JP2002524070A - 放出された組換えａａｖベクターの高力価のヘルパーを含まない調製物を生成するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書中に記載される本発明は、ウイルスの放出を促進する条件（例えば、温度およびｐＨ）下で、プロデューサー細胞を培養することによって、ｒＡＡＶ粒子を生成する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （連邦政府によって援助された研究のもとでなされた発明の権利の陳述） 本発明は、部分的に、国立保健研究所（ＮＩＨ）の助成金Ｒ４４ＤＫ４４６０
によって援助された研究の間になされた。政府は、本発明において一定の権利を
有し得る。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、一般的に、遺伝子移入に使用され得る、組換えアデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）ベクターおよびその調製物の分野に関する。より詳細には、本発明は
、細胞溶解することなくプロデューサー細胞からウイルス粒子を放出することに
よる、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）および細胞性タンパク質を
実質的に含まない、組換えＡＡＶベクターの高力価の調製物の生成方法に関する
。

【０００３】 （発明の背景） アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のためのベクターとして魅力的
な独特の特徴を有する。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型に感染する。し
かし、アデノ随伴ウイルスは、形質転換性でなく、そして、いずれのヒト疾患の
病因とも関係していない。ＤＮＡのレシピエント宿主細胞への導入は、一般的に
、その細胞の正常の代謝を妨げることなく、そのＤＮＡの長時間の残留および発
現をもたらす。

【０００４】 遺伝子移入、特にヒト遺伝子治療における使用のための組換えＡＡＶベクター
調製物の、所望される特徴は、少なくとも３つ存在する。第１に、このベクター
が、標的組織における有効な集団の細胞に形質導入するために、十分に高い力価
で生成されるべきであることが、好ましい。インビボでの遺伝子治療は、代表的
には、大多数のベクター粒子を必要とする。例えば、いくつかの処置は、１０⁸
を超える粒子を必要とし得、そして気道への直接的送達による嚢胞性線維症の処
置には、１０¹⁰を超える粒子を必要とし得る。第２に、このベクター調製物が、
複製コンピテントなＡＡＶ（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイル
ス機能の存在下において複製し得る、表現型としての野生型ＡＡＶ）を、本質的
に含まないべきであることが、好ましい。第３に、このｒＡＡＶベクター調製物
は、全体として、他のウイルス（例えば、ＡＡＶ生成に使用されるヘルパーウイ
ルス）ならびにヘルパーウイルスタンパク質および細胞性タンパク質、および脂
質および糖質のような他の成分を本質的に含まず、その結果、遺伝子治療の状況
において、免疫応答を生じる危険性を、最小化するか、または除去することが、
好ましい。この後者の点は、ＡＡＶの状況において特に重要である。なぜならＡ
ＡＶは、ＡＡＶ生成のプロセスの間に、有効に複製されて、そしてパッケージン
グされるために、ヘルパーウイルス（代表的にはアデノウイルス）との同時感染
またはヘルパーウイルス機能のその他の提供が必要である、「ヘルパー依存性」
ウイルスであるからである。さらに、アデノウイルスは、遺伝子治療適用の状況
において、宿主免疫応答を生じることが観察されている（例えば、Ｂｙｒｎｅｓ
ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６６：１０１５、１９９５；ＭｃＣｏｙら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１５５３、１９９５；およびＢａｒ
ｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１５１、１９９５を参照のこと）。本発
明の方法は、以下に詳細に記載および説明されるように、ｒＡＡＶベクター調製
物のこれらおよび他の所望の特徴に取り組む。

【０００５】 ＡＡＶウイルス学、および遺伝学の一般的な総説は、他で利用可能である。読
者は、特にＣａｒｔｅｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅ
ｓ」、第Ｉ巻、１６９〜２２８ページ（１９８９）、およびＢｅｒｎｓ、「Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ」、１７４３〜１７６４ページ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、（１９
９０）を参照し得る。ＡＡＶは、複製欠損ウイルスであり、このことは、宿主細
胞におけるＡＡＶの複製およびパッケージングサイクルを完成するために、ＡＡ
Ｖがヘルパーウイルスに依存することを意味する。ＡＡＶ複製を支持し得るヘル
パーウイルスは、アデノウイルスによって例示されるが、ヘルペスウイルスおよ
びポックスウイルスのような他のウイルスを含む。ＡＡＶゲノムは、一般的に、
パッケージング遺伝子ｒｅｐおよびｃａｐ（他の必要な機能は、ヘルパーウイル
スおよび宿主細胞からトランスで提供される）を含む。

【０００６】 実例として、ＡＡＶ２血清型の直鎖状ゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配
列によっていずれかの末端で終結する。ＩＴＲの間には、ｒｅｐおよびｃａｐ遺
伝子を発現するために使用される、３つの転写プロモーターｐ５、ｐ１９、およ
びｐ４０が存在する（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５５６７〜５５７１）。ＩＴＲ配列は、シスに
おいて必要であり、そして、機能的な複製起点、細胞ゲノムへの組み込み、なら
びに宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよびレス
キューを提供するのに十分である。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、ウイルス
ゲノムの複製およびキャプシド化の機能を、それぞれ提供し、そしてこれらの産
物がトランスで存在することで十分である。

【０００７】 ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：２０７７〜２０８１）、制限エ
ンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら
、１９８３、Ｇｅｎｅ ２３：６５〜７３）、または、直接的な平滑末端の連結
（ＳｅｎａｎｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２５９：４６６１〜４６６６）のような手順によって、細菌プラスミド中
に導入されてきた。そのようなＡＡＶ組換えプラスミドの哺乳動物細胞への、適
切なヘルパーウイルスを使用する、トランスフェクションは、全くプラスミド配
列を含まないＡＡＶゲノムのレスキューおよび切り出し、レスキューされたゲノ
ムの複製、および子孫の感染性ＡＡＶ粒子の生成をもたらす。

【０００８】 治療目的の異種ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターは、細菌プラス
ミド中のＡＡＶコード配列の部分を、異種ポリヌクレオチドで置換することによ
って、構築され得る。ｒＡＡＶベクター構築の一般的原理はまた、別に概説され
ている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：５３３〜５３９；およびＭｕｚｙｃ
ｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９を参照のこと。ＡＡＶのＩＴＲは
、一般的に保持されている。なぜなら、ベクターのパッケージングは、ＩＴＲが
シスで存在することを必要とするからである。しかし、ＡＡＶゲノムの他のエレ
メント、特に、１つ以上のパッケージング遺伝子は、省略され得る。ベクタープ
ラスミドは、省略されたパッケージング遺伝子を、代替的な供給源を介してトラ
ンスで供給することにより、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされ得る。多数の刊
行物が、ｒＡＡＶベクターを生成するアプローチを記載する。Ｒａｔｓｃｈｉｎ
ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａ
ｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８１：６４６６（１
９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１
（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３（１
９８８）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７
：３４９（１９８８）。Ｓａｍｕｌｓｋｉら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２
２〜３８２８、１９８９）；Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９（１９９２）；米国特許第５，１７３，４１
４号；ＷＯ９５／１３３６５（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎおよびＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）お
よび対応する米国特許第５，６５８，７７６号（Ｆｌｏｔｔｅらによる）；ＷＯ
９５／１３３９２（Ｔｒｅｍｐｅら）；ＷＯ９６／１７９４７（Ｔａｒｇｅｔｅ
ｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｌｌｅｎ）。

【０００９】 ｒＡＡＶベクター調製物の高力価は、特に有用であるが、高力価のｒＡＡＶの
生成（特にラージスケール手順において）が、混入するヘルパーウイルス（例え
ば、アデノウイルスすなわち「Ａｄ」）、ヘルパーウイルスタンパク質（例えば
、Ａｄタンパク質）、および／または細胞性タンパク質の有意な量を生じ得るの
で、混入するウイルスおよび／またはウイルス性もしくは細胞性タンパク質を実
質的に含まない高力価調製物の生成のために使用され得る、ｒＡＡＶの拡大縮小
可能な生成方法を設計することが特に重要となった。

【００１０】 組換えＡＡＶベクターの高力価調製物を生成する方法が、記載されている。国
際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００は、ヘルパーウイルスでの感染の際に
ｒＡＡＶベクターを生成し得る細胞株の培養；アデノウイルスのようなヘルパー
ウイルスでの細胞の感染、および細胞の溶解を記載する。ＡＡＶおよび他のウイ
ルス産生方法および系がまた、例えば、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９
６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；
ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４
３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎら
（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４〜１２５０；Ｐａｕｌら（１９９
３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９〜６１５；Ｃｌａｒｋ
ら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４〜１１３２に記載され
ている。

【００１１】 細胞を溶解しなければ、感知し得る量のＡＡＶがプロデューサー細胞から放出
されないという普及している意見に起因して、パッケージング細胞を使用する組
換えＡＡＶ粒子を生成するために使用される先行技術の方法は、細胞溶解工程を
必要とした。例えば、ＣｈｉｒｉｃｏおよびＴｒｅｍｐｅ（１９９８）、Ｊ．Ｖ
ｉｒａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７６：３１〜４１を参照のこと。しかし、細胞溶解
物は、インビボでの使用に適切である前に、ｒＡＡＶベクターから分離されなけ
ればならない種々の細胞性成分を含む。

【００１２】 本発明の開示は、細胞を溶解することなくプロデューサー細胞から放出される
ｒＡＡＶベクターの高力価産生を達成する方法を提供し、そしてそのような技術
が組換えＡＡＶベクター調製物の大規模産生のために使用され得ることを実証す
る。

【００１３】 本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、その全体が本明
細書において参考として援用される。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、および細胞性タ
ンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の
高力価調製物を生成するための、方法および物質を提供する。この方法は、当該
分野において典型的であるような、細胞を能動的に溶解することなく、プロデュ
ーサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の放出を包含する。この方法は、以前に記載され
た産生方法に比べ、明確かつ顕著な利点を提供する。この方法はまた、非溶解性
であるウイルスおよび／または一般に放出されないウイルス（すなわち、非出芽
ウイルス）に適用可能である。

【００１５】 従って、１つの局面において、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡ
Ｖ）粒子のようなウイルス粒子の集団を産生する方法を提供する。この方法は、
以下の工程：ａ）細胞からのＡＡＶ粒子の放出を促進する条件下で、細胞培養培
地中でプロデューサー細胞をインキュベートする工程であって、これによりｒＡ
ＡＶ粒子がプロデューサー細胞から培養培地中に放出される工程、ここで、この
プロデューサー細胞は、以下、（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子で
あって、ここでこのＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製タンパク
質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１
つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する、異種非ＡＡＶポリヌクレオチ
ドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター；ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶのため
のヘルパーウイルス、またはＡＡＶのためのヘルパーウイルス機能を含む。次に
、放出されたｒＡＡＶ粒子を、培養培地から、収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）または収
集（ｈａｒｖｅｓｔ）し得る。ｒＡＡＶウイルス粒子の放出を促進する条件は、
本明細書において記載され、そしてｐＨ、浸透圧、溶存酸素、富化された培地、
および温度が挙げられるが、これらに限定されない。

【００１６】 いくつかの実施態様において、この方法はさらに、種々の精製および／または
不活性化工程を含む。これらの実施態様のいくつかにおいて、この方法はさらに
、以下の工程を包含する：少なくとも１つの陽荷電アニオン交換樹脂および少な
くとも１つの陰荷電カチオン交換樹脂を含む複数のイオン交換樹脂において、Ａ
ＡＶプロデューサー細胞上清をクロマトグラフして、ｒＡＡＶベクター粒子の精
製された集団を生成する工程、またはアニオン交換樹脂においてＡＡＶプロデュ
ーサー細胞上清をクロマトグラフして、その後に、接線流濾過（ＴＦＦ）する工
程。ヘパリン硫酸クロマトグラフィーもまた、使用して、さらにこのウイルスを
精製し得る。

【００１７】 本発明の方法において、細胞が懸濁中にあるようにか、または細胞の固体支持
体への付着を促進する条件下にあるように、細胞培養を行い得る。従って、いく
つかの実施態様において、プロデューサー細胞を、組織培養フラスコ、ローラー
ボトル、スピナーフラスコ、タンクリアクター、ファーメンター、およびバイオ
リアクター、フラスコストックリアクター、ホローファイバーシステム、充填さ
れた（ｐａｃｋｅｄ ｂｅｄ）リアクター（そして必要に応じてミクロキャリア
を使用する）からなる群から選択される容器中で培養される。

【００１８】 本発明のいくつかの実施態様において、この方法によって産生された組換えＡ
ＡＶベクター調製物は、複製コンピテントなＡＡＶ、ならびにヘルパーウイルス
および細胞性タンパク質を実質的に含まず、そして細胞性ＤＮＡを実質的に含ま
ないｒＡＡＶウイルス粒子の精製された集団を生じる。

【００１９】 本発明はさらに、本発明の産生方法のいずれかに従って産生される、ｒＡＡＶ
粒子の集団を提供する。好ましくは、粒子の集団は、１，０００の感染性ｒＡＡ
Ｖ粒子あたり、約１未満の感染性アデノウイルス粒子を含み、好ましくは、１０ ⁶ ｒＡＡＶあたり１未満であり、なおより好ましくは、１０⁹中に約１未満であり
、さらにより好ましくは、１０¹⁰中に約１未満である。

【００２０】 本発明のこれら、および他の実施態様は、下記の記載において概説される。

【００２１】 （発明の実施の態様） 本発明者らは、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、ならびに細
胞のタンパク質および他の成分を実質的に含まないアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）の高力価調製物を産生するための方法を開示した。この方法は、一般的に、プ
ロデューサー細胞を、そのプロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の放出を促進
する条件下で培養する工程（これは、一般的に、維持する工程を包含する）を伴
う。

【００２２】 ＡＡＶの分野では、細胞が溶解されない限り、ＡＡＶはその細胞から放出され
ないが、その細胞の核には維持されるということが十分に確証されている。従っ
て、ｒＡＡＶ粒子を産生するために、細胞を溶解しなければならないと広く一般
的に考えられている。当該分野の教示とは対照的に、本発明者らは、細胞を溶解
することを伴わずにｒＡＡＶ粒子が細胞から放出され得ること、そしてさらに、
種々の制御された環境条件下でプロデューサー細胞を維持することによって、ｒ
ＡＡＶ粒子の放出が増加され得ることを発見した。これらの条件を用いると、以
前に獲得されたよりも高い力価でｒＡＡＶ粒子を産生し得る。本明細書中に記載
の条件下で培養された細胞は、細胞あたりでより多いウイルスを産生し、そして
培養培地により多いウイルスを放出し、そしてなおさらに重要なことに、細胞内
に保持されるＡＡＶより高い感染性を有するＡＡＶの集団を放出し得る。換言す
れば、感染性に対するＤＮＡｓｅ耐性粒子の比率が、細胞内に保持されるＡＡＶ
のこの比率と比較して、細胞培養培地に放出されるＡＡＶ集団ではより小さくな
り得る（例えば、図４を参照のこと）。さらに、溶解が本発明の方法では必須の
工程ではないので、ｒＡＡＶ粒子が細胞上清から収集され得、従って、後の必要
に応じた精製工程を単純化する。あるいは、溶解もまた実施され得る。

【００２３】 いくつかの実施態様では、本発明は、感染性ウイルス粒子の放出または優先的
放出の方法を提供する。この感染性粒子の優先的放出は、ウイルス産生の状況に
おいて特に重要である。この状況では、非感染性粒子と対立して多数の感染性粒
子を含む集団を産生することが非常に所望される。

【００２４】 本明細書中に記載の方法および原理は、通常保持される（すなわち、放出され
ない）多くの他のウイルス（特にアデノウイルス）に適用されることが理解され
る。ＡＡＶを本明細書中で例示する。

【００２５】 哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生およびプロセシングのための種々の方
法が以下に詳細に記載され、そしてこのような技術の使用の例証を以下の実施例
に提供する。本発明の方法によって産生されるｒＡＡＶ粒子は、遺伝子移入ベク
ターとして特に有用である。このようなベクターを使用する方法は当該分野にお
いて公知であり、そしてそれを本明細書中に記載する必要はない。

