] por cmm)
4. Doença médica principal
5. Doença concomitante que, na opinião do investigador, cria riscos desnecessários para a transferência de genes
6. A família não deseja divulgar a participação no estudo do paciente
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122/177 com o médico da atenção básica e outros prestadores de serviços médicos.
[00280] Duas doses do vetor AAV são testadas, com cada grupo de dosagem para incluir 6 participantes.
• Coorte 1: Dose baixa: 3 x 1013 GC • Coorte 2: Dose alta: 1 x 1014 GC [00281] Seis participantes são inscritos no coorte de dose baixa (3 x 1013 GC). A dosagem dos participantes é feita em série, com um período de observação de segurança de quatro semanas entre a matrícula de cada participante. A segurança é avaliada por um Comitê Interno de Segurança (ISC). Se nenhum teste de revisão de segurança (SRT) for observado, 4 semanas após a dosagem do sexto participante na coorte de dose baixa, todos os dados de segurança disponíveis serão avaliados por um Comitê Independente de Monitoramento de Dados (IDMC) antes de avançar para a matrícula da coorte de dose alta 2.
[00282] Em uma modalidade, uma seringa contendo 5,6 mL do vetor na concentração apropriada será distribuída na sala de procedimentos. O pessoal a seguir está presente para a administração da droga em estudo: intervencionista realizando o procedimento; anestesista e técnico (s) respiratório (s); enfermeiros e assistentes médicos; técnicos de CT (ou de sala de cirurgia); técnico de neurofisiologia; coordenador de pesquisa do local.
[00283] Antes da administração da droga em estudo, é realizada uma punção lombar para remover um volume predeterminado de CSF e, em seguida, injetar contraste iodado por via intratecal (IC) para ajudar na visualização da anatomia relevante da cisterna magna. O contraste intravenoso (IV) pode ser administrado antes ou durante a inserção da agulha como alternativa ao contraste intratecal. A decisão de usar contraste IV ou IC fica a critério do intervencionista. O paciente é anestesiado, intubado e posicionado na mesa de procedimentos. O equipamento
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123/177 de monitoramento neurofisiológico intraoperatório (IONM) está ligado ao participante. O local da injeção é preparado e coberto por técnica estéril. Uma agulha raquidiana (22-25 G) é avançada na cisterna magna sob orientação fluoroscópica. Uma agulha introdutora maior pode ser usada para ajudar na colocação da agulha. Após a confirmação da colocação da agulha, o conjunto de extensão é anexado à agulha raquidiana e deixado preencher com o CSF do paciente. A critério do intervencionista, uma seringa contendo material de contraste pode ser conectada ao conjunto de extensão e uma pequena quantidade injetada para confirmar a colocação da agulha na cisterna magna. Após a colocação da agulha ser confirmada por orientação por CT +/- injeção de contraste, uma seringa contendo 5,6 mL de GTP-201 é conectada ao conjunto de extensão. O conteúdo da seringa é lentamente injetado durante 1-2 minutos, fornecendo um volume de 5,0 mL. A agulha é removida lentamente do paciente.
[00284] Após a administração do medicamento do estudo, os participantes são transportados para uma unidade de cuidados pós-anestésicos adequada, de acordo com as diretrizes institucionais. Depois que o participante recuperou adequadamente a consciência e está em condição estável, ele/ela é internado(a) na unidade apropriada para monitoramento clínico exigido por protocolo. Os sinais vitais e a função neurológica são monitorados com frequência, incluindo avaliações a cada 15 minutos por 3 horas e depois a cada hora durante o período de 24 horas imediatamente após o procedimento. Após o período inicial de 24 horas após o procedimento, as avaliações são realizadas diariamente durante dois dias após o qual os participantes recebem alta e retornam semanalmente por 4 semanas, depois a cada 4 semanas para duas visitas adicionais, seguidas pela visita de avaliação do parâmetro primário na semana 24. [00285] O sangue é coletado para testes de segurança e os participantes são avaliados clinicamente. Os participantes são submetidos a uma punção
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124/177 lombar para coletar o CSF, a fim de monitorar sinais de inflamação e medir biomarcadores no momento da administração, semanas 4, 12 e 24. Durante o período de acompanhamento, os participantes são avaliados a cada três meses até 1 ano após o procedimento. Os participantes são seguidos por visitas anuais por um total de 5 anos. Aos 3 e 6 meses após a administração do vetor, os participantes passam por uma repetição da ressonância magnética (MRI) e do CSF.
[00286] A evidência da inflamação do CNS após a administração do vetor AAV é avaliada em amostras de CSF utilizando técnicas padrão, incluindo contagem de células nucleadas e proteína diferencial e total. As medidas exploratórias da inflamação associada ao tratamento incluem a análise de citocinas multiplex do CSF para marcadores inflamatórios.
[00287] Para validar os níveis de proteína SMN do CSF como um biomarcador para a transdução bem-sucedida do vetor AAV hSMN1, o ensaio está em desenvolvimento para o estudo de intervenção de fase 1/2.
[00288] O Potencial de Ação Muscular Composta (CMAP) representa a saída eletrofisiológica de um músculo após estimulação supramáxima de um nervo periférico e serve como um indicador objetivo e altamente sensível da saúde de neurônios motores (García A, Calleja J, Antolín FM, Berciano J. Peripheral motor and sensory nerve conduction studies in normal infants and children. Clin Neurophysiol 2000; 111:513-20). Em particular, estudos de história natural entre pacientes com SMA do Tipo I demonstram que a amplitude do CMAP é anormalmente baixa e não melhora após o início dos sintomas (Finkel RS, McDermott MP, Kaufmann P et al. Observational study of spinal muscular atrophy type I and implications for clinical trials. Neurology 2014;83:810-7; Swoboda KJ, Prior TW, Scott CB et al. Natural history of denervation in SMA: relation to age, SMN2 copy number, and function. Ann Neurol 2005; 57:
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704-12 e Finkel RS. Electrophysiological and motor function scale association in a pre-symptomatic infant with spinal muscular atrophy type I. Neuromuscul Disord 2013;23:112-5). Além disso, um estudo de SMA em um modelo de suíno knockout, que exibe achados eletrofisiológicos semelhantes aos pacientes com SMA, mostrou que a restauração precoce de SMN em animais pré-sintomáticos resultou na correção de CMAP (Duque SI, Arnold WD, Odermatt et al. A large animal model of spinal muscular atrophy and correction of phenotype. Ann Neurol 2015;77:399-414). Pelas razões acima mencionadas, o CMAP é investigado como um biomarcador exploratório.
[00289] Os eventos que se qualificam para os critérios de parada do estudo incluem:
• Qualquer morte que seja possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionada ao produto sob investigação • Teste de função hepática elevada:
• ALT ou AST 3x maior que o limite superior do normal • Elevação associada da bilirrubina sérica total (na faixa etária deste estudo, definida como um nível de • Mais de um participante apresenta um AE de grau 3 ou superior que esteja possivelmente, provável ou definitivamente relacionado ao produto sob investigação ou ao procedimento de injeção • Hemorragia, acidente vascular cerebral ou paralisia aguda do sistema nervoso central que é possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionada ao produto sob investigação ou procedimento de injeção.
[00290] Anormalidade da função hepática é definida como qualquer aumento da alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) para um valor superior a 3 vezes o limite superior do normal (ULN). As descobertas simultâneas são aquelas que derivam de uma única coleta de sangue ou de amostras de sangue separadas coletadas dentro de 8 dias uma da outra. As investigações e investigações de
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126/177 acompanhamento são iniciadas prontamente pelo local da investigação para determinar se os resultados são reproduzíveis e / ou se há evidência objetiva que apoie claramente a causação de uma doença (por exemplo, colelitíase e obstrução do dueto biliar com vesícula biliar distendida) ou um agente diferente do agente em investigação.
B. Adultos [00291 ] Este ensaio clínico aberto de escalonamento de dose de fase 1/2 avalia a segurança de uma única administração de AAVhu68.SMA em adultos com SMA 5q geneticamente confirmado e história clínica de SMA Tipo 3. Este estudo matricula pacientes não ambulatoriais e ambulatoriais. Os sujeitos recebem uma dose única de AAVhu68.SMA pela injeção de ICM (intra-cisterna magna). Coorte 1 (n=3, dose baixa, 3 x 1013 GC) ou Coorte 2 (n=6; dose alta, 1 x 1014GC). As duas doses avaliadas neste estudo foram selecionadas com base em farmacologia não clínica e estudos toxicológicos. Ambas as doses a serem avaliadas neste estudo foram bem toleradas em primatas não humanos e atingiram níveis de expressão de SMN do neurônio motor da coluna vertebral suficientes para melhorar os déficits motores em um modelo de doença murina e, portanto, espera-se que sejam seguros em humanos. Além disso, as doses têm a possibilidade de oferecer um benefício aos participantes do estudo. Os três primeiros sujeitos elegíveis serão matriculados na Coorte 1. Após a administração de cada sujeito, há um período de observação de quatro semanas, durante o qual o comitê de segurança interno analisa os dados de segurança antes da administração do próximo sujeito. Se não forem observados gatilhos de revisão de segurança (SRTs) dentro do período de observação de quatro semanas para o terceiro participante da Coorte 1, todos os dados de segurança disponíveis serão avaliados por um Conselho de Monitoramento de Segurança de Dados (DSMB) antes de avançar para a matrícula na Coorte
2. Se nenhum SRT de segurança for observado, quatro semanas após
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127/177 a administração do terceiro participante da Coorte 2, todos os dados de segurança disponíveis serão avaliados por um DSMB antes de avançar para a inscrição dos três pacientes restantes na Coorte 2.
[00292] Os sujeitos são triados dos dias -35 a -1 antes da dosagem. Aqueles que atendem aos critérios de seleção são admitidos no hospital no dia da injeção (dia 1). Depois de receber uma injeção ICM de AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG, os sujeitos são monitorados como pacientes internados por 2 dias. Um local, acompanhamento ambulatorial e avaliações telefônicas ocorrem como pontos de tempo especificados para o restante do período de avaliação primária de 52 semanas.
[00293] A segurança e tolerabilidade do AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG são avaliados com base na incidência de AEs e SAEs, avaliações clínicas e laboratoriais, exame físico e sinais vitais. A imunogenicidade do produto vetorial e transgene também é avaliada.
[00294] As avaliações de eficácia incluem 6MWT, tempo de caminhada de 10 metros, escore RULM, 4 degraus, teste dos 9 pinos e buracos, medidas da função pulmonar, PedsQL (escala de fadiga), SMAFRS (escala funcional) e amplitude do CMAP ulnar e peroneal. A concentração de proteína SMN e outros biomarcadores exploratórios são avaliados no CSF.
[00295] Critérios de Inclusão • Ser homem ou mulher >18 anos de idade.
• Documentação genética da deleção ou mutação gênica homozigótica de 5q SMA ou mutação heterozigótica composta e pelo menos 2 cópias de SMN2 na triagem.
• História clínica de SMA tipo 3.
• Estar disposto e capaz de fornecer consentimento informado por escrito e assinado • Avaliação pela equipe interna de neuro intervencionistas e investigador
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128/177 principal do local de que o status anatômico e físico do sujeito não impediría a administração do produto sob investigação.
[00296] Sujeitos não ambulatoriais • Incapazes de andar >15 pés sem ajuda.
• Escore RULM de 5 a 30 na triagem.
Sujeitos Ambulatoriais • Ambulatorial (Capaz de caminhar > 15 pés sem ajuda).
• Capaz de executar com segurança 6MWT com uma distância de 6MW não superior a 530m.
[00297] Critérios de Exclusão • Ter uma contraindicação para uma injeção de ICM.
• Ter alguma contraindicação à punção lombar.
• Ter recebidotratamento com qualquer droga comercial ou de investigação ou agente biológico para SMA, incluindo histórico de terapia genética, tratamento prévio com ASO ou transplante de células (OR) Ter participado de qualquer outro estudo de investigação de droga ou de terapia nos três meses anteriores à triagem.
• Insuficiência respiratória, definida pela necessidade médica de ventilação invasiva ou não invasiva por > 8 horas durante um período de 24 horas na triagem.
• Doença concomitante que, de acordo com o investigador, interferiría na conduta e nas avaliações do estudo ou criaria riscos desnecessários para a transferência de genes.
• Ter um status anormal de coagulação (tempo de protrombina (PT) >
1,5 x normal, tempo parcial de tromboplastina (aPTT) > 1,5 x normal).
