ES2312344T3 - Metodos y composiciones para disminuir el nivel de factor de necrosis tumoral (tnf) en trastornos asociados con tnf. - Google Patents

Abstract

Un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral p75 (TNFR) y un dominio constante de una molécula de inmunoglobulina.

Description

Métodos y composiciones para disminuir el nivel de factor de necrosis tumoral (TNF) en trastornos asociados con TNF.

Referencias cruzadas con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos de número de serie 60/150.688, presentada el 28 de mayo de 1999.

Exposición de derechos de invenciones realizadas bajo investigación financiada federalmente (No aplicable) Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de vectores de virus adenoasociados (AVV) para disminuir los niveles de factor de necrosis tumoral (TNF). Más específicamente, la invención se refiere a vectores de AAV recombinantes que codifican un antagonista de TNF.

Antecedentes

El factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) y el factor de necrosis tumoral \beta (TNF\beta) son citoquinas multifuncionales homólogas; las enormes similitudes en las características estructurales y funcionales de las mismas han dado como resultado su descripción en conjunto como factor de necrosis tumoral o "TNF". Las actividades que generalmente se atribuyen al TNF incluyen: liberación de otras citoquinas, incluyendo IL-1, IL-6, GM-CSF e IL-10, inducción de quimioquinas, aumento de moléculas de adhesión, crecimiento de vasos sanguíneos, liberación de enzimas destructoras de tejido y activación de células T. Véase, por ejemplo, Feldmann et al, 1997, Adv. Immunol., 64: 283-350, Nawroth et al., 1986, J. Exp. Med., 163: 1363-1375; Moser et al., 1989, J. Clin. Invest. 83: 444-455; Shingu et al., 1993, Clin. Exp. Immunol. 94: 145-149; MacNaul et al., 1992, Matrix Suppl., 1: 198-199; y Ahmadzadeh et al., 1990, Clin. Exp. Rheumatol. 8: 387-391. Todas estas actividades pueden servir para potenciar una respuesta inflamatoria.

El TNF inicia su efecto biológico a través de su interacción con receptores de superficie celular específicos en células sensibles a TNF. Existen dos formas diferentes del receptor del factor de necrosis tumoral en la superficie celular (TNFR), denominados p75 (o Tipo II) y p55 (o Tipo I) (Smith et al., 1990, Science 248: 1019-1023; Loetscher et al., 1990, Cell 61: 351-359). El TNFR Tipo I y el TNFR Tipo II se unen cada uno tanto a TNF\alpha como a TNF\beta. Están presentes versiones truncadas solubles de los TNFR con un dominio de unión a ligando en los fluidos corporales y articulaciones (Engelmann et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 11974-11980; Roux-Lombard, et al., 1993, Arthritis Rheum. 36: 485-489).

Varios trastornos están asociados con niveles elevados de TNF, muchos de ellos de una importancia médica significativa. Entre dichos trastornos asociados con TNF están la insuficiencia cardiaca congestiva, las enfermedades inflamatorias del intestino (incluyendo la enfermedad de Crohn), artritis y asma.

El TNF parece afectar al corazón y al endotelio en la insuficiencia cardiaca congestiva y se ha implicado en el inicio de un proceso apoptótico en los miocitos cardiacos. El papel para el TNF en esta enfermedad también se apoya en una asociación temporal entre la activación de TNF y una transición de insuficiencia cardiaca congestiva asintomática a sintomática (Ceconi et al., 1998, Prog. Cardiovasc. Dis. 41: 25-30).

Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa, se asocian con una expresión aumentada de TNF (Evans et al., 1997, Aliment. Pharmacol. Ther. 11: 1031-1035). El tratamiento de dichos trastornos ha incluido el uso generalizado de agentes inmunosupresores, tales como azatioprina, metotrexato, ciclosporina y glucocorticosteroides (Rutgeerts, 1998, Digestión 59: 453-469).

La artritis es una afección común que conduce a parálisis para la que no existen curas y escasas terapias eficaces. Aproximadamente una de cada siete personas en los Estados Unidos está afectada por una o más formas de artritis. La mayoría de las formas de artritis se caracterizan por inflamación crónica de las articulaciones resultado de infecciones, lesiones mecánicas o alteraciones inmunológicas. La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica que se manifiesta principalmente en las articulaciones por hinchazón, dolor, rigidez y destrucción tisular (Harris, 1990, N. Engl. J. Med., 323: 994-996). Las manifestaciones sistémicas pueden incluir elevaciones en los niveles séricos de proteínas de fase aguda, fiebre, anemia moderada, trombocitosis y granulocitosis. En las articulaciones afectadas, existe una sinovitis caracterizada por hiperplasia e inflamación de la cápsula sinovial con un exudado inflamatorio hacia el interior de la cavidad articular, que conduce a la erosión del cartílago y del hueso.

Aunque la artritis reumatoide no es directamente ni inminentemente un peligro para la vida, datos recientes sugieren que la RA da como resultado una esperanza de vida significativamente más corta y supone una enorme coste tanto para el sistema sanitario, la economía global debido a una pérdida de productividad, así como para la calidad de vida como resultado de una movilidad y de actividades restringidas (Schiff, 1997, Am. J. Med., 102 (1A):
11S-15S).

Los agentes terapéuticos empleados comúnmente en la actualidad para el tratamiento de la RA entran principalmente en tres categorías: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) e inmunosupresores. Los AINE son un gran grupo de fármacos que se usan con frecuencia como terapia de primera línea para la artritis reumatoide. Los compuestos actúan principalmente a través del bloqueo de la ciclooxigenasa que cataliza la conversión del ácido araquidónico en prostaglandinas y tromboxanos. Como clase, los DMARD, que incluyen agentes tales como oro, sulfasalazina, hidroxicloroquinona y D-penicilamina, son de acción lenta, muy tóxicos y existen pocas pruebas de que cualquiera de estos compuestos tenga efectos que mitiguen la enfermedad subyacente. Los AINE pueden aliviar algunos de los signos de inflamación y dolor asociados con la artritis; sin embargo, parecen ser ineficaces contra el sistema inmune y en el bloqueo de la evolución de la destrucción y enfermedad articular. Los agentes inmunosupresores, tales como corticosteroides y metotrexato, se usan comúnmente en el tratamiento de la RA para suprimir el sistema inmune y, por lo tanto, tienen un efecto antiinflamatorio. Sin embargo, estos agentes engendran una toxicidad sistémica grave que limita su uso y su
eficacia.

Aunque está ampliamente aceptado que la RA es una enfermedad inflamatoria basada en la inmunidad, todavía se desconoce el antígeno o antígenos que desencadenan la enfermedad. Esto ha conducido a un gran número de estrategias de terapia en la investigación clínica o preclínica, que implican intentos de modular el sistema de respuestas inmunes en su totalidad. Se muestran a continuación ejemplos de varios intentos generales en esta dirección.

El mecanismo de acción de los AINE se ha vinculado con el bloqueo de la ciclooxigenasa, una enzima con una forma tanto inducible como constitutiva. Como la forma inducible de la ciclooxigenasa parece estar aumentada en la enfermedad inflamatoria, están en marcha investigaciones acerca de compuestos selectivos para la forma inducible. Además, se han realizado intentos de elaborar vacunas para tratar una artritis en curso con el uso de vacunas peptídicas dirigidas contra proteínas receptoras de células T o de la clase II del MHC. Generalmente, ha demostrado ser difícil demostrar la eficacia de vacunas administradas a enfermedades en curso.

La mayoría de la destrucción tisular en la RA parece deberse a diversas metaloproteinasas. Se piensa que este grupo de proteasas es central en la degradación del colágeno II y del proteoglicano que se observa en la artritis. Varios inhibidores de diversas de estas enzimas están en investigación preclínica o clínica.

Varios fármacos claramente inmunosupresores están en ensayo clínico para el uso en la artritis reumatoide, incluyendo ciclosporina A y micofenolato de mofetilo. Como se encuentra una amplia variedad de citoquinas en las articulaciones artríticas, las terapias antiartritis se han dirigido a las rutas de citoquinas, incluyendo las de IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, IL-11, TGF\beta y TNF\alpha, así como a rutas de quimioquinas (Feldmann et al., 1997). En particular, se han dirigido terapias hacia rutas proinflamatorias de IL-1 tanto por ataque de IL-1 directamente como a través de la molécula antagonista del receptor de interleuquina 1 de origen natural.

Los métodos de administración de terapia farmacológica para la RA han incluido, y se ha propuesto que incluyan, la administración sistémica o local de un fármaco terapéutico y, en el caso de terapias génicas propuestas, de un gen terapéutico. Hasta la fecha, dichos tratamientos no han logrado una terapia segura de administración eficaz para la artritis por una diversidad de razones, que incluyen: efectos secundarios sistémicos de muchos fármacos, rápida eliminación de moléculas terapéuticas de las articulaciones inyectadas y/o de la circulación, ineficacia en la integración del ADN y expresión del genoma, población celular diana limitada asociada con algunos vectores de administración virales, expresión génica transitoria asociada con vectores viales que no se integran fácilmente e inducción de una respuesta inmune asociada con el virus de administración génica.

El uso de antagonistas de TNF, tales como TNFR solubles y anticuerpos anti-TNF, ha demostrado que un bloqueo de TNF puede revertir los efectos atribuidos al TNF, incluyendo disminuciones en IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y destrucción tisular (Feldmann et al., 1997). Dichos efectos pleiotrópicos aparentemente debidos al bloqueo de TNF solo sugieren que TNF puede encontrarse cerca de la parte superior de la cascada de los acontecimientos mediados por citoquinas. Se encuentran niveles elevados de TNF-\alpha en el líquido sinovial de pacientes de RA (Camussi y Lupia, 1998, Drugs, 55: 613-620).

El efecto del bloqueo de TNF utilizando un anticuerpo anti-TNF de ratón de hámster se ensayó en un modelo de artritis por colágeno de tipo II en ratones de DBA/I (Williams, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 89: 9784-9788). El tratamiento iniciado después del comienzo de la enfermedad dio como resultado una mejora en la hinchazón de las almohadillas plantares, la puntuación clínica y la histopatología de la destrucción articular. Otros estudios han obtenido resultado similares usando anticuerpos (Thorbecke et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7375-7379) o construcciones de TNFR (Husby et al., 1988, J. Autoimmun. 1: 3637-71; Tetta et al., 1990, Ann. Rheum. Dis. 49: 665-667; Wooley et al., 1993, J. Immunol. 151: 6602-6607; Piguet et al., 1992, Immunology 77: 510-514).

También se han obtenido resultados similares en otros modelos animales de artritis en curso. En el conejo, se demostró que el anticuerpo anti-TNF\alpha tenía un efecto antiartrítico en la artritis inducida por antígeno (Lewthwaite et al., 1995, Ann. Rheum. Dis. 54: 366-374). En la rata, se ha demostrado que la terapia anti-TNF es eficaz en la artritis adyuvante (por Mycobacterium) (Issekutz et al., 1994, Clin. Exp. Immunol. 97: 26-32), en la artritis inducida por la pared celular de estreptococos (Schimmer et al., 1997, J. Immunol. 159: 4103-4108) y en la artritis inducida por colágeno (Le et al., 1997, Arthritis Rheum. 40: 1662-1669).

En los estudios descritos anteriormente, el bloqueo de TNF se logró mediante la administración sistémica del agente bloqueante. En un modelo de artritis por colágeno en rata, la administración de un gen de TNFR usando un vector adenoviral dio como resultado una producción transitoria de niveles séricos de TNFR (hasta 8 días) y una disminución significativa en la evolución de la enfermedad cuando se administró el adenovirus a animales que estaban experimentando una artritis activa (Le et al., 1997). No obstante, los intentos de administrar el gen directamente en la articulación no tuvieron éxito y dieron como resultado una reacción inflamatoria contra el adenovirus.

Un anticuerpo monoclonal dirigido contra TNF\alpha (infliximab, REMICADE, Centocor), administrado con y sin metotrexato, ha demostrado una eficacia clínica en el tratamiento de la RA (Elliott et al., 1993, Arthritis Rheum. 36: 1681-1690; Elliot et al., 1994, Lancet 344: 1105-1110). Estos datos demuestran reducciones significativas en los criterios de Paulus del 20% y del 50% a las 4, 12 y 26 semanas. Este tratamiento se administra por vía intravenosa y el anticuerpo monoclonal anti-TNF desaparece de la circulación por un periodo de dos meses. La duración de la eficacia parece disminuir con dosis repetidas. El paciente puede generar anticuerpos contra los anticuerpos anti-TNF que limitan la eficacia y la duración de esta terapia (Kavanaugh et al., 1998, Rheum. Dis. Clin. North Am. 24: 593-614). La administración de metotrexato en combinación con infliximab ayuda a prevenir el desarrollo de anticuerpos anti-infliximab (Maini et al., 1998, Arthritis Rheum. 41: 1552-1563). El infliximab también ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento del trastorno inflamatorio del intestino conocido como enfermedad de Crohn (Baert et al., 1999, Gastroenterology, 116: 22-28).

Los ensayos clínicos de una versión recombinante del TNFR humano soluble (p75) ligado a la porción Fc de la IgG 1 humana (sTNFR(p75):Fc, ENBREL, Immunex) han demostrado que su administración daba como resultado reducción rápidas y significativas en la actividad de la enfermedad RA (Moreland et al., 1997 N. Eng. J. Med. 337: 141-147). Además, datos de seguridad preliminares de un ensayo clínico pediátrico en curso para sTNFR(p75):Fc indican que generalmente este fármaco se tolera bien por pacientes con artritis reumatoide juvenil (JRA) (Garrison et al., 1998, Am. Collage of Rheumatology meeting, 9 de noviembre de 1998, resumen 584).

Como se ha indicado anteriormente, el ENBREL es una proteína de fusión dimérica que consiste en la porción de unión a ligando extracelular del TNFR humano de 75 kilodaltons (p75) ligado a la porción Fc de la IgG1 humana. El componente Fc del ENBREL contiene el dominio CH2, el dominio CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1 de IgG1. El ENBREL se produce en un sistema de expresión de células de mamífero de ovario de hámster chino (CHO). Consiste en 934 aminoácidos y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kilodaltons (Smith et al., 1990, Science 248; 1019-1023; Mohler et al., 1993, J. Immunol. 151; 1548-1561; Patente de Estados Unidos Nº 5.395.760 (Immunex Corporation, Seatle, WA); Patente de Estados Unidos Nº 5.605.690 (Immunex Corporation, Seatle, WA).

Autorizado por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) (2 de noviembre de 1998), el ENBREL está actualmente indicado para la reducción de los signos y síntomas de la artritis reumatoide de moderadamente a gravemente activa en pacientes que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD). El ENBREL puede usarse en combinación con metotrexato en pacientes que no responden adecuadamente al metotrexato en solitario. El ENBREL también está indicado para la reducción en signos y síntomas de la artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular de moderadamente a gravemente activa en pacientes que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARD (28 de mayo de 1999). El ENBREL se administra a pacientes de RA a 25 mg dos veces por semana como una inyección subcutánea.

Actualmente, tratamientos que usan las preparaciones de sTNFR(p75):Fc (ENBREL, Immunex) incluyendo, los descritas anteriormente, se administran por vía subcutánea dos veces por semana, lo que es costoso, desagradable e incómodo para el paciente. "Important Drug Warning" en <http://www.fda.gov/medwatch/safety/1999/enbrel.htm>; "New Warning For Arthritis Drug, ENBREL" en <http://www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/ANS00954.html>;
"ENBREL Injections Difficult for Some Patients" en <http://dailynews.yahoo.com/h/nm/20000516/hl/arthritis_
drugs_1.html>. Además, el alivio proporcionado por este tratamiento no se mantiene. Los síntomas asociados con una afección artrítica se reducen durante el tratamiento con sTNFR(p75):Fc pero vuelven tras la interrupción de esta terapia, generalmente en un mes. Han surgido complicaciones, incluyendo reacciones locales en el lugar de inyección. Además, la exposición sistémica a largo plazo a este antagonista de TNF-\alpha puede imponer un riesgo para infecciones víricas y bacterianas aumentadas y, posiblemente, cáncer. Desde que se introdujo por primera vez este producto, se han descrito infecciones graves, algunas implicando la muerte, en pacientes que usaban ENBREL. "Product Information" en <http://www.enbrel.com/patient/html/patpi.htm>; "Proven Tolerability" en <http://www.enbrel.com/patient/html/
patsafety.htm>.

Las referencias relacionadas adicionales incluyen: Patentes de Estados Unidos Nº 5.858.775; 5.858.355; 5.858.351; 5.846.528; 5.843.742; 5.792.751; 5.785.211; 5.780.447; 5.766.585; 5.633.145; publicaciones de patente internacional WO 95/16353; WO 94/20517; WO 92/11359; Schwarz, 1998, Keystone Symp., En. 23-29, resumen 412; Song et al., (1998) J. Clin. Invest. 101: 2615-2621; Ghivizzani et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4613-4618; Kang et al., 1997, Biochemical Society Transactions 25: 533-537; Robbins et al., 1997, Drug News & Perspect. 10: 283-292; Firestein et al., 1997, N. Engl. J. Med. 337: 195-197; Muller-Ladner et al., 1997, J. Immunol. 158: 3492-3498; y Pelletier et al., 1997, Arthritis Rheum. 40: 1012-1019.

