ES2317709T3 - Metodos para generar preparaciones libres de auxiliares de titulo alto de vectores de aav recombinantes liberados. - Google Patents
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Abstract
Un método para generar una población de partículas de virus, que comprende las etapas de: (a) incubar una célula productora en un medio de cultivo celular en condiciones que comprenden una condición que promueve la liberación de partículas de virus, por lo que las partículas de virus se liberan de la célula productora al medio de cultivo sin lisar las células, en el que la condición que promueve la liberación de partículas de virus: (i) comprende una o más condiciones seleccionadas de osmolalidad, temperatura, concentración de un ión dado, densidad celular, concentración de oxígeno disuelto, concentración de glucosa, concentración de aminoácido y una condición que promueve la sincronización del ciclo celular y (ii) comprende pH y (b) recolectar las partículas virales del medio de cultivo celular sin lisar las células, obteniendo de este modo una población de partículas virales; en el que el virus es un virus adeno-asociado (MV).
Description
Métodos para generar preparaciones libres de
auxiliares de título alto de vectores de AAV recombinantes
liberados.
La presente invención se refiere generalmente al
campo de vectores de virus adeno-asociados (AAV)
recombinantes y preparaciones de los mismos que se pueden usar para
transferencia génica. Más específicamente, se refiere a métodos
para generar preparaciones con títulos altos de vectores de AAV
recombinantes que están sustancialmente libres de virus auxiliar
(por ejemplo, adenovirus) así como a proteínas celulares por
liberación de partículas virales de células productoras sin lisis
celular.
Los virus adeno-asociados (AAV)
tienen características únicas que los hacen atractivos como
vectores para terapia génica. Los virus
adeno-asociados infectan un amplio espectro de
tipos celulares. Sin embargo, son no-transformantes
y no están implicados en la etiología de ninguna enfermedad humana.
La introducción de ADN en células hospedadoras del destinatario
generalmente conduce a persistencia a largo plazo y expresión del
ADN sin alterar el metabolismo normal de la célula.
Existen al menos tres características deseables
de una preparación de vector de AAV recombinante para el uso en
transferencia génica, especialmente en terapia génica humana. En
primer lugar, se prefiere que el vector se genere con títulos
suficientemente altos para transducir una proporción eficaz de
células en el tejido diana. La terapia génica in vivo
requiere típicamente un elevado número de partículas de vector. Por
ejemplo, algunos tratamientos pueden requerir más de 10^{8}
partículas y el tratamiento de fibrosis quística por suministro
directo a las vías respiratorias puede requerir más de 10^{10}
partículas. En segundo lugar, se prefiere que las preparaciones de
vector estén esencialmente libres de AAV con capacidad de
replicación (es decir, AAV fenotípicamente de tipo silvestre que
puede replicarse en presencia de virus auxiliar o funciones de
virus auxiliar). En tercer lugar, se prefiere que la preparación de
vector rAAV en su totalidad esté esencialmente libre de otros virus
(tales como un virus auxiliar usado en la producción de AAV) así
como de virus auxiliar y proteínas celulares y otros componentes
tales como lípidos y carbohidratos, para minimizar o eliminar
cualquier riesgo de generar una respuesta inmune en el contexto de
terapia génica. Este último punto es especialmente significativo en
el contexto de AAV porque el AAV es un virus "dependiente de
auxiliar" que requiere co-infección con un virus
auxiliar (típicamente adenovirus) u otra provisión de funciones de
virus auxiliar para replicarse y empaquetarse eficazmente durante
el proceso de producción de AAV; y, además, se ha observado que el
adenovirus genera una respuesta inmune en el hospedador en el
contexto de aplicaciones de terapia génica (véase, por ejemplo,
Byrnes et al., Neuroscience 66: 1015, 1995; McCoy et
al., Human Gene Therapy 6: 1553, 1995; y Barr et al.,
Gene Therapy 2: 151, 1995). Los métodos de la presente invención
abordan estas y otras características deseables de preparaciones de
vector rAAV, como se describe e ilustra con detalle a
continuación.
Están disponibles en otros lugares revisiones
generales de virología y genética del AAV. El lector puede
remitirse entre otros a Carter, "Handbook of Parvoviruses",
Vol. I, págs. 169-228 (1989) y Berns,
"Virology", págs. 1743-1764, Raven Press,
(1990). El AAV es un virus sin capacidad de replicación, lo que
significa que depende de un virus auxiliar para completar su ciclo
de replicación y empaquetamiento en una célula hospedadora. Los
virus auxiliares capaces de apoyar la replicación de AAV se
ilustran por adenovirus, pero incluyen otros virus tales como
herpes virus y poxvirus. El genoma de AAV comprende generalmente
los genes de empaquetamiento rep y cap,
proporcionándose otras funciones necesarias en trans por el
virus auxiliar y la célula hospedadora.
A modo de ilustración, el genoma lineal del
serotipo AAV2 termina en cualquiera de los extremos con una
secuencia de repetición terminal invertida (ITR). Entre las ITR hay
tres promotores de transcripción p5, p19 y p40 que se usan para
expresar los genes rep y cap (Laughlin et al.,
1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5567-5571).
Las secuencias ITR se requieren en cis y son suficientes
para proporcionar un origen de replicación funcional, integración en
el genoma celular y escisión eficaz y recuperación de los
cromosomas de la célula hospedadora o plásmidos recombinantes. Los
productos génicos rep y cap proporcionan funciones
para la replicación y encapsidación del genoma viral,
respectivamente, y para los mismos es suficiente estar presentes en
trans.
Se han introducido genomas de AAV en plásmidos
bacterianos por procedimientos tales como prolongación GC (Samulski
et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:
2077-2081), adición de enlazadores sintéticos que
contienen sitios de escisión de endonucleasa de restricción
(Laughlin et al., 1983, Gene, 23: 65-73) o
por ligación directa de extremos romos (Senapathy & Carter,
1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666). La
transfección de tales plásmidos recombinantes de AAV en células de
mamífero con un virus auxiliar apropiado da como resultado la
recuperación y escisión del genoma de AAV libre de cualquier
secuencia plasmídica, replicación del genoma recuperado y
generación de partículas de AAV infecciosas descendientes.
Los vectores AAV recombinantes que comprenden un
polinucleótido heterólogo de interés terapéutico se pueden
construir sustituyendo partes de la secuencia codificante de AAV en
plásmidos bacterianos con el polinucleótido heterólogo. Los
principios generales de construcción de vector rAAV también se
reseñan en otros lugares. Véase, por ejemplo, Carter, 1992, Current
Opinions in Biotechnology, 3: 533-539; y Muzyczka,
1992, Curr. Topics in Microbiol. and Inmunol., 158:
97-129). Las ITR de AAV generalmente se conservan,
ya que el empaquetamiento del vector requiere que las mismas estén
presentes en cis. Sin embargo, se pueden omitir otros
elementos del genoma de AAV, en particular, uno o más de los genes
de empaquetamiento. El plásmido vector se puede empaquetar en una
partícula de AAV suministrando los genes de empaquetamiento
omitidos en trans por una fuente alternativa. Varias
publicaciones describen diversas estrategias para producir vectores
rAAV. Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072 (1984);
Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466
(1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251 (1985);
McLaughlin et al., J. Virol., 62; 1963 (1988); Lebkowski
et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7: 349 (1988). Samulski et
al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989); Flotte
et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349 (1992);
Patente de Estados Unidos Nº 5.173.414; el documento WO 95/13365
(Targeted Genetics Corporation and Johns Hopkins University) y la
Patente de Estados Unidos Nº 5.658.776 correspondiente (por Flotte
et al.); el documento WO 95/13392 (Trempe et al.); el
documento WO 96/17947 (por Targeted Genetics Corporation, J.
Allen).
Ya que los títulos altos de preparaciones de
vector rAAV son particularmente útiles, pero la producción de
títulos altos de rAAV, particularmente en procedimientos a gran
escala, puede conducir a la generación de cantidades significativas
de virus auxiliar contaminante (por ejemplo, adenovirus o
"Ad"), proteínas de virus auxiliar (por ejemplo, proteínas de
Ad) y/o proteínas celulares, se hizo especialmente importante
diseñar métodos graduables para la producción de rAAV que se puedan
usar para la generación de preparaciones de título alto que estén
sustancialmente libres de virus contaminante y/o proteínas virales
o celulares.
Se han descrito métodos para generar
preparaciones de título alto de vectores de AAV recombinante. La
Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/US98/18600 describe el
cultivo de una línea celular que puede producir vector rAAV después
de la infección con un virus auxiliar; infectar las células con un
virus auxiliar, tal como adenovirus; y lisar las células. Los
métodos y sistemas de producción de AAV y otros virus también se
describen también, por ejemplo, en el documento WO 97/09441
(PCT/US96/14423); el documento WO 97/08298 (PCT/US96/13872); el
documento WO 97/21825 (PCT/US96/20777); el documento WO 97/06243
(PCT/FR96/01064); el documento WO 99/11764; Perrin et al.
(1995) Vaccine 13: 1244-1250; Paul et al.
(1993) Human Gene Therapy 4: 609-615; Clark et
al. (1996) Gene Therapy 3: 1124-1132.
Los métodos de la técnica anterior usados para
producir partículas de AAV recombinante usando células de
empaquetamiento requerían una etapa de lisis celular debido a la
creencia generalizada de que no se libera AAV de células
productoras en ninguna cantidad apreciable sin lisar las células.
Véase, por ejemplo, Chirico y Trempe (1998), J. Viral. Methods 76:
31-41 o el documento WO 95/06743. Sin embargo, el
lisado celular contiene diversos componentes celulares que se
tienen que separar del vector rAAV antes de que sea adecuado para
uso in vivo.
La presente descripción proporciona métodos para
conseguir la producción de título alto de vectores rAAV liberados
de una célula productora sin lisar la(s) célula(s) y
demuestra que tales técnicas se pueden emplear para producción a
gran escala de preparaciones de vector AVV recombinante.
Esta invención proporciona métodos y materiales
para generar preparaciones de título alto de virus
adeno-asociado (AAV) que están sustancialmente
libres de virus auxiliar, proteínas de virus auxiliar y proteínas
celulares y otros componentes. Los métodos suponen la liberación de
partículas de rAAV de células productoras sin lisar activamente las
células como es típico en la técnica, lo que proporciona una
ventaja clara y significativa con respecto a métodos de producción
que se han descrito previamente. Los métodos también son aplicables
a virus que no son líticos y/o generalmente no se liberan (es
decir, virus sin gemación).
En particular, la presente invención proporciona
un método para generar una población de partículas de virus, que
comprende las etapas de:
(a) incubar una célula productora en un medio de
cultivo celular en condiciones que comprenden una condición que
promueve liberación de partículas de virus, por lo que se liberan
partículas de virus de la célula productora al medio de cultivo sin
lisar las células, donde la condición que promueve la liberación de
partículas de virus:
- (i)
- comprende una o más condiciones seleccionadas de osmolalidad, temperatura, concentración de un ión dado, densidad celular, concentración de oxígeno disuelto, concentración de glucosa, concentración de aminoácidos y una condición que promueve la sincronización del ciclo celular; y
- (ii)
- comprende pH y
(b) recolectar las partículas virales del medio
de cultivo celular sin lisar las células, obteniendo de este modo
una población de partículas virales;
donde el virus es virus
adeno-asociado (AAV).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona métodos para
generar una población de partículas de virus, tales como partículas
de virus adeno-asociado (rAAV) recombinante.
que comprende la etapa de a) incubar una célula
productora en un medio de cultivo celular en condiciones que
promueven la liberación de partículas de AAV de la célula, por lo
que se liberan partículas de rAAV de la célula productora al medio
de cultivo y donde la célula productora comprende (i) uno o más
genes de empaquetamiento de AAV, donde cada uno de dichos genes de
empaquetamiento de AAV codifica una proteína de replicación o
encapsidación de AAV; (ii) un vector de AAV recombinante (rAAV) que
comprende un polinucleótido heterólogo no-AAV
flanqueado por al menos una repetición terminal invertida (ITR) de
AAV; y (iii) un virus auxiliar de AAV o función de virus auxiliar
de AAV. Después, las partículas de rAAV liberadas se pueden recoger
o recolectar del medio de cultivo. Las condiciones que promueven la
liberación de partículas virales de rAAV se describen en este
documento e incluyen, pero sin limitación, pH, osmolalidad, oxígeno
disuelto, medio enriquecido y temperatura.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen
además diversas etapas de purificación y/o inactivación. En algunas
de estas realizaciones, el método comprende además las etapas de:
someter a cromatografía el sobrenadante de células productoras de
AAV en una pluralidad de resinas de intercambio iónico que
comprenden al menos una resina de intercambio aniónico cargada
positivamente y al menos una resina de intercambio catiónico cargada
negativamente para generar una población purificada de partículas
de vector rAAV o someter a cromatografía el sobrenadante de células
productoras de AAV en una resina de intercambio aniónico seguido
por filtración de flujo tangencial (TFF). También se puede usar
cromatografía de sulfato de heparina para purificar adicionalmente
el virus.
En los métodos de la invención se puede realizar
el cultivo celular de tal modo que las células estén en suspensión
o en condiciones que promuevan la adherencia de células a un
soporte sólido. En consecuencia, en algunas realizaciones, la
célula productora se cultiva en un recipiente seleccionado del
grupo que consiste en un matraz de cultivo tisular, un frasco
rotativo, un matraz rotativo, un reactor de tanque, un fermentador
y un biorreactor, un reactor de producción plano, un sistema de
fibra hueca, un reactor de lecho cargado y opcionalmente usando un
microsoporte.
En algunas realizaciones de la invención, las
preparaciones de vector AAV recombinante producidas por los métodos
dan como resultado una población purificada de partículas de vector
rAAV que está sustancialmente libre de AAV con capacidad de
replicación y de virus auxiliar y proteínas celulares, así como
sustancialmente libre de ADN celular.
La presente solicitud describe adicionalmente
una población de partículas de rAAV, producidas de acuerdo con
cualquiera de los métodos de producción de esta invención.
Preferiblemente, la población de partículas contiene no más de
aproximadamente una partícula infecciosa de adenovirus por mil
partículas infecciosas de rAAV, preferiblemente menos de una por
10^{6} rAAV, aún más preferiblemente menos de aproximadamente una
en 10^{9}, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente
una en 10^{10}.
Estas y otras realizaciones de la invención se
explican en la siguiente descripción.
Las Figuras 1A y 1B son gráficos de barras que
ilustran los resultados de dos experimentos separados, expresados
como partículas resistentes a ADNasa (DRP) por célula a los
diversos niveles de pH. Los cultivos celulares se mantuvieron a los
niveles de pH indicados y los lisados celulares se ensayaron el día
2 (barras rellenas) y día 3 (barras sombreadas)
post-infección.
Las Figuras 2A y 2B son gráficos de barras e
ilustran los resultados, expresados como DRP totales, de producción
de rAAV, el día 2 (2A) y día 3 (2B) post-infección,
en biorreactores mantenidos a diversos niveles de pH. Los
porcentajes sobre cada barra son porcentajes de DRP totales en el
lisado celular. La parte rellena de cada barra representa DPR en
lisados celulares, mientras que la parte sombreada de cada barra
representa las DRP en el medio de cultivo celular. Los porcentajes
sobre cada barra indican el porcentaje de DRP totales en el lisado
celular.
Las Figuras 3A y 3B son gráficos de barras que
representan el total de unidades de replicación (RU), el día 2 (3A)
y día 3 (3B) post-infección, en el medio de cultivo
(parte sombreada de cada barra) y lisados celulares (parte rellena
de cada barra) cuando los cultivos se mantuvieron a los niveles
indicados de pH. Los porcentajes sobre cada barra indican el
porcentaje de RU totales en el lisado celular.
La Figura 4 es un gráfico de barras que ilustra
la proporción partícula: infectividad (P/I) de partículas de rAAV
recolectadas de lisados celulares (parte rellena de cada barra) y
medio de cultivo celular (parte sombreada de cada barra) el día 3
post-infección de biorreactores mantenidos a los
niveles indicados de pH.
Las Figuras 5A, 5B y 5C son gráficos de barras
que ilustran las DRP totales en lisados celulares (parte rellena de
cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada
barra) el día 2 (5A), día 3 (5B) y día 4 (5C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular contenía la osmolalidad de partida indicada. Los
porcentajes sobre cada barra indican el porcentaje de DRP totales
en el lisado celular.
Las Figuras 6A, 6B y 6C son gráficos de barras
que ilustran las RU totales en lisados celulares (parte rellena de
cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada
barra) el día 2 (6A), día 3 (6B) y día 4 (6C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular contenía la osmolalidad de partida indicada. Los
porcentajes sobre cada barra indican el porcentaje de RU totales en
los lisados celulares.
La Figura 7 es un gráfico de barras que ilustra
la proporción P/I de partículas de rAAV en el medio de cultivo
celular los días 3 y 4 de cultivos de biorreactor con las
osmolalidades de partida indicadas.
Las Figuras 8A-C son gráficos de
barras que ilustran las DRP totales en lisados celulares (parte
rellena de cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada
de cada barra) el día 2 (8A), día 3 (8B) y día 4 (8C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular se mantuvo a la temperatura indicada. Los
porcentajes sobre cada barra indican el porcentaje de DRP totales
en el lisado celular.
