JP4472182B2 - 放出された組換えaavベクターの高力価のヘルパーを含まない調製物を生成するための方法 - Google Patents
放出された組換えaavベクターの高力価のヘルパーを含まない調製物を生成するための方法 Download PDFInfo
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Description
(連邦政府によって援助された研究のもとでなされた発明の権利の陳述)
本発明は、部分的に、国立保健研究所(NIH)の助成金R44DK4460によって援助された研究の間になされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、一般的に、遺伝子移入に使用され得る、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターおよびその調製物の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞溶解することなくプロデューサー細胞からウイルス粒子を放出することによる、ヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)および細胞性タンパク質を実質的に含まない、組換えAAVベクターの高力価の調製物の生成方法に関する。
【0003】
(発明の背景)
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、遺伝子治療のためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型に感染する。しかし、アデノ随伴ウイルスは、形質転換性でなく、そして、いずれのヒト疾患の病因とも関係していない。DNAのレシピエント宿主細胞への導入は、一般的に、その細胞の正常の代謝を妨げることなく、そのDNAの長時間の残留および発現をもたらす。
【0004】
遺伝子移入、特にヒト遺伝子治療における使用のための組換えAAVベクター調製物の、所望される特徴は、少なくとも3つ存在する。第1に、このベクターが、標的組織における有効な集団の細胞に形質導入するために、十分に高い力価で生成されるべきであることが、好ましい。インビボでの遺伝子治療は、代表的には、大多数のベクター粒子を必要とする。例えば、いくつかの処置は、108を超える粒子を必要とし得、そして気道への直接的送達による嚢胞性線維症の処置には、1010を超える粒子を必要とし得る。第2に、このベクター調製物が、複製コンピテントなAAV(すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下において複製し得る、表現型としての野生型AAV)を、本質的に含まないべきであることが、好ましい。第3に、このrAAVベクター調製物は、全体として、他のウイルス(例えば、AAV生成に使用されるヘルパーウイルス)ならびにヘルパーウイルスタンパク質および細胞性タンパク質、および脂質および糖質のような他の成分を本質的に含まず、その結果、遺伝子治療の状況において、免疫応答を生じる危険性を、最小化するか、または除去することが、好ましい。この後者の点は、AAVの状況において特に重要である。なぜならAAVは、AAV生成のプロセスの間に、有効に複製されて、そしてパッケージングされるために、ヘルパーウイルス(代表的にはアデノウイルス)との同時感染またはヘルパーウイルス機能のその他の提供が必要である、「ヘルパー依存性」ウイルスであるからである。さらに、アデノウイルスは、遺伝子治療適用の状況において、宿主免疫応答を生じることが観察されている(例えば、Byrnesら、Neuroscience 66:1015、1995;McCoyら、Human Gene Therapy 6:1553、1995;およびBarrら、Gene Therapy 2:151、1995を参照のこと)。本発明の方法は、以下に詳細に記載および説明されるように、rAAVベクター調製物のこれらおよび他の所望の特徴に取り組む。
【0005】
AAVウイルス学、および遺伝学の一般的な総説は、他で利用可能である。読者は、特にCarter、「Handbook of Parvoviruses」、第I巻、169〜228ページ(1989)、およびBerns、「Virology」、1743〜1764ページ、Raven Press、(1990)を参照し得る。AAVは、複製欠損ウイルスであり、このことは、宿主細胞におけるAAVの複製およびパッケージングサイクルを完成するために、AAVがヘルパーウイルスに依存することを意味する。AAV複製を支持し得るヘルパーウイルスは、アデノウイルスによって例示されるが、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスのような他のウイルスを含む。AAVゲノムは、一般的に、パッケージング遺伝子repおよびcap(他の必要な機能は、ヘルパーウイルスおよび宿主細胞からトランスで提供される)を含む。
【0006】
実例として、AAV2血清型の直鎖状ゲノムは、逆方向末端反復(ITR)配列によっていずれかの末端で終結する。ITRの間には、repおよびcap遺伝子を発現するために使用される、3つの転写プロモーターp5、p19、およびp40が存在する(Laughlinら、1979、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5567〜5571)。ITR配列は、シスにおいて必要であり、そして、機能的な複製起点、細胞ゲノムへの組み込み、ならびに宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよびレスキューを提供するのに十分である。repおよびcap遺伝子産物は、ウイルスゲノムの複製およびキャプシド化の機能を、それぞれ提供し、そしてこれらの産物がトランスで存在することで十分である。
【0007】
AAVゲノムは、GCテーリング(Samulskiら、1982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2077〜2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加(Laughlinら、1983、Gene 23:65〜73)、または、直接的な平滑末端の連結(SenanpathyおよびCarter、1984、J.Biol.Chem.、259:4661〜4666)のような手順によって、細菌プラスミド中に導入されてきた。そのようなAAV組換えプラスミドの哺乳動物細胞への、適切なヘルパーウイルスを使用する、トランスフェクションは、全くプラスミド配列を含まないAAVゲノムのレスキューおよび切り出し、レスキューされたゲノムの複製、および子孫の感染性AAV粒子の生成をもたらす。
【0008】
治療目的の異種ポリヌクレオチドを含む組換えAAVベクターは、細菌プラスミド中のAAVコード配列の部分を、異種ポリヌクレオチドで置換することによって、構築され得る。rAAVベクター構築の一般的原理はまた、別に概説されている。例えば、Carter、1992、Current Opinions in Biotechnology、3:533〜539;およびMuzyczka、1992、Curr.Topics in Microbiol.and Immunol.、158:97〜129を参照のこと。AAVのITRは、一般的に保持されている。なぜなら、ベクターのパッケージングは、ITRがシスで存在することを必要とするからである。しかし、AAVゲノムの他のエレメント、特に、1つ以上のパッケージング遺伝子は、省略され得る。ベクタープラスミドは、省略されたパッケージング遺伝子を、代替的な供給源を介してトランスで供給することにより、AAV粒子中にパッケージングされ得る。多数の刊行物が、rAAVベクターを生成するアプローチを記載する。Ratschinら、Mol.Cell.Biol.4:2072(1984);Hermonatら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6466(1984);Tratschinら、Mol.Cell.Biol.5:3251(1985);McLaughlinら、J.Virol.62:1963(1988);Lebkowskiら、1988 Mol.Cell.Biol.7:349(1988)。Samulskiら(J.Virol.、63:3822〜3828、1989);Flotteら、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349(1992);米国特許第5,173,414号;WO95/13365(Targeted Genetics CorporationおよびJohns Hopkins University)および対応する米国特許第5,658,776号(Flotteらによる);WO95/13392(Trempeら);WO96/17947(Targeted Genetics Corporation.J.Allen)。
【0009】
rAAVベクター調製物の高力価は、特に有用であるが、高力価のrAAVの生成(特にラージスケール手順において)が、混入するヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルスすなわち「Ad」)、ヘルパーウイルスタンパク質(例えば、Adタンパク質)、および/または細胞性タンパク質の有意な量を生じ得るので、混入するウイルスおよび/またはウイルス性もしくは細胞性タンパク質を実質的に含まない高力価調製物の生成のために使用され得る、rAAVの拡大縮小可能な生成方法を設計することが特に重要となった。
【0010】
組換えAAVベクターの高力価調製物を生成する方法が、記載されている。国際特許出願PCT/US98/18600は、ヘルパーウイルスでの感染の際にrAAVベクターを生成し得る細胞株の培養;アデノウイルスのようなヘルパーウイルスでの細胞の感染、および細胞の溶解を記載する。AAVおよび他のウイルス産生方法および系がまた、例えば、WO97/09441(PCT/US96/14423);WO97/08298(PCT/US96/13872);WO97/21825(PCT/US96/20777);WO97/06243(PCT/FR96/01064);WO99/11764;Perrinら(1995)Vaccine 13:1244〜1250;Paulら(1993)Human Gene Therapy 4:609〜615;Clarkら(1996)Gene Therapy 3:1124〜1132に記載されている。
【0011】
細胞を溶解しなければ、感知し得る量のAAVがプロデューサー細胞から放出されないという普及している意見に起因して、パッケージング細胞を使用する組換えAAV粒子を生成するために使用される先行技術の方法は、細胞溶解工程を必要とした。例えば、ChiricoおよびTrempe(1998)、J.Viral.Methods 76:31〜41を参照のこと。しかし、細胞溶解物は、インビボでの使用に適切である前に、rAAVベクターから分離されなければならない種々の細胞性成分を含む。
【0012】
本発明の開示は、細胞を溶解することなくプロデューサー細胞から放出されるrAAVベクターの高力価産生を達成する方法を提供し、そしてそのような技術が組換えAAVベクター調製物の大規模産生のために使用され得ることを実証する。
【0013】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【0014】
(発明の要旨)
本発明は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、および細胞性タンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス(AAV)の高力価調製物を生成するための、方法および物質を提供する。この方法は、当該分野において典型的であるような、細胞を能動的に溶解することなく、プロデューサー細胞からのrAAV粒子の放出を包含する。この方法は、以前に記載された産生方法に比べ、明確かつ顕著な利点を提供する。この方法はまた、非溶解性であるウイルスおよび/または一般に放出されないウイルス(すなわち、非出芽ウイルス)に適用可能である。
【0015】
従って、1つの局面において、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子のようなウイルス粒子の集団を産生する方法を提供する。この方法は、以下の工程:a)細胞からのAAV粒子の放出を促進する条件下で、細胞培養培地中でプロデューサー細胞をインキュベートする工程であって、これによりrAAV粒子がプロデューサー細胞から培養培地中に放出される工程、ここで、このプロデューサー細胞は、以下、(i)1つ以上のAAVパッケージング遺伝子であって、ここでこのAAVパッケージング遺伝子の各々は、AAV複製タンパク質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子;(ii)少なくとも1つのAAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する、異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)ベクター;ならびに(iii)AAVのためのヘルパーウイルス、またはAAVのためのヘルパーウイルス機能を含む。次に、放出されたrAAV粒子を、培養培地から、収集(collect)または収集(harvest)し得る。rAAVウイルス粒子の放出を促進する条件は、本明細書において記載され、そしてpH、浸透圧、溶存酸素、富化された培地、および温度が挙げられるが、これらに限定されない。
【0016】
いくつかの実施態様において、この方法はさらに、種々の精製および/または不活性化工程を含む。これらの実施態様のいくつかにおいて、この方法はさらに、以下の工程を包含する:少なくとも1つの陽荷電アニオン交換樹脂および少なくとも1つの陰荷電カチオン交換樹脂を含む複数のイオン交換樹脂において、AAVプロデューサー細胞上清をクロマトグラフして、rAAVベクター粒子の精製された集団を生成する工程、またはアニオン交換樹脂においてAAVプロデューサー細胞上清をクロマトグラフして、その後に、接線流濾過(TFF)する工程。ヘパリン硫酸クロマトグラフィーもまた、使用して、さらにこのウイルスを精製し得る。
【0017】
本発明の方法において、細胞が懸濁中にあるようにか、または細胞の固体支持体への付着を促進する条件下にあるように、細胞培養を行い得る。従って、いくつかの実施態様において、プロデューサー細胞を、組織培養フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、タンクリアクター、ファーメンター、およびバイオリアクター、フラスコストックリアクター、ホローファイバーシステム、充填された(packed bed)リアクター(そして必要に応じてミクロキャリアを使用する)からなる群から選択される容器中で培養される。
【0018】
本発明のいくつかの実施態様において、この方法によって産生された組換えAAVベクター調製物は、複製コンピテントなAAV、ならびにヘルパーウイルスおよび細胞性タンパク質を実質的に含まず、そして細胞性DNAを実質的に含まないrAAVウイルス粒子の精製された集団を生じる。
【0019】
本発明はさらに、本発明の産生方法のいずれかに従って産生される、rAAV粒子の集団を提供する。好ましくは、粒子の集団は、1,000の感染性rAAV粒子あたり、約1未満の感染性アデノウイルス粒子を含み、好ましくは、106rAAVあたり1未満であり、なおより好ましくは、109中に約1未満であり、さらにより好ましくは、1010中に約1未満である。
【0020】
本発明のこれら、および他の実施態様は、下記の記載において概説される。
【0021】
(発明の実施の態様)
本発明者らは、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、ならびに細胞のタンパク質および他の成分を実質的に含まないアデノ随伴ウイルス(AAV)の高力価調製物を産生するための方法を開示した。この方法は、一般的に、プロデューサー細胞を、そのプロデューサー細胞からのrAAV粒子の放出を促進する条件下で培養する工程(これは、一般的に、維持する工程を包含する)を伴う。
【0022】
AAVの分野では、細胞が溶解されない限り、AAVはその細胞から放出されないが、その細胞の核には維持されるということが十分に確証されている。従って、rAAV粒子を産生するために、細胞を溶解しなければならないと広く一般的に考えられている。当該分野の教示とは対照的に、本発明者らは、細胞を溶解することを伴わずにrAAV粒子が細胞から放出され得ること、そしてさらに、種々の制御された環境条件下でプロデューサー細胞を維持することによって、rAAV粒子の放出が増加され得ることを発見した。これらの条件を用いると、以前に獲得されたよりも高い力価でrAAV粒子を産生し得る。本明細書中に記載の条件下で培養された細胞は、細胞あたりでより多いウイルスを産生し、そして培養培地により多いウイルスを放出し、そしてなおさらに重要なことに、細胞内に保持されるAAVより高い感染性を有するAAVの集団を放出し得る。換言すれば、感染性に対するDNAse耐性粒子の比率が、細胞内に保持されるAAVのこの比率と比較して、細胞培養培地に放出されるAAV集団ではより小さくなり得る(例えば、図4を参照のこと)。さらに、溶解が本発明の方法では必須の工程ではないので、rAAV粒子が細胞上清から収集され得、従って、後の必要に応じた精製工程を単純化する。あるいは、溶解もまた実施され得る。
【0023】
いくつかの実施態様では、本発明は、感染性ウイルス粒子の放出または優先的放出の方法を提供する。この感染性粒子の優先的放出は、ウイルス産生の状況において特に重要である。この状況では、非感染性粒子と対立して多数の感染性粒子を含む集団を産生することが非常に所望される。
【0024】
本明細書中に記載の方法および原理は、通常保持される(すなわち、放出されない)多くの他のウイルス(特にアデノウイルス)に適用されることが理解される。AAVを本明細書中で例示する。
【0025】
哺乳動物細胞におけるAAV粒子の産生およびプロセシングのための種々の方法が以下に詳細に記載され、そしてこのような技術の使用の例証を以下の実施例に提供する。本発明の方法によって産生されるrAAV粒子は、遺伝子移入ベクターとして特に有用である。このようなベクターを使用する方法は当該分野において公知であり、そしてそれを本明細書中に記載する必要はない。
【0026】
