CN110741089B - 用于治疗脊髓性肌萎缩的组合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了具有AAVhu68衣壳和所述衣壳中的至少一个表达盒的rAAV载体。所述至少一个表达盒包含编码功能性SMN蛋白的核酸序列和指导SMN序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。还提供了含有此rAAVhu68.SMN载体的组合物以及将所述组合物用于患者的脊髓性肌萎缩的方法。

Description

用于治疗脊髓性肌萎缩的组合物
背景技术
脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)是由端粒SMN1中的突变引起的神经肌肉疾病，SMN1是编码参与剪接体生物发生的普遍表达的蛋白质(运动神经元生存(survival of motor neuron，SMN))的基因。SMA是由SMN1基因的突变或缺失引起的常染色体隐性遗传疾病。已显示提供功能性SMN1基因挽救了该表型。参见，例如，Tanguy等人,Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brainand the spinal cord of neonatal mice,Frontiers in Molecular Neuroscience,8(36)(2015年7月)。
国际SMA联盟分类(The International SMA Consortium classification)根据发病年龄和运动发展里程碑定义了SMA表型的多个严重性程度。SMA0名称用于反映产前发作和严重关节挛缩、面部双瘫和呼吸衰竭。1(或I)型SMA(韦德尼希-霍夫曼病I病)是最严重的产后形式，其在出生后6个月内发病。患者无法坐起并具有严重的呼吸功能病症。2(或II)型SMA是在最初2年内发病的中间形式；儿童可以坐起但是不能行走。临床过程是多变的。3(或III)型(也称为库格尔贝格-韦兰德病)在2岁后开始并且通常具有慢性进展。儿童至少在婴儿期可以独立站立和行走。成人形式(4或IV型)是最轻微的，其在30岁以后发病；报告的病例很少，并且其患病率并不准确知道。
许多遗传和获得性神经肌肉疾病涉及下运动神经元(lowermotor neuron)的变性。一个最常见且最具毁灭性的实例是脊髓性肌萎缩(SMA)，其是运动神经元生存(SMN)蛋白的遗传缺陷，其特征在于下运动神经元的选择性死亡、进行性无力以及通常在儿童早期的死亡。由于不明的原因，SMN缺陷导致对下运动神经元的选择性毒性，导致进行性神经元丢失和肌肉无力。疾病的严重性因同源基因(SMN2)的着丝粒重复的拷贝数改变，所述同源基因携带剪接位点突变，导致仅产生少量的全长SMN转录物。携带1-2个SMN2拷贝的患者存在严重形式的SMA，其特征在于在出生后的最初几个月内发病并且快速发展为呼吸衰竭。具有3个SMN2拷贝的患者通常表现出减弱形式的疾病，通常在6个月大之后进展。虽然许多人从未获得行走能力，但他们很少进展为呼吸衰竭，并且经常活到成年期。具有四个SMN2拷贝的患者可能不会表现，并且直到成年之后才逐渐发生肌肉无力。除姑息治疗外，目前尚无用于SMA的治疗方法。
SMN表达与疾病严重程度之间的明确相关性以及相对少数量的受影响细胞使SMA成为基因疗法的优秀靶标。先前的研究已经证明，使用能够穿过血脑屏障的AAV载体血清型的全身注射，可以在转基因小鼠模型中拯救SMA表型。参见，例如，Tanguy等人,SystemicAAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and thespinal cord of neonatal mice,Frontiers in Molecular Neuroscience,8(36)(2015年7月)。Passini等人,HGT,2014报道了使用scAAV9.GusB.SMN1载体在SMNΔ7小鼠中多至200天的存活的剂量依赖性增加。Meyer等人,Molecular Therapy,2014报道了以2.7x109GC/幼仔至3.3x1010GC/幼仔的剂量使用scAAV9.CBA.SMN1载体多至450天的存活的剂量依赖性增加。然而，较低的剂量显示出很小的改善。还参见Passini等人,JCI,2010和Passini等人,Sci Trans Med,2011。这些文献中的每一篇都通过引用并入本文。
仍然需要对SMA进行有效治疗。
发明内容
在一个方面，提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含AAVhu68衣壳和至少一个表达盒，其中所述至少一个表达盒包含编码功能性SMN蛋白的核酸序列和指导SMN序列在宿主细胞中表达的表达控制序列，其中所述AAVhu68衣壳包含AAVhu68 vp1衣壳蛋白群，所述AAVhu68 vp1衣壳蛋白具有独立地选自由SEQ ID NO:7编码产生的蛋白质的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO:8氨基酸序列。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳具有vp1蛋白的异质群。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳具有vp2蛋白的异质群。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳具有vp3蛋白的异质群。在一个实施方案中，AAVhu68衣壳蛋白编码序列具有SEQ IDNO:7的序列。在一个实施方案中，SMA编码序列具有SEQ ID NO:1的序列。
还提供了包含AAVhu68衣壳的rAAV载体，所述AAVhu68衣壳将核酸分子包装在所述衣壳中，所述核酸分子包含AAV 5’ITR、CB7启动子、内含子、SEQ ID NO:1的核酸序列、聚腺苷酸和AAV3’反向末端重复序列，其中所述AAVhu68衣壳包含vp1蛋白群、vp2群和vp3蛋白群，其中所述AAVhu68衣壳蛋白具有独立地选自由SEQ ID NO:7产生的蛋白质的氨基酸序列，衣壳蛋白具有SEQ ID NO:8的vp1、vp2和/或vp3的氨基酸序列。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳具有vp1蛋白的异质群。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳具有vp2蛋白的异质群。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳具有vp3蛋白的异质群。
提供了包含如上所述的AAVhu68载体的药物组合物。除了至少一种载体原液(vector stock)外，该组合物还包含至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂和/或防腐剂。
还提供了使用rAAVhu68.SMA载体或用于本文提供的工程化hSMN的其他递送媒介物治疗有需要的受试者的脊髓性肌萎缩的方法。在某些实施方案中，本文提供的组合物可以鞘内施用。
在某些实施方案中，提供了如本文所述的rAAVhu68.SMN1或组合物用于治疗患者的脊髓性肌萎缩，任选地在共同疗法中。在某些实施方案中，患者具有3型SMA。在某些实施方案中，配制组合物用于鞘内递送。
提供了如本文所述的rAAVhu68.SMA或包含其的组合物用于治疗患有SMA的患者(任选地在共同治疗方案中)的用途。可配制这样的组合物用于鞘内递送。
从对本发明的以下详细描述中，本发明的其他方面和优点将变得显而易见。
附图说明
图1A是AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG载体基因组的示意图。ITR代表AAV2反向末端重复。CB7代表具有巨细胞病毒增强子的鸡β肌动蛋白启动子。RBG聚腺苷酸代表兔β珠蛋白多腺苷酸化信号。
图1B-1C是天然hSMN1、变体D(登录号NM_000344.3)(SEQ ID NO:3)与本文所述的密码子优化序列(SEQ ID NO:1)的比对。
图2是通过免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)对脑和脊髓中的转导的评估。对皮质、小脑和脊髓切片进行SMN1的免疫组织化学，并且代表性图像显示在顶部三组图中。在皮质切片中进行密码子优化的hSMN1核糖核酸(RNA)的ISH，并且代表性结果显示底部图中。从用或未用3x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠收集样品。野生型(WT)和杂合(Het)同窝幼仔作为阳性对照。
图3A是用或未用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠的存活曲线。野生型(WT)/杂合(Het)同窝幼仔和注射PBS的小鼠作为对照。
图3B是图3A中描述的存活曲线的统计学分析表。计算并列出了中位存活。
图4A是用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hS MN1.RBG载体处理的SMNΔ7(KO)小鼠的体重的线图。野生型(WT)/杂合(Het)同窝鼠和注射PBS的小鼠作为对照。
图4B是用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hS MN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠出生后第15天的体重图。野生型(WT)/杂合(Het)同窝幼仔和注射PBS的小鼠作为对照。
图4C是用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hS MN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠出生后第30天的体重图。野生型(WT)/杂合(Het)同窝幼仔作为对照。
图4D-4J是按性别归一化之后体重的线图。对用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠，从出生后第3天至第13天或第15天每两天进行实验。野生型/杂合同窝幼仔(WT)和注射PBS的小鼠作为对照。通过统计学分析计算P值并在图中示出。
图5A是在后肢悬吊测试(Hind-Limb Suspension Test)中使用的评分系统的图示。
图5B包括对于用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠，从出生后第3天至第13天每两天记录的后肢评分的图。野生型(WT)/杂合(Het)同窝幼仔和注射PBS的小鼠作为对照。
图6A-6C包括显示动物在翻正反射测试(Righting Reflex Test)中返回其正常体位花费的时间的图。对于用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠，从出生后第7天至第17天每两天进行实验。野生型(WT)/杂合(Het)同窝幼仔和注射PBS的小鼠作为对照。
图6D-6J是显示在按性别归一化之后动物在翻正反射测试中返回其正常体位花费的时间的图。对于用3x1010或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG处理的SMNΔ7(KO)小鼠，从出生后第7天至第17天每两天进行实验。野生型/杂合同窝幼仔(WT)同窝幼仔和注射PBS的小鼠作为对照。通过统计学分析计算P值并在图中示出。
图7是用于脑池内递送的装置的图像，包括任选的用于同轴插入方法的引导针(introducer needle)，该装置包括10cc载体注射器、10cc预填充冲洗注射器、T型连接器延伸装置(T-connector extension set)、22Gx5"脊柱针、任选的18Gx3.5"引导针。
图8A提供了显示由图8B-8D的核酸序列编码的vp1衣壳序列的氨基酸序列的比对。比对包括以下的vp1蛋白：AAVhu68[SEQ ID NO:8]与AAV9[SEQ ID NO:16]、AAVhu31(在比对中标记为hu.31)[SEQ ID NO:18]和AAVhu32(在比对中标记为hu.32)[SEQ ID NO:19]。与AAV9、AAVhu31和AAVhu32相比，在AAVhu68中发现两个突变(A67E和A157V)是关键的并且在图中圈出。
图8B-8D提供了编码vp1衣壳的核酸序列的比对：AAVhu68[SEQ ID NO:7]与AAV9[SEQ ID NO:22]、AAVhu31[SEQ ID NO:20]和AAVhu32[SEQ ID NO:21]。
图9A-9B是显示用多种剂量的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG ICV处理的成年野生型小鼠(HET/WT，图9A)或SMNΔ7小鼠(KO，图9B)中的体重监测结果的图(1x109GC,WT,n＝7,KO,n＝1；3x109GC,WT,n＝7,KO,n＝1；1x1010GC,WT,n＝3,KO,n＝5；3x1010GC,WT,n＝1,KO,n＝1；或7x1010GC,WT,n＝5,KO,n＝3)。提供PBS注射的动物(WT,n＝3；KO,n＝4)作为对照。
图10A-10B是显示用多种剂量的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG ICV处理的成年野生型小鼠(HET/WT，图10A)或SMNΔ7小鼠(KO，图10B)中的翻正反射结果的图(1x109GC,WT,n＝7,KO,n＝1；3x109 GC,WT,n＝7,KO,n＝1；1x1010GC,WT,n＝3,KO,n＝5；3x1010GC,WT,n＝1,KO,n＝1；或7x1010GC,WT,n＝5,KO,n＝3)。提供PBS注射的动物(WT,n＝3；KO,n＝5)作为对照。
图11A-11H是显示如实施例10中所述用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG鞘内处理的成年恒河猴的临床病理学、CSF化学和CSF细胞学的图。
图12A-12B提供了在如实施例10中所述用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG鞘内处理的成年恒河猴中通过ISH(图12A)和IHC(图12B)的运动神经元转导的量化。使用荧光镜引导和造影材料确认小脑延髓池(cisterna magna)(小脑延髓池内(intra cisterna magna)；ICM)或腰大池(lumbar cistern)(腰椎穿刺；LP)中针的放置。总注射体积对于ICM组(n＝3)为1.0mL，对于LP组为2.5mL(n＝4)或5.0mL(n＝4)。在注射后一个月，处死动物，在脊髓切片中通过转基因mRNA的原位杂交(ISH)和人SMN蛋白的免疫组织化学(IHC)对运动神经元转导进行量化。
图13提供了如实施例10中所述的用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG鞘内处理的成年恒河猴中的生物分布。
图14A-14B提供了如实施例9中所述用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBGICV处理的成年C57BL/6J小鼠的体重监测结果。图14A提供了雌性受试者的体重监测结果。图14B提供了雄性受试者的体重监测结果。
图15A-15B是AAVhu68.SMN载体的制造流程图。
图16A-16E提供了显示在向非人灵长类动物静脉内施用表达人SMN的AAV载体后急性转氨酶升高的图。图16A提供了如实施方案14中所述的研究设计。图16B提供了血清ALT的图。图16C提供了血清AST的图。图16D提供了血清碱性磷酸酶的图。图16E提供了血清总胆红素的图。在动物16C176出现急性肝衰竭需要安乐死之后，在研究第5天对所有动物进行了未预先安排的实验室评估。对于动物16C116和16C215，在研究第5天不进行AST。虚线表示实验室参考范围。
图17A-17D提供了代表性的IHC图像，其显示了对于动物16C176的肝脏组织病理学发现。大量急性肝细胞坏死(图17A)以及门静脉中的窦状纤维蛋白沉积(sinusoidalfibrin deposition)(图17B，箭头)和急性纤维蛋白血栓(图17C)(苏木精和伊红；比例尺＝10μm(图17A和17C)、50μm(图17B))。纤维蛋白原的免疫组织化学描绘了显著的门静脉周窦状纤维蛋白沉积(图17D)(纤维蛋白原IHC，比例尺代表100μm(图17D))。
图18A-18D提供了用表达人SMN的AAVhu68静脉内(IV)处理的婴儿NHP中注射后28天的代表性神经系统组织病理学发现。两只动物都具有脊髓背侧白质束(dorsal whitematter tract)的轴突病变(axonopathy)(图18A)。背侧轴突病变通常是双侧的，并且其特征在于具有和不具有骨髓巨噬细胞(myelomacrophages)的扩张的髓鞘，与轴突变性一致。脊髓的背根神经节(图18B)表现出最小至轻度的神经元细胞体变性，其特征在于中心尼氏体溶解(chromatolysis)、卫星状态(satellitosis)和包围并侵入神经元细胞体的单核细胞浸润(噬神经细胞现象(neuronophagia))。在后肢(坐骨神经，图18C)和前肢(正中神经，图18D)的外周神经中观察到类似的轴突病变。由于急性肝功能衰竭而在第5天实施安乐死的动物(16C176)在神经系统中没有发现。(苏木精和伊红染色；比例尺＝200μm(图18A)、100μm(图18B-18D))
图19提供了恒河猴中的载体生物分布。对用表达人SMN的AAVhu68静脉内处理的恒河猴在注射后的28天实施安乐死，除了动物16C176，其在载体施用后的5天发生肝衰竭和休克并被实施安乐死。通过定量PCR在组织DNA样品中检测载体基因组。数值表示为每个宿主二倍体基因组的载体基因组拷贝(GC)。DRG＝背根神经节。显示了四个肝叶(尾状叶(caudate)、左叶、中叶和右叶)的数据。
图20A-20G显示了恒河猴中的SMN表达，通过肝脏中的ISH检测人SMN RNA(图20A)。将肝脏用白蛋白(图20B)和GFP(图20C)的对照探针进行染色。通过脊髓中的ISH鉴定表达SMN的细胞(图20D)。通过ChAT ISH鉴定运动神经元(图20E)。通过脑中的SMN ISH检测的转导神经元的稀疏片区(图20F，DAPI核染色)。量化每个脊髓水平转导的ChAT+运动神经元的百分比(图20G)。误差棒＝SEM。
图21A-21D提供了在7日龄和30日龄时用表达人SMN的AAVhu68静脉内处理的仔猪的代表性组织病理学发现。在整个两组中，观察脊髓背侧白质束的轴突病变(图21A)。背侧轴突病变是双侧的，并且其特征在于具有和不具有骨髓巨噬细胞的扩张的髓鞘，与轴突变性一致。脊髓的背根神经节(图21B)表现出不同程度的神经元细胞体变性，其特征在于中心尼氏体溶解、卫星状态和包围并侵入神经元细胞体的单核细胞浸润(噬神经细胞现象)。在大多数仔猪中，在后肢(坐骨神经，图21C)和前肢(正中神经，图21D)的外周神经中观察到不同程度的类似轴突病变。(苏木精和伊红；比例尺＝200μm(图21A)、100μm(图21B-21D))
图22提供了仔猪中的载体生物分布。对用表达人SMN的AAVhu68静脉内处理的新生仔猪在注射后13-14天实施安乐死。通过定量PCR在组织DNA样品中检测载体基因组。数值表示为每个宿主二倍体基因组的载体基因组拷贝(GC)。DRG＝背根神经节。显示了四个肝叶(尾状叶、左叶、中叶和右叶)的数据。
图23A-23F提供了显示仔猪脊髓中SMN的表达的代表性图像。在颈部(图23A)、胸部(图23B)和腰部(图23C)脊髓节段中通过ISH检测人SMN RNA。通过相应切片中的ChAT ISH鉴定运动神经元(图23D-23F)。显示了代表性的图像。
具体实施方式
本文提供了一种具有AAVhu68衣壳和编码运动神经元生存(SMN)基因的核酸的重组AAVhu68载体，所述基因在指导其在有需要的患者中的表达的调节序列的控制下。rAAVhu68衣壳包含独立地具有由SEQ ID NO:7产生的氨基酸序列和/或具有SEQ ID NO:8氨基酸序列的蛋白质。提供了包含这些载体的组合物，以及这些载体在用于治疗SMA患者的组合物中的用途。尽管实例集中于治疗SMA3(有时称为库格尔贝格-韦兰德病)，但是也预期了这些rAAV载体单独或与其他共同疗法组合用于1、2或4型SMA的用途。可以使用用于检测染色体5上的SMN1基因中的缺失突变的血液测试诊断SMA。可以使用诸如肌电图或肌肉活检的其他肌肉测试来辅助诊断。
I.AAV
如本文所用，与AAV组相关的术语“进化枝(clade)”是指在系统发生上彼此相关的一组AAV，如使用Neighbor-Joining算法通过至少75％的解靴带值(bootstrap value)(至少1000个重复)和基于AAV vp1氨基酸序列比对的泊松校正距离(Poisson correctiondistance)测量不大于0.05所确定的。Neighbor-Joining算法已在文献中描述。参见，例如，M.Nei and S.Kumar,Molecular Evolution and Phylogenetics(Oxford UniversityPress,New York(2000)。可用于实施该算法的计算机程序是可获得的。例如，MEGA v2.1程序执行改进的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选择的AAV是否包含在本文鉴定的一个进化枝中，在另一个进化枝中，或者在这些进化枝之外。参见，例如，GGao,等人,J Virol,2004年6月；78(10:6381-6388，其鉴定了进化枝A、B、C、D、E和F，并且提供了GenBank登录号AY530553至AY530629的新AAV的核酸序列。还参见WO2005/033321。
如本文所用，“AAV9衣壳”是由多个AAV9 vp蛋白构成的自组装AAV衣壳。AAV9 vp蛋白通常表达为由SEQ ID NO:22的核酸序列或与其至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的序列编码的可选剪接变体，其编码SEQ IDNO:16的vp1氨基酸序列(GenBank登录号：AAS99264)。这些剪接变体导致SEQ ID NO:16的不同长度的蛋白质。在某些实施方案中，“AAV9衣壳”包括具有与AAS99264具有99％同一性或与SEQ ID NO:16具有99％同一性的氨基酸序列的AAV。还参见US7906111和WO 2005/033321。如本文所用，“AAV9变体”包括例如WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911和US 8,734,809中描述的那些。
rAAVhu68由AAVhu68衣壳和载体基因组构成。AAVhu68衣壳是vp1异质群、vp2异质群体和vp3蛋白异质群的组装体。如本文所用，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变体是指由不相同的元件组成的群体，例如具有具不同的修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。SEQ ID NO:8提供了AAVhu68 vp1蛋白的编码的氨基酸序列。还参见美国临时专利申请号62/614,002、62/591,002和62/464,748，其中每一个的标题为“Novel Adeno-Associated Virus(AAV)Clade F Vector and Uses Therefor”，并且其通过引用整体并入本文。
AAVhu68衣壳包含vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群，其具有相对于SEQID NO:8中预测氨基酸残基的修饰。这些亚群至少包含某些脱酰胺的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群包含SEQ ID NO:8中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)位置，并且任选地还包含其他脱酰胺的氨基酸，其中脱酰胺导致氨基酸变化和其他任选修饰。SEQ ID NO:26提供了修饰的AAVhu68衣壳的氨基酸序列，举例说明了可以脱酰胺或以其他方式修饰的残基位置。
如本文所用，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群”是指vp蛋白的组，其具有至少一个确定的共同特征，并且由参考组的至少一个组成员至少于全部成员组成。例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群”是组装的AAV衣壳中的至少一个vp1蛋白并且少于全部vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群”可以是组装的AAV衣壳中的一个vp3蛋白至少于全部vp3蛋白。例如，vp1蛋白可以是vp蛋白的亚群；vp2蛋白可以是vp蛋白的单独亚群，并且vp3是组装的AAV衣壳中vp蛋白的另一亚群。在另一个实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可包含具有不同修饰的亚群，例如至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺，例如在天冬酰胺-甘氨酸对处。
除非另有说明，否则高度脱酰胺是指与参考氨基酸位置的预测氨基酸序列相比，在参考氨基酸位置处至少45％脱酰胺、至少50％脱酰胺、至少60％脱酰胺、至少65％脱酰胺、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、97％、99％、至多约100％脱酰胺(例如基于全部vp1蛋白，SEQ ID NO:8的氨基酸57处的至少80％的天冬酰胺可以被脱酰胺，或者基于全部vp1、vp2和vp3蛋白，SEQ ID NO:8的氨基酸409处的天冬酰胺中20％可以被脱酰胺)。可以使用2D-凝胶、质谱技术或其他合适的技术来确定这样的百分比。
不希望受理论束缚，AAVhu68衣壳中的vp蛋白中至少高度脱酰胺残基的脱酰胺被认为在性质上主要是非酶促的，由衣壳蛋白中使选择的天冬酰胺和较小程度上谷氨酰胺残基脱酰胺的基团引起。大多数脱酰胺vp1蛋白的有效衣壳组装表明这些事件发生在衣壳组装之后，或者单个单体(vp1、vp2或vp3)中的脱酰胺在结构上是良好耐受的并且在很大程度上不影响组装动力学。VP1-独特(VP1-u)区域(～aa1-137)中的广泛脱酰胺通常被认为在细胞进入之前位于内部，表明VP脱酰胺可能发生在衣壳组装之前。
不希望受理论束缚，可以通过其C-末端残基的主链氮原子对Asn的侧链酰胺基团碳原子进行亲核攻击来发生N的脱酰胺。认为形成了中间体闭环琥珀酰亚胺残基。然后琥珀酰亚胺残基进行快速水解，得到最终产物天冬氨酸(Asp)或异天冬氨酸(IsoAsp)。因此，在某些实施方案中，天冬酰胺(N或Asn)的脱酰胺产生Asp或IsoAsp，其可以通过的琥珀酰亚胺中间体相互转化，例如如下所示。
如本文所提及，SEQ ID NO:8的每个脱酰胺N可独立地为天冬氨酸(Asp)、异天冬氨酸(isoAsp)、天冬氨酸盐(aspartate)和/或Asp和isoAsp的互变混合物、或其组合。可以存在任何合适比率的α-和异天冬氨酸。例如，在某些实施方案中，该比率可以为10:1至1:10的天冬氨酸比异天冬氨酸，约50:50的天冬氨酸:异天冬氨酸，或约1:3的天冬氨酸:异天冬氨酸，或其他选择的比率。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:8中的一个或多个谷氨酰胺(Q)脱酰胺成谷氨酸(Glu)，即α-谷氨酸、γ-谷氨酸(Glu)、或α-和γ-谷氨酸的混合物，其可以通过共同的戊二酰亚胺(glutarinimide)中间体进行相互转化。可以存在任何合适比率的α-和γ-谷氨酸。例如，在某些实施方案中，该比率可以为10:1至1:10的α比γ，约50:50的α:γ，或约1:3的α:γ，或其他选择的比率。
因此，rAAVhu68在rAAVhu68衣壳内包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的具有脱酰胺氨基酸的亚群，其至少包含含有至少一个高度脱酰胺天冬酰胺的至少一个亚群。此外，其他修饰可包括异构化，特别是在所选的天冬氨酸(D或Asp)残基位置。在另一些实施方案中，修饰可包括Asp位置的酰胺化。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含与SEQ ID NO:8的编码氨基酸序列相比具有至少4个至至少约25个脱酰胺氨基酸残基位置的vp1、vp2和vp3亚群，其中至少1％至10％被脱酰胺。这些中的大多数可以是N残基。然而，Q残基也可以被脱酰胺。
在某些实施方案中，AAV68衣壳的特征还在于以下一种或多种。AAV hu68衣壳蛋白包含：由编码SEQ ID NO:8的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68vp1蛋白，由SEQ ID NO:7产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:8的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:7具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白；由编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp2蛋白，由包含SEQ ID NO:7的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQ IDNO:8的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:7的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白；和/或由编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp3蛋白，由包含SEQ IDNO:7的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:7的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白。
另外或可替代地，提供了一种AAV衣壳，基于SEQ ID NO:8的vp1衣壳的编号，其包含：vp1蛋白的异质群、vp2蛋白的异质群(任选地包含位置157处的缬氨酸)和vp3蛋白的异质群，其中至少vp1和vp2亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置67处的谷氨酸。另外或可替代地，提供了一种AAVhu68衣壳，其包含：为编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，以及为编码SEQ ID NO:8的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白包含具有氨基酸修饰的亚群。
AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表达为由编码SEQ ID NO:8的全长vp1氨基酸序列(氨基酸1至736)的相同核酸序列编码的可选剪接变体。任选地，vp1编码序列单独用于表达vp1、vp2和vp3蛋白。或者，该序列可以与以下一种或多种共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa1至约aa137)和/或vp2独特区域(约aa1至约aa202)的SEQ ID NO:8的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(或SEQ ID NO:7的约nt607至约nt2211)，或者与编码SEQ ID NO:8的aa203至736的SEQ ID NO:7具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。另外或可替选地，vp1编码序列和/或vp2编码序列可以与以下共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa1至约137)的SEQ ID NO:8的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa138至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(SEQ ID NO:7的nt412至2211)，或与编码SEQ IDNO:8的约aa 138至736的SEQ ID NO:7具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
