PT1109892E - Métodos para produzir preparações de vectores de aav recombinantes libertados, de título elevado, isentas de vírus auxiliares - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Métodos para produzir preparações de vectores de AAV recombinantes libertados, de titulo elevado, isentas de virus auxiliares"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se em geral ao campo de vectores de vírus adeno-associados (AAV) recombinantes e suas preparações que podem ser utilizados para a transferência de genes. Mais especificamente, refere-se a métodos para produzir preparações de título elevado de vectores de AAV recombinante que são substancialmente isentas de vírus auxiliares (e.g. adenovírus), bem como de proteínas celulares, por libertação de partículas virais a partir de células que os produzem, sem lise celular.

ANTERIORIDADE

Os vírus adeno-associados (AAV) têm características únicas que os tornam atractivos como vectores para terapia génica. Os vírus adeno-associados infectam uma vasta gama de tipos de células. No entanto, são não transf ormantes e não estão implicados na etiologia de nenhuma doença humana. A introdução de ADN em células hospedeiras receptoras leva geralmente a uma persistência duradoura e à expressão do ADN, sem perturbar o metabolismo normal da célula. Há pelo menos três características desejáveis que uma preparação de vector de AAV recombinante deve ter para ser utilizado na transferência de genes, em especial na terapia génica humana. Primeiro, é preferido que o vector seja produzido em títulos suficientemente elevados para transduzir uma proporção eficaz de células no tecido alvo. A terapia génica in vivo requer tipicamente um número elevado de partículas de vector. Por exemplo, alguns tratamentos podem necessitar de mais de 108 partículas e o tratamento da fibrose quística por entrega directa às vias respiratórias pode necessitar de mais de IO10 partículas. Segundo, é preferido que as preparações de vector sejam essencialmente isentas de AAV competentes para a replicação (i.e. AAV com o fenótipo do 2 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ tipo selvagem que podem ser replicados na presença de virus auxiliares, ou funções de virus auxiliares). Terceiro, é preferido que a preparação do vector de rAAV, como um todo, seja essencialmente isenta de outros virus (tais como um virus auxiliar utilizado na produção de AAV) assim como de virus auxiliares e proteínas celulares, e outros componentes, tais como lípidos e hidratos de carbono, de modo a minimizar ou eliminar qualquer risco de desencadear uma resposta imunitária no contexto da terapia génica. Este último ponto é especialmente significativo no contexto dos AAV, pois o AAV é um vírus “dependente de vírus auxiliares" que requer a co-infecção com um vírus auxiliar (tipicamente um adenovírus), ou que sejam proporcionadas outras funções de vírus auxiliares, de modo a ser eficazmente replicado e empacotado durante o processo de produção do AAV; e, além disso, verificou-se que o adenovírus produz uma resposta imunitária no hospedeiro no contexto de aplicações em terapia génica (ver, e.g., Byrnes et al., Neuroscience 66:1015, 1995; McCoy et al., Human Gene Therapy 6:1553, 1995; e Barr et al., Gene Therapy 2:151,1995). Os métodos da presente invenção referem-se a estas e outras características desejáveis das preparações de vectores de rAAV, como descrito e ilustrado em detalhe a seguir.

Podem encontrar-se revisões gerais sobre a virologia e genética dos AAV noutros locais. O leitor pode consultar inter alia Cárter, "Handbook of Parvoviruses", Vol. I, pp. 169-228 (1989) , e Berns, "Virology", pp. 1743-1764, Raven Press, (1990) . O AAV é um vírus deficiente para a replicação, o que significa que depende de um vírus auxiliar para completar o seu ciclo de replicação e empacotamento numa célula hospedeira. Os vírus auxiliares capazes de suportar a replicação do AAV são exemplificados pelos adenovírus, mas incluem outros vírus, tais como vírus de herpes e poxvírus. O genoma do AAV compreende geralmente os genes de empacotamento rep e cap, sendo as outras funções necessárias proporcionadas in trans pelo vírus auxiliar e pela célula hospedeira. A título ilustrativo, o genoma linear do serotipo AAV2 é terminado em qualquer das extremidades por uma sequência de repetição terminal invertida (ITR). Entre as ITR estão três promotores de transcrição p5, pl9, e p40 que são utilizados para expressar os genes rep e cap (Laughlin et al., 1979, 3 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5567-5571). As sequências de ITR são necessárias em cis e são suficientes para proporcionar uma origem de replicação funcional, integração no genoma da célula e excisão eficaz e recuperação a partir dos cromossomas da célula hospedeira ou plasmídeos recombinantes. Os produtos dos genes rep e cap proporcionam funções para a replicação e encapsidação do genoma virai, respectivamente, e é suficiente que estejam presentes em trans.

Os genomas de AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos por processos tais como adição de cauda GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:2077-2081), adição de ligantes sintéticos que contêm locais de clivagem de endonucleases de restrição (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73), ou por ligação directa, de extremidades rombas (Senapathy & Cárter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). A transfecção destes plasmídeos de AAV recombinantes em células de mamífero com um vírus auxiliar adequado resulta na recuperação e excisão do genoma de AAV isento de qualquer sequência de plasmídeo, replicação do genoma recuperado e produção de uma progénie de partículas de AAV infecciosas.

Os vectores de AAV recombinantes que compreendem um polinucleótido heterólogo de interesse terapêutico podem ser construídos substituindo porções da sequência codificante de AAV em plasmídeos bacterianos com o polinucleótido heterólogo. Os princípios gerais da construção do vector de rAAV também são revistos noutro local. Ver, e.g., Cárter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 3:533-539; e Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129). As ITR do AAV são geralmente retidas, uma vez que o empacotamento do vector requer que estejam presentes em cis. No entanto, podem-se omitir outros elementos do genoma de AAV, em particular, um ou mais dos genes de empacotamento. O vector plasmídico pode ser empacotado numa partícula de AAV fornecendo os genes de empacotamento omitidos em trans, através de uma fonte alternativa. Algumas publicações descrevem várias abordagens para produzir vectores de rAAV. Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). 4 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349 (1992); patente U.S. 5173414; WO 95/13365 (Targeted Genetics Corporation and Johns Hopkins University) e a patente US correspondente N.° 5658776 (de Flotte et al.); WO 95/13392 (Trempe et al.); WO 96/17947 (pela Targeted Genetics Corporation, J. Allen).

Uma vez que títulos elevados de preparações de vector de rAAV são particularmente úteis, mas a produção de títulos elevados de rAAV, em particular em procedimentos em grande escala, pode levar à produção de quantidades significativas de vírus auxiliares contaminantes (e.g. adenovírus ou "Ad"), proteínas de vírus auxiliares (e.g. proteínas Ad), e/ou proteínas celulares, tornou-se particularmente importante conceber métodos redimensionáveis para a produção de rAAV, que possam ser utilizados para a produção de preparações de título elevado que sejam substancialmente isentas de vírus contaminantes e/ou proteínas virais ou celulares.

Foram descritos métodos para produzir preparações de título elevado de vectores de AAV. O pedido de patente internacional No. PCT/US98/18600 descreve a cultura de uma linha celular que pode produzir vectores de rAAV por infecção com um vírus auxiliar; infectando as células com um vírus auxiliar, tal como um adenovírus; e lisando as células. Também são descritos AAV e outros métodos e sistemas de produção virai, por exemplo, em WO 97/09441 (PCT/US96/14423) ; WO 97/08298 (PCT/US96/13872) ; WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13 : 1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132 .

Os métodos da arte anterior utilizados para produzir partículas de AAV recombinantes utilizando células de empacotamento requeriam um passo de lise celular, devido à crença instalada de que o AAV não é libertado das células produtoras em quantidade apreciável a menos que as células sejam lisadas. Ver, por exemplo, Chirico e Trempe (1998); J. Virai. Methods 76:31-41 ou WO 95/06743. No entanto, o lisado celular contém vários componentes celulares que têm que ser 5 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ separados do vector de rAAV antes deste se tornar adequado para utilização in vivo. A presente descrição proporciona métodos para obter uma produção de titulo elevado de vectores de rAAV libertados a partir de uma célula produtora, sem lise das células e demonstra que estas técnicas podem ser utilizadas para a produção em grande escala de preparações de vectores de AAV recombinantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona métodos e materiais para produzir preparações de titulo elevado de vírus adeno-associados (AAV) que são substancialmente isentas de vírus auxiliares, proteínas de vírus auxiliares e proteínas e outros componentes celulares. Os métodos implicam libertar partículas de rAAV a partir das células produtoras, sem lise efectiva das células, como é típico na especialidade, o que oferece uma vantagem distinta e significativa em relação aos métodos de produção anteriormente descritos. Os métodos também são aplicáveis a vírus que não são líticos e/ou geralmente não são libertados (i.e., vírus sem gemulação).

Em particular, a presente invenção proporciona um método para produzir uma população de partículas de vírus, compreendendo os passos de: (a) incubar uma célula produtora num meio de cultura de células sob condições que compreendem uma condição que promove a libertação de partículas de vírus, sendo as partículas de vírus libertadas pelas células produtoras para o meio de cultura sem lise das células, e em que a condição que promove a libertação das partículas de vírus: (i) compreende uma ou mais condições seleccionadas de entre osmolalidade, temperatura, concentração de um determinado ião, densidade celular, concentração de oxigénio dissolvido, concentração de glucose, concentração de aminoácidos e uma condição que promove a sincronização do ciclo celular; e (ii) compreende pH; e 6 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ (b) recolher as partículas virais a partir do meio de cultura de células, sem lise das células, obtendo-se assim uma população de partículas virais; em que o vírus é um vírus adeno-associado (AAV). A invenção também proporciona métodos para produzir uma população de partículas de vírus, tais como partículas de vírus adeno-associados recombinantes (rAAV) , compreendendo o passo de a) incubar uma célula produtora num meio de cultura de células sob condições que promovem a libertação de partículas de AAV pela célula, sendo as partículas de rAAV libertadas pela célula produtora para o meio de cultura, e em que a célula produtora compreende (i) um ou mais genes de empacotamento de AAV, em que cada um dos referidos genes de empacotamento de AAV codifica para uma proteína de replicação ou encapsidação de AAV; (ii) um vector de AAV recombinante (rAAV) que compreende um polinucleótido heterólogo que não é de AAV flanqueado por pelo menos uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV; e (iii) um vírus auxiliar para AAV ou função de vírus auxiliar para AAV. As partículas de rAAV libertadas podem então ser recolhidas ou recuperadas a partir do meio de cultura. As condições que promovem a libertação de partículas virais de rAAV estão aqui descritas e incluem, mas não se limitam a, pH, osmolalidade, oxigénio dissolvido, meio enriquecido e temperatura.

Nalgumas concretizações, os métodos incluem também vários passos de purificação e/ou inactivação. Nalgumas destas concretizações, o método compreende também os passos de: cromatografar o sobrenadante de células produtoras de AAV em várias resinas de troca iónica compreendendo pelo menos uma resina de troca aniónica carregada positivamente e pelo menos uma resina de troca catiónica carregada negativamente, para produzir uma população purificada de partículas de vector de rAAV, ou cromatografar o sobrenadante das células produtoras de AAV numa resina de troca aniónica, seguida de filtração em fluxo tangencial (TFF). Também se pode utilizar cromatografia em sulfato de heparina para purificar ainda mais o vírus.

Nos métodos da invenção, a cultura de células pode ser realizada de um modo tal que as células ficam em suspensão, ou sob condições que promovam a aderência das células a um 7 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ suporte sólido. Deste modo, nalgumas concretizações, a célula produtora é cultivada num recipiente seleccionado do grupo constituído por frasco de cultura de tecidos, frasco rolante, frasco rotativo, tanque reactor, fermentador e biorreactor, reactor plano (flat stock reactor), sistema de fibra oca, reactor de leito empacotado e opcionalmente utilizando um microtransportador.

Nalgumas concretizações da invenção, as preparações de vectores de AAV recombinante produzidas pelos métodos resultam numa população purificada de partículas de vector de rAAV que é substancialmente isenta de AAV competentes para a replicação, e de vírus auxiliares e proteínas celulares, bem como substancialmente isento de ADN celular. O presente pedido também descreve uma população de partículas de rAAV, produzidas de acordo com qualquer um dos métodos de produção da presente invenção. Preferivelmente, a população de partículas não contém mais do que cerca de uma partícula de adenovírus infecciosa por mil partículas de rAAV infecciosas, preferivelmente menos do que uma por 106 rAAV, ainda mais preferencialmente menos do que cerca de uma em 109, ainda mais preferencialmente menos do que cerca de uma em IO10.

Estas e outras concretizações da invenção estão delineadas na descrição que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras IA e 1B são gráficos de barras que mostram os resultados de duas experiências separadas, expressos como partículas resistentes a ADNase (DRP) por célula, a vários níveis de pH. As culturas de células foram mantidas aos níveis de pH indicados e os lisados celulares foram testados no dia 2 (barras a cheio) e dia 3 (barras a tracejado) após a infecção.

As Figuras 2A e 2B são gráficos de barras e mostram os resultados, expressos como DRP totais, da produção de rAAV no dia 2 (2A) e dia 3 (2B) após a infecção, em biorreactores

mantidos a vários níveis de pH. As percentagens por cima de cada barra são percentagens de DRP totais no lisado celular. A 8 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ porção a cheio de cada barra representa as DRP em lisados celulares, enquanto que a porção a tracejado de cada barra representa as DRP no meio de cultura de células. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de DRP totais no lisado celular.

As Figuras 3A e 3B são gráficos de barras que mostram as unidades de replicação totais (UR), no dia 2 (3A) e dia 3 (3B) após a infecção, no meio de cultura (porção a tracejado de cada barra) e lisados celulares (porção a cheio de cada barra) quando as culturas foram mantidas aos níveis de pH indicados. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de UR totais no lisado celular. A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra a razão partícula:infecciosidade (P/I) das partículas de rAAV recolhidas de lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e do meio de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 3 após a infecção, a partir de biorreactores mantidos aos níveis de pH indicados.

As Figuras 5A, 5B e 5C são gráficos de barras que mostram as DRP totais em lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meios de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (5A), dia 3 (5B) e dia 4 (5C) após a infecção, em biorreactores em que o meio de cultura de células continha a osmolalidade de partida indicada. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de DRP totais no lisado celular.

As Figuras 6A, 6B, e 6C são gráficos de barras que mostram as UR totais em lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meios de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (6A) , dia 3 (6B) e dia 4 (6C) após infecção, em biorreactores em que o meio de cultura de células continha a osmolalidade de partida indicada. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de UR totais nos lisados celulares. A Figura 7 é um gráfico de barras que mostra a razão P/I de partículas de rAAV em meio de cultura de células nos dias 3 9 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ e 4, a partir de culturas em biorreactor com as osmolalidades de partida indicadas.

As Figuras 8A-C são gráficos de barras que mostram as DRP totais em lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meio de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (8A), dia 3 (8B) e dia 4 (8C) após infecção, em biorreactores em que o meio de cultura de células foi mantido à temperatura indicada. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de DRP totais no lisado celular.

As Figuras 9A, 9B e 9C são gráficos de barras que mostram as UR totais em lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meios de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (9A), dia 3 (9B) e dia 4 (9C) após infecção, em biorreactores em que o meio de cultura de células foi mantido à temperatura indicada. As percentagens por cima de cada barra na Figura 9A indicam a percentagem de UR totais no meio de cultura de células. As percentagens por cima de cada barra na Figura 9A indicam a percentagem de UR totais no lisado celular. A Figura 10 é um gráfico de barras que mostra as DRP totais no meio de cultura, três dias após a infecção, em culturas crescidas nos vários meios indicados. A Figura 11 é um gráfico de barras que mostra as UR no meio de cultura, três dias após infecção, em culturas crescidas nos vários meios indicados. A Figura 12 é um gráfico de barras que mostra a razão P/I de partículas virais nos meios de cultura de células quando as culturas foram crescidas nos vários meios indicados. A Figura 13 proporciona composições de aminoácidos e vitaminas para os suplementos de meios descritos no exemplo 6.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Desenvolvemos métodos para produzir preparações de título elevado de vírus adeno-associados (AAV) que são substancialmente isentas de vírus auxiliares, proteínas de 10 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ vírus auxiliares e proteínas celulares e outros componentes. Os métodos geralmente implicam fazer a cultura (que geralmente envolve manter) de células produtoras sob condições que promovem a libertação de partículas de rAAV pelas células produtoras.

