JP2001520047A

JP2001520047A - 組換えａａｖベクターと共に使用するための転写活性化された逆方向末端反復（ｉｔｒ）

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Publication number: JP2001520047A
Application number: JP2000517093A
Authority: JP
Inventors: アンドリューエル．フェルダウス，
Original assignee: ターゲテッドジェネティックスコーポレイション
Priority date: 1997-10-21
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2001-10-30
Also published as: DE69840948D1; EP1025243A2; CA2304801C; EP1025243B1; AU756827B2; CA2304801A1; WO1999020773A2; WO1999020773A3; ATE435293T1; AU1096699A

Abstract

(57)【要約】本発明は、小さくそして転写的に活性である、転写活性化されたＡＡＶのＩＴＲ（逆方向末端反復）、ならびに組換えＡＡＶベクターにおいてパッケージされた比較的大きな導入遺伝子の発現を最適化するためのそれらの使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、一般的には、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよび
遺伝子転移のために使用され得るその調製の分野に関連する。

【０００２】（背景）ＡＡＶベクターは、インビボでの遺伝子転移因子として有用であることが示さ
れている少数の組換えウイルスベクター系に属し（Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ
、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５
８：９７−１２９で論評される）、従っておそらく、ヒト遺伝子治療にとって潜
在的に大変重要である。ＡＡＶベクターは、種々の細胞において、高頻度で安定
なＤＮＡ組み込みおよび発現をし得る。このような細胞としては、嚢胞性線維症
（ＣＦ）気管支および鼻上皮細胞（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２、Ａｍ．
Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９−３５６；Ｅｇ
ａｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ．、３５８：５８１−５８４；Ｆｌｏｔｔｅら
、１９９３ａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：３７８１−３７９０；およ
びＦｌｏｔｔｅら、１９９３ｂ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、９３：１０１６３−１０１６７を参照のこと）、ヒト骨髄由来赤白血病細胞
（例えば、Ｗａｌｓｈら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８９：７２５７−７２６１を参照のこと）、およびその他のいくつかの
細胞が挙げられる。レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは、安定な組み込みのた
めに細胞分裂が進行中であることを必要としないようである。これは、ほとんど
の細胞が最終的に分化され、かつ非分裂型であるヒト気道上皮のような組織にお
ける、遺伝子治療についての明らかな利点である。

【０００３】ＡＡＶは、ある機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞にお
いてのみ一般的に複製される、欠損パルボウイルスである。ＡＡＶの概説は、Ｃ
ａｒｔｅｒ、１９８９、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、
Ｖｏｌ．Ｉ、１６９−２２８頁；およびＢｅｒｎｓ、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７４３−１７６４頁；ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋに見出
され得る。ＡＡＶの成長および複製のためのヘルパー機能を提供する、同時感染
ウイルスの例は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、および、ある場合にはワ
クシニアのようなポックスウイルスである。ヘルパー機能の性質は完全には知ら
れていないが、ヘルパーウイルスの間接効果は、細胞がＡＡＶの複製を許容する
ようにすることであると思われる。この考えは、ある場合において、もし細胞が
遺伝毒性薬剤または細胞周期を中断する薬剤にて処理されると、ヘルパーウイル
スの同時感染がなければＡＡＶの複製が低レベルの効率で生じ得るという知見に
よって、支持される。

【０００４】一般的に、ヘルパーウイルス非存在下で、ＡＡＶの感染は、ＡＡＶゲノムの宿
主細胞ゲノムへの高頻度で、安定な組み込みを生じる。組み込まれたＡＡＶプロ
ウイルスを含有する細胞が、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスに重感染
する場合、組み込まれたＡＡＶゲノムはレスキューされ、そして複製されて、感
染性子孫ＡＡＶ粒子のバーストをもたらし得る。ＡＡＶの組み込みは効率的な事
象であるようなので、ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のような使用について安定な発
現のために細胞に遺伝子導入するための有用なベクターであり得る。

【０００５】ＡＡＶは、明らかな種特異性あるいは組織特異性がなく、とても広い宿主域を
有しており、そして適切なヘルパーが存在すれば、ヒト、類人猿、またはげっ歯
類起源の事実上いずれの細胞株も複製する。ＡＡＶは、ほとんどの哺乳動物およ
びいくつかのトリの種を包含する多種多様な動物種から分離されているので、広
範に分布するようである。

【０００６】ＡＡＶは、いかなる病気の原因とも関連付けされておらず、そしてＡＡＶは、
癌化ウイルスでも発癌性のウイルスでもない。ＡＡＶのヒト細胞株の染色体へ組
み込みは、細胞の成長特性または形態学的特徴に重要な変化を全く引き起こさな
い。ＡＡＶのこれらの特性は、ＡＡＶを、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクタ
ーとしてさらに推奨する。なぜなら、この適用のために提案された他のウイルス
システムのほとんど(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、あるいはポックスウイルス）は、病気を引き起こすウイルスであるからで
ある。

【０００７】ＡＡＶ粒子は、３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）を有しそ
してＤＮＡゲノムを包んでいる、キャプシドで構成される。ＡＡＶのＤＮＡゲノ
ムは、分子量約１．５×１０⁶ダルトンまたは約４６８０ヌクレオチド長を有する線状１本鎖ＤＮＡ分子である。いずれかのセンス鎖（プラスあるいはマイナス
）が、個々の粒子にパッケージングされているが、各粒子はたった１つだけしか
ＤＮＡ分子を有しない。同数のＡＡＶ粒子が、プラス鎖あるいはマイナス鎖のい
ずれかを含有する。どちらの鎖を含有するウイルス粒子も同様に感染性である。
そして親感染１本鎖ＤＮＡから２重鎖型への変換、および２重鎖分子の大きなプ
ールの引き続く増幅によって、複製が生じ、そこから子孫１本鎖がはずされ、そ
してキャプシドにパッケージングされる。細菌性プラスミドまたはファージミド
に挿入されたＡＡＶゲノムの２重鎖または１本鎖コピーが、アデノウイルスに感
染した細胞にトランスフェクトされた場合、感染性粒子を生じ得る。このことが
、ＡＡＶ遺伝学の研究およびＡＡＶベクターの開発を可能にしてきた。

【０００８】サブタイプＡＡＶ２の場合には、そのゲノムは、２コピーの１４５ヌクレオチ
ド長のＩＴＲ（逆方向末端反復）をゲノムの各末端に１コピーずつ有している。
そしてこのゲノムは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子に関する２つの主要な読
み取り枠（Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１：３２９−３３９、Ｔ
ｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４ａ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１：６１１−６１９）
を含有する約４４７０ヌクレオチド長の独特の配列領域（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ
ら、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４５：５５５−５６４）を有している。この
独特の領域は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現するために使用される３
つの転写プロモーター、ｐ５、ｐ１９、ｐ４０を含有する（Ｌａｕｇｈｌｉｎら
、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：５５６７
−５５７１）。

【０００９】ＩＴＲ配列は、ＡＡＶの生活環において、種々の活性に関与している。このＩ
ＴＲ配列は各々ヘアピン構造を形成し得、機能的な複製起点（ｏｒｉ）を提供す
る。そしてＩＴＲ配列は、ＡＡＶのＤＮＡ複製および原核生物のプラスミドから
のレスキューおよび切除のために、シスで必要とされる（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、
１９８３、Ｃｅｌｌ、３３：１３５−１４３；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８７、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１：３０９６−３１０１；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９８
４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７９：１−２０；ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭｕ
ｚｙｃｚｋａ、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：２５１３−２５
２２）。加えて、このＩＴＲは、ＡＡＶプロウイルスの組み込みおよびＡＡＶの
ＤＮＡのビリオンへのパッケージングのために必要とされる最小の配列であるよ
うである（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９
６３−１９７３；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３
８２２−３８２８；Ｂａｌａｇｕｅら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：３
２９９−３３０６）。ＤＮＡ複製の場合、末端１２５ヌクレオチドのパリンドロ
ームの大部分が、ＤＮＡ複製および末端の決定にとって必要であるということが
、明らかである（Ｂｏｈｅｎｚｋｙら、１９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６６：
３１６−３２７；ＬｅＦｅｂｖｒｅら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．４：１４１６−１４１９；ＩｍおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８９、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６３：３０９５−３１０４；ＡｓｈｋｔｏｒａｂおよびＳｒｉｖａｓｔ
ａｖａ、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３０３４−３０３９）。

【００１０】いくつかの報告は、ＩＴＲが一般的には転写調節配列として挙動しないこと（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２；およびＷａｌｓｈら、１９９２）、およびＩＴＲ
の欠失は、ＡＡＶのｐ５プロモーター活性に重要な効果を有しないこと（Ｆｌｏ
ｔｔｅら、１９９２）を指摘した。ＩＴＲは、転写活性を提供するとは考えられ
なかったので、ＡＡＶベクターは、異種遺伝子を発現するためにＡＡＶプロモー
ターを使用して構築されてきた。例えば、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第４，７９
７，３６８号、１９８９年１月１０日発行を参照のこと。Ｃａｒｔｅｒおよび共
同研究者による引き続く報告は、ＩＴＲが一過性および安定発現アッセイにおい
て、低量の転写活性を有していることを示してきた。例えば、Ｃａｒｔｅｒら、
米国特許第５，５８７，３０８号、１９９６年１２月２４日発行、およびＦｌｏ
ｔｔｅら、１９９３ａを参照のこと。

【００１１】ＩＴＲ配列がシスに存在することという必要条件に加えて、ウイルスゲノムの
複製およびキャプシド形成のための機能を提供するために、それぞれＡＡＶのｒ
ｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が、シスまたはトランスに必要とされる。下記に
記載のように、遺伝子治療において使用するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベ
クターは、好ましくはＡＡＶのｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含有せず、む
しろこれらの遺伝子は、パッケージングに使用された宿主細胞（代表的には「Ａ
ＡＶプロデューサー細胞」と呼ばれる）によって提供され得る。

【００１２】無傷のＡＡＶゲノムにおいて、ｒｅｐ遺伝子は、以上に記載したように、２つ
のプロモーターｐ５およびｐ１９から発現される。ｐ５からの転写は、非構造タ
ンパク質Ｒｅｐ７８をコードするスプライスされていない４．２ｋｂｍＲＮＡ
、および第２の非構造タンパク質Ｒｅｐ６８をコードするスプライスされた３．
９ｋｂｍＲＮＡを産生する。ｐ１９からの転写は、Ｒｅｐ５２をコードするス
プライスされていないｍＲＮＡ、およびＲｅｐ４０をコードするスプライスされ
た３．３ｋｂｍＲＮＡを産生する。従って、これらの４つのＲｅｐタンパク質
は、すべて共通の内部領域配列を含有するが、しかしこれらのアミノ末端領域お
よびカルボキシル末端領域において異なる。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８のみが
、ＡＡＶの２重鎖ＤＮＡ複製のために必要とされるが、しかしＲｅｐ５２および
Ｒｅｐ４０は、子孫の１本鎖ＤＮＡの蓄積のために必要とされるようである。Ｒ
ｅｐ７８およびＲｅｐ６８における変異が表現型的にはＲｅｐ（−）であるのに
対して、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０にのみ影響する変異は、Ｒｅｐ（＋）であ
り、しかしＳｓｄ（−）である。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、ＲＲＳ（Ｒｅ
ｐ認識配列）またはＲＢＳ（Ｒｅｐ結合配列）として知られている部位にて、Ｉ
ＴＲと特異的に結合し、そして、そのタンパク質は、ＡＡＶ末端で複製を決定す
るために必要ないくつかの酵素活性を有している。Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０
は、これらの特性のいずれも有していない。

【００１３】Ｒｅｐタンパク質（主にＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８）は、ＡＡＶ遺伝子発現
の正および負の調節ならびにいくつかの異種プロモーターからの発現を含む、い
くつかの多面的調節活性、ならびに細胞成長における阻害効果を示す（Ｔｒａｔ
ｓｃｈｉｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８８４−２８９
４；Ｌａｂｏｗら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１３２０−１
３２５；Ｋｈｌｅｉｆら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８１：７３８−７４１）。ＡＡ
Ｖｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ７８あるいはＲｅｐ６８によって負に自己調節
されている（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８６）。おそらく細胞成長に対するｒ
ｅｐの発現の阻害効果のため、細胞株におけるｒｅｐの構成的な発現は容易には
達成されていない。例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら（１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１６６：１５４−１６５）が、ＡＡＶゲノムの安定な組み込みの後の、ある
細胞株におけるいくつかのＲｅｐタンパク質の極めて低レベルの発現を報告した
。

【００１４】構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３はすべて、共通のオーバーラッ
プ配列を共有しているが、しかし、ＶＰ１およびＶＰ２は、さらなるアミノ末端
配列を含有するという点で異なる。３つのタンパク質すべては、上記ｐ４０プロ
モーターから転写される、スプライスされた２．３ｋｂｍＲＮＡから発現され
る同じｃａｐ遺伝子読み取り枠からコードされる。ＶＰ２およびＶＰ３は、互い
違いの開始コドンの使用によって、同じｍＲＮＡから生成される。ＶＰ１は、Ｖ
Ｐ２およびＶＰ３をコードする主要なｍＲＮＡのために使用される３’ドナーか
ら３０ヌクレオチド上流にある、３’ドナー部位を使用する、主要でないｍＲＮ
Ａによってコードされている。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３はすべて、キャプ
シド形成にとって必要とされている。３つのタンパク質すべてを排除する変異（
Ｃａｐ（−））は、１本鎖子孫ＡＡＶＤＮＡの蓄積を妨げる一方、ＶＰ１アミ
ノ末端における変異（Ｌｉｐ（−）、Ｉｎｆ（−））は、１本鎖生成を可能にす
るが、安定な感染性粒子の集合を妨げる。