• Ter trombocitopenia (por exemplo, contagem de plaquetas <150) • Ter anormalidade hepática (bilirrubina> 1,5x ULN, ALT, AST, e fosfatase alcalina> 2,0x ULN).
• Ter hipertensão não controlada (pressão arterial sistólica [SBP]> 180 mmHg, pressão arterial diastólica [DBP]> 100 mmHg).
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129/177 • Possuir uma anormalidade no ECG clinicamente significativa que, na opinião do investigador, comprometería a segurança do sujeito.
• História de transplante de órgãos sólidos ou imunossupressão crônica.
• Ter uma condição médica ou psicológica grave ou instável que, na opinião do investigador, compromete a segurança do sujeito ou a participação bem-sucedida no estudo ou interpretação dos resultados do estudo.
• Uso de medicamentos destinados ao tratamento da SMA, incluindo riluzol, ácido valproico, hidroxiureia, fenilbutirato de sódio, derivados de butirato, creatina, carnitina, hormônio do crescimento, esteroides anabolizantes, probenecida, uso oral ou parenteral de corticosteroides na admissão, agentes esperados para aumentar ou diminuir a força muscular ou agentes com inibição conhecida ou presumida da histona desacetilase (HDAC), nos 30 dias anteriores à triagem. Os sujeitos que usam um nebulizador ou necessitam de um inalador de esteroides são permitidos no estudo; no entanto, o uso oral de esteroides é proibido. O uso oral de salbutamol é permitido com as seguintes restrições: os sujeitos deveríam ter estado em salbutamol por pelo menos 6 meses antes da inclusão no teste, com boa tolerância. A dose de salbutamol deve permanecer constante durante a duração do ensaio. O uso de beta-agonistas inalados (para o tratamento da crise de asma, por exemplo) é permitido.
Parâmetros Primários do Estudo [00298] Os parâmetros primários deste estudo são segurança e tolerabilidade do AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG por 52 semanas. Estes parâmetros serão avaliados com base na frequência de AEs e SAEs, e quaisquer alterações nos sinais vitais, exame físico ou avaliações laboratoriais clínicas consideradas clinicamente significativas ao longo de 52 semanas após a administração da droga em estudo.
Parâmetros do estudo secundário
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130/177 • Avaliar o impacto do AAVhu68.CB7.Cl.hSMNIco.rBG na função motora medida por sujeitos não ambulatoriais RULM • Os escores do RULM serão comparados aos escores da linha de base até 52 semanas após a administração da droga em estudo.
• Avaliar o impacto do AAVhu68.CB7.Cl.hSMNIco.rBG na função motora medida pelo teste de 6MWT e 10 metros de caminhada em sujeitos ambulatoriais • O tempo de caminhada no 6MWT e os 10 metros será comparado aos valores da linha de base até 52 semanas após a administração da droga no estudo.
[00299] Parâmetros Exploratórios • Avaliar o impacto do AAVhu68.CB7.Cl.hSMNIco.rBG na função motora medida pelo teste de 9 pinos e buracos (ambulatorial e não ambulatorial) e teste de subida de 4 degraus (somente ambulatorial) • O teste de 9 pinos e buracos e o teste de subida de 4 degraus serão comparados aos da linha de base até 52 semanas após a administração da droga.
• Avaliar o impacto do produto na função pulmonar medida pela capacidade vital forçada (FVC), pressão expiratória máxima (MEP), pressão inspiratória máxima (MIP) • Mudança da linha de base na ulnar e na amplitude do CMAP peroneal • Escala de fadiga multidimensional PedQLVersion 3.0, módulo de relatório adulto • SMA-FRS (escala de classificação funcional) • Farmacocinética do vetor no DNA e outros componentes da droga baseados em AAV no CSF, soro e urina
Exemplo 13 - Manufatura [00300] Um AAVhu68.O vetor SMN produzido por transfecção com plasmideo tripla de células HEK293 humanas com: 1) o plasmideo do
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131/177 genoma do vetor, 2) um plasmídeo auxiliar AAV denominado pAAVhu68.KanR contendo os genes AAV rep2 e cap hu68 de tipo selvagem (WT) e 3) um plasmídeo de adenovirus auxiliar denominado pAdAF6(Kan). O tamanho do AAVhu68.CB7.O genoma do vetor empacotado CI.hSMN1co.rBG é 3257bp.
1. Plasmídeos de Genoma de Vetor AAV:
pENN.AAV.CB7.CI.hSMNco.rBG.KanR (p4342) [00301] O plasmídeo do genoma do vetor AAV-hSMN1 pENN.AAV.CB7.0 CI.hSMN1co.rBG (p3246) tem 6077 pb em tamanho. O genoma do vector derivado deste plasmídeo é um genoma de DNA de cadeia simples com ITRs derivadas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão de hSMN1. A expressão do cassete de transgene é acionada por um promotor CB7, um híbrido entre um potenciador precoce imediato de CMV (C4) e o promotor de beta actina de galinha, enquanto a transcrição deste promotor é aumentada pela presença do Cl. O sinal poliA para o cassete de expressão é o poliA rBG. O plasmídeo foi construído por otimização do códon e sintetizando a sequência hSMN1 (GeneArt) e o construto resultante foi clonado no plasmídeo pENN.AAV.CB7.CI.rBG (p1044), um cassete de expressão flanqueado por ITR AAV2 contendo elementos de expressão CB7, Cl e rBG para dar pAAV.CB7.CI.hSMN1co.rBG (p3246). O plasmídeo KanR é pENN.AAV.CB7.CI.hSMN1co.rBG.KanR (p4342). Ο P4342 foi construído através da troca da estrutura principal resistente à ampicilina em pAAV.CB7.CI.hSMN1co.rBG (p3246) com a estrutura principal resistente à canamicina de pENN.AAV.TBG.PI.hLDLr.rBG.KanR (p2017) em dois locais Pad.
Descrição dos Elementos de Sequência:
• ITR: AAV ITRs (GenBank# NC001401) são sequências idênticas nas duas extremidades, mas em orientação oposta. As sequências de ITR de AAV2 funcionam tanto como origem da replicação do DNA do vetor
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132/177 quanto do sinal de empacotamento do genoma do vetor, quando as funções auxiliares do AAV e do adenovirus são fornecidas em trans. Como tai, as sequências ITR representam as únicas sequências cis necessárias para a replicação e empacotamento do genoma vectorial.
• Potenciador imediato do CMV (382 pb, GenBank# K03104.1).
• O promotor de β-actina de frango (282 pb; GenBank # X00182.1) é usado para conduzir uma expressão de hSMN1 de alto nível.
• Intron de beta-actina de frango: O intron de 973 pb do gene da beta actina de galinha (GenBank # X00182.1) está presente no cassete de expressão vetorial. O íntron é transcrito, mas removido do RNA mensageiro maduro (mRNA) por splicing, reunindo as sequências em ambos os lados do mesmo. A presença de um íntron em um cassete de expressão demonstrou facilitar o transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma, aumentando assim a acumulação do nivel estável de mRNA para tradução.
• Sequência de codificação: a sequência hSMN1: (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000344.3) foi otimizada por códon e sintetizada. A SMA é causada por mutações no gene telomérico SMN1. Mutações no SMN1 resultam em toxicidade seletiva para neurônios motores inferiores, levando à perda progressiva de neurônios e fraqueza e degeneração muscular associadas. O transgene é SMN1, isoforma D. A isoforma D codifica a isoforma mais longa e acredita-se que esta variante seja a transcriptase / isoforma predominante produzida por SMN1 tanto no CNS como ubiquamente.
• Sinal de Poliadenilação: O sinal de poliadenilação de beta-globina de coelho de 127 pb de coelho (GenBank # V00882.1) fornece sequências cis para poliadenilação eficiente do mRNA de anticorpo. Este elemento funciona como um sinal para a terminação de transcrição, um evento de divagem específico na extremidade 3' do transcrito nascente e adição de uma cauda longa de poliadenil.
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2. Plasmídeo auxiliar AAVhu68: pAAV2 / hu68n.KanR (p0068) [00302] O plasmídeo auxiliar AAV2 / hu68 pAAV2 / hu.68 (Lote # p0065; 7329 pb) é um plasmídeo auxiliar de AAV que codifica as proteínas rep AAV2 de 4 WT e as proteínas da capsídeo de 3 WT AAV VP do serotipo hu68 de AAV. Uma nova sequência de AAV foi obtida a partir do DNA do tecido cardíaco humano e designada sorotipo AAV hu68. Para criar o construto de empacotamento quimérico, o gene cap AAV2 do plasmídeo pAAV2 / 9n (p0061 -2), contendo os genes AAV2 rep e cap AAV9 do tipo selvagem foi removido e substituído pelo fragmento do plasmídeo pAAV2 / hu68 do gene AAVhu68 cap (p0065). O promotor p5 de AAV que normalmente conduz a expressão de rep é movido neste construto da extremidade 5' de rep para a extremidade 3' da tampa. Este arranjo serve para introduzir um espaçador entre o promotor e o gene rep (isto é, a estrutura do plasmídeo), regula para baixo a expressão de rep e aumenta a capacidade de suportar a produção de vetores. A estrutura principal plasmídica em pAAV2 / 9n é de pBluescript KS. Todas as partes componentes do plasmídeo foram verificadas por sequenciamento direto. O gene de resistência à ampicilina foi então substituído pelo gene de resistência à canamicina para dar pAAV2 / hu68n.KanR (p0068).
3. Plasmídeo auxiliar de adenovirus pAdDeltaF6 (Kan) [00303] O plasmídeo pAdDeltaF6 (Kan) tem 15.774 pb de tamanho. O plasmídeo contém as regiões do genoma do adenovirus que são importantes para a replicação do AAV, ou seja, os RNAs E2A, E4 e VA (as funções E1 do adenovirus são fornecidas pelas células 293), mas não contém outra replicação de adenovirus ou genes estruturais. O plasmídeo não contém os elementos cis críticos para a replicação, como as repetições terminais invertidas adenovirais e, portanto, não é esperado que nenhum adenovirus infeccioso seja gerado. Foi derivado de um clone molecular de Ad5 eliminado por E1, E3 (pBHG10, um plasmídeo
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134/177 baseado em pBR322). As deleções foram introduzidas no DNA de Ad5 para remover a expressão de genes de adenovirus desnecessários e reduzir a quantidade de DNA de adenovirus de 32 kb para 12 kb. Finalmente, o gene de resistência à ampicilina foi substituído pelo gene de resistência à canamicina para obter pAdeltaF6(Kan). Os genes adenovirais E2, E4 e VAI que permanecem neste plasmídeo, juntamente com E1, que está presente nas células HEK293, são necessários para a produção do vetor AAV.
4. Bancos de Células Principal [00304] As células HEK293 foram originalmente geradas por transformação de células HEK com DNA de adenovirus tipo 5 cortado tal como descrito por [Graham FL, et al., (1977) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36 (1): 59-74]. As células expressam os produtos dos genes E1A e E1B necessários para a produção de rAAV com alto título. As células HEK293 são aderentes e altamente transfectáveis, produzindo altos títulos de rAAV após a transfecção de plasmídeo de DNA. Os estoques de glicerol do banco principal de células bacterianas (BMCB) são obtidos por mistura de 1 mL de uma cultura bacteriana de 1 L durante a noite usada para amplificação de DNA de plasmídeo com um volume igual de glicerol estéril a 50%. Duas alíquotas de 0,5 mL dos estoques de glicerol BMCB por construto são preparadas a partir da mistura e armazenadas em frascos criogênicos Nalgene em -80°C. Para verificar as reservas de glicerol BMCB, o DNA plasmídico amplificado é submetido a análise de estrutura interna envolvendo digestão com enzima de restrição seguida de eletroforese em gel, e análise da sequência plasmídica completa por sequenciação Sanger na Qiagen. Para preparar alíquotas de estoque de glicerol do banco de células bacterianas de trabalho (BWCB) para remessa ao fabricante de DNA do plasmídeo (Puresyn Inc.), uma cultura de 3 mL é inoculada a partir de um estoque de
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135/177 glicerol da BMCB e cultivada durante a noite. Um mL da cultura da noite para o dia é usado para preparar alíquotas de estoque de glicerol BWCB como descrito acima.
