ES2607060T3 - Terapia génica para atrofia muscular espinal - Google Patents

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Abstract

Un vector de virus adeno-asociado recombinante de pseudotipo 2/7 o 2/8 que codifica SMN-1, para su uso en un método de tratamiento de un mamífero que tiene atrofia muscular espinal, en el que el vector va a inyectarse en la médula espinal del mamífero.

Description

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La divulgación engloba otros ácidos nucleicos que codifican proteínas del transactivador quimérico biológicamente activas, por ejemplo, una proteína que comprende los dominios de unión de ADN y de dimerización de HIF-1α y el dominio de transactivación de una proteína NFκB (por ejemplo, una proteína NFκB humana).
Los factores de transcripción eucariotas están frecuentemente compuestos de dominios de unión de ADN y del activador transcripcional separados e independientes (Mitchell y Tjian, Science 245:371-378 (1989)). La independencia de los dominios ha permitido la creación de proteínas de fusión funcionales que consisten en los dominios de unión de ADN y de activación de proteínas heterólogas. Se construyeron proteínas reguladoras eucariotas quiméricas, que consisten en la proteína de unión de ADN lexA y el dominio de activación del factor de transcripción de levadura, GAL4, por Brent y Ptashne (Nature 312:612-615 (1985)). El uso de proteínas de fusión ha identificado varios tipos de dominios de proteína que actúan de activadores transcripcionales. Estos dominios tienen poca similitud de aminoácidos, pero frecuentemente se caracterizan por ser altamente ácidos (como en el caso de GAL4 y GNC4), ricos en glutamina (como en el caso de Sp1), o ricos en prolina (como en el caso de NF1, Ma y Ptashne, Cell 51:113-119 (1987); Courey y Tjian (1988); Mermod et al., Cell 58:741-753 (1989)).
Uno de los dominios del activador más eficientes está contenido en los 100 aminoácidos del extremo carboxilo de la proteína 16 (VP16) del virus del herpes simple (VHS) (Sadowski et al., Nature 335:563-564 (1988); Triezenberg et al., Genes & Dev. 2:718-729 (1988)). VP16, también conocida como Vmw65 o factor trans-inductor del gen alfa, es una proteína estructural del VHS que activa la transcripción de los promotores tempranos inmediatos del virus, que incluyen aquellos para ICPO e ICP4 (Campbell et al., J. Mol. Biol. 180:1-19 (1984); Kristie y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81:4065-4069 (1984); Pellet et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:5870-5874 (1985)). Aunque VP16 activa específicamente promotores que contienen el llamado elemento TAATGARAT, la especificidad se crea por una proteína(s) de unión de ADN celular(es) que es (son) complejada(s) con el (los) dominios(s) del extremo amino de VP16 (McKnight et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:7061-7065 (1987); Preston et al., Cell 52:425-434 (1988)).
La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican proteínas de transactivación híbridas/quiméricas que comprenden una porción funcional de una proteína de unión de ADN y una porción funcional de una proteína del activador transcripcional. Tales proteínas de transactivación híbridas/quiméricas ofrecen una variedad de ventajas, que incluyen la activación específica de la expresión de los genes inducibles por hipoxia que contienen elementos sensibles a la hipoxia (HREs), logrando así excepcionalmente altos niveles de expresión génica. Ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de transactivación híbridas/quiméricas son capaces de funcionar en células de vertebrado y pueden codificar proteínas de transactivación transcripcional que existen de forma natural o dominios de proteínas (por ejemplo, proteínas de transactivación transcripcional que existen de forma natural o dominios de células eucariotas que incluyen células de vertebrado), proteínas de transactivación virales o dominios o cualquier secuencia de aminoácidos sintética que sea capaz de estimular la transcripción de un promotor de vertebrado. Ejemplos de tales proteínas de transactivación incluyen, pero no se limitan a, el factor de transcripción específico linfoide identificado por Muller et al. (Nature 336:544-551 (1988)), la proteína fos (Lucibello et al., Oncogene 3:43-52 (1988)); proteína v-jun (Bos et al., Cell 52:705-712 (1988)); factor EF-C (Ostapchuk et al., Mol. Cell. Biol. 9:27872797 (1989)); proteína tat del VIH-1 (Arya et al., Science 229:69-73 (1985)), la proteína E2 del virus del papiloma (Lambert et al., J. Virol. 63:3151-3154 (1989)), la proteína E1A del adenovirus (revisada en Flint y Shenk, Ann. Rev. Genet. (1989), factores de choque térmico (HSF1 y HSF2) (Rabindran, et al., PNAS 88:6906-6910 (1991)); la proteína p53 (Levine, Cell 88:323-331 (1997), Ko y Prives, Genes Dev. 10:1054-1072 (1996)); Sp1 (Kadonaga, et al. Cell 51:1079-1090 (1987)); AP1 (Lee, et al., Nature 325:368-372 (1987)); CTF/NF1 (Mermod, et al., Cell 58: 741-753 (1989)), E2F1 (Neuman, et al., Gene 173: 163-169 (1996)); HAP1 (Pfeifer, et al., Cell 56: 291-301 (1989)); HAP2 (Pinkham, et al., Mol. Cell. Biol. 7:578-585 (1987)); MCM1 (Passmore, et al., J. Mol. Biol. 204:593-606 (1988); PHO2 (Sengstag, y Hinnen, NAR 15:233-246 (1987)); y GAL11 (Suzuki et al., Mol. Cell. Biol. 8:4991-4999 (1988)). En aspectos particulares de la divulgación, la proteína de transactivación es VP16 del virus del herpes simple (Sadowski
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et al., Nature 335:563-564 (1988); Triezenberg et al., Genes y Dev. 2:718-729 (1988)), NF.kappa.B ((Schmitz y Baeuerle, EMBO J. 10:3805-3817 (1991); Schmitz, et al., J. Biol. Chem. 269:25613-25620 (1994); y Schmitz, et al.,
J. Biol. Chem. 270:15576-15584 (1995)), y los activadores de levadura GAL4 y GCN4.
Por supuesto, el experto entenderá que los dominios de activación transcripcional útiles en las composiciones y métodos de la presente invención también pueden ser sintéticos, es decir, basados en una secuencia que no está contenida dentro de una proteína que existe de forma natural conocida. Véase, por ejemplo, Pollock y Gilman, PNAS 94:13388-13389 (1997), que enseña que la activación transcripcional es un proceso inherentemente flexible en el que hay poco requisito, si lo hay, de estructuras específicas o contactos de proteína estereoespecíficos. También revisa la variedad de diferentes moléculas que pueden servir de activadores transcripcionales, que incluyen motivos de péptido cortos (tan pequeños como de ocho aminoácidos), hélices anfipáticas simples e incluso dominios mutagenizados de proteínas sin relacionar con activación transcripcional.
Según la divulgación, se combinan secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio de unión de ADN y un dominio de transactivación para preservar las propiedades de unión y de transactivación respectivas de cada uno de los dominios. En diversos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico que codifica la proteína de transactivación, o una porción de la misma capaz de activar la transcripción, puede insertarse en ácido nucleico en un locus que no altere completamente la función del dominio de unión de ADN codificado. Se conocen regiones de proteínas del factor inducible por hipoxia que no son requeridas para las funciones de unión de ADN y de dimerización y regiones de proteínas que no son requeridas para la función de transactivación transcripcional y/o pueden identificarse por métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, análisis de mutaciones mapeadas, además de la identificación de regiones que carecen de mutaciones mapeadas, que son supuestamente menos sensibles a la mutación que otras porciones más funcionalmente relevantes de la molécula. Pueden producirse construcciones recombinantes apropiadas usando técnicas convencionales en biología molecular, que incluyen aquellas expuestas en Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)).