【００１５】上記のＡＡＶの遺伝的解析は、細菌のプラスミドに分子的にクローン化された
ＡＡＶゲノムの変異解析に大部分準拠した。早期の研究において、ＡＡＶの感染
性ゲノムの分子クローンは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：２０７７−２０８１）
、制限酵素部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３
、Ｇｅｎｅ、２３：６５−７３）、または直接の平滑末端ライゲーション（Ｓｅ
ｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
５９：４６６１−４６６６）のような手順によって、ＡＡＶゲノムの２重鎖分子
をプラスミドに挿入することによって構築された。アデノウイルスのような適切
なヘルパーウイルスにも感染した哺乳動物細胞への、このようなＡＡＶ組換えプ
ラスミドのトランスフェクションは、いずれのプラスミド配列も含まないＡＡＶ
ゲノムのレスキューおよび切り出し、レスキューされたゲノムの複製、および子
孫感染性ＡＡＶ粒子の生成を生じた。このことは、以上に要約されたようなＡＡ
Ｖの遺伝的解析を実施するための基礎を提供し、そしてＡＡＶ形質導入ベクター
の構築を可能にした。

【００１６】この遺伝的解析に基づいて、ＡＡＶベクター構築の一般的原則が定義された( 総説として例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２参照
のこと）。ｒＡＡＶベクターは、ベクタープラスミドを生成するために、ＡＡＶ
コード配列の一部を外来ＤＮＡと置換することによって、ＡＡＶ組換えプラスミ
ド内で構築され得る。このベクタープラスミドにおいては、ＡＡＶゲノムの末端
ＩＴＲ部分（ＩＴＲ）が、トランスフェクション後のプラスミドからの切り出し
、ベクターゲノムの複製、ならびに宿主細胞ゲノムからの組み込みおよびレスキ
ューにおけるその上述の役割が理由で、保持されなければならない。次いで、こ
のベクターは、ＡＡＶ粒子内にパッケージされてＡＡＶ形質導入ウイルスを生成
し得る。その方法は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような適切なヘ
ルパーウイルスによって感染した細胞への、このベクタープラスミドのトランス
フェクションによる。ベクターゲノムの複製およびＡＡＶ粒子内へのキャプシド
形成を達成するために、ベクタープラスミドは、このベクタープラスミドの構築
において欠失された任意のＡＡＶ機能（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）について
トランスに補完されなければならない。

【００１７】外来ＤＮＡをパッケージし、そしてそのＤＮＡを種々の細胞に形質導入するた
めにｒＡＡＶベクターを使用するいくつかの系が、すでに記載されている。記載
された最初のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ転写プロモーターまたはＳＶ４０プロ
モーターから発現されるｎｅｏ、ｃａｔまたはｄｈｆｒのような外来レポーター
遺伝子を含有した（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４ｂ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、
１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６−
６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５
：３２５１−３２６０；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６２：１９６３−１９７３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６）。これらのベクターは、第２のパッケージ
ングプラスミドと一緒に、アデノウイルスに感染した細胞への同時トランスフェ
クションによって、ＡＡＶ形質導入粒子にパッケージされた。第２のパッケージ
ングプラスミドは、野生型ＡＡＶ転写プロモーターから発現されたＡＡＶｒｅｐ
遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有した。

【００１８】Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８７）は、プラスミドｐＳｕｂ２０１を構築した。
このプラスミドは、細菌性プラスミド内で無傷のＡＡＶゲノムであるが、各ＩＴ
Ｒの末端に１３ヌクレオチドの欠失を有し、従って完全なＡＡＶゲノムを含有し
た他のＡＡＶプラスミドよりも、効率悪くレスキューおよび複製された。Ｓａｍ
ｕｌｓｋｉら（１９８９）は、ｐＳｕｂ２０１をベースとしているがｒｅｐおよ
びｃａｐを欠失し、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターから発現されるｈｙｇ遺伝
子またはｎｅｏ遺伝子のいずれかを含有する他のベクターを構築した。これらの
ベクターは、ｐＡＡＶ／Ａｄと呼ばれるパッケージングプラスミドとの同時トラ
ンスフェクションによって、ウイルス粒子にパッケージされた。ｐＡＡＶ／Ａｄ
は、いずれか一方の末端で１コピーのアデノウイルス５末端反復に包まれた、ヌ
クレオチド１９０〜４４９０の完全なＡＡＶヌクレオチド配列からなった。この
パッケージングプラスミドにおいて、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子
は、野生型ＡＡＶプロモーターｐ５、ｐ１９、およびｐ４０から発現された。こ
のプラスミドはＩＴＲを欠失しているので、ｐＡＡＶ／ＡｄのＡＡＶゲノムは複
製しないようである。

【００１９】他のいくつかの報告は、ｒＡＡＶベクターのことを記載している。Ｓｒｉｖａ
ｓｔａｖａら（１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８０７８−８０８２）は、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８７）のｐＳｕｂ２０
１プラスミドをベースとした、あるＡＡＶベクターを記載した。このベクターで
は、ＡＡＶのコード配列が別のパルボウイルス（Ｂ１９）のコード配列と置換さ
れた。このシステムは、ｐＳｕｂ２０１をベースとしていたので、ｐＳｕｂ２０
１プラスミドについて上述された欠陥を受ける。また、このベクターとパッケー
ジングプラスミドとは共に、同じＩＴＲ領域を含有し、従って、野生型ウイルス
の混入を与える組換えが非常に起こりそうであった。Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら（
１９９１、Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、８５−８９頁）、Ｗｏｎｇら（１９９１、
Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１８３−１８９頁）、およびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅら
（１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１４８５−１４８８）は、ＨＩＶまたは
単純ヘルペスウイルスのような感染性ウイルスに対して指向されたアンチセンス
ＲＮＡを発現するように設計されたｒＡＡＶベクターを記載する。他の報告は、
ｐＳｕｂ２０１ベクタープラスミドをベースとしたベクターおよびｐＡＡＶ／Ａ
ｄパッケージングプラスミドを用いて、ヒトリンパ球（Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏら
、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１１：２３１−２３７）および
ヒト赤血球白血病細胞株（Ｗａｌｓｈら、１９９２）において、遺伝子を発現す
るための、ｒＡＡＶベクターの使用を記載している。

【００２０】ヒト気道上皮細胞（嚢胞性線維症患者から分離され、そしてインビトロで増殖
された）の形質導入が、ＡＡＶのｐ５プロモーターから選択マーカー遺伝子ｎｅ
ｏを発現するｒＡＡＶベクターを用いて、達成された（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９
２）。この研究では、ＡＡＶｎｅｏベクターは、ｐＡＡＶ／Ａｄパッケージン
グプラスミドを使用してＡＡＶ粒子にパッケージされた。

【００２１】上記の研究は、ｒＡＡＶベクターが遺伝子治療によるヒトの疾患の処置のため
のベクターとして潜在的有用性を有し得ることを示唆する。しかし、ｒＡＡＶベ
クターを使用するヒト遺伝子治療の開発における厳しい制限は、長い断片の導入
遺伝子ＤＮＡをウイルスキャプシドへ効率よくパッケージすることができないこ
と、およびそれら遺伝子ＤＮＡを受容体細胞において有効に発現することができ
ないことである。例えばアデノウイルスベクターを包含する他のウイルスベクタ
ーもまた、パッケージングサイズの制約を示すが、しかし、ＡＡＶは、サイズの
制約に関して特に敏感に反応するようである。特に、最適サイズを超えるにつれ
て、ベクターの生成に、鋭くかつ劇的な減少が存在する。

【００２２】ＡＡＶは、野生型ゲノムのサイズ（約４．６ｋｂ）より若干大きなゲノムをパッケージングし得る。ゲノムサイズとパッケージング効率との正確な関係は、
ほんの最近になって明らかにされた。ゲノムの長さが１．９〜６．０ｋｂと徐々
に増加する一連のｒＡＡＶベクターを使用して、Ｄｏｎｇら（１９９６，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：２１０１−２１１２）は、ベクターサイズに関
するｒＡＡＶのパッケージング効率を定量的に分析し得、パッケージングについ
てのサイズ制限を決定し得た。詳細には、様々なサイズのｒＡＡＶベクターのパ
ッケージング効率は、ウイルス粒子のＤＮＡ含量を評価することによって直接的
に、標的細胞へのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
レポーター遺伝子の移入を分析することによって間接的に決定された。Ｄｏｎｇ
ら（１９９６）は、パッケージングのためのｒＡＡＶベクターの最適なサイズが
４．１ｋｂと４．９ｋｂとの間であることを示した。ＡＡＶはそれ自体のゲノム
サイズより大きなベクター（約５．２ｋｂまでのベクターを含む）を導入し得る
が、この大きなサイズの範囲におけるパッケージング効率は急に減少した。この
ＡＡＶゲノムサイズが４．１ｋｂより小さい場合もまた、パッケージング効率は
最適以下であった。ゲノムサイズが野生型ゲノムの長さの半分未満である場合は
、２コピーのベクターが各ビリオンにパッケージングされ、このことは、パッケ
ージングの間のコピー数の制御が「満頭（ｈｅａｄ−ｆｕｌｌ）」機構である
ことを示唆した。

【００２３】Ｄｏｎｇら（１９９６）は、様々なサイズのｒＡＡＶベクターおよびｐＡＡＶ
／Ａｄパッケージングプラスミド（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）を、ＨｅＬ
ａ細胞へ同時トランスフェクトした。一時的にトランスフェクトした細胞から生成されたＡＡＶビリオンは収集され、新しいＨｅＬａ細胞を感染させるために
用いられた。感染された細胞におけるＣＡＴ活性は感染後３日目に分析された。
３．２〜４．８８ｋｂの長さをもつベクターの得られたＣＡＴ活性は８０．７〜
１２９．５ｃｐｍであった。しかし、４．８８ｋｂを超えたサイズにおける０．
２ｋｂの増加のみについては、得られたＣＡＴ活性は３５．９ｃｐｍに減少した
。このことは、粒子生成における５０％を超える減少を示す。サイズがさらに増
加した結果、粒子パッケージング効率はより減少した。

【００２４】つまり、組換えｒＡＡＶベクターが遺伝子治療に関する有用性を有すると考え
られる一方、重要な障害は、ウイルスのカプシドへ効率的にパッケージングされ
得、次いで受容細胞において発現され得る、導入遺伝子ＤＮＡ量の制限であった
。これは、より大きな遺伝子の移入を要求するインビボでの応用において、重要
な問題である。

【００２５】本来のプロモーターおよび異種プロモーターを含む、多くの遺伝子がＡＡＶパ
ッケージングベクターのサイズ制約に適するほど十分小さいとはいえ、その他多
くのものは小さくはない。

【００２６】ＡＡＶパッケージング制約に適応させるためのアプローチの一つは外因性転写
プロモーターの使用を差し控えることである。例えば、嚢胞性線維症膜貫通調節
タンパク質（ＣＦＴＲ）の場合では、どんな追加プロモーターなしであっても、
Ｃａｒｔｅｒおよび共同実験者ら（米国特許第５，５８７，３０８号；Ｆｌｏｔ
ｔｅら，１９９３ａ）によって記載されたように、ＡＡＶＩＴＲ自体により与えられた比較的低レベルな転写活性に基づくｒＡＡＶ−ＣＦＴＲベクターを構築
および使用し得ることが示されている。

【００２７】もう一つのアプローチは非必須コード領域を欠失した導入遺伝子を使用することである。例えば、Ｃａｒｔｅｒらにより記載されたように、組換えｒＡＡＶ
ベクター内の短縮型ＣＦＴＲ遺伝子はＡＡＶ粒子にパッケージングされ、次いで
哺乳動物細胞中のＣＦ欠損の補完に使用される。Ｃａｒｔｅｒらの米国特許出願
第０８／４５５，５５２号を参照のこと。これは現在発行手続き中である。

【００２８】Ｃａｒｔｅｒらによって例証されたＣＦＴＲ遺伝子に関する前述のアプローチ
は、極めて有用であり、嚢胞性線維症のような疾患を処置するための遺伝子治療
において使用するためのｒＡＡＶベクターの生成を有効に可能にした。実際に、
これらのアプローチによる成功は、ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ、Ｊｏｈｎｓ
ＨｏｐｋｉｎｓＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＣｅｎｔｅｒ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
，ＭＤ、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖ
ｉｌｌｅ，ＦＬを含めたいくつかのセンターで、ＴａｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔ
ｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより後援された嚢胞性線維症の患者を含む２
つの異なる臨床試験の開始に値した。

【００２９】しかし、潜在的なベクターサイズの制約にもかかわらず、導入遺伝子の発現が
はるかに向上し得る改良されたｒＡＡＶ構築物についての持続する要望が存在す
る。高い粒子生成効率および挿入した導入遺伝子の発現の増強を提供する改変さ
れたｒＡＡＶベクターを有することは最も有用である。本発明はこれらの状況で
使用し得る、転写活性化されたｒＡＡＶベクターを提供する。

【００３０】（発明の要旨）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはインビボで多くの様々な任意の組織
への遺伝子移入を達し得る。しかし、ＡＡＶカプシドはＤＮＡをパッケージング
する能力において制限がある。これは特に、多くの治療用導入遺伝子を含む大き
なＤＮＡ断片のパッケージングに関して問題である。本発明は転写活性化された
ＩＴＲを提供する。これは、組換えＡＡＶベクターにパッケージングされた比較
的大きな導入遺伝子の発現を最適にするために使用され得る。

【００３１】発明の実施態様は以下を含むがこれらに限定されない。

【００３２】本発明は、一つの実施態様において、転写活性化されたアデノ随伴ウイルス（
ＡＡＶ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドを提供する。ここ
で転写活性化されたＩＴＲは長さ約４００ｂｐ未満であり、転写活性異種エレメ
ントを含み、ここで転写活性化されたＩＴＲは、転写可能な条件下において野生
型ＩＴＲに対して、転写活性における少なくとも２倍の増加（好ましくは少なく
とも５倍の増加）を示す。