如本文所述，rAAVhu68具有在生产系统中从编码SEQ ID NO:8的vp1氨基酸序列的AAVhu68核酸和任选的例如编码不含vp1和/或vp2独特区域的vp3蛋白的另外的核酸序列产生的rAAVhu68衣壳。使用单个核酸序列vp1产生的rAAVhu68产生了vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群。更具体地，AAVhu68衣壳包含vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内相对于SEQID NO:8中的预测氨基酸残基具有修饰的亚群。这些亚群至少包含脱酰胺天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺的。
在一个实施方案中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO:7的序列，或其互补链，例如相应的mRNA或tRNA。在某些实施方案中，vp2和/或vp3蛋白可以另外地或替代地从vp1以外的不同核酸序列表达，例如以改变所选表达系统中vp蛋白的比率。在某些实施方案中，还提供了编码不具有vp1独特区域(约aa1至约aa137)和/或vp2独特区域(约aa1至约aa202)的SEQ ID NO:8的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa203至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(或SEQ ID NO:7的约nt607至约nt2211)。在某些实施方案中，还提供了编码不具有vp1独特区域(约aa1至约137)的SEQ ID NO:8的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa138至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(或SEQ ID NO:7的约nt412至2211)。
然而，可以选择编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的其他核酸序列用于产生rAAVhu68衣壳。在某些实施方案中，核酸序列具有SEQ ID NO:7的核酸序列，或者与编码SEQ ID NO:8的SEQ ID NO:7具有至少70％至99％同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，核酸序列具有SEQ ID NO:7的约nt412至约nt2211的核酸序列，或者与编码SEQ ID NO:8的vp2衣壳蛋白(约aa138至736)的SEQ ID NO:7的约nt412至约nt2211具有至少70％至99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，核酸序列具有SEQ ID NO:7的约nt607至约nt2211的核酸序列，或者与编码SEQ ID NO:8的vp3衣壳蛋白(约aa203至736)的SEQ ID NO:7的约nt 607至约nt2211具有至少70％至99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。
设计编码该AAVhu68衣壳的核酸序列(包括DNA(基因组或cDNA)或RNA(例如mRNA))在本领域技术范围内。在某些实施方案中，编码AAVhu68 vp1衣壳蛋白的核酸序列提供在SEQ ID NO:7中。还参见图8B-8D。在另一些实施方案中，可以选择与SEQ ID NO:7具有70％至99.9％同一性的核酸序列以表达AAVhu68衣壳蛋白。在某些另外的实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO:7具有至少约75％同一性、至少80％同一性、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％同一性、或至少99％至99.9％同一性。这样的核酸序列可以密码子优化以在选择的系统(即，细胞类型)中表达，这可以通过各种方法设计。可以使用可在线获得的方法(例如，GeneArt)、公开的方法或提供密码子优化服务的公司例如DNA2.0(MenloPark,CA)来进行该优化。一种密码子优化方法描述于例如美国国际专利公开号WO 2015/012924中，其通过引用整体并入本文。还参见例如美国专利公开号2014/0032186和美国专利公开号2006/0136184。适当地，对产物的开放阅读框(ORF)的整个长度进行修饰。然而，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法之一，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生编码多肽的密码子优化编码区的核酸片段。许多选择可用于进行密码子的实际改变或用于合成如本文所述设计的密码子优化的编码区。这样的修饰和合成可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物学操作进行。在一种方法中，通过标准方法合成一系列各自长度为80-90个核苷酸且跨越期望序列的长度的互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成包含粘性末端的80-90个碱基对的双链片段，例如，合成对中的每个寡核苷酸以延伸超过与对中的另一寡核苷酸互补的区域3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。每个寡核苷酸对的单链末端设计为与另一个寡核苷酸对的单链末端退火。使寡核苷酸对退火，然后使约5至6个这些双链片段通过粘性单链末端一起退火，然后将它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可从Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif获得的载体。然后通过标准方法对构建体进行测序。制备由连接在一起的80至90个碱基对片段的5至6个片段构成的多个这些构建体(即约500个碱基对的片段)，使得整个期望序列在一系列质粒构建体中表示。然后用合适的限制酶切割这些质粒的插入物并连接在一起形成最终的构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并测序。其他方法对于技术人员来说是显而易见的。此外，基因合成在商业上很容易获得。
在某些实施方案中，AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白中的N-G对中的天冬酰胺(N)是高度脱酰胺的。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含AAVvp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白的亚群，该亚群在AAVhu68衣壳蛋白中具有至少四个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)位置。在某些实施方案中，约20％至50％的N-N对(不包括N-N-N三联体)表现为脱酰胺。在某些实施方案中，第一个N被脱酰胺。在某些实施方案中，第二N被脱酰胺。在某些实施方案中，脱酰胺为约15％至约25％脱酰胺。对于AAVhu68蛋白的AAVhu68 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白，SEQ ID NO:8的位置259处的Q处的脱酰胺为约8％至约42％。
在某些实施方案中，rAAVhu68衣壳的特征还在于vp1、vp2和vp3蛋白的D297处的酰胺化。在某些实施方案中，基于SEQ ID NO:8的编号，AAVhu68衣壳中vp1、vp2和/或vp3蛋白的位置297处的D中约70％至约75％酰胺化。
在某些实施方案中，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个Asp异构化为D-Asp。基于SEQ ID NO:8的编号，这些异构体通常以少于残基位置97、107、384中的一个或多个处的Asp的约1％的量存在。
在某些实施方案中，rAAVhu68具有具vp1、vp2和vp3蛋白的AAVhu68衣壳，所述蛋白具有包含在下表中列出的位置处的两个、三个、四个或更多个脱酰胺残基的组合的亚群。可以使用2D凝胶电泳和/或质谱法和/或蛋白质建模技术来确定rAAV中的脱酰胺。可以用AcclaimPepMap柱和与具有NanoFlex源的QExactiveHF(Thermo FisherScientific)偶联的ThermoUltiMate3000RSLC系统(Thermo UltiMate3000RSLC)进行在线色谱法。使用QExactiveHF的数据依赖性top-20方法获取MS数据，从调查扫描(200-2000m/z)动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。通过更高能量的碰撞解离片段化(collisionaldissociation fragmentation)进行测序，其中通过预测性自动增益对照(predictiveautomatic gain control)确定1e5离子的目标值，并且使用4m/z的窗口进行前体的分离。以m/z200下120,000的分辨率获得调查扫描。HCD光谱的分辨率可设置为m/z200下30,000，最大离子注入时间为50ms，标准碰撞能量为30。S-lensRF水平可以设定为50，以给出由来自消化物的肽占据的m/z区域的最佳传递。前体离子可以从片段化选择中以单个、未指定的、或六个和更高的电荷状态排除。可以使用BioPharma Finder 1.0软件(Thermo FischerScientific)分析所获得的数据。对于肽作图，使用单入口蛋白质FASTA数据库进行搜索，其中氨甲酰甲基化设定为固定修饰；氧化、脱酰胺和磷酸化设定为可变修饰，10ppm质量准确度，高蛋白酶特异性和MS/MS谱的置信水平为0.8。合适的蛋白酶的实例可包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脱酰胺肽的质谱鉴定相对简单，因为脱酰胺使完整分子的质量增加了+0.984Da(-OH和-NH2基团之间的质量差异)。特定肽的脱酰胺百分比是确定的脱酰胺肽的质量面积除以脱酰胺和天然肽的面积之和。考虑到可能的脱酰胺位点的数量，在不同位点脱酰胺的同量异位(isobaric)物质可能在单个峰中共迁移。因此，源自具有多个潜在脱酰胺位点的肽的片段离子可用于定位或区分多个脱酰胺位点。在这些情况下，观察到的同位素模式中的相对强度可用于特异性地确定不同脱酰胺肽异构体的相对丰度。该方法假定所有同量异位物质的片段化效率是相同的并且独立于脱酰胺的位点。本领域技术人员将理解，可以使用这些说明性方法的许多变型。例如，合适的质谱仪可包括例如四极飞行时间质谱仪(quadrupole time of flight mass spectrometer，QTOF)，例如Waters Xevo或Agilent6530或轨道阱(orbitrap)仪器，例如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(ThermoFisher)。合适的液相色谱系统包括例如来自Waters或Agilent系统的Acquity UPLC系统(1100或1200系列)。合适的数据分析软件可包括例如MassLynx(Waters)、Pinpoint和Pepfinder(Thermo Fischer Scientific)、Mascot(Matrix Science)、Peaks DB(Bioinformatics Solutions)。还可以描述其他技术，例如X.Jin等人,Hu Gene TherapyMethods,第28卷,编号5,第255-267页,2017年6月16日在线发表。
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在某些实施方案中，AAVhu68衣壳的特征在于，其衣壳蛋白中在基于SEQ ID NO:8的氨基酸序列编号的位置N57、N329、N45和/或N512中的至少一处的至少45％的N残基被脱酰胺。在某些实施方案中，在这些N-G位置(即基于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的编号，N57、N329、N452和/或N512)的一处或更多处的至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少90％的N残基被脱酰胺。在这些和另一些实施方案中，AAVhu68衣壳的特征还在于具有其中在以下一个或多个位置处的N残基中约1％至约20％具有脱酰胺的蛋白质群：基于SEQ IDNO:8的氨基酸序列编号，N94、N253、N270、N304、N409、N477和/或Q599。在某些实施方案中，AAVhu68至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群在以下的一个或多个位置处脱酰胺：基于SEQ ID NO:8的氨基酸序列编号，N35、N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709、N735或其组合。在某些实施方案中，衣壳蛋白可具有一个或多个酰胺化氨基酸。
还观察到其他修饰，其中大多数不导致一个氨基酸转化为不同的氨基酸残基。任选地，衣壳的vp1、vp2和vp3中的至少一个Lys被乙酰化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个Asp异构化为D-Asp。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个S(Ser，丝氨酸)被磷酸化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个T(Thr，苏氨酸)被磷酸化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个W(trp，色氨酸)被氧化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个M(Met，甲硫氨酸)被氧化。在某些实施方案中，衣壳蛋白具有一个或多个磷酸化。例如，某些vp1衣壳蛋白可在位置149处磷酸化。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含：vp1蛋白的异质群，其是编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的核酸序列的产物，其中vp1蛋白包含位置67处的谷氨酸(Glu)和/或位置157处的缬氨酸(Val)；vp2蛋白的异质群，其任选地包含位置157处的缬氨酸(Val)；和vp3蛋白的异质群。AAVhu68衣壳包含至少一个亚群，其中基于SEQ ID NO:8氨基酸序列的残基编号，位于vp1蛋白的位置57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少65％的天冬酰胺(N)以及vp1、v2和vp3蛋白的位置329、452和/或512处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少70％的天冬酰胺(N)被脱酰胺，其中脱酰胺导致氨基酸改变。如本文更详细讨论的，脱酰胺的天冬酰胺可以脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、互变天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合。在某些实施方案中，rAAVhu68的特征还在于以下一种或多种：(a)每个vp2蛋白独立地是编码SEQ ID NO:8的至少vp2蛋白的核酸序列的产物；(b)每个vp3蛋白独立地是编码SEQ ID NO:8的至少vp3蛋白的核酸序列的产物；(c)编码vp1蛋白的核酸序列是SEQ ID NO:7，或与编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的SEQ ID NO:7具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。任选地，该序列单独用于表达vp1、vp2和vp3蛋白。或者，该序列可以与以下一种或多种共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa1至约aa137)和/或vp2独特区域(约aa1至约aa202)的SEQ ID NO:8的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa203至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(SEQ ID NO:7的约nt 607至约nt2211)，或者与编码SEQ ID NO:8的aa203至736的SEQ ID NO:7具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。另外或可替选地，vp1编码序列和/或vp2编码序列可以与以下共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa 1至约137)的SEQ ID NO:8的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(SEQ ID NO:7的nt 412至2211)，或与编码SEQ ID NO:8的约aa138至736的SEQ ID NO:7具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
另外或可替代地，rAAVhu68衣壳至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群在以下一个或多个位置处被脱酰胺：基于SEQ ID NO:8的编号，N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N512、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其组合；(e)rAAVhu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群在以下一个或多个位置处包含1％至20％的脱酰胺：基于SEQ IDNO:8的编号，N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其组合；(f)rAAVhu68衣壳包含vp1的亚群，其中基于SEQ ID NO:8的编号，vp1蛋白位置57处的65％至100％的N被脱酰胺；(g)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白的亚群，其中vp1蛋白位置57处的75％至100％的N被脱酰胺；(h)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO:8的编号，位置329处的80％至100％的N被脱酰胺；(i)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO:8的编号，位置452处的80％至100％的N被脱酰胺；(j)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO:8的编号，位置512处的80％至100％的N被脱酰胺；(k)rAAV包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白质；(1)rAAV包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至9个vp3蛋白。
在某些实施方案中，对AAVhu68进行修饰以改变天冬酰胺-甘氨酸对中的甘氨酸，以降低脱酰胺。在另一些实施方案中，将天冬酰胺改变为不同的氨基酸，例如以较慢的速率脱酰胺的谷氨酰胺；或改变成缺少酰胺基团(amide group)的氨基酸(例如，谷氨酰胺和天冬酰胺包含酰胺基团)；和/或缺少胺基(amine group)的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸包含酰胺基团)。如本文所用，缺少酰胺或胺侧基的氨基酸是指例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸、和/或脯氨酸。如所述的修饰可以在编码的AAVhu68氨基酸序列中发现的一个、两个或三个天冬酰胺-甘氨酸对中。在某些实施方案中，这样的修饰不是在所有四个天冬酰胺-甘氨酸对中进行的。因此，一种用于降低AAVhu68和/或工程化AAVhu68变体的脱酰胺的方法具有较低脱酰胺速率。另外或可替代的，一个或多个其他酰胺氨基酸可以改变为非酰胺氨基酸以降低AAVhu68的脱酰胺。
这些氨基酸修饰可以通过常规遗传工程技术进行。例如，可以产生含有修饰的AAVhu68 vp密码子的核酸序列，其中编码SEQ ID NO:8(精氨酸-甘氨酸对)中位置58、330、453和/或513处的甘氨酸的一至三个密码子被修饰成编码甘氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，可以在位于SEQ ID NO:8中位置57、329、452和/或512处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处对包含修饰的精氨酸密码子的核酸序列进行工程化，使得修饰的密码子编码精氨酸以外的氨基酸。每个修饰的密码子可以编码不同的氨基酸。或者，一个或多个改变的密码子可以编码相同的氨基酸。在某些实施方案中，这些修饰的AAVhu68核酸序列可用于产生突变体rAAVhu68，其具有比天然hu68衣壳具有更低脱酰胺的衣壳。这样的突变体rAAVhu68可具有降低的免疫原性和/或提高储存稳定性，特别是以悬浮形式储存。如本文所用，“密码子”是指序列中编码氨基酸的三个核苷酸。
在一个实施方案中，提供了重组腺相关病毒(rAAV)，所述重组腺相关病毒包含：(A)AAV68衣壳，其包含以下一种或多种：(1)AAV hu68衣壳蛋白，其包含：由编码SEQ ID NO:8的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp1蛋白，由SEQ ID NO:7产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:8的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:7具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，由编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp2蛋白，由包含SEQ ID NO:7的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:7的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，由编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp3蛋白，由包含SEQ ID NO:7的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:7的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或(2)AAV衣壳蛋白，其包含：任选地包含位置157处的缬氨酸和/或位置67处的谷氨酸的vp1蛋白的异质群，任选地包含位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群，和vp3蛋白的异质群，其中至少vp1和vp2蛋白的亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置67处的谷氨酸，基于SEQ ID NO:8的vp1衣壳的编号；和/或(3)为编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQ ID NO:8的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，和为编码SEQ ID NO:8的至少氨基酸203至736的核酸序列的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白包含具有氨基酸修饰的亚群，该亚群包含SEQ ID NO:8中天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)，并且任选地还包含含有其他脱酰胺氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变；(B)AAVhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包含核酸分子，所述核酸分子包含AAV反向末端重复序列和编码产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接。例如，四个残基(N57、N329、N452、N512)通常显示高脱酰胺水平。其他残基(N94、N253、N270、N304、N409、N477和Q599)在不同批次之间也显示多至～20％的脱酰胺水平。
在某些实施方案中，脱酰胺的天冬酰胺被脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、互变天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合。在某些实施方案中，脱酰胺的谷氨酰胺被脱酰胺为(α)-谷氨酸、γ-谷氨酸、互变(α)--谷氨酸/γ-谷氨酸对或其组合。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含具有以下一种或多种的亚群：(a)基于SEQID NO:8的编号，位于vp1蛋白位置57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少65％的天冬酰胺(N)被脱酰胺；(b)基于SEQ ID NO:8氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置329处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少75％的N被脱酰胺；(c)基于SEQ ID NO:8氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置452处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少50％的N被脱酰胺；和/或(d)基于SEQ ID NO:8氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置512处的天冬酰胺-甘氨酸对中至少75％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1亚群，其中如使用质谱法所测定，vp1蛋白的位置57处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法所测定，基于SEQ IDNO:8的编号，位置329处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法所测定，基于SEQ ID NO:8的编号，位置452处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO:8的编号，位置512处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列是SEQ ID NO:7，或与编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的SEQ ID NO:7具有至少80％至至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，该序列与SEQ ID NO:7具有至少80％至97％的同一性。在某些实施方案中，rAAVhu68衣壳还至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群具有从SEQ ID NO:8的氨基酸的修饰，其在选自以下的至少四个位置处包含至少约50％至100％的脱酰胺：N57、329、452、512的一个或多个，或其组合。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白亚群，该亚群还在以下的至少一个或多个位置处包含1％至约40％的脱酰胺：N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其组合。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白亚群，该亚群还包含一个或多个修饰，该修饰选自以下一种或多种的一个或多个修饰：乙酰化赖氨酸、磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸、异构化天冬氨酸、氧化色氨酸和/或甲硫氨酸、或酰胺化氨基酸。在某些实施方案中，rAAVhu68包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白。在某些实施方案中，AAVhu68包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至9个vp3蛋白。在某些实施方案中，载体基因组包含来自AAVhu68以外的AAV来源的AAVITR序列。
在某些实施方案中，提供了一种组合物，其包含重组腺相关病毒hu68(rAAVhu68)的混合群，其中每个rAAVhu68独立地选自如本文所述的rAAVhu68。在某些实施方案中，平均AAVhu68衣壳包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白。在某些实施方案中，平均AAVhu68衣壳包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至6个vp3蛋白。在某些实施方案中，组合物被配制用于静脉内递送。在某些实施方案中，组合物被配制用于鼻内或肌肉内递送。在某些实施方案中，组合物包含至少rAAVhu68载体原液和任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。
可以使用可用于产生重组AAVhu68的任何合适的rAAV生产系统。例如，这样的生产系统可包括：(a)编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的AAVhu68衣壳核酸序列；(b)适于包装到AAVhu68衣壳中的核酸分子，所述核酸分子包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接；以及(c)足够的AAVrep功能和辅助功能，以允许将核酸分子包装到重组AAVhu68衣壳中。在某些实施方案中，(a)的核酸序列至少包含SEQ ID NO:7，或与编码SEQ ID NO:8氨基酸序列的SEQ ID NO:7具有至少70％至至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，该系统任选地还包含编码SEQ ID NO:8的约aa203至约氨基酸736的AAVhu68 vp3的SEQ ID NO:7的约nt607至约nt2211的核酸序列。在某些实施方案中。该系统包含人胚胎肾293细胞或杆状病毒系统。