Existe la necesidad de nuevas formas eficaces de tratamiento para trastornos asociados con TNF tales como RA, particularmente de tratamientos que puedan proporcionar una terapia controlada y mantenida. La presente invención proporciona composiciones para el tratamiento eficaz y continuo de procesos inflamatorios de artritis y otros trastornos asociados con TNF.

Sumario de la invención

La presente invención está relacionada con la reducción de los niveles de TNF y/o con el tratamiento de trastornos asociados con TNF en un mamífero. La presente invención proporciona un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral p75 (TNFR) y un dominio constante de una molécula de inmunoglobulina. El polipéptido de fusión codificado por el vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV) es un antagonista de TNF. El vector de rAAV puede usarse para administrar un polinucleótido que codifica el antagonista de TNF al mamífero, que a su vez reduce los niveles de TNF y da como resultado la paliación de varios trastornos asociados con TNF, tales como artritis (incluyendo RA), enfermedad de Crohn, asma e insuficiencia cardiaca congestiva. La disminución de TNF puede a su vez reducir los niveles de otros agentes causantes o que contribuyen a la enfermedad, tales como otras citoquinas inflamatorias. La disminución de los niveles de TNF soluble en articulaciones que presentan RA puede a su vez paliar las afecciones asociadas con TNF, tales como artritis, y puede reducir una respuesta inflamatoria en las articulaciones.

La presente invención también proporciona una composición que comprende el vector de rAAV de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona el vector de rAAV de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso del vector de rAAV de la invención en la fabricación de un medicamento para el uso en un método para reducir una respuesta inflamatoria o tratar un trastorno inflamatorio en un mamífero. En algunas realizaciones, el medicamento comprende además un antagonista de TNF o el medicamento se administra junto con la administración de un antagonista de TNF.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión TNFR:Fc de la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.690.

La Figura 2 representa las secuencias polinucleotídica y de aminoácidos de un polipéptido de fusión TNFR:Fc de la patente de Estados Unidos 5.605.690.

La Figura 3 representa las secuencias de aminoácidos y polinucleotídica de un IL-1R humano de tipo II del GenBank U74649.

La Figura 4 representa las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del dominio extracelular (ECD)de TNFR (p80) de rata.

La Figura 5 representa el alineamiento de secuencias de aminoácidos del ECD de TNFR (p80) de rata, el ECD de TNFR (p80) murino y el ECD de TNFR (p75) humano.

La Figura 6 representa un diagrama del ADNc de la cadena pesada de la IgG1 de rata y la localización relativa de los cebadores de PCR usados para amplificar la porción Fc del ADNc de IgG1.

La Figura 7 representa las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la Fc de IgG1 de rata.

La Figura 8 representa las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción de fusión TNFR:Fc de rata.

La Figura 9 representa un diagrama del plásmido de expresión pCMVrTNFR-Fc, que incluye el polinucleótido de fusión TNFR(p80)ECD-IgG1Fc de rata y elementos de control unidos operativamente.

La Figura 10 representa un análisis de northern de ARN de células transfectadas con el plásmido de expresión pCMVrTNFR-Fc.

La Figura 11 representa un diagrama del plásmido vector de rAAV pAAVCMVrTNFRFc, que incluye el polinucleótido de fusión TNFR(p80)ECD-IgG1Fc de rata y elementos de control unidos operativamente, que incluyen ITR de AAV.

La Figura 12 es un gráfico que representa los resultados de bioensayos de inhibición de TNF usando medios recogidos de células transfectadas con pCMVrTNFR-Fc (-\blacklozenge-) y de células transfectadas con pCMVGFP (-\lozenge-).

La Figura 13 es un gráfico que representa los resultados de bioensayos de inhibición de TNF usando medios de células transducidas con partículas de AAVCMVrTNFRFc (\blacklozenge), de células transducidas con partículas de AAV-lacZ (\medbullet), de células con infección simulada (\ding{115}) y de células transfectadas con pCMVrTNFR-Fc (\blacksquare).

La Figura 14 es un gráfico que representa los resultados de bioensayos de inhibición de TNF usando medios de células transducidas con partículas de AAVCMVrTNFRFc a 100 (\blacklozenge), 500 (\boxplus), 1000 (\Delta), 5000 (\medcirc) o 10.000 (\lozenge) partículas por célula, así como con medios de células con infección simulada (\oplus) y de células transfectadas con pCMVrTNFR-Fc (\Box).

La Figura 15 es un gráfico que representa un análisis del curso de tiempo de la expresión polipeptídica de TNFR-Fc después de la transducción de células con AAVCMVrTNFRFc a 1000 partículas por célula. La expresión de TNFR-Fc se determinó con bioensayos de inhibición de TNF.

La Figura 16 es una imagen de tejido articular tratado con rAAV-LacZ y teñido histoquímicamente para actividad \beta-galactosidasa.

La Figura 17 es una imagen de tejido articular artrítico tratado con rAAV-LacZ y teñido histoquímicamente para actividad \beta-galactosidasa.

La Figura 18 es una imagen de tejido articular artrítico tratado con PBS y teñido histoquímicamente para actividad \beta-galactosidasa.

La Figura 19 es un gráfico que representa la supresión de artritis inducida por SCW mediante vector rAAV-TNFR:Fc de rata. Cada punto representa la media +/- el error típico de la media (ETM) para cada grupo de ratas.

La Figura 20 es un gráfico que representa la supresión de los síntomas de artritis en la articulación contralateral mediante el vector AAV-TNFR:Fc de rata. Las puntuaciones de AI para cada tobillo de pata posterior se registraron y se representaron por separado. Cada punto representa la media +/- el error típico de la media (ETM) para cada grupo de ratas.

La Figura 21 es un gráfico que representa la expresión sérica de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva en ratas tratadas con SCW. Cada punto representa la media +/- la desviación típica (DT) para cada grupo de ratas.

La Figura 22 es un gráfico que representa la expresión sérica de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva en ratas sin tratamiento previo. Cada punto representa la media +/- la desviación típica (DT) para cada grupo de ratas.

Descripción detallada

Se han descubierto composiciones y métodos para reducir los niveles de TNF en un tejido, un lugar anatómico en particular y/o la circulación de un individuo y métodos para disminuir los niveles de TNF y para paliar los trastornos asociados con TNF. Se incluyen métodos para reducir la respuesta inflamatoria en un sujeto por reducción de los niveles de actividad de TNF.

La invención que se describe en la presente memoria proporciona vectores de rAAV y composiciones para usar en la administración a y en la expresión de un polinucleótido que codifica un antagonista de TNF en un mamífero. El polinucleótido que codifica un antagonista de TNF se administra al mamífero a través de un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV), un vector que se integra en el genoma de la célula hospedadora. La introducción de ADN de rAAV en las células generalmente conduce a una persistencia a largo plazo y a la expresión de ADN sin alterar el metabolismo normal de la célula. Por lo tanto, los vectores de rAAV de la invención proporcionan una fuente continua de y una administración continua del antagonista de TNF al mamífero. Esta es una ventaja diferente y significativa sobre las modalidades de tratamiento descritas anteriormente (es decir, administración exógena de agentes terapéuticos) que confieren sólo beneficios transitorios.

Definiciones

Las formas en singular "uno", "una" y "el/la" incluyen referencias al plural a menos que el contexto imponga claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.

Un "antagonista de TNF", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que se une a TNF e inhibe y/o dificulta la actividad de TNF, como se refleja en la unión de TNF a un receptor de TNF, incluyendo cualquiera de los siguientes: (a) TNFR, preferiblemente endógeno (es decir, nativo para el individuo u hospedador), TNFR unido a membrana celular; (b) el o los dominios extracelulares de TNFR; y/o (c) los dominios de unión a TNF de TNFR (que pueden ser una porción del dominio extracelular). Los antagonistas de TNF incluyen, pero sin limitación, receptores de TNF (o porciones apropiadas de los mismos, como se describe en la presente memoria) y anticuerpos anti-TNF. Como se usa en la presente memoria, la "actividad biológica" de un antagonista de TNF es unirse al TNF e inhibir y/o dificultar la unión de TNF a cualquiera de los siguientes: (a) TNFR, preferiblemente endógeno, TNFR unido a membrana celular; (b) el o los dominios extracelulares de TNFR; y (c) los dominios de unión a TNF de TNFR (que pueden ser una porción del dominio extracelular). Puede demostrarse que un antagonista de TNF presenta actividad biológica usando ensayos conocidos en la técnica para medir la actividad de TNF y su inhibición, proporcionándose un ejemplo de los mismos en la presente memoria.

Los "trastornos asociados con TNF" son los trastornos o enfermedades que están asociados con, son el resultado de y/o aparecen en respuesta a niveles elevados de TNF. Dichos trastornos pueden asociarse con niveles elevados crónicos o episódicos de actividad de TNF y/o con aumentos locales o sistémicos en la actividad de TNF. Dichos trastornos incluyen, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias tales como artritis y enfermedad inflamatoria del intestino e insuficiencia cardiaca congestiva.

Como se usan en la presente memoria, las expresiones "polipéptido receptor de TNF" y "polipéptido TNFR" se refieren a polipéptidos procedentes del TNFR (de cualquier especie) que son capaces de unirse a TNF. Se han descrito dos TNFR de superficie celular diferentes: TNFR de tipo II (o TNFR p75 o TNFRII) y TNFR de Tipo I (o TNFR p55 p TNFRI). El TNFR p75 humano maduro de longitud completa es una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 75-80 kilodaltons (kD). El TNFR p55 humano maduro de longitud completa es una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 55-60 kD. Los polipéptidos TNFR preferidos de esta invención proceden del TNFR de Tipo I y/o del TNFR de Tipo II.

Los polipéptidos de TNFR, tales como "TNFR", "TNFR:Fc" y similares, se refieren al polipéptido intacto respectivo (tal como TNFR intacto) o a cualquier fragmento o derivado del mismo (tal como un derivado de la secuencia de aminoácidos), que presenta la actividad biológica deseada (es decir, unión a TNF). Un "polinucleótido de TNFR" es cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido TNFR (tal como un polipéptido TNFR:Fc).

Como se usa en la presente memoria, un "dominio extracelular" de TNFR se refiere a una porción de TNFR que se encuentra entre el extremo amino terminal de TNFR y el extremo amino terminal de la región transmembrana de TNFR. El dominio extracelular de TNFR se une a TNF.

Un "antagonista de IL-1", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que se une a la interleuquina 1 (IL-1) e inhibe y/o dificulta la actividad de IL-1, como se refleja en la unión de IL-1 a un receptor de IL-1, incluyendo cualquiera de los siguientes: (a) receptor de IL-1 (IL-1R), preferiblemente endógeno (es decir, nativo para el individuo u hospedador), IL-1R unido a membrana celular; (b) el o los dominios extracelulares de IL-1R; y/o (c) los dominios de unión a IL-1 de IL-1R (que pueden ser una porción del dominio extracelular). Los antagonistas de IL-1 incluyen, pero sin limitación, receptores de IL-1 (o porciones apropiadas de los mismos, como se describe en la presente memoria) y anticuerpos anti-IL-1. Como se usa en la presente memoria, la "actividad biológica" de un antagonista IL-1 es unirse a IL-1 e inhibir y/o dificultar la unión de IL-1 a cualquiera de los siguientes: (a) IL-1R, preferiblemente endógeno, IL-1R unido a membrana celular; (b) el o los dominios extracelulares de IL-1R; y/o (c) los dominios de unión a IL-1 de IL-1R (que pueden ser una porción del dominio extracelular). Puede demostrarse que un antagonista de IL-1 presenta actividad biológica usando ensayos conocidos en la técnica, incluyendo ensayos de inhibición de IL-1, que se describen en la presente memoria, así como en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "polipéptido receptor de IL-1" se refiere a polipéptidos procedentes del receptor de IL-1 (de cualquier especie) que son capaces de unirse a IL-1. Los polipéptidos IL-1R, se refieren al polipéptido intacto respectivo (tal como IL-1R intacto) o a cualquier fragmento o derivado del mismo (tal como un derivado de la secuencia de aminoácidos), que presenta la actividad biológica deseada (es decir, unión a IL-1). Un "polinucleótido de IL-1R" es cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido IL-1R.

Como se usa en la presente memoria, un "dominio extracelular" de IL-1R se refiere a una porción de IL-1R que se encuentra entre el extremo amino terminal de IL-1R y el extremo amino terminal de la región transmembrana de IL-1R. El dominio extracelular de IL-1R se une a IL-1.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El término también incluye un polímero de aminoácidos que se ha modificado; por ejemplo, por formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación o conjugación con un componente marcador.

Un "polipéptido quimérico" o "polipéptido de fusión" es un polipéptido que comprende regiones en una posición diferente a la que aparece en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en proteínas separadas y se juntan en el polipéptido quimérico o de fusión, o pueden existir normalmente en la misma proteína pero están colocadas en una nueva organización en el polipéptido quimérico o de fusión. Un polipéptido quimérico o de fusión también puede surgir de formas poliméricas, ya sean lineales o ramificadas, de un polipéptido o polipéptidos TNFR.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", usados de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido puede comprender polinucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos y puede estar interrumpido por componentes no nucleotídicos. Si están presentes, las modificaciones en la estructura nucleotídica pueden impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. El término polinucleótido, como se usa en la presente memoria, se refiere de forma intercambiable a moléculas bicatenarias y monocatenarias. A menos que se especifique o se requiera otra cosa, cualquier realización de la invención descrita en la presente memoria que sea un polinucleótido incluye tanto a la forma bicatenaria como a cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o predichas que componen la forma
bicatenaria.

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Un "polinucleótido quimérico" o "polinucleótido de fusión" es un polinucleótido que comprende regiones en una posición diferente a la que aparece en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en genes separados y se juntan en el polinucleótido quimérico o de fusión, o pueden existir normalmente en el mismo gen pero están colocados en una nueva organización en el polinucleótido quimérico o de fusión.

El "AAV" es una abreviatura para el virus adenoasociado y puede usarse para referirse al propio virus o a derivados del mismo. El término engloba todos los subtipos y las formas tanto de origen natural como recombinantes, excepto donde se requiera otra cosa.

Un "vector de rAAV", como se usa en la presente memoria, se refiere a un vector de AAV que comprende una secuencia polinucleotídica que no es de origen de AAV (es decir, un polinucleótido heterólogo para AAV), típicamente una secuencia de interés para la transformación genética de una célula. El polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, preferiblemente dos, secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV. Como se describe en la presente memoria, un vector de rAAV puede estar en cualquiera de varias formas, incluyendo, pero sin limitación, plásmidos, cromosomas lineales artificiales, formando complejos con lípidos, encapsulado en el interior de liposomas y, más preferiblemente, encapsidado en una partícula viral, particularmente un AAV.

Un "virus rAAV" o "partícula viral de rAAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (preferiblemente, por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo silvestre) y un rAAV encapsidado.

El "empaquetamiento" se refiere a una serie de acontecimientos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y la encapsidación de una partícula de AAV o partícula de rAAV.

Los genes "rep" y "cap" de AAV se refieren a secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas de replicación y encapsidación de un virus adenoasociado. Se han encontrado en todos los serotipos de AAV examinados, y se describen a continuación y en la técnica. Los rep y cap de AAV se denominan en la presente memoria "genes de empaquetamiento" de AAV.

Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que AAV se replique y se empaquete por una célula de mamífero. Se conocen en la técnica una diversidad de dichos virus auxiliares para AAV, incluyendo adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como vaccinia. Los adenovirus incluyen varios subgrupos diferentes, aunque se usa más comúnmente el adenovirus de tipo 5 del subgrupo C. Se conocen y están disponibles de lugares de depósito tales como la ATCC numerosos adenovirus de origen humano, de mamíferos no humanos y aviar. Los virus de la familia herpes incluyen, por ejemplo, virus herpes simple (HSV) y virus de Espstein-Barr (EBV), así como citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV); que también están disponibles de lugares de depósito tales como la ATCC.

Un virus o partícula viral "infecciosa" es uno que comprende un componente polinucleotídico que es capaz de administrarse en el interior de una célula por la que la especie viral tiene tropismo. El término no implica necesariamente ninguna capacidad de replicación del virus. Se describen en la técnica ensayos para el recuento de partículas virales infecciosas.

Un virus "competente para la replicación" (por ejemplo un AAV competente para la replicación, a veces abreviado como "RCA") se refiere a un virus fenotípicamente de tipo silvestre que es infeccioso y también es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o de funciones de virus auxiliar). En el caso de AAV, la competencia para la replicación requiere generalmente la presencia de genes de empaquetamiento de AAV funcionales. Los vectores de rAAV preferidos, como se describen en la presente memoria, son incompetentes para la replicación en células de mamíferos (especialmente, en células humanas) en virtud de la falta de uno o más genes de empaquetamiento de AAV. Preferiblemente, dichos vectores de rAAV carecen de cualquier secuencia de genes de empaquetamiento de AAV para minimizar la posibilidad de que se genere RCA por recombinación entre genes de empaquetamiento de AAV y un vector de rAAV.

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos una fase de lectura abierta que es capaz de codificar una proteína particular después de transcribirse y traducirse.

El término "recombinante", como se aplica a un polinucleótido, se refiere a que el polinucleótido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción o ligación y otros procedimientos que dan como resultado una construcción que es diferente de un polinucleótido que se encuentra en la naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen, respectivamente, réplicas de la construcción polinucleotídica original y progenie de la construcción viral original.