【００２６】 導入の目的で、宿主細胞または「プロデューサー」細胞を、ｒＡＡＶベクター
の複製およびパッケージングのために使用することは典型的である。そのような
プロデューサー細胞（通常は、哺乳動物宿主細胞）は、一般的に、ｒＡＡＶ産生
のために、いくつかの異なるタイプの成分を含むか、またはそれを含むように改
変される。第１の成分は、複製し得かつ宿主パッケージング細胞によってベクタ
ー粒子中にパッケージングされ得る、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベ
クターゲノム（すなわち、「ｒＡＡＶプロベクター」）である。このｒＡＡＶプ
ロベクターは、異種ポリヌクレオチド（または「トランスジーン」）を、通常含
む。この異種ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子治療の状況において、別の細胞
を遺伝的に改変することが所望される（なぜなら、そのようなトランスジーンの
ｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングは、種々の哺乳動物細胞にそのトラン
スジーンを送達するために、効率的に使用され得るからである）。このトランス
ジーンは、好ましくは、ＡＡＶベクターの切り出し、複製およびパッケージング
、ならびにベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みの間に認識される配列を含む
、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する。第２の成分は、ＡＡＶ複
製にヘルパー機能を提供し得るヘルパーウイルスである。アデノウイルスが一般
的に使用されるが、他のヘルパーウイルスもまた、当該分野において公知である
ように使用され得る。あるいは、必要とされるヘルパーウイルス機能は、ヘルパ
ーウイルスから遺伝子的に単離され得、そしてそのコードする遺伝子が、トラン
スで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）ヘルパーウイルス機能を提供するために使用され得る
。ＡＡＶベクターエレメントおよびそのヘルパーウイルス（またはヘルパーウイ
ルス機能）は、同時かまたは任意の順番で連続的のいずれかで、その宿主細胞に
導入され得る。そのプロデューサー細胞に提供されるべきＡＡＶ産生のための最
終成分は、複製およびキャプシド形成タンパク質をそれぞれ提供する、ＡＡＶの
ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子のような「ＡＡＶパッケージング遺伝子」であ
る。ＡＡＶパッケージング遺伝子のいくつかの異なるバージョンが、提供され得
る（野生型ｒｅｐ−ｃａｐカセット、ならびにｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝
子が、ネイティブのプロモーターの制御下に残されたままであり得るか、または
異種プロモーターに作動可能に連結され得る、改変ｒｅｐおよび／またはｃａｐ
カセットを含む）。そのようなＡＡＶパッケージング遺伝子は、当該分野におい
て公知であり、そして以下により詳細に記載されるように、一過的または安定的
のいずれかで、宿主パッケージング細胞中に導入され得る。

【００２７】 本発明の方法に従って、ｒＡＡＶ粒子は、インタクトな（すなわち、溶解され
ていない）細胞から、細胞培養培地（「上清」）に放出される。ＡＡＶ複製、キ
ャプシド形成および放出を許容する条件下で宿主細胞を培養した後、その上清を
処理して、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、細胞のタンパク質
、そして重要なことに細胞のＤＮＡを実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（
ＡＡＶ）の高力価調製物を産生し得る。そのような技術を使用する、処理技術お
よび例示的プロトコールの詳細な説明を、以下に提供する。

【００２８】 （定義） 「ベクター」は、本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドを含むか
、またはポリヌクレオチドと会合して、そして細胞へのそのポリヌクレオチドの
送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合物をいう。例示
的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームお
よび他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。

【００２９】 「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、そして、そのウイルス自体
か、またはその誘導体をいうために使用され得る。この用語は、そうでないこと
が要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態
および組換え形態の両方を包含する。略語「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴
ウイルスをいい、そしてまた組換えＡＡＶベクター（すなわち、「ｒＡＡＶベク
ター」）としてもいう。

【００３０】 「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書において使用する場合、ＡＡＶ起源ではな
いポリヌクレオチド（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）配列
（代表的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列）を含むＡＡＶベクタ
ーをいう。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは
、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣
接する。この用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベ
クタープラスミドの両方を包含する。

【００３１】 「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡ
Ｖキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の
全て）、およびキャプシド形成したｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒
子をいう。従って、ｒＡＡＶ粒子の産生は必然的にｒＡＡＶベクターの産生を含
む。なぜなら、そのようなベクターはｒＡＡＶ粒子内に含まれているからである
。

【００３２】 「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子のアセンブリおよびキャプシド形成を生
じる、一連の細胞内事象をいう。

【００３３】 ＡＡＶの「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製
およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をいう。こ
れらは、試験された全てのＡＡＶ血清型において見出され、そして以下および当
該分野において記載されている。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書にお
いてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」という。

【００３４】 ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）
が哺乳動物細胞により複製およびパッケージングされることを可能にするウイル
スをいう。ＡＡＶについて種々のそのようなヘルパーウイルスが、当該分野にお
いて公知であり、これにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックス
ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が挙げられる。サブグループＣの５型
アデノウイルスが最も一般的に使用されるが、このアデノウイルスは、多数の異
なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のア
デノウイルスが、公知であり、そしてＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能で
ある。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる；これ
らもまた、ＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。

【００３５】 「ヘルパーウイルス機能」とは、ＡＡＶ複製およびＡＡＶパッケージングを可
能にするヘルパーウイルスゲノム中にコードされる機能を言う（本明細書中に記
載される複製およびパッケージングのための他の要求とともに）。本明細書中に
記載される場合、「ヘルパーウイルス機能」は多くの方法で提供され得、その方
法は、例えば、ヘルパーウイルスをプロデューサー細胞に提供することによるも
の、または必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランス（ｔｒａｎ
ｓ）でプロデューサー細胞に提供することによるものを含む。

【００３６】 用語「ｔｓＨＶ」とは、温度感受性ヘルパーウイルスをいう。このウイルスは
、ＡＡＶの複製およびパッケージングのためにヘルパー機能を提供し得るが、そ
れ自体の複製に関して、温度感受性である（すなわち、このウイルスは、「許容
」温度では複製し得るが、「非許容」温度においては、低効率で複製するか、ま
たは好ましくは、全く複製しない）。ｔｓＨＶがＡＡＶ複製の補助を提供する能
力はまた、温度感受性であり得るが、本発明の使用に好ましいｔｓＨＶは、ＡＡ
Ｖが複製し得るが、ｔｓＨＶの複製にとっては非許容的な温度で、ＡＡＶの複製
を効率的に支持する。そのようなｔｓＨＶの例を以下に記載する。

【００３７】 「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ウイルス種が向性（ｔｒｏｐｈｉ
ｃ）である細胞に送達され得るポリヌクレオチド成分を含むものである。この用
語は、ウイルスの複製能力を意味する必要は、全くない。感染性ウイルス粒子を
計数するアッセイは、本開示および当該分野において、他の箇所に記載される。
ウイルス感染性は、Ｐ：Ｉ比または全ウイルス粒子対感染ウイルス粒子の比とし
て表現され得る。

【００３８】 「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）とは、感
染性の野生型表現型ウイルスをいい、そしてまた、感染した細胞（すなわち、ヘ
ルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下）において複製し得る。Ａ
ＡＶの場合、複製コンピテンスは、機能的なＡＡＶパッケージング遺伝子の存在
を、一般的に必要とする。本明細書に記載される好ましいｒＡＡＶベクターは、
１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠損のために、哺乳動物細胞（特にヒ
ト細胞）において複製コンピテントでない。好ましくは、そのようなｒＡＡＶベ
クターは、複製コンピテントＡＡＶがＡＡＶパッケージング遺伝子と進入するｒ
ＡＡＶベクターとの間の組換えによって生じる可能性を最少化するために、ＡＡ
Ｖパッケージング遺伝子配列を完全に欠損する。本明細書において記載される好
ましいｒＡＡＶベクター調製物は、複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）を（
存在するとしても）ほとんど含まない調製物である（好ましくは、１０²ｒＡＡ
Ｖ粒子あたり、約１ｒｃＡＡＶ未満、より好ましくは、１０⁴ｒＡＡＶ粒子あた
り約１ｒｃＡＡＶ未満、さらにより好ましくは、１０⁸ｒＡＡＶ粒子あたり約１
ｒｃＡＡＶ未満、なおより好ましくは、１０¹²ｒＡＡＶ粒子あたり約１ｒｃＡＡ
Ｖ未満、最も好ましくは、ｒｃＡＡＶを含まない）。

【００３９】 ｒＡＡＶ粒子の「放出」とは、ｒＡＡＶ粒子がインタクトなプロデューサー細
胞から細胞培養液に入ること、すなわち、ｒＡＡＶ粒子が細胞を溶解せずに放出
されることを意味する。例えば、所定のプロデューサー細胞の培養物中では、い
くつかの細胞は溶解し、細胞死の状態にあることが理解される。しかし、本発明
は、代表的に当該分野で使用されるように、意図的な細胞溶解を実施することな
しにｒＡＡＶ粒子の放出を促進する方法を提供する。用語プロデューサー細胞か
らの「放出」および「分泌」は、本明細書中で交換可能に使用される。

【００４０】 本明細書中で使用される場合、用語プロデューサー細胞からの「ｒＡＡＶ粒子
の放出を促進する条件」とは、プロデューサー細胞を増殖させるための条件を言
い、これは、プロデューサー細胞から培養培地に、増加されたｒＡＡＶ粒子の放
出に導くか、または増強されたｒＡＡＶ粒子の放出に導く。プロデューサー細胞
から培養培地へのｒＡＡＶ粒子の放出を促進する条件は本明細書中に記載されて
おり、これは、一般的ではあるが、必ずしも細胞性代謝を増強する条件であるわ
けではない。プロデューサー細胞から培養培地へのｒＡＡＶ粒子の「放出を促進
すること」とは、放出を増強する環境的条件下で培養されなかったプロデューサ
ー細胞からのｒＡＡＶ放出と比較した場合、プロデューサー細胞からのｒＡＡＶ
粒子の放出が増大されていることを意味する。この増加は、任意の検出可能な増
加であり得、例えば、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０
％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、
より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より
好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、より好ま
しくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましく
は少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少
なくとも約１００％または２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好まし
くは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、さらにより好ま
しくは少なくとも約５０倍である。当該分野において周知であるように、細胞集
団が、所定の開始培養条件下で増殖する場合、この細胞の代謝性副産物が、特定
の培養条件（例えば、ｐＨおよび重量モル浸透圧濃度）を変更する。ｒＡＡＶ粒
子の放出を促進する環境的条件下で、１つ以上のこれらのパラメーターが必要に
応じて制御され、すなわち規則的な間隔でモニターされ、そして適切な範囲（す
なわち、放出を促進する範囲）内にパラメーターを維持するために調節される。
これらの条件の設定および／または制御は以下においてより詳細に議論される。

【００４１】 用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレ
オチドあるいはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー
形態をいう。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレ
オチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得、そして非ヌクレオチド成分によ
って中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーへのア
センブリの、前または後になされ得る。本明細書において使用する場合、用語ポ
リヌクレオチドとは、互換可能に、２本鎖および１本鎖分子をいう。他に特定さ
れるか、または必要とされない限り、本明細書に記載の本発明の任意の実施態様
において、ポリヌクレオチドは、２本鎖形態、および２本鎖形態を形成すること
が公知であるかまたは予想される、２つの相補的な１本鎖形態の各々の両方を含
む。

【００４２】 「遺伝子」とは、転写そして翻訳された後に、特定のタンパク質をコードし得
る、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを
いう。

【００４３】 ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え（体）」とは、そのポリヌクレ
オチドが、クローニング、制限または連結工程、ならびに天然に見出されるポリ
ヌクレオチドとは異なる構築物を生じる他の手順の種々の組み合わせの産物であ
ることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス
粒子である。この用語は、それぞれ、起源のポリヌクレオチド構築物の複製物、
および起源のウイルス構築物の子孫を含む。

【００４４】 「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節（
ポリヌクレオチドの複製、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシ
ング、翻訳または分解を含む）に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチ
ド配列である。この調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響し得、そ
の性質を増強、または阻害し得る。当該分野において公知の制御エレメントとし
ては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が挙げら
れる。プロモーターは、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして
通常プロモーターから下流に（３’方向に）位置するコード領域の転写を開始し
得るＤＮＡ領域である。

【００４５】 「作動可能に連結した」とは、遺伝子エレメントの近傍位置をいい、ここで、
このエレメントは、予想された様式において、作動することを可能にする関係に
ある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、そのプ
ロモーターは、コード領域に作動可能に連結する。そのプロモーターとコード領
域の間には、この機能的関係が維持される限り、介在残基が存在し得る。

【００４６】 「発現ベクター」とは、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクター
であり、そして意図された標的細胞においてタンパク質の発現をもたらすために
使用される。発現ベクターはまた、コード領域に作動可能に連結された制御エレ
メントを含み、その標的でのタンパク質の発現を容易にする。制御エレメント、
および発現のためにその制御エレメントが作動可能に連結された遺伝子（単数ま
たは複数）の組み合わせは、時として、「発現カセット」といい、当該分野にお
いて公知でありそして利用可能な大多数の発現カセットが、当該分野において利
用可能な成分から容易に構築され得る。

【００４７】 「異種」とは、比較されるその他の実体とは遺伝型が異なる実体に由来するこ
とを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって、異なる種由来のプラスミドま
たはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。
そのネイティブなコード配列から取り出され、そして天然には連結されているこ
とが見出されないコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモ
ーターである。

【００４８】 「遺伝子改変」とは、遺伝子エレメントが、有糸分裂または減数分裂以外によ
って細胞中に導入されるプロセスをいう。このエレメントは、細胞にとって異種
であり得るか、またはその細胞に既に存在するエレメントのさらなるコピーか、
もしくは改善されたバージョンであり得る。遺伝子改変は、例えば、当該分野に
おいて公知の任意のプロセス（例えば、エレクトロポーレーション、リン酸カル
シウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触）を通して、
細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトするこ
とによって、行われ得る。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのウ
イルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入か、または感染によって行われ
得る。好ましくは、遺伝子エレメントは、細胞中の染色体またはミニクロモソー
ム中に導入される；しかし、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子
型を変更する任意の改変は、この用語に含まれる。

【００４９】 遺伝子配列が、インビトロにおける細胞の延長された培養の間に、その機能の
実施のために利用可能である場合、その細胞は、この配列で「安定的に」改変、
形質導入、または形質転換されると言われる。好ましい例において、そのような
細胞は、改変された細胞の子孫によってまた遺伝される遺伝子改変が導入される
という点で、「遺伝的に」改変される。

【００５０】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書にお
いて、互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。この用語
はまた、改変された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化
、または標識成分との結合）アミノ酸のポリマーを含む。「ＣＦＴＲ」、「ｐ５
３」、「Ｅ１Ａ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組
成物の状況において議論される場合、インタクトなタンパク質の所望の生物学的
機能を保持する、各々のインタクトなポリペプチド、またはその任意のフラグメ
ントもしくは遺伝的に操作された誘導体をいう。同様に、ＣＦＴＲ、ｐ５３、Ｅ
１Ａ遺伝子および遺伝子治療における使用のための他のこのような遺伝子は（代
表的に、レシピエント細胞に送達される「トランスジーン」という）、インタク
トなポリペプチド、または所望の生物学的機能を有する、任意のフラグメントも
しくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。

【００５１】 「単離された」プラスミド、ウイルス、または他の物質とは、この物質または
類似物質が天然に存在するかまたはもともとそこから調製されるところにもまた
存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物をいう。それゆえ
、例えば、単離された物質は、供給源混合物から、この物質を富化する精製技術
を使用することにより調製され得る。富化は絶対基準（例えば、溶液中の容量あ
たりの重量）に対して測定され得るか、または供給源混合物中に存在する第２の
潜在的に干渉する物質に関して測定され得る。本発明の実施態様の富化を増加す
ることは、さらにより好ましい。従って、例えば、２倍の富化が好ましく、１０
倍の富化はより好ましく、１００倍の富化はより好ましく、１０００倍の富化は
さらにより好ましい。

【００５２】 ＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子に対する感染性ヘルパーウイルス粒子の
比が少なくとも約１０²：１；好ましくは、少なくとも約１０⁴：１；より好まし
くは、少なくとも約１０⁶：１；なおより好ましくは、少なくとも約１０⁸：１で
ある場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」といわれる。調製物はまた
、好ましくは、等量のヘルパーウイルスタンパク質を含まない（すなわち、もし
上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在するならば、タンパ
ク質はヘルパーウイルスのそのようなレベルの結果と同程度に存在する）。ウイ
ルスおよび／または細胞タンパク質の夾雑物は、ＳＤＳゲル上のクマシー染色ま
たは銀染色のバンドの存在として、一般的に観察され得る（例えば、ＡＡＶキャ
プシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンド
の出現）。

【００５３】 ウイルスの生成、複製、またはパッケージングの記載において使用される場合
、「効率」とは、方法の有用な性質（特に、増殖速度、および１細胞あたり生成
さえるウイルス粒子の数）をいう。「高効率」生成は、特定の培養期間の過程に
わたり、１細胞あたり少なくとも１００のウイルス粒子、好ましくは１細胞あた
り、少なくとも約１０，０００、そしてより好ましくは、少なくとも約１００，
０００粒子の生成を示す。なおより好ましくは、「高効率」生成は、１細胞あた
りの粒子のこれらの生成レベル、ならびに、粒子を生成する細胞の最大数（例え
ば、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくと
も３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％）を含む
。実施例６は１生成細胞あたり９３，０００〜１２３，０００ｒＡＡＶ粒子を生
じる培養条件（「完全培地」）を記載する。本発明の文脈において、効率はまた
、細胞中に保持されたウイルス粒子と比較したウイルス粒子の放出の割合または
程度によって考慮され得る。効率はまた、感染性のウイルス粒子に対する全体の
ウイルス粒子の比または相対的な割合（例えば、「Ｐ／Ｉ」比）によって考慮さ
れ得る。生成の効率のパラメーターを決定するためのアッセイ（例えば、複製単
位および感染性センターアッセイ）は、当該分野で公知である。

