ES2557997T3 - Métodos para generar preparados de vectores AAV de título elevado sin virus auxiliar - Google Patents

Abstract

Un método de generación de una población de partículas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) que comprende las etapas de: (a) incubar la célula productora de AAV en condiciones que sean permisivas para la replicación de AAV, donde dicha célula productora de AAV comprende: (i) uno o más genes de empaquetamiento de AAV, en el que cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV; (ii) un provector de AAV recombinante (rAAV) que comprende un polinucleótido no de AAV heterólogo flanqueado por al menos una repetición terminal invertida (ITR) de AAV; y (iii) un virus auxiliar de AAV; (b) lisar la célula productora después de la incubación de la etapa a) para producir un lisado de célula productora de AAV; (c) Cromatografiar el lisado de células productoras de AAV de la etapa b) mediante varias cromatografías de intercambio de iones que comprenden al menos una cromatografía positivamente cargada de intercambio de aniones y al menos una cromatografía negativamente cargada de intercambio de cationes, o cromatografiar el lisado de células productoras de AAV de la etapa b) por cromatografía de intercambio de aniones seguida de filtración de flujo tangencial para generar una población purificada de partículas de vector de rAAV.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para generar preparados de vectores AAV de tttulo elevado sin virus auxiliar Campo de la invencion

La presente invencion se refiere generalmente al campo de los vectores de virus adenoasociados (AAV) y sus preparados que se pueden utilizar para transferencia de genes. Mas espedficamente, se refiere a metodos para generar preparados de tftulo elevado de vectores de AAV recombinantes que estan sustancialmente exentos de virus auxiliar (p.ej., adenovirus) asf como de protemas celulares.

Antecedentes

Los virus adenoasociados (AAV) tienen caractensticas unicas que los hacen atractivos como vectores para terapia genica. Los virus adenoasociados infectan un amplio rango de tipos de celulas. Sin embargo, no son transformantes y no estan implicados en la etiologfa de ninguna enfermedad humana. La introduccion de ADN a celulas huespedes receptoras conduce generalmente a la persistencia y expresion a largo plazo del ADN sin interferir el metabolismo normal de la celula.

Existen al menos tres caractensticas deseables de un preparado de vector AAV recombinante para el uso en transferencia genetica, especialmente en terapia genica humana. Primero, es preferible que el vector se genere a tftulos suficientemente altos para transducir una proporcion efectiva de celulas del tejido diana. La terapia genica in vivo requiere tfpicamente un elevado numero de partmulas vectores. Por ejemplo, algunos tratamientos pueden requerir mas de 108 partmulas, y el tratamiento de la fibrosis qmstica por administracion directa por via aerea puede requerir mas de 1010 partmulas. Segundo, es preferible que los preparados vectores esten esencialmente exentos de AAV componente para la replicacion (es decir, AAV fenotfpicamente de tipo natural que se puede replicar en presencia del virus auxiliar o de funciones del virus auxiliar). Tercero, es preferible que la preparacion de vector de rAAV en conjunto este esencialmente libre de otros virus (tales como los virus auxiliares utilizados para la produccion de AAV), asf como de virus auxiliar y protemas celulares, y otros componentes tales como lfpidos y carbohidratos, para minimizar o eliminar cualquier riesgo de generar una respuesta inmune en el contexto de la terapia genica. Este ultimo punto es especialmente significativo en el contexto de los AAV, porque el AAV es un virus “dependiente de auxiliar” que requiere coinfeccion con un virus auxiliar (tfpicamente adenovirus) u otra provision de funciones del virus auxiliar para ser replicado y empaquetado efectivamente durante el proceso de la produccion de AAV; y, ademas, se ha observado que el adenovirus genera en el huesped una respuesta inmunitaria en el contexto de las aplicaciones de terapia genica (ver, p.ej., Byrnes et al., Neuroscience 66:l0l5, 1995; McCoy et al., Human Gene Therapy 6:1553, 1995; y Barr et al., Gene Therapy 2:151, 1995). Los metodos de la presente invencion tratan estas y otras caractensticas deseables de las preparaciones de vectores de rAAV, segun se describen y se ilustran en detalle mas abajo.

En otros documentos se dispone de recopilaciones generales de la virologfa y la genetica de los AAV. El lector puede remitirse, entre otros, a Carter, “Handbook of Parvoviruses”, Vol. I, pp. 169-228 (1989), y Berns, “Virology”, pp.1743-1764, Raven Press, (1990). Lo que sigue es una breve sinopsis para comodidad del lector. El AAV es un virus defectivo para la replicacion, lo que significa que depende de un virus auxiliar para completar su ciclo de replicacion y empaquetamiento en una celula huesped. El genoma del AAV comprende generalmente los genes de empaquetamiento rep y cap, siendo otras funciones necesarias aportadas en trans por el virus auxiliar y la celula huesped.

Las partmulas de AAV estan formadas por una capside proteica que tiene tres protemas de capside, VP1, VP2 y VP3, que encierran un genoma de ADN lineal de hebra simple de ~4,6 kb. Las partmulas individuales empaquetan solo una hebra de molecula de ADN, pero puede ser la hebra plus o la minus. Las partmulas que contienen cualquiera de las hebras son infecciosas, y la replicacion ocurre por conversion de la hebra simple infecciosa parental a la forma duplex, y subsecuente amplificacion, de la que se desplazan hebras simples de progenie y se empaquetan en capsides. Las copias de hebra doble o simple de genomas de AAV (a veces denominadas “ADN proviral” o “provirus”) pueden ser insertadas en plasmidos o fagemidos bacterianos, y transfectadas a celulas infectadas por adenovirus.

A modo de ilustracion, el genoma lineal del serotipo AAV2 esta terminado en cada extremo por una secuencia de repeticion terminal invertida (ITR). Entre las ITRs hay tres promotores de transcripcion p5, p19 y p40 que se usan para expresar los genes rep y cap (Laughlin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5567-5571). Las secuencias ITR se requieren en cis y son suficientes para aportar un origen funcional de replicacion, integracion en el genoma celular, y excision y rescate eficiente de los cromosomas o plasmidos recombinantes de la celula huesped. Los productos de los genes rep y cap aportan funciones para la replicacion y la encapsidacion de genoma viral, respectivamente, y es suficiente que esten presentes en trans.

El gen rep se expresa desde dos promotores, p5 y p19, y produce cuatro protemas designadas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. Solo Rep78 y Rep68 se requieren para la replicacion del ADN de doble hebra de AAV, pero Rep52

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y Rep40 parecen ser necesarias para la acumulacion del ADN de hebra simple de progenie (Chejanovsky et al., Virology 173:120, 1989). Rep68 y Rep78 se enlazan espedficamente a la conformacion de horquilla de la ITR del AAV y poseen varias actividades enzimaticas requeridas para resolver la replicacion en los extremos del AAV. Rep78 y Rep68 exhiben tambien actividades reguladoras pleiotropicas que incluyen regulacion positiva y negativa de genes de AAV y expresion desde algunos promotores heterologos, asf como efectos inhibidores sobre el crecimiento celular. El gen cap codifica las protemas de capside VP1, VP2 y VP3. Estas protemas comparten una secuencia superpuesta comun, pero VP1 y VP2 contienen secuencias terminales amino adicionales transcritas desde el promotor p40 mediante el uso de codones de iniciacion alternativos. Las tres protemas son necesarias para la produccion eficaz de la capside.

Se han introducido genomas de AAV en plasmidos bacterianos mediante procedimientos tales como cola de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081), adicion de conectores sinteticos que contienen sitios de corte de endonucleasa de restriccion (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) o por union directa de extremos romos (Senepathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). La transfeccion de tales plasmidos recombinantes de AAV en celulas de mairnfero con un virus auxiliar apropiado tiene como resultado el rescate y la excision del genoma del AAV exento de cualquier secuencia de plasmido, la replicacion del genoma rescatado y la generacion de una progenie de partmulas de AAV infecciosas.

Se pueden reconstruir vectores de AAV recombinante que comprenden un polinucleotido heterologo de interes terapeutico mediante la sustitucion de porciones de la secuencia codificante de AAV en plasmidos bacterianos por el polinucleotido heterologo. Los principios generales de la construccion de vectores de rAAV tambien estan disponibles en otros documentos. Ver, p.ej., Carter, 1992, Current Opinions en Biotechnology, 3:533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129). Generalmente las ITRs de AAV se retienen, ya que el empaquetamiento del vector requiere que esten presentes en cis. Sin embargo, otros elementos del genoma de AAV, en particular, uno o mas de los genes de empaquetamiento, pueden omitirse. El plasmido vector puede empaquetarse en una partmula AAV aportando los genes de empaquetamiento omitidos en trans a traves de una fuente alternativa.

En una estrategia, la secuencia flanqueada por ITRs de AAV (la secuencia del vector rAAV), y los genes de empaquetamiento de AAV que se deben aportar en trans, se introducen en la celula huesped en plasmidos bacterianos separados. Se describen ejemplos de esta estrategia en Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072(1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466(1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251(1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963(1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349(1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828) han descrito un plasmido de empaquetamiento llamado pAAV/Ad, que consiste en las regiones codificante de Rep y Cap entre ITRs procedentes de adenovirus. Se han transducido celulas epiteliales humanas de la via aerea de un paciente con fibrosis qrnstica con un vector de AAV preparado utilizando el plasmido de empaquetamiento pAAV/Ad y un plasmido que comprende el gen marcador selectivo neo expresado a traves del promotor p5 de AAV (Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349, 1992).

Una segunda estrategia es aportar o bien la secuencia vector, o los genes de empaquetamiento de AAV, en forma de un plasmido episomico en una celula de marnffero utilizada para replicacion del aAv. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. 5,173,414 describe una lmea celular en la que la secuencia vector esta presente como un plasmido episomico con alto numero de copias. Las lmeas celulares se pueden transducir con las funciones de AAV trans- complementarias rep y cap para generar preparaciones de vector AAV. Esta estrategia no es ideal, porque el numero de copias por celula no se puede controlar rigurosamente y el ADN episomico tiene mucha mas tendencia a sufrir reordenacion, lo que lleva a la produccion de productos secundarios de vector.

Una tercera estrategia es aportar o bien la secuencia vector, o los genes de empaquetamiento de AAV, o ambos, integrados de forma estable en el genoma de la celula de mai^ero utilizada para la replicacion.

El documento WO 97/09441 publica vectores AAV para terapia genica. Tamayose et al., Human Gene Therapy, 7:507:513 (1996) publican una estrategia para preparacion a gran escala de vectores AAV recombinantes de tftulo elevado mediante la utilizacion de lmeas celulares de empaquetamiento y cromatograffa de columna de celulosa sulfonatada. El documento WO 97/06243 publica la purificacion cromatografica de adenovirus y AAV.

Una tecnica ejemplar se resume en la solicitud de patente internacional WO 95/13365 (Targeted Genetics Corporation y Johns Hopkins University) y en la correspondiente Patente de los EE.UU. 5,658,776 (de Flotte et al.). Este ejemplo utiliza una celula de marnffero con al menos una copia intacta de un vector rAAV establemente integrado, comprendiendo el vector una ITR de AAV y un promotor de la transcripcion ligado operativamente a un polinucleotido diana, pero en la que la expresion de rep es limitante. En una realizacion preferida, se introduce en la celula un plasmido de empaquetamiento de AAV que comprende el gen rep ligado operativamente a un AAV heterologo, y luego la celula es incubada en condiciones que permiten la replicacion y el empaquetamiento de la secuencia vector de AAV en partmulas.

Una segunda tecnica ejemplar se resume en la solicitud de patente WO 95/13392 (Trempe y col.) . Este ejemplo utiliza una lmea celular estable de marnffero con un gen rep de AAV ligado operativamente a un promotor heterologo

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para poder expresar protema Rep funcional. En diversas realizaciones preferidas, el gen cap de AAV se puede proporcionar establemente tambien o puede introducirse transitoriamente (p.ej., en un plasmido). Tambien se puede introducir un vector de AAV recombinante estable o transitoriamente.

Otra tecnica ejemplar se resume en la solicitud de patente WO 96/17947 (de Targeted Genetics Corporation, J. Allen). Este ejemplo utiliza celula de mairnfero que comprende un gen cap de AAV establemente integrado, y un gen rep de AAV establemente integrado ligados operativamente a un promotor heterologo e inducibles mediante un virus auxiliar. En varias realizaciones preferidas, un plasmido que comprende la secuencia vector es introducida tambien en las celulas (ya sea de forma estable o transitoria). El rescate de partmulas vector AAV se inicia entonces mediante la introduccion del virus auxiliar.

Estos ejemplos diversos abordan el problema de aportar AAV con un tftulo suficientemente alto, minimizando la recombinacion entre vector y componentes de empaquetamiento, y reduciendo o evitando las dificultades potenciales asociadas con la expresion del gen rep AAV en la lmea celular de mamffero (ya que las protemas Rep pueden no solo limitar su propia expresion, sino que pueden afectar tambien el metabolismo celular). Sin embargo, el empaquetamiento de un vector AAV en partmulas virales sigue dependiendo de la presencia de un virus auxiliar apropiado para el AAV o de la provision de funciones de virus auxiliar. Ejemplos de virus auxiliares capaces de apoyar la replicacion del AAV son los adenovirus, pero incluyen otros virus como virus del herpes y poxviridae. La presencia de cantidades significativas de virus auxiliar infeccioso en un preparado de vectores AAV es problematica porque la preparacion esta destinada para ser administrada a seres humanos. Incluso la presencia de componentes no replicantes de virus auxiliares puede causar en el sujeto tratado una reaccion inmunologica inaceptable.

Los problemas potenciales provocados por el antfgeno del virus auxiliar han sido ilustrados en varios estudios recientes. Bymes et al. (Neuroscience 66:1015,1995) inyectaron un adenovirus humano tipo 5 con delecion en la region E1, no replicante, en cerebros de ratas endocriadas. Se observo una respuesta inflamatoria que se atribuyo a las partmulas administradas mas que a la expresion de protemas virales nuevas debidas a la infeccion viral de las celulas. La presencia del virus se asocio con un aumento en la expresion de CMH de clase I y una fuerte infiltracion de macrofagos y celulas T. McCoy et al. (Human Gene Therapy 6:1553,1995) instilaron los pulmones de ratones con adenovirus intacto, adenovirus con genomas incompletos, o adenovirus inactivados con luz ultravioleta. Todos produjeron inflamacion pulmonar, y el numero de celulas inflamatorias en el tejido pulmonar fue similar cuantitativamente para las tres formas del virus. Experimentos comparativos que utilizaron constructos de adenovirus en ratones normales e inmunodeficientes realizados por Barr et al. (Gene Therapy 2:151, 1995) indican que la respuesta inmune anti-adenovirus esta mediada primariamente por linfocitos T y da lugar a una respuesta de memoria que afecta a las dosis subsecuentes.

En consecuencia, en el desarrollo de vectores AAV recombinantes tales como los que se usan en terapia genica, son necesarias estrategias que minimicen la cantidad de virus auxiliar, asf como protemas de virus auxiliar y protemas celulares, presentes en el preparado final, alcanzando al mismo tiempo un tftulo mas elevado de AAV de forma que los metodos se puedan emplear efectivamente en una escala que sea adecuada para la aplicacion practica de tecnicas de terapia genica.

Puesto que los tftulos elevados de los preparados de vector rAAV son particularmente utiles, pero la produccion de tftulos mayores de rAAV, particularmente en procedimientos a gran escala, puede llevar a la generacion de cantidades significativas de virus auxiliar (p.ej., adenovirus o “Ad”), protemas de virus auxiliar (p.ej., protemas Ad) y/o protemas celulares contaminantes, se ha hecho especialmente importante disenar metodos escalables para la produccion de rAAV que se puedan utilizar para la generacion de preparaciones de tftulo elevado que esten sustancialmente exentas de virus y/o protemas virales o celulares contaminantes. La presente publicacion proporciona metodos para conseguir estos objetivos contrapuestos y demuestra que tales tecnicas se pueden emplear para la produccion a gran escala de preparados de vector AAV recombinante.