Está bem estabelecido no campo dos AAV que os AAV não são libertados da célula a menos que a célula seja lisada, mas permanece no núcleo da célula. Deste modo, a crença estabelecida e universal é que para produzir partículas de rAAV, as células têm que ser Usadas. Ao contrário dos ensinamentos neste campo, verificámos que as partículas de rAAV podem ser libertadas das células sem lise das células e, além disso, que a libertação de partículas de rAAV pode ser aumentada mantendo as células produtoras sob várias condições ambientais controladas. Utilizando estas condições, as partículas de rAAV podem ser produzidas a títulos mais elevados do que os anteriormente obtidos. As células cultivadas nas condições aqui descritas produzem mais vírus por célula e libertam mais vírus para o meio de cultura e, ainda de maior relevância, podem libertar uma população de AAV com maior infecciosidade do que os AAV que são retidos na célula. Por outras palavras, a razão entre partículas resistentes a ADNase e a infecciosidade pode ser menor na população de AAV libertados para o meio de cultura celular, em comparação com esta razão para AAV retidos na célula (ver, e.g., Figura 4). Além disso, uma vez que a lise não é um passo obrigatório nos métodos da presente invenção, as partículas de rAAV podem ser recolhidas a partir do sobrenadante celular, simplificando assim os passos de purificação opcionais subsequentes. Alternativamente, também se poderá fazer a lise.

Nalgumas concretizações, a invenção proporciona métodos de libertação, ou libertação preferencial, de partículas virais infecciosas. Esta libertação preferencial de partículas infecciosas é particularmente significativa no contexto da produção virai, em que é altamente desejável produzir uma população que contenha um grande número de partículas infecciosas, em oposição a partículas não infecciosas.

Deve entender-se que os métodos e princípios aqui descritos são aplicáveis a vários outros vírus que são 11 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ normalmente retidos (i.e., não libertados), em particular adenovirus. O AAV é aqui exemplificado. A seguir descrevem-se com detalhes vários métodos para a produção e processamento de partículas de AAV em células de mamífero e também se fornecem ilustrações da utilização destas técnicas nos Exemplos seguintes. As partículas de rAAV produzidas pelos métodos da presente invenção são particularmente úteis como vectores de transferência de genes. Os métodos de utilização destes vectores são conhecidos na especialidade e não é necessário descrevê-los aqui. A título de introdução, é típico utilizar uma célula hospedeira ou "produtora" para replicação e empacotamento do vector de rAAV. Uma célula produtora deste tipo (normalmente uma célula hospedeira de mamífero) geralmente compreende, ou é modificada para compreender vários tipos diferentes de componentes para produção de rAAV. O primeiro componente é um genoma de vector virai adeno-associado recombinante (rAAV) (ou "pró-vector de rAAV") que pode ser replicado e empacotado em partículas de vector pela célula de empacotamento hospedeira. 0 pró-vector de rAAV compreenderá normalmente um polinucleótido heterólogo (ou "transgene"), com o qual é desejável alterar geneticamente outra célula no contexto da terapia génica (uma vez que o empacotamento de um transgene deste tipo em partículas de vector de rAAV pode ser utilizado eficazmente para fornecer o transgene a uma variedade de células de mamífero). O transgene é preferivelmente flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITR) de AAV que compreendem sequências que são reconhecidas durante a excisão, replicação e empacotamento do vector de AAV, bem como durante a integração do vector no genoma de uma célula hospedeira. Um segundo componente é um vírus auxiliar que pode proporcionar funções auxiliares para a replicação de AAV. Embora o adenovirus seja normalmente utilizado, também se podem utilizar outros vírus auxiliares, como é conhecido na especialidade. Alternativamente, as funções de vírus auxiliares necessárias podem ser isoladas geneticamente a partir de um virus auxiliar e os genes codificantes podem ser utilizados para proporcionar funções de vírus auxiliares in trans. Os elementos do vector de AAV e o vírus auxiliar (ou funções de vírus auxiliar) podem ser introduzidos na célula 12 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ hospedeira, quer em simultâneo, quer sequencialmente por qualquer ordem. Os componentes finais para a produção de AAV a serem proporcionados na célula produtora são "genes de empacotamento de AAV", tais como os genes rep e cap de AAV que proporcionam proteínas de replicação e encapsidação, respectivamente. Podem-se proporcionar várias versões diferentes de genes de empacotamento de AAV (incluindo cassetes rep-cap do tipo selvagem, bem como cassetes rep e/ou cap modificadas, em que os genes rep e/ou cap podem permanecer sob o controlo dos promotores nativos, ou ser ligados operativamente a promotores heterólogos). Estes genes de empacotamento de AAV podem ser introduzidos quer de forma transitória, quer estável, na célula de empacotamento hospedeira, como é conhecido na especialidade e está descrito em maior detalhe a seguir.

Seguindo os métodos da invenção, as partículas de rAAV são libertadas para o meio de cultura das células ("sobrenadante") a partir de células intactas (i.e., não lisadas). Após cultura das células hospedeiras sob condições que permitem a replicação, encapsidação e libertação de AAV, o sobrenadante pode ser processado para produzir preparações de título elevado de vírus adeno-associados (AAV) que estão substancialmente isentas de vírus auxiliares, proteínas de vírus auxiliares, proteínas celulares e, significativamente, ADN celular. As descrições detalhadas de técnicas de processamento e protocolos ilustrativos utilizando estas técnicas são proporcionados a seguir.

Definições

Um "vector", tal como aqui utilizado, refere-se a uma macromolécula, ou associação de macromoléculas, que compreende ou se associa com um polinucleótido e que pode ser utilizado para mediar a entrega do polinucleótido a uma célula. Exemplos de vectores incluem, por exemplo, plasmídeos, vectores virais, lipossomas e outros veículos de entrega de genes. "AAV" é uma abreviatura para vírus adeno-associados e pode ser utilizada para designar o próprio vírus, ou seus derivados. 0 termo abrange todos os subtipos e ambas as formas, que ocorrem naturalmente e formas recombinantes, 13 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ excepto quando necessário de outro modo. A abreviatura "rAAV" refere-se a vírus adeno-associados recombínantes, também designados por vector de AAV recombinante (ou "vector de rAAV").

Um "vector de rAAV" tal como aqui utilizado, refere-se a um vector de AAV que compreende uma sequência polinucleotídica que não é originária de AAV (i.e., um polinucleótido heterólogo a AAV), tipicamente uma sequência de interesse para a transformação genética de uma célula. Em construções de vector preferidas da presente invenção, o polinucleótido heterólogo é flanqueado por pelo menos uma, preferivelmente duas sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV. O termo vector de rAAV inclui quer partículas de vector de rAAV, quer vectores plasmídicos de rAAV.

Uma "partícula de vector de rAAV" ou "partícula de rAAV" refere-se a uma partícula virai composta por pelo menos uma proteína de cápside de AAV (preferivelmente por todas as proteínas de cápside de um AAV do tipo selvagem) e um vector de rAAV encapsidado. Deste modo, a produção de partículas de rAAV inclui necessariamente a produção do vector de rAAV, dado que esse vector está contido numa partícula de rAAV. "Empacotamento" refere-se a uma série de fenómenos intracelulares que resultam na montagem e encapsidação de uma partícula de AAV.

Genes "rep" e "cap" de AAV referem-se a sequências polinucleotídicas que codificam para proteínas de replicação e de encapsidação de vírus adeno-associados. Estes foram encontrados em todos os serótipos de AAV analisados e estão descritos a seguir e na especialidade. O rep e o cap de AAV são aqui designados por "genes de empacotamento" de AAV.

Um "vírus auxiliar" para AAV refere-se a um vírus que permite que o AAV (e.g. AAV do tipo selvagem) seja replicado e empacotado por uma célula de mamífero. São conhecidos na especialidade vários destes vírus auxiliares para AAV, incluindo adenovírus, herpesvírus e poxvírus, tais como o vacínia. Os adenovírus incluem vários subgrupos diferentes, embora os adenovírus do tipo 5 do subgrupo C sejam mais 14 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ usualmente utilizados. São conhecidos e estão disponíveis de colecções, como a ATCC, vários adenovírus de origem humana, mamífero não humano e avícola. Os vírus da família do herpes incluem, por exemplo, vírus de herpes simples (HSV) e vírus de Epstein-Barr (EBV), bem como citomegalovírus (CMV) e vírus de pseudo-raiva (PRV); que também estão disponíveis em colecções, como a ATCC. "Função(ões) de vírus auxiliares" refere-se à(s) função(ões) codificada(s) no genoma de um vírus auxiliar que permitem a replicação e empacotamento do AAV (em conjunto com outros requisitos para a replicação e empacotamento, aqui descritos). Como aqui descrito, "a função de vírus auxiliar" pode ser proporcionada de vários modos, incluindo proporcionar vírus auxiliares ou proporcionar, por exemplo, sequências polinucleotídicas que codificam para a função ou funções necessárias para uma célula produtora, em trans. O termo "tsHV" refere-se a um vírus auxiliar sensível à temperatura, que pode proporcionar funções auxiliares para a replicação e empacotamento de AAV, mas é sensível à temperatura em relação à sua própria replicação (i.e. pode replicar a uma temperatura "permissiva", mas replica com uma menor eficiência, ou preferivelmente não replica de todo, a uma temperatura "não permissiva"). A capacidade do tsHV proporcionar auxílio à replicação de AAV pode também ser sensível à temperatura, mas os tsHV preferidos para utilização na presente invenção suportam eficazmente a replicação de AAV a temperaturas em que o AAV pode replicar, mas que não são permissivas para a replicação do tsHV. Exemplos destes tsHV estão descritos a seguir.

Um vírus ou partícula virai "infecciosos" são os que compreendem um componente polinucleotídico que é capaz de entregar a uma célula para a qual a espécie virai é trófica. O termo não implica necessariamente nenhuma capacidade de replicação dos vírus. Testes para contar partículas virais infecciosas estão descritos noutros locais desta descrição e na especialidade. A infecciosidade virai pode ser expressa como a razão P:I, ou a razão entre partículas virais totais e partículas virais infecciosas. 15 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Um vírus "competente para a replicação" (e.g. um AAV competente para a replicação) refere-se a um vírus com o fenótipo do tipo selvagem que é infeccioso e que também é capaz de ser replicado numa célula infectada (i.e. na presença de um vírus auxiliar, ou de funções de vírus auxiliar). No caso do AAV, a competência para a replicação geralmente requer a presença de genes de empacotamento de AAV funcionais. Os vectores de rAAV preferidos como descritos aqui são incompetentes para a replicação em células de mamífero (em especial em células humanas) devido à ausência de um ou mais genes de empacotamento de AAV. Preferivelmente, estes vectores de rAAV não possuem nenhuma sequência de genes de empacotamento de AAV, de modo a minimizar a possibilidade de os AAV competentes para a replicação serem produzidos por recombinação entre genes de empacotamento de AAV e um vector de rAAV que se aproxima. Preparações de vector de rAAV preferidas, como aqui descrito, são as que contêm pouco, ou nenhum AAV competente para a replicação (rcAAV) 2 (preferivelmente menos do que cerca de 1 rcAAV por 10 partículas de rAAV, mais preferencialmente, menos de cerca de 1 rcAAV por 104 partículas de rAAV, ainda mais preferencialmente menos de cerca de 1 rcAAV por 108 partículas de rAAV, ainda mais preferencialmente menos de cerca de 1 rcAAV por 1012 partículas de rAAV, muito preferencialmente, nenhum rcAAV). "Libertação" de partículas de rAAV significa que as partículas de rAAV entram no meio de cultura de células a partir de uma célula produtora intacta, i.e., a partícula de rAAV é libertada sem lisar a célula. Deve entender-se que, numa determinada cultura de células produtoras, algumas células lisam, por exemplo, por morte celular. No entanto, a presente invenção proporciona métodos que promovem a libertação da partícula de rAAV sem realizar a lise celular deliberada, tal como é tipicamente realizado na especialidade. Os termos "libertação" e "secreção" a partir de uma célula produtora são aqui utilizados indiferentemente. O termo "condição que promove a libertação de partículas de rAAV" a partir de uma célula produtora, tal como aqui utilizado, refere-se a uma condição para crescer células produtoras que levam a uma libertação aumentada ou melhorada 16 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ de partículas de rAAV, a partir da célula produtora, para o meio de cultura. As condições que promovem a libertação de rAAV pela célula produtora para o meio de cultura são aqui descritas e são em geral, mas não necessariamente, condições que melhoram o metabolismo celular. "Promover a libertação" de partículas de rAAV por uma célula produtora, para o meio de cultura, significa que a libertação de rAAV pela célula produtora é aumentada quando comparada com a libertação de rAAV por uma célula produtora não cultivada sob as condições ambientais que aumentam a libertação. O aumento pode ser qualquer aumento detectável, tal como pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5% , pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 35%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 65%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 100% ou 2 vezes, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5 vezes, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10 vezes, mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 vezes, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 50 vezes. Como é bem conhecido na especialidade, quando uma população de células é crescida sob uma determinada condição de cultura de partida, os produtos secundários metabólicos da célula irão alterar algumas das condições de cultura, tais como o pH e osmolalidade. Sob condições ambientais que promovem a libertação de partículas de rAAV, um ou mais destes parâmetros é controlado, conforme necessário, i.e, monitorizado, a intervalos regulares, e ajustado para manter o parâmetro numa gama adequada (i.e., uma gama que promove a libertação). O ajuste e/ou controlo destas condições será discutido em maior detalhe a seguir. O termo "polinucleótido" refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento, incluindo desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, ou seus análogos. 17 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos de nucleótidos e pode ser interrompido por componentes não nucleotidicos. Se presentes, as modificações na estrutura de nucleótidos podem ser conferidas antes ou após a montagem do polimero. O termo polinucleótido, tal como aqui utilizado, refere-se indiferentemente a moléculas de cadeia dupla e simples. Salvo indicação ou necessidade em contrário, qualquer concretização da invenção aqui descrita que seja um polinucleótido inclui quer a forma de cadeia dupla, quer cada uma das duas formas de cadeia simples complementares que se sabe ou se prevê que constituem a forma de cadeia dupla.

Um "gene" refere-se a um polinucleótido que contém pelo menos uma sequência de leitura aberta que é capaz de codificar para uma proteína particular, depois de ser transcrita e traduzida. "Recombinante", tal como aplicado a um polinucleótido, significa que o polinucleótido é o produto de várias combinações de passos de clonagem, restrição ou ligação e outros procedimentos que resultam numa construção que é diferente de um polinucleótido encontrado na natureza. Um vírus recombinante é uma partícula virai que compreende um polinucleótido recombinante. Os termos incluem, respectivamente, replicações da construção polinucleotídica original e progénie da construção de vírus original.

Um "elemento de controlo" ou "sequência de controlo" é uma sequência de nucleótidos envolvida numa interacção de moléculas que contribui para a regulação funcional de um polinucleótido, incluindo replicação, duplicação, transcrição, corte e rearranjo (splicing), tradução ou degradação do polinucleótido. A regulação pode afectar a frequência, velocidade ou especificidade do processo e pode ser de natureza potenciadora ou inibitória. Os elementos de controlo conhecidos na especialidade incluem, por exemplo, sequências reguladoras da transcrição, tais como promotores e potenciadores. Um promotor é uma região de ADN capaz, sob determinadas condições, de se ligar a ARN-polimerase e iniciar a transcrição de uma região codificante, normalmente localizada a jusante (na direcção 3') do promotor. 18 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ "Ligado operativamente" ou "ligado operavelmente" referem-se a uma justaposição de elementos genéticos, em que os elementos estão numa relação que permite que operem do modo esperado. Por exemplo, um promotor está ligado operativamente a uma região codificante se o promotor ajuda a iniciar a transcrição da sequência codificante. Pode haver resíduos intervenientes entre o promotor e a região codificante, desde que esta relação funcional seja mantida.

Um "vector de expressão" é um vector que compreende uma região que codifica para um polipéptido de interesse e é utilizado para realizar a expressão da proteína numa célula alvo pretendida. Um vector de expressão também compreende elementos de controlo ligados operativamente à região codificante, para facilitar a expressão da proteína no alvo. A combinação de elementos de controlo e um gene ou genes aos quais estão ligados operativamente para a expressão, é por vezes designada por "cassete de expressão" sendo um grande número destas conhecido e disponível na especialidade, ou podendo ser facilmente construídas a partir de componentes que estão disponíveis na especialidade. "Heterólogo" significa que deriva de uma entidade genotipicamente distinta do resto da entidade com a qual está a ser comparada. Por exemplo, um polinucleótido introduzido por técnicas de manipulação genética num plasmídeo ou vector derivado de uma espécie diferente é um polinucleótido heterólogo. Um promotor removido da sua sequência codificante nativa e ligado operativamente a uma sequência codificante com a qual não é naturalmente encontrado é um promotor heterólogo. "Alteração genética" refere-se a um processo em que um elemento genético é introduzido numa célula de um modo que não seja por mitose ou meiose. O elemento pode ser heterólogo em relação à célula, ou pode ser uma cópia adicional ou uma versão melhorada de um elemento já presente na célula. A alteração genética pode ser realizada, por exemplo, por transfecção de uma célula com um plasmídeo recombinante, ou outro polinucleótido, através de qualquer processo conhecido na especialidade, tal como electroporação, precipitação com fosfato de cálcio ou contacto com um complexo polinucleótido- 19 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ lipossoma. A alteração genética pode também ser realizada, por exemplo, por transdução ou infecção com um vírus de ADN ou ARN, ou um vector virai. Preferivelmente, o elemento genético é introduzido num cromossoma ou mini-cromossoma na célula; mas qualquer alteração que altera o fenótipo e/ou o genótipo da célula e a sua progénie, está incluída neste termo.