【００３３】一つの実施態様において、本発明は、転写可能な条件下において野生型ＩＴＲ
に対して、転写活性における少なくとも約７倍の増加を示す、転写活性化された
ＩＴＲを提供する。その例示的な実施態様は、転写開始配列および少なくとも一
つのＣＣＡＣボックスを含む。

【００３４】別の実施態様において、本発明は、転写可能な条件下において野生型ＩＴＲに
対して、転写活性における少なくとも約１０倍の増加を示す、転写活性化された
ＩＴＲを提供する。その例示的な実施態様は、転写開始配列およびアミロイドβ
タンパク質前駆体（ＡＰＰ）プロモーターの転写活性エレメントを含む。

【００３５】別の実施態様において、本発明は転写可能な条件下において野生型ＩＴＲに対
して、転写活性における少なくとも約４０倍の増加を示す、転写活性化されたＩ
ＴＲを提供する。その例示的な実施態様は、転写開始配列およびＡＴＦ−１／Ｃ
ＲＥ部位およびＳｐ１部位を含む。

【００３６】別の実施態様において、本発明は、転写可能な条件下において野生型ＩＴＲに
対して、転写活性における少なくとも約５０倍の増加を示す、転写活性化された
ＩＴＲを提供する。その例示的な実施態様は、転写開始配列およびＡＴＦ−１／
ＣＲＥ部位、Ｓｐ１部位およびＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼα１サブユニット遺伝子
プロモーターのＣボックスエレメントを含む。

【００３７】本発明はまた以下を次の順番で含むポリヌクレオチドを提供する：転写活性化
されたＩＴＲである最初のＩＴＲ（ここで、転写活性化されたＩＴＲは長さが約
４００ｂｐ未満であり、そして転写活性エレメントを含み、そしてここで、転写
活性化されたＩＴＲは、転写可能な条件下において野生型ＩＴＲに対して転写活
性における少なくとも２倍（好ましくは少なくとも５倍）の増加を示す）；およ
び野生型ＩＴＲ、転写活性化されたＩＴＲ、Ｄ配列、ｔｒｓ、または野生型ＩＴ
Ｒの一部からなる群より選択される２番目のＩＴＲ。

【００３８】別の実施態様において、本発明は、転写活性化されたＩＴＲに作動可能に連結
される異種導入遺伝子をさらに含む本発明の任意のポリヌクレオチドを含む。

【００３９】別の実施態様において、本発明は、ＡＡＶウイルス粒子へパッケージングされ
た本発明の任意のポリヌクレオチドを含む。

【００４０】別の実施態様において、本発明は、任意のポリヌクレオチドを含む哺乳動物細
胞を含む。ここで、上記のポリヌクレオチドは上記細胞の染色体へ安定して組み
込まれる。

【００４１】別の実施態様において、本発明は、組換えＡＡＶベクターをパッケージングす
る方法を含み、この方法は以下の工程を含む：哺乳動物細胞を提供する工程；組
換えＡＡＶベクターを導入する工程であって、上記ベクターは、転写活性化され
たＩＴＲである最初のＩＴＲであって、ここでこの転写活性化されたＩＴＲは長
さが約４００ｂｐ未満であり、そして転写活性エレメントを含み、そしてここで
、転写活性化されたＩＴＲは、転写可能状態下において野生型ＩＴＲに対して、
転写活性における少なくとも２倍（好ましくは少なくとも５倍）の増加を示す、
ＩＴＲ；および野生型ＩＴＲ、転写活性化されたＩＴＲ、Ｄ配列、ｔｒｓ、また
は野性型ＩＴＲの一部からなる群より選択される２番目のＩＴＲを含む、工程；
細胞内にＲｅｐおよびＣａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を提供する工程；
ならびにＡＡＶベクターの複製およびパッケージングに適する条件下で細胞をイ
ンキュベートする工程を含む。

【００４２】本発明のこれらおよび他の実施態様を以下の記載において概説する。

【００４３】（発明の詳細な説明）組換えＡＡＶベクターは、少なくとも１つの（好ましくは２つの）ＡＡＶＩ
ＴＲに隣接する目的の異種ポリヌクレオチド、すなわち「導入遺伝子」を含む、
遺伝子送達構築物である。これらの組換えＡＡＶベクターはヒト遺伝子治療のた
めの潜在的に強力な手段である。ＡＡＶベクターに関連した一つの技術的制限は
、パッケージング効率および発現効率はパッケージングした全ＤＮＡが約５ｋｂ
の長さを超えたとき、劇的に落ち込む傾向があるため、大きな治療用導入遺伝子
をパッケージングする能力が制約されることである。

【００４４】本明細書中に記載した本発明は、高い効率でパッケージングおよび発現をされ
得る導入遺伝子材料を最大にする、転写活性化されたＩＴＲの生成における使用
のための方法および材料を提供する。

【００４５】（定義）「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略号であり、そしてウイルス自体または
その誘導体をいうために用いられ得る。本用語は、他に要求される場合を除いて
、すべての血清型およびサブタイプならびに自然に存在するおよび組換えの両方
の型を含む。

【００４６】用語「ＩＴＲ」は、ＡＡＶゲノムのいずれかの末端における逆方向末端反復を
いう。この配列はヘアピン構造を形成し得、原核生物のプラスミドからのＡＡＶ
ＤＮＡの複製およびレスキュー、または切り出しに関与する（Ｓａｍｕｌｓｋ
ｉら、１９８３、１９８７；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９８４；Ｇｏｔｔｌｉｅ
ｂおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８８）。加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶプロウイル
スの組み込みおよびビリオンへのＡＡＶＤＮＡのパッケージングに要求される
最小配列のようである（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ
ら、１９８９）。

【００４７】用語「転写活性化されたＩＴＲ」または「転写活性化されたＡＡＶＩＴＲ」
は、野生型ＩＴＲ（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３、１９８７；Ｓｅｎａｐａｔ
ｈｙら、１９８４；ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８８）の配
列の部分のかなりの配列全体の同一性のヌクレオチドセグメントを含むが、野生
型ＩＴＲに対して転写活性の増加を示す配列をいう。本発明の転写活性化された
ＩＴＲは、ＩＴＲ配列に由来し得るが、ｒＡＡＶベクターにおいて近接している
導入遺伝子の転写レベルを高め得る点でＩＴＲを転写により活性されるようにす
る変異（例えば、欠失、逆位、置換、添加または他の変化）、または複数のこの
ような変異も保有する。上記の転写活性化されたＩＴＲは、野生型ＩＴＲより少
なくとも２倍大きい転写促進活性を示し、好ましくは少なくとも５倍、少なくと
も７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、さらにより好ましくは少なくと
も５０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍大きな活性を示す。代表的には、
転写活性化されたＩＴＲの転写活性部分は、転写活性部分の長さの少なくとも５
０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは全長にわたって、転写活
性エレメントの標準配列と配列類似性を有する配列を含む。好ましくは、転写活
性化されたＩＴＲの転写活性部分はタンパク質−ヌクレオチド相互作用に重要な
ヌクレオチドを含み、上記のタンパク質は転写の開始、促進または増強に関与す
る。一般に、転写活性化されたＩＴＲのＩＴＲ由来部分は、少なくとも５０ヌク
レオチド長、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、さらにより好ま
しくは約１４０ヌクレオチド長であり、かつＩＴＲ由来部分の長さの少なくとも
５０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは野生型ＡＡＶＩＴＲ
の全長にわたって配列類似性を有する配列を含む。好ましくは、転写により活性
されるＩＴＲは、ＤＮＡ複製、ＡＡＶプロウイルスの組み込み、ＡＡＶＤＮＡ
のパッケージング、およびプラスミドＤＮＡからの切り出しの機能を含む、野生
型ＩＴＲに関連した種々の活性を提供する。

【００４８】用語「転写活性エレメント」または「転写活性部分」は、ＲＮＡを形成するた
めにＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの制御転写を可能にする配列をいう。本発
明の転写活性エレメントは概して５００ｂｐより小さく、好ましくは２００ｂｐ
より小さく、より好ましくは１００ｂｐより小さく、最も好ましくは５０ｂｐよ
り小さい。転写活性エレメントを含む転写活性化されたＩＴＲは、概して野生型
ＩＴＲより少なくとも２倍大きな転写活性、好ましくは少なくとも５倍、少なく
とも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくと
も４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きな活性を示す。転
写活性エレメントはまた「転写開始配列」を含む。この「転写開始配列」は概し
て転写開始の位置を決定する。該当分野で公知の転写開始配列は、例えば、ＴＡ
ＴＡおよびＴＡＴＡ様ボックス（例えば、Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈら、１９８１、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９−３８３；Ｓｍａｌｅら、１
９８９、Ｃｅｌｌ５７：１０３−１１３を参照のこと）を含む。従って、転写
活性エレメントは転写開始配列（転写開始を位置決めするため）およびＤＮＡの
制御転写を可能にするための転写を活性化する配列を含む。

【００４９】用語「ポリぺプチド」、「ぺプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さ
のアミノ酸のポリマーをいうために交換可能に用いる。これらの用語はまた、グ
リコシル化、アセチル化およびリン酸化を含む反応を通じて翻訳後に転写活性化
されたタンパク質を含む。

【００５０】「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さ、リボヌクレオチドもし
くはデオキシリボヌクレオチド、またはそのアナログもしくはその誘導体のいず
れかのヌクレオチドのポリマー形態をいう。本用語は一次構造の分子のみをいう
。従って、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖および１本鎖ＲＮＡ、お
よびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリットが含まれる。本用語はまた、メチル化またはキ
ャップされたポリヌクレオチドのような、転写活性化されたポリヌクレオチドを
含む。加えて、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、プリンおよびピリミジ
ン塩基、または他の天然の塩基、化学的もしくは生化学的に転写活性化された塩
基を含む任意のポリマーを含むか、あるいは非天然または誘導化されたヌクレオ
チド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基、または転写活
性化されたかもしくは置換される糖またはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリ
ヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートのような合成サブユニットのポリマ
ーを含み得、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデートまたはホス
ホルアミデート−ホスホジエステル混合オリゴマーであり得る。Ｐｅｙｒｏｔｔ
ｅｓら（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：１８４１−８
；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
２４：２３１８−２３；Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓ．２４：２９６６−７３．別の実施態様において、ホスホチエート
（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）結合はホスホジエステル結合の代わりに用
いられ得る。Ｂｒａｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８４
−９；Ｌａｔｉｍｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０５７
−１０６４．加えて、適切な条件下での相補鎖の合成およびアニール、または適
切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを使用する相補鎖のデノボ合成のい
ずれかによって、２本鎖ポリヌクレオチドは、化学合成の１本鎖ポリヌクレオチ
ド産物から得られ得る。

【００５１】「組換え体」は、ポリヌクレオチドに対して適用したとき、このポリヌクレオ
チドがクローニング、制限エンドヌクレアーゼおよび／もしくは連結工程、また
はこれらの工程の任意の組み合わせ、あるいは自然界でみられるポリヌクレオチ
ドとは異なるポリヌクレオチド構築物をもたらす他の手順での生産物であること
を意味する。

【００５２】２つのポリヌクレオチド間での「配列重複」は、ヌクレオチドが、組換えを促
進するのに十分な長さおよび同一性の相同配列を共有するときに起こる。相同性
および一致する組換えの頻度のレベルは同種の配列の長さが増加するにつれて、
およびそれらの共有した同一性のレベルにつれて増加する。本発明の内容におい
て、ｒＡＡＶベクターは、トランスで供給されてＡＡＶの複製およびカプシド化
を促進する（それにより、複製可能なＡＡＶベクターが生じ得る頻度を減少させ
る）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子との実質的な配列の重複を示
さないことが好ましい。所定のシステムにおいて関心を提起する相同性のレベル
は、該当分野で公知のように、理論的に決定されて実験的に確認され得る。しか
し、もし重複している配列が、約２５ヌクレオチド配列未満でかつそのヌクレオ
チド全長にわたって少なくとも８０％同一であるか、または約５０ヌクレオチド
配列未満でかつそのヌクレオチド全長にわたって少なくとも７０％同一であるな
らば、代表的には組換えは実質上減少し得るかまたは削除され得る。もちろん、
組換えの見込みがはるかに減少するので、さらにより低いレベルの相同性が望ま
しい。

【００５３】「ベクター」とは、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、宿主細胞
へ送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミドまたは組換えウイルス
をいう。

【００５４】「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」とは、少なくとも１つ
の、好ましくは２つの、ＡＡＶＩＴＲにより隣接する目的の１つ以上の異種（
すなわち、非ＡＡＶ）ポリヌクレオチドを含むベクターをいう。単一のＩＴＲは
、いくつかの条件下でｒＡＡＶベクターの複製に十分であり得る。適したヘルパ
ーウイルスに感染し、そしてＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現している
宿主細胞に存在するとき、ｒＡＡＶベクターは複製され得、そして感染性ウイル
ス粒子へパッケージングされ得る。

【００５５】「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」とは、ＡＡＶカプシドおよ
びカプシド化したポリヌクレオチドを含む粒子をいう。

【００５６】「導入遺伝子」とは、ベクターを介して細胞へ送達されるポリヌクレオチドで
あり、そして遺伝子治療の目的のコード配列を含み得る。これは、「標的ポリヌ
クレオチド」または「治療用導入遺伝子」ともいい得る。

【００５７】用語「ＩＴＲ由来エレメント」、「ＩＴＲ由来配列」などは、野生型ＩＴＲ、
またはＩＴＲのレスキュー、複製およびカプシド化機能を促進し得る、従って、
そのために本発明の改変されたＩＴＲへ組み込まれ得る、ＩＴＲの任意の他の部
分を示す。

