JP2003524368A - ニ量化ドメイン、三量化ドメインまたは四量化ドメインおよび補足的非相同転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ｄｎａ結合ドメインまたはリガンド結合ドメインを含む融合蛋白 - Google Patents

ニ量化ドメイン、三量化ドメインまたは四量化ドメインおよび補足的非相同転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、ｄｎａ結合ドメインまたはリガンド結合ドメインを含む融合蛋白

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、転写を活性化する斬新な融合蛋白、その蛋白をコードする核酸構成物および細胞の遺伝子操作におけるそれらの使用に関する。本発明の主要な融合蛋白は、少なくとも２つの互いに非相同ドメインを含み、その１つは束化ドメインである。束化ドメインは、互いとのまたは束化ドメインを含む蛋白との蛋白−蛋白相互作用により多量体（「束」）を形成する。本発明を実行する際に使用することができる束化ドメインの例としては、ｌａｃレプレッサー四量化ドメイン、ｐ５３四量化ドメイン、ロイシンジッパードメイン、およびそれらから誘導される観測可能な束化活性を保持するドメインのようなドメインが挙げられる。融合蛋白をコードするリコンビナント核酸を、場合によってはさらなる核酸構成物と一緒に、導入することによって細胞を操作し、標的遺伝子転写のリガンド依存性調節を可能にする。リガンドを細胞に投与し、次いで、標的遺伝子転写を（正に、場合によっては、負に）調節する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 真核遺伝子の転写の活性化は、種々の蛋白の相互作用を含み、蛋白：ＤＮＡ相
互作用により遺伝子に補充される複合体を形成する。成分上の１つ以上の重要な
蛋白ドメインには、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが含まれる。
転写メカニズムを解明し、転写機構の成分を同定して特性化し、場合によってこ
れらの成分の一部を利用することは、広域調査研究の課題であった。（たとえば
、Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ， １９８５、Ｈｏｐｅ ａｎｄ Ｓｔ
ｒｕｈｌ， １９８６、Ｋｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ． １９８６、Ｆｉｅｌｄｓ
ａｎｄ Ｓｏｎｇ， １９８９、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９３、
Ｂｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ， １９９６およびＲｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ，
１９９６を参照）（以下の実施例の直前に参考文献一覧表を記載する。） 転写活性化ドメインは、プロモーターに対して特異的な機能を有する多数の蛋
白を補充することによって機能すると考えられる（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ
， １９９１、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ， １９９３、Ｏｒｐｈａｎｉｄ
ｅｓ ｅｔ ａｌ， １９９６およびその中で引用された参考文献、Ｐｔａｓｈ
ｎｅ ａｎｄ Ｇａｎｎ， １９９７およびその中で引用された参考文献）。現
在までに特性化されている多数の活性化ドメインの中で、単純ヘルペスウイルス
コード化蛋白の酸性活性化ドメイン、ＶＰ１６は、非常に強力な転写インデュー
サーであり、生物学的調査研究に広く使用されている（Ｓａｄｏｗｓｋｉ ｅｔ
ａｌ， １９８８， Ｐｔａｓｈｎｅ ａｎｄ Ｇａｎｎ， １９９７）。
【０００２】 ヒト転写因子ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットの転写活性化ドメインも遺伝子
発現の非常に強力な刺激物質であり、ある面では、ＶＰ１６よりも強力に転写を
誘導することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｄｅ， １９９１
、Ｂａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ， １９９２、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ， １９
９３、Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ， １９９４、Ｎａｔｅｓａｎ ｅｔ ａｌ，
１９９７）。ＶＰ１６活性化ドメインもｐ６５活性化ドメインも、多数の蛋白と
相互に作用し、且つ多数の蛋白をプロモーターに補充することによって機能する
と考えられる（Ｃｒｅｓｓ ａｎｄ Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ， １９９０、Ｓ
ｃｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９４、Ｕｅｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ， １９９７
）。
【０００３】 このような活性化ドメインの際立つ特徴の１つは、多種多様なプロモーターに
補充するとき、活性化ドメインを非相同蛋白ドメインに「融合」しても、転写を
活性化する能力に影響を及ぼすことが稀なことである。これらの活性化ドメイン
は高度の機能的独立を示すため、活性化ドメインは、遺伝子発現および蛋白−蛋
白相互作用または蛋白−ＲＮＡ相互作用または蛋白−低分子薬物相互作用を分析
するための様々な生物学的アッセイにおける有益な道具となっている（Ｆｉｅｌ
ｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ， １９８９、Ｓｅｎｇｕｐｔｈａ ｅｔ ａｌ， １
９９６、Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ， １９９６、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，
１９９５およびその中で引用された参考文献）。遺伝子発現を強力に活性化する
能力によって、また広範囲のプロモーターに補充されるとき、ｐ６５もＶＰ１６
も、遺伝子療法および他の応用分野における遺伝子転写活性化の魅力的な候補に
なる。しかし、利用できるのであれば、さらにより強力な活性化ドメインは、細
胞当たりのベースで、より高レベルの転写を達成するのにも、レポーター遺伝子
の転写の活性化に頼る多くの生物学的アッセイの有効性を向上させるのにも有用
であろう。
【０００４】 活性化ドメインの効力を向上させ、それによって活性化ドメインの制御下で遺
伝子発現を改善する幾つかの方策が報告されている（Ｅｍａｍｉ ａｎｄ Ｃａ
ｒｅｙ， １９９２、Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９４、Ｏｈａｓｈｉ
ｅｔ ａｌ， １９９４、Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ， １９９６、Ｔａｎａｋａ
ｅｔ ａｌ， １９９６）。一般に、これらのアプローチは、ＤＮＡ結合ドメ
インに融合した活性化ドメインのコピー数の増加または活性化ドメインの活動を
助け補強する組合せを含むアクティベーターの生成を含む。これらの方法で生成
した幾つかのアクティベーターはより強力なことが証明されているが、多くの制
限があるため、広範におよぶ適用は不可能である。第１に、繰り返し活性化ドメ
インを含む強力なアクティベーターは、アクティベーター用の複数の結合部位を
有するプロモーターで試験したとき、レポーター遺伝子発現の絶対レベルを高め
ない（Ｅｍａｍｉ ａｎｄ Ｃａｒｅｙ， １９９２）。第２に、文献に報告さ
れている多数の活性化ドメインの相乗的組み合せは、弱い活性化ドメインを含み
、これらの相乗活性化ドメインによって誘導される遺伝子発現の絶対レベルは、
ＶＰ１６またはｐ６５由来の強力な酸性活性化ドメインに比べてはるかに低い（
Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９４、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ， １９９
６）。第３に、ＤＮＡ結合ドメインに非共有結合するとき、これらの強力な活性
化ドメインのいずれかが遺伝子転写を強力に誘導できるかどうかは不明である。
第４に、ＶＰ１６または他の酸性アクティベーターの複数のコピーを含む多くの
強力なアクティベーターは極めて有毒であり且つ／または細胞に低レベルまで蓄
積するにすぎない。
【０００５】 はじめに述べた通り、遺伝子転写を含む種々の重要な応用分野は、より高レベ
ルの遺伝子発現を必要としたり、より高レベルの遺伝子発現から利益を得る。し
かし、上述の通り、活性化ドメインの効力を改善する努力は失望するものであっ
た。さらに、様々な転写アクティベーターの発現によって、ＮＦ−ｋＢのｐ６５
ユニットのようなさらに強力なアクティベーターの観測レベルは、予想より低い
ことがわかった。何らかの理論に束縛されることは好まないが、活性化ドメイン
が強力なほど、細胞に有毒であると我々は考え、さらに不快なことは、その発現
および／またはより少量が細胞に蓄積することが確認されたことである。それで
は、どうすれば、非相同遺伝子発現レベルを高めることができるのであろうか？
注目すべきは、それでもなお戦術的展開がこれらの本質という事実に勝って、非
相同遺伝子発現を改善できることを発見し、且つ事実、下記の通りに、「束化」
の原理、転写活性化ドメインの操作、およびそれらの組み合せを使用して改善し
たことである。
【０００６】 （発明の概要） 本書類は、転写活性化ドメインのデザインおよび配送における新たな改良点を
開示し、標的遺伝子の転写を調節するための改良された物質および方法を提供す
る。本発明の態様は、転写活性化ドメインのＤＮＡ結合ドメインへの共有結合ま
たは非共有結合のいずれかを含む系に適用できる。
【０００７】 本発明の主要な特徴は、「束化」ドメイン、それらを含む融合蛋白、そのよう
な融合蛋白をコードするリコンビナント核酸、そのような融合蛋白の束を含む系
、およびそのような束化ドメインを含む他の物質および方法を含む。本発明の主
要な融合蛋白は、少なくとも２つの互いに非相同のドメインを含み、そのうち１
つは束化ドメインである。重要なデザインの概念は、融合蛋白は、単独で作動す
る必要がないことである。その代わりに、融合蛋白は互いに見つけて結合し（ま
たは束化ドメインを含む他の蛋白と結合し）、その任務を遂行するための軍団を
形成する。実際には、融合蛋白をコードするリコンビナント核酸を、場合によっ
てはさらなる核酸構成物と一緒に、導入することによって細胞を操作し、標的遺
伝子転写のリガンド依存性調節を可能にする。リガンドを細胞に投与し、次いで
、標的遺伝子転写を（正に、場合によっては、負に）調節する。
【０００８】 束化ドメインに関する詳細な詳細な情報、それらの使用に関するガイダンスお
よび実例を以下に提供する。一般に、束化ドメインは、束化ドメインを含む蛋白
を誘導する任意のドメインを含み、互いとのまたは束化ドメインを含む蛋白との
蛋白−蛋白相互作用により多量体（「束」）を形成する。本発明を実行する際に
使用することができる束化ドメインの例としては、ｌａｃレプレッサー四量化ド
メイン、ｐ５３四量化ドメイン、ロイシンジッパードメイン、およびそれらから
誘導される観測可能な束化活性を保持するドメインのようなドメインが挙げられ
る。束化ドメインを含む蛋白は、互いに複合体を形成して、個々の蛋白分子の束
を形成することができる。このような束化は、蛋白分子を連結するための架橋剤
（すなわち、それ自身が蛋白質束化ドメインを含まない架橋剤）が存在する必要
がないという意味で、「構成的である」。
【０００９】 本発明の様々な融合蛋白中に、束化ドメインと共に含まれてもよい非相同ドメ
インの説明的な（非限定的）例としては、転写調節ドメイン（すなわち、ｐ６５
ドメイン、ＶＰ１６ドメインまたはＡＰドメインのような転写活性化ドメイン、
転写強化ドメインまたは転写相乗ドメイン、または、ｓｓｎ−６／ＴＵＰ−１ド
メインやＫｒｕｐｐｅｌファミリーのサプレッサードメインのような転写抑制ド
メイン）、ＧＡＬ４、ｌｅｘ Ａまたは複合亜鉛フィンガードメインやＺＦＨＤ
１ドメインのような複合ＤＮＡ結合ドメインのようなＤＮＡ結合ドメイン、（ａ
）イムノフィリンドメイン、サイクロフィリンドメインまたはＦＲＢドメイン、
（ｂ）ｔｅｔＲのような抗生物質結合ドメイン、または（ｃ）プロゲステロンレ
セプターやエクジソンレセプターのようなホルモンレセプターを含むかそれらか
ら誘導されたリガンド結合ドメインが挙げられる。
【００１０】 多種多様なリガンド結合ドメインを本発明で使用することができるが、細胞浸
透性リガンドに結合するリガンド結合ドメインが好ましい。リガンドは、約５ｋ
Ｄ以下、さらに好ましくは２．５ｋＤ未満、任意に約１５００Ｄ未満の分子量を
有することも好ましい。非蛋白質リガンドも好ましい。リガンド結合ドメインは
、たとえば、（Ａ）イムノフィリン（たとえば、ＦＫＢＰ １２）ドメイン、サ
イクロフィリンドメインまたはＦＲＡＰドメイン、（ｂ）ホルモンレセプター、
たとえばプロゲステロン、エクジソンまたは他のステロイドに対するレセプター
、および（ｃ）抗生物質レセプター、たとえばテトラサイクリン、ドキシサイク
リンまたは他の類縁体に結合するためのｔｅｔＲドメインまたはそれらの模擬物
から選択されるか、または誘導されるドメインを含む。
【００１１】 本発明を実行する際に使用することができるリガンド結合ドメイン／リガンド
対の例としては、ＦＫＢＰ：ＦＫ１０１２、ＦＫＢＰ：合成の二価ＦＫＢＰリガ
ンド（ＷＯ ９６／０６０９号および ＷＯ ９７／３１８９８号を参照）、Ｆ
ＲＢ：ラパマイシン／ＦＫＢＰ（たとえば、ＷＯ ９６／４１８６５号およびＲ
ｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ， ”Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（９）：１０２８−１０
３２ （１９９７）を参照）、サイクロフィリン：サイクロスポリン（たとえば
ＷＯ ９４／１８３１７号を参照）、ＤＨＦＲ：メトトレキサート（たとえば
Ｌｉｃｉｔｒａ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１２８１７−１２８２１を参照）、ＴｅｔＲ：
テトラサイクリンまたはドキシサイクリンまたはその他の類縁体またはそれらの
模擬物（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． U．S．A． ８９：５５４７、Ｇｏｓｓｅｎ
ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９、
Ｋｉｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０９３３−１０９３８）、プロゲステロンレ
セプター：ＲＵ４８６（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８１８０−８１８４）、エク
ジソンレセプター：エクジソンまたはムリステロンＡまたは他の類縁体またはそ
れらの模擬物（Ｎｏ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：３３４６−３３５１）およびＤＮＡギラー
ゼ：クーママイシン（たとえば、Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｎ
ａｔｕｒｅ ３８３：１７８−１８１を参照）などが挙げられるが、その限りで
はない。
【００１２】 本発明を実行する際に、ＧＡＬ４、 ｌｅｘ Ａまたは複合（たとえばＺＦＨ
Ｄ１）ＤＮＡ結合ドメインから選択されるか誘導されるドメイン、または、たと
えば、ｗｔまたは変異プロゲステロンレセプタードメインのようなリガンド結合
ドメインと結合しているＤＮＡ結合ドメインを含め、多種多様なＤＮＡ結合ドメ
インを使用することができる。ＤＮＡ結合機能とリガンド結合機能の両者を提供
するＴｅｔＲドメインを、リガンド結合ドメインに関連して検討する。多くの応
用分野で、操作の対象である細胞と非相同のＤＮＡ結合ドメインを使用すること
が好ましい。非相同ＤＮＡ結合ドメインは、操作の対象である細胞以外の細胞タ
イプに自然に発生するもの、ならびに自然界では、同一連続のポリペプチドまた
は遺伝子内に認められないか、少なくとも同一順序または同方向ではないか、あ
るいは、複合ドメイン中に同じ空間が存在しない成分部分を含む、複合ＤＮＡ結
合ドメインを含む。複合ＤＮＡ結合ドメインの場合、操作の対象である細胞また
は生物の内部に生じる成分ペプチド部分が一般に好ましい。
【００１３】 ｔｅｔＲドメインを含むキメラ転写因子の場合、ＤＮＡ結合ドメインは、ｔｅ
ｔＲ成分によって提供される、また真核細胞と非相同の性質によって提供される
。ＴｅｔＲドメインに関しては、リガンド結合ドメインに関連してさらに詳細に
検討する。
【００１４】 内因性遺伝子が調節可能に発現される実施形で、標的遺伝子の上流の１つ以上
の配列を認識するために選択される複合ＤＮＡ結合ドメインを配置することがで
きる。
【００１５】 ＤＮＡ結合ドメインに関する補足情報を、以下に提供する。
【００１６】 本発明の重要な応用分野で、束中の融合蛋白のうち２つ以上は、それぞれ、束
化ドメインに加えて、束化ドメインと非相同である少なくとも１つの転写活性化
ドメインを含む。転写活性化ドメインを含む蛋白の束化は、（束化ドメインが欠
けている、１つのこのような融合蛋白と比較して）有効効力を有意に高めること
ができ、結果として遺伝子発現の強力な誘導につながる。束化ドメインが欠けて
いる同等物と違って、束化ドメインを含む融合蛋白は、ｅｎ塊を発現調節配列に
補充したとき、融合蛋の発現または蓄積の総体レベルが比較的低くても、効果的
な転写活性化ドメイン局所濃度を達成し、遺伝子発現を活発に誘導するようにデ
ザインされる。極めて強力な束化した活性化ドメインは、転写読み出しを有する
多種多様なアッセイにも使用することができる。このようなアッセイには、真核
生物、好ましくは哺乳類における蛋白−蛋白相互作用（またはその阻害剤）を同
定するためのアッセイ、ニハイブリッドアッセイまたはその変形、たとえば、３
−ハイブリッドアッセイ、逆ニハイブリッドアッセイ、などが含まれる。
【００１７】 テトラサイクリン、ＲＵ４８６またはエクジソン、またはそれらの類縁体また
は模擬物によって調節されるもののようなアロステリを基本とする系、およびＦ
Ｋ１０１２、ＦＫＣｓＡ、ラパマイシン、ＡＰ１５１０またはクーママイシンの
ような二価化合物、またはそれらの類縁体または模擬物によって調節されるもの
のようなニ量化を基本とする系の両者を含む、種々の調節された遺伝子発現シス
テムの融合蛋白のデザインに束化ドメインを導入することも可能であり、全て、
後述する（Ｃｌａｃｋｓｏｎ, １９９７, Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌ
ｅｃｕｌｅｓ, Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏ
ｌ． １：２１０−２１８も参照）。融合蛋白は、束化ドメイン、ＤＮＡ結合ド
メイン、転写活性化（または抑制）ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む
、適当な諸成分の任意の組合せを含んでもよい。その他の非相同ドメインも含ん
でもよい。
【００１８】 本発明の様々な実施形態は、少なくとも１つの束化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメ
インおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白、少なくとも１つの束化ドメイン
、リガンド結合ドメインおよび転写抑制ドメインを含む融合蛋白、少なくとも１
つの束化ドメイン、リガンド結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合
蛋白、少なくとも１つの束化ドメイン、リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメ
インおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白、および、好ましくは、少なくと
も１つの束化ドメイン、リガンド結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む
融合蛋白を含む。現在好ましい実施形態で、これらの融合蛋白は、リガンド結合
ドメインはサイクロフィリンドメイン、イムノフィリンドメイン（たとえば、Ｆ
ＫＢＰドメイン）またはＦＲＢドメインであるかそれらに由来するが、任意のリ
ガンド結合ドメインをキメラ蛋白に使用することができ、且つ調節メカニズムは
ニ量化系であってもアロステリック系であってもよい、ＷＯ９４／１８３１７号
およびＷＯ９６／４１８６５号に記載のタイプで改善を示す。
【００１９】 好ましい融合蛋白は、ｌａｃレプレッサー四量化ドメイン、ＦＲＢドメインお
よびヒトｐ６５の活性化ドメインに由来する転写活性化ドメインを含む。束化ド
メインを含んでも含まなくても、ｐ６５に由来する少なくとも１つの転写活性化
ドメインを含む融合蛋白を含む本発明の実施形態のいずれでも、ｐ６５ペプチド
配列は天然のｐ６５配列であってもよく、下記の通りに操作したものであっても
よいことを十分に理解されたい。
【００２０】 本発明の別の態様は、転写活性化ドメインそのものの改良を含む。この点に関
して、転写活性化ドメインおよびそれに非相同な少なくとも１つの補足的ドメイ
ンを含む融合蛋白をコードするリコンビナント核酸が提供され、ここで、転写ア
クティベーターとしての効力が、生来のペプチド配列を含む同等物と比較して増
大または低減するように、活性化ドメインが誘導される天然の配列と比較して、
活性化ドメインのペプチド配列そのものが改変されている。本発明のある特定の
実施形態は、ｐ６５由来の転写活性化ドメインを含み、且つ図１９に示す突然変
異を１つ以上担持する融合蛋白を含む。改変された活性化ドメインを１つ以上含
む融合蛋白は、転写アクティベーター、および／または１つ以上の補足的ドメイ
ン、たとえば、リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインまたは上記または下
記のような転写活性化相乗ドメインとしての有効性をさらに高めるために、束化
ドメインをさらに含んでもよい。
【００２１】 したがって、本発明は、本発明の様々な蛋白をコードするリコンビナント核酸
構成物、または本発明を実行するのに有用なリコンビナント核酸構成物、原核お
よび真核細胞の形質導入に使用するための構成物を含む様々なＤＮＡベクター、
リコンビナント核酸、上記リコンビナント核酸にコードされた融合蛋白、および
標的遺伝子構成物を用いて形質導入された細胞を提供する。
【００２２】 細胞内に存在するとき、好ましくは細胞浸透性リガンドに曝露された後、標的
遺伝子の転写を可能にする、２種以上のリコンビナント核酸を含む核酸組成物も
提供する。これらの組成物を以下に説明する： 組成物＃１．第１のこのような組成物は、少なくとも１つのリガンド結合ドメ
イン、束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白をコード化するリ
コンビナント核酸と、ＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのリガンド結合
ドメインを含む融合蛋白をコード化する第２のリコンビナント核酸と、任意に、
上述のＤＮＡ結合ドメインに認識されるＤＮＡ配列を含む発現調節配列に効果的
に連結された標的遺伝子（またはクローニング部位）を含む第３のリコンビナン
ト核酸とを含む。このような組成物は、リガンド結合ドメインがイムノフィリン
、サイクロフィリンまたはＦＲＢドメインであるか、またはイムノフィリン、サ
イクロフィリンまたはＦＲＢドメインから誘導され、転写活性化ドメインは、Ｖ
Ｐ１６ドメインまたはｐ６５ドメインのような活性化ドメインであるか、活性化
メインから誘導され、束化ドメインは、ｌａｃレプレッサー四量化ドメインであ
るか、ｌａｃレプレッサー四量化ドメインに由来する実施形態によって説明され
る。
【００２３】 組成物＃２．別のこのような組成物は、第１のリコンビナント核酸によりコー
ドされる融合蛋白が少なくとも１つのリガンド結合ドメイン、束化ドメインおよ
びＤＮＡ結合ドメインを含み、且つ第２のリコンビナント核酸によりコードされ
る融合蛋白が転写活性化ドメインおよび少なくとも１つのリガンド結合ドメイン
を含むこと以外は、組成物＃１に類似している。
【００２４】 組成物＃３．別のこのような組成物は、少なくとも１つのリガンド結合ドメイ
ン、束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白をコードするリコン
ビナント核酸と、ＤＮＡ結合ドメインを含む蛋白をコードする第２のリコンビナ
ント核酸と、任意に、上述のＤＮＡ結合ドメインに認識されるＤＮＡ配列を含む
発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子（またはクローニング部位）を含
む第３のリコンビナント核酸とを含む。このような組成物は、リガンド結合ドメ
インはエクジソンレセプターのようなレセプタードメインであるかレセプタード
メインから誘導され、ＤＮＡ結合ドメインは、レセプターに対するリガンドの存
在下でレセプタードメインに結合することができるために選択されるＲＸＲ蛋白
のようなＤＮＡ結合ドメインであるかＤＮＡ結合ドメインから誘導され、転写活
性化ドメインはＶＰ１６またはｐ６５ドメインのような活性化ドメインであるか
活性化ドメインから誘導され、且つ束化ドメインはｌａｃレプレッサー四量化ド
メインであるかｌａｃレプレッサー四量化ドメインに由来する、実施形態によっ
て説明される。
【００２５】 組成物＃４．別のこのような組成物は、少なくとも１つのリガンド結合ドメイ
ン、ＤＮＡ結合ドメイン、束化ドメインおよび転写活性化ドメイン（リガンド結
合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、同一ドメインの一部であってもよく、
同一ドメインから誘導されてもよい）を含む融合蛋白をコードするリコンビナン
ト核酸と、上述のＤＮＡ結合ドメインにより認識されるＤＮＡ配列を含む発現調
節配列に効果的に連結された標的遺伝子（またはクローニング部位）を含む任意
の第２のリコンビナント核酸とを含む。このような組成物は、リガンド結合ドメ
インおよびＤＮＡ結合ドメインは、テトラサイクリンまたはレセプターに対する
別のリガンドの存在下で独特のＤＮＡ配列に結合することができるテトラサイク
リンレセプターのようなレセプタードメインであるかレセプタードメインから誘
導され、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６またはｐ６５ドメインのような活性化
ドメインであるか活性化ドメインから誘導され、束化ドメインは、ｌａｃレプレ
ッサー四量化ドメインであるかｌａｃレプレッサー四量化ドメインに由来する実
施形態により説明される。このような組成物は、リガンド結合ドメインは、プロ
ゲステロンまたは類縁体またはそれらの模擬物に結合することができる、ＲＵ４
８６をはじめとするプロゲステロンレセプターのようなレセプタードメインであ
るかレセプタードメインから誘導され、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４ドメイ
ンまたは複合ＤＮＡ結合ドメインであるかＧＡＬ４ドメインまたは複合ＤＮＡ結
合ドメインから誘導され、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６ドメインまたはｐ６
５ドメインのような活性化ドメインであるか活性化ドメインから誘導され、且つ
束化ドメインはｌａｃレプレッサー四量化ドメインであるかｌａｃレプレッサー
四量化ドメインに由来する実施形態によってさらに説明される。
【００２６】 組成物＃５．組成物１〜４と異なる、別のこのような組成物は、リガンド介在
性転写調節よりむしろ構成的発現のためにデザインされたものであり、少なくと
も１つのＤＮＡ結合ドメイン、束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融
合蛋白をコードするリコンビナント核酸と、上述のＤＮＡ結合ドメインにより認
識されるＤＮＡ配列を含む発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子（また
はクローニング部位）を含む第２のリコンビナント核酸とを含む。このような組
成物は、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６ドメインまたはｐ６５ドメインのよう
な活性化ドメインであるか活性化ドメインから誘導され、ＤＮＡ結合ドメインは
、ＧＡＬ４ドメインまたは複合ＤＮＡ結合ドメインであるかＧＡＬ４ドメインま
たは複合ＤＮＡ結合ドメインから誘導され、且つ束化ドメインはｌａｃレプレッ
サー四量化ドメインであるかｌａｃレプレッサー四量化ドメインに由来する実施
形態により説明される。
【００２７】 組成物１、３、４および５は、束化ドメインおよび少なくとも１つの転写活性
化ドメインまたは転写相乗ドメインを含み、１つ以上の任意の補足的ドメインを
含むまたは含まない、融合蛋白をコードする補足的リコンビナント核酸をさらに
含んでもよい。
【００２８】 本発明のリコンビナント核酸は、それぞれ、コーディング配列に操作可能に連
結された発現調節配列をさらに含んでもよく、また、たとえば、原核細胞または
真核細胞の形質導入用のＤＮＡベクター内に提供することができる。任意のリコ
ンビナント核酸を含め、上述した所与の組成物のリコンビナント核酸の一部また
は全部が１つのベクター内に存在してもよく、２つ以上のベクターの間で配分さ
れいてもよい。ある特定の実施形態で、ベクターまたは諸ベクターは、１つ以上
のリコンビナント核酸を含む、リコンビナントウイルスの産生に有用なウイルス
ベクターである。このリコンビナント核酸は、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの
細胞またはヒトまたは非ヒト哺乳類被験対象を含む生物内に存在する細胞に形質
導入するのに使用することが可能な１つ以上のリコンビナントウイルス内の挿入
物として提供することが可能である。たとえば、任意のリコンビナント核酸を含
め、組成物１〜５のいずれかのリコンビナント核酸が１つのリコンビナントウイ
ルス内または１組のリコンビナントウイルス内に存在してもよく、各リコンビナ
ントウイルスは一組のリコンビナント核酸を１つ以上含む。このような実施形態
に有用なウイルスには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レト
ロウイルス、ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レンチ
ウイルスなどを含め、遺伝子導入に有用なあらゆるウイルスが含まれる。特定の
実施形態で、標的遺伝子を含むリコンビナント核酸は第１のウイルスに存在し、
転写調節蛋白をコードする１つ以上のまたはリコンビナント核酸は１つ以上の別
のウイルスに存在する。このようなマルチウイルスの実施形態で、束化ドメイン
および転写活性化ドメイン、および任意に、リガンド結合ドメインを含む融合蛋
白をコードするリコンビナント核酸は、標的遺伝子構成物と同じリコンビナント
ウイルス内に存在してもよく、あるいは、第３のウイルス上に存在してもよい。
非ウイルスアプローチ（裸のＤＮＡ、リポソームまたは他の脂質組成物など）を
使用して、本発明のリコンビナント核酸を、受容者の細胞に配送できることも十
分に理解されたい。
【００２９】 本発明は、本発明のリコンビナント核酸の１つ以上を細胞に導入して、標的遺
伝子の転写を調節するのに適した本発明の融合蛋白を発現することができる、操
作された細胞を生成することを含む、細胞が、標的遺伝子の調節された発現をで
きるようにする方法も提供する。本リコンビナント核酸を、ウイルスまたは他の
形態で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持された細胞または生物内に存在する細胞に導入
すること可能である。結果として得られる、これらのリコンビナント核酸または
本発明の核酸組成物を１つ以上含む、操作された細胞およびそれらの子孫を、ヒ
ト遺伝子療法、類似の獣医学応用分野、細胞モデルまたは動物モデルの制作（遺
伝子導入応用分野を含む）およびアッセイ応用分野を含め、他所で検討した種々
の重要な応用分野で使用することが可能である。このような細胞は、たとえば、
標的遺伝子の発現を調節するためにリガンド、好ましくは細胞浸透性リガンドを
、細胞に加えること（または、細胞を含む生物にリガンドを投与すること）を含
む方法に有用である。特に重要な動物モデルとしては、囓歯類（特にマウスおよ
びラット）および非ヒト霊長類モデルが挙げられる。遺伝子療法応用分野では、
細胞は一般ににヒトであり、融合蛋白中に存在する様々な各ドメイン（束化ドメ
インを除外する可能性もある）のペプチド配列は、好ましくはヒト起源のペプチ
ド配列であるか、ヒト起源のペプチド配列に由来する。
【００３０】 ある特定のアッセイ応用分野で、リコンビナント核酸は、融合蛋白のリガンド
結合ドメインが、互いに結合することが判明している蛋白ドメインと置き換えら
れていること以外は、組成物＃１に関する記載の通りにデザインされている。こ
れらのリコンビナント核酸および適合する標的遺伝子構成物を用いて形質導入さ
れた細胞は、一般に、発現レベルの測定の都合上選択される標的遺伝子を発現す
る。これらの細胞を使用して、相互に作用することが判明している２つの蛋白ド
メインの相互作用を遮断する物質が存在することを確認できる。
【００３１】 関心事の蛋白または蛋白ドメインと相互に作用する蛋白をコードする遺伝子を
同定するための他のニハイブリッドタイプの応用分野では、潜在的関心事の被験
核酸配列のライブラリ−を、融合蛋白の１つをコードするリコンビナント核酸の
１つにクローニングすること以外は、すぐ上に記載したものと同様のリコンビナ
ント核酸を用いて細胞の形質導入を行う。標的遺伝子の転写が、同系融合蛋白に
おける蛋白ドメインと相互に作用するドメインをコードする被験核酸配列の存在
を示すニハイブリッドスタイルのアッセイを実施する。
【００３２】 「ニハイブリッド」形成の結果として、レポーター遺伝子の発現を正または負
に調節するように操作された細胞を使用して、逆ニハイブリッド−タイプのアッ
セイを同様に実施することが可能である。細胞を１つ以上の被験物質に曝露し、
発現調節阻害を可能なニハイブリッド形成阻害の目安として考える。
【００３３】 （図面の説明） 図に使用した略語： Ｇ＝酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、アミノ酸１〜９４ Ｆ＝ヒトＦＫＢＰ１２、アミノ酸１〜１０７ Ｒ＝ヒトＦＲＡＰのＦＲＢドメイン、アミノ酸２０２５〜２１１３ Ｓ＝ヒトＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニット由来の活性化ドメイン、アミノ酸３６
１〜５５０ Ｖ＝ヘルペスウイルスＶＰ１６由来の活性化ドメイン、アミノ酸４１０〜４９４ Ｌ＝Ｅ． ｃｏｌｉラクトースレプレッサー、アミノ酸４６〜３６０ ＭＴ＝Ｅ． ｃｏｌｉラクトースレプレッサーの最小四量化（「束化」）ドメイ
ン、アミノ酸３２４〜３６０ 図１〜８．束化ドメインを含むおよび含まない、様々な融合蛋白を比較し、活性
化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための様々な方策における使
用を示す図である。（１）１つはＦＫＢＰ１２に融合したＤＮＡ結合ドメイン（
たとえばＧＡＬ４またはＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメイン）を含み、他方はＦＲ
Ｂに融合したｐ６５活性化ドメインを含む、２つの融合蛋白は、細胞で発現する
。ラパマイシンを加えると、各ＤＮＡ結合ドメインモノマーに活性化ドメイン１
つが補充される。（２）複数のＦＫＢＰをＤＮＡ結合ドメインに融合すると、ラ
パマイシンは、複数の活性化ドメインを各ＤＮＡ結合ドメインモノマーに補充す
ることが可能になる。（３）ラクトースレプレッサー四量化ドメインをＦＲＢ−
活性化ドメイン融合物に加えると、ラパマイシンは、ＤＮＡ結合ドメインに融合
した各ＦＫＢＰに、４つの活性化ドメインを補充することが可能になる。（４）
ラパマイシンは、束化した活性化ドメイン融合蛋白を各ＦＫＢＰ−ＤＮＡ結合ド
メイン融合蛋白に補充する。（５）および（６）は、束化しないおよび束化した
、変異ｔｅｔＲを基本とする系を示す。（７）および（８）は、束化しないおよ
び束化した、操作されたプロゲステロン−Rを基本とする系を示す。
【００３４】 図９〜１０．プロモーターに補充された活性化ドメイン数と相関関係のある、
しっかりと組込まれたレポーター遺伝子の発現レベルを示す図である。指示され
たＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとの融合物を、しっかりと組込まれたＳ
ＥＡＰレポーターを含むＨＴ１０８０Ｂ細胞にトランスフェクトした。１０ｎＭ
ラパマイシンの添加後に、培地中に分泌されたＳＥＡＰ活性の平均値を示す（＋
／−標準偏差）。すべての場合に、活性化ドメイン発現プラスミド１００ｎｇを
投与した培地について、ＳＥＡＰ発現値をプロットプロットすると、一時的にト
ランスフェクションされた細胞におけるピーク発現値およびしっかりとトランス
フェクションされた細胞系における僅かに低いピークレベルが得られる。
【００３５】 図１１〜１２．ＲＬＳ束における活性化ドメイン間の相乗作用が、レポーター
遺伝子発現の超活性化の主要原因である。図１１）細胞で共発現するＬＳまたは
Ｌの濃度を漸増させた、ＲＬＳの蛋白束の組成物の略図。図１２の上）ＲＬＳ
１００ｎｇのみまたは指示された濃度のＬＳ領域またはＬ領域を用いて、ＧＦ１
コード化プラスミド２０ｎｇを共トランスフェクトした。１０ｎＭラパマイシン
で細胞を刺激し、トランスフェクションの１８時間後に培地中のＳＥＡＰ活性を
測定した。ラパマイシンの添加後に培地中に分泌されたＳＥＡＰ活性の平均値を
示す（＋／−標準偏差）。図１２の下）トランスフェクションされた細胞で発現
した様々なリコンビナント蛋白のヘマグルチニンエピトープに対する１２ＣＡ５
抗体を使用したウエスタンブロット分析。
【００３６】 図１３．ラクトースレプレッサー蛋白のカルボキシ末端の３６アミノ酸領域は