5. Visão Geral do Processo de Fabricação [00305] O AAVhu68.CB7.O processo de produção vetorial de CI.hSMN1co.rBG é ilustrado no fluxograma do processo de fabricação da Figura 15A-15B. Os principais reagentes que entram na preparação do produto estão indicados no lado esquerdo do diagrama e as avaliações de qualidade no processo estão representadas no lado direito do diagrama. Também é fornecida uma descrição de cada etapa de produção e purificação. A fabricação do produto segue um fluxo linear de operações da unidade e utiliza sistemas de bioprocessamento descartáveis e fechados, a menos que especificado de outra forma. Todas as etapas do processo de produção envolvendo a cultura de células, desde a semeadura da célula até a coleta do sobrenadante, são realizadas de maneira asséptica usando conjuntos descartáveis de tubos e bolsas estéreis de uso único. As células são cultivadas em Corning 10-layer CelISTACKs® (CS-10) e HS-36 e todas as manipulações abertas. O processo de purificação é realizado em um sistema fechado sempre que possível; no entanto, as manipulações de cromatografia em coluna são consideradas operações sanitárias e não são vistas como um sistema completamente fechado.
6. Descrição do processo de fabricação
a. Semeadura Celular [00306] Uma linha de células HEK293 qualificada é usada para o processo de produção. Um WCB foi produzido nos Laboratórios Charles River a partir do MCB-2 descrito em 5.2.6 e será caracterizado na submissão do IND. A cultura de células utilizada para a produção vetorial será iniciada a partir de um único frasco WCB descongelado e expandida de acordo com um Documento de Registro de Lote Principal
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136/177 (MBR). Células são expandidas para 5 χ 109 a 5 χ 1O10 células usando frascos Corning T e CS-10, o que permite massa celular suficiente ser gerada para semeadura de até 48 HS-36 para produção de vetor por lote de BDS. As células serão cultivadas em meio composto por Meio Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) de origem norte-americana ou da Nova Zelândia, irradiado com radiação gama. As células são dependentes de ancoragem e a dissociação celular será realizada utilizando TrypLE™ Select, um reagente de dissociação de células sem produto animal. A semeadura de células será realizada usando sacos de bioprocesso descartáveis de uso único estéreis e conjuntos de tubos. As células serão mantidas a 37° C (± 2o C), em atmosfera de 5% (± 0,5%) de CO2
b. Transfecção Transiente [00307] Após aproximadamente 3 dias de crescimento (meio DMEM + 10% de FBS), 0 meio de cultura de células HS-36 será substituído por meio DMEM fresco e sem soro e transfectado com os 3 plasmídeos de produção usando um método de transfecção baseado em polietilenoimina otimizada (PEI). Um complexo de transfecção de plasmídeo de DNA suficiente será preparado no BSC para transfectar 48 HS-36 (por lote de BDS). Inicialmente, uma mistura de DNA / PEI será preparada contendo plasmídeo cis (genoma do vetor), plasmídeo trans (genes capsídeo e rep) e plasmídeo auxiliar (Ad) na proporção de 0,1:1:2 e PEI de grau GMP PEI (PEIPro, PolyPlus Transfection SA). Essa razão de plasmídeo foi determinada como sendo ideal para a produção de AAV em estudos de otimização de pequena escala. Depois de misturar bem, a solução será deixada em temperatura ambiente por 25 min, e depois será adicionada a meio isento de soro para extinguir a reação e depois finalmente adicionada a HS-36. A mistura de transfecção será equalizada entre todas as 36 camadas de HS-36 e as células serão incubadas a 37° C (± 2o C) em uma atmosfera de CO2 a 5% (± 0,5%) durante 5
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c. Colheita de Mídia Celular [00308] As células e meios transfectados serão colhidos de cada HS36 usando sacos de bioprocesso descartáveis, drenando assepticamente o meio para fora das unidades. Após a colheita do meio, aproximadamente 200 litros de volume serão suplementados com MgCk até uma concentração final de 2 mM (co-fator para Benzonase) e a nuclease de Benzonase será adicionada a uma concentração final de 25 unidades / mL. O produto (em uma bolsa descartável de bioprocesso) será incubado a 37°C por 2 horas em uma incubadora para fornecer tempo suficiente para a digestão enzimática de DNA residual celular e plasmidial presente na colheita como resultado do procedimento de transfecção. Esta etapa é realizada para minimizar a quantidade de DNA residual no vetor final DP. Após a incubação, o NaCI será adicionado a uma concentração final de 500 mM para auxiliar na recuperação do produto durante a filtração e a filtração do fluxo tangencial a jusante.
d. Clarificação [00309] Células e detritos celulares serão removidos do produto usando uma cápsula de filtro de profundidade (1,2 pm / 0,22 pm) conectada em série como uma tubulação estéril fechada e conjunto de sacos que é acionado por uma bomba peristáltica. A clarificação assegura que os filtros a jusante e as colunas de cromatografia serão protegidos da incrustação e a filtragem de redução de biocarga assegura que, no final do trem de filtragem, qualquer carga biológica potencialmente introduzida durante o processo de produção a montante será removida antes da purificação a jusante. O material coletado será passado através de um filtro de cápsula Sartorius Sartoguard PES (1,2 / 0,22 pm) (Sartorius Stedim Biotech Inc.).
e. Filtragem de Fluxo Tangencial de Grande Escala [00310] A redução de volume (10 vezes) do produto clarificado será
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138/177 obtida por Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF) usando um tubo de bioprocessamento fechado estéril, saco e conjunto de membrana personalizados. O princípio da TFF é fazer fluir uma solução sob pressão paralela a uma membrana de porosidade adequada (100 kDa). O diferencial de pressão aciona moléculas de menor tamanho através da membrana e efetivamente para o fluxo de resíduos, enquanto retém moléculas maiores que os poros da membrana. Recirculando a solução, o fluxo paralelo varre a superfície da membrana, impedindo a incrustação dos poros da membrana e a perda do produto através da ligação à membrana. Ao escolher um tamanho de poro de membrana apropriado e área de superfície, uma amostra líquida pode ser rapidamente reduzida em volume, enquanto retém e concentra a molécula desejada. A diafiltração em aplicações TFF envolve a adição de um novo tampão à amostra recirculante na mesma velocidade que o líquido está passando através da membrana e para o fluxo de resíduos. Com volumes crescentes de diafiltração, quantidades crescentes das pequenas moléculas são removidas da amostra recirculante. Isso resulta em uma purificação modesta do produto clarificado, mas também alcança uma troca de tampão compatível com a etapa subsequente de cromatografia em coluna de afinidade. Consequentemente, utilizamos uma membrana PES de 100 kDa para concentração que é então diafiltrada com um mínimo de 4 diavolumes de um tampão composto por Tris 20 mM, pH 7,5 e NaCI 400 mM. O produto diafiltrado será armazenado durante a noite a 4o C e depois clarificado com uma cápsula de filtro de profundidade de 1,2 pm / 0,22 pm para remover qualquer material precipitado.
f. Cromatografia de afinidade [00311 ] O produto diafiltrado será aplicado a uma resina de afinidade Poros TM Capture SelectTM AAV9 (Life Technologies) que captura com eficiência o sorotipo AAVhu68. Sob essas condições iônicas, um percentual significativo de DNA e proteínas celulares residuais flui através
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139/177 da coluna, ao mesmo tempo em que as partículas de AAV são capturas com eficiência. Após a aplicação, a coluna é tratada com 5 volumes de uma solução de benzonase com baixo sal (2500 U / mL de benzonase, Tris 20 mM pH 7,5 e NaCI 40 mM, 1,5 mM MgCL) para remover qualquer célula hospedeira restante e ácido nucleico plasmídico. A coluna é lavada para remover impurezas adicionais de alimentação seguido por uma eluição de pH baixo (NaCI 400 mM, citrato de sódio 20 mM; pH 2,5) que é imediatamente neutralizado por coleta em um volume de 1 / 10Q de um tampão de neutralização (Tris Propano, 200 mM, pH 10,2).
g. Cromatografia de Troca Aniônica [00312] Para obter uma redução adicional das impurezas em processo, incluindo partículas vazias de AAV, o pool de eluição PorosAAV9 é diluído 50 vezes (Bis Tris Propano 20 mM, Pluronic F68 0,001%, pH 10,2) para reduzir a força iônica e permitir a ligação a um CIMultus™ Matriz de monólito QA (Separações BIA). Após uma lavagem com pouco sal, o produto de vetor é eluído utilizando um gradiente salino linear de 60 CV NaCI (10-180 mM NaCI). Este gradiente de sal raso separa efetivamente partículas de capsídeo sem um genoma de vetor (partículas vazias) de partículas contendo genoma de vetor (partículas cheias) e resulta em uma preparação enriquecida para capsídeos completos. As frações serão coletadas em tubos contendo 1/100° volume de plurônico F68 a 0,1% e 1/27° volume de Bis Tris pH 6,3 para minimizar a ligação não específica aos tubos e a duração da exposição a pH alto, respectivamente. As frações de pico de partículas totais reunidas são diluídas 20 vezes em Bis Tris Propano 20 mM, Pluronic F68 a 0,001%, pH 10,2 e reaplicadas à mesma coluna, a qual foi limpa no local. O gradiente de sal NaC110-180 mM é reaplicado e as frações de pico de partículas completas apropriadas serão coletadas. A área do pico é avaliada e comparada com os dados anteriores para determinação do rendimento aproximado do vetor.
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h. Formulação final e filtração de redução de biocarga para fornecer o BDS [00313] O TFF é utilizado para obter a formulação final nas frações de troca aniônica combinada (AEX) com uma membrana de 100 kDa. Isto será conseguido por diafiltração do tampão de formulação final e concentrado para produzir o BDS a uma concentração alvo desejada. As amostras serão removidas para teste BDS (descrito na seção abaixo). O BDS é filtrado estéril (0,22 pm), armazenado em tubos de polipropileno estéreis e congelado a < -60°C em um local de quarentena até a liberação para o Preenchimento final.
i. Preenchimento Final [00314] A BDS congelada será descongelada, reunida e ajustada à concentração alvo (etapa de diluição ou concentração via TFF) utilizando o tampão de formulação final. O produto será então filtrado através de um filtro de 0,22 pm e envasado em frascos de cristal estéreis da West Pharmaceutical's Crystal Zenith (polímero) e tampas com selos de crimpagem em um volume de preenchimento a ser determinado. Os frascos serão etiquetados individualmente de acordo com as especificações abaixo. Os frascos etiquetados são armazenados a < -60°C.
j. Identidade do genoma vetorial: sequenciamento de DNA e NGS [00315] O DNA genômico do vetor viral será isolado e a sequência determinada pela cobertura de sequenciamento de duas vezes usando primer walking. O alinhamento da sequência é realizado e comparado com a sequência esperada. Em certas modalidades, o sequenciamento de próxima geração (também conhecido como sequenciamento de alto rendimento) é realizado, por exemplo, usando máquinas Illumina®.
k. Identidade de capsídeo do vetor: Espectrometria de massa de capsídeo AAV de VP1 [00316] A confirmação do sorotipo AAVhu68 do vetor é alcançada por um ensaio que foi desenvolvido com base na análise de peptídeos
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141/177 da proteína do capsídeo AAV. O método envolve a digestão com tripsina da VP seguida pela caracterização em espectrometria de massa em tandem em um espectrômetro de massa Q-Exactive Orbitrap para sequenciar os peptídeos da proteína do capsídeo. Uma biblioteca espectral dos espectros de massa em tandem sequenciados e um método de espectrometria de massa direcionada é usado para testar peptídeos de assinatura que podem identificar exclusivamente sorotipos específicos de partículas virais de AAV. Um banco de peptídeos específicos para oito AAVs (AAVhu68, AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrhl0, AAVhu37) são triados contra os espectros de massa em tandem produzidos por digestão do artigo de teste. Para uma identificação positiva, somente os peptídeos de assinatura de um único sorotipo serão detectados.
l. Título de Cópia Genômica [00317] Uma técnica de reação em cadeia de polimerase com base em gota digital (ddPCR) para determinar o título de GC para vetores de AAV foi desenvolvida recentemente [Lock M, Alvira MR, Chen SJ, & Wilson JM (2014) Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods 25(2):115-125.] O método é prático, relata títulos equivalentes ou melhores que o qPCR e não requer uma curva padrão de plasmídeo. O ensaio utilizado envolve a digestão com DNase I, seguido por análise de PCR digital para medir as cópias genéticas vetoriais encapsuladas. A detecção de DNA será realizada usando primers específicos para sequências direcionadas à região poliA em combinação com uma sonda fluorescente marcada, hibridizando para essa mesma região. Um número de padrões, amostras de validação e controles (para contaminação de fundo e DNA) foram introduzidos no ensaio.
