PT2066791E - Terapia génica para esclerose lateral amiotrófica e outros distúrbios da medula espinal - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TERAPIA GENICA PARA ESCLEROSE LATERAL AMIOTROFICA E OUTROS DISTÚRBIOS DA MEDULA ESPINAL"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições para o tratamento de distúrbios afectando a função motora de um indivíduo e, em particular, função motora afectada por doença ou lesão do cérebro e/ou medula espinal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é um estado neurodegenerativo, progressivo, envolvendo a perda de grandes neurónios motores no cérebro e medula espinal. É caracterizada por fraqueza progressiva, atrofia e espasticidade, conduzindo a paralisia e insuficiência respiratória no espaço de cinco anos a seguir ao seu começo. A ALS familiar contribui para 10% de todos os casos de ALS; aproximadamente 25% destes casos são devido a mutações no gene de Cu/Zn superóxido dismutase (SOD1) [1]. Até à data, foram identificadas 109 mutações diferentes no gene de SOD1; estas abarcam todos os cinco exões [2] . Além de mutações muito raras nos genes para a cadeia de neurofilamento pesado (NFH), dinactina, gene da proteína 1 de ligação vesicular e o gene de ALSIN, SOD1 é o único lócus de susceptibilidade principal de ALS identificado. SOD1 é uma enzima principalmente citoplasmática que catalisa a desagregação de iões de superóxido 1 em oxigénio e peróxido de hidrogénio que, por sua vez, é degradado por glutationo peroxidase ou catalase para formar água. Várias linhas de evidência defendem que a proteina S0D1 mutante é neurotóxica através de uma função adquirida, adversa, que implica patologia oxidativa e agregação de proteina, com perturbações secundárias do metabolismo do glutamato, função mitocondrial, transporte axonal e homeostasia do cálcio [3]. Que a S0D1 mutante é tóxica, é fortemente suportado pela observação de que a expressão transgénica de elevados níveis de proteína SOD 1 mutante em murganhos produz um fenótipo de doença de neurónio motor, com idade de começo e duração de doença dependentes do número de cópia [4].

Até à data, poucas intervenções terapêuticas alteraram o fenótipo de neurónio motor nos murganhos de ALS transgénicos. Embora mais de 100 moléculas pequenas tenham sido testadas até à data, poucas tiveram sequer um benefício marginal (e. g., riluzole [5], celecoxib [6], arimoclomol [7]). Por contraste, algumas formas de terapia de proteína foram benéficas. Deste modo, o melhoramento na sobrevivência foi produzido pela administração do factor 1 de crescimento semelhante a insulina, de modo transgénico [8] ou através de distribuição de AAV2, por meio de injecção IM e subsequente transporte axonal retrógrado para nervos motores [9] . Duas outras proteínas que se mostraram terapeuticamente promissoras como agentes neuroprotectores são a eritropoietina [10] e o factor endotelial vascular (VEGF) [11, 12] . O último é de interesse, porque a análise genética implicou variantes hipomórficos no gene de VEGF como um factor de risco para a ALS [13]. Além disso, os murganhos que são desprovidos de elementos promotores responsivos a hipoxia desenvolvem uma doença de neurónio motor lentamente progressiva [14]. Subsequentemente, foi documentado que a distribuição lentiviral 2 de VEGF na medula espinal de murganhos de ALS retarda a morte [15]. Dois investigadores independentes referiram que a infusão de VEGF dentro do fluido cerebrospinal em murganhos [16] e ratos [17] de ALS também abranda o curso da doença. A terapia génica é uma modalidade de tratamento emergente para distúrbios afectando o sistema nervoso central (SNC). A terapia génica de SNC tem sido facilitada pelo desenvolvimento de vectores virais, capazes de infectarem eficazmente neurónios pós-mitóticos. 0 sistema nervoso central é composto pela medula espinal e pelo cérebro. A medula espinal conduz a informação sensorial do sistema nervoso periférico para o cérebro e conduz a informação motora do cérebro para diversos efectores. Para uma revisão de vectores virais para distribuição génica no sistema nervoso central, ver Davidson et al. (2003) Nature Rev. 4:353-364.

Os vectores de vírus adeno-associados (AAV) são considerados úteis para a terapia génica de SNC porque têm um perfil de toxicidade e imunogenicidade favorável, são capazes de transduzir células neuronais e são capazes de mediar expressão de logo prazo no SNC (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet. 8:148-154; Bartlett et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1181-1186; e Passini et al. (2002) J. Neurosci. 22:6 43 7-6 446).

Uma propriedade útil dos vectores de AAV reside na capacidade de alguns vectores de AAV sofrerem transporte retrógrado e/ou anterógrado em células neuronais. Os neurónios numa região de cérebro estão interligados por axónios a regiões de cérebro distais proporcionando, desse modo, um sistema de transporte para a distribuição de vector. Por exemplo, um vector de AAV pode ser administrado nas terminações axonais, ou na sua 3 proximidade, de neurónios. Os neurónios internalizam o vector de AAV e transportam-no, num modo retrógrado, ao longo do axónio para o corpo celular. Mostrou-se que propriedades semelhantes de adenovirus, HSV e vírus da pseudo-raiva distribuem genes para estruturas distais dentro do cérebro (Soudas et al. (2001) FASEB J. 15:2283-2285; Breakefield et al. (1991) New Biol. 3:203-218; e deFalco et al. (2001) Science, 291:2608-2613). Vários grupos referiram que a transdução do cérebro por serotipo 2 de AAV (AAV2) está limitada ao sítio de injecção intracraniana (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet. 8:148-154; Passini et al. (2002) J. Neurosci. 22:6437-6446; e Chamberlin et al. (1998) Brain Res. 793:169-175). Referências recentes sugerem que o transporte axonal retrógrado de vectores virais neurotróficos, incluindo vectores de AAV e lentivirais, também pode ocorrer em circuitos seleccionados do cérebro de rato normal (Kaspar et al. (2002) Mol. Ther. 5:50-56; Kasper et al. (2003) Science 301:839-842 e Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-417. Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11(4) :429-433 referem que a injecção intramuscular de ARN de interferência de superóxido dismutase Cu/Zn (SOD 1) humana de silenciamento de expressão em lentivírus retardou o começo de doença de esclerose lateral amiotrófica (ALS) num modelo de roedor terapeuticamente relevante de ALS.

As células transduzidas por vectores de AAV podem expressar um produto transgénico terapêutico, tais como uma enzima ou um factor neurotrófico, para mediar efeitos benéficos intracelularmente. Estas células também podem segregar o produto transgénico terapêutico, que pode ser subsequentemente absorvido por células distais, onde pode mediar os seus efeitos benéficos. 4

Este processo foi descrito como correcção cruzada (Neufeld et al. (1970) Science 169:141-146). Há uma necessidade na técnica para composições para tratar a disfunção da medula espinal que resulta em perda da função motora em doentes humanos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é o seguinte: 1. Um vector de vírus adeno-associado de pseudotipo 2/7 ou 2/8 codificando HIFl-alfa, para utilização num método de tratamento de um mamífero com um distúrbio de neurónio motor. 2. O vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a forma de realização 1, em que o pseudotipo do vector de vírus adeno-associado é 2/7. 3. O vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a forma de realização 1, em que o pseudotipo do vector de vírus adeno-associado é 2/8. 4. O vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 3, em que o vector se destina a ser injectado dentro da medula espinal do mamífero. 5. O vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a forma de realização 4, em que o vector se 5 destina a ser distribuído para dentro de uma pluralidade de sítios na medula espinal. 6. 0 vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 5, em que o vector codifica uma proteína de fusão de HIFl-alfa e VP16 de HSV. 7. 0 vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 5, em que o vector codifica uma proteína de fusão de HIFl-alfa e NFkB. 8. 0 vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com as formas de realização 7, em que a proteína de fusão é codificada por uma sequência nucleotídica como mostrada na SEQ ID N°: 1. 9. 0 vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 8, em que o mamífero tem um estado seleccionado do grupo consistindo em atrofia muscular bulbar espinal, ataxia cerebelosa espinal, atrofia muscular espinal e lesão traumática da medula espinal. 10. O vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 8, em que o mamífero tem esclerose lateral amiotrófica. 11. O Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com quaisquer formas de realização anteriores, em 6 que o mamífero é seleccionado do grupo consistindo num roedor, num murino, num humano e num símio. 12. 0 vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a forma de realização 11, em que o mamífero é um humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a distribuição de genoma de vector de medula espinal por meio de diferentes modos de distribuição e pseudotipos de vector. A Figura 2 mostra a distribuição de genoma de vector de cérebro por meio de diferentes modos de distribuição e pseudotipos de vector. A Figura 3 mostra o número de genomas de vector que foram distribuídos no músculo após injecção intramuscular dos vectores de AAV. A Figura 4 mostra a expressão génica de EPO, VEGF e IGF-1 após transdução do cérebro de um murganho com um vector de AAV codificando para HIF-lalfa NF-kB. A Figura 5 mostra uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier que demonstra um aumento estatisticamente significativo (p = 0,033) na sobrevivência de murganhos de ALS, após administração intra-espinal de AAV2/8 HiflaNF-kB (sobrevivência de 133 dias em murganhos de controlo vs 7 sobrevivência de 139 dias em murganhos tratados com Hit-1 alfa NF- kB). A Figura 6 mostra a hibridação in situ para Hif-1 alfa NF-κΒ nas medulas espinais de murganhos de ALS tratados com AAV2/8 Hifl aNFkB, sugere que a transdução se verificou, principalmente, na região lombar da medula espinal. Os animais 6817, 6715 e 6389 foram tratados com AAV2/8 Hifl aNFkB; o animal 1460 era um animal de controlo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De modo a que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, determinados termos são, em primeiro lugar, definidos. As definições adicionais são expostas em toda a descrição detalhada. A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e ADN recombinante, que estão dentro do estado da técnica. Ver, e. g., Sambrook, Fritsch e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edição (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M.

Ausubel, et al. eds., (1987)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc. ) : PCR 2: A PRACTICAL . APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor ed. (1995 ) ) , Harlow and Lane, ed. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL e ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Como utilizado na descrição e reivindicações, a forma singular "um", "uma" e "o" incluem referências no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.

Como aqui utilizado, o termo "compreendendo" pretende significar que as composições e métodos incluem os elementos enumerados, mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente em", quando utilizado para definir composições e métodos, deverá significar excluindo outros elementos de qualquer significância essencial para a combinação. Deste modo, uma composição consistindo essencialmente nos elementos, como aqui definido, não excluiria contaminantes vestigiais do método de isolamento e purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfatos, conservantes e semelhantes. "Consistindo em" deverá significar excluindo mais do que elementos vestigiais de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administração das composições desta invenção.

Todas as designações numéricas, e. g., pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo gamas, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 0,1. Deve ser compreendido, embora nem sempre explicitamente referido, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". Também deve ser compreendido, embora nem sempre explicitamente referido, que os reagentes aqui descritos são meramente exemplificativos e que os equivalentes desses são conhecidos na técnica. O termo "transgene" refere-se a um polinucleótido que é introduzido dentro de uma célula e é capaz de ser transcrito em ARN e, opcionalmente, traduzido e/ou expresso sob condições 9 apropriadas. Num aspecto, confere uma propriedade desejada a uma célula dentro da qual foi introduzido ou, de outro modo, conduz a um resultado terapêutico ou diagnóstico desejado.

Os termos "partículas de genoma (gp)", ou "equivalentes de genoma", como utilizados em referência a um título virai, referem-se ao número de viriões contendo o genoma de ADN de AAV recombinante, independentemente de infecciosidade ou funcionalidade. 0 número de partículas de genoma numa preparação de vector particular pode ser medido por processos, tal como descritos nos presentes Exemplos ou, por exemplo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa" ou "unidade de replicação", como utilizados em referência a um título virai, referem-se ao número de partículas de vector de AAV recombinantes infecciosas e competentes para replicação, como medido pelo ensaio de centro infeccioso, também conhecido como ensaio de centro de replicação, como descrito, por exemplo, em McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62 :1963-1973. O termo "unidade de transdução (tu)", como utilizado em referência a um título virai, refere-se ao número de partículas de vector de AAV recombinantes infecciosas que resulta na produção de um produto transgénico funcional, como medido em ensaios funcionais, tal como descritos nos presentes Exemplos ou, por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; ou em Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensaio de LFU) . 10

Os termos "terapêutico", "quantidade terapeuticamente eficaz" e seus cognatos referem-se à quantidade de um ARN, ADN ou produto de expressão de ADN e/ou ARN que resulta na prevenção ou atraso do começo ou melhoramento de sintomas num indivíduo ou uma realização de um resultado biológico desejado, tal como a correcção de neuropatologia, e. g., patologia celular associada a doença neuronal motora, tal como ALS. 0 termo "correcção terapêutica" refere-se ao grau de correcção que resulta em prevenção ou atraso do começo ou melhoramento de sintomas num indivíduo. A quantidade eficaz pode ser determinada por métodos empíricos conhecidos.