在某些实施方案中，提供了用于降低AAVhu68衣壳的脱酰胺的方法。该方法包括从含有修饰的AAVhu68vp密码子的核酸序列产生AAVhu68衣壳，该核酸序列独立地包含位于SEQ ID NO:8中的位置58、330、453和/或513处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处的修饰的甘氨酸密码子，使得修饰的密码子编码精氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，该方法包括从含有修饰的AAVhu68vp密码子的核酸序列产生AAVhu68衣壳，该核酸序列独立地包含位于SEQ ID NO:8中的位置57、329、452和/或512处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处的修饰的甘氨酸密码子，使得修饰的密码子编码精氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，每个修饰的密码子编码不同的氨基酸。在某些实施方案中，两个或更多个修饰的密码子编码相同的氨基酸。在某些实施方案中，如本文所述的突变体AAVhu68衣壳包含精氨酸-甘氨酸对中的突变，使得甘氨酸变为丙氨酸或丝氨酸。突变体AAVhu68衣壳可包含一个、两个或三个突变体，其中参考AAVhu68天然地含有四个NG对。在某些实施方案中，突变体AAVhu68衣壳包含NG对中的仅单个突变。在某些实施方案中，突变体AAVhu68衣壳包含在两个不同NG对中的突变。在某些实施方案中，突变体AAVhu68衣壳包含位于AAVhu68衣壳中的结构上分开的位置的两个不同的NG对中的突变。在某些实施方案中，突变不在VP1独特区域中。在某些实施方案中，突变之一在VP1独特区域中。任选地，突变体AAVhu68衣壳不含NG对中的修饰，但包含突变以最小化或消除位于NG对外的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺中的脱酰胺作用。
如本文所用，“编码的氨基酸序列”是指基于被翻译为氨基酸的参考核酸序列的已知DNA密码子的翻译而预测的氨基酸。下表举例说明了DNA密码子和20种常见氨基酸，示出了单字母代码(SLC)和三字母代码(3LC)。
已经描述了产生衣壳、其编码序列的方法，以及产生rAAV病毒载体的方法。参见，例如，Gao,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)和US2013/0045186A1。其他衣壳，例如WO 2003/042397、WO2005/033321、WO2006/110689、US7588772B2(其通过引用并入本文)中描述的那些可用于人受试者。在一个实施方案中，本发明提供了工程化分子，其包含在AAVhu68 vp1编码序列和AAVhu68 rep编码序列之间的间隔序列。
如上所述，AAVhu68序列和蛋白质用于产生rAAV。以下实例描述了具有AAVhu68或AAV9载体的rAAV载体的产生。然而，在另一些实施方案中，选择另一种AAV衣壳。组织特异性由衣壳类型决定。例如，具有AAVhu68的病毒载体在以下实例中示例为可用于转导鼻上皮细胞。本文描述了AAVhu68的序列。此外，已经描述了产生具有AAV9衣壳和来源于AAV9的嵌合衣壳的载体的方法。参见，例如，US7,906,111，其通过引用并入本文。可以选择转导鼻细胞或其他合适靶标(例如，肌肉或肺)的其他AAV血清型作为AAV病毒载体(DNA酶抗性病毒颗粒)衣壳的来源，包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8(参见，例如，美国公开专利申请号2007-0036760-A1；美国公开专利申请号2009-0197338-A1；和EP1310571)。还参见WO 2003/042397(AAV7和其他猿猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO 2005/033321(AAV9)和WO 2006/110689，或尚待发现的或基于其的重组AAV可以用作AAV衣壳的来源。这些文献还描述了可以选择用于产生AAV的其他AAV，并且通过引用并入。在一些实施方案中，用于病毒载体的AAV衣壳(cap)可以通过前述AAV cap或其编码核酸之一的诱变(即，通过插入、缺失或替代)产生。在一些实施方案中，AAV衣壳是嵌合的，其包含来自两种或三种或四种或更多种上述AAV衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，AAV衣壳是来自两种或三种不同AAV或重组AAV的Vp1、Vp2和Vp3单体的嵌合体。在一些实施方案中，rAAV组合物包含超过一种的上述cap。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳可能是有用的。例如，这样的衣壳可用于产生单克隆抗体和/或产生用于监测基因疗法患者中AAVhu68浓度水平的测定中的试剂。用于产生有用的抗AAVhu68抗体、标记这样的抗体或空衣壳的技术以及合适的测定形式是本领域技术人员已知的。
更典型地，本文提供的AAVhu68衣壳用于产生重组AAV载体，其中工程化核酸序列包装在AAVhu68衣壳中。这些重组AAV载体(称为“rAAVhu68”或“rAAVhu68载体”)及其用途将在本申请的其他部分中更详细地讨论。这些rAAVhu68载体用于产生提供良好产量和/或包装效率的重组AAV(rAAV)载体，以及提供用于转导许多不同细胞和组织类型的rAAV载体。这样的细胞和组织类型包括但不限于肺、心脏、肌肉、肝、胰腺、肾、脑、海马、运动皮质、小脑、鼻上皮细胞、心脏肌细胞或心肌细胞、肝细胞、肺内皮细胞、肌细胞、肺上皮细胞、胰岛细胞、腺泡细胞、肾细胞和/或运动神经元。
在某些实施方案中，与基于AAV9的载体相比，具有AAVhu68衣壳的载体使包装载体的产量提高至少15％。在AAVhu68和AAVrh10之间的比较中，已发现在脑室内施用后，AAVhu68在低剂量(例如约1x109)下提供比AAVrh10更好的转导效率。在AAVhu68和AAV9之间的进一步比较中，已发现在脑室内施用后，AAVhu68在脑的小脑、运动皮质和脑海马(例如约1x1011GC)中提供比AAV9更好的转导效率。
“重组AAV”或“rAAV”是含有两种元件的DNA酶抗性病毒颗粒：AAV衣壳和包装在AAV衣壳内的包含至少非AAV编码序列的载体基因组。在某些实施方案中，衣壳含有由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白构成的约60个蛋白质，其自组装形成衣壳。除非另有说明，否则“重组AAV”或“rAAV”可与短语“rAAV载体”互换使用。rAAV是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，因为其缺少任何功能性AAVrep基因或功能性AAVcap基因并且不能产生子代。在某些实施方案中，唯一的AAV序列是AAV反向末端重复序列(ITR)，其通常位于载体基因组的最5’和3’末端，以使位于ITR之间的基因和调节序列包装在AAV衣壳内。
通常，术语“核酸酶抗性”表示AAV衣壳组装在表达盒周围，其被设计用于将基因递送至宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在核酸酶孵育步骤期间免于降解(消化)，核酸酶孵育步骤被设计用于除去可能存在于生产过程中的污染核酸。
在某些实施方案中，用于制备rAAV的非病毒遗传元件被称为载体(例如，生产载体)。在某些实施方案中，这些载体是质粒，但也考虑使用其他合适的遗传元件。这样的生产质粒可编码在rAAV产生期间表达的序列，例如，对于产生rAAV所需的AAV衣壳或rep蛋白，其未包装入rAAV。或者，这样的生产质粒可以携带包装在rAAV中的载体基因组。
如本文所用，“载体基因组”是指包装在形成病毒颗粒的rAAV衣壳内的核酸序列。这样的核酸序列包含AAV反向末端重复序列(ITR)。在本文的该实例中，载体基因组至少以5’至3’包含AAV5’ITR、编码序列和AAV 3’ITR。可以选择来自AAV2(与衣壳的来源AAV不同)的ITR或者除了全长ITR之外的ITR。在某些实施方案中，ITR来自与在生产期间提供rep功能的AAV相同的AAV来源或反式互补AAV。此外，可以使用其他ITR。此外，载体基因组包含指导基因产物表达的调节序列。本文更详细地讨论了载体基因组的合适组分。
在某些实施方案中，术语“表达盒”是指包含hSMN序列和其调节序列(例如，启动子、增强子、聚腺苷酸)的核酸分子，该盒可以包装到病毒载体的衣壳(例如，病毒颗粒)中。通常，这种用于产生病毒载体的表达盒包含本文所述的hSMN序列，其两侧是病毒基因组的包装信号和其他表达控制序列，例如本文所述的那些。例如，对于AAV病毒载体，包装信号是5’反向末端重复(ITR)和3’ITR。在某些实施方案中，术语“转基因”可与“表达盒”互换使用。在另一些实施方案中，术语“转基因”仅指所选基因的编码序列，例如“hSMN1”。
如本文所用，术语“SMN”包括在递送本文提供的组合物或方法时恢复期望功能，减轻症状或提供其他期望生理学结果的任何SMN同种型。本文提供的实例使用最长的同种型，同种型D，其被认为是由未受SMN缺乏或缺陷影响的患者中基因产生的主要转录物。同种型D提供294个氨基酸的蛋白质[参见，例如，NCBI登录号NM_000334/NP_000335；ENSEMBL IDENST00000380707]，蛋白质序列在SEQ ID NO:2中再现，并且编码序列在SEQ ID NO:3中再现。然而，可以选择其他同种型。例如，同种型B在3’编码序列中具有替代的框内外显子，得到长度(262个氨基酸)比同种型D短但与该同种型具有相同的N-和C-末端的蛋白质。参见NCBI登录号NM_022874/NP_075012；ENSEMBL ID ENST00000503079。同种型B编码序列和蛋白质序列分别在SEQ ID NO:11和12中再现。同种型A缺乏倒数第二个外显子，这导致与同种型D相比替代的翻译终止密码子。因此，与同种型D相比，同种型A较短(282个氨基酸)并且具有不同的C-末端。参见，NCBI登录号NM_001297715/NP_001284644；ENSEMBL IDENSTL00000506163。同种型A编码序列和蛋白质序列分别在SEQ ID NO:13和14中再现。
在某些实施方案中，本文提供了工程化人(h)运动神经元生存(SMN)cDNA，其被设计为与天然hSMN序列(SEQ ID NO:3)相比使翻译最大化。内含子可以引入到编码序列的上游，以改善mRNA的5’加帽和稳定性。参见，例如，SEQ ID NO:15和25。这些组合物可用于如本文所述的治疗脊髓性肌萎缩的方法中。为了比较的目的，天然人SMN编码序列和工程化cDNA的比对示于图1B-1C中。
本文所述的hSMN cDNA序列可以体外或合成产生，或通过本领域熟知的技术通过任何其他合适的方法产生。例如，可以使用长DNA序列的基于PCR的精确合成(PAS)方法，如Xiong等人,PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences,NatureProtocols1,791-797(2006)所述。组合了双不对称PCR和重叠延伸PCR方法的方法由Young和Dong,Two-step total gene synthesis method,Nucleic Acids Res.2004；32(7):e59描述。还参见Gordeeva等人,J Microbiol Methods.Improved PCR-based gene synthesismethod and its application to the Citrobacter freundii phytase gene codonmodification.2010年5月；81(2):147-52.Epub 2010年3月10日；还参见以下关于寡核苷酸合成和基因合成的专利，Gene Seq.2012年4月；6(1):10-21；US 8008005；和US 7985565。这些文献中的每一篇都通过引用并入本文。此外，用于通过PCR产生DNA的试剂盒和方案可商购获得。这些包括使用聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶；(New EnglandBiolabs)；/>High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs)；和/>G2Polymerase(Promega)。DNA也可以由用本文所述的包含hOTC序列的质粒转染的细胞产生。试剂盒和方案是已知的并且可商购获得，包括但不限于QIAGEN质粒试剂盒；Pro Filter Plasmid Kits(Invitrogen)；和GenEluteTM Plasmid Kits(Sigma Aldrich)。可用于本文的其他技术包括消除对热循环的需要的序列特异性等温扩增方法。这些方法通常使用链置换DNA聚合酶(如Bst DNA Polymerase,Large Fragment(New England Biolabs))来分离双链DNA，而不是加热。还可以通过使用逆转录酶(RT)通过扩增从RNA分子产生DNA，逆转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶。RT聚合与原始RNA模板互补的DNA链(称为cDNA)。然后可以通过如上所述的PCR或等温方法进一步扩增该cDNA。定制DNA也可以从公司商业产生，包括但不限于GenScript；/> (LifeTechnologies)；和Integrated DNA Technologies。
本文还提供了包含工程化hSMN序列的病毒载体。在一个实施方案中，rAAVhu68.SMN是由外部组分和内部DNA基因组组成的病毒载体。外部载体组分是如本文定义的AAVhu68衣壳。包装在衣壳内的是由两侧为两个AAV反向末端重复(ITR)的人运动神经元生存(hSMN)转基因组成的单链DNA基因组。增强子、启动子、内含子、hSMN1编码序列和(聚腺苷酸)信号构成hSMN转基因。ITR是在载体生产过程中负责基因组复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。hSMN编码序列的表达由CB7启动子驱动，CB7启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子(C4)和鸡β肌动蛋白启动子之间的杂交体。CI的存在增强了来自该启动子的转录。包含rBG聚腺苷酸信号以介导人hSMN mRNA转录物的终止。在该实施方案中，“hSMN”是hSMN1。
在一个方面，提供了编码功能性SMN蛋白的编码序列。“功能性hSMN”是指编码SMN蛋白质的基因，所述蛋白质提供了天然运动神经元生存蛋白或者与病无关的天然变体或多晶型物的至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或大致相同、或大于100％的生物活性水平。此外，SMN1同源物-SMN2也编码SMN蛋白，但较不有效地处理功能性蛋白。基于SMN2的拷贝数，缺少功能性hSMN基因的受试者表现出不同程度的SMA。因此，对于一些受试者，可能期望SMN蛋白质提供天然SMN蛋白质的低于100％的生物活性。在某些实施方案中，术语“hSMN1”、“hSMN”和“功能性hSMN”可互换使用。
存在多种用于体外测量SMN表达和活性水平的测定法。参见例如上文引用的Tanguy等人,2015。本文描述的方法还可以与用于治疗SMA或其症状的任何其他疗法组合。在某些实施方案中，护理标准可包括诺西那生钠(nusinersen)，其是FDA和EMA[SPINRAZATM，Biogen]接受的SMN2前信使核糖核酸(mRNA)靶向反义寡核苷酸(ASO)。参见，例如，美国专利号6,166,197、US 6,210,892、US 7,101,993；US 7,838,657；US 8,110,560；US 8,361,977；US 8,980,853。这是鞘内施用的SMN2定向反义寡核苷酸。推荐剂量为12mg(每次施用5mL)。治疗以4个负荷剂量开始；前3个负荷剂量以14天间隔施用，第4个负荷剂量在第3个剂量后30天施用，维持剂量在其后每4个月一次施用。
在一个实施方案中，功能性SMN的氨基酸序列是SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其共享95％同一性的序列。在一个实施方案中，提供了修饰的hSMN编码序列。优选地，修饰的hSMN编码序列与全长天然hSMN编码序列(图1B-1C，SEQ ID NO:3)具有小于约80％的同一性，优选约75％的同一性或更低。在一个实施方案中，在AAV介导的递送(例如rAAV)之后，与天然hSMN相比，修饰的hSMN编码序列的特征在于改善的翻译速率。在一个实施方案中，修饰的hSMN编码序列与全长天然hSMN1编码序列共享小于约80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或更低的同一性。在一个实施方案中，修饰的hSMN编码序列是SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的序列。在另一些实施方案中，选择不同的SMN编码序列。
在另一些实施方案中，选择同种型D以外的SMN同种型的编码序列。另外或可替代地，本文提供的组合物或方案可以结合使用编码同种型DSMN蛋白的AAVhu68.SMN原液与编码不同SMN蛋白的载体原液的组合的治疗。该载体原液可具有AAVhu68衣壳或不同衣壳。
在核酸序列的情况下，术语“百分比(％)同一性”、“序列同一性”，“百分比序列同一性”或“百分比同一性”是指在用于对应对齐时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500-5000个核苷酸的片段是期望的。然而，可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。
可以容易地在蛋白质全长、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或相应核酸序列编码序列上确定氨基酸序列的同一性百分比。合适的氨基酸片段长度可以为至少约8个氨基酸，并且可以为至多约700个氨基酸。通常，当提及两个不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参照“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对物”是指多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列，与参考序列相比，其通常含有对缺失或额外碱基或氨基酸的校正。
可以通过制备序列的比对物并且通过使用本领域已知的或商业上可获得的多种算法和/或计算机程序[例如BLAST、ExPASy；ClustalO；FASTA；使用例如Needleman-Wunsch算法，Smith-Waterman算法]来确定同一性。使用多种公开或商业上可获得的多序列比对程序中的任何一种进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如“ClustalOmega”、“ClustalX”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任何程序都在默认设置下使用，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可以利用其他种算法或计算机程序，该算法或计算机程序至少提供由参考算法和程序提供的同一性水平或比对物。参见，例如，J.D.Thomson等人,Nucl.Acids.Res.,“A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。
多序列比对程序也可用于核酸序列。这些程序的实例包括“Clustal Omega”、“Clustal W”、“CAP Sequence Assembly”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，其可通过因特网上的Web服务器访问。这些程序的其他来源是本领域技术人员已知的。或者，也使用Vector NTI实用程序。本领域已知的许多算法可用于测量核苷酸序列同一性，包括上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用FastaTM(GCG Version 6.1中的程序)比较多核苷酸序列。FastaTM提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，可以使用GCG Version 6.1中提供的FastaTM以其默认参数(单词大小为6和评分矩阵的NOPAM因子)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比，其通过引用并入本文。
II.表达盒和载体
在一个实施方案中，将本文所述的hSMN基因工程化到可用于产生病毒载体和/或用于递送至宿主细胞的合适的遗传元件(载体)中，例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体等，其传递其上携带的hSMN1序列。所选择的载体可以通过任何合适的方法递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的颗粒(high velocity DNA-coatedpellet)、病毒感染和原生质体融合。用于制备这样的构建体的方法是核酸操作领域技术人员已知的，包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY。在一个方面，提供了包含hSMN核酸序列的表达盒。
因此，在一个方面，提供了腺相关病毒载体，其包含AAV衣壳和至少一个表达盒，其中所述至少一个表达盒包含编码SMN的核酸序列和指导SMN序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。AAV载体还包含AAVITR序列。在一个实施方案中，ITR来自与提供衣壳的AAV不同的AAV。在一个优选的实施方案中，来自AAV2的ITR序列或其缺失的版本(ΔITR)可以方便使用和加速监管批准。然而，也可以选择来自其他AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得到的载体可以称为假型化的(pseudotyped)。通常，AAV载体基因组包含AAV 5’ITR、hSMN编码序列和任何调节序列，以及AAV 3’ITR。然而，这些元件的其他配置可能是合适的。已经描述了缩短版本的5’ITR，称为ΔITR，其中D序列和末端分辨率位点(terminal resolution site，trs)缺失。在另一些实施方案中，使用全长AAV 5’和3’ITR。
在一个方面，提供了一种构建体，其为用于产生病毒载体的DNA分子(例如质粒)。表达盒通常包含启动子序列作为表达控制序列的一部分，例如位于所选择的5’ITR序列和hSMN编码序列之间。本文描述的说明性质粒和载体使用遍在鸡β-肌动蛋白启动子(CB)和CMV立即早期增强子(CMV IE)。或者，可以使用神经元特异性启动子[参见，例如，LockeryLab神经元特异性启动子数据库，访问chinook.uoregon.edu/promoters.html]。这样的神经元特异性启动子包括但不限于例如突触蛋白I(SYN)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II、微管蛋白αI、神经元特异性烯醇酶和血小板衍生生长因子β链启动子。参见Hioki等人,GeneTherapy,2007年6月,14(11):872-82，其通过引用并入本文。其他神经元特异性启动子包括67kDa谷氨酸脱羧酶(GAD67)、同源框Dlx5/6、谷氨酸受体1(GluR1)、前原激肽1(Tac1)启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和多巴胺能受体1(Drd1a)启动子。参见，例如，Delzor等人,Human Gene Therapy Methods.2012年8月,23(4):242-254。在另一个实施方案中，启动子是GUSb启动子www.jci.org/articles/view/41615#B30。
可以使用其他启动子，例如组成型启动子、调节型启动子[参见例如WO2011/126808和WO2013/04943]，或可以使用对生理信号有响应的启动子用于本文描述的载体中。启动子可选自不同来源，例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子(JC polymovirus promoter)、髓鞘碱性蛋白(MBP)或胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏相关启动子(LAP)、劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素浓缩激素(MCH)启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)和鸡β-肌动蛋白启动子。
除启动子外，表达盒和/或载体可包含一个或多个其他合适的转录起始、终止、增强子序列，有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化(聚腺苷酸)信号；使细胞质mRNA稳定的序列，例如WPRE；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。合适的聚腺苷酸序列的实例包括例如SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成聚腺苷酸。合适的增强子的实例是CMV增强子。其他合适的增强子包括适合CNS适应症的增强子。在一个实施方案中，表达盒包含一个或多个表达增强子。在一个实施方案中，表达盒包含两个或更多个表达增强子。这些增强子可以相同或可以彼此不同。例如，增强子可包括CMV立即早期增强子。该增强子可以以彼此相邻的两个拷贝存在。或者，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列分开。在另一个实施方案中，表达盒还含有内含子，例如鸡β-肌动蛋白内含子。其他合适的内含子包括本领域已知的内含子，例如WO2011/126808中描述的内含子。任选地，可以选择一种或多种序列以使mRNA稳定。这样的序列的一个实例是修饰的WPRE序列，其可以设计在聚腺苷酸序列的上游和编码序列的下游[参见，例如，MAZanta-Boussif,等人,Gene Therapy(2009)16:605-619。
这些控制序列与hSMN基因序列“可操作地连接”。如本文所用，术语“可操作地连接”是指表达控制序列与目的基因相邻以及表达控制序列反式或远距离起作用以控制目的基因的表达两种情况。
在一个实施方案中，提供了自身互补(self-complementary)的AAV。在此上下文中，缩写“sc”指的是自我互补的。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列携带的编码区被设计形成分子内双链DNA模板的构建体。在感染时，不是等待细胞介导的第二链的合成，scAAV的两个互补半部将结合形成准备立即复制和转录的一个双链DNA(dsDNA)单元。参见，例如，D M McCarty等人,“Self-complementary recombinant adeno-associatedvirus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNAsynthesis”,Gene Therapy,(2001年8月),第8卷,编号16,第1248-1254页。自身互补的AAV描述于例如美国专利号6,596,535、7,125,717和7,456,683中，每一个都通过引用整体并入本文。
产生和分离适于递送至受试者的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。参见，例如，美国公开专利申请No.2007/0036760(2007年2月15日)，美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321，WO 2006/110689；和US 7588772 B2]。在一个系统中，用编码两侧为ITR的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二个系统中，用编码两侧为ITR的转基因的构建体瞬时转染稳定供应rep和cap的包装细胞系。在这些系统的每一个中，响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染而产生AAV病毒体，需要将rAAV与污染病毒分离。最近，已开发出不需要辅助病毒感染以回收AAV的系统-所需的辅助功能(即腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，以及疱疹病毒聚合酶)也由系统反式提供。在这些较新的系统中，辅助功能可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供，或者可以工程化细胞以稳定地包含编码辅助功能的基因，其表达可以在转录或转录后水平控制。在另一个系统中，将两侧为ITR的转基因和rep/cap基因通过基于杆状病毒的载体感染引入昆虫细胞。关于这些生产系统的综述，一般参见例如Zhang等人,2009,"Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scalerecombinant adeno-associated virus production,"Human Gene Therapy 20:922-929，其各自的内容通过引用整体并入本文。制备和使用这些和其他AAV生产系统的方法也在以下美国专利中有所描述，每篇专利的内容通过引用整体并入本文：5,139,941、5,741,683、6,057,152、6,204,059、6,268,213、6,491,907、6,660,514、6,951,753、7,094,604、7,172,893、7,201,898、7,229,823和7,439,065。
任选地，本文所述的hSMN基因可以工程化到其他递送系统中，包括rAAV以外的病毒载体。这样的其他病毒载体可包括任何适用于基因疗法的病毒，包括但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒；博卡病毒。合适地，在产生这些其他载体之一的情况下，其作为复制缺陷型病毒载体产生。
在某些实施方案中，提供了工程化AAVhu68.SMN载体。在一个实施方案中，rAAVhu68SMN的载体基因组具有SEQ ID NO:15的序列。在另一个实施方案中，rAAVhu68SMN的载体基因组具有SEQ ID NO:25的序列。在某些实施方案中，术语“rAAVhu68.SMN1”和“rAAVhu68.SMN”可互换使用。
III.组合物和用途
本文还提供了药物组合物。本文描述的药物组合物被设计用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至有需要的受试者。
设计这些递送手段以避免直接全身递送含有本文所述AAV组合物的悬浮液。适当地，这可以具有与全身施用相比减少剂量、降低毒性和/或减少对AAV和/或转基因产物的不期望的免疫应答的益处。
或者，可以选择其他施用途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌肉内和其他亲本途径)。