Diz-se que uma célula é alterada, transduzida ou transformada "de forma estável" com uma sequência genética, se a sequência está disponível para realizar a sua função durante uma cultura prolongada da célula in vitro. Em exemplos preferidos, esta célula é "hereditariamente" alterada, na medida em que é introduzida uma alteração genética que também é herdada pela progénie da célula alterada.

Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína" são utilizados aqui indiferentemente para designar polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os termos também incluem um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, por formação de ligações dissulfureto, glicosilação, lipidação ou conjugação com um componente marcador. Polipéptidos, tais como "CFTR", "p53", "EIA" e semelhantes, quando discutido no contexto da terapia génica e suas composições, referem-se ao polipéptido intacto respectivo, ou a qualquer seu fragmento ou derivado geneticamente manipulado, que retém a função bioquímica desejada da proteína intacta. De igual modo, as referências aos genes de CFTR, p53, EIA e outros genes deste tipo para utilização na terapia génica (tipicamente designados por "transgenes" a ser entregues a uma célula receptora), incluem polinucleótidos que codificam para o polipéptido intacto, ou qualquer fragmento, ou derivado geneticamente manipulado que possui a função bioquímica desejada.

Um plasmídeo, vírus ou outra substância "isolados" referem-se a uma preparação da substância destituída de pelo menos alguns dos outros componentes que possam também estar presentes, em que a substância ou uma substância semelhante ocorre naturalmente, ou é inicialmente preparada a partir desta. Assim, por exemplo, pode-se preparar uma substância isolada utilizando uma técnica de purificação para a enriquecer a partir de uma mistura original. O enriquecimento pode ser medido numa base absoluta, tal como peso por volume 20 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ de solução, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância, potencialmente interferente, presente na mistura original. Enriquecimentos crescentes das concretizações da presente invenção têm preferência crescente. Assim, por exemplo, é preferido um enriquecimento de 2 vezes, ainda mais preferido um enriquecimento de 10 vezes, ainda mais preferido um enriquecimento de 100 vezes, e ainda mais preferido um enriquecimento de 1000 vezes.

Diz-se que uma preparação de AAV está "substancialmente isenta" de vírus auxiliares se a razão entre partículas de AAV infecciosas e partículas de vírus auxiliar infecciosas é de pelo menos cerca de 102:1; preferivelmente pelo menos cerca de 104:1, mais preferencialmente pelo menos cerca de 106:1; ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 108:1. As preparações também são preferivelmente isentas de quantidades equivalentes de proteínas de vírus auxiliares (i.e. proteínas como as que estariam presentes como resultado de um nível tal de vírus auxiliar como se as impurezas de partículas virais acima referidas estivessem presentes na forma degradada). A contaminação com proteínas virais e/ou celulares pode ser geralmente observada como a presença de bandas que coram com Coomassie ou bandas coradas com prata, em géis de SDS (e.g. o aparecimento de bandas que não as que correspondem às proteínas de cápside de AAV, VP1, VP2 e VP3). "Eficiência" quando utilizado na descrição da produção, replicação ou empacotamento virais refere-se a propriedades úteis do método; em particular, a taxa de crescimento e o número de partículas de vírus produzidas pela célula. Produção de "eficiência elevada" indica a produção de pelo menos 100 partículas virais por célula; preferivelmente pelo menos cerca de 10 000 e mais preferencialmente pelo menos cerca de 100 000 partículas por célula, no decorrer do período de cultura especificado. Ainda mais preferencialmente, produção de "eficiência elevada" inclui estes níveis de produção de partículas por célula, bem como o número máximo de células que produzem partículas, tais como pelo menos cerca de 10%, preferivelmente pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 75%. O exemplo 6 descreve condições de cultura (meio "completo") que resultaram em 93 000-123 000 partículas 21 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ de rAAV por célula produtora. No contexto da presente invenção, a eficiência também pode ser considerada em termos de percentagem, ou extensão, da libertação de partículas virais em comparação com partículas virais retidas na célula. A eficácia também pode ser considerada em termos da razão ou proporção relativa entre partículas virais totais e partículas virais infecciosas (tais como a razão "P/I"). Os testes para determinar os parâmetros de eficiência de produção, tais como unidades replicativas e ensaio do centro infeccioso, são conhecidos na especialidade. Técnicas gerais A prática da presente invenção irá utilizar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, virologia, cultura de células animais e bioquímica, que estão no âmbito dos conhecimentos na especialidade. Estas técnicas estão explicadas em detalhe na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda edição (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "Current Protocols in Protein Science" (John E Coligan, et al. eds Wiley and Sons, 1995); e "Protein Purification: Principies and Practice" (Robert K. Scopes, Springer-Verlag, 1994).

Condições que promovem a libertação de partículas de rAAV por células produtoras A presente invenção proporciona métodos para produzir uma população de partículas de vírus adeno-associados recombinantes (rAAV), compreendendo o passo de: a) incubar uma população de células produtoras num meio de cultura de células sob condições que promovem a libertação de partículas de rAAV pelas células produtoras, para o meio de cultura. As partículas de rAAV libertadas podem então ser recolhidas a partir do meio de cultura de células, obtendo-se assim uma população de partículas virais. 22 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

As condições que promovem (ou aumentam) a libertação de partículas de AAV (incluindo rAAV) por uma célula produtora para o meio de cultura incluem, mas não se limitam ao pH do meio de cultura; osmolalidade do meio de cultura; temperatura; concentração de um determinado ião no meio de cultura; densidade celular; concentração de oxigénio dissolvido no meio de cultura; concentração de glucose no meio de cultura; concentração de aminoácidos no meio de cultura; e condições que promovem a sincronização do ciclo celular. O pH do meio de cultura e qualquer um ou mais dos outros parâmetros é mantido numa gama adequada (i.e., uma gama que promove a libertação) na qual as células libertam as partículas de AAV. Embora um parâmetro (i.e., condição) possa ser suficiente para promover a libertação, uma combinação de dois ou mais parâmetros pode ser mantida em simultâneo, cada um dentro da sua própria gama adequada. Além disso, uma gama adequada para um parâmetro pode variar, dependendo de se utilizar ou não qualquer parâmetro ou parâmetros adicionais. Se um parâmetro é mantido numa gama adequada durante um período de tempo, um segundo parâmetro pode ser mantido numa segunda gama adequada, durante o mesmo ou um período de tempo diferente daquele do primeiro parâmetro. Alternativamente, podem-se utilizar condições em série. Por exemplo, pode ocorrer controlo de pH durante uma fase de crescimento, seguido de controlo de temperatura.

Está no âmbito dos conhecimentos na especialidade variar estes parâmetros e determinar se a libertação de rAAV para o meio de cultura está aumentada em relação à quantidade de rAAV libertados, quando as células produtoras não são mantidas sob determinadas condições ambientais. Uma libertação melhorada (ou aumentada) de partículas de rAAV a partir de uma célula produtora pode ser medida por qualquer um de vários métodos conhecidos na especialidade, incluindo, mas não se limitando a ensaios funcionais, tais como ensaio do centro de replicação e um ensaio do centro infeccioso; ensaios imunológicos para produtos do gene cap, tais como ELISA; HPLC; e qualquer um de vários métodos de detecção de ADN (para detectar a presença de ADN virai), tal como slot blot.

Em geral, qualquer destas condições pode ser monitorizada e controlada na medida necessária e/ou desejada, utilizando métodos e equipamentos convencionais conhecidos na 23 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ especialidade. A condição é medida e fazem-se ajustes para manter ou recuperar a condição para o seu nivel adequado (i.e., um nivel que promove a libertação de vírus). Verificámos que a incapacidade de manter de forma apropriada ou adequada as condições de cultura pode resultar na cessação da libertação de partículas de vírus, não sendo no entanto necessário que outras condições, tais como osmolalidade, sejam mantidas a um nível específico, sendo suficiente o ajuste das condições iniciais de cultura em relação a este parâmetro ou parâmetros. Para condições que têm que ser monitorizadas e ajustadas, por exemplo, pode-se utilizar um biorreactor e/ou um sistema de perfusão do meio. Estes sistemas são preferidos pois permitem um controlo mais cuidadoso das condições de cultura. No entanto, é adequado qualquer sistema que permita um controlo e ajuste suficientes das condições de cultura para permitir uma libertação suficiente e/ou desejada de partículas de AAV. Outros exemplos de mecanismos de controlo para se obterem as condições, são aqui proporcionados.

Numa concretização, as células produtoras são crescidas sob condições de pH que promovem a libertação de partículas virais. Em geral, o pH do meio de cultura é mantido numa gama de cerca de 7,0 a cerca de 8,5, preferivelmente de cerca de 7,4 a cerca de 8,5, mais preferencialmente cerca de 7,5 a cerca de 8,0. Ainda mais preferencialmente, e em especial se o pH é a única condição utilizada para promover a libertação, o pH é de cerca de 8,0. Um biorreactor, por exemplo, permite o controlo do pH para +/- 0,05, e um controlo ainda mais preciso está disponível (tal como para +/- 0,01), e pode monitorizar o pH a cada um a 3 minutos, ou mesmo menos. Nalgumas concretizações, as células são crescidas sob condições de pH em que pelo menos cerca de 67% das partículas de vírus totais são encontradas no sobrenadante de cultura. Noutras concretizações, as células são crescidas sob condições de pH tais que pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 95% de partículas virais são encontradas no sobrenadante da cultura. Preferivelmente, o P/I, ou razão entre partículas e infecciosidade no sobrenadante da cultura é inferior a cerca de 4 000, mais preferencialmente inferior a cerca de 3 000, mais preferencialmente inferior a cerca de 2 000, mais preferencialmente inferior a cerca de 1 700, mais 24 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ preferencialmente inferior a cerca de 1 500. Nalgumas concretizações, as células são cultivadas a cerca de pH 8 e são recolhidas em cerca de 96 horas, desde a infecção com vírus auxiliar (ou introdução, ou início da função ou funções de vírus auxiliar). Noutras concretizações, as células são cultivadas a cerca de pH 8 e são recolhidas em cerca de 72 horas desde a infecção com vírus auxiliar (ou introdução ou início da função ou funções de vírus auxiliar). Noutras concretizações, as células são cultivadas a cerca de pH 8 e são recolhidas em cerca de 48 horas, desde a infecção com vírus auxiliar (ou introdução ou início da função ou funções de vírus auxiliar).

Nalgumas concretizações, uma condição ou condições que não o pH também são utilizadas para promover a libertação de vírus. Por exemplo, noutras concretizações a temperatura é utilizada para promover a libertação de vírus. Em geral, a temperatura do meio de cultura é mantida entre cerca de 30°C e cerca de 45°C, preferivelmente entre cerca de 32°C e cerca de 42°C, mais preferencialmente cerca de 35°C a cerca de 40°C. Ainda mais preferivelmente, a temperatura é de cerca de 37°C a cerca de 39°C. Um biorreactor, por exemplo, pode controlar uma temperatura a +/- 0,5°C e pode monitorizar tão de perto quanto a cerca de cada 30 segundos.

Noutras concretizações, a osmolalidade é utilizada para promover a libertação de vírus. Em geral, a osmolaridade do meio de cultura é iniciada e/ou mantida entre cerca de lOOmOsM e cerca de 650mOsM, preferivelmente de cerca de 150mOsM a cerca de 500mOsM, preferivelmente cerca de 200mOsM a cerca de 400mOsM, ainda mais preferencialmente de cerca de 300mOsM (especialmente se a osmolaridade é a única condição utilizada para promover a libertação). Osmolalidade, um termo bem conhecido na especialidade, é definida como o número de moléculas de soluto por kg de água. Em geral, compostos como NaCl e outros sais, manitol, glucose, contribuem para a osmolalidade. A osmolalidade pode ser medida utilizando técnicas convencionais na especialidade, tais como a depressão do ponto de congelação, utilizando, por exemplo, um osmómetro.

Outras condições que podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção incluem, mas não se limitam a um ou mais dos 25 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ seguintes: factores de crescimento, tais como insulina, EGF e FGF; concentração de glucose; concentração de oxigénio dissolvido; meio enriguecido (e.g., glucose adicional e/ou outros nutrientes, tais como vitaminas e aminoácidos). As concentrações de glucose são geralmente entre cerca de 0,1 e cerca de 20 g/1; mais preferencialmente entre cerca de 0,5 e cerca de 15 g/1; mais preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 10 g/1. As concentrações de oxigénio (tipicamente medidas, por exemplo, por eléctrodo de oxigénio dissolvido ou analisador de gás no sangue) são geralmente entre cerca de 10% e cerca de 200% em relação ao ar, preferivelmente entre cerca de 20% e cerca de 100% em relação ao ar, preferivelmente de cerca de 30% a cerca de 75% em relação ao ar. Em geral, guanto maior a densidade celular, mais enriguecido é o meio. As condições do meio podem ser mantidas e/ou suplementadas utilizando técnicas conhecidas na especialidade, tais como perfusão.

As células produtoras são crescidas durante um período de tempo adequado, de modo a promover a libertação de vírus para o meio. Em geral, as células podem ser crescidas durante cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 8 dias, cerca de 9 dias, até cerca de 10 dias. Após cerca de 10 dias (ou mais cedo, dependendo das condições de cultura e da célula produtora particular utilizada), o nível de produção geralmente diminui de forma significativa. Em geral, o tempo de cultura é medido desde o ponto de produção virai. Por exemplo, no caso de AAV, a produção virai normalmente começa com o fornecimento da função de vírus auxiliar numa célula produtora adequada, como aqui descrito. Em geral, as células são recolhidas cerca de 48 a cerca de 100, preferivelmente de cerca de 48 a cerca de 96, preferivelmente de cerca de 72 a cerca de 96, preferivelmente de cerca de 68 a cerca de 72 horas após a infecção com vírus auxiliares (ou após a produção virai ter início). Nos exemplos, os resultados são normalmente expressos como o número de dias, e.g., "dia 2", "dia 3", etc. Estas designações geralmente indicam um dia adicional, tal como medido desde a infecção com vírus auxiliar. Isto é, um resultado referido para "dia 3" geralmente indica que o resultado foi obtido 26 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ aproximadamente 2 dias, ou 48 horas, a contar do momento de introdução da função ou funções de vírus auxiliar.

Como discutido acima, pode-se utilizar o pH e qualquer uma ou mais, em qualquer combinação, das outras condições que promovem a libertação. Por exemplo, as células podem ser crescidas sob qualquer uma ou mais das condições sequintes: (a) pH a cerca de 8,0; (b) temperatura de cerca de 39°C; (c) cerca de 300 mOsM; (d) meio enriquecido, durante cerca de 2 a 3 dias. "Meio enriquecido" qeralmente siqnifica enriquecido em termos de sais inorgânicos adicionais (tais como Mg2, Ca+2) , vitaminas e/ou cofactores, de modo que o soro possa ser reduzido ou mesmo eliminado. Numa concretização preferida, as células são crescidas nas seguintes condições: (a) cerca de 300 mOsm; (b) cerca de pH 8,00; (c) cerca de 39°C; (d) e são recolhidas em cerca de 96 horas, desde a infecção com vírus auxiliar. Numa concretização preferida, as células são crescidas nas seguintes condições: (a) cerca de pH 8,00; (b) cerca de 39°C; e (c) e são recolhidas em cerca de 96 horas desde a infecção com vírus auxiliar. Noutra concretização, as células são crescidas nas seguintes condições: (a) cerca de 300 mOsm; (b) cerca de pH 8,00; (c) cerca de 39°C; (d) e são recolhidas em cerca de 72 horas desde a infecção com vírus auxiliar. Noutra concretização, as células são crescidas nas seguintes condições: (a) cerca de pH 8,00; (b) cerca de 39°C; e (c) são recolhidas em cerca de 72 horas desde a infecção com vírus auxiliar. Noutra concretização, as células são crescidas nas seguintes condições: (a) cerca de 300 mOsm; (b) cerca de pH 8,00; (c) cerca de 39°C; (d) e são recolhidas em cerca de 48 horas desde a infecção com vírus auxiliar. Noutra concretização, as células são crescidas nas seguintes condições: (a) cerca de pH 8,00; (b) cerca de 39°C; e (c) são recolhidas em cerca de 48 horas desde a infecção com vírus auxiliar.