Un "elemento de control" o "secuencia de control" es una secuencia de nucleótidos implicada en una interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional de un polinucleótido, incluyendo la replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar a la frecuencia, velocidad o especificidad de los procesos y puede ser potenciadora o inhibidora por naturaleza. Los elementos de control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias de regulación transcripcional tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de ADN capaz en determinadas condiciones de unirse a una ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante localizada habitualmente cadena abajo (en la dirección 3') del promotor.

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Las expresiones "unido operativamente" o "unido funcionalmente" se refieren a una yuxtaposición de elementos genéticos en la que los elementos están en una relación que les permite funcionar de la forma esperada. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una región codificante si el promotor a ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber restos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga su relación funcional.

El término "heterólogo" significa procedente de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, un polinucleótido introducido por técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector procedente de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterólogo.

La "modificación genética" se refiere a un proceso en el que se introduce un elemento genético en una célula, distinto de mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterólogo para la célula o puede ser una copia adicional o una versión mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alteración genética puede efectuarse, por ejemplo, por transfección de una célula con un plásmido recombinante u otro polinucleótido a través de cualquier proceso conocido en la técnica, tal como electroporación, precipitación con fosfato de calcio o contacto con un complejo polinucleótido-liposoma. La modificación genética también puede efectuarse, por ejemplo, por transducción o infección con un virus o vector viral de ADN o ARN. Preferiblemente, el elemento genético se introduce en un cromosoma o minicromosoma en la célula; pero cualquier modificación que cambia el fenotipo y/o genotipo de la célula y su progenie se incluye en este término.

Se dice que una célula está modificada, transducida o transformada "de forma estable" con una secuencia genética si la secuencia está disponible para realizar su función durante un cultivo prologando de la célula in vitro. En ejemplos preferidos, dicha célula está modificada "de forma heredable" por el hecho de que se introduce una modificación genética que además es heredable por la progenie de la célula modificada.

La "integración estable" de un polinucleótido en una célula significa que el polinucleótido se ha integrado en un replicón que tiende a mantenerse de forma estable en la célula. Aunque episomas tales como plásmidos pueden mantenerse a veces durante muchas generaciones, generalmente el material genético que se lleva de forma episomal es más susceptible de perderse que el material integrado cromosómicamente. Sin embargo, el mantenimiento de un polinucleótido puede efectuarse con frecuencia por incorporación de un marcador de selección en o adyacente a un polinucleótido y, después, mantenimiento de las células que lleven el polinucleótido bajo presión de selección. En algunos casos, las secuencias no pueden mantenerse eficazmente de forma estable a menos que se integren en un cromosoma; y, por lo tanto, la selección para la conservación de una secuencia que comprende un marcador de selección puede dar como resultado la selección de las células en las que el marcador se haya integrado de forma estable en un cromosoma. Pueden emplearse de forma conveniente genes de resistencia a antibióticos como dichos marcadores de selección, como se conoce bien en la técnica. Típicamente, se esperaría que los polinucleótidos integrados de forma estable se mantuvieran de media durante al menos aproximadamente veinte generaciones, preferiblemente al menos aproximadamente cien generaciones, aún más preferiblemente, que se mantuvieran de forma permanente. La estructura de la cromatina de los cromosomas eucariotas también puede influir en el nivel de expresión de un polinucleótido integrado. El tener los genes en episomas mantenidos de forma estable puede ser particularmente útil cuando se desea tener múltiples copias mantenidas de forma estable de un gen particular. La selección de línea celulares estables que tienen propiedades que son particularmente deseables en el contexto de la presente invención se describe y se ilustra a continuación.

Un plásmido, virus u otra sustancia "aislada" se refiere a una preparación de la sustancia desprovista de al menos algunos de los otros componentes que pueden estar también presentes donde la sustancia, o una sustancia similar, aparecen de forma natural o a partir de donde se prepara inicialmente. Por lo tanto, por ejemplo, una sustancia aislada puede prepararse mediante el uso de una técnica de purificación para enriquecerla a partir de una mezcla fuente. El enriquecimiento puede medirse en una base absoluta, tal como peso por volumen de solución, o puede medirse en relación con una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente. Se prefieren cada vez más enriquecimientos crecientes de las realizaciones de esta invención. Por lo tanto, por ejemplo, se prefiere un enriquecimiento de 2 veces, se prefiere más un enriquecimiento de 10 veces, se prefiere más un enriquecimiento de 100 veces, y se prefiere aún más un enriquecimiento de 1000 veces.

Se dice que una preparación de rAAV está "sustancialmente libre" de virus auxiliar si la proporción de partículas de rAAV infecciosas con respecto a partículas de virus auxiliar infecciosas es de al menos aproximadamente 10^{2}:1; preferiblemente de al menos aproximadamente 10^{4}:1; más preferiblemente, de al menos aproximadamente 10^{6}:1; aún más preferiblemente, de al menos aproximadamente 10^{8}:1. Las preparaciones también están preferiblemente libres de cantidades equivalentes de proteínas de virus auxiliar (es decir, proteínas como estarían presentes como resultado de dicho nivel de virus auxiliar, si las impurezas de partículas de virus auxiliar señaladas anteriormente estuvieran presentes en forma descompuesta). Generalmente puede observarse contaminación con proteínas virales y/o celulares como la presencia de bandas de tinción de Coomassie en geles de SDS (por ejemplo, la aparición de bandas distintas de las correspondientes a las proteínas de la cápside de AAV VP1, VP2 y VP3).

Una "célula hospedadora" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o que ha sido un receptor para un vector o vectores o para la incorporación de polinucleótidos y/o proteínas. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una célula hospedadora individual y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en la genómica de la dotación de ADN total) a la célula parental original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una célula hospedadora incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido o polinucleótidos de esta invención.

La "transformación" o "transfección" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora, independientemente del método usado para la inserción, por ejemplo, lipofección, transducción, infección o electroporación. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o, como alternativa, puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora.

Un "individuo" o "sujeto" se refiere a vertebrados, particularmente miembros de una especie de mamífero, e incluye, pero sin limitación, animales domésticos, animales de deporte, roedores y primates, incluyendo seres humanos.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una "cantidad eficaz" es una cantidad que logra cualquiera de lo siguiente: reducción de los niveles de TNF; reducción de una respuesta inflamatoria; y/o paliación, mejoría, estabilización, reversión, ralentización o retraso de la evolución de la patología.

Como se usa en la presente memoria, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento, tal como la administración de un antagonista de TNF a un sujeto además de la administración de un rAAV al mismo sujeto, o la administración de dos vectores de rAAV diferentes al mismo sujeto. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al sujeto.

Una "afección artrítica" es un término bien conocido en la técnica que se refiere a un estado caracterizado por inflamación de una articulación o articulaciones.

Como se usa en la presente memoria, el "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, alivio de síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), prevención de la extensión de la enfermedad, retraso o ralentización de la evolución de la enfermedad, mejoría o paliación de la patología y remisión (ya sea parcial o total), ya se detectable o indetectable. El "tratamiento" también puede referirse a una supervivencia prolongada en comparación con la supervivencia esperada si no se recibiera el tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento de un individuo puede emprenderse para disminuir o limitar la patología asociada con niveles elevados de TNF, incluyendo, pero sin limitación, una deficiencia genética heredada o inducida, infección por un organismo vírico, bacteriano o parasitario, una afección neoplásica o aplásica o una disfunción del sistema inmune, tal como autoinmunidad. El tratamiento puede realizarse de forma profiláctica o terapéutica; es decir, anterior o posterior al inicio del acontecimiento patológico o del contacto con un agente etiológico.

Una "muestra biológica" incluye una diversidad de tipos de muestra obtenidos de un individuo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. La definición incluye sangre y otras muestras de líquido de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como especímenes de biopsia o cultivos tisulares o células procedentes de los mismos, y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que se han manipulado de cualquier modo después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. La expresión "muestra biológica" incluye una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes de células, lisados de células, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido.

La "paliación" de una enfermedad se refiere a que el grado y/o las manifestaciones clínicas indeseables de una patología se disminuyen y/o se ralentiza o prolonga el curso de tiempo de la evolución en comparación con la no administración de vectores de rAAV de la presente invención.

Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biológica molecular, virología, cultivo de células animales y bioquímica que están dentro de la técnica especialista. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "Current Protocols in Protein Science" (John E Coligan, et al. eds. Wiley and Sons, 1995); y "Protein Purification: Principles and Practice" (Robert K. Scopes, Springer-Verlag, 1994).

Vectores de rAAV para administración de antagonista de TNF

Esta invención proporciona vectores de AAV recombinantes (rAAV) para reducir los niveles de TNF en un sujeto. Esta reducción puede producirse en cualquier parte del cuerpo, tal como en un tejido o tejidos, un lugar anatómico particular y/o en la circulación. Estos vectores de rAAV comprenden un polinucleótido que codifica un antagonista de TNF, en el que el antagonista de TNF es un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular de TNFR p75 y un dominio constante y una molécula de inmunoglobulina.

Un vector de rAAV de esta invención comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido Resion en lugar de los genes rep y/o cap de AAV que normalmente componen la masa del genoma de AAV. No obstante, como en el genoma de AAV de tipo silvestre, el nucleótido está preferiblemente flanqueado por al menos una, más preferiblemente dos, repeticiones terminales invertidas de AAV (ITR). Se han descrito en la técnica variaciones en las que una construcción de rAAV está flanqueada solamente por una única ITR (típicamente modificada) y pueden emplearse junto con la presente invención.

Antagonistas de TNF

Un antagonista de TNF puede suministrarse a un individuo, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, junto con el rAAV de la invención. Un antagonista de TNF puede ser cualquier polipéptido que se une a TNF, incluyendo, pero sin limitación, un polipéptido TNFR y un anticuerpo anti-TNF.

El polipéptido de fusión codificado por el vector de rAAV de la invención se secreta por la célula que recibe el vector de rAAV. Preferiblemente, el antagonista de TNF es soluble (es decir, no está unido a la célula). Por ejemplo, los antagonistas de TNF solubles están desprovistos de una región transmembrana y se secretan a partir de la célula. Se conocen en la técnica procedimientos para identificar y eliminar secuencias polinucleotídicas que codifican dominios transmembrana.

Preferiblemente, el antagonista de TNF es un polipéptido TNFR. El polipéptido TNFR puede ser un TNFR intacto (preferiblemente de la misma especie que recibe el rAAV) o un fragmento adecuado de TNFR. La Patente de Estados Unidos Nº 5.605.690 proporciona ejemplos de polipéptidos TNFR, incluyendo polipéptidos TNFR solubles, apropiados para el uso en la presente invención. Preferiblemente, el polipéptido TNFR comprende un dominio extracelular de TNFR. Más preferiblemente, el polipéptido TNFR es un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular de TNFR unido a un dominio constante de una molécula de inmunoglobulina; aún más preferiblemente, el polipéptido TNFR es un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular del TNFR p75 unido a un dominio constante de una molécula de IgG1. Preferiblemente, cuando se contempla la administración a seres humanos, una Ig usada para proteínas de fusión es humana, preferiblemente, IgG1 humana.

Pueden usarse formas monovalentes y multivalentes de polipéptidos TNFR en la presente invención. Las formas multivalentes de polipéptidos TNFR poseen más de un sitio de unión a TNF. Las formas multivalentes de polipéptidos TNFR pueden estar codificadas en un vector de rAAV, por ejemplo, a través de la ligación repetida de polinucleótidos que codifican dominios de unión a TNF, estando cada repetición separada por una región enlazadora. Preferiblemente, el TNFR es una forma dimérica o bivalente de TNFR. Por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.690 y en Moler et al., 1993, J. Immunol., 151: 1548-1561, un polipéptido de anticuerpo quimérico con dominios extracelulares de TNFR sustituidos en lugar de los dominios variables de cualquiera o de ambas cadenas pesada o ligera de la inmunoglobulina proporcionaría un polipéptido TNFR. Generalmente, cuando dicho polipéptido quimérico TNFR:anticuerpo se produce por las células, forma una molécula bivalente a través de enlaces disulfuro entre los dominios de inmunoglobulina. Dicho TNFR:anticuerpo quimérico que comprende un dominio extracelular de polipéptido p75 se denomina TNFR:Fc. TNFR y un dominio constante de una inmunoglobulina.

La molécula polipeptídica de fusión se denomina sTNFR(p75):Fc. La secuencia polipeptídica de sTNFR(p75):Fc se representa en la Figura 1. La secuencia codificante para este antagonista de TNF se encuentra en el plásmido pCAVDHFRhuTNFRFc, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.690. Cualquier polinucleótido que codifique este polipéptido sTNFR(p75):Fc es adecuado para el uso en la presente invención. Una secuencia polinucleotídica que codifica sTNFR(p75):Fc se representa en la Figura 2.

Las secuencias polipeptídicas de TNFR adicionales incluyen, pero sin limitación, las indicadas en las Figuras 2 y 3 de la Patente de Estados Unidos Nº 5.395.760.

Pueden generarse polinucleótidos que codifican polipéptidos TNFR usando métodos conocidos en la técnica, a partir de secuencias polinucleotídicas de TNFR conocidas en la técnica.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos TNFR incluyen, pero sin limitación, secuencias polinucleotídicas de TNFR que se encuentran en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.395.760 y 5.605.690 y en las entradas del GenBank M32315 (TNFR humano) y M59378 (TNFR murino). Pueden sintetizarse polinucleótidos adecuados usando síntesis convencional y métodos recombinantes.

Se conocen en la técnica y se ejemplifican en la presente memoria métodos para la evaluar la actividad antagonista de TNF. Por ejemplo, la actividad antagonista de TNF puede evaluarse con un ensayo de unión competitiva basado en células. En dicho ensayo, se mezcla TNF radiomarcado con diluciones seriadas de antagonista de TNF y células que expresan TNFR unido a membrana celular. Se centrifugan porciones de la suspensión para separar el TNF libre del unido y se determina la cantidad de radiactividad en las fracciones libre y unida. Se evalúa la actividad antagonista de TNF por inhibición de la unión de TNF a las células en presencia del antagonista de TNF.

Como otro ejemplo, pueden analizarse antagonistas de TNF por la capacidad para neutralizar la actividad de TNF in vitro en un bioensayo que usa células susceptibles a la actividad citotóxica de TNF como células diana, tales como células L929 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3). En dicho ensayo, se tratan células diana cultivadas con TNF con cantidades variables de antagonista de TNF y, posteriormente, se examinan para determinar la citolisis. Se evalúa la actividad antagonista de TNF por una disminución en la citolisis de células diana inducida por TNF en presencia de antagonista de TNF.

La descripción también proporciona vectores de rAAV que comprenden un polinucleótido que codifica un antagonista interleuquina 1 (IL-1). La citoquina IL-1 se ha implicado como un mediador central tanto en las fases de enfermedad temprana como tardía de la RA (Joosten et al., 1996, Artritis Rheum. 39: 797-809). En la RA, la IL-1 parece estar implicada en la infiltración de células inflamatorias y en la destrucción de cartílago en la articulación afectada. Un ensayo clínico con un antagonista de IL-1 en pacientes con RA indicaba que el bloqueo de la actividad de IL-1 puede dar como resultado una mejoría de los síntomas de RA (Campion et al., 1996, Artritis Rheum. 39: 1092-1101; Bresnihan et al., 1996, Artritis Rheum. 39: S73). En un modelo de artritis murino, un tratamiento combinado con anti-TNF\alpha/anti-IL-1 condujo tanto a una inflamación disminuida como a daños en el cartílago articular disminuidos (Kuiper et al., 1998, Cytokine 10: 690-702).

Como IL-1 y TNF parecen mediar diferentes aspectos de la RA, la presente descripción proporciona vectores de rAAV que comprenden un polinucleótido que codifica un antagonista de TNF (tal como sTNFR(p75):Fc) y un antagonista de IL-1 (o el vector de rAAV comprende un polinucleótido que codifica un antagonista de TNF y un antagonista de IL-1). La presente descripción también proporciona vectores de rAAV que comprenden un polinucleótido que codifica un antagonista de IL-1. Preferiblemente, el antagonista de IL-1 es un receptor de IL-1 (IL-1R) o un polipéptido IL-1R (incluyendo un derivado o derivados biológicamente activos del mismo) que presenta la actividad biológica deseada (es decir, unión a IL-1). Preferiblemente, el IL-1R procede del IL-1R de tipo II.

Las secuencias polipeptídicas de IL-1R incluyen, pero sin limitación, las que se representan en la Figura 3 y las que se encuentran en la entrada del GenBank de IL-1R U74649 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.350.683.

Una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido IL-1R preferido se representa en la Figura 3. Pueden sintetizarse polinucleótidos adecuados usando síntesis convencional y métodos recombinantes.