導入の目的で、宿主細胞または「プロデューサー」細胞を、rAAVベクターの複製およびパッケージングのために使用することは典型的である。そのようなプロデューサー細胞(通常は、哺乳動物宿主細胞)は、一般的に、rAAV産生のために、いくつかの異なるタイプの成分を含むか、またはそれを含むように改変される。第1の成分は、複製し得かつ宿主パッケージング細胞によってベクター粒子中にパッケージングされ得る、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターゲノム(すなわち、「rAAVプロベクター」)である。このrAAVプロベクターは、異種ポリヌクレオチド(または「トランスジーン」)を、通常含む。この異種ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子治療の状況において、別の細胞を遺伝的に改変することが所望される(なぜなら、そのようなトランスジーンのrAAVベクター粒子へのパッケージングは、種々の哺乳動物細胞にそのトランスジーンを送達するために、効率的に使用され得るからである)。このトランスジーンは、好ましくは、AAVベクターの切り出し、複製およびパッケージング、ならびにベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みの間に認識される配列を含む、2つのAAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する。第2の成分は、AAV複製にヘルパー機能を提供し得るヘルパーウイルスである。アデノウイルスが一般的に使用されるが、他のヘルパーウイルスもまた、当該分野において公知であるように使用され得る。あるいは、必要とされるヘルパーウイルス機能は、ヘルパーウイルスから遺伝子的に単離され得、そしてそのコードする遺伝子が、トランスで(in trans)ヘルパーウイルス機能を提供するために使用され得る。AAVベクターエレメントおよびそのヘルパーウイルス(またはヘルパーウイルス機能)は、同時かまたは任意の順番で連続的のいずれかで、その宿主細胞に導入され得る。そのプロデューサー細胞に提供されるべきAAV産生のための最終成分は、複製およびキャプシド形成タンパク質をそれぞれ提供する、AAVのrep遺伝子およびcap遺伝子のような「AAVパッケージング遺伝子」である。AAVパッケージング遺伝子のいくつかの異なるバージョンが、提供され得る(野生型rep−capカセット、ならびにrepおよび/またはcap遺伝子が、ネイティブのプロモーターの制御下に残されたままであり得るか、または異種プロモーターに作動可能に連結され得る、改変repおよび/またはcapカセットを含む)。そのようなAAVパッケージング遺伝子は、当該分野において公知であり、そして以下により詳細に記載されるように、一過的または安定的のいずれかで、宿主パッケージング細胞中に導入され得る。
【0027】
本発明の方法に従って、rAAV粒子は、インタクトな(すなわち、溶解されていない)細胞から、細胞培養培地(「上清」)に放出される。AAV複製、キャプシド形成および放出を許容する条件下で宿主細胞を培養した後、その上清を処理して、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、細胞のタンパク質、そして重要なことに細胞のDNAを実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス(AAV)の高力価調製物を産生し得る。そのような技術を使用する、処理技術および例示的プロトコールの詳細な説明を、以下に提供する。
【0028】
(定義)
「ベクター」は、本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合して、そして細胞へのそのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合物をいう。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【0029】
「AAV」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、そして、そのウイルス自体か、またはその誘導体をいうために使用され得る。この用語は、そうでないことが要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。略語「rAAV」とは、組換えアデノ随伴ウイルスをいい、そしてまた組換えAAVベクター(すなわち、「rAAVベクター」)としてもいう。
【0030】
「rAAVベクター」は、本明細書において使用する場合、AAV起源ではないポリヌクレオチド(すなわち、AAVに対して異種のポリヌクレオチド)配列(代表的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列)を含むAAVベクターをいう。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つ、好ましくは2つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接する。この用語rAAVベクターは、rAAVベクター粒子およびrAAVベクタープラスミドの両方を包含する。
【0031】
「rAAVベクター粒子」または「AAV粒子」とは、少なくとも1つのAAVキャプシドタンパク質(好ましくは、野生型AAVのキャプシドタンパク質の全て)、およびキャプシド形成したrAAVベクターから構成されるウイルス粒子をいう。従って、rAAV粒子の産生は必然的にrAAVベクターの産生を含む。なぜなら、そのようなベクターはrAAV粒子内に含まれているからである。
【0032】
「パッケージング」とは、AAV粒子のアセンブリおよびキャプシド形成を生じる、一連の細胞内事象をいう。
【0033】
AAVの「rep」および「cap」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をいう。これらは、試験された全てのAAV血清型において見出され、そして以下および当該分野において記載されている。AAV repおよびcapは、本明細書においてAAV「パッケージング遺伝子」という。
【0034】
AAVのための「ヘルパーウイルス」とは、AAV(例えば、野生型AAV)が哺乳動物細胞により複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスをいう。AAVについて種々のそのようなヘルパーウイルスが、当該分野において公知であり、これにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)が挙げられる。サブグループCの5型アデノウイルスが最も一般的に使用されるが、このアデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが、公知であり、そしてATCCのような寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)およびエプスタイン−バーウイルス(EBV)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)および仮性狂犬病ウイルス(PRV)が挙げられる;これらもまた、ATCCのような寄託機関から入手可能である。
【0035】
「ヘルパーウイルス機能」とは、AAV複製およびAAVパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノム中にコードされる機能を言う(本明細書中に記載される複製およびパッケージングのための他の要求とともに)。本明細書中に記載される場合、「ヘルパーウイルス機能」は多くの方法で提供され得、その方法は、例えば、ヘルパーウイルスをプロデューサー細胞に提供することによるもの、または必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランス(trans)でプロデューサー細胞に提供することによるものを含む。
【0036】
用語「tsHV」とは、温度感受性ヘルパーウイルスをいう。このウイルスは、AAVの複製およびパッケージングのためにヘルパー機能を提供し得るが、それ自体の複製に関して、温度感受性である(すなわち、このウイルスは、「許容」温度では複製し得るが、「非許容」温度においては、低効率で複製するか、または好ましくは、全く複製しない)。tsHVがAAV複製の補助を提供する能力はまた、温度感受性であり得るが、本発明の使用に好ましいtsHVは、AAVが複製し得るが、tsHVの複製にとっては非許容的な温度で、AAVの複製を効率的に支持する。そのようなtsHVの例を以下に記載する。
【0037】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ウイルス種が向性(trophic)である細胞に送達され得るポリヌクレオチド成分を含むものである。この用語は、ウイルスの複製能力を意味する必要は、全くない。感染性ウイルス粒子を計数するアッセイは、本開示および当該分野において、他の箇所に記載される。ウイルス感染性は、P:I比または全ウイルス粒子対感染ウイルス粒子の比として表現され得る。
【0038】
「複製コンピテント」ウイルス(例えば、複製コンピテントAAV)とは、感染性の野生型表現型ウイルスをいい、そしてまた、感染した細胞(すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下)において複製し得る。AAVの場合、複製コンピテンスは、機能的なAAVパッケージング遺伝子の存在を、一般的に必要とする。本明細書に記載される好ましいrAAVベクターは、1つ以上のAAVパッケージング遺伝子の欠損のために、哺乳動物細胞(特にヒト細胞)において複製コンピテントでない。好ましくは、そのようなrAAVベクターは、複製コンピテントAAVがAAVパッケージング遺伝子と進入するrAAVベクターとの間の組換えによって生じる可能性を最少化するために、AAVパッケージング遺伝子配列を完全に欠損する。本明細書において記載される好ましいrAAVベクター調製物は、複製コンピテントAAV(rcAAV)を(存在するとしても)ほとんど含まない調製物である(好ましくは、102rAAV粒子あたり、約1rcAAV未満、より好ましくは、104rAAV粒子あたり約1rcAAV未満、さらにより好ましくは、108rAAV粒子あたり約1rcAAV未満、なおより好ましくは、1012rAAV粒子あたり約1rcAAV未満、最も好ましくは、rcAAVを含まない)。
【0039】
rAAV粒子の「放出」とは、rAAV粒子がインタクトなプロデューサー細胞から細胞培養液に入ること、すなわち、rAAV粒子が細胞を溶解せずに放出されることを意味する。例えば、所定のプロデューサー細胞の培養物中では、いくつかの細胞は溶解し、細胞死の状態にあることが理解される。しかし、本発明は、代表的に当該分野で使用されるように、意図的な細胞溶解を実施することなしにrAAV粒子の放出を促進する方法を提供する。用語プロデューサー細胞からの「放出」および「分泌」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【0040】
本明細書中で使用される場合、用語プロデューサー細胞からの「rAAV粒子の放出を促進する条件」とは、プロデューサー細胞を増殖させるための条件を言い、これは、プロデューサー細胞から培養培地に、増加されたrAAV粒子の放出に導くか、または増強されたrAAV粒子の放出に導く。プロデューサー細胞から培養培地へのrAAV粒子の放出を促進する条件は本明細書中に記載されており、これは、一般的ではあるが、必ずしも細胞性代謝を増強する条件であるわけではない。プロデューサー細胞から培養培地へのrAAV粒子の「放出を促進すること」とは、放出を増強する環境的条件下で培養されなかったプロデューサー細胞からのrAAV放出と比較した場合、プロデューサー細胞からのrAAV粒子の放出が増大されていることを意味する。この増加は、任意の検出可能な増加であり得、例えば、少なくとも約1%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約35%、より好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約65%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約100%または2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、より好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、さらにより好ましくは少なくとも約50倍である。当該分野において周知であるように、細胞集団が、所定の開始培養条件下で増殖する場合、この細胞の代謝性副産物が、特定の培養条件(例えば、pHおよび重量モル浸透圧濃度)を変更する。rAAV粒子の放出を促進する環境的条件下で、1つ以上のこれらのパラメーターが必要に応じて制御され、すなわち規則的な間隔でモニターされ、そして適切な範囲(すなわち、放出を促進する範囲)内にパラメーターを維持するために調節される。これらの条件の設定および/または制御は以下においてより詳細に議論される。
【0041】
用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドあるいはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド(例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ)を含み得、そして非ヌクレオチド成分によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーへのアセンブリの、前または後になされ得る。本明細書において使用する場合、用語ポリヌクレオチドとは、互換可能に、2本鎖および1本鎖分子をいう。他に特定されるか、または必要とされない限り、本明細書に記載の本発明の任意の実施態様において、ポリヌクレオチドは、2本鎖形態、および2本鎖形態を形成することが公知であるかまたは予想される、2つの相補的な1本鎖形態の各々の両方を含む。
【0042】
「遺伝子」とは、転写そして翻訳された後に、特定のタンパク質をコードし得る、少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。
【0043】
ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え(体)」とは、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限または連結工程、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物を生じる他の手順の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、それぞれ、起源のポリヌクレオチド構築物の複製物、および起源のウイルス構築物の子孫を含む。
【0044】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節(ポリヌクレオチドの複製、重複(duplication)、転写、スプライシング、翻訳または分解を含む)に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響し得、その性質を増強、または阻害し得る。当該分野において公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定の条件下で、RNAポリメラーゼに結合し、そして通常プロモーターから下流に(3’方向に)位置するコード領域の転写を開始し得るDNA領域である。
【0045】
「作動可能に連結した」とは、遺伝子エレメントの近傍位置をいい、ここで、このエレメントは、予想された様式において、作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、そのプロモーターは、コード領域に作動可能に連結する。そのプロモーターとコード領域の間には、この機能的関係が維持される限り、介在残基が存在し得る。
【0046】
「発現ベクター」とは、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、そして意図された標的細胞においてタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、コード領域に作動可能に連結された制御エレメントを含み、その標的でのタンパク質の発現を容易にする。制御エレメント、および発現のためにその制御エレメントが作動可能に連結された遺伝子(単数または複数)の組み合わせは、時として、「発現カセット」といい、当該分野において公知でありそして利用可能な大多数の発現カセットが、当該分野において利用可能な成分から容易に構築され得る。
【0047】
「異種」とは、比較されるその他の実体とは遺伝型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブなコード配列から取り出され、そして天然には連結されていることが見出されないコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。
【0048】
「遺伝子改変」とは、遺伝子エレメントが、有糸分裂または減数分裂以外によって細胞中に導入されるプロセスをいう。このエレメントは、細胞にとって異種であり得るか、またはその細胞に既に存在するエレメントのさらなるコピーか、もしくは改善されたバージョンであり得る。遺伝子改変は、例えば、当該分野において公知の任意のプロセス(例えば、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触)を通して、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、行われ得る。遺伝子改変はまた、例えば、DNAまたはRNAのウイルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入か、または感染によって行われ得る。好ましくは、遺伝子エレメントは、細胞中の染色体またはミニクロモソーム中に導入される;しかし、細胞およびその子孫の表現型および/または遺伝子型を変更する任意の改変は、この用語に含まれる。
【0049】
遺伝子配列が、インビトロにおける細胞の延長された培養の間に、その機能の実施のために利用可能である場合、その細胞は、この配列で「安定的に」改変、形質導入、または形質転換されると言われる。好ましい例において、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によってまた遺伝される遺伝子改変が導入されるという点で、「遺伝的に」改変される。