【００５４】 （一般的技術） 本発明の実施は、他に示さない限り、当業者にとって公知である、従来の分子
生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の技術を使用する。そのような
技術は、文献において十分に例示される。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９）；「Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「
Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）
；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ Ｅ Ｃ
ｏｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５）；ならびに「Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ」（Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ、１９９４）を参照のこと。

【００５５】 （プロデューサー細胞からｒＡＡＶ粒子の放出を促進する条件） 本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成するため
の方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）プロデューサー細胞から
のｒＡＡＶ粒子の培養培地への放出を促進する条件下で、細胞培養培地中でプロ
デューサー細胞の集団をインキュベートする工程。次いで、放出されたｒＡＡＶ
粒子は、細胞培養培地から回収され得る。これによりウイルス粒子の集団を獲得
する。

【００５６】 プロデューサー細胞から培養培地へＡＡＶ（ｒＡＡＶを含む）粒子の放出を促
進（または増強する）条件としては、培養培地のｐＨ；培養培地の重量モル濃度
；温度；培養培地中の所定のイオンの濃度；細胞密度；培養培地中の溶存酸素濃
度；培養培地中のグルコース濃度；培養培地中のアミノ酸の濃度；および細胞周
期同調化を促進する条件が挙げられるがこれらに限定されない。これらのパラメ
ーターのいずれか１つ以上が、この細胞がＡＡＶ粒子を放出する間、適切な範囲
（すなわち、放出を促進する範囲）内で維持される。１つのパラメーター（すな
わち、条件）は、放出を促進するために十分であり得、２つ以上のパラメーター
の組み合わせが、各々その独自の適切な範囲の内で同時に維持され得る。さらに
、１つのパラメーターに適切な範囲は、任意のさらなるパラメーターのいずれか
用いられるか否かに依存して変化し得る。１つのパラメーターが一定時間、適切
な範囲内に保持される場合、第２のパラメーターが第１のパラメーターと同じか
または異なる間隔の間、第２の適切な範囲内で維持され得る。あるいは、条件は
、連続的に使用され得る。例えば、ｐＨのコントロールは、増殖の１つの相、温
度の制御の間により生じ得る。

【００５７】 これらのパラメーターを変化させること、およびプロデューサー細胞が所定の
環境条件下で維持されない場合、放出したｒＡＡＶの量に対して、ｒＡＡＶの培
養培地インキュベートへの放出が増強されるか否かを決定することは、十分、当
業者の能力の範囲内である。プロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の増強した
（または増加した）放出は、当該分野の公知の任意の多数の方法により測定され
得る。この方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：複製中心
アッセイ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）および感染中
心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）のような機能
的アッセイ；ｃａｐ遺伝子産物のための免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ
）；ＨＰＬＣ；ならびに任意の多数のＤＮＡ検出方法（ウイルスＤＮＡの存在を
検出するため）（たとえば、スロットブロット）。

【００５８】 一般に、任意のこれらの条件は、当該分野で公知の標準的方法および装置を用
いて、必要な程度および／または所望の程度までモニタリングおよび制御され得
る。この条件は、測定され、そしてその適切なレベル（すなわち、ウイルス放出
を促進するレベル）へその条件を維持または回復するために調節がなされる。本
発明者らは、培養条件を適切または適当に維持することの失敗がウイルス粒子放
出の休止を生じ得るが、他の条件（例えば、重量モル濃度）が特定のレベルに維
持される必要はない（ただし、このパラメーターに関しては最初の培養条件の設
定が十分である）ことを観察した。モニタリングおよび調節されることが必要で
ある条件について、例えば、バイオリアクターおよび／または培地灌流システム
が用いられ得る。これらのシステムは好ましい。なぜなら、それらは培養条件の
より注意深いコントロールを可能にするからである。しかし、ＡＡＶ粒子の十分
な放出および／または所望の放出を可能にする培養条件の十分なコントロールお
よび調節を可能にする任意のシステムが適切である。この条件を提供するための
コントロール機構の他の例が本明細書において提供される。

【００５９】 １つの実施態様において、プロデューサー細胞は、ウイルス粒子放出を促進す
るｐＨ条件下で増殖される。一般に培養培地のｐＨは約７．０〜約８．５、好ま
しくは約７．４〜約８．５、より好ましくは約７．５〜約８．０の範囲内で維持
される。なおより好ましくは、そして特には、ｐＨが放出を促進するために用い
られる唯一の条件である場合、ｐＨは約８．０である。バイオリアクターは、例
えば、ｐＨの＋／−０．０５への制御を可能にし、そしてさらにより正確なコン
トロールが利用可能であり（例えば、＋／−０．０１へ）、そして１〜３分ごと
またはそれ未満でさえｐＨをモニターし得る。いくつかの実施態様において、少
なくとも約６７％の総ウイルス粒子が培養上清において見出されるｐＨ条件下で
細胞は増殖される。他の実施態様において、ウイルス粒子の少なくとも約８０％
、少なくとも約８２％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも
約９５％が培養上清中でみられるようなｐＨ条件下で、細胞は増殖される。好ま
しくは、培養上清における、Ｐ／Ｉすなわち粒子対感染性の比は、約４，０００
未満、より好ましくは約３，０００未満、より好ましくは約２，０００未満、よ
り好ましくは、１，７００未満、より好ましくは約１，５００未満である。いく
つかの実施態様において、細胞は約ｐＨ８で培養され、そしてヘルパーウイルス
での感染（またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始）から約９６時間で
収集される。他の実施態様において、細胞は約ｐＨ８で培養され、そしてヘルパ
ーウイルスでの感染（またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始）から約
７２時間で収集される。他の実施態様において、細胞は、約ｐＨ８で培養され、
そしてヘルパーウイルスでの感染（またはへルパーウイルス機能の導入もしくは
開始）から約４８時間で収集される。

【００６０】 いくつかの実施態様において、ｐＨ以外の条件（単数または複数）がウイルス
放出を促進するために用いられる。例えば、他の実施態様において、ウイルス放
出を促進するために温度が用いられる。一般に、培養培地の温度は約３０℃〜約
４５℃、好ましくは約３２℃〜約４２℃、より好ましくは約３５℃〜約４０℃で
維持される。なおより好ましくは、そして特には、温度が放出を促進するための
唯一の条件である場合、温度は約３７℃〜約３９℃である。バイオリアクターは
、例えば、温度を＋／−０．５℃にコントロールし得、そして約３０秒ごと程度
にモニターし得る。

【００６１】 他の実施態様においては、重量オスモル濃度がウイルス放出を促進するために
用いられる。一般に培養培地の重量オスモル濃度は、約１００ｍＯｓＭ〜約６５
０ＯｓＭ、好ましくは約１５０ｍＯｓＭ〜約５００ｍＯｓＭ、好ましくは約２０
０ｍＯｓＭ〜約４００ｍＯｓＭ、なおより好ましくは約３００ｍＯｓＭで開始さ
れるかおよび／または維持される（特に、重量オスモル濃度が放出を促進するた
めに用いられる唯一の条件である場合）。当該分野で十分に理解される用語、重
量オスモル濃度は、水１ｋｇあたりの溶質分子の数として規定される。一般に、
ＮａＣｌおよび他の塩、マンニトール、グルコースのような化合物が重量オスモ
ル濃度に寄与する。重量モル濃度は、例えば、浸透圧計を用いる凝固点降下のよ
うな当該分野の標準的技術を用いて測定され得る。

【００６２】 本発明の方法において用いられ得る他の条件としては、以下の任意の１つ以上
が挙げられるがこれらに限定されない：インスリン、ＥＧＦおよびＦＧＦのよう
な増殖因子；グルコース濃度；溶存酸素濃度；強化培地（例えば、さらなるグル
コースおよび／または他の栄養素（例えば、ビタミンおよびアミノ酸））。グル
コース濃度は、一般に約０．１〜約２０ｇ／ｌ；より好ましくは約０．５〜約１
５ｇ／ｌ；より好ましくは約１〜約１０ｇ／ｌである。酸素濃度（代表的には、
例えば、溶存酸素電極または血液ガス分析器により測定される）は、通常、空気
に対して約１０％〜約２００％、好ましくは、空気に対して約２０％〜約１００
％、好ましくは空気に対して約３０％〜約７５％である。一般に、細胞密度が高
くなればなるほど、培地はより強化される。培地条件は、潅流のような当該分野
で公知の技術を用いて維持および／または補充され得る。

【００６３】 プロデューサー細胞は、ウイルスの培地への放出を促進するために適切な時間
間隔で増殖される。一般に、細胞は、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約
７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日までの
間増殖され得る。約１０日後（または、用いられる培養条件および特定のプロデ
ューサー細胞に依存して、より早く）、産生のレベルは一般的に有意に低下する
。一般に、培養の時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶ
の場合、ウイルス産生は、一般に、本明細書において記載される適切なプロデュ
ーサー細胞において、ヘルパーウイルス機能を供給することに基づいて開始する
。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染（またはウイルス産生開始）後、約４
８時間〜約１００時間、好ましくは約４８時間〜約９６時間、好ましくは約７２
時間〜約９６時間、好ましくは約６８時間〜約７２時間に回収される。本実施例
では、結果は通常、例えば、「２日」、「３日」などの日数で表現される。これ
らの表示は通常、ヘルパーウイルスでの感染から測定したさらなる日数を示す。
すなわち、「３日」で報告される結果は、一般に、その結果がヘルパーウイルス
機能の導入の時点から約２日（すなわち４８時間）で得られたことを示す。

【００６４】 上記のように、放出を促進する条件の任意の１つ以上の、任意の組み合わせが
用いられ得る。例えば、細胞は以下の任意の１つ以上の条件のもとで増殖され得
る：（ａ）約８．０のｐＨ；（ｂ）約３９℃の温度；（ｃ）約３００ｍＯｓＭ；
（ｄ）強化培地（約２〜３日間）。「強化培地」は、一般に、血清が減少され得
るか排除さえされ得るように、さらなる無機塩（例えばＭｇ²、Ｃａ⁺²）、ビタ
ミン、および／または補因子について強化されたことを意味する。好ましい実施
態様では、細胞は以下の条件のもとで増殖される：（ａ）約３００ｍＯｓｍ；（
ｂ）約ｐＨ８．００；（ｃ）約３９℃；（ｄ）そしてヘルパーウイルスでの感染
から約９６時間で回収される。好ましい実施態様において、細胞は以下の条件下
で増殖される：（ａ）約ｐＨ８．００；（ｂ）約３９℃；および（ｃ）そしてヘ
ルパーウイルスでの感染から約９６時間で回収される。別の実施態様において、
細胞は以下の条件下で増殖される：（ａ）約３００ｍＯｓｍ；（ｂ）約ｐＨ８．
００；（ｃ）約３９℃；（ｄ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約７２時間
で回収される。別の実施態様において、細胞は、以下の条件下で増殖される：（
ａ）約ｐＨ８．００；（ｂ）約３９℃；および（ｃ）そしてヘルパーウイルスで
の感染から約７２時間で回収される。別の実施態様では、細胞は以下の条件のも
とで増殖される：（ａ）約３００ｍＯｓｍ；（ｂ）約ｐＨ８．００；（ｃ）約３
９℃；（ｄ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約４８時間で回収される。別
の実施態様では、細胞は以下の条件下で増殖される：（ａ）約ｐＨ８．００；（
ｂ）約３９℃；および（ｃ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約４８時間で
回収される。

【００６５】 いくつかの実施態様では、ｐＨは、約８．０に維持され、そして培養物は約３
９℃の温度で増殖される。いくつかの実施態様では、ｐＨは、約８．０に維持さ
れ、そして重量オスモル濃度（少なくとも開始オスモル濃度）は約３００ｍＯｓ
ｍである。いくつかの実施態様では、ｐＨは、約８．０に維持され、そして重量
オスモル濃度（少なくとも開始オスモル濃度）は約３００ｍＯｓｍであり、そし
て培養物は約３９℃の温度で増殖される。

【００６６】 いくつかの実施態様において、細胞は同調化される。これは，例えば、特にヘ
ルパーウイルス機能の付加前に、ストレス条件に細胞を供することにより達成さ
れ得る。同調化は、全体的生産性に寄与し得る。ストレスの可能性のある形態と
しては、栄養ストレス、浸透性ストレス、ｐＨストレス、温度ストレス、有酸素
ストレス、機械的ストレス、放射ストレスおよび毒素ストレスが挙げられるがこ
れらに限定されない。栄養ストレスが課される非限定的な例は、１つ以上のアミ
ノ酸において欠乏している培地においてプロデューサー細胞を培養することであ
る。

【００６７】 本発明はまた、ウイルス放出を促進する因子または条件でプロデューサー細胞
（すなわち、インタクトなプロデューサー細胞）を処置する方法（例えば、細胞
を透過性にする因子（例えば、イオノフォアまたは毒素（例えば、細菌毒素）、
浸透性ショック）での処置）を含むこともまた理解される。これらの実施態様に
ついて、培養集団のプロデューサー細胞は、一般にその統合性を保持する（すな
わち、溶解されない）（しかし、任意の細胞培養集団における場合、いくつかの
細胞は溶解され得る）。一般に、以下のほぼ任意の割合未満の細胞が溶解される
：５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１２％
、１０％、８％、５％、３％、２％、１％。あるいは、一般に、以下のほぼ少な
くとも任意の割合の細胞内容物が細胞内で保持される（すなわち、細胞膜に保持
される）：４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％
、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％。

【００６８】 （放出されたウイルス粒子の収集および精製） プロデューサー細胞は、懸濁液中で、または適切な表面に付着されて培養され
得る。懸濁液または固定化培養の方法は、当該分野で公知である。放出されたウ
イルス粒子の集団の生成の際、その放出されたウイルス粒子は、さらに使用する
ために収集および／または精製され得る。以下により詳細に考察するように、培
養培地中のウイルス粒子は、プロデューサー細胞から当該分野で公知の方法（例
えば、遠心分離または濾過（例えば、中空繊維膜中での接線流濾過））を使用し
て分離される。好ましくは、１つ以上のさらなる精製工程が、プロデューサー細
胞を培養培地から分離した後に行われる。このような工程の例には、適切なフィ
ルターまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用しての濃縮が含まれるが、こ
れらに限定されない。種々の産生および精製方法が、ＷＯ９９／１１７６４（Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９８／１８６００）（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載される。

【００６９】 いくつかの実施態様において、培養上清（細胞が除去された後）は、反対電荷
のイオン性クロマトグラフィーに供される。いくつかの実施態様において、陰イ
オン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に行われ
る。その他の実施態様において、陽イオン交換は、陰イオン交換クロマトグラフ
ィーの後に行われる。いくつかの実施態様において、培養上清は、ヘパリン硫酸
上でクロマトグラフィーに、好ましくは、反対電荷のイオンクロマトグラフィー
の処置後に、より好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィー上での培養上清
の処置、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーの後に、供される。これらの技
術は、より詳細に以下に記載される。

【００７０】 例示のために、培養上清、または陰イオン交換もしくは陽イオン交換カラムか
ら溶出され、および／もしくは接線流濾過によって濃縮された調製物は、ヘパリ
ン硫酸を含むカラムに結合させることによって精製され得る。次いで、ＡＡＶは
、このようなカラムから塩を含有する緩衝液（例えば、ＮａＣｌの直線勾配）を
使用して溶出され得る。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからプ
ールされた画分から得られるＡＡＶは、ＴＭＥＧ＋１００ｍＭのＮａＣｌ中にて
３００Ｋの接線流濾過膜を使用して濃縮され、そしてダイアフィルトレーション
され得る。この濃縮物は、１ｍｌのヘパリン硫酸カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
「Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ」カラム）上に注入され、ＮａＣｌの直線勾
配を使用して溶出され得る。

