CN105770910A

CN105770910A - 肌萎缩性侧索硬化症和其它脊髓病症的基因治疗

Info

Publication number: CN105770910A
Application number: CN201610214446.3A
Authority: CN
Inventors: C·奥赖尔登; S·瓦兹沃斯
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2006-10-03
Filing date: 2007-10-03
Publication date: 2016-07-20
Also published as: LT3146982T; EP2066791A2; SI2066791T1; ES2757723T3; HUE046709T2; CN101528922A; EP3632472A1; US10920245B2; EP2066791B1; PT3146982T; EP2066791A4; WO2008042420A3; ES2391789T3; EP3146982B1; DK2497500T3; US20090286857A1; ES2607060T3; PL2066791T3; CY1118477T1; EP2497500B1

Abstract

本申请涉及肌萎缩性侧索硬化症和其它脊髓病症的基因治疗。本公开提供了治疗影响受治疗者运动功能和控制的病症或损伤的方法和组合物。一方面，通过将含转基因的重组病毒载体施用至脊髓，将本发明的转基因产物递送到受治疗者的脊髓。病毒载体递送表达编码重组病毒基因产物的转基因。病毒基因产物包括HIF1?α。本发明也提供了将转基因产物递送到受治疗者脊髓的组合物。

Description

肌萎缩性侧索硬化症和其它脊髓病症的基因治疗

本申请是申请日为2007年10月03日、中国申请号为200780038545.X、发明名称为“肌萎缩性侧索硬化症和其它脊髓病症的基因治疗”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及治疗影响受治疗者运动功能，特别是受脑和/或脊髓疾病或损伤影响的运动功能的病症的方法和组合物。

发明背景

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种进行性神经变性病状(condition)，涉及脑和脊髓中大运动神经元的丧失。该病的特征是进行性衰弱、萎缩和痉挛状态，导致在发病5年内瘫痪和呼吸衰竭。家族性ALS占所有ALS病例的10％；这些病例中约25％是由于Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(SOD1)的突变造成的[1]。迄今为止，SOD1基因中鉴定到109个不同的突变，这些突变覆盖了所有5个外显子[2]。除了在重神经丝链(heavy neurofilamentchain，NFH)基因、动力蛋白激活蛋白基因、囊泡(vesicular)结合蛋白1基因和ALSIN基因上的非常罕见的突变外，SOD1是已鉴定的唯一的主要ALS易感性基因座。SOD1是主要存在于的胞质的酶，其催化超氧离子分解成氧和过氧化氢，然后过氧化氢被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶降解形成水。许多证据认为，突变型SOD1蛋白通过获得的相反的功能具有神经毒性，该功能可引起氧化性病理状态和蛋白聚集，伴有谷氨酸代谢、线粒体功能、轴突运输和钙平衡的次级紊乱[3]。突变型SOD1蛋白在小鼠体内高水平的转基因表达产生运动神经元疾病的表型，并且发病年龄和疾病持续时间依赖于拷贝数[4]，这一观察有力支持了突变型SOD1具有毒性。

迄今为止，很少有治疗性干预改变了转基因ALS小鼠的运动神经元表型。尽管迄今为止已测试了超过100种小分子，但这些分子甚至是边际效益(marginal benefit)都很少具有(如利鲁唑[5]、塞内昔布(celecoxib)[6]、arimoclomol[7])。相比之下，一些形式的蛋白治疗是有益的。因此，通过转基因[8]或经IM注射和随后逆向轴突运输到运动神经的AAV2递送系统[9]施用胰岛素样生长因子1，以改进存活。另外2个作为神经保护剂显示有治疗前景的蛋白是促红细胞生成素[10]和血管内皮因子(VEGF)[11,12]。后者令人感兴趣，因为遗传分析表明VEGF基因的减效变体是ALS的危险因子[13]。此外，缺少低氧反应启动子元件的小鼠出现缓慢进行性运动神经元疾病[14]。随后，有文献表明，慢病毒递送VEGF到ALS小鼠的脊髓延缓死亡[15]。2个独立的研究者报导，将VEGF注入ALS小鼠[16]和大鼠[17]的脑脊液也延缓疾病的进程。基因治疗是一种新兴的针对影响中枢神经系统(CNS)病症的治疗方式。能有效感染有丝分裂后神经元的病毒载体的发展促进了CNS基因治疗。中枢神经系统由脊髓和脑组成。脊髓将来自外周神经系统的感觉信息传导给脑，并将来自脑的运动信息传导给各种效应器。将基因递送到中枢神经系统的病毒载体的综述参见Davidson等，(2003)Nature Rev.4:353-364。

认为腺伴随病毒(AAV)载体可用于CNS基因治疗，因为该载体具有有利的毒性和免疫原性特征，能转导神经元细胞，并能介导CNS中的长期表达(Kaplitt等，(1994)Nat.Genet.8:148-154；Bartlett等，(1998)Hum.GeneTher.9:1181-1186；Passini等，(2002)J.Neurosci.22:6437-6446)。

AAV载体的一个有用的特性在于某些AAV载体在神经元细胞中具有进行逆向和/或顺向运输的能力。在一个脑区的神经元通过轴突相互连接到远侧脑区，因此为载体的递送提供了运输系统。例如，可将AAV载体施用在神经元轴突末端处或其附近。神经元内吞AAV载体，并以逆向模式将其沿轴突运输到细胞体。腺病毒、HSV和伪狂犬病病毒也显示出可在脑内将基因递送到远侧结构的相似的特性。(Soudas等，(2001)FASEB J.15:2283-2285；Breakefield等，(1991)New Biol.3:203-218；deFalco等，(2001)Science,291:2608-2613)。

几个研究组报导，通过AAV血清型2(AAV2)的脑转导限于颅内注射位点(Kaplitt等，(1994)Nat.Genet.8:148-154；Passini等，(2002)J.Neurosci.22:6437-6446和Chamberlin等，(1998)Brain Res.793:169-175)。近来的报导表明，神经营养性病毒载体(包括AAV和慢病毒载体)的逆向轴突运输也可发生在正常大鼠脑部的选择回路(Kaspar等，(2002)Mol.Ther.5:50-56；Kasper等，(2003)Science 301:839-842和Azzouz等，(2004)Nature 429:413-417。Roaul等(2005)Nat.Med.11(4):423-428和Ralph等(2005)Nat.Med.11(4):429-433报导，肌内注射表达使人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)沉默的干扰RNA的慢病毒，使治疗性相关ALS啮齿类动物模型的肌萎缩性侧索硬化症(ALS)疾病延迟出现。

AAV载体转导的细胞可表达治疗性转基因产物(如酶或神经营养性因子)以在细胞内介导有益效应。这些细胞也可以分泌治疗性转基因产物，该产物随后被远侧细胞吸收，并在远侧细胞中介导其有益效应。这一过程被称为交叉矫正(cross-correction)(Neufeld等，(1970)Science169:141-146)。

本领域需要治疗人类患者中引起运动功能丧失的脊髓机能障碍的组合物和方法。

发明概述

一方面，本发明提供了通过直接脊髓注射编码治疗性分子的神经营养性载体来治疗患有运动神经元病症的哺乳动物的方法。在一个具体实施方式中，神经营养性载体是编码HIF1-α的重组表达载体，其中所述载体是重组腺伴随病毒(AAV)。它通过直接注射到患有运动神经元病症的哺乳动物的脊髓灰质来递送。从而延长了哺乳动物的预期寿命。

另一方面，本发明提供了通过直接脊髓注射编码治疗性分子的神经营养性载体来治疗患有运动神经元病症的人类患者的方法。在一个具体实施方式中，将编码与NFκB融合的HIF1-α的重组AAV载体递送到患有运动神经元病症的人类患者的脊髓的多个位点。从而延长了人类患者的预期寿命。

根据另一个具体实施方式，本发明提供编码HIF1-α的重组AAV载体用于治疗患有运动神经元病症的患者。运动神经元病症可以是ALS。AAV载体可以是编码HIF1-α的重组AAV2/7或AAV2/8载体。

本发明涉及下述各项：

1.一种治疗患有运动神经元病症的哺乳动物的方法，该方法包括下述步骤：

将编码HIF1-α的重组表达载体注射入患有运动神经元病症的哺乳动物的脊髓内，从而延长其预期寿命。

2.根据项1所述的方法，其中重组载体是腺病毒相关载体。

3.根据项2所述的方法，其中所述腺病毒的假型是2/7。

4.根据项2所述的方法，其中所述腺病毒的假型是2/8。

5.根据项1所述的方法，其中将所述载体递送至所述脊髓的多个位点。

6.根据项1所述的方法，其中所述载体编码HIF1-α和HSV VP16的融合蛋白。

7.根据项1所述的方法，其中所述载体编码HIF 1-α和NFκB的融合蛋白。

8.根据项1所述的方法，其中所述哺乳动物患有的病状选自脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩或创伤性脊髓损伤。

9.根据项1所述的方法，其中所述哺乳动物患有ALS。

10.根据项1所述的方法，其中所述哺乳动物选自啮齿类、鼠、人或猿。

11.根据项1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类患者。

12.一种治疗患有运动神经元病症的人类患者的方法，该方法包括下述步骤：

将编码与NFκB融合的HIF1-α的重组AAV假型2/7或2/8载体递送至患有运动神经元病症的人类患者的脊髓的多个位点，从而延长其预期寿命。

13.根据项11或12所述的方法，其中所述人类患者患有的病状选自脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩或创伤性脊髓损伤。