【0050】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。この用語はまた、改変された(例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、または標識成分との結合)アミノ酸のポリマーを含む。「CFTR」、「p53」、「E1A」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物の状況において議論される場合、インタクトなタンパク質の所望の生物学的機能を保持する、各々のインタクトなポリペプチド、またはその任意のフラグメントもしくは遺伝的に操作された誘導体をいう。同様に、CFTR、p53、E1A遺伝子および遺伝子治療における使用のための他のこのような遺伝子は(代表的に、レシピエント細胞に送達される「トランスジーン」という)、インタクトなポリペプチド、または所望の生物学的機能を有する、任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【0051】
「単離された」プラスミド、ウイルス、または他の物質とは、この物質または類似物質が天然に存在するかまたはもともとそこから調製されるところにもまた存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物をいう。それゆえ、例えば、単離された物質は、供給源混合物から、この物質を富化する精製技術を使用することにより調製され得る。富化は絶対基準(例えば、溶液中の容量あたりの重量)に対して測定され得るか、または供給源混合物中に存在する第2の潜在的に干渉する物質に関して測定され得る。本発明の実施態様の富化を増加することは、さらにより好ましい。従って、例えば、2倍の富化が好ましく、10倍の富化はより好ましく、100倍の富化はより好ましく、1000倍の富化はさらにより好ましい。
【0052】
AAVの調製物は、感染性AAV粒子に対する感染性ヘルパーウイルス粒子の比が少なくとも約102:1;好ましくは、少なくとも約104:1;より好ましくは、少なくとも約106:1;なおより好ましくは、少なくとも約108:1である場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」といわれる。調製物はまた、好ましくは、等量のヘルパーウイルスタンパク質を含まない(すなわち、もし上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在するならば、タンパク質はヘルパーウイルスのそのようなレベルの結果と同程度に存在する)。ウイルスおよび/または細胞タンパク質の夾雑物は、SDSゲル上のクマシー染色または銀染色のバンドの存在として、一般的に観察され得る(例えば、AAVキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3に対応するバンド以外のバンドの出現)。
【0053】
ウイルスの生成、複製、またはパッケージングの記載において使用される場合、「効率」とは、方法の有用な性質(特に、増殖速度、および1細胞あたり生成さえるウイルス粒子の数)をいう。「高効率」生成は、特定の培養期間の過程にわたり、1細胞あたり少なくとも100のウイルス粒子、好ましくは1細胞あたり、少なくとも約10,000、そしてより好ましくは、少なくとも約100,000粒子の生成を示す。なおより好ましくは、「高効率」生成は、1細胞あたりの粒子のこれらの生成レベル、ならびに、粒子を生成する細胞の最大数(例えば、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約20%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%)を含む。実施例6は1生成細胞あたり93,000〜123,000rAAV粒子を生じる培養条件(「完全培地」)を記載する。本発明の文脈において、効率はまた、細胞中に保持されたウイルス粒子と比較したウイルス粒子の放出の割合または程度によって考慮され得る。効率はまた、感染性のウイルス粒子に対する全体のウイルス粒子の比または相対的な割合(例えば、「P/I」比)によって考慮され得る。生成の効率のパラメーターを決定するためのアッセイ(例えば、複製単位および感染性センターアッセイ)は、当該分野で公知である。
【0054】
(一般的技術)
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者にとって公知である、従来の分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の技術を使用する。そのような技術は、文献において十分に例示される。例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版(Sambrook、FritschおよびManiatis、1989);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編、1987);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausbelら編、1987);「Current Protocols in Protein Science」(John E Coliganら編、Wiley and Sons、1995);ならびに「Protein Purification:Principles and Practice」(Robert K.Scopes、Springer−Verlag、1994)を参照のこと。
【0055】
(プロデューサー細胞からrAAV粒子の放出を促進する条件)
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子の集団を生成するための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む:a)プロデューサー細胞からのrAAV粒子の培養培地への放出を促進する条件下で、細胞培養培地中でプロデューサー細胞の集団をインキュベートする工程。次いで、放出されたrAAV粒子は、細胞培養培地から回収され得る。これによりウイルス粒子の集団を獲得する。
【0056】
プロデューサー細胞から培養培地へAAV(rAAVを含む)粒子の放出を促進(または増強する)条件としては、培養培地のpH;培養培地の重量モル濃度;温度;培養培地中の所定のイオンの濃度;細胞密度;培養培地中の溶存酸素濃度;培養培地中のグルコース濃度;培養培地中のアミノ酸の濃度;および細胞周期同調化を促進する条件が挙げられるがこれらに限定されない。これらのパラメーターのいずれか1つ以上が、この細胞がAAV粒子を放出する間、適切な範囲(すなわち、放出を促進する範囲)内で維持される。1つのパラメーター(すなわち、条件)は、放出を促進するために十分であり得、2つ以上のパラメーターの組み合わせが、各々その独自の適切な範囲の内で同時に維持され得る。さらに、1つのパラメーターに適切な範囲は、任意のさらなるパラメーターのいずれか用いられるか否かに依存して変化し得る。1つのパラメーターが一定時間、適切な範囲内に保持される場合、第2のパラメーターが第1のパラメーターと同じかまたは異なる間隔の間、第2の適切な範囲内で維持され得る。あるいは、条件は、連続的に使用され得る。例えば、pHのコントロールは、増殖の1つの相、温度の制御の間により生じ得る。
【0057】
これらのパラメーターを変化させること、およびプロデューサー細胞が所定の環境条件下で維持されない場合、放出したrAAVの量に対して、rAAVの培養培地インキュベートへの放出が増強されるか否かを決定することは、十分、当業者の能力の範囲内である。プロデューサー細胞からのrAAV粒子の増強した(または増加した)放出は、当該分野の公知の任意の多数の方法により測定され得る。この方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:複製中心アッセイ(replication center assay)および感染中心アッセイ(infectious center assay)のような機能的アッセイ;cap遺伝子産物のための免疫学的アッセイ(例えば、ELISA);HPLC;ならびに任意の多数のDNA検出方法(ウイルスDNAの存在を検出するため)(たとえば、スロットブロット)。
【0058】
一般に、任意のこれらの条件は、当該分野で公知の標準的方法および装置を用いて、必要な程度および/または所望の程度までモニタリングおよび制御され得る。この条件は、測定され、そしてその適切なレベル(すなわち、ウイルス放出を促進するレベル)へその条件を維持または回復するために調節がなされる。本発明者らは、培養条件を適切または適当に維持することの失敗がウイルス粒子放出の休止を生じ得るが、他の条件(例えば、重量モル濃度)が特定のレベルに維持される必要はない(ただし、このパラメーターに関しては最初の培養条件の設定が十分である)ことを観察した。モニタリングおよび調節されることが必要である条件について、例えば、バイオリアクターおよび/または培地灌流システムが用いられ得る。これらのシステムは好ましい。なぜなら、それらは培養条件のより注意深いコントロールを可能にするからである。しかし、AAV粒子の十分な放出および/または所望の放出を可能にする培養条件の十分なコントロールおよび調節を可能にする任意のシステムが適切である。この条件を提供するためのコントロール機構の他の例が本明細書において提供される。
【0059】
1つの実施態様において、プロデューサー細胞は、ウイルス粒子放出を促進するpH条件下で増殖される。一般に培養培地のpHは約7.0〜約8.5、好ましくは約7.4〜約8.5、より好ましくは約7.5〜約8.0の範囲内で維持される。なおより好ましくは、そして特には、pHが放出を促進するために用いられる唯一の条件である場合、pHは約8.0である。バイオリアクターは、例えば、pHの+/−0.05への制御を可能にし、そしてさらにより正確なコントロールが利用可能であり(例えば、+/−0.01へ)、そして1〜3分ごとまたはそれ未満でさえpHをモニターし得る。いくつかの実施態様において、少なくとも約67%の総ウイルス粒子が培養上清において見出されるpH条件下で細胞は増殖される。他の実施態様において、ウイルス粒子の少なくとも約80%、少なくとも約82%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約95%が培養上清中でみられるようなpH条件下で、細胞は増殖される。好ましくは、培養上清における、P/Iすなわち粒子対感染性の比は、約4,000未満、より好ましくは約3,000未満、より好ましくは約2,000未満、より好ましくは、1,700未満、より好ましくは約1,500未満である。いくつかの実施態様において、細胞は約pH8で培養され、そしてヘルパーウイルスでの感染(またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始)から約96時間で収集される。他の実施態様において、細胞は約pH8で培養され、そしてヘルパーウイルスでの感染(またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始)から約72時間で収集される。他の実施態様において、細胞は、約pH8で培養され、そしてヘルパーウイルスでの感染(またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始)から約48時間で収集される。
【0060】
いくつかの実施態様において、pH以外の条件(単数または複数)がウイルス放出を促進するために用いられる。例えば、他の実施態様において、ウイルス放出を促進するために温度が用いられる。一般に、培養培地の温度は約30℃〜約45℃、好ましくは約32℃〜約42℃、より好ましくは約35℃〜約40℃で維持される。なおより好ましくは、そして特には、温度が放出を促進するための唯一の条件である場合、温度は約37℃〜約39℃である。バイオリアクターは、例えば、温度を+/−0.5℃にコントロールし得、そして約30秒ごと程度にモニターし得る。
【0061】
他の実施態様においては、重量オスモル濃度がウイルス放出を促進するために用いられる。一般に培養培地の重量オスモル濃度は、約100mOsM〜約650OsM、好ましくは約150mOsM〜約500mOsM、好ましくは約200mOsM〜約400mOsM、なおより好ましくは約300mOsMで開始されるかおよび/または維持される(特に、重量オスモル濃度が放出を促進するために用いられる唯一の条件である場合)。当該分野で十分に理解される用語、重量オスモル濃度は、水1kgあたりの溶質分子の数として規定される。一般に、NaClおよび他の塩、マンニトール、グルコースのような化合物が重量オスモル濃度に寄与する。重量モル濃度は、例えば、浸透圧計を用いる凝固点降下のような当該分野の標準的技術を用いて測定され得る。
【0062】
本発明の方法において用いられ得る他の条件としては、以下の任意の1つ以上が挙げられるがこれらに限定されない:インスリン、EGFおよびFGFのような増殖因子;グルコース濃度;溶存酸素濃度;強化培地(例えば、さらなるグルコースおよび/または他の栄養素(例えば、ビタミンおよびアミノ酸))。グルコース濃度は、一般に約0.1〜約20g/l;より好ましくは約0.5〜約15g/l;より好ましくは約1〜約10g/lである。酸素濃度(代表的には、例えば、溶存酸素電極または血液ガス分析器により測定される)は、通常、空気に対して約10%〜約200%、好ましくは、空気に対して約20%〜約100%、好ましくは空気に対して約30%〜約75%である。一般に、細胞密度が高くなればなるほど、培地はより強化される。培地条件は、潅流のような当該分野で公知の技術を用いて維持および/または補充され得る。
【0063】
プロデューサー細胞は、ウイルスの培地への放出を促進するために適切な時間間隔で増殖される。一般に、細胞は、約24時間、約36時間、約48時間、約72時間、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日までの間増殖され得る。約10日後(または、用いられる培養条件および特定のプロデューサー細胞に依存して、より早く)、産生のレベルは一般的に有意に低下する。一般に、培養の時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、AAVの場合、ウイルス産生は、一般に、本明細書において記載される適切なプロデューサー細胞において、ヘルパーウイルス機能を供給することに基づいて開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染(またはウイルス産生開始)後、約48時間〜約100時間、好ましくは約48時間〜約96時間、好ましくは約72時間〜約96時間、好ましくは約68時間〜約72時間に回収される。本実施例では、結果は通常、例えば、「2日」、「3日」などの日数で表現される。これらの表示は通常、ヘルパーウイルスでの感染から測定したさらなる日数を示す。すなわち、「3日」で報告される結果は、一般に、その結果がヘルパーウイルス機能の導入の時点から約2日(すなわち48時間)で得られたことを示す。
【0064】
上記のように、放出を促進する条件の任意の1つ以上の、任意の組み合わせが用いられ得る。例えば、細胞は以下の任意の1つ以上の条件のもとで増殖され得る:(a)約8.0のpH;(b)約39℃の温度;(c)約300mOsM;(d)強化培地(約2〜3日間)。「強化培地」は、一般に、血清が減少され得るか排除さえされ得るように、さらなる無機塩(例えばMg2、Ca+2)、ビタミン、および/または補因子について強化されたことを意味する。好ましい実施態様では、細胞は以下の条件のもとで増殖される:(a)約300mOsm;(b)約pH8.00;(c)約39℃;(d)そしてヘルパーウイルスでの感染から約96時間で回収される。好ましい実施態様において、細胞は以下の条件下で増殖される:(a)約pH8.00;(b)約39℃;および(c)そしてヘルパーウイルスでの感染から約96時間で回収される。別の実施態様において、細胞は以下の条件下で増殖される:(a)約300mOsm;(b)約pH8.00;(c)約39℃;(d)そしてヘルパーウイルスでの感染から約72時間で回収される。別の実施態様において、細胞は、以下の条件下で増殖される:(a)約pH8.00;(b)約39℃;および(c)そしてヘルパーウイルスでの感染から約72時間で回収される。別の実施態様では、細胞は以下の条件のもとで増殖される:(a)約300mOsm;(b)約pH8.00;(c)約39℃;(d)そしてヘルパーウイルスでの感染から約48時間で回収される。別の実施態様では、細胞は以下の条件下で増殖される:(a)約pH8.00;(b)約39℃;および(c)そしてヘルパーウイルスでの感染から約48時間で回収される。
【0065】
いくつかの実施態様では、pHは、約8.0に維持され、そして培養物は約39℃の温度で増殖される。いくつかの実施態様では、pHは、約8.0に維持され、そして重量オスモル濃度(少なくとも開始オスモル濃度)は約300mOsmである。いくつかの実施態様では、pHは、約8.0に維持され、そして重量オスモル濃度(少なくとも開始オスモル濃度)は約300mOsmであり、そして培養物は約39℃の温度で増殖される。
【0066】
いくつかの実施態様において、細胞は同調化される。これは,例えば、特にヘルパーウイルス機能の付加前に、ストレス条件に細胞を供することにより達成され得る。同調化は、全体的生産性に寄与し得る。ストレスの可能性のある形態としては、栄養ストレス、浸透性ストレス、pHストレス、温度ストレス、有酸素ストレス、機械的ストレス、放射ストレスおよび毒素ストレスが挙げられるがこれらに限定されない。栄養ストレスが課される非限定的な例は、1つ以上のアミノ酸において欠乏している培地においてプロデューサー細胞を培養することである。
【0067】
本発明はまた、ウイルス放出を促進する因子または条件でプロデューサー細胞(すなわち、インタクトなプロデューサー細胞)を処置する方法(例えば、細胞を透過性にする因子(例えば、イオノフォアまたは毒素(例えば、細菌毒素)、浸透性ショック)での処置)を含むこともまた理解される。これらの実施態様について、培養集団のプロデューサー細胞は、一般にその統合性を保持する(すなわち、溶解されない)(しかし、任意の細胞培養集団における場合、いくつかの細胞は溶解され得る)。一般に、以下のほぼ任意の割合未満の細胞が溶解される:50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、12%、10%、8%、5%、3%、2%、1%。あるいは、一般に、以下のほぼ少なくとも任意の割合の細胞内容物が細胞内で保持される(すなわち、細胞膜に保持される):40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%。