【００５８】ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子とは、それぞれ、複製タンパク質お
よびカプシド化タンパク質をコードし、調べられた全てのＡＡＶ血清型において
見い出されている。代表的には、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子はＡＡＶゲノ
ムにおいて互いに近接して見い出され、そしてこれらは一般にＡＡＶ血清型間で
保存される。これらの機能は、下記に表示したように、ｒＡＡＶ生成物の状況で
トランスで提供され得るか、そして代表的には提供される。

【００５９】ＡＡＶに対する「ヘルパーウイルス」とは、野生型ＡＡＶ（一般に欠損パルボ
ウイルスである）が宿主細胞によって複製されそしてパッケージングされるのを
可能にする第２のウイルスをいう。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワ
クシニアの様なポックスウイルスを含め、このような多くのヘルパーウイルスは
同定されている。ヘルパーウイルス機能とは、ＡＡＶ生成を促進および／または
助長するヘルパーウイルスの機能をいい、その機能はヘルパーウイルスから単離
され得、そしてＡＡＶ生成の情況において独立して使用され得る。

【００６０】本明細書中で使用される「パッケージング」とは、ＡＡＶゲノムまたはｒＡＡ
Ｖベクターの集合およびカプシド化を生ずる、一連の細胞内での事象をいう。従
って、適切な条件下において適切なベクタープラスミドが、パッケージング細胞
株へ導入されるとき、このベクタープラスミドはベクターウイルス粒子へと集合
する。

【００６１】「異種」は、比較される実体の残りと遺伝子型が異なる実体に由来することを
意味する。例えば、遺伝子工学技術により異なる細胞型へ導入されたポリヌクレ
オチドは異種ポリヌクレオチド（および、発現される場合、異種ポリぺプチドを
コードし得る）である。同様に、その本来のコード配列から取り出されて異なる
コード配列に作動可能に連結される転写活性エレメントは、異種の転写活性エレ
メントである。

【００６２】「作動可能に連結される」とは近接の位置であることをいう。ここで、このよ
うに記載される構成要素は、それらの意図される様式において機能することを可
能にする関係にある。転写活性エレメントがコード配列の翻訳を促進する場合、
転写活性エレメントはコード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結され
る転写活性エレメントは通常コード配列とシス配置をとるが、コード配列と隣接
する必要はない。

【００６３】「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、およびこのような他の用語は、
より高等な真核生物の細胞を示し、最も好ましくは哺乳動物細胞を示し、これは
組換えベクターのレシピエントまたは他の移入ポリヌクレオチドとして使用され
得、そして形質導入された元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫は、元の親細胞
と、形態またはゲノム相補において必ずしも完全に同一ではないことが理解され
る。

【００６４】細胞へのポリヌクレオチドの「安定な組み込み」は、ポリヌクレオチドが細胞
の染色体またはミニ染色体へ導入されて、従って、細胞性ゲノムの比較的不変の
部分になることを意味する。プラスミドの様なエピソームは時々多くの世代で維
持され得るが（特に選択圧下で維持する場合）、エピソームにより保有される遺
伝物質は概して、染色体に組み込まれた物質よりも失われやすい。また、真核生
物の染色体のクロマチン構造は、組み込まれたポリヌクレオチドの発現レベルに
影響し得る。クロマチンにより誘導されるこのような効果は、組み込まれたポリ
ヌクレオチドが発現される相対的度合を減少または増強し得る。代表的に、多く
の組み込まれたクローンは生産され、そして生産条件下において所望の発現レベ
ルを示すクローンが選択される。

【００６５】ウイルスの生成、複製またはパッケージングの記載に使用したときの「効率」
とは、本法の有用な特性をいう；特に、成長速度および１細胞当たりで生成され
たウイルス粒子の数。「高い効率」の生成とは、本法において記載した培養期間
の経過にわたる、１細胞当たり少なくとも１００ウイルス粒子の、好ましくは１
細胞当たり少なくとも約１０，０００、およびより好ましくは少なくとも約１０
０，０００粒子の生成を示す。

【００６６】（一般技術）本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ
および免疫学の従来技術を採用している。これらは当該分野の技術範囲内である
。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（１９８９）、Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４
）、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，
１９８７）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏ
ｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅおよびＭ
．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編．１９８７）、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｔおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃ
ｋｗｅｌｌ，編）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．
Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓ
ｍｉｔｈ，およびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編，１９８７）、およびＣｕｒｒｅｎｔＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ
．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａ
ｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，１９９１）を参照のこと。全ての特許、特許
出願書、および本明細書中で上記および下記の両方で述べた刊行物は、本明細書
中で参考として援用する。

【００６７】（発明を実施するための形態）ＡＡＶカプシドは標的細胞への導入遺伝子ＤＮＡの送達に有用であるが、特に
約５．０ｋｂを超える様な大きなＤＮＡ断片のとき、ＤＮＡをパッケージングす
る能力は制限される。本発明は転写活性化されたＩＴＲを提供する。これはその
活性および小さいサイズに起因して、ｒＡＡＶベクターにパッケージされ得そし
てｒＡＡＶベクターから効率的に発現され得る導入遺伝子ＤＮＡの量を効果的に
増加し得る。本発明に従って、ＩＴＲは、転写活性エレメントのような、隣接し
た導入遺伝子の翻訳を増強する転写制御配列を含むことにより転写活性化された
。転写活性化されたＩＴＲがどのように配置され得るかいくつかの例を、以下で
詳細に記載するように、図１に示す。

【００６８】従って、本発明のｒＡＡＶベクターは、配列中に、転写活性化されたＩＴＲ、
導入遺伝子（ＡＡＶゲノムコード領域の大部分または全体の代わり）、そして複
製およびパッケージングに対して十分な２番目のＩＴＲ由来エレメントを構築す
ることによって調製され得る。この２番目のＩＴＲ由来エレメントは、野生型Ｉ
ＴＲ、ＩＴＲのＤ配列、ｔｒｓ、複製、レスキューおよびパッケージングを可能
にするに十分なＩＴＲの任意の部分を含み得る。このｒＡＡＶベクターの長さは
、好ましくは約４．１ｋｂと５．２ｋｂとの間、より好ましくは４．２ｋｂと５
．２ｋｂとの間、より好ましくは４．３ｋｂと５．１ｋｂとの間、最も好ましく
は４．６ｋｂと５．０ｋｂとの間である。

【００６９】このｒＡＡＶベクターもまた、当該分野において公知でありそして本明細書中
に引用される様々な参考文献に示されるように、以下の任意のまたは全てのエレ
メントも含み得るプラスミド中に位置し得る：レポーター遺伝子、複製起点、さ
らなるプロモーター、マルチクローニング部位。

【００７０】任意の血清型またはサブタイプのＡＡＶは、様々な血清型が遺伝子レベルでさ
え、機能的および構造的に関連しているため、適している（例えば、Ｂｌａｃｋ
ｌｏｗ，１６５−１７４頁、「ＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＨｕｍａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編，１９８８；およびＲｏｓｅ，
ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＶｉｒｏｌｏｇｙ３：１，１９７４を参照のこ
と）。全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により媒介される類似した複
製特性を明らかに示し、；そして全てがＡＡＶ２により発現されるカプシドタン
パク質のような３つの関連したカプシドタンパク質を有する。この関連度は、ゲ
ノムの長さに沿って血清型間での広範囲なクロスハイブリダイゼーションを示す
ヘテロ２重鎖分析により；そしてＩＴＲに相当する末端での類似の自己アニール
セグメントの存在により、さらに示唆される。類似した感染性パターンもまた、
各血清型における複製の機能が同様の調節制御下にあることを示唆する。利用可
能な血清型の中でも、ＡＡＶ２が現在好ましい。

【００７１】哺乳動物の細胞におけるＡＡＶ粒子の生成および処理についての様々な方法は
記載されている。ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングのための宿主ま
たは「プロデューサー」細胞を使用することは典型的である。このようなプロデ
ューサー細胞（通常哺乳動物宿主細胞）は、概してｒＡＡＶ生成のためのいくつ
かの異なるタイプの構成要素を含むか、または含むように改変される。最初の構
成要素は、複製され得、そして宿主のパッケージング細胞によりベクター粒子へ
パッケージングされ得る、ｒＡＡＶベクターゲノム（または「ｒＡＡＶプロベク
ター」）である。このｒＡＡＶプロベクターは導入遺伝子を普通は含む。この導
入遺伝子は、ＡＡＶベクターの切り出し、複製およびパッケージング中、ならび
に宿主細胞のゲノムへのベクターの組み込み中に認識される配列を含む２つのＩ
ＴＲに概して隣接している。本発明で記載したように、転写活性化されたＩＴＲ
は、作動可能に連結される導入遺伝子の効率的な発現を促進する配列をさらに含
む。２番目の構成要素は、ＡＡＶの複製のヘルパー機能を提供し得るヘルパーウ
イルスである。アデノウイルスが通常使用されるが、当該分野において公知であ
る他のヘルパーウイルスも使用し得る。あるいは、必要なヘルパーウイルス機能
は、ヘルパーウイルスから遺伝的に単離され得、そしてそのコード遺伝子は、ト
ランスでヘルパーウイルスの機能を提供するために使用され得る。ＡＡＶベクタ
ーエレメントおよびヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）は、任意
の順序で同時または連続的のいずれかで宿主細胞へ導入され得る。プロデューサ
ー細胞中に提供されるＡＡＶ生産の最終構成要素は、複製およびタンパク質のカ
プシド化をそれぞれ提供するＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のような「ＡＡ
Ｖパッケージング遺伝子」である。いくつかの異なるバージョンのＡＡＶパッケ
ージング遺伝子が提供され得る。（野生型ｒｅｐ−ｃａｐカセット、ならびにｒ
ｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子がネイティブなプロモーターの制御下において
、あるままであるか、または異種プロモーターに作動可能に連結され得る改変し
たｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含む）。当該分野において公知であり以
下に記載されているように、この様なＡＡＶパッケージング遺伝子は、一時的ま
たは安定してのいずれかで宿主パッケージング細胞へ導入され得る。

【００７２】高い力価の組換えＡＡＶベクターの生成のための一つの例示的な技術は、Ｔａ
ｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＪｏｈｎｓ
ＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって米国特許第５，６５８，７７６
号（Ｆｌｏｔｔｅら）に概説されている。本実施例は、安定して組み込まれたｒ
ＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを有する哺乳動物細胞を使用し
、ここでこのベクターはＡＡＶＩＴＲおよび標的ヌクレオチドに作動可能に連
結される転写プロモーターを含むが、ここでｒｅｐの発現は制限される。好まし
い実施態様において、異種ＡＡＶに作動可能に連結されるｒｅｐ遺伝子を含むＡ
ＡＶパッケージングプラスミドは、細胞へ導入され、そして次いでその細胞はＡ
ＡＶベクター配列の複製および粒子へのパッケージングを可能にする条件下でイ
ンキュベートされる。

【００７３】２番目の例示的な技術は、特許出願ＷＯ９５／１３３９２（Ｔｒｅｍｐｅら）
に概説されており、そして米国特許出願０８／３６２，６０８（現在発行手続き
中である）に対応する。本実施例は、機能的Ｒｅｐタンパク質の発現が可能にな
るように異種プロモーターと作動可能に連結されるＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有す
る安定した哺乳動物細胞株を使用する。様々な好ましい実施態様において、ＡＡ
Ｖｃａｐ遺伝子は、なお安定に提供され得るかまたは（例えばプラスミド上に
）一時的に導入され得る。組換えＡＡＶベクターはまた、安定してまたは一時的
に導入され得る。

【００７４】別の例示的な技術は、特許出願ＷＯ９６／１７９４７（ＴａｒｇｅｔｅｄＧ
ｅｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｌｌｅｎによる）に概説され
ている。本実施例は安定して組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子、およびヘルパ
ーウイルスによって誘導され得る異種プロモーターと作動可能に連結される安定
して組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む哺乳動物細胞を使用する。様々な
好ましい実施態様において、ベクター配列を含むプラスミドはまた細胞へ導入さ
れる（安定してまたは一時的のどちらか）。次いで、ＡＡＶベクター粒子のレス
キューは、ヘルパーウイルスの導入によって開始される。

【００７５】ＡＡＶの複製およびカプシド化が可能な条件下における宿主細胞の培養後、細
胞および非細胞画分は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、およ
び細胞タンパク質を実質上含まないアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価の調
製物を生ずるように処理され得る。例示的技術は、ヘルパーウイルス、ヘルパー
ウイルスタンパク質、および細胞タンパク質ならびに他の構成要素を実質上含ま
ない高力価ｒＡＡＶ調製物の生成についてＴａｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ
ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＡｔｋｉｎｓｏｎらによって１９９７年９月５日に
出願された米国特許出願（代理人事件番号２２６２７−２００３３００）に概説
されている。

【００７６】これらの様々な例は、十分に高い力価でのＡＡＶの提供、ベクターとパッケー
ジングする構成要素との間での組換えの最小化、および哺乳動物細胞株における
ＡＡＶｒｅｐ遺伝子の発現に関連した潜在的な困難性の減少または回避という
問題に取り組む（なぜなら、Ｒｅｐタンパク質はそれら自体の発現を制限できな
いだけでなく、細胞代謝にも影響を与え得るため）。組換えＡＡＶベクター調製
物の大規模生成に用いられ得るヘルパーウイルスを実質上含まないＡＡＶウイル
スの生産のための技術の例もまた提供される。

【００７７】高い力価のｒＡＡＶ粒子の生産のためのさらなる方法は、米国特許出願６０／
０４１，６０９（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ）；米国特許出願６０／０４１，６８９；お
よび１９９７年１０月２１日に提出された米国特許出願（代理人事件番号２２６
２７−２０００３９００）（Ｌｙｎｃｈら）を含む様々な共有に係る米国特許出
願に記載される。