任选地，免疫抑制共同疗法可用于有需要的受试者。用于这样的共同疗法的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂、大环内酯(例如雷帕霉素或rapalog)和细胞抑制剂，包括烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或对亲免蛋白有活性的剂。免疫抑制剂可包括氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素、IL-2受体-(CD25-)或CD3-定向抗体、抗-IL-2抗体、环孢素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、阿片样物质或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施方案中，免疫抑制疗法可以在基因疗法施用之前或之后0、1、2、3、4、5、6、7或更多天开始。这样的免疫抑制疗法可包括施用一种、两种或更多种药物(例如，糖皮质激素、强的松(prednelisone)、霉酚酸酯(micophenolate mofetil)(MMF)和/或西罗莫司(即雷帕霉素))。这样的免疫抑制药物可以相同剂量或调整剂量向有需要的受试者施用一次、两次或多次。这样的疗法可包括在同一天共同施用两种或更多种药物(例如，强的松、霉酚酸酯和/或西罗莫司(即雷帕霉素))。在基因疗法施用后，可以以相同剂量或调整剂量继续施用这些药物中的一种或多种。根据需要，这样的疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更久。在某些实施方案中，选择不含他克莫司的方案。
本文描述的rAAVhu68.hSMN载体可以在单一组合物或多种组合物中施用。任选地，可以递送两种或更多种不同的rAAV[参见例如WO2011/126808和WO2013/049493]。在另一个实施方案中，这样的多种病毒可包含不同的复制缺陷型病毒(例如AAV、腺病毒和/或慢病毒)。或者，递送可以通过非病毒构建体，例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA介导；与多种递送组合物和纳米颗粒偶联，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚-聚糖组合物和其他聚合物，基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物，以及例如本文描述的其他构建体。参见，例如，X.Su等人,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),pp774-787；网络公开:2011年3月21日；WO2013/182683、WO 2010/053572和WO 2012/170930，两者都通过引用并入本文。这样的非病毒hSMN递送构建体可以通过前述途径施用。病毒载体或非病毒DNA或RNA转移部分可以与生理学上可接受的载剂配制，用于基因转移和基因疗法应用。
在某些实施方案中，在储存和/或配制用于向受试者递送之前使rAAVhu68.SMA从生产相关的任何污染物中纯化。可以选择多种合适的纯化方法。描述了合适的纯化方法的实例，例如，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US2016/065970及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,071和2015年12月11日提交的62/226,357，名称为“Scalable Purification Method for AAV9”，其通过引用并入本文。对于AAV8的纯化方法，2016年12月9日提交的国际专利申请PCT/US2016/065976及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,098和2015年12月11日提交的62/266,341，和rh10，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/66013及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,055和题为“Scalable Purification Method for AAVrh10”的同样于2015年12月11日提交的62/266,347，以及对于AAV1，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US2016/065974及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请62/322,083和2015年12月11日提交的“Scalable Purification Method for AAV1”的62/26,351，其均通过引用并入本文中。
对于本文所述的rAAVhu68.SMN1载体，可以使用基因组拷贝(“GC”)的量化作为制剂中所含剂量的量度。可以使用本领域已知的任何方法来确定本发明的复制缺陷型病毒组合物的基因组拷贝(GC)数。用于进行AAV GC数滴定的一种方法如下：首先用DNA酶处理纯化的AAV载体样品，以除去来自生产过程的污染的宿主DNA。然后对DNA酶抗性颗粒进行热处理以从衣壳中释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区域(例如poly A信号)的引物/探针组通过实时PCR对释放的基因组进行量化。用于确定基因组拷贝的另一种合适方法是定量PCR(qPCR)，特别是优化的qPCR或数字液滴PCR[Lock Martin,等人,Human Gene TherapyMethods.April 2014,25(2):115-125.doi:10.1089/hgtb.2013.131,2013年12月13日编辑之前在线公布]。或者，ViroCyt3100可用于颗粒定量或流式细胞术。
rAAVhu68.SMN1组合物可以配制成剂量单位，以包含以下量的rAAV：约1.0x109GC至约9x1015GC(例如基于约约2.5kg至约70kg的体重)，包括该范围内的所有整数或分数量，并且对于人患者优选为1.0x1012GC至1.0x1014GC。在一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010或9x1010GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011或9x1011GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012或9x1012GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、7x1013、8x1013或9x1013GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014或9x1014GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015或9x1015GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在一个实施方案中，对于人施用，剂量可以为每剂量1x1010至约1x1015GC，包括该范围内的所有整数或分数量。
在某些实施方案中，剂量可以为约1x109GC/g脑质量至约1x1012GC/g脑质量。在某些实施方案中，剂量可以为约3x1010GC/g脑质量至约3x1011GC/g脑质量。在某些实施方案中，剂量可以为约5x1010GC/g脑质量至约1.85x1011GC/g脑质量。
在一个实施方案中，rAAVhu68.SMN1可以以至少约1x109GC至约1x1015，或约1x1011至5x1013GC的剂量递送。用于递送这些剂量和浓度的合适体积可由本领域技术人员确定。例如，可以选择约1μL至150mL的体积，对于成人选择更高的体积。通常，对于新生儿，合适的体积为约0.5mL至约10mL，对于较大的婴儿，可以选择约0.5mL至约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL至约20mL的体积。对于儿童，可以选择至多约30mL的体积。对于青少年和少年，可以选择至多约50mL的体积。在另一些实施方案中，患者可以接受鞘内施用，体积为约5mL至约15mL，或约7.5mL至约10mL。可以确定其他合适的体积和剂量。调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这样的剂量可根据使用重组载体的治疗应用而变化。
可以根据公开的方法将上述rAAVhu68.SMN1递送至宿主细胞。在某些实施方案中，对于对人患者施用，rAAV适合悬浮在含有盐水、表面活性剂和生理学相容的盐或盐混合物的水溶液中。合适地，将制剂调节至生理学上可接受的pH，例如pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由于脑脊髓液的pH为约7.28至约7.32，对于鞘内递送，可能需要在该范围内的pH；而对于静脉内递送，可能需要6.8至约7.2的pH。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其他pH用于其他递送途径。
合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可选自无毒的非离子表面活性剂。在一个实施方案中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如F68[BASF]，也称为泊洛沙姆188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其他表面活性剂和其他泊洛沙姆，即由两侧是两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的中央聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))疏水链构成的非离子三嵌段共聚物，SOLUTOL HS15(Macrogol-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧基辛基甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂包含泊洛沙姆。这些共聚物通常用字母“P”(对于泊洛沙姆)跟三个数字命名：前两个数字x100给出聚氧丙烯核心的近似分子量，最后一个数字x10给出聚氧乙烯含量百分比。在一个实施方案中，选择泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的高至约0.0005％至约0.001％的量存在。
在一个实例中，制剂可包含例如缓冲盐水溶液，其包含在水中的氯化钠、碳酸氢钠、右旋糖、硫酸镁(例如硫酸镁·7H2O)、氯化钾、氯化钙(例如氯化钙·2H2O)、磷酸二钠及其混合物中的一种或多种。适合地，对于鞘内递送，摩尔渗透压浓度在与脑脊髓液相容的范围内(例如，约275至约290)；例如，参见emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，可以使用市售稀释剂作为助悬剂，或与另一种助悬剂和其他任选的赋形剂组合使用。参见，例如，Elliotts溶液[Lukare Medical]。每10mLElliotts B溶液包含：
氯化钠,USP 73mg
碳酸氢钠,USP 19mg
右旋糖,USP 8mg
硫酸镁·7H2O,USP 3mg
氯化钾,USP 3mg
氯化钙·2H2O,USP 2mg
磷酸二钠·7H2O,USP 2mg
注射用水,USP 补充至10mL
电解质浓度:
成分的分子式和分子量为：
成分 分子式 分子量
氯化钠 NaCl 58.44
碳酸氢钠 NaHCO3 84.01
右旋糖 C6H12O6 180.16
硫酸镁·7H2O Mg2SO4·7H2O 246.48
氯化钾 KCl 74.55
氯化钙·2H2O CaCl2·2H2O 147.01
磷酸二钠·7H2O Na2HPO4·7H2O 268.07
Elliotts B溶液的pH值为6至7.5，摩尔渗透压浓度为每升288mOsmol(计算值)。在某些实施方案中，含有rAAVhu68.SMN1基因的组合物在6.8至8、或7.2至7.8、或7.5至8的pH范围内递送。对于鞘内递送，可能需要高于7.5的pH，例如7.5至8，或7.8。
在某些实施方案中，制剂可含有不含碳酸氢钠的缓冲盐水溶液。这样的制剂可包含缓冲盐水溶液，其包含在水中的磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其混合物，例如Harvard缓冲液。该水溶液可进一步包含P188，可从BASF商购获得的泊洛沙姆，该产品以前以商品名/>F68出售。水溶液的pH可以为7.2。
在另一个实施方案中，制剂可含有缓冲盐水溶液，其包含1mM磷酸钠(Na3PO4)、150mM氯化钠(NaCl)、3mM氯化钾(KCl)、1.4mM氯化钙(CaCl2)、0.8mM氯化镁(MgCl2)和0.001％188。参见例如harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。在某些实施方案中，Harvard缓冲液是优选的，因为用Harvard缓冲液观察到更好的pH稳定性。下表提供了Harvard缓冲液和ElliotB缓冲液的比较。
脑脊液(CSF)组成
在另一些实施方案中，制剂可包含一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可包括，例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
在另一个实施方案中，组合物包含载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。考虑到转移病毒针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载剂。例如，一种合适的载剂包括盐水，其可以用各种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其他示例性载剂包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲剂/载剂应包含防止rAAV粘附于输注管但不干扰体内rAAV结合活性的组分。
任选地，除了rAAV和载剂之外，本发明的组合物可以包含其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
根据本发明的组合物可包含如上文所定义的药学上可接受的载剂。合适地，本文所述的组合物包含有效量的一种或多种AAV，其悬浮在药学上合适的载剂中和/或与合适的赋形剂混合，其设计用于通过注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或用于通过其他装置或路线递送。在一个实例中，组合物被配制用于鞘内递送。在一个实施方案中，鞘内递送包括注入椎管，例如蛛网膜下腔。
本文所述的病毒载体可用于制备药物，所述药物用于将hSMN递送至有需要的受试者(例如，人患者)，向受试者提供功能性SMN，和/或用于治疗脊髓性肌萎缩。治疗过程可任选地包括重复施用相同的病毒载体(例如AAVhu68载体)或不同的病毒载体(例如AAVhu68和AAVrh10)。可以选择使用本文描述的病毒载体和非病毒递送系统的其他组合。
如本文所用，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注入椎管内，更特别地注入蛛网膜下腔的药物施用途径，以使其到达脑脊液(CSF)。鞘内递送可包括腰椎穿刺、室内(包括脑室内(ICV))、枕下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，注射可以进入小脑延髓池。
如本文所用，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入小脑延髓池cerebellomedularis的脑脊液中的施用途径，更具体地通过枕下穿刺(suboccipitalpuncture)或通过直接注射到小脑延髓池中或通过永久定位管。
在一个实施方案中，可以使用本文描述的装置进行递送。
IV.用于将药物组合物递送到脑脊髓液中的装置和方法
在一个方面，本文提供的载体可以通过本节中提供并在实施方案和图7中进一步描述的方法和/或装置进行鞘内施用。或者，可以选择其他装置和方法。该方法包括以下步骤：将脊柱针推进患者的小脑延髓池中，将一段柔性管连接到脊柱针的近端毂并且将阀的输出口连接到柔性管的近端，在所述推进和连接步骤之后并且在允许管被患者的脑脊髓液自填充(self-primed)之后，将含有一定量等渗溶液的第一个容器连接到阀的冲洗入口，然后将含有一定量的药物组合物的第二容器连接到阀的载体入口。在将第一和第二容器连接到阀之后，打开阀的载体入口和出口之间流体流动路径，并且将药物组合物通过脊椎针注射到患者体内，并且在注射药物组合物之后，打开通过阀的冲洗入口和出口的流体流动路径，并将等渗溶液注入脊柱针以将药物组合物冲洗到患者体内。
在另一方面，提供了用于脑池内递送药物组合物的装置。该装置包括含有一定量药物组合物的第一容器，含有等渗溶液的第二容器，以及脊柱针，药物组合物可通过该脊柱针从该装置直接排出到患者的小脑延髓池内的脑脊髓液中。该装置还包括阀，该阀具有与第一容器互连的第一入口，与第二容器互连的第二入口，与脊椎针互连的出口，以及用于控制药物组合物和等渗溶液通过脊柱针的流动的鲁尔锁(luer lock)。
如本文所用，术语计算机断层摄影术(CT)是指射线照相术，其中通过计算机从沿轴线制作的一系列平面横截面图像构建身体结构的三维图像。
如图7所示的设备或医疗装置10包括：通过阀16互连的一个或多个容器12和14。容器12和14分别提供药物组合物、药物、载体等物质的新鲜来源和等渗溶液(例如生理盐水)的新鲜来源。容器12和14可以是能够将流体注入患者体内的任何形式的医疗装置。
举例来说，每个容器12和14可以以注射器、套管等形式提供。例如，在所示的实施方案中，容器12作为含有一定量药物组合物的单独注射器提供，并在本文中称为“载体注射器”。仅出于举例的目的，容器12可含有约10cc的药物组合物等。
同样地，容器14可以以含有一定量盐水溶液的单独注射器、套管等形式提供，并且可以称为“冲洗注射器”。仅出于示例的目的，容器14可以包含约10cc的盐水溶液。
作为替代方案，容器12和14可以以注射器以外的形式提供，并且可以集成到单个装置中，例如具有一对单独的腔室的集成医疗注射装置，一个腔室用于药物组合物，一个腔室用于盐水溶液。而且，可根据需要提供腔室或容器的尺寸以容纳期望量的流体。
在所示实施方案中，阀16设置为具有旋转公鲁尔锁18的四通旋塞阀(stopcock)。阀16将容器12和14(即，在所示实施方案中的载体注射器和冲洗注射器)互连，并且旋转公鲁尔锁能够使得通过阀16的路径向容器12和14中的每一个关闭或打开。这样，通过阀16的路径可以向载体注射器和冲洗注射器两者关闭，或者可以向载体注射器和冲洗注射器中选择的一个打开。作为四通旋塞阀的替代，阀可以是三通旋塞阀或流体控制装置。
在所示的实施方案中，阀16连接到一段延伸管20或类似的流体导管的一端。可以基于期望的长度或内部容积来选择管道20。仅举例来说，管的长度可为约6至7英寸。
在所示实施方案中，管12的相对端22连接到T型连接器延伸装置24，后者又连接到脊椎针26。举例来说，针26可以是五英寸22或25规格脊柱针。另外，任选地，脊柱针26可以连接到引导针28，例如三英寸半18规格引导针。
在使用中，脊柱针26和/或任选的引导针28可以朝向小脑延髓池推进到患者体内。在针推进之后，可以获得计算机断层扫描(CT)图像，其允许针26和/或28和相关软组织(例如，椎旁肌、骨、脑干和脊髓)的可视化。通过观察针毂中的脑脊液(CSF)和观察小脑池内的针尖可以确认正确的针放置。然后，可以将相对短的延伸管20连接到插入的脊柱针26，然后可以将四通旋塞阀16连接到管20的相对端。
允许上述组件被患者的CSF“自填充”。然后，将预填充的生理盐水冲洗注射器14连接到四通旋塞阀16的冲洗入口，然后将含有药物组合物的载体注射器12连接到四通旋塞阀16的载体入口。然后，旋塞阀16的输出口向载体注射器12打开，并且载体注射器的内容物可以通过阀16和组装好的装置缓慢注入患者体内一段时间。仅出于示例的目的，该时间段可以是约1-2分钟和/或任何其他期望的时间。
在注射载体注射器12的内容物之后，将旋塞阀16上的旋转锁18转到第二位置，使得可以使用连接的预填充冲洗注射器14用期望量的生理盐水冲洗旋塞阀16和针组件。仅举例来说，可以使用1至2cc的生理盐水；尽管可以根据需要使用更多或更少的量。生理盐水确保所有或大部分药物组合物被迫通过组装的装置注射到患者体内，并且使得很少或没有药物组合物保留在组装的装置中。
在用盐水冲洗组装的装置后，将组装的装置整体(包括针、延伸管、旋塞阀和注射器)从受试者中慢慢取出并放在手术托盘上，用于丢弃到生物危害废物容器或硬质容器(用于针)中。
可由主要研究者进行最终可能导致脑池内(IC)程序的筛选过程。主要研究者可以描述过程、程序、施用程序本身以及所有潜在的安全风险，以便使受试者(或指定的护理人员)充分知情。获得或执行病史、伴随药物、体检、生命体征、心电图(ECG)和实验室测试结果，并提供给神经放射学家、神经外科医生和麻醉师，用于IC程序的受试者资格的筛选评估。
为了有足够的时间来审查资格，可以在首次筛选访问和直到研究访问之前的一周之间的任何时间执行以下程序。例如，在“第0天”，可以获得利用和不利用钆的头/颈部磁共振成像(MRI)(即，eGFR>30mL/min/1.73m2)。除了头部/颈部MRI之外，研究者还可以通过屈曲/伸展研究确定是否需要进一步评估颈部。MRI发方案可以包T1、T2、DTI、FLAIR和CINE方案图像。
此外，头/颈部MRA/MRV可根据机构方案获得(即，具有内部/经硬膜手术的受试者可被排除或可能需要进一步测试(例如，放射性核苷酸脑池造影))，以允许充分评估CSF流动和鉴定CSF空间之间可能的堵塞或缺乏联通。
神经放射学家、神经外科医生和麻醉师最终根据所有可用信息(扫描、病史、体检、实验室等)讨论并确定每个受试者是否符合IC程序的资格。也可以从“第-28天”到“第1天”获得手术前评估，该评估提供对MPS受试者的气道、颈部(缩短/加厚)和头部活动范围(颈部屈曲程度)、记住特殊生理需求的详细评估。
在IC程序之前，将确认CT套间(CT Suite)存在以下设备和药物：成人腰椎穿刺(LP)试剂盒(按机构提供)；BD(Becton Dickinson)22或25规格x3-7”脊柱针(Quincke斜面)；同轴引导针，由介入医生决定使用(用于引入脊柱针)；带旋转(Spin)公鲁尔锁的4通小孔旋塞阀；带母鲁尔锁适配器的T型连接器延伸装置(管)，长度为约6.7英寸；Omnipaque180(碘海醇)，用于鞘内施用；碘化造影剂，用于静脉内(IV)施用；注射用1％利多卡因溶液(如果成人LP试剂盒中未提供的话)；预填充的10cc生理盐水(无菌)冲洗注射器；不透射线标记物；手术准备设备/剃须刀；枕头/支撑物，以允许插管受试者的正确定位；气管插管设备、全身麻醉机和机械呼吸机；术中神经生理学监测(IONM)设备(和所需人员)；和含有载体的10cc注射器；根据单独的药剂手册准备并运送到CT/手术室(OR)套间。
确认手术的知情同意书并且记录在医疗记录和/或研究文件中。根据机构要求，获得放射学和麻醉学工作人员对该程序的单独同意。根据机构指南(例如，两个IV访问站点)，受试者可以在适当的医院监护病房内进行静脉通路。静脉输液由麻醉师自行决定。根据麻醉师的判断和机构指南，可以在适当的患者监护病房、保持区域或手术/CT程序套件中诱导受试者并进行气管内插管和全身麻醉。
进行腰椎穿刺，首先去除5cc脑脊液(CSF)，然后鞘内注射造影剂(Omnipaque 180)以帮助显示小脑延髓池。可以执行适当的受试者定位操纵以促进造影剂扩散到小脑延髓池中。
将术中神经生理学监测(Intraoperative neurophysiological monitoring，IONM)设备连接于受试者。将受试者以俯卧位或侧卧位置于CT扫描仪台上。必须存在足够的工作人员以确保运输和定位过程中受试者的安全。如果认为合适，受试者可以以这样的方式定位：提供颈部屈曲至在术前评估期间确定为安全的程度，并且在定位后记录正常的神经生理学监测信号。
可以确认以下工作人员在现场存在并指定：执行该程序的介入医生/神经外科医生；麻醉师和呼吸技师；护士和医师助理；CT(或OR)技术人员；神经生理学技师；和现场协调员。可根据联合委员会/医院协议完成“暂停(time-out)”，以核实正确的受试者、程序、部位、定位以及房间内存在所有必要设备。然后，主要现场调查员可以与工作人员确认他/她可以继续准备该受试者。
根据需要将受试者颅底下皮肤剃毛。如果介入医生认为有必要，则进行CT侦察图像，然后进行具有IV造影的术前计划的CT，以定位目标位置和对脉管系统成像。在确定了目标部位(小脑延髓池)和计划的针轨迹之后，根据机构指南使用无菌技术对皮肤进行准备和覆盖。根据介入医生的指示，将不透射线的标记物放置在目标皮肤位置上。通过用1％利多卡因浸润将标记物下的皮肤麻醉。然后将22G或25G脊柱针推进到小脑延髓池，可选择使用同轴引导针。
在针推进之后，使用机构设备使用可行的最薄CT切片厚度获得CT图像(理想地≤2.5mm)。使用允许针和相关软组织(例如，椎旁肌、骨、脑干和脊髓)的充分可视化的可能的最低辐射剂量，获得连续CT图像。通过观察针毂中的CSF和小脑池内针尖的可视化来确认正确的针放置。
介入医生确认载体注射器位于无菌区域附近，但在无菌区域外。在操作或施用载体注射器中的药物组合物之前，由无菌区域内辅助程序的工作人员佩戴手套、面罩和眼睛保护装置。
将延伸管连接到插入的脊椎针上，然后将其连接到4通旋塞阀。一旦该装置被受试者的CSF“自填充”，将10cc预填充的生理盐水冲洗注射器连接到4通旋塞阀的冲洗入口。然后将载体注射器提供给介入医生并连接到4通旋塞阀上的载体入口。
通过将旋塞阀的旋转锁置于第一位置，将旋塞阀的出口向载体注射器打开后，将注射器的内容物缓慢注入(约1-2分钟)，注意在注射期间不要在注射器柱塞上施加过大的力。在注射了载体注射器的内容物之后，将旋塞阀的旋转锁转到第二位置，使得可以使用附接的预填充冲洗注射器用1-2cc生理盐水冲洗旋塞阀和针组件。
就绪后，干预者然后通知工作人员从受试者中移除该装置。在单次运动中，将针、延伸管、旋塞阀和注射器从受试者中缓慢移除并放置在手术托盘上以丢弃到生物危害废物容器或硬容器(针)中。
检查针插入部位的出血或CSF渗漏迹象，并按研究者的指示进行处理。根据指示，使用纱布、手术胶带和/或Tegaderm敷料包扎部位。然后将受试者从CT扫描仪中移出并放置在担架上。有足够的工作人员以确保运输和定位过程中受试者的安全。
麻醉停止并且按照麻醉后护理的机构指南对受试者进行护理。从受试者中移除神经生理学监测器。在恢复期间，受试者所在的担架头部应稍微抬起(～30度)。根据机构指南将受试者运送到合适的麻醉后监护病房。在受试者已经充分恢复意识并且状况稳定后，允许其进入适当的楼层/病房进行方案规定的评估。将按照方案进行神经学评估，主要研究者与医院和研究人员合作监督受试者的护理。
在一个实施方案中，用于递送本文提供的组合物的方法包括以下步骤：将脊柱针推进患者的小脑延髓池中；将一段柔性管连接到脊柱针的近端毂并且将阀的输出口连接到柔性管的近端；在所述推进和连接步骤之后并且在允许管被患者的脑脊髓液自填充之后，将含有一定量的等渗溶液的第一容器连接到阀的冲洗入口，然后将含有一定量的药物组合物的第二容器连接到阀的载体入口；在将所述第一和第二容器连接到阀之后，打开阀的载体入口和出口之间流体流动路径，并将药物组合物通过脊柱针注入患者体内；在注射药物组合物之后，打开通过阀的冲洗入口和出口的流体流动路径，并将等渗溶液注入脊柱针以将药物组合物冲洗到患者体内。在某些实施方案中，该方法还包括在将管和阀连接到脊柱针的毂之前，确认脊柱针的远端尖端在小脑池内的适当放置。在某些实施方案中，确认步骤包括利用计算机断层摄影(CT)成像使小脑延髓池内的脊柱针的远端尖端可视化。在某些实施方案中，确认步骤包括观察患者脊柱针毂中脑脊髓液的存在。
在上述方法中，阀可以是具有旋转鲁尔锁的旋塞阀，旋转鲁尔锁适于旋转到第一位置，允许从载体入口流动到出口同时阻止通过冲洗入口的流动，以及旋转到第二位置，允许从冲洗入口流到出口同时阻止通过载体入口的流动，并且其中当将所述药物组合物注射到患者体内时旋转鲁尔锁定位于所述第一位置并且当通过等渗溶液将所述药物组合物冲洗到所述患者体内时定位在所述第二位置。在某些实施方案中，在将等渗溶液注射到脊柱针中以将药物组合物冲洗到患者体内之后，将脊柱针从患者体内取出，其中管、阀以及第一和第二容器连接至其作为组件。在某些实施方案中，阀是具有旋转公鲁尔锁的四通旋塞阀。在某些实施方案中，第一和第二容器是单独的注射器。在某些实施方案中，T型连接器位于脊柱针的毂处并且将管连接到脊柱针。任选地，脊柱针包括位于脊柱针远端的引导针。脊柱针可以是5英寸22或24规格脊柱针。在某些实施方案中，引导针是3.5英寸18规格引导针。
在某些方面，该方法使用至少由以下构成的装置：用于容纳一定量的药物组合物的第一容器；含有等渗溶液的第二容器；脊柱针，药物组合物可通过该脊柱针直接从装置中排出到患者的小脑延髓池内的脑脊髓液中；以及阀，其具有与第一容器互连的第一入口，与第二容器互连的第二入口，与脊椎针互连的出口，和用于控制药物组合物和等渗溶液通过脊柱针的流动的鲁尔锁。在某些实施方案中，阀是具有旋转鲁尔锁的旋塞阀，旋转鲁尔锁适于旋转到第一位置，允许从第一入口流到出口同时阻止通过第二入口的流动，以及旋转到第二位置，允许从第二入口流到出口同时阻止通过第一入口的流动。任选地，阀是具有旋转公鲁尔锁的四通旋塞阀。在某些实施方案中，第一和第二容器是单独的注射器。在某些实施方案中，脊柱针通过一段柔性管互连到阀。T型连接器可以将管连接到脊柱针。在某些实施方案中，脊柱针是5英寸22或24规格脊柱针。在某些实施方案中，该装置还包括连接到脊柱针的远端的引导针。任选地，引导针是3.5英寸18规格引导针。
该方法和该装置可各自任选地用于鞘内递送本文提供的组合物。或者，其他方法和装置可用于这种鞘内递送。
在一个实施方案中，将本文提供的AAVhu68.SMA的单剂量施用于具有遗传确认的5q SMA和/或3型SMA的临床病史的成年人(至少18岁(≥18))。在另一些实施方案中，患者可以更年轻(例如，12岁至18岁；6岁至12岁；3岁至6岁；18个月至3岁；6个月至18个月；新生儿)。患者可能是不能走动(non-ambulatory)或能走动(ambulatory)的患者。给药可以通过ICM(脑池内注射)注射的载体的单剂量进行。在一个实施方案中，剂量范围为约3x1013GC至高剂量的1x1014GC。然而，本文提供了其他合适的范围。效力评估可包括以下一项或多项：运动评估，例如6分钟行走测试(six-minute walt test，6MWT)、10米行走时间、RULM评分、4阶梯攀爬(4 stair climb)、9孔钉测试(9 hole peg test)；肺功能检查，如用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、最大呼气压力(maximum expiratory pressure，MEP)和最大吸气压力(maximum inspiratory pressure，MIP)；呼吸功能测量、PedsQL(疲劳量表)、SMA-FRS(功能评定量表)、电生理学(如神经传导测试)、CMAP(例如尺侧和腓侧CMAP振幅)、感觉测试、SMN蛋白浓度和其他探索性生物标记物将在CSF中评估。
在一个实施方案中，使用含有适当浓度的载体的注射器。在载体施用之前，进行腰椎穿刺以移除预定体积的CSF，然后鞘内注射碘化造影剂(IC)以帮助小脑延髓池的相关解剖结构的可视化。可以在针插入之前或期间施用静脉内(IV)造影剂作为鞘内造影剂的替代。使用IV或IC造影剂的决定由介入医生决定。将患者麻醉、插管并定位在手术台上。将术中神经生理学监测(IONM)设备附接于参与者。使用无菌技术准备并覆盖注射部位。在荧光透视引导下，将脊柱针(22-25G)推进到小脑延髓池中。较大的引导针用于辅助针放置。在确认针放置后，将延伸装置连接到脊柱针并允许患者CSF填充。根据介入医生的判断，可以将含有造影材料的注射器连接到延伸装置，并且注射少量以确认在小脑延髓池中针的放置。在通过CT引导+/-造影剂注射确认针放置之后，将含有载体(例如5.6mL)的注射器连接到延伸装置。经过1-2分钟缓慢注射注射器内容物，递送体积为约5mL。从患者中缓慢取出针。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类动物，例如猴、黑猩猩、狒狒或大猩猩。在一个实施方案中，受试者是患有SMA的人患者。
