JP4353701B2 - Foxp3蛋白質を用いた霊長類における免疫機能の調節方法 - Google Patents
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Description
本発明は、調節性T細胞のCD4+CD25+サブセットの生産および/または活性に係わるscurfin蛋白質の発見に関する。Foxp3発現は、この調節性表現型の細胞と直接相関し、その発現は、この特定サブセットの活性化の際にユニークに増加する。突然変異(sf)動物は、このサブセットに欠けて、Foxp3トランスジェニック動物は、CD4+CD25+細胞の増加した割合を有するようである。更に、トランスジェニック動物由来のCD4+CD25+サブセットは、細胞ごとに基づき抑制的でないようであるが、Foxp3の発現は、やはりそのCD25−対応物に対してこのサブセットにて上昇する。面白くも、CD4+CD25−T細胞におけるFoxp3の過剰発現は、これらの細胞に抑制活性を付与するが、CD4+CD25+T細胞より低い効果に止まる。結局、このデータは、最近述べられた転写因子、scurfinが免疫細胞機能の重要な調節剤であり、主としてCD4+CD25+調節性T細胞の生産および/または活性を経て働き得ることを示唆する。
本発明を詳しくする前に、以下に特定の用語の定義を示し、そして本明細書以降で使用する略語をリストし定義することは、これらを理解するために有用であり得る。
簡潔には、本発明は、Fkhsfをエンコードする遺伝子における突然変異が、脾腫、肝腫、大きく拡大したリンパ節、ラント症候群、剥脱性皮膚炎、および厚悪形耳を含む粗大な形態学的症状を生じるリンパ節、脾臓、肝臓および皮膚の進行性リンパ球浸潤によって特徴付けられる希少な状況(scurfy)を生じるという意外な発見に基づく(Godfrey et al.,Amer.J.Pathol.138:1379,1991;Godfrey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5528,1991)。羽付き螺旋(winged−helix)ファミリーのこの新メンバーは、免疫系の新規構成要素を代表する。
本明細書中で、色々なFKHsfまたはFkhsf蛋白質および核酸分子(またはその部分)が提供されたが、本発明に関して、一つ以上のこれらの蛋白質に対する言及は、実質的に類似な活性の蛋白質を含むと理解されるべきであることが理解される。本明細書中で使用する場合、蛋白質は、以下の場合、”実質的に類似”であると考えられる:(a)蛋白質をエンコードする遺伝子のコード領域から誘導されたヌクレオチド配列によりエンコードされる場合(例えば、配列の部分または配列の対立遺伝子バリエーションを含む);(b)中度、高度もしくは極高度のストリンジェンシーの下、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.,1989)、または少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上が本明細書中で開示した配列と相同である場合、あるいは、(c)DNA配列が、(a)または(b)に規定したDNA配列に対して、遺伝子コードの結果として縮重している場合。また、本明細書中に開示される核酸分子は、相補的配列および非相補的配列を含み、ただし、配列は、さもなければ本明細書に示される基準に符合する。本発明において、高度のストリンジェンシーとは標準ハイブリダイゼーション条件を意味する(例えば、65℃で5XSSPE、0.5% SDS、または相当するもの)。ハイブリダイゼーションの目的に、アミノ端ドメイン、ジンクフィンガードメイン、中間部ドメイン、またはフォークヘッドドメインをエンコードした核酸分子(実施例10参照)を利用できる。
上記の通り、本発明は免疫系を調節できる分子の選択および/または単離する方法を提供する。適切な分析の代表例は、酵母と哺乳類の2−ハイブリッド系(例えば、Dang et al.,Mol.Cell.Biol.11:954,1991; Fearon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7958,1992)、DNA結合分析、アンチセンス分析、伝統的蛋白質結合分析(例えば、125Iまたは経時解析蛍光)、ゲル電気泳動および直接蛋白質シークエンシングを組み合わせた免疫沈澱、Fkhsf調節された遺伝子の転写分析、サイトカイン生産および増殖分析を含む。