La construcción de ADN recombinante que codifica la proteína del transactivador quimérico puede ponerse bajo el control de (es decir, operativamente unida a) un promotor adecuado y/u otra secuencia de control de la expresión. Puede ser deseable que la proteína del transactivador se ponga bajo el control de una secuencia promotora constitutivamente activa, aunque la proteína del transactivador también puede ponerse bajo el control de un promotor inducible, tal como el promotor de la metalotionina (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)) o un promotor específico de tejido. Secuencias promotoras que pueden usarse según la divulgación incluyen, pero no se limitan a, la región del promotor temprano del SV40 (Benoist y Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga de virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 78:144-1445 (1981)), el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)).
En un aspecto de la divulgación, la proteína del transactivador quimérico está codificada por pcDNA3/HIF/VP16/Af12. En otro aspecto, la proteína del transactivador quimérico está codificada por pcDNA3/HIF/VP16/RI, que es idéntico a pcDNA3/HIF/VP16/Af12 excepto que el segmento de VP16 se inserta después del codón 530 de la región codificante de HIF-1α.
Según la divulgación, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas del transactivador híbridas/quiméricas pueden utilizarse para regular específicamente la expresión de genes que contienen elementos sensibles a la hipoxia (HREs). Estos HREs se corresponden con una secuencia de ácidos nucleicos reconocida y unida por la proteína de unión de ADN usada como esqueleto de la proteína del transactivador quimérico.
En general, los ácidos nucleicos que codifican proteínas del transactivador quimérico pueden usarse para controlar selectivamente la expresión de genes de interés. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las proteínas del transactivador quimérico pueden ponerse bajo el control de un promotor constitutivo y pueden usarse para aumentar constitutivamente la expresión de un gen de interés asociado a elementos sensibles a la hipoxia (HREs), por ejemplo, cuando se desea producir un producto génico particular en cantidad en un cultivo celular o en un animal transgénico. Alternativamente, la proteína del transactivador puede ponerse bajo el control de un promotor específico de tejido de manera que el gen de interés se exprese en un tejido particular. En aspectos alternativos de la divulgación, la función del transactivador quimérico es inducible, de manera que la expresión de un gen de interés, mediante elementos sensibles a la hipoxia (HREs), puede aumentarse o disminuirse selectivamente. Para revisiones de la expresión transgénica condicional e inducible, véase Fishman, Circ. Res., 82:837-844 (1998) y Fishman, Trends Cardiovasc. Med., 5:211-217 (1995).
Para información adicional sobre las construcciones de HIF1-alfa véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º de serie 6.432.947.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una afección neurodegenerativa progresiva que implica la pérdida de grandes neuronas motoras en el cerebro y la médula espinal. Se caracteriza por debilidad progresiva, atrofia y espasticidad, que conducen a parálisis y fallo respiratorio en el plazo de cinco años desde la aparición. La ELA
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rAAV2/5 tendieron a presentar transducción más alta de rAAV2/2. Además, se ha observado transporte retrógrado de rAAV1 y rAAV5 [20]. Los presentes inventores, por tanto, realizaron experimentos iniciales para determinar la captación y administración relativa de varios serotipos de AAV, usando dos vías de administración, a células en la médula espinal, centrándose en las neuronas motoras. Estos experimentos iniciales compararon la inyección intraparénquima de la médula espinal de AAV que codifica GFP (proteína verde fluorescente) con la inyección intramuscular de AAV que codifica GFP. Se evaluaron seis vectores pseudotipificados diferentes de AAV que incluyen los serotipos 2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/7 y 2/8.
Inyecciones en la médula intraespinal. Se anestesiaron ratones por inhalación de isoflurano y se inmovilizaron usando un dispositivo estereotáxico. Se inyectaron grupos de ratones con un vector CBA-GFP de AAV; un grupo con cada uno de los siguientes serotipos: AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7 y AAV2/8. Cada ratón recibió un total de 2,5 e 10 partículas resistentes a DNAsa (DRPs). La dosis se inyectó por inyección intraparénquima en las siguientes áreas de la médula espinal la región C6 (dentro de la región cervical), la región T8/T9 y la región T13 (dentro de la región torácica) y la región L3/L4 (dentro de la región lumbar). Se inyectaron cuatro microlitros de virus por sitio a una tasa de 1 microlitro/minuto.