【００７１】 以下の節は、本発明の産生システムおよび方法のより詳細な構成要素を記載す
る。

【００７２】 （ヘルパーウイルス機能およびＡＡＶを含むプロデューサー細胞） 本発明の方法において、ウイルス複製およびカプセル化に必要とされる成分を
含むプロデューサー細胞は、適切な条件下（すなわち、ウイルス放出を促進する
条件）で培養される。いくつかの基準は、本明細書中に記載されるｒＡＡＶ粒子
の産生における使用のための細胞の選択に影響を及ぼす。最初の事項として、そ
の細胞は、選択されたヘルパーウイルスを用いる場合、ｒＡＡＶベクターの複製
およびパッケージングを可能にするものでなければならない。しかし、ほとんど
の哺乳動物細胞は、ＡＡＶによって生産的に感染され得、そして多くの細胞もま
たアデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染され得るので、多くの
種々の哺乳動物細胞および細胞株がこれらの基準を有効に満足することは明白で
ある。これらのうち、より好ましい細胞および細胞株は、組換えＡＡＶベクター
調製物の大規模生産を容易にするために培養物中で容易に増殖され得るものであ
る。しかし、このような細胞の多くもまた、この基準を有効に満たす。大規模生
産が所望される場合、産生方法の選択はまた、宿主細胞の選択にも影響を与える
。例えば、以下および当該分野においてより詳細に記載されるように、いくつか
の生産技術および培養容器もしくはチャンバーが付着細胞または接着細胞の増殖
のために設計されており、他方、他のものが懸濁細胞増殖のために設計されてい
る。後者の場合、従って、宿主細胞は、好ましくは、懸濁増殖に適合されたかま
たは適合可能である。しかし、接着またはアンカー依存性とみなされる細胞およ
び細胞株の場合でさえ、（以下に記載されるように）懸濁増殖しうる細胞につい
て連続的に選択することによってアンカー依存性親株の懸濁適合性改変体を誘導
させることが可能である。

【００７３】 温度感受性のヘルパーウイルスが使用される場合、その細胞は、そのヘルパー
ウイルスの複製に非許容性である条件下でｒＡＡＶベクターを有効に複製し得な
ければならない。例示のために、アデノウイルスｔｓ１４９をｔｓへルパーウイ
ルスとして使用する場合（以下に記載されるように）、その細胞は、３２℃を充
分超える温度、好ましくは、約３９．５℃でｒＡＡＶ複製およびパッケージング
を支持し得なければならない。ヒト２９３細胞は、これらの規準を満たす細胞株
の一例であるが、他の多くの細胞および細胞株がこの比較的高温でｒＡＡＶを複
製し得る。

【００７４】 最終的に、複製およびパッケージングに必要であるヘルパーウイルス（または
ヘルパーウイルス機能）、ｒＡＡＶベクター配列、およびすべてのＡＡＶ配列は
、同じ細胞に存在しなければならない。１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子が
ベクターから別個に提供される場合、以下を含む宿主細胞が提供される：（ｉ）
１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子、ここでこのＡＡＶパッケージング遺伝子
は各々が、ＡＡＶ複製またはキャプシド形成タンパク質をコードする；（ｉｉ）
ｒＡＡＶベクターまたはプロベクターを使用してこの宿主細胞に導入された異種
ポリヌクレオチド、ここで、このｒＡＡＶベクターまたはプロベクターは、少な
くとも１つのＡＡＶ ＩＴＲに隣接してその異種ポリヌクレオチドを含み、そし
てそのＡＡＶパッケージング遺伝子において欠損している；ならびに（ｉｉｉ）
必要なヘルパーウイルス機能をコードするヘルパーウイルスまたは配列。しかし
、これらのエレメントの１以上が単一のレプリコンにおいて合わせられ得ること
にも注意すべきである。例示のために、ヘルパーウイルスはまた、ｒＡＡＶプロ
ベクターまたはＡＡＶパッケージング遺伝子を含み得る。

【００７５】 ヘルパーウイルスは好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを感染させるのに
充分なレベルで細胞培養物中に導入されるが、そうでなければ得られた調製物に
存在するヘルパーウイルスの量を制限するために、最低限に維持され得る。１〜
１００の感染多重度すなわち「ＭＯＩ」が使用され得るが、５〜１０のＭＯＩが
代表的に適切である。

【００７６】 同様に、ＡＡＶベクターおよび／またはパッケージング遺伝子が一過的にパッ
ケージング細胞に導入される場合（安定に導入されるのとは反対に）、それらは
、好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを遺伝的に改変するのに充分なレベル
で導入される。一般的に必要な量は、細菌プラスミドとして供給される場合１０ ⁶ 細胞あたり１０μｇのオーダーであり；あるいはＡＡＶ粒子として供給される
場合は、１０⁵細胞あたり１０⁸粒子である。最適な量の決定は、当業者の技術範
囲内である慣用的な力価決定の実施である。

【００７７】 これらのエレメントは、同時または任意の順に連続的に、その細胞に導入され
得る。その細胞がそのエレメントのいずれかによって遺伝的に変化している場合
、その細胞は、次のエレメントが導入される前に、選択され得そして増殖させら
れ得る。

【００７８】 １つの好ましい実施態様において、ヘルパーウイルスは、最後に細胞に導入さ
れて、常在性のｒＡＡＶベクターのレスキューおよびパッケージングを行う。こ
の細胞は、一般的に、ＡＡＶパッケージング遺伝子に必要な程度にまで既に補充
されている。好ましくは、ｒＡＡＶベクターまたはパッケージング遺伝子のいず
れか、またはより好ましくはその両方が、その細胞に安定に組み込まれる。他の
組合せも可能であることも容易に理解される。このような組合せは、本発明の範
囲内に含まれる。

【００７９】 一旦宿主細胞に必要なエレメントが提供されると、その細胞は、ＡＡＶ複製に
許容性である条件下で培養されて、ｒＡＡＶベクターの複製、パッケージングお
よび放出をさせる。適切な培養時間は、多くの考慮に依存し、そして上記で議論
したように変化し得る。培養時間は好ましくは、産生レベルのピークに対応する
ように調整され、そして代表的には３〜６日間である。好ましくは、少なくとも
１００のウイルス粒子が１細胞当たり産生され；より好ましくは１細胞当たり、
少なくとも約１０００粒子、なおより好ましくは１細胞当たり少なくとも約１０
，０００粒子産生される。好ましくは、２×１０⁵細胞当たり，少なくとも０．
５×１０⁶、より好ましくは少なくとも約１×１０⁶細胞、さらにより好ましくは
少なくとも約２×１０⁶ＲＵ／ｍｌ ＡＡＶベクターが、培養期間の間に産生さ
れる。必要に応じて、大規模生産方法（例えば、懸濁培養または接線流濾過）が
使用され得る。次いで、ＡＡＶ粒子が収集され、そしてそれらを調製するために
使用された細胞から単離される。

【００８０】 本発明の方法によって得られるｒＡＡＶ粒子の調製物は、好ましくは、高密度
の感染性ＡＡＶ粒子を含み、そしてヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパ
ク質および細胞砕片、および他の混入物を実質的に含まない。所望の特性は、以
下を含む： ・ 公知の標準を用いて複製アッセイまたは定量ハイブリダイゼーション比較
において決定される場合、少なくとも１０⁷、好ましくは少なくとも約１０⁸、よ
り好ましくは少なくとも約１０⁹ＲＵ／ｍｌの濃度 ・ １０⁸ＲＵのｒＡＡＶ粒子あたり、１０³以下、好ましくは約１０²以下、
より好ましくは１０¹以下のヘルパーウイルスの感染性粒子 ・ ＳＤＳゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク
質（例えば、アデノウイルスのヘキソンまたはペントンファイバー）についての
イムノアッセイのいずれかによって検出される、タンパク質ベース（重量／重量
）で、５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．０１％未満、さ
らにより好ましくは約０．００１％未満のヘルパーウイルスによる混入物 ・ ＳＤＳゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク
質または細胞特異的タンパク質についてのイムノアッセイのいずれかによって検
出される、５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．０１％未満
、さらにより好ましくは約０．００１％未満のヘルパーウイルスまたは細胞タン
パク質（重量／重量）による混入物 ・ 好ましくは、その調製物はまた、細胞の脂質、糖質および／または核酸の
ような他の潜在的な細胞成分を実質的に含まない。

【００８１】 本開示に概説される方法は、小さな実験バッチまたは１０〜１００リットル以
上の調製バッチを調製するのに適切である。大規模バッチ調製について、以下の
特性もまた所望される： ・ この調製物において、合計少なくとも１０¹⁰、好ましくは１０¹²、そして
より好ましくは１０¹⁴ＲＵのＡＡＶベクター粒子。

【００８２】 必要に応じて、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ粒子について富化するため、ヘ
ルパーウイルス粒子を枯渇させるため、または他の方法で被験体への投与に適切
にさせるためにさらに処理され得る。精製技術は、等密度勾配遠心分離およびク
ロマトグラフィー技術を含み得る。感染性ヘルパーウイルス活性の減少は、当該
分野で公知なように、熱処理またはｐＨ処理による不活化を含み得る。他の処理
としては、濃縮、濾過、ダイアフィルトレーション、または適切な緩衝液もしく
は薬学的な賦形剤との混合が挙げられ得る。調製物は、分配のために単位用量お
よび多用量アリコートに分割され得、これは、そのバッチの本質的な特徴（例え
ば、抗原性内容物および遺伝的内容物の均質性、および混入するヘルパーウイル
スの相対比）を保持する。

【００８３】 上記に記載のような種々の所望の特性を示すヘルパーウイルスおよびＡＡＶの
調製物の生成のための例示的な技術は、以下の節において提供される。

【００８４】 ウイルス調製物の感染性力価の決定のための種々の方法が当該分野で公知であ
る。力価決定のための１つの方法は高処理能力力価決定アッセイである。高処理
能力力価決定アッセイにおいて、各々が哺乳動物細胞のアリコートおよびウイル
ス調製物のアリコートを含む培養ウェル（ならびに、例えば、細胞単独、ウイル
ス単独を含むコントロールウェル、および何も含まないコントロールウェル）の
アレイが確立される。培養ウェルのアレイは、例えば、マイクロタイター容器の
形態においてであり得る。代表的に、力価測定されるウイルス調製物のアリコー
ト（例えば、連続希釈したアリコート）をその細胞に添加し、次いで、その細胞
およびウイルスを、ウイルスの複製を可能にする条件（代表的には、哺乳動物宿
主細胞に適した増殖条件）下でインキュベートする。ウイルスの複製後、ウイル
ス核酸を、一般に、哺乳動物細胞の溶解によって放出させる（必要に応じて溶解
を促進する条件または薬剤を用いて）。複数の溶解物における核酸（ウイルス核
酸を含む）を、核酸を結合する条件下で（タンパク質および他の混入物を除去す
るのに適切な洗浄）メンブレンに移しそして固定する。このメンブレンは好まし
くは、もとのアレイの個々のウェルが、次いで、（各培養ウェルの溶解物由来の
）核酸（これは、そのメンブレン上の対応する位置に結合している）の「プール
」によって表される培養アレイの複製または鏡像である。次いで、そのメンブレ
ンと、標識したウイルス特異的（またはウイルス挿入物特異的）プローブとをハ
イブリダイズすることを使用して、そのアレイの点の各々、および対応して、も
との培養ウェルの各々における、ウイルス特異的核酸の相対量を同定および定量
し得る。核酸の移動、結合、洗浄、およびハイブリダイゼーションのための条件
および材料は、慣用的な分子生物学技術から適合され得る（例えば、「ドットブ
ロット」ハイブリダイゼーション（当該分野で記載されるような）。

【００８５】 （ＡＡＶベクターおよびＡＡＶパッケージング遺伝子の選択および調製） 本明細書に記載される産生方法において使用されるプロデューサー細胞は、ｒ
ＡＡＶベクターを含む。ｒＡＡＶベクターは、通常ＡＡＶゲノムの大部分を構成
するＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の全てまたは一部の代わりに、
目的の異種（すなわち、非ＡＡＶ）ポリヌクレオチドを含む。しかし、野生型Ａ
ＡＶゲノムにおける場合のように、ｒＡＡＶベクターは、好ましくは、上記の２
つのＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する。ｒＡＡＶ構築物が単一の（
代表的には改変された）ＩＴＲに隣接するバリエーションもまた、当該分野にお
いて記載され、そして本発明とともに使用され得る。

【００８６】 任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが、適切である。なぜなら、種々の血清型
は、遺伝子レベルにおいてさえ、機能的および構造的に関連するからである（例
えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ、編（１９８８）の１６５〜１７
４頁；およびＲｏｓｅ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：
１、１９７４を参照のこと）。全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によっ
て媒介される、類似の複製特性を明らかに示す；そして、その全ては一般的に３
つの関連するキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２で発現されるタンパク質
）を有する。関連性の程度は、ゲノム長の全体にわたる、血清型の間の広範な交
差ハイブリダイゼーションを示すヘテロ２重鎖分析；およびＩＴＲに対応する末
端での、類似の自己アニーリングセグメントの存在によって、さらに示唆される
。類似の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が、類似の調節性制
御下にあることを、示唆する。種々のＡＡＶ血清型の中で、ＡＡＶ２が最も一般
に使用される。

【００８７】 ｒＡＡＶベクターは、異種ポリヌクレオチドを含有する。このポリヌクレオチ
ドは、代表的には、遺伝子治療（例えば、特定の表現型の発現のアップレギュレ
ーションまたはダウンレギュレーション）の状況において、標的細胞に機能を提
供する能力のために興味深い。そのような、異種ポリヌクレオチドまたは「トラ
ンスジーン」は、一般的に、所望の機能またはコード配列を提供するのに十分な
長さのものである。ＡＡＶ２粒子内へのキャプシド化のために、トランスジーン
は、好ましくは、約５ｋｂ未満であるが、より長い配列のＡＡＶウイルス粒子内
へのパッケージングを可能とするために、他の血清型および／または改変が使用
され得る。

【００８８】 異種ポリヌクレオチドの転写が意図される標的細胞において所望される場合、
これはそれ自体のプロモーターか、または異種プロモーター（例えば、当該分野
において公知のように、標的細胞内の転写の所望のレベルおよび／または特異性
に依存する）に、作動可能に連結され得る。種々の型のプロモーターおよびエン
ハンサーが、この状況での使用に適切である。構成性プロモーターは、遺伝子転
写の継続するレベルを提供し、一方、誘導性プロモーターは、一般的に、インデ
ューサーの非存在下において低い活性を示し、そしてインデューサーの存在下で
アップレギュレートされる。プロモーターおよびエンハンサーはまた、組織特異
的であり得る；すなわち、これらは、特定の細胞型においてのみ、（おそらくそ
れらの細胞においてのみ独特に見出される遺伝子調節エレメントに起因して）そ
の活性を示す。

【００８９】 プロモーターの例示的な例は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロ
モーター、バキュロウイルス多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）エンハンサー／プ
ロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ
）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターおよびＬＴＲエレメ
ントを含む種々のレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターとし
ては、重金属イオン誘導性プロモーター（例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ｍＭ
ＴＶ）プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーター）、ステロイドホル
モン誘導性プロモーター、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性なＴ
７ファージ由来のプロモーターが、挙げられる。組織特異的プロモーターの例と
しては、種々のサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）プロモーター（肺におけ
る発現のため）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現のため）、およびア
ルブミンプロモーター（肝臓での発現のため）が挙げられる。非常に多種の他の
プロモーターが公知であり、そして一般的に当該分野において入手可能であり、
そして、そのようなプロモーターの多くの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース
のような配列データベースにおいて入手可能である。

【００９０】 意図された標的細胞において、翻訳もまた所望される場合、異種ポリヌクレオ
チドはまた、好ましくは、翻訳を容易にする制御エレメントもまた含有する（例
えば、リボソーム結合部位、すなわち、「ＲＢＳ」、およびポリアデニル化シグ
ナル）。従って、異種ポリヌクレオチドは、一般的に、適切なプロモーターに作
動可能に連結した、少なくとも１つのコード領域を含み、そして、例えば、作動
可能に連結したエンハンサー、リボソーム結合部位、およびポリＡシグナルを含
有し得る。異種ポリヌクレオチドは、１つのコード領域、または同一かまたは異
なるプロモーターの制御下の１つより多いコード領域を含有し得る。制御エレメ
ントおよびコード領域の組み合わせを含む全体のユニットは、しばしば、発現カ
セットと称される。

【００９１】 異種ポリヌクレオチドは、組換え技術によって、ＡＡＶゲノムのコード領域中
に、または好ましくは、その代わりに（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ
遺伝子の代わりに）組み入れられ、そして好ましくは、いずれかの側でＡＡＶの
逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接する。このことは、ＩＴＲがコード配列の
上流および下流の両方に、いずれか一方は直接の近傍位置において、好ましくは
（必要ではないが）複製コンピテントなＡＡＶゲノムを再生し得る組換えの可能
性を減少するために、ＡＡＶ起源の介在配列を全く含まずに出現することを意味
する。単一のＩＴＲが、通常２つのＩＴＲを含む配置に関連する機能を行うのに
十分であり得（ＷＯ９４／１３７８８）、従って、単一のＩＴＲのみを有するベ
クター構築物が、本発明のパッケージング方法および生成方法に関連して使用さ
れ得る。