Resumen de la invencion

Se describen aqrn metodos y materiales para la generacion de preparados de tftulo elevado de virus adenoasociados (AAV) que estan sustancialmente exentos de virus auxiliar, protemas de virus auxiliar y protemas celulares y otros componentes.

La invencion proporciona un metodo para generar una poblacion de partmulas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV), que comprende las etapas de:

a) incubar una celula productora de AAV bajo condiciones permisivas para la replicacion de AAV, donde la celula productora de AAV comprende:

(i) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, donde dicho gen de empaquetamiento de AAV codifica una protema de replicacion o de encapsidacion de AAV;

(ii) un pro-vector de AAV recombinante (rAAV) que comprende un polinucleotido heterologo no-AAV flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR); y

(iii) un virus auxiliar para AAV;

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b) lisar la celda productora tras la incubacion de la etapa a) para producir un lisado de celulas productoras de AAV;

c) cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa b) mediante varias cromatograffas de intercambio de iones que comprenden al menos una cromatograffa con carga positiva de intercambio de aniones y al menos una cromatograffa con carga negativa de intercambio de cationes, o cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa b) mediante cromatograffa de intercambio de aniones seguida de filtracion de flujo tangencial para generar una poblacion purificada de partmulas de vector rAAV.

La invencion tambien proporciona un metodo para generar una poblacion de partmulas rAAV segun se describe arriba, donde dicho virus auxiliar es un adenovirus o un virus auxiliar termosensible, y dicha etapa de incubacion de la celula productora se efectua a una temperatura permisiva para la replicacion del AAV, pero no permisiva para la replicacion del virus auxiliar termosensible.

En este documento tambien se describe lo siguiente:

Un metodo para generar una poblacion de partmulas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV), que comprende las etapas de: a) proporcionar una celula productora de AAV que comprende: (i) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, donde cada uno de dichos genes empaquetadores de AAV codifica una protema de replicacion o encapsidacion de AAV; (ii) un pro-vector de aAv recombinante (rAAV) que comprende un polinucleotido no-AAV heterologo flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR) de AAV; y (iii) un virus auxiliar para AAV; b) incubar la celula productora proporcionada en la etapa a) bajo condiciones que son permisivas para la replicacion de AAV; c) lisar la celula productora tras la incubacion de la etapa b) para producir un lisado de celulas productoras de AAV; y d) cromatografiar el lisado de celula productora de AAV de la etapa c) en varias resinas intercambiadoras de iones que comprenden al menos una resina de intercambio de aniones cargada positivamente y al menos una resina de intercambio de cationes cargada negativamente para generar una poblacion purificada de partmulas de vector de rAAV, o cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa c) en una resina de intercambio de aniones seguida de filtracion de flujo tangencial (TFF).

Un metodo para generar una poblacion de partmulas de rAAV, en el que la incubacion de la celula productora se efectua en un recipiente seleccionado de un grupo consistente en matraz de cultivo tisular, botella roller, matraz spinner, tanque de reaccion, fermentador, y biorreactor, utilizando opcionalmente un microportador, y preferiblemente utilizando una lmea celular de mamffero adaptada a suspension.

Un metodo para generar una poblacion de partmulas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV), que comprende la etapas de: a) proporcionar una celula productora de AAV que comprende: (i) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, donde cada uno de dichos genes empaquetadores de AAV codifica una protema de replicacion o encapsidacion de AAV; (ii) un pro-vector AAV recombinante (rAAV) que comprende un polinucleotido no-AAV heterologo flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR) de AAV; y (iii) un virus auxiliar para AAV o una secuencia de polinucleotido de dicho virus auxiliador que codifica al menos una funcion del virus auxiliador; b) someter la celula productora proporcionada en la etapa a) a un estres sub-letal; y c) incubar la celula productora estresada del paso b) bajo condiciones que son permisivas para la replicacion de aAv. Formas posibles de estres sub-letal se pueden seleccionar sin limitarse a las del grupo que consiste en estres nutricional, estres osmotico, estres de pH, estres de temperatura, estres aerobico, estres mecanico, estres de radiacion y estres toxico. Un ejemplo no limitante por el que se impone estres nutricional es cultivando las celulas productoras en un medio que es deficiente en uno o mas aminoacidos. Mas abajo se aportan otros ejemplos.

Un metodo para generar una poblacion de partmulas de rAAV, en el que dicha poblacion purificada de partmulas vector de rAAV esta sustancialmente libre de AAV competente para la replicacion y de virus auxiliar y de protemas celulares.

Un metodo para generar una poblacion de partmulas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV), que comprende la etapas de: a) proporcionar una celula productora de AAV que comprende: (i) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, donde cada uno de dichos genes empaquetadores de AAV codifica una protema de replicacion o encapsidacion de AAV; (ii) un pro-vector AAV recombinante (rAAV) que comprende un polinucleotido no-AAV heterologo flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR) de AAV; y (iii) un virus auxiliar para AAV; b) incubar la celula productora proporcionada en la etapa a) bajo condiciones permisivas para la replicacion del AAV y que comprenden inducir un estres sub-letal en la celula productora de AAV; c) lisar la celula productora tras la incubacion de la etapa b) para producir un lisado de celula productora de AAV; y d) purificar el lisado de celula productora de AAV para generar una poblacion de partmulas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV). Metodos apropiados de purificacion incluyen los descritos en otras partes de esta publicacion. Un procedimiento ejemplar de purificacion comprende cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa c) en al menos una resina cromatografica seleccionada del grupo que consiste en una resina de intercambio de aniones cargada positivamente y una resina de intercambio de cationes cargada negativamente para generar una poblacion purificada de partmulas de vector rAAV (metodos preferidos incluyen intercambio anionico seguido de intercambio cationico o filtracion de flujo tangencial (TFF)). Procedimientos cromatograficos ilustrativos, que incluyen la cromatograffa de intercambio de iones, y la purificacion cromatografica sobre sulfato de heparina se

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proporcionan se proporcionan mas abajo a modo de ejemplo.

Una celula huesped para producir partmulas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) con alta eficiencia, que comprende: a) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, donde cada uno de dichos genes empaquetadores de AAV codifica una protema de replicacion o encapsidacion de AAV; b) un polinucleotido heterologo introducido en dicha celula huesped utilizando un pro-vector rAAV, en el que el pro-vector de rAAV comprende el polinucleotido heterologo flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR) de AAV y es deficiente en dicho(s) gen(es) de empaquetamiento de AAV; c) un virus auxiliar tal como un virus auxiliar termosensible (tsHV) para AAV, en el que dicho tsHV es termosonsible para la auto replicacion.

Una poblacion de partmulas de rAAV, producida de acuerdo con el metodo de produccion de esta invencion. Preferiblemente, la poblacion de partmulas contiene no mas de aproximadamente una partmula infecciosa de adenovirus por cada mil partmulas infecciosas de rAAV, preferiblemente menos de una por cada 106 rAAV, aun mas preferiblemente menos de aproximadamente una por cada 109

Tambien se describen en el presente documento tecnicas de analisis de alto rendimiento que se pueden utilizar, por ejemplo, en la valoracion de preparados de virus, asf como en el cribado de agentes que afectan a la replicacion viral.

Las realizaciones de la invencion se resumen en la siguiente descripcion.

Descripcion breve de las figuras

La Figura 1 es una reproduccion a medio tono de un analisis Southern para la produccion de vector rAAV, utilizando una sonda para un modelo de gen terapeutico de la CF contenido en el vector. La banda prominente a 1.4 kb indica la presencia de rAAV en la preparacion. La funcion de auxilio fue proporcionada por adenovirus subtipo 5 (Ad5) o por la cepa de adenovirus termosensible ts149.

La Figura 2 es una reproduccion a medio tono de un analisis slot blot de la produccion de vector rAAV, para cuantificar el nivel de rAAV presente en cada preparacion. Cuando la funcion auxiliar la proporciona el ts149, la cantidad de rAAV producida en condiciones normales de cultivo es varias unidades logantmicas inferior a la producida en presencia de Ad5.

La Figura 3 es una reproduccion a medio tono de un analisis de hibridacion Southern de rAAV, que indica que el aumento de nivel de ts149 no mejora el nivel de produccion de rAAV.

La Figura 4 es una grafica de barras que indica un aumento drastico de la cantidad de rAAV producido en presencia de ts149 (barras oscuras) si los periodos de cultivo se extienden mas alla de los 5 dfas. Esto contrasta fuertemente con el descenso sustancial en rAAV que ocurre mas alla del dfa 5 cuando se utilizan adenovirus no termosensibles para proporcionar la funcion auxiliar (barras claras).

La Figura 5 es una grafica lineal que muestra la densidad de celulas viables (VCD) de celulas HeLa S3 cultivadas en cultivo de suspension a 37 °C (drculos) o 32 °C (cuadrados).

La Figura 6 es una grafica lineal que muestra el efecto de la filtracion de flujo tangencial a dos velocidades diferentes sobre celulas HeLa S3 cultivadas en cultivo de suspension.

La Figura 7 es una grafica de barras que muestra la produccion de ts149 detectada en celulas HeLa S3 infectadas cultivadas durante 3-7 dfas en suspension a la temperatura permisiva de 32 °C, en comparacion con el nivel detectado el dfa 7 tras microfluidificacion (MF).

La figura 8 es una grafica de combinacion que muestra la purificacion de ts149 por cromatograffa de intercambio de aniones en matriz PI, eluida con un gradiente lineal de 900-1300 meq de NaCl a pH 8,0.

La figura 9 es una grafica de combinacion que muestra la purificacion de adenovirus en matriz PI de intercambio de aniones, eluida con un gradiente de 800-1300 meq de NaCl a pH 8,0. Barras: actividad viral medida en un analisis de infectividad; lmea continua: A280 (una medida de la protema total); lmea de puntos: conductividad del tampon (mS).

La Figura 10 es una grafica de combinacion que muestra la separacion de Adenovirus y AAV recombinante. El panel superior muestra la separacion en matriz PI de intercambio de aniones, eluida con un gradiente 0-1000 meq de NaCl a pH 8,0. El panel inferior muestra la separacion subsiguiente de Adenovirus de contaminantes en matriz HS de intercambio de cationes, eluida con un gradiente 0-500 meq de NaCl a pH 8,0.

La figura 11 son dos graficas de barras, que muestran el efecto del nivel de suero fetal bovino (FBS) en el medio de cultivo sobre la produccion de rAAV. La deficiencia de suero en el medio de cultivo es uno de una serie de factores de estres a los que se pueden someter las celulas productoras para mejorar la produccion de partmulas virales.

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La Figura 12 es una reproduccion a medio tono de un analisis de gel de SDS-poliacrilamida para protemas AAV durante los pasos de la purificacion. El preparado de AAV se sometio a filtracion de flujo tangencial tras cromatograffa en una columna de intercambio de aniones (POROS 50 PI). El gel tenido de plata muestra las protemas de capside de AAV altamente purificadas, VP1, VP2 y VP3 en el material bruto final.

La figura 13 es un cromatograma que muestra la concentracion de AAV en una columna de sulfato de heparina. El pico estrecho de absorbancia a 280 nm (eje de la izquierda) a un tiempo de elucion de unos 18 minutos representa la fraccion de AAV (tras intercambio de aniones y filtracion de flujo tangencial) eluida del sulfato de heparina con un gradiente lineal de 0 a 1M NaCl (la conductividad en mS se muestra en el eje derecho).

Descripcion detallada

En el presente documento se describen metodos y materiales para generar preparados de virus adenoasociados (AAV) de alto tftulo que estan sustancialmente exentos de virus auxiliar, protemas de virus auxiliares y protemas celulares y otros componentes.

Diversos metodos para la generacion y el procesado de partmulas de AAV en celulas de mairnfero se describen mas abajo en detalle, y se proporcionan ilustraciones del uso de tales tecnicas en los Ejemplos que siguen.

A modo de introduccion, es tfpico emplear una celula huesped o “productora” para la replicacion y el empaquetado de vector de rAAV. Tal celula productora (habitualmente una celula huesped de mamffero) comprende generalmente o esta modificada para comprender varios tipos diferentes de componentes para la produccion de rAAV. El primer componente es el genoma de un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) (o pro-vector “rAAV”) que puede ser replicado y empaquetado en particular vector por la celula de empaquetamiento huesped. El pro-vector rAAV comprendera normalmente un pronucleotido heterologo (o “transgen”), con el que es deseable alterar geneticamente otra celula en un contexto de terapia genica (puesto que el empaquetado de tal transgen en partmula de vector de rAAV puede ser utilizado efectivamente para transferir el transgen a una variedad de celulas de mamffero). El transgen esta flanqueado generalmente por dos repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV que comprenden secuencias que son reconocidas durante la excision, replicacion y empaquetamiento del vector AAV, asf como durante la integracion del vector en el genoma de una celula huesped. Un segundo componente es un virus auxiliar que puede aportar funciones auxiliares para la replicacion del AAV. Aunque se emplea habitualmente adenovirus, tambien se pueden utilizar otros virus auxiliares, segun se conoce en el estado de la tecnica. Alternativamente, las funciones del virus auxiliar requeridas se pueden aislar geneticamente de un virus auxiliar y los genes que las codifican se pueden utilizar para aportar funciones de virus auxiliar en trans. Los elementos del vector AAV y el virus auxiliar (o las funciones del virus auxiliar) se pueden introducir en la celula huesped ya sea simultaneamente o secuencialmente en cualquier orden. Los componentes finales para la produccion de AAV que se deben proporcionar en la celula productora son “genes de empaquetamiento AAV” tales como los genes de AAV cap y rep que proporcionan protemas de replicacion y de encapsidacion, respectivamente. Varias versiones diferentes de genes de empaquetamiento de AAV se pueden proporcionar (incluyendo casetes de rep-cap naturales asf como casetes modificadas rep y/o cap en las que los genes rep y/o cap se pueden dejar bajo el control de los promotores nativos o ligados operativamente a promotores heterologos. Tales genes de empaquetamiento de AAV se pueden introducir ya sea de forma transitoria o estable en la celula de empaquetamiento huesped, segun se conoce en el estado de la tecnica y se describe en mas detalle mas abajo.

Despues de cultivar las celulas huespedes en condiciones que permiten la replicacion y encapsidacion del AAV, las celulas y las fracciones sub-celulares se pueden procesar para generar preparados de virus adenoasociado (AAV) de titulacion elevada que estan sustancialmente exentos de virus auxiliar, protemas de virus auxiliar y protemas celulares. Mas abajo se aportan descripciones detalladas de tecnicas de procesado y protocolos ilustrativos que emplean tales tecnicas.

Definiciones

Un “vector”, segun se utiliza en el presente documento, se refiere a una macromolecula o asociacion de macromoleculas que comprende o se asocia con un polinucleotido y que se puede utilizar para mediar la introduccion del polinucleotido en una celula. Vectores ilustrativos incluyen, por ejemplo, plasmidos, vectores vmcos, liposomas y otros vehmulos de introduccion de genes.

“AAV” es una abreviacion de virus adenoasociado, y se puede utilizar para referirse al propio virus o a sus derivados. El termino cubre todos los subtipos y tanto formas que se dan naturalmente como recombinantes, excepto cuando se requiere de otro modo. La abreviacion “rAAV” se refiere a virus adenoasociado recombinante, tambien denominado vector recombinante AAV (o “vector rAAV”).