Se conocen en la técnica métodos para evaluar la actividad antagonista de IL-1. Por ejemplo, puede evaluarse la actividad antagonista de IL-1 con un ensayo de unión competitivo basado en células, como se describe en la presente memoria para antagonistas de TNF. Como otro ejemplo, puede evaluarse la actividad antagonista de IL-1 por la capacidad para neutralizar la actividad de IL-1 in vitro en un bioensayo para IL-1. En dicho ensayo, se usa una línea celular (por ejemplo, EL-4 NOB-1) que produce interleuquina 2 (IL-2) en respuesta al tratamiento con IL-1. Esta línea celular sensible a IL-1 se usa en combinación con una línea celular sensible a IL-2 (por ejemplo, CTLL-2). La proliferación de la línea celular sensible a IL-2 es dependiente de la línea celular sensible a IL-1 que produce IL-2 y, por lo tanto, se usa como una medida de la estimulación de IL-1 de la línea celular sensible a IL-1. La actividad antagonista de IL-1 se evaluaría por su capacidad para neutralizar la actividad de IL-1 en dicho bioensayo de IL-1 (Gearing et al., 1991, J. Immunol. Methods 99: 7-11; Kuiper et al., 1998).

El vector o vectores de la invención pueden encapsidarse en una partícula viral de rAAV. Por consiguiente, la invención incluye una partícula viral de rAAV (recombinante porque contiene un polinucleótido recombinante) que comprende el rAAV de la invención. Se describen a continuación métodos de producción de dichas partículas.

La presente invención también proporciona composiciones que contienen cualquiera de los vectores de rAAV (y/o partículas virales de rAAV que comprenden los vectores de rAAV) y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones son especialmente útiles para la administración a individuos que pueden beneficiarse de una reducción en el nivel de TNF.

Generalmente, las composiciones de la invención para el uso en la reducción de los niveles de TNF comprenden una cantidad eficaz del vector de rAAV o la invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se conoce bien en la técnica, los excipientes farmacéuticamente aceptables son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz y pueden suministrarse como soluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones o como formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en un líquido antes del uso. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes y tampones. Se explican excipientes, así como formulaciones para administración de fármacos parenteral y no parenteral en Remington's Pharmaceutical Sciences 19ª Ed. Mack Publishing (1995).

Generalmente, estas composiciones de rAAV están formuladas para la administración por inyección (por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, etc.). Por consiguiente, estas composiciones se combinan preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución salina equilibrada de Ringer (pH 7,4), solución de dextrosa y similares. Aunque no es necesario, pueden suministrarse opcionalmente composiciones farmacéuticas en una forma de dosificación unitaria adecuada para la administración de una cantidad
exacta.

La invención también incluye el vector de rAAV de la invención (o composiciones que comprenden los vectores) para el uso en un método del cuerpo humano o animal mediante terapia, por ejemplo, puede usarse el vector de rAAV y composiciones para hacer frente a trastornos asociados con TNF, tales como afecciones inflamatorias (incluyendo artritis) o para reducir los niveles de TNF en un individuo. La invención proporciona además el uso del vector de rAAV de la invención (o composiciones que comprenden el vector) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de afecciones inflamatorias (incluyendo artritis). También se proporciona el uso de cualquiera de los vectores anteriores (o composiciones que comprenden los vectores) en la fabricación de un medicamento para reducir los niveles de actividad de TNF en un individuo.

Células hospedadoras que comprenden un rAAV de la invención

La presente invención también proporciona células hospedadoras de mamífero que comprenden un vector de rAAV de la invención.

Entre las células hospedadoras eucariotas están células de levaduras, insectos, aves, plantas y mamíferos. Por ejemplo, las células hospedadoras de mamíferos incluyen, pero sin limitación, células HeLa y 293, ambas de origen humano y ambas fácilmente disponibles.

El desarrollo de células hospedadoras capaces de expresar la secuencia del vector de rAAV proporciona una fuente establecida del material que se expresa a un nivel fiable. Los métodos y composiciones para introducir el vector de rAAV en la célula hospedadora y, después, para determinar si una célula hospedadora contiene el vector de rAAV se analizan en una sección posterior, se han descrito en la técnica y están ampliamente disponibles.

Se incluyen en estas realizaciones, y se analizan en una sección posterior, las denominadas "células productoras" usadas como una base para producir vectores de rAAV empaquetados.

Preparación del rAAV de la invención

Los vectores de rAAV de esta invención pueden prepararse usando métodos convencionales en la técnica. Son adecuados virus adenoasociados de cualquier serotipo, puesto que los diversos serotipos están funcionalmente y estructuralmente relacionados, incluso a nivel genético (véase, por ejemplo, Blacklow, págs. 165-174 de "Parvoviruses and Human Disease" J. R. Pattison, ed. (1998); y Rose, Comprehensive Virology 3: 1, 1974). Todos los serotipos de AAV presentan aparentemente propiedades de replicación similares mediadas por los genes rep homólogos; y en general todos llevan tres proteínas de la cápside relacionadas, tales como las expresadas en AAV2. El grado de relación se sugiere adicionalmente mediante el análisis de heterodúplex, que revela una gran hibridación cruzada entre serotipos a lo largo de la longitud del genoma; y la presencia de segmentos que hibridan consigo mismos análogos en los extremos terminales, que se corresponden con las ITR. Los patrones de infectividad similares también sugieren que las funciones de replicación en cada serotipo están bajo un control de regulación similar. Entre los diversos serotipos de AAV, el AAV2 es el que se emplea más comúnmente. Para una revisión general de la biología y la genética de AAV, véase, por ejemplo, Carter, "Handbook of Parvoviruses", Vol. I, págs. 169-228 (1989) y Bems, "Virology", págs. 1743-1764, Raven Press, (1990). Los principios generales de la construcción de vectores de rAAV se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3: 533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-129.

Como se ha descrito anteriormente, los vectores de rAAV de esta invención comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular de TNFR p75 y un dominio constante de una molécula de inmunoglobulina. Los vectores de rAAV también pueden codificar polipéptidos adicionales, tales como un receptor de IL-1 de tipo II. Como alternativa, los vectores de rAAV pueden comprender un polinucleótido heterólogo que codifica un antagonista de IL-1, tal como un IL-1R. Generalmente dichos polinucleótidos heterólogos serán de una longitud suficiente para proporcionar la secuencia codificante y la función deseada. Para la encapsidación en el interior de partículas de AAV, el polinucleótido heterólogo será preferiblemente de menos de aproximadamente 5 kb, aunque pueden emplearse otros serotipos y/o modificaciones para permitir que se empaqueten secuencias de mayor tamaño en las partículas virales de AAV. Por ejemplo, un polinucleótido preferido codifica un TNFR:Fc como se representa en la SEC ID Nº: 1, de aproximadamente 1,5 kb de longitud.

Puesto que se desea la transcripción del polinucleótido heterólogo en la célula diana deseada, puede unirse operativamente a su propio o a un promotor y/o potenciador heterólogo dependiendo, por ejemplo, del nivel y/o de la especificidad de la transcripción deseada dentro de la célula diana, como se sabe en la técnica. Diversos tipos de promotores y potenciadores son adecuados para el uso en este contexto. Por ejemplo, Feldhaus (solicitud de patente de Estados Unidos 09/171.75, presentada el 20 de octubre de 1998) describe una ITR modificada que comprende un promotor para regular la expresión de un rAAV. Los promotores constitutivos proporcionan un nivel continuo de transcripción génica y se prefieren cuando se desea que el polinucleótido terapéutico se exprese de forma continuada. Generalmente, los promotores inducibles o regulables presenta una actividad reducida en ausencia del inductor y están regulados positivamente en presencia del inductor. Pueden preferirse cuando se desea la expresión sólo en determinados momentos o en determinadas localizaciones, o cuando es deseable para valorar el nivel de expresión usando un agente inductor. Los promotores y potenciadores también pueden ser específicos de tejido, es decir, presentan su actividad sólo en determinados tipos celulares, presumiblemente debido a elementos reguladores de genes que se encuentran únicamente en esas células. Se conocen en la técnica dichos promotores y potenciadores específicos de tejidos. A modo de ilustración, un ejemplo de promotores específicos de tejidos incluye diversos promotores de miosina para la expresión en el músculo. Otro ejemplo de promotores y potenciadores específicos de tejidos son elementos reguladores para células y/o tipos tisulares que están en una articulación.

Los promotores y/o potenciadores inducibles o regulados preferidos incluyen los que son fisiológicamente sensibles, tales como los que son sensibles a señales y/o afecciones inflamatorias. Por ejemplo, el uso de promotores y/o potenciadores que se activan en respuesta a mediadores que dirigen brotes inflamatorios, incluyendo, pero sin limitación, los de genes de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF\alpha, IL-1\beta e IFN\gamma), darían como resultado la expresión de un antagonista de TNF durante el periodo de brote inflamatorio (Varley et al., 1998, Mol. Med. Todya 4: 445-451). La región promotora de TNF\alpha es de aproximadamente 1,2 kb y la secuencia se ha descrito por Takashiba et al., 1993, Gene, 131: 307-308.

Son ejemplos de promotores ilustrativos adicionales el promotor tardío de SV40 del virus de los simios 40, el elemento potenciador/promotor de poliedro de Baculovirus, la timidina quinasa de Herpes Virus Simple (HSV tk), el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV) y diversos promotores retrovirales, incluyendo elementos LTR. Los promotores inducibles adicionales incluyen promotores inducibles de iones metálicos pesados (tales como el promotor del virus del tumor mamario de ratón (mMTV) o diversos promotores de la hormona de crecimiento) y los promotores del fago T7 que son activos en presencia de ARN polimerasa de T7. Se conocen una gran diversidad de otros promotores y generalmente están disponibles en la técnica, y muchos de dichos promotores están disponibles en bases de datos de secuencias tales como la base de datos GenBank.

Como también se desea la traducción en la célula diana deseada, el polinucleótido heterólogo que codifica un antagonista de TNF comprenderá también preferiblemente elementos de control que faciliten la traducción (tal como un sitio de unión al ribosoma o "RBS" y una señal de poliadenilación). Por consiguiente, el polinucleótido heterólogo comprenderá generalmente al menos una región codificante unida operativamente a un promotor adecuado y también puede comprender, por ejemplo, un enlazador, un sitio de unión al ribosoma y una señal poli A unidos operativamente. El polinucleótido heterólogo puede comprender una región codificante o más de una región codificante bajo el control del mismo o de diferentes promotores. La unidad completa, que contiene una combinación de elementos de control y región codificante, se denomina con frecuencia casete de expresión.

Un polinucleótido heterólogo que codifica un antagonista de TNF se integra mediante técnicas recombinantes en o, preferiblemente, en lugar de la región codificante genómica del AAV (es decir, en lugar de los genes rep y cap de AAV), pero generalmente está flanqueado en cualquier lado por ITR de AAV. Esto significa que aparece una ITR tanto cadena arriba como cadena abajo de la secuencia codificante, en yuxtaposición directa, preferiblemente (aunque no necesariamente) sin ninguna secuencia intermedia de origen de AAV, para reducir la probabilidad recombinación que podría regenerar un genoma de AAV competente para la replicación ("RCA"). Pruebas recientes sugieren que una sola ITR puede ser suficiente para llevar a cabo las funciones normalmente asociadas con configuraciones que comprenden dos ITR (Patente de Estados Unidos 5.478.745) y, por lo tanto, pueden emplearse construcciones de vectores con una sola ITR junto con los métodos de empaquetamiento y producción descritos en la presente memoria. Se hace referencia al vector de rAAV resultante como "deficiente" en funciones de AAV cuando se delecionan del vector secuencias codificantes de AAV específicas.

Dados los límites del tamaño de encapsidación relativo de diversos genomas de AAV, la inserción de un polinucleótido heterólogo grande en el genoma requiere la eliminación de una porción del genoma de AAV, en particular, pueden eliminarse uno o más de los genes de empaquetamiento. En cualquier caso, es deseable la eliminación de uno o más genes de AAV, para reducir la probabilidad de generación de RCA. Por consiguiente, se eliminan preferiblemente secuencias codificantes o promotoras para rep, cap o ambas, puesto que las funciones proporcionadas por estos genes pueden proporcionarse en trans.

Los vectores de rAAV se proporcionan en una diversidad de formas, tales como en forma de plásmidos bacterianos, partículas de AAV, liposomas o cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones, la secuencia del vector de rAAV se proporciona en las células eucariotas transfectadas con el vector de rAAV.

Si se va usar el rAAV en forma de una partícula de rAAV empaquetada, existen al menos tres características deseables de una preparación de virus de rAAV para el uso en la transferencia de genes. En primer lugar, se prefiere que el virus de rAAV se genere a títulos suficientemente elevados para transducir una proporción eficaz de células en el tejido diana. Se requiere típicamente un número elevado de partículas virales de rAAV para la transferencia génica in vivo. Por ejemplo, algunos tratamientos pueden requerir un exceso de 10^{8} partículas. En segundo lugar, se prefiere que las preparaciones de virus de rAAV estén esencialmente libres de AAV competentes para la replicación (es decir, AAV fenotípicamente de tipo silvestre que puede replicarse en presencia de virus auxiliar o de funciones de virus auxiliar). En tercer lugar, se prefiere que la preparación de virus de rAAV como una totalidad este esencialmente libre de otros virus (tal como un virus auxiliar usado en la producción de AAV), así como de proteínas de virus auxiliar y celulares y otros componentes tales como lípidos e hidratos de carbono, de tal modo que se minimice o elimine cualquier riesgo de generar una respuesta inmune en el contexto de la transferencia génica. Este último punto es especialmente importante en el contexto del AAV, porque el AAV es un virus "dependiente de auxiliar" que requiere la coinfección con un virus auxiliar (típicamente adenovirus) u otro suministro de funciones de virus auxiliar para replicarse y empaquetarse eficazmente durante el proceso de producción de AAV; y, además, como se ha descrito anteriormente, se ha observado que los adenovirus generan una respuesta inmune del hospedador en el contexto de aplicaciones de transferencia génica (véase, por ejemplo, Le et al., 1997; Byrnes et al., 1995, Neuroscience, 66: 1015; McCoy et al., 1995, Human Gene Therapy, 6: 1553; y Barr et al., 1995, Gene Therapy, 2: 151).

Si un vector de rAAV se va empaquetar en una partícula de AAV para replicar y empaquetar el vector de rAAV, las funciones ausentes se complementan con un gen de empaquetamiento, o un pluralidad de los mismos, que juntos codifican las funciones necesarias para los diversos productos génicos de rep y/o cap ausentes. Preferiblemente, los genes de empaquetamiento o casetes génicos no están flanqueados por ITR de AAV y, preferiblemente, no comparten ninguna homología sustancial con el genoma de rAAV. Por lo tanto, para minimizar la recombinación homóloga durante la replicación entre la secuencia del vector y genes de empaquetamiento proporcionados por separado, es deseable evitar el solapamiento de las dos secuencias polinucleotídicas. El nivel de homología y la frecuencia de recombinación correspondiente aumentan con el aumento de la longitud de las secuencias homólogas y con su nivel de identidad compartida. El nivel de homología que planteará un problema en un sistema dado puede determinarse teóricamente y confirmarse experimentalmente, como se sabe en la técnica. Generalmente, sin embargo, puede reducirse sustancialmente o eliminarse la recombinación si la secuencia solapante es una secuencia de menos de aproximadamente 25 nucleótidos si tiene una identidad de al menos el 80% a lo largo de su longitud completa, o una secuencia de menos de aproximadamente 50 nucleótidos si tiene una identidad del al menos el 70% a lo largo de su longitud completa. Por supuesto, son preferibles niveles incluso inferiores de homología, puesto que reducirán adicionalmente la probabilidad de recombinación. Parece que, incluso sin ninguna homología solapante, existe cierta frecuencia residual de generación de RCA. Incluso reducciones adicionales en la frecuencia de generación de RCA (por ejemplo, mediante recombinación no homóloga) pueden obtenerse por "división" de las funciones de replicación y encapsidación de AAV, como se describe por Allen et al., en la solicitud de patente de Estados Unidos 08/769.728, presentada el 18 de diciembre 1996.

La construcción de vector de rAAV y las construcciones de genes de empaquetamiento complementarias pueden llevarse a cabo de varias formas diferentes. Partículas virales, plásmidos y células hospedadoras transformadas de forma estable pueden usarse todos para introducir dichas construcciones en la célula de empaquetamiento, de forma transitoria o estable.

Por lo tanto, puede usarse una diversidad de células genéticamente modificadas diferentes. A modo de ilustración, puede usarse una célula hospedadora de mamífero con al menos una copia intacta de un vector de rAAV integrado de forma estable. Un plásmido de empaquetamiento de AAV que comprende al menos un gen rep de AAV unido operativamente a un promotor puede usarse para suministrar las funciones de replicación (como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.658.776). Como alternativa, puede usarse una línea celular de mamífero estable con un gen rep de AAV unido operativamente a un promotor para suministrar las funciones de replicación (véanse, por ejemplo, Trempe et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.837.484; Burstein et al., documento WO 98/27207; y Jonson et al., Patente de Estados Unidos 5.658.785). El gen cap de AAV que proporciona las proteínas de encapsidación que se han descrito anteriormente, puede proporcionarse junto con un gen rep de AAV o por separado (véanse, por ejemplo las solicitudes y patentes mencionadas anteriormente, así como Allen et al. (documento WO 96/17947). Son posibles otras combinaciones.

Como se describe en la técnica y se ilustra en las referencias citadas anteriormente y en los ejemplos a continuación, puede introducirse material genético en células (tales como células "productoras" de mamíferos para la producción de rAAV) usando cualquiera de una diversidad de medios para transformar o transducir dichas células. A modo de ilustración dichas técnicas incluyen, pero sin limitación, transfección con plásmidos bacterianos, infección con vectores virales, electroporación, precipitación con fosfato de calcio e introducción usando cualquiera de una diversidad de composiciones basadas en lípidos (un proceso denominado con frecuencia "lipofección"). Se han descrito en la técnica y están ampliamente disponibles métodos y composiciones para realizar estas técnicas.