Las Figuras 9A, 9B y 9C son gráficos de barras
que ilustran las RU totales en lisados celulares (parte rellena de
cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada
barra) el día 2 (9A), día 3 (9B) y día 4 (9C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular se mantuvo a la temperatura indicada. Los
porcentajes sobre cada barra en la Figura 9A indican el porcentaje
de RU totales en el medio de cultivo celular. Los porcentajes sobre
cada barra en la Figura 9A indican el porcentaje de RU totales en
el lisado celular.
La Figura 10 es un gráfico de barras que ilustra
las DRP totales en el medio de cultivo tres días
post-infección en cultivos desarrollados en los
diversos medios indicados.
La Figura 11 es un gráfico de barras que ilustra
las RU en el medio de cultivo tres días
post-infección en cultivos desarrollados en los
diversos medios indicados.
La Figura 12 es un gráfico de barras que ilustra
la proporción P/I de partículas virales en los medios de cultivo
celular cuando los cultivos se desarrollaron en los diversos medios
indicados.
La Figura 13 proporciona composiciones de
aminoácidos y vitaminas para los suplementos de medios descritos en
el Ejemplo 6.
Se han descubierto métodos para generar
preparaciones con título alto de virus
adeno-asociado (AAV) que están sustancialmente
libres de virus auxiliar, proteínas de virus auxiliar y proteínas
celulares y otros componentes. Los métodos generalmente suponen
cultivar (que generalmente implica mantener) células productoras en
condiciones que promuevan la liberación de partículas de rAAV de
las células productoras.
Está bien establecido en el campo de AAV que no
se libera AAV de la célula a menos que la célula se lise, sino que
permanece en el núcleo de la célula. En consecuencia, la creencia
generalizada y universal es que, para producir partículas de rAAV,
las células se tienen que lisar. En comparación con las enseñanzas
del campo, se ha descubierto que se pueden liberar partículas de
rAAV de las células sin lisar las células y adicionalmente que se
puede aumentar la liberación de partículas de rAAV manteniendo las
células productoras en diversas condiciones ambientales
controladas. Usando estas condiciones se pueden producir partículas
de rAAV con mayores títulos que los obtenidos previamente. Las
células cultivadas en las condiciones descritas en este documento
producen más virus por célula y liberan más virus al medio de
cultivo e, incluso más significativamente, pueden liberar una
población de AAV con mayor infectividad que el AAV que se retiene
dentro de la célula. En otras palabras, la proporción de partícula
resistente a ADNasa a infectividad puede ser menor en la población
de AAV liberada al medio de cultivo en comparación con esta
proporción de AAV retenido dentro de la célula (véase, por ejemplo,
la Figura 4). Adicionalmente, ya que la lisis no es una etapa
obligatoria en los métodos de la presente invención, se pueden
recoger las partículas de rAAV del sobrenadante celular,
simplificando por tanto las etapas de purificación opcional
posteriores. Alternativamente, también se podría realizar la
lisis.
En algunas realizaciones, la invención
proporciona métodos de liberación, o liberación preferente, de
partículas virales infecciosas. Esta liberación preferente de
partículas infecciosas es particularmente significativa en el
contexto de producción viral, en el que es altamente deseable
producir una población que contenga un gran número de partículas
infecciosas en comparación con partículas no infecciosas.
Se entiende que los métodos y principios
descritos en este documento son aplicables a varios virus
diferentes que normalmente se retienen (es decir, no se liberan),
particularmente adenovirus. En este documento se ilustra AAV.
A continuación se describen con detalle diversos
métodos para la generación y el procesamiento de partículas de AAV
en células de mamífero y se proporcionan ilustraciones del uso de
tales técnicas en los Ejemplos siguientes. Las partículas de rAAV
producidas mediante los métodos de esta invención son
particularmente útiles como vectores de transferencia génica. En la
técnica se conocen métodos para el uso de tales vectores y no
necesitan describirse en este documento.
A modo de introducción, es típico emplear una
célula hospedadora o "productora" para la replicación y el
empaquetamiento de vector rAAV. Una célula productora de este tipo
(habitualmente una célula hospedadora de mamífero) generalmente
comprende o está modificada para comprender varios tipos diferentes
de componentes para producción de rAAV. El primer componente es un
genoma de vector viral adeno-asociado recombinante
(rAAV) (o "pro-vector rAAV") que se puede
replicar y empaquetar en partículas de vector mediante la célula de
empaquetamiento hospedadora. El pro-vector rAAV
normalmente comprenderá un polinucleótido heterólogo (o
"transgen") con el que se desea alterar genéticamente otra
célula en el contexto de terapia génica (ya que el empaquetamiento
de un transgen de este tipo en partículas de vector rAAV se puede
usar eficazmente para suministrar el transgen a una diversidad de
células de mamífero). El transgen preferiblemente está flanqueado
por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV que
comprenden secuencias que se reconocen durante la escisión, la
replicación y el empaquetamiento del vector de AAV, así como
durante la integración del vector en el genoma de una célula
hospedadora. Un segundo componente es un virus auxiliar que puede
proporcionar funciones auxiliares para la replicación de AAV.
Aunque frecuentemente se emplea adenovirus, también se pueden usar
otros virus auxiliares como se conoce en la técnica.
Alternativamente, las funciones de virus auxiliar requeridas se
pueden aislar genéticamente de un virus auxiliar y se pueden usar
los genes codificantes para proporcionar funciones de virus
auxiliar en trans. Los elementos de vector AAV y el virus
auxiliar (o funciones de virus auxiliar) se pueden introducir en la
célula hospedadora simultáneamente o secuencialmente en cualquier
orden. Los componentes finales para la producción de AAV que se
tienen que proporcionar en la célula productora son "genes de
empaquetamiento de AAV", tales como genes rep y
cap de AAV que proporcionan proteínas de replicación y
encapsidación, respectivamente. Se pueden proporcionar varias
versiones diferentes de genes de empaquetamiento de AAV (incluyendo
casetes rep-cap de tipo silvestre así como
casetes rep y/o cap modificados en los que los genes
rep y/o cap se pueden dejar bajo el control de los
promotores nativos o unidos de forma funcional a promotores
heterólogos). Tales genes de empaquetamiento de AAV se pueden
introducir de forma transitoria o de forma estable en la célula de
empaquetamiento hospedadora, como se conoce en la técnica y se
describe con mayor detalle a continuación.
Siguiendo los métodos de la invención, se
liberan partículas de rAAV al medio de cultivo
("sobrenadante") de células intactas (es decir, no lisadas).
Después de cultivar las células hospedadoras en condiciones que
permiten la replicación, encapsidación y liberación de AAV, se
puede procesar el sobrenadante para generar preparaciones con
título alto de virus adeno-asociado (AAV) que están
sustancialmente libres de virus auxiliar, proteínas de virus
auxiliar, proteínas celulares y, significativamente, de ADN celular.
A continuación se proporcionan descripciones detalladas de técnicas
de procesamiento y protocolos ilustrativos que emplean tales
técnicas.
Un "vector" como se usa en este documento
se refiere a una macromolécula o asociación de macromoléculas que
comprende o se asocia a un polinucleótido y que se puede usar para
mediar el suministro del polinucleótido a una célula. Los vectores
ilustrativos incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores virales,
liposomas y otros vehículos de suministro génico.
"AAV" es una abreviatura para virus
adeno-asociado y se puede usar para referirse al
propio virus o a derivados del mismo. El término abarca todos los
subtipos y formas tanto de origen natural como recombinantes,
excepto cuando se requiera de otra manera. La abreviatura
"rAAV" se refiere a virus adeno-asociado
recombinante, también denominado vector AAV recombinante (o
"vector rAAV").
Un "vector rAAV" como se usa en este
documento se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia
polinucleotídica sin origen en AAV (es decir, un polinucleótido
heterólogo a AAV), típicamente una secuencia de interés para la
transformación genética de una célula. En construcciones de vector
preferidas de esta invención, el polinucleótido heterólogo está
flanqueado por al menos una, preferiblemente dos secuencias de
repetición terminal invertida de AAV (ITR). La expresión vector de
rAAV incluye tanto partículas de vector rAAV como plásmidos de
vector rAAV.
Una "partícula de vector rAAV" o
"partícula de rAAV" se refiere a una partícula viral compuesta
por al menos una proteína de cápside de AAV (preferiblemente por
todas las proteínas de cápside de un AAV de tipo silvestre) y un
vector rAAV encapsidado. Por tanto, la producción de partícula rAAV
incluye necesariamente la producción de vector rAAV, ya que un
vector de este tipo está contenido dentro de una partícula de
rAAV.
"Empaquetamiento" se refiere a una serie de
acontecimientos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje
y la encapsidación de una partícula de AAV.
Los genes "rep" y "cap"
de AAV se refiere a secuencias polinucleotídicas que codifican
proteínas de replicación y encapsidación de virus
adeno-asociado. Éstas se han encontrado en todos
los serotipos de AAV examinados y se describen más adelante y en la
técnica. A rep y cap de AAV se les denomina en este
documento "genes de empaquetamiento" de AAV.
Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a
un virus que permite que AAV (por ejemplo, AAV de tipo silvestre)
se replique y se empaquete por una célula de mamífero. Se conoce
una diversidad de tales virus auxiliares para AAV en la técnica,
incluyendo adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como vaccinia.
Los adenovirus incluyen varios subgrupos diferentes, aunque el
Adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más comúnmente usado. Se
conocen numerosos adenovirus de origen humano, mamífero no humano y
aviar y están disponibles en depósitos tales como ATCC. Los virus
de la familia de herpesvirus incluyen, por ejemplo, virus de herpes
simple (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), así
como citomegalovirus (CMV) y virus de pseudorrabia (PRV); que
también están disponibles en depósitos tales como ATCC.
"Función(es) de virus auxiliar" se
refiere a función(es) codificada(s) en el genoma de
un virus auxiliar que permiten la replicación y el empaquetamiento
de AAV (junto con otros requerimientos para la replicación y el
empaquetamiento descritos en este documento). Como se describe en
este documento, la "función de virus auxiliar" se puede
proporcionar de varias maneras, incluyendo proporcionando virus
auxiliar o proporcionando, por ejemplo, secuencias
polinucleotídicas que codifiquen la(s) función(es)
requerida(s) a una célula productora en trans.
El término "tsHV" se refiere a un virus
auxiliar sensible a temperatura, que puede proporcionar funciones
auxiliares para la replicación y el empaquetamiento de AAV pero es
sensible a temperatura con respecto a su propia replicación (es
decir, se puede replicar a una temperatura "permisiva" pero se
replica con menor eficacia, o preferiblemente no se replica en
absoluto, a una temperatura "no permisiva"). La capacidad del
tsHV de proporcionar ayuda para la replicación de AAV también puede
ser sensible a temperatura, pero el tsHV preferido para el uso con
esta invención apoya eficazmente la replicación de AAV a
temperaturas a las que se puede replicar AAV pero que son no
permisivas para la replicación del tsHV. A continuación se describen
ejemplos de tales tsHV.
Un virus o partícula viral "infeccioso/a"
es uno que comprende un componente polinucleótido que es capaz del
suministro a una célula para la que la especie viral es trófica. El
término no implica necesariamente ninguna capacidad de replicación
del virus. Se describen ensayos para contar partículas virales
infecciosas en otros lugares en esta descripción y en la técnica. La
infectividad viral se puede expresar como la proporción P:I o la
proporción de partículas virales totales a partículas virales
infecciosas.
Un virus "con capacidad de replicación"
(por ejemplo, un AAV con capacidad de replicación) se refiere a un
virus fenotípicamente de tipo silvestre que es infeccioso y también
es capaz de replicarse en una célula infectada (es decir, en
presencia de un virus auxiliar o funciones de virus auxiliar). En el
caso de AAV, la capacidad de replicación generalmente requiere la
presencia de genes de empaquetamiento de AAV funcionales. Los
vectores rAAV preferidos como los descritos en este documento no
tienen capacidad de replicación en células de mamífero
(especialmente en células humanas) debido a la carencia de uno o
más genes de empaquetamiento de AAV. Preferiblemente, tales
vectores de rAAV carecen de cualquier secuencia de genes de
empaquetamiento de AAV para minimizar la posibilidad que se generen
AAV con capacidad de replicación por recombinación entre genes de
empaquetamiento de AAV y un vector de rAAV entrante. Las
preparaciones de vector rAAV preferidas como las descritas en este
documento son las que contienen poco, si es que contienen, AAV con
capacidad de replicación (rcAAV) (preferiblemente menos de
aproximadamente 1 rcAAV por 10^{2} partículas de rAAV, más
preferiblemente menos de aproximadamente 1 rcAAV por 10^{4}
partículas de rAAV, aún más preferiblemente menos de
aproximadamente 1 rcAAV por 10^{8} partículas de rAAV, incluso más
preferiblemente menos de aproximadamente 1 rcAAV por 10^{12}
partículas de rAAV, más preferiblemente sin rcAAV).
"Liberación" de partículas de rAAV
significa que las partículas de rAAV entran en el medio de cultivo
celular de una célula productora intacta, es decir, la partícula de
rAAV se libera sin lisar la célula. Se entiende que, en un cultivo
de célula productora dado, algunas células se lisan, por ejemplo,
después de muerte celular. Sin embargo, esta invención proporciona
métodos que promueven la liberación de partícula de rAAV sin
realizar lisis celular deliberada, como se hace típicamente en la
técnica. Los términos "liberación" y "secreción" de una
célula productora se usan de manera intercambiable en este
documento.
La expresión "condición que promueve la
liberación de partículas de rAAV" de una célula productora, como
se usa en este documento, se refiere a una condición para cultivar
células productoras que conduce a la liberación aumentada, o
mejorada, de partícula de rAAV de la célula productora al medio de
cultivo. Las condiciones que promueven la liberación de rAAV de la
célula productora al medio de cultivo se describen en este
documento y son generalmente, pero no necesariamente, condiciones
que mejoran el metabolismo celular. "Promover la liberación"
de partículas de rAAV de una célula productora al medio de cultivo
significa que la liberación de rAAV de la célula productora aumenta
cuando se compara con la liberación de rAAV de una célula
productora no cultivada en las condiciones ambientales que mejoran
la liberación. El aumento puede ser cualquier aumento detectable,
tal como al menos aproximadamente el 1%, al menos aproximadamente
el 5%, al menos aproximadamente el 10%, más preferiblemente al
menos aproximadamente el 20%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 25%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 35%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 50%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 60%, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, más preferiblemente
al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 100% o dos veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 5
veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces, más
preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces. Como se conoce
bien en la técnica, cuando una población celular se cultiva en una
condición de partida de cultivo dada, los subproductos metabólicos
de las células cambiarán algunas de las condiciones del cultivo,
tales como pH y osmolalidad. En condiciones ambientales que
promueven la liberación de partículas de rAAV, se controlan uno o
más de estos parámetros según sea necesario, es decir, se controlan
a intervalos regulares y se ajustan para mantener el parámetro
dentro de un intervalo adecuado (es decir, un intervalo que
promueve la liberación). El ajuste y/o control de estas condiciones
se describirá con más detalle a continuación.
El término "polinucleótido" se refiere a
una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud,
incluyendo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de
los mismos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos
modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de
nucleótido y pueden estar interrumpidos por componentes no
nucleotídicos. Si están presentes, las modificaciones de la
estructura del nucleótido se pueden realizar antes o después del
ensamblaje del polímero. El término polinucleótido, como se usa en
este documento, se refiere de manera intercambiable a moléculas
bicatenarias o monocatenarias. A menos que se especifique o
requiera de otra manera, cualquier realización de la invención
descrita en este documento que es un polinucleótido incluye tanto la
forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias
complementarias que se conoce o predice que forman la forma
bicatenaria.
Un "gen" se refiere a un polinucleótido que
contiene al menos una fase de lectura abierta que es capaz de
codificar una proteína particular después de transcribirse y
traducirse.
"Recombinante", como se aplica a un
polinucleótido significa que el polinucleótido es el producto de
diversas combinaciones de etapas de donación, restricción o
ligación y otros procedimientos que dan como resultado una
construcción que es diferente de un polinucleótido encontrado en la
naturaleza. Un virus recombinante es una partícula viral que
comprende un polinucleótido recombinante. Los términos incluyen
respectivamente copias de la construcción polinucleotídica original
y la descendencia de la construcción de virus original.
Un "elemento de control" o "secuencia de
control" es una secuencia de nucleótidos implicada en una
interacción de moléculas que contribuye a la regulación funcional
de un polinucleótido, incluyendo replicación, duplicación,
transcripción, corte y empalme, traducción o degradación del
polinucleótido. La regulación puede afectar la frecuencia,
velocidad o especificidad del proceso y puede ser de naturaleza
potenciadora o inhibidora. Los elementos de control conocidos en la
técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras
transcripcionales, tales como promotores y potenciadores. Un
promotor es una región de ADN capaz en ciertas condiciones de unir
ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante
localizada habitualmente cadena abajo (en dirección 3') del
promotor.