広汎なバラエティの分子は、その免疫系を調節する能力について分析され得る。以下でさらに詳細に議論される代表例、有機分子、蛋白質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。
多数の有機分子は、その免疫系を調節する能力について分析され得る。例えば、本発明の一実施形態において、適切な有機分子は、化学品を個別に分析する化学ライブラリー、または複数の化合物を一度に分析し、次いで、最も活性な化合物を決定し、単離するようにデコンボレーションされるコンビナトリアル化学ライブラリーのいずれかから選択され得る。
広汎な蛋白質およびペプチドは、免疫系を調節するために候補分子と同様にに用いられる。
免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを経て得られ得る。このようなライブラリーは当業者により調製され得るか(例えば、米国特許4,528,266および4,359,535,およびPatent Cooperation Treaty Publication Nos.WO 92/15679,WO 92/15677,WO 90/07862,WO 90/02809を参照のこと)、または販売元から購入され得る(例えば、New England BiolabsTM Phage Display Peptide Library Kit)。
免疫系を調節する抗体は、本明細書中の開示を考慮して容易に製造され得る。本発明において、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、アンチイデオタイプ抗体、抗体断片(例えば、Fab、およびF(ab’)2、Fv可変領域、または相補性決定領域)を含むことが理解される。上記の通り、抗体は107M以上、好ましくは108M以上のKaで結合した場合、Fkhsfに対して特異的であると理解される。モノクロナール抗体または結合パートナーの親和性、および結合の阻害は、当業者により容易に決定できる(Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660−72,1949)。
本明細書中および下記の実施例で述べる通り、Fkhsfの改変されたバージョンは、Fkhsfの正常な活性を抑制するのに利用され得、それにより、免疫系を調節する(一般に、上記核酸分子および蛋白質を参照)。
本発明の他の局面では、免疫系を調節できる核酸分子を提供する。例えば、一つの実施形態において、特にFKHsfまたはFkhsf核酸配列、または突然変異体FKHsfまたはFkhsfの発現を抑制するアンチセンス オリゴヌクレオチド分子を提供する(一般に、Hirashima et al.in Molecular Biology of RNA: New Perspectives (M.Inouye and B.S.Dudock,eds.1987 Academic Press,San Diego,p.401);Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (J.S.Cohen,ed.,1989 MacMillan Press,London); Stein and Cheng,Science 261:1004−12,1993; WO 95/10607; 米国特許5,359,051; WO 92/06693;およびEP−A2−612844を参照のこと)。要するに、このような分子は、転写されたFkhsf mRNA配列の領域を有するWatson−Crick塩基対に相補的で、且つWatson−Crick塩基対を形成できるように構築される。得られた二本鎖核酸はmRNAの次のプロセシングと干渉し、蛋白質の合成を阻止する。
FKHsfまたはFkhsf、(およびその突然変異型)、または、上記および下記いずれの候補分子は、例えば、蛍光分子、トキシン、および放射性核種等の色々な化合物でラベル付けができる。蛍光分子の代表的な例として、フルオレセイン、Phycobili蛋白質、例えば、フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。トキシンの代表的な例として、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、トリチン、Shigellaトキシン、およびPseudomonasエキソトキシンAが挙げられる。放射性核種の代表的な例として、Cu−64、Ga−67、Ga−68、Zr−89、Ru−97、Tc−99m、Rh−105、Pd−109、In−111、I−123、I−125、I−131、Re−186、Re−188、Au−198、Au−199、Pb−203、At−211、Pb−212およびBi−212が挙げられる。なお、上記の抗体は、リガンド結合対の1パートナーもラベル付けまたは結合体化できる。代表的な例として、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合蛋白質が挙げられる。