【0068】
(放出されたウイルス粒子の収集および精製)
プロデューサー細胞は、懸濁液中で、または適切な表面に付着されて培養され得る。懸濁液または固定化培養の方法は、当該分野で公知である。放出されたウイルス粒子の集団の生成の際、その放出されたウイルス粒子は、さらに使用するために収集および/または精製され得る。以下により詳細に考察するように、培養培地中のウイルス粒子は、プロデューサー細胞から当該分野で公知の方法(例えば、遠心分離または濾過(例えば、中空繊維膜中での接線流濾過))を使用して分離される。好ましくは、1つ以上のさらなる精製工程が、プロデューサー細胞を培養培地から分離した後に行われる。このような工程の例には、適切なフィルターまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用しての濃縮が含まれるが、これらに限定されない。種々の産生および精製方法が、WO99/11764(PCT/US98/18600)(Targeted Genetics Corporation)に記載される。
【0069】
いくつかの実施態様において、培養上清(細胞が除去された後)は、反対電荷のイオン性クロマトグラフィーに供される。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に行われる。その他の実施態様において、陽イオン交換は、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に行われる。いくつかの実施態様において、培養上清は、ヘパリン硫酸上でクロマトグラフィーに、好ましくは、反対電荷のイオンクロマトグラフィーの処置後に、より好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィー上での培養上清の処置、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーの後に、供される。これらの技術は、より詳細に以下に記載される。
【0070】
例示のために、培養上清、または陰イオン交換もしくは陽イオン交換カラムから溶出され、および/もしくは接線流濾過によって濃縮された調製物は、ヘパリン硫酸を含むカラムに結合させることによって精製され得る。次いで、AAVは、このようなカラムから塩を含有する緩衝液(例えば、NaClの直線勾配)を使用して溶出され得る。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからプールされた画分から得られるAAVは、TMEG+100mMのNaCl中にて300Kの接線流濾過膜を使用して濃縮され、そしてダイアフィルトレーションされ得る。この濃縮物は、1mlのヘパリン硫酸カラム(Pharmacia 「Hi−Trap Heparin」カラム)上に注入され、NaClの直線勾配を使用して溶出され得る。
【0071】
以下の節は、本発明の産生システムおよび方法のより詳細な構成要素を記載する。
【0072】
(ヘルパーウイルス機能およびAAVを含むプロデューサー細胞)
本発明の方法において、ウイルス複製およびカプセル化に必要とされる成分を含むプロデューサー細胞は、適切な条件下(すなわち、ウイルス放出を促進する条件)で培養される。いくつかの基準は、本明細書中に記載されるrAAV粒子の産生における使用のための細胞の選択に影響を及ぼす。最初の事項として、その細胞は、選択されたヘルパーウイルスを用いる場合、rAAVベクターの複製およびパッケージングを可能にするものでなければならない。しかし、ほとんどの哺乳動物細胞は、AAVによって生産的に感染され得、そして多くの細胞もまたアデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染され得るので、多くの種々の哺乳動物細胞および細胞株がこれらの基準を有効に満足することは明白である。これらのうち、より好ましい細胞および細胞株は、組換えAAVベクター調製物の大規模生産を容易にするために培養物中で容易に増殖され得るものである。しかし、このような細胞の多くもまた、この基準を有効に満たす。大規模生産が所望される場合、産生方法の選択はまた、宿主細胞の選択にも影響を与える。例えば、以下および当該分野においてより詳細に記載されるように、いくつかの生産技術および培養容器もしくはチャンバーが付着細胞または接着細胞の増殖のために設計されており、他方、他のものが懸濁細胞増殖のために設計されている。後者の場合、従って、宿主細胞は、好ましくは、懸濁増殖に適合されたかまたは適合可能である。しかし、接着またはアンカー依存性とみなされる細胞および細胞株の場合でさえ、(以下に記載されるように)懸濁増殖しうる細胞について連続的に選択することによってアンカー依存性親株の懸濁適合性改変体を誘導させることが可能である。
【0073】
温度感受性のヘルパーウイルスが使用される場合、その細胞は、そのヘルパーウイルスの複製に非許容性である条件下でrAAVベクターを有効に複製し得なければならない。例示のために、アデノウイルスts149をtsへルパーウイルスとして使用する場合(以下に記載されるように)、その細胞は、32℃を充分超える温度、好ましくは、約39.5℃でrAAV複製およびパッケージングを支持し得なければならない。ヒト293細胞は、これらの規準を満たす細胞株の一例であるが、他の多くの細胞および細胞株がこの比較的高温でrAAVを複製し得る。
【0074】
最終的に、複製およびパッケージングに必要であるヘルパーウイルス(またはヘルパーウイルス機能)、rAAVベクター配列、およびすべてのAAV配列は、同じ細胞に存在しなければならない。1以上のAAVパッケージング遺伝子がベクターから別個に提供される場合、以下を含む宿主細胞が提供される:(i)1以上のAAVパッケージング遺伝子、ここでこのAAVパッケージング遺伝子は各々が、AAV複製またはキャプシド形成タンパク質をコードする;(ii)rAAVベクターまたはプロベクターを使用してこの宿主細胞に導入された異種ポリヌクレオチド、ここで、このrAAVベクターまたはプロベクターは、少なくとも1つのAAV ITRに隣接してその異種ポリヌクレオチドを含み、そしてそのAAVパッケージング遺伝子において欠損している;ならびに(iii)必要なヘルパーウイルス機能をコードするヘルパーウイルスまたは配列。しかし、これらのエレメントの1以上が単一のレプリコンにおいて合わせられ得ることにも注意すべきである。例示のために、ヘルパーウイルスはまた、rAAVプロベクターまたはAAVパッケージング遺伝子を含み得る。
【0075】
ヘルパーウイルスは好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを感染させるのに充分なレベルで細胞培養物中に導入されるが、そうでなければ得られた調製物に存在するヘルパーウイルスの量を制限するために、最低限に維持され得る。1〜100の感染多重度すなわち「MOI」が使用され得るが、5〜10のMOIが代表的に適切である。
【0076】
同様に、AAVベクターおよび/またはパッケージング遺伝子が一過的にパッケージング細胞に導入される場合(安定に導入されるのとは反対に)、それらは、好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを遺伝的に改変するのに充分なレベルで導入される。一般的に必要な量は、細菌プラスミドとして供給される場合106細胞あたり10μgのオーダーであり;あるいはAAV粒子として供給される場合は、105細胞あたり108粒子である。最適な量の決定は、当業者の技術範囲内である慣用的な力価決定の実施である。
【0077】
これらのエレメントは、同時または任意の順に連続的に、その細胞に導入され得る。その細胞がそのエレメントのいずれかによって遺伝的に変化している場合、その細胞は、次のエレメントが導入される前に、選択され得そして増殖させられ得る。
【0078】
1つの好ましい実施態様において、ヘルパーウイルスは、最後に細胞に導入されて、常在性のrAAVベクターのレスキューおよびパッケージングを行う。この細胞は、一般的に、AAVパッケージング遺伝子に必要な程度にまで既に補充されている。好ましくは、rAAVベクターまたはパッケージング遺伝子のいずれか、またはより好ましくはその両方が、その細胞に安定に組み込まれる。他の組合せも可能であることも容易に理解される。このような組合せは、本発明の範囲内に含まれる。
【0079】
一旦宿主細胞に必要なエレメントが提供されると、その細胞は、AAV複製に許容性である条件下で培養されて、rAAVベクターの複製、パッケージングおよび放出をさせる。適切な培養時間は、多くの考慮に依存し、そして上記で議論したように変化し得る。培養時間は好ましくは、産生レベルのピークに対応するように調整され、そして代表的には3〜6日間である。好ましくは、少なくとも100のウイルス粒子が1細胞当たり産生され;より好ましくは1細胞当たり、少なくとも約1000粒子、なおより好ましくは1細胞当たり少なくとも約10,000粒子産生される。好ましくは、2×105細胞当たり,少なくとも0.5×106、より好ましくは少なくとも約1×106細胞、さらにより好ましくは少なくとも約2×106RU/ml AAVベクターが、培養期間の間に産生される。必要に応じて、大規模生産方法(例えば、懸濁培養または接線流濾過)が使用され得る。次いで、AAV粒子が収集され、そしてそれらを調製するために使用された細胞から単離される。
【0080】
本発明の方法によって得られるrAAV粒子の調製物は、好ましくは、高密度の感染性AAV粒子を含み、そしてヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質および細胞砕片、および他の混入物を実質的に含まない。所望の特性は、以下を含む:
・ 公知の標準を用いて複製アッセイまたは定量ハイブリダイゼーション比較において決定される場合、少なくとも107、好ましくは少なくとも約108、より好ましくは少なくとも約109RU/mlの濃度
・ 108RUのrAAV粒子あたり、103以下、好ましくは約102以下、より好ましくは101以下のヘルパーウイルスの感染性粒子
・ SDSゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質(例えば、アデノウイルスのヘキソンまたはペントンファイバー)についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、タンパク質ベース(重量/重量)で、5%未満、好ましくは約1%未満、より好ましくは約0.01%未満、さらにより好ましくは約0.001%未満のヘルパーウイルスによる混入物
・ SDSゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質または細胞特異的タンパク質についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、5%未満、好ましくは約1%未満、より好ましくは約0.01%未満、さらにより好ましくは約0.001%未満のヘルパーウイルスまたは細胞タンパク質(重量/重量)による混入物
・ 好ましくは、その調製物はまた、細胞の脂質、糖質および/または核酸のような他の潜在的な細胞成分を実質的に含まない。
【0081】
本開示に概説される方法は、小さな実験バッチまたは10〜100リットル以上の調製バッチを調製するのに適切である。大規模バッチ調製について、以下の特性もまた所望される:
・ この調製物において、合計少なくとも1010、好ましくは1012、そしてより好ましくは1014RUのAAVベクター粒子。
【0082】
必要に応じて、rAAVベクターは、rAAV粒子について富化するため、ヘルパーウイルス粒子を枯渇させるため、または他の方法で被験体への投与に適切にさせるためにさらに処理され得る。精製技術は、等密度勾配遠心分離およびクロマトグラフィー技術を含み得る。感染性ヘルパーウイルス活性の減少は、当該分野で公知なように、熱処理またはpH処理による不活化を含み得る。他の処理としては、濃縮、濾過、ダイアフィルトレーション、または適切な緩衝液もしくは薬学的な賦形剤との混合が挙げられ得る。調製物は、分配のために単位用量および多用量アリコートに分割され得、これは、そのバッチの本質的な特徴(例えば、抗原性内容物および遺伝的内容物の均質性、および混入するヘルパーウイルスの相対比)を保持する。
【0083】
上記に記載のような種々の所望の特性を示すヘルパーウイルスおよびAAVの調製物の生成のための例示的な技術は、以下の節において提供される。
【0084】
ウイルス調製物の感染性力価の決定のための種々の方法が当該分野で公知である。力価決定のための1つの方法は高処理能力力価決定アッセイである。高処理能力力価決定アッセイにおいて、各々が哺乳動物細胞のアリコートおよびウイルス調製物のアリコートを含む培養ウェル(ならびに、例えば、細胞単独、ウイルス単独を含むコントロールウェル、および何も含まないコントロールウェル)のアレイが確立される。培養ウェルのアレイは、例えば、マイクロタイター容器の形態においてであり得る。代表的に、力価測定されるウイルス調製物のアリコート(例えば、連続希釈したアリコート)をその細胞に添加し、次いで、その細胞およびウイルスを、ウイルスの複製を可能にする条件(代表的には、哺乳動物宿主細胞に適した増殖条件)下でインキュベートする。ウイルスの複製後、ウイルス核酸を、一般に、哺乳動物細胞の溶解によって放出させる(必要に応じて溶解を促進する条件または薬剤を用いて)。複数の溶解物における核酸(ウイルス核酸を含む)を、核酸を結合する条件下で(タンパク質および他の混入物を除去するのに適切な洗浄)メンブレンに移しそして固定する。このメンブレンは好ましくは、もとのアレイの個々のウェルが、次いで、(各培養ウェルの溶解物由来の)核酸(これは、そのメンブレン上の対応する位置に結合している)の「プール」によって表される培養アレイの複製または鏡像である。次いで、そのメンブレンと、標識したウイルス特異的(またはウイルス挿入物特異的)プローブとをハイブリダイズすることを使用して、そのアレイの点の各々、および対応して、もとの培養ウェルの各々における、ウイルス特異的核酸の相対量を同定および定量し得る。核酸の移動、結合、洗浄、およびハイブリダイゼーションのための条件および材料は、慣用的な分子生物学技術から適合され得る(例えば、「ドットブロット」ハイブリダイゼーション(当該分野で記載されるような)。
【0085】
(AAVベクターおよびAAVパッケージング遺伝子の選択および調製)
本明細書に記載される産生方法において使用されるプロデューサー細胞は、rAAVベクターを含む。rAAVベクターは、通常AAVゲノムの大部分を構成するAAVのrepおよび/またはcap遺伝子の全てまたは一部の代わりに、目的の異種(すなわち、非AAV)ポリヌクレオチドを含む。しかし、野生型AAVゲノムにおける場合のように、rAAVベクターは、好ましくは、上記の2つのAAVの逆方向末端反復(ITR)に隣接する。rAAV構築物が単一の(代表的には改変された)ITRに隣接するバリエーションもまた、当該分野において記載され、そして本発明とともに使用され得る。
【0086】
任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが、適切である。なぜなら、種々の血清型は、遺伝子レベルにおいてさえ、機能的および構造的に関連するからである(例えば、Blacklow、「Parvoviruses and Human Disease」、J.R.Pattison、編(1988)の165〜174頁;およびRose、Comprehensive Virology 3:1、1974を参照のこと)。全てのAAV血清型は、相同rep遺伝子によって媒介される、類似の複製特性を明らかに示す;そして、その全ては一般的に3つの関連するキャプシドタンパク質(例えば、AAV2で発現されるタンパク質)を有する。関連性の程度は、ゲノム長の全体にわたる、血清型の間の広範な交差ハイブリダイゼーションを示すヘテロ2重鎖分析;およびITRに対応する末端での、類似の自己アニーリングセグメントの存在によって、さらに示唆される。類似の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が、類似の調節性制御下にあることを、示唆する。種々のAAV血清型の中で、AAV2が最も一般に使用される。
【0087】
rAAVベクターは、異種ポリヌクレオチドを含有する。このポリヌクレオチドは、代表的には、遺伝子治療(例えば、特定の表現型の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)の状況において、標的細胞に機能を提供する能力のために興味深い。そのような、異種ポリヌクレオチドまたは「トランスジーン」は、一般的に、所望の機能またはコード配列を提供するのに十分な長さのものである。AAV2粒子内へのキャプシド化のために、トランスジーンは、好ましくは、約5kb未満であるが、より長い配列のAAVウイルス粒子内へのパッケージングを可能とするために、他の血清型および/または改変が使用され得る。
【0088】
異種ポリヌクレオチドの転写が意図される標的細胞において所望される場合、これはそれ自体のプロモーターか、または異種プロモーター(例えば、当該分野において公知のように、標的細胞内の転写の所望のレベルおよび/または特異性に依存する)に、作動可能に連結され得る。種々の型のプロモーターおよびエンハンサーが、この状況での使用に適切である。構成性プロモーターは、遺伝子転写の継続するレベルを提供し、一方、誘導性プロモーターは、一般的に、インデューサーの非存在下において低い活性を示し、そしてインデューサーの存在下でアップレギュレートされる。プロモーターおよびエンハンサーはまた、組織特異的であり得る;すなわち、これらは、特定の細胞型においてのみ、(おそらくそれらの細胞においてのみ独特に見出される遺伝子調節エレメントに起因して)その活性を示す。
【0089】