14.根据项11或12所述的方法，其中所述人类患者患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

15.一种用于治疗患有运动神经元病症的患者的重组基因递送载体，该载体包括：编码HIF1-α的重组AAV假型2/7或2/8载体。

16.根据项15所述的载体，其中所述HIF1-α与NFκB融合。

17.根据项16所述的载体，其中所述HIF1-α与NFκB融合，由SEQID NO:1所示的核苷酸序列编码。

18.根据项7所述的方法，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码。

要理解，前面的大体描述和下面的详述都只是示例性和解释性的，而不是限制要求保护的发明。

附图简述

图1显示递送方式和载体假型(pseudotype)不同的脊髓载体基因组的递送。

图2显示递送方式和载体假型不同的脑载体基因组的递送。

图3显示肌内注射AAV载体后递送到肌肉的载体基因组的数目。

图4显示以编码HIF-1αNF-κB的AAV载体转导小鼠脑后，EPO、VEGF和IGF-1的基因表达。

图5显示Kaplan-Meier存活曲线，说明脊内施用AAV2/8Hif1a NF-kB后，ALS小鼠存活时间呈统计学显著性(p＝0.033)增加(对照小鼠存活133天，而Hif-1αNF-κB处理小鼠存活139天)。

图6显示以AAV2/8Hif1aNFkB处理的ALS小鼠脊髓中Hif-1αNF-κB的原位杂交，说明转导主要见于脊髓的腰区。动物6817、6715和6389用AAV2/8Hif1aNFkB处理；动物1460是对照动物。

发明详述

为使本发明更容易理解，首先定义某些术语。额外的定义在整个详述中提出。

除非另外指明，本发明的实施将使用常规的免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些都是为本领域所熟知的技术。参见如Sambrook,Fritsch和Maniatis，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(分子克隆实验手册)，第2版(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(最新分子生物学实验方法)(F.M.Ausubel等编辑，(1987))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)(Academic Press,Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(实用方法)(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编辑.(1995))、Harlow和Lane编辑(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(抗体实验手册)和ANIMAL CELL CULTURE(动物细胞培养)(R.I.Freshney编辑(1987))。

说明书和权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个所指物，除非上下文另外清楚说明。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞及其混合物。

本文所用的术语“包含”是用来指组合物和方法包括所述的元素，但不排除其它元素。当用来限定组合物和方法时，“主要由…组成”是指排除对组合物具有任何必要意义的其他元素。因此，本文限定的主要由元素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体(如磷酸盐缓冲盐溶液、防腐剂等)。对于使用本发明所述的组合物，“由…组成”是指排除超过痕量元素的其它成分和和实质性方法步骤。由每个过渡术语限定的具体实施方式在本发明的范围内。

所有数字符号(如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)是近似值，以增量0.1正向(+)或负向(-)变化。要理解，尽管不总是明确陈述，但所有数字符号前加术语“大约”。还要理解，尽管不总是明确陈述，但本文所述试剂只是示例性的，这些试剂的等同替代是为本领域所已知的。

术语“转基因”指被引入细胞、并能在合适条件下转录成RNA和任选地翻译和/或表达的多核苷酸。一方面，该多核苷酸赋予它被引入其中的细胞所需的特性，或者导致所需治疗性或诊断性结果。

提及病毒滴度时使用的术语“基因组颗粒(gp)”或“基因组等同替代”是指含重组AAV DNA基因组的病毒粒子的数目，与感染性和功能性无关。特定载体制品中基因组颗粒的数目可通过如本文实施例中所述或例如Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039和Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278所述程序测定。

提及病毒滴度时使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”是指感染性的和能复制的重组AAV载体颗粒的数目，该数目通过例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述的感染中心试验(也称为复制中心试验)测定。

提及病毒滴度时使用的术语“转导单位(tu)”是指导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数目，该数目通过如本文实施例所述或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU试验)所述的功能性试验测定(LFU assay)。

术语“治疗性的”、“治疗上有效量”和它们的相关术语是指预防受治疗者发病或使其发病延迟或症状改善或获得所需生物学结果的RNA、DNA或DNA和/或RNA的表达产物的量(所需生物学结果是如神经病理学(例如与运动神经元疾病(如ALS)相关的细胞病理学)上的矫正)。术语“治疗性矫正”是指矫正程度达到预防受治疗者发病或导致发病延迟或症状改善。可通过已知的经验方法确定有效量。

“组合物”也旨在包含活性剂和其它载体的组合，所述载体如惰性(例如可检测剂或标记)或活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。载体也包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂类和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它们可单独或组合存在，单独或组合占1-99.99％(以重量或体积计)。示例性蛋白赋形剂包括血清清蛋白(如人血清清蛋白(HSA))、重组人清蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可在功能上具有缓冲能力的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在包含在本发明范围内，其实例包括但不限于单糖(如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等)、二糖(如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等)、多糖(如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等)和糖醇(如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇(lactitol)、木糖醇山梨糖醇(xylitol sorbitol)(葡萄糖醇(glucitol))和肌醇)。

术语载体进一步包括缓冲剂或pH调节剂；典型地，缓冲剂是从有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐或邻苯二甲酸盐；Tris，盐酸氨基丁三醇，或磷酸盐缓冲剂。其它载体包括高分子赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、菲柯尔(ficoll)(一种高分子糖)、葡聚糖结合剂(dextrates)(例如环化糊精，如2-羟丙基-.正交.-环化糊精(2-hydroxypropyl-.quadrature.-cyclodextrin))、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，如“吐温(TWEEN)20”和“吐温80”)、脂类(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。

本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体，如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂(如油/水或水/油乳剂)和各种类型润湿剂。组合物也可包括稳定剂和防腐剂以及任何上面提到的载体，附加条件是它们可接受用于体内使用。载体、稳定剂和佐剂的实例参见MartinREMINGTON’S PHARM.SCI.,第15版(Mack Publ.Co.,Easton(1975)和Williams&Williams,(1995)和“PHYSICIAN’S DESK REFERENCE”(医师的案头参考)，第52版，Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)。

“受治疗者”、“个体”或“患者”在本文可互换使用，指脊椎动物，优选指哺乳动物，更优选指人。哺乳动物包括但不限于鼠、大鼠、猿、人、农场动物(farm animal)、运动动物(sport animal)和宠物。

“对照”是实验中出于比较目的而在实验中使用的另一受治疗者或样品。对照可是“阳性对照”或“阴性对照”。例如，如果实验目的是确定改变的基因表达水平与特定类型病理状态(参见例如下面的ALS)之间的相关性，通常优选使用阳性对照(携带所述改变并表现出该疾病特征性的症状的受治疗者或来自该受治疗者的样品)和阴性对照(缺少改变的表达和该疾病临床症状的受治疗者或来自该受治疗者的样品)。

应用于基因的“差异表达”是指从基因转录的mRNA或该基因编码的蛋白产物产生的差异。与正常或对照细胞的表达水平相比，差异表达的基因可以是过表达或低表达。一方面，该术语指至少1.5倍、或至少2.5倍、或可选地至少5倍、或可选地至少10倍地高于或低于对照样品中检测到的表达水平的差异。术语“差异表达”也指某些细胞或组织中的核苷酸序列，该核苷酸序列在对照细胞中沉默而在该细胞或组织中表达，或者在对照细胞中表达而在该细胞或组织中不表达。

本文使用的术语“调节”指改变效果或结果的量或强度，例如增强、增大、减少或降低。

本文使用的术语“改善”是“缓和”的同义词，指降低或减轻。例如一种可通过使其更能被忍受而改善疾病或病症的症状。

在基因转移由DNA病毒载体(如腺病毒(Ad)或腺伴随病毒(AAV))介导的方面，载体构建体指包括病毒基因组或其部分和转基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是相对良好表征的同源病毒组，包括超过50种血清型。参见例如国际PCT申请第WO 95/27071号。腺病毒容易生长，并且不需要整合到宿主细胞的基因组中。重组腺病毒衍生的载体，特别是那些降低野生型病毒重组和产生潜力的载体也已经构建好。参见国际PCT申请第WO 95/00655和WO 95/11984号。野生型AAV具有高感染性并能特异性整合到宿主细胞基因组中。参见Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470和Lebkowski等(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。

HIF-1是由2个亚基组成的异源二聚体蛋白：(i)组成型表达的β亚基(与其它相关转录因子共有)和(ii)α亚基(参见如WO 96/39426，描述了HIF-1α的亲和纯化和分子克隆)，其聚集是受翻译后机制调控的，以致只能在低氧条件下检测到高水平的α亚基。这两个亚基都是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)-PAS转录因子家族的成员。这些结构域调节DNA的结合和二聚化。反式激活结构域被认为存在于蛋白的C末端。

HIF-1参与对许多靶基因的调控(低氧诱导因子的综述参见诸如Bracken等，Cell.Mol.Life Sci.60(2003)1376-1393)。HIF-1的靶基因包括VEGF和促红细胞生成素。

为在含氧量正常条件下稳定低氧诱导因子蛋白以及提供强的组成性的转录激活，使用由位于氨基末端的来自HIF-1α的DNA结合和二聚化结构域，和位于羧基末端的转录激活蛋白的功能性转录激活结构域组成的杂合/嵌合融合蛋白。为产生该融合蛋白，将HIF-1α的内源反式激活结构域替换成异源反式激活结构域。在一个具体实施方式中，反式激活结构域来自单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)VP16蛋白。在本文将这种融合蛋白在本文称为HIF 1α-VP16构建体或融合构建体。在另一个具体实施方式中，反式激活结构域是NF-κB反式激活结构域，其可以是人NF-κB反式激活结构域。在本文将这种融合蛋白称为HIF 1α-NFκB构建体或融合构建体。可使用任何哺乳动物的HIF1-α编码序列。异源反式激活结构域也可以是酵母转录因子(如GAL4和GCN4)的其中之一。包括人编码序列的HIF-1α构建体可有利于将其递送至人。