Nalgumas concretizações, o pH é mantido a cerca de 8,0 e a cultura é crescida a uma temperatura de cerca de 39°C. Nalgumas concretizações, o pH é mantido a cerca de 8,0 e a osmolalidade (pelo menos a osmolalidade inicial) é de cerca de 300 mOsm. Nalgumas concretizações, o pH é mantido a cerca de 8,0, a osmolalidade (pelo menos a osmolalidade inicial) é de 27 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ cerca de 300 mOsm, e a cultura é crescida a uma temperatura de cerca de 39°C.

Nalgumas concretizações, as células estão sincronizadas. Isto pode ser conseguido, por exemplo, submetendo as células a condições de stress, em particular antes da adição da função ou funções de virus auxiliar. A sincronização pode contribuir para a produtividade global. As formas de stress possíveis incluem, mas não se limitam a um stress nutricional, um stress osmótico, um stress de pH, um stress de temperatura, um stress aeróbico, um stress mecânico, um stress radiacional e um stress tóxico. Um exemplo não limitativo pelo qual o stress nutricional é imposto é fazendo a cultura das células produtoras num meio que é deficiente em um ou mais aminoácidos.

Também deve entender-se que a invenção também inclui métodos para tratar células produtoras (i.e., células produtoras intactas) com um agente ou condição que promove a libertação de vírus, por exemplo, tratamento com um agente que permeabiliza uma célula, tal como um ionóforo ou uma toxina (tal como uma toxina bacteriana), choque osmótico. Para estas concretizações, as células produtoras de uma população cultivada retêm geralmente a sua integridade, i.e., não são lisadas (embora, tal como em qualquer população de cultura de células, algumas células possam ser lisadas). Em geral, menos de cerca de qualquer uma das percentagens seguintes de células são lisadas: 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 5%, 3%, 2%, 1%. Alternativamente, geralmente cerca de pelo menos qualquer uma das seguintes percentagens de teores celulares são retidas nas células (i.e., retidas na membrana celular) : 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%.

Recolha e purificação de partículas virais libertadas

As células produtoras podem ser cultivadas em suspensão ou ligadas a uma superfície adequada. São conhecidos na especialidade métodos de cultura em suspensão ou fixada. Ao produzir uma população de partículas virais libertadas, as partículas virais libertadas podem ser recolhidas e/ou purificadas para posterior utilização. Como discutido em maior 28 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ detalhe a seguir, as partículas de vírus em meio de cultura são separadas das células produtoras utilizando métodos conhecidos na especialidade, tais como centrifugação ou filtração (tal como filtração em fluxo tangencial numa membrana de fibra oca) . Preferivelmente, são realizados um ou mais passos de purificação adicionais após a separação das células produtoras do meio de cultura. Exemplos destes passos incluem, mas não se limitam a, concentração utilizando filtros adequados, ou cromatografia de troca iónica. Estão descritos vários métodos de produção e purificação em WO 99/11764 (PCT/US98/18600) (Targeted Genetics Corporation).

Nalgumas concretizações, o sobrenadante de cultura (após as células serem removidas) é submetido a cromatografias iónicas opostas. Nalgumas concretizações, a cromatografia de troca aniónica é seguida de cromatografia de troca catiónica. Noutras concretizações, a cromatografia de troca catiónica segue-se à cromatografia de troca aniónica. Nalgumas concretizações o sobrenadante de cultura é submetido a cromatografia em sulfato de heparina, preferivelmente após tratamento de cromatografia iónica oposta, mais preferencialmente após tratamento do sobrenadante de cultura em cromatografia de troca catiónica seguido de cromatografia de troca aniónica. Estas técnicas estão descritas em maior detalhe a seguir. A título ilustrativo, o sobrenadante de cultura, ou uma preparação que foi eluída a partir de uma coluna de troca aniónica ou troca catiónica e/ou concentrada por filtração em fluxo tangencial, podem ser purificados por ligação a uma coluna que compreende sulfato de heparina. O AAV pode então ser eluído a partir de uma coluna deste tipo utilizando um tampão que contém um sal (eg, um gradiente linear de NaCl). Por exemplo, o AAV obtido de fracções reunidas de coluna de cromatografia de troca aniónica pode ser concentrado e diafiltrado em TMEG mais NaCl 100 mM, utilizando uma membrana de filtração em fluxo tangencial de 300K. Este concentrado pode ser injectado numa coluna de sulfato de heparina de 1 ml (coluna "Hi-Trap Heparin" da Pharmacia), e eluído utilizando um gradiente linear de NaCl. 29 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

As secções a seguir descrevem em maior detalhe os componentes do sistema de produção e métodos da invenção.

Célula produtora que compreende função de vírus auxiliar e AAV

Nos métodos da invenção, as células produtoras compreendendo componentes necessários para a replicação e encapsidação virais são cultivadas sob condições adequadas (i.e., condições que promovem a libertação virai). Vários critérios influenciam a selecção de células para utilização na produção de partículas de rAAV, como aqui descrito. Como tema inicial, a célula tem que ser permissiva para a replicação e empacotamento do vector de rAAV quando se utiliza o vírus auxiliar seleccionado. No entanto, uma vez que a maioria das células de mamífero podem ser produtivamente infectadas por AAV, e muitas podem também ser infectadas por vírus auxiliares como os adenovírus, é óbvio que uma grande variedade de células e linhas celulares de mamífero satisfazem eficazmente estes critérios. De entre estas, as células e linhas celulares mais preferidas são as que podem ser facilmente crescidas em cultura de modo a facilitar a produção em grande escala de preparações de vector de AAV recombinante. Mais uma vez, no entanto, muitas destas células satisfazem eficazmente este critério. Quando se pretende uma produção em grande escala a escolha do método de produção também irá influenciar a selecção da célula hospedeira. Por exemplo, como descrito em maior detalhe a seguir e na especialidade, algumas técnicas de produção e recipientes ou câmaras de cultura são concebidos para o crescimento de células aderentes ou fixadas, enquanto que outras são concebidas para o crescimento de células em suspensão. Neste último caso, a célula hospedeira seria assim preferencialmente adaptada ou adaptável ao crescimento em suspensão. No entanto, mesmo no caso de células e linhas celulares que são consideradas como aderentes ou dependentes de ancoragem, é possível (como descrito a seguir) derivar variantes adaptadas a suspensão a partir de uma linha progenitora dependente de ancoragem, fazendo a selecção em série de células capazes de crescer em suspensão.

Quando se utiliza um vírus auxiliar sensível à temperatura a célula tem que ser capaz de replicar eficazmente o vector de rAAV sob condições que não sejam permissivas para 30 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ a replicação do vírus auxiliar. A título ilustrativo, quando o adenovírus tsl49 é utilizado como um vírus auxiliar ts (como descrito a seguir), a célula terá que ser capaz de suportar a replicação e empacotamento de rAAV a temperaturas bem acima de 32°C, preferivelmente de cerca de 39,5°C. As células 293 humanas são um exemplo de uma linha celular que preenche estes critérios, mas várias outras células e linhas celulares são capazes de replicar o rAAV a esta temperatura relativamente elevada.

Por fim, o vírus auxiliar (ou função de vírus auxiliar), a sequência do vector de rAAV e todas as sequências de AAV necessárias para replicação e empacotamento terão que estar presentes na mesma célula. Quando um ou mais genes de empacotamento de AAV são proporcionados separadamente do vector, é proporcionada uma célula hospedeira que compreende: (i) um ou mais genes de empacotamento de AAV, em que cada um dos referidos genes de empacotamento de AAV codifica para uma proteína de replicação ou encapsidação de AAV; (ii) um polinucleótido heterólogo introduzido na referida célula hospedeira utilizando um vector ou pró-vector de rAAV, em que o referido vector ou pró-vector de rAAV compreende o referido polinucleótido heterólogo flanqueado por pelo menos uma ITR de AAV e é deficiente no(s) referido(s) gene(s) de empacotamento de AAV; e (iii) um vírus auxiliar ou sequências que codificam para as funções de vírus auxiliar necessárias. Deve notar-se, no entanto, que um ou mais destes elementos podem ser combinados num único replicão. A título ilustrativo, um vírus auxiliar pode também compreender um pró-vector de rAAV ou um gene de empacotamento de AAV. O vírus auxiliar é preferivelmente introduzido na cultura de células a um nível suficiente para infectar a maioria das células em cultura, mas pode de outro modo ser mantido num mínimo, de modo a limitar a quantidade de vírus auxiliar presente na preparação resultante. Pode-se utilizar uma multiplicidade de infecção, ou "MOI", de 1-100, mas é tipicamente adequada uma MOI de 5-10.

De igual modo, se o vector de AAV e/ou os genes de empacotamento são introduzidos de forma transitória na célula de empacotamento (em oposição a serem introduzidos de forma 31 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ estável) eles são preferencialmente introduzidos a um nível suficiente para alterar geneticamente a maioria das células em cultura. As quantidades geralmente necessárias são da ordem de 10 pg por 106 células, se fornecidas na forma de um plasmídeo bacteriano; ou 108 partículas por 105 células, se fornecidas na forma de uma partícula de AAV. A determinação de uma quantidade óptima é um exercício de titulação de rotina que está no âmbito dos conhecimentos das pessoas competentes na matéria.

Estes elementos podem ser introduzidos na célula, quer em simultâneo, quer sequencialmente, por qualquer ordem. Quando a célula é hereditariamente alterada por qualquer dos elementos, a célula pode ser seleccionada e deixada proliferar antes de se introduzir o elemento seguinte.

Numa concretização preferida, o vírus auxiliar é introduzido por último na célula para recuperar e empacotar um vector de rAAV residente. A célula estará já, em geral, suplementada na medida necessária com genes de empacotamento de AAV. Preferivelmente, o vector de rAAV ou os genes de empacotamento, e mais preferencialmente ambos, são integrados de forma estável na célula. Deve entender-se que outras combinações são possíveis. Estas combinações estão incluídas no âmbito da invenção.

Uma vez proporcionados à célula hospedeira os elementos necessários, a célula é cultivada sob condições que são permissivas para a replicação de AAV, para permitir a replicação, empacotamento e libertação do vector de rAAV. Os tempos de cultura adequados dependem de várias considerações e podem variar como discutido acima. O tempo de cultura é preferivelmente ajustado para corresponder aos níveis de pico de produção e é geralmente de 3-6 dias. Preferivelmente, pelo menos 100 partículas virais são produzidas por célula; mais preferencialmente pelo menos cerca de 1000 por células, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 10 000 por célula. De preferência, são produzidos pelo menos 0,5 χ 106, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1 χ 106, ainda mais preferencialmente, pelo menos 2 χ 106 UR/ml de vectores de AAV, por 2 χ 105 células durante o período de cultura. Opcionalmente, podem-se utilizar métodos de produção em grande 32 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ escala, tais como cultura em suspensão e filtração em fluxo tangencial. Em seguida recolhem-se as partículas de AAV e isolam-se das células utilizadas para as preparar.

As preparações de partículas de rAAV obtidas pelos métodos da presente invenção compreendem preferencialmente uma densidade elevada de partículas de AAV infecciosas e estão substancialmente isentas de vírus auxiliares, proteínas de vírus auxiliares e detritos celulares e outros contaminantes. As propriedades desejáveis incluem as seguintes: • Uma concentração de pelo menos 107, preferivelmente de pelo menos cerca de 108, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 109 UR/ml, tal como determinado num ensaio de replicação ou comparação quantitativa da hibridação com um padrão conhecido. • Não mais de 103, preferivelmente não mais de cerca de 102, mais preferencialmente não mais de cerca de 101 partículas infecciosas de vírus auxiliares por 108 UR de partículas de rAAV. • Menos de 5%, preferivelmente menos de cerca de 1%, mais preferencialmente menos de cerca de 0,01%, ainda mais preferencialmente menos de cerca de 0,001% de contaminação por vírus auxiliar, numa base de proteína (p/p), detectado quer por análise densitométrica com géis de SDS, quer por imunoensaio de proteína específica para vírus auxiliar (tal como fibra hexão ou pentão de adenovírus). • Menos de 5%, preferivelmente menos de cerca de 1%, mais preferencialmente menos de cerca de 0,01%, ainda mais preferencialmente menos de cerca de 0,001% de contaminação por vírus auxiliar ou proteína celular (p/p), detectada quer por análise densitométrica de géis de SDS, quer por imunoensaio para vírus auxiliar ou proteínas específicas celulares. • Preferivelmente, a preparação também está substancialmente isenta de outros componentes celulares potenciais, tais como lípidos celulares, hidratos de carbono e/ou ácidos nucleicos.

Os métodos apresentados nesta descrição são adequados para preparar pequenos lotes experimentais, ou lotes preparativos de 10-100 litros, ou mais. Para preparações em 33 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ lotes em grande escala, também é desejável a seguinte propriedade: • Um total de pelo menos IO10, preferivelmente 1012, e mais preferencialmente 1014 UR de partículas de vector de AAV na preparação.

Opcionalmente, os vectores de rAAV podem ser também processados para efectuar o enriquecimento em partículas de rAAV, eliminar partículas de vírus auxiliares ou, de outro modo, torná-los adequados para serem administrados a um indivíduo. As técnicas de purificação podem incluir centrifugação em gradiente isopícnico e técnicas cromatográficas. A redução da actividade de vírus auxiliar infeccioso pode incluir inactivação por tratamento com calor ou por tratamento por pH, como é conhecido na especialidade. Outros processos podem incluir concentração, filtração, diafiltração ou mistura com um tampão ou excipiente farmacêutico adequados. As preparações podem ser divididas em alíquotas de doses unitárias e multidoses para distribuição, que irão reter as características essenciais do lote, tais como homogeneidade do teor antigénico e genético, e a proporção relativa do vírus auxiliar contaminante.

Exemplos de técnicas para produzir preparações de vírus auxiliares e AAV que exibem várias propriedades desejáveis, como descrito acima, são proporcionados nas secções seguintes. São conhecidos na especialidade vários métodos para a determinação do título infeccioso de uma preparação virai. Um método para a determinação do título é um ensaio de titulação de elevado processamento, em que é estabelecida uma série de poços de cultura que compreendem, cada um, uma alíquota de células de mamífero e uma alíquota de preparação de vírus (bem como poços de controlo que compreendem e.g., células apenas, vírus apenas e poços vazios) . A série de poços de cultura pode, por exemplo, estar na forma de um recipiente de microtítulo. Tipicamente, adicionam-se às células alíquotas (e.g., alíquotas diluídas em série) da preparação de vírus a ser titulada, e em seguida as células e vírus são incubados sob condições que permitem a replicação do vírus (tipicamente condições de crescimento adequadas para a célula hospedeira de mamífero). Após replicação do vírus, o ácido nucleico virai é 34 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ geralmente libertado por lise das células de mamífero (utilizando condições ou agentes que promovem a lise, conforme necessário). O ácido nucleico (incluindo ácido nucleico virai) na multiplicidade de lisados pode ser transferido e fixado numa membrana sob condições que ligam o ácido nucleico (lavando, como adequado, para remover proteínas e outros contaminantes). A membrana preferivelmente é uma réplica ou imagem no espelho da série de cultura sendo os poços individuais da série original subsequentemente representados por "conjuntos" de ácido nucleico (do lisado de cada poço de cultura) que estão ligados nas posições correspondentes na membrana. A hibridação da membrana com uma sonda específica para o vírus (ou específica para a inserção do vírus), marcada, pode ser em seguida utilizada para identificar e quantificar a quantidade relativa de ácido nucleico específico para o vírus em cada um dos pontos na série e, por correspondência, em cada um dos poços de cultura originais. As condições e materiais para a transferência de ácido nucleico, ligação, lavagem e hibridação podem ser adaptadas a partir de técnicas de biologia molecular de rotina, tais como hibridação "dot blot" (como descrito na especialidade).

Selecção e preparação do vector de AAV e genes de empacotamento de AAV

As células produtoras utilizadas nos métodos de produção aqui descritos compreendem um vector de rAAV. Um vector de rAAV compreende um polinucleótido heterólogo (i.e. não-AAV) de interesse, em vez da totalidade ou uma porção dos genes rep e/ou cap de AAV que normalmente constituem o grosso do genoma de AAV. Tal como no genoma de tipo selvagem de AAV, no entanto, o vector de rAAV é preferivelmente flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITR) de AAV, como referido acima. Também foram descritas na especialidade variações em que uma construção de rAAV é flanqueada por apenas uma única ITR (tipicamente modificada) e estas podem ser utilizadas em conjunção com a presente invenção.