、極めて強力で且つ束化した活性化ドメイン融合蛋白の生成に十分である。ＧＦ
１ ２０ｎｇおよび指示された活性化ドメイン含有プラスミドベクター１００ｎ
ｇを用いて、ＨＴ１０８０Ｂ細胞を共トランスフェクトした。１０ｎＭラパマイ
シンを培地中に加えることによって、レポーター遺伝子の転写を刺激した。トラ
ンスフェクションの２４時間後にアッセイした、培地中に分泌されたＳＥＡＰ活
性の平均値を示す（＋／−標準偏差）。
【００３７】 図１４〜１５．束化した活性化ドメイン融合蛋白をＤＮＡ結合蛋白に連結する
と、標的遺伝子発現を強力に刺激するのに必要な、再構成されたアクティベータ
ーの量が有意に減少する。図１４）ＧＦ４ ２０ｎｇおよび指示された濃度の活
性化ドメイン発現プラスミドを、ＨＴ１０８０B細胞にトランスフェクトした。
１０ｎＭラパマイシンを培地に加えることによって、しっかりと組込まれたレポ
ーター遺伝子の転写を誘導した。図１５の上）トランスフェクションされた転写
因子の相対的発現レベルのウエスタンブロット分析。図１５の下）ＧＦ４ ２０
ｎｇおよび指示された活性化ドメイン融合蛋白コード化プラスミド１００ｎｇを
ＨＴ１０８０Ｂ細胞に共トランスフェクトし、指示された濃度のラパマイシンを
培地に加えることによって、ＧＡＬ４応答性レポーター遺伝子の転写活性を誘導
した。すべての場合に、ラパマイシンを添加した２４時間に培地中に分泌された
ＳＥＡＰ活性の平均値を示す（＋／−標準偏差）。
【００３８】 図１６〜１８．標的活性化ドメイン融合蛋白を束化すると、哺乳類細胞におけ
るニハイブリッドアッセイの感度が向上する。標的ドメインおよび活性化ドメイ
ンを含む束化融合蛋白を使用したニハイブリッドアッセイを示す図。ｃ−Ｃｂｌ
に融合したＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＣＢＬ）は、図１６）ＶＰ１６活
性化ドメイン（ＳＨ３Ｓ）または図１７）ラクトースレプレッサー四量化ドメイ
ン−ＶＰ１６活性化ドメイン配列（ＳＨ３ＭＴＳ）のいずれかと融合した、その
標的蛋白ＳＨ３と相互に作用することを示す。図１８）指示された発現プラスミ
ド１００ｎｇを用いて、しっかりと組込まれたＧＡＬ４応答性レポーター遺伝子
を含むＨＴ１０８０Ｂ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２
４時間後に培地中に分泌されたＳＥＡＰ活性の平均値を示す（＋／−標準偏差）
。
【００３９】 図１９．ｐ６５転写活性化ドメインに関する突然変異を列挙する： １．Ｍ１、Ｍ２、Ｍ６、M７およびＭ８を含む、活性化効力を増強するための突
然変異。
【００４０】 ２．Ｍ４およびＭ５を含む、活性化 効力を僅かに低減させるための突然変異。
【００４１】 （発明の詳細な説明） （定義） 便宜上、本明細書で使用するある特定の用語および語句の意図する意味を以下
に示す。
【００４２】 遺伝子の発現または転写に適用される「活性化する」は、直接または間接的に
観測可能な遺伝子生成物、たとえば、遺伝子にコードされたＲＮＡまたはポリペ
プチドの産生の増加を示す。
【００４３】 「選択的にハイブリッド形成することができる」は、他のＤＮＡ分子が存在し
ても、当業者が選択したり経験的に容易に決定できるハイブリッド形成条件下で
、２つのＤＮＡ分子が互いにハイブリッド形成されすいことを意味する。このよ
うな処理は、きわめてストリンジェントな条件、たとえば、室温から６５〜７５
℃の温度範囲で、０．２〜６×ＳＳＣ、および／または０．１％〜１％ＳＤＳを
含む緩衝液で徹底的に洗浄することを含む。たとえばＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら
編、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ， 単元６．３および６．４（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第３版、１９９５）を参照されたい。
【００４４】 「細胞」、「宿主細胞」または「リコンビナント宿主細胞」は、検討中の特定
の細胞を指すばかりではなく、それらの子孫または潜在的な子孫も指す。突然変
異または環境的影響によるある種の改変が次の世代で発生する可能性があるため
、このような子孫は、事実上、親細胞と同じではないかもしれないが、それでも
なお、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００４５】 「細胞系」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの連続的なまたは長期成長および分裂が可
能な細胞集団を指す。多くの場合、細胞系は、１つの前駆細胞に由来するクロー
ン集団である。さらに、このようなクローン集団の保存中または導入中に、核型
の自発的変化または誘導性の変化が発生し得ることが、当技術分野で知られてい
る。したがって、言及された細胞系に由来する細胞が、先祖の細胞または培養と
精確に同じではない可能性もあり、細胞系は、このような変種も含む。
【００４６】 「複合」、「融合」、および「リコンビナント」は、それらが、自然界では、
他の状況で、（共有的に）連結した状態で直接確認されない、すなわち、自然界
では、同一の連続的ポリペプチドまたは遺伝子内に認められない、少なくとも同
じ順序または方向ではないか、あるいは複合生成物、融合生成物またはリコンビ
ナント生成物に存在するのと同じ空間ではない、という意味で互いに非相同であ
る、少なくとも２つの構成要素部分を含む核酸、核酸配列またはポリペプチドの
ような物質を表す。一般に、このような物質は、少なくとも２つの異なる蛋白ま
たは遺伝子に由来するか、同一蛋白または遺伝子の少なくとも２つの非隣接部分
に由来する成分を含む。一般に、「複合」は、合体して１つの機能単位を形成す
る異なる蛋白または核酸の部分を指し、「融合」は、一般に、連結されている、
２つ以上の機能単位を指す。一般に、「リコンビナント」は、核酸または核酸配
列に関連して使用される。
【００４７】 「補因子」は、非遺伝子特異的方式で転写を増強するかまたは抑制する蛋白を
指す。一般に、補因子は固有のＤＮＡ結合特異性がなく、一般的なエフェクター
として機能する。正に作用する補因子は基礎転写を刺激しないが、アクティベー
ターに対する応答を増強する。正に作用する補因子としては、ＰＣ１、ＰＣ２、
ＰＣ３、ＰＣ４、およびＡＦＣが挙げられる。転写アクティベーターと直接相互
に作用するＴＡＦも補因子と呼ばれる。
【００４８】 「コーディング配列」または特定のポリペプチドまたはＲＮＡを「コード」す
る配列は、適切な発現調節配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏまた
はｉｎ ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（m
ＲＮＡの場合）核酸配列である。一般に、コーディング配列の境界は、５'（ア
ミノ）末端の開始コドンおよび３'（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによっ
て決定される。コーディング配列としては、原核mＲＮＡまたは真核mＲＮＡ由来
のｃＤＮＡ、原核ＤＮＡまたは真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成
ＤＮＡ配列が挙げられるが、その限りではない。転写終結配列は、通常、コーデ
ィング配列の３'に位置する。
【００４９】 ２つ以上のウイルスの投与に関する用語「結合した」は、個々のウイルスの同
時投与、逐次投与または別々の投与を指すが、但し動物の１つ以上の細胞に、ウ
イルスが同時に存在する条件下で、若干のオーバーラップが生じる。
【００５０】 「構成物」、たとえば、「核酸構成物」または「ＤＮＡ構成物」は、核酸また
は核酸配列を指す。
【００５１】 「由来する」は、所与の配列内から選択されたペプチドまたはヌクレオチド配
列を指す。名前がついた配列由来のペプチドまたはヌクレオチド配列は、親配列
と比較して少数の改変をさらに含んでもよく、大抵の場合、親配列に存在するア
ミノ酸残基または塩基の約１５％未満、好ましくは約１０％未満、多くの場合、
約５％、の欠失、置換または挿入を表す。ＤＮＡの場合、その２つが互いに選択
的にハイブリッド形成できる場合、１つのＤＮＡ分子は、もう一方から誘導され
るとも考えられる。その２つのポリペプチドまたは配列をコード化する任意のＤ
ＮＡが互いに選択的にハイブリッド形成できる場合、ポリペプチドまたはポリペ
プチド配列は、リファレンスポリペプチドまたはポリペプチド配列から誘導され
るとも考えられる。一般に、誘導されたペプチド配列は、アミノ酸５個まで、多
くの場合、アミノ酸３個まで、非常に多くの場合、アミノ酸０個または１個の置
換分だけ親配列と異なる。誘導された核酸配列は、塩基１５個まで、多くの場合
、塩基９個まで、非常に多くの場合、塩基０〜３個の置換分だけ親配列と異なる
。アミノ酸または塩基が、置換されているのではなく、付加されていたり欠失し
ている場合もある。
【００５２】 「ドメイン」は、蛋白またはポリペプチドの一部分を指す。本技術分野では、
用語「ドメイン」は、不連続の二次構造を有する蛋白の一部分を指すこともある
。しかし、本明細書で使用される状況から明白なように、本書で使用される用語
「ドメイン」は、所与の二次構造を含む必要はない。むしろ、本書では、規定さ
れた起源に由来するか、あるいは所期の活性または確認された活性を有するかま
たは与えるポリペプチド配列を表すために、ペプチド配列が「ドメイン」と呼ば
れるにすぎない。ドメインは天然の蛋白に由来してもよく、非天然配列を含んで
もよい。
【００５３】 「ＤＮＡ認識配列」は、たとえば、転写因子または操作されたポリペプチドの
１つ以上のＤＮＡ−結合ドメインに結合することができるＤＮＡ配列を意味する
。
【００５４】 「発現調節要素」、または単に「調節要素」は、操作可能に連結しているＤＮ
Ａ配列の転写を誘導または調節する、開始シグナル、エンハンサー、プロモータ
ー、サイレンサーのようなＤＮＡ配列を指す。遺伝子の調節要素は、イントロン
、エクソン、コディング領域、および３'フランキング配列に存在してもよい。
一部の調節要素は「組織特異的」である、すなわち、選択されたＤＮＡ配列の特
定の細胞（たとえば、特定の組織の細胞）における発現に優先的に影響を及ぼす
が、多くのまたはほとんどの細胞タイプで活性なものもある。特定の細胞タイプ
における発現が他の細胞タイプにおける発現よりも認識できるほど高い場合、こ
の特定の細胞で遺伝子発現が優先的に起こる。調節要素としては、主として１つ
の組織ににおける選択されたＤＮＡの発現を調節するが、他の組織でも発現させ
る、いわゆる「漏出性」プロモーターが挙げられる。さらに、調節要素は、構成
的にまたは誘導可能に作用することができる。誘導可能なプロモーターは、たと
えば、刺激に応答して、その刺激が存在しない場合より、明らかに活性になる。
刺激はホルモン、サイトカイン、重金属、ホルボールエステル、サイクリックＡ
ＭＰ（ｃＡＭＰ）、レチノイン酸またはそれらの誘導体などを含んでもよい。１
つ以上の発現調節要素を含むヌクレオチド配列は、「発現調節配列」とも呼ばれ
る。
【００５５】 「遺伝子」は、オープンリーディングフレームを含み且つ少なくとも１つのエ
クソン配列および（任意に）１つ以上のイントロン配列を含む核酸分子または配
列を指す。
【００５６】 「遺伝子操作した細胞」は、リコンビナントまたは非相同核酸（たとえば１つ
以上のＤＮＡ構成物またはそれらのＲＮＡ同等物）を導入することによって改変
されている細胞を表し、且つ、このような遺伝子改変の一部または全部を保持す
るこのような細胞の子孫をさらに含む。
【００５７】 「非相同」は、核酸またはペプチド配列に関連するとき、通常は合体されない
、且つ／または通常は特定の細胞と関連のない配列を表す。したがって、核酸構
成物の「非相同」領域は、自然界では他の分子と関連して確認されない、別の核
酸分子内または別の核酸に結合した核酸のセグメントである。たとえば、構成物
の非相同領域は、自然界では、コーディング配列と関連して確認されない配列に
囲まれたコーディング配列を含む可能性がある。非相同コーディング配列の別の
例は、自然界では、コーディング配列そのものが認められない構成物である。（
たとえば、生来の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。同様に、通常は細
胞内に存在しない核酸構成物を用いて形質導入した細胞の場合、本発明の論点に
関しては、細胞および構成物は、互いに非相同であると考えられる。対立遺伝子
の変化または天然の突然変異的事象によって、本明細書で使用される非相同ＤＮ
Ａは生じない。
【００５８】 「イニシエーター」は、転写開始部位を含み、且つ適切に開始された転写物の
合成を指令するのに重要な、短い、弱く保護された要素を指す。
【００５９】 「相互に作用する」は、たとえば、酵母ニハイブリッドアッセイを使用するか
、免疫沈降によって検出できるような、直接または間接的に検出可能な分子間の
相互作用を指す。用語「相互に作用する」は、分子間の「結合」相互作用を含む
。相互作用は、たとえば、本質的に、蛋白−蛋白、蛋白−核酸、蛋白−低分子ま
たは低分子−核酸であってもよい。
【００６０】 「最小プロモーター」は、選択されたＤＮＡ配列が操作可能に連結される対象
に、選択されたＤＮＡ配列の転写を開始することができる最小発現調節要素を指
す。最小プロモーターは、多くの場合、ＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡ様ボッ
クスから成る。非常に多くの最小プロモーター配列が文献で知られている。
【００６１】 「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のようなポリヌクレオチド、および
該当する場合、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語は、ヌクレオチド類縁体か
ら作られたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの誘導体、変異体および類縁体、およ
び、記載の実施形態に応用できる、１本鎖ポリヌクレオチド（センスまたはアン
チセンス）および２本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解されたい。
【００６２】 「操作可能に連結された」は、発現調節要素およびコーディング配列に言及す
るとき、発現調節要素が、コーディング配列の転写を可能にするか促進するよう
な方式で、コーディング配列と関連していることを意味する。
【００６３】 「リコンビナントウイルス」は、パッケージされた核酸が非相同部分を含むウ
イルス粒子である。
【００６４】 「蛋白」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に使用される。
【００６５】 「標的遺伝子」は、関心事の核酸であって、その発現が、本発明の方法に従っ
て調整される。標的遺伝子は内因性であっても外因性であってもよく、且つ細胞
'ゲノムに組み込まれていてもよく、エピソーム性のままであってもよい。標的
遺伝子は、たとえば、蛋白、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする
ことができる。
【００６６】 用語「転写活性化単位」および「活性化単位」は、独力で、または別の転写活
性化単位に共有結合するか非共有結合したとき、転写アクティベーター依存性転
写を誘導するか、さもなければ強化することができるペプチド配列を指す。活性
化単位は、転写因子と直接または間接的に相互に作用する能力を保持する最小ポ
リペプチド配列を含んでもよい。融合蛋白が活性化単位を「含有する」または「
包含する」と言われる状況から明らかでない限り、活性化単位が由来する蛋白の
他の部分が含まれ得ることが理解される。転写活性化単位は、ある種のアミノ酸
に富む可能性がある。たとえば、転写活性化単位は、酸性残基、グルタミン、プ
ロリン、またはセリン残基およびスレオニン残基に富むペプチドであってもよい
。他の転写アクティベーターは、イソロイシン残基または塩基性アミノ酸残基に
富んでいてもよい（たとえば、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ（１９９５） Ｃｕｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． ５：１９０およびその中で引用さ
れた参考文献を参照）。たとえば、活性化単位は、ｐ６５、ＯＣＴ２Ｑドメイン
およびＯＣＴ２Ｐドメインにそれぞれ由来するＫ１３モチーフのような周知の「
酸性」モチーフ、「富グルタミン」モチーフおよび「富プロリン」モチーフを含
め、転写活性化ドメインと関連した、アミノ酸残基が少なくとも約６個のペプチ
ドモチーフであってもよい。
【００６７】 用語「転写アクティベーター」は、存在すると、応答性遺伝子の細胞における
遺伝子転写レベルが上昇する蛋白または蛋白複合体を指す。転写アクティベータ
ーは、基礎転写複合体が作動する能率を高めることができる、すなわち、転写を
活性化することができる、と考えられる。したがって、本明細書で使用される転
写アクティベーターは、単一の蛋白であってもよく、あるいはその少なくとも一
部は互いに共有結合していない数単位を含んでもよい。転写アクティベーターは
、一般にモジュラー構造を有する、すなわち、１つ以上の成分ドメイン、たとえ
ばＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上の転写活性化単位またはドメインとを含む。
転写アクティベーターは、以下に規定する、転写因子の部分集合である。
【００６８】 「転写因子」は、その有無が転写の開始の一因となるが、それ自身はポリメラ
ーゼの一部ではない蛋白を指す。ある種の転写因子は転写を刺激し（「転写アク
ティベーター」）、他の転写因子は転写を抑制する（「転写レプレッサー」）。
一般に、転写因子は、（ｉ）一般的転写因子と、（ｉｉ）転写アクティベーター
の２つのグループに分類できる。通常、転写因子は１つ以上の調節ドメインを含
む。一部の転写因子は、標的遺伝子の発現調節要素と直接相互に作用する転写因
子の部分であるＤＮＡ結合ドメインを含む。
【００６９】 「転写調節ドメイン」は、転写を調節し、且つ活性化ドメイン相乗ドメインお
よび抑制ドメインを含む、ドメインを表す。用語「活性化ドメイン」は、たとえ
ば、遺伝子転写速度を正に調節する（高める）転写因子のドメインを表す。用語
「抑制ドメイン」は、遺伝子転写速度を負に調節する（阻害するまたは低減する
）ドメインを表す。
【００７０】 「転写相乗ドメイン」は、転写活性化ドメインと一緒に存在するとき、転写活
性化力を高めるドメインと定義される。相乗ドメインは、独立した転写アクティ
ベーターであってもよく、あるいは、転写を独力で誘導しない（または通常は誘
導しない）が、転写活性化ドメインの活性を増強することができるドメインであ
ってもよい。この相乗ドメインは、活性化ドメインを含む融合蛋白の成分ドメイ
ンであってもよく、あるいは、たとえば、束化相互作用を介して、ＤＮＡ結合ド
メインまたは転写複合体の他の成分に補充することもできる。
【００７１】 「トランスフェクション」は、裸の核酸分子を受容細胞に導入することを意味
する。「感染」は、核酸を含有するウイルスによって核酸が細胞に導入される過
程を指す。「生産的感染」は、ウイルスが細胞に入り、複製され、次いで細胞か
ら放出される過程を指す（時には、「溶菌」感染とも呼ばれる）。「形質導入」
は、任意の手段による細胞への核酸の導入を含む。
【００７２】 「導入遺伝子」は、細胞に導入された核酸配列を指す。導入遺伝子が導入され
た細胞に由来する娘細胞も、（導入遺伝子が欠失していなければ）導入遺伝子を
含むと言われる。導入遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはＲＮＡは、
導入遺伝子が導入される動物または細胞に関して、部分的にまたは完全に非相同
、すなわち、外来であってもよい。あるいは、導入遺伝子は、導入遺伝子が導入
される遺伝子導入動物または細胞の内因性遺伝子と相同であってもよいが、導入
遺伝子が挿入される細胞のゲノムを変える方式で、動物のゲノムに挿入されるよ
うにデザインされるか、挿入される（たとえば、正常な遺伝子とは異なる位置に
挿入される）。導入遺伝子は、エピソームに存在していてもよい。導入遺伝子は
、選択されたコーディング配列の最適発現に必要または望ましいと思われる１つ
以上の発現調節要素および任意の他の核酸、（たとえばイントロン）を含んでも
よい。
【００７３】 用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分
子を指す。ベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可
能な核酸である。連結されている核酸の自律的複製および／または発現が可能ベ
クターがしばしば使用される。発現調節配列に効果的に連結されて含まれている
遺伝子の発現を指令することができるベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる
こともある。一般に、発現ベクターは、概して環状二本鎖ＤＮＡループを指す「
プラスミド」の形をとり、それらのベクターの形では染色体に結合されない。プ
ラスミドが最もよく使用されるベクターの形であるため、本明細書では、「プラ
スミド」と「ベクター」が、互換的に使用されている。しかし、本発明は、同等
の機能を果たし、且つ当技術分野で周知の、または知られるようになる、このよ
うな他形のベクターも含むものとする。ウイルスベクターはウイルスの粒子内に
詰め込むことができウイルスの配列を含む核酸分子である。
【００７４】 （束化ドメイン） 上述の通り、束化ドメインは、蛋白−蛋白相互作用を介して類似したドメイン
と相互に作用し、蛋白「束」の形成を誘導する。束化ドメインの選択によって、
束化ドメインを含む蛋白の様々な状態のオリゴマー（二量体、三量体、四量体な
ど）を形成することができる。
【００７５】 ニ量化ドメインの一例は、ロイシンジッパー（ＬＺ）要素である。一般に、ロ
イシンジッパーは、アミノ酸６個によって互いに隔てられたロイシン残基を４〜
５個含むアミノ酸約３５個の伸張として認定されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ ａ
ｎｄ Ａｂｅｌ（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：２４−２５）。代表的な
ロイシンジッパーが、種々の真核ＤＮＡ結合蛋白、たとえば、ＧＣＮ４、Ｃ／Ｅ
ＢＰ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃおよびｃ−Ｍａｘに存在する。その
他のニ量化ドメインは、ラセン−ループ−ドメインを含む。（Ｍｕｒｒｅ， Ｃ
． ｅｔ ａｌ． (１９８９) Ｃｅｌｌ ５８：５３７−５４４）。ニ量化ド
メインは、レチノイン酸レセプター、甲状腺ホルモンレセプターまたは他の核ホ
ルモンレセプターのような他の蛋白（Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９
９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７：１４２３−１４３５）、または酵母転写因
子ＧＡＬ４およびＨＡＰ１（Ｍａｒｍｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２
） Ｎａｔｕｒｅ ３５６：４０８−４１４、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１
９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２
８５１−２８５５）から選択することも可能である。Ｅｉｓｅｎｍａｎによる米
国特許第５，６２４，８１８号には、ニ量化ドメインについてさらに説明されて
いる。
【００７６】 現在特に関心のあるものは、四量体形成束化ドメインである。このような四量
化ドメインを融合蛋白内に組込むと、四量体クラスターまたは束の構成的アセン
ブリができる。たとえば、活性化単位４個を四量化ドメインに共有結合すること
によって、活性化単位４個の束を作ることができる。束化ドメインを介して活性
化単位を１つに集合させることにより、活性化単位４個を、プロモーターのＤＮ
Ａ結合ドメイン１個に配送することができる。Ｅ． ｃｏｌｉラクトースレプレ
ッサー四量化ドメイン（アミノ酸４６−３６０、Ｃｈａｋｅｒｉａｎ ｅｔ ａ
ｌ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１３７１、Ａｌ
ｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２：３２２７、
およびＬｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ２７１：１２
４７）は、このクラスを具体的に説明するものである。さらに、融合蛋白は、束
化ドメインに連結された複数の活性化単位を含むため、四量体の４個の蛋白は、
それぞれ、複数の活性化単位を含むことが可能である（複合体は４個より多い活
性化単位を含むことが可能である）。
【００７７】 その他の代表的な四量化ドメインとしては、ｐ５３の残基３２２−３５５に由
来するものなどがある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅ
ｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：５１８２、Ｃｌｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：３８６）。Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓによる米国特許
第５，５７３，９２５号も参照されたい。その他の束化ドメインを、肝細胞核因
子−１（ＤＣｏＨ）のニ量化補因子から誘導することができる。ＤＣｏＨは、特
定のＤＮＡ結合蛋白と会合し、フェニルアラニンヒドロキシラーゼのビオプテリ
ン補因子の脱水に触媒作用を及ぼす。ＤＣｏＨは、四量体である。たとえば、Ｅ
ｎｄｒｉｚｚｉ， Ｊ．Ａ．， Ｃｒｏｎｋ， Ｊ．Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｗ．
， Ｃｒａｂｔｒｅｅ， Ｇ．Ｒ およびＡｌｂｅｒ， Ｔ．（１９９５） Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２６８， ５５６５５９、Ｓｕｃｋ ａｎｄ Ｆｉｃｎｅｒ（１
９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３８９（１）：３−３９、Ｓｔａｎｄｍａｎｎ
， Ｓｅｎｋｅｌ ａｎｄ Ｒｙｆｆｅｌ（１９９８） Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ
Ｂｉｏｌ ４２（１）：５３−５９を参照されたい。
【００７８】 束化ドメインは、天然のペプチド配列を含んでもよく、または改変したまたは
人工的なペプチド配列を含んでもよい。束化ドメインの配列改変を使用して、束
形成の安定性を高めたり、野生型束化ドメインを含む操作された細胞中の生来の
蛋白分子との、意図されたものではない束化を回避するのを助けることができる
。
【００７９】 たとえば、ロイシンジッパーによって推進されるオリゴマー化を安定させる配
列置換が知られている（上記Ｋｒｙｌｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、上記Ｏ
'Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．（１９９２））。
【００８０】 例を挙げて説明するために、ヒトｐ５３の残基１７４または１７５を、それぞ
れ、グルタミンまたはロイシンと置き換えることが可能である。
【００８１】 意図されたものではない内因性蛋白分子との束化を避けるための配列改変を、
例を挙げて説明するために、ｐ５３四量化ドメインを改変して、野生型ｐ５３ま
たは腫瘍由来のｐ５３突然変異体のような、野生型ｐ５３四量化ドメインを有す
る内因性ｐ５３蛋白と束化する公算を低減させることができる。このような変化
したｐ５３四量化ドメインは、Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓによる米国特許第５，５
７３，９２５に記載されており、四量化を維持する方法による、生来のｐ５３四
量化ドメインの分裂および非相同束化ドメインの挿入を特徴とする。残基３３５
−３４８、またはこれらの残基の部分集合を含むｐ５３四量化ドメインの分裂は
、もはや野生型ｐ５３または腫瘍由来のｐ５３突然変異体による四量化を推進で
きないように、このドメインの機能を十分に崩壊させる。しかし、同時に、非相
同ニ量化ドメインを導入すると、非相同ニ量化ドメインとｐ５３四量化ドメイン
配列の残基部分の両者が介在する、四量体形成能力が回復する。
【００８２】 専門家は、四量体を形成するＧＣＮ４ロイシンジッパーの変異体のような半人
工的束化ドメインを含め、他の適当な束化ドメインを容易に選択したりデザイン
したりすることができる。（Ａｌｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｅ
ＭＢＯ Ｊ． １２：３２２７−３２３６、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ． （
１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−１４０７、Ｋｒｙｌｏｖ ｅ
ｔ ａｌ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３：２８４９−２８６１）。Ｈ
ａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）（前出）に記載のＧＣＮ４ロイシンジ
ッパーの四量体変異体は、超ラセンの位置ｄにイソロイシンがあり、位置ａにロ
イシンがあるのに対して、元のジッパーは、それぞれ、ロイシンおよびバリンを
有する。
【００８３】 少なくともある程度、束の望ましい構造に基づいて、束化ドメインを選択する
ことができる。たとえば、ＧＣＮ４ロイシンジッパーは、平行サブユニットアセ
ンブリを推進し［Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、上記］、生来の
ｐ５３四量化ドメインは逆平行アセンブリを推進する［Ｃｌｏｒｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９４）上記、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８９７４−８９７８］
． さらに、その他の天然の束化ドメインの同定、ならびに突然変異体または別の
人工的配列に由来する束化ドメインの選択に、種々の技術を利用できる。たとえ
ば、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｇｅｎｅ １８５：２４５、Ｏ'Ｓ
ｈｅａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：６９９−７０８、Ｋｒｙｌ
ｏｖ ｅｔ ａｌ．［上記］を参照されたい。
【００８４】 動物全身内の（または、動物全身内で使用するための）細胞の遺伝子操作を含
む本発明を適用する際に、可能であれば、その種に由来するペプチド配列を使用
することが好ましい。たとえば、ヒト遺伝子療法を含む用途では、ヒト蛋白由来
の束化ドメインを使用すると、免疫原性反応の危険性を最小限に抑えることが可
能である。しかし、ヒト起源の束化ドメインを使用すると、融合蛋白と、束化ド
メインが由来する内因性蛋白との間に、相互作用を惹起する、すなわち、融合蛋
白と、同じ束化ドメインを含む内因性蛋白との好ましくない束化を招く場合もあ
る。このような相互作用は、標的遺伝子発現の阻害のほかにも、たとえば、束化
ドメインが由来する内因性蛋白の機能を妨害することによって、細胞で他の有害
作用を示す可能性がある。
【００８５】 本発明の融合蛋白と、内因性蛋白との好ましくない束化を回避するアプローチ
は、（ａ）宿主生物と非相同である、（ｂ）宿主生物により発現されるが、融合
蛋白を発現する細胞または組織以外の細胞または組織に限られる（または支配的
である）、または（ｃ）ペプチド配列の改変によって、内因性束化ドメインとで
はなく、自身と優先的に束化するという具合に操作されている、束化ドメインの
使用を含む。
【００８６】 第１のアプローチは、細菌のｌａｃレプレッサー四量化ドメインをヒト細胞で
使用することによって、説明される。
【００８７】 第２のアプローチでは、本発明の融合蛋白を発現するように操作される細胞ま
たは組織で発現されない蛋白に由来する束化ドメインを、少なくとも束化アプリ
ケーションまたは正常な細胞機能を過度に妨害しないレベルで、使用することが
必要である。１つの組織で選択的にまたは優先的に発現される内因性蛋白に由来
する束化ドメインを含む融合蛋白は、有害作用なしに、異なる組織で発現される
可能性がある。たとえば、ヒト筋肉における遺伝子発現を調節するために、肝、
脳またはその他の組織で発現されるが、筋肉では発現されない蛋白由来の束化ド
メインを含む融合蛋白を、誤った束化の過度の危険性なしに、筋肉細胞で発現さ
せることができる。
【００８８】 第３のアプローチでは、また前述の通り、ペプチド配列を改変することによっ
て、改質ペプチド配列を含む蛋白に対する束化活性が、野生型束化ドメインを含
む蛋白に関する束化活性に取って代わるように、束化ドメインの結合特異性を操
作する。
【００８９】 本発明を実行する際に使用することができる組織特異的束化ドメインの若干例
として、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ レセプター（Ｋｅｒｓｔｅｎ， Ｓ．， Ｒｅ
ｃｚｅｋ， Ｐ．Ｒ ａｎｄ Ｎ． Ｎｏｙ（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２７２， ２９７５９− ２９７６８）、ドーパミンＤ３レセプタ
ー（Ｎｉｍｃｈｉｎｓｋｙ， Ｅ．Ａ．， Ｈｏｆ， Ｐ．Ｒ．， Ｊａｎｓｓ
ｅｎ， Ｗ．Ｇ．Ｍ．， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ．Ｈ ａｎｄ Ｃ． Ｓｃｈ
ｍａｕｓｓ（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２９２２
９−２９２３７）、ブチルコリンエステラーゼ（Ｂｌｏｎｇ， Ｒ．Ｍ．， Ｂ
ｅｄｏｗｓ， Ｅ ａｎｄ Ｏ． Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ（１９９７） Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． Ｊ． ３２７，７４７−７５７）、チロシンヒドロキシラーゼ（Ｇｏ
ｏｄｗｉｌｌ， Ｋ．Ｅ．， Ｓａｂａｔｉｅｒ， Ｃ．， Ｍａｒｋｓ， Ｃ
．， Ｒａａｇ， Ｒ．， Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ， ＰＹＦ ａｎｄ Ｒ．
Ｃ． Ｓｔｅｖｅｎｓ（１９９７） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ 7
， ５７８−５８５）、Ｂｃｒ（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ， Ｊ．Ｒ．， Ｇａｌａ
ｓｓｏ， Ｄ．Ｌ ａｎｄ Ｊ．Ｙ． Ｗａｎｇ（１９９３） Ｍｏｌ． Ｃｅ
ｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ７５８７−７５９５）、およびアポリポ蛋白Ｅ（
Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ， Ｊ．Ａ ａｎｄ Ｋ．Ｈ． Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ（
１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８，１５７４５−１５７５０
）に由来する束化ドメインが挙げられる。
【００９０】 （転写活性化ドメイン／活性化単位） 転写活性化ドメインおよび活性化単位は、標的遺伝子構成物の転写を活性化ま
たは増強することができる限り、天然または非天然のペプチド配列を含んでもよ
い。真核細胞における転写を活性化または増強することができる種々のポリペプ
チド配列およびポリペプチド配列は、融合蛋白の成分として発現されるとき、そ
の活性化機能を保持することが知られており、多くの場合、証明されている。一
般に、活性化単位は、少なくとも６個のアミノ酸であり、好ましくは約３００未
満のアミノ酸残基、さらに好ましくは２００未満、あるいは１００未満の残基を
含む。
【００９１】 天然の活性化単位は、本明細書で「Ｖｃ」と呼ばれる、ＶＰ１６のＣ−末端か
らアミノ酸３０個の配列（アミノ酸４６１−４９０）のような、転写因子の一部
を含む。他の活性化単位は、天然のペプチドから誘導される。たとえば、天然の
活性化単位のアミノ酸１個を別のものと交換して、活性化をさらに高めることが
可能である。このような活性化単位の一例は、ＶＰ１６のアミノ酸８個のペプチ
ドの誘導体であり、この誘導体じは、アミノ酸配列ＤＦＤＬＤＭＬＧを有する。
その他の活性化単位は、天然の配列から誘導されないため「合成」または「人工
的」である。たとえば、酸性アミノ酸のある一定のランダム配列は、転写を活性
化できることが判明している。
【００９２】 ある種の転写因子は、特定の細胞タイプのみで活性である、すなわち、組織特
異的方式で転写を活性化することが判明している。特定の細胞で選択的または優
先的に機能する活性化単位を使用することによって、所望の組織特異性を有する
本発明の転写アクティベーターをデザインすることが可能である。
【００９３】 本発明の融合蛋白に使用するためペプチド配列の１つの起源は、単純ヘルペス
ウイルスビリオン蛋白１６（本明細書でＶＰ１６と呼ばれ、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅ
ｒｇ， Ｓ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２：７
１８−７２９にそのアミノ酸配列開示されている）である。たとえば、ＶＰ１６
のＣ−末端アミノ酸約１２７個に相当する活性化単位を使用することができる。
あるいは、転写活性化能を保持するＶＰ１６のＣ−末端領域からアミノ酸約１１
個の少なくとも１つのコピーを、活性化単位として使用することができる。この
配列のコピーを２つ以上含むオリゴマーを使用することが好ましい。ＶＰ１６の