Também se pretende que uma "composição" abranja uma combinação de agente activo e outro veículo, e. g., composto ou composição, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou activo, tal como um adjuvante, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou semelhantes. Os veículos também incluem excipientes farmacêuticos e proteínas de aditivos, péptidos, aminoácidos, lípidos e hidratos de carbono (e. g., açúcares, incluindo monossacáridos, di-, tri-, tetra- e oligossacáridos; açúcares derivatizados, tais como alditóis, ácidos aldónicos , açúcares esterifiçados e semelhantes; e polissacáridos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, compreendendo 1-99,99%, isoladamente ou em combinação, em peso ou volume. Excipientes de proteína exemplificativos incluem albumina sérica, tais como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Componentes de aminoácido/anticorpo representativos, que também podem funcionar numa capacidade de tamponização, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, 11 cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e semelhantes. Excipientes de hidratos de carbono também se pretendem dentro do âmbito desta invenção, cujos exemplos incluem mas não estão limitados a monossacáridos, tais como frutose, maltose, galactose, glucose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacáridos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes; polissacáridos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e semelhantes; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol. 0 termo veículo inclui, ainda, um tampão ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de um ácido ou base orgânico. Os tampões representativos incluem sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfatos. Veículos adicionais incluem excipientes/aditivos poliméricos, tais como polivinilpirrolidonas, ficóis (um açúcar polimérico), dextratos (e. g. , ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-.quadratura.-ciclodextrina), polietilenoglicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, surfactantes (e. g., polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lípidos (e. g., fosfolípidos, ácidos gordos), esteróides (e. g., colesterol) e agentes quelantes (e. g., EDTA) .

Como aqui utilizado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" abrange quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfatos, água e emulsões, tais como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo e 12 diversos tipos de agentes molhantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes e quaisquer dos veículos notados acima, com a disposição adicional de que sejam aceitáveis para utilização in vivo. Para exemplos de veículos, estabilizantes e adjuvantes, ver Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 15a Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975) e Williams & Williams, (1995) e no "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 52a ed., Medicai Economics, Montvale, N.J. (1998).

Um "indivíduo", "pessoa" ou "doente" é aqui utilizado com o mesmo significado, que se refere a um vertebrado, de um modo preferido um mamífero, de um modo mais preferido um humano. Os mamíferos incluem mas não estão limitados a murinos, ratos, símios, humanos, animais de criação, animais desportivos e animais de estimação.

Um "controlo" é um indivíduo ou amostra alternativo utilizado numa experiência para efeitos de comparação. Um controlo pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, onde o objectivo da experiência seja determinar uma correlação de um nível de expressão alterado de um gene com um tipo particular de patologia (ver ALS, por exemplo, infra) é, em geral, preferido utilizar um controlo positivo (um indivíduo ou uma amostra de um indivíduo transportando essa alteração e exibindo sintomas característicos dessa doença) e um controlo negativo (um indivíduo ou uma amostra de um indivíduo desprovido da expressão alterada e sintoma clínico dessa doença). "Expresso de modo diferencial", como aplicado a um gene, refere-se à produção diferencial do ARNm transcrito a partir do gene ou o produto de proteína codificado pelo gene. Um gene expresso de modo diferencial pode ser superexpresso ou 13 subexpresso, em comparação com o nível de expressão de uma célula normal ou de controlo. Num aspecto, refere-se a um diferencial que é, pelo menos, 1,5 vezes ou, pelo menos, 2,5 vezes ou, alternativamente, pelo menos, 5 vezes ou, alternativamente, pelo menos, 10 vezes superior ou inferior ao nível de expressão detectado numa amostra de controlo. O termo "expresso de modo diferencial " também se refere a sequências nucleotídicas numa célula ou tecido que são expressas onde silenciosas numa célula de controlo ou não expressas onde expressas numa célula de controlo.

Como aqui utilizado, o termo "modular" significa variar a quantidade ou intensidade de um efeito ou resultado, e. g., para melhorar, aumentar, diminuir ou reduzir.

Como aqui utilizado, o termo "melhorar" é sinónimo de "aliviar" e significa reduzir ou aligeirar. Por exemplo, podem melhorar-se os sintomas de uma doença ou distúrbio tornando-os mais suportáveis.

Onde a transferência génica seja mediada pode um vector virai de ADN, tal como um adenovírus (Ad) ou vírus adeno-associado (AAV), uma construção de vector refere-se ao polinucleótido compreendendo o genoma virai ou sua parte e um transgene. Os adenovírus (Ad) são um grupo homogéneo, relativamente bem caracterizado, de vírus incluindo acima de 50 serotipos. Ver, e. g., Pedido PCT Internacional N° WO 95/27071. Os Ad são fáceis de cultivar e não requerem integração dentro do genoma da célula hospedeira. Vectores derivados de Ad recombinantes, particularmente os que reduzem o potencial para recombinação e geração de vírus de tipo selvagem, também foram construídos. Ver os Pedidos PCT Internacionais N° WO 95/00655 e 14 WO 95/11984. O AAV de tipo selvagem tem elevada infecciosidade e especificidade a integrar-se dentro do genoma da célula hospedeira. Ver, Hermonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6466-6470 e Lebkowski, et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996. A HIF-1 é uma proteína heterodimérica composta por duas subunidades: (i) uma subunidade beta (β) expressa constitutivamente (partilhada por outros factores de transcrição relacionados) e (ii) uma subunidade alfa (a) (ver, e. g. , o documento WO 96/39426, descrevendo a purificação de afinidade e clonagem molecular de HIF-Ια), cuja acumulação é regulada por um mecanismo pós-traducional, de modo a que elevados níveis da subunidade alfa possam ser apenas detectados durante condições hipóxicas. Ambas as subunidades são membros da família de PAS de hélice-gancho-hélice básica (bHLH) de factores de transcrição. Estes domínios regulam a ligação de ADN e dimerização. Pensa-se que o domínio de transactivação resida na terminação C da proteína. A HIF-1 está envolvida na regulação de um número genes alvo (ver, e. g., Bracken et al., Cell. Mol. Life Sei. 60 (2003) 1376-1393 para uma revisão de factores indutíveis por hipoxia). Entre os genes alvo para HIF-1 estão VEGF e eritropoietina.

Para estabilizar a proteína de factor indutível por hipoxia sob condições normóxicas e para proporcionar activação transcricional forte, constitutiva, uma proteína de fusão híbrida/quimérica, consistindo nos domínios de ligação de ADN e dimerização de HIF-Ια a, na terminação amino, e um domínio activador transcricional funcional de uma proteína activadora transcricional, na terminação carboxilo, pode ser utilizada no 15 contexto da presente invenção. Para criar esta proteína de fusão, o domínio de transactivação endógeno de HIF-Ια é substituído por um domínio de transactivação heterólogo. Numa forma de realização, o domínio de transactivação é da proteína VP16 do Vírus Herpes Simplex (HSV) . Esta é aqui designada uma construção HIF 1 alfa-VP 16 ou construção de fusão. Noutra forma de realização, o domínio de transactivação é o domínio de transactivação NF-κΒ, que pode ser o domínio de transactivação NF-κΒ humano. Esta é aqui designada uma construção HIFlalfa-NFxB ou construção de fusão. Pode ser utilizada qualquer sequência codificante de HIFl-alfa de mamífero. 0 domínio de transactivação heterólogo também pode ser um dos factores de transcrição de levedura, tais como GAL4 e GCN4. As construções HIF-Ια compreendendo sequências codificantes humanas podem ser utilizadas, de modo vantajoso, para a distribuição a humanos. A hipoxia (um estado no qual a procura de O2 tecidular ou celular excede a oferta) é um poderoso modulador da expressão génica. A resposta fisiológica à hipoxia envolve eritropoiese melhorada (Jelkman, Physiol. Rev. 72:449-489 (1992)), neovascularização em tecidos isquémicos (White et al., Circ. Res. 71:1490-1500 (1992)) e uma mudança para metabolismo baseado na glicólise (Wolfe et al., Eur. J. Biochem. 135:405-412 (1983)). Estas respostas adaptativas aumentam a distribuição de O2 ou activam vias metabólicas alternativas que não requerem 02. Os produtos génicos envolvidos nestes processos incluem, por exemplo: (i) EPO, codificando eritropoietina, o regulador primário da eritropoiese e, deste modo, um determinante principal da capacidade de transporte de 02 pelo sangue (Jiang et al., J. Biol. Chem. 271(30):17771-78 (1996)); (ii) VEGF, codificando o factor de crescimento endotelial vascular, um regulador primário da angiogénese e, deste modo, um determinante 16 principal de perfusão tecidular (Levy et al., J. Biol. Chem. 270:13333 (1995); Liu et al., Circ. Res. 77:638 (1995); Forsythe et al., Mol. Ce 11. Biol. 16:4604 (1996)); (iii) ALDA, ENOl, LDHA, PFKL e PGKl, codificando as enzimas glicoliticas aldolase A, enolase 1, lactato desidrogenase A, fosfofrutocinase L e fosfoglicerato cinase 1, respectivamente, que proporcionam uma via metabólica para geração de ATP na ausência de O2 (Firth et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA 91:6496 (1994); Firth et al., J. Biol. Chem. 270:21021 (1995); Semenza et al., J. Biol. Chem. 269:23757 (1994)); e (iv) HOl e iNOS, codificando heme oxigenase 1 e sintase de óxido nítrico indutível, que são responsáveis pela síntese das moléculas vasoactivas monóxido de carbono e óxido nítrico, respectivamente (Lee et al., J. Biol. Chem. 272:5375; Melillo et al. J. Exp. Med. 182:1683 (1995)).

Um mediador importante destas respostas é a interaeção de um complexo transcricional, compreendendo uma proteína de factor indutível por hipoxia de ligação de ADN, com o seu sítio de reconhecimento de ADN cognato, um elemento responsivo a hipoxia (HRE), localizado dentro dos elementos promotores/estimuladores de genes indutíveis por hipoxia. Os HRE consistem num sítio de ligação de proteína de factor indutível por hipoxia (que contém a sequência nuclear 5'-CGTG-3'), assim como sequências de ADN adicionais que são requeridas para função que, em alguns elementos, incluem um segundo sítio de ligação.

Numa forma de realização, a HIF-Ια é, e. g., HIF-la humana. Noutra forma de realização, o domínio de ligação de ADN de HIF-Ια compreende os aminoácidos 1-390 de HIF-Ια humana. É feita divulgação que o domínio de proteína capaz de activação transcricional não é derivado de uma proteína de 17 factor indutível por hipoxia. Noutra forma de realização, o domínio de proteína capaz de activação transcricional é derivado de uma proteína seleccionada do grupo consistindo em: VP16 de HSV; NFQ3; um factor de choque térmico; p53; fos; v-jun; factor EF-C; tat de VIH; E2 de HPV; Ela de Ad; Spl; AP1; CTF/NF 1; E2F 1; HAP 1; HAP2; MCM1; PH02; GAL4; GCN4; e GAL11.

Numa forma de realização, o domínio de proteína capaz de activação transcricional é sintético. Noutra forma de realização, a proteína de factor indutível por hipoxia é HIF-la (e. g., HIF-la humana) e o domínio de proteína capaz de activação transcricional é um domínio de activação transcricional de VP16 de HSV. Ainda noutra forma de realização, a proteína de factor indutível por hipoxia é HIF-la (e. g., HIF-la humana) e o domínio de proteína capaz de activação transcricional é um domínio de activação transcricional de NFQ3. A presente descrição divulga um método de tratamento de um distúrbio neurodegenerativo num indivíduo, incluindo ALS, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína transactivadora quimérica biologicamente activa, compreendendo o domínio de ligação de ADN de uma proteína de factor indutível por hipoxia e um domínio de proteína capaz de activação transcricional.