上記の通り、本発明は、色々な医薬組成物も提供する、それには、免疫系を調節する一つの上記の分子および薬学上または生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤が含まれる。一般に、このような担体は、使用する投与量と濃度でレシピエントに無毒であるべきである。通常、このような組成物の調製は、治療剤に緩衝剤、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸)、低分子量(約10残基以下)ポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、炭水化物(ブドウ糖、ショ糖またはデキストリン)、キレート剤(例えばEDTA)、グルタチオンおよび他の安定剤および賦形剤を配合する。中性緩衝化生理食塩水または非特異的血漿アルブミンと混合した生理食塩水は適切な希釈剤である。好ましくは、医薬組成物(または「医薬品」)を消毒して、無発熱性物質の型で提供する。
本発明はまた、免疫系を調節する方法を提供する。この免疫系を調節する本明細書中に記載される分子を使用することにより、温血動物における広汎なバラエティの状態を容易に治療または予防できる。治療され得る温血動物の実例は、脊椎動物と哺乳類の両方を含み、例えば、ヒト、馬、牛、豚、羊、犬、猫、ラットおよびマウスが挙げられる。このような方法は、変化した免疫系を有する患者において治療価値を有し得る。これには色々な免疫不全症候群を有する化学治療を受けてる患者、およびT細胞が媒介した自己免疫疾患を有する患者が含まれる。治療価値はまた、ワクチンアジュバントとしての有用性から認識され得る。
Scurfy 突然変異に応答する遺伝子の同定
A.Scurfy遺伝子のクローニング
オリジナルのscurfy突然変異は、1949年にOak Ridge National Laboratory(ORNL)に寄託した部分的近交系のMRにて自然発生させた。戻し交雑分析をマウスScurfy突然変異を含むX染色体の原動体周囲領域をファインマップするために用いた。同じ領域をカバーする実質的地図は、重なる酵母と細菌の人工染色体(YACsおよびBACs)の単離を経て同時に産生させた。候補領域は一旦、約500キロ塩基対(kb)以下に狭まると、大規模のDNAシークエンシングを、4つの重複BACクローンで行う。この500kb領域における全ての転写ユニットは、配列データベース検索とコンピュータエクソン予測プログラムの適用の組み合わせを経て同定された。次に候補遺伝子は、正常およびScurfy−誘導RNAサンプルより、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)手法で得られcDNAsの配列を比較しScurfy−特異突然変異をスクリーンした。一つの遺伝子(本明細書中でFkhsfと呼ばれる)において、正常cDNAに対し二つの塩基対(bp)挿入がScurfy cDNAのコード領域に見られた。Scurfy突然変異を含むいくつかのマウス系のゲノムDNAから誘導されたPCR生成物のDNA配列を比較することにより、挿入が確認された。また、2bpの挿入はScurfyサンプルのみにしか見られなかった、これをScurfy欠損の可能な原因と確証した。
Scurfy表現型の本当の原因としてのFkhsf遺伝子の正体を、トランスジェニックマウスにて確認した。要するに、Fkhsf遺伝子の約7kbコード領域、および上流の隣接配列の約20kbおよび下流配列の約4kbを含む正常ゲノムDNAの30kb断片(図5)を正常マウスの単一細胞胚に微量注射した。それぞれ区別可能な組込みを有する五匹の個別の創始動物を産生し、各トランスジェニック系統からの雄の動物を雌のsfキャリアと交配した。導入遺伝子(正常 Fkhsf)およびsf突然変異(突然変異体 Fkhsf)の両方を有する雄の後代を分析した。
FKHsf cDNAの生成