m. Título de Unidade Infecciosa
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142/177 [00318] O ensaio de unidade infecciosa (IU) é utilizado para determinar a absorção e replicação produtivas do vetor rAAV em células RC32 (células HeLa que expressam rep2). Um formato de ponto final de 96 poços foi empregado semelhante ao publicado anteriormente. Resumidamente, as células RC32 são co-infectadas por diluições em série de rAAV BDS e uma diluição uniforme de Ad5 com 12 repetições a cada diluição de rAAV. Setenta e duas horas após a infecção, as células são lisadas e a qPCR realizada para detectar a amplificação do vetor rAAV sobre a entrada. Um cálculo de dose infecciosa de cultura de tecido a 50% (TCID50) de diluição de desfecho (Spearman-Karber) é realizado para determinar um título replicativo expresso como IU / mL. Uma vez que os valores de “infectividade” são dependentes do contato de partículas com as células, ligação ao receptor, internalização, transporte para o núcleo e replicação do genoma, elas são influenciadas pela geometria do ensaio e pela presença de receptores apropriados e vias de pós-ligação na linhagem celular usada. Os receptores e as vias de pósligação não são normalmente mantidos em linhagens celulares imortalizadas e, assim, os títulos do ensaio de infecciosidade não são uma medida absoluta do número de partículas “infecciosas” presentes. No entanto, a proporção de GC encapsidado para “unidades infecciosas” (descrita como razão GC / UI) pode ser usada como uma medida da consistência do produto de lote para lote.
n. Razão de partículas vazias/cheias [00319] A velocidade de sedimentação, medida em uma ultracentrífuga analítica (AUC), pode detectar agregados, outros componentes menores, além de fornecer boa quantificação de quantidades relativas de diferentes espécies de partículas com base em seus diferentes coeficientes de sedimentação. Este é um método absoluto baseado em unidades fundamentais de comprimento e tempo, não requerendo nenhuma molécula padrão como referência. As amostras de vetores são
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143/177 carregadas nas células com peças centrais de carvão epon de 2 canais com comprimento de caminho óptico de 12 mm. O tampão de diluição fornecido é carregado no canal de referência de cada célula. As células carregadas são então colocadas em um rotor analítico AN-60TÍ e carregadas em uma ultracentrífuga analítica Beckman-Coulter ProteomeLab XL-I equipada com detectores de absorvância e RI. Após o equilíbrio da temperatura total a 20°C, o rotor é levado à velocidade final de 12.000 rpm. A absorvância nas varreduras de 280 nm é registrada aproximadamente a cada 3 minutos por aproximadamente 5,5 horas (110 varreduras totais para cada amostra). Os dados brutos são analisados pelo método c(s) e implementados no programa de análise SEDFIT. As distribuições de tamanho resultantes são representadas graficamente e os picos integrados. Os valores percentuais associados a cada pico representam a fração da área do pico da área total sob todos os picos e são baseados nos dados brutos gerados a 280 nm; muitos laboratórios usam esses valores para calcular vazios: proporções de partículas completas. No entanto, como as partículas vazias e cheias têm coeficientes de extinção diferentes nesse comprimento de onda, os dados brutos podem ser ajustados de acordo. A razão entre os valores de pico de partículas vazias e de monômero completo antes e após o ajuste do coeficiente de extinção é usada para determinar a proporção de partículas vazias e completas e ambas as razões são registradas em certificados de análise.
o. DNA da célula hospedeira [00320] Um ensaio de qPCR é usado para detectar DNA 293 humano residual. Após a adição de um DNA não relevante, o DNA total (não relevante, vetor e genômica residual) é extraído de aproximadamente 1 mL de produto. O DNA da célula hospedeira é quantificado usando qPCR direcionado ao gene 18S rDNA. As quantidades de DNA detec
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144/177 tadas são normalizadas com base na recuperação do DNA não relevante cravado. Três tamanhos diferentes de amplicons são testados para estabelecer o espectro de tamanho do DNA residual da célula hospedeira.
p. Proteína da Célula Hospedeira [00321] Um ELISA é realizado para medir os níveis de proteínas celulares contaminantes do hospedeiro HEK293. O kit ELISA de Proteínas de células hospedeiras HEK293 de 2- geração da Cygnus Technologies é usado de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor.
q. Ensaio AAV Replicação-competente [00322] Uma amostra é analisada quanto à presença de replicantes competentes AAV2/hu68 (rcAAV) que possam potencialmente surgir durante o processo de produção. Um ensaio de 3 passagens foi desenvolvido consistindo em amplificação e passagem baseadas em células, seguida pela detecção de DNA de rcAAV por qPCR em tempo real (alvo de caphu68). O componente baseado em células consiste em inocular monocamadas de células HEK293 (P1) com diluições da amostra de teste e adenovirus humano do tipo selvagem tipo 5 (Ad5). A quantidade máxima do produto testado será de 1 χ 101° GC do produto vetor. Devido à presença de adenovirus, o rcAAV amplificará a cultura de células. Após 2 dias, um lisado celular é gerado e Ad5 inativado pelo calor. O lisado clarificado é então passado para um segundo ciclo de células (P2) para aumentar a sensibilidade (novamente na presença de Ad5). Após 2 dias, um lisado celular é gerado e Ad5 inativado pelo calor. O lisado clarificado é então passado para um terceiro ciclo de células (P3) para maximizar a sensibilidade (novamente na presença de Ad5). Após 2 dias, as células são lisadas para liberar DNA, o qual é então submetido a qPCR para detectar as sequências de tampa de AAVhu68. A amplificação de sequências de tampa de AAVu68 de um modo dependente de
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Ad5 indica a presença de rcAAV. O uso de um controle positivo substituto de AAV2/hu68 contendo os genes AAV2 rep e genes AAVhu68 cap permite determinar o limite de detecção (LOD) do ensaio a ser determinado (0,1, 1, 10, e 100 IU) e usando uma diluição serial de rAAV (1 x 1010, 1 x 109, 1 x 108, e 1 χ 107 GC) o nível aproximado de rcAAV presente na amostra de teste pode ser quantificado.
r. Potência In Vitro [00323] Para relacionar o título de qPCR GC à expressão gênica, é realizado um bioensaio in vitro. Resumidamente, as células são plaqueadas por poço em uma placa de 96 poços e são incubadas a 37°C / 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte, as células são infectadas com 0 vetor AAV diluído em série e são incubadas a 37 0 C /5% CO2 por dois dias. As células são então fixadas com paraformaldeído a 4%, seguidas de lavagens com PBS contendo Triton-100 a 0,1%, depois incubadas com tampão de bloqueio. Após 0 bloqueio, as células são incubadas com uma diluição de 1:200 do anticorpo primário (GenTex monoclonal a-Smn1, CAT # GTX60451), lavadas e incubadas com 1:500 a-camundongo-488 (Thermo Fisher). Antes da imagem, as células são tratadas com PBS contendo DAPI para visualizar os núcleos. As placas são gravadas usando 0 gerador de imagens de alto conteúdo Cell Insight Cx5 (Thermo Fisher). O método atual para captura de dados é rastrear 2.500 objetos (ou seja, células) por poço e usar um protocolo SpotID modificado para contar 0 número de corpos de Gêmeos de Cajal por núcleo. A formação do corpo de Gêmeos Nucleares de Cajal depende da proteína Smn1 funcional. O MOI do vetor de log é plotado no eixo x versus a leitura do instrumento no eixo y. A otimização do ensaio está em andamento.
s. Proteína total, Proteína Capsídica, Pureza Proteica e Proporção de Proteínas Capsídicas
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146/177 [00324] As amostras de vetor são primeiro quantificadas para proteína total contra uma curva padrão de proteína de albumina de soro bovino (BSA) usando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA). A determinação é feita misturando partes iguais da amostra com um reagente Micro-BCA fornecido no kit. O mesmo procedimento é aplicado às diluições de um Padrão BSA. As misturas são incubadas a 60 ° C e aabsorvância é medida a 562 nm. Uma curva padrão é gerada a partir da absorbância padrão das concentrações conhecidas usando um ajuste de 4 parâmetros. Amostras desconhecidas são quantificadas de acordo com a regressão de 4 Parâmetros. Para fornecer uma determinação semi-quantitativa de pureza de rAAV, as amostras serão normalizadas para o título do genoma e 5 χ 109 GC separados em gel de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) sob condições redutoras. O gel é então corado com o corante SYPRO Ruby. Quaisquer bandas de impurezas são quantificadas por densitometria. As bandas coradas que aparecem para além das 3 proteínas específicas de AAV VP1, VP2 e VP3 são consideradas impurezas proteicas. A percentagem de massa de impurezas, bem como o peso molecular aproximado das bandas contaminantes são relatados. Os géis SDSPAGE também serão usados para quantificar as proteínas VP1, VP2 e VP3 e determinar sua proporção.
t. Proteína BSA [00325] Este ensaio é realizado utilizando o kit ELISA de albumina bovina obtido na Bethyl Laboratories de acordo com o protocolo fornecido com o kit de ensaio.
u. Endonuclease Benzonase [00326] A benzonase é usada no processo de produção para degradar ácidos nucleicos para facilitar a purificação do vetor e, como tal, representa uma impureza do processo. Um ELISA comercial (Millipore) é
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147/177 usado para medir a concentração de benzonase residual. Como é provável que a quantidade de benzonase esteja em pequenas quantidades, é necessário realizar um ELISA com uma série de padrões que incluem concentrações <1 ng / mL.
v. Razão de GC para IU [00327] A relação GC/IU é uma medida da consistência do produto. O título de ddPCR (GC/mL) é dividido pela “unidade infecciosa (HJ/mL) para obter a razão GC/IU calculada.
w. Osmolaridade, pH e teste de aparência [00328] A osmolaridade e o pH são determinados de acordo com USP <785> e USP <791 >, respectivamente. A aparência do produto é determinada por inspeção visual quanto à transparência, cor e ausência / presença de partículas estranhas. O produto é inspecionado contra fundos brancos e pretos.
Exemplo 14 - Toxicidade grave em primatas e leitões não humanos após administração intravenosa em altas doses de um vetor AAV que expressa SMN humano [00329] Demonstrou-se que sorotipos de AAV neurotrópicos, como o AAV9, transduzem neurônios motores da coluna vertebral quando administrados por via intravenosa em altas doses. Esta observação conduziu à recente aplicação bem sucedida de administração intravenosa de AAV9 para tratar crianças com atrofia muscular espinal, uma deficiência hereditária da sobrevivência da proteína do neurônio motor (SMN) caracterizada pela morte seletiva de neurônios motores inferiores.
[00330] Para avaliar a eficiência da transdução de neurônios motores usando esta abordagem, três primatas não humanos juvenis (NHPs; 13 a 14 meses) e três leitões neonatais (7 a 30 dias) foram tratados com uma injeção intravenosa de um vetor de AAV que transportava um SMN humano transgene intimamente relacionado ao AAV sorotipo 9 (AAVhu68) carregando um cassete de expressão SMN humano em uma
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148/177 dose semelhante ao empregado no ensaio clínico SMA. Os animais foram avaliados quanto à transdução de neurônios motores espinhais, 14 bem como evidencia de toxicidade. Administração de 2 x 10 copias do genoma por quilograma de peso corporal resultou na transdução generalizada de neurônios motores espinhais em ambas as espécies. No entanto, toxicidade grave ocorreu em NHPs e leitões. Todos os três NHPs exibiram elevações marcadas das transaminases e um animal foi eutanizado 5 dias após a injeção com sinais clínicos e histológicos de insuficiência hepática aguda e choque. Também foi observada degeneração dos neurônios sensoriais dos gânglios da raiz dorsal (DRG), embora os NHPs não exibissem déficits sensoriais clinicamente aparentes. Não houve correlação entre os achados clínicos e as respostas das células T ao capsídeo do vetor ou ao produto transgênico nos NHPs. Os leitões não demonstraram evidência de toxicidade hepática, mas dentro de 14 dias da injeção do vetor, todos os três animais exibiram déficits proprioceptivos e ataxia, o que prejudicou profundamente a ambulação e necessitou de eutanásia. Esses achados clínicos se correlacionaram com lesões neuronais sensoriais DRG mais graves do que as observadas nos NHPs. Os achados do fígado e do neurônio sensorial nestas espécies parecem ser uma consequência direta da transdução do AAV independente de uma resposta imune ao produto do capsídeo ou do transgene. Estudos pré-clínicos e clínicos envolvendo alta exposição sistêmica aos vetores de AAV devem incluir monitoramento cuidadoso quanto a toxicidade semelhante.