Na divulgação feita, a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína transactivadora quimérica biologicamente activa compreende o domínio de ligação de ADN de uma proteína de factor indutível por hipoxia (HIF) e um domínio de proteína capaz de activação transcricional. 18 A HIF-1 é uma proteína heterodimérica composta por duas subunidades: (i) uma subunidade beta (β) expressa constitutivamente, também conhecida por translocador nuclear de hidrocarboneto de arilo (ARNT) (que é partilhada por outros factores de transcrição relacionados (e. g. , o receptor de hidrocarboneto de dioxina/arilo (DR/AhR)); e (ii) uma subunidade alfa (a) (ver, e. g. , o documento WO 96/39426, Pedido Internacional N° PCT/US96/10251, descrevendo a recente purificação de afinidade e clonagem molecular de HIF-Ια), cuja acumulação é regulada por um mecanismo pós-traducional, de modo a que elevados níveis da subunidade alfa possam ser apenas detectados durante condições hipóxicas. Ambas as subunidades são membros da família de PAS de hélice-gancho-hélice básica (bHLH) de factores de transcrição. Estes domínios regulam a ligação de ADN e dimerização. 0 domínio de transactivação reside na terminação C da proteína. A região básica consiste em, aproximadamente, 15 aminoácidos predominantemente básicos, responsáveis por ligação de ADN directa. Esta região é adjacente a duas hélices oí anfifílicas, separadas por um gancho de comprimento variável, que forma a interface de dimerização primária entre membros de família (Moore, A.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:10436-41 (2000)). O domínio PAS, que é denominado com base nas três primeiras proteínas nas quais foi identificado (Per, ARNT e Sim), abrange 200-300 aminoácidos contendo duas regiões largamente hidrófobas, vagamente conservadas, de aproximadamente 50 aminoácidos, designadas PAS A e PAS B.

Enquanto a HIF-Ιβ (ARNT) é expressa constitutivamente a um nível elevado, a acumulação de HIF-1 na célula é sensível à concentração de O2, de modo a que níveis elevados sejam detectados apenas durante a hipoxia. Esta observação conduziu a 19 um mecanismo proposto para activação de gene alvo, pelo que a concentração de O2 é detectada por uma proteína sensora e, através de um complexo mecanismo de sinalização, conduz à estabilização da subunidade HIF-Ια. A HIF-la fica, depois, disponível para se complexar com HIF-Ιβ e ligar-se, de modo selectivo, a sítios de HRE no promotor/estimulador do(s) gene(s) alvo. Pensa-se que as regiões da proteína HIF-Ια envolvidas na concessão desta resposta coincidem com regiões envolvidas na transactivação.

Pensa-se que a indução da actividade de HIF-1 em resposta à hipoxia ocorre por meio de estabilização da proteína HIF-Ια. As regiões de HIF-la envolvidas nesta resposta foram localizadas na terminação C da proteína e sobrepõem-se ao dominio de transactivação. Por exemplo, Jiang et al., J. Biol. Chem. 271(30):17771 78 (1996), mostraram que a HIF-Ια truncada no aminoácido 390 perdeu actividade de transactivação, mas reteve a capacidade de se ligar a ADN e mostrou elevados níveis de proteína sob condições normóxicas e hipóxicas. Este resultado demonstrou que o domínio de transactivação e a região conferindo instabilidade com normoxia residem na metade C-terminal da proteína. Pugh et al., J. Biol. Chem. 272(17):11205 14 (1997) localizaram, ainda, as regiões envolvidas em duas áreas, aminoácidos 549-582 e 775-826.

Um domínio de, aproximadamente, 200 aminoácidos, referido como o "domínio de degradação dependente de oxigénio" (ODD), medeia a degradação de HIF-la (Huang, L., J. Gu, M. Schau e H. Bunn. 1998. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 7987-92). A deleção do ODD (HIF-la DODD) resulta numa HIF-la constitutivamente activa, independentemente da concentração de 20 oxigénio (Huang, L., J. Gu, M. Schau, e H. Bunn. 1998. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 7987-92; Patente U.S. N° 6124131). A presente descrição divulga moléculas de ácido nucleico codificando proteínas transactivadoras guiméricas biologicamente activas, compreendendo um domínio da proteína HIF-1 α suficiente para ligação de ADN e dimerização com HIF-Ιβ (ARNT) e um domínio de proteína capaz de activação transcricional.

Em murganhos, são produzidos dois transcritos de HIF-la (1.1 e 1.2) a partir de promotores diferentes, em oposição à excisão alternativa (Wenger, R.H., et ai., Eur. J. Biochem. 246:155-65 (1997). Estes transcritos são ambos eficientemente traduzidos, independentemente do oxigénio, mas diferem na medida em que o transcrito 1.1 codifica uma proteína desprovida dos primeiros 12 aminoácidos amino-terminais e é expresso num modo restringido a tecido, enquanto o 1.2 é expresso de modo ubíquo e codifica uma proteína de comprimento completo. Apesar destas diferenças, não foi observada especificidade na ligação de ADN ou actividade de transactivação (Wenger, R.H., et al., Blood 91:3471-80 (1998); Gorlach, A., et al., Biochem. Biophys. Acta 1493:125-134 (2000)). Também foram observados em humanos diversos variantes de excisão de HIF-Ια. Por exemplo, verificou-se que um variante de excisão de HIF-Ια, que não tem o exão 14, está presente na pele e várias linhas celulares (Gothie, E., et al., J. Biol. Chem. 275:6922-27 (2000)). Isto conduz a um desvio de fase e codifica uma proteína mais curta (736 aminoácidos) que, embora ainda hipoxicamente indutível, não tem um TAD carboxi-terminal (C-TAD) e, por conseguinte, é menos activa do que a HIF-la de tipo selvagem (Gothie, E., et ai., J. Biol. Chem. 275:6922-27 (2000)). Também foi identificada uma isoforma negativa dominante, desprovida dos exões 11 e 12, que 21 codifica uma proteína que tem 516 aminoácidos de comprimento, estável em normoxia e não exibe transactivação (Chun, Y.S., et al., Biochem. J. 362:71-79 (2002)). Além disso, um variante de excisão induzido por zinco, desprovido do exão 12, também actua como um negativo dominante, inibindo a actividade de HIF pela ligação a ARNT e impedindo a sua acumulação nuclear (Chun, Y.S., et al., Biochem. Biophys. Res. Comrnun. 268:652-56 (2000)).

As sequências representativas de HIF-Ια humana incluem, por exemplo, os Acessos Genbank N° NM_001530 (variante 1 de transcrito) e NM_181054 (variante 2 de transcrito). As sequências representativas da subunidade HIF-Ιβ humana incluem, por exemplo, os Acessos Genbank N° NM_001668 (variante 1 de transcrito de ARNT), NM_178426 (variante 2 de transcrito de ARNT) e NM__178427 (variante 3 de transcrito de ARNT) .

Uma proteína estreitamente relacionada, HIF-2a (também designada PAS endotelial (EPAS), factor relacionado com HIF (HRF) e membro da superfamília 2 de PAS (MOP2)), foi identificada pouco depois de a HIF-Ια ser clonada (Tian, H., et al., Genes Dev. 11 : 72-82 (1997); Ema, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4273-78 (1997); Flamme, I., et al., Mech. Dev. 63:51-60 (1997); Hogenesch, J.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:5474-79 (1998)). A HIF-2a partilha 48% de identidade de aminoácido com HIF-Ια e menor semelhança com outros membros da família do domínio bHLH/PAS de factores de transcrição (as sequências humanas de HIF-2a representativas têm os Acessos GenBank N° NM_001430 e U81984; uma sequência de murganho de HIF-2a representativa tem o Acesso GenBank N° U81983). Como a HIF-Ια, verificou-se que a HIF-2a se heterodimeriza com ARNT e liga-se a HRE (Tian, H., et al., Genes Dev. 11:72-82 (1997); Ema, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4273-78 (1997)). 22 A análise de deleção demonstrou que HIF-Ια e HIF-2a partilham uma arquitectura de domínio funcional comum. Especificamente, além dos domínios bHLH e PAS amino-terminais, HIF-Ια e HIF-2a possuem dois domínios de transactivação (TAD), separados por uma região designada domínio inibidor (ID), que é responsável por repressão normóxica da actividade de TAD. A sobreposição de TAD amino-terminal (N-TAD) é um domínio de degradação dependente de oxigénio (ODDD), que confere estabilidade normóxica às proteínas HIFa (Bracken, C.P., et al. , CMLS. Cell. Mol. Life Sei. 60:1376-93 (2003)) .

As HIF-2cx humana e murina partilham extensa identidade de sequência primária de aminoácidos com HIF-la (48%). A

conservação de sequência entre as duas proteínas é mais elevada nas regiões bHLH (85%), PAS-A (68%) e PAS-B (73%). Uma segunda região de identidade de sequência ocorre nas terminações C extremas das proteínas HIF-Ια e HIF-2a. Demonstrou-se que esta região conservada em mHIF-Ια contém um domínio de resposta de hipoxia (Li et al., J. Biol. Chem. 271(35):21262-67 (1996)). O elevado grau de semelhança de sequência entre HIF-Ια e HIF-2a sugere que partilham função (funções) fisiológica(s) comum (comuns). As condições hipóxicas estimulam a capacidade de a HIF-Ια transactivar genes alvo contendo a sequência nuclear HRE. A actividade de HIF-2a também é melhorada em células cultivadas sob condições hipóxicas.

Os padrões de expressão de ARN revelaram que as HIF-Ια e HIF-2a são largamente expressas, de modo ubíquo, em tecidos humanos e de murganho num modo independente de oxigénio (Tian, H., et al., Genes Dev. 11 : 72-82 (1997); Ema, M., et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 94: 4273-78 (1997); Flamme, I., et al.,

Mech. Dev. 63:51-60 (1997); Wenger, R.H., et al., Kidney Int. 23 51:560-63 (1997); Wiesener, M.S., et al., Blood 92:2260-68 (1998)). Contudo, a análise de padrão de expressão específica de tipo de célula revelou que, em contraste com a HIF-1 α ubíqua, o ARNm de HIF-2cx é predominantemente expresso em tipos específicos de células, tais como células endoteliais, epiteliais, neuronais, fibroblastos e macrófaqos (Bracken, C.P., et ai., CMLS. Ce11. Mol. Life Sei. 60:1376-93 (2003)).

Também foi descoberto um terceiro gene de HIFa e designado HIF-3 a. Como a HIF-Ια e HIF-2 a, a HIF-3cx é expressa por uma variedade de tecidos, dimeriza-se com ARNT, liga-se a sequências de ADN de HRE e regula, de modo positivo, a expressão de repórter, num modo indutível por hipoxia e dependente de ARNT (Gu, Y.Z., et ai. Gene Expr. 7:205-13 (1998)). Um variante de excisão de HIF-3 a, designado PAS inibitório (IPAS), foi identificado. 0 IPAS parece ser desprovido de actividade de transactivação endógena, mas actua como um regulador negativo dominante de HIF, interagindo com a região amino-terminal de HIF-Ια e impedindo a ligação de ADN. São sequências representativas de HIF-3cx humana os Acessos Genbank N° NM_152794 (variante 1 de transcrito de HIF-3oí) , NM_152794 (variante 2 de transcrito de HIF-3a) e NM_022462 (variante 3 de transcrito de HIF-3a). São aqui descritas, e como é evidente para os especialistas na técnica, sequências de HIF-1 a, HIF-2a e/ou HIF-3 a, incluindo sequências de quaisquer variantes de excisão conhecidos ou descobertos.

Muito foi descoberto acerca da regulação de HIF-α. A regeneração normóxica de HIF-α é muito rápida e, sob condições normóxicas, resulta em essencialmente nenhuma proteína HIF-a detectável (Wang, G.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:5510-14 (1995); Yu, A.Y., et al., Am. J. Physiol. 275:L818-L826 (1998); Huang, L.E., et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 95:7987-92 (1998)). Esta estabilidade normóxica é controlada pelos 200 aminoácidos centrais de ODDD que se sobrepõem a N-TAD (Huang, L.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:7987-92 (1998)). A rápida acumulação de HIF-la e HIF-2oí, que ocorre em hipoxia, é mediada por estabilidade aumentada de proteína. Em contraste, a tensão de oxigénio não tem um efeito importante na transcrição ou tradução de HIF-α (Wenger, R.H., et al., Kidney Int. 51:560-63 (1997); Huang, L.E., et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 95:7987-92 (1998)); Huang, L.E., et al., J.