国际SMA联盟分类根据发病年龄和运动发展里程碑定义了SMA表型的多个严重性程度。SMA0名称用于反映产前发作和严重关节挛缩、面部双瘫和呼吸衰竭。I型SMA(韦德尼希-霍夫曼病I病)是最严重的产后形式，其在出生后6个月内发病。患者无法坐起并具有严重的呼吸功能病症。II型SMA是在最初2年内发病的中间形式；儿童可以坐起但是不能行走。临床过程是多变的。III型(也称为库格尔贝格-韦兰德病)在2岁后开始并且通常具有慢性进展。儿童至少在婴儿期可以独立站立和行走。成人形式(IV型)是最轻微，30岁以后发病；报告的病例很少，并且其患病率并不准确知道。
在某些情况下，在怀孕约30至36周的胎儿中检测到SMA。在这种情况下，可能期望在分娩后尽快治疗新生儿。还可能期望在子宫内治疗胎儿。因此，提供了一种拯救和/或治疗患有SMA的新生儿受试者的方法，包括将hSNM1基因递送至新生受试者(例如人患者)的神经元细胞的步骤。提供了一种拯救和/或治疗具有SMA的胎儿的方法，包括将hSMN基因递送至子宫内胎儿的神经元细胞的步骤。在一个实施方案中，通过鞘内注射在本文所述的组合物中递送基因。该方法可利用编码功能性hSMN蛋白质的任何核酸序列，无论是如本文所述的密码子优化的hSMN还是天然hSMN，或者与“野生型”蛋白质相比具有增强的活性的hSMN等位基因，或其组合。在一个实施方案中，子宫内治疗定义为在检测到胎儿中的SMA后施用如本文所述的hSMN构建体。参见，例如，David等人,Recombinant adeno-associated virus-mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgene expression in thesheep,Hum Gene Ther.2011 Apr；22(4):419-26.doi:10.1089/hum.2010.007.Epub 2011Feb 2，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，新生儿治疗定义为在分娩的8小时、前12小时、前24小时或前48小时内施用如本文所述的hSMN构建体。在另一个实施方案中，特别是对于灵长类动物(人或非人)，新生儿递送在约12小时至约1周、2周、3周或约1个月的时期内，或在约24小时至约48小时之后。在另一个实施方案中，对于迟发性SMA，在症状发作后递送组合物。在一个实施方案中，患者的治疗(例如，第一次注射)在生命的第一年之前开始。在某些实施方案中，例如，对于婴儿，在例如1岁之后重新施用构建体。任选地，允许多于一次的重新施用。这种重新施用可以使用相同类型的载体、不同的病毒载体、或通过本文所述的非病毒递送。在另一个实施方案中，治疗在第一年后，或在第一个2至3岁之后，5岁之后，11岁之后或更大年龄时开始。
根据本发明，如本文所述递送“治疗有效量”的AAV.hSMN以实现期望的结果，即治疗SMA或其一种或多种症状。其他期望的结果包括减少肌肉无力，增加肌肉力量和张力，预防或减少脊柱侧凸，或维持或增加呼吸系统健康，或减少震颤或抽搐。其他期望的终点可以由医生确定。
在某些实施方案中，可以通过一种或多种以下参数评估含有本文提供的AAV.hSMN的组合物的治疗效力。这样的评分可以在52周，或者更长或更短的间隔，例如，8周、12周、36周、48周或其间的时间。将给药后预定时间的RULM评分与基线评分进行比较。可以通过能走动受试者中的6MWT测试或10米行走时间来测量运动功能。可以通过9孔钉测试(能走动和不能走动)和4阶梯攀爬测试(仅限能走动)来测量运动功能。可通过用力肺活量(FVC)、最大呼气压(MEP)、最大吸气压(MIP)来测量肺功能。可以评估尺侧和腓侧CMAP振幅与基线相比的变化。可以评估PedQLVersion 3.0多维疲劳量表，成人报告模块。可以评估SMA-FRS(功能评定量表)。可以测量CSF、血清和尿液中的DNA和其他基于AAV的药物组分中载体的药代动力学。
如本文所用，6MWT是6MWT中能走动受试者所覆盖的距离的量度。6MWT在位于室内的长的低流量直走廊中进行。30米的距离将在两端用橙色锥体标记。起步线用颜色鲜艳的胶带标记。
RULM：改进的上肢模块(revised upper limb module)由通过受试者选择的一个上肢执行的20个运动任务组成。评估员将每项任务的表现评定为0-2。
9孔钉测试：9-HPT是上肢功能的简便、标准化、定量测试。优势手(dominant hand)和非优势手(non-dominant hand)均测试两次。受试者坐在桌子上，桌子具有小的浅容器，其装有九个钉子和包含九个空孔的木或塑料块。在启动秒表时的开始命令下，受试者尽快一次一个的拾取九个钉子，将它们放入九个孔中，并且一旦它们进入孔中，则尽快一次一个将它们移除，将它们重新放置到浅容器中。记录完成任务的总时间。用优势手进行两次连续试验，然后立即用非优势手进行两次连续试验。9-HPT的评分是四次试验的平均值。对每只手的两次试验进行平均，转换为每只手的平均时间的倒数，然后对两个倒数取平均值。
10米行走时间：10米行走时间是行走10米所需时间的量度。测试将在位于室内的长的低流量直走廊进行。10米的距离将在两端用橙色锥体标记。起步线用颜色鲜艳的胶带标记。
4阶梯攀爬：4阶梯攀爬测试评估受试者上升和下降4个阶梯所需的时间。该任务将由经过培训的评估员执行，评估员将确保受试者能够安全地完成任务。阶梯必须有16-20厘米的高度和扶手。指示受试者以安全的方式尽快上升和下降。记录完成任务所需的时间以及使用扶手的需要。
进行电生理学研究以评估运动单元的功能。CMAP：除非有令人信服的理由避免研究该肢体(例如，病前叠加的神经损伤)，否则尺神经的运动神经传导研究优先在右臂上进行。这涉及向神经提供电流并记录肌肉中的运动反应。这种反应被称为复合肌肉动作电位(compound muscle action potential)。可以测量CMAP的高度和面积(幅度和AUC)。
功能和疲劳评定量表：
PedsQL疲劳量表，成人报告：PedsQL多维疲劳量表(PedsQL MultidimensionalFatigue Scale)是一个18项问卷，其评估一般疲劳(6项)、睡眠和休息(6项)和认知疲劳(6项)。
SMA-FRS：SMA-FRS是一种易于执行的序数评定量表(ordinal rating scale)，其基于日常生活活动的10个方面。每个子集由受试者或护理人员从0(完全依赖)到5(完全独立)评分，最高得分为50。
在一个实施方案中，如下对于患者按以下顺序执行评估顺序：PedsQL(疲劳量表)，SMA-FRS(功能评定量表)，6MWT，15分钟休息(最少)，RULM，9孔钉测试，10米行走，15分钟休息(最少)，4阶梯攀爬，PFT*以及尺侧和腓侧CMAP*。*可以按任何顺序执行。将省略患者无法安全执行的测试。
在治疗之前，可以评估SMA患者对用于递送hSMN-1基因的rAAV载体的衣壳的中和抗体(Nab)。这样的Nab可能干扰转导效率并降低治疗效力。具有基线血清Nab滴度≤1:5至≤1:20、或≤1:2.5至≤1:10的SMA患者是用rAAV.hSMN1基因疗法方案治疗的良好候选者。治疗血清Nab滴度>1:5的SMA患者可能需要联合疗法，例如在rAAV.hSMN载体递送的治疗之前和/或期间与免疫抑制剂短暂共同治疗。任选地，免疫抑制共同疗法可以用作预防措施，而无需事先评估对AAV载体衣壳和/或制剂的其他组分的中和抗体。在某些实施方案中，可能期望提前的免疫抑制治疗以防止对hSMN转基因产物的潜在不良免疫反应，尤其是在几乎没有SMN活性水平的患者中，其中转基因产物可能被视为“外来的”。
用于这样的共同疗法的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂、大环内酯(例如雷帕霉素或rapalog)和细胞抑制剂，包括烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或对亲免蛋白有活性的剂。免疫抑制剂可包括氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素、IL-2受体-(CD25-)或CD3-定向抗体、抗-IL-2抗体、环孢素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、阿片样物质或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施方案中，可以在基因疗法施用之前开始免疫抑制疗法。这样的疗法可以包括在同一天共同施用两种或更多种药物(例如，强的松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即雷帕霉素))。在基因疗法施用之后，可以以相同剂量或调整剂量继续施用这些药物中的一种或多种。根据需要，这样的疗法可以持续约1周、约15天、约30天、约45天、60天或更久。在某些实施方案中，接受本文所述的rAAVhu68.SMA基因疗法的患者已经接受过先前的诺西那生钠治疗。在另一些实施方案中，患者接受诺西那生钠的持续治疗，并在基因疗法后监测对这种诺西那生钠治疗的需要的减少或消除。接受rAAVhu68.SMA的患者可接受其他疗法，包括但不限于吡啶斯的明(pyridostigmine)[UMC Ultrecht]、RO7034067[Hoffman-LaRoche]、塞来昔布、CK-2127107[Astellas Pharma]。在某些实施方案中，通过这样的共同疗法的频率和/或剂量的降低来测量rAAVhu68.SMA的效力。在某些实施方案中，由于AAVhu68-SMN1疗法虽然耐用但可能不会导致所选患者期望的高校正，因此可能需要在AAVhu68-SMN1治疗后早至6个月转换为诺西那生钠(SpinrazaTM)疗法，向患者施用诺西那生钠(SpinrazaTM)可被认为是两种剂的共同施用。还参见Wang等人,Consensus Statement for Standard of Care in SpinalMuscular Atropy，其提供了对SMA的现有护理标准的讨论，以及www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1352/。
例如，当关注SMA中的营养时，胃造口管的放置是合适的。随着呼吸功能恶化，提供气管切开术或无创呼吸支持。睡眠呼吸紊乱可以通过夜间使用持续气道正压来治疗。如果用力肺活量大于30％-40％，可以安全地进行SMA II和SMA III患者的脊柱侧凸手术。电动椅和其他设备可以改善生活质量。还参见美国专利号8211631，其通过引用并入本文。
应注意，术语“一个(a)”或“一种(an)”是指一个或多个。因此，未用数量词限定的名词、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
词语“包括”、“包含”和“含有”应包含性而非排他性地解释。词语“由...组成”及其变体应排他性地而不是包含性地解释。虽然说明书中的多个实施方案使用“包含”语言来呈现，但在其他情况下，相关实施方案也旨在使用“由......组成”或“基本上由......组成”语言来解释和描述。
除非另有说明，否则本文所用的术语“约”是指与给定参考值相差10％(±10％)。
如本文所用，“疾病”、“病症”和“疾患”可互换使用，以指示受试者中的异常状态。
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括RNA或RNA和蛋白质的产生。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是瞬时的或可以是稳定的。
术语“翻译”涉及核糖体处的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以产生蛋白质或肽。
除非在本说明书中另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义，并且通过参考公开的文本，其为本领域技术人员提供了本申请中使用的术语的一般指南。
以下实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明。
实施例1-新进化枝FAAV-AAVhu68
使用QIAamp柱(Qiagen)根据制造商的推荐(具有以下修改)从人组织样品中提取组织DNA作为PCR模板。如Gao等人[Proc Natl Acad Sci USA,2002 Sep3,99(18):11854-11859(Epub 2002年8月21日)]所述，因为Q5 DNA聚合酶(Hot Start High-Fidelity2X Master Mix,NEB)具有非凡的高保真度和强效率，选择所述Q5DNA聚合酶以回收样品中潜在AAV的全长VP1基因，其中引物组修改如下：使用引物prm504[GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC,SEQ ID NO:23]代替AV1NS，并且使用prm505[CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA,SEQ ID NO:24]代替反向引物AV 2CAS。PCR条件修改如下：/>
μL
水 9
prm504 1.25
prm505 1.25
模板 1
2XQ5 12.5
PCR程序
从凝胶中切出来自PCR的～3kb的条带；用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取DNA，并克隆到ZeroPCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)中。对质粒进行测序以获得AAV VP1基因的全长。对于大多数样品，对至少三个质粒完全测序，并且绘制共有序列作为该样品的最终AAV序列。
获得的编码AAVhu68的vp1衣壳蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:7中提供。还参见图8B-8D。AAVhu68的vp1氨基酸序列在图8A和SEQ ID NO:8中提供。与AAV9、AAVhu31和AAVhu32相比，在AAVhu68中鉴定出两个突变(A67E和A157V)是关键的(图8A中圈出)。
然后通过将hu68的VP1基因加载到pAAV2/9骨架中代替AAV9 VP1基因来制备pAAV2/hu68反式质粒，以评估包装效率、产量和转导性质。pAAV2/9质粒含有在衣壳基因两侧的AAV25’和3’ITR，并且可获自Penn Vector Core[University of Pennsylvania,Phila,PA US,pennvectorcore.med.upenn.edu]。
实施例2-AAVhu68载体
产生并评估携带多种标签(例如GFP和LacZ)的AAVhu68和AAV9载体。每种载体使用三重转染技术在293细胞中产生，如Gao等[Gao,Guang-Ping,等人"Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy."Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18(2002):11854-11859]所述。
1.pAAVhu68反式质粒的产生
编码vp1衣壳蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:7中提供。
通过将hu68的VP1基因加载到pAAV2/9骨架中代替AAV9 VP1基因来制备pAAV2/hu68反式质粒，以评估包装效率、产量和转导性质。pAAV2/9质粒含有在衣壳基因两侧的AAV2 5’和3’ITR，并且可获自Penn Vector Core[University of Pennsylvania,Phila,PAUS,pennvectorcore.med.upenn.edu]。
2.AAVhu68载体的产量
在37℃的5％CO2气氛下，在含有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠并补充有10％胎牛血清的DMEM,1X(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium)中培养和维持293细胞。如Gao等人[Gao,Guang-Ping,等人"Novel adeno-associated viruses fromrhesus monkeys as vectors for human gene therapy."Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 99.18(2002):11854-11859.]所述进行转染，用pAAV2/hu68或pAAV2/9代替载体质粒。使用的转基因盒是CB7.CI.ffLuciferase.RBG。将转染的细胞在6孔板中进一步培养。收集细胞的总裂解物以及上清液，用于使用靶向转基因盒的兔β-珠蛋白聚腺苷酸区域的探针和引物通过TaqMan(Applied Biosystems)进行病毒定量，如Gao等人[Gao,Guangping,等人"Purification of recombinant adeno-associated virusvectors by column chromatography and its performance in vivo."Human genetherapy 11.15(2000):2079-2091.]所述。在上清液滴度和总裂解物滴度两方面，在6孔板中头对头比较6个pAAV2/9质粒和6个pAAV2/hu.68质粒的产量。每个质粒来自单个细菌菌落。
发现就总裂解物而言，AAVhu68的产量与AAV9的产量相似。然而，在上清液中，AAVhu68的产量显著高于AAV9的产量。因此，就生产而言，AAVhu68被证明是与AAV9相比更好的载体，因为上清液对于大规模病毒生产是优选的。
3.AAVhu68.LacZ的体内转导
通过插入编码核定位的细菌β-半乳糖苷酶(nLacZ)的序列作为转基因产生AAVhu68.CB7.nLacZ(也称为AAVhu68.LacZ)，然后如上所述生产。为了评估体内AAVhu68的包装效率、产量、转导性质、转导效率和向性，通过多种施用方法(例如静脉内、肌肉内和鼻内施用)向小鼠注射5x1011个基因组拷贝的AAVhu68.LacZ载体。在载体施用后两周处死小鼠后收集肌肉、肺、肝和心脏。制备、处理和分析每个器官的冷冻切片，作为检测LacZ基因表达的常规方案[Bell,Peter,等人"An optimized protocol for detection of E.coli β-galactosidase in lung tissue following gene transfer."Histochemistry and cellbiology 124.1(2005):77-85.]。这些结果表明AAVhu68显示出高转导效率和广泛的组织/器官向性。
4.与AAV9.GFP相比，AAVhu68.GFP的体内转导
通过插入编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因作为转基因产生AAVhu68.GFP和AAV9.GFP，然后如上所述生产。为了评估体内AAVhu68和AAV9的包装效率、产量、转导性质、转导效率和向性，向小鼠施用1x1010GC或1x1011GC剂量的AAVhu68.GFP或AAV9.GFP。研究了脑室内施用载体的小鼠的多个脑区(海马、运动皮层和小脑)的切片。除了来自注射1x1010GC的AAV9.GFP的一只小鼠外，在所有测试的海马样品中观察到AAV载体的转导。在运动皮质中观察到与AAV9的转导相比AAVhu68.GFP的更好转导。此外，仅在小鼠注射1x1011GC的载体时，观察到小脑中AAVhu68.GFP的转导。在这些小鼠中，与AAV9相比，AAVhu68在脑中显示出更高的转导效率以及更广泛的向性。
在进一步的实验中，如Wang等人[Wang L,Calcedo R,Bell P,Lin J,Grant RL,Siegel DL,Wilson JM,Hum Gene Ther.2011 Nov；22(11):1389-401；Wang L,Calcedo R,Wang H,Bell P,Grant R,Vandenberghe LH,Sanmiguel J,Morizono H,Batshaw ML,Wilson JM,Mol Ther.2010Jan；18(1):126-34]所述制备并处理来自静脉内施用AAVhu68.GFP的小鼠的多种器官，例如肝、肾、心脏和胰腺。在肝中观察到强阳性信号，而肾、心脏和胰腺也显示载体的转导，表明AAVhu68载体的广泛组织/器官向性。
实施例3-含有hSMN的AAV载体
AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG由外部组分和内部DNA基因组组成。外部载体组分是血清型hu68,T＝1二十面体衣壳，其由比率为约1:1:8-10的三种AAV病毒蛋白VP1、VP2和VP3的60个拷贝组成。衣壳包含单链DNA基因组，所述单链DNA基因组由两侧为两个AAV反向末端重复(ITR)的人运动神经元生存1(hSMN1)转基因组成。增强子、启动子、内含子、hSMN1编码序列和多腺苷酸化(聚腺苷酸)信号构成人SMN1转基因。ITR是在载体生产过程中负责基因组复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。hSMN1编码序列的表达由CB7启动子驱动，CB7启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子(C4)和鸡β肌动蛋白启动子之间的杂合体。通过鸡β肌动蛋白内含子(CI)的存在增强了来自该启动子的转录。包含兔β珠蛋白聚腺苷酸信号以介导人hSMN1 mRNA转录物的终止。AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG载体基因组的示意图显示在图1A中。
序列元件的描述：
1.反向末端重复(ITR)：AAV ITR(GenBank#NC001401)是两端相同但方向相反的序列。当AAV和腺病毒辅助功能以反式提供时，AAV2 ITR序列充当载体DNA复制的起点和载体基因组的包装信号两者。因此，ITR序列代表载体基因组复制和包装所需的唯一顺式序列。
2.CMV立即早期增强子(382bp,GenBank#K03104.1)。
3.鸡β-肌动蛋白启动子(282bp；GenBank#X00182.1)启动子并用于驱动高水平的人运动神经元生存1(hSMN1)表达。
4.鸡β-肌动蛋白内含子：来自鸡β-肌动蛋白基因的973bp内含子(GenBank#X00182.1)存在于载体表达盒中。内含子被转录，但通过剪接从成熟mRNA中除去，将其任一侧的序列合并在一起。已经显示表达盒中内含子的存在有助于mRNA从细胞核转运至细胞质，从而增强稳定水平的用于翻译的mRNA的积累。这是旨在用于提高基因表达水平的基因载体的共同特征。
5.编码序列：使人SMN1序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/N M_000344.3)经密码子优化和合成(UPenn)。脊髓性肌萎缩(SMA)由端粒基因运动神经元生存1(SMN1)中的突变引起。SMN1中的突变导致对下运动神经元的选择性毒性，导致进行性神经元丢失和相关的肌肉无力和变性。我们使用的转基因是SMN1，同种型D。同种型D编码最长的同种型，并且该变体被认为是CNS中SMN1和遍在SMN1产生的主要转录物/同种型。
6.多腺苷酸化信号：127bp兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号(GenBank#V00882.1)提供用于抗体mRNA的有效多聚腺苷酸化的顺式序列。该元件用作转录终止的信号，在新生转录物的3’端的特异性切割事件和添加长聚腺苷酸尾。
使用常规三重转染技术在293细胞中制备载体，如[Mizukami,Hiroaki,等人AProtocol for AAV vector production and purification.Diss.Division of GeneticTherapeutics,Center for MolecularMedicine,1998.]所述。所有载体均由宾夕法尼亚大学载体中心(Vector Core at the University of Pennsylvania)产生，如先前所述[Lock,M.,等人,Hum Gene Ther,21:1259-1271(2010)]。
进行基于液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)的技术以确定AAV载体的基因组拷贝(GC)滴度，如先前所述(Lock,Martin,等人"Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titersby droplet digital PCR."Human gene therapy methods 25.2(2013):115-125)。该方法是实用的，报告与qPCR相当或更好的滴度，并且不需要质粒标准曲线。所用的测定包括用DNA酶I消化，然后进行数字PCR分析以测量包封的载体基因组拷贝。组合使用靶向聚腺苷酸区的序列特异性引物与杂交至该相同区域的荧光标记探针完成DNA检测。
实施例4-SMA模型中的AAVhu68.CB7.CI.hSMN.RBG
所有动物程序均按照宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案进行。所有小鼠均保持在宾夕法尼亚大学转化研究实验室的动物设施(Animal Facilityof the Translational Research Laboratories)中。
在小鼠中，存在一个等同于人SMN1(hSMN1)的SMN基因。该基因的完全丧失导致胚胎致死表型(Monani UR,Sendtner M,Coovert DD等人The human centromeric survivalmotor neuron gene(SMN2)rescues embryonic lethality in Smn(-/-)mice andresults in a mouse with spinal muscular atrophy.Hum Mol Genet 2000；9:333-9；Schrank B,Gotz R,Gunnersen JM等人Inactivation of the survival motor neurongene,a candidate gene for human spinal muscular atrophy,leads to massive celldeath in early mouse embryos.Proc Natl Acad Sci U S A 1997；94:9920-5.)。用于评估治疗的最常用的SMA临床前模型之一是SMNΔ7小鼠模型。SMNΔ7小鼠模型是在FVB背景上开发的转基因小鼠，其具有2个拷贝的人SMN2(hSMN2)和2个拷贝的外显子7被去除的hSMN2(SMNΔ7)。野生型(WT)SMNΔ7小鼠具有2个拷贝的鼠SMN(mSMN)，杂合(HET)小鼠具有1个拷贝的mSMN，并且敲除(KO)SMNΔ7小鼠没有mSMN的拷贝。KO SMNΔ7小鼠的平均寿命为13-15天，并且表现为脊髓中的运动神经元数量减少，肌纤维尺寸减小，体重减轻，翻正和行走受损，以及部分和非神经支配的神经肌肉接头增加。SMNΔ7小鼠模型的主要优点是相对于平均寿命为约5天的严重SMA模型的延长的治疗窗口，同时还表现出足够严重的表型以快速辨别治疗干预是否对疾病减弱有影响。请参阅Le TT,PhamLT,Butchbach ME等人SMNDelta7,the major product of the centromeric survival motor neuron(SMN2)gene,extendssurvival in mice with spinal muscular atrophy and associates with full-lengthSMN.Hum Mol Genet 2005；14:845-57。
在实施例4中，使用了mSMN-/-hSMN2+/+SMNΔ7+/+(KO SMNΔ7，在以下实施例中也称为SMNΔ7)小鼠。SMN的免疫组织化学证明，在皮质、小脑和脊髓中，SMNΔ7幼仔没有表现出SMN1的表达(图2)。在出生时注射3x1010GC的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG载体后23天，观察到SMNΔ7幼仔、野生型和杂合同窝幼仔的SMN表达增加。通过脑室内注射到左侧脑室进行施用。
通过AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理的动物的皮质中的密码子优化的hSMN1核糖核酸(RNA)的原位杂交(ISH)进一步评估测试载体的病毒转导。提供野生型和SMNΔ7动物作为对照。图2的底部图中显示的结果证明了在测试剂量下的高转导率。
进行通过免疫组织化学确定运动神经元转导百分比的分析。进行通过蛋白质印迹来进一步分析以检测来自脑和脊髓两者的匀浆的SMN表达。
实施例5-AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG提高SMA啮齿动物模型的存活
在新生mSMN1-/-hSMN2+/+SMNΔ7+/+(SMNΔ7)、杂合同窝幼仔(HET)和野生型C57BL/6J(WT)幼仔中评估AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG的脑室内注射的效力。测试的小鼠在出生后24小时内接受用3x1010或8.76x1010GC的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的至左侧脑室中的单次脑室内(ICV)注射。PBS注射的幼仔用作对照(图3A)。每天监测小鼠。将任何符合安乐死标准(从先前称重减轻体重20％或趾坏死)或在断奶前发现死亡的小鼠进行基因分型，将所有存活至断奶的小鼠进行基因分型。
在两个月的观察期间，野生型、用PBS注射的杂合幼仔和用载体注射的杂合幼仔的存活率相似，表明没有与载体或施用途径相关的毒性(图3A)。在用PBS处理的WT动物和用3x1010GC或～9x1010GC的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理的WT小鼠之间未观察到翻正反射的显著差异(图3A)。仅注射PBS的SMNΔ7幼仔(n＝8)的中位存活为15天。然而，在用较低剂量的载体(3x1010GC/1.5g幼仔)处理后，中位存活显著增加至37天(n＝7)。如果载体的剂量增加至每只幼仔8.76x1010GC(n＝10)，则中位存活为23天(图3B)。该结果表明出生时以两种剂量脑室内注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG均成功地改善了SMNΔ7幼仔的存活，同时检测到最小毒性。
实施例6-AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG促进SMA啮齿动物模型的生长
从出生后(Postnatal Day，PND)第3天开始，每2天对小鼠称重，直至其符合安乐死标准或发现死亡，并将结果绘制在图4A中。比较每两组之间所有时间点变量的总体变化。
用PBS或低剂量和高剂量的载体处理的野生型和杂合幼仔显示相似的生长曲线，表明没有与载体或施用途径相关的毒性。用PBS处理的SMNΔ7幼仔表现出进行性体重减轻和15天的中位存活。然而，当注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG载体时，幼仔的体重在出生后缓慢但稳定地增加。在出生后第15天(P15)，虽然来自所有三个组的野生型幼仔的体重相当，但与仅PBS组相比，载体拯救的SMNΔ7幼仔显著更重(图4B)。在出生后第30天(P30)，在高剂量和低剂量的载体处理之间，SMNΔ7幼仔和野生型/杂合同窝幼仔未表现出体重差异(图4C)。
使用“nlme”包中的函数“lme”，使用R程序(版本3.3.1；cran.r-project.org)内的线性混合效应建模进行进一步的比较。在分析中包含性别作为协变量。线性混合效应模型考虑了在每个受试者内在不同时间点的观察结果的依赖性，并且是分析时间过程数据的优选方法。在PBS处理的WT动物和用3x1010GC或～9x1010GC的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理的WT小鼠之间没有观察到体重的显著差异(图4D和4E)，表明没有与载体或施用途径相关的毒性。与健康的同窝幼仔相比，SMNΔ7幼仔表现出较慢的体重增长率(图4F)，而在SMNΔ7幼仔中用3x1010GC/幼仔或8.76x1010GC/幼仔的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理显著提高了体重增加(图4I和4J)。