【００９２】 ｒｅｐのネイティブのプロモーターは、自己調節性であり、そして生成される
ＡＡＶ粒子の量を制限し得る。ｒｅｐ遺伝子はまた、異種プロモーターと作動可
能に連結され得る（ｒｅｐは、ベクター構築物の一部として提供されるか、また
は別々に提供される）。ｒｅｐ遺伝子の発現によって、強力にはダウンレギュレ
ートされない異種プロモーターはいずれも適切である；しかし、誘導性プロモー
ターは、好ましい。なぜなら、ｒｅｐ遺伝子の構成性発現は、宿主細胞に負の影
響を有し得るからである。非常に多種の誘導性プロモーターが、当該分野におい
て公知であり、そして例は上記に列挙されている。誘導性プロモーターの特に好
ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを相補する
ために使用されるヘルパーウイルスによって誘導されるサブクラスである。多数
のヘルパーウイルス誘導性プロモーターもまた、記載され、これには、アデノウ
イルスＥ１Ａタンパク質によって誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモー
ター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６または１ＣＰ４のような
ヘルペスウイルスタンパク質によって誘導されるヘルペスウイルスプロモーター
；ならびにワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモーターが、挙げられ
る。

【００９３】 ヘルパーウイルス誘導性プロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝
子由来のプロモーター）を同定および試験するための方法は、記載されている。
ＷＯ９６／１７９４７（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ）を参照のこと。

【００９４】 種々のＡＡＶゲノムの相対的なキャプシド形成の大きさが制限されるので、こ
のゲノム内への大きい異種ポリヌクレオチドの挿入は、ＡＡＶ配列の一部を除去
することを必要とする。１以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、複製コンピテントなＡ
ＡＶ（「ｒｃＡＡＶ」）を生成する確率を減少するために、いずれの場合におい
ても所望される。従って、ｒｅｐ、ｃａｐまたはその両方のコード配列またはプ
ロモーター配列は、これらの遺伝子によって提供される機能がトランスに提供さ
れ得るので、好ましくは除去される。

【００９５】 生じたベクターは、これらの機能において「欠損性」であるといわれる。この
ベクターを複製およびパッケージングするために、この損失した機能を、種々の
損失ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子産物に必要な機能を共にコードする、１
つのパッケージング遺伝子または複数のパッケージング遺伝子で相補する。パッ
ケージング遺伝子またはパッケージング遺伝子カセットは、ベクター配列と離れ
て提供されるパッケージング遺伝子との間で、複製の間に相同組換えを最小化す
るために、好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接されず、そして好ましくは、ｒＡ
ＡＶゲノムと実質的な相同性を全く共有しない。相同性および対応する組換えの
頻度のレベルは、相同性配列の長さ、および共有される同一性のレベルを増加す
ることによって増加する。所定の系において関係する相同性のレベルは、当該分
野で公知のように、理論的に決定され、そして実験的に確認される。しかし、代
表的に、組換えは、たとえ重複配列の全長にわたって少なくとも８０％同一であ
っても、その重複配列が約２５ヌクレオチド配列未満である場合か、またはたと
え重複配列の全長にわたって少なくとも７０％同一であっても、その重複配列が
約５０ヌクレオチド配列未満である場合には、実質的に減少または排除され得る
。もちろん、さらに低いレベルの相同性は、それらが組換えの確率をさらに減少
するので、好ましい。重複相同性を全く有さなくとも、ｒｃＡＡＶを生成するい
くらかの残存頻度があることは明らかである。ｒＣＡＡＶを生成（例えば、非相
同組換えにより）する頻度のなおさらなる減少は、ＷＯ９８／２７２０４（Ｔａ
ｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載されるよう
に、ＡＡＶの複製およびキャプシド形成の機能を「分裂」させることによって得
られ得る。

【００９６】 ｒＡＡＶベクター構築物、およびその相補的パッケージング遺伝子構築物は、
多くの異なる形態で本発明において実用され得る。ウイルス粒子、プラスミド、
および安定に形質転換された宿主細胞は全て、このような構築物をパッケージン
グ細胞内に、一過的または安定的のいずれかで導入するために使用され得る。他
の組み合わせも可能である。

【００９７】 ＡＡＶベクターおよび相補的パッケージング遺伝子は、もし存在する場合、細
菌プラスミド、ＡＡＶ粒子、またはこれらの任意の組み合わせの形態で提供され
得る。あるいは、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子のいずれか、また
はその両方は、遺伝子改変された（好ましくは、遺伝的に改変されるか、または
安定に組み込まれた）真核生物細胞の形態で提供される。ＡＡＶベクター配列、
ＡＡＶパッケージング遺伝子、またはその両方を発現するように遺伝的に改変さ
れた宿主細胞の発生は、信頼のおけるレベルで発現される材料の、確立された供
給源を提供する。従って、種々の異なる遺伝子改変された細胞は、当該分野（特
に、米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９８／２３
０１８；米国特許第５，６５６，７８５号；ＷＯ９８／２７２０４）に記載され
るように、本発明の状況において使用され得る。

【００９８】 従って、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、プラスミド中に存在し得るか
、そして／またはプロデューサー細胞のゲノム内に安定に組み込まれ得る。

【００９９】 （細胞内への遺伝物質の導入） 当該分野で記載され、そして本明細書および上記で引用された参考文献の両方
において説明されるように、遺伝物質を、プロデューサー細胞内に、このような
細胞を形質転換または形質導入するための任意の種々の手段（例えば、細菌プラ
スミドを用いたトランスフェクション、ウイルスベクターを用いた感染、エレク
トロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、および脂質ベースの種々の任意の
組成物を用いる導入（しばしば「リポフェクション」と呼ばれるプロセス））を
用いて導入し得る。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該分
野で記載され、そして広く利用可能である。

【０１００】 適切に改変されたプロデューサー細胞の選択は、当該分野の任意の技術により
実施され得る。例えば、細胞を改変するために用いられるポリヌクレオチド配列
は、当該分野で公知のような１つ以上の検出可能または選択可能マーカー（例え
ば、薬物耐性遺伝子）と同時に挿入され得るか、またはそれらに作動可能に連結
され得る。導入されたポリヌクレオチドの獲得、局在化および／または維持につ
いての試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく技術（サザンブロッティ
ングおよび当該分野で公知の他の手順など）を用いて実施され得る。発現の試験
は、遺伝子的に改変された細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析によるか、
または対応する遺伝子産物に対する間接的な免疫蛍光により容易に実施され得る
。パッケージング能力および効率の試験および確認は、細胞に、ＡＡＶの残りの
機能的成分およびヘルパーウイルスを導入し、ＡＡＶ粒子の産生を試験すること
により得られ得る。細胞が、複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変され
る場合、一般に、それらを、細胞に別々に導入し、各工程を順次確証することが
（必須ではないが）より便利である。このような技術を記載する参考文献は、本
明細書に引用されたものを含む。

【０１０１】 （ヘルパーウイルスの選択および調製） 上記のように、ＡＡＶは、自己複製欠損であるパルボウイルスであり、そして
一般に、特定の複製機能を供給するヘルパーウイルスに依存しなければならない
。種々のヘルパーウイルスが、本発明の方法において使用され得る。

【０１０２】 多くのこのようなヘルパーウイルスが同定され、これらは、アデノウイルス、
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガロウイルスおよびＨＨＶ−６を含むが
これらに限定されない）、およびポックスウイルス（特にワクシニア）を含む。
これらウイルスのいずれかを本発明とともに用い得る。

【０１０３】 頻繁に、ヘルパーウイルスは、意図される宿主細胞に感染し得る、あるタイプ
およびサブグループのアデノウイルスである。サブグループＣのヒトアデノウイ
ルス、特に血清型１、２、４、６、および７が一般に用いられる。血清型５が一
般に好ましい。アデノウイルスの特徴および増殖パターンは当該分野で公知であ
る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら編、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
」中の、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、７７１〜８１６頁を参照のこと。

【０１０４】 必須ではないが、原則的に、ヘルパーウイルス株は、最終的に遺伝子治療を受
ける被験体中で複製欠損であることが所望される。従って、ｒＡＡＶ調製物中に
存在する任意の残存ヘルパーウイルスは、複製不能である。Ｅ１Ａ領域、または
Ｅ１Ａ領域およびＥ３領域の両方が除去されたアデノウイルスは、大部分のヒト
細胞に対して感染性ではない。それらは、失われた活性を相補し得る許容細胞株
（例えば、ヒト２９３細胞株）中で複製され得る。ヘルパー機能と関連するよう
であるアデノウイルスの領域、およびそうでない領域は、同定され、そして当該
分野で記載されている（例えば、Ｐ．Ｃｏｌｏｓｉら、ＷＯ９７／１７４５８、
およびそこに引用される参考文献を参照のこと）。

【０１０５】 （条件的感受性ヘルパーウイルスの使用） 「条件的感受性」ヘルパーウイルスもまた、ヘルパーウイルス活性を提供する
ために使用され得る。ＷＯ９９／１１７６４を参照のこと。このようなヘルパー
ウイルス株は、ＡＡＶがそれ自身効果的なゲノム複製を行わない少なくとも１セ
ットの条件下で、宿主細胞中でのＡＡＶ複製を支持し得る性質を最小限有さなけ
ればならない。ヘルパーウイルス活性が、インタクトなウイルス粒子として提供
される場合、一般に、このウイルスが、第２のセットの条件下で、宿主細胞中で
複製し得ることが必要である。第１のセットの条件は、第２のセットの条件と、
容易に制御可能な特徴（必要な補因子（例えば、カチオン）の存在または非存在
、阻害薬物の存在または非存在、または温度のような環境条件におけるシフトな
ど）が異なる。最も簡便には、２つの条件の差異は、温度であり、そしてこのよ
うな条件的感受性ウイルスは、それゆえ、温度感受性ヘルパーウイルス（ｔｓＨ
Ｖ）と呼ばれる。

【０１０６】 「温度感受性」または「ｔｓ」ヘルパーウイルスは、特定の温度範囲（「許容
」温度範囲）、代表的には約１５〜３５℃、そして好ましくは約２０〜３２℃で
、真核細胞中でその遺伝物質を複製し得るものである。しかし、「非許容」温度
では、たとえその他の条件が同じに保たれたとしても、遺伝物質の複製の速度は
、実質的により低く、少なくとも１０倍低く；通常少なくとも約１００倍より低
く；および好ましくは少なくとも約１０００倍低い。代表的には、この温度は、
約３５〜５０℃、一般に、約４２℃である。このような、ｔｓヘルパーウイルス
の代表的な実施例では、このウイルスは、約２０〜３２℃の温度のような比較的
低温度で効率的に複製し得るが、約３７〜４２℃の温度のような比較的高温では
効果的に複製し得ない。ウイルス感染細胞は、それにもかかわらず、非許容温度
で、ＡＡＶ産生のためのヘルパー機能を含むがこれに限定されない、ウイルスに
起因し得るいくつかの代謝プロセスを示し得ることが理解される。

【０１０７】 温度感受性ヘルパーウイルスは、感染細胞を許容温度で培養することにより、
大量に産生し得る。次いでＡＡＶベクターは、ベクターエレメントおよび温度感
受性ヘルパーウイルスを含む細胞を、非許容温度で培養することにより産生され
得る。ベクター調製物は、ヘルパーウイルス成分を実質的に含んでいない。

【０１０８】 多数の温度感受性アデノウイルス改変体が当該分野で記載されている；例えば
、Ｅｎｓｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８、１９７２）；Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓら（Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１１：９５、１９７１）；Ｉｓｈｉｂａ
ｓｈｉ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６５：３０４、１９
７０）；Ｌｕｎｄｈｏｌｍら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：８２７、１９７１）；
およびＳｈｉｒｏｋｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：４７４、１９７４）により
記載された改変体を参照のこと。相補性分析は、このような改変体が、複数の異
なる相補性グループに入ることを示している（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３４：４１９
、１９７４）。このことは、アデノウイルス複製サイクル中の多くの工程に温度
感受性を与え得ることを示唆する。

【０１０９】 ＡＡＶ複製のヘルパー機能は、アデノウイルスサイクルの一部分のみがインタ
クトであることを必要とするので、非許容温度で、種々の変異体のヘルパー機能
を試験することは、ヘルパー機能をマッピングするための手段を提供する。例え
ば、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７、１９７１）は、
温度感受性トリアデノウイルス改変体がＡＡＶ１およびＡＡＶ２の複製を支持す
ることを報告した。Ｉｔｏらは、ヒトアデノウイルス７の温度感受性変異体ｔｓ
１３（Ａｄ７ｔｓ１３）が、野生株と同じく効率的に非許容温度でＡＡＶ複製を
補助することを報告した。Ｄｒａｋｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６０：２３０、１
９７４）は、３つのグループの、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）の温度
感受性変異体によるＡＡＶ４抗原合成の相補を報告した。Ｈａｎｄａら（Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏ． ２９：２３９、１９７５）は、ヒトアデノウイルス変異体Ａ
ｄ５ｔｓ３６、Ａｄ５ｔｓ１２５、Ａｄ５ｔｓ１４９、Ａｄ１２ｔｓＡ２７５、
Ａｄ１２ｔｓＢ２２１、およびＡｄ１２ｔｓＣ２９５によるＡＡＶ１ウイルス産
生に対するヘルパー活性を報告した。Ｏｓｔｒｏｖｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １
０４：５０２、１９８０）は、温度感受性変異体、Ａｄ５ｔｓ１２５、Ａｄ５ｔ
ｓ１３５、Ａｄ５ｔｓ１５７、Ａｄ５ｔｓ１１６、およびＡｄ５ｔｓ１４２、な
らびに宿主範囲変異体ｈｒ６がＡＡＶ複製を支持する（ｈｒ３は支持しない）こ
とを報告した。Ｍａｙｏｒら（Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３５：５４５、１９７
７）は、Ａｄ３１ｔｓ９４ではなくＡｄ３１ｔｓ１３が、非許容温度でＡＡＶ１
産生を支持したことを報告した。

【０１１０】 Ｓｔｒａｕｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：７
４２、１９７６）は、Ａｄ５ｔｓ１２５が、アデノウイルスがそれ自身複製しな
い条件下で、ＡＡＶ２複製を支持したことを報告した。彼らは、この性質を用い
てＡＡＶ複製の間に形成されるＤＮＡ中間体を研究した。Ｍｙｅｒｓら（Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．３５：６５、１９８０）は、ヘルパー機能に関して定量的研究を実施
し、そしてＡｄ５ｔｓ１４９が非許容温度で、１細胞あたり２０，０００の感染
性ＡＡＶ粒子の産生を支持したが、その一方、Ａｄ５ｔｓ１０７は、１細胞あた
りほんの約１００粒子を生産したに過ぎないことを示した。Ａｄ５ｔｓ１０７は
、７２ｋＤａ ＤＮＡ結合タンパク質コード領域中に変異を有するので、彼らは
、このタンパク質が、ＡＡＶ ＲＮＡ発現において役割を果たすと結論付けた。
より最近、Ｃａｒｔｅｒら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：４７３、１９９２）は
、完全に機能的な７２ｋＤａタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子
の定量的な転写後の発現に必要であることを提唱した。

【０１１１】 ヘルパーウイルスの選択された株の条件感受性改変体は、適切な変異誘発およ
び選択戦略により生成され得る。例えば、ウイルスは、ニトロソグアニジン、亜
硝酸、ヒドロキシルアミン、または５−ブロモ−２−デオキシウリジンで変異誘
発され得る。所望の許容条件下で、適切な真核細胞において増加し得るが、所望
の非許容条件下ではそうではない候補が選択される。例として、例えば、３２℃
で増加するが、３９．５℃では増加しないアデノウイルス温度感受性変異体が得
られ得る。３９．５℃対３２℃でのプラーク形成効率比は、好ましくは、１０^-4 より少なく、そしてより好ましくは１０^-5より少ない。温度感受性アデノウイル
スの適切な選択プロセスのさらなる例は、例えば、Ｅｎｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．１０：３２８、１９７２；およびＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｇｅｎ
Ｖｉｒｏｌ．１１：９５、１９７１に見出され得る。温度感受性ではなく、宿主
範囲感受性であるアデノウイルス改変体の記載は、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ７７：３１９、１９７７に見出され得る。本発明における使用に有
効な温度感受性変異体は、例えば、代替のヘルパーウイルス様単純ヘルペス１（
ＨＳＶ１）、または単純ヘルペス２（ＨＳＶ２）から調製され得る。例えば、Ｈ
ＳＶ１についてＳｃｈａｆｆｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５７、１９７３
；ＨＳＶ２についてＥｓｐａｒｚａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：５５４、１９
７４を参照のこと。背景のセクションで示したように、多数の条件感受性ヘルパ
ーウイルスが記載され、そしてそれらを開発または記載した科学者から、または
公的な寄託機関から得られ得る。

【０１１２】 この株は、非許容条件下でブロックされる機能が、ＡＡＶの高効率複製に必要
であるものではないような、その複製サイクルにおけるステージで条件感受性を
与えなければならない。使用のためのそのヘルパーウイルス株の選択は、ヘルパ
ーウイルスおよびＡＡＶの複製要件の両方の公知の生物学を参照してなされ得る
。