"Unido funcionalmente" u "unido de forma
funcional" se refiere a una yuxtaposición de elementos
genéticos, en la que los elementos están en una relación que les
permite funcionar de la forma esperada. Por ejemplo, un promotor
está unido funcionalmente a una región codificante si el promotor
ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede
haber restos de intervinientes entre el promotor y la región
codificante mientras se mantenga esta relación funcional.
Un "vector de expresión" es un vector que
comprende una región que codifica un polipéptido de interés y se
usa para efectuar la expresión de la proteína en una célula diana
pretendida. Un vector de expresión también comprende elementos de
control unidos funcionalmente a la región codificante para
facilitar la expresión de la proteína en la diana. La combinación de
elementos de control y un gen o genes a los que están
funcionalmente unidos para la expresión se denomina en ocasiones un
"casete de expresión", de los que se conoce un gran número y
están disponibles en la técnica o se pueden construir fácilmente a
partir de componentes que están disponibles en la técnica.
"Heterólogo" significa obtenido de una
entidad genotípicamente distinta a la del resto de la entidad con
la cual se compara. Por ejemplo, un polinucleótido introducido por
técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector obtenido de
una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Un promotor
retirado de su secuencia codificante nativa y unido funcionalmente a
una secuencia codificante a la que no se encuentra unida de forma
natural es un promotor heterólogo.
"Alteración genética" se refiere a un
proceso en el que se introduce un elemento genético en una célula
por un proceso diferente a mitosis o meiosis. El elemento puede ser
heterólogo a la célula o puede ser una copia adicional o versión
mejorada de un elemento ya presente en la célula. La alteración
genética se puede efectuar, por ejemplo, introduciendo por
transfección en una célula un plásmido recombinante u otro
polinucleótido por cualquier proceso conocido en la técnica, tal
como electroporación, precipitación con fosfato de calcio o puesta
en contacto con un complejo polinucleótido-liposoma.
También se puede efectuar la alteración genética, por ejemplo, por
transducción o infección con un virus o vector viral ADN o ARN.
Preferiblemente se introduce el elemento genético en un cromosoma o
minicromosoma en la célula; pero en esta expresión se incluye
cualquier alteración que cambia el fenotipo y/o genotipo de la
célula y su descendencia.
Se dice que una célula está alterada,
transducida o transformada "de forma estable" con una
secuencia genética si la secuencia está disponible para realizar su
función durante el cultivo prolongado de la célula in vitro.
En ejemplos preferidos, una célula de este tipo está alterada "de
forma heredable" por que se introduce una alteración genética
que también se puede heredar por la descendencia de la célula
alterada.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se usan de manera intercambiable en este
documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier
longitud. Los términos también incluyen un polímero de aminoácido
que se ha modificado; por ejemplo, formación de enlace de puente
disulfuro, glicosilación, lipidación o conjugación con un componente
marcador. Cuando se describen en el contexto de terapia génica y
composiciones para la misma, los polipéptidos tales como
"CFTR", "p53", "EIA" y similares, se refieren al
respectivo polipéptido intacto o cualquier fragmento o derivado
modificado por ingeniería genética del mismo, que conserva la
función bioquímica deseada de la proteína intacta. De forma
similar, las referencias a los genes de CFTR, p53, EA1 y otros
genes de este tipo para el uso en terapia génica (típicamente
denominados "transgenes" para suministrarse a una célula
receptora) incluyen polinucleótidos que codifican el polipéptido
intacto o cualquier fragmento o derivado modificado por ingeniería
genética que posea la función bioquímica deseada.
Un plásmido, virus u otra sustancia
"aislada" se refiere a una preparación de sustancia
desprovista de al menos alguno de los demás componentes que también
pueden estar presentes cuando la sustancia o una sustancia similar
tienen un origen natural o su forma preparada inicialmente. Por
tanto, por ejemplo, se puede preparar una sustancia aislada usando
una técnica de purificación para enriquecer la misma a partir de
una mezcla de partida. El enriquecimiento se puede medir en una
base absoluta, tal como peso por volumen de solución, o se puede
medir en relación con una segunda sustancia potencialmente
interferente presente en la mezcla de partida. El aumento de los
enriquecimientos de las realizaciones de esta invención es cada vez
más preferido. Por tanto, por ejemplo, se prefiere un
enriquecimiento de 2 veces, se prefiere más un enriquecimiento de
10 veces, se prefiere más un enriquecimiento de 100 veces, se
prefiere aún más un enriquecimiento de 1000 veces.
Se dice que una preparación de AAV está
"sustancialmente libre" de virus auxiliar si la proporción de
partículas infecciosas de AAV a partículas infecciosas de virus
auxiliar es al menos aproximadamente 10^{2}:1; preferiblemente al
menos aproximadamente 10^{4}:1, más preferiblemente al menos
aproximadamente 10^{6}:1, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 10^{8}:1. Las preparaciones están también
preferiblemente libres de cantidades equivalentes de proteínas de
virus auxiliar (es decir, proteínas como estarían presentes como
resultado de un nivel de este tipo de virus auxiliar si las
impurezas de partícula de virus auxiliar que se han señalado
anteriormente estuvieran presentes en forma alterada). La
contaminación con proteína viral y/o celular generalmente se puede
observar como la presencia de bandas de tinción con Coomassie o
bandas teñidas con plata en geles SDS (por ejemplo, la aparición de
bandas diferentes a las correspondientes a las proteínas de cápside
de AAV VP1, VP2 y VP3).
"Eficacia" cuando se usa para describir la
producción, la replicación o el empaquetamiento viral se refiere a
propiedades útiles del método; en particular, a la velocidad de
crecimiento y el número de partículas de virus producidas por
célula. La producción de "alta eficacia" indica la producción
de al menos 100 partículas virales por célula; preferiblemente al
menos aproximadamente 10.000 y más preferiblemente al menos
aproximadamente 100.000 partículas por célula, a lo largo del
periodo de cultivo especificado. Aún más preferiblemente, la
producción de "alta eficacia" incluye estos niveles de
producción de partículas por célula así como el máximo número de
células que producen partículas, tal como al menos aproximadamente
el 10%, preferiblemente al menos aproximadamente el 20%,
preferiblemente al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al
menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos el 75%. El
Ejemplo 6 describe condiciones de cultivo (medio "completo")
que dieron como resultado 93.000-123.000 partículas
de rAAV por célula productora. En el contexto de la presente
invención, la eficacia también se puede considerar en términos de
porcentaje, o alcance, de liberación de partículas virales
comparada con partículas virales retenidas en la célula. La
eficacia también se puede considerar en términos de relación o
proporción relativa de partículas virales totales a partículas
virales infecciosas (tal como proporción "P/I"). Se conocen en
la técnica ensayos para determinar parámetros de eficacia de
producción, tales como unidades de replicación y ensayo de centro
infeccioso.
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de
biología molecular, virología, cultivo de células animales y
bioquímica que están dentro de la especialidad de la técnica. Tales
técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véase, por
ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual", Segunda
Edición (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989); "Animal Cell
Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Gene Transfer Vectors
for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds.,
1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel
et al., eds., 1987); "Current Protocols in Protein
Science" (John E. Coligan, et al. eds. Wiley and Sons,
1995); y "Protein Purification: Principles and Practices"
(Robert K. Scopes, Springer-Verlag, 1994).
La presente invención proporciona métodos para
generar una población de partículas de virus
adeno-asociado recombinante (rAAV), que comprenden
el paso de: a) incubar una población de células productoras en un
medio de cultivo celular en condiciones que promuevan la liberación
de partículas de rAAV de las células productoras al medio de
cultivo. Después, las partículas de rAAV liberadas se pueden
recolectar del medio de cultivo, obteniendo de este modo una
población de partículas virales.
Las condiciones que promueven (o mejoran) la
liberación de partículas de AAV (incluyendo rAAV) de una célula
productora al medio de cultivo incluyen, pero sin limitación, pH
del medio de cultivo; osmolalidad del medio de cultivo;
temperatura; concentración de un ión dado en el medio de cultivo;
densidad celular; concentración de oxígeno disuelto en el medio de
cultivo; concentración de glucosa en el medio de cultivo;
concentración de aminoácidos en el medio de cultivo y condiciones
que promueven la sincronización del ciclo celular. El pH del medio
de cultivo y cualquiera o más de los demás parámetros se mantiene
dentro de un intervalo adecuado (es decir, un intervalo que
promueve la liberación) durante el que las células liberan
partículas de AAV. Aunque un parámetro (es decir, condición) puede
ser suficiente para promover la liberación, se puede mantener una
combinación de dos o más parámetros simultáneamente, cada uno
dentro de su propio intervalo adecuado. Adicionalmente, un
intervalo adecuado para un parámetro puede variar dependiendo de si
se usa cualquier parámetro adicional. Si un parámetro se mantiene
dentro de un intervalo adecuado durante un periodo de tiempo, se
puede mantener un segundo parámetro dentro de un segundo intervalo
adecuado durante un periodo de tiempo igual o diferente que el
primer parámetro. Alternativamente, se pueden emplear condiciones
en serie. Por ejemplo, el control del pH puede realizarse durante
una fase del cultivo, seguido de control de temperatura.
Está dentro de la habilidad de un especialista
en la técnica variar estos parámetros y determinar si la liberación
de rAAV al medio de cultivo está mejorada, en relación a la
cantidad de rAAV liberado cuando las células productoras no se
mantienen en la(s) condición(es) ambiental(es)
dada(s). La liberación mejorada (o aumentada) de partículas
de rAAV de una célula productora se puede medir por cualquiera de
varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin
limitación, ensayos funcionales tales como un ensayo de centro de
replicación y un ensayo de centro infeccioso, ensayos inmunológicos
para productos génicos cap, tales como ELISA, HPLC y
cualquiera de varios métodos de detección de ADN (para detectar la
presencia de ADN viral) tal como transferencia por ranuras.
Generalmente se puede supervisar y controlar
cualquiera de estas condiciones en el alcance necesario y/o deseado
usando métodos convencionales y equipamientos conocidos en la
técnica. La condición se mide y se hacen los ajustes para mantener
o restituir la condición a su nivel adecuado (es decir, un nivel que
promueve la liberación de virus). Se ha observado que el fallo en
el mantenimiento de forma apropiada o adecuada de condiciones de
cultivo puede dar como resultado el cese de la liberación de
partículas de virus, mientras que otras condiciones, tales como
osmolalidad, no necesitan mantenerse a un nivel específico, sino
que el ajuste de la condición de cultivo inicial con respecto a
este parámetro es suficiente. Para condiciones que necesitan ser
supervisadas y ajustadas puede usarse, por ejemplo, un biorreactor
y/o sistema de perfusión de medio. Se prefieren estos sistemas,
porque los mismos permiten un control más cuidadoso de las
condiciones de cultivo. Sin embargo, es adecuado cualquier sistema
que permita un control y ajuste suficiente de las condiciones de
cultivo para permitir la liberación suficiente y/o deseada de
partículas de AAV. En este documento se proporcionan otros ejemplos
de mecanismos de control para proporcionar las
condiciones.
condiciones.
En una realización se cultivan células
productoras en condiciones de pH que promueven la liberación de
partículas virales. Generalmente, el pH del medio de cultivo se
mantiene dentro de un intervalo de aproximadamente 7,0 a
aproximadamente 8,5, preferiblemente de aproximadamente 7,4 a
aproximadamente 8,5, más preferiblemente de aproximadamente 7,5 a
aproximadamente 8,0. Aún más preferiblemente y especialmente si el
pH es la única condición usada para promover la liberación, el pH
es aproximadamente 8,0. Por ejemplo, un biorreactor permite el
control del pH a +/- 0,05 y está disponible un control todavía más
preciso (tal como +/- 0,01) y puede supervisar el pH de cada minuto
a 3 minutos o incluso menos. En algunas realizaciones, las células
se cultivan en condiciones de pH por lo que se encuentran al menos
aproximadamente el 67% de partículas de virus totales en el
sobrenadante del cultivo. En otras realizaciones, las células se
cultivan en condiciones de pH tales que al menos aproximadamente el
80%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el
90%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el
95% de partículas de virus se encuentran en el sobrenadante del
cultivo. Preferiblemente, la P/I, o proporción de partícula a
infectividad, en el sobrenadante del cultivo es menos de
aproximadamente 4.000, más preferiblemente menos de aproximadamente
3.000, más preferiblemente menos de aproximadamente 2.000, más
preferiblemente menos de aproximadamente 1.700, más preferiblemente
menos de aproximadamente 1.500. En algunas realizaciones, las
células se cultivan aproximadamente a pH 8 y se recolectan
aproximadamente 96 horas después de la infección con virus auxiliar
(o introducción o iniciación de función(es) de virus
auxiliar). En otras realizaciones, las células se cultivan
aproximadamente a pH 8 y se recolectan aproximadamente 72 horas
después de la infección con virus auxiliar (o introducción o
iniciación de función(es) de virus auxiliar). En otras
realizaciones, las células se cultivan aproximadamente a pH 8 y se
recolectan aproximadamente 48 horas después de la infección con
virus auxiliar (o introducción o iniciación de función(es) de
virus auxiliar).
En algunas realizaciones también se usa una
condición o condiciones diferentes al pH para promover la
liberación de virus. Por ejemplo, en otras realizaciones, se usa la
temperatura para promover la liberación de virus. Generalmente, la
temperatura del medio de cultivo se mantiene entre aproximadamente
30ºC y aproximadamente 45ºC, preferiblemente entre aproximadamente
32ºC y aproximadamente 42ºC, más preferiblemente aproximadamente
35ºC y aproximadamente 40ºC. Aún más preferiblemente, la
temperatura es de aproximadamente 37ºC a aproximadamente 39ºC. Por
ejemplo, un biorreactor puede controlar una temperatura a +/- 0,5ºC
y puede supervisar de forma tan precisa como aproximadamente cada
30 segundos.
En otras realizaciones se usa la osmolalidad
para promover la liberación de virus. Generalmente la osmolaridad
del medio de cultivo se inicia y/o mantiene entre aproximadamente
100 mOsM y aproximadamente 650 mOsM, preferiblemente
aproximadamente 150 mOsM y aproximadamente 500 mOsM,
preferiblemente aproximadamente 200 mOsM y aproximadamente 400 mOsM,
aún más preferiblemente aproximadamente 300 mOsM (especialmente si
la osmolaridad es la única condición usada para promover la
liberación). Osmolalidad, un término bien comprendido en la
técnica, se define como el número de moléculas de soluto por kg de
agua. Generalmente, compuestos tales como NaCl y otras sales,
manitol, glucosa, contribuyen a la osmolalidad. Se puede medir la
osmolalidad usando técnicas convencionales en la técnica, tales
como disminución del punto de congelación usando, por ejemplo,
un
osmómetro.
osmómetro.
Otras condiciones que se pueden usar en los
métodos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, uno
cualquiera o más de lo siguiente: factores de crecimiento, tales
como insulina, EGF y FGF; concentración de glucosa; concentración de
oxígeno disuelto; medio enriquecido (por ejemplo, glucosa adicional
y/u otros nutrientes tales como vitaminas y aminoácidos). Las
concentraciones de glucosa están generalmente entre aproximadamente
0,1 y aproximadamente 20 g/l; más preferiblemente entre
aproximadamente 0,5 y aproximadamente 15 g/l; más preferiblemente
entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 g/l. Las
concentraciones de oxígeno (típicamente medidas mediante, por
ejemplo, electrodo de oxígeno disuelto o analizador de gas en
sangre) están generalmente entre aproximadamente el 10% y
aproximadamente el 200% con respecto al aire, preferiblemente entre
aproximadamente el 20% y aproximadamente el 100% con respecto al
aire, preferiblemente aproximadamente el 30% y aproximadamente el
75% con respecto al aire. Generalmente, a mayor densidad celular,
más enriquecido el medio. Las condiciones del medio se pueden
mantener y/o complementar usando técnicas conocidas en la técnica,
tales como perfusión.
Las células productoras se cultivan durante un
periodo de tiempo adecuado para promover la liberación de virus al
medio. Generalmente, las células se pueden cultivar durante
aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente
48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 4 días,
aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7
días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, hasta
aproximadamente 10 días. Después de aproximadamente 10 días (o
antes, dependiendo de las condiciones de cultivo y la célula
productora particular usada), el nivel de producción generalmente
disminuye significativamente. Generalmente el tiempo de cultivo se
mide a partir del punto de producción viral. Por ejemplo, en el
caso de AAV, la producción viral generalmente comienza después de
suministrar función de virus auxiliar en una célula productora
apropiada como se describe en este documento. Generalmente, las
células se recolectan de aproximadamente 48 a aproximadamente 100,
preferiblemente de aproximadamente 48 a aproximadamente 96,
preferiblemente de aproximadamente 72 a aproximadamente 96,
preferiblemente de aproximadamente 68 a aproximadamente 72 horas
después de la infección con virus auxiliar (o después de que
comience la producción viral). En los Ejemplos, los resultados se
expresan habitualmente en número de días, por ejemplo, "día 2",
"día 3", etc. Estas indicaciones generalmente indican un día
adicional medido desde la infección con virus auxiliar. Es decir, un
resultado presentado para el "día 3" generalmente indica que
el resultado se obtuvo aproximadamente 2 días, o 48 horas, desde el
momento de introducción de función(es) de virus auxiliar.