適当なＣ−末端ペプチド部分としては、Ｓｅｉｐｅｌ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．
（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９２） １３：４９６１−４９６８）に記載のものが挙
げられる。
【００９４】 酸性活性化単位のもう１つの例は、ＧＡＬ４の残基７５３−８８１である。
【００９５】 転写活性化単位の特に重要な１つの起源は、（ヒト）NF−kBサブユニットｐ６
５である。この活性化ドメインは、残基４５０−５５０にわたるｐ６５配列の全
部または一部を含むペプチド配列、またはそれから誘導されるペプチド配列のコ
ピーを、１つ以上含んでもよい。ある特定の実施形態で、たとえば、「ＡＰ活性
化単位」を含む、ｐ６５残基３６１−４５０にわたる配列を含むように、ｐ６５
ペプチド配列を延長すると、予想外の転写活性化増進につながることが確認され
ている。さらに、ｐ６５（３６１−５５０）の全部または一部を含むペプチド配
列、またはそれから誘導されるペプチド配列は、非相同活性化単位と組み合せる
と、転写活性化のレベルがさらに驚くほど上昇する。ｐ６５系活性化ドメインは
、広範囲のプロモーター全域に機能し、且つ多数の束化実験で、それ自身が非常
に強力な活性化ドメインとして広く認められているＶＰ１６の非束化縦列コピー
を用いて得られたものより、６倍、８倍、さらに１４〜１５倍も高い、染色体的
に組込まれた標的遺伝子の転写レベルが得られた。
【００９６】 ｐ６５活性化単位を含む融合蛋白をコードするリコンビナントＤＮＡ分子、ま
たはそれから誘導されるペプチド配列は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１
６１７号、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０５９１号、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８号
等々に記載されているようなニ量化を基本とする調節された系を含む様々な状況
で、またＢｕｊａｒｄ ｅｔ ａｌ．により報告されたテトラサイクリン系の調
節を含むものや、ステロイドまたは他のホルモン系の調節を含むもののようなア
ロステリック系の調節を含む他の非相同転写システムで、非相同遺伝子発現に際
立った利点を提供することが予期される。
【００９７】 １クラスのｐ６５系の転写因子は、ｐ６５由来のメインのコピーを１つより多
く含む。一般に、このような蛋白は、ｐ６５（３６１−５５０）の全部または一
部を含むペプチド配列、またはそれから誘導されるペプチド配列のコピーを２つ
以上、一般に約６つまで含む。このような反復したｐ６５系の転写活性化ドメイ
ンは、束化アプローチにも、非束化アプローチにも有用である。
【００９８】 真核細胞における転写活性化活性を有する他のポリペプチドを使用して、本発
明の融合蛋白に活性化単位を提供することができる。様々な蛋白内に存在する転
写活性化ドメインは、共有の構造的特徴に基づいて、何種類かに分類されている
。転写活性化ドメインのタイプとしては、酸性転写活性化ドメイン（前述）、富
プロリン転写活性化ドメイン、富セリン／スレオニン転写活性化ドメインおよび
富グルタミン転写活性化ドメインなどがある。富プロリン活性化ドメインの例と
しては、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９およびＡＰ２のアミノ酸
残基３１−７６が挙げられる。富セリン／スレオニン転写活性化ドメインの例と
しては、ＩＴＦ１のアミノ酸残基１−４２７およびＩＴＦ２のアミノ酸残基２−
４５１が挙げられる。富グルタミン活性化ドメインの例としては、Ｏｃｔ１のア
ミノ酸残基１７５−２６９およびＳＰ１のアミノ酸残基１３２−２４３が挙げら
れる。上述の各領域のアミノ酸配列、および他の有用な転写活性化ドメインのア
ミノ酸配列は、Ｓｅｉｐｅｌ， K． ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９
２） １３：４９６１−４９６８）に開示されている。
【００９９】 さらに他の説明に役立つヒト起源の活性化ドメインおよびモチーフとしては、
ヒトＣＴＦの活性化ドメイン、Ｏｃｔ−２のアミノ酸１８個（ＮＦＬＱＬＰＱＱ
ＴＱＧＡＬＬＴＳＱＰ）の富グルタミン領域、ｐ５３のN−末端のアミノ酸７２
個、ＳＹＧＱＱＳ反復ユーイング肉腫遺伝子およびＲｅｌ Ａ蛋白のアミノ酸１
１個（５３５−５４５）の富酸性領域などがある。
【０１００】 前述の転写活性化ドメインに加えて、標準技術で同定することができる新規転
写活性化単位は、本発明の範囲内である。ポリペプチドをＤＮＡ結合ドメインに
連結し、融合蛋白によって刺激される標的配列の転写の量を測定することによっ
て、ポリペプチドの転写活性化能を分析することができる。たとえば、当技術分
野で使用される標準アッセイは、想定上の活性化単位とＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ド
メイン（たとえば、アミノ酸残基１−９３）との融合蛋白を使用する。次いで、
この融合蛋白を使用して、ＧＡＬ４ 結合部位に連結されたレポーター遺伝子の
発現を刺激する（たとえば、Ｓｅｉｐｅｌ， K． ｅｔ ａｌ．（１９９２）
ＥＭＢＯ Ｊ． １１：４９６１−４９６８およびその中で引用された参考文
献を参照）。
【０１０１】 本発明の活性化ドメインは真核種（様々な酵母種、および哺乳類を含む様々な
脊椎動物種が含まれるが、その限りではない）のものであってもよく、あらゆる
活性化単位またはドメインが同じ種のものである必要はない。本発明を全生物に
適用する際に、融合蛋白に対する免疫反応を回避するために、多くの場合、受容
者と同じ種の活性化単位および活性化ドメインを使用することが好ましい。
【０１０２】 （活性化ドメインにおける突然変異） 活性化ドメインの効力を増強する１つの方法は、ペプチド配列の改変によって
、その酸性アミノ酸含有率または疎水性アミノ酸含有率をを高めることである。
活性化ドメインの効力を増強することができる酸性アミノ酸としては、アスパラ
ギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。特に、多数の個別的に弱い活性化ドメ
インが、たとえば、束化によって、一緒に配置される場合は、さほど急勾配では
ない活性化曲線を得るために、活性化ドメインの効力を低下させたい（通常は、
適度に）場合もある。したがって、本発明の１つの実施形態では、当技術分野で
周知の標準技術、たとえば、位置指定ＰＣＲベースの突然変異誘発によって、突
然変異が活性化ドメイン導入される。この実施形態では、１〜５の、場合によっ
ては１〜３の、ペプチド配列の変更を、活性化ドメインに関するＤＮＡコーディ
ング導入することができる。一時的にトランスフェクトされた標的レポーター遺
伝子構成物またはしっかりと組込まれた標的レポーター遺伝子構成物の転写を誘
導する能力について、これらの各突然変異を、単独で、または１つ以上の他の突
然変異と組み合せて、分析することが可能である。たとえば、改変された配列の
複数のコピーおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコードする構成物を細
胞に導入し、コードされた融合蛋白の活性を、（応答性レポーター遺伝子構成物
を用いた）転写アッセイで測定し、野生型活性化ドメイン配列または関心事の異
なる突然変異を含む類似の融合蛋白と比較することができる。
【０１０３】 前述のものを、ｐ６５転写活性化ドメインの場合で説明する。１つ以上のｐ６
５転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコードする構
成物を調製する。ｐ６５ドメインは、野生型（対照として）であってもよく、ペ
プチド配列に種々の変化を幾らか含んでもよい。一般に、これらの突然変異は、
種々のｐ６５由来の転写活性化ドメインに導入される。たとえば、アミノ酸５３
３〜５５０の間、または３６１〜５５０、または２８０〜５５０の間の領域をコ
ードするｐ６５活性化ドメインを担持するプラスミドに、M１突然変異を導入す
ることができる。
【０１０４】 ｐ６５転写活性化ドメインに適する代表的な突然変異としては、ｐ６５活性化
ドメインの効力を増強するためのもの（M１、M２、M６、M７およびM８突然変異
を含む）および活性化ドメインの効力を（一般に僅かに）低減するものがある。
ｐ６５活性化ドメインはフェニルアラニン残基を４個含み、且つこれらの残基を
アラニンに変換する突然変異はｐ６５活性化ドメインの効力を有意に低減するこ
とが、酵母実験およびｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で証明されている。Ｆ５３３および
Ｆ５４１をアラニン残基に変えると、ｐ６５活性化ドメインの効力が野生型のレ
ベルの半分まで低減することが、我々の実験からわかる。Ｍ４クラスおよびＭク
ラス５の突然変異は、アミノ酸３６１〜４５０の間のセリン残基およびプロリン
残基を変化させる。Ｍ４およびＭ５突然変異体配列は、他の酸性型活性化ドメイ
ンに融合したとき、標的遺伝子の発現を相乗的に誘導できることが、我々のデー
タからわかる。ＧＳＴプルダウンアッセイで、Ｍ４およびＭ５突然変異の領域は
、ＴＦＩＩＡと相互に作用する。Ｍ４突然変異およびＭ５突然変異は、個別には
、ｐ６５活性化ドメインがレポーター遺伝子を誘導する力に対して、非常に小さ
い作用を有するが、合併すると、その効力を有意に低減させる。したがって、専
門家が心に銘記すべき突然変異を以下に挙げるが、この限りではない： ＷＴ： ５３２−ＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱＩＳ Ｍ１： ５３２−ＤＦＳＤＦＡＤＭＤＦＤＡＤＬＳＯＩＳ ＷＴ： ４３９−ＡＬＬＱＬＱＦＤＤＥＤ Ｍ２： ４３９−ＡＬＬＤＬＤＦＤＤＥＤ ＷＴ： ５２９−ＧＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱＩ Ｍ３： ５２９−ＧＤＥＤＡＳＳＩＡＤＭＤＡＳＡＬＬＳＱＩ ＷＴ： ３７７−ＳＡＬＡＬＰＡＰＰＱＶＬ Ｍ４： ３７７−ＧＡＬＡＬＧＡＧＧＱＶＬ ＷＴ： ４０１−ＳＡＬＡＱＡＰＡＰＶＰ Ｍ５： ４０１−ＧＡＬＡＱＡＧＡＧＶＧ ＷＴ： ４３４−ＧＴＬＳＥＡＬＬＱＬＱＦＤ Ｍ６： ４３４−ＧＤＦＳ−ＡＬＬＱＬＱＦＤ ＷＴ： ４７２−ＳＥＦＱＱＬＬＮＱ Ｍ７： ４７２−ＳＥＦＳＡＬＬＮＱ ＷＴ： ４７２−ＳＥＦＱＱＬＬＮＱ Ｍ８： ４７２−ＳＤＦＱＱＬＬＮＱ ＷＴ： ５３０−ＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳ Ｍ９： ５３０−ＤＥＤＦＳＳＬＬＤＭＤＦＳ （相乗ドメイン） 相乗ドメインは、転写活性化ドメインと一緒にプロモーターに補充されると、
転写活性化効力を著しく増強するドメインである。相乗ドメインは、独立した転
写活性化ドメインであってもよく、独力で転写を誘導しないが、活性化単位と共
有的に連結している（すなわち、同じ融合蛋白内）か、または（たとえば、束化
介在性クラスター化またはリガンド介在性クラスター化によって）非共有的に会
合している転写活性化ドメインの活性を増強することができる活性化単位であっ
てもよい。
【０１０５】 相乗ドメインの一例は、いわゆるｐ６５の「富アラニン／プロリン」すなわち
「ＡＰ」活性化モチーフであり、その蛋白のほぼアミノ酸３６１からほぼアミノ
酸４５０におよぶ。たとえば、ｐ５３蛋白およびＣＴＦ蛋白にも、類似したＡＰ
活性化モチーフが存在する。蛋白にＡＰドメインのみのコピーが１個または数個
存在しても、アクティベーター依存性転写活性化を誘導することはできない。し
かし、それ自身が、あるレベルのアクティベーター依存性転写を誘導することが
できる活性化単位、たとえば、ｐ６５またはＶＰ１６の別の部分に連結されると
、ＡＰ活性化単位は第２の活性化ドメインと相乗的に作用して、転写レベルを高
める。
【０１０６】 したがって、本発明は、ＡＰ活性化単位、その機能的誘導体、または独力で転
写を活性化することができない他の相乗ドメインを提供する。たとえば、ＴＦＩ
ＩＡへの結合に関して候補の配列をスクリーニングし、共トランスフェクション
アッセイで転写活性を測定することによって、相乗ドメインとして使用するため
の、特にＡＰ活性化単位の誘導体を含む機能的な代替配列を獲得することができ
る。このような同等物は、N−末端またはＣ−末端または両者のいずれかで切ら
れている活性化単位の形態、たとえば、アミノ酸残基が約７５、６０、５０、３
０または２０の長さ（たとえば、アミノ酸２０〜８９個の長さの範囲）の、ｐ６
５のフラグメント（またはそれと相同の配列）を含むことが予期される。同様に
、ｐ６５のＡＰ活性化単位配列は、たとえば、ＵＳＳＮ ０８／９１８，４０１
の配列番号２のＡＰ活性化単位配列と少なくとも９５％、９０％、８０％、およ
び７０％同じＡＰモチーフを作るための、アミノ酸置換に耐えることができる。
これらのＡＰ誘導体および他の誘導体としては、たとえば、天然の配列を基礎と
するものの、アミノ酸残１、２、３、４または5個の基置換、挿入または欠失に
よって改変されているＡＰドメインが挙げられる。
【０１０７】 その他の相乗ドメインは、独立した活性化ドメイン、たとえばＶＰ１６である
。ＶＰ１６は独力で転写を活性化することができるが、ｐ６５と相乗的に作用し
て各活性化ドメイン単独で遂行される転写レベルの合計より高レベルの転写を生
じさせる。実施例に示すとおり、ＦＲＢドメイン、ｌａｃレプレッサー四量化ド
メインおよびｐ６５を含む核酸にＶＰ１６を融合させると、ＶＰ１６が存在しな
い同じ構成物に比べて、標的遺伝子の発現レベルが大きく上昇する。
【０１０８】 非束化ＤＮＡ結合ドメインまたは束化ＤＮＡ結合ドメインに相乗ドメインを融
合してもよい。上記のような構成物による構成的方式での転写の活性化を回避す
るためには、相乗ドメイン自身は転写を活性化することができないことが好まし
い。
【０１０９】 （リガンド結合ドメイン） 本発明を実行する際に使用するためのリガンド結合ドメインを含む融合蛋白は
、種々の分子メカニズムの１つを介して機能することができる。
【０１１０】 ある特定の実施形態で、リガンド結合ドメインは、適切なリガンド結合ドメイ
ンを担持する融合蛋白分子のリガンド介在性架橋を可能にする。この場合、リガ
ンドは少なくとも二価であり、２つの融合蛋白に結合して、標的遺伝子発現を活
性化する架橋したヘテロ二量体複合物を形成することによって、二量体化剤の役
割をする。たとえば、ＷＯ ９４／１８３１７号、ＷＯ ９６／２０９５１号、
ＷＯ ９６／０６０９７号、 ＷＯ ９７／３１８９８号およびＷＯ ９６／４
１８６５号を参照されたい。
【０１１１】 他の実施形態で、リガンドを融合蛋白に結合させると、蛋白のアロステリの変
化が生じ、融合蛋白は標的ＤＮＡ配列［たとえば、米国特許第５、６５４，１６
８号および第５，６５０，２９８号（試験系）、およびＷＯ ９３／２３４３１
号およびＷＯ ９８／１８９２５号（ＲＵ４８６を基本とする系）を参照］か、
または標的ＤＮＡ配列に結合する別の蛋白［たとえばＷＯ ９６／３７６０９号
およびＷＯ ９７／３８１１７号（エクジソン／ＲＸＲを基本とする系）］に結
合し、いずれの場合にも、標的遺伝子発現を調整する。
【０１１２】 （ニ量化を基礎とする系） 架橋を基礎とするニ量化系で、融合蛋白は、１つ以上のリガンド結合ドメイン
を含んでもよく（このようなドメインを２個、３個または４個含む場合もある）
、たとえば、ＤＮＡ結合ドメインや転写活性化ドメインなどを含む、リガンド結
合ドメインに関して非相同な１つ以上の補足的ドメインをさらに含んでもよい。
【０１１３】 一般に、任意のリガンド／リガンド結合ドメイン対を、このような系で使用す
ることが可能である。リガンド結合ドメインに適するリガンドが判明しているか
同定することができる限り、たとえば、リガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰのよ
うなイムノフィリン、サイクロフィリン、ＦＲＢドメイン、ホルモンレセプター
蛋白、抗体などに由来のものであってもよい。
【０１１４】 たいていは、レセプタードメインは、そのままのドメインまたはその先端が切
られた活性部分のいずれとしても、アミノ酸少なくとも約５０個、且つアミノ酸
約３５０未満、通常はアミノ酸２００個未満である。上述の通り、結合ドメイン
は、小さく（＜２５ｋＤａ、ウイルスベクターにおける能率的なトランスフェク
ションを可能にするため）、モノマーで、非免疫原性であり、且つ合成で入手可
能な、細胞浸透性の、無毒のリガンドを有することが好ましい。
【０１１５】 好ましくは、リガンド結合ドメインは、それ自身は遺伝子生成物ではなく（す
なわち、蛋白ではない）、約５ｋＤ未満、好ましくは約２．５ｋＤ未満の分子量
を有し、且つ細胞浸透性であるリガンドに適する（すなわち、結合する）ことが
好ましい。多くの場合、リガンドは、転写レギュレーターとしての使用を妨げる
固有の薬理学的活性または毒性を持たないことが好ましい。
【０１１６】 種々の理由で、リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を、突然変異誘
発に供してもよい。突然変異誘発リガンド結合ドメインは、より高いアフィニテ
ィを実現し、リガンドによる、リガンド結合ドメインの突然変異体と天然型との
間の識別を可能にし、リガンド−リガンド結合ドメイン対などをデザインする機
会を与える。リガンド結合ドメインの変化は、リガンド結合に含まれるか、また
はリガンド依存性構造変化を伴うことが判明している、指示されたアミノ酸の変
化を含んでもよい。あるいは、組み合せ技術を使用したランダム突然変異誘発を
使用してもよい。いずれの事象でも、突然変異体リガンド結合ドメインを適切な
原核宿主または真核宿主で発現させ、次いで、所望のリガンド結合または構造特
性についてスクリーニングすることができる。ＷＯ ９４／１８３１７号、ＷＯ
９６／０６０９７号、ＷＯ ９７／３１８９８号およびＷＯ ９６／４１８６
５号には、ＦＫＢＰ、サイクロフィリンおよびＦＲＢドメインを含む例が詳細に
開示されている。たとえば、ＦＫＢＰ１２のＰｈｅ３６をＡｌａに変え、且つ／
またはＡｓｐ３７をＧｌｙまたはＡｌａに変えて、リガンドＦＫ５０６またはＦ
Ｋ５２０またはそれらの類縁体、模擬物、二量体またはその他の誘導体の９位ま
たは１０位の置換基を調節することができる。特に、Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、
Ａｓｐ３７、Ｔｙｒ８２およびＰｈｅ９９の１つ以上の代わりに、Ｖａｌ、Ａｌ
ａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔまたはその他の小さいアミノ酸を含む突然変異体ＦＫＢＰ１
２ドメインは、Ｃ９および／またはC１０における改変を含むＦＫ５０６タイプ
およびＦＫ５２０タイプのリガンドまたはそれらの合成同等物に対するレセプタ
ードメインとして、特に興味深い。（たとえば、ＷＯ ９７／３１８９８号を参
照）。目下関心のあるＦＫＢＰドメインの例示的突然変異を以下に示す。
【０１１７】
【表１】 表１： 記載事項から、一文字コードおよび配列位置によってそのままのアミノ
酸を、続いて突然変異体のアミノ酸を確認できる。したがって、Ｆ３６Ｖは、３
６位のフェニルアラニンがバリンで置き換えられているヒトＦＫＢＰ１２配列を
示す。Ｆ３６ＶＦ９９Ａは、３６位および９９位のフェニルアラニンが、それぞ
れ、バリンおよびアラニンで置き換えられている二重突然変異を表す。
【０１１８】 ＦＫＢＰ：ラパマイシン複合体（「ＦＲＢ」）に結合するドメインの説明に役
立つ実例は、ヒトＦＲＡＰの残基２０２５−２１１３を含む、アミノ酸が約８９
個の配列を含むものである。関心事のＦＲＡＰ由来の別の配列は、アミノ酸２０
２４−２１１３から成るアミノ酸９３個の配列を含む。薬剤のＦＲＡＰ結合部分
のラパマイシンと比較して、改変を含むラパマイシン類縁体（ラパログラパログ
）とのＦＫＢＰ複合体に優先的に結合する（すなわち、「衝突」される）突然変
異体ＦＲＡＰ由来のドメインの生成に、同様の考えが当てはまる。たとえば、ヒ
トＦＲＡＰ ＦＲＢペプチド配列を基礎とするが、残基Ｔｙｒ２０３８、Ｐｈｅ
２０３９、Ｔｈｒ２０９８、Ｇｌｎ２０９９、Ｔｒｐ２１０１およびＡｓｐ２１
０２の１つ以上に関してアミノ酸置換を担持するＦＲＢと共に、Ｃ７位の−OＭe
以外の置換基を担持するラパログとを使用して、優先的な結合を獲得することが
できる。代表的な突然変異としては、Ｙ２０３８H、Ｙ２０３８Ｌ、Ｙ２０３８
Ｖ、Ｙ２０３８Ａ、Ｆ２０３９H、Ｆ２０３９Ｌ、Ｆ２０３９Ａ、Ｆ２０３９Ｖ
、Ｄ２１０２Ａ、Ｔ２０９８Ａ、Ｔ２０９８Ｎ、Ｔ２０９８Ｌ、およびＴ２０９
８Ｓなどがある。Ｃ２８の−ＯＨ以外の置換基および／またはＣ３０の＝Ｏ以外
の置換基を担持するラパログを使用して、Ｇｌｕ２０３２にしてアミノ酸置換を
担持するＦＲＡＰ蛋白への優先的結合を獲得することができる。代表的な突然変
異としては、Ｅ２０３２ＡおよびＥ２０３２Ｓなどがある。衝突したラパログに
優先的に結合する突然変異体ＦＲＡＰを同定するために、上述の手順を使用して
、前述の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＲＢを含む蛋白、それらの位置
でランダム化された（すなわち、それらの残基における様々な置換されたアミノ
酸を含む）蛋白またはペプチドのライブラリ−、蛋白ドメイン全体をランダム化
するライブラリー、または、これらの一連の突然変異体の組み合せを作る。
【０１１９】 本発明で有用なその他のマクロライド結合ドメインは、その突然変異体を含め
、当技術分野で記載されている。たとえば、ＷＯ９６／４１８６５号、ＷＯ ９
６／１３６１３号、ＷＯ ９６／０６１１１号、ＷＯ ９６／０６１１０号、WO
９６／０６０９７号、ＷＯ ９６／１２７９６号、ＷＯ ９５／０５３８９号、
ＷＯ ９５／０２６８４号、ＷＯ ９４／１８３１７号を参照されたい。
【０１２０】 蛋白をコードする配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発または組み合せ改変を
使用することができると、異なるリガンドに対する結合アフィニティに関してス
クリーニングすることができる蛋白のライブラリーを制作することができる。た
とえば、結合蛋白をコードするＤＮＡ配列中の１つ以上の部位で、１〜５、５〜
１０、または１０以上のコドンの配列をランダム化し、発現構成物を作ってその
発現構成物を単細胞微生物に導入し、改変配列のライブラリーを制作することが
できる。次いで、コードされたポリペプチドの、１つ以上のリガンドに対する結
合アフィニティについて、このライブラリーをスクリーニングすることができる
。次いで、アフィニティ配列を導入する対象である細胞に適合する最高のアフィ
ニティ配列を、所与のリガンドに対するリガンド結合ドメインとして使用するこ
とができる。内因性蛋白へのリガンドの結合レベルを決定するのに望ましい宿主
細胞を用いて、このリガンドを評価することが可能である。このような各リガン
ドについて、改変したリガンド結合ドメインに対するリガンド結合アフィニティ
を、内因性蛋白に対するアフィニティと比較する、結合プロフィールを決定する
ことが可能である。次いで、最高の結合プロフィールを有するリガンドをリガン
ドとして使用することが可能である。前述の事柄を実施する際に、非限定的な例
として、ファージ展示技術を使用することができる。
【０１２１】 他の実施形態で、抗体サブユニット、たとえば、可変領域、または１本鎖抗体
の、重鎖または軽鎖、詳細にはフラグメント、さらに詳細には全部または一部を
リガンド結合ドメインとして使用することができる。薬学的に許容できるハプテ
ンに対する抗体を調製し、結合アフィニティに関して、個々の抗体サブユニット
をスクリニングすることができる。抗体サブユニットをコードするｃＤＮＡを単
離し、定常領域または可変領域の一部の欠失、可変領域の突然変異誘発等々によ
って改変し、リガンドに対して適切なアフィニティを有する結合蛋白ドメインを
獲得することができる。この方法で、生理学的に許容できる、ほぼあらゆるハプ
テンＧａｎをリガンドとして使用することができる。特に、結合ドメインが判明
している場合には、抗体単位の代わりに、天然のレセプターを使用することがで
きる。本発明の若干の実施形態で、融合蛋白は、１つ以上のリガンド結合ドメイ
ンを含む。たとえば、ＤＮＡ結合ドメインを、２つ、３つまたは４つ以上のリガ
ンド結合ドメインに連結することができる。複数のリガンド結合ドメインが存在
することは、リガンド介在性架橋によって、転写活性化ドメインを含む複数の融
合蛋白が、ＤＮＡ結合ドメイン含有融合蛋白に補充されることを意味する。
【０１２２】 （アロステリを基礎とする系） 前述の通り、キメラ転写因子のリガンド依存性アロステリック変化を基礎とす
る転写調節系も、本発明の実行に有用である。１つのこのような系は、もはやプ
ロゲステロンまたは他の内因性ステロイドに結合しないが、たとえば、Ｗａｎｇ
ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
U．Ｓ．A． ９１：８１８０に記載の経口的に有効なプロゲステロン拮抗物質
ＲＵ４８６によって活性化することができる、ヒトプロゲステロンレセプターの
欠失突然変異体を使用する。ヒトで流産を誘発する通常用量（１０mｇ／ｋｇ）
よりかなり低い用量のＲＵ４８６（５〜５０ｇ／ｋｇ）を使用してマウスに移植
された細胞で活性化が証明された。しかし、報告によると、培養および動物にお
ける誘発率はかなり低かった。
【０１２３】 もう１つのこのような系は、エクジソン誘導可能系である。ショウジョウバエ
ステロイドエクジソン（Ｅｃ）レセプター（ＥｃＲ）Ｅｃ−結合ドメインを非相
同ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメイン、たとえば、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌｅ
ｘＡやヘルペスウイルスＶＰ１６に融合すると、適切な結合部位の下流に向かう
標的遺伝子のエクジソン依存性活性化が可能になることが初期の研究で証明され
ている。（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． U．Ｓ．A． ８９：６３１４）．Ｅ
ｃＲそのもののＤＮＡ結合ドメインを使用して、改良されたエクジソン調節系が
開発された。この系では、調節転写因子は２つの蛋白：（１）ヘルペスＶＰ１６
に融合した、先端が切られた突然変異体ＥｃＲ、および（２）ＥｃＲとヘテロ二
量体化するウルトラスピラクル（Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）蛋白（ＵＳＰ）
の哺乳類相同部分（ＲＸＲ）として提供される（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６
） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． U．Ｓ．A． ９３：３３
４６）。この系では、ＤＮＡ結合ドメインはヒトレセプター（ヒトfarnesoid
Ｘレセプター）によっても認識されたため、ＤＮＡ結合ドメインを、突然変異体
ＥｃＲのみが認識する部位に変更した。したがって、本発明は、先端が切られた
突然変異体ＥｃRが、本発明の転写アクティベーターの少なくとも１つのサブユ
ニットに融合されるエクジソン誘導可能系を提供する。この転写因子は、ＵＳP
をさらに含み、その結果、エクジソンの存在次第で、ＥｃR標的配列を有する標
的遺伝子の転写を高レベルで誘導する。
【０１２４】 別のアプローチで、この誘導可能系は、標的遺伝子の上流に向かうｔｅｔオペ
レーター（ｔｅｔＯ）配列に結合する、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｅｔレプレッサー（
ＴｅｔＲ）を含むか、ＴｅｔＲから誘導される。テトラサイクリン、またはｔｅ
ｔＲに結合するテトラサイクリン類縁体の存在下で、ＤＮＡ結合は破壊され、し
たがって転写促進は破壊される。事前にＴｅｔＲが、たとえば、ＶＰ１６の転写
活性化ドメインに連結されているこの系は、一般に、Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂ
ｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． U．Ｓ．A．（１
９９２） ８９：５５４７）およびＢｕｊａｒｄ ｅｔ ａｌによる米国特許第
５，４６４，７５８号、第５，６５０，２９８号および第５，５８９，３６２号
に記載されている、アロステリックな「オフスイッチ（off-switch）」と呼ばれ
る。報告によれば、標的遺伝子発現は、可逆的方式で、数桁にわたって調節可能
である。この系は、テトラサイクリンまたは類縁体の非存在下で、低いバックグ
ラウンドおよび比較的高い標的遺伝子発現を実現すると言われる。本明細書に記
載の本発明は、テトラサイクリ系ンまたは他の誘導可能なＤＮＡ結合ドメインに
よって調節可能な、標的遺伝子のさらに強力な転写誘導を獲得する方法を提供す
る。
【０１２５】 幾つかの実施形態で、やはり、Ｅ． ｃｏｌｉ ＴｅｔＲの突然変異体である
が、Ｔｅｔの存在下でＴｅｔＯに結合するＤＮＡ結合ドメインを基礎とする、「
逆」ｔｅｔ系が使用される。突然変異したｔｅｔＲを基礎とする系に関するさら
なる情報は、上記および先に引用した特許に提供されている。本明細書に記載の
束化を使用して、テトラサイクリンの非存在下では非常に低いバックグラウンド
から、テトラサイクリンまたはその類縁体の存在下で、さらに強力な、標的遺伝
子の転写誘導を得る方法を提供することができる。
【０１２６】 本発明を実行する際に有用なｔｅｔＲドメインは、様々なクラス（たとえばク
ラスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ）のいずれかのｔｅｔＲの天然のペプチド配列を含
んでもよく（その場合、リガンドが存在しないと、標的遺伝子転写を刺激する）
、あるいは、さらに好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加または
欠失によって異なる、天然の配列から誘導された、突然変異したｔｅｔＲを含む
。特に興味深いものは、リガンドが存在するとＴｅｔＯ配列への結合を刺激して
、本発明に従って操作された細胞における標的遺伝子転写を誘導する、突然変異
したｔｅｔＲドメインである。たとえば、突然変異したｔｅｔＲドメインは、７
１位、９５位、１０１位および１０２位のアミノ酸の１つ以上にアミノ酸置換を
有する、突然変異したＴｎ１０由来のｔｅｔＲドメインを含む。さらに例を挙げ
て説明するために、１つの突然変異したｔｅｔＲは、グルタミン酸７１がリシン
に変わり、アスパラギン酸９５がアスパラギンに変わり、ロイシン１０１がセリ
ンに変わり、グリシン１０２がアスパラギン酸に変わっているＴｎ１０ ｔｅｔ
Ｒのアミノ酸１−２０７を含む。リガンドは、テトラサイクリン、および、たと
えば、無水テトラサイクリンやドキシサイクリンをはじめとするテトラサイクリ
ンの多種多様な類縁体および模擬物を含む。これらの実施形態における標的遺伝
子構成物は、たとえば、適切なｔｅｔオペレーターに関する上流のアクティベー
ター配列を含む、関心事のｔｅｔＲによって認識されるＤＮＡ配列のコピーを１
つ以上含む発現調節配列に操作可能に連結した標的遺伝子を含む。たとえば、米
国特許第５，６５４，１６８号を参照されたい。
【０１２７】 （本発明のリガンド） リガンドに適するリガンド結合ドメインが、操作すべき細胞にとって内因性で
ある様々な実施形態で、内因性リガンド結合ドメインと操作されたリガンド結合
ドメインとを識別するリガンドを使用するために、リガンド結合ドメインのペプ
チド配列を変えることが好ましい場合が多い。このようなリガンドは、たとえば
、改変したドメインが由来する天然のペプチド配列と比較して、操作されたリガ
ンド結合ドメインに優先的に結合しなければならない。このアプローチは、リガ
ンドの不都合な固有の活性を回避することができる。上記目的に向けた重要なガ
イダンスおよび説明に役立つ例は、本明細書に引用した様々な参考文献に記載さ
れている。
【０１２８】 （架橋／ニ量化系） 結合蛋白またはリガンド結合ドメインに適したリガンドは周知であるか、同定
することができ、且つ本発明を実施する際に、このようなリガンド結合ドメイン
と組み合せて使用することができる。
【０１２９】 ＷＯ ９４／１８３１７号には、架橋した、オリゴマー化を基礎とする系に有
用なリガンドおよび他の成分に関する広範なガイダンスおよび実施例が提供され
ている。ＦＫＢＰのようなイムノフィリン、サイクロフィリン、および／または
ＦＲＢドメインに対するリガンドを基礎とする系は、特に興味深い。架橋に使用
することが可能なリガンド結合ドメイン／リガンド対の説明に役立つ例としては
、ＦＫＢＰ／ＦＫ１０１２、ＦＫＢＰ／合成の二価ＦＫＢＰリガンド（ＷＯ ９
６／０６０９７号およびＷＯ ９７／３１８９８号を参照）、ＦＲＢ／ラパマイ
シンまたはその類縁体：ＦＫＢＰ（たとえば、ＷＯ ９３／３３０５２号、ＷＯ
９６／４１８６５号およびＲｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ， ”A ｈｕｍａｎｉ
ｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
２（９）：１０２８−１０３２（１９９７）を参照）、サイクロフィリン／サ
イクロスポリン（たとえばＷＯ ９４／１８３１７号を参照）、ＦＫＢＰ／ＦＫ
ＣｓＡ／サイクロフィリン（たとえばＢｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ， １９９６
， ＰＮＡＳ ９３：４６０４−４６０７を参照）、ＤＨＦＲ／メトトレキサー
ト（たとえば、Ｌｉｃｉｔｒａ ｅｔ ａｌ， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１２８１７−１２８２１を参照
）、およびＤＮＡギラーゼ／クーママイシン（たとえばＦａｒｒａｒ ｅｔ ａ
ｌ， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８３：１７８−１８１を参照）などがあげ
られるが、その限りではない。引用した参考文献には、リガンドおよびリガンド
結合ドメインに対する非常に多くの変化および改変、ならびにそれらをデザイン
、選択および／または特性化する方法論が開示されており、それらは、本発明に
合わせて改変することが可能である。
【０１３０】 （アロステリを基礎とする系） 本発明に合わせて改変することが可能な他の系に適するリガンドに関するさら
なるガイダンスについては、たとえばＧｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． U．Ｓ．A． １９９２ ８９：
５５４７、および米国特許第５，６５４，１６８号、第５，６５０，２９８号、
第５，５８９，３６２号および第５，４６４，７５８号（ＴｅｔＲ／テトラサイ
クリン）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９４、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８１８０−８１８４（プロゲステロンレセ
プター／ＲＵ４８６）、およびＮｏ ｅｔ ａｌ， １９９６、 Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：３３４６−３３５１（エク
ジソンレセプター／エクジソン）を参照されたい。
【０１３１】 （ＤＮＡ−結合ドメイン） 本発明に関連のある調節された発現系では、発現（または抑制）に望ましい遺
伝子を選択的に標的に向けて送るためのＤＮＡ結合ドメインを含む蛋白を使用す
る。一般に、リガンド介在性架橋を基本とする系は、ＤＮＡ結合ドメインと一緒
に１つ以上のリガンド結合ドメインを含む融合蛋白に頼る。このような系の１つ
の全般的な利点は、本質的に個別にモジュール組み立て式であり、多種多様なデ
ザイン選択に向いていることである。これらの系を使用すると、ＤＮＡ結合ドメ
インの選択の範囲が広くなる。多くのアロステリを基本とする系は、ＴｅｔＲ−
およびプロゲステロン−R−を基本とする系と同様、ＤＮＡ結合ドメインと一緒
に転写調節ドメイン（たとえば、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメイン）
を含む融合蛋白を使用する。アロステリを基本とする幾つかの系、たとえば、エ
クジソン調節系は、ＤＮＡ結合ドメインと一緒に別の蛋白用の結合部位（たとえ
ば、エクジソンレセプター）を含むＲＸＲのような蛋白を使用する。アロステリ
を基礎とする系の中で、プロゲステロンレセプターを基礎とする系および同様の
系を使用すると、ＤＮＡ結合ドメインの選択の範囲が比較的広くなる。アロステ
リを基礎とする系は、ＴｅｔＲ−およびエクジソンレセプタータイプと同様、Ｄ
ＮＡ結合ドメインで操作することが可能であるが、ＤＮＡ結合ドメインの置換の
準備には、若干扱いにくい。
【０１３２】 ドメインが結合できる、対応するＤＮＡ「認識」配列が判明しているか、同定
することができる限り、様々なＤＮＡ結合ドメインを、本発明の融合蛋白、特に
、リガンド介在性架橋タイプおよびプロゲステロン−R−を基礎とするタイプの
もののデザインに組み込むことが可能である。標的遺伝子構成物の発現調節配列
に、認識配列の１つ以上のコピーが組込まれるか、中に存在する。ヒト遺伝子療
法用には、入手できるとき、ヒト起源のペプチド配列が好ましい場合が多い。複
合ＤＮＡ結合ドメインは、蛋白−ＤＮＡ結合相互作用に対して新規な配列特異性
を達成する１つの方法を提供する。ヒト起源の成分ペプチド配列を含む例示的な
複合ＤＮＡ結合ドメインは、以下に詳細に説明する、ＺＦＨＤ−１である。
【０１３３】 個々のＤＮＡ−結合ドメインを、突然変異誘発によってさらに改変し、ＤＮＡ
結合の認識特異性を低減、増大、または変化させることが可能である。ＤＮＡ認
識に寄与することが判明している位置における置換を合理的にデザインする（多
くの場合、明白な構造データを入手できる関連蛋白との相同性に基づく）ことに
よって、これらの改変を達成することができる。
【０１３４】 たとえば、ホメオドメインの場合、ＤＮＡと接触することが判明しているN−
末端アーム、第１ループ、第２ラセン、および第３ラセンのアミノ酸で置換を行
うことができる。亜鉛フィンガーの場合、ＤＮＡ認識ラセンの選択された位置で
置換を行うことができる。
【０１３５】 あるいは、ファージ展示ライブラリーからの選択のような、成り行きまかせの
方法を使用して、アフィニティが上昇するかまたは特異性が変化した、変化した
ドメインを同定することができる。
【０１３６】 ＤＮＡ結合ドメインのデザイン、突然変異、選択、組み合せおよび特性化に関
するさらなる例、情報およびガイダンスについては、たとえば、Ｐｏｍｅｒａｎ
ｔｚ ＪＬ， Ｗｏｌｆｅ Ｓａ， Ｐａｂｏ ＣＯ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−
ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｄｉｍｅｒｉｃ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅ
ｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８ Ｊａｎ ２７，３
７（４）：９６５−９７０、 Ｋｉｍ Ｊ−Ｓ ａｎｄ Ｐａｂｏ ＣＯ， Ｇ
ｅｔｔｉｎｇ ａ Ｈａｎｄｈｏｌｄ ｏｎ ＤＮＡ： Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ
Ｐｏｌｙ− ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｅｍｔ
ｏｍｏｌａｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ， ＰＮＡＳ
ＵＳＡ， １９９８ Ｍａｒ １７；９５（６）：２８１２−２８１７、Ｋｉｍ
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ｓｉｏｎ ｂｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｅｘｐｌｏｒ
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ｎ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７ Ｎ
ｏｖ ２１；２７２（４７）：２９７９５−２９８００、Ｇｒｅｉｓｍａｎ Ｈ
Ａ， Ｐａｂｏ ＣＯ ， Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ
ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ− ａｆｆｉｎｉｔｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｄｉｖｅｒｓｅ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔ
ｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７ Ｊａｎ ３１；２７５（５３００）：６５
７−６６１、 Ｒｅｂａｒ ＥＪ， Ｇｒｅｉｓｍａｎ ＨＡ， Ｐａｂｏ Ｃ
Ｏ， Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉ
ｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ Ｄ
ＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ, Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ １９９６；２６７：１２９−１４９、 Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ JL，
Pabo CO， Ｓｈａｒｐ Ｐａ， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｍｅｏｄｏ
ｍａｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ｄｅｓ
ｉｇｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ， Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５ Ｏｃｔ １０；９２（２１）
：９７５２−９７５６、Ｒｅｂａｒ ＥＪ， Ｐａｂｏ ＣＯ， Ｚｉｎｃ ｆ
ｉｎｇｅｒ ｐｈａｇｅ： ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆ
ｉｎｇｅｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｉｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， Ｆｅｂ ４；２６３：６７１−
６７３、Ｃｈｏｏ Ｙ， Ｓａｎｃｈｅｓ−Ｇａｒｃｉａ １， Ｋｌｕｇ Ａ
， ＩＮ ｖｉｖｏ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ＤＮＡ− ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｇ
ａｉｎｓｔ ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， Ｎａｔｕｒｅ
１９９４， Ｄｅｃ １５；３７２：６４２−６４５、Ｃｈｏｏ Ｙ， Ｋｌｕ
ｇ Ａ， Ｔｏｗａｒｄ ａ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ： Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｆｉｎｇｅｒｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏ
ｎ ｐｈａｇｅ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， Ｎｏｖ １９９４； ９１：１１１６
３−１１１６７、Ｗｕ Ｈ， Ｙａｎｇ Ｗ−Ｐ， Ｂａｒｂａｓ ＣＦ １１
１， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ： Ｔｏｗａｒｄ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，
ＰＮＡＳ ＵＳＡ Ｊａｎｕａｒｙ １９９５； ９２：３４４−３４８、Ｊ
ａｍｉｅｓｏｎ ＡＣ， Ｋｉｍ Ｓ−Ｈ， Ｗｅｌｌｓ Ｊａ， ＩＮ Ｖｉ
ｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ
ｌｔｅｒｅｄ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９４， ３３：５６８９−５６９５、国際特許出願WO
９６／２０９５１号、WO ９４／１８３１７号、WO ９６／０６１６６号および
WO ９５／１９４３１号およびＵＳＳＮ ６０／０８４８１９号を参照されたい
。
【０１３７】 （さらなるドメインおよびリンカー） 本発明の融合蛋白にさらなるドメインが含まれてもよい。たとえば、融合蛋白
は、蛋白を核に転位させる核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。ＮＬＳの存
在によって融合蛋白およびその成分の機能が破壊される限り、ＮＬＳは、融合蛋
白のN−末端に位置しても、Ｃ−末端に位置してもよく、あるいは、融合蛋白の
成分部分の間に位置してもよい。一般に、核局在化配列は、ニ裂塩基性反復と呼
ばれる、複数の塩基性アミノ酸を有する（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｕｓｔｏｓ ｅｔ
ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ １０７１：８３−１０１で再検討されている）。１つの例示的なＮＬＳ
は、アミノ酸プロリン−リシン−リシン−リシン−アルギニン−リシン−バリン
を含むＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳから誘導される（Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ
ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３９：４９９−５０９）。別の例示的なＮＬＳ
は、ｐ５３蛋白から誘導される。野生型ｐ５３は、ｐ５３の残基３１６−３２５
、３６９−３７５および３７９−３８４を含む、Ｃ−末端核局在化シグナルを３
個含む（Ｓｈａｕｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ． １０：６５６５−６５７７）。Ｓｈａｕｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ（
１９９０）（前出）およびＳｈａｕｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ ６：２０５６により、その他のＮＬＳが記載されている。
【０１３８】 それらの検出および／または精製を容易にするために、融合蛋白は、抗体が認
識できる「ヒスチジンタグ」、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメイン
または「エピトープタグ」のようなペプチド部分を含んでもよい。
【０１３９】 融合蛋白の様々な成分ドメインの仲介距離および相対的位置を変更して、その
生産または性能を最適化することができる。融合蛋白のデザインは、個々の成分
ポリペプチド配列を隔てているペプチド配列（天然であってもなくてもよい）を
含む、１つ以上の「リンカー」を含んでもよい。多くのリンカー配列の例、それ
らの自然における存在、デザインおよび融合蛋白における使用が知られている。
たとえば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＰＮＡＳ ８５：４８７
９、米国特許第５，０９１，５１３号およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１６４８−１６５２を参照されたい
。
【０１４０】 （標的遺伝子構成物） 標的遺伝子構成物は、リガンドに制御された遺伝子の発現を可能にする発現調
節配列に操作可能に連結された関心事の遺伝子を含む。さらに詳細には、このよ
うな構成物は、一般に、（１）本発明の融合蛋白のＤＮＡ結合ドメインに認識さ
れるＤＮＡ配列の１つ以上のコピー（または本発明の融合蛋白に結合するＲＸＲ
に似たＤＮＡ結合蛋白）、（２）最低限、ＴＡＴＡボックスおよびイニシエータ
ー配列で構成されるが、他の転写因子結合部位を任意に含む、プロモーター配列
、（３）適切であれば、翻訳の開始および終結を促進する配列を含む、所望の生
成物をコードする配列、（４）スプライス供与体、スプライス受容体および仲介
イントロンＤＮＡから成る任意の配列、および（５）結果として得られるＲＮＡ
転写物の切断およびポリアデニル化を指令する配列を含む。一般に、本構成物は
、最小プロモーターを含む発現調節配列に操作可能に連結された発現させるべき
標的遺伝子のコピーと、転写因子応答性ＤＮＡ認識配列の１つ以上のコピーとを
含む。
【０１４１】 （ａ）標的遺伝子 関心事の治療用蛋白、アンチセンス配列またはリボザイムをコードする遺伝子
、または治療的または科学的に関心のある任意の他の蛋白蛋白を含め、多種多様
な遺伝子を標的遺伝子として使用することができる。標的遺伝子（複数の標的遺
伝子が存在してもよい）は、所望の表現型を実現することができる遺伝子生成物
をコードしてもよい。標的遺伝子は、膜結合蛋白、膜全域蛋白、分泌蛋白、また
は細胞質蛋白をコードしてもよい。単独でまたは組み合せて、発現される蛋白は
、ホーミング、細胞傷害性、増殖、分化、免疫応答、炎症性応答、凝固、血栓溶
解、ホルモン調節、血管形成などを含んでもよい。標的遺伝子にコードされるポ
リペプチドは、天然のペプチド配列であっても、非天然のペプチド配列であって
もよい。
【０１４２】 様々な分泌生成物としては、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、下
垂体放出因子、ＡＣＴＨ、メラノトロピン、レラクシン、レプチンなどのような
ホルモン類、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、Ｇ−Ｃ
ＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、エリトロポエチン、トロンボポエチ
ン、巨球核成長因子、神経成長因子などのような成長因子類、アンギオスタチン
、エンクロスタチン、ＶＥＧＦおよびそれらの異体のような、血管形成を刺激ま
たは阻害する蛋白、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５のようなインターロイキン類、ＴＮＦ
−αおよびＴＮＦ−β、組織プラスミノーゲンアクティベーター、補体カスケー
ドの構成員、パーフォリン、スーパーオキシドジスムターゼのような酵素および
他の因子、アンチトロンビン−III、第Ｖ因子、第VII因子、第VIIIｃ因子、vWF
、第IX因子、α−アンチトリプシン、プロテインＣ、およびプロテインＳのよう
な凝固関連因子、エンドルフィン、ジノルフィン、骨形態形成蛋白、ＣＦＴＲな
どがある。
【０１４３】 遺伝子は、天然の表面膜蛋白、または適切なシグナルペプチドおよび貫膜配列
の導入によってそのように作られた蛋白をコードしてもよい。様々なこのような
蛋白としては、ホーミングレセプター、たとえば、Ｌ−セレクチン（−１４）、
造血細胞マーカー、たとえばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞レセプター、ＴＣ
Ｒサブユニットα、ＴＣＲサブユニットβ、ＴＣＲサブユニットγ、ＴＣＲサブ
ユニットδ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１な
ど、インターロイキンレセプターＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒのようなレセプター、
様々なホルモンや成長因子などを含む他のリガンドのレセプター、このようなレ
セプターおよびこのようなレセプターの可溶形に対するレセプター拮抗物質、イ
オン、たとえばH+、Ｃa+２、K+、Na+、Ｃl-などの流入または流出に関するチャ
ネル蛋白、ＣＦＴＲ、チロシン活性化モチーフ、ｚａｐ−７０、などがある。
【０１４４】 エキソサイトーシスのための小胞に輸送するのに適するように蛋白を改変する
ことが可能である。小胞内にパッケージするために、小胞有向性の蛋白の配列を
加えることにより（この場合、配列は、一端または他端の近くで改変されている
か、または蛋白起源に類似した位置にある）、改変された蛋白をゴルジ器官に向
けて送る。この方法は、エキソサイトーシスのためのキメラ蛋白の存在と相俟っ
て、蛋白を細胞外媒体に速やかに輸送し、比較的高い局所濃度が可能になる。
【０１４５】 標的遺伝子生成物は、代謝経路に含まれる蛋白、調節蛋白、ステロイドレセプ
ター、転写因子、などのような細胞内蛋白であってもよい。さらに例を挙げて説
明する。Ｔ−細胞に関しては、Ｔ−細胞レセプターの一方または両方の鎖をコー
ドする遺伝子を導入してすることが可能である。Ｂ細胞に関しては、イムノグロ
ブリンの重鎖および軽鎖を提供して分泌させることができる。皮膚細胞、たとえ
ばケラチン生成細胞、詳細にはケラチン生成細胞幹細胞に関しては、αインター
フェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、抗走化性因子、細菌の細
胞壁蛋白に特異的なプロテアーゼ、様々な抗ウイルス蛋白を分泌することによっ
て、感染に対する防護を実現することができる。
【０１４６】 様々な状況で、細胞を特定の部位に向けて送りたいことがある。この部位とし
ては、リンパ節、粘膜組織、皮膚、滑膜、肺または他の内部器官のような解剖組
織上の部位、または血塊、傷害部位、外科的操作部位、炎症、感染などのような
機能的部位を含めることができる。関心事の特定の部位を認識するか、または関
心事の特定の部位に結合する膜蛋白の調節された発現は、たとえば、操作された
細胞をその部位に向けて送る方法を提供する。したがって、分泌生成物の局所濃
度を実現したり、細胞を基礎とする治癒、清掃、感染防護、抗腫瘍活性などを達
成したりすることができる。関心事の蛋白としては、ホーミングレセプター（た
とえばＬ−セレクチン、ＧＭＰ１４０、ＣＬＡＭ−１など）、またはアドレッシ
ン（たとえばＥＬＡＭ−１、ＯＮＡｄ、ＰＮＡｄなど）、血塊結合蛋白、または
走化性因子の局所勾配に応答する細胞表面蛋白などがある。
【０１４７】 １つの実施形態では、本発明の融合蛋白の１つのＤＮＡ結合ドメインの認識要
素が、たとえばゲノムＤＮＡとの相同リコンビネーションによって、内因性標的
遺伝子に効果的に連結されるという具合に、宿主細胞に導入される。種々の適当
なアプローチを利用できる。たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／０９２２２号、
ＷＯ ９５／３１５６０号、ＷＯ ９６／２９４１１号、ＷＯ ９５／３１５６
０号およびＷＯ ９４／１２６５０号を参照されたい。これによって、内因性遺
伝子の転写のリガンド介在性調節が可能になる。
【０１４８】 （ｂ）最小プロモーター 標的遺伝子構成物（または本発明の他の構成物）に組み込むことが可能な最小
プロモーターは、特にｆｏｓ、hＣＭＶ、ＳＶ４０およびＩＬ−２のプロモータ
ー領域を含む、多種多様な既知の配列から選択することが可能である。最小ＣＭ
Vプロモーターまたは最小ＩＬ２遺伝子プロモーターを使用する、説明に役立つ
例が提供されている（出発部位に関して−７２〜+４５； Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓ
ｔ ｅｔ ａｌ．， ＭＣＢ ６：３０４２−３０４９、１９８６）。
【０１４９】 （ｃ）ＤＮＡ認識配列 標的遺伝子構成物に使用する認識配列の選択は、使用すべき調節系の性質によ
って決定される場合がある。
【０１５０】 標的遺伝子構成物が内因性遺伝子と、それ自身の調節ＤＮＡとを含む場合、細
胞によって認識配列が提供され、専門家は、それを認識するＤＮＡ結合ドメイン
を提供する。
【０１５１】 ｔｅｔＲまたはＲＸＲ−タイプのＤＮＡ結合ドメインに頼る系では、通常、認
識配列は、（ｔｅｔＲまたはＲＸＲ−タイプのＤＮＡ結合ドメインを選択するこ
とによって）予め決定されている。
【０１５２】 他の場合、たとえば、リガンド介在性架橋系やプロゲステロンレセプターを基
礎とする系のような場合、専門家は異なる組のＤＮＡ結合ドメイン：認識配列選
択を利用できる。
【０１５３】 多種多様なＤＮＡ−結合ドメインに関する認識配列が知られている。他のＤＮ
Ａ結合ドメインに関するＤＮＡ認識配列は、実験的に決定することができる。複
合ＤＮＡ結合ドメインの場合、ＤＮＡ認識配列Ｇａｎが実験的に決定されるか、
または、蛋白を操作して、その特異性を望ましい配列に誘導することができる。
複合ＤＮＡ結合ドメインに望ましい核酸認識配列は、少なくとも１０、好ましく
は１１、さらに好ましくは１２以上、さらになお好ましくは、時には１８におよ
ぶ塩基のヌクレオチド配列で構成される。ヌクレオチド配列内の成分結合部分（
想定上または証明された）は、完全に連続している必要はなく、キメラ蛋白と直
接接触している必要がなく、むしろ各モジュールによって認識される核酸亜部位
間に適当な空間を課す「スペーサー」塩基対と共に点在していてもよい。これら
の配列は、操作されたＤＮＡ−結合蛋白の非存在下で細胞に導入されるとき、連
結された遺伝子は発現されない。ＤＮＡ−結合領域を含むキメラ蛋白に認識され
る、好ましくは高アフィニティ（解離定数１０−１１Ｍ以下が特に好ましい）で
認識されるヌクレオチド配列を同定には、幾つかの方法を使用することができる
。個々の複合ＤＮＡ−結合領域のサブドメインに対する高アフィニティ結合部位
が既に知られている場合、これらの配列を様々な空間および位置と合わせて、最
適配置を実験的に決定することができる（アフィニティを決定する方法について
は以下を参照されたい）。あるいは、周知の方法を適応することによって、ラン
ダムＤＮＡ配列の大きなプールから蛋白または蛋白複合体に対する高−アフィニ
ティ結合部位を選択することができる。（Ｐｏｌｌｏｃｋ， Ｒ． ａｎｄ Ｔ
ｒｅｉｓｍａｎ， Ｒ．， １９９０， Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄ
ＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ． １８， ６１９７−６２０４）。結合した配列をプラスミドにク
ローニングする、その精確な配列、および蛋白に対するアフィニティを決定する
。使用するために、この配列コレクションから、所望の特性（すなわち、複合蛋
白に対する最大限のアフィニティ、個々のサブドメインに対する最小限のアフィ
ニティ）を有する個々の配列を選択する。あるいは、この配列コレクションを使
用して、好まれる塩基対を各位置に担持するコンセンサス配列を誘導する。この
ようなコンセンサス配列を合成し、試験して、適切なレベルのアフィニティおよ
び特異性を有することを確認する。
【０１５４】 標的遺伝子構成物は、ＤＮＡ認識配列の複数のコピーを含んでもよい。たとえ
ば、この構成物は、ＧＡＬ４またはＺＦＨＤ１に関する認識配列を、５、８、１
０または１２含んでもよい。
【０１５５】 （ＤＮＡ構成物のデザインおよびアセンブリ） 特許書類およびその中に引用されている科学文献に開示の原理、説明に役立つ
例および物質および方法（一部変更して）、および記載のさらなる実例に従って
、構成物をデザインすることができる。コーディング配列および調節領域を単離
し、適宜、連結し、適切なクローニング宿主でクローニングし、制限または配列
決定、または他の便利な方法で分析することが可能な従来の方法で、構成物の成
分を調製することができる。詳細には、「プライマー修復」、連結、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ突然変異誘発などを、適宜、使用して、１つ以上の突然変異を導入するこ
とが可能な場合、ＰＣＲを使用し、機能単位の全部または部分を含む個々のフラ
グメントを単離してもよい。融合蛋白をコードするＤＮＡ構成物の場合、細胞ま
たは細胞溶解物で、すべての成分ドメインを包含する１つのポリペプチドに翻訳
されることが可能な融合蛋白をコードする１つのオープンリーディングフレーム
を構成するという具合に、個々のドメインおよびサブドメインをコードするＤＮ
Ａ配列を接合する。次に、宿主細胞に形質導入し、蛋白の発現を可能にするため
に、融合蛋白ＤＮＡをコードする構成物をベクターに入れる。コードされたキメ
ラの生化学分析の場合、細菌または網状赤血球−溶解物系における蛋白の発現を
指令するプラスミドを構成することが望ましいと考えられる。哺乳類細胞におけ
る蛋白の産生に使用する場合、これらの細胞における発現を指令する蛋白−コー
ド化配列が発現ベクターに導入される。このような用途に適した発現ベクターは
、当技術分野で周知である。様々な種類のこのようなベクターが市販されている
。
【０１５６】 （構成物の細胞への導入） 本発明は、動物細胞の操作およびこのような操作された動物細胞の使用を含む
用途で特に有用である。動物細胞は、昆虫、虫または哺乳類の細胞であってもよ
い。例えば、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、および非ヒト霊長類の細胞を
含め、様々な哺乳類細胞を使用してもよいが、ヒトおよびマウスの細胞は特に興
味深い。様々な種の全域で、造血細胞、神経細胞、神経膠細胞、間充組織細胞、
皮膚細胞、粘膜細胞、ストロマ細胞、筋肉細胞（平滑筋肉細胞を含む）、脾細胞
、網内系細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、胃腸細胞、肺細胞、線維
芽細胞、および他の細胞タイプのような、様々なタイプの細胞を使用することが
できる。特に興味深いものは、筋肉細胞（骨格、心臓および他の筋肉細胞を含む
）、中枢神経系および末梢神経系の細胞、および赤血球系、リンパ系または骨髄
単核球系、ならびに筋芽細胞および線維芽細胞と関係があると考えられる有核細
胞のいずれを含んでもよい造血細胞である。やはり興味深いものは、造血細胞、
神経細胞、ストロマ細胞、筋肉細胞、肝細胞、肺細胞、胃腸細胞および間充組織
幹細胞のような、幹細胞および前駆細胞である。
【０１５７】 細胞は、所期の宿主生物に関して、自己細胞、同系細胞、同種細胞および、場
合によっては、異種細胞であってもよい。機能的クラスI ＭＨＣ分子の形成を
防止するβ２−ミクログロブリンの不活化、１つ以上のＭＨＣ分子を発現させる
クラスII分子の不活化、細胞傷害性活性関連の遺伝子の発現を増強または阻害す
ることによる細胞傷害能の不活化、等々によって、主要な組織適合性複合体（「
ＭＨＣ」）プロフィールを変えることにより、細胞を改変することが可能である
。
【０１５８】 標的部位特異性を有するＴ細胞およびＢ細胞のような、独特の特異性を細胞が
有する場合、特定のクローン、クローン細胞またはオリゴクローナル細胞が関心
事であってもよい場合がある。
【０１５９】 融合蛋白をコードし、且つ本発明の標的遺伝子を含む構成物を、多くの場合、
構成物を含む宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーと関連している１
つ以上の核酸分子または構成物として、細胞に導入することができる。コーディ
ング配列および調節領域を単離し、適宜、連結し、適切なクローニング宿主でク
ローニングし、制限または配列決定、または他の便利な方法で分析することが可
能な従来の方法で、構成物を調製することができる。詳細には、「プライマー修
復」、連結、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発などを、適宜、使用して、１つ以上
の突然変異を導入することが可能な場合、ＰＣＲを使用し、機能単位の全部また
は部分を含む個々のフラグメントを単離してもよい。
【０１６０】 構成物がいったん完成し、適切な配列を有することが証明された後は、任意の
便利な方法で、宿主細胞を導入することが可能である。エピソーム複製が可能な
ベクター（たとえばＢＰＶベクターまたはＥＢＶベクターs）または宿主細胞の
染色体に組み込むためにデザインされたベクターに、構成物を組込みこんでもよ
い。感染または細胞への形質導入のためにアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（HＳＶ）のような、非複製性、欠陥
ウイルスゲノム、またはレトロウイルスベクターを含む他のものに、構成物を組
み込むか、パッケージしてもよい。あるいは、プロトプラスト融合、エレクトロ
ポレーション、 biolistics、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフ
ェクション、ＤＮＡのミクロインジェクションなどによって、構成物を導入して
もよい。場合によっては、宿主細胞を成長させ、拡大してから構成物を導入し、
続いて構成物を導入するための適切な処理を行い、構成物を組み込む。次いで、
細胞拡大し、構成物中に存在するマーカーでスクリーニングする。首尾よく使用
することが可能な様々なマーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミ
ジンキナーゼ、ヒグロマイシン耐性など、および様々な細胞−表面マーカー、た
とえば、Ｔac、ＣＤ８、ＣＤ３、ＴｈｙｌおよびＮＧＦレセプターなどが挙げら
れる。
【０１６１】 場合によっては、相同リコンビネーション用の標的部位を有することも可能で
あり、この場合、構成物は特定の遺伝子座に組込まれていることが望ましい。た
とえば、内因性遺伝子（同一遺伝子座または他所）の削除および／または本発明
のリコンビナント標的構成物との交換をすることができる。相同部分リコンビネ
ーションの場合、一般に、ΩベクターまたはO−ベクターのいずれかを使用する
ことが可能である。たとえば、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅ
ｌｌ （１９８７） ５１， ５０３−５１２、Ｍａｎｓｏｕｒ， ｅｔ ａｌ
， Ｎａｔｕｒｅ（１９８８） ３３６， ３４８−３５２、およびＪｏｙｎｅ
ｒ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ（１９８９） ３３８， １５３−１５６を
参照されたい。
【０１６２】 構成物は、遺伝子の全てをコードする１つのＤＮＡ分子として導入してもよく
、または１つ以上の遺伝子を有する異なるＤＮＡ分子として導入してもよい。構
成物は、それぞれ、同じマーカーまたは異なるマーカーと一緒に、同時に導入し
てもまたは連続的に導入してもよい。
【０１６３】 構成物ＤＮＡのストックの調製およびトランスフェクションの実施に使用する
ことが可能な、細菌起源または酵母起源の複製、選択可能且つ／または増幅可能
なマーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター／エン
ハンサー要素、および哺乳類発現調節要素などのような有用な要素を含むベクタ
ーは、当技術分野で周知であり、その多くは市販されている。
【０１６４】 （構成物の動物への導入） 様々なＤＮＡ構成物を所期の受容者に配送するために、遺伝子操作された細胞
または非相同ＤＮＡを動物、好ましくは哺乳類、ヒトまたは非ヒトに導入する任
意の方法を、本発明の実行に合わせて改変してもよい。これについて検討するた
めに、本明細書に記載の様々なＤＮＡ構成物を一緒にして導入遺伝子と呼ぶこと
がある。
【０１６５】 （ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子操作による） ＤＮＡ構成物を用いてｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入され
た細胞を、選択的条件下の培養中で成長させ、次いで、所望の構成物を有すると
して選択される細胞を拡大し、宿主細胞に構成物が存在することを決定するため
に、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、さらに分析し、且つ／または
所望の遺伝子生成物の産生について分析することが可能である。非相同遺伝子構
成物を用いて形質導入した後、改変された宿主細胞を、必要に応じて、同定し、
選択し、成長させ、特性化などを行い、次いで計画通りに使用する、たとえば培
養中で成長さたり宿主生物に導入したりすることができる。
【０１６６】 細胞の性質に応じて、多種多様な方法で、一般に、所望の組織またはコンパート
メント、または細胞を所期の目的地に移動させることが可能な組織またはコンパ
ートメントに注入または移植することによって、宿主生物、たとえば哺乳類に、
細胞を導入することができる。注入または移植に適した例示的な部位としては、
脈管系、骨髄、筋肉、肝、頭蓋または脊髄、腹膜、および皮膚などがある。たと
えば、少なくとも約１０４個の細胞、一般に約１０１０個以下の細胞を脈管系に
注入することによって、造血細胞を投与することができる。使用する細胞数は、
環境、導入の目的、細胞の寿命、使用するプロトコル、たとえば、投与回数、細
胞が増殖する能力、治療剤の安定性、治療剤の生理学的必要性、等々によって左
右される。
【０１６７】 一般に、筋芽細胞または線維芽細の場合、たとえば、細胞数は少なくとも約１０ ４ 且つ約１０９以下であって、分散として適用することが可能であり、一般に関
心事の部位にまたは部位付近に注入される。細胞は、通常、生理学的に−許容で
きる媒体中にある。
【０１６８】 治療用蛋白を産生するために宿主生物または患者に移植する前に、本発明に従っ
て操作された細胞を、たとえば従来の生体適合物質および方法を使用して、カプ
セルに包むことができる。たとえば、Ｈｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｕ
ｓｔａｉｎｉｎｇ ｖｉａｂｌｅ Ｈｉｇｈ Ｃｅｌｌ Ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ
ｗｉｔｈｉｎ ａ Ｈｏｓｔ，米国特許第５，３１４，４７１号（Ｂａｘｔｅｒ
ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）、Ｕｌｕｄａｇ ａｎｄ Ｓｅｆ
ｔｏｎ， １９９３， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ２７（
１０）：１２１３−２４（ＨｅｐＧ２細胞／ヒドロキシエチルメタクリレート−
メチルメタクリレート膜）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９３、 Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４（４）：４３３−４０（ｈＧＨ発現マウスＬｔｋ−細胞
／免疫保護ｐｅｒｍ−選択的アルギネートマイクロカプセル、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ
ａｌ， １９９３、 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １６８（４）：１０８２−
３（アルギネート）、 Ｔａｉ ａｎｄ Ｓｕｎ， １９９３、 ＦＡＳＥＢ
Ｊ ７（１１）：１０６１−９（ｈＧＨ発現マウス線維芽細胞／アルギネート−
ｐｏｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−アルギネート膜）、Ａｏ ｅｔ ａｌ， １９９５
、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ． ２７（６）：３３４９，
３３５０（アルギネート）、 Ｒａｊｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ． ２７（６）：３３８９（アルギネ
ート）、Ｌａｋｅｙ ｅｔ ａｌ， １９９５、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ
ｏｎ Ｐｒｏｃ． ２７（６）：３２６６（アルギネート）、 Ｋｏｒｂｕｔｔ
ｅｔ ａｌ， １９９５、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ．
２７（６）：３２１２（アルギネート）、Ｄｏｒｉａｎ ｅｔ ａｌ， 米国特
許第５，４２９，８２１号（アルギネート）、 Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，
１９９３、 Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １２２（１）：３７−４７（ポリマー被
包ＰＣ１２細胞）、 Ｓａｇｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９３、 Ｊ Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ １３（６）：２４１５−２３（半透過性ポリマー膜内に被包され、ラッ
ト脊髄くも膜下腔に移植されたウシクロム塩染色性細胞）、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ
ｅｔ ａｌ， １９９４、 Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １２６（２）：１５１−
８（サルに移植されたポリマー被包ラットＰＣ１２細胞、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ、
ＷＯ ９２／１９５９５号も参照）、Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ ｅｔ ａｌ， １９
９４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７０（２）：１８５−９６（カ
プセルに包まれた抗体産生性ハイブリドーマ；様々なサイトカイン類を発現する
カプセルに包まれたトランスフェクト細胞系）、Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ，１９９
４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１（６）：２３２４−８（ヒト神経成長因子を発現す
る操作されたＢＨＫ細胞免疫単離ポリマー装置内に包まれて、ラットに移植され
た、ヒト神経成長因子を発現する操作されたＢＨＫ細胞）、Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅ
ｔ ａｌ， １９９４、 Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １８（５）：９３５−４６（ラットに移
植されたポリマー被包ＰＣ１２細胞）、Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９
４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１（２３）：１０８９８−９０２（操作されてポリマ
ーで被包され、サルに移植された、hＮＧＦを発現するＢＨＫ細胞）およびＢｕ
ｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ ＷＯ ９５／０４５２１号（カプセルに包まれた装置）
を参照されたい。次いで、カプセルに包まれた形態の細胞を、これを必要として
いる動物宿主、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒト被験者に、導入するこ
とができる。好ましくは、カプセルを包む物質は、カプセルに包まれた細胞によ
って生じる分泌された蛋白を宿主に放出させることが可能な、半透過性である。
多くの実施形態で、半透過性のカプセルに包むと、カプセルに包まれた細胞を、
カプセルに包まれた細胞が導入される宿主生物から、免疫学的に隔離する。こう
した実施形態では、カプセルに包まれる細胞は、宿主種の蛋白および／またはウ
イルスの蛋白または宿主種以外の種に由来する蛋白から誘導された成分ドメイン
を含む１つ以上の融合蛋白発現することが可能である。細胞は、受容者以外の１
つ以上の個体から誘導してもよく、受容者または患者以外の種から誘導してもよ
い。
【０１６９】 （ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子操作による） 細胞のｅｘ ｖｉｖｏ改変の代わりに、多くの状況で、細胞をｉｎ ｖｉｖｏ
で改変することが可能である。ウイルス系および非ウイルス系を含む標的組織お
よび細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子操作するための種々の技術が開発されてい
る。
【０１７０】 １つのアプローチでは、トランスフェクションによって、すなわち、「裸のＤ
ＮＡ」、脂質複合またはリポソームで製剤したＤＮＡ、または他の方法で製剤し
たＤＮＡを細胞に配送することによって、ＤＮＡ構成物を細胞に配送する。たと
えば、脂質で、ＤＮＡを調剤する前、または他のアプローチの場合と同様、最終
的な発現ベクターに組み込む前に、所望のＤＮＡ構成物を担持する導入遺伝子を
含むプラスミドを、先ず、発現に適するように実験的に最適化してもよい（たと
えば、５'未領域におけるイントロン包含および不必要な配列の除去（Ｆｅｌｇ