低氧(组织或细胞的O₂需求超过供给的状态)是基因表达的有效调节因子。低氧的生理反应包括红细胞发生作用增强(Jelkman,Physiol.Rev.72:449-489(1992))和缺血组织的新生血管形成(White等，Circ.Res.71:1490-1500(1992))以及代谢转换到基于糖酵解(Wolfe等，Eur.J.Biochem.135:405-412(1983))。这些适应性反应促进O₂的递送，或激活不需要O₂的可选代谢途径。参与这些过程的基因产物包括，例如：(i)EPO，编码促红细胞生成素，是红细胞发生的首要调节因子并因此是血液携带O₂能力的主要决定因子(Jiang等，J.Biol.Chem.271(30):17771-78(1996))；(ii)VEGF，编码血管内皮生长因子，是血管发生的首要调节因子，并因此是组织灌流的主要决定因子(Levy等，J.Biol.Chem.270:13333(1995)；Liu等,Circ.Res.77:638(1995)；Forsythe等,Mol.Cell.Biol.16:4604(1996))；(iii)ALDA、ENO1、LDHA、PFKL和PGK1，分别编码糖酵解酶醛缩酶A、烯醇化酶1、乳酸脱氢酶A、果糖磷酸激酶L和磷酸甘油酸激酶1，其在缺少O₂的条件下提供产生ATP的代谢途径(Firth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6496(1994)；Firth等，J.Biol.Chem.270:21021(1995)；Semenza等，J.Biol.Chem.269:23757(1994))；和(iv)HO1和iNOS，编码血红素加氧酶1和可诱导的一氧化氮合酶，两者分别负责血管活性分子一氧化碳和一氧化氮的合成(Lee等，J.Biol.Chem.272:5375；Melillo等，J.Exp.Med.182:1683(1995))。

这些反应的重要介质是包括DNA结合低氧诱导因子蛋白的转录复合体与其相关DNA识别位点—低氧反应元件(HRE)(位于低氧诱导基因的启动子/增强子元件内)之间的相互作用。HRE由低氧诱导因子蛋白结合位点(含核心序列5’-CGTG-3’)和发挥功能所需的其它DNA序列组成，在某些元件中还包括第二结合位点。

在一个具体实施方式中，低氧诱导因子蛋白是HIF-1α(例如人HIF-1α)。在另一个具体实施方式中，HIF-1α的DNA结合结构域包括人HIF-1α第1-390位氨基酸。

在一个具体实施方式中，能转录激活的蛋白结构域不是衍生自低氧诱导因子蛋白。在另一个具体实施方式中，能转录激活的蛋白结构域衍生自选自下列蛋白：HSV VP16、NF_□B、热激因子、p53、fos、v-jun、因子EF-C、HIV tat、HPV E2、Ad E_1α、Sp1、AP1、CTF/NF1、E2F1、HAP1、HAP2、MCM1、PHO2、GAL4、GCN4或GAL11。

在一个具体实施方式中，能转录激活的蛋白结构域是合成的。在另一个具体实施方式中，低氧诱导因子蛋白是HIF-1α(例如人HIF-1α)，并且能转录激活的蛋白结构域是来自HSV VP16的转录激活结构域。而在另一个具体实施方式中，低氧诱导因子蛋白是HIF-1α(例如人HIF-1α)，并且能转录激活的蛋白结构域是来自NF_□B的转录激活结构域。

在一个具体实施方式中，本发明是治疗受治疗者神经变性病症(包括ALS)的方法，该方法包括对受治疗者施用有效量的核酸分子，该核酸分子编码具有生物活性的嵌合的反式激活蛋白，该反式激活蛋白包括低氧诱导因子蛋白的DNA结合结构域和能转录激活的蛋白结构域。

在优选具体实施方式中，编码具有生物活性的嵌合的反式激活蛋白的核酸分子包括低氧诱导因子(HIF)蛋白的DNA结合结构域和能转录激活的蛋白结构域。

HIF-1是由2个亚基组成的异源二聚体蛋白：(i)组成型表达的β亚基，也称为芳香烃核易位蛋白(ARNT)(该亚基与其它相关转录因子(例如二噁英/芳香烃受体(DR/AhR)共有)；和(ii)α亚基(参见，例如WO 96/39426、国际申请第PCT/US96/10251号，描述了近期的HIF-1α亲和纯化和分子克隆)，其聚集是受翻译后机制调控的，以致只能在低氧条件期间检测到高水平的α亚基。这两个亚基都是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)-PAS转录因子家族的成员。这些结构域调节DNA的结合和二聚化。反式激活结构域存在于蛋白的C末端。碱性区域由约15个占优势的碱性氨基酸组成，负责直接的DNA结合。该区域紧邻两个由长度可变的环分开的两个两亲性α螺旋，这2个α螺旋形成家族成员间首要的二聚化界面(Moore,A.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10436-41(2000))。PAS结构域(根据该结构域中最初鉴定出的的3个蛋白(Per、ARNT和Sim)命名)包括200-300个氨基酸，含2个不严格保守、主要疏水的、约50个氨基酸的区域，以PAS A和PAS B表示。

尽管HIF-1β(ARNT)以高水平组成型表达，但是HIF-1在细胞中的聚集对O₂浓度敏感，故高水平只能在低氧期间检测到。这一观察结果导致靶基因激活的机制的提出，其中O₂浓度藉此由传感蛋白检测，并通过复杂的信号传导机制导致HIF-1α亚基的稳定化。随后HIF-1α可与HIF-1β形成复合体，并选择性地结合到靶基因启动子/增强子的HRE位点上。认为参与赋予这种反应的HIF-1α蛋白区域与参与反式激活的区域相同。

对低氧产生反应HIF-1的活性被认为是通过稳定HIF-1α蛋白发生的。参与这一反应的HIF-1α区域位于蛋白的C末端，并与反式激活结构域重叠。例如，Jiang等,J.Biol.Chem.271(30):17771 78(1996)表明在第390位氨基酸截断的HIF-1α丧失了反式激活活性，但保留了结合DNA的能力，并在含氧量正常和低氧条件下都表现出高的蛋白水平。这一结果说明，反式激活结构域和赋予该蛋白在含氧量正常条件下的不稳定性的区域位于蛋白的C末端部分。Pugh等,J.Biol.Chem.272(17):11205 14(1997)进一步将参与区域定位在2个区域：第549-582和775-826氨基酸。

约200个氨基酸的结构域(称为“依赖于氧的降解结构域”(ODD))介导HIF-1α的降解(Huang,L.,J.Gu,M.Schau和H.Bunn.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7987-92)。ODD的缺失(HIF-1α□ODD)导致与氧浓度无关的组成型活化的HIF-1α(Huang,L.,J.Gu,M.Schau和H.Bunn.1998.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7987-92；美国专利第6,124,131号)。

在一个具体实施方式中，本发明提供了编码具有生物活性的嵌合反式激活蛋白的核酸分子，所述反式激活蛋白包含足以结合DNA和与HIF-1β(ARNT)二聚化的HIF-1α蛋白的结构域和能转录激活的蛋白结构域。

小鼠中，从不同启动子产生2个HIF-1α的转录本(I.1和I.2)，这与可变剪接相反(Wenger,R.H.等，Eur.J.Biochem.246:155-65(1997)。这些转录本都不依赖于氧而有效地翻译，但差别在于转录本I.1编码缺少最前面12个氨基末端的氨基酸的蛋白并以组织限制性方式表达；而转录本I.2是普遍表达的并编码全长蛋白。尽管这些差别，并没有观察到DNA结合或反式激活活性的特异性(Wenger,R.H.等，Blood 91:3471-80(1998)；Gorlach,A.等，Biochem.Biophys.Acta 1493:125-134(2000))。在人中也可观察到HIF-1α的几个剪接变体。例如，发现缺少第14外显子的HIF-1α剪接变体存在于皮肤和几种细胞系中(Gothie,E.等,J.Biol.Chem.275:6922-27(2000))。这导致读码框移位并编码更短的蛋白(736个氨基酸)，该蛋白尽管仍然受低氧诱导，但缺少了羧基末端的TAD(C-TAD)，因此不如野生型HIF-1α活性高(Gothie,E.等,J.Biol.Chem.275:6922-27(2000))。还鉴定出缺少第11和12外显子的显性失活同种型，该同种型编码516个氨基酸长的蛋白，该蛋白在含氧量正常条件下稳定并不显示反式激活(Chun,Y.S.等,Biochem.J.362:71-79(2002))。此外，缺少第12外显子的锌诱导的剪接变体也可作为显性失活变体，其通过与ARNT结合并阻止其核聚集来抑制HIF的活性(Chun,Y.S.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.268:652-56(2000))。

人HIF-1α的代表性序列包括，例如Genbank登录号NM_001530(转录本变体1)和NM_181054(转录本变体2)。人HIF-1β亚基的代表性序列包括，如Genbank登录号NM_001668(ARNT转录本变体1)、NM_178426(ARNT转录本变体2)和NM_178427(ARNT转录本变体3)。