La selección de células convenientemente modificadas puede realizarse por cualquier procedimiento en la técnica. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas usadas para modificar la célula pueden introducirse simultáneamente con o unidas operativamente a uno o más marcadores de selección o de detección, como se sabe en la técnica. A modo de ilustración, se puede emplear un gen de resistencia a fármacos como marcador de selección. Después, las células resistentes a fármaco pueden seleccionarse y cultivarse y, después, ensayarse para determinar la expresión de la secuencia deseada (es decir, un producto del polinucleótido heterólogo). El ensayo para la adquisición, localización y/o mantenimiento de un polinucleótido introducido puede realizarse usando técnicas basadas en hibridación de ADN (tales como transferencia de Southern y otros procedimientos como se conocen en la técnica). El ensayo para la expresión puede realizarse fácilmente mediante análisis de Northern de ARN extraído de las células genéticamente modificadas o mediante inmunofluorescencia indirecta para el producto génico correspondiente. El ensayo y la confirmación de las capacidades y eficacias de empaquetamiento pueden obtenerse por introducción en la célula de los componentes funcionales de AAV restantes y un virus auxiliar para ensayar la producción de partículas de AAV. Cuando una célula se modifica de forma heredable con una pluralidad de construcciones polinucleotídicas, generalmente es más conveniente (aunque no esencial) introducirlas en la célula por separado y validar cada etapa en serie. Las referencias que describen dichas técnicas incluyen las citadas en la presente memoria.

En una estrategia para empaquetar vectores de rAAV en una partícula de AAV, la secuencia del vector de rAAV (es decir, la secuencia flanqueada por ITR de AAV) y los genes de empaquetamiento de AAV que se van a proporcionar en trans se introducen en la célula hospedadora en plásmidos bacterianos separados. Se describen ejemplos de esta estrategia en Ratschin et al., 1984; Mol. Cell. Biol., 4: 2072; Hermonat et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466, Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5: 3251; McLaughlin et al., 1988, J. Virol., 62: 1963: Lebkowski et al., 1988, Mol. Cell. Biol, 7: 349; Samulski et al., 1989; J. Virol., 63: 3822-3828; y Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 7: 349.

Una segunda estrategia es proporcionar la secuencia del vector de rAAV o los genes de empaquetamiento de AAV en forma de un plásmido episomal en una célula de mamífero usada para la replicación de AAV. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.173.414.

Una tercera estrategia consiste en proporcionar la secuencia del vector de rAAV o los genes de empaquetamiento de AAV, o ambos, integrados de forma estable en el genoma de la célula de mamífero usada para la replicación, como se ejemplifica en el Ejemplo 2 a continuación.

Una técnica ejemplar de esta tercera estrategia se resume en la solicitud de Patente Internacional 95/13365 (Targeted Genetics Corporation y Johns Hopkins University) y en la Patentes de Estados Unidos correspondiente 5.658.776 (por Flotte et al.). Este ejemplo usa una célula de mamífero con al menos una copia intacta de un vector de rAAV integrado de forma estable, en la que el vector comprende una ITR de AAV y un promotor de la transcripción unido operativamente a un polinucleótido diana, pero en la que la expresión de rep es limitante en la célula. Un plásmido de empaquetamiento de AAV que comprende el gen rep unido operativamente a un promotor heterólogo puede introducirse en la célula y, después, la célula puede incubarse en condiciones que permitan la replicación y el empaquetamiento de la secuencia del vector de rAAV en partículas.

Otra estrategia se resume en Trempe et al., Patente de Estados Unidos 5.837.484. Este ejemplo usa una línea celular de mamífero estable con un gen rep de AAV unido operativamente a un promotor heterólogo, de tal modo que sea capaz de expresar proteína Rep funcional. El gen cap de AAV puede proporcionarse también de forma estable o puede introducirse de forma transitoria (por ejemplo, en un plásmido). Un vector de rAAV también puede introducirse de forma estable o transitoria.

Otra estrategia se resume en la solicitud de patente WO 96/17947 (Targeted Genetics Corporation). Este ejemplo usa una célula de mamífero que comprende un gen cap de AAV integrado de forma estable y un gen rep de AAV integrado de forma estable unidos operativamente a un promotor heterólogo inducible por virus auxiliar. También se introduce en las células (de forma estable o transitoria) un plásmido que comprende la secuencia del vector de rAAV. El empaquetamiento del vector de rAAV en partículas se inicia después mediante la introducción del virus auxiliar.

Se describen métodos para conseguir preparaciones de virus rAAV de títulos elevado que estén sustancialmente libres de virus y/o proteínas virales o celulares contaminantes en Atkinson et al., en el documento WO 99/11764. Las técnicas que se describen en la presente memoria pueden emplearse para la producción a gran escala de preparaciones de partículas virales de rAAV. Otros métodos para preparar rAAV se describen en los documentos WO 00/14205, WO 99/20773 y WO 99/20779.

Estos diversos ejemplos abordan el tema de la producción de partículas virales de rAAV en un título suficientemente elevado, minimizando la recombinación entre el vector de rAAV y las secuencias que codifican componentes de empaquetamiento, reduciendo o evitando las dificultades potenciales asociadas con la expresión del gen rep de AAV en una línea celular de mamífero (puesto que las proteínas Rep no sólo pueden limitar su propia expresión, sino que también pueden afectar al metabolismo celular) y la producción de preparaciones de virus rAAV que estén sustancialmente libres de virus y/o proteínas virales o celulares contaminantes.

El empaquetamiento de un vector de AAV en partículas virales depende de la presencia de un virus auxiliar adecuado para AAV o del suministro de funciones de virus auxiliar. Se ejemplifican virus auxiliares capaces de apoyar la replicación del AAV mediante adenovirus, pero incluyen otros virus tales como herpesvirus (incluyendo, pero sin limitación, HSV1, citomegalovirus y HHV-6) y poxvirus (particularmente vaccinia). Puede usarse cualquiera de estos virus.

Frecuentemente, el virus auxiliar será un adenovirus de un tipo y un subgrupo que pueda infectar la célula hospedadora deseada. Se usan comúnmente adenovirus humanos del subgrupo C, particularmente los serotipos 1, 2, 4, 6 y 7. Generalmente se prefiere el serotipo 5.

Las características y patrones de crecimiento de adenovirus se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo Horowitz, "Adenoviridae and their replication", págs. 771-816 en "Fundamental Virology", Fields et al., eds. El genoma de adenovirus empaquetado es una molécula de ADN lineal unida a través de ITR de adenovirus en los extremos terminales izquierdo y derecho a través de un complejo proteico terminal para formar un círculo. Las regiones de control y codificantes para los componentes tempranos, intermedios y tardíos se solapan dentro del genoma. Los genes de la región temprana están implicados en la replicación del genoma de adenovirus y se agrupan dependiendo de su localización en las regiones E1, E2, E3 y E4.

Aunque no es esencial, en principio es deseable que la cepa de virus auxiliar sea defectuosa para la replicación en el sujeto que en última instancia va a recibir la terapia génica. Por lo tanto, cualquier virus auxiliar residual presente en una preparación de virus rAAV será incompetente para la replicación. Los adenovirus a los que se les ha eliminado la región E1A o tanto la región E1A como la E3 no son infecciosos para la mayoría de células humanas. Pueden replicarse en una línea celular permisiva (por ejemplo, la línea celular 293 humana) que sea capaz de complementar la actividad ausente. Se han identificado regiones de adenovirus que parecen estar asociadas con la función auxiliar, así como regiones que no lo están, y se han descrito en la técnica (véase, por ejemplo P. Colosi et. al., documento WO 97/17458 y las referencias citadas en el mismo).

Por ejemplo, como se describe en Atkinson et al., (documento WO 99/11764), también puede emplearse un virus auxiliar "sensible de forma condicionada" para proporcionar actividad de virus auxiliar. Dicha cepa de virus auxiliar debe tener como mínimo la propiedad de ser capaz de apoyar la replicación de AAV en una célula hospedadora bajo al menos un conjunto de condiciones, en las que él mismo no experimenta una replicación genómica eficaz. Cuando la actividad de virus auxiliar se suministra como partículas de virus intactas, generalmente también es necesario que el virus sea capaz de replicarse en una célula hospedadora bajo un segundo conjunto de condiciones. El primer conjunto de condiciones diferirá del segundo conjunto de condiciones por una característica fácilmente controlable, tal como la presencia o ausencia de un cofactor necesario (tal como un catión), la presencia o ausencia de un fármaco inhibidor o un cambio en una condición ambiental tal como la temperatura. Más convenientemente, la diferencia entre las dos condiciones es la temperatura y dicho virus sensible de forma condicionada se denomina, por lo tanto, virus auxiliar termosensible.

Puede prepararse virus auxiliar en cualquier célula que permita la replicación viral. Para adenovirus, las células preferidas incluyen células 293 y células HeLa. Es preferible emplear técnicas de cultivo que permitan un aumento en la densidad de siembra. Están disponibles variantes de células 293 y de células HeLa que se han adaptado al cultivo en suspensión. Son preferibles HeLa por razones de cultivo, viabilidad y morfología de las células suspensión. Estas células pueden cultivarse a una densidad suficiente (2 x 10^{6} por ml) para recuperar la velocidad de replicación menor de la cepa de adenovirus termosensible. Una vez establecidas, las células se infectan con el virus y se cultivan a la temperatura permisiva durante un periodo suficiente; generalmente, 3-7 días y, típicamente, aproximadamente
5 días.

Pueden encontrarse ejemplos de métodos útiles para la preparación, aislamiento y concentración de virus auxiliares en Atkinson et al. (WO 99/11764).

Varios criterios influyen en la selección de células para el uso en la producción de partículas de rAAV como se describe en la presente memoria. Como una cuestión inicial, la célula debe permitir la replicación y el empaquetamiento del vector de rAAV cuando se usa el virus auxiliar seleccionado. Sin embargo, puesto que la mayoría de las células de mamíferos pueden infectarse de forma productiva por AAV, y muchas pueden infectarse también por virus auxiliares tales como adenovirus, está claro que una gran diversidad de células de mamíferos y líneas celulares cumplen eficazmente estos criterios. Entre estas, las células y líneas celulares más preferidas son las que pueden cultivarse fácilmente en cultivo de tal modo que se facilite la producción a gran escala de preparaciones de virus de rAAV. De nuevo, sin embargo, muchas de dichas células cumplen eficazmente este criterio. Cuando se desee una producción a gran escala, la elección del método de producción también influirá en la selección de la célula hospedadora. Por ejemplo, como se describe en más detalle en Atkinson et al. (documento 99/11764) y en la técnica, algunas técnicas de producción y recipientes o cámaras de cultivo están diseñadas para el cultivo de células adherentes o unidas, mientras que otras están diseñadas para el cultivo de células en suspensión. En el último caso, la célula hospedadora estará preferiblemente adaptada o podrá adaptarse al crecimiento en suspensión. Sin embargo, incluso en el caso de células y líneas celulares que se consideran como adherentes o dependientes de anclaje, es posible derivar variantes adaptadas al cultivo en suspensión de una línea parental dependiente de anclaje, seleccionándose de forma seriada las células capaces de crecer en suspensión. Véase, por ejemplo, Atkinson et al. (documento 99/11764).

En última instancia, el virus auxiliar, la secuencia del vector de rAAV y todas las secuencias de AAV necesarias para la replicación y empaquetamiento deben estar presentes en la misma célula. Cuando se proporcionan uno o más genes de empaquetamiento de AAV de forma separada del vector, se proporciona una célula hospedadora que comprende: (i) uno o más genes de empaquetamiento de AAV, en la que dichos genes de empaquetamiento de AAV codifican una proteína de replicación o encapsidación de AAV; (ii) un polinucleótido heterólogo introducido en dicha célula hospedadora usando un vector de rAAV, en el que dicho vector de rAAV comprende dicho polinucleótido heterólogo flanqueado por al menos una ITR de AAV y es deficiente en dicho gen o genes de empaquetamiento de AAV; y (iii) un virus auxiliar o secuencias que codifican las funciones de virus auxiliar necesarias. Debe señalarse, sin embargo, que uno o más de estos elementos pueden combinarse en un solo replicón.

El virus auxiliar se introduce preferiblemente en el cultivo celular a un nivel suficiente para infectar la mayoría de las células en cultivo, pero de otro modo puede mantenerse en un mínimo para limitar la cantidad de virus auxiliar presente en la preparación resultante. Puede usarse una multiplicidad de infección o "MOI" de 1-100, pero típicamente es adecuada una MOI de 5-10.

De forma similar, si los genes de empaquetamiento y/o el vector de rAAV se introducen de forma transitoria en la célula de empaquetamiento (en oposición a introducirse de forma estable), preferiblemente se introducen a un nivel suficiente para modificar genéticamente la mayoría de las células en el cultivo. Las cantidades generalmente necesarias son del orden de 10 \mug por 10^{6} células, si se suministra como un plásmido bacteriano; o de 10^{8} partículas por 10^{5} células, si se suministra como una partícula de AAV. La determinación de una cantidad óptima es un ejercicio de titulación de rutina que está dentro de la técnica común del especialista.

Estos elementos pueden introducirse en la célula simultáneamente o secuencialmente en cualquier orden. Cuando la célula se modifica de forma heredable por cualquiera de los elementos, la célula puede seleccionarse y permitirse que prolifere antes de introducir el siguiente elemento.

En un ejemplo preferido, el virus auxiliar se introduce en último lugar en la célula para rescatar y empaquetar un vector de rAAV residente. La célula generalmente habrá suministrado ya genes de empaquetamiento de AAV en el grado necesario. Preferiblemente, el vector de rAAV o los genes de empaquetamiento y, más preferiblemente ambos, se integran de forma estable en la célula. Se apreciará fácilmente que son posibles otras combinaciones.

Una vez que la célula hospedadora se proporciona con los elementos necesarios, la célula se cultiva en condiciones que permitan la replicación de AAV para permitir la replicación y el empaquetamiento del vector de rAAV. El tiempo de cultivo se ajusta preferiblemente para corresponderse con los niveles de producción máximos y es típicamente de 3-6 días. Después, las partículas de rAAV se recogen y se aíslan de las células usadas para prepararlas.

Opcionalmente, las preparaciones de virus de rAAV pueden procesarse adicionalmente para enriquecer para partículas de rAAV, disminuir las partículas de virus auxiliar o hacerlas de otro modo adecuadas para la administración a un sujeto. Véase Atkinson et al., para técnicas ejemplares (documento WO 99/11764). Las técnicas de purificación pueden incluir centrifugación en gradiente isopícnico y técnicas cromatográficas. La reducción de actividad de virus auxiliar infeccioso puede incluir la inactivación por tratamiento térmico o mediante tratamiento de pH, como se sabe en la técnica. Otros procesos pueden incluir la concentración, filtración, diafiltración o mezcla con un tampón adecuado o un excipiente farmacéutico. Las preparaciones pueden dividirse en dosis unitarias y alícuotas multidosis para su distribución, que conservarán las características esenciales del lote, tales como la homogeneicidad de contenido antigénico y genético y la proporción relativa de virus auxiliar contaminante.

Se conocen en la técnica diversos métodos para la determinación del título infeccioso de una preparación viral. Por ejemplo, un método para la determinación del título es un ensayo de titulación de alto rendimiento que se proporciona en Atkinson et al. (documento WO 99/11764). Los títulos de virus determinados mediante este método rápido y cuantitativo se corresponden estrechamente con los títulos determinados por técnicas más clásicas. Además, sin embargo, este método de alto rendimiento permite el procesamiento y análisis al mismo tiempo de muchas reacciones de replicación viral y, por lo tanto, tiene otros muchos usos, incluyendo, por ejemplo, la selección de líneas celulares permisivas o no permisivas para la replicación y la infectividad viral.

Usos médicos del rAAV de la invención

La invención también proporciona el rAAV de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La administración de vectores de rAAV descritos en la presente memoria puede usarse para reducir los niveles de TNF en un sujeto. Dichos métodos pueden ser particularmente beneficiosos para individuos con un trastorno asociado con TNF. Los trastornos adecuados para estos métodos son los asociados con niveles elevados de TNF e incluyen, pero sin limitación, artritis (incluyendo RA), artritis psoriásica, enfermedades inflamatorias del intestino (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), asma, e insuficiencia cardiaca congestiva.

El nivel de TNF pueden ser niveles circulantes de TNF y/o niveles de TNF en un tejido y/o en un lugar anatómico particular. Se entiende que los niveles de TNF están reducidos cuando se comparan con los niveles de TNF de un sujeto antes de recibir un rAAV que codifica un antagonista de TNF o cuando se comparan con los niveles de TNF de un individuo que no recibe un rAAV que codifica un antagonista de TNF. Se entiende que los niveles de TNF se refieren a niveles de TNF libre (no formando complejos ni unido) o activo. Se describen a continuación métodos para detectar los niveles de TNF.