【００７８】（ＩＴＲの詳細な分析）野生型ＡＡＶＩＴＲは、機能的な複製起点（ｏｒｉ）を提供し、そしてＡＡ
ＶＤＮＡ複製のため、および原核生物プラスミドからのレスキューまたは切り
出しのためにシスで機能する（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３；Ｓａｍｕｌｓｋ
ｉら、１９８７；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９８４；ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭ
ｕｚｙｃｚｋａ、１９８８）。ＩＴＲは概して通常の転写調節配列として働くと
は考えられていない（Ｃａｒｔｅｒ，１９９０；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２；
およびＷａｌｓｈら、１９９２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２）が、野生型ＩＴＲ
は低いレベルの転写活性を提供することが示されている（Ｃａｒｔｅｒら、米国
特許第５，５８７，３０８号；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３ａ）。

【００７９】ＡＡＶ２の場合、野生型ＩＴＲは１４５ヌクレオチド長である（Ｓｒｉｖａｓ
ｔａｖａら、１９８３）。ＩＴＲは、ヘアピン（ＨＰ）領域およびＤ配列という
の２つの領域を含む。ＨＰ配列はＡＡＶ２ＩＴＲの末端１２５ヌクレオチドを
含み、一方Ｄ配列は隣接した２０ヌクレオチドを含む。加えて、末端分解部位（
ｔｒｓ）がＨＰ領域とＤ配列との間に位置する。

【００８０】ＨＰ領域はパリンドローム配列エレメントをＡ、Ｃ’、Ｃ、Ｂ’、Ｂ、Ａ’
の順で含み、従ってそれ自体が折り返されてＴ型ヘアピン構造を形成し得る（図
１）。Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２。末端ＨＰ構造は明らかにウイルスＤＮＡの
複製開始のプライマーとして使用され、１本鎖のゲノムを一方の末端に共有結合
により閉じたヘアピンを有する２本鎖テンプレートへと変換する（Ｂｅｒｎｓお
よびＢｏｈｅｎｚｋｙ，１９８７，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．３２：２４３−３
０６；Ｌｕｓｂｙら、１９８０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３４：４０２−４０９；Ｎａ
ｂｒｅｉｎｉおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，１９８９，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ３０：７４−８５；Ｎｉら、１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１１２８
−１１３８；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，１９８７，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ
２７：１３８−１４７）。

【００８１】Ｄ配列は、ＩＴＲのＴ型構造の形成に関与せず、高い効率のレスキュー、選択
的複製およびＡＡＶゲノムのカプシド化において重要な役割を果たすようである
。Ｗａｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０７７−３０８２。いくつ
かのＤ配列変異体の分析は、ＨＰに対して遠位の１０ヌクレオチドのＤ配列が取
り除かれたとき、ＡＡＶゲノムは効率的なレスキュー、複製およびカプシド化を
受け得ることを示した。しかし、欠失が１５ヌクレオチドに及んだとき、レスキ
ュー、複製およびパッケージングは激しく損なわれた。Ｗａｎｇら、１９９７。
宿主細胞のタンパク質（Ｄ配列結合タンパク質（Ｄ−ＢＰ）と称される）は、Ｄ
配列と特異的に相互作用する。Ｗａｎｇら、１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：
１６６８−１６７７。

【００８２】ｔｒｓはＤ配列とＨＰ配列との接合部に位置する。ｔｒｓは、Ｒｅｐ７８およ
びＲｅｐ６８によって特異的に結合および切断されるようである。Ａｓｈｋｔｏ
ｒａｂおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，１９８９；ＩｍおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，
１９８９；ＩｍおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９０，Ｃｅｌｌ６１：４４７−
４５７；ＩｍおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１１
１９−１１２８；Ｓｎｙｄｅｒら，１９９０、Ｃｅｌｌ６０：１０５−１１３
。ｔｒｓにおけるＲｅｐ媒介切断はＤ配列とは独立しているようである（Ｗａｎ
ｇら、１９９６）。

【００８３】（転写活性化されたＩＴＲ）ＩＴＲの全てがその様々な機能にとって必須というわけではないようである。
例えば、ＨＰ領域に対して遠位のＤ配列の１０ヌクレオチドは、明らかに、レス
キュー、複製およびカプシド化を損なうことなく、取り除かれ得る。例えば、Ｗ
ａｎｇら、１９９７を参照のこと。しかし、ＨＰ領域の末端１２５ヌクレオチド
の多くは、ＤＮＡの複製および末端分解に必要とされるようである（Ｂｏｈｅｎ
ｚｋｙら、１９８８；ＬｅＦｅｂｖｒｅら、１９８４；ＩｍおよびＭｕｚｙｃｚ
ｋａ、１９８９；ＡｓｈｋｔｏｒａｂおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ、１９８９）
。

【００８４】本発明の転写活性化されたＩＴＲは、少なくとも１つの転写活性エレメントを
含むことによって転写により活性化された野生型ＩＴＲの全てまたは部分を含み
得る。様々な型の転写活性エレメントは状況での使用に適している。構成的転写
活性エレメントは、継続レベルの遺伝子転写を提供し、そして導入遺伝子が継続
的基準において発現することが所望される場合に好ましい。誘導性転写活性エレ
メントは概してインデューサ、（または誘導条件）の非存在下において低い活性
を示し、インデューサ、（または誘導条件への転換）の存在下においてアップレ
ギュレートされる。特定の時または特定の位置においてのみ発現が望まれる場合
、または誘導剤を使用して発現レベルを滴定することが望ましい時、それらは好
適であり得る。転写活性エレメントはまた組織特異的であり得る；すなわち、こ
れらは、おそらくこれらの細胞で唯一みられる遺伝子調節エレメントまたはファ
クターに起因して、特定の組織または細胞型においてのみそれらの活性を示し得
る。

【００８５】転写活性エレメントは様々な方法でＩＴＲに組み込まれ得る（例示的な例とし
て図１を参照のこと）。例えば、転写活性エレメントは、ＩＴＲの任意の部分の
５’側（例えば、ＨＰ領域の５’側、またはｔｒｓの５’側）またはＩＴＲの任
意の部分の３’側（例えば、ＨＰのＢ’領域の３’側またはＤ配列の３’側）へ
組み込まれ得る。あるいは、転写活性化されたＩＴＲの転写活性エレメントは、
２つのＩＴＲ配列の間に位置し得る（例えば、ＨＰのセグメントＢとＢ’との間
またはセグメントＣ’とＡ’との間）。転写活性エレメントが、間隔をあけなけ
ればならない２つ以上のエレメントを含む場合、これらのエレメントはＩＴＲの
部分と互い違いになり得る（例えば、１つの転写活性エレメントはＢとＢ’との
間に位置し得、一方別のエレメントはＣとＣ’との間に位置する）。あるいは、
ＩＴＲのヘアピン構造は欠失され、そして転写エレメントの逆方向反復物によっ
て置換され得る；この後者の配置は、構造中に欠失部分を模倣するヘアピンを作
製する。複数のタンデムな転写活性エレメントはまた、転写活性化されたＩＴＲ
において存在し得、そしてこれらは隣接し得るかまたは間隔をあけられ得る。加
えて、タンパク質結合部分（例えば、Ｒｅｐ結合部分）は、転写活性化されたＩ
ＴＲの転写活性エレメントへ導入され得る。転写活性エレメントは、ＲＮＡを形
成するＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの制御転写を可能にする任意の配列を含
み得、例えば下記に定義したような転写活性エレメントを含み得る。

【００８６】転写活性化されたＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターにより保有および発現され得る
導入遺伝子の長さを効果的に最大限にする、比較的制限されるヌクレオチド配列
の長さにおいて、転写活性化およびｒＡＡＶに対するＩＴＲ機能の両方を提供す
る。ＩＴＲへの転写活性エレメントの組み込みは、様々な方法で成し遂げられ得
る。ＩＴＲ配列および転写活性エレメントの配列要件との比較は、ＩＴＲ内にエ
レメントをコードする方法の洞察を提供し得る。例えば、転写活性は、転写活性
エレメントの機能的エレメントを複製するＩＴＲ配列中の特異的変化の導入を通
じてＩＴＲに加えられ得る。特定のヌクレオチド配列を特異的部位で効果的に付
加、欠失、および／または変更する多くの技術が当該分野に存在する（例えば、
ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
００：８１−８８を参照のこと）。

【００８７】転写活性化されたＩＴＲを作製するための別の方法は以下の実施例において記
載している。転写活性化されたＩＴＲの生成はＩＴＲ内の望ましい位置における
制限部位の導入を含んでいた。転写活性エレメントを含む相補的オリゴヌクレオ
チドは、生成した末端がＩＴＲにおける前述の制限部位と適合し得るように互い
にアニーリングした。２本鎖の転写活性エレメントおよび制限消化したＩＴＲは
、転写活性化されたＩＴＲを生成するためにともに連結された。本アプローチは
また、複数の転写活性エレメントを転写活性化されたＩＴＲへ組み込むために使
用され得る。

【００８８】潜在的なｔｒｓ配列は、複製に必要なＩＴＲ配列をさらに減少させる別の方法
を提供し得る。ｐ５プロモーター内の潜在的なｔｒｓは、ＩＴＲの左側末端が完
全に削除されている場合、複製のための代替物となり得る。Ｗａｎｇら、１９９
５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：５７３−５８０；Ｗａｎｇら、１９９６。
さらに、Ｘｉａｏら（１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９４１−９４８）は、
ＡＡＶゲノム（Ｄ配列の２つのコピー、ＡＡＶのニッキング部位に隣接した独特
の配列、およびＩＴＲを１つだけ含む）の１６５塩基のみが、Ｒｅｐ及びヘルパ
ー機能がトランスに与えられる場合、複製が行われるために十分であるらしいと
いうことを示した。従って、本発明のＡＡＶベクターは、単一のＩＴＲおよびＤ
配列もしくはｔｒｓのような、付加的な配列を含み得、それらの１つ以上は、転
写活性化エレメントを含むことにより改変されている。例えば、「ゆらぎ」塩基
対；またはアミノ酸配列のために厳密に要求されるのではないスペーサー（ｓｐ
ａｃｅｒ）セグメントもしくは膜貫通セグメントといった、導入遺伝子のＣ末端
に含まれるか、もしくは存在する決定的でない配列は、ｔｒｓまたはＤ配列の配
列を模倣するように変化し得る。それによって，ＡＡＶベクターに求められる、
ＡＡＶ配列をさらに減少させる。

【００８９】例示のために、ＴＡＴＡボックス、ＧＣボックス、ＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ
Ｉ部位、Ｉｎｒ領域、ｃＡＭＰ調節エレメントであるＣＲＥ部位，ＡＴＦ−Ｉ／
ＣＲＥ部位、ＡＰＢβボックス、ＡＰＢαボックス、ＣＡｒＧボックス、ＣＣＡ
Ｃボックス、もしくは当該分野で公知のような転写に関与する、任意の他のエレ
メントといった、１つ以上の転写的に活性なエレメントを含むことによって転写
的活に性化されたＩＴＲが生成され得る。他の多くの転写的に活性なエレメント
は公知であり、そして新しいそのようなエレメントは、完全に同定される。その
ような配列の多くは、プラスミドとして利用できるか、またはプラスミド内に含
有され、そして、転写活性を持った配列の多くは、ＡＴＣＣ寄託機関または市販
の供給源から得られ得る。新しいエレメントの転写活性を、以下に詳しく記載し
、例示した手順と、類似の手順を使用して、配列エレメントを、プロモーターを
持たない「レポーター」遺伝子に隣接する位置に置きかえるという、標準的な技
術を用いてテストし得る。

【００９０】より大きなプロモーターから、小さな転写活性化配列を取り除くことも可能で
ある。プロモーターの具体例には：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期プ
ロモーター、シミアンウイルス４０のＳＶ４０後期プロモーター、単純ヘルペス
ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、およびＬＴＲエレメントを含む
、種々のレトロウイルスのプロモーターが挙げられる。誘導可能なプロモーター
の例として、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターまたは成長ホルモ
ンプロモーターのような、重金属イオンにより誘導され得るプロモーターおよび
、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７期由来のプロモーターが含
まれる。組織特異的なプロモーターの例として、肝臓における発現についてのア
ルブミンプロモーターまたは肺での発現についてのサーファクチンプロモーター
が挙げられる。

【００９１】異なる転写活性の転写的に活性な種々のＩＴＲは、このように本発明により提
供される。ある応用例では、本発明のある使用は、導入遺伝子の最大限のレベル
の転写を要求し得る。そのような場合では、使用者は，最も高い転写レベルを与
える転写活性化されたＩＴＲを選択し得る。他の応用例では、導入遺伝子のより
控えめな転写が要求され得る。例えば、導入遺伝子の産物がわずかに毒性があり
、そして／または治療目的のためには、比較的低いレベルの転写で十分である場
合、野生型ＩＴＲの２倍から５倍に等しい転写レベルが最適であり得る。このよ
うな場合において、使用者は、所望の（しかし、必ずしも最大ではない）レベル
の転写を提供する転写的に活性なＩＴＲを選択し得る。

【００９２】適切なレベルの転写、およびこのような導入遺伝子の発現は、特定の遺伝子治
療に関しては、使用者が決定する。代表的には、遺伝子治療が、欠損したかまた
は欠失した遺伝子を修正するために行われる場合、その野生型の遺伝子のレベル
に近い導入遺伝子の発現のレベルが選択される。その他の場合では、より高レベ
ルの発現が、より有益であると証明され得る。

【００９３】従って、転写活性化されたＩＴＲの転写活性は、ＩＴＲに組み込まれた転写活
性エレメントによって決定され得る。転写的に活性なエレメントを組み合わせる
と、それらのエレメントを単独で用いた場合とは異なった方法で転写活性に影響
し得る。お互いに関係のある転写的に活性なエレメントの間隔をあけること、ま
たは方向づけはまた、それらの組み合わされた転写活性に影響を与え得る。実施
例２では、さらなるエレメントが転写的に活性なＩＴＲに組み込まれた場合、転
写活性が増加した例を実証する（転写エレメント６を有するｒＡＡＶの結果と転
写エレメント７を有するｒＡＡＶの結果を比較のこと）。