Biol. Chem. 271:32253-59 (1996); Powell, J.D., et al. , Biol.

Reprod. 67:995-1002 (2002); Kallio, P.J., et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 94:5667-72 (1997)). De modo semelhante, o oxigénio não afecta significativamente os níveis de ARNm ou proteína de ARNT, que são expressos constitutivamente (Huang, L.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 7987-92 (1998)); Huang, L.E., et al., J. Biol. Chem. 271:32253-59 (1996); Kallio, P.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:5667-72 (997)). A instabilidade normóxica de HIF-α é mediada por poliubiquitilação e subsequente degradação pelo proteassoma. Tal foi demonstrado utilizando inibidores proteossómicos ou mutação da enzima de activação de ubiquitina EI (Huang, L.E., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:7987-92 (1998); Kallio, P.J., et al., J. Biol. Chem. 274:6519-25 (1999)). Deste modo, a HIF-a é poliubiquitilada sob normoxia, com o nível de ubiquitilação diminuindo em hipoxia (Huang, L.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:7987-92 (1998); Kallio, P.J., et al., J. Biol. Chem. 274:6519-25 (1999); Sutter, C.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4748-53 (2000)). Além disso, demonstrou-se que a HIF-la 25 interage fisicamente com a subunidade PSMA7 proteossómica de 20S (Cho, S., et al., FEBS Lett. 498:62-66 (2001)).

A proteína supressora tumoral de von-Hippel-Lindau (VHL) é um componente de um complexo de ubiquitina E3-proteína ligase, contendo as elonginas B e C, Cul2 e Rbxl, e é esta capacidade pela qual a VHL medeia a degradação proteossómica de HIF-Ια e HIF-2a (Lisztwan, J., et al., Genes Dev. 13:1822-33 (1999)). O suporte é proporcionado pela verificação de que, sob condições normóxicas, a HIF-Ια é estável em células deficientes em VHL, contudo, a estabilidade de proteína normóxica é restaurada após transfecção de VHL (Maxwell, P.H., et al., Nature 399:271-75 (1999) ; Cockman, M.E., et al., J. Biol. Chem. 275:25733-741 (2000) ). A VHL é capaz de exercer este efeito pela ligação aos aminoácidos 517-571 ou 380-417 de HIF-Ια em normoxia (aminoácidos 517-534 e 383-418 em HIF-2a) , por meio do seu domínio β, enquanto o domínio cx se liga a elonginas. A ubiquitina é, depois, transferida para resíduos de HIF, marcando a proteína para degradação proteossómica (Cockman, M.E., et al., J. Biol. Chem. 275:25733-741 (2000); Ohh, M., et al., Nat. Cell

Biol. 2:423-27 (2000)); Tanimoto, K., et al., EMBO J. 19:4298-4309 (2000); Masson, N., et al., EMBO J. 20:5197-5206 (2001) ; Srinivas, V., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 260:557-61 (1999)) .

Foi descoberto que a ligação de VHL a HIF em normoxia e, deste modo, o principal mecanismo pelo qual é conferida a instabilidade da proteína HIF, é mediada pela hidroxilação irreversível de dois resíduos de prolina (P402 e P564 em HIF-la, P405 e P530 em HIF-2a) (Jaakkola, P., et al., Science 292:468-72 (2001); Ivan, M., et al., Science 292:464-68 (2001); Yu, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:9630-35 (2001)); Chan, D.A., 26 et al., J. Biol. Chem. 277:40112-17 (2002)). Estes resíduos são hidroxilados apenas em normoxia, possibilitando a ligação de elevada afinidade de VHL a HIF (Min, J.H., et al., Science 296:1886-89 (2002)). A identificação de egl9, uma prolil-hidroxilase de HIF em Caenorhabditis elegans, possibilitou a clonagem de três homólogos de mamífero, designados domínio de prolil-hidroxilase contendo (PHD) 1, 2 e 3, ou prolil-hidroxilases de HIF (HPH 3, 2 e 1, respectivamente (Bruick, R.K., et al., Science 294:1337-40 (2001); Epstein, A.C., et al. , Cell 107:43-54 (2001); Ivan, M., et al. , Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 99:13459-464 (2002); Lieb, M.E., et al.,

Biochem. Cell. Biol. 80:421-426 (2002); Huang, J., et al., J.

Biol. Chem. 277:39792-800 (2002)). Uma quarta PHD/HPH, largamente expressa, também foi identificada (Oehme, F., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 296(2):343-49 (2002)).

As PHD/HPH são enzimas dependentes de 2-oxoglutarato que requerem oxigénio (O2) para hidroxilação. Contêm ferro ligado a dois resíduos de histidina e um ácido aspártico que, quando mantido no seu estado ferroso pelo ascorbato, se liga a dioxigénio. Um oxigénio é transferido para o resíduo de prolina alvo de HIF; o segundo reage com 2-oxoglutarato para produzir succinato e dióxido de carbono. Deste modo, a ausência de oxigénio conduz a não actividade enzimática, não modificação de resíduos de prolina de HIF e não ligação de VHL/HIF, resultando em proteína HIF-α estabilizada.

Por conseguinte, é provável que as PHD/HPH funcionem como um sensor de oxigénio directo em células que modulam directamente HIF em resposta à concentração fisiológica de oxigénio (Bracken, C.P., et al., CMLS. Cell. Mol. Life Sei. 60:1376-93 (2003)) . 27 São aqui divulgadas moléculas de ácido nucleico codificando as proteínas transactivadoras quiméricas, compreendem um domínio de uma proteína de factor indutível por hipoxia não mamífera. Como será reconhecido pelo especialista na técnica, é provável que a resposta adaptativa a hipoxia tenha sido altamente conservada durante toda a evolução. Consequentemente, seria de esperar que as proteínas de factor indutível por hipoxia ocorressem numa ampla variedade de espécies, incluindo vertebrados não mamíferos e não vertebrados, tal como insectos. Ver, por exemplo, Bacon et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 249:811-816 (1998), que referem a semelhança funcional entre a proteína de PAS de hélice-gancho-hélice básica Sima de Drosophila e a proteína HIF-Ια de mamífero.

As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos para proteínas de factor indutível por hipoxia não mamíferas podem ser obtidas pelo especialista na técnica por uma variedade de técnicas, por exemplo, por hibridação cruzada ou amplificação, utilizando a totalidade ou uma porção das sequências aqui referidas. Uma vez determinada a sequência codificando uma proteína de factor indutível por hipoxia candidata, a localização de porções da proteína suficientes para ligação a HRE e dimerização com HIF-Ιβ pode ser determinada utilizando, e. g., os mesmos tipos de técnicas utilizadas para determinar a localização dos domínios dentro da proteína HIF-Ια humana. Os domínios relevantes de proteínas de factor indutível por hipoxia não mamíferas podem ser produzidos sinteticamente ou por manipulações dirigidas pontuais do ADN codificando proteínas de factor indutível por hipoxia mamíferas conhecidas. Também se espera que os motivos de sequência em comum entre diversas proteínas de factor indutível por hipoxia mamíferas e não mamíferas sugiram sequências consenso que, embora talvez não 28 ocorrendo naturalmente em qualquer espécie produziriam, não obstante, domínios apropriados. Tudo o que é requerido, de modo a substituir esses domínios de proteína de factor indutível por hipoxia não mamíferos pelos domínios de proteína HIF-Ια humana aqui exemplificados, é que sejam capazes de se ligar a HRE e dimerizar com HF-Ιβ (ARNT).

Por exemplo, embora a subunidade de HIF-1 α seja instável durante condições normóxicas, a superexpressão desta subunidade em células cultivadas sob níveis normais de oxigénio é capaz de induzir a expressão de genes normalmente induzidos por hipoxia. Uma estratégia alternativa seria a de modificar a subunidade HIF-Ια, de modo a que já não fosse desestabilizada por condições normóxicas e, por conseguinte, fosse mais potente sob uma gama de condições de oxigénio. A substituição da região C terminal (ou transactivação) da proteína de factor indutível por hipoxia com um forte domínio de transactivação de uma proteína activadora transcricional, tal como, por exemplo, VP16 de Vírus Herpes Simplex (HSV) , NFkB ou factores GAL4 e GCN4 de transcrição de levedura, é concebida para estabilizar a proteína sob condições normóxicas e proporcionar activação transcricional forte, constitutiva.

Para estabilizar a proteína de factor indutível por hipoxia sob condições normóxicas e para proporcionar activação transcricional forte, constitutiva, foi construída uma proteína de fusão híbrida/quimérica, consistindo nos domínios de ligação de ADN e dimerização de HIF-Ια e no domínio de transactivação da proteína VP16 de Vírus Herpes Simplex (HSV). A administração deste híbrido/quimera às células de um indivíduo, por meio de terapia génica, induz a expressão de genes normalmente regulados 29 positivamente em resposta a hipoxia (i. e., VEGF e semelhantes). Demonstrou-se que um híbrido constitutivamente estável HIF-Ια é eficaz para o tratamento de doentes isquémicos (Patentes U.S. N° 6432927 e 7053062, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade). A administração de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína transactivadora quimérica biologicamente activa, compreendendo o domínio de ligação de ADN de uma proteína de factor indutível por hipoxia (e. g. , HIF-la) e um domínio de proteína capaz de activação transcricional (e. g. , um domínio de activação transcricional de VP16 de HSV, um domínio de activação transcricional de NFkB), pode tratar distúrbios motores neurodegenerativos num doente que dela necessita. Numa forma de realização, o domínio de ligação de ADN é um domínio de ligação de ADN de HIF-Ια e o domínio de proteína capaz de activação transcricional é um domínio de activação transcricional de VP16 de HSV. Uma sequência de ácidos nucleicos de ADNc representativa de uma construção do tipo HIFla NP16, que contém o domínio de ligação de ADN e domínio de dimerização de HIF-Ιβ de HIF-Ια e o domínio de activação transcricional de VP16 de HSV, é a seguinte:

ATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCT

GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGA

AGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACT

TCC AC AT AAT GT G AGTTCGC AT CTTG ATAAGGCCTCTGTG ATG AGG

CTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTG

ATTTGG AT ATTG AAG AT G AC AT G AA AGC AC AG AT G AATTGCTTTTA

TTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTG 30

AC ATG ATTTAC ATTT CTG ATAAT GT G AAC A AATAC ATGGG ATT A AC

TCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCAT

GTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCC

TTGT G AAA AAGGGTAA AGAAC AAAAC AC AC AGCG AAGCTTTTTTCT

C AG AAT G AAGT GT ACCCTAACT AGCCG AGGAAGAACTATG AAC AT

AAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCAC

GTAT AT G AT ACC AAC AGT AACC AACCTC AGT GT GGGT ATAAG AAAC

CACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCA

TCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGAC

AC AGCCTGGAT AT G AAATTTTCTTATT GTG AT GAAAGAATT ACCGA

ATT G AT G GGATAT G AGCC AG AAG AACTTTT AGGCC GCT C AATTTAT

GAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATC

ATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGA

TGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAAC

T GTC AC ATATAAC ACC AAG AATTCT C AAC C AC AGT GC ATT GTAT GT

GTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTC

CCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGAT

ATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACA

AGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGG

CCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGG

CGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGA

TCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACC

CCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCG

AGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGG TGGGTAG (SEQ ID NS; 1). 31

Nesta sequência de ácidos nucleicos representativa, a sequência dos domínios de ligação de ADN de HIF-Ια e de dimerização de HIF-Ιβ é a seguinte: atggagggcgccggcggcgcgaacgacaagaaaaagataagttct

GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGA

AGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACT

TCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGG

CTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTG

ATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTA

TTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTG

AC AT GATTT AC ATTTCTG ATAATGT G AAC AAATACAT GGGATTAAC

TCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCAT

GTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCC

TT GTG AAAAAGGGT AAAG AAC AA AAC AC AC AGCG AAGCTTTTTT CT

CAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACAT

AAAGTCT GC AAC AT GGAAGGTATTGCACTGCAC AGGCC ACATTCAC

GTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAAC

CACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCA

TCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGAC

ACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGA

ATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTAT

GAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATC

ATG ATAT GTTTACT AAAGGACAAGTC ACCAC AGGAC AGTACAGGA

TGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAAC

TGTCACATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGT 32 GTG AATT ACGTTGTGAGT GGTATT ATTC AGCACGACTTGATTTTCTC CCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGAT ATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACA AGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAG (SEQ ID N2 : 2).