在克隆HIF-1α后不久，鉴定出一个与其密切相关的蛋白HIF-2α(也称为内皮PAS(EPAS)、HIF相关因子(HRF)和PAS超家族2成员(MOP2))(Tian,H.等，Genes Dev.11:72-82(1997)；Ema,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4273-78(1997)；Flamme,I.等，Mech.Dev.63:51-60(1997)；Hogenesch,J.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5474-79(1998))。HIF-2α与HIF-1α具有48％的氨基酸同一性，与转录因子的bHLH/PAS结构域家族其它成员的相似性更低(代表性人HIF-2α序列是GenBank登录号NM_001430和U81984；代表性小鼠HIF-2α序列是GenBank登录号U81983)。与HIF-1α类似，发现HIF-2α与ARNT形成异源二聚体，并且结合HRE(Tian,H.等，Genes Dev.11:72-82(1997)；Ema,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4273-78(1997))。缺失分析表明HIF-1α和HIF-2α共有共同的功能结构域结构。特别地，除了氨基末端的bHLH和PAS结构域外，HIF-1α和HIF-2α还有由称为抑制结构域(ID)的区域分开的2个反式激活结构域(TAD)，该抑制结构域负责含氧量正常条件下抑制TAD的活性。与氨基末端TAD(N-TAD)重叠的是依赖于氧的降解结构域(ODDD)，该结构域可赋予HIFα蛋白在含氧量正常条件下稳定的能力(Bracken,C.P.等，CMLS.Cell.Mol.Life Sci.60:1376-93(2003))。

人和鼠的HIF-2α与HIF-1α共有广泛的初级氨基酸序列同一性(48％)。两个蛋白之间的序列保守性在bHLH(85％)、PAS-A(68％)和PAS-B(73％)区域最高。序列同一性的第二个区域出现在HIF-2α和HIF-1α蛋白紧邻C末端处。mHIF-1α中的这一保守区显示含低氧反应结构域(Li等，J.Biol.Chem.271(35):21262-67(1996))。HIF-1α和HIF-2α之间高度的序列相似性表明两者具有共同的生理功能。低氧条件刺激HIF-1α反式激活含HRE核心序列的靶基因的能力。在低氧条件下生长的细胞中，HIF-2α的活性也得到增强。

RNA表达模式表明，HIF-1α和HIF-2α在人和小鼠组织中主要以不依赖于氧的模式普遍表达(Tian,H.等，Genes Dev.11:72-82(1997)；Ema,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4273-78(1997)；Flamme,I.等，Mech.Dev.63:51-60(1997)；Wenger,R.H.等，Kidney Int.51:560-63(1997)；Wiesener,M.S.等，Blood 92:2260-68(1998))。然而，细胞类型特异性表达模式分析表明，与HIF-1α的普遍表达相反，HIF-2α的mRNA主要在特定的细胞类型中表达，如内皮、上皮、神经元、成纤维细胞和巨噬细胞(Bracken,C.P.等，CMLS.Cell.Mol.Life Sci.60:1376-93(2003))。

也发现第三个HIFα基因并命名为HIF-3α。与HIF-1α和HIF-2α类似，HIF-3α在许多组织表达，与ARNT形成二聚体，结合HRE DNA序列并以低氧诱导和依赖于ARNT的方式上调报告基因的表达(Gu,Y.Z.等，Gene Expr.7:205-13(1998))。鉴定出HIF-3α的一个剪接变体，称为抑制性PAS(IPAS)。IPAS似乎缺乏内源反式激活活性，但可作为HIF的显性失活调节因子，与HIF-1α的氨基末端区域相互作用并阻止DNA结合。人HIF-3α的代表性序列是Genbank登录号NM_152794(HIF-3α转录本变体1)、NM_152794(HIF-3α转录本变体2)和NM_022462(HIF-3α转录本变体3)。

如此处所述并对于本领域技术人员明显的是，HIF-1α、HIF-2α和/或HIF-3α的序列，包括任何已知或已发现的剪接变体序列，可用在本发明的方法中。

对于HIF-α的调节已经有许多发现。含氧量正常条件下，HIF-α的转换非常快并导致在含氧量正常条件下基本检测不到HIF-α蛋白(Wang,G.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5510-14(1995)；Yu,A.Y.等，Am.J.Physiol.275:L818-L826(1998)；Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7987-92(1998))。这种含氧量正常条件下的稳定性是由与N-TAD重叠的中心200个氨基酸的ODDD控制的(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:7987-92(1998))。低氧时发生的HIF-1α和HIF-2α的快速聚集是由增强蛋白稳定性介导的。相反，氧张力对HIF-α的转录或翻译没有主要影响(Wenger,R.H.等，Kidney Int.51:560-63(1997)；Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7987-92(1998))；Huang,L.E.等，J.Biol.Chem.271:32253-59(1996)；Powell,J.D.等，Biol.Reprod.67:995-1002(2002)；Kallio,P.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5667-72(1997))。相似地，氧不显著影响组成型表达的ARNT的mRNA或蛋白水平(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7987-92(1998))；Huang,L.E.等，J.Biol.Chem.271:32253-59(1996)；Kallio,P.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5667-72(1997))。

HIF-α在含氧量正常条件的不稳定性是由多聚泛素化作用和随后的蛋白酶体的降解作用介导的。这已使用蛋白酶体抑制剂或E1泛素激活酶的突变体而证明(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7987-92(1998)；Kallio,P.J.等，J.Biol.Chem.274:6519-25(1999))。因此，HIF-α在含氧量正常条件下被多聚泛素化，而在低氧条件下泛素化水平下降(Huang,L.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7987-92(1998)；Kallio,P.J.等，J.Biol.Chem.274:6519-25(1999)；Sutter,C.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4748-53(2000))。此外，显示HIF-1α物理性地与20S蛋白酶体亚基PSMA7相互作用(Cho,S.等，FEBS Lett.498:62-66(2001))。

Von-Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白是含延伸蛋白(elongin)B和C、Cul2和Rbx1的E3泛素蛋白连接酶复合体的组分，并且正是通过这种能力，VHL介导HIF-1α和HIF-2α的蛋白酶体降解(Lisztwan,J.等，Genes Dev.13:1822-33(1999))。在含氧量正常条件下，HIF-1α在VHL缺陷细胞中是稳定的，但是VHL转染后可恢复含氧量正常条件下的蛋白稳定性(Maxwell,P.H.等，Nature 399:271-75(1999)；Cockman,M.E.等，J.Biol.Chem.275:25733-741(2000))，这一发现支持了上述结论。在含氧量正常条件下，VHL可通过其β结构域与HIF-1α的第517-571或380-417氨基酸(HIF-2α的第517-534和383-418氨基酸)结合而发挥这种作用，而α结构域与延伸蛋白结合。然后泛素转移到HIF的残基上，标记该蛋白为蛋白酶体降解(Cockman,M.E.等，J.Biol.Chem.275:25733-741(2000)；Ohh,M.等，Nat.Cell Biol.2:423-27(2000))；Tanimoto,K.等，EMBO J.19:4298-4309(2000)；Masson,N.等，EMBO J.20:5197-5206(2001)；Srinivas,V.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.260:557-61(1999))。

已经发现含氧量正常条件下VHL与HIF的结合，因此赋予HIF蛋白的不稳定性的主要机制由2个脯氨酸残基(HIF-1α的P402和P564，HIF-2α的P405和P530)的不可逆羟基化作用介导(Jaakkola,P.等，Science 292:468-72(2001)；Ivan,M.等，Science 292:464-68(2001)；Yu,F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9630-35(2001))；Chan,D.A.等，J.Biol.Chem.277:40112-17(2002))。这些残基只在含氧量正常条件下被羟基化，使VHL可以高亲和地与HIF结合(Min,J.H.等，Science 296:1886-89(2002))。鉴定egl9(秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的HIF脯氨酰基羟化酶)使3个哺乳动物同系物(分别名为含脯氨酰基羟化酶结构域(PHD)的1、2和3或HIF脯氨酰基羟化酶(HPH 3、2和1))的克隆成为可能(Bruick,R.K.等，Science294:1337-40(2001)；Epstein,A.C.等，Cell 107:43-54(2001)；Ivan,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:13459-464(2002)；Lieb,M.E.等，Biochem.Cell.Biol.80:421-426(2002)；Huang,J.等，J.Biol.Chem.277:39792-800(2002))。还鉴定出广泛表达的第四个PHD/HPH(Oehme,F.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.296(2):343-49(2002))。

PHD/HPH是2-氧代戊二酸酯(2-oxogluterate)依赖的酶，其羟基化作用需要氧(O₂)。这些酶含与2个组氨酸和1个天冬氨酸残基结合的铁，当通过抗坏血酸(ascorbate)维持其亚铁状态时可与双氧结合。一个氧转移到HIF的靶脯氨酸残基上；第二个氧与2-氧代戊二酸酯(2-oxogluterate)反应产生琥珀酸酯和二氧化碳。因此，缺少氧引起酶活性的丧失并不能修饰HIF的脯氨酸残基，并且VHL/HIF不能结合，形成稳定的HIF-α蛋白。

因此，PHD/HPH功能上可能作为细胞中直接的氧传感蛋白，而直接介导HIF对生理氧浓度发生反应(Bracken,C.P.等，CMLS.Cell.Mol.Life Sci.60:1376-93(2003))。

在一个具体实施方式中，编码嵌合反式激活蛋白的核酸分子包含非哺乳动物低氧诱导因子蛋白的结构域。如本领域技术人员所公认，对低氧的适应性反应在整个进化过程中可能是高度保守的。相应地，预期低氧诱导因子蛋白会存在于许多物种中，包括非哺乳动物的脊椎动物和无脊椎动物(如昆虫)。参见例如Bacon等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,249:811-816(1998)，该文献报导了果蝇(Drosophila)的Sima碱性-螺旋-环-螺旋PAS蛋白和哺乳动物的HIF-1α蛋白之间的功能相似性。