A. Resultados:
1. Estudo sobre primatas não humanos:
[00331 ] Macacos rhesus de 13-14-meses de idade foram administrados com uma dose intravenosa (IV) de 2x1014 GC/kg vetor AAVhu68 expressando SMN humana sob o controle de um promotor de beta ac
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149/177 tina de galinha com um intensificador precoce imediato de citomegalovírus (Tabela 1).
Tabela 1. Macacos rhesus tratados com AAVhu68.CB7.hSMN1 incluído no exemplo 14
ID do ani- mal Idade (meses) Peso (Kg) Título de Linha de Base AAVhu68 nAb Dose Via de Administração
16C116 13 2,52 <1:5 2x1014GC/kg IV
16C176 14 2,22 <1:5 2x1014GC/kg IV
16C215 14 2,40 <1:5 2x1014GC/kg IV
00332] Todos os animais exibiram sinais vitais estáveis durante a infusão de vetor e se recuperaram sem intercorrências da anestesia. No dia 5 do estudo, o animal 16C176 tornou-se agudamente não responsive. O exame físico revelou membranas mucosas pálidas, uma diminuição aproximada de 15% no peso corporal a partir do momento da administração do vetor, hepatomegalia e uma onda de fluido abdominal palpável. As anormalidades no exame de sangue incluíram um volume de células empacotadas de 22%, glicose de <20mg / dl_, BUN de 75 mg / dL e creatinina de 2 mg / dl_. A condição deste animal diminuiu rapidamente e foi subsequentemente eutanizado. Uma necropsia completa foi realizada.
[00333] O sangue foi coletado no momento da eutanásia e realizado um painel químico sérico completo. Achados notáveis incluíram hipoproteinemia, enzimas hepáticas marcadamente elevadas (AST, ALT, GGTP, ALP), hiperbilirrubinemia, aumento do nitrogênio ureico no sangue (BUN), relação BUN / creatinina elevada, hiperfosfatemia, hipoglicemia, hipocalcemia, hipocloremia, hipocolesterolemia, hipertrigliceridemia e creatinina fosfoquinase elevada (CPK) (FIGs 16A-16E). Esses achados foram sugestivos de insuficiência hepática com insuficiência renal provavelmente secundária à hipoperfusão. A amostra coletada na necropsia foi severamente hemolisada e, portanto, não foram relatados hemograma completo (hemograma completo) e painel de coagulação.
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150/177 [00334] Na necropsia, a cavidade abdominal continha aproximadamente 44 mL de líquido serossanguíneo vermelho. A avaliação citológica do líquido abdominal foi consistente com o transudato com hemorragia aguda. O fígado estava difusamente aumentado, firme e manchado de marrom a vermelho, o que correspondia histologicamente a necrose e degeneração hepatocelular maciça, afetando -95% do parênquima hepático, restando apenas aglomerados raros de hepatócitos relativamente normais (FIGS 17A-17D). As regiões centrolobular a mediozonal estavam gravemente congestionadas com perda de hepatócitos, degeneração e necrose. Além disso, havia pequenos focos de fibrina que ocasionalmente formavam tampões nos sinusoides e preenchiam o lúmen das veias portais (trombos agudos de fibrina). A imunohistoquímica (IHC) para fibrinogênio confirmou a presença de tampões de fibrina sinusoidal. A coloração com fibrinogênio foi fortemente positiva nas regiões periportal a mediozonal, que foram as áreas de necrose hepatocelular ativa no parênquima hepático que permaneceram. A coloração com fibrinogênio frequentemente destacava os sinusoides nessas regiões. Os hepatócitos necróticos e os detritos associados também foram fortemente positivos.
[00335] O baço estava difusamente aumentado, firme e congestionado. A congestão foi confirmada histologicamente e os centros germinativos dentro da polpa branca foram depletados de linfócitos com detritos celulares extensos (linfocitólise) e tinham vênulas endoteliais proeminentes, ocasionalmente hialinizadas (HEV). Da mesma forma, o cortex do timo exibia linfocitólise leve com macrófagos proeminentes do corpo tingível. De maneira grosseira, os linfonodos mesentéricos estavam difusamente aumentados e congestionados. Histologicamente, os folículos exibiram depleção do centro germinativo com linfocitólise. Achados histológicos semelhantes foram observados em outros tecidos
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151/177 linfoides, incluindo outros linfonodos (submandibular, retal), tecido linfoide associado aos brônquios (BALT) no pulmão e tecido linfoide associado ao intestino (GALT) no cólon e no ceco. Os linfonodos associados ao reto, assumidos como linfonodos mesorretais, apresentavam eritrocitose sinusal subcapsular e medular, consistente com a drenagem de glóbulos vermelhos. Os achados histológicos nos folículos linfoides foram sugestivos de estresse sistêmico grave. Histologicamente, observou-se hemorragia aguda e edema no pulmão, adventícia da vesícula biliar, coração, tecido adiposo perirretal e subcutâneo próximo à glândula mamária. A mucosa superficial do intestino delgado, ceco e reto estava congestionada com hemorragia ocasional, bem como agregados superficiais de macrófagos carregados de hemossiderina. A presença de hemorragia e edema no pulmão, trato gastrointestinal e fígado são sugestivos de choque, pois são órgãos de choque conhecidos em primatas não humanos. Foi observada degeneração de células acinares no pâncreas, que também foi relatada em casos de choque em primatas não humanos (Khan, N.A., et al. Mitigation of septic shock in mice and rhesus monkeys by human chorionic gonadotrophin-related oligopeptides. Clinical and Experimental Immunology 160, 466-478 (2010).). Degeneração e necrose de células únicas adrenocorticais mínimas estavam presentes na zona fasciculada das glândulas adrenais, provavelmente também atribuíveis a doenças sistêmicas, tais como estresse sistêmico, isquemia, hemorragia e inflamação. Nenhum achado grosseiro ou histológico foi observado no cérebro, medula espinhal, nervos cranianos e nervos periféricos deste animal. Nenhum achado significante foi observado nos rins.
[00336] Os dois primatas restantes (16C116 e 16C215) foram clinicamente normais durante todo o estudo e necropsiados conforme planejado no dia 28. O exame de sangue realizado em momentos especíPetição 870190098644, de 02/10/2019, pág. 192/231
152/177 ficos ao longo do estudo revelou uma elevação dramática das transaminases no dia 5, que diminuiu no dia 7 e normalizou no dia 14 (FIGs 16A16E). Um dos dois primatas restantes exibiu trombocitopenia transitória (contagem de plaquetas 24.000 / pl_) no dia 5; as plaquetas não puderam ser quantificadas no outro animal devido à aglomeração, mas pareciam ser normais em número no esfregaço periférico. O exame de sangue não era digno de nota durante todo o estudo. No momento da necropsia, o fígado de um animal (16C116) estava manchado de marrom a vermelho com um padrão lobular acentuado; nenhuma outra anormalidade significativa foi observada em nenhum desses dois primatas.
[00337] Histologicamente, o fígado de ambos os primatas exibiu necrose hepatocelular única multifocal mínima, a qual foi mais proeminente na região periportal (FIG. 17A-17D). Adicionalmente, o animal 16C215 tinha agregados multifocais de hepatócitos dispostos irregularmente com basofilia citoplasmática, núcleos vesiculares e figuras mitóticas ocasionais, indicativas de regeneração. Esses aglomerados de hepatócitos geralmente envolviam áreas portais com infiltrados de células mononucleares intercaladas e fibroblastos em proliferação (fibroplasia). [00338] Achados histológicos nos dois primatas necropsiados terminais (16C215 e 16C116) foram observados no sistema nervoso, predominantemente na medula espinhal, nos gânglios trigêmeos e nos gânglios da raiz dorsal, bem como nos nervos periféricos, incluindo os nervos mediano, radial, ciático, tibial e nervos peroneais (FIGs 18A-18D, Tabelas 2-4). As lesões histológicas no sistema nervoso central e periférico eram muitas vezes variáveis, com gravidade diferente entre as seções de tecido dentro do mesmo segmento, bem como entre os segmentos da medula espinhal e nervos periféricos no mesmo animal. Os gânglios da raiz dorsal (DRG) exibiram degeneração do corpo celular neuronal mínima a leve, caracterizada por cromatólise central e infiltra
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153/177 dos de células mononucleares ao redor (satelitose) e infiltração de corpos celulares neuronais (neuronofagia). Com base na imuno-histoquimica (IHC), os infiltrados de células mononucleares foram compostos por células T CD3 positivas com poucas células B CD20 positivas. Nos dois primatas, os tratos da substância branca dorsal da medula espinhal cervical, torácica e lombar exibiram axonopatia bilateral de mínima a moderada, caracterizada por bainhas de mielina dilatadas com e sem mielomacrófagos, indicando degeneração axonal. Ocasionalmente, observou-se axonopatia mínima a acentuada nas raízes nervosas dorsais da medula espinhal. Os nervos periféricos (mediano, radial, ciático, peroneal e tibial) exibiram uma axonopatia semelhante que variou de leve a acentuada, juntamente com infiltrados de células mononucleares variáveis e fibrose periaxonal. Axonopatia periférica foi observada bilateralmente; no entanto, a gravidade variou entre as seções e até dentro de algumas seções nervosas.
Tabela 2. Incidência e gravidade da axonopatia nos tratos dorsais da substância branca da medula espinhal em primatas não humanos e leitões infantis que receberam AAVhu68 expressando SMN humano por via intravenosa. Excluindo-se o NHP necropsiado no dia 5, a incidência e a gravidade da axonopatia dorsal na medula espinhal foram relativamente semelhantes entre os NHPs e os leitões.
Espécie NHP infante Leitões
Número de animais avaliados por grupo 3 3
Número examinado 3 3
Medula espinhal, Cervical (C2)
Axonopatia, tratos dorsais da substância branca
Ausente Γ -
Grau 1 1 1
Grau 2 - 1
Grau 3 1 1
Medula Espinhal Torácica (T2)
Axonopatia, tratos dorsais da substância branca
Ausente Γ -
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Grau 1 1 1
Grau 2 1 2
Medula espinhal, Lombar (L2)
Axonopatia, tratos dorsais da substância branca
Ausente Γ -
Grau 1 1 2
Grau 2 - 1
Grau 3 1 -
* Denota o animal de necropsia não programado 16C176 (Dia 5)
Tabela 3. Incidência e gravidade da degeneração neuronal da raiz dorsal e gânglios do trigêmeo em primatas não humanos e leitões que receberam AAVhu68 expressando SMN humano por via intravenosa. Excluindo-se o NHP necropsiado no dia 5, a incidência de degeneração do corpo celular neuronal foi semelhante entre os NHPs e os leitões; no entanto, a severidade foi levemente aumentada nos leitões em comparação com os NHPs.
Espécie NHP infante Leitões
Número de animais avaliados por grupo 3 3
Gânglios da raiz dorsal, Cervical
Número examinado 3 3
Degeneração do corpo celular neuronal com infiltrado de células mononucleares
Ausente Γ -
Grau 1 2 -
Grau 2 - 1
Grau 4 - 2
Gânglios da raiz dorsal, Torácica
Número examinado 2 3
Degeneração do corpo celular neuronal com infiltrado de células mononucleares
Ausente - -
Grau 1 1 -
Grau 2 1 3
Gânglios da raiz dorsal, Lombar
Número examinado 3 3
Degeneração do corpo celular neuronal com infiltrado de células mononucleares
Ausente Γ -
Grau 1 1 -
Grau 2 1 1
Grau 3 - 2
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Gânglios trigêmeos
Número examinado 2 3
Degeneração do corpo celular neuronal com infiltrado de células mononucleares
Ausente - -
Grau 1 2 1
Grau 2 - 1
Grau 3 - 1
* Denota o animal de necropsia não programado 16C1 76 (Dia 5)
Tabela 4. Incidência e gravidade da axonopatia dos nervos periféricos em primatas não humanos e leitões infantis que receberam AAVhu68 expressando SMN humano por via intravenosa. Excluindo o NHP necropsiado no dia 5, a incidência da axonopatia periférica foi semelhante entre os NHPs e os leitões; no entanto, a severidade foi levemente aumentada nos NHPs em comparação com os leitões.