完全マウスFkhsf蛋白質をコードする相補的なDNA(cDNA)は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)手法より得られる。より具体的には、第一鎖cDNAを適切な供与源(例えば、マウス脾臓)からの全RNA(5μg)のオリゴ dTプライミング、および標準条件(例えば、Gibco/BRL SuperScript kit)下、逆転写酵素用いる伸長によって生成させる。次に第一鎖cDNAのアリコートを前方向および逆方向のプライマー(前方向プライマー:GCAGATCTCC TGACTCTGCC TTC;逆方向プライマー:GCAGATCTGA CAAGCTGTGT CTG)(0.2 mMの最終濃度)、60 mM Tris−HCl、15 mM 硫酸アンモニウム、1.5 mM 塩化マグネシウム、0.2 mM各dNTPおよび1単位のTaqポリメラーゼの存在下、35サイクルのPCR(94℃ 30秒、63℃ 30秒、72℃ 2分)を行う。
マウスFKHsfに対するヒトオルソログの生成
完全 FKHsf蛋白質をコードしたヒトFKHsf cDNAは、実施例2に記載されるのと本質的に同じ手法で得られる。特に、全脾臓RNAから始め、下記オリゴヌクレオチドプライマー(前方向プライマー:AGCCTGCCCT TGGACAAGGA C;逆方向プライマー:GCAAGACAGT GGAAACCTCA C)、および60℃アニーリング温度の他は上記と同じPCR条件を利用する。
Scurfy突然変異を検出する方法
上記の通り、Scurfy突然変異は、元来sfおよび正常マウスRNAサンプルのRT−PCRより誘導されたcDNAを直接シークエンシングすることによって発見され、ゲノムDNAと同じ領域をシークエンシングすることによって確認された。突然変異の性質(即ち2bpの挿入)は、それ自体が多数の異なる突然変異検出分析をさせる。先ずはオリゴヌクレオチドプローブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このようなハイブリダイゼーション−ベースの分析は、アレイ特異的発現の定量分析を可能にする。
DMO5985(前方向):CTACCCACTGCTGGCAAATG(図1のヌクレオチド825−844)
DMO6724(逆方向):GAAGGAACTATTGCCATGGCTTC(ヌクレオチド1221−1199)。
FKHsf遺伝子発現
半定量RT−PCRを広汎なバラエティの組織と細胞株におけるマウスおよびヒトFkhsf遺伝子発現のパターンの分析に用いた。発現のレベルは、遍在して発現したDAD−1遺伝子に正規化される。要するに、Fkhsf遺伝子は、胸腺、脾臓、分類されたCD4+とCD4−CD8− T−リンパ球、および腎臓、脳、および色々なマウスとヒトのT−細胞株およびヒト腫瘍を含む、これまでに検査された殆ど全ての組織において、極低いレベルで発現される。しかし、発現の欠如は、新しく分類されたマウスB−細胞に見られた。
FKHsfの生体外表現
マウスおよびヒトの全長のFkhsf cDNA、およびこのcDNAの色々な小領域を、哺乳類の細胞(例えば、ヒトJurkat T−細胞株)、E.coliまたは酵母において発現されるベクターにクローン化する。E.coli系または酵母系を、Fkhsf−特異抗体(下記参照)を惹起するための蛋白質の生産に用い得る。
抗−FKHsf 抗体の作製
実施例6記載のベクターから発現される蛋白質を、FKHsf特異抗体の作製のために適当な動物に免疫するために用いる。全長蛋白質または切断された蛋白質のいずれかをこの目的に使う。例えば、E.coli等の細菌、昆虫細胞または哺乳類の細胞から蛋白質が得られる。動物の種類として、マウス、兎、モルモット、ニワトリなどが挙げられる。生化学的特徴付け(免疫沈澱およびウェスタンブロッティング)により測定した場合、FKHsfに特異的な兎抗血清が産生された。
FKHsf遺伝子の機能の分析
FKHsf蛋白質の機能の損失がscurfy動物において観察される表現型(衰弱、過剰免疫応答および死亡)を生じるので、FKHsf蛋白質の過剰表現を評価する分析について述べる。トランスジェニック動物(実施例1に記載)に若干の異なるパラメーターを用いて免疫能の状態を検査する。動物は、リンパ節および胸腺に存在するリンパ系細胞の数(図7)およびT細胞のインビトロでの刺激に対する応答性(図8)について検査する。
ヒトFKHsf cDNA配列はJM2に相関する