本领域技术人员可通过许多技术来获得非哺乳动物的低氧诱导因子蛋白的核酸和氨基酸序列，例如，通过交叉杂交或使用本文提到的所有或部分序列进行扩增。一旦确定了编码候选低氧诱导因子蛋白的序列，可使用例如用来确定人HIF-1α蛋白内那些结构域位置的同类技术来确定足以结合HRE并与HIF-1β形成二聚体的蛋白部分的位置。用于本发明组合物和方法的非哺乳动物低氧诱导因子蛋白的相关结构域也可合成产生或通过对编码已知哺乳动物低氧诱导因子蛋白的DNA进行位点定向操作来产生。还预期，各种哺乳动物和非哺乳动物低氧诱导因子蛋白之间共同的序列基序将表明尽管可能不是天然存在于任何物种但将仍会产生可用于本发明方法和组合物的结构域的共有序列。为了用这样的非哺乳动物低氧诱导因子蛋白结构域代替本文所示例的人HIF-1α蛋白结构域，需要使这些结构域能与HRE结合并与HIF-1β(ARNT)形成二聚体。

例如，尽管HIF-1α亚基在含氧量正常条件期间不稳定，但是在正常含氧水平条件下在培养细胞中过量表达该亚基能诱导正常被低氧诱导的基因的表达。一个可选策略是修饰HIF-1α亚基，使其不再因含氧量正常条件而去稳定，因此在一系列氧条件下将更有效。

设计用来自诸如单纯疱疹病毒(HSV)VP16、NFκB或酵母转录因子GAL4和GCN4的转录激活蛋白的强反式激活结构域替换低氧诱导因子蛋白的C末端(或反式激活)区域，以在含氧量正常条件下稳定蛋白，并提供强且组成性的转录激活。

为在含氧量正常条件下稳定低氧诱导因子蛋白，并提供强且组成性的转录激活，构建由HIF-1α的DNA结合和二聚化结构域和单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白的反式激活结构域组成的杂合/嵌合融合蛋白。通过基因治疗将该杂合/嵌合体施用至受治疗者的细胞，诱导正常情况下对低氧的反应是表达上调的基因(即VEGF等)的表达。已表明组成上稳定的杂合HIF-1α用于治疗缺血患者是有效的(美国专利第6,432,927和7,053,062号，两者都通过引用整体结合入本文)。

因此，如本文描述和示例，施用编码具有生物活性的嵌合反式激活蛋白的核酸分子可治疗有相应需要的患者的神经变性运动病症，所述反式激活蛋白包括低氧诱导因子蛋白(如HIF-1α)的DNA结合结构域和能转录激活的蛋白结构域(如HSV VP16的转录激活结构域、NFκB的转录激活结构域)。在一个具体实施方式中，DNA结合结构域是HIF-1α的DNA结合结构域，能转录激活的蛋白结构域是HSV VP16的转录激活结构域。这个HIF1α/VP16构建体(含HIF-1α的DNA结合结构域和HIF-1β二聚化结构域和HSV VP16的转录激活结构域)的代表性cDNA核酸序列如下：

ATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTGATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTATTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGACATGATTTACATTTCTGATAATGTGAACAAATACATGGGATTAACTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCTTGTGAAAAAGGGTAAAGAACAAAACACACAGCGAAGCTTTTTTCTCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCATCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCACATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAG(SEQ ID NO：1).

该代表性核酸序列中，HIF-1α的DNA结合和HIF-1β二聚化结构域的序列如下：

ATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTGATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTATTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGACATGATTTACATTTCTGATAATGTGAACAAATACATGGGATTAACTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCTTGTGAAAAAGGGTAAAGAACAAAACACACAGCGAAGCTTTTTTCTCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCATCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCACATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAG(SEQ ID NO：2).

该代表性序列中，HSV VP16的转录激活结构域的序列如下：

CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGACCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAG(SEQ ID NO：3).

本发明包括编码具有生物活性的嵌合反式激活蛋白的其它核酸，所述反式激活蛋白例如包括HIF-1α的DNA结合和二聚化结构域和NF□B蛋白(例如人NFκB蛋白)的反式激活结构域的蛋白。

真核转录因子通常由分离并独立的DNA结合和转录激活结构域组成(Mitchell和Tjian，Science 245：371-378(1989))。结构域的独立性得以制成由异源蛋白的DNA结合和激活结构域组成的功能性融合蛋白。Brent和Ptashne构建了由lexa DNA结合蛋白和酵母转录因子GAL4的激活结构域组成的嵌合真核调节蛋白(Nature 312：612-615(1985))。使用融合蛋白已鉴定出几种类型的可作为转录激活子的蛋白结构域。这些结构域氨基酸相似性很小，但经鉴定通常为高度酸性(如GAL4和GNC4)、富含谷氨酰胺(如Sp1)或富含脯氨酸(如NF1，Ma和Ptashne，Cell 51：113-119(1987)；Courey和Tjian(1988)；Mermod等，Cell 58：741-753(1989))。

已知最有效的激活结构域之一包含在单纯疱疹病毒(HSV)病毒粒子蛋白16(VP16)的羧基末端100个氨基酸内(Sadowski等，Nature 335：563-564(1988)；Triezenberg等，Genes&Dev.2：718-729(1988))。VP16(也称为Vmw65或α-基因反式诱导因子(trans-inducing factor))是HSV的结构蛋白，可激活病毒即时早期启动子的转录，包括ICPO和ICP4的即时早期启动子(Campbell等，J.Mol.Biol.180：1-19(1984)；Kristie和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：4065-4069(1984)；Pellet等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5870-5874(1985))。尽管VP16特异地激活含所谓TAATGARAT元件的启动子，但这种特异性是由与VP16氨基末端结构域形成复合体的细胞DNA结合蛋白赋予的(McKnight等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7061-7065(1987)；Preston等，Cell 52:425-434(1988))。

本发明提供了编码包括DNA结合蛋白的功能性部分和转录激活蛋白的功能性部分的杂合/嵌合反式激活蛋白的核酸。这种杂合/嵌合反式激活蛋白具有许多优势，包括特异性激活含低氧反应元件(HRE)的低氧诱导基因的表达，使其因此达到异常高水平的基因表达。编码这种杂合/嵌合反式激活蛋白的核酸能在脊椎动物细胞中发挥功能，并且可以编码天然存在的转录反式激活蛋白或蛋白的结构域(例如包括脊椎动物细胞在内的真核细胞中天然存在的转录反式激活蛋白或结构域)、病毒反式激活蛋白或结构域，或任何能刺激脊椎动物的启动子转录的合成氨基酸序列。这种反式激活蛋白的实例包括但不限于：Muller等(Nature 336:544-551(1988))鉴定的淋巴特异性转录因子、fos蛋白(Lucibello等，Oncogene 3:43-52(1988))、v-jun蛋白(Bos等，Cell 52:705-712(1988))、因子EF-C(Ostapchuk等，Mol.Cell.Biol.9:2787-2797(1989))、HIV-1tat蛋白(Arya等，Science 229:69-73(1985))、乳头瘤病毒E2蛋白(Lambert等，J.Virol.63:3151-3154(1989))、腺病毒E1A蛋白(综述于Flint和Shenk，Ann.Rev.Genet.(1989)、热激因子(HSF1和HSF2)(Rabindran等，PNAS 88:6906-6910(1991))、p53蛋白(Levine，Cell 88:323-331(1997)，Ko和Prives，Genes Dev.10:1054-1072(1996))、Sp1(Kadonaga等，Cell 51:1079-1090(1987))、AP1(Lee等，Nature325:368-372(1987))、CTF/NF1(Mermod等，Cell 58:741-753(1989))、E2F1(Neuman等，Gene 173:163-169(1996))、HAP1(Pfeifer等，Cell 56:291-301(1989))、HAP2(Pinkham等，Mol.Cell.Biol.7:578-585(1987))、MCM1(Passmore等，J.Mol.Biol.204:593-606(1988))、PHO2(Sengstag和Hinnen，NAR 15:233-246(1987))和GAL11(Suzuki等，Mol.Cell.Biol.8:4991-4999(1988))。在本发明特定具体实施方式中，反式激活蛋白是单纯疱疹病毒VP16(Sadowski等，Nature 335:563-564(1988)；Triezenberg等，Genes andDev.2:718-729(1988))、NFκB((Schmitz和Baeuerle，EMBO J.10:3805-3817(1991)；Schmitz等，J.Biol.Chem.269:25613-25620(1994)和Schmitz等，J.Biol.Chem.270:15576-15584(1995))和酵母激活子GAL4和GCN4。

当然，本领域技术人员会理解用于本发明所述的组合物和方法的转录激活结构域也可以是合成的，即基于不包含在已知天然存在的蛋白中的序列。参见例如Pollock和Gilman，PNAS 94:13388-13389(1997)，该文献教导了转录激活是内在灵活的过程，其中很少(如果有的话)需要特定结构或立体特异性蛋白接触。该文献也综述了可作为转录激活子起作用的许多不同分子，包括短肽基序(短至8个氨基酸)、简单两亲性螺旋和甚至与转录激活无关的蛋白的诱变结构域。

根据本发明，将编码DNA结合结构域和反式激活结构域的核酸序列结合以保留每个结构域各自的结合特性和反式激活特性。在本发明各种具体实施方式中，编码能激活转录的反式激活蛋白或其一部分的核酸可以在不完全破坏编码的DNA结合结构域功能的基因座插入核酸。低氧诱导因子蛋白中DNA结合和二聚化功能不需要的区域和转录反式激活功能不需要的蛋白质区域为已知和/或可通过本领域已知方法鉴定，包括例如定位突变(mapped mutation)分析以及鉴定缺少定位突变的区域，后者与其它区域相比对突变更不敏感并且是分子的功能上更加相关的部分。使用标准分子生物学技术可产生合适的重组构建体，包括在Maniatis(Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆实验手册)(Cold Spring Harbor,N.Y.,ColdSpring Harbor Laboratory)(1989))中提出的技术。