Espécie NHP infante Leitões
Número de animais avaliados por grupo 3 3
Número examinado 3 3
Nervo mediano
Axonopatia
Ausente Γ 1
Grau 1 - 1
Grau 2 1 1
Grau 3 1 -
Nervo peroneal
Axonopatia
Ausente Γ 2
Grau 1 - -
Grau 2 1 -
Grau 4 1 1
Nervo radial
Axonopatia
Ausente 2* 1
Grau 1 - 1
Grau 2 - 1
Grau 3 1 -
Nervo ciático
Axonopatia
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Ausente Γ 1
Grau 1 - 1
Grau 3 1 1
Grau 4 1 -
Nervo tibial
Axonopatia
Ausente Γ 1
Grau 1 - 1
Grau 3 1 1
Grau 4 1 -
* Denota o animal de necropsia não programado 16C176 (Dia 5) [00339] A análise da biodistribuição do vetor demonstrou a transferência de genes para todos os tecidos avaliados, incluindo o cérebro e a medula espinhal (FIG 19). Notavelmente os gânglios da raiz dorsal (DRG) foram fortemente direcionados com mais de 10 genomas vetoriais por célula em muitas amostras. Transdução hepática extremamente alta também foi evidente com mais de 1000 cópias do genoma do vetor (GC) por célula. As cópias do genoma do vetor foram detectadas em níveis mais elevados no animal necropsiado no dia 5 do que as necropsiadas no dia 28, sugerindo que alguns dos genomas do vetor detectados nos tecidos no início após a injeção não representam transdução estável.
[00340] A expressão de SMN foi avaliada por hibridação in-situ (FIGs 20A-20G). Houve uma expressão marcada de mRNA de SMN humano no fígado do animal necropsiado no dia 5, mas sem expressão detectável na medula espinhal ou cérebro. Os dois animais necropsiados 28 dias após a injeção do vetor exibiram expressão robusta de SMN nos neurônios motores espinhais, com aproximadamente 30-90% das células transduzidas em média em cada nível da medula espinhal avaliado. Havia também manchas dispersas de neurônios transduzidos e células ependimárias no cérebro.
[00341] As respostas das células T ao produto transgênico do capsídeo vetor e do SMN humano foram avaliadas pelo interferon gama ELIS
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POT (Tabela 5). Células mononucleares do sangue periférico foram coletadas para análise ELISPOT antes da administração do vetor e no momento da necropsia para todos os três animais. As células mononucleares também foram coletadas do fígado na necropsia. Todas as amostras exibiram uma resposta robusta de interferon gama a uma estimulação de controle positiva com PHA com a exceção de linfócitos de fígado coletados do animal 16C215, que não exibiram qualquer resposta à estimulação com PHA e foram excluídos da análise subsequente. Nenhuma resposta de células T ao capsídeo AAVhu68 ou hSMN foi detectável no ponto do tempo dos animais 16C176 ou 16C215. O animal 16C116 não exibiu resposta de células T em PBMCs em nenhum ponto no tempo, mas teve uma resposta de interferon gama detectável ao capsídeo vetorial e ao produto transgênico no momento da necropsia.
Tabela 5. Detecção de IFN gama ELISPOT das respostas das células T ao capsídeo AAVhu68 e ao transgene hSMN no sangue periférico e linfócitos hepáticos. As respostas de células T foram medidas contra peptídeos 15-meros sobrepostos agrupados compreendendo a sequência VP1 de AAVhu68 (3 conjuntos de peptídeos) ou a sequência de SMN humana (2 conjuntos de peptídeos). Os valores são expressos como unidades formadoras de ponto (SFU) por milhão de PBMCs. O asterisco indica uma resposta detectável de células T (> 50 SFU e 3 vezes maior que o controle não estimulado). Os linfócitos hepáticos isolados de 16C215 exibiram resposta inadequada à estimulação por PHA e foram excluídos da análise. PHA: fitohemaglutinina, TNTC: numerosa demais para contar.
AAVhu68 hSMN
ID do ani- mal Fonte de lin- fócitos Ponto de tempo Não estimulado PHA Conjunto A Conjunto B Conjunto C Conjunto A Conjunto B
16C116 Sangue periférico Linha de Base 8 TNTC 5 8 8 8 5
Sangue peri- férico Necropsia 3 TNTC 13 8 8 13 3
Fígado Necropsia 0 TNTC 28 40 80* 123* 48
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16C215 Sangue periférico Linha de Base 0 TNTC 30 13 8 23 15
Sangue periférico Necropsia 10 TNTC 8 23 18 13 18
16C176 Sangue periférico Linha de Base 25 TNTC 8 18 8 28 18
Sangue periférico Necropsia 13 1043 8 5 0 20 0
Fígado Necropsia 5 1023 5 5 0 3 0
2.Estudo de leitão [00342] Três microleitões de Yucatan foram administrados com uma dose intravenosa de 2x1014 GC/kg AAVhu68.hSMN a 7 (n=1; Leitão A) ou 30 (n=2; Leitões B e C) dias de idade (Tabela 6). Todos os animais se recuperaram sem intercorrências após a administração do vetor. No dia 14 do estudo após a administração do vetor, o Leitão A desenvolveu a ataxia do membro posterior. A ataxia foi caracterizada por uma marcha oscilante com articulações intermitentes e cruzamento dos membros posteriores. Quando os pés traseiros foram colocados na superfície dorsal, o leitão não conseguiu corrigir o posicionamento do casco (teste de colocação), indicando um déficit na propriocepção consciente. Esta ataxia progrediu para os membros anteriores ao longo de 6 horas. Este leitão também desenvolveu dispnéia, mas a auscultação de todos os campos pulmonares estava dentro dos limites normais. Dada a progressão dos sinais clínicos, o leitão foi sacrificado no dia 14 após a administração do vetor e uma necropsia completa foi realizada.
Tabela 6. Micro leitões de Yucatan tratados com AAVhu68.CB7.hSMN1 incluído neste estudo
ID do animal Idade (dias) Peso (Kg) Dose Via de Administração
Leitão A 7 1,56 2x1014 GC/kg IV
Leitão B 30 3,35 2x1014 GC/kg IV
Leitão C 30 4,30 2x1014 GC/kg IV
[00343] N o dia 13 após a administração do vetor, os leitões injetados
aos 30 dias de idade desenvolveram sinais neurológicos semelhantes, embora menos graves. Não foi observada dispnéia nestes animais. Os
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159/177 leitões foram sacrificados e uma necropsia completa foi realizada. [00344] Não foram observadas anormalidades macroscópicas significativas nos leitões de ambos os grupos etários. O leitão injetado com 7 dias de idade apresentava condições nutricionais razoáveis no momento da necropsia e apresentava história clínica de diarréia no dia 7 do estudo, que foi resolvido no dia 9 do estudo após o tratamento com ceftiofur intramuscular (IM). Os leitões injetados com 30 dias de idade estavam em condições nutricionais adequadas. Um hemograma (CBC) do sangue coletado antes da eutanásia no leitão injetado de 7 dias de idade (leitão A) revelou uma neutrofilia acentuada (22.468 / μΙ_; faixa de referência: 2.300-11.900 / μΙ). Nenhuma outra anormalidade significativa foi observada no exame de sangue. A neutrofilia provavelmente correspondia a evidências histológicas de broncopneumonia bacteriana. Não foram observadas anormalidades significativas no exame de sangue nos leitões injetados com 30 dias de idade.
[00345] Os gânglios da raiz dorsal cervical, torácica e lombar (DRG) de todos os animais exibiram degeneração do corpo celular neuronal leve a acentuada com infiltrados de células mononucleares (FIGs 21A21 D, Tabelas 2-4). As lesões histológicas de degeneração neuronal variaram de eosinofilia citoplasmática com glóbulos citoplasmáticos eosinofílicos brilhantes e cromatólise central para completar o apagamento com células mononucleares infiltrantes (neuronofagia). Lesões semelhantes, embora menos graves, foram observadas nos gânglios trigêmeos de todos os animais, variando de mínima a moderada. Em todos os leitões, os tratos da substância branca dorsal da medula espinhal cervical, torácica e lombar exibiram axonopatia de mínima a moderada, caracterizada por bainhas de mielina dilatadas com e sem mielomacrófagos, consistente com degeneração axonal. A incidência dessas lesões foi a mesma em todos os animais; no entanto, a gravidade diminuiu ligeiramente em um dos leitões injetados com 30 dias de idade (leitão C).
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160/177 [00346] Em 7 dias de idade, injete o leitão (leitão A), os nervos periféricos (mediano, radial, ciático, peroneal e tibial) continham uma axonopatia semelhante à medula espinhal que variava de leve a grave bilateralmente. Curiosamente, a axonopatia nos nervos periféricos dos membros posteriores (moderada a marcada) foi mais grave do que os membros anteriores (leve). Nos leitões injetados com 30 dias de idade, apenas 1 animal (leitão B) apresentou axonopatia periférica mínima na maioria dos nervos, exceto o nervo fibular. Os nervos periféricos do outro leitão injetado com 30 dias de idade (leitão C) eram histologicamente insignificantes. As lesões histológicas no sistema nervoso central e periférico eram muitas vezes variáveis, uma vez que a gravidade diferia entre e dentro das seções de tecido do mesmo animal, bem como entre diferentes segmentos da medula espinhal. Não foram observadas alterações histológicas no cérebro ou no fígado.
[00347] Em geral, a incidência e gravidade das lesões dos nervos periféricos diminuíram nos leitões injetados com 30 dias de idade, em comparação com o leitão injetado com 7 dias de idade, que coincidiu com os sinais neurológicos antemortem menos graves observados em animais mais velhos. Além disso, a gravidade das lesões na medula espinhal e a incidência de lesões nos nervos periféricos foram mais baixas em um dos leitões injetados com 30 dias de idade (leitão C) que também apresentavam os sinais neurológicos menos graves dos leitões em ambos os grupos etários.
[00348] Os genomas do vetor foram detectáveis em todos os tecidos analisados, incluindo cérebro e medula espinhal (FIG 22). A transferência de genes para DRG foi geralmente maior do que para a medula espinhal, muitas vezes com mais de 1 GC vector por genoma diploide do hospedeiro (dg). Os maiores números de cópias do genoma do vetor foram encontrados no fígado, com aproximadamente 200 GC/dg em amostras de fígado dos três animais. Não houve impacto aparente da
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161/177 idade na injeção da eficiência da transferência de genes para os tecidos avaliados.
[00349] A expressão do mRNA de SMN humano foi detectada por ISH em neurônios motores em toda a medula espinhal de todos os três animais (FIGS 23A-23). A maioria dos neurônios motores pareceu ser transduzida em todos os animais, sem diferença aparente na transdução entre os leitões de 7 e 30 dias de idade.
B. Discussão:
[00350] Neste exemplo, a administração intravenosa de um vetor AAV expressando SMN humana a uma dose elevada resultou em toxicidade inesperada em leitões e NHPs juvenis. Toxicidade hepática limitada a NHPs, enquanto degeneração neuronal sensitiva ocorreu em ambas as espécies. A transferência de genes aproximadamente 5 vezes menor para o fígado em leitões tratados com a mesma dose de vetor sugere que um menor tropismo hepático do AAV nessa espécie pode explicar a ausência da toxicidade hepática observada nos NHPs. Todos os três NHPs desenvolveram uma rápida elevação das enzimas hepáticas e bilirrubina após a administração do vetor. O animal com elevação mais acentuada das transaminases também exibiu evidência de coagulopatia, com extensa deposição de fibrina no fígado, hemorragia generalizada e hemoperitônio espontâneo aparente, embora estudos de coagulação não pudessem ser realizados no momento da necropsia, limitando a interpretação desses achados. A presença de deposição de fibrina no fígado associada a hemorragia generalizada foi sugestiva de coagulação intravascular disseminada (DIG). No entanto, a deposição de fibrina não foi observada fora do fígado, inconsistente com o verdadeiro DIC. Os resultados parecem semelhantes aos descritos na insuficiência hepática aguda causada pela toxicidade do acetaminofeno, caracterizada por rápida degeneração hepatocelular e apresentação de fator tecidual no fígado, o que leva à coagulação intra-hepática. Veja,
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162/177 por exemplo, Ganey, PE, et al. Role of the coagulation system in acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Hepatology 46, 1177-1186 (2007); Kerr, R. New insights into haemostasis in liver failure. Blood coagulation & fibrinolysis : an international journal in haemostasis and thrombosis 14 Suppl 1, S43-45 (2003); Payen, 0., Dachraoui, A., Pulce,
C. & Descotes, J. Prothrombin time prolongation in paracetamol poisoning: a relevant marker of hepatic failure? Human & experimental toxicology 22, 617-621 (2003); e James, L.P., Wells, E., Barba, RH & Farrar, H.C. Predictors of outcome after acetaminophen poisoning in children and adolescents. The Journal of pediatrics 140, 522-526 (2002). Isso geralmente está associado à coagulopatia, que pode estar relacionada ao consumo do fator de coagulação causado pela coagulação intra-hepática, à diminuição da síntese do fator de coagulação devido à insuficiência hepática ou a uma combinação destes. Ver Ganey et al, 2007 e Kerr, 2003, como citado acima. A trombocitopenia transitória em um animal no dia 5 também pode estar relacionada à coagulação intra-hepática. Outra explicação possível podería ser a ativação de uma resposta inflamatória sistêmica por AAV em altas doses, com ativação plaquetária, coagulação intravascular, choque e disfunção hepática como consequências secundárias. Investigações são realizadas para determinar se a lesão hepática é a causa inicial dessa cascata ou uma consequência secundária, pois tentativas de reduzir o tropismo hepático dos vetores de AAV podem ser benéficas no primeiro caso, mas não no segundo. Dados insuficientes estão disponíveis neste exemplo para distinguir essas possibilidades, e estudos adicionais estão sendo investigados para elucidar completamente a fisiopatologia da toxicidade hepática após alta exposição sistêmica aos vetores de AAV.