Os virus adeno-associados de qualquer serotipo são adequados, uma vez que os vários serótipos estão funcional e estruturalmente relacionados, mesmo ao nível genético (ver, e.g., Blacklow, pp. 165-174 de "Parvoviruses and Human 35 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Disease" J.R. Pattison, ed. (1988); e Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974). Todos os serótipos de AAV exibem aparentemente propriedades de replicação semelhantes mediadas por genes rep homólogos; e todos têm em geral três proteínas de cápside relacionadas, tais como as que são expressas em AAV2. O grau de relacionamento é também sugerido pela análise do heterodúplex que revela uma hibridação cruzada elevada entre os serótipos, ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos de auto-fusão análogos nos terminais que correspondem às ITR. Os padrões de infecciosidade semelhantes também sugerem que as funções de replicação em cada serotipo estão sob um controlo regulatório semelhante. De entre os vários serotipo de AAV, o AAV2 é o mais usualmente utilizado.

Um vector de rAAV compreende um polinucleótido heterólogo. O polinucleótido é tipicamente de interesse devido a uma capacidade de proporcionar uma função a uma célula alvo, no contexto da terapia génica, tal como supra- ou infra-regulação da expressão de um determinado fenótipo. Este polinucleótido heterólogo ou "transgene", terá geralmente comprimento suficiente para proporcionar a função ou sequência codificante desejada. Para encapsidação em partículas de AAV2, o transgene terá preferivelmente menos de cerca de 5kb embora se possam utilizar outros serótipos e/ou modificações para permitir que sequências maiores sejam empacotadas nas partículas virais de AAV.

Quando a transcrição do polinucleótido heterólogo é desejada na célula alvo, este pode ser ligado operativamente ao seu próprio promotor, ou a um promotor heterólogo, dependendo, por exemplo, do nível e/ou especificidade de transcrição desejados na célula alvo, como é conhecido na especialidade. Vários tipos de promotores e potenciadores são adequados para utilização neste contexto. Os promotores constitutivos proporcionam um nível constante de transcrição do gene, enquanto que os promotores indutíveis geralmente exibem uma actividade baixa na ausência do indutor, e são supra-regulados na presença de um indutor. Os promotores e potenciadores também podem ser específicos para o tecido: isto é, eles exibem a sua actividade apenas em determinados tipos de células, presumivelmente devido aos elementos reguladores de genes encontrados apenas nestas células. 36 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Exemplos ilustrativos de promotores são o promotor tardio de SV40 do vírus 40 de símio, o elemento potenciador/promotor de poliedro de Baculovírus, timidina-quinase do vírus de herpes simples (HSV tk), o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV) e vários promotores retrovirais, incluindo elementos de LTR. Os promotores indutíveis incluem promotores indutíveis por iões de metais pesados (tais como o promotor do vírus de tumor mamário de ratinho (mMTV), ou vários promotores da hormona de crescimento), promotores indutíveis por hormonas esteróides e os promotores do fago T7 que estão activos na presença de ARN-polimerase de T7. Exemplos de promotores específicos de tecidos incluem vários promotores de surfactina (para expressão no pulmão) , promotores de miosina (para expressão no músculo) e promotores de albumina (para expressão no fígado). É conhecida um grande variedade de outros promotores e estes estão geralmente disponíveis na especialidade e as sequências para muitos destes promotores estão disponíveis em bases de dados de sequências, tais como a base de dados GenBank.

Quando também é desejada a tradução na célula alvo pretendida, o polinucleótido heterólogo também compreenderá, preferivelmente, elementos de controlo que facilitam a tradução (tais como um local de ligação ao ribossoma, ou "RBS" e um sinal de poliadenilação). Deste modo, o polinucleótido heterólogo compreenderá geralmente pelo menos uma região codificante ligada operativamente a um promotor adequado e pode também compreender, por exemplo, um potenciador ligado operativamente, local de ligação ao ribossoma e sinal poli-A. O polinucleótido heterólogo pode compreender uma região codificante, ou mais que uma região codificante sob o controlo do mesmo, ou de promotores diferentes. Toda a unidade que contém uma combinação de elementos de controlo e região codificante é muitas vezes designada por cassete de expressão. O polinucleótido heterólogo é integrado por técnicas recombinantes no, ou preferivelmente no lugar da região codificante genómica de AAV (i.e. no lugar dos genes rep e cap de AAV), e é preferivelmente flanqueado em ambos os lados por regiões de repetição terminal invertida (ITR) de AAV. Isto significa que uma ITR aparece quer a montante, quer a jusante 37 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ da sequência codificante quer em justaposição directa, preferivelmente (embora não necessariamente) sem qualquer sequência interveniente de origem no AAV, de modo a reduzir a probabilidade de recombinação que pudesse regenerar um genoma de AAV competente para a replicação. Uma única ITR pode ser suficiente para realizar as funções normalmente associadas com configurações que compreendem duas ITR (WO 94/13788), e podem-se assim utilizar construções de vectores com apenas uma ITR, em conjunção com os métodos de empacotamento e produção da presente invenção.

Os promotores nativos para rep são auto-regulados e podem limitar a quantidade de partículas de AAV produzidas. O gene rep também pode ser ligado operativamente a um promotor heterólogo, quer o rep seja proporcionado como parte da construção de vector, quer separadamente. Qualquer promotor heterólogo que não é fortemente infra-regulado pela expressão do gene rep é adequado; mas os promotores indutíveis são preferidos porque a expressão constitutiva do gene rep pode ter um impacto negativo na célula hospedeira. É conhecida na especialidade uma grande variedade dos promotores indutíveis; e foram enumerados alguns exemplos acima. Uma subclasse preferida de promotores indutíveis é a dos que são induzidos pelo vírus auxiliar que é utilizado para complementar a replicação e empacotamento do vector de rAAV. Também foram descritos vários promotores indutíveis pelo vírus auxiliar, incluindo o promotor do gene precoce de adenovírus que é indutível pela proteína EIA do adenovírus; o promotor tardio principal de adenovírus; o promotor do vírus de herpes que é indutível pelas proteínas do vírus de herpes, tais como VP16 ou 1CP4; bem como promotores indutíveis de vacínia e poxvírus.

Os métodos para identificar e testar promotores indutíveis por vírus auxiliares, tais como promotores derivados do gene de metalotioneína de ratinho, foram descritos, ver W096/17947 (Targeted Genetics Corporation).

Tendo em conta os limites de tamanho de encapsidação relativos de vários genomas de AAV, a inserção de um polinucleótido heterólogo grande no genoma necessita da remoção de uma porção da sequência de AAV. A remoção de um ou mais genes de AAV é em qualquer dos casos desejável, para 38 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ reduzir a probabilidade de produzir AAV competente para a replicação ("rcAAV"). Deste modo, as sequências codificantes ou promotoras de rep, cap, ou ambas, são preferivelmente removidas, uma vez que as funções proporcionadas por estes genes podem ser fornecidas em trans. O vector resultante é designado como sendo "deficiente" para estas funções. De modo a replicar e empacotar o vector, as funções em falta são complementadas com um gene de empacotamento, ou uma pluralidade destes, que em conjunto codificam para as funções necessárias para os vários produtos de gene rep e/ou cap em falta. Os genes de empacotamento ou cassetes de genes são preferivelmente não são flanqueados pelas ITR de AAV e preferivelmente não partilham nenhuma homologia substancial com o genoma de rAAV, de modo a minimizar a recombinação homóloga durante a replicação entre a sequência de vector e os genes de empacotamento proporcionados em separado. O nivel de homologia e a frequência de recombinação correspondente aumentam com o aumento do comprimento das sequências homólogas e com o seu nível de identidade partilhada. O nível de homologia que irá levantar alguma preocupação num determinado sistema pode ser determinado teoricamente e confirmado experimentalmente, como é conhecido na especialidade. Tipicamente, no entanto, a recombinação pode ser substancialmente reduzida ou eliminada se a sequência sobreposta é inferior a uma sequência de cerca de 25 nucleótidos se é pelo menos 80% idêntica em todo o seu comprimento, ou menos de uma sequência de cerca de 50 nucleótidos, se é pelo menos 70% idêntica em todo o seu comprimento. Obviamente, são preferíveis níveis ainda inferiores de homologia, uma vez que estes irão reduzir ainda mais a probabilidade de recombinação. Parece que, mesmo sem nenhuma homologia de sobreposição, há alguma frequência residual de produção de rcAAV. Podem-se obter reduções ainda maiores na frequência de produção de rcAAV (e.g. por recombinação não homóloga) "dividindo" as funções de replicação e encapsidação de AAV, como descrito na WO98/27204 (Targeted Genetics Corporation). A construção do vector de rAAV e as construções do gene de empacotamento complementar podem ser implementadas na presente invenção de várias formas diferentes. Também se podem 39 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ utilizar partículas virais, plasmídeos e células hospedeiras transformadas de forma estável para introduzir estas construções na célula de empacotamento, quer de forma transitória, quer estável. O vector de AAV e gene(s) de empacotamento complementar(es) , se existentes, podem ser proporcionados na forma de plasmídeos bacterianos, partículas de AAV, ou qualquer sua combinação. Alternativamente, quer a sequência do vector de AAV, o(s) gene de empacotamento, ou ambos, são proporcionados na forma de células eucarióticas geneticamente alteradas (preferivelmente hereditariamente alteradas, ou integradas de forma estável). O desenvolvimento de células hospedeiras hereditariamente alteradas para expressar a sequência do vector de AAV, genes de empacotamento de AAV, ou ambos, proporciona uma fonte estabelecida do material que é expresso a um nível fiável. Uma variedade de células geneticamente alteradas diferentes pode assim ser utilizado no contexto da presente invenção, como descrito na especialidade, inter alia, na patente U.S. 5658776; W095/13392; WO98/23018; patente U.S. 5656785; WO98/27204. São possíveis outras combinações.

Deste modo, por exemplo, os genes rep e cap podem estar presentes em plasmídeos e/ou ser integrados de forma estável no genoma da célula produtora.

Introdução de material genético nas células

Como descrito na especialidade, e ilustrado, quer aqui, quer nas referências citadas acima, o material genético pode ser introduzido em células produtoras utilizando qualquer um de uma variedade de meios para transformar ou transduzir estas células, tais como transfecção com plasmídeos bacterianos, infecção com vectores virais, electroporação, precipitação com fosfato de cálcio e introdução utilizando qualquer uma de uma variedade de composições à base de lípidos (um processo muitas vezes designado por "lipofecção"). Os métodos e composições para realizar estas técnicas foram descritos na especialidade e estão amplamente disponíveis. 40 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ A selecção de células produtoras alteradas de forma adequada pode se realizada por qualquer técnica na especialidade. Por exemplo, as sequências polinucleotidicas utilizadas para alterar a célula podem ser introduzidas em simultâneo com, ou ligadas operativamente a um ou mais marcadores detectáveis ou seleccionáveis, tais como genes de resistência a drogas, como é conhecido na especialidade. O teste para aquisição, localização e/ou manutenção de um polinucleótido introduzido pode ser realizado utilizando técnicas baseadas em hibridação de ADN (tais como transferência de Southern e outros procedimentos, como é conhecido na especialidade). O teste da expressão pode ser facilmente realizado por análise de Northern de ARN extraído a partir de células geneticamente alteradas, ou por imunofluorescência indirecta para o produto de gene correspondente. O teste e confirmação das capacidades e eficiência de empacotamento podem ser obtidos introduzindo na célula os restantes componentes funcionais de AAV e um vírus auxiliar, para testar quanto à produção de partículas de AAV. Quando uma célula é alterada de forma hereditária com várias construções de polinucleótidos, é geralmente mais conveniente (embora não essencial) introduzi-las na célula, separadamente, e validar cada passo sequencialmente. As referências que descrevem estas técnicas incluem as aqui citadas.

Selecção e preparação do vírus auxiliar

Como discutido acima, o AAV é um parvovírus que é deficiente para a auto-replicação e depende em geral de um vírus auxiliar para fornecer algumas funções replicativas. Podem-se utilizar vários vírus auxiliares nos métodos da presente invenção. Vários destes vírus auxiliares foram identificados, incluindo adenovírus, vírus de herpes (incluindo mas não se limitando a HSV1, citomegalovírus e HHV-6), e poxvírus (em particular vacínia). Pode-se utilizar qualquer destes vírus com a presente invenção.

Frequentemente, o vírus auxiliar será um adenovírus de um tipo e subgrupo que pode infectar a célula hospedeira pretendida. Os adenovírus humanos do subgrupo C, em particular 41 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ os serótipos 1, 2, 4, 6, e 7, são normalmente utilizados. O serotipo 5 é geralmente preferido. As características e padrões de crescimento são conhecidos na especialidade. Ver, e.g., to Horowitz, "Adenoviridae and their replication", pp 771-816 in "Fundamental Virology", Fields et al. eds.

Embora não seja essencial, em principio é desejável que a estirpe de virus auxiliar seja deficiente para a replicação no indivíduo que recebe a terapia genética. Deste modo, qualquer vírus auxiliar residual presente numa preparação de rAAV será incompetente para a replicação. Os adenovírus a partir dos quais a região EIA ou ambas, a região EIA e E3 foram removidas, são não infecciosos para a maioria das células humanas. Podem ser replicados numa linha celular permissiva (e.g. a linha celular 293 humana) que é capaz de complementar a actividade em falta. As regiões de adenovírus que parecem estar associadas com a função auxiliar, bem como as regiões que não estão, foram identificadas e descritas na especialidade (ver, e.g., P. Colosi et al., W097/17458, e referências aí citadas).

Utilização de um vírus auxiliar sensível às condições

Também se pode utilizar um vírus auxiliar "sensível às condições" para se obter a actividade do vírus auxiliar. Ver WO 99/11764. Uma estirpe de vírus auxiliar deste tipo deve ter no mínimo a propriedade de ser capaz de suportar a replicação de AAV numa célula hospedeira, sob pelo menos um conjunto de condições em que ele próprio não sofre replicação genómica eficaz. Quando a actividade do vírus auxiliar é fornecida como partículas de vírus intactas, também é geralmente necessário que o vírus seja capaz de se replicar numa célula hospedeira sob um segundo conjunto de condições. O primeiro conjunto de condições irá diferir do segundo conjunto de condições por uma característica facilmente controlável, tal como a presença ou ausência de um cofactor necessário (tal como um catião), a presença ou ausência de uma droga inibitória, ou um mudança numa condição ambiental, tal como a temperatura. De modo mais conveniente, a diferença entre as duas condições é a temperatura e um vírus sensível às condições é assim designado como um vírus auxiliar sensível à temperatura (tsHV). 42 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Um vírus auxiliar "sensível à temperatura" ou "ts" é um que é capaz de replicar o seu material genético numa célula eucariótica a uma determinada gama de temperaturas (a gama de temperatura "permissiva"), tipicamente cerca de 15°-35°C e preferivelmente cerca de 20-32°C. No entanto, à temperatura "não permissiva", mesmo quando outras condições são mantidas iguais, a taxa de replicação do material genético é substancialmente inferior, pelo menos 10 vezes inferior; normalmente pelo menos cerca de 100 vezes inferior; e preferivelmente pelo menos cerca de 1000 vezes inferior. Esta temperatura é tipicamente cerca de 35°-50°C, em geral cerca de 42°C. Num exemplo típico de um vírus auxiliar ts deste tipo, o vírus é capaz de replicação eficaz a temperaturas relativamente baixas, tais como temperaturas de cerca de 20-32°C, mas é incapaz de replicação eficaz a temperaturas relativamente elevadas, tais como temperaturas de cerca de 37-42°C. Deve entender-se que a célula infectada pelo vírus pode, apesar de tudo, exibir alguns processos metabólicos atribuíveis aos vírus à temperatura não permissiva, incluindo, mas não se limitando à função auxiliar para a produção de AAV.

Pode-se produzir um vírus sensível à temperatura em quantidades volumosas cultivando células infectadas a uma temperatura permissiva. O vector de AAV pode então ser produzido cultivando as células que compreendem elementos de vector e o vírus auxiliar sensível à temperatura, a uma temperatura não permissiva. A preparação do vector será substancialmente isenta de componentes do vírus auxiliar.