可将编码嵌合反式激活蛋白的重组DNA构建体置于(即可操作性地连接至)合适的启动子和/或其它表达控制序列的控制下。尽管也可将反式激活蛋白置于诱导型启动子(如金属硫蛋白启动子(Brinster等，Nature296:39-42(1982)))或组织特异性启动子的控制下，但是最好将反式激活蛋白置于组成型活性的启动子序列的控制下。可根据本发明使用的启动子序列包括但不限于：SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，Nature290:304-310(1981))、包含在劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)的长末端重复序列内的启动子(Yamamoto等，Cell 22:787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.78:144-1445(1981))、人巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子/增强子(Boshart等，Cell 41:521-530(1985))。

在本发明一个具体实施方式中，嵌合反式激活蛋白是由pcDNA3/HIF/VP16/Afl2编码的。在另一个具体实施方式中，嵌合反式激活蛋白是由pcDNA3/HIF/VP16/RI编码的，除了VP16片段插入在HIF-1α编码区第530密码子之后外，pcDNA3/HIF/VP16/RI与pcDNA3/HIF/VP16/Afl2相同。

根据本发明，编码杂合/嵌合反式激活蛋白的核酸可用来特异性地调节含低氧反应元件(HRE)基因的表达。这些HRE对应于用作嵌合反式激活蛋白骨架的DNA结合蛋白识别和结合的核酸序列。

总的来说，编码嵌合反式激活蛋白的核酸可用来选择性地控制目的基因的表达。例如，并不作为限制的方式，例如当需要在细胞培养物或转基因动物体内产生一定量特定基因产物时，可将嵌合反式激活蛋白置于组成型启动子的控制下并且可用于组成性增强与低氧反应元件(HRE)连接的目的基因的表达。可选地，可将反式激活蛋白置于组织特异性启动子的控制下，使目的基因可在特定组织中表达。在本发明可选的具体实施方式中，嵌合反式激活功能是可诱导的，这样通过低氧反应元件(HRE)，目的基因的表达可被选择性地增强或降低。条件性的和可诱导的转基因表达的综述参见Fishman,Circ.Res.,82:837-844(1998)和Fishman,Trends Cardiovasc.Med.,5:211-217(1995)。

HIF1-α构建体的其它信息可参见例如美国专利序列第6,432,947号。

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种进行性神经变性病状，其涉及脑和脊髓中大运动神经元的丧失。该病的特征是进行性衰弱、萎缩和痉挛状态，导致在发病5年内瘫痪和呼吸衰竭。家族性ALS占所有ALS病例的10％；这些病例中约25％是由于Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(SOD1)的突变造成的[1]。迄今为止，SOD1基因中鉴定到109个不同的突变，这些突变覆盖了所有5个外显子[2]。除了非常罕见的在重神经丝链(NFH)基因、动力蛋白激活蛋白基因、囊泡结合蛋白1基因和ALSIN基因的突变外，SOD1是已鉴定的唯一的主要ALS易感性基因座。SOD1是一个主要存在于胞质的酶，其催化超氧离子分解成氧和过氧化氢，然后过氧化氢被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶降解形成水。许多证据认为，突变型SOD1蛋白通过获得的相反的功能具有神经毒性，该功能可引起氧化性病理状态和蛋白的聚集，伴有谷氨酸代谢、线粒体功能、轴突运输和钙平衡的次级紊乱[3]。突变型SOD1蛋白在小鼠中高水平的转基因表达产生运动神经元疾病的表型，发病的年龄和疾病的持续时间依赖于拷贝数[4]，这一观察结果有力支持了突变型SOD1具有毒性这一论断。

迄今为止，很少有治疗性干预措施改变了转基因ALS小鼠的运动神经元表型。尽管迄今为止已测试了超过100种小分子，但是这些分子甚至是边际效益都很少具有(如利鲁唑[5]、塞内昔布[6]、arimoclomol[7])。相比之下，一些形式的蛋白治疗是有益的。因此，通过转基因[8]或经IM注射并随后逆向轴突运输到运动神经的AAV2递送[9]系统施用胰岛素样生长因子1(IGF-1)以显著改进存活。另外2个作为神经保护剂显示有治疗前景的蛋白是促红细胞生成素[10]和血管内皮因子(VEGF)[11,12]。后者特别令人感兴趣，因为遗传分析表明VEGF基因的减效变体是ALS的危险因子[13]。此外，缺少低氧反应启动子元件的小鼠出现缓慢进行性运动神经元疾病[14]。随后，有文献表明，通过慢病毒将VEGF递送到ALS小鼠的脊髓可延缓死亡[15]。2个独立的研究者报导将VEGF注入ALS小鼠[16]和大鼠[17]的脑脊液也延缓疾病的进程。

由于这个原因，本发明的一个具体实施方式是提高神经营养性蛋白VEGF家族和/或EPO水平的方法，该方法包括将编码HIF-1α的神经营养性载体注射到具有ALS或其它运动神经元病症的受治疗者的脊髓区域。该方法可增加超过一种这样的神经营养性蛋白。理论上不受限制，递送编码HIF-1α的转基因将增强各种HIF-1靶基因的表达，因此为HIF-1α的表达位点的运动神经元提供了好处。

理论上不受限制，直接脊髓注射神经营养性载体也为治疗性分子(如HIF-1α)的递送提供优势，因为其在脊髓细胞中直接表达时更有效发挥功能。例如，编码例如短干扰RNA(siRNA)分子的神经营养性载体可通过直接注射脊髓递送到脊髓细胞。以这种方式递送的siRNA直接在细胞内对转导的脊髓细胞产生影响。

此外，某种遗传性运动神经元病症(如SMA)可通过将编码治疗性基因的神经营养性载体直接注射脊髓进行治疗。这种直接脊髓注射的方法提供了将重组病毒直接递送到脊髓区域细胞的方法。

合适的用于实施本发明的神经营养性病毒载体包括但不限于：腺伴随病毒载体(AAV)、单纯疱疹病毒载体(美国专利第5,672,344号)和慢病毒载体。

在本发明的方法中，可使用任何血清型或假型AAV。在本发明某些具体实施方式中使用的病毒载体的血清型选自下述：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8(参见如Gao等(2002)PNAS,99:11854-11859和Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols(基因治疗的病毒载体：方法和步骤)，编辑Machida,Humana Press,2003)。除本文列出的血清型外，也可使用其它血清型。此外，假型AAV载体也可用在本文所述的方法中。假型AAV载体是那些含一种AAV血清型的反向末端重复序列(ITR)和第二种AAV血清型的衣壳的载体；例如，含AAV2衣壳和AAV1ITR的AAV载体(即AAV1/2)或含AAV5衣壳和AAV2ITR的AAV载体(即AAV2/5)。

AAV载体衍生自对哺乳动物不致病的单链(ss)DNA细小病毒(综述见Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129)。简单地说，基于AAV的载体除去了占病毒基因组96％的rep和cap病毒基因，保留了2个侧翼的145碱基对(bp)的反向末端重复序列(ITR)，该反向末端重复序列可用来起始病毒DNA复制、包装和整合。在缺少辅助病毒时，野生型AAV以优先位点特异性整合到人宿主细胞基因组中染色体19q 13.3处，或可以游离地保留。单个AAV颗粒可接纳达5kb的ssDNA，因此保留了约4.5kb转基因和调节元件，这一般是足够的。然而，如美国专利第6,544,785号所述的反式剪接系统几乎可以使这个限值加倍。

在一个示例性具体实施方式中，AAV是AAV7或AAV8。许多血清型的腺伴随病毒，特别是AAV2，被广泛研究并鉴定作为基因治疗载体。本领域技术人员熟悉功能性基于AAV的基因治疗载体的制备。许多关于AAV产生、纯化和制备以施用至人受治疗者的各种方法的参考可发现在许多已公开的文献中(参见如Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols(基因治疗的病毒载体：方法和步骤)，编辑Machida,Humana Press,2003)。此外，基于AAV的靶向CNS细胞的基因治疗描述于美国专利第6,180,613和6,503,888号。其它的示例性AAV载体有编码人蛋白的重组AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8血清型载体。其它示例性假型载体可以是AAV载体AAV2/1、AAV2/2、AAV2/6、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8。

在本发明某些方法中，载体包括可操作连接至启动子的转基因。转基因编码生物活性分子，该转基因在CNS中的表达导致至少部分神经病理学的矫正。HIF1-α基因是为本领域所熟知的。参见如NM_001530和NP_001521。NFκκB反式激活序列可替换HIF1-α反式激活序列。参见如NM_003998。

真核细胞中转基因的表达水平主要是由转基因表达盒内的转录启动子决定的。显示长期活性和组织特异性甚至细胞特异性的启动子在某些实施方式中使用。启动子的非限制性实例包括但不限于：巨细胞病毒(CMV)启动子(Kaplitt等(1994)Nat.Genet.8:148-154)、CMV/人β3-珠蛋白启动子(Mandel等(1998)J.Neurosci.18:4271-4284)、GFAP启动子(Xu等.(2001)Gene Ther.8:1323-1332)、1.8-kb的神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Klein等(1998)Exp.Neurol.150:183-194)、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子(Miyazaki(1989)Gene 79:269-277)、β-葡糖醛酸酶(GUSB)启动子(Shipley等.(1991)Genetics 10:1009-1018)和诸如美国专利第6,667,174号所述的分离自人泛素A、人泛素B和人泛素C的泛素启动子。为延长表达，可额外将其他调节元件可操作连接至转基因，如土拨鼠肝炎病毒后调控元件(WPRE)(Donello等.(1998)J.Virol.72:5085-5092)或牛生长激素(BGH)多聚腺苷化位点。

对于某些CNS基因治疗应用，可有必要控制转录活性。为达到这个目的，可通过引入例如Haberma等.(1998)Gene Ther.5:1604-16011和Ye等(1995)Science 283:88-91所述的各种调节元件和药物反应性启动子，获得用病毒载体药理性地调控基因的表达。