Nesta sequência representativa, a sequência do domínio de activação transcricional de VP16 de HSV é a seguinte:

CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGG

GGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATG

CCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGG

ATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGG

CGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGA

CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGG

GGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATG

CCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGG

ATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGG

CGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGAT GCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAG (SEQ ID N2 : 3). A invenção abrange outros ácidos nucleicos que codificam proteínas transactivadoras quiméricas biologicamente activas, por exemplo, uma proteína compreendendo os domínios de ligação de ADN e dimerização de HIF-Ια e o domínio de transactivação de uma proteína NFDB (e. g., uma proteína NFkB humana). 33

Os factores de transcrição eucarióticos são frequentemente compostos por domínios activadores de ligação de ADN e transcricionais separados e independentes (Mitchell e Tjian, Science 245:371-378 (1989)). A independência dos domínios tem permitido a criação de proteínas de fusão funcionais, consistindo nos domínios de ligação de ADN e de activação de proteínas heterólogas. As proteínas regulatórias eucarióticas quiméricas, consistindo na proteína de ligação de ADN lexa e no domínio de activação do factor de transcrição de levedura, GAL4, foram construídas por Brent e Ptashne (Nature 312:612-615 (1985)). A utilização de proteínas de fusão tem identificado vários tipos de domínios de proteína que actuam como activadores transcricionais. Estes domínios têm pouca semelhança de aminoácido mas, frequentemente, são caracterizados como sendo altamente acídicos (como no caso de GAL4 e GNC4), ricos em glutamina (como no caso de Spl) ou ricos em prolina (como no caso de NF1, Ma e Ptashne, Cell 51:113-119 (1987); Courey e Tjian (1988); Mermod et al., Cell 58:741-753 (1989)).

Um dos domínios activadores mais eficientes conhecidos está contido nos 100 aminoácidos carboxil-terminais da proteína 16 de virião do Vírus Herpes Simplex (HSV) (VP16) (Sadowski et al., Nature 335:563-564 (1988); Triezenberg et al., Genes & Dev. 2:718-729 (1988)). A VP16, também conhecida por Vmw65 ou factor de indução em trans do gene alfa, é uma proteína estrutural de HSV que activa a transcrição dos promotores precoces imediatos do vírus, incluindo aqueles para ICPO e ICP4 (Campbell et al., J. Mol. Biol. 180 : 1-19 (1984); Kristie e Roizman, Proc. Natl. Acad. Sei., EUA 81:4065-4069 (1984); Pellet et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA 82:5870-5874 (1985)). Embora a VP16 active, de modo específico, promotores contendo o denominado elemento TAATGARAT, a especificidade provém de proteína(s) de ligação de 34 ADN celular (es) que está (estão) complexada (s) com o(s) domínio(s) amino-terminal (amino-terminais) de VP16 (McKnight et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA 84:7061-7065 (1987); Preston et al., Cell 52:425-434 (1988)). A presente descrição proporciona ácidos nucleicos codificando proteínas de transactivação híbridas/quiméricas, compreendendo uma porção funcional de uma proteína de ligação de ADN e uma porção funcional de uma proteína activadora transcricional. Essas proteínas de transactivação híbridas/quiméricas oferecem uma variedade de vantagens, incluindo activação específica de expressão de genes indutíveis por hipoxia contendo elementos responsivos a hipoxia (HRE) alcançando-se, desse modo, níveis excepcionalmente elevados de expressão génica. Os ácidos nucleicos codificando essas proteínas de transactivação híbridas/quiméricas são capazes de funcionarem em células de vertebrado e podem codificar proteínas ou domínios de proteínas de transactivação transcricional de ocorrência natural (e. g., proteínas ou domínios de transactivação transcricional de ocorrência natural de células eucarióticas, incluindo células de vertebrado), proteínas ou domínios de transactivação virai ou qualquer sequência de aminoácidos sintética que seja capaz de estimular a transcrição a partir de um promotor de vertebrado. Os exemplos dessas proteínas de transactivação incluem mas não estão limitados ao factor de transcrição específico linfóide, identificado por Muller et al. (Nature 336:544-551 (1988)), a proteína fos (Lucibello et ai., Oncogene 3:43-52 (1988)); proteína v-jun (Bos et ai., Cell 52:705-712 (1988)); factor EF-C (Ostapchuk et ai., Mol. Cell. Blol. 9:2787-2797 (1989)); proteína tat de VIH-1 (Arya et al., Science 229:69-73 (1985)), a proteína E2 de papilomavírus (Lambert et al., J. Virol. 63:3151-3154 (1989)) a 35 proteína EIA de adenovírus (revisto em Flint e Shenk, Ann. Rev. Genet. (1989), factores de choque térmico (HSF1 e HSF2) (Rabindran, et al., PNAS 88:6906-6910 (1991)); a proteína p53 (Levine, Cell 88:323-331 (1997), Ko e Prives, Genes Dev. 10:1054-1072 (1996)); Sp 1 (Kadonaga, et al. Cell 51:1079-1090 (1987)); AP1 (Lee, et al., Nature 325:368-372 (1987)); CTF/NF1 (Mermod, et al., Cell 58: 741-753 (1989)), E2F1 (Neuman, et al.,

Gene 173: 163-169 (1996)); HAP1 (Pfeifer, et al., Cell 56: 291-301 (1989)); HAP2 (Pinkham, et al., Mol. Cell. Biol. 7:578-585 (1987)); MCM1 (Passmore, et al., J. Mol. Biol. 204:593-606 (1988); PH02 (Sengstag e Hinnen, NAR 15:233-246 (1987) ); e GAL11 (Suzuki et al., Mol. Cell. Biol. 8:4991-4999 (1988) ). Em formas de realização particulares da invenção, a proteína de transactivação é a VP16 do Vírus herpes simplex (Sadowski et al., Nature 335:563-564 (1988); Triezenberg et al.,

Genes and Dev. 2:718-729 (1988)), NF.capa.B ((Schmitz e

Baeuerle, EMBO J. 10:3805-3817 (1991); Schmitz, et al., J.Biol.Chem. 269:25613-25620 (1994); e Schmitz, et al., J. Biol. Chem. 270:15576-15584 (1995)) e os activadores GAL4 e GCN4 de levedura.

Certamente, o especialista na técnica compreenderá que os domínios de activação transcricional úteis nas composições desta invenção também podem ser sintéticos, i. e., baseados numa sequência que não está contida dentro de uma proteína de ocorrência natural conhecida. Ver, por exemplo, Pollock e Gilman, PNAS 94:13388-13389 (1997), que ensinam que a activação transcricional é um processo inerentemente flexível, no qual existem poucos requisitos, se é que existem, para estruturas especificas ou contactos de proteína estereoespecificos. Também revêem a variedade de diferentes moléculas que podem funcionar como activadores transcricionais, incluindo motivos peptídicos 36 curtos (tão pequenos quanto oito aminoácidos), hélices anfifílicas simples e até domínios mutagenizados de proteínas não relacionadas com a activação transcricional.

De acordo com a invenção, as sequências de ácidos nucleicos codificando um domínio de ligação de ADN e um domínio de transactivação são combinadas, de modo a preservar-se as respectivas propriedades de ligação e transactivação de cada dos domínios. Em diversas formas de realização da invenção, o ácido nucleico codificando a proteína de transactivação, ou uma sua porção capaz de activar a transcrição, pode ser inserido dentro de ácido nucleico num lócus que não dissocie completamente a função do domínio de ligação de ADN codificado. As regiões de proteínas de factor indutível por hipoxia que não são requeridas para as funções de ligação de ADN e dimerização e as regiões de proteínas que não são requeridas para a função de transactivação transcricional são conhecidas e/ou podem ser identificadas por métodos conhecidos na técnica, incluindo, e. g., análise de mutações mapeadas, assim como identificação de regiões desprovidas de mutações mapeadas que são, presumivelmente, menos sensíveis a mutação do que outras porções da molécula mais relevantes funcionalmente. As construções recombinantes apropriadas podem ser produzidas utilizando técnicas padrão em biologia molecular, incluindo as expostas em Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.I., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). A construção de ADN recombinante codificando a proteína transactivadora quimérica pode ser colocada sob o controlo de (i. e., ligada operativamente) um promotor adequado e/ou outra sequência de controlo de expressão. Pode ser desejável que a proteína transactivadora seja colocada sob o controlo de uma 37 sequência promotora constitutivamente activa, embora a proteína transactivadora também possa ser colocada sob o controlo de um promotor indutível, tais como o promotor de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)) ou um promotor específico de tecido. As sequências promotoras que podem ser utilizadas de acordo com a invenção incluem mas não estão limitadas à região do promotor precoce de SV40 (Benoist e Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell 22 : 787-797 (1980)), o promotor da timidina cinase de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei., E.U.A. 78:144-1445 (1981)), o promotor/estimulador precoce imediato de citomegalovírus (CMV) humano (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)).

Numa forma de realização da invenção, a proteína transactivadora quimérica é codifica por pcDNA3/HIFNP16/Af12. Noutra forma de realização, a proteína transactivadora quimérica é codificada por pcDNA3/HIFNP16/RI, que é idêntica a pcDNA3/HIFNP16/Af 12, com a excepção de que o segmento de VP16 é inserido a seguir ao codão 530 da região codificante de HIF-la.

De acordo com a invenção, os ácidos nucleicos codificando proteínas transactivadoras híbridas/quiméricas podem ser utilizados para regular, de modo específico, a expressão de genes contendo elementos responsivos a hipoxia (HRE). Estes HRE correspondem a uma sequência de ácidos nucleicos reconhecida e ligada pela proteína de ligação de ADN, utilizada como a estrutura da proteína transactivadora quimérica.

Em geral, os ácidos nucleico codificando proteínas transactivadoras quiméricas podem ser utilizados para controlar, 38 selectivamente, a expressão de genes de interesse. Por exemplo, e não a título de limitação, as proteínas transactivadoras quiméricas podem ser colocadas sob o controlo de um promotor constitutivo e podem ser utilizadas para aumentar, de modo constitutivo, a expressão de um gene de interesse associado a elementos responsivos a hipoxia (HRE), por exemplo, quando é desejável produzir-se um produto génico particular em quantidade, numa cultura celular ou num animal transgénico. Alternativamente, uma proteína transactivadora pode ser colocada sob o controlo de um promotor específico de tecido, de modo que o gene de interesse seja expresso num tecido particular. Em formas de realização alternativas da invenção, uma função transactivadora quimérica é indutível, de modo que a expressão de um gene de interesse, por meio de elementos responsivos a hipoxia (HRE), possa ser selectivamente aumentada ou diminuída. Para revisões de expressão transgénica condicional e indutível, ver Fishman, Circ. Res., 82:837-844 (1998) e Fishman, Trends Cardiovasc. Med., 5:211-217 (1995).

Para informação adicional sobre construções de HIFl-alfa ver, por exemplo, a Patente U.S. com o N° de Série 6432947. A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é um estado neurodegenerativo, progressivo, envolvendo a perda de grandes neurónios motores no cérebro e medula espinal. É caracterizada por fraqueza progressiva, atrofia e espasticidade, conduzindo a paralisia e insuficiência respiratória no espaço de cinco anos a seguir ao seu começo. A ALS familiar contribui para 10% de todos os casos de ALS; aproximadamente 25% destes casos são devido a mutações no gene de Cu/Zn superóxido dismutase (SOD1) [1]. Até à data, foram identificadas 109 mutações diferentes no gene de SOD 1; estas abarcam todos os cinco exões [2] . Além de mutações 39 muito raras nos genes para a cadeia de neurofilamento pesado (NFH), dinactina, gene da proteína 1 de ligação vesicular e o gene de ALSIN, S0D1 é o único lócus de susceptibilidade principal de ALS identificado. S0D1 é uma enzima principalmente citoplasmática que catalisa a desagregação de iões de superóxido em oxigénio e peróxido de hidrogénio que, por sua vez, é degradado por glutationo peroxidase ou catalase para formar água. Várias linhas de evidência defendem que a proteína SOD 1 mutante é neurotóxica através de uma função adquirida, adversa, que implica patologia oxidativa e agregação de proteína, com perturbações secundárias do metabolismo do glutamato, função mitocondrial, transporte axonal e homeostasia do cálcio [3]. Que a S0D1 mutante é tóxica, é fortemente suportado pela observação de que a expressão transgénica de elevados níveis de proteína S0D1 mutante em murganhos produz um fenótipo de doença de neurónio motor, com idade de começo e duração de doença dependentes do número de cópia [4] .