【００９４】転写活性化されたＩＴＲからの転写活性の調節はまた、転写活性エレメントの
ヌクレオチドを変えることにより達成され得る。転写活性エレメントの機能は、
一般的にエレメントの塩基配列を特異的に認識する制御タンパク質の結合に依存
する。転写的に活性なエレメントのタンパク質結合部位の変化（すなわち、ヌク
レオチドの挿入、欠損または置換）は、タンパク質の結合能力に影響を与え得る
。例えば、タンパク質とその認識配列との間により高い結合親和力を引き起こす
エレメントの配列の変化は、転写の増加をもたらし得る。特定のヌクレオチド配
列における部位特異的な変化を導入する方法は、当業者に周知である。ヌクレオ
チド配列中のタンパク質結合ドメインは、例えば電気泳動移動度シフトアッセイ
、ＤＮａｓｅ保護アッセイ、メチル化干渉アッセイおよび、その他の当該分野で
公知のアッセイによって決定され得る。

【００９５】転写活性化されたＩＴＲの転写活性を試験するために、実施例２に例示したよ
うに、容易にアッセイし得る酵素活性をコードする、レポーター遺伝子ポリヌク
レオチドをＩＴＲに付加し得る。「レポーター」遺伝子であるクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）は、野生型のＩＴＲ転写活性と比較
して転写活性化されたＩＴＲの転写活性測定をするための手段を提供し得る。以
下に例示したように、培養細胞は一過性に転写活性化されたＩＴＲレポーター遺
伝子構築物でトランスフェクトされ、そして、しかるべき培養期間の後に、細胞
内のＣＡＴ活性の量を決定する。野生型のＩＴＲ由来のものと比較して、転写活
性化されたＩＴＲ由来のＣＡＴ活性の量を、図表を用いて図２に示した。この試
験は、導入遺伝子に最も適切な細胞のタイプで行われ得る。他の多くのプロモー
ターを持たないレポーター遺伝子は、記載され、そして広い範囲において役立つ
。それらは、例えばβガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼをコードする遺伝
子を含む。あるいは、目的の導入遺伝子と連結された、転写活性化されたＩＴＲ
の転写活性は、トランスフェクトされた細胞によって産生される導入遺伝子のｍ
ＲＮＡを直接測定するかもしくは、細胞で生産される導入遺伝子がコードしてい
るポリペプチドを定量することにより決定され得る。

【００９６】当業者は、ＩＴＲへの転写活性エレメントの導入が、複製、パッケージング、
組込み、レスキュー、または他のＩＴＲの機能を損なうかどうかを容易に決定し
得る。例えば、当該分野で公知であるようなパッケージング効率または、レポー
ター遺伝子（抗生物質耐性マーカー、またはルシフェラーゼもしくはβガラクト
シダーゼのような検出可能な遺伝子産物）の発現レベルの比較は、その野生型の
ＩＴＲを含み、他のものは転写活性化されたＩＴＲを含む、他の点では同質遺伝
子型のＡＡＶパッケージングベクターを比較するために行われ得る。

【００９７】（パッケージング細胞株の産生）パッケージング細胞が生成する親株は、ＡＡＶに感受性であり、そしてインビ
トロの培養に用いることの出来る任意の細胞株から得られ得る。より初期から注
目されてきたように、ＡＡＶは非常に広い宿主範囲を有し、そして、サル、ヒト
およびげっ歯類の細胞を含む、種々の哺乳類の細胞型から単離されてきた。ヒト
の遺伝子治療において、適切な補助機能が発現され得るヒトの細胞株が、代表的
には好ましい。例えば、パッケージング細胞株が由来し得る、そのようなヒトの
細胞株は、ＨｅＬａ、Ａ５４９，２９３，ＫＢ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、およびＷ１３
８細胞を含む。ヒト気管支上皮細胞株であるＩＢ３細胞は、本発明の種々の転写
活性化されたＩＴＲの実証のために選択された。

【００９８】（ｒＡＡＶベクターの生成）遺伝子治療のような目的に有用な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を生成するた
めに、転写的に活性なＩＴＲおよび標的ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベ
クターを有するパッケージング細胞株が供給される。ｒＡＡＶベクターはまた、
転写活性化されたＩＴＲ、１つまたは複数のさらなるプロモーター、および標的
ポリヌクレオチドを含有し得る。標的のポリヌクレオチドは、転写活性化された
ＩＴＲの転写的に活性な部分、またはさらなるプロモーターに作動可能に連結さ
れている。疾患の状態に関係して、欠損するか、欠失するか、または低レベルで
発現する任意の種々の遺伝子は、ｒＡＡＶベクターに取り込むための候補である
。

【００９９】例示の目的で、ｒＡＡＶベクターは、プロモータに作動可能に連結した、嚢胞
性線維症膜コンダクタンス調節因子ポリペプチド（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（
ＣＦＴＲ）をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結した転写活性化され
たＩＴＲを含有し得る。現在当該分野で公知であるように、嚢胞性線維症患者由
来の細胞において、機能的に欠損したＣＦＴＲを再構築し得る様々なＣＦＴＲポ
リペプチドが存在する。共有に係る米国特許出願０８／４４５、５５２（発行手
続中）に記載されるように、野生型のタンパク質の１−１１８アミノ酸を欠失し
た切断型のＣＦＴＲポリペプチドは、嚢胞性の欠損を有する細胞（ＩＢ３細胞）
においてｃＡＭＰ調節塩素イオンのコンダクタンスを回復し得た。アミノ酸１−
１１８をコードするＣＦＴＲｃＤＮＡの部位は、ポリヌクレオチドがｒＡＡＶ
にパッケージングされ得るように、全長ｃＤＮＡから削除された。類似して、Ｒ
ｉｃｈら（１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：２０５−２０７）は、塩素イオ
ンを輸送し得、そして天然に存在するＣＦＴＲ欠損の修復能力がある、アミノ酸
残基７０８−８３５を欠損するＣＦＴＲの誘導体について記載している。２つの
さらなる例を挙げると、Ａｒｉｓｐｅら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１５３９−１５４３）は、残基４３３〜５８６を
含むＣＦＴＲのフラグメントは、脂質二重層において正しい塩素イオンチャネル
を再構成するのに十分であることを明らかにした；そして、Ｓｈｅｐｐａｒｄら
（１９９４；Ｃｅｌｌ７６：１０９１−１０９８）は、その長さの約半分であ
る８３６残基において切断されたＣＦＴＲのポリペプチドが、なお制御された塩
素イオンチャネル構築能力があることを明らかにした。このように、ネイティブ
なＣＦＴＲタンパク質および変異体、ならびにそれらのフラグメントの全てが、
本発明において有用であるＣＦＴＲポリペプチドを構成する。

【０１００】用語「ＩＴＲ」は、２つのＩＴＲが同じＡＡＶゲノム上に存在し、相対的にお
互いに反転しているということを意味するが、本発明においては、２つのＩＴＲ
はお互いに完全に反転している必要はない。本発明において、例えば、ＡＡＶベ
クターは、片方の末端に転写活性化されたＩＴＲを含み、そして、もう片方の末
端に、同定されたか、または同定されていないＩＴＲ由来の配列を含有し得る（
実例については図２Ｂ参照のこと）。このＩＴＲ由来の配列は、同じ転写的に活
性なＩＴＲ、異なった転写活性化されたＩＴＲ、野生型のＩＴＲ、Ｄ配列、ｔｒ
ｓ、または、レスキュー、複製およびキャプシド形成機能を可能にする転写活性
化されたＩＴＲを相補することが可能なＩＴＲの任意のその他の部分であり得る
（Ｗａｎｇら、１９９５；Ｗａｎｇら、１９９６；Ｘｉａｏら、１９９７）。

【０１０１】その他の有用な標的のポリヌクレオチドが、本発明において使用され、多くの
異なる適用のためにｒＡＡＶベクターを生成し得る。そのようなポリヌクレオチ
ドには、以下に示すものが含まれるが、それらに制限されない：（ｉ）いくつか
の肺癌および乳癌に関連する欠失したかまたは、損傷したｐ５３遺伝子の置換す
るための、野生型のｐ５３腫瘍サプレッサーのｃＤＮＡのような、構造タンパク
質または酵素の欠失、欠損、または最適なレベルに達しないことのによって引き
起こされる欠損を補う遺伝子治療のその他の形式において有用なタンパク質をコ
ードする、ポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌク
レオチド；（ｉｉｉ）転写因子または翻訳因子に結合するデコイに転写されるポ
リヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードす
るポリヌクレオチド；（ｖ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような
、特定の薬物に感受性であるレシピエント細胞を作り得るポリヌクレオチド；お
よび（ｖｉ）癌治療のためのポリヌクレオチド。

【０１０２】ｒＡＡＶベクターはまた、ｒＡＡＶベクターに感染した細胞の選択を可能にす
るためのポジティブおよび／またはネガティブな選択マーカーを含有し得る。

【０１０３】得られる組み換えＡＡＶベクターを用いた治療の特異性は、導入されるプラス
ミドにより決定されるために、同じパッケージング細胞株がこれらの任意の適用
に用いられ得る。特定の標的ポリヌクレオチドを含有するプラスミドは、例えば
エレクトロポレーションを含むいくつかの可能な方法の１つにより、ｒＡＡＶベ
クターの産生のためにパッケージング細胞内に導入される。

【０１０４】ヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶベクターの導入前に、導入中に、または導入後
に、導入され得る。プラスミドは、ヘルパーウイルスと一緒に培養物中へ同時感
染され得る。次いで、細胞は、当該分野で公知の複製およびパッケージングに適
切な条件下（以下の引用文献を参照のこと）で、適切な期間（代表的には２〜５
日間）培養される。溶解物は、調製され、そして組み換えＡＡＶベクター粒子は
、当該分野で公知の技術により精製される。好ましくは、ＴａｒｇｅｔｅｄＧ
ｅｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる、１９９７年９月５日に出願さ
れた、米国特許（Ａｔｋｉｎｓｏｎら）（代理人番号２２６２７−２００３３０
０）に記載される技術が用いられる。

【０１０５】好ましい実施様態において、転写活性化されたＩＴＲを含有する組み換えＡＡ
Ｖベクターは、それ自体が安定したパッケージング細胞株のクローンに組み込ま
れる。そのような安定な、ベクターを含んだパッケージング株は、使用する準備
ができるまで増殖させ、そして保存され得る。ｒＡＡＶ粒子の産生を誘導するた
めに、使用者は、単にＡＡＶの複製およびパッケージングに適した条件下で、細
胞をヘルパーウイルスに感染させ、そして細胞を培養させる。高い力価のｒＡＡ
Ｖ粒子の生成方法は、米国特許出願５，６５８，７７６；ＷＯ９５／１３３９２
；ＷＯ９６／１７９４７；米国特許出願６０／０４１，６０９；米国特許出願６
０／０４１，６８９；１９９７年１０月２１日に出願された米国特許（Ｌｙｎｃ
ｈら）（代理人番号２２６２７−２００３９００）。

【０１０６】非常に短い配列における内因性のＩＴＲ機能と、転写促進活性の組み合わせを
通じて、本発明における転写活性化されたＩＴＲは、ｒＡＡＶ粒子にキャプシド
形成し得る標的遺伝子のポリヌクレオチド配列の長さを最大化する手段を提供し
、そしてまた、宿主細胞ゲノムにいったん組み込まれると標的ポリヌクレオチド
の転写活性を補助する手段を提供する。本発明は、ＩＴＲに関する内因性の機能
に加えて、転写活性化されたＩＴＲが、作動可能に連結された標的遺伝子の転写
を活性化するための調節エレメントを提供し得るように、ＩＴＲのＤＮＡ配列が
、転写的に活性化され得る方法を記載する。多数の転写的に活性な調節エレメン
トは、当該分野で公知である。そのようなエレメントの活性は、ヌクレオチド配
列、他のエレメントの存在もしくは非存在、そのようなエレメント間の間隔、お
よびエレメントの相対的な方向を含む多くの要因により影響され得る。転写的に
活性なエレメントの全てが、ＩＴＲの状況において所望されるように行われるわ
けではないが、これらは実施例２に例示されるように、容易に生成および試験さ
れ得、転写活性の所望されるレベルを示すこれらの改変されたＩＴＲを同定する
。実施例２に図示したものは、機能的なＡＡＶＩＴＲの状況内で転写活性のレ
ベルの変化を与える転写活性化されたＩＴＲの例である。さらに、そのような転
写的に活性なＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターは、感染性のウイルス粒子に効率
的にパッケージングされる能力を保持する（実施例３）。

【０１０７】以下に示す実施例は、当業者にさらなる指針を提供し、そしていかなる方法に
おいても、本発明を限定するものとしては解釈されない。

【０１０８】（実施例）（実施例１）（ＡＡＶベクターのための転写活性化されたＩＴＲの構築）例示のために、一連の転写活性化されたＩＴＲを構築した。全ての転写的に活
性なエレメントを、定義された配列を有する相補的なオリゴヌクレオチドの対を
用いて構築した。代表的には、相補的なオリゴヌクレオチドをアニールした場合
、ＸｈｏＩ適合性端が生成した。（実施例１−１）（転写エレメント１：ＴＡＴＡボックス／ＣＭＶ配列（４０ｂｐ））

【０１０９】

【化１】二重下線を引いた配列は、ＣＭＶプロモーターのエレメントに由来する。Ｌｅ
ｈｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２４９４−
２５０２。これは、ＴＡＴＡボックス (太字、イタリック)、ならびに転写開始部位までの上流の配列および転写開始部位を含む配列を含む。

【０１１０】この転写エレメントは、ＡＡＶ−ＣＡＴベクターに組み込んでいないが、この
配列は、以下に記載される他のＴＡＴＡボックスを含む転写エレメントのサブ配
列である。