Como se ha descrito anteriormente, se puede usar
el pH y una cualquiera o más, en cualquier combinación, de las
demás condiciones que promueven la liberación. Por ejemplo, se
pueden cultivar las células en una cualquiera o más de las
siguientes condiciones: (a) pH a aproximadamente 8,0; (b)
temperatura de aproximadamente 39ºC; (c) aproximadamente 300 mOsM;
(d) medio enriquecido, durante aproximadamente 2 a 3 días. "Medio
enriquecido" generalmente significa enriquecido en términos de
sales inorgánicas adicionales (tales como Mg^{2}, Ca^{+2}),
vitaminas y/o cofactores de tal modo que el suero se puede reducir
o incluso eliminar. En una realización preferida se cultivan
células en las siguientes condiciones: (a) aproximadamente 300
mOsM; (b) aproximadamente pH 8,00; (c) aproximadamente 39ºC y (d)
se recolectan aproximadamente 96 horas después de la infección con
virus auxiliar. En una realización preferida se cultivan las
células en las siguientes condiciones: (a) aproximadamente pH 8,00;
(b) aproximadamente 39ºC; y (c) se recolectan aproximadamente 96
horas después de la infección con virus auxiliar. En otra
realización se cultivan las células en las siguientes condiciones:
(a) aproximadamente 300 mOsM; (b) aproximadamente pH 8,00; (c)
aproximadamente 39ºC y (d) se recolectan aproximadamente 72 horas
después de la infección con virus auxiliar. En otra realización se
cultivan las células en las siguientes condiciones: (a)
aproximadamente pH 8,00; (b) aproximadamente 39ºC y (c) se
recolectan aproximadamente 72 horas después de la infección con
virus auxiliar. En otra realización se cultivan las células en las
siguientes condiciones: (a) aproximadamente 300 mOsM; (b)
aproximadamente pH 8,00; (c) aproximadamente 39ºC y (d) se
recolectan aproximadamente 48 horas después de la infección con
virus auxiliar. En otra realización se cultivan las células en las
siguientes condiciones: (a) aproximadamente pH 8,00; (b)
aproximadamente 39ºC y (c) se recolectan aproximadamente 48 horas
después de la infección con virus auxiliar.
En algunas realizaciones, el pH se mantiene en
aproximadamente 8,0 y el cultivo se desarrolla a una temperatura de
aproximadamente 39ºC. En algunas realizaciones, el pH se mantiene
en aproximadamente 8,0 y la osmolalidad (al menos la osmolalidad
inicial) es aproximadamente 300 mOsM. En algunas realizaciones, el
pH se mantiene en aproximadamente 8,0, la osmolalidad (al menos la
osmolalidad inicial) es aproximadamente 300 mOsM y el cultivo se
desarrolla a una temperatura de aproximadamente 39ºC.
En algunas realizaciones, las células están
sincronizadas. Esto puede conseguirse, por ejemplo, sometiendo las
células a condiciones de estrés, particularmente antes de la
adición de función(es) de virus auxiliar. La sincronización
puede contribuir a la productividad global. Las posibles formas de
estrés incluyen, pero sin limitación a, un estrés nutricional, un
estrés osmótico, un estrés de pH, un estrés de temperatura, un
estrés aeróbico, un estrés mecánico, un estrés de radiación y un
estrés tóxico. Un ejemplo no limitante mediante el que se impone
estrés nutricional es cultivando las células productoras en un
medio que carece de uno o más aminoácidos.
También se entiende que la invención también
incluye métodos para tratar células productoras (es decir, células
productoras intactas) con un agente o una condición que promueva la
liberación de virus, por ejemplo, tratamiento con un agente que
permeabiliza una célula, tal como un ionóforo o una toxina (tal
como una toxina bacteriana), choque osmótico. Para estas
realizaciones, las células productoras de una población de cultivo
generalmente conservan su integridad, es decir, no se lisan
(aunque, como en cualquier población de cultivo celular, algunas
células se pueden lisar). Generalmente se lisan menos de
aproximadamente cualquiera de los siguientes porcentajes de células:
el 50%, el 45%, el 40%, el 35%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el
12%, el 10%, el 8%, el 5%, el 3%, el 2%, el 1%. Alternativamente,
generalmente se retiene en las células al menos aproximadamente
cualquiera de los siguientes porcentajes de contenidos celulares
(es decir, se retiene en la membrana celular): el 40%, el 45%, el
50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el
90%, el 95%, el 98%.
Las células productoras se pueden cultivar en
suspensión o adheridas a una superficie adecuada. Se conocen
métodos de cultivo en suspensión o fijos en la técnica. Después de
generar una población de partículas virales liberadas, las
partículas virales liberadas pueden recolectarse y/o purificarse
para uso posterior. Como se describe con más detalle a continuación,
las partículas de virus en medio de cultivo se separan de células
productoras usando métodos conocidos en la técnica, tales como
centrifugación o filtración (tal como filtración de flujo
tangencial en una membrana de fibra hueca). Preferiblemente se
realizan una o más etapas adicionales de purificación después de
separar las células productoras del medio de cultivo. Los ejemplos
de tales etapas incluyen, pero sin limitación, concentración usando
filtros adecuados o cromatografía de intercambio iónico. Diversos
métodos de producción y purificación se describen en el documento
WO 99/11764 (PCT/US98/18600) (Targeted Genetics Corporation).
En algunas realizaciones, el sobrenadante del
cultivo (después de retirar las células) se somete a cromatografía
iónica opuesta. En algunas realizaciones, a la cromatografía de
intercambio aniónico sigue la cromatografía de intercambio
catiónico. En otras realizaciones, a la cromatografía de
intercambio catiónico sigue la de intercambio aniónico. En algunas
realizaciones, el sobrenadante del cultivo se somete a cromatografía
sobre sulfato de heparina, preferiblemente después del tratamiento
de cromatografía iónica opuesta, más preferiblemente después del
tratamiento del sobrenadante del cultivo con cromatografía de
intercambio catiónico seguida por cromatografía de intercambio
aniónico. Estas técnicas se describen con más detalle a
continuación.
A modo de ilustración, el sobrenadante del
cultivo, o una preparación que se ha eluido de una columna de
intercambio aniónico o intercambio catiónico y/o concentrada por
filtración de flujo tangencial se puede purificar mediante unión a
una columna que comprenda sulfato de heparina. Después, el AAV se
puede eluir de una columna de este tipo usando un tampón que
contiene una sal (por ejemplo, un gradiente lineal de NaCl). Por
ejemplo, el AAV obtenido de fracciones combinadas de una columna de
cromatografía de intercambio aniónico se puede concentrar y someter
a diafiltración en TMEG más NaCl 100 mM usando una membrana de
filtración de flujo tangencial de 300 K. Este concentrado se puede
inyectar en una columna de un ml de sulfato de heparina (columna de
"Hi-Trap Heparin" Pharmacia) y eluir usando un
gradiente lineal de NaCl.
Las siguientes secciones describen con mayor
detalle componentes del sistema de producción y métodos de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En los métodos de la invención se cultivan
células productoras que comprenden componentes necesarios para la
replicación y encapsidación viral en condiciones adecuadas (es
decir, condiciones que promueven la liberación viral). Varios
criterios influyen en la selección de células para el uso en la
producción de partículas de rAAV como se describe en este documento.
Como una cuestión inicial, la célula debe ser permisiva a
replicación y empaquetamiento del vector de rAAV cuando se usa el
virus auxiliar seleccionado. Sin embargo, ya que la mayoría de
células de mamífero se pueden infectar productivamente con AAV y
muchas también se pueden infectar con virus auxiliares tales como
adenovirus, está claro que una gran diversidad de células de
mamífero y líneas celulares satisfacen eficazmente estos criterios.
Entre éstas, las células y líneas celulares más preferidas son las
que se pueden desarrollar fácilmente en cultivo para facilitar la
producción a gran escala de preparaciones de vector de AAV
recombinante. De nuevo, sin embargo, muchas de tales células
satisfacen eficazmente este criterio. Cuando se desea producción a
gran escala, la elección del método de producción también influirá
en la selección de la célula hospedadora. Por ejemplo, como se
describe con mayor detalle más adelante y en la técnica, algunas
técnicas de producción y recipientes o cámaras de cultivo están
diseñadas para el cultivo de células adherentes o unidas, mientras
otras están diseñadas para el cultivo de células en suspensión. En
el último caso, la célula hospedadora estará por tanto
preferiblemente adaptada o se podrá adaptar al cultivo en
suspensión. Sin embargo, incluso en el caso de células y líneas
celulares que están consideradas como adherentes o dependientes de
anclaje, es posible (como se describe más adelante) obtener
variantes adaptadas a suspensión de una línea precursora
dependiente de anclaje seleccionando en serie células con capacidad
de crecimiento en suspensión.
Cuando se usa un virus auxiliar sensible a
temperatura, la célula tiene que ser capaz de replicar eficazmente
el vector de rAAV en condiciones que sean no permisivas para la
replicación del virus auxiliar. A modo de ilustración, cuando se
usa adenovirus ts149 como un virus auxiliar ts (como se describe
más adelante), la célula debe ser capaz de apoyar la replicación y
el empaquetamiento de rAAV a temperaturas muy superiores a 32ºC,
preferiblemente aproximadamente 39,5ºC. Las células 293 humanas son
un ejemplo de una línea celular que satisface estos criterios, pero
muchas otras células y líneas celulares son capaces de replicar
rAAV a esta temperatura relativamente elevada.
Finalmente, el virus auxiliar (o la función de
virus auxiliar), la secuencia de vector de rAAV y todas las
secuencias de AAV requeridas para la replicación y el
empaquetamiento tienen que estar presentes en la misma célula.
Cuando se proporcionan uno o más genes de empaquetamiento de AAV de
forma separada del vector, se proporciona una célula hospedadora que
comprende: (i) uno o más genes de empaquetamiento de AAV, donde
cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica una
proteína de replicación o encapsidación de AAV; (ii) un
polinucleótido heterólogo introducido en dicha célula hospedadora
usando un vector o pro-vector de rAAV, donde dicho
vector o pro-vector de rAAV comprende dicho
polinucleótido heterólogo flanqueado por al menos una ITR de AAV y
carece de dicho(s) gen(es) de empaquetamiento de AAV;
y (iii) un virus auxiliar o secuencias que codifican las funciones
de virus auxiliar requeridas. Sin embargo, se debe señalar que uno
o más de estos elementos se pueden combinar en un solo replicón. A
modo de ilustración, un virus auxiliar también puede comprender un
pro-vector de rAAV o un gen de empaquetamiento de
AAV.
El virus auxiliar preferiblemente se introduce
en el cultivo celular a un nivel suficiente para infectar la
mayoría de las células en cultivo, pero, por el contrario, se puede
mantener a un mínimo para limitar la cantidad de virus auxiliar
presente en la preparación resultante. Se puede usar una
multiplicidad de infección o "MOI" de 1-100,
pero típicamente es adecuada una MOI de 5-10.
De forma similar, si el vector de AAV y/o los
genes de empaquetamiento se introducen transitoriamente en la
célula de empaquetamiento (a diferencia de introducirse de forma
estable), se introducen preferiblemente a un nivel suficiente para
alterar genéticamente la mayoría de las células en cultivo. Las
cantidades requeridas generalmente están en el orden de 10 \mug
por 10^{6} células, si se suministra como un plásmido bacteriano;
o 10^{8} partículas por 10^{5} células, si se suministra como
una partícula de AAV. La determinación de una cantidad óptima es un
ejercicio de titulación de rutina que está dentro de la
especialidad de la técnica.
Estos elementos se pueden introducir en la
célula, bien simultáneamente, o secuencialmente en cualquier orden.
Cuando la célula se altera de forma heredable por cualquiera de los
elementos, la célula se puede seleccionar y permitirse su
proliferación antes de introducir el siguiente elemento.
En una realización preferida, el virus auxiliar
se introduce el último en la célula para recuperar y empaquetar un
vector de rAAV residente. La célula generalmente ya estará
complementada hasta el grado necesario con genes de empaquetamiento
de AAV. Preferiblemente, el vector de rAAV o los genes de
empaquetamiento y más preferiblemente ambos se integran de forma
estable en la célula. Se entenderá fácilmente que son posibles
otras combinaciones. Tales combinaciones se incluyen dentro del
alcance de la invención.
Una vez que se proporcionan los elementos
requeridos a la célula hospedadora, la célula se cultiva en
condiciones que son permisivas para la replicación de AAV, para
permitir la replicación, el empaquetamiento y la liberación del
vector de rAAV. Los tiempos de cultivo adecuados dependen de varias
consideraciones y pueden variar como se ha descrito anteriormente.
El tiempo de cultivo se ajusta preferiblemente para corresponderse
con niveles máximos de producción y es generalmente de
3-6 días. Preferiblemente se producen al menos 100
partículas virales por célula; más preferiblemente al menos
aproximadamente 1000 por célula, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 10.000 por célula. Preferiblemente, al menos 0,5 x
10^{6}, más preferiblemente al menos aproximadamente 1 x
10^{6}, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 2 x
10^{6} RU/ml de vectores de AAV se producen por 2 x 10^{5}
células durante el periodo de cultivo. Opcionalmente se pueden usar
métodos de producción a gran escala tales como cultivo en suspensión
y filtración de flujo tangencial. Después, las partículas de AAV se
recogen y se aíslan de las células usadas para preparar las
mismas.
Las preparaciones de partículas de rAAV
obtenidas por los métodos de la presente invención comprenden
preferiblemente una densidad alta de partículas infecciosas de AAV
y están sustancialmente libres de virus auxiliar, proteínas de
virus auxiliar y restos celulares y otros contaminantes. Las
propiedades deseables incluyen las siguientes:
\bullet Una concentración de al menos
10^{7}, preferiblemente al menos aproximadamente 10^{8}, más
preferiblemente al menos aproximadamente 10^{9} RU/ml, como se
determina en un ensayo de replicación o comparación de hibridación
cuantitativa con un patrón conocido.
\bullet No más de 10^{3}, preferiblemente no
más de aproximadamente 10^{2}, más preferiblemente no más de
aproximadamente 10^{1} partículas infecciosas de virus auxiliar
por 10^{8} RU de partículas de rAAV.
\bullet Menos del 5%, preferiblemente menos de
aproximadamente el 1%, más preferiblemente menos de aproximadamente
el 0,01%, aún más preferiblemente menos de aproximadamente el
0,001% de contaminación por i virus auxiliar en una base de proteína
(p/p), detectada por análisis densitométrico de geles SDS o por
inmunoensayo para proteína específica de virus auxiliar (tal como
fibra de hexona y pentona de adenovirus).
\bullet Menos del 5%, preferiblemente menos de
aproximadamente el 1%, más preferiblemente menos de aproximadamente
el 0,01%, aún más preferiblemente menos de aproximadamente el
0,001% de contaminación por virus auxiliar o proteína celular
(p/p), detectada por análisis densitométrico de geles SDS o por
inmunoensayo para virus auxiliar o proteínas específicas
celulares.
\bullet Preferiblemente, la preparación está
también sustancialmente libre de otros componentes celulares
potenciales tales como lípidos celulares, carbohidratos y/o ácidos
nucleicos.
Los métodos explicados en esta descripción son
adecuados para preparar pequeños lotes experimentales o lotes
preparativos de 10-100 litros o más. Para
preparaciones de lotes a gran escala también es deseable la
siguiente propiedad:
\bullet Un total de al menos 10^{10},
preferiblemente 10^{12} y más preferiblemente 10^{14} RU de
partículas de vector de AAV en la preparación.
Opcionalmente se pueden procesar vectores de
rAAV adicionalmente para enriquecer para partículas de rAAV, agotar
partículas de virus auxiliar o convertir los mismos de otro modo en
adecuados para la administración a un sujeto. Las técnicas de
purificación pueden incluir centrifugación de gradiente isopícnico
y técnicas cromatográficas. La reducción de actividad infecciosa de
virus auxiliar puede incluir inactivación por tratamiento térmico o
por tratamiento de pH como se conoce en la técnica. Otros procesos
pueden incluir concentración, filtración, diafiltración o mezcla
con un tampón adecuado o excipiente farmacéutico. Las preparaciones
se pueden dividir en alícuotas de dosis unitaria y multidosis para
la distribución, que conservarán las características esenciales del
lote, tales como la homogeneidad de contenido antigénico y genético
y la proporción relativa de virus auxiliar contaminante.
En las siguientes secciones se proporcionan
técnicas ejemplares para generar preparaciones de virus auxiliar y
AAV que muestran diversas propiedades deseables como se ha descrito
anteriormente.