プロモーターの例示的な例は、シミアンウイルス40由来のSV40後期プロモーター、バキュロウイルス多面体(polyhedron)エンハンサー/プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV tk)、サイトメガロウイルス(CMV)の前初期プロモーターおよびLTRエレメントを含む種々のレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターとしては、重金属イオン誘導性プロモーター(例えば、マウス乳腺癌ウイルス(mMTV)プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーター)、ステロイドホルモン誘導性プロモーター、およびT7 RNAポリメラーゼの存在下で活性なT7ファージ由来のプロモーターが、挙げられる。組織特異的プロモーターの例としては、種々のサーファクチン(surfactin)プロモーター(肺における発現のため)、ミオシンプロモーター(筋肉における発現のため)、およびアルブミンプロモーター(肝臓での発現のため)が挙げられる。非常に多種の他のプロモーターが公知であり、そして一般的に当該分野において入手可能であり、そして、そのようなプロモーターの多くの配列は、GenBankデータベースのような配列データベースにおいて入手可能である。
【0090】
意図された標的細胞において、翻訳もまた所望される場合、異種ポリヌクレオチドはまた、好ましくは、翻訳を容易にする制御エレメントもまた含有する(例えば、リボソーム結合部位、すなわち、「RBS」、およびポリアデニル化シグナル)。従って、異種ポリヌクレオチドは、一般的に、適切なプロモーターに作動可能に連結した、少なくとも1つのコード領域を含み、そして、例えば、作動可能に連結したエンハンサー、リボソーム結合部位、およびポリAシグナルを含有し得る。異種ポリヌクレオチドは、1つのコード領域、または同一かまたは異なるプロモーターの制御下の1つより多いコード領域を含有し得る。制御エレメントおよびコード領域の組み合わせを含む全体のユニットは、しばしば、発現カセットと称される。
【0091】
異種ポリヌクレオチドは、組換え技術によって、AAVゲノムのコード領域中に、または好ましくは、その代わりに(すなわち、AAV repおよびcap遺伝子の代わりに)組み入れられ、そして好ましくは、いずれかの側でAAVの逆方向末端反復(ITR)領域に隣接する。このことは、ITRがコード配列の上流および下流の両方に、いずれか一方は直接の近傍位置において、好ましくは(必要ではないが)複製コンピテントなAAVゲノムを再生し得る組換えの可能性を減少するために、AAV起源の介在配列を全く含まずに出現することを意味する。単一のITRが、通常2つのITRを含む配置に関連する機能を行うのに十分であり得(WO94/13788)、従って、単一のITRのみを有するベクター構築物が、本発明のパッケージング方法および生成方法に関連して使用され得る。
【0092】
repのネイティブのプロモーターは、自己調節性であり、そして生成されるAAV粒子の量を制限し得る。rep遺伝子はまた、異種プロモーターと作動可能に連結され得る(repは、ベクター構築物の一部として提供されるか、または別々に提供される)。rep遺伝子の発現によって、強力にはダウンレギュレートされない異種プロモーターはいずれも適切である;しかし、誘導性プロモーターは、好ましい。なぜなら、rep遺伝子の構成性発現は、宿主細胞に負の影響を有し得るからである。非常に多種の誘導性プロモーターが、当該分野において公知であり、そして例は上記に列挙されている。誘導性プロモーターの特に好ましいサブクラスは、rAAVベクターの複製およびパッケージングを相補するために使用されるヘルパーウイルスによって誘導されるサブクラスである。多数のヘルパーウイルス誘導性プロモーターもまた、記載され、これには、アデノウイルスE1Aタンパク質によって誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター;アデノウイルス主要後期プロモーター;VP16または1CP4のようなヘルペスウイルスタンパク質によって誘導されるヘルペスウイルスプロモーター;ならびにワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモーターが、挙げられる。
【0093】
ヘルパーウイルス誘導性プロモーター(例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター)を同定および試験するための方法は、記載されている。WO96/17947(Targeted Genetics Corporation)を参照のこと。
【0094】
種々のAAVゲノムの相対的なキャプシド形成の大きさが制限されるので、このゲノム内への大きい異種ポリヌクレオチドの挿入は、AAV配列の一部を除去することを必要とする。1以上のAAV遺伝子の除去は、複製コンピテントなAAV(「rcAAV」)を生成する確率を減少するために、いずれの場合においても所望される。従って、rep、capまたはその両方のコード配列またはプロモーター配列は、これらの遺伝子によって提供される機能がトランスに提供され得るので、好ましくは除去される。
【0095】
生じたベクターは、これらの機能において「欠損性」であるといわれる。このベクターを複製およびパッケージングするために、この損失した機能を、種々の損失repおよび/またはcap遺伝子産物に必要な機能を共にコードする、1つのパッケージング遺伝子または複数のパッケージング遺伝子で相補する。パッケージング遺伝子またはパッケージング遺伝子カセットは、ベクター配列と離れて提供されるパッケージング遺伝子との間で、複製の間に相同組換えを最小化するために、好ましくは、AAV ITRに隣接されず、そして好ましくは、rAAVゲノムと実質的な相同性を全く共有しない。相同性および対応する組換えの頻度のレベルは、相同性配列の長さ、および共有される同一性のレベルを増加することによって増加する。所定の系において関係する相同性のレベルは、当該分野で公知のように、理論的に決定され、そして実験的に確認される。しかし、代表的に、組換えは、たとえ重複配列の全長にわたって少なくとも80%同一であっても、その重複配列が約25ヌクレオチド配列未満である場合か、またはたとえ重複配列の全長にわたって少なくとも70%同一であっても、その重複配列が約50ヌクレオチド配列未満である場合には、実質的に減少または排除され得る。もちろん、さらに低いレベルの相同性は、それらが組換えの確率をさらに減少するので、好ましい。重複相同性を全く有さなくとも、rcAAVを生成するいくらかの残存頻度があることは明らかである。rCAAVを生成(例えば、非相同組換えにより)する頻度のなおさらなる減少は、WO98/27204(Targeted Genetics Corporation)に記載されるように、AAVの複製およびキャプシド形成の機能を「分裂」させることによって得られ得る。
【0096】
rAAVベクター構築物、およびその相補的パッケージング遺伝子構築物は、多くの異なる形態で本発明において実用され得る。ウイルス粒子、プラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞は全て、このような構築物をパッケージング細胞内に、一過的または安定的のいずれかで導入するために使用され得る。他の組み合わせも可能である。
【0097】
AAVベクターおよび相補的パッケージング遺伝子は、もし存在する場合、細菌プラスミド、AAV粒子、またはこれらの任意の組み合わせの形態で提供され得る。あるいは、AAVベクター配列、パッケージング遺伝子のいずれか、またはその両方は、遺伝子改変された(好ましくは、遺伝的に改変されるか、または安定に組み込まれた)真核生物細胞の形態で提供される。AAVベクター配列、AAVパッケージング遺伝子、またはその両方を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞の発生は、信頼のおけるレベルで発現される材料の、確立された供給源を提供する。従って、種々の異なる遺伝子改変された細胞は、当該分野(特に、米国特許第5,658,776号;WO95/13392;WO98/23018;米国特許第5,656,785号;WO98/27204)に記載されるように、本発明の状況において使用され得る。
【0098】
従って、例えば、repおよびcap遺伝子は、プラスミド中に存在し得るか、そして/またはプロデューサー細胞のゲノム内に安定に組み込まれ得る。
【0099】
(細胞内への遺伝物質の導入)
当該分野で記載され、そして本明細書および上記で引用された参考文献の両方において説明されるように、遺伝物質を、プロデューサー細胞内に、このような細胞を形質転換または形質導入するための任意の種々の手段(例えば、細菌プラスミドを用いたトランスフェクション、ウイルスベクターを用いた感染、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、および脂質ベースの種々の任意の組成物を用いる導入(しばしば「リポフェクション」と呼ばれるプロセス))を用いて導入し得る。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該分野で記載され、そして広く利用可能である。
【0100】
適切に改変されたプロデューサー細胞の選択は、当該分野の任意の技術により実施され得る。例えば、細胞を改変するために用いられるポリヌクレオチド配列は、当該分野で公知のような1つ以上の検出可能または選択可能マーカー(例えば、薬物耐性遺伝子)と同時に挿入され得るか、またはそれらに作動可能に連結され得る。導入されたポリヌクレオチドの獲得、局在化および/または維持についての試験は、DNAハイブリダイゼーションに基づく技術(サザンブロッティングおよび当該分野で公知の他の手順など)を用いて実施され得る。発現の試験は、遺伝子的に改変された細胞から抽出されたRNAのノーザン分析によるか、または対応する遺伝子産物に対する間接的な免疫蛍光により容易に実施され得る。パッケージング能力および効率の試験および確認は、細胞に、AAVの残りの機能的成分およびヘルパーウイルスを導入し、AAV粒子の産生を試験することにより得られ得る。細胞が、複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合、一般に、それらを、細胞に別々に導入し、各工程を順次確証することが(必須ではないが)より便利である。このような技術を記載する参考文献は、本明細書に引用されたものを含む。
【0101】
(ヘルパーウイルスの選択および調製)
上記のように、AAVは、自己複製欠損であるパルボウイルスであり、そして一般に、特定の複製機能を供給するヘルパーウイルスに依存しなければならない。種々のヘルパーウイルスが、本発明の方法において使用され得る。
【0102】
多くのこのようなヘルパーウイルスが同定され、これらは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(HSV1、サイトメガロウイルスおよびHHV−6を含むがこれらに限定されない)、およびポックスウイルス(特にワクシニア)を含む。これらウイルスのいずれかを本発明とともに用い得る。
【0103】
頻繁に、ヘルパーウイルスは、意図される宿主細胞に感染し得る、あるタイプおよびサブグループのアデノウイルスである。サブグループCのヒトアデノウイルス、特に血清型1、2、4、6、および7が一般に用いられる。血清型5が一般に好ましい。アデノウイルスの特徴および増殖パターンは当該分野で公知である。例えば、Fieldsら編、「Fundamental Virology」中の、Horowitz、「Adenoviridae and their replication」、771〜816頁を参照のこと。
【0104】
必須ではないが、原則的に、ヘルパーウイルス株は、最終的に遺伝子治療を受ける被験体中で複製欠損であることが所望される。従って、rAAV調製物中に存在する任意の残存ヘルパーウイルスは、複製不能である。E1A領域、またはE1A領域およびE3領域の両方が除去されたアデノウイルスは、大部分のヒト細胞に対して感染性ではない。それらは、失われた活性を相補し得る許容細胞株(例えば、ヒト293細胞株)中で複製され得る。ヘルパー機能と関連するようであるアデノウイルスの領域、およびそうでない領域は、同定され、そして当該分野で記載されている(例えば、P.Colosiら、WO97/17458、およびそこに引用される参考文献を参照のこと)。
【0105】
(条件的感受性ヘルパーウイルスの使用)
「条件的感受性」ヘルパーウイルスもまた、ヘルパーウイルス活性を提供するために使用され得る。WO99/11764を参照のこと。このようなヘルパーウイルス株は、AAVがそれ自身効果的なゲノム複製を行わない少なくとも1セットの条件下で、宿主細胞中でのAAV複製を支持し得る性質を最小限有さなければならない。ヘルパーウイルス活性が、インタクトなウイルス粒子として提供される場合、一般に、このウイルスが、第2のセットの条件下で、宿主細胞中で複製し得ることが必要である。第1のセットの条件は、第2のセットの条件と、容易に制御可能な特徴(必要な補因子(例えば、カチオン)の存在または非存在、阻害薬物の存在または非存在、または温度のような環境条件におけるシフトなど)が異なる。最も簡便には、2つの条件の差異は、温度であり、そしてこのような条件的感受性ウイルスは、それゆえ、温度感受性ヘルパーウイルス(tsHV)と呼ばれる。
【0106】
「温度感受性」または「ts」ヘルパーウイルスは、特定の温度範囲(「許容」温度範囲)、代表的には約15〜35℃、そして好ましくは約20〜32℃で、真核細胞中でその遺伝物質を複製し得るものである。しかし、「非許容」温度では、たとえその他の条件が同じに保たれたとしても、遺伝物質の複製の速度は、実質的により低く、少なくとも10倍低く;通常少なくとも約100倍より低く;および好ましくは少なくとも約1000倍低い。代表的には、この温度は、約35〜50℃、一般に、約42℃である。このような、tsヘルパーウイルスの代表的な実施例では、このウイルスは、約20〜32℃の温度のような比較的低温度で効率的に複製し得るが、約37〜42℃の温度のような比較的高温では効果的に複製し得ない。ウイルス感染細胞は、それにもかかわらず、非許容温度で、AAV産生のためのヘルパー機能を含むがこれに限定されない、ウイルスに起因し得るいくつかの代謝プロセスを示し得ることが理解される。
【0107】
温度感受性ヘルパーウイルスは、感染細胞を許容温度で培養することにより、大量に産生し得る。次いでAAVベクターは、ベクターエレメントおよび温度感受性ヘルパーウイルスを含む細胞を、非許容温度で培養することにより産生され得る。ベクター調製物は、ヘルパーウイルス成分を実質的に含んでいない。
【0108】
多数の温度感受性アデノウイルス改変体が当該分野で記載されている;例えば、Ensingerら(J.Virol.10:328、1972);Williamsら(J.Gen Virol.11:95、1971);Ishibashi(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 65:304、1970);Lundholmら(Virology 45:827、1971);およびShirokiら(Virology 61:474、1974)により記載された改変体を参照のこと。相補性分析は、このような改変体が、複数の異なる相補性グループに入ることを示している(Ginsbergら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.34:419、1974)。このことは、アデノウイルス複製サイクル中の多くの工程に温度感受性を与え得ることを示唆する。
【0109】
AAV複製のヘルパー機能は、アデノウイルスサイクルの一部分のみがインタクトであることを必要とするので、非許容温度で、種々の変異体のヘルパー機能を試験することは、ヘルパー機能をマッピングするための手段を提供する。例えば、Ishibashiら(Virology 45:317、1971)は、温度感受性トリアデノウイルス改変体がAAV1およびAAV2の複製を支持することを報告した。Itoらは、ヒトアデノウイルス7の温度感受性変異体ts13(Ad7ts13)が、野生株と同じく効率的に非許容温度でAAV複製を補助することを報告した。Drakeら(Virology 60:230、1974)は、3つのグループの、I型単純ヘルペスウイルス(HSV1)の温度感受性変異体によるAAV4抗原合成の相補を報告した。Handaら(J.Gen.Viro. 29:239、1975)は、ヒトアデノウイルス変異体Ad5ts36、Ad5ts125、Ad5ts149、Ad12tsA275、Ad12tsB221、およびAd12tsC295によるAAV1ウイルス産生に対するヘルパー活性を報告した。Ostroveら(Virology 104:502、1980)は、温度感受性変異体、Ad5ts125、Ad5ts135、Ad5ts157、Ad5ts116、およびAd5ts142、ならびに宿主範囲変異体hr6がAAV複製を支持する(hr3は支持しない)ことを報告した。Mayorら(J.Gen Virol.35:545、1977)は、Ad31ts94ではなくAd31ts13が、非許容温度でAAV1産生を支持したことを報告した。
【0110】
Strausら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:742、1976)は、Ad5ts125が、アデノウイルスがそれ自身複製しない条件下で、AAV2複製を支持したことを報告した。彼らは、この性質を用いてAAV複製の間に形成されるDNA中間体を研究した。Myersら(J.Virol.35:65、1980)は、ヘルパー機能に関して定量的研究を実施し、そしてAd5ts149が非許容温度で、1細胞あたり20,000の感染性AAV粒子の産生を支持したが、その一方、Ad5ts107は、1細胞あたりほんの約100粒子を生産したに過ぎないことを示した。Ad5ts107は、72kDa DNA結合タンパク質コード領域中に変異を有するので、彼らは、このタンパク質が、AAV RNA発現において役割を果たすと結論付けた。より最近、Carterら(Virology 191:473、1992)は、完全に機能的な72kDaタンパク質が、AAV repおよびcap遺伝子の定量的な転写後の発現に必要であることを提唱した。
【0111】
ヘルパーウイルスの選択された株の条件感受性改変体は、適切な変異誘発および選択戦略により生成され得る。例えば、ウイルスは、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、または5−ブロモ−2−デオキシウリジンで変異誘発され得る。所望の許容条件下で、適切な真核細胞において増加し得るが、所望の非許容条件下ではそうではない候補が選択される。例として、例えば、32℃で増加するが、39.5℃では増加しないアデノウイルス温度感受性変異体が得られ得る。39.5℃対32℃でのプラーク形成効率比は、好ましくは、10-4より少なく、そしてより好ましくは10-5より少ない。温度感受性アデノウイルスの適切な選択プロセスのさらなる例は、例えば、Ensingerら、J.Virol.10:328、1972;およびWilliamsら、J.Gen Virol.11:95、1971に見出され得る。温度感受性ではなく、宿主範囲感受性であるアデノウイルス改変体の記載は、Harrisonら、Virology 77:319、1977に見出され得る。本発明における使用に有効な温度感受性変異体は、例えば、代替のヘルパーウイルス様単純ヘルペス1(HSV1)、または単純ヘルペス2(HSV2)から調製され得る。例えば、HSV1についてSchafferら、Virology 52:57、1973;HSV2についてEsparzaら、Virology 57:554、1974を参照のこと。背景のセクションで示したように、多数の条件感受性ヘルパーウイルスが記載され、そしてそれらを開発または記載した科学者から、または公的な寄託機関から得られ得る。