ヒトFKHsf cDNA配列の改変バージョンは、GenBank 公共配列データベースに存在する。この配列はJM2(GenBank acc.# AJ005891)と称し、エクソン予測プログラムをFKHsf遺伝子を含むゲノム配列に適用した結果である(Strom,T.M.et al.,未公開 GenBank acc.# AJ005891参照)。これに反し、FKHsf cDNAの構造は、実験的に決定されている。Genetics Computer Group(GCG;Madison,USA) Wisconsin配列分析パッケージのGAPプログラムを、2つの配列の比較に用い、その差異を図9に示す。2つの配列の5’端は、ゲノムDNA配列内でその位置が異なり、FKHsfの第二コードエクソンはJM2から省略され、FKHsf遺伝子の最終イントロンは、JM2 配列にスプライスされていない。これらの差異は、FKHsfに対してより短いアミノ末端領域を有するJM2蛋白質、およびカルボキシ末端におけるフォークヘッド領域内に大きな挿入物(下記参照)を生じる。
FKHsf蛋白質は、種間で保存されている
FKHsf蛋白質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づき部分領域に分け得る。FKHsfにおける二つの主なモチーフは、蛋白質の中間部分におけるC2H2クラスの単一ジンクフィンガー(ZNF)、および蛋白質のカルボキシ末端におけるフォークヘッド(または羽付き螺旋)ドメインである。FKHsfと他の蛋白質と間の相同性の程度を特徴付けるため、蛋白質を4領域まで分けた:
アミノ末端ドメイン:図2の残基1−197 図4の残基1−198
ジンクフィンガードメイン:図2の残基198−221 図4の残基199−222
中間ドメイン:図2の残基222−336 図4の残基223−336
フォークヘッドドメイン: 図2の残基337−429 図4の残基337−431。
新規なFKHsf相関遺伝子の同定
FKHsf遺伝子配列のユニークな特徴は、フォークヘッド含有分子の同じサブクラスに入る他の新規な遺伝子(および蛋白質)を同定するために用いられ得る。FKHsf蛋白質は、フォークヘッドドメインのアミノ末端側に単一のジンクフィンガードメインを有すること、および、フォークヘッドドメインのカルボキシ末端にユニークなところがある。縮重PCRアプローチを、フォークヘッドドメインの上流にジンクフィンガー配列を含む新規な遺伝子を単離するために取り得る。例として、下記縮重プライマーを合成した(縮重の位置を括弧で示し、“I”はヌクレオシドイノシンを示す):
順方向プライマー:CA(TC)GGIGA(GA)TG(CT)AA(GA)TGG
逆方向プライマー:(GA)AACCA(GA)TT(AG)TA(AGT)AT(CT)TC(GA)TT。
野生型Foxp3遺伝子の過剰発現は末梢T細胞数を減少する結果になる
scurfyマウスのオリジンナル育種系統を、Oak Ridge National Laboratory(ORNL)から得、その後、帝王切開によりSPF条件へと誘導した。トランスジェニックマウスを、DNX Transgenic Services(Cranbury,NJ)による卵母細胞マイクロインジェクションにより産生した(Brunkow et al.,Nat.Gen.27:68−72,2001)。2826マウス系について、30.8kbコスミド構築物を、注入のためにマウスBAC K60から産生した。このコスミドは、5’配列の約18kbpおよび3’配列の4kbpと共に全Foxp3遺伝子が含まれている。遺伝子の発現は組織分布に関して内在性遺伝子の発現と平行である(Brunkow et al.,Nat.Gen.27:68−72,2001)。lck−Foxp3トランスジェニック動物を、発現を駆動するlckプロモーターを用いて産生した(Garvin et al.,Int.Immunol 2(2):173,1990)。全ての研究に、トランスジェニックマウスおよびscurfyマウスの両方をC57B1/6バックグランド(JAX)に4−6世代戻し交雑した。戻し交雑の際、応答性または表現型の差異は見られなかった。ノーザンブロット分析を、以前に記載されたように行った(Brunkow et al.,Nat.Gen.27:68−72,2001)。
Scurfinトランスジェニックマウスの胸腺表現型