Se conocen diversos métodos para la
determinación del título infeccioso de una preparación viral en la
técnica. Un método para la determinación del título es un ensayo de
titulación de alto rendimiento, en el que se establece una matriz
de pocillos de cultivo que comprenden cada uno una alícuota de
células de mamífero y una alícuota de preparación de virus (así
como pocillos de control que comprenden, por ejemplo, solamente
células, solamente virus y nada). La matriz de pocillos de cultivo
puede estar, por ejemplo, en forma de un recipiente de
microtitulación. Típicamente se añaden a las células alícuotas (por
ejemplo, alícuotas diluidas en serie) de la preparación de virus que
se tiene que titular y después las células y los virus se incuban
en condiciones que permiten la replicación del virus (típicamente
condiciones de cultivo adecuadas para la célula hospedadora de
mamífero). Después de la replicación del virus, el ácido nucleico
viral generalmente se libera por lisis de las células de mamífero
(usando condiciones o agentes que promueven la lisis según sea
necesario). El ácido nucleico (incluyendo ácido nucleico viral) en
la multiplicidad de lisados se puede transferir y fijar a una
membrana en condiciones que unen ácido nucleico (lavando según sea
apropiado para retirar proteínas y otros contaminantes). La
membrana es preferiblemente una réplica o imagen especular de la
matriz de cultivo en la que los pocillos individuales de la matriz
original se representan posteriormente mediante "combinaciones"
de ácidos nucleicos (del lisado de cada pocillo de cultivo) que
están unidos en posiciones correspondientes a la membrana. Después
se puede usar la hibridación de la membrana con una sonda
específica de virus marcada (o específica de inserto viral) para
identificar y cuantificar la cantidad relativa de ácido nucleico
específico de virus en cada uno de los puntos de la matriz y, por
correspondencia, en cada uno de los pocillos de cultivo original.
Las condiciones y los materiales para transferencia, unión, lavado
e hibridación de ácido nucleico se pueden adaptar de técnicas de
biología molecular de rutina tales como hibridación de
"transferencia puntual" (como se describe en la técnica).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células productoras usadas en los métodos de
producción descritos en este documento comprenden un vector de rAAV.
Un vector de rAAV comprende un polinucleótido heterólogo (es decir,
no AAV) de interés en lugar de todos o una parte de los genes
rep y/o cap de AAV que normalmente forman la mayor
parte del genoma de AAV. Sin embargo, como en el genoma de AAV de
tipo silvestre, el vector de rAAV está preferiblemente flanqueado
por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV como se ha
señalado anteriormente. También se han descrito en la técnica
variaciones en las que una construcción de rAAV está flanqueada por
sólo una ITR única (típicamente modificada) y pueden emplearse en
relación con la presente invención.
Son adecuados los virus
adeno-asociados de cualquier serotipo, ya que los
diversos serotipos están relacionados funcionalmente y
estructuralmente, incluso a nivel genético (véase, por ejemplo,
Blacklow, págs. 165-174 de "Parvovirus and Human
Disease" J. R. Pattison, ed. (1988); y Rose, Comprehensive
Virology 3: 1, 1974). Todos los serotipos de AAV aparentemente
muestran propiedades de replicación similares mediadas por genes
rep homólogos; y todos llevan generalmente tres proteínas de
cápside relacionadas tales como las expresadas en AAV2. El grado de
relación se sugiere adicionalmente por análisis de heterodúplex que
muestra amplia hibridación cruzada entre serotipos a lo largo de la
longitud del genoma; y la presencia de segmentos análogos de
auto-hibridación en los extremos que corresponden a
las ITR. Los patrones de infectividad similares también sugieren
que las funciones de replicación en cada serotipo están bajo un
control regulador similar. Entre los diversos serotipos de AAV, el
AAV2 es el más comúnmente empleado.
Un vector de rAAV comprende un polinucleótido
heterólogo. El polinucleótido es típicamente de interés por una
capacidad de proporcionar una función a una célula diana en el
contexto de terapia génica, tal como regulación positiva o negativa
de la expresión de un cierto fenotipo. Un polinucleótido heterólogo
o "transgen" de este tipo generalmente será de una longitud
suficiente para proporcionar la función o secuencia codificante
deseada. Para la encapsidación en partículas de AAV2, el transgen
será preferiblemente menor de aproximadamente 5 kb aunque pueden
emplearse otros serotipos y/o modificaciones para permitir que
secuencias mayores se empaqueten en las partículas virales de
AAV.
Cuando se desea la transcripción del
polinucleótido heterólogo en la célula diana pretendida, se puede
unir de forma funcional con su propio promotor o un promotor
heterólogo, dependiendo, por ejemplo, del nivel y/o especificidad
de transcripción deseados dentro de la célula diana, como se conoce
en la técnica. Diversos tipos de promotores y potenciadores son
adecuados para el uso en este contexto. Los promotores constitutivos
proporcionan un nivel continuo de transcripción génica, mientras
que los promotores inducibles generalmente muestran baja actividad
en ausencia del inductor y se regulan positivamente en presencia
del inductor. Los promotores y potenciadores también pueden ser
específicos de tejido: es decir, los mismos muestran su actividad
sólo en ciertos tipos celulares, presumiblemente debido a elementos
reguladores génicos encontrados exclusivamente en esas células.
Los ejemplos ilustrativos de promotores son el
promotor tardío SV40 del virus de simio 40, el elemento
potenciador/promotor de poliedro de baculovirus, la timidina
quinasa del Virus Herpes Simplex (HSV tk), el promotor temprano
inmediato de citomegalovirus (CMV) y diversos promotores
retrovirales incluyendo elementos LTR. Los promotores inducibles
incluyen promotores inducibles por iones de metales pesados (tales
como el promotor del virus dé tumor mamario de ratón (mMTV) o
diversos promotores de hormonas de crecimiento), promotores
inducibles por hormonas esteroideas y los promotores del fago T7
que están activos en presencia de ARN polimerasa de T7. Los
ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen diversos
promotores de surfactina (para expresión en el pulmón), promotores
de miosina (para expresión en el músculo) y promotores de albúmina
(para expresión en el hígado). Se conoce una gran diversidad de
otros promotores y están generalmente disponibles en la técnica y
las secuencias de muchos de tales promotores están disponibles en
bases de datos de secuencias tales como la base de datos de
GenBank.
GenBank.
Cuando también se desea la traducción en la
célula diana pretendida, el polinucleótido heterólogo comprenderá
también preferiblemente elementos de control que faciliten la
traducción (tales como un sitio de unión a ribosoma o "RBS" y
una señal de poliadenilación). En consecuencia, el polinucleótido
heterólogo comprenderá generalmente al menos una región codificante
unida funcionalmente a un promotor adecuado y también puede
comprender, por ejemplo, un potenciador unido funcionalmente, un
sitio de unión a ribosoma y una señal de poli-A. El
polinucleótido heterólogo puede comprender una región codificante o
más de una región codificante bajo el control del mismo o de
diferentes promotores. La unidad completa, que contiene una
combinación de elementos de control y región codificante, se
denomina frecuentemente un casete de expresión.
El polinucleótido heterólogo se integra por
técnicas recombinantes en o preferiblemente en lugar de la región
codificante genómica de AAV (es decir, en lugar de los genes
rep y cap de AAV) y está flanqueado preferiblemente en
cualquiera de sus lados por regiones de repetición terminal
invertida (ITR) de AAV. Esto significa que una ITR aparece tanto
cadena arriba como cadena abajo de la secuencia codificante, ya sea
en yuxtaposición directa, preferiblemente (aunque no
necesariamente) sin ninguna secuencia de intervención de origen de
AAV para reducir la probabilidad de recombinación que podría
regenerar un genoma con capacidad de replicación de AAV. Una única
ITR puede ser suficiente para realizar las funciones normalmente
asociadas a configuraciones que comprenden dos ITR (documento WO
94/13778), y, por tanto, se pueden emplear construcciones de vector
con sólo una ITR junto con los métodos de empaquetamiento y
producción de la presente invención.
Los promotores nativos para rep son
autorreguladores y pueden limitar la cantidad de partículas de AAV
producidas. El gen rep también puede estar unido
funcionalmente a un promotor heterólogo, tanto si se proporciona
rep como parte de la construcción de vector o de forma
separada. Cualquier promotor heterólogo que no esté fuertemente
regulado negativamente por la expresión del gen rep es
adecuado; pero se prefieren promotores inducibles porque la
expresión constitutiva del gen rep puede tener un impacto
negativo en la célula hospedadora. Se conoce una gran diversidad de
promotores inducibles en la técnica y se han enumerado ejemplos
anteriormente. Una sub-clase preferida de
promotores inducibles son los inducidos por el virus auxiliar que
se usa para complementar la replicación y el empaquetamiento del
vector de rAAV. También se han descrito varios promotores
inducibles por virus auxiliar, incluyendo el promotor de gen
temprano de adenovirus que es inducible por la proteína E1A de
adenovirus; el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor
de herpes virus que es inducible por proteínas de herpes virus
tales como VP16 o 1CP4; así como promotores inducibles de vaccinia
y poxvirus.
Se han descrito métodos para identificar y
ensayar promotores inducibles por virus auxiliar tales como los
promotores obtenidos del gen de la metalotioneina de ratón. Véase
el documento WO96/17947 (Targeted Genetics Corporation).
Dada los límites de tamaño de encapsidación
relativos de diversos genomas de AAV, la inserción de un
polinucleótido heterólogo grande en el genoma requiere la retirada
de una parte de la secuencia de AAV. La retirada de uno o más genes
de AAV es deseable en cualquier caso, para disminuir la
probabilidad de generar AAV con capacidad de replicación
("rcAAV"). En consecuencia, las secuencias codificantes o
promotoras para rep, cap o ambos preferiblemente se retiran,
ya que las funciones proporcionadas por estos genes se pueden
proporcionar en trans.
El vector resultante se denomina "sin
capacidad" de estas funciones. Para replicar y empaquetar el
vector, las funciones ausentes se complementan con un gen de
empaquetamiento, o una pluralidad del mismo, que codifican
conjuntamente las funciones necesarias para los diversos productos
génicos ausentes de rep y/o cap. Los genes de
empaquetamiento o casetes génicos preferiblemente no están
flanqueados por ITR de AAV y preferiblemente no comparten ninguna
homología sustancial con el genoma de rAAV para minimizar
recombinación homóloga durante la replicación entre la secuencia
del vector y los genes de empaquetamiento proporcionados
separadamente. El nivel de homología y frecuencia de recombinación
correspondiente aumentan con el aumento de longitud de secuencias
homólogas y con su nivel de identidad compartida. El nivel de
homología que supondrá una preocupación en un sistema dado se puede
determinar teóricamente y confirmarse experimentalmente, como se
conoce en la técnica. Típicamente, sin embargo, se puede reducir la
recombinación sustancialmente o eliminarse si la secuencia
solapante es menor de aproximadamente una secuencia de 25
nucleótidos si tiene una identidad de al menos el 80% a lo largo de
toda su longitud o menor de aproximadamente una secuencia de 50
nucleótidos si tiene una identidad de al menos el 70% a lo largo de
toda su longitud. Por supuesto, se prefieren niveles de homología
aún menores ya que los mismos disminuirán adicionalmente la
probabilidad de recombinación. Parece que, aún sin ninguna
homología solapante, existe alguna frecuencia residual de generación
de rcAAV. Se pueden obtener disminuciones aún mayores en la
frecuencia de generación de rcAAV (por ejemplo, por recombinación no
homóloga) al "escindir" las funciones de replicación y
encapsidación de AAV, como se describe en el documento WO98/27204
(Targeted Genetics Corporation).
La construcción de vector de rAAV y las
construcciones de genes de empaquetamiento complementarias se
pueden implementar en esta invención de varias formas diferentes.
Se pueden usar partículas virales, plásmidos y células hospedadoras
transformadas de forma estable en su totalidad para introducir
tales construcciones en la célula de empaquetamiento, tanto de
forma transitoria como estable.
El vector de AAV y los gen(es) de
empaquetamiento complementarios, si existen, se pueden proporcionar
en forma de plásmidos bacterianos, partículas de AAV o cualquier
combinación de los mismos. Alternativamente, la secuencia de vector
de AAV, el gen(es) de empaquetamiento o ambos, se
proporcionan en forma de células eucariotas genéticamente alteradas
(preferiblemente alteradas de forma heredable o integradas de forma
estable). El desarrollo de células hospedadoras alteradas de forma
heredable para expresar la secuencia de vector de AAV, los genes de
empaquetamiento de AAV o ambos, proporciona una fuente establecida
del material que se expresa a un nivel fiable. Por tanto, se puede
usar una diversidad de células diferentes genéticamente alteradas
en el contexto de esta invención como se describe en la técnica,
entre otros, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.658.776; el
documento WO95/13392; el documento WO98/23018; la Patente de Estados
Unidos Nº 5.656.785; el documento WO98/27204. Otras combinaciones
son posibles.
En consecuencia, por ejemplo, los genes
rep y cap pueden estar presentes en plásmidos y/o
integrados de forma estable en el genoma de la célula
productora.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se describe en la técnica y se ilustra
tanto en este documento como en las referencias citadas
anteriormente, se puede introducir material genético en células
productoras usando cualquiera de una diversidad de medios para
transformar o transducir tales células tales como transfección con
plásmidos bacterianos, infección con vectores virales,
electroporación, precipitación con fosfato de calcio e introducción
usando cualquiera de una diversidad de composiciones basadas en
lípidos (un proceso frecuentemente denominado "lipofección").
Se han descrito en la técnica métodos y composiciones para llevar a
cabo estas técnicas y están disponibles ampliamente.
La selección de células productoras alteradas
adecuadamente se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica en
la técnica. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas usadas
para alterar la célula se pueden introducir simultáneamente con o
funcionalmente unidas a uno o más marcadores detectables o
seleccionables, tales como genes de resistencia a fármacos, como se
conoce en la técnica. Se pueden realizar ensayos para la
adquisición, localización y/o mantenimiento de un polinucleótido
introducido usando técnicas basadas en hibridación de ADN (tales
como transferencia de Southern y otros procedimientos conocidos en
la técnica). Los ensayos para expresión se pueden llevar a cabo
fácilmente por análisis Northern de ARN extraído de las células
genéticamente alteradas o por inmunofluorescencia indirecta para el
producto génico correspondiente. Se pueden obtener ensayos y
confirmación de capacidades y eficacias de empaquetamiento
introduciendo los componentes funcionales restantes de AAV y un
virus auxiliar en la célula, para ensayar la producción de
partículas de AAV. Cuando una célula se altera de forma heredable
con una pluralidad de construcciones de polinucleótido, es por lo
general más conveniente (aunque no esencial) introducir las mismas
en la célula separadamente y validar cada etapa en serie. Las
referencias que describen tales técnicas incluyen las citadas en
este documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito anteriormente, el AAV es un
parvovirus que carece de auto-replicación y debe
depender generalmente de un virus auxiliar para suministrar
determinadas funciones de replicación. Se pueden usar diversos
virus auxiliares en los métodos de la presente invención.
Se han identificado varios de tales virus
auxiliares, incluyendo adenovirus, herpes virus (incluyendo, pero
sin limitación, HSV1, citomegalovirus y HHV-6) y
pox virus (especialmente vaccinia). Se puede usar cualquiera de
tales virus con esta invención.
Frecuentemente, el virus auxiliar será un
adenovirus de un tipo y subgrupo que pueda infectar la célula
hospedadora pretendida. Comúnmente se usa adenovirus humano de
subgrupo C, especialmente serotipos 1, 2, 4, 6 y 7. Se prefiere
generalmente el serotipo 5. Las características y los patrones de
crecimiento de adenovirus se conocen en la técnica. Véase, por
ejemplo, Horowitz, "Adenoviridae and their replication", págs.
771-816 en "Fundamental Virology", Fields
et al., eds.
Aunque no es esencial, en principio es deseable
que la cepa de virus auxiliar carezca de capacidad de replicación
en el sujeto que finalmente recibirá la terapia génica. Por tanto,
cualquier virus auxiliar residual presente en una preparación de
rAAV no tendrá capacidad de replicación. Los adenovirus en los que
la región E1A o tanto la E1A como la E3 se han retirado no son
infecciosos para la mayoría de células humanas. Éstos se pueden
replicar en una línea celular permisiva (por ejemplo, la línea
celular humana 293) que es capaz de complementar la actividad
ausente. Las regiones de adenovirus que parecen estar asociadas con
función auxiliar, así como las regiones que no lo están, se han
identificado y descrito en la técnica (véase, por ejemplo, P. Colosi
et al., documento WO 97/17458 y las referencias citadas en
ese documento).
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Un virus auxiliar "condicionalmente
sensible" también se puede emplear para proporcionar actividad
de virus auxiliar. Véase el documento WO 99/11764. Una cepa de
virus auxiliar de ese tipo debe tener como mínimo la propiedad de
ser capaz de apoyar la replicación de AAV en una célula hospedadora
en al menos un conjunto de condiciones donde por sí misma no
experimenta replicación genómica eficaz. Cuando la actividad de
virus auxiliar se suministra en forma de partículas de virus
intactas, también es generalmente necesario que el virus sea capaz
de replicarse en una célula hospedadora en un segundo conjunto de
condiciones. El primer conjunto de condiciones se diferenciará del
segundo conjunto de condiciones en una característica fácilmente
controlable, tal como la presencia o ausencia de un cofactor
requerido (tal como un catión), la presencia o ausencia de un
fármaco inhibidor o un cambio en una condición ambiental tal como
temperatura. Más oportunamente, la diferencia entre las dos
condiciones es temperatura y por tanto, tal virus condicionalmente
sensible se denomina un virus auxiliar sensible a temperatura
(tsHV).