Un “vector rAAV” segun se utiliza en el presente documento se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia de polinucleotido de interes para la transformacion genetica de una celula. En constructos de vectores segun se describen en el presente documento, el polinucleotido heterologo esta flanqueado por el menos una,

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preferiblemente dos secuencias de repeticion terminal invertida (ITRs) de AAV. El termino vector rAAV abarca tanto partmulas de vector rAAV como plasmidos de vector rAAV.

Un “virus AAV” o “partmula viral AAV” se refiere a una partmula viral compuesta por al menos una protema de capside AAV (preferiblemente por todas las protemas de capside de un AAV de tipo natural) y un polinucleotido encapsidado. Si la partmula comprende un polinucleotido heterologo (es decir, un polinucleotido que no sea un genoma de tipo natural de AAV tal como un transgenico que se debe introducir en una celula de mairnfero), se denomina tfpicamente “partmula de vector rAAV”, o simplemente “vector rAAV”.

“Empaquetamiento” se refiere a una serie de eventos intracelulares que resultan en el ensamblado y encapsidacion de una partmula AAV.

Los genes de AAV “rev” y “cap” se refieren a secuencias polinucleotfdicas que codifican protemas de replicacion y encapsidacion de virus adenoasociados. Se han encontrado en todos los serotipos de AAV examinados, y se describen mas abajo y en la literatura. rep y cap de AAV se denominan en este documento “genes de empaquetamiento” de aAv.

Un “virus auxiliar” para AAV se refiere a un virus que permite que un AAV (p.ej., AAV de tipo natural) replicado y empaquetado por una celula de mai^ero. Se conocen en el estado de la tecnica una diversidad de tales virus auxiliares para AAV, incluyendo adenovirus, herpesvirus, y poxvirus tales como vaccinia. Los adenovirus abarcan una serie de subgrupos diferentes, aunque el adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el mas comunmente utilizado. Numerosos adenovirus de origen humano, no humano marnffero y aviar se conocen y estan disponibles en depositos tales como el ATCC. Los virus de la familia herpes incluyen, por ejemplo, los virus del herpes Simplex (HSV) y los virus de Epstein-Barr (EBV), asf como citomegalovirus (CMV) y virus pseudorabies (PRV): los cuales tambien estan disponibles en depositos como el ATCC.

El termino “tsHV” se refiere a un virus auxiliar termosensible, que puede proporcionar funciones auxiliares para la replicacion y el empaquetamiento de AAV pero es termosensible con respecto a su propia replicacion (es decir, se puede replicar a una temperatura “permisiva” pero se replica con menor eficiencia, o preferiblemente nada en absoluto, a una temperatura “no permisiva”). La habilidad del tsHV para auxiliar la replicacion del AAV puede ser tambien termosensible, pero los tsHV preferidos para su utilizacion con esta invencion apoyan eficientemente la replicacion de AAV a temperaturas a las que el AAV puede replicarse pero que son no permisivas para la replicacion del tsHV. Mas abajo se describen ejemplos de tales tsHV.

Una partmula viral o virus “infeccioso” es aquel que comprende un componente polinucleotfdico que puede introducir en una celula, por lo cual la especie vmca es trofica. El termino no implica necesariamente ninguna capacidad de replicacion del virus. Los analisis para contar partmula virales infecciosas se describen en otra parte de esta publicacion y en la literatura.

Un virus “competente para la replicacion” (p.ej., un AAV competente para la replicacion, a veces abreviado como “RCA”) se refiere a un virus fenotfpicamente de tipo natural que es infeccioso, y tambien es capaz de ser replicado en una celula infectada (es decir, en presencia de un virus auxiliar o de funciones de virus auxiliar). En el caso de AAV, la competencia para la replicacion requiere generalmente la presencia de genes de empaquetamiento de AAV funcionales. Vectores rAAV preferidos segun se describen en el presente documento son incompetentes para la replicacion en celulas de mamffero (especialmente en celulas humanas) debido a la falta de uno o mas genes de empaquetamiento de AAV. Preferiblemente, tales vectores rAAV carecen de toda secuencia de genes de empaquetamiento de AAV para minimizar la posibilidad de que se generen RCApor recombinacion entre genes de empaquetamiento de AAV y un vector rAAV que llega. Los preparados de vector rAAV preferidos segun se describen en el presente documento son aquellos que contienen pocos o ningun RCA (preferiblemente menos de aproximadamente 1 RCA por cada 102 partmulas de rAAV, aun mas preferiblemente menos de aproximadamente 1 RCA por cada 108 partmulas de rAAV, todavfa mas preferiblemente menos de aproximadamente 1 RCA por cada 1013 partmulas de rAAV, lo mas preferiblemente ninguna RCA).

El termino “polinucleotido” se refiere a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, incluyendo desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, o analogos de estos. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos y analogos de nucleotidos, metilados y puede ser interrumpido por componentes no nucleotfdicos. Si existen, las modificaciones a la estructura del nucleotido se pueden introducir antes o despues del ensamblado del polfmero. El termino polinucleotido, segun se utiliza en el presente documento, se refiere indistintamente a moleculas de hebra simple o doble. A no ser que se especifique o se requiera otra cosa, cualquier aspecto de la publicacion descrita en el presente documento que es un polinucleotido abarca tanto la forma de doble hebra como cada una de las dos formas de hebra simple complementarias conocidas o que se predice construyan la forma de doble hebra.

Un “gen” se refiere a un polinucleotido que contiene al menos un marco de lectura abierto que es capaz de codificar una protema particular despues de ser transcrito y traducido.

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“Recombinante”, segun se aplica a un polinucleotido significa que el polinucleotido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonacion, restriccion o union, y otros procedimientos que tienen como resultado un constructo que es distinto de un polinucleotido encontrado en la naturaleza. Un virus recombinante es una partmula viral que comprende un polinucleotido recombinante. Los terminos incluyen respectivamente replicas del constructo polinucleotidico original y progenie del constructo del virus original.

Un “elemento de control” o “secuencia de control” es una secuencia de nucleotidos implicada en una interaccion de moleculas que contribuye a la regulacion funcional de un polinucleotido, incluyendo replicacion, duplicacion, transcripcion, splicing, traduccion o degradacion del polinucleotido. La regulacion puede afectar a la frecuencia, velocidad o especificidad del proceso, y puede estar potenciada o inhibida en la naturaleza. Elementos de control conocidos en el estado de la tecnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripcion tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una region de ADN que bajo ciertas condiciones es capaz de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripcion de una region codificante usualmente localizada secuencia abajo (en sentido 3') del promotor.

“Ligado operativamente” se refiere a una yuxtaposicion de elementos geneticos, donde los elementos se relacionan de una forma que les permite funcionar del modo esperado. Por ejemplo, un promotor esta ligado operativamente a una region codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripcion de la secuencia codificante. Podna haber residuos que intervienen entre el promotor y la region codificante, mientras esta relacion funcional se mantenga.

Un “vector de expresion” es un vector que comprende una region que codifica un polipeptido de interes, y se usa para efectuar la expresion de la protema en una celula diana. Un vector de expresion tambien comprende elementos de control ligados operativamente a la region codificante para facilitar la expresion de la protema en la diana. La combinacion de elementos de control en un gen o genes a los que estan ligados operativamente para la expresion se denomina a veces una “casete de expresion”, de las cuales un gran numero se conoce y esta disponible en el estado de la tecnica o se puede construir sin problemas a partir de componentes que estan disponibles en el estado de la tecnica.

“Heterologo” significa derivado de una entidad genotfpicamente diferente de la del resto de la entidad con la que se esta comparando. Por ejemplo, un polinucleotido introducido mediante tecnicas de ingeniena genetica en un plasmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleotido heterologo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y ligado operativamente a una secuencia codificante a la que naturalmente no se encuentra ligada es un promotor heterologo.

“Alteracion genetica” se refiere a un proceso en el que un elemento genetico es introducido en una celula de forma diferente a mitosis o meiosis. El elemento puede ser heterologo a la celula, o puede ser una copia adicional o version mejorada de un elemento ya presente en la celula. Una alteracion genetica se puede efectuar, por ejemplo, transfectando una celula con un plasmido recombinante u otro polinucleotido mediante cualquier proceso conocido en el estado de la tecnica, tal como electroporacion, precipitacion de fosfato calcico, o contacto con un complejo liposoma-polinucleotido. Una alteracion genetica tambien se puede efectuar, por ejemplo, por transduccion o infeccion con un virus o vector vmco de ADN o ARN. Preferiblemente, el elemento genetico es introducido en un cromosoma o mini-cromosoma en la celula; pero cualquier alteracion que cambia el fenotipo y/o el genotipo de la celula y de su progenie esta incluido en este termino.

Se dice que una celula esta “establemente” alterada, transducida o transformada con una secuencia genetica si la secuencia esta disponible para realizar su funcion durante el cultivo prolongado de la celula in vitro. En ejemplos preferidos, tal celula esta alterada “heredablemente”, porque se ha introducido una alteracion genetica que ademas puede ser heredada por la progenie de la celula alterada.

Los terminos “polipeptido”, “peptido” y “protema” se utilizan de forma indistinta en esta publicacion para denominar polfmeros de aminoacidos de cualquier longitud. Los terminos tambien abarcan un polfmero de aminoacido que ha sido modificado; por ejemplo, formacion de puente disulfuro, glicosilacion, lipidacion o conjugacion con un componente marcador.

Polipeptidos tales como “CFTR”, “p53”, “E1A” y similares, cuando se mencionan en el contexto de la terapia genica y de sus composiciones, se refieren al polipeptido correspondiente intacto, o cualquier fragmento o derivado suyo sometido a ingeniena genetica, que conserva la funcion bioqmmica deseada de la protema intacta. De manera similar, las referencias a los genes CFTR, p53, E1A, y a otros de tales genes para el uso en terapia genica (tfpicamente denominados “transgenes” a introducir en una celula receptora), incluyen a los polinucleotidos que codifican el polipeptido intacto o cualquier fragmento o derivado sometido a ingeniena genetica que posee la funcion bioqmmica deseada.

Un plasmido, virus u otra sustancia “aislada” se refiere a una preparacion de la sustancia desprovista de al menos algunos de los otros componentes que pueden estar tambien presentes donde la sustancia o una sustancia similar ocurre naturalmente o a partir de donde se prepara inicialmente. Asf, por ejemplo, una sustancia aislada se puede preparar utilizando una tecnica de purificacion para enriquecerla a partir de una mezcla original. El enriquecimiento

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se puede medir de manera absoluta, tal como peso por volumen de solucion, o se puede medir en relacion a una segunda sustancia, potencialmente interferente, presente en la mezcla original. Los enriquecimientos crecientes de los aspectos de esta publicacion son crecientemente mas preferidos. Asf, por ejemplo, un enriquecimiento del doble es preferido, un enriquecimiento de 10 veces mas es mas preferido, un enriquecimiento de 100 veces mas es mas preferido, un enriquecimiento de 1000 veces mas es incluso mas preferido.

Se dice que una preparacion de AAV esta “sustancialmente exenta” de virus auxiliar si la proporcion de partmula infecciosas de AAV respecto a partmula infecciosas de virus auxiliar es de al menos l02:1 aproximadamente; preferiblemente al menos 104:1 aproximadamente; mas preferiblemente al menos 106:1 aproximadamente; aun mas preferiblemente al menos 108:1 aproximadamente. Preferiblemente los preparados estan tambien exentos de cantidades equivalentes de protemas de virus auxiliar (es decir, protemas tal como estanan presentes como resultado de tales niveles de virus auxiliar si las impurezas de partmulas de virus auxiliar mencionadas mas arriba estuvieran presentes en forma disgregada). La contaminacion por protema vmca y/o celular se puede observar generalmente como la presencia de bandas reveladas con Coomassie en geles SDS (p.ej., la aparicion de bandas distintas a las correspondientes a las protemas de capside de AAV VP1, VP2 y VP3).

Cuando se utiliza “eficiencia” para describir la produccion, replicacion o empaquetamiento vmco, se hace referencia a propiedades utiles del metodo: particularmente, la tasa de crecimiento y el numero de partmulas vmicas producidas por cada celula. Produccion de “alta eficiencia” indica produccion de al menos 100 partmulas vmcas por celula; preferiblemente al menos unas 10'000 y mas preferiblemente el menos unas 100'000 partmulas por celula, a lo largo del periodo de cultivo especificado.

Un “individuo” o “sujeto” tratado de acuerdo con esta publicacion hace referencia a vertebrados, particularmente miembros de una especie de mamfferos, e incluye pero no se limita a animales domesticos, animales de deportes y primates, incluyendo humanos.

“Tratamiento” de un individuo o celula es cualquier tipo de intervencion realizada para intentar alterar el curso natural del individuo o de la celula en el momento en el que se inicia el tratamiento. Por ejemplo, se podna iniciar el tratamiento de un individuo para disminuir o limitar la patologfa causada por cualquier condicion patologica, incluyendo (pero no limitandose a ello) una deficiencia genetica heredada o inducida, una infeccion por un organismo vmico, bacteriano o parasftico, una condicion neoplasica o aplasica, o una disfuncion del sistema inmune, tal como autoinmunidad o inmunosupresion. El tratamiento incluye (pero no se limita a ello) la administracion de una composicion, tal como una composicion farmaceutica, y la administracion de celulas compatibles que han sido tratadas con una composicion. El tratamiento puede ser realizado ya sea de manera profilactica o terapeutica; es decir, ya sea previamente o subsecuentemente a la iniciacion de un evento patologico contacto con un agente etiologico.

Tecnicas generales

La practica de la presente invencion empleara, salvo indicacion contraria, tecnicas convencionales de biologfa molecular, virologfa, cultivo de celulas animales, y bioqmmica que se pertenecen al estado de la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda edicion (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos. eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "Current Protocols in Protein Science" (John E Coligan, et al. eds. Wiley and Sons, 1995); y "Protein Purification: Principles and Practice" (Robert K. Scopes, Springer-Verlag, 1994).

Seleccion y preparacion de vectores de aav y genes de empaquetado AAV

Un vector recombinante de AAV descrito en el presente documento comprende un polinucleotido heterologo (es decir, no-AAV) de interes, en lugar de los genes rep y/o cap de AAV que normalmente forman el grueso del genoma de AAV. Como en el genoma del AAV tipo natural, sin embargo, el pro-vector rAAV esta flanqueado preferiblemente por dos repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV segun se menciona mas arriba. Las variaciones en las que un constructo de rAAV esta flanqueado por solo una ITR individual (tfpicamente modificada) tambien se han descrito en el estado de la tecnica y se pueden emplear en conexion con la presente invencion.

Se dispone de virus adenoasociados de cualquier serotipo, puesto que los diversos serotipos estan funcionalmente y estructuralmente relacionados, incluso a nivel genetico (ver, p.ej., Blacklow, pp. 165-174 de “Parvoviruses and Human Disease”, J.R. Pattison, ed. (1988); y Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974). Todos los serotipos AAV exhiben aparentemente propiedades similares de replicacion mediadas por genes homologos rep; y generalmente todos llevan tres protemas de capside relacionadas tales como las expresadas en AAV2. Adicionalmente, el grado de relacion es sugerido por analisis heteroduplex que revela una extensa hibridacion cruzada entre serotipos a lo largo de todo el genoma; y la presencia de segmentos analogos que forman lazos, en los extremos que corresponden a ITRs. Los patronos de infectividad similares tambien sugieren que las funciones de replicacion en cada serotipo estan sometidas a un control regulatorio similar. Entre los diversos serotipos AAV, el AAV2 es el mas comunmente utilizado.