胸腺選択におけるFoxp3遺伝子の役目は未だ不明である。スーパー抗原特異的Vβ保有胸腺細胞の欠失は、sf/Yトランスジェニックマウスおよび2826トランスジェニックマウス共に正常のようである。これと一致して、それ自体の内在性プロモーターを用いたFoxp3遺伝子の過剰発現(2826系)も胸腺の発育または選択における如何なる明白な変化も見られない。主な表現型サブセット中の胸腺細胞の数(表I)およびその分布は、同腹子対照動物と区別できない。胸腺組織、リンパ節組織および脾臓組織を上記のように集め(Clark et al.,Immunol 162:2546,1999)、染色緩衝剤(1% BSA、0.1% アジ化ナトリウム/PBS)で細胞密度20×106/mLに再懸濁した。細胞アリコートを2%正常マウス血清(Sigma)で処理して非特異結合を遮断してから、下記フルオロクロム結合体化抗マウスモノクロナール抗体(mAb):CD3、CD8β、CD4、CD25、IgG2a対照(Caltag Laboratories,Burlingame,CA);CD28、CD45RB、CD44、CD62L、CD69、CD95(PharMingen,San Diego,CA)の併合剤で氷の上で30分間インキュベートすることによって染色した。約105細胞の蛍光強度をMoFloTMフローサイトメトリー(Cytomation,Fort Collins,CO)によりヨウ化プロピジウム(10μg/mL)を加えて死亡細胞を排除して検査した。
Scurfinトランスジェニックマウス由来の末梢T細胞の変化した表現型
2826マウスにおける末梢T細胞数の減少に加えて、NLCに対するリンパ節および脾臓の両方におけるCD4+8−細胞%のわずかな減少がある。CD3レベルは、末梢T細胞にて正常であるようであるが、変化された発現レベルを有する複数の他の表面マーカーがある。トランスジェニックマウスにおけるCD4+8−細胞について、最も一致する変化は、CD62LとCD45RBの発現の小さな減少およびCD95の発現の増加である。比較すると、sf変異株動物由来の細胞に甚だ異なる表現型がある。これらのマウス由来のCD4+8−細胞は、大きく、そして明確に活性化されている。それらは主にCD44H1、CD45RBLO、CD62LLOであり、部分的にCD69+である(Clark et al.,Immunol 162:2546)。
Scurfinトランスジェニックマウスの組織学分析
2826マウスにおける末梢T細胞は明らかに減少するが、リンパ系器官の構造も混乱したかの決定を行った。主なリンパ系器官(胸腺、リンパ節および脾臓)の組織学検査は、最も顕著な変化は、腸間膜リンパ節および末梢リンパ節に見られることを示した。組織学分析用の組織を生後約8週齢のマウスから摘出し、緩衝された10%ホルマリンに直ちに固定した。パラフィン包埋片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色処理して、代表的マウスにて組織病理学比較を行った。期待通り、胸腺は比較的正常のようであり、胸腺髄質の大きさがやや減少するが、十分確定された皮質−髄質接合部がある。トランスジェニック動物は、より小さい末梢リンパ節を有し、強く正常に分布したリンパ小節が欠け、小節と小節間区域との間に鮮明な縁が欠け、正常同腹子対照マウスのリンパ節に見られるものより明らかな空洞がある。脾臓およびパイエル板の大きさおよび微小構造がほぼ正常であるようであると言えども、全細胞数は緩やかに減少し、これらの組織の胚中心の証明がないかまたは少ない。ここで、注目された変化は、リンパ節に発育がない複数の他の目標変異と区別できる細胞下(hypocellular)状態を反映する。従って、T細胞は明らかに正常な方式で発育できるが、その末梢リンパ性組織内の代表、特にリンパ節は、実質的に減少している。
Scurfinトランスジェニックマウス由来のCD4+8−細胞の減少された機能応答
表現型データおよび細胞数データは、2826トランスジェニック動物由来のCD4T細胞に生物学的に特異的欠損があることを示唆する。これらの動物由来のT細胞の、抗CD3および抗CD28を含むいくつかの刺激に対する機能応答を評価した。NLC、2826トランスジェニックマウスまたはscurfy(変異株)マウスの色々な組織からリンパ球を単離して、CD4細胞を細胞選別により精製した。胸腺、リンパ節および脾臓組織を適切な動物から摘出して、無菌顕微鏡スライド間で柔らかくし、無菌70μmナイロンメッシュを通して濾過し、遠心分離で集めた。これらの組織から、MoFloを用いたポジティブ選択でCD4+Tリンパ球を選別精製した。選別後分析で決定した選別純度は、通常95%より高い。細胞の培養は、37℃の完全RPMI(cRPMI)(10% ウシ胎仔血清、0.05mM 2−メルカプトエタノール、15mM HEPES、100U/mLペニシリン、それぞれ100μg/mLのストレプトマイシンおよびグルタミン)を用いて96ウェル丸底組織培養プレートにて行った。培養ウェルは、CD3(クローン2C11)に対する指定濃度の精製抗体とともに無菌PBS中で4時間37℃でプレインキュベーションすることにより、T細胞活性化のため調製した。精製α−マウスCD28(クローン37.51)またはα−マウスKLH(対照抗体)を、1μg/ml最終濃度で共固定した。