在某些具体实施方式中，组合物中载体的浓度或滴度至少是：(a)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。

一方面，转基因编码生物活性分子，该转基因在CNS中的表达可导致至少部分神经病理学的矫正。在某些实施方式中，治疗性转基因产物是减轻和/或阻止ALS症状的HIF1-α蛋白。参见Raoul等.(2005)Nat.Med.11(4):423-428和Ralph等.(2005)Nat.Med.11(4):429-433。

另外的或可选的转基因可用来表达治疗量的胰岛素生长因子-1(IGF-1)、钙结合蛋白(calbindin)D28、小清蛋白、HIF1-α、SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2和CNTF(睫状神经营养因子)。

本发明提供了调控、矫正或增大罹患运动神经元损伤的受治疗者运动功能的方法。只为例证的目的，受治疗者可患肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化(PLS)或创伤性脊髓损伤中的一种或多种。

理论上不受限制，与运动神经元损伤相关的病理学可包括运动神经元退化、神经胶质增生、神经丝异常、皮层脊髓束和脊神经前根中有髓纤维的丧失。可识别两种类型病症的出现：延髓发病，影响脑干运动神经元(影响面部肌肉、语言和吞咽)；四肢发病，影响脊髓运动神经元，表现为痉挛状态、普遍的衰弱、肌萎缩、瘫痪和呼吸衰竭。ALS中，受治疗者有延髓发病也有四肢发病。在PLS中，受治疗者延髓发病。

组织和完成复杂的运动作用的能力依赖于来自大脑皮层运动区域(即运动皮层)的信号。皮质运动指令沿两个神经束下行。皮质延髓纤维控制移动面部肌肉的脑干中的运动核，而皮质脊髓纤维控制神经支配躯干和四肢肌肉的脊髓运动神经元。大脑皮层也通过作用于下行脑干途径间接影响脊髓运动活动。

原生运动皮层沿Broadmann’s区的中央前回分布(4)。投射到脊髓的皮层神经元轴突在皮质脊髓束(含约1百万轴突的一大束纤维)汇集到一起。这些轴突中约1/3起源自额叶中央前回。另外1/3起源自6区。剩余部分起源于体感觉皮层的3、2和1区，调节经背角向中枢传入的传输。

皮质脊髓纤维与皮质延髓纤维汇集通过内囊后肢到达中脑的前侧部分。它们在脑桥分离成小束纤维，小束纤维在脑桥核间运行。小束纤维在髓质重新组合形成髓质锥体。约3/4的皮质脊髓纤维与位于髓质和脊髓连接处的锥体交叉的中线相交。相交的纤维在脊髓侧柱的背部(背外侧柱)下行，形成皮质脊髓侧束。不相交的纤维在前柱下行，形成皮质脊髓前束。

皮质脊髓的侧束和前束的分开终止于大致与脑干侧生和中央系统同样的脊髓灰质区。皮质脊髓侧束主要向前角侧生部分的运动核和中间区的中间神经元投射。皮质脊髓前束向两侧投射前内侧细胞柱和含神经支配轴向肌肉的运动神经元的中间区连接部。

一方面，公开的方法包括施用携带编码治疗性产物转基因的神经营养性病毒载体到受折磨受治疗者的CNS，使转基因在接近施用位点的CNS内表达，表达水平足以使表达的蛋白通过CSF在CNS中运输时产生治疗性效果。此外，载体可包含编码有效治疗CNS病症的生物活性分子的多核苷酸。这种生物活性分子可包括肽，包括但不限于天然的、融合的或突变形式的全长蛋白、天然的、融合的或突变形式的蛋白片段、合成的多肽。

在一个例证性具体实施方式中，施用是通过直接将高滴度的载体溶液注射到受治疗者或患者的脊髓来实现的。

在某些具体实施方式中，方法包括施用高滴度的携带治疗性转基因的神经营养性载体，以使转基因产物在脊髓内第一位点以治疗性水平表达。在某些具体实施方式中，组合物的病毒滴度至少是：(a)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(×10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50(×10¹⁰iu/ml)。

在实验小鼠中，注入AAV溶液的总体积可在诸如1到20μl之间。对其它哺乳动物，包括人，体积和递送速率是按合适比例的。治疗可由每个靶位点单次注射组成，也可在一个或多个位点重复注射。也可使用多注射位点。例如，在某些具体实施方式中，除了第一施用位点，含携带转基因的病毒载体的组合物可施用于另一位点，该位点可在第一施用位点的对侧或同侧。注射可以是单次或多次、单侧或两侧。

高滴度AAV的制品可使用本领域已知技术来产生，例如，如美国专利第5,658,776号和Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols(基因治疗的病毒载体：方法和步骤)，编辑Machida,Humana Press,2003所述。

下述实施例提供了本发明例证性的具体实施方式。本领域的普通技术人员可考虑到多种可进行的改进和调整，而不改变本发明的精神或范围。这种改进和调整包括在本发明的范围内。实施例不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1.rAAV病毒载体递送转基因到脊髓

迄今为止，系统地监测不同血清型rAAV在神经系统的分布模式的研究相对较少。一个最提供信息的研究表明rAAV2/1和rAAV2/5倾向于表现出比rAAV2/2更高的转导。此外，观察到rAAV1和rAAV5的反向运输[20]。因此我们进行了初始实验来决定许多AAV血清型的相对摄取和递送，使用两种递送途径将其递送到脊髓细胞，集中在运动神经元。这些初始实验比较脊髓灰质内注射编码GFP(绿色荧光蛋白)的AAV和肌内注射编码GFP的AAV。评估包括血清型2/1、2/2、2/5、2/6、2/7和2/8的6个不同的假型AAV载体。

脊髓内注射通过吸入异氟烷麻醉小鼠，并使用立体定位仪固定。小鼠组用AAV CBA-GFP载体注射，一组用下述血清型之一进行注射：AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7和AAV2/8。每只小鼠接受总数为2.5e 10的DNA酶抗性颗粒(DRP)。通过灰质内注射一剂到脊髓的下述区域：C6区(颈区内)、T8/T9区和T13区(胸区内)和L3/L4区(腰区内)。以1微升/分钟的速率每个位点注射4微升病毒。

肌内注射成组小鼠用AAV CBA-GFP载体注射；一组用下述血清型中的每一种进行注射：AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7和AAV2/8。每只小鼠接受4次AAV注射：2次注射到四头肌，2次注射到腓肠肌(gasctrocnemius)。每只小鼠接受总剂量为2.5e 10的DNA酶抗性颗粒(DRP)。

解剖全脑、脊髓和肌肉。用Qiagen Dneasy^TM试剂盒提取DNA。用针对AAV CBA-GFP载体上BGH序列的引物和探针对脑、脊髓和肌肉进行BGH(牛生长激素)Taqman^TM试验分析，来确定每种组织中载体基因组的拷贝数。确定总DNA中BGH的拷贝数。也对解剖的脊髓进行免疫组织化学分析来检测以下各项：1)GFP以确定转基因的表达，2)胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)以代表(label)神经胶质细胞，和3)SM132和NeuN以代表(label)神经元细胞。

图1显示了通过脊髓注射或通过肌内注射递送到脊髓的AAV载体基因组的数目。在用脊髓注射AAV 2/7和2/8处理的小鼠脊髓中发现了更多的载体基因组。

图2显示了脊髓或肌内注射AAV载体后递送到脑的载体基因组的数目。很少的AAV载体存在于脑。不同处理组间的显著性差异是不明显的。数据显示直接脊髓注射任何AAV血清型后，散布到脑的载体很少。这可能是一种安全优势，说明脊髓注射后载体保留在脊髓区域。

图3显示了肌内注射AAV载体后递送到肌肉的载体基因组的数目。

数据显示与肌内注射AAV载体相比，直接脊髓注射AAV载体介导更多的基因转移到脊髓。脊髓注射与肌肉注射同样AAV载体的小鼠相比，脊髓中测到更大数目的AAV载体基因组，这证明了上述观点。此外，数据表明本实验中介导最高脊髓基因转移的血清型是AAV2/7和AAV2/8。

免疫组织化学结果表明脊髓注射编码GFP的AAV载体引起显著的GFP表达。GFP表达与表达神经元标记SM132和NeuN的细胞共定位。没有观察到GFP与星形胶质标记GFAP的共定位。所有测试血清型的免疫组织化学结果类似。肌内注射后，在肌内注射后的脊髓中，观察到没有GFP或很少GFP阳性细胞(主要为非神经元细胞)。

实施例2.小鼠脑中AAV-HIF-1αNFκB的评估

小鼠脑中注射AAV-HIF1αNFκB：在脑的丘脑区域用编码HIF1αNFκB的AAV载体注射小鼠。评估2种血清型：1)AAV2/1-HIF1αNFκB和2)AAV2-HIF1αNFκB。每只小鼠接受9e9的DNA酶抗性颗粒(DRP)。未处理的小鼠作为对照。注射后4周，处死小鼠，收集它们的脑。对脑切片进行原位杂交以显现HIF-1α的mRNA。也对从脑中提取的cDNA进行RT-PCR，来评估VEGF基因的表达。用GUSB基因的表达对VEGF基因的表达进行归一化(normalization)。

通过原位杂交在用AAV2/1-HIF1αNFκB和AAV2-HIF1αNFκB处理的小鼠脑内观察HIF-1α的mRNA；对照脑中没有观察到信息(message)。在用AAV2/1-HIF1αNFκB处理的小鼠中观察到更多的HIF-1αmRNA信号。RT-PCR的基因表达分析表明，相对于对照动物，用AAV2/1-HIF1αNFκB处理的小鼠中VEGF基因表达增加。在用AAV2-HIF1αNFκB处理的小鼠中没有观察到可测的VEGF基因表达的增加。