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Un vector AAV descrito en este documento comprendera tipicamente un polinucleotido que es heterologo al AAV. Tfpicamente, el polinucleotido es de interes debido a una capacidad para proporcionar una funcion a una celula diana en el contexto de terapia genica, tal como regulacion positiva o negativa de la expresion de un cierto fenotipo. Generalmente, tal polinucleotido heterologo o “transgen” sera suficientemente largo como para proporcionar la funcion o secuencia codificante deseada. Para la encapsidacion en partfculas AAV2, preferiblemente el transgen tendra menos de unas 5 kb, aunque se pueden emplear otros serotipos y/o modificaciones que permitan empaquetar secuencias mas largas en las partfculas vmcas AAV.

Si se desea la transcripcion del polinucleotido heterologo en la celula diana en cuestion, se puede unir operativamente a su propio promotor o a uno heterologo, dependiendo por ejemplo del nivel y/o especificidad de transcripcion deseados en la celula diana, segun se conoce en el estado de la tecnica. Varios tipos de promotores y potenciadores son validos para su utilizacion en este contexto. Los promotores constitutivos aportan un nivel regular de transcripcion genetica, y son preferidos cuando se desea que el polinucleotido terapeutico se exprese de forma regular. Los promotores inducibles exhiben generalmente baja actividad en ausencia del inductor, y son regulados positivamente en presencia del inductor. Pueden ser preferibles cuando se desea expresion solo en ciertos momentos o en ciertas localizaciones, o cuando se desea valorar el nivel de expresion utilizando un agente inductor. Los prootores y potenciadores tambien pueden ser espedficos de un tejido: es decir, exhiben su actividad solo en ciertos tipos de celulas, presumiblemente debido a elementos reguladores de genes encontrados unicamente en esas celulas.

Ejemplos ilustrativos de promotores son el promotor tardfo SV40 del virus de simio 40, el elemento polihedrico potenciador/promotor del Baculovirus, la timina kinasa del Herpes Simplex (HSV tk), el promotor temprano inmediato del Citomegalovirus (CMV) y varios promotores retrovirales incluyendo elementos LTR. Promotores inducibles incluyen promotores inducibles de iones de metales pesados (tales como el promotor del virus del tumor mamario del raton (mMTV) o diversos promotores de hormona de crecimiento), y los promotores del fago T7 que son activos en presencia de la RNA polimerasa del T7. A modo de ilustracion, ejemplos de promotores espedficos de tejido incluyen diversos promotores de surfactina (para expresion en el pulmon), promotores de miosina (para expresion en el musculo) y promotores de albumina (para expresion en el hngado). Se conoce una amplia variedad de otros promotores y estan generalmente disponibles en el estado de la tecnica, y las secuencias para muchos de tales promotores estan disponibles en bases de datos de secuencias tales como la base de datos GenBank.

Si se desea la traslacion tambien en la celula diana, el polinucleotido heterologo comprendera preferiblemente tambien elementos de control que facilitan la traduccion (tales como un lugar de union en el ribosoma o “RBS” y una senal de poliadenilacion). Consecuentemente, el polinucleotido heterologo comprendera generalmente al menos una region codificante ligada operativamente a un promotor adecuado, y puede comprender tambien, por ejemplo, un potenciador ligado operativamente, un sitio de union a ribosoma y una senal de poli-A. El polinucleotido heterologo puede comprender una region codificante, o mas de una region codificante bajo el control del mismo o diferentes promotores. A la unidad entera, que contiene una combinacion de elementos de control y region codificante, se la denomina a menudo un casete de expresion.

El polinucleotido heterologo es integrado por tecnicas recombinantes dentro de o preferiblemente en lugar de la region codificante del genoma del AAV (es decir, en lugar de los genes de AAV rep y cap), pero generalmente esta flanqueado en ambos lados por regiones de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV. Esto significa que aparece una ITR tanto secuencia arriba como secuencia abajo de la secuencia codificante, ya sea en yuxtaposicion directa, preferiblemente (aunque no necesariamente) sin ninguna secuencia interviniente de origen AAV para reducir la probabilidad de recombinacion que podna regenerar un genoma de AAV competente para la replicacion. Hay evidencia reciente que sugiere que un unico ITR puede ser suficiente para efectuar las funciones normalmente asociadas con configuraciones que comprenden dos ITRs (documento WO 94/13788), y constructos de vector con solo un ITR pueden por tanto emplearse en conjuncion con los metodos de empaquetamiento y produccion de la presente invencion.

Los promotores nativos para rep son auto-reguladores, y pueden limitar la cantidad de partfculas AAV producidas. El gen rep puede tambien estar ligado operativamente a un promotor heterologo, se aporte rep como parte del constructo vector o por separado. Cualquier promotor heterologo que no este fuertemente regulado secuencia abajo por la expresion del gen rep es apropiado; pero se prefieren promotores inducibles porque la expresion constitutiva del gen rep puede tener un impacto negativo en la celula huesped. Una amplia variedad de promotores inducibles se conocen en el estado de la tecnica; incluyen, a modo de ilustracion, promotores inducibles de ion de metal pesado (tales como promotores de metalotionema); promotores inducibles de hormona esteroidea (tales como el promotor de MMTV o los promotores de hormona del crecimiento); y promotores tales como los del fago T7 que estan inactivos en presencia de la RNA polimerasa de T7. Una subclase especialmente preferida de promotores inducibles son los inducidos por el virus auxiliar que se utiliza para complementar la replicacion y el empaquetamiento del vector rAAV. Se han descrito tambien numerosos promotores inducibles por virus auxiliar, incluyendo el promotor de gen temprano de adenovirus que es inducible por la protema E1A de adenovirus; el promotor tardfo mayor de adenovirus; el promotor de herpesvirus que es inducible por protemas de herpesvirus tales como VP16 o 1Cp4; asf como los promotores inducibles de vaccina o poxvirus.

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Los metodos para identificar y comprobar promotores inducibles por virus auxiliar se han descrito en una solicitud en tramitacion junto con la presente y de propiedad comun, publicada como WO96/17947 por Targeted Genetics Corporation (Allen et al.). As^ se conocen en el estado de la tecnica metodos para determinar si promotores candidatos son o no son inducibles por virus auxiliar, y si seran utiles o no para la generacion de celulas de empaquetamiento de alta eficiencia. En pocas palabras, uno de tales metodos implica sustituir el promotor p5 del gen rep de AAV con el promotor putativo inducible por virus auxiliar (ya sea conocido en el estado de la tecnica o identificado utilizando tecnica bien conocidas tales como union a genes reporteros sin promotor). Los genes rep-cap de AAV (con p5 sustituido), preferiblemente ligados a un marcador seleccionable positivo tal como un gen de resistencia a antibiotico, se integran entonces establemente en una celula huesped apropiada (tal como las celulas HeLa o A549 ejemplificadas mas abajo). Las celulas que son capaces de crecer relativamente bien bajo condiciones de seleccion (p.ej., en presencia del antibiotitico) se prueban entonces en cuanto a su capacidad para expresar los genes rep y cap al anadir un virus auxiliar. Como prueba inicial para la expresion de rep y/o cap, las celulas se pueden cribar facilmente utilizando inmunofluorescencia para detectar protemas Rep y/o Cap. La confirmacion de las capacidades y eficiencias de empaquetamiento se pueden entonces determinar mediante pruebas funcionales sobre la replicacion y el empaquetamiento de vectores rAAV entrantes. Utilizando esta metodologfa, un promotor inducible por virus auxiliar derivado del gen metalotionema del raton ha sido identificado como un sustituto apropiado para el promotor p5, y se ha utilizado para producir altos tftulos de partfculas rAAV (segun se describe en el documento WO96/17947, Targeted Genetics Corporation).

Dados los lfmites relativos de tamano de encapsidacion de diversos genomas AAV, la insercion de un polinucleotido heterologo grande en el genoma requiere la eliminacion de una porcion de la secuencia de AAV. La eliminacion de uno o mas genes de AAV es en cualquier caso deseable, para reducir la probabilidad de generar AAV competente para la replicacion (“RCA”). Por consiguiente, las secuencias codificantes o promotoras de rep, cap o ambos, preferiblemente se eliminan, puesto que las funciones proporcionadas por estos genes se pueden proporcionar en trans.

Se dice que el vector resultante es “defectivo” en estas funciones. Para replicar y empaquetar el vector, las funciones ausentes se complementan con un gen de empaquetado, o una pluralidad de ellos, que codifican juntos las funciones necesarias para los diversos productos geneticos rep y/o cap ausentes. Preferiblemente, los genes de empaquetamiento o casetes de genes no estan flanqueados por ITRs de AAV y preferiblemente no comparten ninguna homologfa sustancial con el genoma del rAAV. Asf pues, para minimizar la recombinacion homologa durante la replicacion entre la secuencia vector y los genes de empaquetado proporcionados se forma separada, es deseable evitar la superposicion de las dos secuencias de polinucleotidos. El nivel de homologfa y la correspondiente frecuencia de recombinacion aumenta con la longitud de las secuencias homologas y con su nivel de identidad compartida. El nivel de homologfa que planteara un problema en un sistema dado se puede determinar teoricamente y confirmar experimentalmente, segun se conoce en el estado de la tecnica. Sin embargo, tfpicamente se puede reducir o eliminar la recombinacion si la secuencia que se superpone es menor de unos 25 nucleotidos si es al menos identica en un 80% en toda su longitud, o menor de unos 50 nucleotidos seguidos si es identica en al menos un 70% en toda su longitud. Por supuesto, son preferibles niveles incluso menores de homologfa puesto que reduciran mas la probabilidad de recombinacion. Parece que, incluso sin ninguna homologfa superpuesta, existe una cierta frecuencia residual de generar RAC. Se pueden obtener reducciones incluso mayores en la frecuencia de generacion de RCA (p.ej., por recombinacion no homologa) “separando” las funciones de replicacion y encapsidacion del AAV, segun se describe por Allen et al. en la solicitud de patente de los EE.UU. 08/769,728, presentada el 18 dic 1996, publicada internacionalmente como WO98/27204 el 25 jun 1998 (Targeted Genetics Corporation).

El constructo de vector de rAAV, y los constructos de genes de empaquetamiento complementario se pueden implementar en esta invencion de numerosas formas diferentes. Partfculas vmcas, plasmidos y cualquier celula huesped establemente transformada se pueden utilizar para introducir tales constructos en la celula de empaquetamiento, tanto de forma transitoria como estable.

En cierta realizacion de esta invencion, el vector de AAV y el/los gen(es) complementario(s) de empaquetamiento, si los hay, se proporcionan en forma de plasmidos bacterianos, partfculas de AAV o cualquier combinacion de ellos. En otras realizaciones, ya sea la secuencia del vector de AAV, el/los gen(es) complementario(s) de empaquetamiento, o ambos, se proporcionan bajo la forma de celulas eucariotas geneticamente alteradas (de forma preferiblemente heredable). El desarrollo de celulas huespedes alteradas de forma heredable para expresar la secuencia del vector de AAV, los genes de empaquetamiento, o ambos, proporciona una fuente asentada del material que se expresa a un nivel confiable.

Asf pues, se pueden utilizar diversas celulas diferentes alteradas geneticamente en el contexto de esta invencion. A modo de ilustracion, una celula huesped de mamffero se puede utilizar con al menos una copia intacta de un vector de rAAV establemente integrado. Un plasmido de empaquetamiento de AAV que comprende al menos un gen rep de AAV ligado operativamente a un promotor se puede utilizar para proporcionar funciones de replicacion (segun se describe en una solicitud de propiedad comun de Flotte et al., ahora patente de los Ee.UU. 5,658,776). Alternativamente, una lmea celular estable de mairnfero con un gen rep de AAV ligado operativamente a un

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promotor se puede utilizar para proporcionar funciones de replicacion (ver, p.ej., Trempe et al., (USSN 08/362,608, 9 ene 1995, WO95/13392, 18 may 1995); Burstein et al., (USSN 08/770,122, presentada el 18 dic 1996, WO98/23018, 25 jun 1998); y Johnson et al., (USSN 08/254,358, presentada el 6 jun 1994, emitida como U.S. No. 5,656,785, 19 ago 1997)). El gen cap de AAV, que proporciona las protemas de encapsidacion segun se describe arriba, se puede proporcionar junto con un gen rep de AAV o por separado (ver, p.ej., las solicitudes y patentes referenciadas mas arriba, asf como Allen et al., USSN 08/769,728, presentada 18 dic 1996, WO98/27204 el 25 jun 1998 (Targeted Genetics Corporation)). Otras combinaciones son posibles y se incluyen en el alcance de esta invencion.

Introduccion de material genetico en celulas

Segun se describe en el estado de la tecnica, y se ilustra tanto en el presente documento como en las referencias citadas mas arriba, se puede introducir material genetico en celulas (tales como celulas “productoras” de mairnfero para la produccion de a) utilizando cualquier variedad de medios para transformar o transducir tales celulas. A modo de ilustracion, tales tecnicas incluyen por ejemplo transfeccion con plasmidos bacterianos, infeccion con vectores vmcos, electroporacion, precipitacion de fosfato calcico, e introduccion utilizando cualquiera de diversas composiciones con base lipfdica (un proceso a menudo denominado “lipofeccion”). Se han descrito metodos y composiciones para realizar estas tecnicas en el estado de la tecnica y estan ampliamente disponibles.

La seleccion de celulas apropiadamente alteradas se puede llevar a cabo mediante cualquier tecnica de la literatura. Por ejemplo, las secuencias de polinucleotido utilizadas para alterar la celula se pueden introducir simultaneamente con uno o mas marcadores detectables o seleccionables segun se conoce en el estado de la tecnica, o ligadas operativamente a ellos. A modo de ilustracion, se puede emplear un gen de resistencia a un farmaco como un marcador seleccionable. Las celulas resistentes al farmaco se pueden entonces escoger y cultivar, y luego probar la expresion de la secuencia deseada, es decir, un producto de gen de empaquetamiento, o un producto del polinucleotido heterologo, segun sea el caso. La prueba de adquisicion, localizacion y/o permanencia de un polinucleotido introducido se puede realizar utilizando tecnicas basadas en la hibridacion de ADN (tales como hibridacion Southern y otros procedimientos segun se conocen en el estado de la tecnica). La prueba de expresion se puede realizar sin problemas mediante analisis Northern del ARN extrafdo de las celulas alteradas geneticamente, o por inmunofluorescencia indirecta del correspondiente producto genetico. La comprobacion y confirmacion de las capacidades y eficiencias de empaquetamiento se pueden obtener introduciendo en la celula los demas componentes funcionales de AAV y un virus auxiliar, para probar la produccion de partfculas de AAV. Cuando una celula esta alterada de forma heredable con una pluralidad de constructos de polinucleotidos, en general es mas conveniente (aunque no esencial) introducirlos en la celula por separado, y validar cada paso en serie. Las referencias que describen tales tecnicas incluyen las citadas en este documento.

Seleccion y preparacion de virus auxiliares

Segun se describe mas arriba, el AAV es un parvovirus defectivo para la auto-replicacion, y generalmente debe depender de un virus auxiliar para proporcionar ciertas funciones de replicacion. Se ha identificado una serie de tales virus auxiliares, entre los que se incluyen adenovirus, virus del herpes (incluyendo sin limitarse a HSV1, citomegalovirus y HHV-6), y poxvirus (particularmente vaccinia). Cualquiera de tales virus se puede utilizar con esta invencion.

Frecuentemente el virus auxiliar sera un adenovirus de un tipo y subgrupo que puede infectar la celula huesped. El adenovirus humano del subgrupo C, particularmente los serotipos 1, 2, 4, 6 y 7, se usan comunmente. Generalmente se prefiere el serotipo 5.

Las caractensticas y los patrones de crecimiento del adenovirus se conocen en el estado de la tecnica. El lector se puede referir, por ejemplo, a Horowitz, “Adenoviridae and their replication”, pp 771-816 en “Fundamental Virology”, Fields et al., eds. El genoma de adenovirus empaquetado es una molecula lineal de ADN, ligado a traves de ITRs de adenovirus a las terminaciones derecha e izquierda a traves de un complejo de protema terminal para formar un cfrculo. Las regiones de control y codificacion para componentes tempranos, intermedios y tardfos se solapan en el genoma. Genes de la region temprana estan implicados en la replicacion del genoma del adenovirus, y estan agrupados dependiendo de su ubicacion en las regiones E1, E2, E3 y E4.