ｎｅｒ、 ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２６−１３９
、１９９５）。次いで、既知の方法および物質を使用して、たとえば、様々な脂
質またはリポソーム物質でＤＮＡを調剤し、受容哺乳類に配送することができる
。たとえば、Ｃａｎｏｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅ
ｌｌＭｏｌ Ｂｉｏｌ １０：２４−２９， １９９４（ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｎ ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈ
ｕｍａｎ ａｌｐｈａｌ - ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅ
ｄ ｔｏ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｕｎｇｓ ｏｆ
ｒａｂｂｉｔｓ）、Ｔｓａｎ ｅｔ ａｌ、 Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６８ （
Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２）： Ｌ１ ０５２−Ｌｌ
０５６， １９９５ （ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｒａｔ
ｌｕｎｇｓ ｖｉａ ｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ
ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）、Ａｌｔｏｎ eｔ Ａｌ．， Ｎａ
ｔ Ｇｅｎｅｔ． ５：１３５−１４２， １９９３（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ａｉｒｗａｙｓ ｂｙ ｎｅｂｕｌｉｚｅｄ ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）を参照
されたい。いずれの場合にも、ウイルス粒子をリンゲルのリン酸緩衝生理食塩水
または他の類似の媒体に移した後、気管支鏡で滴下するか、または霧状化によっ
て、ベクターまたは、裸または調剤されたＤＮＡを配送することができる。
【０１７１】 ウイルス系としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ハイブリッドア
デノ−ＡＡＶ、レンチウイルスおよびレトロウイルスのような、ウイルスを基本
とするものが挙げられ、感染、およびある場合には、ウイルスまたは導入遺伝子
を宿主ゲノムに組み込むことによって形質導入が可能である。たとえば、Ｄｕｂ
ｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１、 ７５２９−７５３３、 Ｋａｎｅｄａ ｅｔ
ａｌ．，（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、３７５−３７８、 Ｈｉｅｂ
ｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８６、３５９４−３５９８、Ｈａｔｚｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．（
１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５、 １７２８５−１７２９
３およびＦｅｒｒｙ， ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８、 ８３７７−８３８１を参照されたい。
注入（たとえば、血管内または筋肉内）、吸入、または他の非経口方式で、ウイ
ルスを投与することができる。リポソームとの複合体または注入、カテーテルま
たはbiolisticsによるＤＮＡの投与のような、非ウイルス配送方法を使用するこ
とができる。たとえば、調剤および細胞および生物へのリコンビナント核酸の配
送に関するさらなるガイダンスについては、たとえばＷＯ ９６／４１８６５号
、 ＰＣＴ／ＵＳ９７／２２４５４号およびＵＳＳN ６０／０８４８１９号を
参照されたい。
【０１７２】 必要があれば、弱毒化または改変させた、標的転写開始領域を担持する、レト
ロウイルスを使用することによって、ウイルスを産生し、隣接細胞に形質導入で
きるように、本発明の転写因子構成物の１つを使用してウイルスを活性化するこ
とができる。
【０１７３】 核酸構成物の配送にリコンビナントウイルスを使用することは、特に興味深い
。導入遺伝子を、遺伝子療法に有用な種々のウイルスのいずれかに組み込んでも
よい。
【０１７４】 臨床状況では、数多い既知の方法のいずれかによって、遺伝子配送システム
（すなわち、ベクター、ウイルス、脂質製剤または他の形態のリコンビナント核
酸）を患者に導入することができる。たとえば、遺伝子配送システムの医薬品を
、たとえば静脈内注入、吸入などによって、全身に導入してもよい。あるシステ
ムでは、配送手段によって、構成物を所望の標的細胞に特異的または選択的に形
質導入することができる。これは、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号
を参照）、または走触性注入（たとえばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７）または配送手段の決定要素に
よって達成される。たとえば、ウイルスシステムの中には、感染に対する組織ま
たは細胞タイプ特異性を有するものもある。遺伝子の発現をコントロールする細
胞タイプ特異的または組織特異的発現調節要素によって、胞タイプまたは組織タ
イプの発現が達成されるシステムもある。
【０１７５】 ｔｅｔＲを基礎とするシステム、プロゲステロン−レセプターを基礎とするシ
ステムおよびエクジソンを基礎とするシステムに関するものを含め、上記参考文
献および先に引用した参考文献には、調製、調剤およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの細
胞および生物への様々なリガンドの配送に関する詳細なさらなるガイダンスが記
載されている。
【０１７６】 本発明の好ましい実施形態では、リコンビナントレトロウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶ、
ヘルペスウイルスまたはレンチウイルスウイルス配送システムに、関心事の遺伝
子構成物を組み込むことによって本発現構成物が誘導される（リコンビナント細
菌プラスミドまたはリコンビナント真核プラスミドを使用して、他のアプリケー
ションを実施することも可能である）。本発明を実行する際に、様々なウイルス
ベクターを使用してもよいが、ｉｎ ｖｉｖｏで、特にヒトおよび他の哺乳類に
、外因性遺伝子を導入する場合、ＡＡＶおよびアデノウイルスを基礎とするアプ
ローチは特に興味深い。ウイルスベクターの選択および使用に関する下記のさら
なるガイダンスは、ｅｘ ｖｉｖｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであっても、特に
全動物を含む応用分野（ヒト遺伝子療法と動物モデルシステムの開発および使用
の両者）に関して、専門家に役立つと思われる。
【０１７７】 （ウイルスベクター：アデノウイルスベクター） 本発明に有用なウイルス遺伝子配送システムは、アデノウイルス由来のベクタ
ーを使用する。アデノウイルス、３６ｋＢ、線状二本鎖ＤＮＡウイルスの遺伝子
学的構成を知ることによって、８ｋＢまで、アデノウイルスＤＮＡの大きな区画
を外来配列と置換することが可能になる。レトロウイルスと違って、アデノウイ
ルスＤＮＡは、潜在的な遺伝子毒性なしに、エピソーム的方式で複製できるため
、アデノウイルスＤＮＡを宿主細胞に感染させても染色体的組み込みが生じない
。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、多大な増幅後に、ゲノム再編成
は全く検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期のステージと関係なく、
実質的に全ての上皮細胞を感染させることができる。今までのところ、アデノウ
イルスの感染は、軽度疾患、たとえば、ヒトにおける急性呼吸疾患のみと関連づ
けられているようである。
【０１７８】 アデノウイルスは、ゲノムが中くらいの大きさであり、操作しやすく、力価が
高く、標的細胞範囲が広く、且つ感染力が高いため、遺伝子導入ベクターとして
使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスのＤＮＡ複製
およびパッケージに必要なシス要素である、１００〜２００塩基対（ｂｐ）の逆
方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの初期領域（Ｅ）および後期（Ｌ）領域
は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写ドメインを含む。
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスのゲノムおよび若干の細胞性遺伝
子の転写調節に必要な蛋白をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）が発
現すると、ウイルスのＤＮＡ複製用の蛋白が合成される。この蛋白は、ＤＮＡ複
製、後期遺伝子発現、および宿主細胞遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ（１９９０）
Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐ． Ｏｎｃｏｌ． １９：１９７）。ウイルスのカプシ
ド蛋白を大部分を含む、後期遺伝子の生成物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ
）によって放出される１つの一次転写産物のプロセッシングがかなり行われた後
に限って発現される。ＭＬＰ（１６．８m．u．に位置する）は、特に効率的であ
る。感染後期中、このプロモーターから放出されるmＲＮＡの全てが５'三部分リ
ーダー（ＴＬ）配列を有し、そのため、翻訳に好ましいmＲＮＡである。
【０１７９】 関心事の遺伝子生成物をコードするが、正常な溶菌ウイルスのライフサイクル
内で複製する能力に関して不活化されているという具合に、アデノウイルスのゲ
ノムを操作することができる（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）
Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６， Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４， ａｎｄ Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５
５を参照）。アデノウイルス菌株ＡＤタイプ５ dｌ３２４、またはアデノウイ
ルスの他の菌株（たとえば、ＡＤ２、ＡＤ３、ＡＤ７など）から誘導された適当
なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。リコンビナントアデノウイ
ルスは、非分裂細胞を感染することができなため、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌ
ｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）前出）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：６４８２−６４８６）、
肝細胞（Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ，（１９９３） ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９０：２８１２−２８１６）および筋肉細胞s（Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ
．，（１１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２５８１−２５８４）を含め、
多種多様な細胞タイプの感染に使用できる点で、ある一定の環境で有利である。
アデノウイルスベクターは、ワクチン開発にも使用されてきた（Ｇｒｕｎｈａｕ
ｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ（１９９２） Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ ３：２３７、 Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ（１９９２） Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：３６３）。リコンビナントアデノウイルスを
異なる組織に投与する実験は、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（
１９９１）， Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８
：１４３）、筋肉注入（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ
３６１：６４７）、末梢静脈内注入（Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ（１９
９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． U．Ｓ．A． ９０：
２８１２）、および脳への走触性接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ
ａｌ．（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９８８）を含む。
【０１８０】 さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮しやすく、且つ、
上述の通り、感染性スペクトルに変化をもたらすように改変することができる。
その上、アデノウイルスは成長および操作が容易であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよ
びｉｎ ｖｉｖｏで広い宿主範囲を示す。この群のウイルスを高力価、たとえば
、１０９〜１０１１プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで得ることができ、且つ
感染性が高い。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムに組み込ま
れることが必要である。したがって、アデノウイルスベクターによって配送され
る外来遺伝子は、エピソーム性であり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒
性が低い。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の研究で、副作用は全く
報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９６３， Ｔｏｐ ｅｔ
ａｌ．， １９７１）、治療用潜在的なｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入ベクターとし
ての安全性および治療潜能力を示す。さらに、他の遺伝子配送ベクターに比べて
、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ担持力が大きい（８ｋＢまで）（Ｂｅｒｋ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出、Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（
１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７）。現在使用されている、した
がって、本発明で好まれる複製−欠陥アデノウイルスベクターは、そのほとんど
が、ウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデ
ノウイルスの遺伝子物質を８０％も保持している（たとえば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ
ａｌ．，（１９７９）Ｃｅｌｌ １６：６８３、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ
．，前出、およびＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅ．J． Ｍｕｒｒａｙ， Ｅd．
（Ｈｕｍａｎａ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ， １９９１） ｖｏｌ． ７．
ｐｐ． １０９−１２７）を参照されたい。挿入された遺伝子の発現は、たとえ
ば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および付随リーダー
配列、ウイルスのＥ３プロモーター、または外因的に付加されたプロモーター配
列の管理下にあってもよい。
【０１８１】 アデノウイルスベクターは複製欠陥物である、または少なくとも条件付き欠陥
物であるという必要条件以外、アデノウイルスベクターの性質は、本発明を首尾
よく実行するために重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異な
る既知のセロタイプまたは下位集団Ａ〜Ｆのいずれのものであってもよい。本発
明の方法で使用するため条件付き複製−欠陥アデノウイルスベクター得るために
は、アデノウイルス下位集団Ｃのタイプ５が好ましい出発物質である。これは、
アデノウイルスタイプ５は、大量の生化学情報および遺伝子情報が知られている
ヒトアデノウイルスであり、且つアデノウイルスをベクターとして使用する大抵
の構築に歴史的に使用されているためである。上述の通り、本発明による典型的
なベクターは複製欠陥物であり、アデノウイルスＥ１領域を持たない。したがっ
て、Ｅ１コーディング配列が除去されている位置に、関心事の核酸を導入するの
に最も便利であろう。しかし、関心事の核酸が挿入される、アデノウイルス配列
内の領域の位置は、本発明に重要ではない。たとえば、関心事の核酸を、Ｋａｒ
ｌｓｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（１９８６）により既述されているＥ３置換ベクタ
ーの欠失したＥ３領域の位置、またはヘルパー細胞系またはヘルパーウイルスが
Ｅ４欠陥物を補足するＥ４領域に挿入してもよい。
【０１８２】 好ましいヘルパー細胞系は、２９３（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲL 1５７３）であ
る。このヘルパー細胞系は、「パッケージング細胞系」とも呼ばれ、Ｆｒａｎｋ
Ｇｒａｈａｍ（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ． Ｇｅｎ．
ＶＩＲＯＬ． ３６：５９−７２およびＧｒａｈａｍ（１９７７） Ｊ．ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：９３７−９４０）によって開発され、Ｅ１
ＡおよびＥ１Ｂをトランスで提供する。しかし、ヘルパー細胞系は、ヒト細胞、
たとえば、ヒト胚腎細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胚間充組織または
上皮細胞から誘導することもできる。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウ
イルスに寛容な他の哺乳類種の細胞から誘導することもできる。このような細胞
としては、たとえば、ベロ細胞または他のサル胚間充組織または上皮細胞がある
。
【０１８３】 様々なアデノウイルスベクターが、ヒトを含む哺乳類への遺伝子導入に有用な
ことが証明されている。肺上皮におけるマーカー蛋白およびＣＦＴＲの発現に、
複製欠陥アデノウイルスベクターが使用されてきた。複製欠陥アデノウイルスベ
クターは、分裂細胞を能率的に感染させることができ、肺への向性があり、高力
価ストックの製作が比較的容易なため、この数年間、アデノウイルスベクターは
、多くの調査研究の対象であり、被験者の肺への遺伝子配送に、様々なベクター
が使用されてきた（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７５：２０７−
２１６， １９９３、 Ｃｒｙｓｔａｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅ
ｔ． ８：４２−５１， １９９４、 Ｂｏｕｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Hu
m Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：６１５−６３９、 １９９４）。第一世代の Ｅ
１a欠失アデノウイルス ベクターは、温度感受性Ｅ２a ウイルス蛋白を含み、
且つウイルス蛋白の発現が少なく、その結果、免疫系に関する標的細胞をより少
しウイルス感染されるようにデザインされた第ニ世代によって、改良されている
。システム（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ６：８３９−８５１，１９９５）。その後、ウイルスのオープンリー
ディングフレームが全部欠失したウイルスベクターが報告された（Ｆｉｓｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１７：１１−２２， １９９６）。さ
らに、ウイルスのＩＬ−１０の発現は、アデノウイルスの抗原に対する免疫応答
を阻害することが明らかにされた（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１３６５−１３７４、１９９７）。
【０１８４】 アデノウイルスは、細胞タイプが特異的であることができる、すなわち、限定
されたタイプの細胞のみを感染させ且つ／または限定されたタイプの細胞のみで
導入遺伝子を発現することができる。たとえば、１９９７年１２月１６日発行の
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｕｒによる米国特許第５，６９８，４４
３号に記載の通り、このウイルスは、宿主細胞によって特異的に調節される開始
領域の転写管理下にある転写遺伝子を含む。したがって、たとえば、細胞特異的
応答要素を挿入することによって、複製能力のあるアデノウイルスを、ある一定
の細胞に制限し、複製に必要な蛋白、たとえば、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの合成を調
節することができる。
【０１８５】 多数のアデノウイルスタイプのＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋから入手すること
ができる。たとえば、ヒトアデノウイルスタイプ５のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は
Ｍ７３２６０である。現在同定されている４２のヒトアデノウイルスタイプのア
デノウイルスＤＮＡ配列は、いずれも入手することができる。Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄから、または請求によって多数の業者および学術機関から、
様々なアデノウイルス菌株が入手できる。ＣＦＴＲまたは他の遺伝子をベクター
に挿入するのに使用されるのと同じ方法（制限消化、リンカー連結または末端の
充填、および連結）で、本明細書に記載の導入遺伝子を、任意のアデノウイルス
ベクターおよび配送プロトコルに組み込むことが可能である。
【０１８６】 アデノウイルスプロデューサー細胞系は、アデノウイルス遺伝子Ｅ１、Ｅ２a
、およびＥ４ＤＮＡ配列の１つ以上を含んでもよく、これらの遺伝子の１つ以上
が突然変異しているかまたは欠失しているパッケージングアデノウイルスベクタ
ーについては、たとえば、Ｋａｄａｎ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ／ＵＳ９５／
１５９４７（ＷＯ ９６／１８４１８）、Ｋｏｖｅｓｄｉ ｅｔ ａｌ．による
ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７３４１（ＷＯ ９５／３４６６７１）、Ｉｍｉｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．によるＰＣＴ／FR９４／００６２４（ＷＯ ９４／２８１５２）、Ｐ
ｅｒｒｏｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ／FR９４／００８５１（ＷＯ
９５／０２６９７）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ／ＵＳ９５／１４
７９３（ＷＯ ９６／１４０６１）に記載されている。
【０１８７】 （ＡＶベクター） ＤＮＡの配送に有用な別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、能率的な複製および生産的ライフサ
イクルのヘルパーウイルスとして、別のウイルス、たとえば、アデノウイルスや
ヘルペスウイルスを必要とする、天然の欠陥ウイルスである。（総説については
、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉ
ｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２） １５８：９７−１２９を参
照）。
【０１８８】 ＡＡＶは、病因と関連がなかった。ＡＡＶは形質転換ウイルスまたは腫瘍形成
性ウイルスではない。ＡＡＶをヒト細胞系の染色体に組み込んでも、細胞の成長
特性または形態学的特徴に重大な変化を惹起しない。ＡＡＶのこれらの特性から
、ＡＡＶは、潜在的に有用なヒト遺伝子療法ベクターとして推奨される。
【０１８９】 ＡＡＶは、そのＤＮＡを非分裂細胞、たとえば、肺上皮細胞筋肉細胞、に組み
込むことができ、高頻度の安定な組み込みを示す数少ないウイルスの１つでもあ
る（たとえばＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅ
ｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７：３４９−３５６、Ｓａｍ
ｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｊ． Ｖirol． ６３：３８２２−
３８２８、およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３を参照）。ＡＡＶの３００塩基対しか
含まないベクターをパッケージして組み込むことができる。外因性ＤＮＡ用の空
間は約４．５ｋＢに限られている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１１
９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０に記載
されているもののようなＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞に導入するこ
とができる。ＡＡＶベクターを使用して、種々の核酸が異なる細胞タイプを導入
している（たとえばＨｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） ＰＮＡＳ
ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（
１１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１、
Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ． ２：３２−３９、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１１９８
４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９、およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ
ａｌ．，（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−
３７９０を参照）。
【０１９０】 一般に、使用されるＡＡＶを基礎とする発現ベクターは、利用できる制限部位
を直接使用するか、制限酵素で導入遺伝子を切除し、続いて末端の平滑化、適切
なＤＮＡリンカーの連結、制限消化、およびＩＴＲ間の部位への連結を行うかの
いずれかによって、導入遺伝子をサブクローニングするのに使用される、ヌクレ
オチド１４５個のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲs）フランキング制限部位を含
む。ＡＡＶベクターの容量は約４．４ｋＢである。様々なＡＡＶを基礎とするベ
クター、および種々のプロモーター／エンハンサーを使用して、以下の蛋白が発
現されている。：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ、ファンコニー貧血遺伝子、嚢胞性線維症貫膜コ
ンダクタンスレギュレーター、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（
Ｋｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９
３−８０１， １９９４、表１）。同様に、本発明の様々なＤＮＡ構成物を組み
込む導入遺伝子を、ＡＡＶを基礎とするベクターに含めることができる。融合蛋
白、たとえば、活性化ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコー
ドするリコンビナントＤＮＡの発現を推進するために、ＣＭＶのような構成的プ
ロモーターを含める代わりに、ＡＡＶプロモーターを使用することができる（Ｉ
ＴＲそのものまたはＡＡＶ p５（Ｆｌｏｔｔｅ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０， １９９３））。 このようなベクターを、報告されている方法で、ＡＡＶビリオン内にパッケー
ジすることができる。たとえば、内因性ＡＡＶプロモーターまたは非相同プロモ
ーターの制御下でＡＡＶを基礎とする発現ベクターと、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃ
ａｐをコードするオープンリーディングフレームを含む他のプラスミド（これら
は、リコンビナントウイルス構成物の複製およびパッケージングに必須である）
とを用いて、２９３のようなヒト細胞系を共トランスフェクトすることができる
。ｒｅｐ蛋白Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、ヘルパーウイルスの非存在下で、
複製型の蓄積を防止するが、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスで重複感染
させると、これらの蛋白は、ＩＴＲ（導入遺伝子を含む構成物中のみに存在する
）からの複製およびウイルスのカプシド蛋白の発現を可能にする。このシステム
を使用すると、導入遺伝子ＤＮＡがＡＡＶビリオン内にパッケージングされる（
Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ．Ｊ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９，１９９２、 Ｋｏｔｉｎ， Ｒ．
Ｍ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１， １９９
４））。一般に、トランスフェクションの３日後に、アデノウイルスと一緒にリ
コンビナントＡＡＶを細胞から収穫し、次いで、汚染しているアデノウイルスを
熱処理で不活化する。
【０１９１】 ＡＡＶの力価を向上させる方法を使用して、ＡＡＶビリオン中の導入遺伝子を
発現させることもできる。このような方策としては、細胞系におけるＩＴＲ−フ
ランク導入遺伝子の安定な発現に続くウイルスのパッケージングに関連した第２
のプラスミドによるトランスフェクション、誘導可能にＡＡＶ蛋白を発現する細
胞系、たとえば、温度感受性誘導可能発現または薬理学的に誘導可能な発現の使
用などがあるが、その限りではない。あるいは、５' ＩＴＲを含む第１のＡＡ
Ｖベクター、非相同遺伝子を囲む３' ＩＴＲ、および誘導可能な複製起点、た
とえば、ＳＶ４０複製起点（薬剤、たとえば、ＳＶ４０ Ｔ抗原によって誘導す
ることができ、且つＡＡＶ ｒｅｐ蛋白およびｃａｐ蛋白をコードするＤＮＡ配
列を含む）を含む第２のＡＡＶベクターを用いて、細胞をトランスフォームする
ことができる。薬剤で誘導すると、第２のＡＡＶベクターの多数のコピーを複製
することができ、その結果、感染力のあるＡＡＶ粒子数を多数作ることができる
（たとえば、１９９７年１２月２日発行のＣｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によ
る米国特許第５，６９３，５３１号を参照。多量のリコンビナントＡＡＶを産生
するためのさらに別の方法では、エプスタインバール核抗原（ＥＢＮＡ）遺伝子
、エプスタインバールウイルスの後期複製起点ｏｒｉＰ）およびＡＡＶゲノムを
組み込むプラスミドが使用される。このプラスミドは、２９３細胞のような細胞
内に、マルチコピー染色体外要素として維持される。野生型ヘルパー機能を付加
すると、これらの細胞は、多量のリコンビナントＡＡＶを産生する（１９９７年
１１月２５日発行のＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６
９１，１７６）。別のシステムでは、通常はｒｅｐ発現を調節するｐ５プロモー
ターが、非相同プロモーターと置き換えられている、ｒｅｐ遺伝子の発現を可能
にするＡＡＶパッケージングプラスミドが提供される（１９９７年８月１９日発
行のＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６５８、７７６号）。さ
らに、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９６／３９５３０号に記載の通り
に、一本鎖形から二本鎖形への変換を促進する薬剤で細胞を処理することによっ
て、ＡＡＶ形質導入の効率を高めることが可能である。
【０１９２】 Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４） ＰＮＡＳ ８１
：６４６６に記載されている通りに、ＡＡＶストックを作り、Ｓａｍｕｌｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２によって記
載されているpＡＡＶ／Ａｄを使用して改変した。報告された方法、たとえば、
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶベクター発現に関する初期のレポートで使用されてい
る塩化セシウム勾配中でのバンディング（Ｆｌｏｔｔｅ， ｅｔ ａｌ． Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０， １９９３）、また
はＯ'Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９７／０８２９８に記載されて
いるクロマトグラフィ精製によって、ウイルスの濃縮および精製を行うことがで
きる。
【０１９３】 ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＡＶベクターをパッケージングする方法も利用でき、粒
子にパッケージされるＤＮＡのサイズに制限がないという利点がある（１９９７
年１１月１８日発行のＺｈｏｕ ｅｔ ａｌによる米国特許第５，６８８、６７
６号を参照）。この手順は無細胞パッケージング抽出物の調製を含む。
【０１９４】 導入遺伝子を組み込むための方法および物質、導入遺伝子を含むリコンビナン
トＡＡＶベクターの増殖および精製、および細胞および哺乳類のトランスフェク
ションにおけるその使用とを含め、本発明の実行に有用と思われるＡＡＶテクノ
ロジーに関するさらなる詳細なガイダンスについては、たとえばＣａｒｔｅｒ
ｅｔ ａｌ， 米国特許第４，７９７，３６８号（１９８９年１月１０日）、Ｍ
ｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，１３９，９４１号（１９９２年
８月１８日）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，１７３，４
１４号（１９９２年１２月２２日）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， 米国特許第５，
２５２，４７９号（１９９３年１０月１２日）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ， 米国特許第５，３５４，６７８号（１９９４年１０月１１日）、Ｓｈｅｎ
ｋ ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，４３６，１４６号（１９９５年７月２５日）
、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，４５４，９３５号（１
９９５１２月１２日）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ＷＯ ９３／２４６４１号
（１９９３年１２月９日公告）、およびＮａｔｓｏｕｌｉｓ，米国特許第５，６
２２，８５６（１９９７年４月２２日）を参照されたい。以下の論文に、ＡＡＶ
および必要なアデノウイルスまたはヘルペスヘルパーの機能に関するさらなる情
報を見つけることができる記載がなされている。Ｂｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅ
ｎｓｋｙ（１９８７），“Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ
： Ａｎ Ｕｐｄａｔｅ“， Ａｄｖａｎｃｅｄ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ３３：２４３−３０６。ＡＡＶ
のゲノムは、Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） “Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒ
ｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ”， Ｇ
ｅｎｅ， ２３： ６５−７３に記載されている。ＡＡＶの発現は、Ｂｅａｔｏ
ｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐ５ ａｎｄ ｐ１９ ｐ
ｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｓ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ
ｔｒａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｐ ｐｒｏｔｅｉｎ“， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
， ６３：４４５０−４４５４に記載されている。ｒＡＡＶの構築は、多数の出
版物に記載されている：Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） “
Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｉ
ｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ, ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅ
ｌｌｓ“， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４：２０７２−２０８１、
Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ （１９８４） “Ｕｓｅ ｏｆ
ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ： Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａ
ｎ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｌｌｓ“， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６４６６−６４７０、 ＭｃＬａｕ
ｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） “Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ
： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｖｉｒａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ“，
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６２：１９６３−１９７３、およびＳａｍｕｌｓｋｉ
ｅｔ ａｌ． （１９８９） “Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ ｓｔｏｃｋｓ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ： ｎｏｒｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｄｏｍｑｕｂｂ ｖｉｒａｌ
Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ“， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３：３８２２
−３８２８。ｒＡＡＶでトランスフォームすることができる細胞系は、Ｌｅｂｋ
ｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） “Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ ｖｉｒｕｓ： ａ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ
ＮＡ ｉｎｔｏ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ
ｔｙｐｅｓ“， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：３９８８−３９９
６に記載のものである。リコンブナントレトロウイルスの製造に使用される「プ
ロデューサ−」または「パッケージング」細胞系は、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ
ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３：３２０９−３２１２、
およびＭａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
， ６２：１１２０−１１２４に記載されている。
【０１９５】 （ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶベクター） プロモーターの制御下で、アデノウイルスの一部と、選択された導入遺伝子を
囲むＡＡＶの５' および３' ＩＴＲ配列とを含む核酸を含むアデノウイルスカ
プシドによって呈示されるハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶベクター。たと
えばＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， 国際特許出願公告第 ＷＯ ９６／１３５９
８を参照されたい。このハイブリッドベクターは、宿主細胞への高力価導入遺伝
子配送、およびｒｅｐ遺伝子の存在下で、導入遺伝子を宿主細胞染色体にしっか
りと組み込む能力を特徴とする。このウイルスは、実質的に全ての細胞タイプを
感染させることができ（アデノウイルス配列によって与えられる）、且つ宿主細
胞ゲノムへの安定した長期導入遺伝子組み込みが可能である（ＡＡＶ配列によっ
て与えられる）。
【０１９６】 このベクターに使用されるアデノウイルス核酸配列は、最小限の配列量（ハイ
ブリッドウイルス粒子の製造にヘルパーウイルスを使用することが必要である）
から、アデノウイルス遺伝子の選択された欠失のみ（パッケージング細胞によっ
て、欠失している遺伝子生成物をハイブリッドウイルスのプロセスで供給するこ
とができる）範囲であってもよい。たとえば、ハイブリッドウイルスは、アデノ
ウイルスの５'および３'逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（複製起点の役割をする
）を含んでもよい。使用することができるＡｄ５ゲノムの左末端配列（５'）は
、定型的なアデノウイルスゲノムの塩基対１〜約３６０個に及び（図単位０〜１
とも呼ばれる）、５' ＩＴＲおよびパッケージング／エンハンサードメインを
含む。ハイブリッドウイルスの３'アデノウイルス配列は、ヌクレオチド約５８
０個である右末端３' ＩＴＲ配列（アデノウイルスの塩基対約３５，３５３個
の末端、図単位９８．４−１００付近とも呼ばれる）を含む。
【０１９７】 ハイブリッドベクターに有用なＡＡＶ配列は、ｒｅｐおよびｃａｐポリペプチ
ドコード化配列が欠失しているウイルスの配列であり、通常は、シス作用型５'
および３' ＩＴＲ配列である。したがって、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、選択され
たアデノウイルス配列に囲まれており、ＡＡＶ ＩＴＲ配列自身は選択された導
入遺伝子を囲む。"Ｈｙｂｒｉｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ＡＡＶ Ｖｉｒｕｓ
ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ"と題するＷｉｌｓｏ
ｎ eｔ ａｌ．によるＰＣＴ出願公告ＷＯ ９６／１３５９８号には、ハイブ
リッドベクターの調製についてさらに詳細記載されている。
【０１９８】 導入遺伝子を組み込むための方法および物質、導入遺伝子を含むリコンビナン
トウイルスの増殖およひ精製、細胞および哺乳類のトランスフェクションにおけ
るその使用を含め、本発明の実行に有用と思われる、アデノウイルスおよびハイ
ブリッドアデノウイルス−ＡＡＶテクノロジーに関するさらなる詳細なガイダン
スについては、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， ＷＯ ９４／２８９３８号、ＷＯ
９６／１３５９７号およびＷＯ ９６／２６２８５号、およびその中で引用さ
れている参考文献も参照されたい。
【０１９９】 （レトロウイルス） 感染細胞中で、逆転写のプロセスによって、自らのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換
できることを特徴とする、一群の一本鎖ＲＮＡウイルスである（Ｃｏｆｆｉｎ（
１９９０） “Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ” Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｋｎｉｐｅ ｅｄ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）。次いで、このようにして
得られたＤＮＡをプロウイルスとして細胞性染色体にしっかりと組み込み、ウイ
ルス蛋白の合成を指令する。組み込まれると、ウイルスの遺伝子配列は、受容細
胞およびその子孫に保持される。レトロウイルスのゲノムは、それぞれ、カプシ
ドの蛋白成分、ポリメラーゼ酵素成分、およびエンベロープ成分をコードする３
種の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流にあ
る、ｐｓｉと呼ばれる配列は、ゲノムをビリオン内にパッケージするシグナルの
役割をする。ウイルスゲノムの５'末端および３'末端に、２つの長末端反復（Ｌ
ＴＲ）配列が存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー
配列を含み、宿主細胞ゲノムにおける組込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ（１
９９０）、前出）。
【０２００】 レトロウイルスベクターを構築するために、ある一定のウイルスの配列の代わ
りに、関心事の核酸をウイルスゲノムに挿入し、複製欠陥であるウイルスを作る
。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝
子を含むが、ＬＴＲ成分およびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞系を構
築する（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３）細胞 ３３：１５３）。この細
胞系に、レトロウイルスのＬＴＲおよびｐｓｉ配列と一緒にヒトｃＤＮＡを含む
リコンビナントプラスミドを導入する（たとえば、リン酸カルシウム沈降による
）と、ｐｓｉ配列によって、リコンビナントプラスミドのＲＮＡ転写産物が、ウ
イルス粒子内にパッケージされ、次いで、ウイルス粒子内が培地中に分泌される
（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ（１９８８）“Ｒｅｔｒｏｖ
ｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ”， Ｉｎ： Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ ｅｄ．ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ．
Ｓｔｏｎｅｈａｍ： Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ； Ｔｅｍｉｎ， （１９８６）
“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ： Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｎｄ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｉｎ Ｖｅｒｔｅｂ
ｒａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｅ”， Ｉｎ： Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ
ｅｄ． Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ； Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３ 前出）。次いで、リコン
ビナントレトロウイルスを含む培地を回収し、任意に濃縮し、遺伝子導入に使用
する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞タイプを感染させることがで
きる。しかし、組み込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要である（
Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９７５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：２４２
）。 レトロウイルスを使用するための主要な前提条件は、特に、細胞集団で野生型
ウイルスが広がる可能性に関する、その使用の安全性の確保である。複製−欠陥
レトロウイルスのみを産生する特殊化された細胞系（「パッケージング細胞」と
呼ばれる）が開発され、遺伝子療法用のレトロウイルスの有用性が高まり、欠陥
レトロウイルス遺伝子療法用の遺伝子導入で使用するために、十分に特性化され
ている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．（１９９０） Ｂｌｏｏｄ
７６：２７１を参照）。したがって、レトロウイルスのコーディング配列（ｇ
ａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部が本発明の融合蛋白をコードしている核酸と置き
換えられており、レトロウイルスを複製欠陥にさせるリコンビナントレトロウイ
ルスを構築することができる。次に、複製欠陥レトロウイルスをビリオンにパッ
ケージし、標準技術でヘルパーウイルスを使用することによって、これを、標的
細胞の感染に使用することができる。リコンビナントレトロウイルスを作り、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、このようなウイルスで細胞を感染させ
るプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌs ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（ｅ
ｄｓ．） Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１
９８９）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４および他の標準的な実験マ
ニュアルに記載されている。適当なレトロウイルスの例としては、当業者に周知
のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭがある。好ましいレトロウイルスベク
ターは、ｐＳＲ ＭＳＶｔｋＮｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：１７８５およびｐＳＲ ＭＳＶ（Ｘ
ｂａｌ）（Ｓａｗｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ
ｄ． １８１：３０７）およびそれらの誘導体である。たとえば、両ベクターの
独特なＢａｍＨＩ部位を除去することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ
によりＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８に記載されている通りに、ベクターをＢａ
ｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで充填し、再連結して、それぞれｐＳＭＴＮ２お
よびｐＳＭＴＸ２を作る。同種指向性レトロウイルスシステムと両種指向性レト
ロウイルスシステムの両者を調製するのに適したパッケージングウイルス系とし
ては、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ、２およびＡｍなどがある。
【０２０１】 ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、神経細胞、上皮細胞、内
皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む種々の遺伝子を、多くの
異なる細胞タイプに導入するのに、レトロウイルスが使用されてきた。（たとえ
ば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：
１３９５−１３９８、 Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ、（１９８８）
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４、 Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．，（１９８８） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎ
ｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６１４１−
６１４５、 Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
８：８０３９−８０４３、 Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、 Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．
，（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、 ｖａｎ Ｂ
ｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７
６４０−７６４４、 Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、 Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，（１９
９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５、
米国特許第４，８６８、１１６号、米国特許第４，９８０、２８６号、ＰＣＴ出
願ＷＯ ８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０２４６８号、ＰＣＴ出
願ＷＯ ８９／０５３４５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ ９２／０７５７３号を参
照）。
【０２０２】 さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージング蛋白を改変すること
によって、レトロウイルスの、その結果としてレトロウイルスを基礎とするベク
ターの、感染スペクトルを限定できることが証明されている。（たとえば、ＰＣ
Ｔ公告ＷＯ ９３／２５２３４号、ＷＯ ９４／０６９２０号、およびＷＯ ９
４／１１５２４号を参照）。たとえば、レトロウイルスベクターの感染スペクト
ルを一部変更する方策としては次のものがある：細胞表面抗原特異的抗体を、ウ
イルスのｅｎｖ蛋白ニカップリングすること（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９
８９） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９０７９−９０８３、Ｊｕｌａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９２） Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：３２５１−３２５５、
およびＧｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２
５１−２５４）、または細胞表面リガンドをウイルスのｅｎｖ蛋白にカップリン
グすること（Ｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ． ２６６：１４１４３−１４１４６）。カップリングは、蛋白との化学的
架橋という形態であっても、他の形態であってもよく（たとえばｅｎｖ蛋白をア
シアログリコプロテインに変換するためのラクトース）、融合蛋白（たとえば一
本鎖抗体／env融合蛋白）の生成によってもよい。この技術は、感染を、ある一
定の組織タイプに限定するか、さもなければ向けるのに有用であるが、同種指向
性ベクターを両種指向性ベクターに変換するのにも使用することができる。
【０２０３】 （他のウイルスシステム） 遺伝子療法に使用することが可能な他のウイルスベクターシステムが、ヘルペ
スウイルス、たとえば、単純ヘルペスウイルス（１９９７年５月２０日発行のＷ
ｏｏ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６３１，２３６号）、ワクシニアウイ
ルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８） Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，“In： Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ R
Ｌ， Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ Ｔ， ｅｄ． Ｖｅｃｔｏｒs：Ａ Ｓｕｒｖ
ｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ． Ｓｔｏｎｅｈａｍ： Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ； Ｂ
ａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ（１９８６） “Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒ
ｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ： Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ
ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎ
ｅs，” Ｉｎ： Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ， ｅｄ． Ｇｅｎｅ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｕｐ
ａｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｇｅｎｅ， ６８：１−１０）および幾種か
のＲＮＡウイルスから誘導されている。好ましいウイルスとしては、アルファウ
イルス、ポックスウイルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイ
ルス等々がある。特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および目の組
織の細胞においてリコンビナント遺伝子持続させる独特の方策を実現することが
可能である（Ｐｅｐｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２６６２−２６６６）。ヘルペスウ
イルスベクターは、様々な哺乳類細胞に、幾つかの興味深い特徴を与える（Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎｎ（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１２７５−１２８１
， Ｒｉｄｇｅｗａｙ， １９８８、前出、Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇ
ｄｅｎ， １９８６、前出、Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｈｏ
ｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６４：６４２
−６５０）。
【０２０４】 欠陥Ｂ型肝炎ウイルスが最近認められ、異なるウイルス配列の構造−機能関係
について新たな見識が得られた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で、ウイルスは、ゲノム
の８０％まで欠失しているにかかわず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆
転写に関する能力を保持できることが判明した（Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．
， １９９０、前出）。このことから、ゲノムの大部分を外来の遺伝学的物質と
置換できることが示唆される。向肝性および持続性（組み込み）は、肝指向遺伝
子導入にとって、特に魅力的な特性である。Ｃｈａｎｇらは、最近、ポリメラー
ゼコーディング配列、表面コーディング配列、およびプレ表面コーディング配列
の代わりに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝
子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。野生型ウイルスを用いて、この
ゲノムをトリ肝癌細胞系に共トランスフェクトした。高力価のリコンビナントウ
イルスを含む培地を使用して第１代のアヒルの子の肝細胞を感染させた。トラン
スフェクションの少なくとも２４日後に、適当なＣＡＴ遺伝子発現が検出された
。（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １４：
１２４Ａ）。
【０２０５】 （ウイルスベクターの投与） 一般に、ＤＮＡまたはウイルス粒子は、無菌生理食塩水、または他の水性また
は非水性の等張無菌注射用液または懸濁液のような、生物学的適合溶液または薬
学的に許容できる配送媒体に移されるが、リンゲル液、燐酸緩衝食塩水、他の類
似子の媒体を含め、非常に多くの例が当技術分野で周知である。次に、導入遺伝
子の配送が、裸のＤＮＡとして、脂質、リポソーム、または別の方法で調剤した
ＤＮＡとして、またはリコンビナントウイルスベクターとして、好ましくはｉｎ
ｖｉｖｏ肺指向性遺伝子療法で実施される。これは、霧状化／吸入または気管
支鏡を介した滴下を含む様々な方法で遂行される。最近、フェーズ１臨床試験で
、ＣＦＴＲをコードするリコンビナントアデノウイルスがヒト被験者にエアゾー
ルで投与された。これらの患者の鼻および気道でベクターＤＮＡおよびＣＦＴＲ
発現が明らかに検出され、急性毒性反応は皆無であった（Ｂｅｌｌｏｎｅｔ ａ
ｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８（１）：１５−２５、１９
９７）。
【０２０６】 好ましくは、様々な気道上皮細胞、気道および接近可能な気道平滑筋細胞内に
存在する白血球を含む（これに限定されない）、受容者気道内の細胞をトランス
フェクトするのに十分な量のＤＮＡまたはリコンビナントウイルスウイルスを投
与し、標的遺伝子の観測可能なリガンド応答性転写を実現するのに十分なレベル
、好ましくは、過度の有害作用なしに、治療的利益を提供するレベルの導入遺伝
子発現を提供する。
【０２０７】 ＤＮＡまたはウイルスの最適用量は、先に検討した種々の因子によって異なる
ため、患者毎に若干変化すると考えられる。また、ウイルスの治療有効量は、ウ
イルス約１×１０７〜約１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌの濃度を含む食塩溶液約２０
〜約５０ｍｌの範囲、たとえばウイルス１×１０８〜１×１０９ＰＦＵ／ｍｌと
考えられる。
【０２０８】 好ましい実施形態で、標的遺伝子を含むウイルス粒子と本発明の融合蛋白を含
む核酸を含むウイルス粒子との比率は約１：１である。しかし、その他の比率を
使用してもよい。たとえば、標的遺伝子を含む粒子を、融合蛋白をコードする粒
子の２倍、投与することが望ましい場合もある。その他の比率としては１：３、
１：４、１：１０、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１などがある。ど
の比率が標的遺伝子の最高の発現および最低のバックグラウンド発現になるかを
決定するために、異なる比率のウイルス粒子を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセ
イを実施することによって、最適比率を決定することができる。同様に、それぞ
れ別々にカプシドで包まれた２つの異なる核酸によって融合蛋白がコードされる
場合、所望の結果に応じて、３つのウイルス粒子間の比率を変えることができる
。
【０２０９】 （本発明の方法） 本発明は、細胞を、標的遺伝子の発現のリガンド介在性調節に対して応答する
ようにさせるために、細胞を操作する方法を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ
ｖｉｖｏ）またはｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、ｉｎ ｓｉｔｕ−生物内）で、
細胞を操作することができる。標的遺伝子は、内因性遺伝子であっても、外因性
遺伝子（天然のペプチド配列のものであってもよく、非天然のペプチド配列を含
んでもよい）であってもよい。本方法は、関心事の細胞に、本発明の遺伝子構成
物または組成物を１つ以上導入することを含む。これらの方法の例は、たとえば
、正常な生物学的プロセスまたは病理学的生物学的プロセス（種々の疾患を含む
）の試験で使用するために、遺伝子の同定または特性化に使用するために、ある
いは新薬の認定または薬物作用、メカニズムまたは効果の評価に使用するために
、本明細書に記載の細胞または動物（たとえば、マウス、ラットなど．）の遺伝
子操作を含む。その他の例は、ｉｎ ｖｉｖｏであれ、ｅｘ ｖｉｖｏであれ、
ヒト被験者への遺伝子療法の配送を含む。
【０２１０】 本発明は、上記または本明細書の他所ならびに引用の参考文献に記載の目的を
実施するために、このような操作された細胞、またはその細胞を含む生物を使用
する方法も提供する。一般に、これらの方法は、標的遺伝子の発現を調節するた
めに、操作された細胞またはその細胞を含む生物にリガンドを適用することを含
む。
【０２１１】 （キット） 本発明は、さらに、様々な用途に有用なキットを提供する。１つのこのような
キットは、それぞれ、本発明の融合蛋白をコードする核酸を１つ以上含む。キッ
トは、標的遺伝子構成物を含む別の核酸をさらに含んでもよい。あるいは、その
別の核酸は、専門家が所望の標的遺伝子を挿入するためのクローニング部位を含
んでもよい。キットは、これらの物質を使用して遺伝子発現を調節するための試
料をさらに含んでもよい。
【０２１２】 （使用） １つの用途で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的蛋白を作るために、本発明に従って操
作された細胞が使用される。このような用途では、標的蛋白の生産が望み通りに
なるまで、細胞を培養するか、別の方法で維持する。同時に、適切なリガンドを
、所望のレベの標的蛋白を産生させるのに十分な量で、培地に加える。このよう
にして産生された蛋白は、培地または細胞回収することができ、必要に応じて、
細胞の成分または培地から精製することが可能である。
【０２１３】 蛋白を発現するように操作された哺乳類細胞系を使用して、工業用または研究用
の蛋白を製造することができる。適切な蛋白機能が、非哺乳類細胞によって一般
に行われない翻訳後改変を必要とする場合、細菌、昆虫または酵母の細胞ではな
く、哺乳類細胞の使用が指示される。この方法で工業的に製造される蛋白の例と
しては、特に、エリトロポエチン、ＢＭＰ−２、組織プラスミノーゲンアクティ
ベーター、第VIII：ｃ因子、第IX因子、および抗体である。この様式での蛋白製
造原価は、操作された細胞で達成される発現レベルと関連する。したがって、本
明細書に記載の本発明は、従来の発現システムよりかなり高い発現レベルを達成
できるため、蛋白製造原価を低減させることが可能である。標的蛋白生産の毒性
は、第２の制限を表すこともあり、細胞が高密度まで成長することを妨げ且つ／
または生産レベルを低減させる。したがって、本明細書に記載の通り、蛋白発現
を厳重に管理できると、細胞は、蛋白産生をせずに、高密度まで成長させること
ができる。最適細胞密度に達した後に限って、または望ましい時に、標的遺伝子
の発現を活性化し、その後蛋白生産物を収穫することができる。
【０２１４】 他の用途では、本発明に従って動物宿主またはヒト被験者内の細胞が操作され
るか、そのように操作された細胞が動物またはヒト被験者に導入されるが、いず
れの場合にも、受容者を標的遺伝子の発現のリガンド介在性調節に合うように準
備するためである。非ヒト動物の場合、動物の獣医学治療の一部として行われる
か、種々の研究用の動物モデルを作製するために行われる。ヒト被験者の場合、
治療プログラムまたは予防的治療プログラムの一部として行うことができる。
【０２１５】 本発明は、種々の治療方法に応用でき、たとえば、調節すべき標的遺伝子は内
因性遺伝子であっても非相同遺伝子であってもよく、リガンドを加えることによ
って、その発現を活性化することも、抑制することもできる。
【０２１６】 ある場合には、因子は、関心事の１つ以上の細胞タイプの増殖および／または
分化に必要な標的遺伝子である。たとえば、放射線療法または化学療法によって
、血液細胞の少なくとも一部が破壊されている、被験者の成長因子およびリンホ
カイン類の発現を刺激することが望ましいこともある。たとえば、エリトロポエ
チンの発現は、赤血球の産生を刺激し、Ｇ−ＣＳＦの発現は顆粒球の産生を刺激
し、ＧＭ−ＣＳＦの発現は、様々な白血球の産生を刺激する。同様に、疾患プロ
セス、たとえば、自己免疫疾患、によって１つ以上の特定の細胞タイプが破壊さ
れている疾患または状態、たとえば、自己免疫疾患では、これらの細胞の増殖を
刺激する因子をコードする１つ以上の遺伝子の発現を刺激することによって、そ
の特定の細胞を補充することができる。
【０２１７】 本発明の方法を使用して、たとえば、リンホカイン類（たとえば、ある種のＴヘ
ルパー（Ｔｈ）細胞の増殖を刺激するＩＬ−４）の発現を刺激することによって
、ＡＩＤＳ患者のリンパ球数を増加させることもできる。
【０２１８】 被験者の内因性蛋白の産生を増進させる少なくとも１つの利点は、蛋白に対す
る免疫反応がなく、したがって、被験者の治療がより能率的になることである。
非相同蛋白の発現が調節される場合、免疫抑制薬、たとえば、ラパマイシン、サ
イクロスポリンＡ、ＦＫ５０６または前述のいずれかの混合物または免疫反応を
抑制する他の化合物を、被験者に同時に投与することが好ましいこともある。
【０２１９】 本発明のＤＮＡ構成物を用いてｅｘ ｖｉｖｏで改変された細胞を、選択的条
件下で成長させ、次いで、所望の構成物を有するとして選択された細胞を拡大し
、たとえば、宿主細胞に構成物が存在することを決定するためのポリメラーゼ連
鎖反応および／または所望の遺伝子生成物の産生に関するアッセイを使用して、
さらに分析することが可能である。改変された宿主細胞は、いったん同定される
とその後は、計画通りに使用する（たとえば、培養中で成長させたり、宿主生物
に導入したりする）ことができる。
【０２２０】 標的遺伝子が操作すべき細胞の内因性遺伝子である場合、内因性標的遺伝子が
特異的に認識されてリガンド依存性方式で調節されるように、プロモーターおよ
び／または遺伝子の１つ以上の他の領域を、本発明の融合蛋白のＤＮＡ結合ドメ
インによって特異的に認識される標的配列を含むように改変することができる。
標的遺伝子の調節領域に結合することが判明しているＤＮＡ結合蛋白がない状況
では、このような実施形態は、有用であろう。したがって、１つの実施形態では
、被験者または他の起源から１つ以上の細胞を獲得して、所望の調節要素が挿入
され、標的遺伝子に効果的に連結されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子操作す
る。次いで、この細胞を被験者に導入する。あるいは、細胞を被験者に導入する
前に、発標的遺伝子に導入された現調節要素と特異的に相互に作用することがで
きるＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコードする核酸を含むように細胞をさ
らに改変する。本発明の他の実施例では、たとえば、当技術分野で周知であり、
たとえば、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８７） Ｃｅｌｌ
５１：５０３、Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３
３６：３４８、およびＪｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ
３３８：１５３に記載されている技術である相同リコンビネーションによって
、ｉｎ ｖｉｖｏで内因性遺伝子が改変される。
【０２２１】 標的遺伝子は、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムまたは翻訳されない他の
ＲＮＡ分子をコードしてもよい。たとえば、本発明の方法を使用して、被験者の