在第二个实验中，用AAV2/1-HIF1αNFκB两侧注射小鼠到小鼠脑的小脑区。每只小鼠接受2e10的DNA酶抗性颗粒(DRP)。未处理的小鼠作为对照。注射后3周，处死小鼠，收集它们的脑。对脑切片进行原位杂交以显现HIF-1α的mRNA。也对从脑中提取的cDNA进行RT-PCR，以评估VEGF、EPO和IGF-1基因的表达。用GUSB基因的表达对表达水平进行归一化。

通过原位杂交在整个小脑观察到HIF-1α的mRNA。表达是强的并遍及各个神经元细胞层。脑干中没有观察到HIF-1α的mRNA。对照小鼠的脑中没有观察到HIF-1α的mRNA。如图4显示，用编码HIF-1α的AAV载体转导后，脑中VEGF、EPO和IGF-1的mRNA水平被上调。对照小鼠中没有观察到这些基因的上调。这表明用AAV载体转导后，HIF-1α具有调节脑中靶基因的基因表达水平的能力。

实施例3.rAAV介导的递送HIF-1α到ALS小鼠的脊髓

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的治疗性相关模型。肌萎缩性侧索硬化症(amytrophic lateral sclerosis)(ALS)是一种致死性的神经变性疾病，其特征是皮层、脑干和脊髓中运动神经元的选择性丧失。疾病的进展可导致四肢、轴向和呼吸肌肉的萎缩。运动神经元细胞的死亡伴随着活性神经胶质增生、神经丝异常和皮质脊髓束和脊神经前根内大的有髓纤维的显著丧失。尽管对ALS的病因学了解较少，越来越多的证据表明散发性(SALS)和家族性(FALS)ALS共有许多相似的病理特征；因此，提供了一个前景：对任何一种形式的研究将导致共同的疗法。FALS占诊断病例约10％，其中20％与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)的显性遗传突变相关。表达突变型人SOD1蛋白的转基因小鼠(如SOD1^G93A小鼠)重现了ALS的许多病理特征，是研究ALS的适合的动物模型。对SALS来说，大量的病理机制被牵涉为潜在的起因，包括谷氨酸诱导的兴奋性神经毒性、毒素的暴露、蛋白酶体功能障碍、线粒体损伤、神经丝结构破坏和神经营养性支持的丧失。

我们将测试如下假说：通过rAAV介导将HIF1α递送到脊髓可促进运动神经元存活和改善SOD1^G93A ALS小鼠疾病进展。用重组AAV载体递送允许相对长期的转基因表达(ALS小鼠可能需要转基因表达许多个月。此外，根据血清型，AAV感染神经元和非神经元细胞，如果如我们猜想，非神经元细胞参与运动神经元的死亡[21]，则是一个潜在的好处。

实验大纲。我们使用脊髓内注射施用AAV2/8-HIF1αNFκB，来确定本策略对运动神经元存活、疾病发病和ALS SOD1^G93A小鼠存活的影响。

rAAV感染ALS小鼠的脊髓。对每个病毒处理组，60天龄或90天龄的SOD1^G93A或SOD1WT小鼠(5只/组)和WT小鼠(5只/组)注射1e11DRP的AAV2/8-Hif1α-NFκB。作为阴性对照，60天龄或90天龄的SOD1小鼠用同样剂量的空载体注射。(作为一个额外的阳性对照，60天龄或90天龄的SOD1小鼠(5只/组)可用同样剂量的AAV2/8-hIGF-1(人IGF-1)载体注射。一个额外的阴性对照也可以是野生型小鼠。)病毒注射到椎骨C6、T8/T9、T13、L3/L4的脊髓，每个位点4μl，以1μl/分钟递送，总剂量为2.5e 10DRP。用TaqMan试验检测脊髓中病毒基因组、HIF1α信息和VEGF。进行脊髓的原位杂交来显现HIF1-α在AAV2/8-Hif1α-NFκB处理和阴性对照小鼠脊髓中的表达。

样本大小和统计学考量。20只TgSOD1^G93A小鼠用AAV2/8-HIF1α处理以观察发病和存活。每种类型中可额外有30只小鼠在110天和最后被处死，用于组织学和生物化学分析。基于先前的研究，我们假设(i)具有SOD1^G93A转基因的小鼠存活130±13天；(ii)检测真实组间差异的本研究的统计学功效是90％；(iii)α以0.05双尾检验；和(iv)我们希望在处理小鼠的平均存活上检测到10％或更大的差异。用这些假设，我们要求每个测试单型至少14只小鼠。因此，我们决定每组观察至少20只动物的病症发病、疾病进展和存活，免得小鼠因与它们运动神经元疾病不相关的原因死亡。在最后的存活分析中，评估20只用AAV2/8-HIF1α处理的小鼠，并评估18只对照小鼠。每组中可额外有30只小鼠以预定的时间间隔(每个月5只，共6个月)被处死，用于组织学和生物化学分析。用Kaplan-Meier曲线和log-rank统计学检验来比较疾病发病和存活的时间。用Cox比例风险模型来控制性别的影响。

确定rAAV-HIF1α对ALS表型的影响。疾病的发病定义为当用尾巴提起小鼠时，伸展的腿出现震颤。死亡定义为小鼠不能在30秒内恢复正常的点。

评估rAAV-HIF1α对运动神经元存活的影响。我们将使用脊神经前根分析来监测5只用rAAV-HIF1α处理的TgSOD1^G93A小鼠在症状性(110天)和末期时间点的运动神经元数目。

结果。脊髓内施用AAV2/8Hif1αNFκB后，观察到ALS小鼠存活的统计学显著(p＝0.033)的增长(对照小鼠存活133天而实验动物存活139天)。不同同龄组动物对处理的反应不同：25％的处理动物表现出18-23天存活的增长，而25％的动物表现出8-13天存活的增长。在AAV2/8Hif1aNFkB处理的ALS小鼠脊髓中，对Hif1αNFκB的原位杂交分析表明转导主要见于脊髓的腰区。此外，分析也表明只有25％的预定剂量1e 11drps供给动物。

表1

列1的存活归纳表

截尾指示变量(Censor Variable)：列3

分组变量：列1.2

表2

列1的Kaplan-Meier存活统计

截尾指示变量：列3

分组变量：列1.2

实施例4.杂合/嵌合体的构建

可以构建由HIF-1α的DNA结合和二聚化结构域和单纯疱疹病毒VP16的反式激活结构域组成的杂合转录因子(pcDNA3/HIF.VP-16.Afl2)，以使正常参与对低氧的生理性适应的基因发生强且组成性的激活，如下面概述。

通过PCR(Advantage cDNA PCR试剂盒，Clontech,Palo Alto,Calif.)，用提出的引物(SEQ ID NO:4：ggggtacctt ctcttctccg cgtgtggagg gagccagc；SEQ ID NO:5：gctctagagt gagccaccag tgtccaaaaa aaggatg)，从HeLa细胞cDNA文库(Clontech)中分离全长(aa 1-826)HIF-1α基因，并将其插入表达载体pcDNA3(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)的KpnI和XbaI位点之间。在该质粒中，基因表达是由巨细胞病毒(CMV)即时早期增强子/启动子控制的。HIF-1α/VP-16杂合体是通过在aa 390(Afl2位点)处截短HIF-1α、然后将HSV VP-16的反式激活结构域连接在其下游构建的。用Vent聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)和提出的引物(SEQ ID NO:6：cgtacgctta agccggaatt cccggggatc tgg；SEQ ID NO:7：cgctctagac tacccaccgtactcgtcaat tc)PCR扩增含Afl2和XbaI末端的VP16片段(aa 413-490)，并将该片段克隆到pcDNA3/HIF-1α构建体合适的位点内。将在aa530处截短HIF-1α产生相关的构建体(pcDNA3/HIF/VP-16/R1)用EcoR1进行部分消化。PCR产生的所有序列的完整性通过使用Applied Biosystems 377DNA序列分析仪进行DNA测序来验证。所有克隆操作按标准步骤进行(Sambrook,J.等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)第2版(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989))。限制性内切酶和DNA修饰酶从New England Biolabs或Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,Md.)获得，并参照制造厂商的说明书使用。质粒DNA用从Qiagen(Chatsworth,Calif.)获得的试剂盒纯化。

除非另外指明，说明书(包括权利要求)中使用的表达成分、细胞培养物、处理条件等的量的所有数字应理解成在所有情况下都由术语“大约”修饰。相应地，除非另外有相反指明，数字参数都是近似值，并且可根据试图通过本发明获得的所需特性而改变(very)。除非另外指明，在一系列元素之前的术语“至少”应理解成指系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或能确定，利用不超出常规的实验可对本文所述的本发明的具体实施方式进行许多等同替代。这些等同替代预期包括在权利要求中。

参考文献

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Claims

2.根据权利要求1所述的方法，其中重组载体是腺病毒相关载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述腺病毒的假型是2/7。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述腺病毒的假型是2/8。

5.根据权利要求1所述的方法，其中将所述载体递送至所述脊髓的多个位点。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体编码HIF1-α和HSVVP16的融合蛋白。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体编码HIF 1-α和NFκB的融合蛋白。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物患有的病状选自脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩或创伤性脊髓损伤。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物患有ALS。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物选自啮齿类、鼠、人或猿。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类患者。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述人类患者患有的病状选自脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩或创伤性脊髓损伤。

14.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述人类患者患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

16.根据权利要求15所述的载体，其中所述HIF1-α与NFκB融合。

17.根据权利要求16所述的载体，其中所述HIF1-α与NFκB融合，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码。

18.根据权利要求7所述的方法，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码。