Aunque no es esencial, en principio es deseable que la cepa de virus auxiliar sea defectiva para la replicacion en el sujeto que en ultima instancia debe recibir la terapia genica. Asf, cualquier virus auxiliar residual presente en una preparacion rAAV sera incompetente para la replicacion. Los adenovirus de los que se ha eliminado la region E1A o ambas regiones E1A y E3 no son infecciosos para la mayona de las celulas humanas. Pueden ser replicados en una lmea celular permisiva (p.ej., la lmea celular humana 293) que es capaz de complementar la actividad perdida. Las regiones de adenovirus que parecen estar asociadas con la funcion auxiliar, asf como las regiones que no lo parecen, se han identificado y descrito en la literatura (ver, p.ej., P. Colosi et al., WO97/17458, y las referencia citadas en ese documento).

Utilizacion de un virus auxiliar sensible a las condiciones

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Segun se describe en el presente documento, un virus auxiliar “sensible a las condiciones” puede tambien ser empleado para proporcionar la actividad de virus auxiliar. Tal cepa de virus auxiliar tiene que tener como mmimo la propiedad de ser capaz de apoyar la replicacion del AAV en una celula huesped al menos bajo un conjunto de condiciones en las que el mismo no experimenta replicacion genomica efectiva. Cuando la actividad del virus auxiliar se proporcionada como partmulas de virus intacto, generalmente tambien es necesario que el virus sea capaz de replicacion es una celula huesped bajo un segundo conjunto de condiciones. El primer conjunto de condiciones diferira del segundo conjunto de condiciones en una caractenstica facilmente controlable, tal como la presencia o ausencia de un cofactor requerido (tal como un cation), la presencia o ausencia de un farmaco inhibidor, o un cambio en una condicion ambiental tal como la temperatura. Lo mas conveniente es que la diferencia entre las dos condiciones sea la temperatura, y tal virus sensible a las condiciones se denomina por tanto virus auxiliar termosensible (tsHV).

Para los objetivos de esta publicacion, un virus auxiliar “termosensible” o “ts” es uno capaz de replicar su material genetico en una celula eucariotica en cierto rango de temperatura (el rango de temperatura “permisivo”), tfpicamente aproximadamente 15 °C - 35 °C y preferiblemente aproximadamente 20 °C - 32 °C. Sin embargo, a la temperatura ”no permisiva”, incluso cuando las otras condiciones se mantienen iguales, la velocidad de replicacion del material genetico es sustancialmente inferior, al menos 10 veces inferior; habitualmente al menos unas 100 veces inferior; y preferiblemente al menos unas 1000 veces inferior. Esta temperatura es tipicamente aproximadamente 35 °C - 50 °C, generalmente aproximadamente 42 °C. En un ejemplo tfpico de tal virus auxiliar ts, el virus es capaz de replicacion eficaz a temperaturas relativamente bajas tales como temperaturas de aproximadamente 20 °C - 32 °C, pero es incapaz de replicacion eficaz a temperaturas relativamente altas tales como temperaturas de aproximadamente 37 °C - 42 °C. Se entiende que la celula infectada por virus puede sin embargo exhibir algun proceso metabolico atribuible al virus a la temperatura no permisiva, incluyendo pero no limitandose a funcion auxiliar para produccion de AAV.

Un virus auxiliar termosensible se puede producir en grandes cantidades cultivando celulas infectadas a una temperatura permisiva. Se puede entonces producir el vector AAV cultivando celulas que comprenden elementos vectores y el virus auxiliar termosensible a una temperatura no permisiva. La preparacion del vector estara sustancialmente exenta de componentes de virus auxiliar.

Se ha descrito un gran numero de variantes de adenovirus termosensibles en la literatura; ver, p.ej., las variantes descritas por Ensinger et al. (J. Virol. 10:328, 1972); Williams et al. (J. Gen Virol. 11:95, 1971); Ishibashi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65:304, 1970); Lundholm et al. (Virology 45:827, 1971); y Shiroki et al., (Virology 61:474, 1974); entre otros. El analisis de complementacion indica que tales variantes pertenecen a una pluralidad de grupos de complementacion diferentes (Ginsberg et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34:419, 1974). Esto sugiere que varias etapas del ciclo de replicacion del adenovirus se pueden volver termosensibles.

Puesto que la funcion auxiliar para replicacion de AAV requiere que solo parte del ciclo del adenovirus este intacta, comprobar la funcion auxiliar de diversos mutantes a temperaturas no permisivas proporciona un metodo para mapear la funcion auxiliar. Por ejemplo, Ishibashi et al. (Virology 45:317, 1971) reportaron que variantes de adenovirus aviar termosensibles apoyan la replicacion de AAV1 y AAV2. Ito et al. reportaron que el mutante ts13 termosensible del adenovirus humano 7 (Ad7ts13) auxilia la replicacion de AAV a la temperatura no permisible tan eficazmente como la cepa natural. Drake et al. (Virology 60:230, 1974) reportaron la complementacion de la smtesis de antfgenos de AAV4 por 3 grupos de mutantes termosensibles del virus de herpes simplex tipo 1 (HSV1). Handa et al. (J. Gen. Viro. 29:239, 1975) reportaron actividad auxiliar para produccion de virus aAV1 por adenovirus humanos mutantes Ad5ts36, Ad5ts125, Ad5ts149, Ad12tsA275, Ad12tsB221, y Ad12tsC295. Ostrove et al. (Virology 104:502, 1980) reportaron que los mutantes termosensibles Ad5ts125, Ad5ts135, Ad5ts157, Ad5ts116, y Ad5ts142, y el conjunto de huespedes mutantes hr6, pero no el hr3, apoyan la replicacion de AAV. Mayor et al. (J. Gen. Virol. 35:545, 1977) reportaron que Ad31ts13 pero no Ad31ts94 apoyaron la produccion de AAV1 a la temperatura no permisiva.

Straus et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:742, 1976) reportaron que Ad5ts125 apoyo la replicacion de AAV2 bajo condiciones en las que los propios adenovirus no se replicaron. Utilizaron esta propiedad para estudiar intermediarios de ADN formados durante la replicacion de AAV. Myers et al. (J. Virol. 35:65, 1980) realizaron un estudio cuantitativo sobre la funcion de auxilio y mostraron que Ad5ts149 apoyaba la produccion de 20'000 partmulas de AAV infecciosas por celula a la temperatura no permisiva, mientras que Ad5ts107 produda solo ~100 partmulas por celula. Puesto que Ad5ts107 tiene una mutacion en la region que codifica la protema de union a ADN de 72 kDa, concluyeron que esa protema jugaba un papel en la expresion del ARN de AAV. Mas recientemente, Carter et al. (Virology 191:473, 1992) propusieron que se requiere una protema de 72kDa completamente funcional para la expresion posttranscripcional de los genes de AAV rep y cap.

Segun se subraya en la seccion de antecedentes, la existencia de adenovirus termosensibles se conoce desde hace bastante. Sin embargo, no ha habido aprendizaje o sugerencia efectiva en relacion al uso actual de virus auxiliares condicionales en la generacion de vectores de AAV recombinante, como los que se pueden utilizar para terapia genica.

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Parte de la explicacion puede ser la dificultad para obtener tftulos factibles de AAV cuando se utilizan vectores recombinantes. Entre otras cosas, las protemas Rep de AAV aparentemente regulan secuencia abajo su propia expresion a traves del promotor p5 (Tratschin et al., Mol. Cell Biol. 6:2884, 1986). Ademas, se ha observado que la expresion del gen rep en lmeas celulares de empaquetamiento tales como las que se pueden utilizar para la produccion de vector AAV recombinante, tiende a inhibir el crecimiento y/o el metabolismo de la celula (ver, p.ej., Targeted Genetics Corporation, WO96/17947, por Allen et al.).

Las diferencias entre la generacion de vectores AAV de tipo natural y vectores AAV recombinantes tiende a ser bastante dramatica si se considera en terminos de produccion. En particular, se ha observado que la produccion de vectores AAV recombinantes tiende a ser sustancialmente inferior a la produccion de partfculas de AAV de tipo natural, y que la presencia o generacion de cantidades incluso pequenas de contaminacion con AAV de tipo natural tiende a resultar en una produccion preferente de virus de tipo natural que eventualmente puede superar en numero a los vectores de AAV recombinante.

Estos fenomenos quedan adicionalmente ilustrados por los resultados descritos en los ejemplos 1 y 2 de esta publicacion, y en la Figura 1. Se reporta en otro lugar que el adenovirus termosensible mutante ts149 apoya la replicacion de partfculas AAV (Myers et al., J. Virol. 35:65, 1980). Sin embargo, el Ejemplo 2 muestra que cuando este mutante se utiliza para apoyar la produccion de un vector de AAV con un promotor heterologo bajo condiciones normales, el nivel de produccion es varios ordenes de magnitud inferior al apoyo con adenovirus de tipo natural.

Esta publicacion muestra que un virus auxiliar termosensible se puede de hecho utilizar para preparar vectores de AAV recombinantes con tftulos factibles, venciendo los aparentes obstaculos de produccion. Las descripciones que siguen ilustran como seleccionar un virus auxiliar termosensible y optimizar las condiciones para aportar suficiente AAV para los propositos de la terapia genica.

En particular, se muestra que extender el periodo de replicacion para AAV cuando se utiliza un tsAd como auxiliar aumenta dramaticamente la cantidad de vector AAV que se produce (Ejemplo 3). Esto es opuesto a la intuicion, porque extender el periodo de replicacion cuando se utiliza un Ad de tipo natural del mismo modo disminuye la cantidad de vector AAV en al menos un orden de magnitud. El experto en la materia que quiere optimizar las condiciones de produccion probana logicamente tiempos de cultivo mas cortos y concentraciones mas elevadas de virus auxiliar; en el presente documento se muestra que ambas cosas son inefectivas.

Tambien se describen en este documento metodos mejorados de cultivo y separacion para preparar cantidades cuantitativas de adenovirus termosensibles. Aunque no se requiere estrictamente para la practica de ciertas realizaciones de esta invencion, los preparados de adenovirus termosensibles obtenidos mediante estos metodos son particularmente adecuados para la produccion de AAV, entre otros, con fines de terapia genica.

Las variantes sensibles a las condiciones de la cepa seleccionada de virus auxiliar se pueden generar mediante una estrategia de mutegenizacion y seleccion apropiada. Por ejemplo, el virus puede mutagenizarse con nitrosoguanidina, acido nitroso, hidroxilamina o 5-bromo-2-desoxiuridina. Se seleccionan candidatos que puedan multiplicarse en una celula eucariotica adecuada en las condiciones permisivas deseadas, pero no en las condiciones no permisivas deseadas. A modo de ilustracion, se pueden obtener mutantes de adenovirus termosensibles que se multiplican, p.ej., a 32 °C pero no a 39,5 °C. Las relaciones de eficacia de siembra en placa a 39,5 °C frente a 32 °C son preferiblemente menores de 10"4 y mas preferiblemente menores de 10"5. Puede encontrarse una ilustracion adicional de procesos de seleccion adecuados para adenovirus termosensibles, por ejemplo, en Ensinger et al., J. Virol. 10:328, 1972; y Williams et al., J. Gen Virol. 11:95, 1971. Se puede encontrar la descripcion de variantes de adenovirus que no son termosensibles sino sensibles al tipo de hospedador en Harrison et al., Virology 77:319, 1977. Pueden prepararse mutantes termosensibles eficaces para uso en la practica de esta invencion, por ejemplo, a partir de virus auxiliares alternativos como herpes simple 1 (HSV1) o herpes simple 2 (HSV2). Ver, p.ej., Schaffer et al., Virology 52:57, 1973 para HSV1; Esparza et al., Virology 57:554, 1974 para HSV2. Segun se indica en la seccion de antecedentes, se han descrito un gran numero de virus auxiliares sensibles a las condiciones, y pueden obtenerse de los cientfficos que los desarrollaron o describieron o de un deposito publico.

No todas las variantes sensibles a las condiciones de los virus anteriormente enumerados funcionaran con la presente invencion. En particular, la cepa debe volverse sensible a la condicion en una etapa de su ciclo de replicacion tal que la funcion que se bloquee en condiciones no permisivas no sea una necesaria para la replicacion con alta eficacia de AAV. La eleccion de la cepa de virus auxiliar a utilizar puede realizarse con referencia a la biologfa conocida del virus auxiliar y a los requisitos de replicacion del AAV.

Un virus auxiliar ejemplar para utilizar con esta invencion el adenovirus termosensible ts149 del serotipo Ad5 (Ad5ts149). Segun se muestra en la seccion de ejemplos, en condiciones optimizadas, esta cepa puede utilizarse para producir rAAV a niveles que igualan o superan los apoyados por Ad5 de tipo natural. El ts149 tiene una sola transicion de C-G a A-T en posicion 7563 (Roovers et al., Virus Genes 4:53, 1990). Esto tiene como resultado un cambio del aminoacido leucina en el residuo 411 de la ADN polimerasa a fenilalanina. La ADN polimerasa esta contenida en la unidad de transcripcion E2 del adenovirus. Sin embargo, otros mutantes de ts que se cartograffan en esta region son menos adecuados. En particular, la unidad de transcripcion E2 comprende tambien la region de

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codificacion de la protema de union a ADN de 72 kDa (DBP). Una cepa que no produce DBP detectable (Add/802) apoya la replicacion de AAV, pero a un nivel que esta reducido en un orden de magnitud (Carter et al., Virology 191:473, 1992). Adts125, que comprende tambien una mutacion que se cartograffa en la region que codifica DBP, apoya la replicacion de AAV (Straus et al., J. Virol. 17:140, 1976), aunque los niveles son generalmente mucho menores que con Ad5 de tipo natural (Myers et al., J. Virol. 35:65, 1980). Por consiguiente, los vectores de adenovirus termosensibles adecuados para utilizar en la presente invencion incluyen aquellos para los que la sensibilidad se cartograffa en la region e2a del genoma, preferiblemente en la region que codifica aDn polimerasa.

El experto puede determinar facilmente que cepas vmcas son adecuadas para utilizar como virus auxiliar realizando un ensayo de replicacion de rAAV usando un panel de cepas de virus auxiliar candidatas en una celula candidata en condiciones que sean no permisivas para la autorreplicacion del auxiliar. Para variantes termosensibles, se realiza el cribado a la temperatura no permisiva segun las propiedades conocidas de la cepa. Las temperaturas no permisivas son generalmente mayores que las temperaturas permisivas, tfpicamente de aproximadamente 35 °C - 50 °C, preferiblemente de 38 °C - 45 °C, mas preferiblemente de aproximadamente 39,5 °C. Se prefieren las variantes que apoyan la replicacion de AAV a un nivel que esta dentro de un orden de magnitud del apoyado por el correspondiente virus de tipo natural. Al realizar el cribado, el experto debe incorporar las demas ensenanzas de esta publicacion. En particular, cribar cultivando durante tiempos que procuran una replicacion de AAV maxima con virus de tipo natural es insuficiente. Se debe establecer una matriz cinetica en la que se usan los virus auxiliares candidatos durante periodos mas largos, y comparar entonces con el virus de tipo natural en el momento de recoleccion maxima. Se proporciona una ilustracion mas detallada de este analisis en el Ejemplo 3 de esta publicacion.

Una vez se ha seleccionado una cepa de virus auxiliar adecuada, puede aplicarse en esta invencion en una serie de formas diferentes. Pueden usarse partfculas vmcas, plasmidos vmcos y celulas huespedes transformadas establemente.