Un virus auxiliar "sensible a temperatura"
o "ts" es uno que es capaz de replicar su material genético en
una célula eucariota en un determinado intervalo de temperaturas
(el intervalo "permisivo" de temperaturas), típicamente
aproximadamente 15º-35ºC y preferiblemente aproximadamente 20º-32ºC.
Sin embargo, a la temperatura "no-permisiva",
aún cuando otras condiciones se mantienen iguales, la tasa de
replicación de material genético es sustancialmente menor, al menos
10 veces menor, habitualmente al menos aproximadamente 100 veces
menor y preferiblemente al menos aproximadamente 1000 veces menor.
Esta temperatura es típicamente aproximadamente 35º-50ºC,
generalmente aproximadamente 42ºC. En un ejemplo típico de tal
virus auxiliar ts, el virus es capaz de replicación eficaz a
temperaturas relativamente bajas tales como temperaturas de
aproximadamente 20º-32ºC, pero es incapaz de replicación eficaz a
temperaturas relativamente altas tales como temperaturas de
aproximadamente 37º-42ºC. Se entiende que la célula infectada por
virus puede aún así mostrar algunos procesos metabólicos
atribuibles al virus a la temperatura no-permisiva,
incluyendo, pero sin limitación, función auxiliar para producción
de AAV.
Se puede producir un virus auxiliar sensible a
temperatura en grandes cantidades cultivando células infectadas a
una temperatura permisiva. Después puede producirse un vector de
AAV cultivando de células que comprenden elementos de vector y el
virus auxiliar sensible a temperatura a una temperatura
no-permisiva. La preparación de vector estará
sustancialmente libre de componentes de virus auxiliar.
Se ha descrito en la técnica un gran número de
variantes de adenovirus sensible a temperatura; véase, por ejemplo,
las variantes descritas por Ensinger et al. (J. Virol. 10:
328, 1972); Williams et al. (J. Gen. Virol. 11: 95, 1971);
Ishibashi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65: 304, 1970); Lundholm et
al. (Virology 45: 827, 1971); y Shiroki et al.,
(Virology 61: 474, 1974). El análisis de complementación indica que
tales variantes entran dentro de una pluralidad de grupos
diferentes de complementación (Ginsberg et al., Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 34: 419, 1974). Esto sugiere que se puede
convertir en sensible a temperatura varias etapas en el ciclo
replicativo de adenovirus.
Ya que la función auxiliar para replicación de
AAV requiere que sólo parte del ciclo de adenovirus esté intacto,
el ensayo para función auxiliar de diversos mutantes a la
temperatura no-permisiva proporciona un medio para
mapear la función auxiliar. Por ejemplo, Ishibashi et al.
(Virology 45: 317, 1971) describieron que las variantes sensibles a
temperatura de adenovirus aviar apoyan la replicación de AAV1 y
AAV2. Ito et al. publicaron que un mutante sensible a
temperatura ts13 de adenovirus humano 7 (Ad7ts13) ayuda a la
replicación de AAV a la temperatura no permisiva tan eficazmente
como la cepa silvestre. Drake et al. (Virology 60: 230,
1974) describieron la complementación de síntesis de antígeno de
AAV4 mediante 3 grupos de mutantes sensibles a temperatura de virus
herpes simplex tipo 1 (HSV1). Handa et al. (J. Gen. Viro.
29: 239, 1975) publicaron actividad auxiliar para producción de
virus AAV1 mediante mutantes de adenovirus humano Ad5ts36,
Ad5ts125, Ad5ts149, Adl2tsA275, Adl2tsB221 y Adl2tsC295. Ostrove
et al. (Virology 104: 502, 1980) publicaron que los mutantes
sensibles a temperatura Ad5ts125, Ad5ts135, Ad5ts157, Ad5ts116 y
Ad5ts142 y el espectro de hospedadores de mutantes hr6 pero no hr3
apoyan la replicación de AAV. Mayor et al. (J. Gen. Virol.
35: 545, 1977) publicaron que el Ad3lts13 pero no el Ad31ts94
apoyaba la producción de AAV1 a la temperatura no permisiva.
Straus et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
73: 742, 1976) publicaron que Ad5ts125 apoyaba la replicación de
AAV2 en condiciones en las que el adenovirus no se replicaba por sí
mismo. Usaron esta propiedad para estudiar los intermedios de ADN
formados durante la replicación de AAV. Myers et al. (J.
Virol. 35: 65, 1980) llevaron a cabo un estudio cuantitativo de
función auxiliar y mostraron que Ad5ts149 apoyaba la producción de
20.000 partículas infecciosas de AAV por célula a la temperatura no
permisiva, mientras que Ad5ts107 produjo sólo \sim100 partículas
por célula. Ya que Ad5ts107 tiene una mutación en la región
codificante de unión a proteína de ADN de 72 kDa, concluyeron que
esta proteína desempeñaba un papel en la expresión de ARN de AAV.
Más recientemente, Carter et al. (Virology 191: 473, 1992)
propusieron que se requiere una proteína de 72 kDa completamente
funcional para la expresión post-transcripcional
cuantitativa de los genes rep y cap de AAV.
\newpage
Se pueden generar variantes sensibles a
condición de la cepa seleccionada de virus auxiliar mediante una
estrategia apropiada de mutagenización y selección. Por ejemplo, el
virus se puede mutagenizar con nitrosoguanidina, ácido nitroso,
hidroxilamina o
5-bromo-2-desoxiuridina.
Se seleccionan candidatos que se puedan multiplicar en una célula
eucariota adecuada en las condiciones permisivas deseadas, pero no
en las condiciones no permisivas deseadas. Como ilustración se
pueden obtener mutantes sensibles a temperatura de adenovirus que
se multiplican, por ejemplo, a 32ºC, pero no a 39,5ºC. Las
proporciones de eficacia de plaqueo a 39,5ºC frente a 32ºC son
preferiblemente menores de 10^{-4} y más preferiblemente menores
de 10^{-5}. Se puede encontrar una ilustración adicional de
procesos de selección adecuados para adenovirus sensible a
temperatura, por ejemplo, en Ensinger et al., J. Virol. 10:
328, 1972; y Williams et al., J. Gen. Virol. 11: 95, 1971. Se
puede encontrar una descripción de variantes de adenovirus que no
son sensibles a temperatura, sino sensibles a espectro de
hospedador, en Harrison et al., Virology 77: 319, 1977. Se
pueden preparar mutantes sensibles a temperatura eficaces para el
uso en esta invención, por ejemplo, a partir de virus auxiliares
alternativos como herpes simplex 1 (HSV1) o herpes simplex 2
(HSV2). Véase, por ejemplo, Schaffer et al., Virology 52: 57,
1973 para HSV1; Esparza et al., Virology 57: 554, 1974 para
HSV2. Como se ha indicado en la sección de antecedentes, se ha
descrito un gran número de virus auxiliares sensibles a condición y
se pueden obtener de los científicos que los desarrollaron o
describieron o de un depósito público.
La cepa se debe convertir en sensible a
condición en una etapa de su ciclo replicativo de tal modo que la
función que está bloqueada en condiciones
no-permisivas no sea una que se requiere para la
replicación de alta eficacia de AAV. La elección de qué cepa de
virus auxiliar usar se puede hacer mediante referencia tanto a la
biología conocida del virus auxiliar como a los requerimientos
replicativos del AAV.
Un virus auxiliar ejemplar para el uso con esta
invención es el adenovirus sensible a temperatura ts149 del
serotipo Ad5 (Ad5ts149). En condiciones optimizadas, esta cepa se
puede usar para producir rAAV a niveles que alcanzan o superan los
soportados por Ad5 de tipo silvestre. El ts149 tiene una única
transición de C-G a A-T en la
posición 7563 (Roovers et al., Virus Genes 4: 53, 1990).
Esto da como resultado un cambio del aminoácido leucina en el resto
411 de la ADN polimerasa a fenilalanina. La ADN polimerasa está
contenida dentro de la unidad de transcripción E2 del adenovirus.
Sin embargo, otros mutantes ts que se mapean en esta región son
menos adecuados. En particular, la unidad de transcripción E2
también comprende la región codificante para la proteína de unión a
ADN de 72 kDa (DBP). Una cepa que no produce DBP detectable
(Add/802) apoya la replicación de AAV, pero a un nivel que
está reducido en un orden de magnitud (Carter et al.,
Virology 191: 473, 1992). El Adts125, que también comprende un
mapeo de mutación para la región codificante de DBP, apoya la
replicación de AAV (Straus et al., J. Virol. 17: 140, 1976),
aunque los niveles son generalmente mucho menores que con el Ad5 de
tipo silvestre (Myers et al., J. Virol. 35: 65, 1980). En
consecuencia, los vectores de adenovirus sensibles a temperatura
adecuados para el uso en esta invención incluyen aquellos para los
que la sensibilidad mapea la región del genoma E2A, preferiblemente
la región codificante de ADN polimerasa.
El especialista puede determinar fácilmente qué
cepas virales son adecuadas para el uso como virus auxiliar
realizando un ensayo de replicación de rAAV usando un panel de
cepas candidatas del virus auxiliar en una célula candidata en
condiciones que son no-permisivas para la
auto-replicación del auxiliar. Para variantes
sensibles a temperatura, la selección se realiza a la temperatura
no permisiva de acuerdo con las propiedades conocidas de la cepa.
Las temperaturas no-permisivas generalmente son más
elevadas que las temperaturas permisivas, típicamente
aproximadamente 35º-50ºC, preferiblemente 38º-45ºC, más
preferiblemente aproximadamente 39,5ºC. Se prefieren las variantes
que apoyan la replicación de AAV a un nivel que está dentro de un
orden de magnitud del apoyado por el virus de tipo silvestre
correspondiente. Al realizar la selección, el especialista debe
incorporar las otras enseñanzas de esta descripción. En particular,
es insuficiente seleccionar mediante el cultivo en momentos que dan
replicación máxima de AAV con virus de tipo silvestre. Debe
ajustarse una matriz cinética en la que los virus auxiliares
candidatos se usen durante períodos más largos y después se
comparen con el virus de tipo silvestre en el momento máximo de
recolección.
Una vez que se ha seleccionado una cepa adecuada
de virus auxiliar, se puede implementar en esta invención de varias
formas diferentes. Se pueden usar partículas virales, plásmidos
virales y células hospedadoras transformadas de forma estable en su
totalidad.
En una realización, el genoma del virus auxiliar
(o como mínimo, las regiones del genoma del virus auxiliar que
codifican función auxiliar) se introduce en la célula hospedadora
para usarse para la replicación del vector de rAAV en forma de un
plásmido de ADN o una pluralidad de plásmidos, que proporcionan
funciones complementarias. Se conocen en la técnica procedimientos
para manipulación experimental de adenovirus. Véase, por ejemplo,
Graham et al., "Manipulation of adenovirus vectors". En:
Murray EJ, ed Methods in molecular biology: Gene transfer and
expression protocols, vol.7. Clifton, NJ: The Human Press, 1991:
109-128, que proporciona protocolos detallados para
propagación, titulación y purificación de adenovirus,
cotransfección y recombinación in vivo. Los plásmidos de
adenovirus están disponibles en el mercado en Microbix Biosystems
Inc., Toronto, Canadá.
En otra realización, la célula hospedadora se
transfecta de forma estable con genes de adenovirus o se altera
genéticamente para proporcionar las funciones requeridas para la
replicación de rAAV. Alternativamente, la célula hospedadora se
puede alterar genéticamente con sólo una parte del genoma de
adenovirus y posteriormente se infecta o transfecta con una
partícula de adenovirus o plásmido. Las solicitudes de patente WO
95/27071 y WO 95/34671 describen células hospedadoras alteradas de
forma heredable para proporcionar función de adenovirus, que
complementa la propiedad replicativa de diversas construcciones
anormales de adenovirus.
En otra realización más, la célula hospedadora
usada para la replicación de AAV se infecta con un virus auxiliar
que tiene capacidad de auto-replicación, pero no en
condiciones no-permisivas. Se puede usar cualquier
preparación de la cepa requerida que proporcione una MOI
suficiente. En conformidad con GMP y otros requisitos reguladores y
para facilitar el aumento de escala para propósitos comerciales,
las preparaciones de virus auxiliar comprenden preferiblemente una
densidad elevada de partículas infecciosas y están sustancialmente
libres de restos celulares y otros contaminantes. Las propiedades
deseables incluyen las siguientes:
\bullet Una densidad de al menos 10^{6},
preferiblemente al menos aproximadamente 10^{8}, más
preferiblemente al menos aproximadamente 10^{10} Ul/ml, como se
determina en un ensayo de DITC_{50}.
\bullet Una proporción de ADN de adenovirus a
proteína total o hexona de adenovirus que indique que al menos el
10%, preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 80% de las partículas
virales contienen ADN de adenovirus.
\bullet Menos del 20%, preferiblemente menos
de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de
aproximadamente el 1% de contaminación mediante material
no-adenovirus a nivel de proteína o ADN, como se
detecta en geles SDS teñidos para proteínas o geles de agarosa de
productos de digestión de nucleasa de restricción teñidos con
bromuro de etidio.
\bullet Un total de al menos 10^{9},
preferiblemente al menos aproximadamente 10^{11}, más
preferiblemente al menos aproximadamente 10^{13} Ul por lote de
producción.
Se puede preparar virus auxiliar en cualquier
célula que sea permisiva para replicación viral. Para adenovirus,
las células preferidas incluyen células 293 y células HeLa.
Tradicionalmente, cuando estas células se han usado para la
replicación de adenovirus, se han usado en placas de cultivo. Estos
métodos generalmente soportan la replicación de adenovirus sensible
a temperatura a niveles que son uno o dos logaritmos menores que
para adenovirus de tipo silvestre.
En consecuencia, es preferible emplear técnicas
de cultivo que permitan un aumento en la densidad de siembra. Están
disponibles variantes de células 293 y de células HeLa que se han
adaptado a cultivo en suspensión. Se prefiere HeLa por razones de
crecimiento celular, viabilidad y morfología en suspensión. Estas
células se pueden cultivar a densidad suficiente (2 x 10^{6} por
ml) para compensar la menor tasa de replicación de la cepa sensible
a temperatura de adenovirus. Una vez establecidas se infectan las
células con el virus y se cultivan a la temperatura permisiva
durante un periodo suficiente; generalmente 3-7
días y típicamente aproximadamente 5 días.
La filtración de flujo tangencial es una técnica
usada en la técnica para procesar grandes cantidades de células de
mamífero con el objetivo de perfundir, concentrar y recolectar las
mismas. Véase, por ejemplo, Dorin et al., Biotechnol. Prog.
6: 494, 1990; Maiorella et al., Biotechnol. Bioeng. 37: 121,
1991. Se recomienda que esta técnica se use con cultivos en
suspensión para la preparación de virus auxiliar para el uso en
esta invención. Las células HeLa S3 soportan fuerzas de cizalla de
750-1500 s^{-1}, permitiendo la concentración de
las células y diafiltración de medio consumido.
Se recolecta el virus del cultivo del medio
consumido o por microfluidización de las células. El nivel de virus
auxiliar producido en el cultivo es típicamente al menos 10^{7}
Ul/ml y preferiblemente al menos aproximadamente 3 x 10^{7}
Ul/ml.
El virus auxiliar preparado de acuerdo con la
anterior descripción se puede usar directamente para infectar
células hospedadoras usadas para la replicación de rAAV. Más
habitualmente se aísla y concentra el virus antes del uso. Los
métodos actuales para purificar y concentrar virus auxiliar
típicamente implican gradientes isopícnicos de CsCl. Este método
requiere tiempo y trabajo, requiere numerosas etapas de
procesamiento abierto y es difícil de aumentar de escala. En lugar
de ello se recomienda la purificación por cromatografía. Se remite
el lector generalmente a Prior et al., Pharmaceut. Technol.
19: 30, 1995; y Huyghe et al., Human Gene Therapy 6: 1403,
1995. La cromatografía de intercambio aniónico se prefiere
particularmente para el aislamiento de cepas sensibles a
temperatura de adenovirus, especialmente en una resina de
polietilenimina usando un gradiente continuo de NaCl a pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Como con el virus auxiliar, con propósitos de
ilustración es conveniente dividir la discusión de la producción y
purificación de AAV en etapas "aguas arriba" y "aguas
abajo" del proceso; refiriéndose el proceso "aguas arriba"
generalmente a la producción de AAV en células hospedadoras
adecuadas y liberación del virus de las células para producir una
preparación "sin procesar" de AAV. El procesamiento "aguas
abajo" se puede emplear para purificar la preparación de AAV
(por ejemplo, para aislar AAV de proteínas celulares y/u otros
contaminantes).
En aspectos preferidos de la presente invención,
los procesamientos aguas arriba y aguas abajo de AAV se realizan de
una manera diseñada para reducir y/o eliminar sustancialmente
proteínas celulares contaminantes, así como cualquier virus
auxiliar contaminante (por ejemplo, Ad) o proteínas de virus
auxiliar, cualquiera de los cuales podría contribuir a la
provocación de una respuesta inmune si están presentes en niveles
considerables en la preparación final de vector de rAAV que se
tiene que usar para transferencia génica.