这些结果表明AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG改善了由体重指示的SMNΔ7幼仔的生长。
实施例7-功能评估揭示AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG在SMA啮齿动物模型中的积极作用
进行两种功能评估(后肢悬吊测试和翻正反射测试)以评价在用本文所述载体处理之后SMA的发展和进展。
为了评估SMA新生小鼠模型的近端后肢肌肉力量和疲劳，采用后肢悬吊测试的方案，并从来自TREAT-NMD(El-Khodor等人)的Behavior Phenotype for neonates:HindLimb Suspension Test(a.k.a.Tube Test),SOP#SMA_M.2.2.001进行优化。包含后肢悬吊(HLS)评分和悬吊时间(Time Spent Hanging，TSH)作为测量后肢肌肉力量和疲劳的参数。该测试在出生后每2天进行2次连续试验。每次试验持续最多60秒。在同一试验中测量HLS和TSH两者。前15秒用于确定HLS评分。对于TSH，对时间继续计数直到动物掉落或时间达到60秒，以第一个为准。此外，本研究排除了超过10只动物的同窝仔，以避免由于营养竞争引起的偏差。本研究排除少于5只幼仔的同窝仔，因为增加的母亲照顾可能导致更轻微的表型，并导致研究的偏差。
代替在用PBS或载体处理的野生型或杂合幼仔中观察到的生长后HLS评分增加，用PBS注射的SMNΔ7幼仔表现出HLS评分的下降，表明后肢肌肉力量受损(图5B)。然而，以每只幼仔3x1010GC的剂量单次注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG，SMNΔ7幼仔在发育期间HLS评分保持稳定。此外，如果剂量增加至每只幼仔8.76x1010GC，则观察到HLS评分随时间略微增加。这些结果表明AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG载体改善了SMNΔ7幼仔的功能发育。
如上所述记录悬吊时间(TSH)并且作为掉落潜伏期的指标，在SMNΔ7幼仔及其健康的同窝幼仔中没有观察到差异。该结果表明TSH未能揭示SMNΔ7模型中受损的肌肉功能，因此排除在进一步评估之外。
为了在新生小鼠SMA模型中测试运动能力和评估肌肉力量，采用翻正反射测试的方案，并从来自TREAT-NMD(Didonato等人)的Behavior Phenotype for neonates:Righting Reflex,SOP#MD_M.2.2.002进行优化。它通过测量小鼠在离开其正常直立体位时校正身体方向的能力来检查可能受肌肉无力和/或一般健康状况不佳影响的一般身体力量。将单个动物从其饲养笼中取出并置于仰卧体位，使得所有4只爪子朝上。将手指放在胸部以使动物在该倒置体位稳定。然后移开手指并启动计时器。一旦动物翻转为腹部朝下并且所有4只爪子平放在其站立的表面上，则停止计时器。每次试验后，将动物放回其饲养笼中并使其休息5分钟。
从出生后第7天到出生后第17天，每两天对SMNΔ7幼仔进行测试。每次试验最多60秒。动物在该时间段内恢复到正常体位的时间用于量化肌肉力量。如果动物在给定时间内无法翻正，则终止试验并且将翻正时间记录为60秒。
此外，本研究排除了超过10只动物的同窝仔，以避免由于营养竞争引起的偏差。本研究排除少于5只幼仔的同窝仔，因为增加的母亲照顾可能导致更轻微的表型，并导致研究的偏差。当在同一天与后肢悬吊测试组合来使用翻正反射测试时，其总是首先进行以防止动物肌肉疲劳。
进行了进一步的分析，以提供组间的详细比较,并减少由性别引起的变化。比较每两组之间所有时间点变量的总体变化。使用“nlme”包中的函数“lme”，使用R程序(版本3.3.1；cran.r-project.org)内的线性混合效应建模进行进一步的比较。在分析中包含性别作为协变量。将记录的动物恢复到直立体位花费的时间按性别进行归一化，数据绘制在图6D至6J中。在PBS处理的WT动物和用3x1010GC或～9x1010 GC的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理的WT小鼠之间未观察到翻正反射的显著差异(图6D和6E)。
结果表明，野生型或杂合幼仔花费有限的时间返回直立体位，并且该时间段在生长后减少，而SMNΔ7幼仔在给定时间内无法校正其方向(图6)。在出生时以每只幼仔3x1010GC或每只幼仔8.76x1010GC注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG，在SMNΔ7幼仔中校正体位所花费的时间显著减少并在出生后第17天恢复至由野生型和杂合幼仔指示的正常水平，表明AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG成功改善了SMA啮齿动物模型的功能发育。
有趣的是，在KO中，中位存活和体重增加没有以剂量依赖性方式改善，而翻正反射以剂量依赖性方式得到改善。基于这些数据，推断在SMNΔ7 KO中3x1010GC和～9x1010GC的AAVhu68.CB 7.CI.hSMN1co.RBG高于最小有效剂量(MED)。
总之，当在新生SMNΔ7小鼠中鞘内(脑室内)施用时，单次脑室内注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG载体导致显著的运动神经元转导和伴随的功能矫正。
实施例8-组织学分析揭示AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG在SMA啮齿动物模型中的积极作用
进行进一步的研究以评估SMA模型中肌纤维的组织学和形态学受损以及由于注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG引起的恢复。通过苏木精和伊红染色以及α-肌养蛋白的免疫组织化学染色显示胫骨前肌、四头肌、膈肌、肋间肌、背最长肌和舌的肌纤维。使用中心核纤维(CNF)的横截面积(CSA)、纤维直径和百分比作为参数。对于CSA测定，仅考虑圆形或多边形纤维。
实施例9-野生型和SMNΔ7小鼠中AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG的剂量范围和转导效率
为了确定最高剂量的潜在毒性、AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的剂量依赖性表达以及确定AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG在SMNΔ7小鼠中的最小有效剂量(MED)，HET/HET交配产生的全部同窝仔在出生后24小时内向左侧脑室(脑室内)(ICV)注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)、每只小鼠1x109GC、3x109GC、1x1010GC、3x1010GC、或7x1010GC的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG。在整个研究中每天监测小鼠。将任何符合安乐死标准(从先前称重减轻体重15％或无法护理)的小鼠安乐死。在研究第13天之前没有发现死亡或安乐死的小鼠被尸检。
在研究第3、5、7、9、11和13天，对小鼠称重。在研究第3天，对小鼠进行纹身和基因分型。在研究第7天和第13天，小鼠进行3轮翻正反射测试。在研究第9天，对同窝仔进行淘选以保持均匀的同窝仔数(littersize)。对同窝仔进行淘选以包含所有KO和相应数量的HET和WT，使同窝仔数等于4只动物。在研究第13天，对动物实施安乐死并进行尸检以分析运动神经元转导和肌纤维大小。
在HET/WT和KO SMNΔ7小鼠中，所有剂量的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG都被良好耐受。图9A和9B中的数据表示每剂量仅2升，因此认为用1x109GC处理的HET/WT动物的体重显著降低是由于母体和同窝仔数的变化(图9B)。此外，登记的1x109GC组的单个KO在研究第9天由于体重减轻超过15％必须实施安乐死。较高剂量的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG未改变HET/WT动物中的体重增加，并且相对于PBS处理的KO对照，改善了KO动物中的体重增加(图9A和9B)。基于这些数据，可以得出结论，1x1010GC代表SMNΔ7小鼠中AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的MED。
对于翻正反射，在研究第7天，在多个剂量组中的多个的HET/WT动物之间存在明显的变化(图10A)。然而，到研究第13天，所有剂量组中的HET/WT动物具有～1秒的平均翻正时间(图10A)。研究第7天的这种变化被认为是由于母亲和同窝仔数导致的变化。与体重监测数据类似，在1x1010GC及更高的剂量下，相对于PBS处理的KO对照，AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理的KO在研究第13天的翻正时间方面表现出显著改善(图10B)。
因此，基于体重监测和翻正反射的终生测量，可以得出结论，SMNΔ7小鼠中AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的当前MED是1x1010GC。
评估运动神经元转导和肌纤维大小的组织学测量。在上面实施例9中描述的实验中登记另外的同窝仔。
此外，在登记的同窝仔中，未观察到与任何剂量的载体相关的急性毒性迹象，并且在13天的研究期间，没有与载体相关的毒性迹象。
为了进一步评估ICV施用后成年小鼠中AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的潜在毒性和耐受性，向成年C57BL/6J雄性和雌性鞘内注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG。本研究中使用的总剂量与上述新生鼠实验中使用的剂量相当，而每克脑质量的剂量相差2倍，这是因为成年小鼠估计的脑质量为0.4g，相比之下新生小鼠估计的脑质量为0.2g。研究第14天时间点包括所有剂量，而在研究第28天时间点仅重复媒介物和7x1010GC。
如果适用，在研究第0、7、14、21和28天监测体重。对尸检时收集的血清进行临床化学(研究第14天或研究第28天，如适用)。收集脑、脊髓、心脏、肺、肝、脾、肾、坐骨神经和四头肌进行显微镜组织病理学评估。将所有参数与媒介物处理的动物进行比较。
到研究第14天，任何组都没有发病率或死亡率。与性别匹配的媒介物处理的对照相比，所有剂量的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RB G对体重迹线没有影响(图14A-14B)。
进行进一步研究以评估实施例9中上述模型中肌纤维的组织学和形态学受损以及由于注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1.RBG的恢复。通过苏木精和伊红染色以及α-肌养蛋白的免疫组织化学染色显示胫骨前肌、四头肌、膈肌、肋间肌、背最长肌和舌的肌纤维。使用中心核纤维(CNF)的横截面积(CSA)、纤维直径和百分比作为参数。对于CSA测定，仅考虑圆形或多边形纤维。
实施例10-恒河猴中含有hSMN1的AAV载体
本研究的目的是评估恒河猴中不同的鞘内施用途径，以确定哪种途径导致最强的脊髓运动神经元转导，以及评估恒河猴中AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的药代动力学特征和安全性。在这项研究中使用恒河猴，因为其大小和中枢神经系统解剖结构比小鼠更接近人。
使用荧光镜引导和造影材料确认小脑延髓池内(ICM)或腰大池(腰椎穿刺)(LP)中椎间隙L4和L5之间的针放置。组为1.0mL ICM(n＝3)、2.5mL LP(n＝4)和5.0mL LP(n＝4)。每组包含对AAV9具有从不可检测到大于1:20的一系列中和抗体(NAb)滴度的动物。所有组均接受3.3x1011GC/g(总共3x1013GC)的AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG。本研究中未包含媒介物对照组。
在研究期间，每天由专门人员观察动物的异常行为和痛苦迹象。在基线、在AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG施用当天(研究第0天)、研究第3天、研究第7天以及此后每周进行临床病理学，直至研究完成。在研究第0天、研究第7天以及此后每周进行CSF化学和细胞学，直至研究完成。在研究第28天对动物实施安乐死并进行尸检，用于脊髓中运动神经元转导的组织学评估、生物分布和初步组织病理学评估。
在整个研究过程中，没有动物表现出异常行为或痛苦迹象。在研究第0天和研究第21天之间，1只动物(RA1871)的ALT水平从55U/L增加至～80U/L，尽管这没有对应于任何临床体征(图11B)。在施用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG后，没有其他动物表现出ALT(图11B)、AST(图11A)、淋巴细胞(图11C)或单核细胞(图11D)增加的趋势。
在整个研究中，似乎在任何动物中没有CSF蛋白质或葡萄糖改变的任何趋势(图11E-11H)。在研究第28天，1只动物(RA1327)在CSF中具有17个白细胞/μL(图11E)。在总体检查中，CSF似乎具有血液污染，但确实含有250个红细胞/μL。目前尚不清楚这是真正的细胞增多症(pleocytosis)还是不洁的CSF龙头。来自先前鞘内研究的CSF细胞学显示CSF白细胞计数在数周内从一位数逐渐增加到两位数(数据未显示)，从而得出结论，在研究第28天这单次出现17个白细胞/μL(从研究第21天的0个白细胞/μL)可能是由于不洁的CSF龙头，而不是真正的细胞增多症。
在尸检时，将每根脊髓分成颈部、胸部和腰部切片。随后将每个脊髓水平分成4片。将1片快速冷冻用于生物分布，1片置于福尔马林中用于组织病理学评估，并将剩余的2片置于福尔马林中用于评估运动神经元转导。
通过用于密码子优化的hSMN1核糖核酸(RNA)的ISH(3个载玻片/脊髓水平片/动物等于6个载玻片/脊髓水平/动物)和用于hSMN1蛋白的IHC(2个载玻片/脊髓水平片/动物等于4个载玻片/脊髓水平/动物)来测量运动神经元转导。用Nissl染料标记运动神经元以确定转导的运动神经元的百分比。通过在所有脊髓水平的ISH和IHC两者测量，ICM施用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG导致比LP施用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG显著更高的运动神经元转导(图12A和12B)。尽管通过IHC测量时转导的运动神经元的百分比更高，但每组中ISH和IHC之间的转导效率是一致的(图12A和12B)。虽然可能发生抗体与恒河猴SMN蛋白的交叉反应，但用于ISH的RNA探针对AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG产生的密码子优化的hSMN1 RNA具有特异性，这消除了与恒河猴SMN RNA交叉反应的可能性。与已公布的数据一致，在所有组中转导的运动神经元的百分比以从尾部至嘴侧(caudal to rostral)(颈部至腰部)的模式增加(Hinderer C,Bell P,Vite CH等人Widespread gene transfer in thecentral nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 intothe cisterna magna.Molecular therapy Methods&clinical development 2014；1:14051)(图12A和12B)。
鞘内AAV递送可以使用多种途径进行CSF接近。腰椎穿刺是接近CSF的最常用方法，因此被评估为非人灵长类动物的AAV施用途径。值得注意的是，发现与在小脑延髓池水平上更优异地注射载体相比，通过腰椎穿刺将AAV9载体递送到CSF中在转导脑和脊髓细胞方面的效率低至少10倍[HindererC,等人(2014)Widespread gene transfer in the centralnervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into thecisterna magna.Mol Ther Methods Clin Dev 1:14051]。在使用AAVhu68-SMN1载体的NHP研究中证实了这一发现。如通过转基因mRNA的原位杂交(ISH)以及人SMN蛋白的免疫组化染色(IHC)所示，通过枕下穿刺将临床候选载体注射到成年恒河猴的小脑延髓池中(n＝3)在脊髓的所有水平都表现出运动神经元转导。相反，通过腰椎穿刺接受载体注射的动物在脊髓的所有水平上显示出显著较低的转导，即使当注射体积增加至5mL-动物CSF体积的40％-以促进延髓分布也是如此。该研究说明了在小脑延髓水平提供载体的必要性，并支持选择枕下穿刺作为临床施用途径。
对来自研究的选择的组织进行生物分布以确定在不同的鞘内施用途径后的转导。在先前研究中ICM和LP施用载体后脑和脊髓转导的显著差异可能是由于LP使用较低的量(Hinderer C,Bell P,Vite C H等人Widespread gene transfer in the centralnervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into thecisterna magna.Molecular therapy Methods&clinical development 2014；1:14051)。在本研究中，在ICM和LP施用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG后，脑和脊髓的转导是等同的(图13)。
有趣的是，NAb似乎确实具有外周器官转导的影响。在每组中，NAb大于1:20的动物在心脏、肝和脾中具有最低的转导(图13)。
对脑、脊髓、背根神经节(DRG)、坐骨神经和肝脏进行初步组织病理学评估。在脑中，主要发现是最小至轻微的单核细胞浸润和神经胶质增生。这些发现在所有组中均等分布。在脊髓中，发现主要存在于ICM组，腰椎脊髓中的发现的频率增加。最常见的发现是背索(dorsal funiculi)中最小至轻微的轴突变性以及最小至轻微的单核细胞和组织细胞浸润。在颈部、胸部和腰部DRG中，主要发现是最小至轻微的单核细胞浸润、最小至轻微的神经元空泡化和最小至中度的轴突变性。与两个LP组相比，这些发现在ICM组中的更普遍存在。在坐骨神经中，存在最小至中度的轴突变性和最小的巨噬细胞浸润。这些发现主要存在于ICM组中。在肝脏中，所有组中存在最小至轻微的单核细胞浸润和最小的微肉芽肿。
此外，收集肾上腺、升主动脉、骨髓、脑、盲肠、子宫颈附睾(cervixepididimides)、食道、眼、胆囊、心脏、肾、大肠、肺、泪腺、淋巴结、肌肉、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、唾液腺、精囊、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、睾丸、膀胱、子宫、垂体、胸腺、甲状腺、气管、阴道和大病灶(如果有的话)用于组织病理学分析。用苏木精和伊红(H&E)和/或其他免疫组织化学染色对组织进行染色，以鉴定/阐明组织学特征。
实施例11-恒河猴中含有hSMN1的AAV载体的毒性和生物分布研究
在恒河猴中进行180天GLP研究以研究ICM施用后AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的药理学和毒理学。恒河猴接受以下三种剂量中的一种：1.85x1010GC/g脑、5.56x1010GC/g脑、或1.85x1011GC/g脑(n＝3/组/时间点-两性)或者媒介物(Elliot’s Formulation Buffer,EFB)(n＝1/组/时间点-任一性别)。进行基线临床病理学(具有差异、临床化学和凝血组的细胞计数)、CSF化学和CSF细胞学。在AAVh u68.CB7.CI.hSMN1co.RBG或媒介物施用后，每天监测动物的痛苦迹象和异常行为。在AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG或媒介物施用后每周进行临床病理学检查。在AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG或媒介物施用后的前30天每周进行CSF化学和细胞学检查，之后每月进行。在基线时，以及此后每月，通过IFN-γELISPOT测定评估针对AAVhu68的中和抗体和对AAVhu68和hSMN1转基因的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
在AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG或媒介物施用后14天、90天和180天，对动物实施安乐死，并收获组织用于全面的显微组织病理学检查。组织病理学检查特别集中在中枢神经系统组织(脑、脊髓和背根神经节)，因为它们是鞘内施用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.R BG后转导最多的组织。另外，从肝脏、脾脏和骨髓中收获淋巴细胞，以检查在尸检时这些器官中CTL的存在。
在30只非人灵长类动物中使用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的ICM施用进行的GLP毒理学研究在载体施用后在1/30动物中鉴定了短暂神经缺陷，这归因于手术过程中由于麻醉的动物的自发运动导致直接穿刺脑干。通过180天随访时期，本研究中没有其他临床不良事件，并且在整个研究中进行的标准神经系统检查未发现异常。组织病理学揭示了剂量依赖性感觉神经元轴突病变，其与临床后遗症无关。脊髓运动神经元转导的量化表明，XGC剂量实现了X％脊髓运动神经元的转导，转导水平与SMNΔ7小鼠模型中改善的运动功能相关。因此选择该剂量作为MED(具有最终毒性结果的更新)。
在幼年恒河猴的非临床研究中，以极高剂量(2x1014GC/kg)静脉内施用AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG导致3/3只动物的急性肝毒性，其中一只动物在载体施用后5天需要安乐死。在GLP毒理学研究中，在通过高至3x1013GC(使用该施用途径评估的最高剂量)的剂量鞘内注射处理的9只成年和5只幼年恒河猴中，或者在通过ICM注射AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG处理的27只成年恒河猴中，未观察到类似的毒性。
实施例12-临床研究
A.新生儿
进行首次人体试验，对应于5x1010GC/g脑质量的MED剂量，其转化为人的～5x1013GC总量，并且比实施例11中所示的毒理学研究提出的低剂量高3倍，并且仍然比高剂量低3倍(Dekaban AS.Changes in brain weights during the span of human life:relation of brain weights to body heights and body weights.Ann Neurol 1978；4:345-56.)。在首次人体试验中施用的最大剂量等于实施例11中描述的毒理学研究中的最高剂量，1.85x1011GC/g脑，对应于1.85x1014GC总量。
为了确定在具有DNA验证的脊髓性肌萎缩(SMA)的参与者中AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.RBG的2个剂量的安全性，研究了在药学上合适的载剂/溶液中的所述AAV载体的两种不同单剂量施用。
随后的发展包括扩大人群和剂量以建立有效剂量。
主要目标是通过任何与研究相关的III级或更高级别的治疗相关毒性进行评估。
次要目标包括
·不良事件(AE)和/或严重不良事件(SAE)的发生率
·评估哈默史密斯婴儿神经系统检查(Hammersmith Infant NeurologicalExamination，HINE)发育运动里程碑的达成
·费城儿童医院婴儿神经肌肉疾病测试(Children′s Hospital ofPhiladelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders，CHOP-INTEND)运动功能量表中距基线的变化
·发生临床表现的脊髓性肌萎缩的参与者的百分比
·在指定时间点活着的参与者百分比
·物理测量中距基线的变化：
年龄/长度的权重；头部、胸部和手臂周长、头胸围比率
·静息生命体征中距基线的变化：
脉搏、血压、呼吸、温度、脉搏血氧饱和度和经皮二氧化碳
·临床实验室参数中距基线的变化：
由以下实验室测试评估：血液学：红细胞、血红蛋白、血细胞比容(hematocrit)、血小板、白细胞、白细胞差异(white blood cell differential)，血液化学：总蛋白、白蛋白、肌酸酐、胱抑素C、肌酸磷酸激酶、血尿素氮、总胆红素(直接和间接)、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、葡萄糖、钙、磷、氯化物、钠、钾。尿液分析：比重、pH、蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、红细胞、白细胞、上皮细胞、细菌、cast、晶体
·尺侧复合肌肉动作电位(CMAP)距基线的变化
·脑脊液(CSF)和血浆SMN蛋白浓度
目标人群是<6周龄的婴儿，其具有症状前、遗传学记录的SMA和2个拷贝的运动神经元生存2(SMN2)基因。
入选标准如下。
1.出生年龄：<6周，单胎分娩的胎龄为37至42周；双胞胎的胎龄为34至42周。
2.具有遗传学记录的5q脊髓运动神经元1(SMN1)纯合基因缺失或突变或复合杂合突变的症状前SMA。
3.遗传学记录的2个拷贝的运动神经元生存2(SMN2)。
4.具有SMA试验经验的神经科医师进行术后随访。
排除标准如下所列。
1.用用于SMA的任何市售或研究药物、生物制剂或装置治疗，包括基因疗法史、先前反义寡核苷酸(ASO)治疗或细胞移植。
2.筛选时或临第一次给药(第1天)前根据研究者的意见会强烈提示SMA的任何临床体征或症状。
3.临床上认为显著的任何异常实验室值(GGT>3XULN，胆红素≥[X]mg/dL，肌酐≥[Y]mg/dL，Hgb<[Z]或>[A]g/Dl；WBC>[B]/cmm)
4.重大疾病
5.根据研究者意见会给基因转移带来不必要的风险的伴随疾病
6.家庭不希望向初级保健医生和其他医疗服务提供者公开患者的研究参与情况。
测试AAV载体的两种剂量，每个给药队列包括6名参与者。
·队列1：低剂量：3x1013GC
·队列2：高剂量：1x1014GC
六名参与者登记到低剂量队列(3x1013GC)。参与者给药以连续方式进行，每个参与者的登记之间有4周的安全观察期。由内部安全委员会(ISC)评估安全性。如果没有观察到安全性审查触发(safety review trigger，SRT)，则在向低剂量队列中的第6位参与者给药后4周，由独立的数据监测委员会(IDMC)评估所有可用的安全性数据，然后进入高剂量队列2的登记。
在一个实施方案中，将含有5.6mL适当浓度的载体的注射器递送至手术室。存在以下人员用于研究药物施用：进行手术的介入医生；麻醉师和呼吸技师；护士和医师助理；CT(或手术室)技术人员；神经生理学技师；现场研究协调员。
在研究药物施用之前，进行腰椎穿刺以移除预定体积的CSF，然后鞘内注射碘化造影剂(IC)以帮助小脑延髓池的相关解剖结构的可视化。可以在针插入之前或期间施用静脉内(IV)造影剂作为鞘内造影剂的替代。使用IV或IC造影剂的决定由介入医生决定。将患者麻醉、插管并定位在手术台上。将术中神经生理学监测(IONM)设备附接于参与者。使用无菌技术使注射部位进行手术准备并覆盖。在荧光透视引导下，将脊柱针(22-25G)推进到小脑延髓池中。较大的引导针可用于辅助针放置。在确认针放置后，将延伸装置连接到脊柱针并允许患者CSF填充。根据介入医生的判断，可以将含有造影材料的注射器连接到延伸装置，并且注射少量以确认在小脑延髓池中针的放置。在通过CT引导+/-造影剂注射确认针放置之后，将含有5.6mL GTP-201的注射器连接到延伸装置。经过1-2分钟缓慢注射注射器内容物，递送体积为约5.0mL。从患者中缓慢取出针。
在研究药物施用后，根据机构指南将参与者运送到合适的麻醉后监护病房。在参与者充分恢复意识并且状况稳定后，允许其进入适当的病房进行方案强制性临床监测。频繁监测生命体征和神经功能，包括每15分钟评估持续3小时，然后在术后的前24小时时期每小时评估。在术后最初24小时时期之后，每天进行评估，持续两天，之后参与者出院并每周返回进行4周，然后每4周进行另外两次访问，然后在第24周进行主要终点评估访问。
抽取血液进行安全性测试，并对参与者进行临床评估。在给药时、第4、12和24周，对参与者进行腰椎穿刺以收集CSF以监测炎症迹象并测量生物标志物。在随访期间，参与者每三个月评估一次，直至术后一年。参与者之后每年访问，持续总共5年。在载体施用后3和6个月，参与者进行重复MRI和CSF收集。
使用标准技术在CSF样品中评估AAV载体施用后CNS炎症的迹象，包括有核细胞计数和差异和总蛋白。治疗相关炎症的探索性测量包括CSF的对于炎症标志物的多重细胞因子分析。
为了验证作为AAV hSMN1载体的成功转导的生物标志物的CSF SMN蛋白水平，正在开发用于所提出的1/2阶段介入研究的测定。
复合肌肉动作电位(CMAP)代表周围神经超大刺激后肌肉的电生理输出，并作为运动神经元健康的客观和高度敏感的指标(García A,Calleja J,Antolín FM,BercianoJ.Peripheral motor and sensory nerve conduction studies in normal infants andchildren.Clin Neurophysiol 2000；111:513-20)。特别地，I型SMA患者的天然病史研究表明，CMAP振幅异常低，并且在症状出现后没有改善(Finkel RS,McDermott MP,Kaufmann P等人Observational study of spinal muscular atrophy type I and implicationsfor clinical trials.Neurology 2014；83:810-7；Swoboda KJ,Prior TW,Scott CB等人Natural history of denervation in SMA:relation to age,SMN2 copy number,andfunction.Ann Neurol 2005；57:704-12 and Finkel RS.Electrophysiological andmotor function scale association in a pre-symptomatic infant with spinalmuscular atrophy type I.Neuromuscul Disord 2013；23:112-5)。另外，显示出与SMA患者相似的电生理学结果的猪敲除模型中SMA的研究表明，症状前动物中SMN的早期恢复导致CMAP校正(Duque SI,Arnold WD,Odermatt P等人A large animal model of spinalmuscular atrophy and correction of phenotype.Ann Neurol 2015；77:399-414)。出于上述原因，研究CMAP作为探索性生物标志物。
符合研究停止标准的事件包括：
·可能、大概或确定与研究产品相关的任何死亡
·升高的肝功能检查：
·ALT或AST大于正常上限3x
·总血清胆红素的相关升高(在本研究的年龄组中，定义为以下水平