En un aspecto, se introduce en la celula huesped a utilizar para la replicacion del vector de rAAV el genoma del virus auxiliar (o como mmimo, las regiones del genoma del virus auxiliar que codifican la funcion auxiliar) en forma de un plasmido de ADN o una pluralidad de plasmidos que proporcionan las funciones complementarias. En el estado de la tecnica se conocen procedimientos para la manipulacion experimental de adenovirus. El lector se remite a Graham et al., "Manipulation of adenovirus vectors" en: Murray EJ, ed. Methods in molecular biology: Gene transfer and expression protocols, vol 7. Clifton, NJ: The Human Press, 1991:109-128, que proporciona protocolos detallados para la propagacion, titulacion y purificacion de adenovirus, contransfeccion y recombinacion in vivo. Los plasmidos de adenovirus estan disponibles comercialmente en Microbix Biosystems Inc., Toronto, Canada.

En otro aspecto, se transfecta establemente la celula huesped con genes de adenovirus, o se altera geneticamente para proporcionar las funciones necesarias para la replicacion de rAAV. Como alternativa, la celula huesped se puede alterar geneticamente con solo una porcion del genoma de adenovirus, y se infecta o transfecta posteriormente con una partfcula o plasmido de adenovirus. Las solicitudes de patente WO 95/27071 y WO 95/34671 describen celulas huespedes alteradas hereditariamente para proporcionar una funcion adenovmca que complementa la propiedad de replicacion de diversos constructos de adenovirus defectivos.

En otra realizacion mas, la celula huesped usada para replicacion de AAV se infecta con un virus auxiliar que es capaz de autorreplicacion, pero no en condiciones no permisivas. Se puede utilizar cualquier preparacion de la cepa requerida que proporcione una MOI suficiente. Cinendose a las GMPs y a otros requisitos regulatorios, y para facilitar el aumento de escala con fines comerciales, las preparaciones de virus auxiliar comprenden preferiblemente una alta densidad de partfculas infecciosas y estan sustancialmente exentas de desechos celulares y otros contaminantes. Las propiedades deseables incluyen las siguientes:

• Una densidad de al menos 106 UI/mL, preferiblemente de al menos aproximadamente 108 UI/mL, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 1010 UI/mL, determinada en un ensayo de TCID50.

• Una relacion de ADN de adenovirus a protema total o hexon de adenovirus que indica que al menos un 10%, preferiblemente al menos aproximadamente un 50%, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de las partfculas vmcas contienen ADN de adenovirus.

• Menos de un 20%, preferiblemente menos de aproximadamente un 10%, mas preferiblemente menos de aproximadamente un 1% de contaminacion por material que no es de adenovirus a nivel de protema o ADN, detectado por geles de SDS tenidos para protema o geles de agarosa de productos de digestion con nucleasa de restriccion tenidos con bromuro de etidio.

• Un total de al menos 109 UI, preferiblemente al menos aproximadamente 1011 UI, mas preferiblemente al menos aproximadamente 1013 UI por lote de produccion.

Se puede preparar virus auxiliar en cualquier celula que sea permisiva de la replicacion vmca. Para adenovirus, las celulas preferidas incluyen celulas 293 y celulas HeLa. Tradicionalmente, cuando estas celulas se han usado para

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replicacion de adenovirus, se han usado en cultivos en placa. Sin embargo, segun se muestra en el Ejemplo 4, estos procedimientos apoyan generalmente la replicacion de adenovirus termosensibles a niveles que son una o dos unidades logantmicas menores que para adenovirus de tipo natural.

Por consiguiente, es preferible emplear tecnicas de cultivo que permitan un aumento de la densidad de siembra. Se dispone de variantes de celulas 293 y celulas HeLa que se han adaptado al cultivo en suspension. HeLa es preferible por razones de crecimiento celular, viabilidad y morfologfa en suspension. Segun se muestra en el Ejemplo 5, estas celulas pueden crecer a suficiente densidad (2 x 106 por mL) para compensar la menor tasa de replicacion de la cepa de adenovirus termosensible. Una vez establecidas, se infectan las celulas con el virus y se cultivan a la temperatura permisiva durante un periodo suficiente, generalmente de 3-7 dfas y tfpicamente de aproximadamente 5 dfas.

La filtracion de flujo tangencial es una tecnica usada en el estado de la tecnica para procesar grandes volumenes de celulas de mamffero con el fin de perfundirlas, concentrarlas y recolectarlas. Ver, por ejemplo, Dorin et al., Biotechnol. Prog. 6:494, 1990; Maiorella et al., Biotechnol. Bioeng. 37:121, 1991. Se recomienda utilizar esta tecnica con cultivos en suspension para la preparacion de virus auxiliar para utilizar en la presente invencion. El Ejemplo 5 demuestra que las celulas HeLa S3 soportan fuerzas de cizalladura de 750-1500 s-1, permitiendo la concentracion de las celulas y la diafiltracion del medio usado.

Se recolecta el virus del cultivo desde el medio usado o mediante microfluidificacion de las celulas. El nivel de virus auxiliar producido en el cultivo es tfpicamente de al menos 107 UI/mL, y preferiblemente de al menos aproximadamente 3 x 107 UI/mL.

El virus auxiliar preparado segun la descripcion anterior se puede utilizar directamente para infectar celulas huespedes usadas para replicacion de rAAV. Mas habitualmente, el virus se afsla y concentra antes del uso. Los procedimientos actuales para purificar y concentrar virus auxiliares implican tfpicamente gradientes isopmnicos de CsCl. Este procedimiento consume tiempo y trabajo, requiere numerosas etapas de procesamiento abierto y es diffcil de aumentar de escala. En lugar de ello, se recomienda la purificacion por cromatograffa. El lector se remite en general a Prior et al., Pharmaceut. Technol. 19:30, 1995 y Huyghe et al., Human Gene Therapy 6:1403, 1995. Se prefiere particularmente para el aislamiento de cepas termosensibles de adenovirus la cromatograffa de intercambio de aniones, especialmente en una resina de polietilenimina usando un gradiente continuo de NaCl a pH 7,4. Se proporciona en el Ejemplo 6 una ilustracion detallada del metodo de separacion con polietilenimina.

Produccion de una celula huesped que comprende virus auxiliar y AAV

Varios criterios influyen en la seleccion de las celulas para su uso en la produccion de partmulas de rAAV segun se describen en el presente documento. Como cuestion inicial, la celula debe permitir la replicacion y empaquetamiento del vector de rAAV al utilizar el virus auxiliar seleccionado. Sin embargo, puesto que la mayona de celulas de marnffero pueden ser productivamente infectadas por AAV, y muchas pueden ser infectadas tambien por virus auxiliares tales como adenovirus, resulta evidente que una gran variedad de celulas de mamffero y lmeas celulares satisfacen eficazmente estos criterios. Entre ellas, las celulas y lmeas celulares mas preferidas son aquellas que pueden cultivarse facilmente para facilitar la produccion de gran escala de preparados de vector de AAV recombinante. Sin embargo, de nuevo muchas de dichas celulas satisfacen eficazmente este criterio. Cuando se desea una produccion a gran escala, la eleccion del procedimiento de produccion influira tambien en la seleccion de la celula huesped. Por ejemplo, segun se describe con mas detalle a continuacion y en el estado de la tecnica, algunas tecnicas de produccion y recipientes o camaras de cultivo estan disenados para el crecimiento de celulas adherentes o unidas, mientras que otros estan disenados para el crecimiento de celulas en suspension. Por tanto, en el ultimo caso, la celula huesped preferiblemente estana adaptada o sena adaptable al crecimiento en suspension. Sin embargo, incluso en el caso de celulas y lmeas celulares que se consideran adherentes o dependientes de anclaje, es posible (segun se describe mas abajo) derivar variantes adaptadas a la suspension de una lmea parental dependiente de anclaje mediante la seleccion en serie de celulas capaces de crecimiento en suspension.

Cuando se utiliza un virus auxiliar termosensible, la celula debe ser capaz de replicar eficazmente el vector de rAAV en condiciones que sean no permisivas para la replicacion del virus auxiliar. A modo de ilustracion, cuando se utiliza el adenovirus ts149 como virus auxiliar ts (segun se describe e ilustra mas abajo), la celula debe ser capaz de apoyar la replicacion y el empaquetamiento de rAAV a temperaturas bien por encima de 32 °C, preferiblemente de aproximadamente 39,5 °C. Las celulas 293 humanas son un ejemplo de lmea celular que satisface estos criterios, pero numerosas otras celulas y lmeas celulares son capaces de replicar rAAV a esta temperatura relativamente elevada.

En ultima instancia, el virus auxiliar, la secuencia del vector de rAAV y todas las secuencias de AAV necesarias para la replicacion y el empaquetamiento deben estar presentes en la misma celula. Cuando se proporcionan separadamente del vector uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, se proporciona una celula huesped que comprende: (i) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, donde cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica una protema de replicacion o encapsidacion de AAV; (ii) un polinucleotido

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heterologo introducido en dicha celula huesped utilizando un vector o provector de rAAV, donde dicho vector o provector de rAAV comprende dicho polinucleotido heterologo flanqueado por al menos una ITR de AAV y es deficiente de dicho gen o genes de empaquetamiento de AVV; y (iii) un virus auxiliar o secuencias que codifican las funciones de virus auxiliar necesarias. Debe observarse, sin embargo, que uno o mas de estos elementos pueden combinarse en un unico replicon. A modo de ilustracion, un virus auxiliar puede comprender tambien un provector de rAAV o un gen de empaquetamiento de AAV.

El virus auxiliar se introduce preferiblemente en el cultivo celular a un nivel suficiente para infectar la mayona de las celulas en cultivo, pero se puede mantener por otro lado en el mmimo para limitar la cantidad de virus auxiliar presente en la preparacion resultante. Puede usarse una multiplicidad de infeccion o “MOI” de 1-100, pero es tipicamente adecuada una MOI de 5-10.

De forma similar, si el vector de AAV y/o los genes de empaquetamiento se introducen transitoriamente en la celula de empaquetamiento (en contraposicion a introducirse establemente), se introducen preferiblemente a un nivel suficiente para alterar geneticamente la mayona de las celulas en cultivo. Las cantidades requeridas generalmente son del orden de 10 |jg por cada 106 celulas, si se suministran como plasmido bacteriano, o de 108 partfculas por 105 celulas si se suministran como partmula de AAV. La determinacion de la cantidad optima es un ejercicio de titulacion rutinaria que esta dentro de las habilidades normales del experto.

Estos elementos pueden introducirse en la celula simultanea o secuencialmente en cualquier orden. Cuando la celula es alterada hereditariamente por cualquiera de los elementos, la celula puede seleccionarse y dejarse proliferar antes de introducir el siguiente elemento.

En una realizacion preferida, el virus auxiliar se introduce en ultimo lugar en la celula para recuperar y empaquetar un vector de rAAV residente. Generalmente, la celula estara ya suplementada en la medida necesaria con genes de empaquetamiento de AAV. Preferiblemente, el vector de rAAV o los genes de empaquetamiento, y mas preferiblemente ambos, se integran establemente en la celula. Se aprecia facilmente que son posibles otras combinaciones. Dichas combinaciones estan incluidas dentro del alcance de la invencion.

Una vez se proporciona a la celula huesped los elementos necesarios, se cultiva la celula en condiciones permisivas para la replicacion de AAV, para permitir la replicacion y empaquetamiento del vector de rAAV. El tiempo de cultivo se ajusta preferiblemente para corresponder a los niveles de produccion maximos, y es tfpicamente de 3-6 dfas. Preferiblemente, se producen al menos 100 partmulas vmcas por celula; mas preferiblemente al menos aproximadamente 1000 por celula, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 10.000 por celula. Preferiblemente, se producen al menos 0,5 x 106, mas preferiblemente al menos aproximadamente 1 x 106, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 2 x 106 uR/mL vectores de AAV por 2 x 105 celulas durante el periodo de cultivo. Opcionalmente, pueden usarse metodos de produccion a gran escala tales como cultivo en suspension y filtracion de flujo tangencial. Se recolectan entonces las partmulas de AAV y se afslan de las celulas usadas para prepararlas.

Las preparaciones de partmulas de rAAV descritas en este documento comprenden preferiblemente una alta densidad de partmulas de AAV infecciosas y estan sustancialmente exentas de virus auxiliar, protemas de virus auxiliar y desechos celulares y otros contaminantes. Las propiedades deseables incluyen las siguientes:

• Una concentracion de al menos 107, preferiblemente de al menos aproximadamente 108, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 109 UR/mL, determinada en un ensayo de replicacion o comparacion de hibridacion cuantitativa con un patron conocido.

• No mas de 103, preferiblemente no mas de aproximadamente 102, mas preferiblemente no mas de aproximadamente 101 partmulas infecciosas de virus auxiliar por 108 UR de partmulas de rAAV.

• Menos de un 5%, preferiblemente menos de aproximadamente un 1%, mas preferiblemente menos de aproximadamente un 0,01%, aun mas preferiblemente menos de aproximadamente un 0,001% de contaminacion por virus auxiliar basada en protema (p/p), detectada por analisis densitometricos de geles de SDS o por inmunoensayo para protema espedfica de virus auxiliar (tal como fibra de hexon o penton de adenovirus).

• Menos de un 5%, preferiblemente menos de aproximadamente un 1%, mas preferiblemente menos de aproximadamente un 0,01%, aun mas preferiblemente menos de aproximadamente un 0,001% de contaminacion por virus auxiliar o protema celular (p/p), detectada por analisis densitrometricos de geles de SDS o por inmunoensayo para virus auxiliares o protemas espedficas celulares.

• Preferiblemente, la preparacion esta tambien sustancialmente exenta de otros componentes celulares potenciales tales como lfpidos, carbohidratos y/o acidos nucleicos celulares.

Los procedimientos resumidos en esta publicacion son adecuados para preparar lotes experimentales pequenos o lotes preparativos de 10-100 L o mas. Para preparaciones de lotes a gran escala, tambien es deseable la siguiente

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propiedad:

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• Un total de al menos 10 , preferiblemente 10 y mas preferiblemente 10 UR de partmulas de vector de AAV en la preparacion.

Opcionalmente, los vectores de rAAV pueden procesarse adicionalmente para enriquecer en partmulas de rAAV, disminuir las partmulas de virus auxiliar o volverlos de otro modo aptos para administracion a un sujeto. Las tecnicas de purificacion pueden incluir centrifugacion en gradiente isopmnico y tecnicas cromatograficas. La reduccion de la actividad del virus auxiliar infeccioso puede incluir la inactivacion mediante tratamiento termico o mediante tratamiento con pH como es conocido en el estado de la tecnica. Otros procesos pueden incluir concentracion, filtracion, diafiltracion o mezclado con un tampon o excipiente farmaceutico adecuado. Las preparaciones pueden dividirse en aftcuotas de dosis unitaria y dosis multiple para distribucion, que retendran las caractensticas esenciales del lote, tales como la homogeneidad del contenido antigenico y genetico, y la proporcion relativa de virus auxiliar contaminante.

En las siguientes secciones y en ejemplos posteriores se proporcionan tecnicas ejemplares para generar preparados de virus auxiliares y AAV que exhiben diversas propiedades deseables segun se describen mas arriba.