細胞中の１つ以上の特定の蛋白の産生を阻害することができる。本発明によって
提供される強力な転写アクティベーターを利用すると、高レベルのＲＮＡ、たと
えば、アンチセンスＲＮＡ、を細胞で確実に産生させることができる。
【０２２２】 本発明の他の用途としては、生物学的研究が挙げられる。ニハイブリッドアッ
セイは、Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４０：２４５
−２４７（１９８９）が初めて記載した転写系のアッセイである。Ｆｉｅｌｄｓ
ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，２８３，１７３（１９９４年２月１日）も参照
されたい。このニハイブリッドアッセイは、転写因子は、ＤＮＡ結合または転写
活性化のいずれかを指令する分離可能な機能的モジュールを含むという観察結果
に基づいている。細胞で発現されるＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化ドメイン
が欠けているため、ＤＮＡに結合するが転写を活性化しない。反対に、指令され
た相互作用および／またはＤＮＡ−結合ドメインによって提供されるようなＤＮ
Ａとの密接な相互作用が存在しない条件下で、転写活性化ドメインは単独で転写
を行わない。しかし、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、それぞ
れ別々の融合蛋白の一部として発現されるため、融合蛋白は会合することができ
、そのようにして形成された「ニハイブリッド」複合物は再構成された転写因子
を呈示する（図１参照）。このような再構成された転写因子は、ＤＮＡ−結合ド
メインによって認識されるＤＮＡ結合部位の下流に位置するレポーター遺伝子（
たとえば、βガラクトシダーゼやアルアカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のよう
な、便利に検出できるマーカーの遺伝子または細胞生育能に重要な蛋白生存）の
転写を開始することができる。レポーター遺伝子発現量、すなわち、産生された
遺伝子生成物の量は、融合蛋白が互いに複合した程度を表す。実施例８に記載の
通り、本発明の束化ドメインを使用して、この複合体にさらなる活性化ドメイン
を補充すると、以前には検出されなかった相互作用が今度は明らかに確認できる
という具合に、アッセイの感度が有意に上昇する。
【０２２３】 この劇的な向上は、関心事の遺伝子の同定、ペプチド結合パートナーの同定、
および関心事の蛋白−蛋白相互作用の阻害剤の同定を行うためのものを含め、ニ
ハイブリッド方法論の種々の用途にとって、重要な副産物である。
【０２２４】 たとえば、関心事の遺伝子、たとえばｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡを同定
するために、コードされたポリペプチドを、束化ドメインおよび転写活性化ドメ
インに連結された融合蛋白として発現するようにデザインされた構成物に、この
遺伝子をクローニングする。このような構成物のデザインの例として、図３に示
したＲＬＳ融合蛋白のような融合蛋白をコードする構成物で開始することができ
るが、リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡを挿入するた
めのクローニング部位と交換してもよい。この構成物（ｃＤＮＡ挿入物を担持す
る）を、（ｉ）関心事のＤＮＡ結合ドメインおよび標的ドメインを含む融合蛋白
をコードする核酸、および（ii）検出可能な遺伝子生成物をコードする遺伝子か
、または検出可能な表現型必要な遺伝子に操作可能に連結されたＤＮＡ結合ドメ
インに関する認識配列を含むレポーター遺伝子構成物を含む（または、その後、
含むようにした）宿主細胞に導入する。関心事の標的ドメインに結合するｃＤＮ
Ａコード化ドメインを含む融合蛋白を発現する細胞は、レポーター遺伝子構成物
を発現する。このようにして、対応するｃＤＮＡがコードする蛋白は関心事の標
的ドメインに結合することに基づいて、ｃＤＮＡを同定することができる。潜在
的な利点としては、さほど多くないｃＤＮＡ、他のｃＤＮＡに比べて低レベルで
発現されるｃＤＮＡ、比較的低いアフィニティで標的に結合する遺伝子生成物を
コード化するｃＤＮＡsの検出能および同定能の増強が挙げられる。
【０２２５】 別のニハイブリッド応用分野では、先の実施例におけるｃＤＮＡの代わりに望
ましいポリペプチドのコレクションを含む核酸構成物を使用して、ポリペプチド
のコレクションを融合蛋白として発現させる。このようにして、関心事の標的蛋
白またはドメインに結合するペプチド配列を同定することができる。
【０２２６】 もう１つのこのような用途は、関心事の蛋白：蛋白相互作用の阻害剤を同定す
るためのアッセイを含む。このようなアッセイで、２つの融合蛋白、すなわち、
ＤＮＡ結合ドメインおよび関心事の第１の蛋白ドメインを含む第１の融合蛋白と
、転写活性化ドメイン、束化ドメイン、および関心事の第１の蛋白ドメインに結
合する関心事の第２の蛋白ドメインを含む第２の融合蛋白とを、発現するように
宿主細胞を操作する。この細胞は、上記のレポーター遺伝子構成物も含む。２つ
の融合蛋白は互いに結合するため、レポーター遺伝子は通常通り発現する。たと
えば薬物スクリーニングプログラムでこのような細胞を使用して、蛋白：蛋白相
互作用を阻害する化合物を同定することができる。したがって、本発明の融合蛋
白を含む細胞を、試験すべき１つ以上の化合物と接触させることができる。次い
で、レポーター遺伝子生成物の存在および量を決定する。ある物質の存在下にお
けるレポーター発現が、その物質がより少し存在するか全く存在しない条件下に
おける発現と比べて減少することは、その物質が蛋白：蛋白相互作用を阻害した
ことを示す。本発明に合うように改変することができるこのようなアッセイのデ
ザインおよび手段に関するさらなる詳細については、たとえばＷＯ ９５／２４
４１９号を参照されたい。試験に適したものは、微生物ブロス、細胞抽出物、細
胞からの調整培地、組み合せライブラリーおよびその他の天然の起源または合成
化合物（これに限定されない）を含め、多種多様な起源から入手することができ
る。
【０２２７】 （薬学的組成物および操作された細胞を有する被験体へのその投与） 適用 リガンドは、ヒト被験体または非ヒト被験体に、薬学的に受容可能な物質およ
び投与方法を使用して投与することができる。様々な配合物、投与経路、用量お
よび投薬計画が、下記のような要因に依存して、リガンドを投与するために使用
され得る：リガンド結合ドメインに対するリガンドの結合親和性、転写調節ドメ
インの選択、レシピエントの症状および環境、所望する応答、リガンドの生物学
的半減期および生体利用性、標的遺伝子産物の生物学的半減期および比活性、操
作された細胞の存在数および存在位置など。薬物は、非経口的に、あるいはより
好ましくは経口的に投与することができる。投与用量および投与頻度は、上記の
要因に依存する。薬物は、ピル、粉剤または懸濁剤として経口的に、頬的に、舌
下で摂取することができ、あるいは血管内、腹腔内、皮下に注射することができ
、あるいはその他により投与することができる。薬物（および下記のアンタゴニ
スト）は、この分野で十分に知られている従来の方法および物質を使用して、様
々な投与経路のために配合することができる。正確な投与用量および特定の投与
方法は、上記の要因に依存し、そして担当医師または医療提供者によって決定さ
れる。しかし、本発明者らは、今回、集束化させた活性化ドメインが存在すると
きに、本システムの融合蛋白質をオリゴマー化するために必要とされる薬物の量
が、一桁以上、著しく減少することを明らかにする。
【０２２８】 任意の適用に必要な薬物の具体的な投薬量は、治療投薬量のモニターリングに
関する従来の方法および手順に従って決定することができる。所定の範囲内にあ
る薬物用量を投与し、そして患者の応答をモニターし、その結果、治療応答のレ
ベルと、標的遺伝子の発現レベルの時間に対する関係とを明らかにすることがで
きる。その期間に認められる発現レベルおよび治療応答に依存して、その後の投
薬レベルを調節して、時間とともに得られる発現レベルを変えることができ、あ
るいは、そうでなければ、治療応答を改善することができる。このようなプロセ
スは、投薬によって最適な治療応答が得られるまで反復的に繰り返すことができ
る。薬物が長期間投与され得る場合には、薬物の持続投薬量が決定されると、全
体的な治療応答が継続して達成されていることを確かめるために、その後、定期
的にモニターすることができる。
【０２２９】 薬物による活性化を打ち消そようとする場合、薬物投与を一時的に中断するこ
とができ、その結果、細胞は増殖が基礎的な速度に戻る。打ち消し治療をより積
極的に行うために、薬物のアンタゴニスを投与することができる。アンタゴニス
トは、薬物または薬物結合性ドメインに結合して、薬物の融合蛋白質（１つまた
は複数）との相互作用を阻害し、従って下流の生物学的事象を阻害する化合物で
ある。アンタゴニストには、薬物のアナログまたはホモログ、あるいは融合蛋白
質に関して一価である成分が含まれる。そのような化合物は、融合蛋白質に結合
するが、シグナル伝達の活性化に必要とされる融合蛋白質のクラスター化を支援
しない。従って、反応が好ましくない場合または治療効果を停止させることが望
ましい場合には、アンタゴニストを、任意の都合のよい方法で、特に血管内に、
あるいは迅速な打ち消しが所望される場合には吸入／噴霧化によって投与するこ
とができる。
【０２３０】 （組成物） 本発明において使用される薬物（すなわち、リガンド）は、遊離の形態で存在
することができ、あるいは適する場合には塩の形態で存在することができる。広
範囲の様々な薬学的に受容可能な塩の調製が当業者には十分に知られている。様
々な化合物の薬学的に受容可能な塩には、例えば、無機または有機の酸または塩
基から形成されるそのような化合物の従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩
が含まれる。
【０２３１】 薬物は、水和物または溶媒和物を形成することができる。荷電を有する化合物
は、水とともに凍結乾燥された場合には水和種を形成し、あるいは適切な有機溶
媒との溶液中で濃縮された場合には溶媒和種を形成することが当業者に知られて
いる。
【０２３２】 薬物はまた、治療（または予防）有効量の薬物、および薬学的に受容可能なキ
ャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物として投与することができる。キャリア
には、例えば、生理食塩水、緩衝化された生理食塩水、デキストロース、水、グ
リセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。これらは下記に詳し
く記載されている。組成物はまた、所望する場合には、微量の湿潤化剤または乳
化剤あるいはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。組成物は、液体溶液、懸濁
物、エマルション、錠剤、ピル、カプセル、持続放出配合物または粉末であり得
る。組成物は、トリグリセリドなどの従来のバインダーおよびキャリアを用いて
坐薬として配合することができる。経口用の配合物は、薬学規格のマンニトール
、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、
セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なキャリアを含むことができる。配
合は、所望する調製物に適する成分の混合、造粒化および圧縮または溶解を含む
ことができる。
【０２３３】 用いられる薬学的キャリアは、例えば、固体または液体であり得る。
【０２３４】 例示的な固体キャリアには、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチ
ン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリ
ン酸などが含まれる。固体キャリアはまた、風味剤、滑剤、溶解剤、懸濁剤、フ
ィラー、グリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）、圧縮補助剤、バインダーまたは錠剤崩
壊剤として作用し得る１つまたは複数の物質を含むことができる。固体キャリア
はまた、カプセル化物質であり得る。粉末の場合、キャリアは、細かく粉砕され
た活性成分と混合されている細かく粉砕された固体である。錠剤の場合、活性成
分は、適切な割合で必要な圧縮性能を有するキャリアと混合され、そして所望の
形状および大きさで圧縮される。粉末および錠剤は、好ましくは、９９％までの
活性成分を含有する。好適な固体キャリアには、例えば、リン酸カルシウム、ス
テアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、
ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が含まれる
。
【０２３５】 例示的な液体キャリアには、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、
水など含まれる。液体キャリアは、溶液、懸濁物、エマルション、シロップ、エ
リキシル剤、および加圧組成物を調製するときに使用される。活性成分は、水、
有機溶媒、両者の混合物、あるいは薬学的に受容可能なオイルまたは脂肪などの
薬学的に受容可能な液体キャリアに溶解または懸濁することができる。液体キャ
リアは、溶解剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、風味剤、懸濁剤、増粘剤、
色素、粘度調節剤、安定化剤または浸透圧調節剤などの他の適切な薬学的な添加
物を含有することができる。経口投与および非経口投与に好適な液体キャリアの
例には、水（上記の添加物、例えば、セルロース誘導体を部分的に含有する水、
好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（モノア
ルコールおよび多価アルコール（例えば、グリセロール類）を含む）およびその
誘導体、ならびにオイル（例えば、分画化したココナッツオイルおよびピーナッ
ツオイル）が含まれる。非経口投与の場合、キャリアはまた、オレイン酸エチル
およびミリスチン酸イソプロピルなどのオイル状エステルをも含むことができる
。滅菌した液体キャリアは、非経口的に投与される滅菌した液体形態の組成物に
おいて有用である。加圧化された組成物の場合の液体キャリアは、ハロゲン化炭
化水素または他の薬学的に受容可能な噴射剤であり得る。滅菌した溶液または懸
濁物である液体の薬学的組成物は、例えば、筋肉内注射、腹腔内注射または皮下
注射によって利用することができる。滅菌した溶液はまた、血管内に投与するこ
とができる。薬物はまた、液体または固体のいずれかの組成物形態で経口的に投
与することができる。
【０２３６】 キャリアまたは賦形剤は、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジス
テアレートの単独、あるいはワックス、エチルセルロール、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース、メチルメタクリレートなどと一緒になったグリセリルモノス
テアレートまたはグリセリルジステアレートなどのこの分野で十分に知られてい
る時間遅延物質を含むことができる。経口投与のために配合される場合、０．０
１％のツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を含むホサル（ＰＨＯＳＡＬ）ＰＧ−５０（
１，２−プロピレングリコールを含むリン脂質濃縮物、Ａ．Ｎａｔｔｅｒｍａｎ
ｎ＆Ｃiｅ．ＧｍｂＨ）を、本発明の実施時に使用される様々な薬物の経口用配
合物として使用することができる。
【０２３７】 広範囲の薬学的な形態を用いることができる。固体キャリアが使用される場合
、調製物は錠剤化することができ、粉末形態またはペレット形態で、あるいはト
ローチまたは薬用ドロップの形態でハードゼラチンカプセルに入れることができ
る。固体キャリアの量は、広範囲に変化するが、好ましくは約２５ｍｇ〜約１ｇ
である。液体キャリアが使用される場合、調製物は、アンプルまたはバイアルに
入れられたシロップ、エマルション、ソフトゼラチンカプセル、滅菌した注射可
能な溶液または懸濁物の形態、あるいは非水性液体懸濁物の形態である。
【０２３８】 安定な水溶性の投薬形態を得るために、薬物の薬学的に受容可能な塩は、コハ
ク酸またはクエン酸の０．３Ｍ溶液などの有機酸または無機酸の水溶液に溶解す
ることができる。あるいは、酸性誘導体を、適切な塩基性溶液に溶解することが
できる。可溶性塩の形態を得ることができない場合、化合物は適切な共溶媒また
はその組合せに溶解される。適切な共溶媒またはその組合せに溶解されるそのよ
うな適切な例。そのような適切な共溶媒の例には、濃度が全容量の０〜６０％の
範囲にあるアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００
、ポリソルベート８０、グリセリン、ポリオキシエチル化脂肪酸、脂肪アルコー
ルまたはグリセリンヒドロキシ脂肪酸のエステルなどが含まれるが、これらに限
定されない。
【０２３９】 様々な送達システムが知られており、これらを使用して、薬物またはその様々
な配合物（錠剤、カプセル、注射可能な溶液、リポソームでのカプセル化、マイ
クロ粒子、マイクロカプセルなどを含む）を投与することができる。患者への好
ましい投与経路は、経口、舌下および頬である。導入方法はまた、皮膚的経路、
皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、肺経
路、硬膜的経路、眼経路、および（通常は好ましい）経口経路を含むことができ
るが、これらに限定されない。薬物は、任意の都合のよい経路、またはそうでな
ければ、適切な経路によって、例えば、輸液またはボーラス注射によって、上皮
または粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を経由する吸収
によって投与することができ、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与すること
ができる。投与は、全身的または局所的であり得る。エキスビボ適用の場合、薬
物は、液体溶液として細胞組成物に送達することができる。
【０２４０】 特定の実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組
成物として日常的な手順に従って配合される。典型的には、静脈内投与用の組成
物は、滅菌した等張性の水性緩衝液での溶液である。必要な場合、組成物はまた
、可溶化剤および注射部での痛みを和らげるための局所麻酔剤を含むことができ
る。一般に、成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋などの密
封容器に入れられた凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別個に供給
されるか、あるいは単位投薬形態で一緒に混合される。組成物が輸液によって投
与され得る場合、組成物は、滅菌した薬学規格の水または生理食塩水を含有する
輸液ビンを用いて調合することができる。組成物が注射によって投与される場合
、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが、投与前に成分を混合できるよ
うに提供され得る。
【０２４１】 さらに、特定の状況において、組成物は、皮膚の表面、皮内または皮下に置か
れたデバイスの内部に配置することができる。そのようなデバイスには、受動的
または能動的な放出機構のいずれかによって、皮膚に化合物を放出するパッチ、
インプラントおよび注射物が含まれる。
【０２４２】 様々な配合物を製造するための物質および方法がこの分野では十分に知られて
おり、これらは本発明を実施するために適応させることができる。例えば、米国
特許第５，１８２，２９３号および同第４，８３７，３１１号（錠剤、カプセル
および他の経口用配合物ならびに静脈内用配合物）、ならびに欧州特許出願公開
第０ ６４９ ６５９号（１９９５年４月２６日公開；静脈内投与用のラパマイ
シン配合物）および同第０ ６４８ ４９４号（１９９５年４月１９日公開；経
口投与用のラパマイシン配合物）を参照のこと。
【０２４３】 薬物の効果的な用量は、典型的には、哺乳動物体重１ｋｇあたり、約０．０１
ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲であり、好ましくは約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲で
あり、これらは単回または多数回の用量で投与される。一般に、化合物は、その
ような処置を必要とする患者に、約１ｍｇ／患者〜約２０００ｍｇ／患者の日用
量の範囲で投与することができる。化合物が、ラパマイシンまたはいくらかの免
疫抑制作用が残留するそのアナログである実施形態では、投与用量は、過剰な免
疫抑制作用を伴う用量よりも少ないことが好ましい。
【０２４４】 特定の疾患または症状の処置または予防において効果的な所与薬物の量は、部
分的には、その疾患または状態の重篤度に依存し、そして標準的な診断技術によ
って決定することができる。さらに、インビトロまたはインビボでのアッセイを
必要に応じて用いて、最適な投薬範囲を確定させることを助けることができる。
効果的な用量は、インビトロまたは動物モデルでの試験系から得られた用量応答
曲線から推定することができる。正確な投薬レベルは、担当医師または他の診療
提供者によって決定され得るが、よく知られている要因に依存する。そのような
要因には、投与経路ならびに個体の年齢、体重、性別および全身的な健康状態；
疾患の種類、重篤度および臨床的段階；付随する治療の有無；および患者におけ
る細胞の遺伝子操作の種類および程度が含まれる。
【０２４５】 薬物はまた、薬学的組成物の１つまたは複数の成分で満たされた１つまたは複
数の容器を含む薬学的なパックまたはキットで提供され得る。必要に応じて、そ
のような容器（１つまたは複数）には、薬学的製剤または生物学的製剤の製造、
使用または販売を規制する政府当局によって規定された形式の通知が伴い得る。
そのような通知は、ヒト投与に関する製造、使用または販売の当局による承認を
反映する。
【０２４６】 本明細書において引用される、科学文献、発行された特許および公開された特
許出願からの参照を含むすべての参考文献の内容はすべて、それにより参考とし
て明示的に援用される。
【０２４７】 下記の実施例は、本発明の様々な実施形態およびその均等物において本発明の
実施に適応させることができる重要なさらなる情報、例示および指針を含む。実
施例は、例示として提供され、そしていかなる点においても限定として解釈して
はならない。本明細書を通して記載されているように、本発明は、広範囲に適用
することができ、そして実施者によって広範囲な考案の選択を可能にする。
【０２４８】 本発明の実施には、別途示されていない限り、当業者の範囲に含まれる細胞生
物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤ
ＮＡ、免疫学、ウイルス学、薬理学、化学、および薬学的な配合および投与の従
来技術が用いられる。そのような技術は文献において十分に説明されている。例
えば、下記を参照のこと。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈおよ
びＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第Ｉ巻および第Ｉ
Ｉ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；米国特許第４，６８
３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ他）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａ
ｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，
Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚ
ｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８
４）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒお
よびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第
１５４巻および第１５５巻（Ｗｕ他編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（
ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏ
ｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍ
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F. Science 277,1310 - 1313. （実施例） 実施例１：集束化された活性化ドメインをコードするプラスミドの構築： 転写因子融合蛋白質を、ｐＣＧＮＮ（Ａｔｔａｒ、Ｒ．Ｍ．＆Ｇｉｌｍａｎ、
Ｍ．Ｚ．（１９９２）ｃ−ｆｏｓ血清応答エレメントに結合する新規なジンクフ
ィンガー蛋白質の発現クローニング、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２、２４
３２〜２４４３）から発現した。ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＣ
ＧＮＮにクローニングされたインサートをヒトＣＭＶのエンハンサーおよびプロ
モーターの制御下で転写して、アミノ末端エピトープ標識（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ赤血球凝集素遺伝子の１６アミノ酸部分）および
ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在化配列とともに発現する。転写因子のそれぞれの
成分を、ポリメラーゼ連鎖反応によって、最初のコドンのすぐ上流でのＸｂａＩ
部位、およびＳｐｅＩ部位、読み枠があった停止コドン、ならびに最後のコドン
のすぐ下流でのＢａｍＨＩ部位を含有するフラグメントとして合成した。多数の
成分を含む融合蛋白質を、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＳｐｅＩ／Ｂａ
ｍＨＩで開環したベクターに段階的に挿入することによって組み立てた。使用し
たそれぞれの成分およびその略号は次の通りである： Ｇ＝酵母Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン、アミノ酸１〜９４ Ｆ＝ヒトＦＫＢＰ１２、アミノ酸１〜１０７ Ｒ＝ヒトＦＲＡＰのＦＲＢドメイン、アミノ酸２０２５〜２１１３ Ｓ＝ヒトＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニット由来の活性化ドメイン、アミノ酸３６
１〜５５０ Ｖ＝ヘルペスウイルスＶＰ１６由来の活性化ドメイン、アミノ酸４１０〜４９４
Ｌ＝Ｅ．ｃｏｌｉラクトースリプレッサー、アミノ酸４６〜３６０ ＭＴ＝Ｅ．ｃｏｌｉラクトースリプレッサーの最小四量化ドメイン、アミノ酸３
２４〜３６０ 例えば、ｐＣＧＮＮ−ＧＦ２を、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインをｐＣＧＮＮに
挿入して、ｐＣＧＮＮ−Ｇを作製し、その後、２個のＦＫＢＰドメインを続けて
挿入することによって作製した。ｐＣＧＮＮ−Ｌを、ラクトースリプレッサーの
コード配列（アミノ酸４６〜３６０）を含むＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ消化のＰＣＲ
フラグメントをｐＣＧＮＮベクターに挿入して作製した。ｐＣＧＮＮ−ＬＳを、
ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＣＧＮＮ−Ｌ発現プラスミドにｐ６５活
性化ドメイン（アミノ酸３６１〜５５０）を挿入することによって作製した。ｐ
ＣＧＮＮ−ＧＡＬ４ＣＢを、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＣＧＮＮ−
ＧＡＬ４発現プラスミドに、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化したｃ−ＣＢＬ配
列のフラグメントを挿入することによって作製した。ｐＣＧＮＮ−ＭＡを、Ｘｂ
ａＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＣＧＮＮに、ＳＨ３ドメインのコード配列を含有
するＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによる消化フラグメントを挿入することによって
作製した。ｐＣＧＮＮ−ＭＡＳおよびｐＣＧＮＮ−ＭＡＭＴＳを、ＳｐｅＩ／Ｂ
ａｍＨＩ消化のｐＣＧＮＮ−ＭＡベクターに、Ｓ（ｐ６５活性化ドメイン）およ
びＭＴＳ（ｐ６５活性化ドメインに融合させた最小四量化ドメイン）をそれぞれ
挿入することによって作製した。５ｘＧＡＬ４−ＩＬ２−ＳＥＡＰは、ＳＥＡＰ
遺伝子（Ｊ．ＭｏｒｇｅｎｓｔｅｍおよびＳ．Ｈｏの寄贈物）を発現させる最小
ＩＬ２プロモーターの上流に５個のＧＡＬ４部位を含有する。レトロウイルスベ
クターｐＬＨ−５ｘＧａｌ４−ＩＬ２−ＳＥＡＰを、上記の５ｘＧＡＬ４−ＩＬ
２−ＳＥＡＰフラグメントをベクターｐＬＨ（Ｒｉｖｅｒａ他、１９９６、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：１０２８〜１０３２；Ｎａｔｅｓａｎ他、Ｎ
ａｔｕｒｅ、１９９７年１１月２７日、３９０：６６５８ ３４９〜５０）にク
ローニングすることによって構築した。ｐＬＨは、モロニーマウス白血病ウイル
ス長末端反復によって駆動されるヒグロマイシンＢ耐性遺伝子をも含有する。
【０２５０】 実施例２：安定な細胞株の作製： 安定的に組み込まれたｐＬＨ−５ｘＧＡＬ４−ＩＬ２−ＳＥＡＰレポーターを
含有する細胞を作製するために、記載（Ｒｉｖｅｒａ他、１９９６；Ｎａｔｅｓ
ａｎ他、１９９７）に従って作製した無ヘルパーレトロウイルスを使用して、Ｈ
Ｔ１０８０細胞に感染させた。数百のヒグロマイシンＢ（３００ｍｇ／ｍｌ）耐
性クローンを集めた（ＨＴ１０８０Ｂプール）。個々のクローンをｐＣＧ−ＧＳ
による一過性トランスフェクションによってスクリーニングした。最も大きな応
答性のクローンＨＴ１０８０Ｂをさらなる分析のために選択した。
【０２５１】 実施例３：一過性トランスフェクション： ＨＴ１０８０細胞を、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸類およびペニシリ
ン−ストレプトマイシンを含有するＭＥＭ培地において３７℃で増殖させた。ト
ランスフェクションの２４時間前に、約２ｘ１０５個の細胞を１２ウエルプレー
トの各ウエルに播種した。細胞を、リポフェクタミンを指示（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）に従って使用してトランスフェクションした。各ウエルの細胞に、図に示さ
れている量のプラスミドを、４００ｎｇのレポータープラスミドの存在下または
非存在下で、ＤＮＡの総量をｐＵＣ１９で１．２５ｕｇに調節して与えた。図１
４〜１６に示されている実験の場合、ＤＮＡ結合ドメイン融合物を発現する１０
ｎｇのプラスミド、およびｐ６５活性化ドメイン融合物を発現する増大量のプラ
スミドが含まれた。トランスフェクションの５時間後に培地を除き、そして１ｍ
ｌの新鮮な培地を加えた。１８〜２４時間後、１００ｕｌの培地を除き、そして
ＳＥＡＰ活性について、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を３５０ｎｍの励起および４５０ｎｍの放出で使
用してアッセイした。示されている場合、指示（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃ）に従って２ｕｌ〜５ｕｌの培地をｈＧＨ蛋白質についてもアッセイし
た。
【０２５２】 実施例４：集束化された活性化ドメインのＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインへの送
達： 調節された遺伝子発現のために使用される基本的なシステム（図１）は、２つ
の融合蛋白質を含む：１コピーのＦＫＢＰ１２に融合したＤＮＡ結合ドメイン（
ＧＡＬ４など）を含む融合蛋白質、およびＦＲＡＰのＦＲＢドメインに融合した
転写活性化ドメイン（ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットなどに由来）を含む融合
蛋白質（例えば、Ｒｉｖｅｒａ他を参照のこと）。ＦＫＢＰドメインおよびＦＲ
Ｂドメインとの大きな親和性複合体を形成する天然産物のラパマイシンが存在す
るとき、ＦＲＢ−ｐ６５の融合蛋白質は、ＧＡＬ４−ＦＫＢＰの融合蛋白質に効
率よく集まる。この基本的なシステムによって、１個のＤＮＡ結合ドメインモノ
マーあたり、最大で１個のｐ６５活性化ドメインの送達が得られる（図１）。こ
のシステムにおいて、プロモーターに送達される活性化ドメインの数は、多数の
ＦＫＢＰ部分をＧＡＬ４に融合することによって増大させることができる。これ
により、各ＤＮＡ結合ドメインは多数のＦＲＢ−ｐ６５活性化ドメイン融合物を
呼び寄せることができる（図２）。活性化ドメインを含有する融合蛋白質はこの
システムでは別々に発現されるので、活性化ドメイン融合蛋白質を集束化し、そ
してＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに連結されたＦＫＢＰ部分にそれらを送達する
ことができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉラクトースリプレッサーに存在する四量化
ドメインをＦＲＢドメインおよび活性化ドメインの間に加えることによって、４
個の活性化ドメインおよびＦＲＢドメインからなる融合蛋白質「集束体（ｂｕｎ
ｄｌｅ」を作製することができるはずである。これは、「二量体化物」が存在す
るときに各ＦＫＢＰ部分に送達することができる（図３）。図４に示されている
形態において、ラパマイシンは、集束化された活性化ドメイン融合蛋白質の四量
体複合体がＧａｌ４−４ｘＦＫＢＰ融合蛋白質の各ＦＫＢＰに集積することを媒
介し、それによって、１６個までのｐ６５活性化ドメインを１個のＧＡｌ４モノ
マーに集めることができる。同様に集束化に基づくアロステリック型システムで
の類似する改善を図５〜図８に示す。
【０２５３】 実施例５：転写活性化はプロモーターに結合した活性化ドメインの数に比例す
る。
【０２５４】 集束化された活性化ドメイン融合蛋白質が本システムにおいてどのように機能
するかを調べるために、本発明者らは、ＨＴ１０８０Ｂ細胞を、様々な転写因子
融合蛋白質を発現するプラスミドでトランスフェクションし、そして活性化ドメ
インをプロモーターに送達させるために１０ｎＭのラパマイシンで細胞を処理し
た。本発明者らは、わずかに１個のＲＳ融合蛋白質またはＲＬＳ融合蛋白質が各
ＧＡＬ４モノマーに送達された場合（ＧＦ１＋ＲＳおよびＧＦ１＋ＲＬＳ）、集
束化された活性化ドメイン融合蛋白質は、集束化されていない活性化ドメイン融
合蛋白質と比較して、レポーター遺伝子を強く誘導することを認めた。この発見
により、集束化された活性化ドメイン融合蛋白質は、より多くの活性化ドメイン
をプロモーターに送達するその能力のために、転写の非常に強力な誘導因子とし
て機能することが示唆される。さらに、ＤＮＡ結合性融合蛋白質および活性化ド
メイン融合蛋白質の様々な組合せを使用した本発明者らの研究によって、レポー
ター遺伝子の発現レベルが、そのプロモーターに結合した１個のＧＡＬ４モノマ
ーに送達され得る活性化ドメインの数とほぼ比例することが明らかにされた（図
９）。
【０２５５】 ＲＬＳ融合蛋白質は、ｐ６５活性化ドメインを、集束化されていないその対応
物ＲＳよりも４倍多くプロモーターに送達することができる。理論的には、４個
の縦一列に繰り返されるｐ６５活性化ドメインを含有するＦＲＢ融合蛋白質（Ｒ
Ｓ４）は、ＲＬＳと同じ数の活性化ドメインをプロモーターに送達するはずであ
り、従って、同じような転写能力を有するはずである。ラパマイシンで調節され
る遺伝子発現システムにおいてＲＳ４がＲＬＳと類似するように機能し得るかど
うかを調べるために、本発明者らは、ＲＳ４融合蛋白質またはＲＬＳ融合蛋白質
と一緒にＤＮＡ結合レセプターＧＦ１をコードする発現プラスミドをＨＴ１０８
０Ｂ細胞にトランスフェクションし、そして１０ｎＭのラパマイシンを培地に加
えることによって、組み込まれたレポーター遺伝子の発現を分析した。本発明者
らは、ラパマイシンは、ＧＦ１およびＲＬＳを発現する細胞でレポーター遺伝子
を強く誘導したが、ＧＦ１およびＲＳ４の組合せの融合蛋白質を誘導しなかった
ことを見出した。このことは、繰り返されたｐ６５活性化ドメインは、二量体化
体システムにおける転写の弱い誘導因子であることを示す（図１０）。対照的に
、ラパマイシンは、ＧＦ１／ＲＬＳの組合せの蛋白質よりも非常に低いレベルに
も関わらず、ＧＦ３およびＲＳ４の組合せの融合蛋白質が存在するときにレポー
ター遺伝子の発現を誘導することができた。特定の理論に限定されないが、ＧＦ
３融合蛋白質は、活性化ドメインを、ＧＦ１よりも３倍多くプロモーターに集め
るはずである。ＧＦ３に結びつけられた場合に、ＧＦ１と比較して、ＲＳ４融合
蛋白質が転写活性化を非常により強く誘導し得るという事実は、活性化ドメイン
融合蛋白質の濃度が非常に低い場合には、より多くの活性化ドメインが、ＧＡＬ
４ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦＫＢＰ部分の数の増大によってプロモーター
に集まり得ることを示唆している。トランスフェクションされた蛋白質の細胞内
レベルのウエスタンブロット分析によって、細胞内のＲＳ４の量は検出レベルよ
りも低いことが明らかにされた。これにより、ＲＳ４は転写の良好な誘導因子と
して作用しない原因を説明することができる。これらの結果は、繰り返しとは異
なり、集束化法により、細胞に対してあまり毒性でない非常に強力な活性化ドメ
インが得られることを強く示唆している。
【０２５６】 ＲＬＳ融合蛋白質による遺伝子発現の強力な誘導の一部またはすべてに関する
１つの可能な説明は、ＲＬＳ集束体における４個のＦＲＢ部分が非常に接近して
いることによって親和力作用が誘導されるということである。これを調べるため
に、本発明者らは、図１１に示される方法を考案した。理論的には、大過剰のＬ
Ｓ融合蛋白質が存在するときに限られた量のＲＬＳを同時に発現することによっ