Um grande número de variantes de adenovírus sensíveis à temperatura está descrito na especialidade; ver, e.g., as variantes descritas por Ensinger et al. (J. Virol. 10:328, 1972); Williams et al. (J. Gen Virol. 11:95, 1971); Ishibashi (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 65:304, 1970); Lundholm et al. (Virology 45:827, 1971); e Shiroki et al., (Virology 61:474, 1974). A análise de complementação indica que estas variantes estão inseridas em vários grupos de complementação diferentes (Ginsberg et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34:419, 1974). Isto sugere que vários passos no ciclo replicativo do adenovírus podem ser tornados sensíveis à temperatura. 43 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Uma vez que a função auxiliar para a replicação de AAV requer que apenas parte do ciclo do adenovirus esteja intacta, o teste para a função auxiliar de vários mutantes à temperatura não permissiva proporciona um meio para mapear a função auxiliar. Por exemplo, Ishibashi et al. (Virology 45:317, 1971) referiram que as variantes de adenovirus de aves sensíveis à temperatura suportam a replicação de AAV 1 e AAV2. Ito et al. referiram que o mutante tsl3 sensível à temperatura do adenovirus humano 7 (Ad7tsl3) ajuda a replicação de AAV à temperatura não permissiva, de um modo tão eficaz quanto a estirpe selvagem. Drake et al. (Virology 60: 230, 1974) descreveram a complementação da síntese do antigénio de AAV4 por 3 grupos de mutantes sensíveis à temperatura do vírus de herpes simples do tipo 1 (HSV1) . Handa et al. (J. Gen. Viro. 29:239, 1975) referiram uma actividade auxiliar para a produção do vírus AAV 1 por mutantes de adenovirus humano Ad5ts36, Ad5tsl25, Ad5tsl49, Adl2tsA275, Adl2tsB221 e Adl2tsC295. Ostrove et al. (Virology 104:502, 1980) descreveram que os mutantes sensíveis à temperatura Ad5tsl25, Ad5tsl35, Ad5tsl57, Ad5tsll6 e Ad5tsl42, e os mutantes da gama hospedeira hr6, mas não hr3, suportam a replicação de AAV. Mayor et al. (J. Gen Virol. 35:545, 1977) referiram que o Ad31tsl3, mas não o Ad31ts94, suportaram a produção de AAV 1 à temperatura não permissiva.

Straus et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73:742, 1976) referiram que o Ad5tsl25 suportou a replicação de AAV2 sob condições em que o adenovirus não auto-replicou. Utilizaram esta propriedade para estudar os intermediários de ADN formados durante a replicação do AAV. Myers et al. (J. Virol. 35:65, 1980) realizaram um estudo quantitativo sobre a função auxiliar e mostraram que o Ad5tsl49 suportou a produção de 20 000 partículas de AAV infecciosas por célula, à temperatura não permissiva, enquanto que o Ad5tsl07 produziu apenas -100 partículas por célula. Uma vez que o Ad5tsl07 tem uma mutação na região codificante da proteína de ligação de ADN de 72 kDa, eles concluíram que esta proteína desempenhava um papel na expressão do ARN de AAV. Mais recentemente, Cárter et al. (Virology 191:473, 1992) propuseram que é necessária uma proteína de 72 kDa totalmente funcional para a expressão pós-transcrição quantitativa dos genes rep e cap de AAV. 44 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

As variantes da estirpe seleccionada de vírus auxiliar sensíveis às condições podem ser geradas através de uma estratégia de mutação e selecção adequada. Por exemplo, o vírus pode ser mutado com nitrosoguanidina, ácido nitroso, hidroxilamina ou 5-bromo-2-desoxiuridina. Seleccionam-se candidatos que se podem multiplicar numa célula eucariótica adequada nas condições permissivas desejadas, mas não nas condições não permissivas desejadas. A título ilustrativo, podem-se obter mutantes de adenovírus sensíveis à temperatura que se multiplicam, e.g., a 32°C, mas não a 39,5°C. As razões de eficiência de plaqueamento a 39,5°C versus 32°C são preferivelmente inferiores a 1CT4 e mais preferencialmente inferiores a 1CT5. Outros exemplos de processos de selecção adequados para adenovírus sensíveis à temperatura podem ser encontrados, por exemplo em Ensinger et ai., J. Virol. 10:328, 1972; e Williams et al., J. Gen Virol. 11:95, 1971. A descrição de variantes de adenovírus que não são sensíveis à temperatura, mas são sensíveis à gama de hospedeiros, pode ser encontrada em Harrison et al.r Virology 77:319, 1977. Os mutantes sensíveis à temperatura eficazes para utilização na presente invenção podem ser preparados, por exemplo, a partir de vírus auxiliares alternativos, como o vírus de herpes simples 1 (HSV1), ou vírus de herpes simples 2 (HSV2). Ver, e.g., Schaffer et al., Virology 52:57, 1973 para HSV1; Esparza et al., Virology 57:554, 1974 para HSV2. Como indicado na secção de antecedentes, foi descrito um grande número de vírus auxiliares sensíveis a condições, e estes podem ser obtidos pelos cientistas que os desenvolveram ou descreveram, ou a partir de uma colecção pública. A estirpe tem que ser tornada sensível às condições numa fase do seu ciclo replicativo tal que a função que é bloqueada sob condições não permissivas não é necessária para a replicação de AAV de eficiência elevada. A escolha de qual a estirpe de vírus auxiliar a utilizar pode ser feita em relação quer à biologia conhecida do vírus auxiliar, quer aos requisitos replicativos do AAV.

Um exemplo de vírus auxiliar para utilização na presente invenção é o adenovírus sensível à temperatura, tsl49 do serotipo Ad5 (Ad5tsl49). Sob condições optimizadas, esta estirpe pode ser utilizada para produzir rAAV a níveis que 45 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ correspondem, ou excedem os suportados pelo Ad5 do tipo selvagem. O tsl49 tem uma única transição de C-G para A-T na posição 7563 (Roovers et al., Vírus Genes 4:53, 1990). Isto resulta numa alteração do aminoácido leucina no resíduo 411 da ADN-polimerase, para fenilalanina. A ADN-polimerase está contida na unidade de transcrição E2 do adenovírus. No entanto, outros mutantes de ts mapeados nesta região são menos adequados. Em particular, a unidade de transcrição de E2 também compreende a região codificante para a proteína de ligação a ADN de 72 kDa (DBP) . Uma estirpe que não produz DBP detectável (Add/802) suporta a replicação de AAV, mas a um nível que é reduzido numa ordem de grandeza (Cárter et al., Virology 191:473, 1992). O Adtsl25, que também compreende uma mutação mapeada na região codificante de DBP, suporta a replicação de AAV (Straus et al., J. Virol. 17:140, 1976), embora os níveis sejam geralmente muito inferiores aos de Ad5 do tipo selvagem (Myers et al., J. Virol. 35:65, 1980). Deste modo, os vectores de adenovírus sensíveis à temperatura adequados para utilização na presente invenção incluem aqueles para os quais a sensibilidade está mapeada na região E2A do genoma, preferivelmente na região codificante da ADN-polimerase . O técnico pode determinar com facilidade quais as estirpes virais que são adequadas para utilizar como vírus auxiliar, realizando um ensaio de replicação de rAAV utilizando um painel de estirpes de vírus auxiliares candidatas numa célula candidata, sob condições que são não permissivas para a auto-replicação do vírus auxiliar. Para variantes sensíveis à temperatura, a pesquisa é feita à temperatura não permissiva de acordo com as propriedades conhecidas da estirpe. As temperaturas não permissivas são geralmente superiores às temperaturas permissivas, tipicamente de cerca de 35°-50°C, preferivelmente 38°-45°C, mais preferencialmente cerca de 39,5°C. Preferem-se as variantes que suportam a replicação de AAV a um nível que está dentro de uma ordem de grandeza em relação ao nível que é suportado pelo vírus de tipo selvagem correspondente. Ao realizar a pesquisa, o perito deverá incorporar os outros ensinamentos desta descrição. Em particular, a pesquisa fazendo a cultura durante tempos que originam uma replicação de AAV de pico com vírus do tipo selvagem não é suficiente. Deverá estabelecer-se uma 46 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ matriz cinética em que os vírus auxiliares candidatos são utilizados durante períodos longos e em seguida comparados com o vírus de tipo selvagem na altura de colheita de pico.

Uma vez seleccionada uma estirpe de vírus auxiliar adequada, pode-se implementar nesta invenção num número de formas diferentes. Partículas virais, plasmídeos virais e células hospedeiras transformadas de forma estável podem todas ser utilizadas.

Numa concretização, o genoma do vírus auxiliar (ou no mínimo as regiões do genoma do vírus auxiliar que codificam para a função auxiliar) é introduzido na célula hospedeira a ser utilizada para replicação do vector de rAAV, na forma de um plasmídeo de ADN, ou vários plasmídeos que proporcionam funções complementares. Os procedimentos para a manipulação experimental de adenovírus são conhecidos na especialidade. Ver, por exemplo, Graham et al., "Manipulation of adenovírus vectors". In: Murray EJ, ed Methods in molecular biology: Gene transfer and expression protocols, vol7. Clifton, NJ: The Human Press, 1991:109-128, que fornece protocolos detalhados para a propagação, titulação e purificação de adenovírus, co-transfecção e recombinação in vivo. Os plasmídeos de adenovírus estão disponíveis comercialmente da Microbix Biosystems Inc., Toronto, Canada.

Noutra concretização, a célula hospedeira é transformada de forma estável com genes de adenovírus, ou geneticamente alterada para se obter as funções necessárias para a replicação de rAAV. Alternativamente, a célula hospedeira pode ser geneticamente alterada com apenas uma porção do genoma de adenovírus e é subsequentemente infectada ou transfectada com uma partícula de adenovírus ou um plasmídeo. Os pedidos de patente WO 95/27071 e WO 95/34671 descrevem células hospedeiras hereditariamente alteradas para se obter a função de adenovírus que complementa a propriedade replicativa de várias construções de adenovírus deficientes.

Ainda noutra concretização, a célula hospedeira utilizada para a replicação de AAV é infectada com um vírus auxiliar que é capaz de auto-replicação, mas não sob condições não permissivas. Pode-se utilizar qualquer preparação da estirpe 47 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ necessária que proporciona uma MOI suficiente. Respondendo ao GMP e outros requisitos regulatórios e para facilitar o redimensionamento para fins comerciais, as preparações de vírus auxiliares compreendem preferivelmente uma densidade elevada de partículas infecciosas e são substancialmente isentas de detritos celulares e outros contaminantes. As propriedades desejáveis incluem as seguintes: • Uma densidade de pelo menos 106, preferivelmente pelo menos cerca de 108, mais preferencialmente pelo menos cerca de IO10 Ul/ml, como determinado num ensaio de TCID50. • Uma razão entre ADN de adenovírus e proteína total ou hexão de adenovírus que indica que pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% das partículas virais contêm ADN de adenovírus. • Menos de 20%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferencialmente menos de cerca de 1% de contaminação por material não adenoviral, ao nível da proteína ou do ADN, como detectado por géis de SDS corados para proteína, ou géis de agarose de fragmentos de digestão por nuclease corados com brometo de etídio. • Um total de pelo menos 109, preferivelmente pelo menos cerca de 1011, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1013 UI por lote de produção. O vírus auxiliar pode ser preparado em qualquer célula que é permissiva para a replicação virai. Para adenovírus, as células preferidas incluem células 293 e células HeLa. Tradicionalmente, quando estas células foram utilizadas para replicação de adenovírus, foram utilizadas em culturas em placas. Estes métodos geralmente suportam a replicação de adenovírus sensíveis à temperatura a níveis que são um ou dois log inferiores aos do adenovírus do tipo selvagem.

Deste modo, é preferível utilizar técnicas de cultura que permitam um aumento na densidade de sementeira. Estão disponíveis variantes de células 293 e células HeLa que foram adaptadas a cultura em suspensão. A HeLa é preferível por razões de crescimento celular, viabilidade e morfologia em suspensão. Estas células podem ser crescidas a uma densidade 48 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ suficiente (2 χ 106 por ml) para compensar a menor taxa de replicação da estirpe de adenovirus sensível à temperatura. Uma vez estabelecidas, as células são infectadas com o vírus e cultivadas à temperatura permissiva durante um período suficiente; geralmente, 3-7 dias e tipicamente cerca de 5 dias. A filtração em fluxo tangencial é uma técnica utilizada na especialidade para processar volumes grandes de células de mamífero para fins de perfusão, concentração e colheita. Ver, e.g., Dorin et al., Biotechnol. Prog. 6 : 494, 1990; Maiorella et al., Biotechnol. Bioeng. 37:121, 1991. É recomendado que esta técnica seja utilizada com culturas em suspensão para a preparação de vírus auxiliares para utilização na presente invenção. As células HeLa S3 suportam forças de corte de 750-1500 s_1, permitindo a concentração das células e a diafiltração do meio gasto. O vírus é colhido a partir da cultura, quer a partir do meio gasto, quer por microfluidização das células. O nível de vírus auxiliar produzido na cultura é tipicamente de pelo menos 107 Ul/ml e preferivelmente de pelo menos cerca de 3 χ 107 Ul/ml.

Os vírus auxiliares preparados de acordo com a descrição anterior podem ser utilizados directamente para infectar as células hospedeiras utilizadas para a replicação de rAAV. Mais usualmente, o vírus é isolado e concentrado antes da utilização. Os métodos actuais para purificar e concentrar vírus auxiliares envolvem tipicamente gradientes de CsCl isopícnicos. Este método é moroso e trabalhoso, requer vários passos de processamento abertos, e é difícil de redimensionar. Pelo contrário, a purificação por cromatografia é recomendada. O leitor pode consultar em geral Prior et al., Pharmaceut. Technol. 19:30, 1995; e Huyghe et al., Human Gene Therapy 6:1403, 1995. É particularmente preferida para o isolamento de estirpes de adenovirus sensíveis à temperatura a cromatografia de troca aniónica, em especial numa resina de polietilenoimina, utilizando um gradiente contínuo de NaCl a pH 7,4. 49 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ Técnicas de produção e purificação de AAV preferidas para utilização na presente invenção

Tal como com o vírus auxiliar, é conveniente para fins de ilustração, dividir a discussão sobre a produção e purificação de AAV em fases de processo "a montante" e a "jusante"; sendo o processo "a montante" geralmente referente à produção de AAV em células hospedeiras adequadas e libertação do vírus a partir das células para produzir uma preparação de AVV "bruta". Processamento a "jusante" pode ser utilizado para purificar a preparação de AAV (e.g. para isolar AAV de proteínas celulares e/ou outros contaminantes).

Em aspectos preferidos da presente invenção, o processamento de AAV a montante e a jusante são realizados de um modo concebido para reduzir e/ou eliminar substancialmente proteínas celulares contaminantes, bem como quaisquer vírus auxiliares contaminantes (e.g. Ad) ou proteínas de vírus auxiliares, podendo qualquer destes contribuir para desencadear uma resposta imunitária se presente em níveis substanciais no vector de rAAV final, a ser utilizado para a transferência de genes.

As seguintes secções descrevem, para fins ilustrativos, técnicas que podem ser utilizadas para a produção de AAV. (i) Processamento de AAV a montante 0 vector de AAV pode ser produzido a partir de uma linha celular de mamífero que contém os genes de empacotamento de AAV necessários (e.g. um gene rep e cap de AAV); um pró-vector de AAV recombinante (rAAV) que compreende um polinucleótido heterólogo que não de AAV flanqueado por pelo menos uma repetição terminal invertida de AAV (ITR); e um vírus auxiliar para AAV (e.g. um adenovírus). Estes componentes podem ser introduzidos na célula numa variedade de configurações. Uma vez que o AAV pode ser replicado e empacotado em qualquer uma de uma variedade de células de mamífero, há um grande número de linhas celulares que podem ser modificadas e utilizadas para a produção de AAV. 50 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ A título ilustrativo, ο vector de AAV pode ser produzido a partir de uma linha celular, tal como "C12" (como descrito por K.R. Clark et al., Gene Therapy, 3: 1124-1132, 1996), ou a linha "C137.5" (descrito num pedido co-pendente dos mesmos requerentes da Targeted Genetics Corporation, J. Allen et al., WO 96/17947), que foi manipulada para conter uma construção de rep e/ou cap, bem como uma construção de vector. Opcionalmente, uma linha celular, tal como C12 ou cl37 que contêm uma construção rep e/ou cap pode ser transfectada com um plasmídeo que contém uma construção de vector, tal como ptgAAV-CF. Ou uma célula pode ser transfectada com um plasmídeo que contém rep e cap, tal como pRS5, bem como um plasmídeo que contém uma construção de vector. A célula pode ser infectada com adenovírus, ou transfectada com ADN que contém os genes de adenovírus.

Podem-se produzir várias destas células "produtoras" de AAV, como descrito nas referências aqui citadas e na especialidade.