[00351] A degeneração de DRG após a administração de AAV não foi relatada, embora um forte tropismo para DRG tenha sido observado em alguns estudos. Ver, por exemplo, Gray, SJ, Kalburgi, SN, McCown,
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TJ & Samulski, R.J. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAVneutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene therapy 20, 450-459 (2013). As lesões observadas no presente exemplo consistiram na degeneração dos corpos celulares dos neurônios sensoriais DRG, bem como nos axônios centrais e periféricos destes. É provável que essas lesões apareçam mais de 5 dias após a transferência gênica, pois estavam ausentes no NHP sacrificado 5 dias após o tratamento, e os sinais clínicos foram apresentados pela primeira vez em leitões 13-14 dias após a administração do vetor. As lesões DRG foram levemente mais graves em porcos do que nos NHPs, enquanto a degeneração dos axônios sensoriais na medula espinhal e nos nervos periféricos foi semelhante ou até mais leve nos porcos em comparação aos NHPs, uma observação que pode ser explicada pelo ponto de tempo de necropsia anterior em os porcos que podem não ter permitido a degeneração de todos os axônios associados às células moribundas. Déficits sensitivos eram aparentes em porcos, mas não em NHPs, sugerindo que a extensão das lesões de DRG em NHPs caiu abaixo de um limiar no qual os sinais clínicos aparecem. O tipo de fibras sensoriais afetadas em ambas as espécies não foi caracterizado. Propriocepção parecia ser afetada com base nos déficits observados em leitões; o impacto sobre outras fibras sensoriais não foi claro e é ainda caracterizado em estudos posteriores.
[00352] As respostas das células T a um neo-antígeno são uma causa teórica de toxicidade em qualquer estudo que avalia a distribuição de um transgene humano xenogênico a um modelo animal, ou em estudos clínicos de terapia genética para doenças recessivas. Além disso, os peptídeos derivados do capsídeo apresentados de maneira cruzada no MHC classe I por células transduzidas foram identificados como alvos potenciais para respostas de células T citotóxicas após a transferência de genes mediada por AAV. Ver, por exemplo, Manno, CS, et al.
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Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med 12, 342-347 (2006); e Martino, A.T., et al. Engineered AAV vector minimizes in vivo targeting of transduced hepatocytes by capsid-specific CD8+ T cells. Blood 121,2224-2233 (2013). Este último mecanismo foi proposto para ser responsável pelas elevações das transaminases observadas em alguns ensaios clínicos de liberação sistêmica de AAV, e a administração de glicocorticoides para suprimir respostas de células T tem sido empregada para mitigar esse risco. Ver, por exemplo, Manno et al, 2006 como citado acima e George, LA, et al. Hemophilia B Gene Therapy with a High-Specific-Activity Factor IX Variant. New England Journal of Medicine 377, 2215-2227 (2017). Neste exemplo, as elevações de transaminase em NHPs pareciam não ter correlação com as respostas de células T ao produto de capsídeo ou transgene. As respostas das células T ao produto do capsídeo e do transgene foram detectadas em linfócitos coletados do fígado, mas não no sangue periférico de um animal, demonstrando que respostas podem ocorrer a ambos os antígenos, e que respostas mediadas no sangue periférico podem nem sempre refletir aquelas que ocorrem dentro do órgão alvo. No entanto, o animal com a toxicidade mais grave não teve resposta detectável de células T no sangue periférico ou linfócitos hepáticos, e outro animal exibindo elevação acentuada de transaminase não apresentou resposta de células T no sangue periférico. Além disso, o rápido início da toxicidade hepática (menos de 5 dias) não é consistente com a resposta das células T em um hospedeiro naive. O achado de toxicidade hepática na ausência de uma resposta de células T sugere que um mecanismo alternativo é responsável pela lesão hepática. As possibilidades podem incluir toxicidade causada pelo acúmulo maciço de capsídeo do vetor na via endossômica, indução da resposta a danos no DNA pela liberação de um
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165/177 grande número de genomas de vetores, toxicidade do produto transgênico expressa em níveis extremamente altos ou comprometimento da transcrição e tradução normais de genes do hospedeiro causados por altos níveis de expressão do transgene. Se essa toxicidade é específica para o transgene SMN pode ser facilmente testada em estudos pré-clínicos; avaliar as outras possibilidades requer uma pesquisa mais extensa. Foi observado que toxicidade hepática grave, anormalidades de coagulação, trombocitopenia e choque em um NHP adulto tratado com a mesma dose de um sorotipo diferente de AAV portador de um transgene de proteína verde fluorescente, demonstrando que esses achados não são exclusivos dos vetores AAVhu68 nem do transgene SMN (dados não mostrados). É importante ressaltar que, se houver mecanismos mediados não imunes de toxicidade hepática que ocorrem em humanos, os protocolos de administração de glicocorticoides atualmente sendo incorporados aos ensaios clínicos podem ser ineficazes para mitigar esse risco.
[00353] Uma questão crítica para o campo da terapia genética com AAV é se a toxicidade observada neste estudo se traduz em seres humanos e, se sim, quais modelos animais são suficientemente preditivos de toxicidade para permitir estudos de segurança pré-clínicos informativos. Alguns pacientes com SMA tratados com uma dose similar de um vetor AAV9 estreitamente relacionado exibiram acentuada toxicidade hepática, sugerindo que os achados hepáticos no presente estudo podem ser aplicáveis a humanos, e que os macacos podem ser um modelo preditivo. É mais difícil determinar se a toxicidade DRG observada neste exemplo se traduz em seres humanos. Os sintomas sensoriais não foram relatados no ensaio clínico da SMA, embora lesões subclínicas semelhantes às dos NHPs possam não ser observadas nas avaliações de rotina.
[00354] Os presentes achados levantam questões importantes sobre
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166/177 a segurança da administração sistêmica de vetores de AAV em doses extremamente altas. Os resultados mostrados neste exemplo suportam o potencial de AAV em altas doses para transduzir efetivamente célulasalvo críticas, como neurônios motores inferiores, mas demonstram que as doses necessárias podem estar associadas a uma toxicidade significativa. Um NHP adulto com uma dose 10 vezes menor de um vetor AAV9 foi tratado anteriormente e não foi observada transdução significativa de neurônio motor nem toxicidade, demonstrando que o índice terapêutico para os AAV sistêmicos que visam neurônios motores pode ser bastante estreito. Ver, por exemplo, Hinderer, C., et al. Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna. Molecular therapy. Methods & clinical development 1, 14051 (2014). Semelhante às elevações relatadas de transaminase no ensaio clínico SMA, os NHPs tratados com a mesma dose de vetor neste estudo exibiram variação interindividual na gravidade da toxicidade hepática, e 2/3 dos NHPs demonstraram transferência genética eficaz com apenas anormalidades laboratoriais assintomáticas. Isso sugere que o AAV sistêmico em altas doses pode ser seguro e eficaz em alguns pacientes, embora o índice terapêutico estreito e a gravidade dos achados em valores extremos possam significar que casos de toxicidade grave surgem à medida que um número maior de pacientes é tratado.
[00355] Estudos estão sob investigação para entender o mecanismo da toxicidade dos neurônios hepáticos e sensoriais observada neste exemplo, e a relevância de cada um para os humanos. Atualmente, experimentos com primatas não humanos podem ser informativos para avaliar a toxicidade hepática e neurológica associada à administração sistêmica de AAV em altas doses, e esses estudos devem ser realizados antes de avançar para a clínica. Em ensaios clínicos, a toxicidade hepática deve ser cuidadosamente avaliada, assim como os sintomas
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167/177 de neuropatia sensorial. Avaliações objetivas de toxicidade para neurônios sensoriais, incluindo potenciais evocados somatossensoriais e estudos de condução nervosa, também podem ser valiosos. Quando elevações de transaminase ou outros sinais de toxicidade são encontrados em ensaios clínicos com AAV, os pesquisadores devem manter um amplo diagnóstico diferencial, pois os mecanismos imunes e não imunes podem ser responsáveis.
C. Materiais e Métodos:
[00356] Procedimentos animais: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade da Pensilvânia. Para administração de vetor intravenoso, o vetor foi diluído em solução salina tamponada com fosfato estéril e infundido via veia safena (NHPs) ou veia da orelha (leitões) por 10 minutos. A eutanásia foi realizada com overdose de pentobarbital.
[00357] Histologia: Os tecidos foram fixados em formalina, embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina de acordo com os protocolos convencionais. O fibrinogênio IHC também foi realizado de acordo com métodos convencionais.
[00358] A hibridação in situ (ISH) foi realizada em tecidos embebidos em parafina fixados em formalina, não excedendo o tempo de fixação de 24 h, utilizando o Kit de Ensaio de Tecido ViewRNA ISH (Thermo Fisher), de acordo com o protocolo do fabricante. As sondas consistindo em pares de sondas em forma de Z foram sintetizadas pelo fabricante do kit. As sondas específicas para SMN humano otimizado para códons foram usadas sozinhas ou em combinação com sondas para CHAT de rhesus ou porco como marcadores para neurônios motores. As sondas SMN ligadas foram detectadas pela formação de precipitados Fast Red fotografados com um conjunto de filtros de rodamina. As sondas CHAT foram detectadas através de depósitos Fast Blue fotografados com um conjunto de filtros personalizado (AVR Optics, Rochester, NY) feito de
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168/177 acordo com as especificações do fabricante do kit. As seções foram contrastadas com DAPI para mostrar núcleos.
[00359] Produção vectorial: O vetor AAVhu68 foi produzido por transfecção tripla de células HEK293 aderentes. O vetor foi purificado do sobrenadante celular por cromatografia de afinidade usando uma resina POROS™ CaptureSelect™ AAV9, seguida por cromatografia de troca aniônica para remover capsídeos vazios e outras impurezas.
[00360] Biodistribuição vetorial: No momento da necropsia, os tecidos foram congelados em gelo seco para análise de biodistribuição vetorial. O DNA foi extraído e os genomas vetoriais quantificados por PCR TaqMan como descrito anteriormente. Ver, Wang, L, et al. Impact of pre-existing immunity on gene transfer to nonhuman primate liver with adeno-associated virus 8 vectors. Human gene therapy 22, 1389-1401 (2011).
[00361] ELISPOT: o interferon gama ELISPOT foi realizado como descrito anteriormente. Ver, Brantly, M.L., et al. Sustained transgene expression despite T lymphocyte responses in a clinical trial of rAAV1 -AAT gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 16363-16368 (2009). As bibliotecas de peptídeos SMN e AAVhu68 VP1 humano consistiam em peptídeos 15mer sobrepostos por 5 aminoácidos divididos em agrupamentos de 2 (SMN) ou 3 (AAVhu68).