Inyecciones intramusculares. Se inyectaron grupos de ratones con un vector CBA-GFP de AAV; un grupo con cada uno de los siguientes serotipos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7 y AAV2/8. Cada ratón recibió cuatro inyecciones de AAV; dos inyecciones en el músculo cuádriceps y dos inyecciones en el músculo gastrocnemio. Cada ratón recibió una dosis total de 2,5 e 10 partículas resistentes a la DNAsa (DRPs).
Se diseccionaron cerebro completo, médula espinal y músculos. Se extrajo ADN mediante el kit Qiagen Dneasy™. Se realizó el análisis del ensayo Taqman™ de BGH (hormona de crecimiento bovina) en el cerebro, médula espinal y músculos usando cebadores y sondas contra la secuencia de BGH en el vector CBA-GFP de AAV para determinar el número de copias de genoma de vector en cada tejido. Se determinó el número de copias de BGH del ADN total. También se realizó inmunohistoquímica en las médulas espinales diseccionadas para detectar cada uno de los siguientes: 1) GFP para medir la expresión transgénica, 2) proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) para marcar las células de la glía, y 3) SM132 y NeuN para marcar células neuronales.
La Figura 1 demuestra el número de genomas de vector de AAV que se administraron a la médula espinal por tanto inyecciones espinales como mediante inyecciones intramusculares. Se encontraron más genomas de vector en las médulas espinales de ratones tratados con las inyecciones espinales AAV 2/7 y 2/8.
La Figura 2 muestra el número de genomas de vector que se administraron al cerebro tras tanto la inyección en la médula espinal como intramuscular de los vectores de AAV. Estuvo presente muy poco vector de AAV en el cerebro. No fueron evidentes diferencias significativas entre los diferentes grupos de tratamiento. Los datos demuestran que hubo poca diseminación de vector al cerebro tras la inyección directa en la médula espinal de cualquier serotipo de AAV. Esto puede ser una ventaja de seguridad y sugiere que el vector sigue en el área de la médula espinal tras la inyección en la médula espinal.
La Figura 3 muestra el número de genomas de vector que se administraron al músculo tras la inyección intramuscular de los vectores de AAV.
Los datos demuestran que la inyección directa en la médula espinal de vectores de AAV media en una mayor transferencia génica a la médula espinal en comparación con la inyección intramuscular de los vectores de AAV. Esto se demuestra por el mayor número de genomas de vector de AAV como se mide en la médula espinal en ratones inyectados en la médula espinal frente a en el músculo con vectores de AAV idénticos. Además, los datos demuestran que los serotipos que median en la mayor transferencia génica de la médula espinal en este experimento fueron AAV2/7 y AAV2/8.
Los resultados de inmunohistoquímica demuestran que la inyección en la médula espinal de vectores de AAV que codifican GFP produjo expresión de GFP significativa. La expresión de GFP se co-localizó en células que expresaban marcadores neuronales, SM132 y NeuN. No se observó co-localización de GFP con GFAP, un marcador de la astroglía. Los resultados inmunohistoquímicos fueron similares para todos los serotipos probados. Tras la inyección intramuscular, no se observaron GFP o algunas células positivas para GFP (principalmente no neuronales) en la médula espinal después de las inyecciones intramusculares.
Ejemplo 2. Evaluación de AAV-HIF-1alfaNFκB en el cerebro de ratón.
Inyección de AAV-HIF1alfaNFκB en el cerebro de ratón: Se inyectaron ratones con vectores de AAV que codificaban HIF1alfaNFκB en el área del tálamo del cerebro. Se evaluaron dos serotipos 1) AAV2/1-HIF1alfaNFκB y 2) AAV2-HIF1alfaNFκB. Cada ratón recibió 9 e9 partículas resistentes a la DNAsa (DRPs). Ratones sin tratar sirvieron de controles. Cuatro semanas después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se recogieron sus cerebros. Se realizó hibridación in situ en secciones del cerebro para visualizar ARNm de HIF-1alfa. También se realizó RT-PCR en ADNc extraído de los cerebros para evaluar la expresión génica de VEGF. La expresión génica de VEGF se normalizó a la expresión génica de GUSB.
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