ScurfinトランスジェニックCD4−8+T細胞の変化した機能応答
細胞傷害性T細胞(CTL)として産生および機能するトランスジェニックT細胞の能力を生体外の分析で測定した。Balb/c脾臓細胞の単一細胞懸濁液を産生し、刺激因子細胞として使用した。これらの細胞を照射(3300rad)して、scurfinトランスジェニック脾臓細胞またはNLC脾臓細胞と10:1(刺激因子:エフェクター)の比でインキュベートした。若干の培養物には、IL−2を100U/ml加えた。CTLの生成には、脾臓T細胞を100U/mlのIL−2の存在下にて類似の方式で刺激した。5日後、細胞をJAM分析(Matzinger,P.J Immunol 145(1−2):185(1991))で分析するか、または新刺激細胞層に再刺激した。細胞は約95%CD4−8+であった。
SCURFY T細胞は生体内野生型T細胞により抑制され得る
sfのるいそうおよび皮膚損傷特徴により測定されたように、sfマウスからのCD4+8−T細胞の養子移入はヌードマウスに疾患を移入することが以前に報告されている。しかし、sf胸腺の正常マウスへの移植は疾患を伝達しないことは、免疫コンピテントマウスにsf細胞を抑制する能力があることを示唆する(Godfrey et al.,Am.J.Pathol.145:281−286,1994)。阻害のメカニズムをよく理解するため、3×106sf CD4+T細胞または野生型CD4+T細胞、またはsfと野生型CD4+T細胞混合細胞を同系C3H−SCIDマウスに養子移入した。
Sf細胞はCD4+ CD25+ T−調節性細胞により調節される
多数の報告によると、末梢 CD4+ T細胞(T−reg細胞) のCD4+CD25+ サブセットは、生体内および生体外の他のT細胞の調節に係わる(Roncarolo et al.,Curr.Opin.Immun.12:676−683 (2000); Sakaguchi,S.,Cell 101:455−458 (2000); Shevach,E.M..Ann.Rev.Immun.18:423−449 (2000))。従って、このようなT−reg細胞が生体内でのsfおよび野生型 CD4+ T細胞共移入後に見られる疾患を抑制できるかを決定すべきである。200万のsf CD4+ T細胞を野生型 CD4+CD25− T細胞とまたは野生型 CD4+CD25+ T−reg細胞と異なる比率で混合し、C3H/SCIDマウスに注射した。レシピエントは実施例 1記載のように、体重損失およびPBMCによるIL−4分泌を追跡した。T−reg細胞を分離するに、これらを抗CD4−FITC (Caltag Laboratories,Burlingame,CA)および抗CD25−ビオチン(Caltag)で氷上にて30分間染色した。細胞をPBSで二回洗いストレプアビジン−APC (Molecular Probes,Eugene,OR)で氷上にて20分間染色した。細胞を二回洗い、CD4+CD25+ T細胞をポジティブ選別した。
TGF−β はSF CD4+ T細胞を抑制しない
最近の研究ではCTLA−4およびCD4+CD25+ T−reg細胞生体内の調節性機能におけるTGF−βの分泌の重要な役割が説明された(Read et al.,J.Exp.Med.192:295−302,2000); Takahashi et al.,J.Exp.Med.192:303−310,2000)。sf細胞がTGF−βでの抑制に感受性であるかを試験するため、CD4+ T細胞を外因性TGF−βの添加が有りまたは無しで刺激した。TGF−β分析のために、抗CD3 (異なる濃度、Pharmingen)および抗CD28 (1μg/ml,Pharmingen)をプラスチックに固定した。TGF−β(R&D)を最終濃度2.5 ng/mlに加えた。培養は37°C で指定期間培養した。各ウェルに、1 μCi/ウェルの[3H] チミジン (Amersham Life Sciences,Arlington,IL)を、培養の最終8−12時間加えた。増殖データは、三重複ウェルの平均値であり、少なくとも3実験の値を代表する。
Foxp3発現はCD4+CD25+ T−Reg細胞にて上方調節されている