【０１１１】（実施例１−２）（転写エレメント２：ＩｎＲ(合成開始領域）（５０−ｂｐ）を有する２７− ｂｐエレメント（ホスホリパーゼＡ２遺伝子））

【０１１２】

【化２】このエレメントは細胞質ゾルのホスホターゼＡ₂（ｃＰＬＡ₂）遺伝子プロモー
ターに由来し、そしてＴＡＴＡボックスを含まない。Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、１
９９５、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：２９３−３０１。転写エ
レメント２は、隣接している配列に沿った２７ヌクレオチド断片を含み、ｃＰＬ
Ａ₂遺伝子の主要な転写開始領域に対して、全てで−３０から＋１４（下線）の配列を含む。オリゴヌクレオチド端の余分な配列は、ＸｈｏＩ制限酵素部位の突
出末端を形成する。その断片はまた、ＣＴＣＣＣＴＣＴ（太字）の配列を含み、
これは、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子末端のイ
ニシエーターエレメント（ＣＴＣＡＮＴＣＴ）に類似する（下線部が異なってい
る）、Ｓｍａｌｅら、１９８９。

【０１１３】（実施例１−３）（転写エレメント３：ＣＲＥサイト＋ＴＡＴＡボックス（６０−ｂｐ））

【０１１４】

【化３】この転写エレメントは、ｃＡＭＰ調節エレメント（ＣＲＥ）のみ、およびＴＡ
ＴＡボックス（太字、イタリック）からＣＲＥの間隔をあける配列を含む。この
ＣＲＥ部位は、Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰａｓｅ α１サブユニット（Ａｔｐ１ α１）
遺伝子プロモーター由来である。Ｓｕｚｕｋｉ−Ｙａｇａｗａら、１９９２、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４０４６−４０５５；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら
、１９９５、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：２８４８−２８５５
。これらの配列は、ＣＭＶＴＡＴＡボックス、および転写開始部位（二重下線
部）に融合される。Ｌｅｈｎｅｒら、１９９１。

【０１１５】（実施例１−４）（転写エレメント４：ＡＰＢβ＋ＴＡＴＡボックス（６７−ｂｐ））

【０１１６】

【化４】オリゴヌクレオチド１（配列番号７）（下線部）の５から３２のヌクレオチド
配列は、ヒトアミロイドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）プロモーターの一部に由
来し、そしてＱｕｉｔｓｃｈｋｅ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９
：２１２２９−２１２３３により定義された、核因子結合領域ＡＰＢβボックス
（太字）を含む。ＨｅＬａそしてＰＣ−１２細胞のＡＰＰプロモーターの総合活
性の少なくとも７０−９０％は、ＡＰＢβ結合ドメインに起因し得る。ＡＰＰプ
ロモーターは、明らかにＣＣＡＡＴまたはＴＡＴＡボックスを欠くが、本転写エ
レメントはＴＡＴＡボックス由来（太字、イタリック）の配列、およびＣＭＶプ
ロモーターの転写開始部位の配列（ヌクレオチド３３〜６６、二重下線部）を含
む。Ｌｅｈｎｅｒら、１９９１。

【０１１７】（実施例１−５）（転写エレメント５：ＡＰＢα／ＡＰＢβ＋ＩｎＲ（８２−ｂｐ））

【０１１８】

【化５】上記の転写エレメント４のような、転写エレメント５の配列は、ヒトアミロイ
ドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）プロモーターに由来する。Ｑｕｉｔｓｃｈｋｅ
、１９９４。転写エレメント５は、ＡＰＢβ（太字）、ＡＰＢα（太字、イタリ
ック）そして、ＩｎＲ配列を含む。しかし、これは、内因性のＡＰＰプロモータ
ーと異なり、そこではＡＰＢβとＡＰＢαとの間の１０個のヌクレオチド配列｛
「（）」で示された、ΔＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧ（配列番号１９）｝、およびＡＰ
Ｂαに近い７つのヌクレオチド配列（「（（））」で示した、ΔＣＣＴＧＧＣＴ
）を、転写エレメントを受容可能なサイズ範囲に維持するように削除した。ＡＰ
ＢβとＡＰＢα間の１０ヌクレオチドの欠失は、明らかにプロモーター活性に効
果を有さなかった。Ｑｕｉｔｓｃｈｋｅ、１９９４。

【０１１９】（実施例１−６）（転写エレメント６：ＡＴＦ−１／ＣＲＥ／Ｓｐ１＋ＴＡＴＡボックス（８３
−ｂｐ））

【０１２０】

【化６】この転写エレメントは、Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰａｓｅ α１サブユニット遺伝子プ
ロモーターに由来し、そしてＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位（太字）およびＳｐ１部位
（下線部）を含む。Ｓｕｚｕｋｉ−Ｙａｇａｗａら、１９９２；Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉら、１９９５。ＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位は、核因子と結合することが示され
、そしてＮａ、Ｋ−ＡＴＰａｓｅ α１サブユニット遺伝子の効率的な転写を明
らかに必要とする。Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９５。この配列を、ＣＭＶＴ
ＡＴＡボックス（太字、イタリック）および、転写開始部位に融合させる。

【０１２１】（実施例１−７）（転写エレメント７：ＡＴＦ−１／ＣＲＥ／Ｓｐ１／Ｃ＋ＴＡＴＡボックス（
１１０−ｂｐ））

【０１２２】

【化７】この転写エレメントは、転写エレメント６よりも、Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰａｓｅ
α１サブユニット遺伝子プロモーターのより大きな領域を含む。転写エレメント
７は、上記の構成物６のエレメントを含み、また核タンパク質に結合することが
見出されるプロモーターのさらなる配列、Ｃボックス（太字）を含む。Ｓｕｚｕ
ｋｉ−Ｙａｇａｗａら、１９９２。この配列を、ＣＭＶＴＡＴＡボックス（太
字、イタリック）および、転写開始領域（二重下線部）と再び融合させる。

【０１２３】（実施例１−８）（転写エレメント８：ＣＡｒＧボックス／ＣＣＡＡＴボックス／ＴＡＴＡボッ
クス（８３−ｂｐ））

【０１２４】

【化８】この転写エレメントは、ヒトβ−アクチン遺伝子（下線部）のＣＣＡＡＴボッ
クス（イタリック）およびＣＡｒＧボックス（太字）を含有する配列に由来する
配列を含む。Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｉｉｊｉｍａら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６１３３−６１３７。ＣＡｒＧボッ
クスは、ＷがＡまたはＴである配列ＣＣＷ₆ＧＧを含む。この転写エレメントは、１０−ｂｐの欠失を｛ΔＣＣＧＡＡＡＧＴＴＧ（配列番号２０）「−」で示す
｝ＣＣＡＡＴボックスとＣＡｒＧボックスのと間に導入し、そしてＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧ（配列番号２１）（下線部）の１箇所にＡからＣの変異を作製した、と
いう点で、公表された配列の転写エレメントとは異なる。この配列は、ＣＭＶ
ＴＡＴＡボックス（太字、イタリック）および転写開始部位を含む配列（二重下
線部）と融合する。野生型のヒトβーアクチン遺伝子プロモーターにおいて、Ｃ
ＡｒＧボックスは、推定されるＴＡＴＡボックスから２３ヌクレオチド分離する
；この転写エレメント中では、これらのエレメントは、１５ヌクレオチド分離す
る。

【０１２５】（実施例１−９）（転写エレメント９：ＣＣＡＣボックス４／ＴＡＴＡボックス（８８−ｂｐ）
）

【０１２６】

【化９】この転写エレメントは、Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５０２４−５０３２で定義された、筋肉特異的なヒトミ
オグロビンプロモーターからの、ＣＣＡＣボックス（太字）の４つのコピーを含
む。しかし、ＣＣＡＣボックスを含む配列のくり返しが、種々の細胞型において
機能することが、記載された。本発明において使用された、ＣＣＡＣボックスは
、以前に公表されたものより短いものであった。くり返す配列は、ＣＭＶＴＡ
ＴＡボックス（太字、イタリック）および、転写開始部位を含むセグメント（二
重下線部）と融合する。

【０１２７】（実施例１−１０改変ＩＴＲを産成するための、例示的な転写エレメントの
使用）転写活性化されたＩＴＲを構築するために、上記の種々の転写的に活性なエレ
メントを含む相補的なオリゴヌクレオチドをアニールし（ＸｈｏＩ適合端を形成
する）、キナーゼ反応を行い、そしてそのセグメントを、ＡＡＶ−ＣＡＴベクタ
ーのＸｈｏＩサイトにクローニングした。ＸｈｏＩサイトを、上流のＩＴＲ（１
４６塩基対）の直前の３’端に操作した。従って、転写的に活性なエレメントを
ＩＴＲと組み合わせて配置し、そして転写活性化されたＩＴＲを形成した。ＡＡ
Ｖ−ＣＡＴベクターは、Ａｆｉｏｎｅら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３
２３５−３２４１に記載された、ＡＡＶ−ＣＦＴＲベクターとして、同じ５’非
翻訳配列、ポリＡシグナル、およびＸｈｏＩクローニング部位を含む。しかし、
ＡＡＶ−ＣＡＴベクターは、３’（下流）ＩＴＲより前のＡＡＶの野生型配列の
３７ヌクレオチドを含む。このクローニングは、転写活性化されたＩＴＲをＣＡ
Ｔ遺伝子との作動可能な連結に配置した。

【０１２８】（実施例２）（転写活性化されたＩＴＲを含むＡＡＶＣＡＴベクターの転写活性試験）ＣＡＴレポーター遺伝子の転写を駆動する転写活性化されたＩＴＲの能力はＣ
Ｆ患者に由来し、そしてアデノ／ＳＶ４０ハイブリッドウイルスで不死化したヒ
ト気管支上皮細胞株であるＣＦＢＥＩＢ３−１細胞株（ＩＢ３細胞）で、試験
した。Ｌｕｏら、１９８９、ＰｆｌｕｅｇｅｒｓＡｒｃｈ．４１５：１９８−
２０３；Ｚｅｉｔｌｉｎら、１９９１、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４：３１３−３１９。

【０１２９】これらの転写活性化されたＩＴＲを有する、ＡＡＶＣＡＴベクターをＩＢ−
３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出
液を調製し、そして３７℃、１６時間、５０μＬの細胞抽出液（５×１０⁵細胞に等価）と共にインキュベートすることにより、アセチル化した¹⁴Ｃ−クロラム
フェニコールの量（％）としてＣＡＴ活性を測定し、その後シリカゲル薄層クロ
マトグラフィーおよびシンチレーション計数により、アセチル化および非アセチ
ル化基質を分離し、放射能を測定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。

【０１３０】ＡＡＶ−ＣＡＴベクターを含む種々の転写活性化されたＩＴＲから産生するＣ
ＡＴ活性を、ＣＡＴ遺伝子の転写がＩＴＲのみに依存するベクターである、デル
タ３７ＡＡＶＣＡＴベクターからの生成する活性に関連して示す。ＩＴＲは低
いレベルの転写プロモーター活性を持つと考えられる（Ｃａｒｔｅｒら、米国特
許第５，５８７，３０８；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３ａ）。結果を図２に示し、
そして以下に要約する。

【０１３１】

【表１】上記のように、開示された転写活性化されたＩＴＲは、少なくとも野生型のＩ
ＴＲ（バックグラウンドのレベル）の２倍以下の増加から、バックグラウンドの
約７倍増加、約１０倍増加、約４０倍増加、約５０倍より多い増加までの範囲に
わたる、種々のレベルの転写活性を提供した。

【０１３２】従って、本発明に含まれる種々の転写的に活性なエレメントは、低レベルの、
中程度レベルの、または高レベルの所望の遺伝子産物の発現を誘導するために、
有用であり得る。

【０１３３】本明細書中に記載したエレメントよりも長いか、または、本明細書中に記載し
たエレメントよりも短いかのいずれかの転写的に活性なエレメントは、本発明に
おいて使用され得る。

【０１３４】より活性である転写的に活性なエレメントを、ＴＡＴＡボックス、ならびにＡ
ＰＢβ、ＡＴＦ−１／ＣＲＥ／Ｓｐ１、ＡＴＦ−１／ＣＲＥ／Ｓｐ１／Ｃ、およ
びＣＣＡＣｂｏｘ₄または他のセグメントまたは結合部位の構成要素由来の、さらなる転写的に活性なエレメントを一般的に含む。そのヌクレオチド配列が本
明細書中で開示した配列と同一でない場合でさえ、構成要素の類似したセットを
含む他の転写的に活性なエレメントは、本発明において使用され得る。例えば、
多くの類似したエレメントが他のプロモーターより同定され、そして得られ得る
。さらに、変化は、プロモーターの必須の要素の間、または、これらの変化が必
須のエレメントの活性を妨げない条件で、必須のエレメントの内部でなされ得る
（例えば、転写的活性を著しく減少させない当該分野では公知であるＴＡＴＡボ
ックス領域での置換）。あるいは、低レベルの転写が所望される場合、特定の変
異を、所望のレベルに転写活性を減少させるために必須のエレメント中に作り得
る（例えば、当該分野で公知のＴＡＴＡボックスにおける置換を用いて転写活性
を減少させる）。

【０１３５】（実施例３）（転写活性化されたＩＴＲを有するＡＡＶＣＦＴＲベクターからのウイルス
粒子の産生）ＡＡＶＣＡＴベクターの転写活性の種々の上昇したレベルを実証した転写活
性化されたＩＴＲを、Ａｆｉｏｎｅら（１９９６）のｔｇＡＡＶＣＦＴＲベクタ
ーに置けるものとしてとして、ＣＦＴＲｃＤＮＡの上流にクローニングした。例
示的なｒＡＡＶＣＦＴＲベクターを、そのようにして転写的に活性なエレメン
ト４（ＡＰＢβ＋ＴＡＴＡボックス）、６（ＡＴＦ−１／ＣＲＥ／Ｓｐ１＋ＴＡ
ＴＡボックス）、７（ＡＴＦ−１／ＣＲＥ／Ｓｐ１／Ｃ＋ＴＡＴＡボックス）、
および９（ＣＣＡＣｂｏｘ₄＋ＴＡＴＡボックス）を含む転写活性化されたＩＴＲを用いて生成した。ウイルスの調製物は、野生型のＩＴＲおよび、ＣＦＴＲ
ｃＤＮＡを含む、これらの４つのベクターおよび親ベクターから作製した。