As células produtoras de AAV podem ser crescidas sob condições (incluindo meios, temperatura e semelhantes) que são geralmente adequadas para crescimento das células de mamífero que também são geralmente permissivas para a replicação de AAV. Por exemplo, o meio de suspensão DMEM/F12 é preferido para crescimento das células e o meio DMEM isolado é preferido para a produção do vector de AAV. Como é conhecido na especialidade, alguns tipos de células e linhas celulares tendem a ser dependentes de fixação, enquanto que outros são capazes de crescer em suspensão; e muitas células dependentes de fixação também podem ser "adaptadas" ao crescimento em suspensão, efectuando ciclos com as células em condições de suspensão, como um meio de enriquecer e por fim seleccionar as variantes que são capazes de crescer em suspensão. Deste modo, o crescimento de células para a produção de AAV pode ser realizado em qualquer um de uma variedade de recipientes, dependendo em parte do facto de a linha celular produtora ser ou não relativamente dependente de fixação ou adaptada a suspensão. Estes recipientes para o crescimento de células dependentes de fixação incluem, por exemplo, frascos de cultura de tecidos, garrafas rolantes, microtransportadores e biorreactores (tais como biorreactores de fibra oca, leito 51 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ empacotado ou leito fluidizado). Os recipientes para linhas celulares de mamífero adaptadas a suspensão incluem, por exemplo, frascos rotativos, reactores de tanque e fermentadores agitados por fase gasosa (air-lift). A replicação de AAV prossegue durante um período de tempo, bem como até um ponto no ciclo de crescimento em que a produção virai é óptima, preferivelmente crescimento logarítmico médio a tardio (tipicamente um a três dias), tempo após o que as partículas de vírus são recolhidas a partir do sobrenadante de cultura. A filtração em fluxo tangencial (TFF) pode ser utilizada com benefício para processamento e recolha de grandes volumes de células. A TFF pode ser utilizada para perfundir, concentrar e recolher células animais. Por exemplo, a TFF pode ser utilizada para processar células sob condições de fluxo laminar, a velocidades de corte médias na parede de até 3000 por segundo (ver, e.g. . Maiorella, B., et al.,

Biotechnology and Bioengineering, 37: 121-126, 1991). A concentração de vírus em grande escala utilizando ultrafiltração TFF foi descrita por R. Paul et al. Human Gene Therapy, 4:609-615, 1993.

Exemplos de produção utilizando estas técnicas são descritos a seguir. (ii) Processamento de AAV a jusante

Como descrito acima, seria particularmente vantajoso obter preparações de AAV que sejam substancialmente isentas de partículas de vírus auxiliares (tais como partículas Ad). Além disso, as preparações de vector de AAV serão também, preferencialmente, substancialmente isentas de vírus auxiliares e proteínas celulares (que também podem ser imunogénicas) . No entanto, há um outro conjunto de restrições que influenciam a adequabilidade das técnicas para a produção de AAV. Nomeadamente, de modo a ser particularmente útil para a produção de AVV para terapia génica, é particularmente desejável que as técnicas sejam "redimensionáveis", i.e. aplicáveis em conjunto com dispositivos e procedimentos de fabrico em grande escala. Este último conjunto de restrições 52 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ reduz ou elimina eficazmente a utilidade de técnicas convencionais disponíveis, tais como separação em cloreto de césio (que não é bem adequada para procedimentos de preparação em larga escala).

Preferivelmente, as partículas de rAAV são ainda purificadas por procedimentos de cromatografia de troca iónica que contrastam com vários procedimentos referidos na especialidade para a purificação potencial de, e.g., AAV ou Ad. Em particular, os procedimentos como os descritos na especialidade tipicamente utilizam um único tipo de separação iónica, por vezes em combinação com outros tipos de procedimentos cromatográficos (ver, e.g., K. Tamayose et al., Human Gene Therapy 7: 507-513 (1996), e W096/27677, Sept. 12, 1996). No entanto, no caso da produção de AAV, uma combinação de cromatografia de troca iónica oposta sequencial, é particularmente eficaz para a produção de preparações de AAV que sejam substancialmente isentas de partículas e proteínas de vírus auxiliares, bem como de proteínas celulares. Uma combinação de ambas as trocas iónicas opostas é particularmente eficaz para eliminar todas as várias partículas e contaminantes proteicos que tipicamente ocorrem na produção de preparações de vector de AAV.

Pode-se utilizar qualquer uma de uma variedade de resinas de troca catiónica e aniónica em conjunto com estes procedimentos, sendo as propriedades fundamentais destas a disponibilidade de grupos carregados negativa e positivamente, respect ivamente, aos quais o AAV se pode ligar, pelo menos nalgum grau (muito preferencialmente num grau que difere substancialmente da afinidade de ligação relativa de um ou mais dos contaminantes referidos acima, i.e. partículas e proteínas de Ad, bem como proteínas celulares de mamífero). Sem pretender estar ligado a nenhuma teoria particular, pensa-se que o passo de troca aniónica é particularmente eficaz para separar os AVV de adenovírus; enquanto que se pensa que ambos os passos (mas em especial o passo de troca catiónica) são particularmente eficazes para separar o AAV das proteínas celulares. Também utilizámos troca aniónica seguida de filtração em fluxo tangencial, como descrito e ilustrado a seguir. Como descrito a seguir, verificámos que as preparações 53 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ de AAV podem ser altamente concentradas por cromatografia em sulfato de heparina. A título ilustrativo, um lisado de AAV clarificado, como descrito acima, pode ser carregado numa coluna de troca aniónica carregada positivamente, tal como uma resina de amino ou imino carregada em N (e.g. POROS 50 PI, ou qualquer DEAE, TMAE, amina terciária ou quaternária, ou resina baseada em PEI) , ou uma coluna de troca catiónica carregada negativamente (tal como HS, SP, CM ou qualquer resina catiónica baseada em sulfo, fosfo ou carboxi) . A coluna pode ser lavada com um tampão (tal como tampão de cromatografia A/TMEG). A coluna pode ser eluída com um gradiente de concentração crescente de NaCl e podem-se recolher fracções e testar quanto à presença de AVV e/ou contaminantes.

Podem-se utilizar outros procedimentos em vez de ou, preferivelmente, além dos procedimentos de troca aniónica e catiónica acima descritos, baseados em associações intermoleculares mediadas por características que não a carga, como é conhecido na especialidade. Estes outros procedimentos incluem associações intermoleculares baseadas em pares ligando-receptor (tais como interacções anticorpo-antigénio ou lectina-hidrato de carbono), bem como separações baseadas noutros atributos das moléculas, tais como cromatografia por crivo molecular baseada no tamanho e/ou na forma. Para referir apenas um exemplo, o filtrado ou a preparação de AAV parcialmente purificada podem ser carregados num coluna que contém um anticorpo específico de AAV. Esta coluna pode ligar AAV. A coluna pode ser lavada com tampão para remover proteínas contaminantes e em seguida eluir com um gradiente ou passo de concentração de NaCl crescente, podendo-se recolher as fracções. Alternativamente, esta coluna pode ser eluída com um tampão com um pH diferente do tampão de carga.

Os picos de AVV e adenovírus podem ser identificados nas fracções por ensaios de infecciosidade, ou por hibridação de ácidos nucleicos ou imunoensaios. Os picos podem ser reunidos e o conjunto pode ser diluído ou dialisado ou diafiltrado com um tampão (e.g. TMEG ou equivalente) para reduzir a concentração de sal. 54 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Este conjunto pode ser injectado numa coluna de troca aniónica carregada positivamente e/ou coluna de troca catiónica carregada negativamente (tais como as referidas acima) . A coluna pode ser lavada com um tampão (tal como um tampão de cromatografia A/TMEG). A coluna pode ser eluida com um gradiente de concentração crescente de NaCl e as fracções podem ser recolhidas. Os picos de AAV e adenovirus podem ser identificados nas fracções por um ensaio de infecciosidade ou por hibridação de ácidos nucleicos ou um imunoensaio. Os picos podem ser reunidos com base nos resultados de qualquer destes ensaios. O conjunto de fracções que contêm AAV eluidas a partir de uma coluna de troca aniónica como descrito acima, pode ser concentrado e purificado por filtração em fluxo tangencial (TFF), por exemplo numa unidade Filtron Ultrasette ou Millipore Pellicon. Uma membrana de limite de exclusão de peso molecular adequada (tal como limite de exclusão de 100 00 ou 300 000), é tipicamente composta por um polimero, tal como celulose regenerada ou poliéter-sulfona. A preparação é filtrada através da membrana e o produto é retido. O material retido pode ser diafiltrado utilizando a membrana com lavagens sucessivas de um tampão adequado, tal como solução salina equilibrada de Ringer + glicerol a 5%. A amostra final é altamente enriquecida no produto e pode ser esterilizada por filtração através de um filtro de 0,2 μ e armazenada para utilização.

Na purificação e concentração de AAV com filtração em fluxo tangencial a partir de material submetido a coluna de troca aniónica, a membrana de limite de exclusão de peso molecular de 300 000 resultou em rendimentos mais elevados de unidades replicativas do que a membrana de limite de exclusão de peso molecular de 100 000.

Um passo adicional que pode ser utilizado para remover o adenovirus, se desejado, envolve tratar o conjunto eluido com um passo de inactivação pelo calor (como aqui descrito) e em seguida filtração (e.g. antes de submeter a preparação a TFF). No entanto, verificámos que o procedimento de "troca aniónica para TFF" descrito acima resultou numa preparação de AAV que 55 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ era isenta de adenovírus detectável e resultou em melhores rendimentos de AAV purificado. A seguir estão exemplos de operações de produção utilizando estas técnicas. A descrição anterior proporciona, inter alia, métodos para produzir preparações de título elevado de vectores de AAV recombinantes que são substancialmente isentas de vírus auxiliares (e.g. adenovírus) e proteínas celulares.

Os exemplos apresentados a seguir são dados como guia adicional para o técnico competente na matéria e não pretendem ser limitativos em nenhum modo. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Métodos gerais

Quantificação de títulos de rAAV em preparações de vector: ensaio de slot blot O ensaio de slot blot de ADN de rAAV foi realizado como se segue. Digeriram-se alíquotas de amostras com nuclease, para remover ADN não encapsidado. As amostras foram desnaturadas em NaOH 0,4M, EDTA 10 mM com ADN de esperma de salmão a 1,0 pg/ml a 65°C. As amostras e padrões de rAAV foram diluídos e filtrados em membranas de nylon utilizado um dispositivo de slot blot e lavadas com NaOH 0,4M. O filtro foi hibridado com um fragmento de restrição de ADNc de CFTR humano marcado com 32P. Esta sonda detecta um fragmento de aproximadamente 1,5 kb do vector de AAVCF (correspondendo ao fragmento EcoRI previsto de 1,488 kb).

Ensaio de microtítulo de infecciosidade para medir rAAV O ensaio de microtítulo de infecciosidade foi realizado como descrito anteriormente. Atkinson et al. (1998) Nucleic Acids Research 26(11): 2821-2823. Em resumo, fez-se um teste de microtítulo de infecciosidade de elevada capacidade para medir os vírus infecciosos, como se segue. Inocularam-se alíquotas (10 μΐ) de sobrenadantes isentos de células, diluídos em série, em células HeLa clone 37 crescidas em placas de microtítulo de 96 poços. Após três dias, as células 56 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ infectadas foram tratadas e lisadas com uma solução de desnaturação (adição de 1/10 do volume de NaOH 4,0 M, ADN de esperma de salmão a 10 yg/ml e EDTA 100 mM) . O lisado foi transferido para uma placa Silent Monitor BiodyneB (Pall) e filtrado sob vácuo numa membrana de nylon. A membrana foi lavada, desnaturada, hibridada com um fragmento de restrição de ADNc de CFTR humano marcado com 32P. Esta sonda detecta um fragmento de aproximadamente 1,5 kb do vector de AAVCF (correspondente ao fragmento EcoRI previsto de 1, 488 kb) . A replicação do vector foi quantificada em relação a uma banda de CFTR genómico endógeno e é expressa em unidades de replicação. Uma unidade de replicação (UR) é definida como a intensidade de um sinal equivalente à da banda do CFTR genómico endógeno, que é de aproximadamente 1,8 kb. Utilizou-se a regressão linear de padrões de vector conhecidos diluídos em série para extrapolar e calcular a concentração de vector nas amostras.

Meios de produção

As tabelas 1 e 2 proporcionam concentrações de componentes (em mg/1) de meios adequados para crescer células e produzir rAAV (as células em branco indicam concentração zero). Em geral, é preferível ter níveis séricos reduzidos. Por exemplo, os meios utilizados nestas experiências continham cerca de 1% de soro fetal de bovino (FBS). TABELA 1

Concentração SAIS INORGÂNICOS CaCl2 anidro 200 Fe(N03)3 * 9H2 0 0,1 KCL 400 MgSO4*7H20 200 NaCl 4675 NaHC03 1200 NaH2P04·Η2 0 125 OUTROS COMPONENTES Glucose 8500 HEPES 3575 Vermelho de fenol, sal de Na Piruvato de sódio 110 57 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Pantotenato de cálcio 6 Cloreto de colina 6 Ácido fólico 6 Inositol 11 Nicotinamida 6 piridoxal HC1 2 Piridoxina HC1 4 Riboflavina 0,6 tiamina HC1 6 F-6 8 500 AMINOÁCIDOS L-Alanina 8,9 L-Arginina »HCL 236,9 L-Asparagina ·Η20 17 Ácido L-aspártico 13,3 L-Cistina 72 Ácido L-Glutâmico 14, 7 L-Glutamina 1168 Glicina 37,5 L-Histidina «HCL ·Η20 84 L-Isoleucina 157,3 L-Leucina 157,2 L-Lisina *HCL 218, 7 L-Metionina 45, 1 L-Fenilalanina 99 L-Prolina 11,5 L-Serina 52,5 L-Treonina 142, 8 L-Triptofano 26,2 L-Tirosina 108 L-Valina 140, 4 58 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ TABELA 2

Componente Concentração, mg. /L CaC12 200 Fe(N03)3.9H20 0,1 KC1 400 MgS04.7H20 200 NaCl 4675 NaHC03 1200 NaH2P04.H20 125 Glucose 4500 HEPES 3575 Piruvato de sódio 110 Pantotenato de cálcio 4 Cloreto de colina 4 Ácido fólico 4 Inositol 7 Nicotinamida 4 piridoxal HC1 piridoxina HC1 4 Riboflavina 0,4 tiamina HC1 4 F68 500 L-alanina L-arginina HC1 84 L-asparagina Ácido L-aspártico L cisteína 48 L glutâmico L glutamina 876 Glicina 30 L-histidina-HCl. H20 42 L isoleucina 104, 8 L-Leucina 104, 8 L-Lisina HC1 146,2 L-metionina 30 L-fenilalanina 66 L-prolina L-serina 42 L-treonina 95,2 L-triptofano 16 L tirosina 72 L valina 93,6 59 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ EXEMPLO 2

Efeito do pH na produção de partículas de vector de rAAV em Usados de células produtoras

As células JL14 foram inoculadas a cerca de 3 x 105 células/ml num biorreactor de 3 litros e crescidas em 1.5 litros do meio rAAV apresentado na tabela 2. Dois dias após a inoculação do meio de cultura no biorreactor com células JL14, o biorreactor foi perfundido com meio fresco, começando a 0,4 volumes por dia, em seguida duplicando esta quantidade a cada 24 horas. Após 5 dias, ou quando a densidade celular atingiu 6 x 106 células/ml, removeram-se 3 x 108 células e cresceram-se sob condições convencionais, i.e, deixando o pH variar. As células que permanecem nos biorreactores foram concentradas num volume de 750 ml de meio de cultura e fez-se uma troca de três volumes de meio com meio de produção (i.e., meio de acordo com a tabela 2) a pH 7,2 para trocar o meio, de modo que o volume final da cultura de células era de 750 ml. Cresceu-se o adenovirus do tipo 5 a partir de uma solução mãe obtida da American Type Culture Collection (Manassas, VA). O adenovirus foi diluído em 750 ml de meio de produção e adicionado às células (multiplicidade de infecção (MOI) = 10), acertando o volume final para 1,5 litros. A infecção com adenovirus foi deixada prosseguir durante uma hora a 37°C.

Após deixar a infecção prosseguir, transferiram-se 1 x 105 células para cada um de 5 frascos com agitador, separados. O volume nos cinco frascos foi acertado para 1.5 litros com meio de produção a pH 6,6, 7,0, 7,2, 7,4, e 7,8, respectivamente. Os conteúdos dos frascos com agitador foram transferidos para biorreactores separados que foram então mantidos individualmente a pH 6,6, 7,0, 7,2, 7,4, e 7,8. Outros parâmetros do meio de cultura eram como se segue: temperatura = 37°C; concentração de oxigénio dissolvido(DO2) = 30%; e agitação = 150 rpm. A temperatura, pH, DO2, densidade celular, osmolaridade e glucose/lactato foram monitorizados diariamente. Recolheram-se amostras de células no dia 2 e dia 3 após a infecção e 60 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ lisaram-se. Os lisados celulares foram testados por ensaio de slot blot de partículas resistentes a ADNase (DRP) e por ensaio de infecciosidade de microtítulo.