Até à data, poucas intervenções terapêuticas alteraram o fenótipo de neurónio motor nos murganhos de ALS transgénicos. Embora mais de 100 moléculas pequenas tenham sido testadas até à data, poucas tiveram sequer um benefício marginal (e. g., riluzole [5], celecoxib [6], arimoclomol [7]). Por contraste, algumas formas de terapia de proteína foram benéficas. Deste modo, o melhoramento significativo na sobrevivência foi produzido pela administração do factor 1 de crescimento semelhante a insulina (IGF-1), de modo transgénico [8] ou através de distribuição de AAV2, por meio de injecção IM e subsequente transporte axonal retrógrado para nervos motores [9] . Duas outras proteínas que se mostraram terapeuticamente promissoras como agentes neuroprotectores são a eritropoietina [10] e o factor endotelial vascular (VEGF) [11,12]. O último é 40 de interesse particular, porque a análise genética implicou variantes hipomórficos no gene de VEGF como um factor de risco para a ALS [13]. Além disso, os murganhos que são desprovidos de elementos promotores responsivos a hipoxia desenvolvem uma doença de neurónio motor lentamente progressiva [14]. Subsequentemente, foi documentado que a distribuição lentiviral de VEGF na medula espinal de murganhos de ALS retarda a morte [15]. Dois investigadores independentes referiram que a infusão de VEGF dentro do fluido cerebrospinal em murganhos [16] e ratos [17] de ALS também abranda o curso da doença. A presente descrição da invenção divulga um método que aumenta os níveis da família de VEGF de proteínas neurotróficas e/ou EPO, compreendendo a injecção de um vector neurotrófico codificando para HIF-Ια dentro da região da medula espinal de um indivíduo com ALS ou outro distúrbio de neurónio motor. 0 método pode aumentar mais de uma dessas proteínas neurotróficas. Sem limitação a respeito de teoria, a distribuição de um transgene codificando para HIF-Ια aumentará a expressão de diversos genes alvo de HIF-1 proporcionando, deste modo, um benefício a neurónios motores em sítios de expressão de HIF-la.

Sem limitação a respeito de teoria, a injecção directa de um vector neurotrófico na medula espinal também proporciona uma vantagem para a distribuição de moléculas terapêuticas, tal como HIF-Ια, que funcionam mais eficientemente quando expressas directamente em células de medula espinal. Por exemplo, os vectores neurotróficos codificando para moléculas, tal como ARN de interferência curto (ARNsi), podem ser distribuídos em células de medula espinal por meio de injecção directa da medula espinal. 0 ARNsi distribuído deste modo pode exercer 41 directamente, de modo intracelular, efeitos em células de medula espinal transduzidas.

Além disso, determinados distúrbios genéticos de neurónio motor, tal como SMA, podem ser tratados por injecção directa da medula espinal com um vector neurotrófico codificando para um gene terapêutico. A injecção directa de medula espinal proporciona um meio para distribuir vírus recombinante directamente em células na área da medula espinal.

Os vectores virais neurotróficos incluem mas não estão limitados a vectores virais adeno-associados (AAV), vectores virais de herpes simplex (Patente U.S. N° 5672344) e vectores lentivirais.

Na presente descrição, pode ser utilizado AAV de qualquer serotipo ou pseudotipo. 0 serotipo do vector virai pode ser seleccionado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8 (ver, e. g., Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854-11859; e Virai Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Podem ser utilizados outros serotipos além dos aqui listados. Além disso, também podem ser utilizados os vectores de AAV pseudotipados. Os vectores de AAV pseudotipados são os que contêm as repetições terminais invertidas (ITR) de um serotipo de AAV e a cápside de um segundo serotipo de AAV; por exemplo, um vector de AAV que contém a cápside de AAV2 e as ITR de AAV1 (i. e. AAV 1 /2) ou um vector de AAV que contém a cápside de AAV 5 e as ITR de AAV2 (i. e. AAV2/5) .

Os vectores de AAV são derivados de parvovírus de ADN de cadeia simples (ss) que são não patogénicos para mamíferos 42 (revisto em Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). Resumidamente, os vectores baseados em AAV têm os genes virais rep e cap que contribuem para 96% do genoma virai removidos, deixando as duas repetições terminais invertidas (ITR) flanqueantes de 145 pares de bases (pb) , que são utilizadas para iniciar a replicação, empacotamento e integração de ADN virai. Na ausência de vírus auxiliar, o AAV de tipo selvagem integra-se dentro do genoma de célula hospedeira humana, com especificidade de sítio preferida, no cromossoma 19q 13.3 ou pode ser mantido de modo epissomal. Uma única partícula de AAV pode acomodar até 5 kb de ssDNA deixando, por conseguinte, cerca de 4,5 kb para um transgene e elementos regulatórios, o que é tipicamente suficiente. Contudo, os sistemas de excisão em trans, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 6544785, podem quase duplicar este limite. 0 AAV pode ser AAV7 ou AAV8. Os vírus adeno-associados de muitos serotipos, especialmente AAV2, têm sido extensamente estudados e caracterizados como vectores de terapia génica. Os especialistas na técnica estarão familiarizados com a preparação de vectores de terapia génica baseados em AAV funcionais. Numerosas referências a diversos métodos de produção, purificação e preparação de AAV para administração a indivíduos humanos podem consultar-se no extenso conjunto de literatura publicada (ver, e. g., Virai Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Além disso, a terapia génica baseada em AAV dirigida a células do SNC foi descrita nas Patentes dos Estados Unidos N° 6180613 e 6503888. São vectores de AAV exemplificativos adicionais vectores de serotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV 6, AAV7 e AAV 8 recombinantes codificando proteína humana. Vectores pseudotipados adicionais 43 podem ser os vectores de AAV AAV2/1, AAV2/2, AAV2/6, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8.

Em determinados métodos da presente divulgação, o vector compreende um transgene ligado, de um modo operativo, a um promotor. 0 transgene codifica uma molécula biologicamente activa, cuja expressão no SNC resulta, pelo menos, em correcção parcial de neuropatologia. 0 gene de HIFl-alfa é bem conhecido na técnica. Ver, e. g., NM_001530. e NP_001521. As sequências de transactivação NFkkB podem ser substituídas pela sequência de transactivação HIFl-alfa. Ver, e. g., NM_003998. 0 nível de expressão transgénica em células eucarióticas é largamente determinado pelo promotor transcricional dentro da cassete de expressão transgénica. Os promotores que mostram actividade de longo prazo e são específicos de tecido e, até, de célula, são utilizados em algumas formas de realização. Os exemplos não limitativos de promotores incluem mas não estão limitados ao promotor de citomegalovírus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet. 8:148-154), promotor de p3-globina de CMV/humano (Mandei et al. (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284), promotor GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther. 8:1323-1332), o promotor de enolase específico de neurónio (NSE) de 1,8 kb (Klein et al. (1998) Exp. Neurol. 150:183-194), promotor de actina beta (CBA) de galinha (Miyazaki (1989) Gene 79:269-277), o promotor de β-glucuronidase (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics 10:1009-1018) e os promotores de ubiquitina, tais como os isolados de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana e ubiquitina C humana, como descrito na Patente US N° 6667174.

Para prolongar a expressão, outros elementos regulatórios podem ainda estar ligados, de um modo operativo, ao transgene, tais como, e. g. , o Elemento Pós-Regulatório do Vírus da Hepatite de 44

Marmota Americana (WPRE) (Donello et al. (1998) J. Virol. 72:5085-5092) ou o sítio de poliadenilação da hormona bovina do crescimento (BGH).

Para algumas aplicações de terapia génica de SNC, pode ser necessário controlar a actividade transcricional. Para o efeito, a regulação farmacológica da expressão génica com vectores virais pode ser obtida pela inclusão de diversos elementos regulatórios e promotores responsivos a fármacos, como descrito, por exemplo, em Haberma et al. (1998) Gene Ther. 5:1604-16011; e

Ye et al. (1995) Science 283:88-91.

Em determinados casos, a concentração ou título do vector na composição é, pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xlO12 gp/mL) ; (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xlO9 tu/mL) ; ou (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xlO10 iu/mL) . O transgene pode codificar uma molécula biologicamente activa, cuja expressão no SNC resulta, pelo menos, em correcção parcial de neuropatologia. Em algumas formas de realização, o produto transgénico terapêutico é uma proteína HIFl-alfa para utilização num método que alivia e/ou previne os sintomas da ALS. Ver Raoul et al. (2005) Nat. Med. 11 (4) :423-428 e Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11(4):429-433.

Os transgenes, além de HIFI-alfa, podem ser utilizados para expressar uma quantidade terapêutica de factor 1 de crescimento de insulina (IGF-1), calbindina D28, parvalbumina, SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2 e CNTF (Factor neurotrófico ciliário). 45 A presente divulgação proporciona métodos para modular, corrigir ou aumentar a função motora num indivíduo acometido com lesão de neurónio motor. Para efeitos de ilustração, apenas, o indivíduo pode sofrer de um ou mais de esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular bulbar espinal, atrofia muscular espinal (SMA), ataxia cerebelosa espinal, esclerose lateral primária (PLS) ou lesão traumática da medula espinal.

Sem limitação a respeito de teoria, a patologia associada a lesão de neurónio motor pode incluir degenerescência de neurónio motor, gliose, anormalidades de neurofilamento, perda de fibras mielinizadas em aparelhos corticospinais e raízes ventrais. São reconhecidos dois tipos de começo; começo bulbar, que afecta neurónios motores do tronco cerebral (afecta os músculos faciais, discurso e deglutição); e começo límbico, que afecta neurónios motores de medula espinal, é reflectido por espasticidade, fraqueza generalizada, atrofia muscular, paralisia e insuficiência respiratória. Na ALS, os indivíduos têm começo bulbar e límbico. Na PLS, os indivíduos têm começo bulbar. A capacidade de organizar e executar actos motores complexos depende de sinais das áreas motoras no córtex cerebral, i. e., o córtex motor. Os comandos motores corticais descem em dois aparelhos. As fibras corticobulbares controlam os núcleos motores no tronco cerebral que movimentam músculos faciais e as fibras corticospinais controlam os neurónios motores espinais que inervam os músculos do tronco e membros. 0 córtex cerebral também influencia indirectamente a actividade motora espinal ao actuar nas vias do tronco cerebral descendente. 46 0 córtex motor primário situa-se ao longo da circunvolução pré-central na área (4) de Broadmann. Os axónios dos neurónios corticais que se projectam para a medula espinal correm juntos no aparelho corticospinal, um feixe maciço de fibras contendo cerca de 1 milhão de axónios. Cerca de um terço destes tem origem na circunvolução pré-central do lobo frontal. Outro terço tem origem na área 6. 0 restante tem origem nas áreas 3, 2 e 1 no córtex sensorial somático e regulam a transmissão da alimentação aferente através do corno dorsal.

As fibras corticospinais correm juntamente com as fibras corticobulbares através do ramo posterior da cápsula interna para alcançar a porção ventral do mesencéfalo. Separam-se no mesocéfalo em pequenos feixes de fibras que correm entre os núcleos pontinos. Reagrupam-se na medula para formar a pirâmide medular. Cerca de três quartos das fibras corticospinais cruzam a linha média na decussação piramidal, na junção do bolbo raquidiano e medula espinal. As fibras cruzadas descem na parte dorsal das colunas laterais (coluna dorsolateral) da medula espinal, formando o aparelho corticospinal lateral. As fibras não cruzadas descem nas colunas ventrais como o aparelho corticospinal ventral.

As divisões lateral e ventral do aparelho corticospinal terminam em torno das mesmas regiões da matéria cinzenta espinal, como os sistemas lateral e medial do tronco cerebral. 0 aparelho corticospinal lateral projecta-se, principalmente, para núcleos motores na parte lateral do corno ventral e para interneurónios na zona intermédia. 0 aparelho corticospinal ventral projecta-se bilateralmente para a coluna celular ventromediana e para porções contíguas da zona intermédia que contém os neurónios motores que inervam músculos axiais.