【０１１３】 本発明で使用のための例示のヘルパーウイルスは、Ａｄ５血清型の温度感受性
アデノウイルスｔｓ１４９（Ａｄ５ｔｓ１４９）である。最適化条件下で、この
株を用いて、野生型Ａｄ５により支持されるレベルに一致またはそれを超えるレ
ベルでｒＡＡＶを産生し得る。ｔｓ１４９は、位置７５６３においてＣ−Ｇから
Ａ−Ｔへの単一のトランジションを有する（Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｖｉｒｕｓ Ｇ
ｅｎｅｓ ４：５３、１９９０）。これは、ＤＮＡポリメラーゼの残基４１１の
アミノ酸ロイシンのフェニルアラニンへの変化を生じる。このＤＮＡポリメラー
ゼは、アデノウイルスのＥ２転写ユニット内に含まれる。しかし、この領域にマ
ッピングされるその他のｔｓ変異体は、あまり適切ではない。特に、このＥ２転
写ユニットはまた、７２ｋＤａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）のコード領域
を含む。検出可能なＤＢＰを産生しない株（Ａｄｄ／８０２）は、ＡＡＶ複製を
支持するが、そのレベルは１オーダーの大きさ減少する（Ｃａｒｔｅｒら、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ １９１：４７３、１９９２）。Ａｄｔｓ１２５（これもまたＤＢ
Ｐコード領域にマッピングされる変異を含む）は、野生型Ａｄ５を用いるよりも
一般にかなり低いレベルであるが（Ｍｙｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６５
、１９８０）、ＡＡＶ複製を支持する（Ｓｔｒａｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７
：１４０、１９７６）。従って、本発明における使用のための適切な温度感受性
アデノウイルスベクターは、感受性が、ゲノムのＥ２Ａ領域、好ましくはＤＮＡ
ポリメラーゼコード領域にマップされるベクターを含む。

【０１１４】 当業者は、候補ヘルパーウイルス株のパネルを、候補細胞中で、そのヘルパー
の自己複製に非許容的である条件下で用いるｒＡＡＶ複製アッセイを実施するこ
とにより、ヘルパーウイルスとしての使用にどのウイルス株が適切であるかを容
易に決定し得る。温度感受性改変体について、スクリーニングは、株の既知の性
質に従って非許容温度で行われる。非許容温度は、一般に、許容温度より高く、
代表的には約３５〜５０℃、好ましくは３８〜４５℃、より好ましくは約３９．
５℃である。対応する野生型ウイルスにより支持されるレベルの１オーダーの大
きさの中にあるレベルでＡＡＶ複製を支持する改変体が好ましい。スクリーニン
グを実施することで、当業者は、本開示の他の教示を取り込むべきである。特に
、野生型ウイルスでピークのＡＡＶ産生を与える時間培養することによるスクリ
ーニングは、不十分である。候補ヘルパーウイルスをより長い期間用い、次いで
ピーク収穫時間にある野生型ウイルスと比較する速度論的マトリックスが設定さ
れるべきである。

【０１１５】 一旦、適切なヘルパーウイルス株が選択されたなら、それは、本発明において
多くの異なる形態で履行され得る。ウイルス粒子、ウイルスプラスミド、および
安定に形質転換された宿主細胞のすべてが用いられ得る。

【０１１６】 １つの実施態様では、ヘルパーウイルスのゲノム（または最小限、ヘルパー機
能をコードするヘルパーウイルスゲノムの領域）が宿主細胞中に導入され、ＤＮ
Ａプラスミド、または相補的機能を提供する複数のプラスミドの形態にあるｒＡ
ＡＶベクターの複製に用いられる。アデノウイルスの実験操作のための手順は、
当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ」：Ｍｕｒｒａｙ ＥＪ編、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第７巻、Ｃ
ｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ：Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９１：１０９−１
２８を参照のこと。こらは、アデノウイルスの増殖、滴定、および精製、同時ト
ランスフェクションおよびインビボ組換えの詳細なプロトコルを提供する。アデ
ノウイルスプラスミドは、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．
，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａから市販されている。

【０１１７】 別の実施態様では、宿主細胞は、アデノウイルス遺伝子で安定にトランスフェ
クトされるか、または遺伝子的に改変されてｒＡＡＶ複製に必須の機能を提供す
る。あるいは、宿主細胞は、アデノウイルスゲノムの部分のみが遺伝子的に改変
され得、次いでアデノウイルス粒子またはプラスミドで感染またはトランスフェ
クトされる。特許出願ＷＯ９５／２７０７１およびＷＯ９５／３４６７１は、遺
伝的に改変されてアデノウイルス機能を提供する宿主細胞を記載し、これは、種
々の欠損アデノウイルス構築物の複製性質を補完する。

【０１１８】 なお別の実施態様では、ＡＡＶ複製に用いられる宿主細胞は、自己複製し得る
（しかし非許容条件下ではそうではない）ヘルパーウイルスで感染される。十分
なＭＯＩを提供する必要な株の任意の調製物が用いられ得る。ＧＭＰおよびその
他の規制要件を維持することにおいて、および商業的目的のスケールアップを容
易にするために、好ましくは、ヘルパーウイルスの調製物は、高密度の感染性粒
子を含み、そして細胞残渣およびその他の夾雑物を実質的に含まない。所望の性
質は以下を含む： ・ＴＣＩＤ₅₀アッセイで測定したとき、少なくとも１０⁶、好ましくは少なくと
も約１０⁸、より好ましくは少なくとも約１０¹⁰ＩＵ／ｍｌの密度。 ・総タンパク質またはアデノウイルスヘキソンに対するアデノウイルスＤＮＡの
比は、ウイルス粒子の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも約５０％、よ
り好ましくは、少なくとも約８０％が、アデノウイルスＤＮＡを含むことを示す
。 ・タンパク質について染色されたＳＤＳゲル、またはエチジウムブロマイドで染
色された制限ヌクレアーゼ消化物のアガロースゲルにより検出されるとき、タン
パク質またはＤＮＡレベルの非アデノウイルス物質による、２０％より少ない、
好ましくは約１０％より少ない、より好ましくは約１％より少ない夾雑物。 ・生産バッチあたり、合計少なくとも１０⁹、好ましくは少なくとも約１０¹¹、
より好ましくは少なくとも約１０¹³ＩＵ。

【０１１９】 ヘルパーウイルスは、ウイルス複製について許容性である任意の細胞において
調製され得る。アデノウイルスについて、好ましい細胞は、２９３細胞およびＨ
ｅＬａ細胞を含む。伝統的に、これらの細胞は、アデノウイルスの複製のために
用いられる場合、それらは、プレート培養において使用されてきた。これらの方
法は、一般に、野生型アデノウイルスよりも１または２対数分低いレベルで温度
感受性アデノウイルスの複製を支持する。

【０１２０】 従って、播種密度の増加を許容する培養技術を使用することが好ましい。懸濁
培養に適合させた２９３細胞およびＨｅＬａ細胞改変体が利用可能である。Ｈｅ
Ｌａは、細胞増殖、生存度、および懸濁物中の形態の理由のために好ましい。こ
れらの細胞を十分な密度（２×１０⁶／ｍｌ）で増殖させて、温度感受性アデノ
ウイルス株の複製速度の低下を補い得る。一旦樹立されると、細胞にそのウイル
スを感染させ、そして十分な時間（一般的に３〜７日間および代表的に約５日間
）許容温度で培養する。

【０１２１】 接線流濾過は、当該分野において、その灌流、濃縮および採取の目的のために
大容量の哺乳動物細胞を処理するために使用される技術である。例えば、Ｄｏｒ
ｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：４９４、１９９０；Ｍａｉｏｒ
ｅｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３７：１２１、１９９１を
参照のこと。この技術は、本発明における使用のためのヘルパーウイルスの調製
のために懸濁培養物を用いて使用することが推奨される。ＨｅＬａ Ｓ３細胞は
、７５０〜１５００秒^-1の剪断力に耐え、これにより細胞の濃縮および使用した
培地のダイアフィルトレーションが可能になる。

【０１２２】 ウイルスを、使用した培地からまたはその細胞の微量流動化によるかのいずれ
かで、その培養物から採取する。その培養物において産生されたヘルパーウイル
スのレベルは、代表的に少なくとも１０⁷ＩＵ／ｍｌであり、そして好ましくは
少なくとも約３×１０⁷ＩＵ／ｍｌである。

【０１２３】 上記の記載に従って調製されたヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶ複製のために使
用される宿主細胞を感染させるために直接使用され得る。より通常には、このウ
イルスは、使用前に単離および濃縮される。ヘルパーウイルスを精製および濃縮
するための現在の方法は、代表的には、等密度ＣｓＣｌ勾配を含む。この方法は
、時間集約的および労働集約的であり、多数の開放処理工程を必要とし、そして
規模拡大が困難である。その代わり、クロマトグラフィーによる精製が推奨され
る。読者は一般に、Ｐｒｉｏｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１
９：３０、１９９５；およびＨｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ ６：１４０３、１９９５を参照する。アデノウイルスの温度感受性株の
単離のために特に好ましいのは、アニオン交換クロマトグラフィー、特にｐＨ７
．４での連続的なＮａＣｌ勾配を用いるポリエチレンイミンの樹脂においてであ
る。

【０１２４】 （本発明における使用のために好ましい、ＡＡＶの産生および精製） ヘルパーウイルスを用いる場合、例示の目的で、「上流」および「下流」のプ
ロセス相へとＡＡＶの産生および精製の議論を分割することが簡便である；「上
流」プロセスとは、一般的に、適切な宿主細胞におけるＡＡＶの産生、および「
粗」ＡＡＶ調製物を産生するためにその細胞からそのウイルスを放出することを
いう。「下流」プロセシングは、そのＡＡＶ調製物を精製するために使用され得
る（例えば、細胞タンパク質および／または他の混入物からＡＡＶを単離するた
めに）。

【０１２５】 本発明の好ましい局面において、ＡＡＶの上流および下流のプロセシングは、
混入する細胞タンパク質、ならびに混入する任意のヘルパーウイルス（例えば、
Ａｄ）またはヘルパーウイルスタンパク質を実質的に減少および／または除去す
るように設計された様式で実施される。これらの物質のいずれも、遺伝子移入の
ために使用される最終のｒＡＡＶベクター調製物において実質的なレベルで存在
する場合、免疫応答の誘発に寄与し得る。

【０１２６】 以下の節は、例示の目的で、ｒＡＡＶの産生のために使用され得る技術を記載
する。

【０１２７】 （（ｉ）ＡＡＶ上流処理） ＡＡＶベクターは、必要なＡＡＶパッケージング遺伝子（例えば、ＡＡＶ ｒ
ｅｐおよびｃａｐ遺伝子）；少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）
に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロ
ベクター；およびＡＡＶのためのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）
を含む、哺乳動物細胞株から産生され得る。これらの成分は、種々の構成で細胞
中に導入され得る。ＡＡＶは、任意の種々の哺乳動物細胞において複製され得そ
してパッケージングされ得るので、ＡＡＶの産生のために改変され得そして使用
され得る多数の細胞株が存在する。

【０１２８】 例示のために、ＡＡＶベクターは、細胞株（例えば、「Ｃ１２」（Ｋ．Ｒ．Ｃ
ｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、３：１１２４−１１３２、１９９６に
よって記載される）または「Ｃ１３７．５」株（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｌｌｅｎら、ＷＯ９６／１７９７４に
よる、共有に係る同時係属中の出願に記載される）から産生され得る。この細胞
株は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ構築物ならびにベクター構築物を含むように
操作されている。必要に応じて、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ構築物を含む、Ｃ
１２またはｃｌ３７のような細胞株は、ベクター構築物を含むプラスミド（例え
ば、ｐｔｇＡＡＶ−ＣＦ）でトランスフェクトされ得る。または、ｒｅｐおよび
ｃａｐを含むプラスミド（例えば、ｐＲＳ５）、ならびにベクター構築物を含む
プラスミドで細胞がトランスフェクトされ得る。この細胞は、アデノウイルスに
感染させられ得るか、またはアデノウイルス遺伝子を含むＤＮＡでトランスフェ
クトされ得る。

【０１２９】 種々のこのようなＡＡＶ「プロデューサー」細胞が、本明細書において引用さ
れた参考文献および当該分野で記載されるように、産生され得る。

【０１３０】 ＡＡＶプロデューサー細胞は、哺乳動物細胞の増殖に一般的に適切であり、Ａ
ＡＶ複製にもまた一般的に許容性である条件（培地、温度などを含む）下で増殖
され得る。例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２懸濁培地は、その細胞の増殖について好ま
しく、そしてＤＭＥＭ培地単独は、ＡＡＶベクター産生について好ましい。当該
分野で公知であるように、いくつかの細胞型および細胞株は、接着依存性である
傾向にあるが、他の細胞は、懸濁物中で増殖し得；そして多くの接着依存性細胞
もまた、懸濁増殖し得る改変体について富化しそして最終的に選択する手段とし
て懸濁条件下で細胞のサイクルを行うことにより、懸濁物中での増殖に「適合」
され得る。従って、ＡＡＶ産生のための細胞増殖は、その選択されたプロデュー
サー細胞株が、比較的接着依存性であるか、または懸濁適合されているか否かに
一部依存して、任意の種類の容器において、実施され得る。接着依存性細胞の増
殖のためのこのような容器はとして、例えば、組織培養フラスコ、ローラーボト
ル、マイクロキャリアおよびバイオリアクター（例えば、中空繊維、充填ベッド
または流動化ベッドのバイオリアクター）が挙げられる。懸濁適合した哺乳動物
細胞株のための容器としては、例えば、スピナーフラスコ、タンクリアクター、
およびエアリフト醗酵槽が挙げられる。

【０１３１】 ＡＡＶ複製は、一定時間、およびウイルス産生が最適になる、増殖周期におけ
る点まで進行し（好ましくは、中期から後期の対数増殖期（代表的には１〜３日
間））、その時点の後、そのウイルス粒子を培養上清から採取する。

【０１３２】 接線流濾過（ＴＦＦ）は、大容量の細胞をプロセスしそして採取するために都
合よく使用され得る。ＴＦＦは、動物細胞を灌流し、濃縮し、そして採取するた
めに使用され得る。例えば、ＴＦＦを使用して、１秒あたり３０００までの平均
壁剪断速度での層流条件下で細胞をプロセスし得る（例えば、Ｍａｉｏｒｅｌｌ
ａ、Ｂ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ，３７：１２１−１２６、１９９１）。ＴＦＦ限外濾過を用いるウイルスの
大規模濃縮は、Ｒ．Ｐａｕｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：
６０９−６１５、１９９３により記載されている。

【０１３３】 このような技術を用いた例示的な産生の実施は、以下に記載される。

【０１３４】 （（ｉｉ）ＡＡＶ下流処理） 上記に記載されるように、ヘルパーウイルス粒子（例えば、Ａｄ粒子）を実質
的に含まないＡＡＶの調製物を得ることは特に有利である。さらに、ＡＡＶベク
ター調製物はまた、好ましくは、ヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質（これ
はまた、免疫原性であり得る）を実質的に含まない。しかし、ＡＡＶ産生のため
の技術の適性に影響を与えるさらなるセットの限定が存在する。すなわち、遺伝
子治療のためのＡＡＶの産生に特に有用であるために、その技術は、「大規模化
可能」である（すなわち、大規模製造用デバイスおよび手順に関して適用可能で
ある）ことが最も所望される。この後者のセットの限定は、塩化セシウム分離（
これは、大規模調製手順にはあまり適していない）のような利用可能な標準的な
技術の有用性を有効に減少または排除する。

【０１３５】 好ましくは、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶまたはＡｄの可能な精製につい
て当該分野において言及されている種々の手順とは対照的である、イオン交換ク
ロマトグラフィー手順によってさらに精製される。特に、当該分野で記載されて
いるこのような手順は、代表的に、単一の型のイオン性分離、時に他の種類のク
ロマトグラフィー手順との組合せを使用する（例えば、Ｋ．Ｔａｍａｙｏｓｅら
、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：５０７−５１３（１９９６）、
およびＷＯ９６／２７６７７、１９９６年９月１２日を参照のこと）。しかし、
ＡＡＶ産生の場合、連続的な反対のイオン交換クロマトグラフィーの組合せが、
ヘルパーウイルス粒子およびタンパク質、ならびに細胞タンパク質を実質的に含
まないＡＡＶ調製物の生成に特に有効である。両方の反対のイオン性交換の組合
せは、その生成およびＡＡＶベクター調製物において代表的に生じる種々の粒子
およびタンパク質混入物の全て除去するのに特に有効である。