El vector de rAAV puede administrarse junto con la administración de un antagonista de TNF, tal como TNFR o anticuerpo anti-TNF. El antagonista de TNF, preferiblemente en composición con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables, puede administrarse por técnicas adecuadas incluyendo, pero sin limitación, vías intraarticular, intraperitoneal o subcutánea mediante inyección embolada, infusión continua o liberación sostenida de implantes. Como se analiza a continuación, el antagonista de TNF también puede administrarse directamente al tejido conectivo, particularmente en la articulación.

La invención también proporciona el uso del vector de rAAV de la invención (o composiciones que comprenden el vector de rAAV) en la fabricación de un medicamento para el uso en un método de reducción de la respuesta inflamatoria en un sujeto. Preferiblemente, se reduce una respuesta inflamatoria en un tejido conectivo, incluyendo, pero sin limitación, cápsula sinovial, cartílago, ligamento y tendón. Un lugar anatómico preferido para la reducción de una respuesta inflamatoria es una articulación afectada en un sujeto con artritis, tal como RA. Se entiende que una respuesta inflamatoria se reduce cuando se compara con una respuesta inflamatoria en un sujeto antes de recibir un rAAV que codifica un antagonista de TNF o cuando se compara con una respuesta inflamatoria en un individuo que no recibe un rAAV que codifica un antagonista de TNF.

La administración de vectores de rAAV descrita en la presente memoria (o composiciones que comprenden un vector o vectores de rAAV) puede usarse para paliar un trastorno asociado con TNF, incluyendo enfermedades inflamatorias tales como artritis (es decir, una afección artrítica) que aparecen en un sujeto. Preferiblemente, una afección artrítica se mitiga en una articulación, preferiblemente en tejido conectivo que incluye, pero sin limitación, cápsula sinovial, cartílago, ligamento y tendón. Se entiende que una afección artrítica se mitiga cuando se compara con una afección artrítica en sujeto antes de recibir el rAAV o cuando se compara con una afección artrítica en un individuo que no recibe el rAAV.

El vector de rAAV (o composiciones que comprenden un vector o vectores de rAAV) puede administrarse a una articulación artrítica de un mamífero, proporcionando de este modo una fuente del antagonista de TNF en el lugar de la inflamación.

El vector o vectores de rAAV (o composiciones que comprenden un vector o vectores de rAAV) pueden administrarse a un articulación artrítica de un mamífero, proporcionando una fuente del antagonista de TNF y una fuente del antagonista de IL-1 en el lugar de la inflamación. Preferiblemente, el vector de rAAV comprende un polinucleótido que codifica sTNFR(p75):Fc y un polinucleótido que codifica IL-1R.

Una fuente del antagonista de TNF y una fuente de antagonista de IL-1 pueden administrarse a una articulación artrítica de un mamífero en el lugar de inflamación a través de la administración de al menos dos vectores de rAAV diferentes (o composiciones que comprenden al menos dos vectores de rAAV diferentes). Preferiblemente, uno de los vectores de rAAV comprende un polinucleótido que codifica un TNFR y otro de los vectores de rAAV comprende un polinucleótido que codifica un IL-1R. En estos dos vectores de rAAV diferentes, los polinucleótidos heterólogos pueden estar unidos operativamente a promotores y/o potenciadores de la transcripción que son activos en condiciones similares o a promotores y/o potenciadores de la transcripción que son activos en condiciones diferentes, por ejemplo, regulados de forma independiente. En diversos perfeccionamientos de la administración, los dos vectores de rAAV diferentes (es decir, uno que comprende un polinucleótido que codifica un TNFR y uno que comprende un polinucleótido que codifica IL-1R) pueden administrarse al mamífero en el mismo momento o en momentos diferentes, a la misma o a frecuencias diferentes y/o en la misma o en cantidades diferentes.

Para cualquiera de los métodos anteriores, se entiende que pueden administrarse uno o más vectores de rAAV. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente, puede administrarse un vector que codifica un antagonista de TNF, tal como un receptor de TNF (más preferiblemente sTNFR(p75):Fc). Como alternativa, puede administrarse un vector adicional que codifica un antagonista de IL-1, tal como un polipéptido receptor de IL-1. Como alternativa, puede administrarse un solo vector que codifique tanto un antagonista de TNF como un antagonista de IL-1. Este único vector puede tener las secuencias codificantes bajo el control del mismo o de diferentes elementos reguladores de la transcripción. Si se usa más de un vector, se entiende que pueden administrarse en momentos y/o frecuencias iguales o diferentes.

Además, se entiende que, para cualquiera de los métodos anteriores, el individuo que recibe un vector o vectores de rAAV puede tener células que contengan el vector de rAAV (después de la administración) y, preferiblemente, células en las que el vector o vectores de rAAV esté integrado en el genoma celular. La integración estable de rAAV es una ventaja clara, puesto que permite una expresión más persistente que los vectores episomales. Por consiguiente, las células (es decir, al menos una célula) en el individuo pueden comprender rAAV integrado de forma estable. Expresado de forma alternativa, para cualquiera de los métodos anteriores, la administración de uno o más rAAV da como resultado la integración del o los rAAV en genomas celulares (aunque, como se entiende por los especialistas, no todos los vectores de rAAV necesitan integrarse). Se conocen bien en la técnica métodos de determinación y/o diferenciación de formas integradas frente a no integradas, tales como métodos de detección de Southern.

La administración de vectores de rAAV (preferiblemente empaquetados como partículas de AAV) puede ser por cualquiera de varias vías. Un modo preferido de administración es por administración intramuscular. La administración intramuscular de vectores de rAAV puede reducir los niveles de TNF tanto en el tejido como en los espacios intertisulares próximos al lugar de inyección y también en la circulación. Otro modo preferido de administración de las composiciones de rAAV es por administración intravenosa. Otro modo preferido de administración de composiciones de rAAV de la invención es por inyección de la composición o composiciones directamente en el tejido o lugar anatómico. Un modo preferido de dicha administración es mediante inyección intraarticular de la composición. Preferiblemente, la composición de rAAV se administra en la cápsula sinovial de la articulación afectada; más preferiblemente, en las células sinoviales que revisten el espacio articular. La administración a la articulación puede ser una administración única o repetida. La administración repetida será a intervalos adecuados, tales como aproximadamente cualquiera de los siguientes: una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses. Las administraciones repetidas también pueden producirse a intervalos variables.

Otro modo preferido de administración de composiciones de rAAV es a través de vías de administración nasofaríngea y pulmonar, incluyendo, pero sin limitación, por inhalación y vías transbronquial y transalveolar. La descripción incluye composiciones de rAAV adecuadas para la administración por inhalación que incluyen, pero sin limitación, diversos tipos aerosoles para inhalaciones, así como formas en polvo para sistemas de administración. Los dispositivos adecuados para la administración por inhalación de composiciones de rAAV incluyen, pero sin limitación, atomizadores y vaporizadores.

Una cantidad eficaz de rAAV (preferiblemente en forma de partículas de AAV) se administra dependiendo de los objetivos del tratamiento. Una cantidad eficaz puede administrarse en dosis únicas o divididas. Cuando un porcentaje reducido de transducción puede conseguir un efecto terapéutico, entonces generalmente el objetivo del tratamiento es satisfacer o superar este nivel de transducción. En algunos casos, este nivel de transducción puede lograrse por transducción de sólo aproximadamente el 1 al 5% de las células diana, pero más típicamente es de aproximadamente el 20% de las células del tipo tisular deseado, habitualmente al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos el aproximadamente el 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de las células del tipo tisular deseado.

Como guía, el número de partículas de rAAV administradas por inyección será generalmente de entre aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 1 x 10^{14} partículas, preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10^{7} y 1 x 10^{13} partículas, más preferiblemente entre aproximadamente 1 x 10^{9} y 1 x 10^{12} partículas y, aún más preferiblemente, de aproximadamente 1 x 10^{11} partículas.

El número de partículas de rAAV administradas por articulación mediante inyección intraarticular, por ejemplo, será generalmente de al menos aproximadamente 1 x 10^{8} y, más típicamente, es de aproximadamente 5 x 10^{8}, aproximadamente de 1 x 10^{10} y, en algunas ocasiones, de aproximadamente 1 x 10^{11} partículas, incluyendo partículas tanto resistentes a ADNasa como sensibles a ADNasa. En términos de partículas resistentes a ADNasa, la dosis será generalmente de entre aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 1 x 10^{14} partículas, más generalmente de entre aproximadamente 1 x 10^{8} y aproximadamente 1 x 10^{12} partículas.

El número de partículas de rAAV administradas por inyección intramuscular y por administración intravenosa, por ejemplo, será generalmente de al menos aproximadamente 1 x 10^{10} y, más típicamente, de aproximadamente cualquiera de los siguientes: 5 x 10^{10}, 1 x 10^{11}, 5 x 10^{11}, 1 x 10^{12}, 5 x 10^{12} y, en algunas ocasiones, de 1 x 10^{13} partículas, incluyendo partículas tanto resistentes a ADNasa como sensibles ADNasa. En términos de partículas resistentes a ADNasa, la dosis será generalmente de entre aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 1 x 10^{14} partículas, más generalmente, de entre aproximadamente 1 x 10^{10} y 1 x 10^{13} partículas.

La eficacia de administración de rAAV puede controlarse mediante varios criterios. Por ejemplo, muestras extirpadas por biopsia o escisión quirúrgica pueden analizarse mediante hibridación in situ, amplificación por PCR usando sondas específicas de vector y/o protección frente a ARNasa para detectar ADN de rAAV y/o ARNm de rAAV. Además, por ejemplo, el tejido recogido, el líquido articular y/o las muestras de suero pueden controlarse para determinar la presencia de antagonista de TNF codificado por el rAAV con inmunoensayos, incluyendo, pero sin limitación, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, inmunohistología y/o recuento de células inmunofluorescentes, o con bioensayos basados en función que dependen de la inhibición de la actividad de TNF mediada por antagonista de TNF. Por ejemplo, cuando el antagonista de TNF codificado por rAAV es un polipéptido TNFR, la presencia del TNFR codificado en muestras recogidas puede controlarse con un inmunoensayo de TNFR o un bioensayo basado en función dependiente de la inhibición mediada por TNFR de la destrucción por TNF de células L929 de ratón. Se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria ejemplos de dichos ensayos.

La administración de vectores de rAAV puede usar estrategias ex vivo para la administración de polinucleótidos al mamífero. Dichos métodos y técnicas se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.399.346. Generalmente, las células se transducen mediante los vectores de rAAV in vitro y, después, las células transducidas se introducen en el mamífero, por ejemplo, en una articulación artrítica. Se conocen por los especialistas en la técnica células adecuadas e incluyen células autólogas tales como células madre.

La eficacia de los métodos proporcionados en la presente memoria pueden controlarse, por ejemplo, por evaluación de los niveles relativos de TNF en un tejido, líquido articular y/o suero recogidos posteriormente a la administración de los vectores de rAAV descritos en la presente memoria. Se conocen en la técnica ensayos para evaluar los niveles de TNF e incluyen, pero sin limitación, inmunoensayos para TNF que incluyen, pero sin limitación, ensayos de inmunotransferencia y/o inmunoprecipitación y ensayos de citotoxicidad con células sensibles a la actividad citotóxica de TNF. Véase, por ejemplo, Khabar et al., 1995, Immunol. Lett. 46: 107-110.

El sujeto tratado también puede controlarse para las características clínicas que acompañan al trastorno asociado con TNF. Por ejemplo, pueden controlarse sujetos para la reducción de los síntomas asociados con la inflamación. Por ejemplo, después del tratamiento de RA en un sujeto, el sujeto puede evaluarse para determinar mejoras en varios parámetros clínicos incluyendo, pero sin limitación, hinchazón articular, dolor articular, rigidez matutina, dolor, velocidad de sedimentación de eritrocitos y proteína C reactiva.

La selección de una composición, régimen de dosificación (es decir, dosis, momento de la dosis y repetición) y vía de administración particular dependerá de varios factores diferentes incluyendo, pero sin limitación, la historia clínica del sujeto y características de la afección y del sujeto que se trate. La evaluación de dichas características y el diseño de un régimen terapéutico apropiado son, en última instancia, responsabilidad del médico que lo prescribe. El régimen de dosificación particular puede determinarse empíricamente.

La descripción anterior proporciona, entre otras, composiciones y métodos para reducir los niveles de TNF en un mamífero. Se entiende que pueden aplicarse variaciones a estos métodos por los especialistas en esta técnica.

Los ejemplos que se presentan a continuación se proporcionan como una guía adicional para un especialista en la técnica y no pretenden ser limitantes de ningún modo.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcciones de fusión de TNFR(P80):FC de rata y expresión de las mismas Clonación del dominio extracelular (ECD) de TNFR (p80) de rata

El ADNc que codifica el dominio extracelular (EDC) del TNFR p80 de rata (Tipo II) se aisló a partir de ADNc de bazo de rata MARATHON-READY (Clontech) usando 5' RACE PCR (Clontech) con un cebador de PCR específico de gen (5'-CTAACGACGTTAACGATGCAGGTGAC-3') (Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 8998-9002). Este cebador se seleccionó de la secuencia de 259 pb de la región citoplásmica del gen de TNFR (p80) de rata (Bader et al., 1996, J. Immunol. 157: 3089-3096). Se realizaron cinco reacciones de 5' RACE PCR separadas. Los productos de cada reacción de PCR se ligaron en un plásmido PCR 2.1 (Invitrogen Corporation) seguido de la transformación en células competentes TOP10F' usando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen Corporation). Un panel representativo de clones se secuenciaron completamente y se generó una secuencia consenso completa del ECD de TNFR (p80) de rata. La secuencia del ADNc y la secuencia de aminoácidos se representan en la Figura 1. Se llevaron a cabo alineamientos de secuencias de ADN y proteína usando el TNFR p80 murino y el TNFR p75 humano como secuencias de referencia. La Figura 2 representa un alineamiento de proteínas del ECD de TNFR p80 de rata, el ECD de TNFR p80 murino y el ECD TNFR p75 humano. El plásmido de ECD de TNFR (p80) de rata se denominó pCRrTNFR.ECD.

Clonación de la región Fc de IgG1 de rata

Se realizó una transcripción inversa del ARN poli(A) de bazo de rata con Oligo d(T)_{16} como cebador y el ADNc de Fc de IgG1 (incluyendo los dominios bisagra, CH2 y CH3) se amplificó posteriormente usando el GeneAmp &AElig; RNA PCR Kit (Perkin Elmer) (Figura 3). Se diseñaron cebadores de PCR basados en la secuencia de IgG1 de rata (GenBank RAT IGG1Z, nº de acceso M28670) (Bruggemann, 1988, Gene 74: 473-82). El cebador directo (región bisagra): 5'-cggaattcGTGCCCAGAAACTGTGGAG-3' incluía un sitio EcoR1 (en letras minúsculas). El cebador inverso (región CH3): 5'-gctctagaTCATTTACCCGGAGAGTGG-3' incluía un sitio XbaI. El producto de PCR se ligó en el ADN plasmídico pCR 2.1, seguido de transformación en células competentes TOP10F' usando el TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen Corporation). Se analizó un panel de clones mediante enzimas de restricción y análisis de secuencia. La secuencia del ADNc de la Fc de IgG1 de rata y la secuencia de aminoácidos correspondiente se representa en la
Figura 4. Se usó un clon para manipulaciones adicionales (véase a continuación) y se denominó pCRrIgG1Fc.

Generación de construcción de fusión de TNFR(p80)-Fc de rata y vector de expresión

Para facilitar la fusión del ECD de TNFR de rata con la región Fc de IgG1 (en la región bisagra), se usó PCR para introducir por ingeniería genética un sitio de restricción NotI en el extremo 5' y un sitio de restricción KpnI en el extremo 3' del ECD de TNFR. Para las reacciones de PCR, se usó un plásmido pCRrTNFR.ECD como molde, el cebador directo (p80-5 NotI) era 5'-CATAAGGGCCCGCAAGAGCGG GAGCTACCGCCG-3' y el cebador inverso (p80-3 KpnI) era 5'-GGTACCCCACCCGTGATGCTTGGTTCAATG-3'. De forma similar, se usó PCR para introducir por ingeniería genética un sitio de restricción KpnI en el extremo 5' de la Fc de IgG1 (en la región bisagra). Para éste, se usó pCRrIgG1Fc como molde, el cebador directo (5r IgG1 Fc) era 5'-GGGTACCCAGAAACTGTGGAGGT
GATTGC-3' y el cebador inverso (HBRATG1/3') era 5'-GCTCTAGATCATTTACCCGGAGAGTGG-3'.

El sitio de la fusión de secuencia se modeló de acuerdo con la proteína de fusión TNFR(p75):Fc humana (Mohler et al., 1993, J. Immunol. 151: 1548-1561). Los productos de PCR de ECD de TNFR y Fc de IgG1 se ligaron a través de sus sitios de restricción KpnI y se subclonaron en pCR 2.1. Se analizó un panel de clones mediante enzimas de restricción y análisis de secuencia. Se usó un plásmido con el polinucleótido de fusión (pCRrTNFR-Fc) para manipulaciones adicionales. La secuencia de nucleótidos del polinucleótido de fusión TNFR:Fc de rata y la secuencia de aminoácidos codificada se representan en la Figura 5.