Num aspecto da presente descrição, os métodos divulgados incluem administrar, no SNC de um indivíduo acometido, um vector virai neurotrófico transportando um transgene codificando um produto terapêutico e permitir que o transgene seja expresso dentro do SNC, próximo do sítio de administração, a um nível suficiente para exercer um efeito terapêutico, à medida que a proteína expressa é transportada por meio do CSF para todo o SNC. Além disso, o vector pode compreender um polinucleótido codificando uma molécula biologicamente activa, eficaz para tratar o distúrbio de SNC. Essas moléculas biologicamente activas podem compreender péptidos incluindo mas não limitados a versões nativas, fundidas ou mutadas de proteínas de comprimento completo, versões nativas, fundidas ou mutadas de fragmentos de proteína, polipéptidos sintéticos. A administração pode ser alcançada por injecção directa de uma solução de vector de elevado título dentro da medula espinal de um indivíduo ou doente.

Em algumas formas de realização da presente descrição, os métodos compreendem a administração de um vector neurotrófico de elevado título transportando um transgene terapêutico, de modo que o produto transgénico seja expresso, a um nível terapêutico, num primeiro sítio dentro da medula espinal. 0 título virai da composição pode ser, pelo menos: (a: ) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (χΙΟ12 gp/mL) ; (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 , 20, 25 ou 50 (xlO9 tu/mL) ; ou (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xlO10 iu/mL) . Em murganhos experimentais, o volume total de solução de AAV injectada é, por exemplo, entre 1 a 2 0 μύ. Para outros mamíferos, incluindo o humano, os volumes e taxas de 48 distribuição são escalonados de modo apropriado. 0 tratamento pode consistir numa única injecção por sítio alvo ou pode ser repetido num ou mais sítios. Podem ser utilizados múltiplos sítios de injecção. Além de um primeiro sítio de administração, uma composição contendo um vector virai transportando um transgene pode ser administrada noutro sítio, que pode ser contralateral ou ipsilateral em relação ao primeiro sítio de administração. As injecções podem ser únicas ou múltiplas, unilaterais ou bilaterais.

As preparações de AAV de elevado título podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na matéria, e. g., como descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5658776 e Virai Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Distribuição de vector virai de rAAV de transgene na medula espinal

Até à data, tem havido relativamente poucos estudos que monitorizem de modo sistemático padrões de distribuição de diferentes serotipos de rAAV no sistema nervoso. Um dos mais informativos sugeria que rAAV2/l e rAAV2/5 tendiam a exibir transdução mais elevada do que rAAV2/2. Além disso, o transporte retrógrado de rAAVl e rAAV5 foi observado [20] . Foram, por conseguinte, conduzidas experiências iniciais para determinar a absorção e distribuição relativas de um número de serótipos de 49 AAV, utilizando duas vias de distribuição, em células na medula espinal, com o foco em neurónios motores. Estas experiências iniciais compararam a injecção de medula espinal intraparenquimatosa de AAV codificando para GFP (proteína verde fluorescente) com a injecção intramuscular de AAV codificando para GFP. Seis vectores de AAV pseudotipados diferentes foram avaliados, incluindo os serotipos 2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/7 e 2/8.

Injecções intra-medula espinal. Os murganhos foram anestesiados por inalação de isoflurano e imobilizados utilizando um dispositivo estereotáxico. Os grupos de murganhos foram injectados com um vector AAV CBA-GFP; um grupo com cada um dos seguintes serotipos: AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7 e AAV2/8. Cada murganho recebeu um total de 2,5 e 10 partículas resistentes a DNAse (DRP). A dose foi injectada por injecção intraparenquimatosa dentro das seguintes áreas da medula espinal, a região C6 (dentro da região cervical) , a região T8/T9 e a região T13 (dentro da região torácica) e a região L3/L4 (dentro da região lombar). Foram injectados quatro microlitros de vírus por sítio, a uma taxa de 1 microlitro/minuto.

Injecções Intramusculares. Os grupos de murganhos foram injectados com um vector AAV CBA-GFP; um grupo com cada um dos seguintes serotipos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7 e AAV2/8. Cada murganho recebeu quatro injecções de AAV; duas injecções dentro do músculo quadríceps e duas injecções dentro do músculo gastrocnémio. Cada murganho recebeu uma dose total de 2,5 e 10 partículas resistentes a DNAse (DRP).

Foram dissecados cérebro intacto, medula espinal e músculos. O ADN foi extraído por meio do kit Dneasy™ da Qiagen. A análise do ensaio Taqman™ de BGH (hormona bovina do 50 crescimento) foi conduzida no cérebro, medula espinal e músculos, utilizando iniciadores e sondas contra a sequência de BGH no vector AAV CBA-GFP, para determinar o número de cópias de genoma de vector em cada tecido. 0 número de cópia de BGH em ADN total foi determinado. A imuno-histoquímica também foi realizada nas medulas espinais dissecadas para detectar cada do seguinte: 1) GFP, para medir a expressão transgénica, 2) Proteína glial fibrilar ácida (GFAP), para marcar células gliais e 3) SM132 e NeuN, para marcar células neuronais. A Figura 1 demonstra o número de genomas de vector de AAV que foi distribuído na medula espinal por injecções espinais ou por injecção intramuscular. Verificaram-se mais genomas de vector nas medulas espinais de murganhos tratados com injecções espinais AAV 2/7 e 2/8. A Figura 2 mostra o número de genomas de vector que foram distribuídos no cérebro após injecção de medula espinal ou intramuscular dos vectores de AAV. Muito pouco vector de AAV estava presente no cérebro. Entre os diferentes grupos de tratamento, não eram evidentes diferenças significativas. Os dados demonstram que havia pouca disseminação de vector no cérebro, após injecção directa de medula espinal de qualquer serotipo de AAV. Tal pode ser uma vantagem de segurança e sugere que o vector permanece na área da medula espinal após injecção de medula espinal. A Figura 3 mostra o número de genomas de vector que foram distribuídos no músculo após injecção intramuscular dos vectores de AAV. 51

Os dados demonstram que a injecção directa de medula espinal de vectores de AAV medeia maior transferência génica na medula espinal, em comparação com injecção intramuscular dos vectores de AAV. Tal é demonstrado pelo maior número de genomas de vector de AAV medido na medula espinal, em murganhos injectados na medula espinal, versus no músculo com idênticos vectores de AAV. Além disso, os dados demonstram que os serotipos mediando a transferência génica de medula espinal mais elevada nesta experiência foram AAV2/7 e AAV2/8.

Os resultados de imuno-histoquímica demonstram que a injecção de medula espinal de vectores de AAV codificando para GFP resultou em expressão significativa de GFP. A expressão de GFP era co-localizada em células expressando marcadores neuronais, SM132 e NeuN. Não foi observada co-localização de GFP com GFAP, um marcador de astróglia. Os resultados imuno-histoquimicos foram semelhantes para a totalidade dos serotipo testada. Após injecção intramuscular, não foram observadas células GFP ou foram observadas poucas células positivas para GFP (maioritariamente não neuronais) na medula espinal após injecções intramusculares.

Exemplo 2. Avaliação de AAV-HIF-lalfaNFKB no cérebro de murganho.

Injecção de AAV-HIFlalfaNFKB no cérebro de murganho: Os murganhos foram injectados com vectores de AAV codificando HIFlalfaNFxB na área do tálamo do cérebro. Dói serotipos foram avaliados 1) AAV2/1-HIFlalfaNFxB e 2) AAV2-HIFlalfaNFxB. Cada murganho recebeu 9 e9 partículas resistentes a DNAse (DRP). Os murganhos não tratados serviram como controlos. Quatro semanas 52 pós-injecção, os murganhos foram mortos e os seus cérebros foram recolhidos. A hibridação in situ foi realizada em secções do cérebro para visualizar ARNm de HIF-lalfa. Também foi realizado RT-PCR em ADNc extraído dos cérebros para avaliar a expressão génica de VEGF. A expressão génica de VEGF foi normalizada para expressão génica de GUSB. 0 ARNm de HIF-1 alfa foi observado por meio de hibridação in situ em cérebros de murganhos tratados com AAV2/1-HIFlalfaNFxB e AAV2-HIFlalfaNFKB; não foi observada mensagem no cérebro de controlo. Foi observado mais sinal de ARNm de HIF-lalfa em murganhos tratados com AAV2/l-HIFlalfaNFKB. A análise de expressão génica por RT-PCR demonstrou um aumento na expressão génica de VEGF em murganhos tratados com AAV2/l-HIFlalfaNFKB em relação a animais de controlo. Não foi observado aumento mensurável de expressão génica de VEGF em murganhos tratados com AAV2-HIFlalfaNFKB.

Numa segunda experiência, os murganhos foram injectados com AAV2/l-HIFlalfaNFKB bilateralmente dentro da área do cerebelo do cérebro de murganho. Cada murganho recebeu 2 elO partículas resistentes a DNAse (DRP). Os murganhos não tratados serviram como controlos. Três semanas pós-injecção, os murganhos foram mortos e os seus cérebros foram recolhidos. A hibridação in situ foi realizada em secções do cérebro para visualizar ARNm de HIF-lalfa. Também foi realizado RT-PCR em ADNc extraído dos cérebros para avaliar a expressão génica de VEGF, EPO e IGF-1. Os níveis de expressão foram normalizados para expressão génica de GUSB. 0 ARNm de HIF-lalfa foi observado por meio de hibridação in situ em todo o cerebelo. A expressão era robusta e estava 53 presente em todas as diversas camadas celulares neuronais. Não foi observado ARNm de HIF-lalfa no cérebro. 0 ARNm de HIF-lalfa não foi observado nos cérebros de murganhos de controlo. Como mostrado na Figura 4, após transdução com um vector de AAV codificando para HIF-1 alfa, os níveis de ARNm de VEGF, EPO e IGF-1 eram regulados de modo positivo no cérebro. Não foi observada regulação positiva nestes genes em murganhos de controlo. Tal demonstra que HIF-lalfa tem a capacidade de modular níveis de expressão génica em genes alvo no cérebro, após transdução com um vector de AAV.

Exemplo 3. Distribuição mediada por rAAV de HIF-lalfa na medula espinal de murganhos de ALS.

Modelo terapeuticamente Relevante de Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS). A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é uma doença neurodegenerativa fatal que é caracterizada por uma perda selectiva de neurónios motores no córtex, tronco cerebral e medula espinal. A progressão da doença pode conduzir a atrofia dos músculos dos membros, axiais e respiratórios. A morte celular do neurónio motor é acompanhada de gliose reactiva, anormalidades de neurofilamento e uma perda significativa de grandes fibras mielinizadas nos aparelhos corticospinais e raízes ventrais. Embora a etiologia da ALS seja insuficientemente compreendida, a acumulação de provas indica que a ALS esporádica (SALS) e familiar (FALS) partilham muitas características patológicas semelhantes; proporcionando, deste modo, uma esperança que o estudo de qualquer das formas conduza a um tratamento comum. A FALS contribui para, aproximadamente, 10% dos casos diagnosticados, dos quais 20% estão associados a mutações, herdadas de modo dominante, em Cu/Zn superóxido dismutase (SOD1). Os murganhos transgénicos que expressam a 54 proteína S0D1 humana mutante (e. g., murganhos S0D1G93A) recapitulam muitas características patológicas da ALS e são um modelo animal disponível para estudar a ALS. Para a SALS, uma miríade de mecanismos patológicos tem estado implicada como a causa subjacente, incluindo excitotoxicidade induzida por glutamato, exposição a toxina, disfunção de proteassoma, lesão mitocondrial, desorganização de neurofilamento e perda de suporte neurotrófico.

Será testada a hipótese de que a distribuição mediada por rAAV de HIF 1 alfa na medula espinal pode promover a sobrevivência de neurónio motor e melhorar a progressão da doença de murganhos de ALS S0D1G93A. A distribuição com um vector de AAV recombinante permite expressão transgénica de prazo relativamente longo (os murganhos de ALS podem requerer expressão transgénica durante muitos meses). Além disso, dependendo do serotipo, o AAV infecta células neuronais e não neuronais, um potencial benefício se, como se suspeita, as células não neuronais participarem na morte dos neurónios motores [21].

Esboço experimental. Utilizaram-se injecções intra-espinais para administrar AAV2/8-HIFlalfa NFkB, para determinar o efeito desta estratégia na sobrevivência de neurónio motor e começo de doença e sobrevivência de murganhos de ALS S0D1G93A.