【０１３６】ウイルスの調製のために、ＪＩｃ１２細胞のＴ２２５フラスコに、ＤＥＡＥ−
デキストラントランスフェクション法を用いて、それぞれのベクターを一過性に
トランスフェクションした。細胞、フラスコから細胞をかき取ることによりトラ
ンスフェクションから７２時間後に収集し、５×１０⁶ 細胞／ｍｌの割合でＴＭＥＧ（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＤＴＡ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）および１００ｍＭＮａＣｌで再懸濁した。細
胞を凍結／解凍のサイクルにより溶解し、続いて超音波処理（４×１５秒バース
ト）を行った。細胞の溶解物に３７℃、１時間のベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａ
ｓｅ）処理を行い、次いで、５．０ミクロンのＭｉｌｌｅｘＳＶフィルターを
通して濾過した。ｒＡＡＶウイルス粒子を１つのカラムで精製した。ｒＡＡＶウ
イルス粒子を含む画分をプールし、そして透析した。

【０１３７】ＤＮａｓｅ耐性ｒＡＡＶ粒子の数を、以下に示すスロットブロット法により決
定した。サンプルのアリコートを６５℃で、０．４ＭＮａＯＨ、１０ｍＭＥ
ＤＴＡ、１．０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で変性させた。サンプルおよびア
デノウイルス標準物を希釈して、スロットブロットマニホールド（ｓｌｏｔｂ
ｌｏｔｍａｎｉｆｏｌｄ）を用いて、ナイロンメンブレン上にろ過し、そして
０．４ｍＭＮａＯＨで洗浄した。フィルターをアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子配
列に対応する、³²Ｐラベルしたプローブを用いてハイブリダイズした。完全なＡ
ｄ５ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０２９９６で利用可能である。１．０
ＫｂのＳｓｐＩ−ＸｂａＩフラグメントを含むプローブ（３３９−１３３９番の
ヌクレオチドに対応）を使用し、そしてブロットを、ホスホイメージャー（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）により
分析した。等価な１つのゲノムを、１つのアデノウイルス粒子に等価なものとみ
なした。

【０１３８】感染性のｒＡＡＶ粒子の数は、Ｃ３７複製アッセイに従って、決定した。Ｈｅ
ＬａＣ３７を、ｒＡＡＶベクターの複製のためのＡＡＶＲｅｐタンパク質の
誘導性の発現を可能にするように構築した。手短に言えば、マウスメタロチオネ
インＩプロモーター、ＡＡＶ２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子からなるＡＡＶＲｅ
ｐ／Ｃａｐ発現カセット、およびＡＡＶ転写終了部位を構築した。ＳＶ４０初期
プロモーター、ＳＶ４０のスモールＴイントロン、およびＳＶ４０ポリアデニル
化シグナルの制御下におけるネオマイシン耐性遺伝子もまたプラスミドに含まれ
る。ＨｅＬａ細胞にプラスミドをトランスフェクトさせ、Ｇ４１８中でクローン
を選択した。クローンの集団は、ｒＡＡＶベクターの増幅アッセイによりスクリ
ーニングした。あるＣ３７というクローンは、形質転換およびアデノウイルスの
感染後、一貫し、かつ用量依存的なｒＡＡＶベクターの増幅を示した。

【０１３９】ベクターの複製の検出は、ＤＮＡの単離、その後のＣＦＴＲプローブへのハイ
ブリダイゼーションにより達成する。詳細には、ＨｅＬａＣ３７細胞を、１０
％ＦＢＳおよび、２．０ｍＭＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭとともに、組
織培養フラスコに４．４×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²で接種し、そして５％ＣＯ ₂ の加湿したインキュベーターで、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで細胞に、アデノウイルス（ＭＯＩ＝５）およびｒＡＡＶサンプルの７２時間の
希釈物を接種した。細胞を、かきとって収集し、サザンブロットアッセイのため
に調製した。全細胞ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、１％のアガロースゲ
ルで電気泳動を行い、ナイロン６６メンブレンに転写し、続いて、³²Ｐ標識され
た、ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ制限フラグメントを用いて、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。このプローブは、ＡＡＶＣＦＴＲベクターのおよそ１．５ｋｂの
フラグメントを検出する。ベクターの複製を、内因性のゲノムＣＦＴＲのバンド
に対して相対的に定量化し、そして複製ユニットとして表した。1つの複製ユニット（ＲＵ）は、およそ１．８ｋｂの内因性のゲノムＣＦＴＲバンドのユニット
に相当するシグナル強度として定義する。いくつかの実施例において、連続的に
希釈した公知ベクターの標準物の直線回帰を用いて、サンプル中のベクターの濃
度を推定及び計算した。

【０１４０】両方のアッセイの結果から、ウイルス粒子産生に関して、親のＩＴＲＡＡＶ
ＣＦＴＲウイルスの調製物と転写活性化されたＩＴＲＡＡＶＣＦＴＲウイ
ルスの調製物との間には、有意差がないことが示された。

【０１４１】これらの結果は、ｒＡＡＶベクターからの感染性のウイルス粒子のパッケージ
ングまたは産生に干渉することなく、それらの転写活性の有意に増加する改変が
ＡＡＶＩＴＲになされ得ることを示した。従って、そのような転写活性化され
たＩＴＲを、発現レベルを向上させ得る、トランスジーンを送達することが可能
なｒＡＡＶベクターの調製に利用し得る。

【０１４２】（実施例４）（転写活性化されたＩＴＲを有するＡＡＶベクターの構築）本発明の組換えＡＡＶベクターは、配列中に転写活性化されたＩＴＲ、標的の
ポリヌクレオチド、および複製およびパッケージングに十分な第２のＩＴＲエレ
メントを構築することによって調製され得る。転写活性化されたＩＴＲは、標的
ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるべきである。第２のＩＴＲエレメント
は、野生型のＩＴＲ、ＩＴＲのＤ配列、ｔｒｓ、または複製、レスキュー、およ
びパッケージングを可能にするために十分な任意のＩＴＲの部分を含有し得る。
ＡＡＶベクターの長さは、理想的には約４．２〜５ｋｂの間である。

【０１４３】ＡＡＶベクターは、任意のまたは全ての以下のエレメントもまた含み得るプラ
スミド上に位置し得る：レポーター遺伝子、複製起点、さらなるプロモーター、
複数のクローニングサイトなど。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ＡおよびＢ。図１は、野生型ＩＴＲの領域（Ａ）および本発明の転写活性
化されたＩＴＲの例（Ｂ）を示す。（ＨＰ、ヘアピン領域；ｔｒｓ、末端決定部
位；Ｄ、Ｄ配列）

【図２】図２。転写活性化されたＩＴＲを含むＡＡＶＣＡＴベクターを用いたトラン
スフェクション後のＣＡＴ活性。棒グラフは、様々なＡＡＶＣＡＴベクターを
用いてトランスフェクトしたＩＢ３細胞におけるＣＡＴ活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA80 DA02 EA02 EA04 FA02 FA10 GA11 GA18 HA17 4B065 AA90X AA95Y AB01 AC14 BA01 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】転写活性化されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端
反復（ＩＴＲ）を含有するポリヌクレオチドであって、ここで該転写活性化され
たＩＴＲは、長さ約４００ｂｐ未満であり、そして異種の転写活性因子を含有し
、そしてここで該転写活性化されたＩＴＲは、転写を許容する条件下において、
野生型ＩＴＲと比較して少なくとも約２倍の転写活性の増加を示す、ポリヌクレ
オチド。
【請求項２】前記転写活性化されたＩＴＲが約２００ｂｐ未満である、請
求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】前記転写活性化されたＩＴＲが、転写を許容する条件下で、
野生型ＩＴＲと比較して少なくとも約７倍の転写活性の増加を示す、請求項１に
記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】前記転写活性化されたＩＴＲが、転写開始配列および少なく
とも１つのＣＣＡＣボックスを含有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】前記転写開始配列および少なくとも１つのＣＣＡＣボックス
が、約９０ｎｔ未満のポリヌクレオチドセグメント内に含有される、請求項４に
記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】前記転写活性化されたＩＴＲの前記転写活性因子が、配列番
号１７またはそれと相補的な配列と少なくとも約９０％の全体同一性を有する、
請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７を含有する、請求項
４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】前記転写活性化されたＩＴＲが、転写を許容する条件下で、
野生型ＩＴＲと比較して少なくとも約１０倍の転写活性の増加を示す、請求項１
に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】前記転写活性化されたＩＴＲが、アミロイドβタンパク質前
駆体（ＡＰＰ）プロモーターの転写活性因子および転写開始配列を含有する、請
求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】前記アミロイドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）プロモータ
ーの転写活性因子および前記転写開始配列が、約７０ｎｔ未満のポリヌクレオチ
ドセグメント内に含有される、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】前記転写活性化されたＩＴＲの前記転写活性因子が、配列
番号７またはそれと相補的な配列と少なくとも約９０％の全体配列同一性を有す
る、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】前記ポリヌクレオチドが、配列番号７を含有する、請求項
９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】前記転写活性化されたＩＴＲが、転写を許容する条件下で
、野生型ＩＴＲと比較して少なくとも約４０倍の転写活性の増加を示す、請求項
１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】前記転写活性化されたＩＴＲが、ＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位
、Ｓｐ１部位、および転写開始配列を含有する、請求項１３に記載のポリヌクレ
オチド。
【請求項１５】前記ＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位、前記Ｓｐ１部位、および前
記転写開始配列が、約８５ｎｔ未満のポリヌクレオチドセグメント内に含有され
る、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】前記転写活性化されたＩＴＲの前記転写活性因子が、配列
番号１１またはそれと相補的な配列と少なくとも約９０％の全体配列同一性を有
する、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１を含有する、請求
項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】前記転写活性化されたＩＴＲが、転写を許容する条件下で
、野生型ＩＴＲと比較して少なくとも約５０倍の転写活性の増加を示す、請求項
１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】前記転写活性化されたＩＴＲが、ＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位
、Ｓｐ１部位、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅα１サブユニット遺伝子プロモーターの
Ｃボックス因子、および転写開始配列を含有する、請求項１８に記載のポリヌク
レオチド。
【請求項２０】前記ＡＴＦ−１／ＣＲＥ部位、前記Ｓｐ１部位、Ｃボック
ス因子、および前記転写開始配列が、約１１０ｎｔ未満のポリヌクレオチドセグ
メント内に含有される、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】前記転写活性化されたＩＴＲの前記転写活性因子が、配列
番号１３またはそれと相補的な配列と少なくとも約９０％の全体配列同一性を有
する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３を含有する、請求
項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】前記転写活性化されたＩＴＲが、異種の転写開始配列を含
有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】前記転写活性化されたＩＴＲが、転写開始配列としてＴＡ
ＴＡボックスを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】以下を順序正しく含有するポリヌクレオチド：転写活性化されたＩＴＲである第１のＩＴＲであって、ここで該転写活性化さ
れたＩＴＲは、長さ４００ｂｐ未満であり、そして転写活性因子を含有し、そし
てここで該転写活性化されたＩＴＲは、転写を許容する条件下において、野生型
ＩＴＲと比較して少なくとも２倍の転写活性の増加を示す、ＩＴＲ；および野生型ＩＴＲ、転写活性化されたＩＴＲ、Ｄ配列、ｔｒｓまたは野生型ＩＴＲ
の一部からなる群から選択される、第２のＩＴＲ。
【請求項２６】前記転写活性化されたＩＴＲが約２００ｂｐ未満である、
請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含有し、複製起点
およびレポーター遺伝子からなる群から選択される因子をさらに含有するプラス
ミド。
【請求項２８】前記転写活性化されたＩＴＲと作動可能に連結された遺伝
子をさらに含有する、前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】前記遺伝子がＣＦＴＲ遺伝子である、請求項２８に記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項３０】前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有す
るＡＡＶウイルス粒子。
【請求項３１】請求項１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを
含有する哺乳動物細胞であって、ここで該ポリヌクレオチドが該細胞の染色体に
安定的に組み込まれている、哺乳動物細胞。
【請求項３２】前記細胞が、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝
子を含有する、請求項３１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３３】前記細胞が、該細胞の染色体に安定的に組み込まれたＡＡ
Ｖｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｃａｐ遺伝子を含有する、請求項３１に記載の
哺乳動物細胞。
【請求項３４】組換えＡＡＶベクターをパッケージングする方法であって
、ａ）哺乳動物細胞を提供する工程；ｂ）組換えＡＡＶベクターを導入する工程であって、該ベクターは、転写活性化されたＩＴＲである第１のＩＴＲであって、ここで該転写活性化さ
れたＩＴＲは、長さ４００ｂｐ未満であり、そして転写活性因子を含有し、そし
てここで該転写活性化されたＩＴＲは、転写を許容する条件下において、野生型
ＩＴＲと比較して少なくとも２倍の転写活性の増加を示す、ＩＴＲ；および野生型ＩＴＲ、転写活性化されたＩＴＲ、Ｄ配列、ｔｒｓまたは野生型ＩＴＲ
の一部からなる群から選択される、第２のＩＴＲ；を含有する、工程；ｃ）該細胞内にＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を提供する工程；ｄ）ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能を提供する工程；およびｅ）該細胞を、ＡＡＶベクターの複製およびパッケージングに適した条件下で
インキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項３５】前記Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質が、前記細
胞の染色体に組み込まれたｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子から産生される、請
求項３４に記載の方法。