【0112】
この株は、非許容条件下でブロックされる機能が、AAVの高効率複製に必要であるものではないような、その複製サイクルにおけるステージで条件感受性を与えなければならない。使用のためのそのヘルパーウイルス株の選択は、ヘルパーウイルスおよびAAVの複製要件の両方の公知の生物学を参照してなされ得る。
【0113】
本発明で使用のための例示のヘルパーウイルスは、Ad5血清型の温度感受性アデノウイルスts149(Ad5ts149)である。最適化条件下で、この株を用いて、野生型Ad5により支持されるレベルに一致またはそれを超えるレベルでrAAVを産生し得る。ts149は、位置7563においてC−GからA−Tへの単一のトランジションを有する(Rooversら、Virus Genes 4:53、1990)。これは、DNAポリメラーゼの残基411のアミノ酸ロイシンのフェニルアラニンへの変化を生じる。このDNAポリメラーゼは、アデノウイルスのE2転写ユニット内に含まれる。しかし、この領域にマッピングされるその他のts変異体は、あまり適切ではない。特に、このE2転写ユニットはまた、72kDa DNA結合タンパク質(DBP)のコード領域を含む。検出可能なDBPを産生しない株(Add/802)は、AAV複製を支持するが、そのレベルは1オーダーの大きさ減少する(Carterら、Virology 191:473、1992)。Adts125(これもまたDBPコード領域にマッピングされる変異を含む)は、野生型Ad5を用いるよりも一般にかなり低いレベルであるが(Myersら、J.Virol.35:65、1980)、AAV複製を支持する(Strausら、J.Virol.17:140、1976)。従って、本発明における使用のための適切な温度感受性アデノウイルスベクターは、感受性が、ゲノムのE2A領域、好ましくはDNAポリメラーゼコード領域にマップされるベクターを含む。
【0114】
当業者は、候補ヘルパーウイルス株のパネルを、候補細胞中で、そのヘルパーの自己複製に非許容的である条件下で用いるrAAV複製アッセイを実施することにより、ヘルパーウイルスとしての使用にどのウイルス株が適切であるかを容易に決定し得る。温度感受性改変体について、スクリーニングは、株の既知の性質に従って非許容温度で行われる。非許容温度は、一般に、許容温度より高く、代表的には約35〜50℃、好ましくは38〜45℃、より好ましくは約39.5℃である。対応する野生型ウイルスにより支持されるレベルの1オーダーの大きさの中にあるレベルでAAV複製を支持する改変体が好ましい。スクリーニングを実施することで、当業者は、本開示の他の教示を取り込むべきである。特に、野生型ウイルスでピークのAAV産生を与える時間培養することによるスクリーニングは、不十分である。候補ヘルパーウイルスをより長い期間用い、次いでピーク収穫時間にある野生型ウイルスと比較する速度論的マトリックスが設定されるべきである。
【0115】
一旦、適切なヘルパーウイルス株が選択されたなら、それは、本発明において多くの異なる形態で履行され得る。ウイルス粒子、ウイルスプラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞のすべてが用いられ得る。
【0116】
1つの実施態様では、ヘルパーウイルスのゲノム(または最小限、ヘルパー機能をコードするヘルパーウイルスゲノムの領域)が宿主細胞中に導入され、DNAプラスミド、または相補的機能を提供する複数のプラスミドの形態にあるrAAVベクターの複製に用いられる。アデノウイルスの実験操作のための手順は、当該分野で公知である。例えば、Grahamら、「Manipulation of adenovirus vectors」:Murray EJ編、Methods in molecular biology:Gene transfer and expression protocols、第7巻、Clifton、NJ:The Human Press、1991:109−128を参照のこと。こらは、アデノウイルスの増殖、滴定、および精製、同時トランスフェクションおよびインビボ組換えの詳細なプロトコルを提供する。アデノウイルスプラスミドは、Microbix Biosystems Inc.,Toronto,Canadaから市販されている。
【0117】
別の実施態様では、宿主細胞は、アデノウイルス遺伝子で安定にトランスフェクトされるか、または遺伝子的に改変されてrAAV複製に必須の機能を提供する。あるいは、宿主細胞は、アデノウイルスゲノムの部分のみが遺伝子的に改変され得、次いでアデノウイルス粒子またはプラスミドで感染またはトランスフェクトされる。特許出願WO95/27071およびWO95/34671は、遺伝的に改変されてアデノウイルス機能を提供する宿主細胞を記載し、これは、種々の欠損アデノウイルス構築物の複製性質を補完する。
【0118】
なお別の実施態様では、AAV複製に用いられる宿主細胞は、自己複製し得る(しかし非許容条件下ではそうではない)ヘルパーウイルスで感染される。十分なMOIを提供する必要な株の任意の調製物が用いられ得る。GMPおよびその他の規制要件を維持することにおいて、および商業的目的のスケールアップを容易にするために、好ましくは、ヘルパーウイルスの調製物は、高密度の感染性粒子を含み、そして細胞残渣およびその他の夾雑物を実質的に含まない。所望の性質は以下を含む:
・TCID50アッセイで測定したとき、少なくとも106、好ましくは少なくとも約108、より好ましくは少なくとも約1010IU/mlの密度。
・総タンパク質またはアデノウイルスヘキソンに対するアデノウイルスDNAの比は、ウイルス粒子の、少なくとも10%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは、少なくとも約80%が、アデノウイルスDNAを含むことを示す。
・タンパク質について染色されたSDSゲル、またはエチジウムブロマイドで染色された制限ヌクレアーゼ消化物のアガロースゲルにより検出されるとき、タンパク質またはDNAレベルの非アデノウイルス物質による、20%より少ない、好ましくは約10%より少ない、より好ましくは約1%より少ない夾雑物。
・生産バッチあたり、合計少なくとも109、好ましくは少なくとも約1011、より好ましくは少なくとも約1013IU。
【0119】
ヘルパーウイルスは、ウイルス複製について許容性である任意の細胞において調製され得る。アデノウイルスについて、好ましい細胞は、293細胞およびHeLa細胞を含む。伝統的に、これらの細胞は、アデノウイルスの複製のために用いられる場合、それらは、プレート培養において使用されてきた。これらの方法は、一般に、野生型アデノウイルスよりも1または2対数分低いレベルで温度感受性アデノウイルスの複製を支持する。
【0120】
従って、播種密度の増加を許容する培養技術を使用することが好ましい。懸濁培養に適合させた293細胞およびHeLa細胞改変体が利用可能である。HeLaは、細胞増殖、生存度、および懸濁物中の形態の理由のために好ましい。これらの細胞を十分な密度(2×106/ml)で増殖させて、温度感受性アデノウイルス株の複製速度の低下を補い得る。一旦樹立されると、細胞にそのウイルスを感染させ、そして十分な時間(一般的に3〜7日間および代表的に約5日間)許容温度で培養する。
【0121】
接線流濾過は、当該分野において、その灌流、濃縮および採取の目的のために大容量の哺乳動物細胞を処理するために使用される技術である。例えば、Dorinら、Biotechnol.Prog.6:494、1990;Maiorellaら、Biotechnol.Bioeng.37:121、1991を参照のこと。この技術は、本発明における使用のためのヘルパーウイルスの調製のために懸濁培養物を用いて使用することが推奨される。HeLa S3細胞は、750〜1500秒-1の剪断力に耐え、これにより細胞の濃縮および使用した培地のダイアフィルトレーションが可能になる。
【0122】
ウイルスを、使用した培地からまたはその細胞の微量流動化によるかのいずれかで、その培養物から採取する。その培養物において産生されたヘルパーウイルスのレベルは、代表的に少なくとも107IU/mlであり、そして好ましくは少なくとも約3×107IU/mlである。
【0123】
上記の記載に従って調製されたヘルパーウイルスは、rAAV複製のために使用される宿主細胞を感染させるために直接使用され得る。より通常には、このウイルスは、使用前に単離および濃縮される。ヘルパーウイルスを精製および濃縮するための現在の方法は、代表的には、等密度CsCl勾配を含む。この方法は、時間集約的および労働集約的であり、多数の開放処理工程を必要とし、そして規模拡大が困難である。その代わり、クロマトグラフィーによる精製が推奨される。読者は一般に、Priorら、Pharmaceut.Technol.19:30、1995;およびHuygheら、Human Gene Therapy 6:1403、1995を参照する。アデノウイルスの温度感受性株の単離のために特に好ましいのは、アニオン交換クロマトグラフィー、特にpH7.4での連続的なNaCl勾配を用いるポリエチレンイミンの樹脂においてである。
【0124】
(本発明における使用のために好ましい、AAVの産生および精製)
ヘルパーウイルスを用いる場合、例示の目的で、「上流」および「下流」のプロセス相へとAAVの産生および精製の議論を分割することが簡便である;「上流」プロセスとは、一般的に、適切な宿主細胞におけるAAVの産生、および「粗」AAV調製物を産生するためにその細胞からそのウイルスを放出することをいう。「下流」プロセシングは、そのAAV調製物を精製するために使用され得る(例えば、細胞タンパク質および/または他の混入物からAAVを単離するために)。
【0125】
本発明の好ましい局面において、AAVの上流および下流のプロセシングは、混入する細胞タンパク質、ならびに混入する任意のヘルパーウイルス(例えば、Ad)またはヘルパーウイルスタンパク質を実質的に減少および/または除去するように設計された様式で実施される。これらの物質のいずれも、遺伝子移入のために使用される最終のrAAVベクター調製物において実質的なレベルで存在する場合、免疫応答の誘発に寄与し得る。
【0126】
以下の節は、例示の目的で、rAAVの産生のために使用され得る技術を記載する。
【0127】
((i)AAV上流処理)
AAVベクターは、必要なAAVパッケージング遺伝子(例えば、AAV repおよびcap遺伝子);少なくとも1つのAAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)プロベクター;およびAAVのためのヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)を含む、哺乳動物細胞株から産生され得る。これらの成分は、種々の構成で細胞中に導入され得る。AAVは、任意の種々の哺乳動物細胞において複製され得そしてパッケージングされ得るので、AAVの産生のために改変され得そして使用され得る多数の細胞株が存在する。
【0128】
例示のために、AAVベクターは、細胞株(例えば、「C12」(K.R.Clarkら、Gene Therapy、3:1124−1132、1996によって記載される)または「C137.5」株(Targeted Genetics Corporation、J.Allenら、WO96/17974による、共有に係る同時係属中の出願に記載される)から産生され得る。この細胞株は、repおよび/またはcap構築物ならびにベクター構築物を含むように操作されている。必要に応じて、repおよび/またはcap構築物を含む、C12またはcl37のような細胞株は、ベクター構築物を含むプラスミド(例えば、ptgAAV−CF)でトランスフェクトされ得る。または、repおよびcapを含むプラスミド(例えば、pRS5)、ならびにベクター構築物を含むプラスミドで細胞がトランスフェクトされ得る。この細胞は、アデノウイルスに感染させられ得るか、またはアデノウイルス遺伝子を含むDNAでトランスフェクトされ得る。
【0129】
種々のこのようなAAV「プロデューサー」細胞が、本明細書において引用された参考文献および当該分野で記載されるように、産生され得る。
【0130】
AAVプロデューサー細胞は、哺乳動物細胞の増殖に一般的に適切であり、AAV複製にもまた一般的に許容性である条件(培地、温度などを含む)下で増殖され得る。例えば、DMEM/F12懸濁培地は、その細胞の増殖について好ましく、そしてDMEM培地単独は、AAVベクター産生について好ましい。当該分野で公知であるように、いくつかの細胞型および細胞株は、接着依存性である傾向にあるが、他の細胞は、懸濁物中で増殖し得;そして多くの接着依存性細胞もまた、懸濁増殖し得る改変体について富化しそして最終的に選択する手段として懸濁条件下で細胞のサイクルを行うことにより、懸濁物中での増殖に「適合」され得る。従って、AAV産生のための細胞増殖は、その選択されたプロデューサー細胞株が、比較的接着依存性であるか、または懸濁適合されているか否かに一部依存して、任意の種類の容器において、実施され得る。接着依存性細胞の増殖のためのこのような容器はとして、例えば、組織培養フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアおよびバイオリアクター(例えば、中空繊維、充填ベッドまたは流動化ベッドのバイオリアクター)が挙げられる。懸濁適合した哺乳動物細胞株のための容器としては、例えば、スピナーフラスコ、タンクリアクター、およびエアリフト醗酵槽が挙げられる。
【0131】
AAV複製は、一定時間、およびウイルス産生が最適になる、増殖周期における点まで進行し(好ましくは、中期から後期の対数増殖期(代表的には1〜3日間))、その時点の後、そのウイルス粒子を培養上清から採取する。
【0132】
接線流濾過(TFF)は、大容量の細胞をプロセスしそして採取するために都合よく使用され得る。TFFは、動物細胞を灌流し、濃縮し、そして採取するために使用され得る。例えば、TFFを使用して、1秒あたり3000までの平均壁剪断速度での層流条件下で細胞をプロセスし得る(例えば、Maiorella、B.ら、Biotechnology and Bioengineering,37:121−126、1991)。TFF限外濾過を用いるウイルスの大規模濃縮は、R.Paulら、Human Gene Therapy、4:609−615、1993により記載されている。
【0133】
このような技術を用いた例示的な産生の実施は、以下に記載される。
【0134】
((ii)AAV下流処理)
上記に記載されるように、ヘルパーウイルス粒子(例えば、Ad粒子)を実質的に含まないAAVの調製物を得ることは特に有利である。さらに、AAVベクター調製物はまた、好ましくは、ヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質(これはまた、免疫原性であり得る)を実質的に含まない。しかし、AAV産生のための技術の適性に影響を与えるさらなるセットの限定が存在する。すなわち、遺伝子治療のためのAAVの産生に特に有用であるために、その技術は、「大規模化可能」である(すなわち、大規模製造用デバイスおよび手順に関して適用可能である)ことが最も所望される。この後者のセットの限定は、塩化セシウム分離(これは、大規模調製手順にはあまり適していない)のような利用可能な標準的な技術の有用性を有効に減少または排除する。
【0135】
好ましくは、rAAV粒子は、例えば、AAVまたはAdの可能な精製について当該分野において言及されている種々の手順とは対照的である、イオン交換クロマトグラフィー手順によってさらに精製される。特に、当該分野で記載されているこのような手順は、代表的に、単一の型のイオン性分離、時に他の種類のクロマトグラフィー手順との組合せを使用する(例えば、K.Tamayoseら、Human Gene Therapy 7:507−513(1996)、およびWO96/27677、1996年9月12日を参照のこと)。しかし、AAV産生の場合、連続的な反対のイオン交換クロマトグラフィーの組合せが、ヘルパーウイルス粒子およびタンパク質、ならびに細胞タンパク質を実質的に含まないAAV調製物の生成に特に有効である。両方の反対のイオン性交換の組合せは、その生成およびAAVベクター調製物において代表的に生じる種々の粒子およびタンパク質混入物の全て除去するのに特に有効である。
【0136】
任意の種々のカチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂がこれらの手順に関して使用され得、その基礎的な特性は、それぞれ、負荷電基および正荷電基の利用可能性であり、それらの基に対して、AAVは、少なくともある程度(最も好ましくは、上記に記載のような1つ以上の混入物、すなわち、Ad粒子およびタンパク質、ならびに哺乳動物細胞タンパク質の相対的結合親和性とは実質的に異なる程度に)結合し得る。理論に拘束されることは望まないが、アニオン交換工程は、アデノウイルスからAAVを分離するのに特に有効であると考えられる;一方、両方の工程(しかし、特にカチオン交換工程)が、細胞タンパク質からAAVを分離するのに特に有効であると考えられる。本発明者らはまた、以下に記載および例示されるように、アニオン交換、次いで接線流濾過を使用した。以下にさらに記載されるように、本発明者らは、AAV調製物がヘパリン硫酸上のクロマトグラフィーによって高度に濃縮され得ることを見出した。
【0137】
例示のために、上記のように明澄化したAAV溶解物は、正に荷電したアニオン交換カラム(例えば、N荷電アミノ樹脂またはイミノ樹脂(例えば、POROS 50 PI、または任意のDEAE、TMAE、三級アミンもしくは四級アミン、またはPEIベースの樹脂))または負に荷電したカチオン交換カラム(例えば、HS、SP、CMまたは任意のスルホ、ホスホ、もしくはカルボキシベースのカチオン樹脂)にロードされ得る。そのカラムは、緩衝液(例えば、クロマトグラフィー緩衝液A/TMEG)で洗浄され得る。そのカラムは、NaCl濃度の増加勾配で溶出され得、そして画分が集められ得、そしてAAVおよび/または混入物の存在についてアッセイされ得る。