Se conocen en el estado de la tecnica diversos metodos para la determinacion del tftulo infeccioso de un preparado vftico. Sin embargo, un metodo preferido para la determinacion del tftulo es un ensayo de titulacion de alto rendimiento segun se proporciona en el presente documento. En un ensayo de titulacion de alto rendimiento ejemplar, se establece una matriz de pocillos de cultivo que comprenden cada uno una aftcuota de celulas de mairftfero y una aftcuota de preparacion vftica (asf como pocillos de control que comprenden, por ejemplo, celulas solas, virus solo y nada). La matriz de pocillos de cultivo puede estar, por ejemplo, en forma de un recipiente de microtitulacion. Tfpicamente, se anaden a las celulas aftcuotas (p.ej., aftcuotas diluidas en serie) del preparado vftico a titular, y entonces se incuban las celulas y virus en condiciones que permitan la replicacion del virus (tfpicamente, condiciones de crecimiento adecuadas para la celula huesped de mairftfero). Despues de la replicacion del virus, generalmente se libera el acido nucleico vftico mediante la lisis de las celulas de mamftfero (utilizando condiciones o agentes que promuevan la lisis segun sea necesario). En realizaciones preferidas, el acido nucleico (incluyendo acido nucleico vftico) en la multiplicidad de lisados se transfiere y fija a una membrana en condiciones de union al acido nucleico (lavando de forma adecuada para retirar las protemas y otros contaminantes). La membrana es preferiblemente un duplicado o imagen especular de la matriz de cultivos en la que los pocillos individuales de la matriz original se representan subsecuentemente por “conjuntos” de acido nucleico (del lisado de cada pocillo de cultivo) que se unen en las correspondientes posiciones en la membrana. Puede usarse entonces la hibridacion de la membrana con una sonda marcada espedfica de virus (o espedfica de inserto vftico) para identificar y cuantificar la cantidad relativa de acido nucleico espedfico de virus en cada uno de los puntos de la matriz, y en correspondencia, en cada uno de los pocillos de cultivo originales. Las condiciones y materiales para transferencia, union, lavado e hibridacion de acido nucleico se pueden adaptar a partir de tecnicas de biologfa molecular rutinarias tales como hibridacion “dot blot” (segun se describe en la literatura, ver p.ej. las tecnicas biologicas moleculares en Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra). Se presentan mas abajo aplicaciones ilustrativas de estas tecnicas.

Estos metodos proporcionan por tanto un ensayo de infectividad de alto rendimiento que puede utilizarse para la determinacion del tftulo infeccioso de un preparado vftico. Segun se muestra en el Ejemplo 4, los tftulos vfticos determinados mediante este procedimiento rapido y cuantitativo se corresponden estrechamente con los tftulos determinados mediante tecnicas mas clasicas. Sin embargo, este procedimiento de alto rendimiento permite ademas el procesamiento y analisis simultaneo de muchas reacciones de replicacion vftica y por tanto tiene muchos otros usos incluyendo, por ejemplo, el cribado de ftneas celulares permisivas o no permisivas para la replicacion e infectividad vftica, asf como el cribado de agentes que afectan a la replicacion vftica, segun se examina adicionalmente mas abajo.

Tecnicas de produccion y purificacion de virus auxiliares preferidas para uso en la presente invencion

En diversos aspectos preferidos de la presente publicacion, se emplean metodos de produccion y purificacion para la generacion de virus auxiliares adecuados para el uso en la produccion de vectores de rAAV segun se describen en el presente documento. Un virus auxiliar habitualmente utilizado para la produccion de AAV es el adenovirus, ftpicamente Ad5, aunque se pueden emplear tambien otros virus auxiliares segun se examinan en el presente documento y en la literatura.

Con fines de ilustracion, es conveniente dividir el examen de la produccion y purificacion de virus en las fases “anterior” y “posterior”. El proceso “anterior” designa generalmente la produccion del virus en celulas huespedes adecuadas y la liberacion o retirada del virus de las celulas para producir una preparacion de virus “bruta” tal como un lisado. El procesamiento “posterior” puede emplearse para purificar la preparacion de virus bruta (p.ej., para aislarlo de protemas celulares y/u otros contaminantes).

Se conocen una variedad de tecnicas para la produccion y el procesamiento de virus auxiliares, incluyendo adenovirus (p.ej., centrifugacion en CsCl, asf como otras tecnicas tales como las descritas en el documento WO

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96/27677). El virus auxiliar producido utilizando tales tecnicas se puede emplear entonces en la produccion de vectores de rAAV segun se describe en el presente documento.

Las siguientes secciones describen, con fines de ilustracion, tecnicas que pueden emplearse para la produccion de adenovirus, aunque en el estado de la tecnica se conocen otras tecnicas y pueden emplearse en el presente documento.

(i) Virus auxiliares anteriores

El virus auxiliar, tal como Ad5, se puede producir facilmente infectando celulas de mairnfero (p.ej., celulas humanas). En los ejemplos ilustrativos descritos mas abajo, las celulas crecen en medios y recipientes de cultivo adecuados para el crecimiento de la celula huesped, se concentran antes de la infeccion y luego se infectan con virus auxiliar (p.ej., a una MOI de 1-5) con agitacion suave. Despues de la infeccion, las celulas pueden resuspenderse en medio reciente e incubarse durante un periodo de tiempo adicional (tfpicamente aproximadamente 2 dfas) para permitir la replicacion y empaquetamiento del virus auxiliar. Despues de la incubacion, las celulas pueden recolectarse y lisarse para liberar el virus auxiliar. Despues de la lisis, se trata preferiblemente el lisado celular con una nucleasa para degradar el acido nucleico libre (p.ej., acido nucleico celular) sin degradar el acido nucleico que esta encapsidado en partfculas vmcas. El lisado puede clarificarse (p.ej., mediante filtracion y/o centrifugacion) y puede someterse tambien a tecnicas de purificacion adicionales para purificar y concentrar el virus auxiliar en la preparacion segun se describe e ilustra mas abajo.

Como ejemplo ilustrativo de dicho proceso, las celulas pueden crecer en medios a una densidad de aproximadamente 1 x 106 celulas/mL en un recipiente tal como un matraz spinner. Despues de la incubacion, las celulas pueden concentrarse entonces a aproximadamente 107 celulas/mL e infectarse con Ad5 a 1-2 unidades infecciosas/celula con agitacion suave. Las celulas pueden resuspenderse entonces en medio a aproximadamente 106 celulas/mL y dejarse produciendo virus durante un periodo de incubacion de aproximadamente 2 dfas. Las celulas pueden recolectarse entonces, resuspenderse en medio o tampon (p.ej., a aproximadamente 5 x 106 celulas/mL) y luego disgregarse, p.ej. mediante lisis mecanica tal como pasar a traves de un microfluidificador a 8000 psi o tecnica equivalente (p.ej., congelacion-descongelacion o sonicacion). El lisado puede tratarse con una nucleasa (p.ej., benzonasa) durante 1 hora a 37 °C. El lisado puede clarificarse a traves de un filtro, tal como un filtro de 1,0 pm, o mediante centrifugacion. Mas abajo se describen adicionalmente tecnicas analogas y modificaciones de las mismas.

(ii) Virus auxiliares posteriores

Las tecnicas preferidas para el procesamiento posterior de virus auxiliares, tales como adenovirus, emplean procedimientos cromatograficos de intercambio ionico para la purificacion de virus auxiliar.

A modo de ilustracion, el filtrado de adenovirus segun se describe anteriormente puede cargarse en una resina de intercambio anionico, tal como una resina de amino o imino con carga en N (p.ej., POROS 50 PI, o cualquier resina basada en DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria o PEI) en una columna de cromatograffa equilibrada con tampon (tal como TMEG, tambien designado en el presente documento como tampon de cromatograffa A: Tris 50 mM (pH 8,0), MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, 5% de glicerol).

La columna puede lavarse entonces con multiples volumenes de columna de TMEG (p.ej., 5-6 volumenes), seguido de multiples volumenes de lavado salino (p.ej., 5-6 volumenes de TMEG con NaCl 800 mM (tampon de cromatograffa B: 60% de TMEG y 40% de TMEG con NaCl 2 M). El adenovirus puede eluirse con TMEG con NaCl 1300 mM (35% de tampon de cromatograffa A y 65% de tampon de cromatograffa B).

El pico de adenovirus puede identificarse en las fracciones mediante un ensayo de infectividad o mediante una hibridacion de acido nucleico o inmunoensayo, segun se ha descrito en la literatura. El pico puede esterilizarse por filtracion a traves de un filtro esteril de 0,2 pm. Opcionalmente, el pico puede concentrarse mediante filtracion de flujo tangencial, por ejemplo en una unidad Filtron Ultrasette o Millipore Pellicon. El pico o concentrado puede diafiltrarse en este sistema en un tampon adecuado, tal como PBS + 5% de sacarosa. Alternativamente, el adenovirus puede dejarse en el tampon de elucion. El producto de adenovirus final puede esterilizarse por filtracion a traves de un filtro de 0,2 pm y almacenarse para su uso. Segun se describe e ilustra en el presente documento, puede emplearse tambien un virus auxiliar termosensible (tal como un adenovirus termosensible).

Se proporcionan a continuacion con fines de ilustracion adicional ejemplos que describen la preparacion y uso de dichos virus auxiliares.

Tecnicas de produccion y purificacion de AAV preferidas para uso en la presente invencion

Como con los virus auxiliares, es conveniente con fines de ilustracion dividir el examen de la produccion y purificacion de AAV en fases de proceso “anteriores” y “posteriores”, designando el proceso “anterior” generalmente la produccion de AAV en celulas huespedes adecuadas y la liberacion o retirada del virus de las celulas para

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producir una preparacion de AAV “bruta”. El procesamiento “posterior” puede emplearse para purificar el preparado de AAV (p.ej., para aislar el AAV de protemas celulares y/u otros contaminantes).

En aspectos preferidos de la presente invencion, se realiza el procesamiento anterior y posterior de AAV de una manera disenada para reducir sustancialmente y/o eliminar las protemas celulares contaminantes, asf como cualquier virus auxiliar contaminante (p.ej. Ad) o protemas de virus auxiliar, cualquiera de las cuales podna contribuir a la provocacion de una respuesta inmunitaria si estuvieran presentes a niveles sustanciales en el preparado final de vector de rAAV a usar para transferencia genica.

Las siguientes secciones describen, con fines de ilustracion, tecnicas que pueden emplearse para la produccion de AAV.

(i) Procesamiento anterior de AAV

El vector de AAV puede producirse a partir de una lmea celular de mairnfero que contiene los genes de empaquetamiento de AAV necesarios (p.ej., un gen rep y cap de AAV); un provector de AAV recombinante (rAAV) que comprende un polinucleotido no de AAV heterologo flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR) de AAV; y un virus auxiliar para AAV (p.ej., un adenovirus). Estos componentes pueden introducirse en la celula en una variedad de configuraciones, segun se describe mas arriba y se ilustra mas abajo. Puesto que el AAV se puede replicar y empaquetar en una variedad de celulas de mai^ero, hay un gran numero de lmeas celulares que pueden modificarse y emplearse para la produccion de AAV.

A modo de ilustracion, el vector de AAV puede producirse a partir de una lmea celular tal como “C12” (segun se describe por K.R. Clark et al., Gene Therapy, 3:1124-1132,1996) o la lmea "C137.5" (descrita en una solicitud en tramitacion y de propiedad comun con la presente de Targeted Genetics Corporation, J. Allen et al., WO 96/17947), que se ha modificado por ingeniena genetica para contener un constructo de rep y/o cap, asf como un constructo de vector. Opcionalmente, se puede transfectar una lmea celular tal como C12 o c137 que contiene un constructo de rep y/o uno de cap con un plasmido que contiene un constructo de vector tal como ptgAAV-CF. O puede transfectarse una celula con un plasmido que contiene rep y cap, tal como pRS5, asf como un plasmido que contiene un constructo de vector. La celula puede infectarse con adenovirus o transfectarse con ADN que contiene genes de adenovirus.

Puede generarse una variedad de dichas celulas “productoras” de AAV, segun se describe en las referencias citadas en el presente documento y en la literatura.

Las celulas productoras de AAV pueden cultivarse condiciones (incluyendo medios, temperatura y similares) que son generalmente adecuadas para el crecimiento de celulas de mai^ero, y que son generalmente tambien permisivas de replicacion de AAV. Por ejemplo, se prefiere el medio de suspension DMEM/F12 para el crecimiento de celulas y se prefiere el medio DMEM solo para la produccion de vector de AAV. Segun se conoce en la materia, algunos tipos celulares y lmeas celulares tienden a ser dependientes de union, mientras que otros son capaces de crecimiento en suspension y muchas celulas dependientes de union pueden “adaptarse” tambien al crecimiento en suspension mediante ciclado de las celulas en condiciones de suspension como medio para enriquecer en y seleccionar en ultima instancia variantes que sean capaces de crecimiento en suspension. Por consiguiente, el cultivo de celulas para la produccion de AAV puede realizarse en cualquiera de una variedad de recipientes, dependiendo en parte de si la lmea productora seleccionada es relativamente dependiente de union o esta adaptada a suspension. Dichos recipientes para el crecimiento de celulas dependientes de union incluyen, por ejemplo, matraces de cultivo tisular, botellas roller, microportadores y biorreactores (tales como biorreactores de fibra hueca, de lecho empaquetado o lecho fluidificado). Los recipientes para lmeas celulares de marnffero adaptadas a suspension incluyen, por ejemplo, matraces spinner, tanques de reaccion y fermentadores de levantamiento por aire.

La replicacion de AAV transcurre durante un periodo de tiempo asf como hasta un punto del ciclo de crecimiento en que la produccion vmca es optima, preferiblemente con crecimiento logantmico de medio a tardfo (tfpicamente de uno a tres dfas), tras lo cual las celulas pueden recolectarse y lisarse para liberar el virus de progenie. Por ejemplo, las celulas se pueden resuspender en medios de crecimiento a aproximadamente 1-10x106 celulas/mL, y dejar producir durante 48 horas. Entonces se pueden recolectar las celulas (p.ej., mediante centrifugacion) y resuspender en tampon (p.ej., TMEG (o “tampon de cromatograffa A”) : Tris 50 mM, pH 8,0, MgCl2 5 mM, EDtA 1 mM, 5% de glicerol) a aproximadamente 1-10 x 106 celulas/mL.

El AAV puede replicar a un alto numero de copias (p.ej., 105-106 genomas/celula) en celulas transducidas si las protemas Rep de AAV y funciones de virus auxiliar necesarias se proporcionan con relativa simultaneidad. Si se proporcionan tambien protemas Cap, las partmulas de AAV se ensamblan en el nucleo de las celulas infectadas, donde tienden a ensamblarse en matrices cristalinas. La primera etapa en la recuperacion de producto es por lo tanto la disgregacion celular. Aunque pueden usarse congelacion-descongelacion y/o sonicacion para disgregar las celulas (como con adenovirus), dichas tecnicas no son muy adecuadas para la preparacion a gran escala. Es por tanto preferible a este respecto la lisis mecanica, usando tecnicas tales como microfluidificacion. Pueden emplearse tambien detergentes y otros agentes qmmicos para mediar o facilitar la lisis. Se ha encontrado que el tratamiento de

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lisados con nucleasas (tales como benzonasa) es provechoso para reducir la viscosidad y mejorar la filtrabilidad. La clarificacion, por ejemplo mediante microfiltracion para separar el vector de al menos una porcion del desecho celular, es tambien provechosa para promover la recuperacion y la purificacion.

A modo de ilustracion, las celulas pueden lisarse mecanicamente despues del periodo de incubacion mediante pasada secuencial a traves de un microfluidificador (ffpicamente aproximadamente a 8000 psi usando dos pasadas). Otras tecnicas empleadas comunmente incluyen ciclos de congelacion-descongelacion y sonicacion, como es conocido en el estado de la tecnica. El lisado puede tratarse tambien con una nucleasa para degradar el acido nucleico (tal como acido nucleico celular o vffico) que no esta eficazmente “protegido” gracias a estar empaquetado en una parffcula vffica. Se emplea ffpicamente digestion con benzonasa durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. Tambien se puede clarificar el lisado. Los procedimientos para clarificacion incluyen paso a traves de un filtro, tal como un filtro de 1,0 pm, y centrifugacion.