Para construir un vector de expresión en mamíferos, se digirió el plásmido pCRrTNFR-Fc con la enzima de restricción NotI y se aisló y purificó un fragmento de ADN de 1,6 kb que contenía el gen de fusión de rTNFR-Fc. El plásmido de expresión de mamíferos pCMV\beta (Clontech) se digirió con NotI para eliminar el gen de la \beta-galactosidasa y se aisló y purificó el fragmento de la cadena principal de ADN plasmídico de 3,6 kb. El fragmento génico de rTNFR-Fc de 1,6 kb se ligó en la cadena principal del plásmido de 3,6 kb y el plásmido de expresión resultante se denominó pCMVrTNFR-Fc (se representa un esquema en la Figura 6).

Análisis de expresión de pCMVrTNFR-Fc

El plásmido de expresión pCMVrtTNFR-Fc (10 \mug) se transfectó en células 293A usando LIPOFECTAMINE (Life Tecnologies). Se incluyó una transfección simulada como control negativo. A las 48 horas después de la transfección, las células se recogieron y se extrajo el ARN celular total usando el Rneasy Mini Kit (Qiagen). Las muestras de ARN (10 \mug) se sometieron a análisis de transferencia de Northern usando una sonda marcada con ^{32}P específica de TNFR de rata. Una banda de 1,6 kb que se corresponde con el ARN de TNFR-Fc de rata estaba presente sólo en la muestra de ARN de las células transfectadas con pCMVrTNFR-Fc (Figura 7).

Para evaluar la expresión proteica del vector de expresión de TNFR-Fc de rata, se transfectaron células 293 en placas de 60 mm con 10 \mug de pCMVrTNFR-Fc o un plásmido de control (pCMVGFP) usando LIPOFECTAMINE (Life Technologies). También se incluyó una transfección simulada. A las 48 horas después de la transfección, las células se lavaron con PBS y se fijaron durante 10 min en metanol/acetona a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron con PBS, se incubaron con tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo con PBS y después se incubaron con anti-IgG1 de rata conjugado con fosfatasa alcalina (diluido 1:5000 en PBS) durante 1 hora a 37ºC. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con el sistema de detección de fosfatasa alcalina 1-STEP NBT/BCIP plus Suppressor (PIERCE) durante de 2 a 4 horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 2 Generación de vectores de rAAV y líneas celulares productoras Vectores de rAAV

Los principios de la construcción de vectores de rAAV siguen la genética del virus. Generalmente, los genes rep y cap de AAV se delecionan y las secuencias de ITR que actúan en cis se conservan en la construcción de un vector de rAAV. Las funciones de rep y cap pueden proporcionarse por una diversidad de estrategias incluyendo, pero sin limitación las basadas en transfecciones transitorias (véase, por ejemplo Samulski et al., 1989; Flotte et al., 1995, Gene Ther. 2: 29-37) y las basadas en líneas celulares estables (véase, por ejemplo, Clark et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6: 1329-1341; Tamayose et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7: 507-513) para permitir la generación de virus rAAV.

Construcción del plásmido vector de AAV pAAVCMVrTNFR-Fc

El ADN del plásmido de expresión pCMVrTNFR-Fc se digirió con las enzimas de restricción NotI y XbaI y el fragmento de ADN de 1,6 kb que contenía el gen de fusión de TNFR-Fc de rata se aisló y purificó. Un plásmido vector de rAAV, pAAVflagLUC, se digirió con las enzimas de restricción NotI y XbaI para eliminar el fragmento de ADN de marcador LUC y la cadena principal del vector de rAAV se aisló y se purificó. El fragmento génico de TNFR-Fc de rata de 1,6 kb se subclonó después en los sitios de restricción NotI y XbaI del plásmido vector de rAAV. El diagrama en la Figura 8 representa el vector de rAAV resultante, en el que el polinucleótido de fusión de TNFR-Fc de rata se localiza entre, y unido operativamente a, el promotor potenciador de CMV inmediato temprano humano y una señal de adición de poli(A) sintética. La unidad de transcripción que contiene el gen de fusión de TNFR-Fc está incluida entre las ITR de AAV-2. Este plásmido vector de rAAV se denominó pAAVCMVrTNFR-Fc.

Generación de una línea celular productora estable para AAVCMVrTNFR-Fc

Generalmente, se generan líneas celulares productoras de rAAV por transfección de las células con plásmido vector, seguida de selección con antibióticos (típicamente G418, higromicina o histidinol) y clonación de colonias individuales. Las colonias se exploran primero para la replicación del vector. Los clones que demuestran un nivel elevado de replicación del vector después de la infección con adenovirus se ensayan después para la producción del vector infeccioso.

Se transfectó plásmido pAAVCMVrTNFR-Fc (30 \mug) en la línea celular de empaquetamiento Hela C12 mediante electroporación (Potter et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7167-7165). La línea celular C12 contiene los genes rep y cap de AAV2 que son transcripcionalmente inactivos hasta la inducción tras la infección con auxiliar de adenovirus (Clark et al., 1995, Clark et al., 1996, Gene Therapy 3: 1124-1132). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en placas de 100 mm a densidades que variaban de 5 x 10^{3} a 5 x 10^{4} células por placa. Las células se sometieron a selección en DMEM que contenía suero fetal bovino al 10% e higromicina B 300 \mug/ml. Se aislaron los clones de células resistentes a fármaco, se expandieron y se ensayó su capacidad para producir vectores AAVCMVrTNFR-Fc infecciosos y se compararon en un ensayo de infectividad, como se describe en Atkinson et al., 1998, Nucleic Acid Res. 26: 2821-2823. Un clon celular productor de este tipo (C12-55) se usó adicionalmente para la producción de vector AAVCNVrTNFR-Fc. La producción, purificación y titulación se llevaron a cabo esencialmente como se describe en la presente memoria, y como se ha descrito en general en Atkinson et al., (documento WO 99/11764).

Ejemplo 3 TNFR-FC de rata como un antagonista de TNF Expresión de actividad de TNFR-Fc de rata después de la transfección con pCMVrTNFR-Fc

Se transfectaron células con el vector de expresión de TNFR-Fc de rata para determinar (1) si el TNFR-Fc de rata se secretaría a partir de las células y (2) si el TNFR-Fc de rata tenía la capacidad de neutralizar la actividad de TNF-\alpha.

Se transfectaron células 293 (2 x 10^{6}) en matraces T-75 con 10 \mug de pCMVrTNFR-Fc o pCMVGFP usando LlPOFECTAMINE (Life Technologies, Inc.). Después de 48 horas, el medio se recogió y se ensayó en un bioensayo de inhibición de TNF-\alpha de la forma siguiente. Se sembraron células WEHI-13var de fibrosarcoma de ratón (ATCC, CRL-2148) en microplacas de 96 pocillos a 4 x 10^{4} células por pocillo en 100 \mul de medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Después de una incubación durante una noche, se añadió actinomicina D (1 \mug/ml) y TNF-\alpha de rata recombinante (0,75 ng/ml; BioSource International, PRC 3014) a cada pocillo en un volumen total de 100 \mul. Se añadieron muestras de medio de las células 293 transfectadas en la primera fila de pocillos y se realizaron diluciones seriadas de dos veces por triplicado. Las células se incubaron durante una noche a 37ºC, suplementadas con CO_{2} al 5%. Al día siguiente, se añadieron 5 \mul de mezcla de marcaje XTT (Cell proliferation kit, Boehringer Mannheim, nº1-465-015) a cada pocillo y las células se incubaron a 37ºC durante 4 horas. Por último, la placa se colocó en un lector de placas Spectra MAX 250 (Molecular Devices) y se registró la absorbancia a 490 nm usando un programa informático de análisis Delta Soft. La absorbancia medida se correlaciona directamente con el número de células y, por lo tanto, con la proliferación celular en el ensayo. Si no se inhibe, el TNF-\alpha induce muerte celular en este ensayo.

Los resultados de un bioensayo de inhibición de TNF de este tipo se representan en la Figura 9 y demuestran que las células 293 transfectadas con pCMVrTNFR-Fc expresaban y secretaban la proteína de fusión TNFR-Fc de rata en el medio y que esta proteína TNFR-Fc inhibía la destrucción de células WEHI-13var por TNF-\alpha de una forma dependiente de la dosis. El medio de células 293 transfectadas con pCMVGFP parecía no tener efecto sobre la actividad de TNF-\alpha.

Actividad de TNFR-Fc de rata después de la transducción con AAVCMVrTNFR-Fc

Se infectaron células con las partículas de virus de rAAV para determinar si las células transducidas podían expresar y secretar TNFR-Fc de rata. El TNFR-Fc de rata producido a partir de las células transducidas también se ensayó para determinar la capacidad para actuar como un antagonista de TNF.

Se infectaron de forma simulada células 293 en una placa de 24 pocillos con un vector de AAV que contenía el gen LacZ (Clark et al., 1995; Clark et al., 1996) o con AAVCMVrTNFR-Fc a 10^{4} partículas por célula. Las células infectadas se mantuvieron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (1 ml por pocillo). Cuarenta y ocho horas después de la infección, los medios se recogieron y se analizaron muestras que variaban de 0,3125 \mul a 20 \mul en un ensayo de inhibición de TNF-\alpha, como se ha descrito anteriormente. Las células 293 transducidas con AAVCMVrTNFR-Fc, pero no las células transducidas con el vector que contenía el gen de LacZ (D6) ni las células con infección simulada, expresaban y secretaban un polipéptido TNFR-Fc con actividad neutralizante de TNF-\alpha (Figura 10).

En otro experimento, se infectaron de forma simulada o se infectaron con vector AAVCMVrTNFR-Fc células 293 a 10^{2}, 5 x 10^{2}, 10^{3}, 5 x 10^{3} y 10^{4} partículas por célula. A las 48 horas postinfección, los medios se recogieron y se sometieron a un ensayo de inhibición de TNF-\alpha como se ha descrito anteriormente. La proteína TNFR-Fc de rata se secretó a partir de células transducidas de una forma dependiente de la dosis (Figura 11). El análisis del curso de tiempo de expresión proteica de TNFR-Fc después de la transducción de células 293 con AAVCMVrTNFR-Fc a 10^{3} partículas por célula demostró un aumento continuo en la secreción de una proteína TNFR-Fc con actividad antagonista de TNF-\alpha durante 120 horas (Figura 12).

Ejemplo 4 Administración de vector rAAV a articulaciones

Se ha demostrado que los vectores de AAV median una administración génica eficaz y persistente en una diversidad de dianas tisulares in vivo. Estas dianas han incluido epitelio de vías respiratorias, vasos sanguíneos, músculo, hígado y sistema nervioso central. Véase, por ejemplo, Flotte et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 10613-10617; Lynch, et al., 1997, Circ. Res. 80: 497-505; Kessler et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14082-14087; Xiao et al., 1996, J Virol. 70: 8098-8108; Koeberl et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1426-1431; Snyder et al., 1997, Nat. Genet. 16: 270-276; y Kaplitt et al., 1994, Nat. Genet. 8: 148-154. En varios casos, la expresión de un transgén indicador administrado con un vector de rAAV se ha documentado durante más de un año. Estudios animales con el sistema de vector de AAV han demostrado en general escasa o ninguna patogenicidad o inmunogenicidad, al contrario que otros sistemas de vectores virales.

En un estudio piloto, a 5 ratas normales se les inyectaron en las articulaciones de las patas traseras 10^{11} partículas resistentes a ADNasa (DRP) de un rAAV que contenía el gen LacZ, rAAV-LacZ. La detección de la incorporación del vector de rAAV en el genoma se controlaría por la producción del polipéptido codificado LacZ, la \beta-galactosidasa. Las ratas se observaron durante 30 días para indicios de inflamación tales como enrojecimiento, hinchazón y dolor articular. No se observaron indicios de inflamación en estos animales, al contrario que en ratas a las que se les inyectó M. tuberculosis en adyuvante incompleto de Freund, que desarrollaban una inflamación manifiesta como indicaba la hinchazón, el enrojecimiento y el dolor articular.

Los animales se sacrificaron el día 30, las articulaciones se examinaron y se raspó el tejido articular para evaluar la expresión génica por lectura de la luminiscencia de la actividad \beta-galactosidasa. No se observó inflamación macroscópica, las articulaciones parecían idénticas a las articulaciones sin inyectar, al contrario que las ratas a las que se les inyectó adyuvante que presentaban una celularidad acusada. La medición de la luminiscencia mostró 52 x 10^{4} URL en la articulación inyectada con rAAV mientras que el nivel de fondo era de 3,5 x 10^{4} URL. A pesar del elevado fondo de la \beta-galactosidasa endógena descubierto en el tejido articular, los resultados de este experimento indican que los vectores de rAAV son capaces de transducir con éxito células que se encuentran en la articulación.

En resumen, los experimentos preliminares en ratas normales sugieren que los vectores de rAAV median la transducción de células que se encuentran en la proximidad del espacio articular después de una inyección intraarticular del vector.

Ejemplo 5 Administración del vector de rAAV en articulaciones en un modelo de artritis en roedor

Se realizó un estudio usando transferencia génica con vector de rAAV en el modelo de artritis por pared celular de estreptococos. El modelo de rata usado en estos estudios es un modelo aceptado en la técnica y aceptado por la FDA para el estudio de la artritis, y se usa para evaluar terapias anticitoquinas.

En este estudio, a ratas tratadas con una inyección intraperitoneal de pared celular de estreptococos del Grupo A para inducir artritis se les coadministró también una inyección intraarticular de 8,6 x 10^{9} DRP de vector rAAV-LacZ. Los animales se sacrificaron el día 5 después de la administración del vector. Las ratas que recibieron la preparación de pared celular de estreptococos desarrollaron artritis independientemente de la administración del vector rAAV-LacZ.

La tinción histoquímica para actividad \beta-galactosidasa dio como resultado la presencia de actividad \beta-galactosidasa (producto de reacción azul) en articulaciones tratadas con rAAV-LacZ (Figuras 13 y 14) pero no en articulaciones tratadas con control (Figura 15). Se observaron células de azul muy oscuro a negras en la cápsula sinovial de animales tratados con rAAV-LacZ y se localizaban células de un azul más claro en el estroma óseo subyacente al espacio articular. En este momento, ni el cartílago ni el hueso esponjoso parecían estar transducidos por el vector.

En resumen, los experimentos preliminares en un modelo de artritis en rata sugieren que los vectores de rAAV median la transducción de células que se encuentran en la proximidad del espacio articular después de una inyección intraarticular del vector.

Ejemplo 6 Terapia génica con vector rAAV-TNFR:FC de rata en un modelo de artritis en roedor

Vectores. Se produjeron vectores AAV-TNFR:Fc de rata recombinante (véanse los ejemplos anteriores) y AAV-EGFP a partir de sus correspondientes líneas celulares productoras HeLa C12 estables, C12/AAV-TNFR:Fc de rata y C12/AAV-EGFP, respectivamente. El AAV-EGFP codifica la proteína verde fluorescente potenciada desplazada hacia el rojo (EGFP) de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria (Heim et al., 1995, Nature 373: 663-664; Cormack et al., 1996, Gene 173: 33-38). Este casete génico incluye un potenciador/promotor inmediato temprano (IE) de CMV y una señal de poliadenilación (poli A) de la hormona del crecimiento bovino (BGH). Se incluyó en los experimentos como control de vector (gen no relacionado). Las células se cultivaron en fábricas de células y los vectores se produjeron a partir de lisados preparados 3 días después de la infección con auxiliar Ad5 (moi 10). Los lisados se microfluidificaron a través de un orificio de calibre 18 G (1,219 mm) a 10.000 PSI. Después, el vector se separó en bandas mediante centrifugación en gradiente de CsCl, se dializó y se purificó adicionalmente a través de una columna PI. Por último, la masa del vector purificado se dializó contra solución salina tampón de Ringer (RBSS) más glicerol al 4%, se esterilizó por filtración, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC. Se determinaron los títulos de partículas resistentes a ADNasa I (DRP) mediante análisis de transferencia por ranuras y eran de 7,6 x 10^{11} DRP/ml y 2,8 x 10^{12} DRP/ml para los vectores AAV-TNFR:Fc de rata y AAV-EGFP, respectivamente. Clark, et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1329-1341. Se determinaron los títulos infecciosos mediante ensayos de centro infeccioso y eran de 1 x 10^{10} u.i./ml y 5,2 x 10^{9} u.i./ml para los vectores AAV-TNFR:Fc de rata y AAV-EGFP, respectivamente. Yakobson et al., 1987, J. Virol. 61: 972-981; Zolotukhin et al., 1999, Gene therapy 6: 973-985.

Modelo de artritis inducida por SCW. En este modelo de artritis experimental, la enfermedad se inició mediante una sola inyección intraperitoneal (i. p.) de peptidoglicano-polisacárido de SCW del Grupo A (PG-APS) (30 \mug/g peso corporal) (Lee Laboratories Inc., Grayson, GA) en ratas Lewis hembra genéticamente susceptibles de 4 semanas de edad (100 g) (Charles River. Breeding Laboratories, Wilmington, MA) (Cromartie, et al., 1977, J. Exp. Med. 146: 1585-1602). Típicamente este modelo presenta una poliartritis bifásica periférica y simétrica con ciclos de reaparición exacerbada y remisión y es clínicamente e histológicamente similar a la RA (Cromartie, et al., 1977). Se desarrolló una inflamación aguda de los tobillos traseros en 24-48 horas que persistió durante 4-5 días y después se resolvía parcialmente. Esta respuesta inflamatoria agua con predominancia de neutrófilos se siguió después de una inflamación crónica espontáneamente reactivante a aproximadamente el día 15, que evolucionó a una sinovitis erosiva progresiva crónica. Además de la poliartritis, este modelo de PG-APS inducía una inflamación granulomatosa crónica del hígado y del bazo. La gravedad de la artritis (índice articular, AI) se determinó por puntuación de cada tobillo en base al grado de hinchazón, eritema y deformación en una escala de 0-4 y suma de las puntuaciones para todas las extremidades.