て、多くても１個のＦＲＢドメインを含有するＲＬＳ集束体の形成が促進される
はずである。レポーター遺伝子の発現に対して、ＲＬＳ集束体におけるＦＲＢド
メインの数を減少させた結果を調べるために、本発明者らは、ＨＴ１０８０Ｂ細
胞を関連する発現プラスミドで同時トランスフェクションし、そして１０ｎＭの
ラパマイシンが培地に存在するときのＧＡＬ４応答性遺伝子の発現を分析した。
以前に観測されたように（図９を参照のこと）、ラパマイシンは、ＧＦ１融合蛋
白質およびＲＳ融合蛋白質を発現する細胞で低レベルのレポーター遺伝子の発現
を誘導するだけであった。しかし、レポーター遺伝子の発現は、ＧＦ１融合蛋白
質およびＲＬＳ融合蛋白質を発現する細胞では非常に強力であった（図１２）。
驚くべきことに、ＧＦ１、限られた量のＲＬＳおよび大過剰のＬＳ融合蛋白質を
発現する細胞で、ラパマイシンは、ＧＦ１およびＲＬＳによって達成されるレベ
ルよりもさらに大きなレベルにまでレポーター遺伝子の発現を誘導した（図１２
）。これは、ＲＬＳ融合蛋白質による遺伝子発現の強力な刺激は、集束体におけ
る多数のＦＲＢドメインの存在に依存しないことを示唆している。実際、今回示
された結果は、ＲＬＳ融合蛋白質に多数のＦＲＢドメインが存在することによっ
て、実際には、遺伝子発現を可能な最大レベルにまで活性化するその能力が減少
することを明らかにしている。ラパマイシンは、ＲＬＳにおける多数のＦＲＢド
メインを、プロモーターに結合した２個以上のＧＡＬ４−ＦＫＢＰモノマーと接
触させて、送達される活性化ドメインの数を効果的に減少させることができるよ
うである。しかし、１個のＦＲＢドメインとのＲＬＳ集束体は１個のＧＡＬ４−
ＦＫＢＰモノマーのみと接触することができ、従って、非常に多くの活性化ドメ
インをプロモータ−を集めることができ、これにより標的遺伝子の発現のわずか
な増大が得られる。
【０２５７】 ＲＬＳ融合蛋白質における活性化ドメインの数を減少させたときの結果を評価
するために、本発明者らは、ＲＬＳに対して過剰量のラクトースリプレッサー領
域（Ｌ、アミノ酸４６〜３４０）を、ＤＮＡ結合性蛋白質ＧＦ１と一緒に発現し
、そして１０ｎＭのラパマイシンを培地に加えることによって、レポーター遺伝
子の発現を誘導した。この場合、形成された四量体集束体は、最大で１個の活性
化ドメインおよび１個のＦＲＢドメインを含有するはずである。ＲＬＳ集束体に
おけるＦＲＢドメインの数を減少させることによってレポーター遺伝子の発現が
増大したので、ＲＬＳに対してＬ領域が過剰に存在するときのレポーター遺伝子
発現の何らかの阻害は、プロモーターに集まった活性化ドメインの数が減少した
ためであり得る。図１２の結果は、ラクトースリプレッサーの過剰な一部が、Ｇ
Ｆ１融合蛋白質およびＲＬＳ融合蛋白質を発現する細胞において、ラパマイシン
により誘導されるレポーター遺伝子の発現を阻害していることを示す。トランス
フェクション細胞における組換え蛋白質のウエスタンブロット分析によって、ト
ランスフェクションで使用したプラスミド量と蛋白質の対応する発現レベルとの
良好な相関が明らかにされる。まとめると、これらの結果は、ＲＬＳ融合蛋白質
は、主として、プロモーターを著しくより多くの活性化ドメインを送達するその
能力のために、転写の強力な誘導因子として機能することを示唆している。
【０２５８】 実施例６：最小四量化ドメインの使用および活性化ドメインの相乗作用による
転写の活性化 記載される実験では、ラクトースリプレッサー（そのＤＮＡ結合ドメインを除
く）を、ＦＲＢドメインおよび活性化ドメインをも含有する融合蛋白質における
集束化ドメインとして使用した。四量化ドメインに加えて、ラクトースリプレッ
サーのこの部分は、ラクトース結合ドメインおよび隣接リンカー領域を含有する
。ラクトースリプレッサーの四量化ドメインは単独で融合蛋白質の集束化に十分
であるかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ＲＬＳ融合蛋白質におけ
るラクトースリプレッサーのコード配列（アミノ酸４６〜３６０）が、四量化ド
メインを含有するアミノ酸３２４〜アミノ酸３６０の３６アミノ酸領域および上
流リンカー領域（ＭＴ）の一部により置換された発現ベクターＲＭＴＳを作製し
た。本発明者らは、ｐ６５活性化ドメインおよびＶＰ１６活性化ドメインの組合
せが、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合されたときに、ＧＡｌ応答性遺伝子を
相乗的に誘導することを見出した。それらが、最小ラクトースリプレッサーの最
小四量化ドメインを使用して一緒に集束化されたときに同様な挙動を取るかどう
かを調べるために、本発明者らは、ＶＰ１６活性化ドメイン（アミノ酸４１９〜
４９０）をそれぞれＲＭＴＳまたはＲＭＴに融合したＲＭＴＳＶおよびＲＭＴＶ
の２つのプラスミドをさらに作製した。次いで、本発明者らは、融合蛋白質の適
切な組合せ（図１３）を発現するプラスミドを、安定的に組み込まれたＧＡＬ４
応答性レポーター遺伝子を有するＨＴ１０８０Ｂ細胞に同時トランスフェクショ
ンし、そして細胞をラパマイシンで処理して、標的遺伝子の発現を刺激した。本
発明者らは、ＧＦ４／ＲＭＴＳＶおよびＧＦ４／ＲＭＴＳの組合せの融合蛋白質
を発現する細胞で、ラパマイシンは、レポーター遺伝子の発現を、ＧＦ４／ＲＳ
の組合せの融合蛋白質よりも約６倍および３倍多く誘導することを見出した。Ｇ
Ｆ４／ＲＭＴＶまたはＧＦ４／ＲＳＶの組合せの融合蛋白質を発現する細胞では
、ラパマイシンは、レポーター遺伝子を、ＧＦ４／ＲＳ融合蛋白質によって誘導
されるレベルよりもわずかに多く誘導しただけであった（図１３）。ＧＦ４／Ｒ
ＭＴＶおよびＧＦ４／ＲＭＴＳＶによるレポーター遺伝子発現の誘導倍数は、Ｇ
Ｆ４／ＲＬＳおよびＧＦ４／ＲＬＳＶよりもわずかに低く、それぞれ、４倍およ
び８倍と比較して３倍および６倍（図９を参照のこと）であった。ラクトースリ
プレッサーの最小四量化ドメインを含有する活性化ドメイン融合蛋白質による遺
伝子発現の強力な刺激は、最小四量化ドメインが融合蛋白質の集束化に十分であ
ることを示唆している。
【０２５９】 実施例７：集束化は最大レベルの遺伝子発現を誘導するのに必要な活性化因子
の最小数を下げる： ｐ６５活性化ドメインを含有する集束化された融合蛋白質によって誘導される
遺伝子発現の強力な刺激が、単に、より多くの活性化ドメインをプロモーターに
送達するその能力によるものであるならば、活性化ドメインを含有する融合蛋白
質は、集束化した場合、集束化されていない活性化ドメインと比較して、レポー
ター遺伝子の発現を強く刺激するには、より低いレベルで十分であるはずである
。二量体化システムでは、形成された再構成活性化因子の数は、活性化ドメイン
融合蛋白質の量を調節することによって、あるいは培地に加えられたラパマイシ
ンの量を変えることのいずれかによって制御することができる。本発明者らは、
活性化ドメインの集束化によって、レポーター遺伝子の強力な発現に必要とされ
る活性化因子の最小量が低下するかどうかという疑問を検討するためにこれらの
相補的な方法の両方を用いた。最初の方法において、様々な量の集束化された活
性化ドメイン（ＲＭＴＳおよびＲＭＴＳＶ）または集束化されていないそれらの
対応物（ＲＳ）の発現を、ＨＴ１０８０Ｂ細胞で、ＤＮＡ結合性レセプターのＧ
Ｆ４の量を固定して行った（図１４）。活性化因子を、１０ｎＭのラパマイシン
を培地に加えることによって再構成した。トランスフェクションされた細胞で発
現する再構成された蛋白質レベルをウエスタンブロット分析によって測定した（
図１５）。発現した活性化ドメインのレベルが最も低い場合、ラパマイシンは、
ＧＦ４＋ＲＳの組合せの融合蛋白質を発現する細胞で、レポーター遺伝子の転写
を誘導しなかった。しかし、本発明者らは、ＧＦ４＋ＲＭＴＳまたはＲＭＴＳＶ
の組合せの融合蛋白質を含有する細胞で、レポーター遺伝子発現の強力な活性化
を認めた。活性化ドメイン融合蛋白質が高レベルで存在する場合、ラパマイシン
は、レポーター遺伝子の発現を、ＧＦ４＋ＲＳ融合蛋白質と比較して、ＧＦ４＋
ＲＭＴＳＶおよびＧＦ４＋ＲＭＴＳの組合せの融合蛋白質をそれぞれ含有する細
胞で、約４倍および２倍の高いレベルに誘導した。実際、最も低いレベルのＲＭ
ＴＳＶによって誘導されるレポーター遺伝子の発現レベルは、細胞内の最大量の
ＲＳ融合蛋白質によって刺激されるレベルを超えた（図１４）。これらの結果は
、レポーター遺伝子の発現の最大レベルは、集束化された活性化ドメインを含有
する再構成された活性化因子によって、その集束化されていない対応物の場合よ
りも少ない量で達成され得ることを示唆している。
【０２６０】 第２の相補的な方法において、本発明者らは、ＨＴ１０８０Ｂ細胞を、図１５
で使用した発現プラスミドの一定量でトランスフェクションし、そして様々な量
のラパマイシンを培地に加えることによって活性化因子の再構成を誘導した。Ｇ
Ｆ４ＤＮＡ結合性レセプターが存在する場合、ＲＭＴＳＶ融合蛋白質およびＲＭ
ＴＳ融合蛋白質はともに、培地中のラパマイシンが１ｎＭのときにレポーター遺
伝子の発現を強く誘導した。培地中のラパマイシンがこの濃度のとき、ＧＦ４＋
ＲＳの組合せの融合蛋白質は、バックグラウンドレベルを大きく上回るレポータ
ー遺伝子を誘導しなかった。すべての場合において、本発明者らは、ラパマイシ
ンが培地に１０ｎＭで存在するときにレポーター遺伝子の最高レベルの発現を認
めた（図１５）。まとめると、多数の集束化された活性化ドメインを含有する活
性化因子は、その数が比較的少ないときでも、遺伝子発現を強く誘導するのに十
分であるという発見は、最大レベルの遺伝子発現に必要とされる活性化因子の最
少量を、活性化因子の能力を増大させることによって著しく低下させることがで
きることを示唆している。
【０２６１】 実施例８：ニハイブリッドシステムにおける活性化ドメイン融合蛋白質の集束
化はその感度を高める： 標的遺伝子の強力な発現が、集束化していない活性化ドメイン融合蛋白質では
なく、集束化した活性化ドメイン融合蛋白質を含有する再構成された活性化因子
が比較的少量存在するときに達成できるという発見は、ニハイブリッドシステム
において重要な意味を有する。ニハイブリッドシステムは、インビボで蛋白質−
蛋白質の相互作用を検出するための非常に高感度なアッセイであるが、多数の因
子によって、細胞で発現される２つのハイブリッド蛋白質間の相互作用が消去さ
れ得る。ニハイブリッドシステムにより頻繁に直面する問題の１つは、真核生物
細胞は、非常に保存されたその生化学的な調節経路のために、多くの場合、高レ
ベルのハイブリッド蛋白質、特に、ＶＰ１６活性化ドメインを含有するハイブリ
ッド蛋白質に対して良好な耐性を示さず、その結果、このような細胞での融合蛋
白質の発現が非常に悪く、あるいは場合によっては細胞死をもたらすことである
。このアッセイの成功は、相互に見出される２つのハイブリッド蛋白質に依存し
ているので、ハイブリッド蛋白質、好ましくは、活性化ドメインを含有する融合
蛋白質の一方または両方は、２つのハイブリッド蛋白質との間の相互作用を促進
させるために比較的多くの量が存在することが必要不可欠である。
【０２６２】 集束化された活性化ドメイン融合蛋白質を使用することによって、哺乳動物の
ニハイブリッドアッセイにおいて以前には検出できなかった蛋白質−蛋白質の相
互作用を検出することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、２つの
蛋白質、すなわち、プロトオンコジーンのＣ−Ｃｂ１とＣ−ＳｒｃＳＨ３との相
互作用を調べることを選択した。プロリンが多いＣ−Ｃｂ１プロトオンコジーン
のドメインは、インビトロアッセイおよび酵母のニハイブリッドアッセイの両方
で多数のシグナル伝達蛋白質のＳＨ３ドメインに結合することが明らかにされて
いる。しかし、哺乳動物のニハイブリッド実験では、ＧＡＬ４−ＣＢＬおよびＳ
ｒｃＳＨ３−ＶＰ１６のハイブリッド蛋白質は、安定的に組み込まれたレポータ
ー遺伝子の発現を誘導しなかった。「集束化された」ＳｒｃＳＨ３−活性化ドメ
イン融合蛋白質をＧＡＬ４−ＣＢＬと一緒に発現することによって、ＧＡＬ４応
答性遺伝子が刺激されるかどうかを調べるために、本発明者らは、図１６および
図１７に概略される融合蛋白質の発現に必要な適切なプラスミドを作製し、そし
て一過性トランスフェクションによって、発現プラスミドを関連する組合せでＨ
Ｔ１０８０Ｂ細胞に導入した。本発明者らは、ＧＣＢＬ単独、あるいはＳＨ３−
ＶＰ１６またはＳＨ３−ｐ６５の存在下でのＧＣＢＬはいずれも、レポーター遺
伝子の発現を検出可能なレベルに誘導しないことを認めた。しかし、集束化され
た融合蛋白質（ＳＨ３−ＬＶＰ１６またはＳＨ３−Ｌｐ６５）が存在する場合、
ＧＣＢＬはレポーター遺伝子を非常に強く誘導した。これらの結果は、集束化さ
れた活性化ドメイン融合蛋白質の使用によって、ニハイブリッドアッセイの感度
が著しく改善され得ることを示している（図１８）。集束化されていない活性化
ドメイン融合蛋白質は、その細胞内濃度が低いために、レポーター遺伝子の発現
を誘導できないことを検討するために、本発明者らは、トランスフェクションさ
れた細胞から得られた溶解物のウエスタンブロット分析を行った。図１８に示す
代表的なウエスタンブロットは、集束化されていない融合蛋白質（ＳＨ３−ＶＰ
１６およびＳＨ３−ｐ６５）は、実際には、その集束化された対応物（ＳＨ３−
ＬＶＰ１６およびＳＨ３−Ｌｐ６５）よりも多い量で存在していたことが示して
いる（図１８）。このことは、レポーター遺伝子が活性化されないことは、活性
化ドメイン融合蛋白質の全体的な細胞内レベルに関連していないことを示してい
る。しかし、ＧＡＬ４抗体をプローブとした別のウエスタンブロットにおいて、
本発明者らは、Ｇａｌ４−ＣＢＬの存在を検出することができなかった。このこ
とは、この融合蛋白質は細胞にとって毒性であることを示唆している。従って、
本発明者らは、ＤＮＡ結合成分（ＧＣＢＬ）が細胞内に非常に少ない量で存在す
る場合、集束化された活性化ドメイン融合蛋白質のみが、レポーター遺伝子の転
写を活性化するプロモーターに十分な数の活性化ドメインを送達することができ
ると結論する。まとめると、これらの結果は、活性化ドメイン融合蛋白質の集束
化は、哺乳動物のニハイブリッドアッセイにおいて、２つの蛋白質の一方または
両方が細胞内に非常に低いレベルで存在する場合、そのような２つの蛋白質間の
相互作用の検出を非常に高めることができることを強く示唆している。
【０２６３】 均等物 当業者は、本明細書中において説明されている特定の物質および方法に対する
無数の均等物を認識し、あるいは日常的な実験を超えることなく、そのような均
等物を確認することができる。そのような均等物は、本発明の範囲に含まれるも
のとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図２】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図３】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図４】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図５】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図６】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図７】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図８】 活性化ドメインを標的遺伝子のプロモーターに配送するための方策における使
用を示す図
【図９】 プロモーターに補充された活性化ドメイン数と相関関係のある、しっかりと組
込まれたレポーター遺伝子の発現レベルを示す図
【図１０】 プロモーターに補充された活性化ドメイン数と相関関係のある、しっかりと組
込まれたレポーター遺伝子の発現レベルを示す図
【図１１】 細胞で共発現するＬＳまたはＬの濃度を漸増させた、ＲＬＳの蛋白束の組成物
の略図
【図１２】 ラパマイシンの添加後に培地中に分泌されたＳＥＡＰ活性の平均値を示すグラ
フおよびトランスフェクションされた細胞で発現した様々なリコンビナント蛋白
のヘマグルチニンエピトープに対する１２ＣＡ５抗体を使用したウエスタンブロ
ット分析
【図１３】 トランスフェクションの２４時間後にアッセイした、培地中に分泌されたＳＥ
ＡＰ活性の平均値を示すグラフ
【図１４】 ＧＦ４ ２０ｎｇおよび指示された濃度の活性化ドメイン発現プラスミドのＨ
Ｔ１０８０B細胞へのトランスフェクションを示すグラフ
【図１５】 トランスフェクションされた転写因子の相対的発現レベルのウエスタンブロッ
ト分析およびラパマイシンを添加した２４時間に培地中に分泌されたＳＥＡＰ活
性の平均値を示すグラフ
【図１６】 標的ドメインおよび活性化ドメインを含む束化融合蛋白を使用したニハイブリ
ッドアッセイを示す図
【図１７】 標的ドメインおよび活性化ドメインを含む束化融合蛋白を使用したニハイブリ
ッドアッセイを示す図
【図１８】 トランスフェクションの２４時間後に培地中に分泌されたＳＥＡＰ活性の平均
値を示すグラフ
【図１９】 ｐ６５転写活性化ドメインに関する突然変異の列挙
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/50 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ＵＳ９７１５２１９ (32)優先日 平成９年８月27日(1997．8．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／１２６，００９ (32)優先日 平成10年７月29日(1998．7．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ギルマン，マイケル ズィー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02168 ニュートン チェスナット スト リート 550 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA36 FA26 FA29 GC15 4B024 AA11 BA80 CA07 DA02 EA02 FA01 GA11 HA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4C084 AA13 NA10 ZC032 4H045 AA10 BA10 BA41 CA11 CA15 CA40 DA50 EA50 FA72 FA74

Claims (74)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 束化ドメインと、束化ドメインと非相同である少なくとも１
    つの補足的ドメインとを含む、融合蛋白をコードするリコンビナント核酸。
  2. 【請求項２】 束化ドメインがニ量化ドメイン、三量化ドメインまたは四量
    化ドメインであることを特徴とする請求項１記載のリコンビナント核酸。
  3. 【請求項３】 束化ドメインが、ｌａｃレプレッサー四量化ドメイン、ｐ５
    ３四量化ドメインまたはロイシンジッパードメインであるか、またはそれらに由
    来することを特徴とする請求項２記載のリコンビナント核酸。
  4. 【請求項４】 非相同ドメインが転写活性化ドメインであることを特徴とす
    る請求項１〜３のいずれかに記載のリコンビナント核酸。
  5. 【請求項５】 非相同ドメインが転写抑制ドメインであることを特徴とする
    請求項１〜３のいずれかに記載のリコンビナント核酸。
  6. 【請求項６】 非相同ドメインがＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とす
    る請求項１〜３のいずれかに記載のリコンビナント核酸。
  7. 【請求項７】 非相同ドメインがリガンド結合ドメインであることを特徴と
    する請求項１〜３のいずれかに記載のリコンビナント核酸。
  8. 【請求項８】 非相同ドメインがｐ６５、ＶＰ１６またはＡＰドメインであ
    るか、またはそれらに由来することを特徴とする請求項４記載のリコンビナント
    核酸。
  9. 【請求項９】 非相同ドメインがＫＲＡＢドメイン、ｓｓｎ−６／ＴＵＰ−
    １サプレッサードメインまたはＫｒｕｐｐｅｌファミリーサプレッサードメイン
    であるか、またはそれらに由来することを特徴とする請求項５記載のリコンビナ
    ント核酸。
  10. 【請求項１０】 非相同ドメインが、ＧＡＬ４ドメイン、ｌｅｘ Ａドメイ
    ンまたは複合ＤＮＡ結合ドメインであるか、またはそれらに由来することを特徴
    とする請求項６記載のリコンビナント核酸。
  11. 【請求項１１】 非相同ドメインが、イムノフィリンドメイン、サイクロフ
    ィリンドメイン、ＦＲＢドメイン、抗生物質耐性ドメインまたはホルモンレセプ
    タードメインであるか、それらに由来することを特徴とする請求項７記載のリコ
    ンビナント核酸。
  12. 【請求項１２】 非相同ドメインが、ＦＫＢＰ、ｔｅｔＲ、プロゲステロン
    レセプターまたはエクジソンレセプターであるか、それらに由来することを特徴
    とする請求項１１記載のリコンビナント核酸。
  13. 【請求項１３】 融合蛋白が束化ドメイン、少なくとも１つの転写活性化ド
    メインおよび少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含むことを特徴とする請求
    項１、２、３、４、６、８または１０のいずれかに記載のリコンビナント核酸。
  14. 【請求項１４】 融合蛋白が、束化ドメイン、少なくとも１つの転写活性化
    ドメインおよび少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むことを特徴とする
    請求項１、２、３、４、７、８、１１または１２のいずれかに記載のリコンビナ
    ント核酸。
  15. 【請求項１５】 融合蛋白が、束化ドメイン、少なくとも１つの転写抑制ド
    メインおよび少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むことを特徴とする請
    求項１、２、３、５、９、７、１１または１２のいずれかに記載のリコンビナン
    ト核酸。
  16. 【請求項１６】 融合蛋白が、束化ドメイン、少なくとも１つのＤＮＡ結合
    ドメインおよび少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含むことを特徴とする
    請求項１、２、３、６、７、１０、１１または１２のいずれかに記載のリコンビ
    ナント核酸。
  17. 【請求項１７】 束化ドメイン、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイ
    ンおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコードすることを特徴とする請求
    項１、２、３、４、６、７、８、１０、１１または１２のいずれかに記載のリコ
    ンビナント核酸。
  18. 【請求項１８】 融合蛋白が、ｌａｃレプレッサー四量化ドメイン、少なく
    とも１つのＦＲＢドメインおよび少なくとも１つのｐ６５転写活性化ドメインを
    含むことを特徴とする請求項１４記載のリコンビナント核酸。
  19. 【請求項１９】 図１９の突然変異を１つ以上含むｐ６５転写活性化ドメイ
    ンに由来する少なくとも１つのドメインを含むことを特徴とする請求項８、１３
    、１４、１７または１８のいずれかに記載のリコンビナント核酸。
  20. 【請求項２０】 ｐ６５転写活性化ドメインに由来する少なくとも１つのド
    メインおよびそれに非相同である少なくとも１つのドメインを含む融合蛋白をコ
    ードするリコンビナント核酸であって、ｐ６５由来のドメインが図１９の突然変
    異を１つ以上含むリコンビナント核酸。
  21. 【請求項２１】 非相同ドメインがリガンド結合ドメインであることを特徴
    とする請求項２０記載のリコンビナント核酸。
  22. 【請求項２２】 リガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメイン、サイクロフ
    ィリンドメインまたはＦＲＢドメインであるか、またはそれらに由来することを
    特徴とする請求項２１記載のリコンビナント核酸。
  23. 【請求項２３】 リガンド結合ドメインが、ｔｅｔＲドメインであるか、ま
    たはｔｅｔＲドメインに由来することを特徴とする請求項２１記載のリコンビナ
    ント核酸。
  24. 【請求項２４】 リガンド−結合ドメインが、ホルモンレセプタードメイン
    であるか、またはホルモンレセプタードメインに由来することを特徴とする請求
    項２１記載のリコンビナント核酸。
  25. 【請求項２５】 ホルモンレセプタードメインがステロイドレセプタードメ
    インであることを特徴とする請求項２４記載のリコンビナント核酸。
  26. 【請求項２６】 非相同ドメインがＤＮＡ結合ドメインであることを特徴と
    する請求項２０記載のリコンビナント核酸。
  27. 【請求項２７】 ＤＮＡ結合ドメインドメインが、ＧＡＬ４、ｌｅｘ Ａま
    たは複合ＤＮＡ結合ドメインであるか、またはそれらに由来することを特徴とす
    る請求項２６記載のリコンビナント核酸。
  28. 【請求項２８】 請求項１〜２７のいずれかに記載のリコンビナント核酸に
    よりコードされる融合蛋白。
  29. 【請求項２９】 （ａ）束化ドメイン、リガンド結合ドメインおよび転写活
    性化ドメインを含む融合蛋白をコードする第１の核酸と、 （ｂ）結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコード
    する第２の核酸と を含むことを特徴とする核酸組成物。
  30. 【請求項３０】 （ａ）束化ドメイン、リガンド結合ドメインおよびＤＮＡ
    結合ドメインを含む融合蛋白をコードする第１の核酸と、 （ｂ）リガンド結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白
    をコードする第２の核酸と を含むことを特徴とする核酸組成物。
  31. 【請求項３１】 （ａ）束化ドメイン、リガンド結合ドメインおよび転写活
    性化ドメインを含む融合蛋白をコードする第１の核酸と、 （ｂ）ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸と を含むことを特徴とする核酸組成物。
  32. 【請求項３２】 発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子をさらに含
    むことを特徴とする請求項２９〜３１のいずれかに記載の核酸組成物。
  33. 【請求項３３】 （ａ）束化ドメイン、リガンド結合ドメイン、転写活性化
    ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白をコードする第１の核酸と、 （ｂ）発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子を含む第２の核酸
    と、 を含むことを特徴とする核酸組成物。
  34. 【請求項３４】 （ａ）束化ドメイン、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結
    合ドメインを含む融合蛋白をコードする第１の核酸と、 （ｂ）発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子を含む第２の核酸
    と、 を含むことを特徴とする核酸組成物。
  35. 【請求項３５】 束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白を
    コードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項３２または３３記載の核酸
    組成物。
  36. 【請求項３６】 束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白を
    コードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項３４記載の核酸組成物。
  37. 【請求項３７】 リガンド結合ドメイン、束化ドメインおよび転写活性化ド
    メインを含む融合蛋白をコードする核酸をさらに含むことを特徴とする請求項３
    ２記載の核酸組成物。
  38. 【請求項３８】 請求項１〜２７のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
  39. 【請求項３９】 請求項２９〜３７のいずれかに記載の核酸組成物を含むベ
    クター。
  40. 【請求項４０】 ベクターがウイルスベクターであることを特徴とする請求
    項３８または３９記載のベクター。
  41. 【請求項４１】 ベクターが、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、
    レトロウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶベクター、HＳ
    Ｖベクターから成る群から選択されることを特徴とする請求項４０記載のベクタ
    ー。
  42. 【請求項４２】 さらにリコンビナントウイルスにパッケージされているこ
    とを特徴とする請求項４０または４１記載のベクター。
  43. 【請求項４３】 （ａ）請求項２９、３０、または３１記載の核酸組成物を
    含む第１のリコンビナントウイルスと、 （ｂ）発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子を含む標的遺伝子
    構成物を含む第２のリコンビナントウイルスと を含むことを特徴とする組成物。
  44. 【請求項４４】 （ａ）請求項１７記載のリコンビナント核酸を含む第１の
    リコンビナントウイルスと、 （ｂ）発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子を含む標的遺伝子
    構成物を含む第２のリコンビナントウイルスと を含むことを特徴とする組成物。
  45. 【請求項４５】 （ａ）請求項１３記載のリコンビナント核酸を含む第１の
    リコンビナントウイルスと、 （ｂ）発現調節配列に効果的に連結された標的遺伝子を含む標的遺伝子
    構成物を含む第２のリコンビナントウイルスと を含むことを特徴とする組成物。
  46. 【請求項４６】 第２のウイルスが、束化ドメインおよび転写活性化ドメイ
    ンを含む融合蛋白をコード化する核酸をさらに含むことを特徴とする請求項４３
    または４４記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 第２のウイルスが、束化ドメインおよび転写活性化ドメイ
    ンを含む融合蛋白をコード化する核酸をさらに含むことを特徴とする請求項４５
    記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 第２のウイルスが、リガンド結合ドメイン、束化ドメイン
    および転写活性化ドメインを含む融合蛋白をコード化する核酸をさらに含むこと
    を特徴とする請求項４３記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白を
    コード化する核酸を含む第３のリコンビナントウイルスをさらに含むことを特徴
    とする請求項４３または４４記載の組成物。
  50. 【請求項５０】 束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白を
    コード化する核酸を含む第３のリコンビナントウイルスをさらに含むことを特徴
    とする請求項４５記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 リガンド結合ドメイン、束化ドメインおよび転写活性化ド
    メインを含む融合蛋白をコード化する核酸を含む第３のリコンビナントウイルス
    をさらに含むことを特徴とする請求項４３記載の組成物。
  52. 【請求項５２】 リコンビナントウイルスが、アデノウイルス、ＡＡＶ、レ
    トロウイルス、ハイブリッドアデノウイルス−ＡＡＶ、およびHＳＶから成る群
    から選択されることを特徴とする請求項４３〜５１のいずれかに記載の組成物。
  53. 【請求項５３】 細胞が核酸を取りこむことが可能な条件で、請求項２９〜
    ３３、３５または３７記載の核酸組成物のいずれかを細胞に導入することによっ
    て、標的遺伝子のリガンド依存性転写を可能にする方法。
  54. 【請求項５４】 請求項４３、４４、４６、４７、４９または５１記載の核
    酸組成物のいずれかを細胞に導入することによって、標的遺伝子のリガンド依存
    性転写を可能にする方法。
  55. 【請求項５５】 組成物がｅｘ ｖｉｖｏで導入されることを特徴とする請
    求項５３または５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】 組成物がｉｎ ｖｉｖｏで導入されることを特徴とする請
    求項５３または５４記載の方法。
  57. 【請求項５７】 請求項１〜２７のいずれかに記載の核酸を含む宿主細胞。
  58. 【請求項５８】 請求項２９〜３３、３５または３７のいずれかに記載の核
    酸組成物を含む宿主細胞。
  59. 【請求項５９】 請求項３４または３６記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
  60. 【請求項６０】 請求項４３、４４、４６、４７、４９または５１のいずれ
    かに記載の組成物を含む宿主細胞。
  61. 【請求項６１】 請求項４５、４７または５０のいずれかに記載の組成物を
    含む宿主細胞。
  62. 【請求項６２】 請求項５３〜５６のいずれかに記載の方法で調製される宿
    主細胞。
  63. 【請求項６３】 請求項５８、６０または６２のいずれかに記載の宿主細胞
    に細胞浸透性リガンドを加えることによって標的遺伝子の発現を調節する方法で
    あって、前記細胞浸透性リガンドが融合蛋白のリガンド結合ドメインに結合して
    遺伝子発現を活性化する方法。
  64. 【請求項６４】 宿主細胞が全生物中にあることを特徴とする請求項６３記
    載の方法。
  65. 【請求項６５】 生物が哺乳類であることを特徴とする請求項６４記載の方
    法。
  66. 【請求項６６】 細胞が霊長類起源のものであり、哺乳類が霊長類であるこ
    とを特徴とする請求項６５記載の方法。
  67. 【請求項６７】 霊長類がヒトであることを特徴とする請求項６６記載の方
    法。
  68. 【請求項６８】 束化ドメインおよびそれに非相同なさらなるドメインを含
    む融合蛋白をコードする第１の部分と、関心事のＤＮＡ配列を挿入するためのク
    ローニング部位を含む第２の部分とを含むリコンビナントＤＮＡ配列を含むＤＮ
    Ａベクター。
  69. 【請求項６９】 （ａ）束化ドメイン、転写活性化ドメインおよびペプチド
    結合対の１つの構成員を含む第１の融合蛋白と、 （ｂ）ＤＮＡ−結合ドメインおよび結合対の他方の構成員を含む第２の
    融合蛋白と、 をコードするリコンビナント核酸を含む細胞であって、 前記ペプチド結合対が、（ｉ）ペプチドリガンドおよび（ii）前記ペプチドリ
    ガンドに結合することができるペプチド結合ドメインを含み、 且つ、２つの融合蛋白が会合するとレポーター遺伝子発現を可能にする発現調
    節配列に連結されたレポーター遺伝子をさらに含む、 ことを特徴とする細胞。
  70. 【請求項７０】 （ａ）調節可能な発現調節要素に連結されたレポーター遺
    伝子と、 （ｂ）関心事の蛋白ドメインに連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む融
    合蛋白をコードする第１のリコンビナント核酸と、 （ｃ）束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白をコード
    する核酸配列に連結されたクローニング部位を含む第２のリコンビナント核酸と
    を含み、 融合蛋白が会合するとレポーター遺伝子の発現を活性化する、 遺伝子操作されたことを特徴とする宿主細胞。
  71. 【請求項７１】 （ａ）調節可能な発現調節要素に連結されたレポーター遺
    伝子と、 （ｂ）関心事の蛋白ドメインに連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む融
    合蛋白をコードする第１のリコンビナント核酸と （ｃ）束化ドメインおよび転写活性化ドメインを含む融合蛋白をコード
    する核酸配列に連結された試験ライブラリーの構成員を含む第２のリコンビナン
    ト核酸と を含み、 融合蛋白が会合するとレポーター遺伝子の発現を活性化する、 遺伝子操作されたことを特徴とする宿主細胞。
  72. 【請求項７２】 （ａ）調節可能な発現調節要素に連結されたレポーター遺
    伝子と、 （ｂ）関心事の蛋白ドメインに連結された転写活性化ドメインを含む融
    合蛋白をコードする第１のリコンビナント核酸と、 （ｃ）束化ドメインおよびDNA結合ドメインを含む融合蛋白をコードする
    核酸配列に連結されたクローニング部位を含む第２のリコンビナント核酸と を含み、 融合蛋白が会合するとレポーター遺伝子の発現を活性化する、 ことを特徴とする遺伝子操作された宿主細胞。
  73. 【請求項７３】 （ａ）調節可能な発現調節要素に連結されたレポーター遺
    伝子と、 （ｂ）関心事の蛋白ドメインに連結された転写活性化ドメインを含む融
    合蛋白をコードする第１のリコンビナント核酸と、 （ｃ）束化ドメインおよびDNA結合ドメインを含む融合蛋白をコードする
    核酸配列に連結された試験ライブラリーの構成員を含む第２のリコンビナント核
    酸と を含み、 融合蛋白が会合するとレポーター遺伝子の発現を活性化する、 ことを特徴とする遺伝子操作された宿主細胞。
  74. 【請求項７４】 （ａ）遺伝子発現を可能にする適当な条件下で、請求項６
    ９〜７３に記載の遺伝子操作された細胞を、組み合せライブラリーの構成員と接
    触させ、 （ｂ）レポーター遺伝子の存在および／または量を観測し、 （ｃ）レポーター遺伝子の存在および／または量を、組み合せライブラ
    リーの個々の構成員の１つ以上との接触と相関させる、 各工程を含む、関心事の蛋白または蛋白ドメインに結合することができる部分を
    同定する方法。
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