Infecção de rAAV de medula espinal de murganhos de ALS. Para cada grupo de tratamento virai, murganhos S0D1G93A ou S0D1 WT (5/grupo) e murganhos WT (5/grupo), de 60 dias de idade ou 90 dias de idade, foram injectados com 1 e 11 DRP de AAV2/8-Hiflalfa-NFxB. Como controlos negativos, os murganhos de SODl, de 60 dias de idade ou 90 dias de idade, foram injectados 55 com a mesma dose de vector vazio. (Como um controlo positivo adicional, murganhos S0D1 (5/grupo), de 60 dias de idade ou 90 dias de idade, poderiam ser injectados com a mesma dose de vector AAV2/8-hIGF-l (IGF-1 humana). Um controlo negativo adicional também poderia ser murganhos de tipo selvagem). O vírus foi injectado dentro das vértebras C6, T8/T9, T13, L3/L4 da medula espinal, 4 pL por sítio, distribuído a 1 pL/min, com dose total de 2,5 e 10 DRP. Os ensaios de TaqMan serão utilizados para detectar genomas virais, mensagem para HIFlalfa e VEGF na medula espinal. A hibridação in situ de medulas espinais foi realizada para visualizar a expressão de HIFl-alfa nas medulas espinais de murganhos tratados com AAV2/8-Hiflalfa-NFxB e de controlo negativo.

Tamanho de amostra e considerações estatísticas. Vinte murganhos TgSODlG93A foram tratados com AAV2/8- HIF 1 alfa para serem observados para começo e sobrevivência. 30 Murganhos adicionais de cada tipo poderiam ser sacrificados para análise histológica e bioquímica, a 110 d e terminalmente. Com base em estudos anteriores, pressupôs-se que (i) murganhos com o transgene S0D1G93A vivem 130 ± 13 dias; (ii) o poder estatístico do presente estudo para detectar a diferença intergrupo verdadeira é 90%; (iii) alfa é bilateral a 0,05; e (iv) deseja-se detectar uma diferença de 10% ou maior em sobrevivência média de murganhos tratados. Com estes pressupostos, requer-se um mínimo de 14 murganhos por haplótipo de teste. Foi, por conseguinte, escolhido observar, pelo menos, 20 animais em cada grupo para o começo, progressão e sobrevivência de doença, no caso de os murganhos morrerem por razões não relacionadas com a sua doença de neurónio motor. Na análise de sobrevivência final, foram avaliados 20 murganhos tratados com AAV2/8- HIFlalfa e foram avaliados 18 murganhos de 56 controlo. Poderiam ser sacrificados 30 murganhos adicionais por grupo para análise histológica e bioquímica, em intervalos de tempo predeterminados (5 por mês x 6 meses). O tempo do começo e sobrevivência de doença foi comparado utilizando representações gráficas de Kaplan-Meier e o teste estatístico log-rank. Será empregue um modelo de risco proporcional de Cox para controlar para os efeitos de género.

Determinação do efeito de rAAV-HIFlalfa no fenótipo de ALS. O começo de doença é definido pelo aparecimento de tremores nas pernas estendidas, quando o murganho é segurado pela sua cauda. A morte é definida como o ponto em que o murganho não consegue endireitar-se no espaço de 30 segundos.

Avaliação do efeito de rAAV- HIFlalfa na sobrevivência de neurónio motor. Será utilizada análise de raiz ventral para monitorizar os números de neurónio motor em 5 murganhos TgSODlG93A tratados com rAAV-HIFlalfa, em intervalos de tempo sintomáticos (110 dias) e de final de estádio.

Resultados. Foi observado um aumento estatisticamente significativo (p = 0,033) na sobrevivência de murganho de ALS, após administração intra-espinal de AAV2/8 HiflaNFkB (animais de controlo de sobrevivência de 133 dias vs experimentais de sobrevivência de 139 dias). Diferentes coortes de animais responderam de modo diferente ao tratamento; 25% dos animais tratados mostraram um aumento na sobrevivência de 18-23 dias, enquanto 25% dos animais mostraram um aumento na sobrevivência de 8-13 dias. A análise de hibridação in situ para Hifl aNFkB, nas medulas espinais de murganhos de ALS tratados com AAV2/8 HiflaNFkB, sugere que a transdução se verificou, principalmente, na região lombar da medula espinal. Além disso, a análise sugere 57 que apenas 25% da dose pretendida de 1 e 11 drp foi administrada aos animais. TABELA 1

Tabela de Sumário de Sobrevivência para a Coluna 1 Variável Censora: Coluna 3 Variável de Agrupamento: Coluna 1.2 # De # De # De % De # De # De Obs. Eventos Censurados Censurados Ausentes Inválidos CONTROLO 18 13 5 27,778 0 0 EXP 20 20 0 0,000 0 0 Total 38 33 5 13,158 0 0 TABELA 2

Estatística de Sobrevivência de Kaplan-Meier para a Coluna 1 Variável Censora: Coluna 3 Variável de Agrupamento: Coluna 1.2

Estimativa Erro-Padrao CONTROLO: 25% 129,000 4, 992 CONTROLO: 50% 134,000 2,996 CONTROLO: 75% 139,000 1,519 CONTROLO: Média 133,000 2,169 EXP. 25% 131,000 4, 782 EXP. 50% 139,000 2, 966 EXP. 75% 144,000 3, 873 EXP. Média 138,100 2,334 58

Exemplo 4. Construção de Híbrido/Quimera

Um factor de transcrição híbrido (pcDNA3/HIF.VP-16.Af12) , composto por um domínio de ligação de ADN e dimerização de HIF-Ια e o domínio de transactivação de VP16 de vírus herpes simplex, pode ser construído para proporcionar activação forte, constitutiva, de genes normalmente envolvidos na adaptação fisiológica a hipoxia, como esboçado abaixo. 0 gene de HIF-1 α de comprimento completo (aa 1-826) foi isolado por PCR (Kit de PCR Advantage cDNA, Clontech, Paio Alto, Calif.) de uma biblioteca de ADNc de células HeLa (Clontech), utilizando os iniciadores expostos (SEQ ID N° : 4: ggggtacctt ctcttctccg cgtgtggagg gagccagc; SEQ ID N°: 5: gctctagagt gagccaccag tgtccaaaaa aaggatg) e inserido entre os sítios Kpnl e Xbal do vector de expressão, pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Neste plasmídeo, a expressão génica é controlada pelo estimulador/promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV). 0 híbrido HIF-1 oí/VP-16 foi construído pelo truncamento de HIF-1 a, nos aa 390 (um sítio Afl2) e, depois, unindo o domínio de transactivação de HSV VP-16 a jusante. Um fragmento de VP16 (aa 413-490), com extremidades Afl2 e Xbal, foi amplificado por PCR, utilizando a Vent polimerase (New England Biolabs, Beverly, MA) e os iniciadores exposto (SEQ ID NO:6: cgtacgctta agccggaatt cccggggatc tgg; SEQ ID N°: 7: cgctctagac tacccaccgt actcgtcaat tc) e este fragmento foi clonado dentro dos sítios apropriados da construção pcDNA3/ HIF-1 a. Uma construção relacionada (pcDNA3/HIF/VP-16/Rl) foi produzida pelo truncamento de HIF-1 a, nos aa 530, por digestão parcial com EcoRl. A integridade de todas as sequências geradas por PCR foi verificada por sequenciação de ADN utilizando um sequenciador de ADN 377 da Applied Biosystems. Todas as manipulações de clonagem foram 59 efectuadas seguindo processos padrão (Sambrook, J. et al., Molecular Clonlng, A Laboratory Manual 2a Ed. (Cold Spring Harbor, N.I., 1989). As enzimas de restrição e enzimas de modificação de ADN foram obtidas de New England Biolabs ou Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Md.) e utilizadas de acordo com as especificações do fabricante. Os ADN plasmidicos foram purificados com kits obtidos da Qiagen (Chatsworth, Calif.).

Salvo indicado em contrário, todos os números expressando quantidades de ingredientes, cultura celular, condições de tratamento e assim por diante, utilizados na descrição, incluindo reivindicações, devem ser compreendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Consequentemente, salvo indicado de outro modo em contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar, dependendo das propriedades desejadas que se pretendem obter pela presente invenção. Salvo indicado em contrário, o termo "pelo menos", precedendo uma série de elementos, deve ser compreendido como referindo-se a cada elemento na série. Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às formas de realização especificas da invenção aqui descritas.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> 0'Riordan, Catherine Wadsworth, Samuel <120> Terapia Génica para Esclerose Lateral Amiotrófica e Outros Distúrbios de Medula Espinal <130> 003482.00049 <150> 60/827977 <151> 2006-10-03 <160> 7 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 1431 <212> ADN 63 <213> Homo sapiens <400> 1 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa 60 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt 120 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg 180 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt 240 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt 300 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg 360 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac 420 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa 480 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga 540 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgeaet gcacaggcca catteacgta 600 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg 660 gtgctgattt gtgaacccat Ccctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag 720 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattctctt attgtgatga aagaattacc 780 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat 840 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc 900 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa 960 gcaactgtca catataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac 1020 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc 1080 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca 1140 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagccggaat tcccggggat ctgggccccc 1200 ccgaccgatg tcagcctggg ggacgagctc cacttagacg gcgaggacgt ggcgatggcg 1260 catgccgacg cgctagaega tttcgatctg gacatgttgg gggacgggga ttccccgggg 1320 ccgggattta ccccccacga ctccgccccc tacggcgctc tggatatggc cgacttcgag 1380 tttgagcaga tgtttaccga tgcccttgga attgacgagt acggtgggta g 1431 <210> 2 <211> 1173 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa 60 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt 120 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg 180 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt 240 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt 300 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg 360 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac 420 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa 480 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga 540 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgeaet gcacaggcca catteacgta 600 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg 660 gtgctgattt gtgaacccaC tcctcaccca tcaaatattg aaatcccttt agatagcaag 720 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc 780 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat 840 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc 900 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa 960 gcaactgtca catataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac 1020 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc 1080 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca 1140 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aag 1173

<210> 3 <211> 475 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 ccggaattcc cggggatctg ggcccccccg accgatgtca gcctggggga cgagctccac 60 ttagacggcg aggacgtggc gatggcgcat gccgacgcgc tagacgattt cgatctggac 120 atgttggggg acggggattc cccggggccg ggatttaccc cccacgactc cgecccctac 180 ggcgctctgg atatggccga cttcgagttt gagcagaccg gaattcccgg ggatctgggc 240 ccccccgacc gatgtcagcc tgggggacga gctccactta gacggcgagg acgtggcgat 300 ggcgcatgcc gacgcgctag acgatttcga tctggacatg ttgggçgacg gggattcccc 360 ggggccggga tttacccccc acgactccgc cccctacggc gctctggata tggccgactt 420 cgagCttgag cagatgttta ccgatgccct tggaattgac gagtacggtg ggtag 475

<210> 4 <211> 38 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 ggggtacctt ctcttctccg cgtgtggagg gagccagc 38 <210> 5 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens 65 <400> 5 gctctagagt gagccaccag tgtccaaaaa aaggatg 37 <210> 6 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 cgtacgctta agccggaatt cccggggatc tgg 33 <210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 cgctctagac tacccaccgt actcgtcaat tc 32

Lisboa, 19 de Novembro de 2012 66

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vector de vírus adeno-associado de pseudotipo 2/7 ou 2/8 codificando HIFl-alfa, para utilização num método de tratamento de um mamífero com um distúrbio de neurónio motor.
2. 2. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o pseudotipo do vector de vírus adeno-associado é 2/7.
3. 3. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o pseudotipo do vector de vírus adeno-associado é 2/8.
4. 4. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o vector se destina a ser injectado dentro da medula espinal do mamífero.
5. 5. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o vector se destina a ser distribuído para dentro de uma pluralidade de sítios na medula espinal.
6. 6. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o vector codifica uma proteína de fusão de HIFl-alfa e VP16 de HSV. 1
7. 7. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o vector codifica uma proteína de fusão de HIFl-alfa e NFkB.
8. 8. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a proteína de fusão é codificada por uma sequência nucleotídica como mostrada na SEQ ID N°: 1.
9. 9. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o mamífero tem um estado seleccionado do grupo consistindo em atrofia muscular bulbar espinal, ataxia cerebelosa espinal, atrofia muscular espinal e lesão traumática da medula espinal.
10. 10. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações até 8, em que o mamífero tem esclerose lateral amiotrófica.
11. 11. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o mamífero é seleccionado do grupo consistindo num roedor, num murino, num humano e num símio.
12. 12. Vector de vírus adeno-associado para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o mamífero é um humano. Lisboa, 19 de Novembro de 2012 2