·超过1名参与者经历3级或更高级别的AE，其可能、大概或确定与研究产品或注射程序有关
·中枢神经系统出血、中风或急性麻痹，其可能、大概或确定与研究产品或注射程序有关。
肝功能异常定义为丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天冬氨酸氨基转移酶(AST)的任何增加至大于正常上限(ULN)的3X。同时发现(Concurrent finding)是来自单次抽血或彼此在8天内抽取的单独抽血的结果。调查现场迅速开展后续调查和询问，以确定发现是否可重复和/或是否有明确支持疾病因果关系(例如，胆石症和伴有胆囊扩张的胆管阻塞)或研究的剂以外的剂的客观证据。
B.成人
该开放标签1/2阶段剂量递增临床试验(open label phase 1/2 dose-escalation clinical trial)评估在具有遗传确认的5q SMA和3型SMA临床病史的成人中单次施用AAVhu68.SMA的安全性。该研究招募不能走动的患者和能走动的患者。受试者通过ICM(脑池内注射)注射接受AAVhu68.SMA的单剂量。队列1(n＝3，低剂量，3x1013GC)或队列2(n＝6；高剂量，1x1014GC)。基于非临床药理学和毒理学研究选择在该研究中评估的两个剂量。在该研究中待评估的两个剂量在非人灵长类动物中都良好耐受并且达到足以改善鼠疾病模型中的运动缺陷的脊髓运动神经元SMN表达水平，因此预期在人中是安全的。此外，剂量有可能为研究参与者提供益处。前三位符合条件的受试者登记在队列1中。在每位受试者的给药之后，存在4周的观察期，在此期间内部安全委员会审查安全性数据，然后进行下一位受试者的给药。如果在队列1中第3位参与者的4周观察期内未观察到安全性审查触发(SRT)，则由数据安全监测委员会(DSMB)评估所有可用的安全数据，然后进入列队2的登记。如果未观察到安全性SRT，然后在列队2中第3位参与者给药后4周，由DSMB评估所有可用的安全数据，然后进行列队2中其余3位患者的登记。
在给药前的第-35天至第-1天筛选受试者。允许符合选择标准的患者在注射当天(第1天)入院。在接受AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.r BG的ICM注射后，将受试者作为住院患者监测2天。进行一次现场、门诊随访和电话评估，作为52周初级评估期的剩余时间内的指定时间点。
基于AE和SAE的发生率、临床和实验室评估、体格检查和生命体征评估AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG的安全性和耐受性。还评估了载体和转基因产品的免疫原性。
效力评估包括6MWT、10米行走时间、RULM评分、4阶梯攀爬、9孔钉测试、肺功能测量、PedsQL(疲劳量表)、SMA-FRS(功能评定量表)以及尺侧和腓侧CMAP幅度。在CSF中评估了SMN蛋白质浓度和其他探索性生物标志物。
入选标准
·≥18岁的男性或女性。
·筛选时5q SMA纯合基因缺失或突变或者复合杂合突变和至少2个拷贝的SMN2的遗传学记录。
·3型SMA的临床病史。
·愿意并且能够提供书面签署的知情同意书
·通过神经介入医生和现场首席研究员的内部小组评估，受试者的解剖学和身体状况不会妨碍研究产品的施用。
不能走动的受试者
·无法独立行走≥15英尺。
·筛选时RULM评分为5-30。
能走动的受试者
·能走动(能够独立行走≥15英尺)。
·能够安全地执行6MWT，6MW距离不大于530m。
排除标准
·有ICM注射的禁忌症。
·有任何腰椎穿刺的禁忌症。
·已接受过用于SMA的任何市售或研究药物或生物制剂的治疗，包括基因疗法史、之前的ASO治疗或细胞移植(OR)。在筛选前3个月内参与任何其他研究药物或疗法研究。
·呼吸功能不全，由筛选时24小时内>8小时的侵入性或非侵入性通气的医疗必要性定义。
·根据调查员意见，会干扰研究的进行和评估或者为基因转移带来不必要的风险的伴随疾病。
·异常的凝血状态(凝血酶原时间(PT)>1.5x正常，部分凝血活酶时间(aPTT)>1.5x正常)。
·有血小板减少症(例如血小板计数<150)
·有肝脏异常(胆红素>1.5xULN，ALT、AST和碱性磷酸酶>2.0x ULN)。
·有不受控制的高血压(收缩压[SBP]>180mmHg，舒张压[DBP]>100mmHg)。
·有临床上显著的ECG异常，根据研究者的意见，其会危及受试者的安全。
·实体器官移植或慢性免疫抑制的历史。
·有严重或不稳定的医学或心理状况，根据研究者的意见，其会损害受试者的安全性或成功参与研究或解释研究结果。
·筛选前30天内使用用于治疗SMA的药物，包括利鲁唑、丙戊酸、羟基脲、苯基丁酸钠、丁酸盐衍生物、肌酸、肉碱、生长激素、合成代谢类固醇(anabolic steroid)、丙磺舒、在进入时口服或肠胃外使用皮质类固醇、预期增加或降低肌肉力量的剂，或者已知或推测的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制的剂。研究中允许使用雾化器或需要类固醇的吸入器的受试者；然而，禁止口服使用类固醇。允许口服使用沙丁胺醇，但具有以下限制：受试者在纳入试验前应该使用沙丁胺醇至少6个月，具有良好的耐受性。沙丁胺醇的剂量应在试验期间保持恒定。允许使用吸入的β-激动剂(例如用于治疗哮喘危象)。
主要研究终点
本研究的主要终点是AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG的整个52周的安全性和耐受性。这些终点基于研究药物施用之后整个52周中的AE和SAE的频率以及生命体征、体格检查或临床实验室评估中在临床上认为显著的任何变化进行评估。
次要研究终点
·评估AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG对RULM不能走动受试者测量的运动功能的影响
·研究药物施用后整个52周中，将RULM评分与基线评分进行比较。
·在能走动的受试者中，评估AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG对通过6MWT测试和10米行走时间测量的运动功能的影响
·研究药物施用后整个52周中，将6MWT和10米行走时间与基线值进行比较。
探索性终点
·评估AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG对通过9孔钉测试(能走动和不能走动)和4阶梯攀爬测试(仅能走动)测量的运动功能的影响
·研究药物施用后整个52周中，将9孔钉测试和4阶梯攀爬测试评分与基线评分进行比较。
·评估产品对通过用力肺活量(FVC)、最大呼气压(MEP)、最大吸气压(MIP)测量的肺功能的影响
·尺侧和腓侧CMAP振幅距基线的变化
·PedQLVersion3.0多维疲劳量表，成人报告模块
·SMA-FRS(功能评定量表)
·CSF、血清和尿液中DNA和其他基于AAV的药物组分中载体的药代动力学
实施例13-制造
通过人HEK293细胞的三重质粒转染利用以下产生AAVhu68.SMN载体：1)载体基因组质粒，2)含有AAV rep2和cap hu68野生型(WT)基因的AAV辅助质粒，称为pAAVhu68.KanR，和3)称为pAdΔF6(Kan)的辅助腺病毒质粒。AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG包装载体基因组的大小为3257bp。
1.AAV载体基因组质粒：pENN.AAV.CB7.CI.hSMNco.rBG.KanR(p4342)
AAV-hSMN1载体基因组质粒pENN.AAV.CB7.CI.hSMN1co.rBG(p3246)的大小为6077bp。来源于该质粒的载体基因组是具有在hSMN1表达盒两侧的AAV2来源的ITR的单链DNA基因组。来自转基因盒的表达由CB7启动子驱动，CB7启动子是CMV立即早期增强子(C4)和鸡β肌动蛋白启动子之间的杂交体，而来自该启动子的转录通过CI的存在而增强。表达盒的聚腺苷酸信号是rBG聚腺苷酸。该质粒如下构建：通过密码子优化和合成hSMN1序列(GeneArt)，并将得到的构建体克隆到质粒pENN.AAV.CB7.CI.rBG(p1044)中，这是两侧为AAV2 ITR的含有CB7、CI和rBG表达元件的表达盒，以得到pAAV.CB7.CI.hSMN1co.rBG(p3246)。KanR质粒是pENN.AAV.C B7.CI.hSMN1co.rBG.KanR(p4342)。P4342通过在两个PacI位点将pAAV.CB7.CI.hSMN1co.rBG(p3246)中的氨苄青霉素抗性骨架替代为来自pENN.AAV.TBG.PI.hLDLr.rBG.KanR(p2017)的卡那霉素抗性骨架来构建。
序列元件的描述：
·ITR：AAV ITR(GenBank#NC001401)是两端相同但方向相反的序列。当AAV和腺病毒辅助功能以反式提供时，AAV2 ITR序列充当载体DNA复制的起点和载体基因组的包装信号两者。因此，ITR序列代表载体基因组复制和包装所需的唯一顺式序列。
·CMV立即早期增强子(382bp,GenBank#K03104.1)。
·鸡β-肌动蛋白启动子(282bp；GenBank#X00182.1)用于驱动高水平的hSMN1表达。
·鸡β-肌动蛋白内含子：来自鸡β-肌动蛋白基因的973bp内含子(GenBank#X00182.1)存在于载体表达盒中。内含子被转录，但通过剪接从成熟mRNA中除去，将其两侧的序列合并在一起。已经显示表达盒中内含子的存在有助于mRNA从细胞核转运至细胞质，从而增强稳定水平的用于翻译的mRNA的积累。
·编码序列：hSMN1序列：(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000344.3)经过密码子优化和合成。SMA由端粒基因SMN1的突变引起。SMN1中的突变导致对下运动神经元的选择性毒性，导致进行性神经元丢失和相关的肌肉无力和变性。转基因是SMN1，同种型D。同种型D编码最长的同种型，并且该变体被认为是CNS中的SMN1和遍在SMN1产生的主要转录物/同种型。
·多聚腺苷酸化信号：127bp兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号(GenBank#V00882.1)提供用于抗体mRNA的有效多聚腺苷酸化的顺式序列。该元件用作转录终止的信号，这是在新生转录物的3’末端的特异性切割事件和添加长聚腺苷酸尾。
2.AAVhu68辅助质粒：pAAV2/hu68n.KanR(p0068)
AAV2/hu68辅助质粒pAAV2/hu.68(Lot#p0065；7329bp)是AAV辅助质粒，其编码4个WT AAV2 rep蛋白和来自AAV血清型hu68的3个WT AAV VP衣壳蛋白。从人心脏组织DNA获得新的AAV序列并命名为AAV血清型hu68。为了产生嵌合包装构建体，去除含有野生型AAV2rep和AAV9 cap基因的质粒pAAV2/9n(p0061-2)的AAV2 cap基因，并用AAVhu68 cap基因质粒pAAV2/hu68(p0065)的片段替代。通常驱动rep表达的AAV p5启动子在该构建体中从rep的5’末端移动到cap的3’末端。该设置用于在启动子和rep基因(即质粒骨架)之间引入间隔区，下调rep的表达并提高支持载体产生的能力。pAAV2/9n中的质粒骨架来自pBluescriptKS。质粒的所有组成部分已通过直接测序验证。然后用卡那霉素抗性基因替代氨苄青霉素抗性基因，得到pAAV2/hu68n.KanR(p0068)。
3.pAdDeltaF6(Kan)腺病毒辅助质粒
质粒pAdDeltaF6(Kan)的大小为15,774bp。该质粒含有对AAV复制很重要的腺病毒基因组区域，即E2A、E4和VARNA(腺病毒E1功能由293细胞提供)，但不含其他腺病毒复制或结构基因。该质粒不含对复制重要的顺式元件，如腺病毒反向末端重复，因此预期不会产生感染性腺病毒。其来自E1、E3缺失的Ad5分子克隆(pBHG10，基于pBR322的质粒)。在Ad5 DNA中引入缺失以去除不必要的腺病毒基因的表达并将腺病毒DNA的量从32Kb减少至12kb。最后，用卡那霉素抗性基因替代氨苄青霉素抗性基因，得到pAdeltaF6(Kan)。保留在该质粒中的E2、E4和VAI腺病毒基因以及存在于HEK293细胞中的E1是AAV载体产生所必需的。
4.主细胞库
HEK293细胞最初是通过用剪切的腺病毒5型DNA转化HEK细胞产生的，如[GrahamFL,等人,(1977)Characteristics of a human cell line transformed by DNA fromhuman adenovirus type 5.J Gen Virol 36(1):59-74]所述。细胞表达高滴度rAAV产生所需的E1A和E1B基因产物。HEK293细胞是贴壁的并且是高度可转染的，在DNA质粒转染后产生高滴度的rAAV。通过将来自用于质粒DNA扩增的1L过夜细菌培养物中的1mL与等体积的无菌50％甘油混合来制备细菌主细胞库(Bacterial master cell bank，BMCB)甘油原液。从混合物制备每个构建体的BMCB甘油原液的两个0.5mL等分试样，并在-80℃下储存在Nalgene低温小瓶中。为了验证BMCB甘油原液，对扩增的质粒DNA进行内部结构分析，其涉及限制酶消化，然后进行凝胶电泳，并通过Qiagen的Sanger测序进行全质粒序列分析。为了制备用于运输到质粒DNA制造商(Puresyn Inc.)的细菌工作细胞库(bacterial working cellbank，BWCB)甘油原液等分试样，从BMCB甘油原液接种3mL培养物并生长过夜。如上所述，使用1mL过夜培养物制备BWCB甘油原液等分试样。
5.制造过程概述
AAVhu68.CB7.CI.hSMN1co.rBG载体生产过程在图15A-15B的制造过程流程图中示出。进入产品制备的主要试剂显示在图的左侧，过程中质量评估显示在图的右侧。还提供了每个生产和纯化步骤的描述。除非另有说明，否则产品制造遵循单元操作的线性流动并利用一次性封闭式生物处理系统。涉及从细胞接种到上清液收集的细胞培养的生产过程的所有步骤均使用无菌的一次性管和袋组件无菌地进行。细胞在10-layer (CS-10)和HS-36以及所有开放操作中培养。在可能的情况下，在封闭系统中进行纯化过程；然而，柱色谱操作被认为是清洁操作而不被视为完全封闭的系统。
6.制造过程的描述
a.细胞接种
将合格的HEK293细胞系用于生产过程。在Charles River实验室从5.2.6中描述的MCB-2生产WCB，并在IND提交中进行表征。用于载体生产的细胞培养将从单个解冻的WCB小瓶开始，并根据Master Batch Record Document(MBR)进行扩增。使用Corning T-烧瓶和CS-10将细胞扩增至5×109至5×1010个细胞，其允许产生足够的细胞质量用于接种多达48HS-36用于每批BDS的载体生产。将细胞培养在由Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)组成的培养基中，所述培养基补充有10％γ辐射的源自US或源自NZ的胎牛血清(FBS)。细胞依赖于锚定，并且使用TrypLETM Select(无动物产物的细胞解离试剂)完成细胞解离。使用无菌的一次性生物过程袋和管套完成细胞接种。将细胞维持在37℃(±2℃)、5％(±0.5％)CO2气氛中。
b.瞬时转染
在生长(DMEM培养基+10％FBS)约3天后，将HS-36细胞培养基替换为新鲜的无血清DMEM培养基，并使用基于优化的聚乙烯亚胺(PEI)的转染方法用3种生产质粒转染。在BSC中制备足够的质粒DNA转染复合物以转染48 HS 36(每批BDS)。最初，制备含有0.1:1:2比率的顺式(载体基因组)质粒、反式(衣壳和rep基因)质粒和辅助(Ad)质粒以及GMP级PEI(PEIPro,PolyPlus Transfection SA)的DNA/PEI混合物。在小规模优化研究中确定了该质粒比率对于AAV生产是最佳的。充分混合后，将溶液在室温下静置25分钟，然后添加到无血清培养基中以淬灭反应，最后添加到HS-36中。将转染混合物在HS-36的所有36层之间平衡，并将细胞在37℃(±2℃)、5％(±0.5％)CO2气氛中孵育5天。
c.细胞培养基收获
使用一次性生物过程袋通过无菌方式从单元中排出培养基来从每个HS-36收获转染的细胞和培养基。收获培养基后，向约200升体积补充MgCl2至终浓度为2mM(Benzonase的辅因子)，并添加Benzonase核酸酶至终浓度为25单位/mL。将产物(在一次性生物过程袋中)在37℃下在培养箱中孵育2小时，以提供足够的时间酶促消化由于转染过程而存在于收获物中的残留细胞和质粒DNA。执行该步骤以使最终载体DP中残留DNA的量最小化。孵育后，添加NaCl至终浓度为500mM，以帮助在过滤和下游切向流过滤期间回收产物。
d.澄清化
使用深度过滤器胶囊(depth filter capsule)(1.2/0.22μm)将细胞和细胞碎片从产品中除去，所述深度过滤器胶囊串联连接为由蠕动泵驱动的无菌封闭管和袋组。澄清化确保了下游过滤器和色谱柱免受污染，并且生物负载减少过滤确保了在过滤器序列结束时，在下游纯化之前除去在上游生产过程中可能引入的任何生物负载。收获材料将通过Sartorius Sartoguard PES胶囊过滤器(1.2/0.22μm)(Sartorius Stedim BiotechInc.)。
e.大规模切向流过滤
使用定制的无菌、封闭的生物处理管、袋和膜组通过切向流过滤(TFF)实现澄清产品的体积减少(10倍)。TFF的原理是在与适当孔隙率(100kDa)的膜平行的压力下流动溶液。压差驱动较小尺寸的分子通过膜并有效地进入废物流，而保留大于膜孔的分子。通过使溶液再循环，平行流清扫膜表面，防止膜孔结垢和通过与膜结合的产物损失。通过选择合适的膜孔径和表面积，可以快速减少液体样品的体积，同时保留和浓缩期望的分子。TFF应用中的渗滤包括以与液体通过膜和废物流相同的速率向再循环样品中添加新鲜缓冲液。随着渗滤体积的增加，从再循环样品中除去增加量的小分子。这导致澄清产物的适度纯化，但也实现与随后的亲和柱色谱步骤相容的缓冲液交换。因此，我们利用100kDa的PES膜进行浓缩，然后用最少4倍体积的由20mM Tris pH 7.5和400mM NaCl组成的缓冲液渗滤。将渗滤的产物在4℃下储存过夜，然后用1.2/0.22μm深度过滤器胶囊进一步澄清化，以除去任何沉淀的物质。
f.亲和色谱
将渗滤产物施加到有效捕获AAVhu68血清型的Poros TM Capture SelectTM AAV9亲和树脂(Life Technologies)。在这些离子条件下，显著百分比的残留细胞DNA和蛋白质流过柱，而AAV颗粒被有效捕获。在施加后，用5体积的低盐Benzonase溶液(2500U/mLBenzonase，20mM Tris pH 7.5和40mM NaCl，1.5mM MgCl2)处理柱，以除去任何残余的宿主细胞和质粒核酸。洗涤柱以除去额外的进料杂质，然后进行低pH分步洗脱(400mM NaCl，20mM柠檬酸钠，pH2.5)，将其通过收集到1/10体积的中和缓冲液(200mM Bis Tris丙烷,pH10.2)中立即中和。
g.阴离子交换色谱
为了进一步减少过程中杂质(包括空AAV颗粒)，将Poros-AAV9洗脱合并物(pool)稀释50倍(20mM Bis Tris丙烷,0.001％Pluronic F68,pH 10.2)以降低离子强度并使其能够与CIMultusTM QA monolith matrix(BIA Separations)结合。在低盐洗涤后，使用60柱体积(CV)的NaCl线性盐梯度(10-180mM NaCl)洗脱载体产物。该低盐梯度有效地将不含载体基因组的衣壳颗粒(空颗粒)与含有载体基因组的颗粒(完整颗粒)分离，并得到富含完整衣壳的制备物。将级分收集到含有1/100体积的0.1％pluronic F68和1/27体积的Bis TrispH 6.3的管中，以分别使与管的非特异性结合和暴露于高pH的长度最小化。将合并的完整颗粒峰级分在20mM Bis Tris丙烷、0.001％Pluronic F68 pH 10.2中稀释20倍，并重新施加到已经原位清洗的相同柱上。重新施加10-180mM NaCl盐梯度并收集适当的完整颗粒峰级分。评估峰面积并与先前的数据进行比较以确定近似的载体产量。
h.最终制剂和生物负荷减少过滤以产生BDS
使用TFF来利用100kDa膜在合并的阴离子交换(AEX)级分上实现最终制剂。这将通过最终制剂缓冲液的渗滤来完成，并浓缩以产生期望目标浓度的BDS。将样品取出用于BDS测试(在下面的部分中描述)。将BDS无菌过滤(0.22μm)，储存在无菌聚丙烯管中，并在隔离位置在≤-60℃下冷冻，直至释放用于最终填充。
i.最终填充
将冷冻的BDS解冻，合并，并使用最终制剂缓冲液调节至目标浓度(稀释或通过TFF的浓缩步骤)。然后将产物通过0.22μm过滤器进行最终过滤，并以确定的填充体积填充到具有卷边密封的无菌West Pharmaceutical’s Crystal Zenith(聚合物)小瓶和塞子中。将样品瓶根据以下规格单独标记。标记的小瓶储存在≤-60℃。
j.载体基因组鉴定：DNA和NGS测序
分离病毒载体基因组DNA，并使用引物步移(primer walking)通过2倍测序覆盖确定序列。进行序列比对并与预期序列比较。在某些实施方案中，例如使用机器进行下一代测序(也称为高通量测序)。
k.载体衣壳鉴定：VP1的AAV衣壳质谱
通过基于AAV衣壳蛋白的肽分析开发的测定来实现载体的AAVhu68血清型的确认。该方法包括VP的胰蛋白酶消化，然后在Q-Exactive Orbitrap质谱仪上进行串联质谱表征，以对衣壳蛋白肽进行测序。来自测序的串联质谱的谱库和靶向质谱法用于测定可以唯一地鉴定特定AAV病毒颗粒血清型的特征肽。针对通过消化测试品产生的串联质谱筛选8种AAV(AAVhu68、AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVhu37)特异性的一组特征肽。对于阳性鉴定，仅检测来自单一血清型的特征肽。
l.基因组拷贝滴度
最近开发了一种用于确定AAV载体的GC滴度的基于数字液滴聚合酶链式反应(ddPCR)的技术[Lock M,Alvira MR,Chen SJ,&Wilson JM(2014)Absolute determinationof single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vectorgenome titers by droplet digital PCR.Hum Gene Ther Methods 25(2):115-125.]。该方法是实用的，报告与qPCR相当或更好的滴度，并且不需要质粒标准曲线。所用的测定包括用DNA酶I消化，然后进行数字PCR分析以测量包封的载体基因组拷贝。使用靶向聚腺苷酸区的序列特异性引物和与该相同区域杂交的荧光标记探针的组合实现DNA检测。许多标准、验证样品和对照(用于背景和DNA污染)已引入测定中。
m.感染单位滴度
感染单位(IU)测定用于确定RC32细胞(表达rep2的HeLa细胞)中rAAV载体的生产性摄取和复制。已采用与先前公布的类似的96孔终点格式(96-well end-point format)。简单地说，通过rAAV BDS的连续稀释液和Ad5的均匀稀释液共同感染RC32细胞，rAAV的每个稀释度12个重复。感染后72小时，裂解细胞，并进行qPCR以检测相对于输入的rAAV载体扩增。进行终点稀释50％组织培养感染剂量(TCID50)计算(Spearman-Karber)以确定以IU/mL表示的复制滴度。由于“感染性”值取决于与细胞接触的颗粒、受体结合、内化、向细胞核的转运和基因组复制，因此它们受到测定几何结构以及所用细胞系中合适受体和结合后途径的存在的影响。在永生化细胞系中受体和结合后途径通常不维持，因此感染性测定滴度不是存在的“感染性”颗粒数量的绝对量度。然而，衣壳化GC与“感染单位”的比率(描述为GC/IU比率)可用作衡量批次之间产品一致性的指标。
n.空颗粒与完整颗粒比率
在分析超速离心机(AUC)中测量的沉降速度可以检测聚集体、其他次要组分以及基于其不同沉降系数提供不同颗粒物质的相对量的良好定量。这是基于长度和时间的基本单位的绝对方法，不需要标准分子作为参考。将载体样品加载到具有12mm光程长度的2通道炭-epon中心片的池中。将提供的稀释缓冲液加载到每个池的参考通道中。然后将加载的池置于AN-60Ti分析转子中并装入配有吸光度和RI检测器的Beckman-Coulter ProteomeLabXL-I分析超速离心机中。在20℃下完全温度平衡后，使转子达到12,000rpm的最终运行速度。大约每3分钟记录280nm扫描的吸光度，持续约5.5小时(每个样品扫描总共110次)。使用c方法分析原始数据，并在分析程序SEDFIT中实施。绘制得到的尺寸分布并对峰值积分。与每个峰相关联的百分比值表示在所有峰下的总面积的峰面积分数，并且基于在280nm处产生的原始数据；许多实验室使用这些值来计算空颗粒:完整颗粒比率。然而，因为空颗粒和完整颗粒在该波长处具有不同的消光系数，所以可以相应地调整原始数据。消光系数调整之前和之后的空颗粒与完整单体峰值的比率用于确定空颗粒-完整颗粒比率，并且两种比率记录在分析证书上。
o.宿主细胞DNA
使用qPCR测定检测残留的人293 DNA。在用“非相关DNA”掺入后，从约1mL产物中提取总DNA(非相关、载体和残留基因组)。使用靶向18S rDNA基因的qPCR定量宿主细胞DNA。基于掺入的非相关DNA的回收，将检测到的DNA量归一化。测试三种不同的扩增子大小以确定残留宿主细胞DNA的大小谱。
p.宿主细胞蛋白
进行ELISA以测量污染的宿主HEK293细胞蛋白的水平。根据供应商提供的说明书使用Cygnus Technologies HEK293 Host Cell Proteins 2nd Generation ELISA试剂盒。
q.能复制的AAV测定
分析样品中是否存在可能在生产过程中潜在出现的能复制的AAV2/hu68(rcAAV)。已经开发了由以下组成的3代测定法(3-passage assay)：基于细胞的扩增和传代，然后通过实时qPCR(caphu68靶标)检测rcAAV DNA。基于细胞的组分由以下组成：用测试样品和WT人腺病毒5型(Ad5)的稀释液接种单层HEK293细胞(P1)。测试产品的最大量为1×1010GC的载体产品。由于腺病毒的存在，rcAAV将在细胞培养物中扩增。2天后，产生细胞裂解物并且将Ad5加热灭活。然后将澄清的裂解物传递到第二轮细胞(P2)上以增强灵敏度(再次在Ad5存在下)。2天后，产生细胞裂解物并且将Ad5加热灭活。然后将澄清的裂解物传递到第三轮细胞(P3)上以使灵敏度最大化(再次在Ad5存在下)。2天后，裂解细胞以释放DNA，然后对其进行qPCR以检测AAVhu68 cap序列。AAVhu68 cap序列以Ad5依赖性方式扩增表明存在rcAAV。使用含有AAV2 rep和AAVhu68 cap基因的AAV2/hu68代表阳性对照，可以确定检测限(limitof detection，LOD)(0.1、1、10和100IU)并且使用rAAV的连续稀释液(1×1010、1×109、1×108和1×107GC)可以定量测试样品中存在的rcAAV的近似水平。
r.体外效力
为了将qPCR GC滴度与基因表达相关联，进行体外生物测定。简单地说，将细胞接种在96孔板中的每个孔中，并在37℃/5％CO2下孵育过夜。第二天，用连续稀释的AAV载体感染细胞，并在37℃/5％CO2下孵育两天。然后将细胞用4％多聚甲醛固定，然后用含有0.1％Triton-100的PBS洗涤，然后用封闭缓冲液孵育。封闭后，将细胞与1:200稀释的一抗(GenTex monoclonal α-Smn1,CAT#GTX60451)一起孵育，洗涤，并与1:500α-小鼠-488(Thermo Fisher)一起孵育。在成像之前，用含有DAPI的PBS处理细胞以显现细胞核。使用CellInsight Cx5 high content imager(Thermo Fisher)对板进行成像。用当前的数据捕获方法筛选每孔2,500个目标(即细胞)，并使用修改的SpotID方案计算每个核的Gemini ofCajal体的数目。核Gemini of Cajal体形成依赖于功能性Smn1蛋白。Log Vector MOI绘制在x轴上，而仪器读数绘制在y轴上。进行测定优化。
s.总蛋白质、衣壳蛋白、蛋白质纯度和衣壳蛋白比率
首先使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)测定法相对于牛血清白蛋白(BSA)蛋白质标准曲线来量化载体样品的总蛋白质。通过将等份的样品与试剂盒中提供的Micro-BCA试剂混合来进行测定。将相同的程序应用于BSA标准品的稀释液。将混合物在60℃孵育并在562nm处测量吸光度。使用4-参数拟合从已知浓度的标准吸光度产生标准曲线。根据4参数回归量化未知样品。为了提供rAAV纯度的半定量测定，将样品的基因组滴度进行归一化，并在还原条件下在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上分离5×109GC。然后将凝胶用SYPRO Ruby染料染色。通过光密度测定法(densitometry)量化任何杂质带。除了3种AAV特异性蛋白质VP1、VP2和VP3之外出现的染色条带被认为是蛋白质杂质。报道了杂质质量百分比以及污染物带的近似分子量。SDS-PAGE凝胶也将用于定量VP1、VP2和VP3蛋白并确定其比率。
t.BSA蛋白质
使用从Bethyl Laboratories获得的牛白蛋白ELISA试剂盒，根据测定试剂盒提供的方案进行该测定。
u.Benzonase核酸内切酶
在生产过程中使用Benzonase降解核酸以促进载体纯化，因此代表过程杂质。使用商业ELISA(Millipore)测量残留的benzonase的浓度。由于benzonase的量可能是微量的(如果有的话)，因此必须使用包括浓度<1ng/mL的一系列标准进行ELISA。
v.GC与IU的比率
GC/IU比率是产品一致性的量度。将ddPCR滴度(GC/mL)除以“感染单位(IU/mL)”，得到计算的GC/IU比率。
w.摩尔渗透压浓度、pH值和外观测试
分别根据USP<785>和USP<791>测定摩尔渗透压浓度和pH。通过肉眼检查透明度、颜色和外来颗粒的存在/不存在来确定产品的外观。对产品进行白色和黑色背景检查。
实施例14-高剂量静脉内施用表达人SMN的AAV载体后非人灵长类动物和仔猪中的严重毒性
已经证明，当以高剂量静脉内施用时，亲神经AAV血清型(例如AAV9)转导脊髓α运动神经元。该观察结果导致最近成功应用静脉内AAV9递送治疗患有脊髓性肌萎缩的婴儿，这是一种以下运动神经元的选择性死亡为特征的运动神经元生存(SMN)蛋白的遗传缺陷。
为了评估使用这种方法的运动神经元转导的效率，以与SMA临床试验中使用的类似剂量用携带人SMN转基因的AAV载体的静脉注射治疗三只幼年非人灵长类动物(NHP；13-14月龄)和三只新生仔猪(7-30日龄)，该转基因与携带人SMN表达盒的AAV血清型9(AAVhu68)密切相关。评估动物的脊髓运动神经元的转导以及毒性的迹象。每千克体重施用2x1014个基因组拷贝导致两个物种中脊髓运动神经元的广泛转导。然而，NHP和仔猪都发生严重毒性。所有三只NHP均显示出显著的转氨酶升高，并且在注射后5天对具有急性肝衰竭和休克的临床和组织学迹象的一只动物实施安乐死。还观察到背根神经节(DRG)感觉神经元的变性，尽管NHP没有表现出临床上明显的感觉缺陷。在NHP中的临床发现与针对载体衣壳或转基因产物的T细胞应答之间没有相关性。仔猪没有表现出肝毒性的迹象，但是在载体注射后14天内，所有三只动物都表现出本体感觉缺陷和共济失调，这严重影响了行走并且需要安乐死。与NHP中观察到的相比，这些临床发现与更严重的DRG感觉神经元病变相关。这些物种中的肝脏和感觉神经元发现似乎是AAV转导的直接后果，而不依赖于对衣壳或转基因产物的免疫应答。涉及高度全身暴露于AAV载体的临床前和临床研究应包括对类似毒性的幼仔细监测。
A.结果：
1.非人灵长类研究：
向三只13-14月龄的恒河猴施用静脉内(IV)剂量的2x1014GC/kg的在鸡β肌动蛋白启动子的控制下并利用巨细胞病毒立即早期增强子表达人SMN的AAVhu68载体(表1)。
表1.实施例14中包含的用AAVhu68.CB7.hSMN1处理的恒河猴
所有动物在载体输注期间表现出稳定的生命体征，并且从麻醉中恢复良好。在研究第5天，动物16C176变得急剧无响应。体格检查显示苍白的粘膜，体重从载体施用时减少约15％，肝肿大和可触及的腹部液体波。血液检查(bloodwork)异常包括22％的细胞压积(packed cell volume)，<20mg/dL的葡萄糖，75mg/dL的BUN和2mg/dL的肌酸酐。该动物的状况迅速下降，随后被安乐死。进行了完整的尸检。