Inyecciones intramusculares e intraarticulares. Las ratas se anestesiaron con isofluorano (al 5% con O_{2} para inducción y al 3% para mantenimiento). Se inyectaron veinte microlitros de los vectores AAV-TNFR de rata o AAV-EGFP (2 x 10^{10} DRP) o un volumen equivalente de RBSS más glicerol al 4% (vehículo) en la articulación del tobillo trasero usando una aguja de calibre 30 G (0,3 mm) adaptada a una jeringa Hamilton. Se llevaron a cabo inyecciones intramusculares de vehículo o vectores de AAV recombinantes (1,2 x 10^{11} DRP en 150 \mul) usando una aguja de calibre 25 G (0,508 mm).

Bioensayo de TNFR:Fc. Se recogieron muestras de sangre (300 \mul) de la vena de la cola antes (extracción de sangre previa) y 5 (fase aguda), 11 (remisión) y 33 (fase crónica) días después de la inyección de SCW. Se ensayaron muestras de suero (50 \mul) para proteína de fusión de TNFR:Fc de rata bioactiva en un bioensayo de TNF-\alpha convencional adaptado para estudios de inhibición (Khabar et al., 1995, Immunol. Lett. 46: 107-110). En este ensayo, se determinó la inhibición de la destrucción mediada por TNF-\alpha (750 pg/mL) de células WEHI-13VAR sensibles mediante TNFR:Fc de ratas soluble por aumento de la absorbancia a DO490 nm.

Resumen. Se evaluó una terapia génica con vector AAV-TNFR:Fc de rata en un modelo de artritis experimental en rata. Se empleó el modelo de artritis inducida por pared celular de estreptococos (SCW) en ratas Lewis para evaluar el efecto de la administración de vector AAV-TNFR:Fc de rata en la gravedad de la artritis tanto en las articulaciones ipsilaterales como contralaterales.

La inyección intraperitoneal de SCW se siguió de una sola administración intraarticular de 2 x 10^{10} partículas resistentes a ADNasa I (DRP) de vector AAV-TNFR:Fc de rata en ambas articulaciones de los tobillos traseros dio como resultado una reducción significativa de la hinchazón de las patas traseras medida mediante las puntuaciones del índice de artritis (Al). Además, la inyección intraperitoneal de SCW seguida de la administración de vector AAV-TNFR:Fc de rata en una sola articulación también dio como resultado una reducción significativa de la hinchazón de la pata en la articulación contralateral. Una sola administración intramuscular de 1,2 x 10^{11} DRP de vector AAV-TNFR:Fc de rata dio como resultado un efecto similar. Como se esperaba, la inyección intraperitoneal de SCW seguida de la administración intraarticular o intramuscular de un vector de AAV que codifica un casete de expresión génica no relacionado (AAV-EGFP) no empeoró la inflamación articular pero tampoco dio como resultado ningún efecto terapéutico. La proteína TNFR:Fc de rata bioactiva era fácilmente detectable el día 33 en muestras de suero de ratas inyectadas por vía intramuscular con vector AAV-TNFR:Fc de rata. Por el contrario, los niveles de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva en suero de ratas que recibieron inyecciones por vía intraarticular no eran significativamente diferentes de los de ratas de control (ratas tratadas con RBSS o AAV-EGFP), sugiriendo que la administración local de vector AAV-TNFR:Fc de rata no conduce a una exposición sistémica significativa de este antagonista de TNF-\alpha.

Resultados. Los experimentos descritos a continuación se llevaron a cabo usando el modelo de artritis inducida por SCW del grupo A en ratas. Se dividieron un total de 65 ratas Lewis hembra de cuatro semanas de edad en 3 grupos y se trataron de la forma siguiente:

Grupo 1

N = 8, día 0: SCW (i. p.) y AAV-TNFR:Fc de rata (intraarticular, ambos tobillos traseros; 2 x 10^{10} DRP/articulación)

N = 8, día 0: SCW (i. p.) y AAV-TNFR:Fc de rata (intraarticular, una articulación de tobillo trasero; 2 x 10^{10} DRP/articulación)

N = 4, día 0: SCW (i. p.) y AAV-TNFR:Fc de rata (intramuscular; 1,2 x 10^{11} DRP/músculo)

N = 6, día 0: SCW (i. p.) y AAV-EGFP (intraarticular, ambos tobillos traseros; 2 x 10^{10} DRP/articulación)

N = 4, día 0: SCW (i. p.) y AAV-EGFP (intramuscular; 1,2 x 10^{11} DRP/músculo)

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo 2

N = 4, día 0: SCW (i. p.) y RBSS (intraarticular, ambos tobillos traseros)

N = 5, día 0: SCW (i. p.)

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo 3

N = 4, día 0: AAV-TNFR:Fc de rata (intraarticular, ambos tobillos traseros; 2 x 10^{10} DRP/articulación)

N = 4, día 0: AAV-TNFR:Fc de rata (intramuscular; 1,2 x 10^{11} DRP/músculo)

N = 4, día 0: AAV-EGFP (intraarticular, ambos tobillos traseros; 2 x 10^{10} DRP/articulación)

N = 4, día 0: AAV-EGFP (intramuscular; 1,2 x 10^{11} DRP/músculo)

N = 3, día 0: RBSS (intraarticular, ambos tobillos traseros).

Las ratas se inspeccionaron diariamente para el comienzo y la evolución de la enfermedad y se registró la gravedad de la artritis (Al) cada 2 a 3 días. La Figura 19 muestra que la inyección intraperitoneal de una dosis artritogénica (30 pg/g de peso corporal) de SCW el día 0 sola o en combinación con la administración intraarticular de RBSS en ambas articulaciones de los tobillos traseros dio como resultado una respuesta inflamatoria aguda típica que alcazaba su máximo el día 4 (Al medio = 6) y después disminuía hasta su mínimo el día 11 (Al medio = 2). La remisión se seguía de una reaparición de la hinchazón articular que tenía una meseta el día 22 (Al medio = 7) y permanecía crónica hasta que los animales se sacrificaban (día 35). Como se esperaba, la inyección intraperitoneal de SCW seguida de una sola administración intraarticular de 2 x 10^{10} DRP de vector AAV-TNFR:Fc de rata en ambas articulaciones de los tobillos traseros no tenía un efecto significativo sobre la hinchazón articular durante la fase aguda. Por el contrario, el efecto de los últimos tratamientos dio como resultado una reducción significativa de la hinchazón de las patas traseras durante la fase crónica, como se midió por la puntuaciones de AI (Al medio = 2). De forma interesante, la administración de vector AAV-TNFR:Fc de rata en una articulación producía efectos terapéuticos significativos y similares tanto en la articulación ipsilateral como en la contralateral (véase también la Figura 20). La Figura 20 muestra que los animales recibieron inyecciones por vía intraperitoneal con SCW (30 \mug/g peso corporal) el día 0 seguidas de una sola administración de AAV-TNFR:Fc de rata (total de 2 x 10^{10} DRP) en la articulación del tobillo trasero izquierdo. Las puntuaciones de AI para cada pata de tobillo trasero se registraron por separado. Una sola administración intramuscular de 1,2 x 10^{11} DRP de vector AAV-TNFR:Fc de rata después de la inyección intraperitoneal de SCW dio como resultado un efecto similar. La inyección intraperitoneal de SCW seguida de la administración intraarticular o intramuscular de un vector de AAV que codificaba el gen verde fluorescente (AAV-EGFP) no empeoró la inflamación articular, pero tampoco dio como resultado ningún efecto terapéutico. Por último, la administración de AAV-TNFR:Fc de rata o AAV-EGFP en articulaciones de rata sin tratamiento previo no induce una hinchazón articular visible. A partir de este experimento se concluyó que la administración de vector AAV-TNFR:Fc de rata, pero no de AAV-EGFP, en la articulación o en el músculo da como resultado la producción de niveles terapéuticos de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva soluble que se une e inhibe significativamente la actividad inflamatoria de TNF-\alpha. Aunque la administración de vector AAV-EGFP no dio como resultado ningún efecto terapéutico, no empeoró el proceso inflamatorio en las articulaciones afectadas y no indujo inflamación en las articulaciones de animales sin tratamiento previo, indicando que la administración local de vector de AAV recombinante en la articulación es segura. Una posible explicación para el efecto contralateral observado es que la expresión del gen de TNFR:Fc de rata en tejido articular transducido conduce a la secreción de esta proteína en la circulación, que después accede a las articulaciones inflamadas no inyectadas. Para ensayar esta hipótesis, se ensayaron muestras de suero de animales tanto sin tratamiento previo como tratados con SCW para proteína TNFR:Fc de rata bioactiva en un bioensayo de inhibición de TNF-\alpha (Khabar et al., 1995), después de la administración de AAV-TNFR:Fc de rata en la articulación o en el músculo. Las Figuras 21 y 22 muestran que la proteína TNFR:Fc de rata bioactiva era fácilmente detectable el día 33 después de la administración intramuscular del vector AAV-TNFR:Fc de rata. Por el contrario, los niveles circulantes de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva de animales inyectados por vía intraarticular eran reducidos y no significativamente diferentes de los de animales de control (ratas tratadas con AAV-EGFP o RBSS). Se concluyó que es poco probable que el efecto contralateral se deba a la secreción y a la distribución sistémica de la proteína TNFR:Fc de rata.

Discusión. Se describe en la presente memoria un estudio in vivo usando una modelo de artritis aceptado en la técnica que tiene como objetivo evaluar la administración génica de TNFR:Fc mediada por AAV recombinante para el tratamiento de una enfermedad articular inflamatoria. Se empleó el modelo de artritis inducida por SCW en ratas para evaluar el efecto terapéutico de la administración local (intraarticular) y sistémica (intramuscular) de vector AAV-TNFR:Fc de rata sobre la gravedad de artritis.

Los resultados demuestran que la administración intraarticular de vector AAV-TNFR:Fc de rata reducía significativamente la gravedad de la artritis inducida por SCW en ausencia de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva detectable en la circulación. La administración intramuscular de vector AAV-TNFR:Fc de rata también era eficaz en la reducción de los síntomas de artritis y, como se esperaba, la proteína TNFR:Fc de rata bioactiva era fácilmente detectable en el suero.

La administración de AAV-TNFR:Fc de rata o AAV-EGFP en las articulaciones de ratas sin tratamiento previo no inducía una respuesta inflamatoria detectable en las patas inyectadas y la administración intraarticular de vector AAV-EGFP en ratas tratadas con SCW no empeoró la enfermedad articular inflamatoria, indicando que la administración local intraarticular de vectores de AAV recombinantes es segura.

De forma interesante, una sola administración de este vector en una articulación dio como resultado un efecto terapéutico similar tanto en la articulación ipsilateral como en la contralateral no inyectada. El fenómeno de un efecto terapéutico contralateral se describió por primera vez por Ghivizzani et al. (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95: 4613-4618), que señaló que la administración adenoviral de receptor de interleuquina 1 soluble (IL-1sR) en una articulación de la rodilla de conejos con artritis bilateral inducida por antígeno suprimía la enfermedad tanto en la rodilla ipsilateral como en la contralateral no inyectada. Un fenómeno similar se ha observado en este modelo usando el gen de la interleuquina 10 viral (vIL-10) (Lechman, 1999, MS Thesis, University of Pittsburgh). Además, la administración adenoviral de vIL-10 en las patas de ratones con artritis inducida por colágeno (CIA) (Whalen et al., 1999, J Immunol. 162: 3625-32) y la administración de IkB en las articulaciones de los tobillos de ratas con artritis inducida por SCW (Miagkov et al., 1998, Proc. Natl. Acad Sci. USA 95: 13859-13864) también suprimía la enfermedad en las articulaciones no inyectadas del mismo animal. Una posible explicación para este efecto contralateral es que la expresión del gen TNFR:Fc de rata en tejido articular transducido conduce a la secreción de esta proteína a la circulación que, después, accede a las articulaciones inflamadas no inyectadas. Los resultados indican que es poco probable que el efecto contralateral se deba a la secreción y distribución sistémica de la proteína TNFR:Fc de rata. Estos resultados también coinciden con los Ghivizzani et al. (1998), que descartó la posibilidad de que el producto génico o incluso el vector adenoviral viajaran a las otras articulaciones a través de la circulación sistémica o la circulación linfática. Por lo tanto, los resultados concuerdan más probablemente con un modelo que sugiere que la introducción directa de genes en una articulación artrítica conduce a la transducción de células con la capacidad de viajar a otras articulaciones (Ghivizzani et al., 1998).

Los niveles circulantes de proteína TNFR:Fc de rata bioactiva en animales sin tratamiento previo (inyectados por vía intramuscular con vector AAV-TNFR:Fc de rata) eran significativamente mayores que en los animales tratados con SCW correspondientes. La posible explicación para esta diferencia es que en animales tratados con SCW, los niveles de TNF-\alpha son considerablemente mayores que en animales sin tratamiento previo, como resultado del proceso inflamatorio sistémico en curso. En estos animales enfermos, las moléculas de TNF-\alpha están más probablemente uniéndose a y neutralizándose por moléculas proteicas de TNF:Fc solubles y no pueden detectarse en el bioensayo.

Ejemplo 7 Vector de rAAV para la coadministración de antagonista de TNF y antagonista de IL-1

Un polinucleótido que codifica un polipéptido TNFR:Fc (como se describe en la presente memoria) se clona en un plásmido vector de rAAV, como se describe en el Ejemplo 2, para generar un plásmido rAAVTNFR:Fc. Un polinucleótido que codifica un IL-1R, entrada de GenBank U74649, se clona en el plásmido rAAVT-NFR:Fc. Tanto la secuencia codificante de TNFR:Fc como la secuencia codificante de IL-1 R están unidas operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción y ambas se incluyen entre la ITR de AAV. Este plásmido vector de rAAV se denomina pAAVTNFR:FcIL-1R.

Se generan líneas celulares productoras de rAAV por transfección de las células con el plásmido pAAVTNFR:FcIL-1R, como se describe en el Ejemplo 2. Las partículas de vector de rAAV se preparan como se describe en la presente memoria. Las expresión de la actividad de TNFR:Fc y de la actividad de IL-1R después de la transducción de las células con partículas virales de rAAVTNFR:FcIL-1R se evaluó usando métodos descritos en la presente memoria. Se describe un bioensayo de IL-1 en Kuiper et al., 1998.

El efecto de la administración de partículas virales de rAAVTNFR:FcIL- 1R se evalúa en el contexto de un modelo animal de artritis. Se administran partículas virales de rAAV por diferentes vías incluyendo inyecciones intraarticulares, intramusculares e intravenosas. La evaluación del tratamiento incluye la determinación de la inflamación y de la destrucción de cartílago en las articulaciones.

Claims (22)

1. Un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral p75 (TNFR) y un dominio constante de una molécula de inmunoglobulina.

2. El vector de rAAV de la reivindicación 1, en el que la molécula de inmunoglobulina es una IgG1.

3. El vector de rAAV de la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido de fusión está codificado por un polinucleótido unido operativamente a un promotor heterólogo.

4. El vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido de fusión está codificado por un polinucleótido unido operativamente a un promotor constitutivo.

5. El vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido de fusión está codificado por un polinucleótido unido operativamente a un promotor inducible.

6. El vector de rAAV de la reivindicación 5, en el que el promotor inducible es del gen de TNF-\alpha.

7. El vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una repetición terminal invertida de AAV.

8. El vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende dos repeticiones terminales invertidas de AAV.

9. El vector de rAAV de la reivindicación 7 u 8, en el que se modifica la repetición terminal de AAV o una de las repeticiones terminales invertidas de AAV.

10. Una célula de mamífero transfectada con el vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Una composición que comprende el rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Una partícula viral de rAAV que comprende el vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Un vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

14. Uso de un vector de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la fabricación de un medicamento para el uso en un método para reducir una respuesta inflamatoria o tratar un trastorno inflamatorio en un mamífero.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que la respuesta inflamatoria se produce en un tejido conectivo.

16. El uso de la reivindicación 14, en el que la respuesta inflamatoria se produce en una articulación.

17. El uso de la reivindicación 16, en el que el medicamento es para la administración en la articulación contralateral a la articulación en la que se produce la respuesta inflamatoria.

18. El uso de la reivindicación 14, en el que el trastorno inflamatorio es una afección artrítica.

19. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el medicamento comprende un antagonista de TNF o en la que el medicamento se administra junto con la administración de un antagonista de TNF.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que el antagonista de TNF comprende un dominio extracelular de TNFR, un dominio de unión a TNF de TNFR o un anticuerpo anti-TNF.

21. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en el que el medicamento es para la administración mediante inyección intraarticular, inyección intravenosa o inyección intramuscular.

22. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en el que el medicamento es para la administración a un tejido conectivo seleccionado de una cápsula sinovial, un cartílago, un ligamento y un tendón de dicho mamífero o a células sinoviales que revisten un espacio articular de dicho mamífero.