As Figuras IA e 1B são gráficos de barras que mostram os resultados de duas experiências separadas, expressos como DRP por célula, aos vários níveis de pH. As barras a cheio representam DRP/célula no dia 2 após a infecção; as barras a tracejado representam o DRP/célula no dia 3. O DRP/célula nas culturas mantidas a pH 7,2, pH 7,4, e pH 7,8 diminuiu drasticamente do dia 2 para o dia 3 após infecção, enquanto que esta redução não era tão pronunciada na cultura de células de controlo. A densidade de células totais não alterou de forma considerável, nestas condições de cultura. EXEMPLO 3

Efeito do pH na libertação de partículas de vector de rAAV no meio de cultura das células

Em resumo, cresceram-se células produtoras de AAV em biorreactores. As células foram em seguida infectadas com Ad5 a M0I= 10 e inoculadas em meio de baixo teor de soro (ver Tabela 2) em suspensão, em biorreactores de 1,5 litros. As culturas foram mantidas a vários níveis elevados de pH elevado (de 7,2 a 8,0) . As culturas foram em seguida monitorizadas diariamente quanto ao número de células, viabilidade, consumo de glucose, produção de lactato, pH, osmolaridade e produção de AAV. Como se mostra a seguir, houve um aumento na produção de AAV quando o pH aumentou para 7,4; acoplado com um aumento ainda mais drástico no número de partículas de AAV libertadas para o sobrenadante (que aumentou à medida que o pH aumentava): pH da Partículas Partículas Partículas % associada % no cultura associadas no totais a células sobrenadante a células sobrenadante 7,2 4, 70E + 12 1,9 0E + 09 4, 70E + 12 100% 0% 7,4 6,50E + 12 1,3 0E + 13 1,95E + 13 33% 67% 7,6 3, 40E + 12 1,50E+13 1,84E + 13 18% 82% O co 1,30E + 12 1,50E+13 1,63E + 13 00 cAP 92% 61 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ

Em resumo, à medida que o pH aumentou, observámos um aumento acentuado no número de partículas de AAV libertadas no sobrenadante, e um desvio na percentagem de partículas no sobrenadante:associadas a células (de quase todas associadas a células a pH 7,2, para quase todas no sobrenadante (92%) a pH 8,0).

Para melhor analisar os efeitos do pH na produção do vector de rAAV cresceram-se células JL14 num biorreactor de perfusão, como descrito acima (utilizando os meios descritos na Tabela 1) a uma densidade de 107 células/ml. A cultura de células foi concentrada para um volume de 750 ml e o meio trocado, realizando 3 diavolumes. O volume total foi acertado para 1,5 litros com meio de produção contendo adenovírus, a uma MOI de 10. A infecção foi deixada prosseguir durante uma hora.

Após deixar a infecção prosseguir, transferiram-se 1 x 105 células para cada um de 5 frascos com agitador, separados. O volume nos cinco frascos foi acertado para 1,5 litros com meio de produção a pH 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, e frascos de controlo (pH não mantido no nível de partida). Os conteúdos no frascos com agitador foram transferidos para biorreactores separados, que foram então mantidos individualmente a pH 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0. Os biorreactores mantiveram o pH no nível referido ± 0,05 unidades de pH. Outros parâmetros do meio de cultura eram como se segue: temperatura = 37°C; concentração de oxigénio dissolvido (DO2) = 30%; e agitação = 150 rpm. As células e sobrenadantes de cultura (meios de cultura) foram recolhidos nos dias 2 e 3.

Os resultados são apresentados nas Figuras 2A a 2B. As Figuras 2A e 2B são gráficos de barras e mostram os resultados, expressos como DRP totais, de produção de rAAV em biorreactores mantidos a vários níveis de pH. As percentagens por cima de cada barra são percentagens de DRP totais no lisado celular. A porção a cheio de cada barra representa DRP nos lisados celulares, enquanto que a porção a tracejado de cada barra representa as DRP no meio de cultura de células. No dia 2 após a infecção, 29% das DRP totais estavam no meio de cultura da cultura mantida a pH 8,0, enquanto que no dia 3, após a infecção, a percentagem de DRP totais no meio de 62 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ cultura aumentou para 92%. No dia 3 após infecção, a percentagem de DRP totais no meio de cultura era de 67% a pH 7,4, 82% a pH 7,6, 73% a pH 7,8 e 92% a pH 8,0. As culturas mantidas a pH 7,2 não originaram nenhuns DRP no meio de cultura de células nesta experiência.

Os lisados celulares do dia 2 e dia 3 após infecção e os meios de cultura dos biorreactores mantidos a pH 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, e 8,0 foram testados quanto a unidades de replicação (UR) utilizando um ensaio de infecciosidade. Os dados são apresentados nas Figuras 3A e 3B. A densidade celular total não se alterou de forma apreciável nestas condições de cultura.

As Figuras 3A e 3B são gráficos de barras que mostram as unidades de replicação totais (UR) testadas no dia 2 (3A) e dia 3 (3B) após a infecção, nos meios de cultura (porção a tracejado de cada barra) e lisados celulares (porção a cheio de cada barra) quando as culturas foram mantidas nos níveis de pH indicados. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de UR totais no lisado celular. Estes dados demonstram que as partículas de rAAV libertadas para o meio de cultura das células são funcionais num ensaio de infecciosidade. A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra a razão partícula:infecciosidade (P/I) das partículas de rAAV recolhidas dos lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e o meio de cultura das células (porção a tracejado de cada barra) no dia 3 após a infecção, a partir de biorreactores mantidos aos níveis de pH indicados. Estes dados indicam que a maioria do vector de rAAV libertado para o meio de cultura celular é infeccioso. EXEMPLO 4

Efeito da osmolalidade na libertação de partículas de vector de rAAV para o meio de cultura de células

Para determinar os efeitos da osmolalidade de partida do meio de cultura sobre a libertação de rAAV para o meio de cultura de células, cresceram-se células JL14 em biorreactores e infectaram-se com adenovírus, essencialmente como descrito no Exemplo 2. A osmolalidade de partida nos biorreactores 63 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ individuais era de 130, 200, 300, 400 e 500 mOsm, respectivamente. Em cada reactor, o pH foi mantido a pH 8,0 (±0,05); temperatura = 37°C; D02 = 30%; e agitação = 150 rpm. Nos dias 2, 3, e 4 após a infecção, os lisados celulares e os meios de cultura de células foram recolhidos e analisados quanto à produção de vector de rAAV.

Os resultados são apresentados nas Figuras 5-7.

As Figuras 5A, 5B, e 5C são gráficos de barras que mostram as DRP totais nos lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meios de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (5A), dia 3 (5B), e dia 4 (5C) após a infecção, em biorreactores em que o meio de cultura de células continha a osmolalidade de partida indicada. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de DRP totais no lisado celular. Estes dados mostram que quando o meio de cultura de células tem uma osmolalidade de partida de 300 mOsm, 41 %, 59%, e 80% das DRP totais estão no meio de cultura de células no dia 2, 3, e 4, respectivamente. Uma osmolalidade de partida do meio de cultura de células de 300 mOsm originou a percentagem máxima de vector de rAAV total no meio de cultura de células, em comparação com outras osmolalidades de partida testadas. A densidade celular total não se alterou de forma considerável nestas condições de cultura.

As figures 6A, 6B, e 6C são gráficos de barras que mostram os UR totais nos lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meios de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (6A) , dia 3 (6B) , e dia 4 (6C) , após infecção em biorreactores em que o meio de cultura de células continha a osmolalidade de partida indicada. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de UR totais nos lisados celulares. Estes dados indicam que o vector de rAAV libertado para o meio é infeccioso. A Figura 7 é um gráfico de barras que mostra a razão P/I das partículas de rAAV no meio de cultura de células, nos dias 3 e 4, a partir de culturas de biorreactores com as osmolalidades indicadas. ΕΡ 1 109 892/ΡΤ 6 4 EXEMPLO 5

Efeito da temperatura sobre a libertação de partículas de vector de rAAV para o meio de cultura de células

As células JL14 foram crescidas em biorreactores e infectadas com adenovírus, essencialmente como descrito no Exemplo 2. As células foram transferidas para biorreactores mantidos individualmente a 31°C, 34°C, 37°C, 39°C, e 42°C, respectivamente. Estas temperaturas foram mantidas ± 0,5°C. O pH em cada reactor foi mantido a 8,0 (±0,05); agitação = 150 rpm; D02 = 30%. Nos dias 2, 3, e 4 após a infecção, os lisados celulares e o meio de cultura de células foi analisado quanto a partículas de rAAV.

Os resultados são apresentados nas figuras 8 e 9.

As Figuras 8A-C são gráficos de barras que mostram as DRP totais nos lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meios de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (8A), dia 3 (8B), e dia 4 (8C), após a infecção em biorreactores em que o meio de cultura de células foi mantido à temperatura indicada. As percentagens por cima de cada barra indicam a percentagem de DRP totais no lisado celular. Os dados mostram que quando o meio de cultura foi mantido a 39°C, 66%, 67%, e 57% das DRP totais foram encontrados no meio de cultura de células nos dias 2, 3, e 4, respect ivamente. Os dados indicam também que uma maior percentagem de DRP foi encontrada no meio de cultura de células quando o meio de cultura de células foi mantido a 39°C, em comparação com 37°C ou 42 °C.

As Figuras 9A, 9B, e 9C são gráficos de barras que mostram as UR totais nos lisados celulares (porção a cheio de cada barra) e meio de cultura de células (porção a tracejado de cada barra) no dia 2 (9A), dia 3 (9B), e dia 4 (9C) após a infecção, em biorreactores em que o meio de cultura de células foi mantido à temperatura indicada. As percentagens por cima de cada barra na Figura 9A indicam a percentagem de UR totais no meio de cultura de células. As percentagens por cima de cada barra na figura 9A indicam a percentagem de UR totais no lisado celular. Estes dados mostram que quando o meio de cultura foi mantido a 39°C, 80%, 97%, e 98% das UR totais foram encontrados no meio de cultura de células nos dias 2, 3, 65 ΕΡ 1 109 892/ΡΤ e 4, respectivamente. A densidade celular total não se alterou de forma considerável nestas condições de cultura. EXEMPLO 6

Efeito de suplementos do meio de cultura na libertação de partículas de vector de rAAV para o meio de cultura de células

As células JL14 foram crescidas em biorreactores e infectadas com adenovirus, essencialmente como descrito no Exemplo 2. As células foram transferidas para biorreactores contendo vários meios, como se segue: (1) DMEM; (2) DMEM + 4 g/litro glucose; (3) DMEM + 4 g/litro glucose + 4 mM glutamina; (4) DMEM + 4 g/litro glucose + 4 mM glutamina + aminoácidos + vitaminas ("completo"); (5) 2X DMEM. Todas as osmolalidades de partida foram ajustadas para 285-300 mOsm. Outros parâmetros eram como se segue: temperatura mantida a 39°C; pH mantido a 8,0; DO2 = 30%; e agitação = 150 rpm. Três dias após a infecção, o sobrenadante da cultura de células foi testado quanto a partículas de vector de rAAV.

Os resultados são apresentados nas Figuras 10, 11, e 12. A Figura 10 é um gráfico de barras que mostra as DRP totais no meio de cultura, três dias após a infecção, em culturas crescidas nos vários meios indicados. A Figura 11 é um gráfico de barras que mostra as UR no meio de cultura, três dias após a infecção, em culturas crescidas nos vários meios indicados. A Figura 12 é um gráfico de barras que mostra a razão P/I das partículas virais no meio de cultura de células, quando as culturas foram crescidas nos vários meios indicados.

Embora a invenção tenha sido descrita com algum detalhe a título ilustrativo e de exemplos para melhor compreensão, será evidente para o perito na especialidade que serão efectuadas algumas alterações e modificações. Deste modo, a descrição e exemplos não deverão ser entendidos como limitativos do âmbito da invenção, que é delineada pelas reivindicações anexas.

Lisboa, 2009-02-09

Claims (28)

1. ΕΡ 1 109 892/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir uma população de partículas virais, compreendendo os passos de: (a) incubar uma célula produtora num meio de cultura de células, sob condições que compreendem uma condição que promove a libertação de partículas de vírus, em que as partículas de vírus são libertadas pela célula produtora para o meio de cultura sem lisar as células, em que a condição que promove a libertação de partículas de vírus: (i) compreende uma ou mais condições seleccionadas de entre osmolalidade, temperatura, concentração de um determinado ião, densidade celular, concentração de oxigénio dissolvido, concentração de glucose, concentração de aminoácidos e uma condição que promova a sincronização do ciclo celular; e (ii) compreende pH; e (b) recolher as partículas virais a partir do meio de cultura de células sem lisar as células, obtendo-se assim uma população de partículas virais; em que o vírus é um vírus adeno-associado (AAV).
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus é um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) e em que a célula produtora compreende: (i) um ou mais genes de empacotamento de AAV, em que cada um dos referidos genes de empacotamento de AAV codifica para uma proteína de replicação ou encapsidação de AAV; (ii) um vector de AAV recombinante (rAAV) que compreende um polinucleótido heterólogo que não de AAV flanqueado por pelo menos uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV; e (iii) função de vírus auxiliar para AAV.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a condição que promove a libertação de partículas de vírus é uma combinação de osmolalidade e pH, temperatura e pH ou osmolalidade, temperatura e pH. ΕΡ 1 109 892/ΡΤ 2/4
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a condição que promove a libertação das partículas de vírus é uma combinação de osmolalidade e pH.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a condição que promove a libertação de partículas de vírus é uma combinação de temperatura e pH.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a condição que promove a libertação de partículas de vírus é uma combinação de osmolalidade, temperatura e pH.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, em que o pH é 7,4 a 8,0.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o pH é 8,0 .
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 18, em que o pH inicial do meio de cultura é 8,00.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o pH do meio de cultura é monitorado durante a cultura e mantido a 8,00.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 e 6 a 10, em que a osmolalidade do meio de cultura é monitorada durante a cultura e mantida de 200 mOsm a 400 mOsm.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a osmolalidade do meio de cultura de células é de 300 mOsm.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a osmolalidade inicial da cultura de células é de 300 mOsm.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que a osmolalidade do meio de cultura de células é ajustada utilizando NaCl ou outro sal, manitol ou glucose.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a osmolalidade do meio de cultura de células é ajustada utilizando NaCl. ΕΡ 1 109 892/ΡΤ 3/4
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 5 a 15, em que a temperatura é de 37°C a 40 °C.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a temperatura é de 39°C.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 17, em que as células produtoras são cultivadas durante 48 a 96 horas após introdução da função de vírus auxiliar.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 18, em que a função de vírus auxiliar é proporcionada por vírus auxiliares.
20. 20. Método para produzir uma população de partículas de rAAV de acordo com a reivindicação 19, em que o referido vírus auxiliar é um adenovírus.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 20, que compreende ainda os passo de: (c) cromatografar o meio de cultura de células produtoras de AAV em pelo menos uma resina de troca aniónica carregada positivamente; e (d) purificar as fracções cromatográficas contendo partículas de rAAV do passo (c) por cromatograf ia de troca catiónica, ou filtração em fluxo tangencial, para produzir uma população purificada de partículas de vector de rAAV.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o passo (d) é cromatografia de troca catiónica.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o passo (d) é filtração em fluxo tangencial.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 20, compreendendo ainda os passos de: (c) cromatografar o meio de cultura de células produtoras de AAV numa resina de troca catiónica; ΕΡ 1 109 892/ΡΤ 4/4 (d) purificar as fracções cromatográficas que contêm partículas de rAAV do passo (c) por cromatograf ia de troca aniónica; e (e) purificar as fracções cromatográficas que contêm partículas de rAAV do passo (d) por cromatograf ia em sulfato de heparina, para produzir uma população purificada de partículas de vector de rAAV.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 20, que compreende ainda os passos de cromatografar o meio de cultura de células produtoras de AAV em várias resinas de troca iónica, compreendendo pelo menos uma resina de troca aniónica carregada positivamente e pelo menos uma resina de troca catiónica carregada negativamente, para produzir uma população purificada de partículas de vector de rAAV.
26. 26. Método para produzir uma população de partículas de rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 25, em que o referido vector de rAAV compreende um polinucleótido heterólogo que não de AAV flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITR) de AAV, e/ou em que a referida célula produtora de AAV compreende pelo menos um gene de empacotamento de AAV que é integrado de forma estável no genoma da referida célula produtora de AAV e/ou em que a referida célula produtora de AAV compreende um gene rep de AAV e um gene cap de AAV.
27. 27. Método para produzir uma população de partículas de rAAV de acordo com a reivindicação 26, em que os referidos gene rep de AAV e gene cap de AAV são integrados de forma estável no genoma da referida célula produtora de AAV.
28. 28. Método para produzir uma população de partículas de rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 27, em que a célula produtora é uma linha de células de mamífero dependente de fixação ou uma linha de células de mamífero adaptada a suspensão. Lisboa, 2009-02-09