【0138】
他の手順が、当該分野で公知なように、荷電以外の特徴によって媒介される分子間会合に基づいて、上記のアニオンおよびカチオン交換手順に代わり、好ましくはそれに加えて、使用され得る。このような他の手順は、リガンド−レセプター対(例えば、抗体−抗原、またはレクチン−炭水化物相互作用)に基づく分子間会合、ならびにその分子の他の属性に基づく分離(例えば、サイズおよび/または形状に基づく分子篩クロマトグラフィー)を含む。ほんの1つの例をみると、濾過物または部分精製したAAV調製物が、AAV特異的抗体を含むカラムにロードされ得る。このカラムは、AAVを結合し得る。このカラムは、緩衝液でリンスして、混入するタンパク質を除去し得、次いで漸増濃度のNaClの勾配または段階を用いて溶出し、そして画分が集められ得る。あるいは、このようなカラムは、ロード緩衝液のpHとは異なるpHの緩衝液で溶出され得る。
【0139】
AAVおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイあるいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分において同定され得る。このピークをプールし得、そしてそのプールを緩衝液(例えば、TMEGまたは等価物)を用いて希釈または透析またはダイアフィルトレートして塩濃度を減少させ得る。
【0140】
このプールは、正に荷電したアニオン交換カラムおよび/または負に荷電したカチオン交換カラム(例えば、上記に言及されるもの)に注入され得る。このカラムは緩衝液(例えば、クロマトグラフィー緩衝液A/TMEG)で洗浄され得る。このカラムは、漸増濃度のNaClの勾配で溶出され得、そして画分が集められ得る。AAVおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイによってあるいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分中で同定され得る。そのピークは、これらのアッセイのいずれかの結果に基づいてプールされ得る。
【0141】
上記のアニオン交換カラムから溶出されたAAV含有画分のプールは、接線流濾過(TFF)(例えば、Filtron UltrasetteまたはMillipore Pelliconユニット)によって濃縮され得そして精製され得る。適切な分子量カットオフ(例えば、100,00または300,000カットオフ)のメンブレンは、代表的に再生セルロースまたはポリエーテルスルホンのようなポリマーから構成される。この調製物は、そのメンブレンを通して濾過され、そしてその産物が保持される。保持された物質は、リンゲル平衡塩溶液および5%グリセロールのような適切な緩衝液の連続的な洗浄を使用して、そのメンブレンを用いてダイアフィルトレートされ得る。最終のサンプルは、その産物について非常に富化されており、そして0.2μフィルターを通して滅菌濾過され得、そして使用のために保存され得る。
【0142】
接線流濾過を用いたアニオン交換カラム後の物質からのAAVの精製および濃縮において、300,000分子量カットオフメンブレンは、100,000分子量カットオフメンブレンよりも、高収量の複製単位をもたらした。
【0143】
アデノウイルスの除去のために用いられ得る、さらなる工程は、所望である場合、熱不活化工程(本明細書において記載されるような)を用いた溶離液プールを処理する工程、次いで濾過(例えば、その調製物をTTFに供する前に)を包含する。しかし、本発明者らは、上記の「アニオン交換からTFF」手順が検出可能なアデノウイルスを含まないAAV調製物を生じ、そしてより良い収率の精製されたAAVをもたらしたこと見い出した。
【0144】
例示的な産生は、以下に記載されるような技術を使用して行う。
【0145】
上記の記載は、とりわけ、ヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)および細胞タンパク質を実質的に含まない組換えAAVベクターの高力価の調製物を生成するための方法を提供する。本発明の精神から逸脱することなく、これらの方法に改変が当業者によって適用されることが理解される。
【0146】
以下に提示される実施例は、当業者にとってさらなるガイドとして提供され、そしていかなる形でも限定することは意図されない。
【0147】
(実施例)
(実施例1)
(一般的な方法)
(ベクター調製物中のrAAV力価の定量:スロットブロットアッセイ)
rAAV DNAスロットブロットアッセイを以下のように行った。サンプルのアリコートを、ヌクレアーゼで消化して、キャプシド化していないDNAを除去した。次いで、このサンプルを、1.0μg/mlサケ精子DNAとともに0.4M NaOH、10mM EDTA中65℃で変性した。サンプルおよびrAAV標準物を希釈し、そしてスロットブロットマニホールドを用いてナイロンメンブレン上に濾過し、そして0.4M NaOHで洗浄した。このフィルターを、32P標識したヒトCFTR cDNA制限フラグメントとハイブリダイズした。このプローブは、AAVCFベクターから約1.5kbのフラグメント(予測した1.448kbのEcoRIフラグメントに対応する)を検出した。
【0148】
(rAAVを測定するためのマイクロタイター感染度アッセイ)
マイクロタイター感染度アッセイを以前に記載のように行った。Atkinsonら、(1998)Nucleic Acids Research 26(11):2821−2823。簡潔には、感染性ウイルスを測定するための高スループットマイクロタイター感染度アッセイを以下のように行った。系列希釈された細胞を含まない上清のアリコート(10μl)を、96ウェルのマイクロタイタープレート中で増殖させたHeLaクローン37細胞に接種した。3日後、感染細胞を、変性溶液(1/10容量の4.0M NaOH、10μg/mlサケ精子DNAおよび100mM EDTAの添加)で処理および溶解させた。溶解物を、Silent Monitor BiodyneBプレート(Pall)に移し、そしてナイロンメンブレン上に真空濾過した。このメンブレンを洗浄し、変性し、32P標識したヒトCFTR cDNA制限フラグメントとハイブリダイズした。このプローブは、AAVCFベクターから約1.5kbのフラグメント(予測した1.448kbのEcoRIフラグメントに対応する)を検出した。ベクター複製を、内因性ゲノムCFTRバンドと比較して定量化し、そして複製単位として表現した。1複製単位(RU)は、約1.8kbである内因性ゲノムCFTRバンドのシグナル強度に相当するシグナル強度として規定される。系列希釈された既知のベクター標準物の直線回帰を用いて、サンプル中のベクター濃度を外挿および計算した。
【0149】
(産生培地)
表1および表2は、細胞の増殖およびrAAVの産生に適切な培地成分の濃度を(mg/lで)提供する(ブランクは、濃度0を示す)。一般には、血清レベルが減少することが好ましい。例えば、これらの実験に使用した培地は、約1%ウシ胎児血清(FBS)を含んだ。
【0150】
【表1】
【0151】
【表2】
【0152】
(実施例2)
(プロデューサー細胞溶解物におけるrAAVベクター粒子産生に対するpHの効果)
JL14細胞を、3リットルのバイオリアクター中に約3×105細胞/mlで接種し、表2中に示される1.5リットルのrAAV培地中で増殖させた。JL14細胞でバイオリアクターにおける培養培地を接種した2日後、このバイオリアクターに、新鮮な培地を注ぎ、1日あたり0.4容量で開始し、次いで、その後24時間毎にこの量を2倍にした。5日後、または細胞密度が6×106細胞/mlに達したときに、3×108細胞を取り出し、そして標準条件(すなわち、pHを変化させる)下で増殖させた。バイオリアクター中に維持した細胞を、750mlの培養培地の容量に濃縮し、そして3容量の培地交換を、pH7.2の産生培地(すなわち、表2の培地)で行って、培地を交換し、その結果、細胞培養物の最終容量は750mlであった。アデノウイルス5型は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Manassas、VA)から入手したストックから増殖させた。アデノウイルスを750mlの産生培地に希釈し、そしてこの細胞に添加し(感染多重度(MOI)=10)、1.5リットルの最終容量にした。アデノウイルスでの感染を、37℃にて1時間進行させた。
【0153】
感染を進行させた後、1×105細胞を、5つの別々のスピナーフラスコの各々に移した。5つのフラスコ中の容量を、それぞれ、pH6.6、7.0、7.2、7.4、および7.8の産生培地で1.5リットルにした。スピナーフラスコの内容物を別々のバイオリアクターに移し、次いで、これを個別に、pH6.6、7.0、7.2、7.4、および7.8で維持した。他の培養培地パラメーターは以下の通りであった:温度=37℃;溶存酸素濃度(DO2)=30%;および攪拌=150rpm。
【0154】
温度、pH、DO2、細胞密度、浸透圧モル濃度、およびグルコース/ラクテートを、毎日モニターした。細胞サンプルを感染後2日目および3日目に採取し、そして溶解させた。細胞溶解物を、DNAse耐性粒子(DRP)スロットブロットアッセイおよびマイクロタイター感染度アッセイによってアッセイした。
【0155】
図1Aおよび1Bは、様々なpHレベルでの細胞あたりのDRPを表した、2つの別々の実験の結果を示す棒グラフである。黒棒は、感染後2日目のDRP/細胞を示す;斜線棒は、3日目のDRP/細胞を示す。pH7.2、pH7,4およびpH7.8にて維持した培養物中のDRP/細胞は、感染後2日目および3日目から劇的に減少したが、この減少は、コントロール細胞培養物においては見られなかった。総細胞密度は、これらの培養条件のもとでは認め得るほどに変化しなかった。
【0156】
(実施例3)
(細胞培養培地へのrAAVベクター粒子の放出に対するpHの効果)
簡単には、AAVプロデューサー細胞をバイオリアクター中で増殖させた。次いで細胞にMOI=10でAd5を感染させ、そしてこれを1.5リットルのバイオリアクター中の懸濁液中の低血清培地(表2を参照のこと)に接種した。培養物を多様な高いpHレベル(7.2から8.0)で維持した。次いで培養物を、細胞数、生存度、グルコース消費、乳酸産生、pH、浸透圧モル濃度、およびAAV産生について毎日モニターした。以下に示されるように、pHが7.4まで上昇した場合、AAV産生に増加が見られた;上清中に放出されたAAV粒子の数のさらにより劇的な増加を伴った(これはpHが上昇するにつれ増加した):
【0157】
【表3】
【0158】
要するに、pHが上昇するにつれて、本発明者らは、上清中に放出されたAAV粒子の数の急激な増加、および上清:細胞結合粒子のパーセンテージのシフト(pH7.2でほとんど全てが細胞結合から、pH8.0でほとんどが上清である(92%)まで)を観察した。
【0159】
rAAVベクター産生に対するpHの効果をさらに評価するために、JL14細胞を、注入バイオリアクター中で上記のように(表1に記載される培地を使用する)107細胞/mlの密度まで増殖させた。この細胞培養物を、750mlの容量まで濃縮し、そしてその培地を、3回ダイアボリューム(diavolume)を行うことによって交換した。総容量を、10のMOIでアデノウイルスを含む産生培地で1.5リットルにした。感染を、1時間進行させた。
【0160】
感染を進行させた後、1×105細胞を、5つの別々のスピナーフラスコの各々に移した。5つのフラスコ中の容量を、pH7.2、7.4、7.6、7.8および8.0の産生培地で1.5リットルにし、そしてコントロールフラスコにした(pHは開始レベルで維持しない)。スピナーフラスコの内容物を別々のバイオリアクターに移し、次いで、これを個別に、pH6.6、7.0、7.2、7.4、および7.8で維持した。バイオリアクターを、定常レベル±0.05pH単位のpHに維持した。他の培養培地パラメーターは以下の通りであった:温度=37℃;溶存酸素濃度(DO2)=30%;および攪拌=150rpm。細胞および培養上清(培養培地)を、2日目および3日目に採取した。
【0161】
結果を、図2Aおよび2Bに示す。図2Aおよび2Bは棒グラフであり、そして様々なpHレベルで維持したバイオリアクターにおけるrAAV産生の結果を示す(総DRPとして表す)。各棒の上の百分率は、細胞溶解物中の総DRPのパーセンテージである。各棒の黒い部分は、細胞溶解物中のDRPを示し、一方、各棒の斜線部分は、細胞培養培地中のDRPを示す。感染の2日後に、総DRPの29%が、pH8.0で維持した培養の培養培地中にあり、一方、感染の3日後に、培養培地における総DRPの百分率は、92%に上昇した。感染の3日後に、培養培地中の総DRPのパーセントは、pH7.4で67%、pH7.6で82%、pH7.8で73%およびpH8.0で92%であった。pH7.2で維持した培養は、この実験における細胞培養培地中ではDRPを全く生じなかった。
【0162】
pH7.2、7.4、7.6、7.8および8.0で維持したバイオリアクターからの感染の2日後および3日後の細胞溶解物および培養培地を、感染度アッセイを用いて複製単位(RU)についてアッセイした。このデータを、図3Aおよび3Bに示す。総細胞密度は、これらの培養条件下では明らかには変化しなかった。
【0163】
図3Aおよび3Bは、示したpHレベルで培養を維持した場合の、培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解物(各棒の黒い部分)における感染の2日後(3A)および3日後(3B)にアッセイした総複製単位(RU)を示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総RUのパーセンテージを示す。これらのデータは、細胞培養培地中に放出されたrAAV粒子が、感染度アッセイにおいて機能的であることを実証する。
【0164】
図4は、示したpHレベルで維持したバイオリアクターからの、感染の3日後の細胞溶解物(各棒の黒い部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)から採取したrAAV粒子の粒子:感染度(P/I)比を示す棒グラフである。これらのデータは、細胞培養培地中に放出されたrAAVベクターの大部分が感染性であることを示す。
【0165】
(実施例4)
(細胞培養培地へのrAAVベクター粒子の放出の対する浸透圧モル濃度の効果)
培養培地における開始時の浸透圧モル濃度の、細胞培養培地へのrAAVの放出に対する効果をアッセイするために、JL14細胞を、本質的に実施例2に記載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。個々のバイオリアクターにおける開始時の重量オスモル濃度を、それぞれ、130、200、300、400、および500 mOsmにした。各リアクターにおいて、そのpHを、pH8.0(±0.05);温度=37℃;DO2=30%;およびs攪拌=150rpmに維持した。感染の2、3および4日後に、細胞溶解物および細胞培養培地を収集し、そしてrAAVベクター産生について分析した。
【0166】
結果を図5〜7に示す。
【0167】
図5A、5Bおよび5Cは、示した開始時重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおける、感染の2日後(5A)、3日後(5B)および4日後(5C)に細胞培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解物(各棒の黒い部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総DRPのパーセンテージを示す。これらのデータは、細胞培養培地が300 mOsmの開始時重量オスモル濃度を有する場合に、総DRPの41%、59%、および80%が、それぞれ、2、3、および4日目に細胞培養培地中に存在することを示す。300 mOsmの開始時の細胞培養培地の重量オスモル濃度は、試験した他の開始時重量オスモル濃度と比較して、細胞培養培地中の総rAAVベクターの最大パーセンテージを与えた。総細胞密度は、これらの培養条件下では明白には変化しなかった。
【0168】
図6A、6Bおよび6Cは、示した開始時重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおける、感染の2日後(6A)、3日後(6B)および4日後(6C)に細胞培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解物(各棒の黒い部分)における総RUを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総RUのパーセンテージを示す。これらのデータは、培地に放出されたrRRVベクターが感染性であることを示す。
【0169】
図7は、示した開始時重量オスモル濃度を有するバイオリアクターからの、3および4日目の細胞培養培地中のrAAV粒子のP/I比を示す棒グラフである。
【0170】
(実施例5)
(細胞培養培地へのrAAVベクター粒子の放出に対する温度の効果)
JL14細胞を、本質的に実施例2に記載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。細胞を、31℃、34℃、37℃、39℃、および42℃にそれぞれ個別に維持したバイオリアクターに移した。これらの温度を、±0.5℃に維持した。各リアクター中のpHを、8.0(±0.05);攪拌=150rpm;DO2=30%に維持した。感染の2、3および4日後に、細胞溶解物および細胞培養培地を、rAAV粒子について分析した。
【0171】
結果を図8および9に示す。
【0172】
図8A〜Cは、示した温度で細胞培養培地を維持したバイオリアクターにおける、感染の2日後(8A)、3日後(8B)および4日後(8C)に細胞培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解物(各棒の黒い部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総DRPのパーセンテージを示す。このデータは、培養培地を39℃で維持した場合に、総DRPの66%、67%、および57%が、それぞれ2、3、および4日で細胞培養培地中に見出されたことを示す。このデータはさらに、培養培地を39℃で維持した場合に、37℃または42℃に比べて、より高いパーセンテージのDRPが細胞培養培地中に見出されたことを示す。
【0173】