在安乐死时收集血液并进行全血清化学组。显著的发现包括低蛋白血症，显著升高的肝酶(AST、ALT、GGTP、ALP)，高胆红素血症，升高的血尿素氮(BUN)，升高的BUN/肌酐比率，高磷血症，低血糖，低钙血症，低氯血症，低胆固醇血症，高甘油三酯血症和升高的肌酐磷酸激酶(CPK)(图16A-16E)。这些发现提示可能继发于低灌注的肝功能衰竭伴肾功能不全。在尸检时收集的样本严重溶血，因此没有报告全血细胞计数(CBC)和凝血组。
在尸检时，腹腔含有约44mL的红色血清血液。腹腔液的细胞学评估与急性出血的渗出液一致。肝脏弥漫性增大、结实和斑杂的棕褐色至红色，这在组织学上对应于大量肝细胞坏死和变性，影响约95％的肝实质，仅剩下稀少的相对正常的肝细胞簇(图17A-17D)。小叶中心(centrilobular)到中间区域(midzonal region)严重充血，并具有肝细胞丢失、变性和坏死。此外，还有纤维蛋白的小病灶，其偶尔在血窦内形成栓塞并填充门静脉腔(急性纤维蛋白血栓)。
纤维蛋白原的免疫组织化学(IHC)证实存在窦状纤维蛋白栓。纤维蛋白原染色在门静脉至中间区域内呈强阳性，这是存活的肝实质中的肝细胞坏死区域。纤维蛋白原染色频繁突出这些区域的血窦。坏死的肝细胞和相关的碎片也是强阳性的。
脾脏弥漫性增大、结实且充血。组织学证实了充血，并且白髓内的生发中心耗尽了淋巴细胞，具有广泛细胞碎片(淋巴细胞溶解)，并且具有突出的、偶尔透明的高内皮微静脉(HEV)。类似地，胸腺的皮质表现出轻微的淋巴细胞溶解，具有突出的可染小体(tingiblebody)巨噬细胞。
总的来说，肠系膜淋巴结弥漫性扩张和充血。组织学上，滤泡(follicle)表现出生发中心消耗和淋巴细胞溶解。在其他淋巴组织中观察到类似的组织学发现，包括其他淋巴结(下颌下、直肠)、肺中的支气管相关淋巴组织(BALT)以及结肠和盲肠中的肠相关淋巴组织(GALT)。与直肠相关的淋巴结(假定为直肠系膜淋巴结)具有包膜下和髓质窦红细胞增多症，与红细胞排出一致。淋巴滤泡内的组织学发现提示严重的全身应激。
在组织学上，在肺部、胆囊外膜、心脏、直肠周围脂肪组织和乳腺附近的皮下组织中急性出血和水肿是明显的。小肠、盲肠和直肠的浅表粘膜充血，偶有出血以及含有含铁血黄素的巨噬细胞的表面聚集物。肺、胃肠道和肝脏中出血和水肿的存在提示休克，因为这些是非人灵长类动物中已知的休克器官。观察到胰腺中的腺泡细胞变性，其也已报道在非人灵长类动物的休克病例中((Khan,N.A.,等人Mitigation of septic shock in mice andrhesus monkeys by human chorionic gonadotrophin-relatedoligopeptides.Clinical and Experimental Immunology 160,466-478(2010))。在肾上腺的束状带中存在最小的肾上腺皮质单细胞变性和坏死，也可能归因于全身性疾病，例如全身性应激、缺血、出血和炎症。在该动物的脑、脊髓、颅神经和外周神经中未注意到严重或组织学发现。在肾脏中未观察到显著的发现。
其余两只灵长类动物(16C116和16C215)在整个研究中临床正常，并按照计划在第28天进行尸检。整个研究中在特定时间点进行的血液检查显示第5天转氨酶急剧升高，其到第7天降低，并到第14天正常化(图16A-16E)。其余两只灵长类动物中的一只在第5天表现出短暂的血小板减少(血小板计数24,000/μL)；由于凝血，另一只动物中的血小板无法量化，但外周涂片上的数量似乎正常。在整个研究过程中，血液检查在其他方面是正常的。在尸检时，一只动物(16C116)的肝脏为斑杂的褐色至红色，并且具有加重的小叶图案；在这两种灵长类动物中都没有观察到其他明显的异常。
在组织学上，两种灵长类动物的肝脏表现出最小的多灶性单肝细胞坏死，其在门静脉区域中最突出(图17A-17D)。另外，动物16C215具有不规则排列的肝细胞的多焦点聚集体，具有细胞质嗜碱性细胞增多(cytoplasmic basophilia)、囊泡核和偶尔的有丝分裂特征，指示再生。这些肝细胞簇通常包围门静脉区域，其中散布有单核细胞浸润和增殖的成纤维细胞(纤维组织增生)。
在神经系统中，主要在脊髓、三叉神经节和背根神经节以及外周神经(包括正中神经、桡神经、坐骨神经、胫神经和腓神经)中，观察到了两只最后尸检的灵长类动物(16C215和16C116)中的组织学发现(图18A-18D，表2-4)。中枢和外周神经系统内的组织学损伤通常是变化的，相同动物中的脊髓和周围神经的相同段内的组织切片之间以及段之间存在严重差异。背根神经节(DRG)表现出最小至轻度的神经元细胞体变性，其特征在于中心尼氏体溶解(chromatolysis)以及周围的单核细胞浸润(卫星状态)和浸润神经元细胞体(噬神经细胞现象)。基于免疫组织化学(IHC)，单核细胞浸润由CD3阳性T细胞和少量CD20阳性B细胞组成。在两只灵长类动物中，颈部、胸部和腰部脊髓的背部白质束表现出双侧最小至中度的轴突病变，其特征在于扩张的髓鞘，具有和不具有指示轴突变性的骨髓巨噬细胞。偶尔，在脊髓的背神经根中观察到最小至显著的轴突病变。周围神经(正中神经、桡神经、坐骨神经、胫神经和腓神经)表现出类似的轴突病变，其范围从轻微到明显，伴随可变的单核细胞浸润和轴突周纤维化(periaxonal fibrosis)。双侧观察到周围轴突病变；然而，切片之间甚至某些神经切片内的严重程度不同。
表2.静脉内接受表达人SMN的AAVhu68的婴儿非人灵长类动物和仔猪的脊髓背侧白质束中的轴突病变的发生率和严重性。排除在第5天进行尸检的NHP，脊髓背侧轴突病变的发生率和严重程度在NHP和仔猪之间相对相似。
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*表示未预先安排的尸检动物16C176(第5天)
表3.静脉内接受表达人SMN的AAVhu68的婴儿非人灵长类动物和仔猪的背根神经节和三叉神经节的神经元变性的发生率和严重性。排除在第5天尸检的NHP，NHP和仔猪之间神经细胞体变性的发生率相似；然而，与NHP相比，仔猪的严重程度略有增加。
/>
*表示未预先安排的尸检动物16C176(第5天)
表4.静脉内接受表达人SMN的AAVhu68的婴儿非人灵长类动物和仔猪的外周神经的轴突病变的发生率和严重性。排除第5天尸检的NHP，NHP和仔猪的外周轴突病变发生率相似；然而，与仔猪相比，NHP的严重程度略有增加。
/>
*表示未安排的尸检动物16C176(第5天)
载体生物分布的分析证明了基因转移到评估的所有组织，包括脑和脊髓(图19)。值得注意的是，背根神经节(DRG)被大量靶向，在许多样品中每个细胞具有超过10个载体基因组。也显示出极高的肝转导，每个细胞具有超过1000个载体基因组拷贝(GC)。与在28天尸检的那些相比，在第5天尸检的动物中检测到更高水平的载体基因组拷贝，这表明注射后早期在组织中检测到的一些载体基因组不代表稳定的转导。
通过原位杂交评估SMN表达(图20A-20G)。在第5天尸检的动物的肝脏中存在显著的人SMN mRNA表达，但在脊髓或脑中没有可检测的表达。在载体注射后28天进行尸检的两只动物在脊髓运动神经元中表现出强烈的SMN表达，在评估的每个脊髓水平具有平均约30-90％的转导细胞。在脑中也存在转导神经元和室管膜细胞的分散片区。
通过干扰素γELISPOT评估对载体衣壳和人SMN转基因产物的T细胞应答(表5)。在载体施用前和所有三只动物尸检时收集外周血单核细胞用于ELISPOT分析。在尸检时还从肝脏收获单核细胞。所有样品对用PHA的阳性对照刺激表现出强烈的干扰素γ应答，除了从动物16C215收集的肝淋巴细胞外，其对PHA刺激没有应答，并且被排除在随后的分析之外。对于动物16C176或16C215，在任一时间点都未检测到针对AAVhu68衣壳或hSMN的T细胞应答。动物16C116在任一时间点在PBMC中均未表现出T细胞应答，但在尸检时对载体衣壳和转基因产物两者具有可检测的干扰素γ应答。
表5.外周血和肝淋巴细胞中针对AAVhu68衣壳和hSMN转基因的T细胞应答的IFNγELISPOT检测。针对包含AAVhu68 VP1序列(3个肽合并物)或人SMN序列(2个肽合并物)的合并的重叠15聚体肽测量T细胞应答。值表示为每百万PBMC的点形成单位(spot formingunit，SFU)。星号表示可检测T细胞应答(>50SFU和比未刺激的对照高3倍)。从16C215分离的肝淋巴细胞表现出对PHA刺激的不充分应答，并且被排除在分析之外。PHA：植物血凝素(phytohemaglutinin)，TNTC：数不胜数。
2.仔猪研究
向3只微型尤卡坦仔猪(micro Yucatan piglet)在7日龄(n＝1；仔猪A)或30日龄(n＝2；仔猪B和C)时施用2x1014GC/kg静脉内剂量的AAVhu68.hSMN(表6)。所有动物在载体给药后均恢复良好。在载体施用后研究第14天，仔猪A患上了后肢共济失调。共济失调的特征是摇摆的步态，并且后肢具有间歇性的屈曲(knuckling)和交叉。当后足被放置在其背面时，仔猪不能校正蹄的位置(放置测试)，表明意识本体感觉缺陷。这种共济失调在6小时内进展到前肢。这头仔猪还出现呼吸困难，但所有肺野的听诊都在正常范围内。鉴于临床症状的进展，在载体施用后第14天对仔猪实施安乐死并进行完全尸检。
表6.本研究中包括的用AAVhu68.CB7.hSMN1处理的微型尤卡坦小猪
动物ID 龄(天) 体重(kg) 剂量 施用途径
仔猪A 7 1.56 2x1014GC/kg IV
仔猪B 30 3.35 2x1014GC/kg IV
仔猪C 30 4.30 2x1014GC/kg IV
在载体施用后第13天，在30日龄时注射的仔猪产生类似的神经系统体征，尽管较不严重。在这些动物中未观察到呼吸困难。对仔猪实施安乐死，并进行全面尸检。
在任一龄组的仔猪中均未观察到显著的严重异常。7日龄注射的仔猪在尸检时营养状况为正常至差，并且在研究第7天具有腹泻的临床病史，其在用肌肉内(IM)头孢噻呋治疗后的研究第9天消退。30日龄注射的仔猪营养状况良好。在7日龄注射仔猪(仔猪A)的安乐死之前采集的血液的全血细胞计数(CBC)显示出显著的中性白细胞增多(22,468/μL；参考范围：2,300-11,900/μl)。血液检查中没有注意到其他显著异常。中性白细胞增多可能与细菌性支气管肺炎的组织学证据相对应。在30日龄注射的仔猪中没有发现明显的血液检查异常。
来自所有动物的颈部、胸部和腰部背根神经节(DRG)表现出具有单核细胞浸润的轻度至显著的神经元细胞体变性(图21A-21D，表2-4)。神经元变性的组织学病变为从具有明亮的嗜酸性细胞质小球(eosinophilic cytoplasmic globule)和中心尼氏体溶解的细胞质嗜酸性粒细胞增多(cytoplasmic eosinophilia)到被浸润的单核细胞完全消除(噬神经细胞现象)。类似的，虽然不太严重，但在所有动物的三叉神经节中也观察到从最小到中等的病变。在所有仔猪中，颈部、胸部和腰部脊髓的背部白质束表现出轻度至中度的轴突病变，其特征在于具有和不具有骨髓巨噬细胞的扩张的髓鞘，与轴突变性一致。所有动物的这些病变的发生率相同；然而，在一只30日龄注射仔猪(仔猪C)中的严重程度略有下降。
在7日龄注射的仔猪(仔猪A)中，周围神经(正中神经、桡神经、坐骨神经、胫神经和腓神经)包含与脊髓相似的轴突病变，其范围从轻度到严重的双侧。有趣的是，后肢周围神经中的轴突病变(中度至显著)比前肢(轻度)更严重。在30日龄注射的仔猪中，仅1只动物(仔猪B)在大多数神经(除了腓神经外)中具有最小的外周轴突病变。另一只30日龄注射仔猪(仔猪C)的外周神经在组织学上不显著。中枢和外周神经系统内的组织学病变通常是可变的，在同一动物的组织切片之间和组织内以及脊髓的不同区段之间的严重程度通常不同。在大脑或肝脏中未发现组织学异常。
通常来说，与7日龄注射的仔猪相比，30日龄注射仔猪的周围神经病变的发生率和严重程度降低，这与在较老的动物中观察到的不太严重的死前神经系统体征一致。此外，在一只30日龄注射仔猪(仔猪C)中脊髓损伤的严重程度和周围神经损伤的发生率最低，其在两个龄组中仔猪中也具有最不严重的神经病体征。
在分析的所有组织(包括脑和脊髓)中都可检测到载体基因组(图22)。到DRG的基因转移通常高于到脊髓的基因转移，通常每个宿主二倍体基因组(dg)具有多于1个载体GC。在肝脏中发现最高的载体基因组拷贝数，在来自所有三只动物的肝脏样品中具有约200GC/dg。注射年龄对所评估的组织的基因转移效率没有明显的影响。
通过所有三只动物的整个脊髓的运动神经元中的ISH检测人SMN mRNA的表达(图23A-23)。在所有动物中大多数运动神经元似乎被转导，在7日龄和30日龄仔猪之间的转导没有明显差异。
B.讨论：
在该实施例中，以高剂量静脉内施用表达人SMN的AAV载体导致仔猪和幼年NHP的意外毒性。肝毒性仅限于NHP，而感觉神经元变性发生在两个物种中。用相同载体剂量处理的仔猪的肝脏基因转移低约5倍，表明该物种中AAV的较低肝脏向性可以解释不存在NHP中观察到的肝脏毒性。所有三只NHP在载体施用后均发生肝酶和胆红素的快速升高。具有最显著的转氨酶升高的动物也表现出凝血病的迹象，肝脏中广泛的纤维蛋白沉积、广泛的出血和明显的自发性腹腔积液，尽管在尸检时不能进行凝血研究，限制了对这些发现的解释。与广泛出血相关的肝脏中纤维蛋白沉积的存在提示弥散性血管内凝血(DIC)。然而，肝脏外未发现纤维蛋白沉积，这与真正的DIC不一致。该发现似乎与由对乙酰氨基酚毒性引起的急性肝衰竭中描述的那些相似，其特征在于导致肝内凝血的肝脏中的快速肝细胞变性和组织因子呈现。参见，例如，Ganey,P.E.,等人Role of the coagulation system inacetaminophen-induced hepatotoxicity in mice.Hepatology 46,1177-1186(2007)；Kerr,R.New insights into haemostasis in liver failure.Blood coagulation&fibrinolysis:an international journal in haemostasis and thrombosis 14Suppl1,S43-45(2003)；Payen,C.,Dachraoui,A.,Pulce,C.&Descotes,J.Prothrombintime prolongation in paracetamol poisoning:a relevant marker of hepaticfailure？Human&experimental toxicology 22,617-621(2003)；和James,L.P.,Wells,E.,Beard,R.H.&Farrar,H.C.Predictors of outcome after acetaminophen poisoning inchildren and adolescents.The Journal of pediatrics 140,522-526(2002)。这通常与凝血病相关，凝血病可能与由肝内凝血引起的凝血因子消耗、由于肝衰竭引起的凝血因子合成减少或这些的组合有关。参见上面引用的Ganey等人,2007和Kerr,2003。在第5天一只动物的短暂性血小板减少也可能与肝内凝血有关。另一种可能的解释可能是高剂量AAV激活全身性炎症应答，以及作为继发性后果的血小板活化、血管内凝血、休克和肝功能病症。进行调查以确定肝损伤是该级联的初始原因还是继发性后果，因为在前一种情况下减少AAV载体的肝向性的尝试可能是有益的，但在后者中则不是。该实施例中没有足够的数据来区分这些可能性，并且正在研究其他研究以充分阐明在高度全身暴露于AAV载体后肝毒性的病理生理学。
尽管在一些研究中已注意到DRG的强烈趋向性，但尚未报道AAV施用后的DRG变性。参见，例如，Gray,S.J.,Kalburgi,S.N.,McCown,T.J.&Samulski,R.J.Global CNS genedelivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAVadministration in non-human primates.Gene therapy 20,450-459(2013)。在本实施例中观察到的病变由DRG感觉神经元细胞体以及其中枢和外周轴突的变性组成。这些病变可能在基因转移后超过5天出现，因为其在处理后5天处死的NHP中不存在，并且在载体施用后13-14天在仔猪中首次出现临床体征。DRG病变在猪中比NHP稍微更严重，而与NHP相比，猪中脊髓和周围神经中感觉轴突的变性相似甚至更轻，这一观察结果可以通过猪中较早的尸检时间点来解释，其可能不允许与垂死细胞相关的所有轴突的变性。在猪中出现感染缺陷，但在NHP中没有，这表明NHP中DRG病变的程度低于出现临床体征的阈值。在任一物种中受影响的感觉纤维的类型未被表征。根据在仔猪中注意到的缺陷，本体感觉似乎受到影响；对其他感觉纤维的影响尚不清楚，并在随后的研究中进一步表征。
在评估异种人转基因向动物模型的递送的任何研究中，或在用于隐性疾病的基因疗法的临床研究中，T细胞对新抗原的应答是毒性的理论原因。此外，已经鉴定了转导细胞对MHCI类上交叉呈递的衣壳来源肽作为AAV介导的基因转移后细胞毒性T细胞应答的潜在靶标。参见，例如，Manno,C.S.,等人Successful transduction of liver in hemophiliaby AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response.Nat Med12,342-347(2006)；和Martino,A.T.,等人Engineered AAV vector minimizes in vivotargeting of transduced hepatocytes by capsid-specific CD8+ T cells.Blood121,2224-2233(2013)。已经提出后一种机制是在一些全身AAV递送的临床试验中观察到的转氨酶升高的原因，并且已经采用施用糖皮质激素来抑制T细胞应答以降低这种风险。参见例如Manno等人,2006 as cited above and George,L.A.,等人Hemophilia B GeneTherapy with a High-Specific-Activity Factor IX Variant.New England Journalof Medicine 377,2215-2227(2017)。在该实施例中，NHP中的转氨酶升高似乎与对衣壳或转基因产物的T细胞应答无关。在从一只动物的肝脏中收获的淋巴细胞中检测到对载体衣壳和转基因产物的T细胞应答，但外周血中没有检测到，证明可能发生针对两种抗原的应答，并且在外周血中测量的应答可能并不总是反映在靶器官内发生的应答。然而，具有最严重毒性的动物在外周血或肝淋巴细胞中没有可检测的T细胞应答，并且另一只表现出明显转氨酶升高的动物在外周血中没有表现出T细胞应答。此外，肝毒性的快速发作(少于5天)与幼稚宿主中的T细胞应答不一致。在没有T细胞应答的情况下发现肝毒性表明另一种机制是导致肝损伤的原因。可能性可包括由内体途径内载体衣壳的大量积累引起的毒性，由递送大量载体基因组诱导DNA损伤应答，极高水平表达的转基因产物的毒性，或者由高水平转基因表达引起的宿主基因的正常转录和翻译的损受损。这种毒性是否是SMN转基因特异性的可以在临床前研究中轻松测试；评估其他可能性需要更广泛的研究。在用相同剂量的携带绿色荧光蛋白转基因的不同AAV血清型处理的成年NHP中观察到严重肝毒性、凝血异常、血小板减少和休克，证明这些发现不是AAVhu68载体或SMN转基因独特的(数据未显示)。重要的是，如果存在人中发生的肝毒性的非免疫介导的机制，则目前引入临床试验的糖皮质激素施用方案可能对减轻这种风险无效。
AAV基因疗法领域的一个关键问题是，在本研究中观察到的毒性是否能够转移到人，并且如果能够，哪种动物模型可以充分预测毒性，以便进行信息性的临床前安全性研究。用相似剂量的密切相关的AAV9载体治疗的一些SMA患者确实表现出显著的肝毒性，表明本研究中的肝脏发现可能适用于人，并且恒河猴可能是预测模型。更难的是确定在该实施例中观察到的DRG毒性是否能够转移到人。在SMA临床试验中未报告感觉症状，但在常规评估中可能未注意到类似于NHP的亚临床病变
本研究结果提出了关于以极高剂量全身施用AAV载体的安全性的重要问题。该实施例中显示的结果支持高剂量AAV有效转导关键靶细胞(例如下运动神经元)的可能性，但证明了所需剂量可能与显著毒性相关。先前用10倍低的剂量的AAV9载体处理成年NHP，并且未观察到显著的运动神经元转导或毒性，这表明针对运动神经元的全身AAV的治疗指数(therapeuticindex)可能非常窄。参见，例如，Hinderer,C.,等人Widespread genetransfer in the central nervous system of cynomolgus macaques followingdelivery of AAV9 into the cisterna magna.Molecular therapy.Methods&clinicaldevelopment 1,14051(2014)。与SMA临床试验中报道的转氨酶升高类似，在该研究中用相同载体剂量处理的NHP显示肝脏毒性严重性的受试者间变异，并且2/3NHP表现出有效的基因转移且仅具有无症状的实验室异常。这表明高剂量全身性AAV在某些患者中可能是安全且有效的，尽管在较窄的治疗指数和极端值中发现的严重程度可能意味着随着更多患者的治疗而出现严重毒性的病例。
正在进行研究以了解在该实施例中观察到的肝和感觉神经元毒性的机制，以及每种对人的相关性。目前，非人灵长类动物实验对于评估与高剂量全身性AAV施用相关的肝和神经毒性可能是信息性的，并且这些研究应在进入临床之前进行。在临床试验中，应该对肝毒性仔细评估，对神经病的症状也应如此。客观评估对感觉神经元的毒性(包括躯体感觉诱发电位和神经传导研究)也可能是有价值的。当在AAV临床试验中遇到转氨酶升高或其他毒性迹象时，研究者应该保持广泛的鉴别诊断，因为免疫和非免疫机制都可能是原因。
C.材料和方法：
动物程序：所有动物程序均由宾夕法尼亚大学的机构动物护理和使用委员会批准。对于静脉内载体施用，将载体在无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释，并通过隐静脉(NHP)或耳静脉(仔猪)经10分钟输注。用过量戊巴比妥进行安乐死。
组织学：将组织根据常规方案在福尔马林中固定，石蜡包埋，切片，并用苏木精和伊红染色。还根据常规方法进行纤维蛋白原IHC。
根据制造商的方案，使用ViewRNAISH组织分析试剂盒(Thermo Fisher)，在不超过24小时固定时间对福尔马林固定的石蜡包埋组织进行原位杂交(ISH)。由试剂盒制造商合成由Z形探针对组成的探针。对密码子优化的人SMN特异性的探针单独使用或与针对恒河猴或猪CHAT的探针组合使用作为运动神经元的标记物。通过形成用罗丹明过滤器组成像的FastRed沉淀物来检测结合的SMN探针。通过根据试剂盒制造商的规格制造的定制过滤器组(AVR Optics,Rochester,NY)成像的Fast Blue沉积物检测CHAT探针。切片用DAPI复染以显示细胞核。
载体产生：通过贴壁HEK293细胞的三重转染产生AAVhu68载体。使用POROSTMCaptureSelectTM AAV9树脂通过亲和色谱从细胞上清液中纯化载体，然后进行阴离子交换色谱以除去空衣壳和其他杂质。
载体生物分布：在尸检时，将组织在干冰上冷冻用于载体生物分布分析。提取DNA，并如前所述通过TaqMan PCR量化载体基因组。参见Wang,L.,等人Impact of pre-existingimmunity on gene transfer to nonhuman primate liver with adeno-associatedvirus 8 vectors.Human gene therapy 22,1389-1401(2011)。
ELISPOT：如前所述进行干扰素γELISPOT。参见Brantly,M.L.,等人Sustainedtransgene expression despite T lymphocyte responses in a clinical trial ofrAAV1-AAT gene therapy.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 106,16363-16368(2009)。人SMN和AAVhu68 VP1肽文库由重复5个氨基酸的15聚体肽组成，分为2个(SMN)或3个(AAVhu68)库。
本说明书中引用的所有公开文献均通过引用并入本文，例如2018年1月17日提交的美国临时专利申请号62/618,437，2017年6月6日提交的美国临时专利申请号62/515,902和2017年2月28日提交的美国临时专利申请号62/464,756。类似地，本文引用的并且出现在所附序列表(文件名17-7988PCT_ST25.txt)中的SEQ ID NO通过引用并入本文。虽然已经参考特定实施方案描述了本发明，但是应该理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
(序列表自由文本)
为数字标识符<223>下包含自由文本的序列提供以下信息。
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Claims (24)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含AAVhu68衣壳和至少一个表达盒，其中所述至少一个表达盒包含编码功能性SMN蛋白的核酸和指导SMN蛋白表达的表达控制元件，其中所述rAAV具有AAVhu68衣壳，所述AAVhu68衣壳包含：
AAVhu68 vp1蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp1蛋白选自：由编码SEQ ID NO:8所示的氨基酸的核酸表达所产生的vp1蛋白，其中所述AAVhu68 vp1蛋白的特征还在于具有位置157处的缬氨酸和位置67处的谷氨酸，
AAVhu68 vp2蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp2蛋白选自：由编码SEQ ID NO:8的至少氨基酸138至736的核酸表达所产生的vp2蛋白，其中所述AAVhu68 vp2蛋白的特征还在于具有位置157处的缬氨酸和位置67处的谷氨酸，
AAVhu68 vp3蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp3蛋白选自：由编码SEQ ID NO:8的至少氨基酸203至736的核酸表达所产生的vp3蛋白。
2.根据权利要求1所述的rAAV载体，其中所述编码的SMN蛋白是同种型D蛋白。
3.根据权利要求2所述的rAAV载体，其中所述编码的SMN同种型D蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2或3所述的rAAV载体，其中所述编码SMN同种型D蛋白的核酸序列选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO:1；
(b)SEQ ID NO:3；
(c)SEQ ID NO:4；
(d)SEQ ID NO:5，或
(e)SEQ ID NO:6。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV载体，其中所述表达控制元件包含启动子。
6.根据权利要求5所述的rAAV载体，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。
7.根据权利要求6所述的rAAV载体，其中所述启动子是CB7启动子，其包含人巨细胞病毒立即早期增强子、鸡β肌动蛋白启动子和内含子。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV载体，其还包含增强子、内含子、Kozak结构、聚腺苷酸、转录后调节元件中的一种或多种。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV载体，其序列还包含AAV反向末端重复(ITR)序列，所述AAV反向末端重复序列来自与提供所述衣壳的AAV不同的AAV。
10.根据权利要求9所述的rAAV载体，其中所述ITR来自AAV2。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV载体，其中所述vp1蛋白由SEQ ID NO:7产生，或者所述vp2蛋白由SEQ ID NO:7的至少核苷酸412至2211产生，或者所述vp3蛋白由SEQID NO:7的至少核苷酸607至2211产生。
12.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含AAVhu68衣壳，所述AAVhu68衣壳将载体基因组包装在所述衣壳中，所述载体基因组包含AAV 5’ITR、巨细胞病毒立即早期增强子、鸡β肌动蛋白启动子、内含子、其序列由SEQ ID NO:1所示的核酸、聚腺苷酸和AAV 3’反向末端重复结构，其中所述rAAV具有AAVhu68衣壳，所述AAVhu68衣壳包含：
AAVhu68 vp1蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp1蛋白选自：由编码由SEQ ID NO:8所示的氨基酸的核酸表达所产生的vp1蛋白，其中所述AAVhu68 vp1蛋白的特征还在于具有位置157处的缬氨酸和位置67处的谷氨酸，
AAVhu68 vp2蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp2蛋白选自：由编码SEQ ID NO:8的至少氨基酸138至736的核酸表达所产生的vp2蛋白，其中所述AAVhu68 vp2蛋白的特征还在于具有位置157处的缬氨酸，和
AAVhu68 vp3蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp3蛋白选自：由编码SEQ ID NO:8的至少氨基酸203至736的核酸表达所产生的vp3蛋白。
13.根据权利要求12所述的rAAV，其中所述载体基因组的序列由SEQ ID NO:15或SEQID NO:25所示。
14.根据权利要求12或13所述的rAAV，其中所述vp1蛋白由SEQ ID NO:7产生，或者所述vp2蛋白由SEQ ID NO:7的至少核苷酸412至2211产生，或者所述vp3蛋白由SEQ ID NO:7的至少核苷酸607至2211产生。
15.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂、赋形剂和/或防腐剂，和根据权利要求1至14中任一项所述的rAAV载体。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的rAAV或根据权利要求15所述的组合物在制备用于在受试者中治疗脊髓性肌萎缩的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述rAAV在经配制用于鞘内递送的组合物中。
18.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述rAAV与另一种疗法组合共同施用。
19.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述rAAV以1x1010 GC/g脑质量至3x1014GC/g脑质量或者1.85x1014GC或5x1013 GC的剂量施用。
20.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述rAAV悬浮在pH为7.2至7.8的水溶液中。
21.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。
22.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述受试者是人。
23.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述受试者为18岁以下儿童。
24.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述受试者为成人。
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