Las siguientes secciones describen, con
propósitos de ilustración, técnicas que se pueden emplear para la
producción de AAV.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede producir vector de AAV a partir de una
línea celular de mamífero que contiene los genes de empaquetamiento
de AAV necesarios (por ejemplo, un gen rep y cap de
AAV); un pro-vector de AAV recombinante (rAAV) que
comprende un polinucleótido heterólogo no-AAV
flanqueado por al menos una repetición terminal invertida de AAV
(ITR) y un virus auxiliar para AAV (por ejemplo, un adenovirus).
Estos componentes se pueden introducir en la célula en una
diversidad de configuraciones. Ya que el AAV se puede replicar y
empaquetar en cualquiera de una diversidad de células de mamífero,
existe un gran número de líneas celulares que se pueden modificar y
emplear para la producción de AAV.
A modo de ilustración se puede producir vector
de AAV a partir de una línea celular, tal como "C12" (como se
describe por K. R. Clark et al., Gene Therapy, 3:
1124-1132, 1996) o la línea "C137.5" (descrita
en una solicitud en trámite junto con la presente del mismo
solicitante por Targeted Genetics Corporation, J. Allen et
al., documento WO 96/17947), que se ha modificado por
ingeniería para contener una construcción rep y/o cap,
así como una construcción de vector. Opcionalmente, se puede
introducir por transfección en una línea celular tal como C12 o
c137 que contiene una construcción rep y/o cap un
plásmido que contiene una construcción de vector, tal como
ptgAAV-CF. O se puede introducir por transfección
en una célula un plásmido que contiene rep y cap, tal
como pRS5, así como un plásmido que contiene una construcción de
vector. La célula se puede infectar con Adenovirus o transfectar
con ADN que contiene genes de adenovirus.
Se puede generar una diversidad de tales células
"productoras" de AAV, como se describe en las referencias
citadas en este documento y en la técnica.
Las células productoras de AAV se pueden
cultivar en condiciones (incluyendo medio, temperatura y similares)
que son generalmente adecuadas para el cultivo de células de
mamífero, que también son generalmente permisivas para la
replicación de AAV. Por ejemplo, el medio de suspensión DMEM/F12 se
prefiere para el cultivo de células y el medio DMEM solo se prefiere
para la producción de vector de AAV. Como se conoce en la técnica,
algunos tipos celulares y líneas celulares tienden a ser
dependientes de unión, mientras otros son capaces de desarrollarse
en suspensión; y muchas células dependientes de unión también pueden
"adaptarse" al cultivo en suspensión ciclando las células en
condiciones de suspensión como un medio de enriquecimiento y
finalmente seleccionando las variantes que son capaces de cultivo en
suspensión. En consecuencia, el cultivo de células para producción
de AAV se puede llevar a cabo en cualquiera de una diversidad de
recipientes, dependiendo en parte de si la línea celular productora
seleccionada es relativamente dependiente de unión o está adaptada a
suspensión. Tales recipientes para el cultivo de células
dependientes de unión incluyen, por ejemplo, matraces de cultivo
tisular, frascos rotativos, microsoportes y biorreactores (tales
como biorreactores de fibra hueca, de lecho cargado o de lecho
fluidizado). Los recipientes para líneas celulares de mamífero
adaptadas a suspensión incluyen, por ejemplo, matraces rotativos,
reactores de tanque y fermentadores de elevación de aire.
La replicación de AAV se desarrolla durante un
periodo de tiempo así como hasta un punto en el ciclo de
crecimiento en el que la producción viral es óptima,
preferiblemente fase logarítmica de crecimiento de medio a tardío
(típicamente de uno a tres días), tiempo después del cual las
partículas de virus se recolectan del sobrenadante de cultivo.
La filtración de flujo tangencial (TFF) se puede
emplear beneficiosamente para el procesamiento y la recolección de
grandes volúmenes de células. La TFF se puede usar para perfundir,
concentrar y recoger células animales. Por ejemplo, la TFF se puede
usar para procesar células en condiciones de flujo laminar a
velocidades medias de cizalla de pared hasta 3000 por segundo
(véase, por ejemplo, Maiorella, B., et al. Biotechnology and
Bioengineering, 37: 121-126, 1991). La concentración
a gran escala de virus usando ultrafiltración TFF se ha descrito
por R. Paul et al. Human Gene Therapy, 4:
609-615, 1993.
A continuación se describen etapas ilustrativas
de producción que emplean tales técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito previamente, sería
particularmente ventajoso obtener preparaciones de AAV que estén
sustancialmente libres de partículas de virus auxiliar (tales como
partículas de Ad). Adicionalmente, las preparaciones de vector de
AAV estarán también preferiblemente sustancialmente libres de virus
auxiliar y proteínas celulares (que también pueden ser
inmunogénicas). Sin embargo, existe un conjunto adicional de
restricciones que influye en la idoneidad de técnicas para
producción de AAV. Concretamente, para ser particularmente útiles
para la producción de AAV para terapia génica, lo más deseable para
las técnicas es que sean "graduables", es decir, aplicables
junto con dispositivos y procedimientos de fabricación a gran
escala. Este último conjunto de restricciones reduce o elimina
eficazmente la utilidad de técnicas convencionales disponibles
tales como separación con cloruro de cesio (que no es adecuada para
procedimientos de preparación a gran escala).
Preferiblemente, las partículas de rAAV se
purifican además por procedimientos cromatográficos de intercambio
iónico que contrastan con diversos procedimientos mencionados en la
técnica para la purificación potencial de, por ejemplo, AAV o Ad.
En particular, tales procedimientos como se describen en la técnica
típicamente emplean un solo tipo de separación iónica, en ocasiones
en combinación con otras clases de procedimientos cromatográficos
(véase, por ejemplo, K. Tamayose et al., Human Gene Therapy
7: 507-513 (1996) y el documento WO 96/27677, 12 de
sept. de 1996). Sin embargo, en el caso de producción de AAV, es
particularmente eficaz una combinación de cromatografía de
intercambio iónico opuesta secuencial para la generación de
preparaciones de AAV que están sustancialmente libres de partículas
y proteínas de virus auxiliar, así como proteínas celulares. Una
combinación de ambos intercambios iónicos opuestos es
particularmente eficaz para eliminar todos los diversos
contaminantes de partículas y proteínas que típicamente se producen
en la generación de preparaciones de vector de AAV.
Se puede emplear cualquiera de una diversidad de
resinas de intercambio catiónico y aniónico junto con estos
procedimientos, cuyas propiedades fundamentales son la
disponibilidad de grupos cargados negativamente y positivamente,
respectivamente, a los que se puede unir AAV al menos en cierto
grado (más preferiblemente en un grado que difiere sustancialmente
de la afinidad de unión relativa de uno o más de los contaminantes
que se han mencionado anteriormente, es decir, partículas y
proteínas de Ad, así como proteínas celulares de mamífero). Sin
desear quedar ligado a la teoría, se cree que la etapa de
intercambio aniónico es particularmente eficaz para separar AAV de
adenovirus; mientras que se cree ambas etapas (pero especialmente
la etapa de intercambio catiónico) son particularmente eficaces
para separar AAV de proteínas celulares. También se ha empleado
intercambio aniónico seguido de filtración de flujo tangencial,
como se describe e ilustra a continuación. Como se describe más
adelante adicionalmente, se ha encontrado que las preparaciones de
AAV se pueden concentrar en gran medida mediante cromatografía en
sulfato de heparina.
A modo de ilustración se puede cargar un lisado
aclarado de AAV como se ha descrito anteriormente en una columna de
intercambio aniónico cargada positivamente, tal como una resina
amino o imino cargada con N (por ejemplo, POROS 50 PI o cualquier
DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria, o resina basada en PEI)
o una columna de intercambio catiónico cargada negativamente (tal
como HS, SP, CM o cualquier resina catiónica basada en sulfo, fosfo
o carboxi). La columna se puede lavar con un tampón (tal como
tampón de cromatografía A/TMEG). Se puede eluir la columna con un
gradiente de concentración creciente de NaCl y las fracciones se
pueden recoger y ensayar para la presencia de AAV y/o
contaminantes.
Se pueden usar otros procedimientos en lugar de
o, preferiblemente, adicionalmente a los procedimientos de
intercambio aniónico y catiónico que se han descrito anteriormente,
basados en asociaciones intermoleculares mediadas por rasgos
distintos a la carga como se conoce en la técnica. Tales
procedimientos diferentes incluyen asociaciones intermoleculares
basadas en pares de ligando-receptor (tales como
interacciones anticuerpo-antígeno o
lectina-carbohidrato), así como separaciones basadas
en otros atributos de las moléculas, tales como cromatografía de
tamizado molecular basada en tamaño y/o forma. Para poner sólo un
ejemplo, se puede cargar la preparación filtrada o parcialmente
purificada de AAV en una columna que contenga un anticuerpo
específico para AAV. Esta columna puede unir el AAV. Se puede
aclarar la columna con tampón para retirar proteínas contaminantes
y luego eluirse con un gradiente o etapa de concentración creciente
de NaCl y las fracciones se pueden recoger. Alternativamente, una
columna de este tipo se puede eluir con un tampón de pH diferente
al del tampón de carga.
Se pueden identificar los picos de AAV y
adenovirus en las fracciones mediante ensayos de infectividad o
mediante hibridación de ácido nucleico o inmunoensayos. Los picos
se pueden combinar y la combinación se puede diluir o dializar o
diafiltrar con un tampón (por ejemplo, TMEG o equivalente) para
reducir la concentración de sal.
Esta combinación se puede inyectar en una
columna de intercambio aniónico cargada positivamente y/o una
columna de intercambio catiónico cargada negativamente (tales como
las que se han mencionado anteriormente). Se puede lavar la columna
con un tampón (tal como tampón de cromatografía A/TMEG). La columna
se puede eluir con un gradiente de concentración creciente de NaCl
y las fracciones se pueden recoger. Se pueden identificar los picos
de AAV y adenovirus en las fracciones mediante un ensayo de
infectividad o mediante hibridación de ácido nucleico o
inmunoensayos. Los picos se pueden combinar basándose en los
resultados de cualquiera de estos ensayos.
La combinación de fracciones que contienen AAV
eluidas de una columna de intercambio aniónico como se ha descrito
anteriormente se puede concentrar y purificar mediante filtración
de flujo tangencial (TFF), por ejemplo, en un Ultrasette de Filtron
o unidad Pellicon de Millipore. Una membrana de límite de peso
molecular adecuado (tal como un límite de 100.000 o 300.000) está
compuesta típicamente por un polímero tal como celulosa regenerada o
polietersulfona. La preparación se filtra a través de la membrana y
el producto se retiene. El material retenido se puede diafiltrar
usando la membrana con lavados sucesivos de un tampón adecuado tal
como Solución Salina Equilibrada de Ringer + glicerol al 5%. La
muestra final está altamente enriquecida para el producto y se
puede filtrar a esterilidad a través de un filtro de 0,2 \mu y
almacenar para el uso.
En la purificación y concentración de AAV con
filtración de flujo tangencial de material después de la columna de
intercambio aniónico, la membrana de límite de peso molecular
300.000 ha dado como resultado rendimientos mayores de unidades
replicativas que la membrana de límite de peso molecular
100.000.
Una etapa adicional que se puede emplear para la
retirada de adenovirus, si se desea, implica tratar la combinación
de eluido con una etapa de inactivación térmica (como se describe
en este documento) y después filtración (por ejemplo, antes de
someter la preparación a TFF). Sin embargo, se ha encontrado que el
procedimiento "intercambio aniónico a TFF" que se ha descrito
anteriormente dio como resultado una preparación de AAV que estaba
libre de adenovirus detectable y dio como resultado mejores
rendimientos de AAV purificado.
A continuación se describen etapas ilustrativas
de producción que emplean tales técnicas.
La anterior descripción proporciona, entre
otros, métodos para generar preparaciones con título alto de
vectores de AAV recombinante que están sustancialmente libres de
virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus) y proteínas celulares.
Los ejemplos presentados a continuación se
proporcionan como una guía adicional para el especialista en la
técnica y no pretenden ser limitantes de ninguna manera.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de transferencia por ranuras de ADN de
rAAV se llevó a cabo de la siguiente manera. Se digirieron
alícuotas de muestras con nucleasa para retirar el ADN
desencapsidado. Después las muestras se desnaturalizaron en NaOH
0,4 M, EDTA 10 mM con 1,0 \mug/ml de ADN de esperma de salmón a
65ºC. Se diluyeron y filtraron muestras y patrones de rAAV en
membranas de nailon usando un colector de transferencia por ranuras
y se lavaron con NaOH 0,4 M. El filtro se hibridó con un fragmento
de restricción de ADNc de CFTR humano marcado con ^{32}P. Esta
sonda detecta un fragmento de aproximadamente 1,5 kb del vector de
AAVCF (correspondiente al fragmento de EcoRI de 1,488 kb
predicho).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de infectividad de microtitulación se
llevó a cabo como se ha descrito previamente. Atkinson et
al. (1988) Nucleic Acids Research 26(11):
2821-2823. En resumen, se llevó a cabo un ensayo de
infectividad de microtitulación de alto rendimiento para medir
virus infeccioso de la siguiente manera. Se inocularon alícuotas
(10 \mul) de sobrenadantes libres de células diluidos en serie en
células HeLa clon 37 cultivadas en placas de microtitulación de 96
pocillos. Después de tres días, las células infectadas se trataron
y lisaron con una solución de desnaturalización (adición de
1/10^{a} de volumen de NaOH 4,0 M, 10 \mul/ml de ADN de esperma
de salmón y EDTA 100 mM). El lisado se transfirió a una placa
Silent Monitor BiodyneB (Pall) y filtró al vacío a la membrana de
nylon. La membrana se lavó, desnaturalizó, hibridó con un fragmento
de restricción de ADNc de CFTR humano marcado con ^{32}P. Esta
sonda detecta un fragmento de aproximadamente 1,5 kb del vector de
AAVCF (correspondiente al fragmento de EcoRI de 1,488 kb predicho).
Se cuantificó la replicación de vector en relación con una banda de
CFTR genómica endógena y se expresa como unidades de replicación.
Una unidad de replicación (RU) se define como una intensidad de
señal equivalente a la de la banda de CFTR genómica endógena que es
aproximadamente 1,8 kb. Se usó regresión lineal de patrones de
vector conocido diluido en serie para extrapolar y calcular la
concentración de vector en muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Tablas 1 y 2 proporcionan concentraciones de
componentes (en mg/l) de medio adecuado para cultivar células y
producir rAAV (espacios en blanco indican concentración nula).
Generalmente, es preferible tener niveles reducidos de suero. Por
ejemplo, el medio usado en estos experimentos contenía
aproximadamente suero fetal bovino (FBS) al 1%.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células JL14 a aproximadamente 3 x
10^{5} células/ml en un biorreactor de 3 litros y se cultivaron
en 1,5 litros del medio de rAAV mostrado en la Tabla 2. Dos días
después de inocular el medio de cultivo en el biorreactor con
células JL14, el biorreactor se perfundió con medio fresco,
empezando con 0,4 volúmenes por día, doblando después esta cantidad
cada 24 horas a partir de entonces. Después de 5 días o cuando la
densidad celular alcanzó 6 x 10^{6} células/ml, se retiraron 3 x
10^{8} células y se cultivaron en condiciones convencionales, es
decir, permitiendo que el pH variara. Las células restantes en el
Biorreactor se concentraron en un volumen de 750 ml de medio de
cultivo y se realizó un intercambio de medio de tres volúmenes con
medio de producción (es decir, medio como en la Tabla 2) a pH 7,2
para intercambiar el medio, para que el volumen final de cultivo
celular fuera de 750 - ml. Se cultivó adenovirus tipo 5 de una
solución madre obtenida de la Colección Americana de Cultivos
Tipo(Manassas, VA). El adenovirus se diluyó en 750 ml de
medio de producción y se añadió a las células (multiplicidad de
infección (MOI) = 10), llevando el volumen final a 1,5 litros. Se
permitió que la infección con adenovirus procediera durante una
hora a 37ºC.
Después de permitir el desarrollo de la
infección, se transfirieron 1 x 10^{5} células a cada uno de 5
matraces rotativos separados. El volumen en los 5 matraces se llevó
a 1,5 litros con medio de producción a pH 6,6, 7,0, 7,2, 7,4 y 7,8,
respectivamente. Los contenidos de los matraces rotativos se
transfirieron a biorreactores separados, los cuales se mantuvieron
después individualmente a pH 6,6, 7,0, 7,2, 7,4 y 7,8. Otros
parámetros del medio de cultivo fueron los siguientes: temperatura
= 37ºC; concentración de oxígeno disuelto (DO_{2}) = 30% y
agitación = 150 rpm.
La temperatura, pH, DO_{2}, densidad celular,
osmolaridad y glucosa/lactato se supervisaron diariamente. Se
recolectaron muestras celulares el día 2 y día 3
post-infección y se lisaron. Los lisados celulares
se ensayaron mediante ensayo de transferencia por ranuras de
partículas resistentes a ADNasa (DRP) y mediante el ensayo de
infectividad de microtitulación.