リンパ性組織 例えば、胸腺、リンパ節および脾臓にてFoxp3遺伝子は、最も高いレベルで発現される(Brunkow et al.,Nature Genetics 27:68−72,2001)。Foxp3のリンパ系における発現は、主にCD4+ T細胞に現れるようである。なぜなら、CD8+ T細胞およびB細胞における表現のレベルは顕著に低いかまたは検出できないからである(Brunkow et al.,Nature Genetics 27:68−72,2001)。
Foxp3の過剰発現はCD4+CD25+細胞数の増加を導くが調節性活性の増加を導かない
T−regサブセット内のFoxp3の比較的排他的な発現は、この転写因子が、このサブセットの生成を要求するかまたは直接その機能に係わることを示す。Foxp3がCD4+CD25+ T−reg細胞機能において役割を果たすか否かを決定するために、Foxp3トランスジェニックマウスからのCD4+CD25+およびCD4+CD25− T細胞サブセットの機能活性を検査した。これらの動物は、野生型動物に見られるFoxp3メッセージよりも16倍多いFoxp3メッセージを有し、これはCD4+CD25+ サブセットにおいて量が非常に多い。さらに、これらのトランスジェニック動物において全CD4+細胞は少なく、これらの細胞はその同腹子対照に対して低応答性である。一方、トランスジェニックマウスにおいてわずかに増加した%のCD4+CD25+ T細胞が存在し、CD25の発現はより広汎であり、野生型動物と異なり、これらの細胞は明確な細胞のサブセットを含まない(図16)。野生型からのCD4+CD25+ T−reg細胞とFoxp3トランスジェニックマウスからのCD4+CD25+ T−reg細胞との機能活性の比較は、トランスジェニックマウスからの細胞が調節性活性を示すが、細胞ごと基準におけるその野生型対応物に対する抑制能力の顕著の増加はなかった(図17)。
Foxp3トランスジェニックマウスからのCD4+CD25−T細胞は調節性活性を示す
Foxp3トランスジェニックからのCD4+CD25−T細胞は野生型CD4+CD25+T細胞より高いレベルでFoxp3を発現するので、次にT調節性細胞に伴う表面マーカーの発現およびこれらの細胞の抑制活性を評価した。面白くも、Foxp3トランスジェニックからのCD4+CD25−T細胞は、GITR(TNFRSF18)も発現し、これは最近T−reg活性を調節することが示されている(図18)。これらの細胞は、他の活性化を伴うT細胞マーカー、例えば、OX40、CTLA4またはLy−6A/E(データーは示されていない)を発現しなかった。更に重要なことは、Foxp3トランスジェニックからの新しく単離されたCD4+CD25−T細胞をT−reg分析における機能を試験した場合、顕著な抑制活性を有した(図19)。この活性は通常同じマウスからのCD4+CD25+T細胞の活性に匹敵から低いに至る。期待する通り、このような抑制活性は、野生型CD4+CD25−T細胞には検出されたことがなかった。CD4+CD25+T細胞と対照的に、Foxp3トランスジェニックからのCD4+CD25−T細胞の抑制活性は、抗CD3およびIL−2での生体外の前活性化で強化され得なかった(データーは示していない)。これはまたFoxp3の発現が調節活性との直接相関がなく、T−細胞をT−reg系列にゆだねるという考えを支持する。
scurfin発現を調節する抗体またはNCEは下記の方法で同定する:
scurfinプロモーターを市販ルシフェラーゼリポーターベクター(Promega,Madison,WI)にクローンする。次にこの構築を細胞、例えば、マウスまたはヒトT細胞株にトランスフェクトをする。例えば、T細胞に対して惹起された抗体、サイトカイン、リセプター、または他の蛋白質、並びに小分子、ペプチド、およびサイトカイン等の薬剤をトランスフェクトされた細胞の処理に用いる。次にルシフェラーゼ活性のレベルを市販ルシフェラーゼ分析系(Promega)で製造業者の指示書に従って、scurfinの発現を増加または減少する薬剤を同定する。
Claims (3)
- 患者における疾患に対するT細胞免疫応答を阻害する組成物であって、患者から単離された、scurfin遺伝子で形質導入されたT細胞を含有し、該T細胞がCD4+CD25+調節性T細胞である、組成物。
- 前記疾患が炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬症、糖尿病、および喘息からなる群より選ばれる請求項1に記載の組成物。
- 前記T細胞がレトロウイルスベクターで形質導入されている、請求項1に記載の組成物。
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