【０１３６】 任意の種々のカチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂がこれらの手順に関し
て使用され得、その基礎的な特性は、それぞれ、負荷電基および正荷電基の利用
可能性であり、それらの基に対して、ＡＡＶは、少なくともある程度（最も好ま
しくは、上記に記載のような１つ以上の混入物、すなわち、Ａｄ粒子およびタン
パク質、ならびに哺乳動物細胞タンパク質の相対的結合親和性とは実質的に異な
る程度に）結合し得る。理論に拘束されることは望まないが、アニオン交換工程
は、アデノウイルスからＡＡＶを分離するのに特に有効であると考えられる；一
方、両方の工程（しかし、特にカチオン交換工程）が、細胞タンパク質からＡＡ
Ｖを分離するのに特に有効であると考えられる。本発明者らはまた、以下に記載
および例示されるように、アニオン交換、次いで接線流濾過を使用した。以下に
さらに記載されるように、本発明者らは、ＡＡＶ調製物がヘパリン硫酸上のクロ
マトグラフィーによって高度に濃縮され得ることを見出した。

【０１３７】 例示のために、上記のように明澄化したＡＡＶ溶解物は、正に荷電したアニオ
ン交換カラム（例えば、Ｎ荷電アミノ樹脂またはイミノ樹脂（例えば、ＰＯＲＯ
Ｓ ５０ ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、三級アミンもしくは四級ア
ミン、またはＰＥＩベースの樹脂））または負に荷電したカチオン交換カラム（
例えば、ＨＳ、ＳＰ、ＣＭまたは任意のスルホ、ホスホ、もしくはカルボキシベ
ースのカチオン樹脂）にロードされ得る。そのカラムは、緩衝液（例えば、クロ
マトグラフィー緩衝液Ａ／ＴＭＥＧ）で洗浄され得る。そのカラムは、ＮａＣｌ
濃度の増加勾配で溶出され得、そして画分が集められ得、そしてＡＡＶおよび／
または混入物の存在についてアッセイされ得る。

【０１３８】 他の手順が、当該分野で公知なように、荷電以外の特徴によって媒介される分
子間会合に基づいて、上記のアニオンおよびカチオン交換手順に代わり、好まし
くはそれに加えて、使用され得る。このような他の手順は、リガンド−レセプタ
ー対（例えば、抗体−抗原、またはレクチン−炭水化物相互作用）に基づく分子
間会合、ならびにその分子の他の属性に基づく分離（例えば、サイズおよび／ま
たは形状に基づく分子篩クロマトグラフィー）を含む。ほんの１つの例をみると
、濾過物または部分精製したＡＡＶ調製物が、ＡＡＶ特異的抗体を含むカラムに
ロードされ得る。このカラムは、ＡＡＶを結合し得る。このカラムは、緩衝液で
リンスして、混入するタンパク質を除去し得、次いで漸増濃度のＮａＣｌの勾配
または段階を用いて溶出し、そして画分が集められ得る。あるいは、このような
カラムは、ロード緩衝液のｐＨとは異なるｐＨの緩衝液で溶出され得る。

【０１３９】 ＡＡＶおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイあるいは核酸ハイブ
リダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分において同定され得る。この
ピークをプールし得、そしてそのプールを緩衝液（例えば、ＴＭＥＧまたは等価
物）を用いて希釈または透析またはダイアフィルトレートして塩濃度を減少させ
得る。

【０１４０】 このプールは、正に荷電したアニオン交換カラムおよび／または負に荷電した
カチオン交換カラム（例えば、上記に言及されるもの）に注入され得る。このカ
ラムは緩衝液（例えば、クロマトグラフィー緩衝液Ａ／ＴＭＥＧ）で洗浄され得
る。このカラムは、漸増濃度のＮａＣｌの勾配で溶出され得、そして画分が集め
られ得る。ＡＡＶおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイによってあ
るいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分中で同定さ
れ得る。そのピークは、これらのアッセイのいずれかの結果に基づいてプールさ
れ得る。

【０１４１】 上記のアニオン交換カラムから溶出されたＡＡＶ含有画分のプールは、接線流
濾過（ＴＦＦ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ ＵｌｔｒａｓｅｔｔｅまたはＭｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎユニット）によって濃縮され得そして精製され
得る。適切な分子量カットオフ（例えば、１００，００または３００，０００カ
ットオフ）のメンブレンは、代表的に再生セルロースまたはポリエーテルスルホ
ンのようなポリマーから構成される。この調製物は、そのメンブレンを通して濾
過され、そしてその産物が保持される。保持された物質は、リンゲル平衡塩溶液
および５％グリセロールのような適切な緩衝液の連続的な洗浄を使用して、その
メンブレンを用いてダイアフィルトレートされ得る。最終のサンプルは、その産
物について非常に富化されており、そして０．２μフィルターを通して滅菌濾過
され得、そして使用のために保存され得る。

【０１４２】 接線流濾過を用いたアニオン交換カラム後の物質からのＡＡＶの精製および濃
縮において、３００，０００分子量カットオフメンブレンは、１００，０００分
子量カットオフメンブレンよりも、高収量の複製単位をもたらした。

【０１４３】 アデノウイルスの除去のために用いられ得る、さらなる工程は、所望である場
合、熱不活化工程（本明細書において記載されるような）を用いた溶離液プール
を処理する工程、次いで濾過（例えば、その調製物をＴＴＦに供する前に）を包
含する。しかし、本発明者らは、上記の「アニオン交換からＴＦＦ」手順が検出
可能なアデノウイルスを含まないＡＡＶ調製物を生じ、そしてより良い収率の精
製されたＡＡＶをもたらしたこと見い出した。

【０１４４】 例示的な産生は、以下に記載されるような技術を使用して行う。

【０１４５】 上記の記載は、とりわけ、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）およ
び細胞タンパク質を実質的に含まない組換えＡＡＶベクターの高力価の調製物を
生成するための方法を提供する。本発明の精神から逸脱することなく、これらの
方法に改変が当業者によって適用されることが理解される。

【０１４６】 以下に提示される実施例は、当業者にとってさらなるガイドとして提供され、
そしていかなる形でも限定することは意図されない。

【０１４７】 （実施例） （実施例１） （一般的な方法） （ベクター調製物中のｒＡＡＶ力価の定量：スロットブロットアッセイ） ｒＡＡＶ ＤＮＡスロットブロットアッセイを以下のように行った。サンプル
のアリコートを、ヌクレアーゼで消化して、キャプシド化していないＤＮＡを除
去した。次いで、このサンプルを、１．０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとともに０
．４Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃で変性した。サンプルおよびｒ
ＡＡＶ標準物を希釈し、そしてスロットブロットマニホールドを用いてナイロン
メンブレン上に濾過し、そして０．４Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。このフィルター
を、³²Ｐ標識したヒトＣＦＴＲ ｃＤＮＡ制限フラグメントとハイブリダイズし
た。このプローブは、ＡＡＶＣＦベクターから約１．５ｋｂのフラグメント（予
測した１．４４８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応する）を検出した。

【０１４８】 （ｒＡＡＶを測定するためのマイクロタイター感染度アッセイ） マイクロタイター感染度アッセイを以前に記載のように行った。Ａｔｋｉｎｓ
ｏｎら、（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６（
１１）：２８２１−２８２３。簡潔には、感染性ウイルスを測定するための高ス
ループットマイクロタイター感染度アッセイを以下のように行った。系列希釈さ
れた細胞を含まない上清のアリコート（１０μｌ）を、９６ウェルのマイクロタ
イタープレート中で増殖させたＨｅＬａクローン３７細胞に接種した。３日後、
感染細胞を、変性溶液（１／１０容量の４．０Ｍ ＮａＯＨ、１０μｇ／ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡおよび１００ｍＭ ＥＤＴＡの添加）で処理および溶解させた。溶
解物を、Ｓｉｌｅｎｔ Ｍｏｎｉｔｏｒ ＢｉｏｄｙｎｅＢプレート（Ｐａｌｌ
）に移し、そしてナイロンメンブレン上に真空濾過した。このメンブレンを洗浄
し、変性し、³²Ｐ標識したヒトＣＦＴＲ ｃＤＮＡ制限フラグメントとハイブリ
ダイズした。このプローブは、ＡＡＶＣＦベクターから約１．５ｋｂのフラグメ
ント（予測した１．４４８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応する）を検出し
た。ベクター複製を、内因性ゲノムＣＦＴＲバンドと比較して定量化し、そして
複製単位として表現した。１複製単位（ＲＵ）は、約１．８ｋｂである内因性ゲ
ノムＣＦＴＲバンドのシグナル強度に相当するシグナル強度として規定される。
系列希釈された既知のベクター標準物の直線回帰を用いて、サンプル中のベクタ
ー濃度を外挿および計算した。

【０１４９】 （産生培地） 表１および表２は、細胞の増殖およびｒＡＡＶの産生に適切な培地成分の濃度
を（ｍｇ／ｌで）提供する（ブランクは、濃度０を示す）。一般には、血清レベ
ルが減少することが好ましい。例えば、これらの実験に使用した培地は、約１％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含んだ。

【０１５０】

【表１】

【０１５１】

【表２】

【０１５２】 （実施例２） （プロデューサー細胞溶解物におけるｒＡＡＶベクター粒子産生に対するｐＨ
の効果） ＪＬ１４細胞を、３リットルのバイオリアクター中に約３×１０⁵細胞／ｍｌ
で接種し、表２中に示される１．５リットルのｒＡＡＶ培地中で増殖させた。Ｊ
Ｌ１４細胞でバイオリアクターにおける培養培地を接種した２日後、このバイオ
リアクターに、新鮮な培地を注ぎ、１日あたり０．４容量で開始し、次いで、そ
の後２４時間毎にこの量を２倍にした。５日後、または細胞密度が６×１０⁶細
胞／ｍｌに達したときに、３×１０⁸細胞を取り出し、そして標準条件（すなわ
ち、ｐＨを変化させる）下で増殖させた。バイオリアクター中に維持した細胞を
、７５０ｍｌの培養培地の容量に濃縮し、そして３容量の培地交換を、ｐＨ７．
２の産生培地（すなわち、表２の培地）で行って、培地を交換し、その結果、細
胞培養物の最終容量は７５０ｍｌであった。アデノウイルス５型は、アメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したストッ
クから増殖させた。アデノウイルスを７５０ｍｌの産生培地に希釈し、そしてこ
の細胞に添加し（感染多重度（ＭＯＩ）＝１０）、１．５リットルの最終容量に
した。アデノウイルスでの感染を、３７℃にて１時間進行させた。

【０１５３】 感染を進行させた後、１×１０⁵細胞を、５つの別々のスピナーフラスコの各
々に移した。５つのフラスコ中の容量を、それぞれ、ｐＨ６．６、７．０、７．
２、７．４、および７．８の産生培地で１．５リットルにした。スピナーフラス
コの内容物を別々のバイオリアクターに移し、次いで、これを個別に、ｐＨ６．
６、７．０、７．２、７．４、および７．８で維持した。他の培養培地パラメー
ターは以下の通りであった：温度＝３７℃；溶存酸素濃度（ＤＯ₂）＝３０％；
および攪拌＝１５０ｒｐｍ。

【０１５４】 温度、ｐＨ、ＤＯ₂、細胞密度、浸透圧モル濃度、およびグルコース／ラクテ
ートを、毎日モニターした。細胞サンプルを感染後２日目および３日目に採取し
、そして溶解させた。細胞溶解物を、ＤＮＡｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）スロットブ
ロットアッセイおよびマイクロタイター感染度アッセイによってアッセイした。

【０１５５】 図１Ａおよび１Ｂは、様々なｐＨレベルでの細胞あたりのＤＲＰを表した、２
つの別々の実験の結果を示す棒グラフである。黒棒は、感染後２日目のＤＲＰ／
細胞を示す；斜線棒は、３日目のＤＲＰ／細胞を示す。ｐＨ７．２、ｐＨ７，４
およびｐＨ７．８にて維持した培養物中のＤＲＰ／細胞は、感染後２日目および
３日目から劇的に減少したが、この減少は、コントロール細胞培養物においては
見られなかった。総細胞密度は、これらの培養条件のもとでは認め得るほどに変
化しなかった。

【０１５６】 （実施例３） （細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出に対するｐＨの効果） 簡単には、ＡＡＶプロデューサー細胞をバイオリアクター中で増殖させた。次
いで細胞にＭＯＩ＝１０でＡｄ５を感染させ、そしてこれを１．５リットルのバ
イオリアクター中の懸濁液中の低血清培地（表２を参照のこと）に接種した。培
養物を多様な高いｐＨレベル（７．２から８．０）で維持した。次いで培養物を
、細胞数、生存度、グルコース消費、乳酸産生、ｐＨ、浸透圧モル濃度、および
ＡＡＶ産生について毎日モニターした。以下に示されるように、ｐＨが７．４ま
で上昇した場合、ＡＡＶ産生に増加が見られた；上清中に放出されたＡＡＶ粒子
の数のさらにより劇的な増加を伴った（これはｐＨが上昇するにつれ増加した）
：

【０１５７】

【表３】

【０１５８】 要するに、ｐＨが上昇するにつれて、本発明者らは、上清中に放出されたＡＡ
Ｖ粒子の数の急激な増加、および上清：細胞結合粒子のパーセンテージのシフト
（ｐＨ７．２でほとんど全てが細胞結合から、ｐＨ８．０でほとんどが上清であ
る（９２％）まで）を観察した。

【０１５９】 ｒＡＡＶベクター産生に対するｐＨの効果をさらに評価するために、ＪＬ１４
細胞を、注入バイオリアクター中で上記のように（表１に記載される培地を使用
する）１０⁷細胞／ｍｌの密度まで増殖させた。この細胞培養物を、７５０ｍｌ
の容量まで濃縮し、そしてその培地を、３回ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕ
ｍｅ）を行うことによって交換した。総容量を、１０のＭＯＩでアデノウイルス
を含む産生培地で１．５リットルにした。感染を、１時間進行させた。

【０１６０】 感染を進行させた後、１×１０⁵細胞を、５つの別々のスピナーフラスコの各
々に移した。５つのフラスコ中の容量を、ｐＨ７．２、７．４、７．６、７．８
および８．０の産生培地で１．５リットルにし、そしてコントロールフラスコに
した（ｐＨは開始レベルで維持しない）。スピナーフラスコの内容物を別々のバ
イオリアクターに移し、次いで、これを個別に、ｐＨ６．６、７．０、７．２、
７．４、および７．８で維持した。バイオリアクターを、定常レベル±０．０５
ｐＨ単位のｐＨに維持した。他の培養培地パラメーターは以下の通りであった：
温度＝３７℃；溶存酸素濃度（ＤＯ₂）＝３０％；および攪拌＝１５０ｒｐｍ。
細胞および培養上清（培養培地）を、２日目および３日目に採取した。

【０１６１】 結果を、図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａおよび２Ｂは棒グラフであり、そし
て様々なｐＨレベルで維持したバイオリアクターにおけるｒＡＡＶ産生の結果を
示す（総ＤＲＰとして表す）。各棒の上の百分率は、細胞溶解物中の総ＤＲＰの
パーセンテージである。各棒の黒い部分は、細胞溶解物中のＤＲＰを示し、一方
、各棒の斜線部分は、細胞培養培地中のＤＲＰを示す。感染の２日後に、総ＤＲ
Ｐの２９％が、ｐＨ８．０で維持した培養の培養培地中にあり、一方、感染の３
日後に、培養培地における総ＤＲＰの百分率は、９２％に上昇した。感染の３日
後に、培養培地中の総ＤＲＰのパーセントは、ｐＨ７．４で６７％、ｐＨ７．６
で８２％、ｐＨ７．８で７３％およびｐＨ８．０で９２％であった。ｐＨ７．２
で維持した培養は、この実験における細胞培養培地中ではＤＲＰを全く生じなか
った。

【０１６２】 ｐＨ７．２、７．４、７．６、７．８および８．０で維持したバイオリアクタ
ーからの感染の２日後および３日後の細胞溶解物および培養培地を、感染度アッ
セイを用いて複製単位（ＲＵ）についてアッセイした。このデータを、図３Ａお
よび３Ｂに示す。総細胞密度は、これらの培養条件下では明らかには変化しなか
った。

【０１６３】 図３Ａおよび３Ｂは、示したｐＨレベルで培養を維持した場合の、培養培地（
各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における感染の２日後（
３Ａ）および３日後（３Ｂ）にアッセイした総複製単位（ＲＵ）を示す棒グラフ
である。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＲＵのパーセンテ
ージを示す。これらのデータは、細胞培養培地中に放出されたｒＡＡＶ粒子が、
感染度アッセイにおいて機能的であることを実証する。

【０１６４】 図４は、示したｐＨレベルで維持したバイオリアクターからの、感染の３日後
の細胞溶解物（各棒の黒い部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）から採
取したｒＡＡＶ粒子の粒子：感染度（Ｐ／Ｉ）比を示す棒グラフである。これら
のデータは、細胞培養培地中に放出されたｒＡＡＶベクターの大部分が感染性で
あることを示す。