Las Figuras 1A y 1B son gráficos de barras que
representan los resultados de dos experimentos separados,
expresados como DRP por célula a diversos niveles de pH. Las barras
rellenas representan DRP/célula el día 2
post-infección; las barras sombreadas representan
las DRP/célula el día 3. Las DRP/célula en los cultivos mantenidos
a pH 7,2, pH 7,4 y pH 7,8 disminuyeron espectacularmente del día 2
al día 3 post-infección, mientras que esta
reducción no fue tan pronunciada en el cultivo celular de control.
La densidad celular total no cambió de forma apreciable en estas
condiciones de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
En resumen, se cultivaron células productoras de
AAV en biorreactores. Después las células se infectaron con Ad5 a
MOI = 10 y se inocularon en un medio bajo en suero (véase Tabla 2)
en suspensión en biorreactores de 1,5 litros. Los cultivos se
mantuvieron a diversos niveles elevados de pH (de 7,2 a 8,0).
Después los cultivos se supervisaron diariamente para número de
células, viabilidad, consumo de glucosa, producción de lactato, pH,
osmolaridad y producción de AAV. Como se muestra a continuación,
hubo un aumento en la producción de AAV cuando el pH se elevó a
7,4; asociado a un aumento aún más espectacular del número de
partículas de AAV liberadas al sobrenadante (que aumentó cuando se
aumentó el pH):
En resumen, a medida que se elevó el pH, se
observó un aumento marcado en el número de partículas de AAV
liberadas al sobrenadante y un desplazamiento en el porcentaje de
partículas de sobrenadante: asociadas a células (de prácticamente
todas asociadas a células a pH 7,2 a la mayoría en el sobrenadante
(92%) a pH 8,0).
Para investigar adicionalmente los efectos de pH
en la producción de vector de rAAV, se cultivaron células JL14 en
un biorreactor de perfusión como se ha descrito anteriormente
(usando el medio descrito en la Tabla 1) a una densidad de 10^{7}
células/ml. El cultivo celular se concentró a un volumen de 750 ml
y el medio se intercambió realizando de 3 diavolúmenes. El volumen
total se llevó a 1,5 litros conteniendo el medio de producción
adenovirus a una MOI de 10. Se permitió el desarrollo de la
infección durante una hora.
Después de permitir el desarrollo de la
infección, se transfirieron 1 x 10^{5} células a cada uno de 5
matraces rotativos separados. El volumen en los cinco matraces se
llevó hasta 1,5 litros con medio de producción a pH 7,2, 7,4, 7,6,
7,8 y 8,0 y matraces de control (pH no mantenido al nivel de
partida). Los contenidos de los matraces rotativos se transfirieron
a biorreactores separados, los cuales después se mantuvieron
individualmente a pH 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 y 8,0. Los biorreactores
mantuvieron el pH al nivel establecido \pm 0,05 unidades de pH.
Otros parámetros del medio de cultivo fueron los siguientes:
temperatura = 37ºC; concentración de oxígeno disuelto (DO_{2}) =
30%; y agitación = 150 rpm. Las células y el sobrenadante de
cultivo se recolectaron los días 2 y 3.
Los resultados se muestran en las Figuras 2A y
2B. Las Figuras 2A y 2B son gráficos de barras y representan los
resultados, expresados como DRP totales, de producción de rAAV en
biorreactores mantenidos a diversos niveles de pH. Los porcentajes
sobre cada barra son porcentajes de DRP totales en el lisado
celular. La parte rellena de cada barra representa las DRP en
lisados celulares, mientras que la parte sombreada de cada barra
representa las DRP en el medio de cultivo. El día 2
post-infección, el 29% de las DRP totales estaban
en el medio de cultivo del cultivo mantenido a pH 8,0, mientras que
el día 3 post-infección, el porcentaje de DRP
totales en el medio de cultivo aumentó al 92%. El día 3
post-infección, el porcentaje de DRP totales en el
medio de cultivo fue del 67% a pH 7,4, del 82% a pH 7,6, del 73% a
pH 7,8 y del 92% a pH 8,0. Los cultivos mantenidos a pH 7,2 no
produjeron ninguna DRP en el medio de cultivo celular en este
experimento.
El día 2 y día 3 post-infección
los lisados celulares y el medio de cultivo de los biorreactores
mantenidos a pH 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 y 8,0 se ensayaron para unidades
de replicación (RU) usando un ensayo de infectividad. Los datos se
muestran en las Figuras 3A y 3B. La densidad celular total no cambió
de forma apreciable en estas condiciones de cultivo.
Las Figuras 3A y 3B son gráficos de barras que
representan las unidades de replicación (RU) totales ensayadas el
día 2 (3A) y día 3 (3B) post-infección en el medio
de cultivo (parte sombreada de cada barra) y lisados celulares
(parte rellena de cada barra) cuando los cultivos se mantuvieron a
los niveles de pH indicados. Los porcentajes sobre cada barra
indican el porcentaje de RU totales en el lisado celular. Estos
datos demuestran que las partículas de rAAV liberadas al medio de
cultivo celular son funcionales en un ensayo de infectividad.
La Figura 4 es un gráfico de barras que
representa la proporción partícula:infectividad (P/I) de partículas
de rAAV recolectadas de lisados celulares (parte rellena de cada
barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada barra)
el día 3 post-infección de biorreactores mantenidos
a los niveles de pH indicados. Estos datos indican que la mayoría
del vector de rAAV liberado al medio de cultivo es infeccioso.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar los efectos de la osmolalidad
inicial del medio de cultivo en la liberación de rAAV al medio de
cultivo celular, se cultivaron células JL14 en biorreactores y se
infectaron con adenovirus esencialmente como se ha descrito en el
Ejemplo 2. La osmolalidad inicial en los biorreactores individuales
fue de 130, 200, 300, 400 y 500 mOsm, respectivamente. En cada
reactor, el pH se mantuvo a pH 8,0 (\pm 0,05); temperatura =
37ºC; DO_{2} = 30%; y agitación = 150 rpm. Los días 2, 3 y 4
post-infección se recogieron los lisados celulares y
el medio de cultivo celular y se ensayaron para producción de
vector de rAAV.
Los resultados se muestran en las Figuras
5-7.
Las Figuras 5A, 5B y 5C son gráficos de barras
que representan las DRP totales en lisados celulares (parte rellena
de cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada
barra) el día 2 (5A), día 3 (5B) y día 4 (5C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular contenía la osmolalidad inicial indicada. Los
porcentajes sobre cada barra indican el porcentaje de DRP totales
en el lisado celular. Estos datos muestran que cuando el medio de
cultivo celular tiene una osmolalidad inicial de 300 mOsm, el 41%,
el 59% y el 80% de las DRP totales están en el medio de cultivo
celular los días 2, 3 y 4, respectivamente. Una osmolalidad inicial
de medio de cultivo celular de 300 mOsm dio el máximo porcentaje de
vector de rAAV total en el medio de cultivo celular, comparado con
otras osmolalidades iniciales ensayadas. La densidad celular total
no cambió de forma apreciable en estas condiciones de cultivo.
Las Figuras 6A, 6B y 6C son gráficos de barras
que representan las RU totales en lisados celulares (parte rellena
de cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada
barra) el día 2 (6A), día 3 (6B) y día 4 (6C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular contenía la osmolalidad inicial indicada. Los
porcentajes sobre cada barra indican el porcentaje de RU totales en
los lisados celulares. Estos datos indican que el vector de rAAV
liberado en el medio de cultivo es infeccioso.
La Figura 7 es un gráfico de barras que
representa la proporción P/I de partículas de rAAV en los medios de
cultivo celular los días 3 y 4 de cultivos de biorreactores con las
osmolalidades iniciales indicadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células JL14 en biorreactores y se
infectaron con adenovirus esencialmente domo se ha descrito en el
Ejemplo 2. Las células se transfirieron a biorreactores mantenidos
individualmente a 31ºC, 34ºC, 37ºC, 39ºC y 42ºC, respectivamente.
Estas temperaturas se mantuvieron \pm 0,5ºC. El pH en cada
reactor se mantuvo a 8,0 (\pm 0,05); agitación = 150 rpm; DO_{2}
= 30%. Los días 2, 3 y 4 post-infección se
ensayaron los lisados celulares y el medio de cultivo celular para
partículas de rAAV.
Los resultados se muestran en las Figuras 8 y
9.
Las Figuras 8A-C son gráficos de
barras que representan las DRP totales en lisados celulares (parte
rellena de cada barra) y medios de cultivo celular (parte sombreada
de cada barra) el día 2 (8A), día 3 (8B) y día 4 (8C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular se mantuvo a la temperatura indicada. Los
porcentajes sobre cada barra indican el porcentaje de DPR totales
en el lisado celular. Los datos muestran que cuando el medio de
cultivo se mantuvo a 39ºC, el 66%, el 67% y el 57% de las DRP
totales se observaron en el medio de cultivo celular los días 2, 3 y
4, respectivamente. Adicionalmente, los datos indican que se
encontró un porcentaje mayor de DPR en el medio de cultivo celular
cuando el medio de cultivo se mantuvo a 39ºC, comparado con 37ºC o
42ºC.
Las Figuras 9A, 9B y 9C son gráficos de barras
que representan las RU totales en lisados celulares (parte rellena
de cada barra) y medio de cultivo celular (parte sombreada de cada
barra) el día 2 (9A), día 3 (9B) y día 4 (9C)
post-infección en biorreactores en los que el medio
de cultivo celular se mantuvo a la temperatura indicada. Los
porcentajes sobre cada barra en la Figura 9A indican el porcentaje
de RU totales en el medio de cultivo celular. Los porcentajes sobra
cada barra en la Figura 9A indican el porcentaje de RU totales en
el lisado celular. Estos datos muestran que cuando el medio de
cultivo se mantuvo a 39ºC, el 80%, el 97% y el 98% de RU totales se
observaron en el medio de cultivo celular los días 2, 3 y 4,
respectivamente. La densidad celular total no cambió de forma
apreciable en estas condiciones de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células JL14 en biorreactores y se
infectaron con adenovirus esencialmente como se ha descrito en el
Ejemplo 2. Las células se transfirieron a biorreactores que
contenían diversos medios, de siguiente la manera: (1) DMEM; (2)
DMEM + 4 g/litro de glucosa; (3) DMEM + 4 g/litro de glucosa +
glutamina 4 mM; (4) DMEM + 4 g/litro de glucosa + glutamina 4 mM +
aminoácidos + vitaminas ("completo"); (5) 2X DMEM. Todas las
osmolalidades de partida se ajustaron a 285-300
mOsm. Otros parámetros fueron los siguientes: temperatura mantenida
a 39ºC; pH mantenido a 8,0; DO_{2} = 30%; y agitación = 150 rpm.
Tres días post-infección, el sobrenadante de
cultivo celular se ensayó para partículas de vector de rAAV.
Los resultados se muestran en las Figuras 10, 11
y 12.
La Figura 10 es un gráfico de barras que
representa las DRP totales en el medio de cultivo tres días
post-infección en cultivos desarrollados en los
diversos medios indicados.
La Figura 11 es un gráfico de barras que
representa las RU en el medio de cultivo tres días
post-infección en cultivos desarrollados en los
diversos medios indicados.
La Figura 12 es un gráfico de barras que
representa la proporción P/I de partículas virales en el medio de
cultivo celular cuando los cultivos se desarrollaron en los
diversos medios indicados.
Aunque la anterior invención se ha descrito con
cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de
claridad de comprensión, será evidente para los especialistas en la
técnica que se practicarán ciertos cambios y modificaciones. Por lo
tanto, la descripción y ejemplos no se deben interpretar como
limitantes del alcance de la invención, que está definido por las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (28)
1. Un método para generar una población de
partículas de virus, que comprende las etapas de:
(a) incubar una célula productora en un medio de
cultivo celular en condiciones que comprenden una condición que
promueve la liberación de partículas de virus, por lo que las
partículas de virus se liberan de la célula productora al medio de
cultivo sin lisar las células, en el que la condición que promueve
la liberación de partículas de virus:
- (i)
- comprende una o más condiciones seleccionadas de osmolalidad, temperatura, concentración de un ión dado, densidad celular, concentración de oxígeno disuelto, concentración de glucosa, concentración de aminoácido y una condición que promueve la sincronización del ciclo celular y
- (ii)
- comprende pH y
(b) recolectar las partículas virales del medio
de cultivo celular sin lisar las células, obteniendo de este modo
una población de partículas virales;
en el que el virus es un virus
adeno-asociado (MV).
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el virus es un virus adeno-asociado recombinante
(rAAV) y en el que la célula productora comprende:
(i) uno o más genes de empaquetamiento de AAV,
donde cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica
una proteína de replicación o encapsidación de AAV;
(ii) un vector de AAV recombinante (rAAV) que
comprende un polinucleótido heterólogo no-AAV
flanqueado por al menos una repetición terminal invertida de AAV
(ITR) y
(iii) función de virus auxiliar para AAV.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que la condición que promueve la liberación de partículas de virus
es una combinación de osmolalidad y pH, temperatura y pH u
osmolalidad, temperatura y pH.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
la condición que promueve la liberación de partículas de virus es
una combinación de osmolalidad y pH.
5. El método de la reivindicación 3, en el que
la condición que promueve la liberación de partículas de virus es
una combinación de temperatura y pH.
6. El método de la reivindicación 3, en el que
la condición que promueve la liberación de partículas de virus es
una combinación de osmolalidad, temperatura y pH.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que el pH es de 7,4 a 8,0.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
el pH es 8,0.
9. El método de la reivindicación 7 o 18, en el
que el pH inicial del medio de cultivo es 8,00.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que el pH del medio de cultivo se
supervisa durante el cultivo y se mantiene en 8,00.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 3, 4 y 6 a 10, en el que la osmolalidad del medio
de cultivo se supervisa durante el cultivo y se mantiene de 200
mOsm a 400 mOsm.
12. El método de la reivindicación 11, en el
que la osmolalidad del medio de cultivo celular es 300 mOsm.
13. El método de la reivindicación 11 6 12, en
el que la osmolalidad inicial del cultivo celular es 300 mOsm.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que la osmolalidad del medio de
cultivo celular se ajusta usando NaCl u otra sal, manitol o
glucosa.
15. El método de la reivindicación 14, en el
que la osmolalidad del medio de cultivo celular se ajusta usando
NaCl.
16. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 y 5 a 15, en el que la temperatura es 37ºC a
40ºC.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
la temperatura es 39ºC.
18. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 17, en el que las células productoras se
cultivan durante 48 a 96 horas después de la introducción de
función de virus auxiliar.
19. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 18, en el que la función de virus auxiliar se
proporciona por el virus auxiliar.
20. Un método para generar una población de
partículas de rAAV de acuerdo con la reivindicación 19, en el que
dicho virus auxiliar es un adenovirus.
21. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 20, que comprende adicionalmente las etapas
de:
(c) cromatografiar el medio de cultivo de la
célula productora de AAV en al menos una resina de intercambio
aniónico cargada positivamente y
(d) purificar las fracciones cromatográficas
que contienen partículas de rAAV de la etapa (c) por cromatografía
de intercambio catiónico o filtración de flujo tangencial para
generar una población purificada de partículas de vector de
rAAV.
22. El método de la reivindicación 21, en el que
la etapa (d) es cromatografía de intercambio catiónico.
23. El método de la reivindicación 21, en el que
la etapa (d) es filtración de flujo tangencial.
24. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 20, que comprende adicionalmente las etapas
de:
(c) cromatografiar el medio de cultivo de célula
productora de AAV en una resina de intercambio catiónico;
(d) purificar las fracciones cromatográficas que
contienen partículas de rAAV de la etapa (c) mediante cromatografía
de intercambio aniónico y
(e) purificar las fracciones cromatográficas que
contienen partículas de rAAV de la etapa (d) mediante cromatografía
de sulfato de heparina para generar una población purificada de
partículas de vector de rAAV.
25. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 20, que comprende adicionalmente las etapas de
cromatografiar el medio de cultivo de la célula productora de AAV
en una pluralidad de resinas de intercambio iónico que comprenden
al menos una resina de intercambio aniónico cargada positivamente y
al menos una resina de intercambio catiónico cargada negativamente
para generar una población purificada de partículas de vector de
rAAV.
26. Un método para generar una población de
partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 25, en el que dicho vector de rAAV comprende
un polinucleótido heterólogo no-AAV flanqueado por
dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y/o en el que
dicha célula productora de AAV comprende al menos un gen de
empaquetamiento de AAV que está integrado de forma estable en el
genoma de dicha célula productora de AAV y/o en el que dicha célula
productora de AAV comprende un gen rep de AAV y un gen
cap de AAV.
27. Un método para generar una población de
partículas de rAAV de acuerdo con la reivindicación 26, en el que
dicho gen rep de AAV y gen cap de AAV están de forma
estable integrados en el genoma de dicha célula productora de
AAV.
28. Un método para generar una población de
partículas de rAAV de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 27, en el que la célula productora es una
línea celular de mamífero dependiente de unión o una línea celular
de mamífero adaptada a suspensión.
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