図9A、9Bおよび9Cは、示した温度で細胞培養培地を維持したバイオリアクターにおける、感染の2日後(9A)、3日後(9B)および4日後(9C)に細胞培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解物(各棒の黒い部分)における総RUを示す棒グラフである。図9Aにおける各棒の上のパーセンテージは、細胞培養培地における総RUのパーセンテージを示す。図9Aにおける各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総RUのパーセンテージを示す。このデータは、培養培地を39℃で維持した場合に、総RUの80%、97%、および98%が、それぞれ2、3、および4日目に細胞培養培地中に見出されたことを示す。総細胞密度は、これらの培養条件下で明白には変化しなかった。
【0174】
(実施例6)
(細胞培養培地へのrAAVベクター粒子の放出に対する培養培地補充物の効果)
JL14細胞を、本質的に実施例2に記載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。細胞を、以下のような様々な培地を含むバイオリアクターに移した:(1)DMEM;(2)DMEM+4g/リットル グルコース;(3)DMEM+4g/リットル グルコース+4mMグルタミン;(4)DMEM+4g/リットル グルコース+4mMグルタミン+アミノ酸+ビタミン(「完全」);(5)2×DMEM。全ての開始時重量オスモル濃度を、285〜300 mOsmに調整した。他のパラメーターを以下の通りに した:温度を39℃に維持した;pHを 8.0に維持した;DO2=30%;および攪拌=150rpm 。感染の3日後に、細胞培養上清を、rAAVベクター粒子についてアッセイした。
【0175】
これらの結果を、図10、11、および12に示す。
【0176】
図10は、示した様々な培地中で増殖させる培養における、感染の3日後の培養培地中の総DRPを示す棒グラフである。
【0177】
図11は、示した様々な培地中で増殖させる培養における、感染の3日後の培養培地中の総RUを示す棒グラフである。
【0178】
図12は、示した様々な培地中で培養物を増殖させた場合の、細胞培養培地中のウイルス粒子のP/I比を示す棒グラフである。
【0179】
前述の本発明を例示および理解の明白さの目的のための例としていくらか詳細に示したが、当業者が、特定の変化および改変を実施することは明らかである。それゆえ、記載および例は、添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1Aおよび1Bは、種々のpHレベルでの、細胞あたりのDNase耐性粒子(DRP)として表される、2つの個別の実験の結果を示す棒グラフである。示されるpHレベルに細胞培養物を維持し、そして細胞溶解産物を、感染後2日目(黒色棒)および感染後3日目(斜線棒)にアッセイした。
【図1B】 図1Aおよび1Bは、種々のpHレベルでの、細胞あたりのDNase耐性粒子(DRP)として表される、2つの個別の実験の結果を示す棒グラフである。示されるpHレベルに細胞培養物を維持し、そして細胞溶解産物を、感染後2日目(黒色棒)および感染後3日目(斜線棒)にアッセイした。
【図2A】 図2Aおよび2Bは棒グラフであり、そしてこれは、種々のpHレベルで維持されたバイオリアクターにおける、感染後2日目(2A)および感染後3日目(2B)の、総DRPとして表されるrAAV産生の結果を示す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総DRPの百分率である。各棒の黒色部分は細胞溶解産物中のDRPを表し、一方、各棒の斜線部分は細胞培養培地中のDRPを表す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総DRPの百分率を示す。
【図2B】 図2Aおよび2Bは棒グラフであり、そしてこれは、種々のpHレベルで維持されたバイオリアクターにおける、感染後2日目(2A)および感染後3日目(2B)の、総DRPとして表されるrAAV産生の結果を示す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総DRPの百分率である。各棒の黒色部分は細胞溶解産物中のDRPを表し、一方、各棒の斜線部分は細胞培養培地中のDRPを表す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総DRPの百分率を示す。
【図3A】 図3Aおよび3Bは、示されるpHレベルに培養物を維持した場合の、細胞培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解産物(各棒の黒色部分)における、感染後2日目(3A)および感染後3日目(3B)の総複製単位(RU)を示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図3B】 図3Aおよび3Bは、示されるpHレベルに培養物を維持した場合の、細胞培養培地(各棒の斜線部分)および細胞溶解産物(各棒の黒色部分)における、感染後2日目(3A)および感染後3日目(3B)の総複製単位(RU)を示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図4】 図4は、示されるpHに維持されたバイオリアクター由来の、感染後3日目に細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)から収集したrAAV粒子の粒子:感染性(P/I)比率を示す棒グラフである。
【図5A】 図5A、5B、および5Cは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後2日目(5A)、感染後3日目(5B)、および感染後4日目(5C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総DRPの百分率を示す。
【図5B】 図5A、5B、および5Cは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後2日目(5A)、感染後3日目(5B)、および感染後4日目(5C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総DRPの百分率を示す。
【図5C】 図5A、5B、および5Cは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後2日目(5A)、感染後3日目(5B)、および感染後4日目(5C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総DRPの百分率を示す。
【図6A】 図6A、6B、および6Cは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後2日目(6A)、感染後3日目(6B)、および感染後4日目(6C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総RUを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図6B】 図6A、6B、および6Cは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後2日目(6A)、感染後3日目(6B)、および感染後4日目(6C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総RUを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図6C】 図6A、6B、および6Cは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後2日目(6A)、感染後3日目(6B)、および感染後4日目(6C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総RUを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図7】 図7は、示される開始重量オスモル濃度を有するバイオリアクター培養物由来の、3日目および4日目の細胞培養培地におけるrAAV粒子のP/I比率を示す棒グラフである。
【図8A】 図8A〜Cは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後2日目(8A)、感染後3日目(8B)、および感染後4日目(8C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総DRPの百分率を示す。
【図8B】 図8A〜Cは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後2日目(8A)、感染後3日目(8B)、および感染後4日目(8C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総DRPの百分率を示す。
【図8C】 図8A〜Cは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後2日目(8A)、感染後3日目(8B)、および感染後4日目(8C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総DRPを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総DRPの百分率を示す。
【図9A】 図9A、9B、および9Cは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後2日目(9A)、感染後3日目(9B)、および感染後4日目(9C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総RUを示す棒グラフである。図9Aの各棒の上部の百分率は、細胞培養培地における総RUの百分率を示す。図9Aの各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図9B】 図9A、9B、および9Cは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後2日目(9A)、感染後3日目(9B)、および感染後4日目(9C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総RUを示す棒グラフである。図9Bの各棒の上部の百分率は、細胞培養培地における総RUの百分率を示す。図9Bの各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図9C】 図9A、9B、および9Cは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後2日目(9A)、感染後3日目(9B)、および感染後4日目(9C)の細胞溶解産物(各棒の黒色部分)および細胞培養培地(各棒の斜線部分)における総RUを示す棒グラフである。図9Cの各棒の上部の百分率は、細胞培養培地における総RUの百分率を示す。図9Cの各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総RUの百分率を示す。
【図10】 図10は、示される種々の培地において増殖した培養において、感染後3日目の培養培地における総DRPを示す棒グラフである。
【図11】 図11は、示される種々の培地において増殖した培養において、感染後3日目の培養培地における総RUを示す棒グラフである。
【図12】 図12は、示される種々の培地において培養物を増殖した場合の、細胞培養培地におけるウイルス粒子のP/I比率を示す棒グラフである。
【図13A】 図13は、実施例6に記載の培地補給物についてのアミノ酸およびビタミン組成を提供する。
【図13B】 図13は、実施例6に記載の培地補給物についてのアミノ酸およびビタミン組成を提供する。
Claims (35)
- ウイルス粒子の集団を生成するための方法であって、
(a)ウイルス粒子の放出を促進する条件を含む条件下で、細胞培養培地中でプロデューサー細胞をインキュベートする工程を含み、それによりウイルス粒子が、細胞を溶解することなく該プロデューサー細胞から該培養培地へ放出される;ここで、ウイルス粒子の放出を促進する条件は:
(i)200mOsm〜500mOsmの重量オスモル濃度、29.5℃〜45.5℃の温度、および1g/L〜10g/Lのグルコース濃度から選択される1つ以上の条件を含み;および
(ii)6.95〜8.05のpH条件を含み;ならびに
(b)細胞を溶解することなく細胞培養培地からウイルス粒子を採取し、それによりウイルス粒子の集団を得る工程を包含し、ここで、ウイルスはアデノ随伴ウイルスであるところの、方法。 - 請求項1記載の方法であって、前記ウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)であり、そして、前記プロデューサー細胞が、以下:
(i)1つ以上のAAVパッケージング遺伝子であって、ここで該AAVパッケージング遺伝子の各々が、AAV複製タンパク質またはAAVキャプシド形成タンパク質をコードする、遺伝子;
(ii)少なくとも1つのAAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)ベクター;および
(iii)AAVについてのヘルパーウイルス機能;
を含む細胞である、方法。 - ウイルス粒子の放出を促進する条件が、重量オスモル濃度およびpH、温度およびpHまたは重量オスモル濃度、温度およびpHの組み合わせである、請求項1または2記載の方法。
- ウイルス粒子の放出を促進する条件が、重量オスモル濃度およびpHの組み合わせである、請求項3記載の方法。
- ウイルス粒子の放出を促進する条件が、温度およびpHの組み合わせである、請求項3記載の方法。
- ウイルス粒子の放出を促進する条件が、重量オスモル濃度、温度およびpHの組み合わせである、請求項3記載の方法。
- pHが7.15〜7.25、7.35〜7.45、7.55〜7.65、7.75〜7.85、または7.95〜8.05である、請求項3〜6のいずれか1項記載の方法。
- pHが7.35〜8.05である、請求項3〜6のいずれか1項記載の方法。
- pHが7.95〜8.05である、請求項7または8記載の方法。
- 培養培地の開始pHが7.95〜8.05である、請求項7〜9のいずれか1項記載の方法。
- 培養培地のpHが、培養中測定され、7.95〜8.05で維持される、請求項7〜10のいずれか1項記載の方法。
- 培養培地の重量オスモル濃度が、培養中測定され、200mOsm、300mOsm、400mOsm、または500mOsmで維持される、請求項3、4、および6〜11のいずれか1項記載の方法。
- 培養培地の重量オスモル濃度が、培養中測定され、200mOsm〜400mOsmで維持される、請求項3、4、および6〜11のいずれか1項記載の方法。
- 重量オスモル濃度が300mOsmである、請求項12または13記載の方法。
- 開始重量オスモル濃度が300mOsmである、請求項12〜14のいずれか1項記載の方法。
- 細胞培養培地の重量オスモル濃度が、NaClまたは他の塩、マンノースまたはグルコースを用いて調節される、請求項12〜15のいずれか1項記載の方法。
- 細胞培養培地の重量オスモル濃度が、NaClを用いて調節される、請求項16記載の方法。
- 温度が30.5℃〜31.5℃、33.5℃〜34.5℃、36.5℃〜37.5℃、38.5℃〜39.5℃、または41.5℃〜42.5℃である、請求項3および5〜17のいずれか1項記載の方法。
- 温度が36.5℃〜40.5℃である、請求項3および5〜17のいずれか1項記載の方法。
- 温度が38.5℃〜39.5℃である、請求項19記載の方法。
- グルコース濃度が4g/Lである、請求項1記載の方法。
- プロデューサー細胞が、ヘルパーウイルス機能の導入後48〜96時間培養される、請求項2〜21のいずれか1項記載の方法。
- ヘルパーウイルス機能が、ヘルパーウイルスによって提供される、請求項2〜22のいずれか1項記載の方法。
- 該ヘルバーウイルスが、アデノウイルスである、請求項23記載の方法。
- 請求項2〜24のいずれか1項記載の方法であって、
c)少なくとも1つの正に荷電したアニオン交換樹脂でrAAVプロデューサー細胞培養培地をクロマトグラフィーする工程;および
d)工程c)のrAAV粒子を含有するクロマトグラフィー画分を、カチオン交換クロマトグラフィーまたは接線流濾過によって精製して、rAAVベクター粒子の精製集団を生成する工程をさらに包含する、方法。 - 工程(d)が、カチオン交換クロマトグラフィーである、請求項25記載の方法。
- 工程(d)が、接線流濾過である、請求項25記載の方法。
- 請求項2〜24のいずれか1項記載の方法であって、
c)カチオン交換樹脂でAAVプロデューサー細胞培養培地をクロマトグラフィーする工程;
d)工程c)のrAAV粒子を含有するクロマトグラフィー画分を、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製する工程;および
e)工程d)のrAAV粒子を含有するクロマトグラフィー画分を、ヘパリン硫酸クロマトグラフィーによって精製し、rAAVベクター粒子の精製集団を生成する工程をさらに包含する、方法。 - 請求項2〜24のいずれか1項記載の方法であって、
少なくとも1つの正に荷電したアニオン交換樹脂および少なくとも1つの負に荷電したカチオン交換樹脂を含む複数のイオン交換樹脂でAAVプロデューサー細胞培養培地をクロマトグラフィーし、rAAVベクター粒子の精製集団を生成する工程をさらに包含する、方法。 - 該rAAVベクターが、2つのAVV逆方向末端反復(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む、請求項2〜29のいずれか1項記載の方法。
- 該AAVプロデューサー細胞が、該AAVプロデューサー細胞のゲノムに安定に組み込まれる少なくとも1つのAAVパッケージング遺伝子を含む、請求項2〜29のいずれか1項記載の方法。
- 該AAVプロデューサー細胞が、AAV rep遺伝子およびAAV cap遺伝子を含む、請求項2〜29のいずれか1項記載の方法。
- 該AAV rep遺伝子およびAAV cap遺伝子が、前記AAVプロデューサー細胞のゲノム中に安定に組み込まれている、請求項32記載の方法。
- 該プロデューサー細胞が、付着依存性哺乳動物細胞株である、請求項2〜33のいずれか1項記載の方法。
- 該プロデューサー細胞が、懸濁適合化哺乳動物細胞株である、請求項2〜33のいずれか1項記載の方法。
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