【０１６５】 （実施例４） （細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出の対する浸透圧モル濃度の効
果） 培養培地における開始時の浸透圧モル濃度の、細胞培養培地へのｒＡＡＶの放
出に対する効果をアッセイするために、ＪＬ１４細胞を、本質的に実施例２に記
載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染
させた。個々のバイオリアクターにおける開始時の重量オスモル濃度を、それぞ
れ、１３０、２００、３００、４００、および５００ ｍＯｓｍにした。各リア
クターにおいて、そのｐＨを、ｐＨ８．０（±０．０５）；温度＝３７℃；ＤＯ ₂ ＝３０％；およびｓ攪拌＝１５０ｒｐｍに維持した。感染の２、３および４日
後に、細胞溶解物および細胞培養培地を収集し、そしてｒＡＡＶベクター産生に
ついて分析した。

【０１６６】 結果を図５〜７に示す。

【０１６７】 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、示した開始時重量オスモル濃度を細胞培養培地が
含むバイオリアクターにおける、感染の２日後（５Ａ）、３日後（５Ｂ）および
４日後（５Ｃ）に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒
い部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは
、細胞溶解物における総ＤＲＰのパーセンテージを示す。これらのデータは、細
胞培養培地が３００ ｍＯｓｍの開始時重量オスモル濃度を有する場合に、総Ｄ
ＲＰの４１％、５９％、および８０％が、それぞれ、２、３、および４日目に細
胞培養培地中に存在することを示す。３００ ｍＯｓｍの開始時の細胞培養培地
の重量オスモル濃度は、試験した他の開始時重量オスモル濃度と比較して、細胞
培養培地中の総ｒＡＡＶベクターの最大パーセンテージを与えた。総細胞密度は
、これらの培養条件下では明白には変化しなかった。

【０１６８】 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、示した開始時重量オスモル濃度を細胞培養培地が
含むバイオリアクターにおける、感染の２日後（６Ａ）、３日後（６Ｂ）および
４日後（６Ｃ）に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒
い部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、
細胞溶解物における総ＲＵのパーセンテージを示す。これらのデータは、培地に
放出されたｒＲＲＶベクターが感染性であることを示す。

【０１６９】 図７は、示した開始時重量オスモル濃度を有するバイオリアクターからの、３
および４日目の細胞培養培地中のｒＡＡＶ粒子のＰ／Ｉ比を示す棒グラフである
。

【０１７０】 （実施例５） （細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出に対する温度の効果） ＪＬ１４細胞を、本質的に実施例２に記載のように、バイオリアクターにおい
て増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。細胞を、３１℃、３４℃、３
７℃、３９℃、および４２℃にそれぞれ個別に維持したバイオリアクターに移し
た。これらの温度を、±０．５℃に維持した。各リアクター中のｐＨを、８．０
（±０．０５）；攪拌＝１５０ｒｐｍ；ＤＯ₂＝３０％に維持した。感染の２、
３および４日後に、細胞溶解物および細胞培養培地を、ｒＡＡＶ粒子について分
析した。

【０１７１】 結果を図８および９に示す。

【０１７２】 図８Ａ〜Ｃは、示した温度で細胞培養培地を維持したバイオリアクターにおけ
る、感染の２日後（８Ａ）、３日後（８Ｂ）および４日後（８Ｃ）に細胞培養培
地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における総ＤＲＰを
示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＤＲ
Ｐのパーセンテージを示す。このデータは、培養培地を３９℃で維持した場合に
、総ＤＲＰの６６％、６７％、および５７％が、それぞれ２、３、および４日で
細胞培養培地中に見出されたことを示す。このデータはさらに、培養培地を３９
℃で維持した場合に、３７℃または４２℃に比べて、より高いパーセンテージの
ＤＲＰが細胞培養培地中に見出されたことを示す。

【０１７３】 図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、示した温度で細胞培養培地を維持したバイオリア
クターにおける、感染の２日後（９Ａ）、３日後（９Ｂ）および４日後（９Ｃ）
に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）におけ
る総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ａにおける各棒の上のパーセンテージは、
細胞培養培地における総ＲＵのパーセンテージを示す。図９Ａにおける各棒の上
のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＲＵのパーセンテージを示す。この
データは、培養培地を３９℃で維持した場合に、総ＲＵの８０％、９７％、およ
び９８％が、それぞれ２、３、および４日目に細胞培養培地中に見出されたこと
を示す。総細胞密度は、これらの培養条件下で明白には変化しなかった。

【０１７４】 （実施例６） （細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出に対する培養培地補充物の効
果） ＪＬ１４細胞を、本質的に実施例２に記載のように、バイオリアクターにおい
て増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。細胞を、以下のような様々な
培地を含むバイオリアクターに移した：（１）ＤＭＥＭ；（２）ＤＭＥＭ＋４ｇ
／リットル グルコース；（３）ＤＭＥＭ＋４ｇ／リットル グルコース＋４ｍ
Ｍグルタミン；（４）ＤＭＥＭ＋４ｇ／リットル グルコース＋４ｍＭグルタミ
ン＋アミノ酸＋ビタミン（「完全」）；（５）２×ＤＭＥＭ。全ての開始時重量
オスモル濃度を、２８５〜３００ ｍＯｓｍに調整した。他のパラメーターを以
下の通りに した：温度を３９℃に維持した；ｐＨを ８．０に維持した；ＤＯ ₂ ＝３０％；および攪拌＝１５０ｒｐｍ 。感染の３日後に、細胞培養上清を、
ｒＡＡＶベクター粒子についてアッセイした。

【０１７５】 これらの結果を、図１０、１１、および１２に示す。

【０１７６】 図１０は、示した様々な培地中で増殖させる培養における、感染の３日後の培
養培地中の総ＤＲＰを示す棒グラフである。

【０１７７】 図１１は、示した様々な培地中で増殖させる培養における、感染の３日後の培
養培地中の総ＲＵを示す棒グラフである。

【０１７８】 図１２は、示した様々な培地中で培養物を増殖させた場合の、細胞培養培地中
のウイルス粒子のＰ／Ｉ比を示す棒グラフである。

【０１７９】 前述の本発明を例示および理解の明白さの目的のための例としていくらか詳細
に示したが、当業者が、特定の変化および改変を実施することは明らかである。
それゆえ、記載および例は、添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の
範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａおよび１Ｂは、種々のｐＨレベルでの、細胞あたりのＤＮａｓｅ耐性粒
子（ＤＲＰ）として表される、２つの個別の実験の結果を示す棒グラフである。
示されるｐＨレベルに細胞培養物を維持し、そして細胞溶解産物を、感染後２日
目（黒色棒）および感染後３日目（斜線棒）にアッセイした。

【図１Ｂ】 図１Ａおよび１Ｂは、種々のｐＨレベルでの、細胞あたりのＤＮａｓｅ耐性粒
子（ＤＲＰ）として表される、２つの個別の実験の結果を示す棒グラフである。
示されるｐＨレベルに細胞培養物を維持し、そして細胞溶解産物を、感染後２日
目（黒色棒）および感染後３日目（斜線棒）にアッセイした。

【図２Ａ】 図２Ａおよび２Ｂは棒グラフであり、そしてこれは、種々のｐＨレベルで維持
されたバイオリアクターにおける、感染後２日目（２Ａ）および感染後３日目（
２Ｂ）の、総ＤＲＰとして表されるｒＡＡＶ産生の結果を示す。各棒の上部の百
分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率である。各棒の黒色部分は細胞溶解
産物中のＤＲＰを表し、一方、各棒の斜線部分は細胞培養培地中のＤＲＰを表す
。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率を示す。

【図２Ｂ】 図２Ａおよび２Ｂは棒グラフであり、そしてこれは、種々のｐＨレベルで維持
されたバイオリアクターにおける、感染後２日目（２Ａ）および感染後３日目（
２Ｂ）の、総ＤＲＰとして表されるｒＡＡＶ産生の結果を示す。各棒の上部の百
分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率である。各棒の黒色部分は細胞溶解
産物中のＤＲＰを表し、一方、各棒の斜線部分は細胞培養培地中のＤＲＰを表す
。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率を示す。

【図３Ａ】 図３Ａおよび３Ｂは、示されるｐＨレベルに培養物を維持した場合の、細胞培
養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解産物（各棒の黒色部分）における、感
染後２日目（３Ａ）および感染後３日目（３Ｂ）の総複製単位（ＲＵ）を示す棒
グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を
示す。

【図３Ｂ】 図３Ａおよび３Ｂは、示されるｐＨレベルに培養物を維持した場合の、細胞培
養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解産物（各棒の黒色部分）における、感
染後２日目（３Ａ）および感染後３日目（３Ｂ）の総複製単位（ＲＵ）を示す棒
グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を
示す。

【図４】 図４は、示されるｐＨに維持されたバイオリアクター由来の、感染後３日目に
細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）から収
集したｒＡＡＶ粒子の粒子：感染性（Ｐ／Ｉ）比率を示す棒グラフである。

【図５Ａ】 図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地
が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（５Ａ）、感染後３日目（５Ｂ
）、および感染後４日目（５Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞
培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上
部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。

【図５Ｂ】 図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地
が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（５Ａ）、感染後３日目（５Ｂ
）、および感染後４日目（５Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞
培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上
部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。

【図５Ｃ】 図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地
が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（５Ａ）、感染後３日目（５Ｂ
）、および感染後４日目（５Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞
培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上
部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。

【図６Ａ】 図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地
が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（６Ａ）、感染後３日目（６Ｂ
）、および感染後４日目（６Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞
培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上部
の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。

【図６Ｂ】 図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地
が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（６Ａ）、感染後３日目（６Ｂ
）、および感染後４日目（６Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞
培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上部
の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。

【図６Ｃ】 図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地
が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（６Ａ）、感染後３日目（６Ｂ
）、および感染後４日目（６Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞
培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上部
の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。

【図７】 図７は、示される開始重量オスモル濃度を有するバイオリアクター培養物由来
の、３日目および４日目の細胞培養培地におけるｒＡＡＶ粒子のＰ／Ｉ比率を示
す棒グラフである。

【図８Ａ】 図８Ａ〜Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターに
おいて、感染後２日目（８Ａ）、感染後３日目（８Ｂ）、および感染後４日目（
８Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分
）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産
物における総ＤＲＰの百分率を示す。

【図８Ｂ】 図８Ａ〜Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターに
おいて、感染後２日目（８Ａ）、感染後３日目（８Ｂ）、および感染後４日目（
８Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分
）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産
物における総ＤＲＰの百分率を示す。

【図８Ｃ】 図８Ａ〜Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターに
おいて、感染後２日目（８Ａ）、感染後３日目（８Ｂ）、および感染後４日目（
８Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分
）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産
物における総ＤＲＰの百分率を示す。

【図９Ａ】 図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイ
オリアクターにおいて、感染後２日目（９Ａ）、感染後３日目（９Ｂ）、および
感染後４日目（９Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（
各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ａの各棒の上部の
百分率は、細胞培養培地における総ＲＵの百分率を示す。図９Ａの各棒の上部の
百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。

【図９Ｂ】 図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイ
オリアクターにおいて、感染後２日目（９Ａ）、感染後３日目（９Ｂ）、および
感染後４日目（９Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（
各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ｂの各棒の上部の
百分率は、細胞培養培地における総ＲＵの百分率を示す。図９Ｂの各棒の上部の
百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。

【図９Ｃ】 図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイ
オリアクターにおいて、感染後２日目（９Ａ）、感染後３日目（９Ｂ）、および
感染後４日目（９Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（
各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ｃの各棒の上部の
百分率は、細胞培養培地における総ＲＵの百分率を示す。図９Ｃの各棒の上部の
百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。

【図１０】 図１０は、示される種々の培地において増殖した培養において、感染後３日目
の培養培地における総ＤＲＰを示す棒グラフである。

【図１１】 図１１は、示される種々の培地において増殖した培養において、感染後３日目
の培養培地における総ＲＵを示す棒グラフである。

【図１２】 図１２は、示される種々の培地において培養物を増殖した場合の、細胞培養培
地におけるウイルス粒子のＰ／Ｉ比率を示す棒グラフである。

【図１３Ａ】 図１３は、実施例６に記載の培地補給物についてのアミノ酸およびビタミン組
成を提供する。

【図１３Ｂ】 図１３は、実施例６に記載の培地補給物についてのアミノ酸およびビタミン組
成を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ファン， ビクター ピー． アメリカ合衆国 ワシントン 98053， レドモンド， エヌ．イー． 17ティーエ イチ 23261 (72)発明者 ウィルキンズ， ペリー シー． アメリカ合衆国 ワシントン 98027， プレストン， プレストン フォール シ ティ ロード エス．イー． 6917 (72)発明者 タケヤ， ライアン ケイ． アメリカ合衆国 ワシントン 98036， リンウッド， 53アールディー アベニュ ー ウエスト 20902 (72)発明者 レイノルズ， トーマス シー． アメリカ合衆国 ワシントン 98040， マーサー アイランド， 93アールディー アベニュー エス．イー．4204 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA02 DA02 EA02 HA17 4B065 AA90X AA95X AB01 AC15 AC16 BC02 BC03 BC11 CA44

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルス粒子の集団を生成するための方法であって、以下の
   工程： ａ）ウイルス粒子の放出を促進する条件を含む条件下で、細胞培養培地中でプ
   ロデューサー細胞をインキュベートし、それによりウイルス粒子が該プロデュー
   サー細胞から該培養培地へ放出される、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記ウイルスは組換えアデ
   ノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であり、そして前記プロデューサー細胞が、以下： （ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで該ＡＡＶパ
   ッケージング遺伝子の各々が、ＡＡＶ複製タンパク質またはＡＡＶキャプシド形
   成タンパク質をコードする、遺伝子； （ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種
   非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター；および （ｉｉｉ）ＡＡＶについてのヘルパーウイルス機能； を含む細胞である、方法。
3. 【請求項３】 前記ウイルス粒子の放出を促進する条件がｐＨである、請求
   項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ｐＨが、約７．４〜約８．０である、請求項３に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 前記ｐＨが約８．０である、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ウイルスの放出を促進する条件が、重量オスモル濃度で
   ある、請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記重量オスモル濃度が、約３００ｍＯｓｍである、請求項
   ６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記細胞培養の最初の重量オスモル濃度が、約３００ｍＯｓ
   ｍである、請求項５に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ウイルスの放出を促進する条件が、温度である、請求項
   ２に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記温度が、約３７℃〜約４０℃である、請求項９に記載
    の方法。
11. 【請求項１１】 前記温度が約３９℃である、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記温度が約３９℃である、請求項５に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記温度が約３９℃である、請求項８に記載の方法。
14. 【請求項１４】 プロデューサー細胞が、ヘルパーウイルス機能の導入後約
    ４８〜約９６時間培養される、請求項５に記載の方法。
15. 【請求項１５】 プロデューサー細胞が、ヘルパーウイルス機能の導入後約
    ４８〜約９６時間培養される、請求項１２に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ヘルパーウイルス機能が、ヘルパーウイルスによって
    提供される、請求項２に記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法で
    あって、前記ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、方法。
18. 【請求項１８】 請求項２に記載の方法であって、（ｂ）前記ウイルス粒子
    を前記細胞培養培地から採取し、それによりｒＡＡＶ粒子の集団を得る工程、を
    さらに包含する、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の方法であって、以下の工程： ｃ）少なくとも１つの正に荷電したアニオン交換樹脂で前記ｒＡＡＶプロデュ
    ーサー細胞培養培地をクロマトグラフィーする工程；および ｄ）工程ｃ）のｒＡＡＶ粒子を含むクロマトグラフィー画分を、カチオン交換
    クロマトグラフィーまたは接線流濾過によって精製して、ｒＡＡＶベクター粒子
    の精製集団を生成する工程、 をさらに包含する、方法。
20. 【請求項２０】 請求項２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であ
    って、前記ｒＡＡＶベクターが、２つのＡＶＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接
    する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む、方法。
21. 【請求項２１】 請求項２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であ
    って、前記ＡＡＶプロデューサー細胞が、該ＡＡＶプロデューサー細胞のゲノム
    に安定に組み込まれる少なくとも１つのＡＡＶパッケージング遺伝子を含む、方
    法。
22. 【請求項２２】 請求項２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であ
    って、前記ＡＡＶプロデューサー細胞が、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ
    ｃａｐ遺伝子を含む、方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法で
    あって、前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、前記ＡＡＶ
    プロデューサー細胞のゲノム中に安定に組み込まれている、方法。
24. 【請求項２４】 請求項２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であ
    って、前記プロデューサー細胞が、付着依存性哺乳動物細胞株である、方法。
25. 【請求項２５】 請求項２に記載のｒＡＡＶ粒子の集団を生成する方法であ
    って、前記プロデューサー細胞が、懸濁適合化哺乳動物細胞株である、方法。