[00362] Todos os documentos publicados citados nesta especificação são incorporados neste documento por referência, assim como o Pedido de Patente Provisório dos EUA NQ 62/618,437, depositado em 17 de janeiro de 2018, Pedido de Patente Provisório dos EUA NQ 62/515,902, depositado em 6 de junho de 2017 e Patente Provisória dos EUA Pedido nQ 62/464,756, depositado em 28 de fevereiro de 2017. De modo semelhante, as SEQ ID NOs que são referidas neste documento
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169/177 e que aparecem na listagem de sequências anexada (arquivo denominado 17-7988PCT_ST25.txt) são incorporadas por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, será apreciado que modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Tais modificações se destinam a permanecer dentro do escopo das reivindicações anexas.
(Listagem Sequencial de Texto Livre) [00363] As informações a seguir são fornecidas para sequências que contêm texto livre sob o identificador numérico <223>.
SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
1 <223> sequência manipulada que codifica a proteína D variante SMN humana <220> <221 > CDS <222> (1) .. (882)
2 <223> Construção sintética
4 <223> Transgene hSMN manipulado G2
5 <223> Transgene SMN manipulado G3
6 <223> Transgene SMN manipulado G4
7 <223> Sequência de codificação AAVhu68 vp1 <220> <221 > CDS <222> (1)..(2211) <223> AAVhu68 vp1
8 <223> Construção sintética
9 <223> Sequência de codificação AAVhu68 rep <220> <221 > CDS <222> (1)..(1866)
10 <223> Construto sintético
15 <223> AAV.CB7.Genoma do vetor Cl.hSMN <220> <221 > regisão de_repetição <222> (1)..(130) <223> AAV2- 5’ITR <220> <221 > promotor <222> (197)..(579) <223> Promotor IE de CMV <220> <221 > promotor <222> (582)..(863) <223> Promotor CB
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SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
<220> <221 > íntron <222> (958)..(1930) <223> Promotor IE de CMV <220> <221 > misc_feature <222> (1948) .. (2829) <220> sequência de codificação hSMN <221 > poliA_sinal <222> (2914) .. (3040) <220> <221 > repetir_região <222> (3129)..(3258) <223> AAV2- 3’ITR
16 <223> Sequência de aminoácidos codificada de AAV9 vp1 <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (1)..(137) <223> região exclusiva de vp1 codificada <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (1)..(736) <223> Sequência de aminoácidos codificada de vp1 <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (138)..(736) <223> sequência de aminoácidos codificada da proteína vp2 variante de emenda alternativa <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (203)..(736) <223> sequência de aminoácidos codificada da proteína vp3 da variante de emenda alternativa
17 <223> Sequência de aminoácidos codificada de AAVrhIO vp1
18 <223> Sequência de aminoácidos codificada de AAVhu31 vp1
19 <223> Sequência de aminoácidos codificada de AAVhu32 vp1
20 <223> Sequência de codificação AAVhu31 vp1
21 <223> Sequência de codificação AAVhu32 vp1
22 <223> Sequência de codificação AAV9 vp1
23 <223> Primário prm504
24 <223> Primário prm505
25 <223> AAV.CB7.Genoma do vetor Cl.hSMN <220> <221 > repetir_região <222> (1)..(130)
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SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
<223> 5’ITR <220> <221 > promotor <222> (198) .. (579) <223> Promotor IE de CMV <220> <221 > promotor <222> (582)..(862) <223> Promotor CB <220> <221 > TATA_sinal <222> (836)..(839) <220> <221 > íntron <222> (956)..(1928) <223> íntron de beta-actina de galinha <220> <221 > misc_característica <222> (1946)..(2827) <223> sequência de codificação hSMN <220> <221 > poliA_sinal <222> (2912)..(3038) <223> poliA de globina de coelho <220> <221 > repetir_região <222> (3127)..(3256) <223> 3’ITR
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SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
26 <223> hu68vp1 modificado <220> <221 > MISC_CARACTERÍSTICA <222> (23)..(23) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa pode ser D (asp, ácido aspártico) ou D. isomerizado. <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa pode ser D (asp, ácido aspártico) ou D. isomerizado. <220> <221 > misc_característica <222> (113)..(113) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (149)..(149) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado
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SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (149)..(149) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (247)..(247) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado (por exemplo, kinurenina). <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (253)..(253) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (259)..(259) <223> Xaa representa Q ou Q desamidado em ácido glutâmico (ácido alfa-glutâmico), ácido gama-glutâmico (Glu) ou uma mistura de ácido alfa e gama-glutâmico <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (270)..(270) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (297)..(297) &lt;223&gt; Xaa representa D (Asp, ácido aspártico) ou D a N amindado (Asn, asparagina) <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (304)..(304) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (306)..(306) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado (por exemplo, kinurenina). <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (314)..(314)
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SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
<223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (319)..(319) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (329)..(329) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (332)..(332) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (336)..(336) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (384)..(384) <223> Xaa pode ser D (asp, ácido aspártico) ou D. isomerizado. <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (404)..(404) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (409)..(409) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (436)..(436) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (452)..(452) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220>
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175/177
SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
<221 > MISC_FEATURE <222> (477)..(477) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (499)..(499) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (512)..(512) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (515)..(515) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (518)..(518) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (524)..(524) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (559)..(559) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (569)..(569) <223> Xaa pode ser T (Thr, treonina) ou T Fosforilada <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (586)..(586) <223> Xaa pode ser S (Ser, serina) ou S fosforilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (599)..(599) <223> Xaa representa Q ou Q desamidado em ácido glutâmico
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176/177
SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
(ácido alfa-glutâmico), ácido gama-glutâmico (Glu) ou uma mistura de ácido alfa e gama-glutâmico <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (605)..(605) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (619)..(619) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado (por exemplo, kinurenina). <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (628)..(628) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, IsoAsp ou Asp / IsoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (640)..(640) <223> Xaa pode ser M (Met, Metionina) ou M. oxidado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (651)..(651) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, IsoAsp ou Asp / IsoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (663)..(663) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, IsoAsp ou Asp / IsoAsp <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (666)..(666) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (689)..(689) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado <220> <221 > MISC_FEATURE <222> (693)..(693) <223> Xaa pode ser K (lis, lisina) ou K acetilado
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177/177
SEQ ID NO: (contendo texto livre) Texto Livre sob <223>
<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (695)..(695) <223> Xaa pode ser W (Trp, triptofano) ou W. oxidado
<220> <221 > MISC_FEATURE <222> (709)..(709) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp
<220> <221 > MISC_FEATURE &lt;222&gt; (735)..(735) <223> Xaa pode ser Asn ou desamidada em Asp, isoAsp ou Asp / isoAsp
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Claims (37)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vetor viral adenoassociado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende um capsídeo de AAVhu68 e pelo menos um cassete de expressão, em que o pelo menos um cassete de expressão compreende sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína SMN funcional e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão das sequências de SMN em uma célula hospedeira, em que o rAAV tem um capsídeo de AAVhu68 que compreende:
    uma população heterogênea de proteínas vp1 de AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp1 produzidas pela expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO:8, proteínas vp1 produzidas a partir da SEQ ID NO: 7, ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO:7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO:8, uma população heterogênea de proteínas vp2 de AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp2 produzidas pela expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO:8, proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO:7, ou proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica aos pelo menos nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO:7 que codificam a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO:8, uma população heterogênea de proteínas vp3 de AAVhu68 selecionadas dentre: vp3 produzidas pela expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO:8, proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos
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  2. 2/7 os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO:7, ou proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica aos pelo menos nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO:7 que codificam a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO:8.
    2. Vetor rAAV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína SMN codificada é uma proteína de isoforma D.
  3. 3. Vetor rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de isoforma D de SMN codificada tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Vetor rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica a isoforma D de SMN é selecionada do grupo consistindo em:
    (a) SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que compartilha pelo menos 70% de identidade com esta que codifica uma proteína SMN tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2;
    (b) SEQ ID NO: 4;
    (c) SEQ ID NO: 5, ou (d) SEQ ID NO: 6.
  5. 5. Vetor rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as sequências de controle de expressão compreendem um promotor.
  6. 6. Vetor rAAV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de β-actina de galinha (CB).
  7. 7. Vetor rAAV, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor CB7.
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    3/7
  8. 8. Vetor rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais dentre um potenciador, um íntron, uma sequência de Kozak, um poliA, um elemento regulador pós-transcricional.
  9. 9. Vetor AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV de um AAV diferente do AAV que fornece o capsídeo.
  10. 10. Vetor AAV, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as ITRs são de AAV2.
  11. 11. Vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de que compreende um capsídeo de AAV que tem empacotado nele um genoma do vetor compreendendo uma 5' ITR do AAV, um promotor CB7, um íntron, sequências de ácido nucleico da SEQ ID NO:1, um poliA, e uma sequência de repetição terminal invertida 3' do AAV.
  12. 12. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o genoma do vetor tem a sequência da SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 25.
  13. 13. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o AAV tem um capsídeo de AAVhu68 compreendendo: em que o capsídeo de AAVhu68 compreende:
    uma população heterogênea de proteínas vp1 de AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp1 produzidas pela expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO:8, proteínas vp1 produzidas a partir da SEQ ID NO: 7, ou proteínas vp1 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO:7 que codifica a sequência de aminoácidos prevista de 1 a 736 da SEQ ID NO:8,
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    4/7 uma população heterogênea de proteínas vp2 de AAVhu68 selecionadas dentre: proteínas vp2 produzidas pela expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO:8, proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO:7, ou proteínas vp2 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica aos pelo menos nucleotídeos 412 a 2211 da SEQ ID NO:7 que codificam a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 138 a 736 da SEQ ID NO:8, uma população heterogênea de proteínas vp3 de AAVhu68 selecionadas dentre: vp3 produzidas pela expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO:8, proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência compreendendo pelo menos os nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO:7, ou proteínas vp3 produzidas a partir de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 70% idêntica aos pelo menos nucleotídeos 607 a 2211 da SEQ ID NO:7 que codificam a sequência de aminoácidos prevista pelo menos de cerca dos aminoácidos 203 a 736 da SEQ ID NO:8.
  14. 14. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o AAVhu68 é distinguido ainda por ter uma valina na posição 157 e, opcionalmente, um ácido glutâmico na posição 67.
  15. 15. Vetor de vírus adenoassociado (AAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o AAV é útil para o tratamento da atrofia muscular espinhal em um paciente.
  16. 16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que
    Petição 870190098644, de 02/10/2019, pág. 222/231
    5/7 compreende um veículo, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitável e um vetor AAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
  17. 17. Método para tratamento da atrofia muscular espinhal em um sujeito, sendo o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a administração da composição, como definida na reivindicação 16, a um sujeito em necessidade da mesma.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada por via intratecal.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o referido sujeito é um mamífero.
  20. 20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido sujeito é um ser humano.
  21. 21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada em combinação com outra terapia.
  22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada em uma dosagem de cerca de 1x1010 GC/g de massa cerebral a cerca de 3x1014 GC/g de massa cerebral.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada em uma dosagem de cerca de 5x1013 GC.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada em uma dosagem de cerca de 1,85 x 1014GC.
  25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada mais de uma vez.
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    6/7
  26. 26. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou uma composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento da atrofia muscular espinhal, com o referido método compreendendo a administração da composição como definida na reivindicação 16, a um paciente em necessidade da mesma.
  27. 27. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV está em uma composição formulada para distribuição intratecal.
  28. 28. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é coadministrado em combinação com outra terapia.
  29. 29. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é administrado em uma dosagem de cerca de 1x101°GC/g de massa cerebral a cerca de 3x1014 GC/g de massa cerebral, ou cerca de 1,85 x 1014GC ou cerca de 5x1013 GC.
  30. 30. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é suspenso em uma solução aquosa com um pH de 7,2 a 7,8.
  31. 31. Uso, caracterizado pelo fato de ser de um rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou uma composição, como definida na reivindicação 16.
  32. 32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV está em uma composição formulada para distribuição intratecal.
  33. 33. Uso, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é coadministrado em combinação com outra terapia.
    Petição 870190098644, de 02/10/2019, pág. 224/231
    7/7
  34. 34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é administrado em uma dosagem de cerca de 1x1010 GC/g de massa cerebral a cerca de 3x1014GC/g de massa cerebral, ou cerca de 1,85 x 1014GC ou cerca de 5x1013GC.
  35. 35. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo fato de que o referido rAAV é suspenso em uma solução aquosa com um pH de 7,2 a 7,8.
  36. 36. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento da atrofia muscular espinhal em uma criança com idade inferior a 18 anos.
  37. 37. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento da atrofia muscular espinhal em um adulto.
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