Se puede emplear beneficiosamente la filtracion de flujo tangencial (TFF) para procesar y recolectar grandes volumenes de celulas. La TFF puede usarse para perfundir, concentrar y recolectar celulas animales. Por ejemplo, la TFF puede usarse para procesar celulas en condiciones de flujo laminar a tasas de cizallamiento de pared medias de hasta 3000 por segundo (ver, p.ej., Maiorella, B., et al., Biotechnology and Bioengineering, 37:121-126, 1991). La concentracion a gran escala de virus usando ultrafiltracion TFF se ha descrito por R. Paul et al. Human Gene Therapy,4:609-615,1993.

Se describen mas abajo marchas de produccion ilustrativas que emplean dichas tecnicas.

(ii) Procesamiento posterior de AAV

Segun se describe mas arriba, seffa particularmente ventajoso obtener preparaciones de AAV que estuvieran sustancialmente exentas de parffculas de virus auxiliar (tales como parffculas de Ad). Ademas, las preparaciones de vector de AAV estaran tambien preferiblemente exentas de protemas de virus auxiliares y celulares (que tambien pueden ser inmunogenicas). Sin embargo, hay un conjunto adicional de limitaciones que influyen en la idoneidad de las tecnicas para la produccion de AAV. A saber, para que sean particularmente utiles para la produccion de AAV para terapia genica, lo mas deseable es que las tecnicas sean “escalables”, es decir, aplicables junto con dispositivos y procedimientos de fabricacion a gran escala. Este ultimo conjunto de limitaciones reduce o elimina de hecho la utilidad de las tecnicas estandares disponibles tales como separacion con cloruro de cesio (que no es adecuada para procedimientos de preparacion a gran escala).

Hemos descubierto una combinacion de procedimientos que son tanto escalables como notablemente eficaces para la generacion de preparaciones de AAV que estan sustancialmente exentas de parffculas de virus auxiliares, asf como de protemas de virus auxiliares y celulares y otros de tales contaminantes. Nuestra combinacion preferida de procedimientos emplea procedimientos cromatograficos de intercambio de iones, lo que contrasta con diversos procedimientos mencionados en la literatura para la purificacion potencial de, p.ej., AAV o Ad. En particular, tales procedimientos segun se describen en la literatura emplean ffpicamente un solo tipo de separacion ionica, a veces en combinacion con otras clases de procedimientos cromatograficos (ver, p.ej., K. Tamayose et al., Human Gene Therapy 7:507-513 (1996) y WO96/27677, 12 de septiembre de 1996). Sin embargo, en el caso de la produccion de AAV, hemos encontrado que una combinacion de cromatograffa de intercambio ionico secuencial opuesto es particularmente eficaz para la generacion de preparaciones de AAV que estan sustancialmente exentas de parffculas y protemas de virus auxiliares, asf como de protemas celulares.

A la vista de estos descubrimientos, parece que el AAV no solo esta “adaptado” tanto a la cromatograffa de intercambio de aniones como de cationes, sino que dicha combinacion de ambos intercambios ionicos opuestos es particularmente eficaz para eliminar todos los contaminantes diversos de parffculas y protemas que aparecen ffpicamente en la generacion de preparados de vector de AAV. Se puede emplear cualquiera de una variedad de resinas de intercambio de cationes y de aniones junto con estos procedimientos, cuyas propiedades fundamentales son la disponibilidad de grupos cargados negativa y positivamente, respectivamente, con los que el AAV puede unirse al menos en cierto grado (lo mas preferiblemente en un grado que difiere sustancialmente de la afinidad de union relativa de uno o mas de los contaminantes referidos mas arriba, es decir parffculas y protemas de Ad, asf como protemas celulares de mamffero). Sin desear estar obligado por teoffa alguna, se cree que la etapa de intercambio de aniones es particularmente eficaz para separar el AAV del adenovirus, mientras que se cree que ambas etapas (pero especialmente la etapa de intercambio de cationes) son particularmente eficaces para separar el AAV de las protemas celulares. Tambien hemos empleado intercambio de aniones seguido de filtracion de flujo tangencial, segun se describe e ilustra mas abajo. Segun se describe adicionalmente mas abajo, hemos encontrado que las preparaciones de AAV pueden concentrarse considerablemente mediante cromatograffa en sulfato de heparina.

A modo de ilustracion, puede cargarse un lisado de AAV clarificado, segun se describe mas arriba, en una columna de intercambio de aniones cargada positivamente tal como una resina de amino o imino N-cargada (p.ej., POROS 50 PI o cualquier resina basada en DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria o PEI) o una columna de intercambio de cationes cargada negativamente (tal como HS, SP, CM o cualquier resina cationica basada en sulfo-, fosfo- o

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carboxi-). La columna puede lavarse con un tampon (tal como el tampon de cromatograffa A/TMEG). La columna puede eluirse con un gradiente de concentracion creciente de NaCl y las fracciones pueden recogerse y ensayarse la presencia de AAV y/o contaminantes.

Se pueden usar otros procedimientos en lugar de o, preferiblemente, ademas de los procedimientos de intercambio de aniones y de cationes descritos mas arriba, basados en asociaciones intermoleculares mediadas por rasgos distintos de la carga como se conoce en el estado de la tecnica. Dichos otros procedimientos incluyen asociaciones intermoleculares basadas en pares de ligando-receptor (tales como interacciones anticuerpo-anffgeno o lecitina- carbohidrato), asf como separaciones basadas en otros atributos de las moleculas, tales como cromatograffa de tamizado molecular basado en tamano y/o forma. Por tomar un unico ejemplo, se puede cargar el preparado de AAV filtrado o parcialmente purificado en una columna que contiene un anticuerpo espedfico de aAv. Esta columna puede unirse a AAV. La columna puede aclararse con tampon para retirar las protemas contaminantes y eluirse entonces con un gradiente o etapa de concentracion creciente de NaCl, y pueden recogerse las fracciones. Alternativamente, dicha columna puede eluirse con un tampon de pH diferente al del tampon de carga.

Los picos de AAV y adenovirus pueden identificarse en las fracciones mediante ensayos de infectividad o mediante una hibridacion de acido nucleico o inmunoensayos. Los picos pueden agruparse y el conjunto puede diluirse o dializarse o diafiltrarse con un tampon (p.ej., TMEG o equivalente) para reducir la concentracion salina.

Este conjunto puede inyectarse en una columna de intercambio de aniones cargada positivamente y/o en una columna de intercambio de cationes cargada negativamente (tales como las consideradas mas arriba). La columna se puede lavar con un tampon (tal como tampon de cromatograffa A/TMEG). La columna se puede eluir con un gradiente de concentracion creciente de NaCl y pueden recogerse las fracciones. Los picos de AAV y adenovirus pueden identificarse en las fracciones mediante un ensayo de infectividad o mediante una hibridacion de acido nucleico o inmunoensayo. Los picos pueden agruparse basandose en los resultados de cualquiera de estos ensayos.

El conjunto de fracciones que contienen AAV, eluidas de una columna de intercambio de aniones segun se describe mas arriba, se puede concentrar y purificar mediante filtracion de flujo tangencial (TFF), por ejemplo en una unidad Filtron Ultrasette o Millipore Pellicon. Una membrana de corte de peso molecular adecuado (tal como un corte de 100.000 o 300.000) se compone ffpicamente de un polfmero tal como una celulosa regenerada o polietersulfona. La preparacion se filtra a traves de la membrana y se retiene el producto. El material retenido puede diafiltrarse usando la membrana con lavados sucesivos con un tampon adecuado tal como disolucion salina equilibrada de Ringer + 5% de glicerol. La muestra final esta altamente enriquecida en producto y puede esterilizarse por filtracion a traves de un filtro de 0,2 pm y almacenarse para su uso.

En la purificacion y concentracion de AAV por filtracion de flujo tangencial de material post-columna de intercambio de aniones, la membrana de corte de peso molecular de 300.000 ha dado como resultado mayores rendimientos de unidades replicativas que la membrana de corte de peso molecular de 100.000.

Una etapa adicional que puede emplearse para la retirada del adenovirus, si se desea, implica tratar el conjunto de eluyentes con una etapa de inactivacion termica (segun se describe en el presente documento) y luego filtrarlo (p.ej., antes de someter la preparacion a TFF). Sin embargo, hemos encontrado que el procedimiento de “intercambio de aniones a TFF” descrito mas arriba daba como resultado una preparado de AAV que estaba exenta de adenovirus libres detectables y daba como resultado mejores rendimientos de AAV purificado.

Se describen mas abajo marchas de produccion ilustrativas que emplean dichas tecnicas.

Alteracion de las condiciones de crecimiento de las celulas productoras de AAV para potenciar la produccion

Durante el transcurso de los ensayos de produccion con AAV en diversos medios y recipientes de cultivo, ffpicamente hemos monitorizado los cultivos con respecto a diversos parametros de crecimiento y/o metabolicos tales como densidad celular, disponibilidad de glucosa y aminoacidos y produccion de subproductos metabolicos tales como amoniaco y acido lactico. Dichos componentes pueden monitorizarse facilmente usando tecnicas estandares tales como HPLC y ensayos enzimaticos, segun se describen en el estado de la tecnica.

Segun se describe en los ejemplos mas abajo, se descubrio que ciertos aminoacidos, particularmente aspartato y glutamato, se agotaban rapidamente tanto en cultivos en lotes como de perfusion. Es mas, en diversos experimentos en lotes y de perfusion hemos observado que se elimina sustancialmente de 90 a 99% del asp y glu disponibles despues de 24 a 48 horas en dichos cultivos. Puesto que los niveles de asp y glu paredan ser suboptimos en dichos medios, hemos proporcionado por lo tanto cantidades adicionales de cualquiera o ambos aminoacidos. Se han aplicado rutinariamente tecnicas de mantenimiento y optimizacion de cultivos tales como estas en el contexto de bioproduccion a gran escala (veanse, por ejemplo, Glacken, M.W.. et al., Biotechnology and Bioengineering, 28:1376-1389, 1986; Glacken, M.W., Bio/Technology 6:1041-1050, 1988; Bibila, T.A., et al., Biotechnol. Prog.,10:87- 96, 1994; y Borys, M.C., et al., Biotechnology and Bioengineering, 43:505-514, 1994).

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Para nuestra sorpresa, la reposicion de estos aminoacidos agotados dio como resultado una brusca cafda de la produccion de aAv. Por ejemplo, en los experimented descritos mas abajo, suplementar el medio estandar (DMEM) con asp y glu adicionales reduda la eficacia de produccion en mas de un orden de magnitud (de aproximadamente 1800 partteulas resistentes a DNasa (DRP) por celula a aproximadamente 140 DRP por celula), aunque se potenciaba ligeramente la viabilidad.

Otro componente comun de los medios para el crecimiento de celulas productoras de mairnfero es el componente serico, tal como suero fetal bovino (FBS), que se incluye tfpicamente en los medios a un nivel de aproximadamente un 10%. Segun se describe mas abajo, cuando se aumentaba el nivel serico para la produccion de AAV (al 20%), la produccion de vector de AAV cafa mas de 2 veces. En contraposicion, cuando las celulas se sometfan a niveles crecientemente menores de suero, la produccion de vector de aAv aumentaba drasticamente. Por ejemplo, cuando los niveles de suero se redudan a un decimo de los niveles de partida normales (es decir al 1%), la produccion de vector aumentaba en mas de 4 veces.

Sin desear estar obligado por teona alguna, parece ahora que estresar las celulas productoras, metabolicamente o por otros medios segun se describen mas abajo, puede potenciar drasticamente la produccion de vector de AAV.

El estres puede caracterizarse eficazmente, y ensayarse, basandose en el efecto negativo de la condicion estresante o agente estresante sobre el crecimiento y/o el metabolismo celular. En efecto, puede conseguirse estres mediante la introduccion de cualquier condicion o agente que inhiba el crecimiento y/o el metabolismo celular, o alterando el nivel de una condicion o agente preexistente de tal modo que se vuelva suboptimo con respecto al crecimiento y/o metabolismo celular. Se conocen y/o son evidentes una amplia variedad de dichas condiciones incluyendo estres nutricional (uno o mas nutrientes presentes a niveles suboptimos para el crecimiento y/o el metabolismo), estres termico (temperatura suboptima, que puede incluir el crecimiento de celulas a temperaturas menores o mayores, o someter las celulas a choques termicos temporales tales como un choque frte o choque caliente), estres osmotico (nivel osmotico suboptimo, que puede ser hipoosmotico o hiperosmotico), estres de pH (pH suboptimo que puede ser acido o alcalino), estres de aireacion (p.ej., niveles suboptimos de oxfgeno o intercambio de gas), estres mecanico (p.ej., estres de cizallamiento como ocurre en el mezclado de cultivo), estres de radiacion y estres toxico (presencia de uno o mas productos qmmicos u otros agentes que inhiben el crecimiento y/o el metabolismo). Con la mayona, si no todos dichos agentes y condiciones, es posible someter las celulas a estres continua o temporalmente. A modo de ilustracion, en el caso de estres termico, las celulas pueden crecer a temperaturas que estan por encima o por debajo del optimo (tfpicamente, el optimo es aproximadamente la temperatura corporal normal del animal del que derivan las celulas), o las celulas pueden someterse a un choque termico temporal, tal como un choque frte o un choque caliente. Los ejemplos actualmente preferidos de dichas condiciones de estres incluyen: estreses nutricionales tales como limitacion de aminoacidos o suero, alteracion de los niveles de aireacion y agitacion, alteracion de los niveles osmoticos (p.ej., usando carbohidratos no metabolizables tales como sorbitol) e inclusion de agentes qmmicos tales como acidos carboxflicos alifaticos saturados (p.ej., acidos propionico, butmco, isobutrnco, valerico y caproico y sus sales con bases organicas o inorganicas), diaminas N,N'-diaciladas (tales como pentametilenbisacetamida, hexametilenbisacetamida y heptametilenbisacetamida), compuestos sulfurados organicos (tales como dimetilsulfoxido) y glucocorticoides (tales como hidrocortisona dexametasona, prednisolona, aldoesterona, triamcinolona y cortexolona). Otros de dichos agentes incluyen agentes genotoxicos tales como carcinogenos qmmicos, UV, choque caliente, inhibidores metabolicos de la smtesis de ADN (p.ej., hidroxiurea, metotrexato, afidicolina, farmacos que afectan a las topoisomerasas (p.ej., amsacrina, camptecina, etoposido y novobiocina).

Segun se ha observa mas arriba, las celulas productoras pueden ser sometidas tambien a un estres subletal alterando el pH. Segun se ejemplifica a continuacion, hemos encontrado que el estres de pH inducido elevando el pH del medio no solo aumentaba el AAV, sino que causaba tambien un drastico desplazamiento de las proporciones relativas de AAV que se liberaban al medio de cultivo. Segun se describe adicionalmente a continuacion, esta tecnica puede usarse por tanto para facilitar la purificacion de AAV asf como para potenciar la produccion.

Se proporcionan mas abajo procedimientos ilustrativos para optimizar la produccion de AAV empleando diversas condiciones de estres, asf como resultados que demuestran que la aplicacion de una variedad de diferentes condiciones de estres se puede usar para potenciar eficazmente los niveles de produccion de AAV.

Uso de rAAV para terapia genica

Se describen en el presente documento composiciones de vector que comprenden polinucleotidos con una secuencia genetica terapeuticamente relevante. Los vectores vmcos de AAV de esta publicacion pueden usarse para administracion a un individuo con fines de terapia genica. Las enfermedades adecuadas para terapia genica incluyen, pero sin limitacion, aquellas inducidas por infecciones vmcas, bacterianas o parasitarias, diversas malignidades y afecciones hiperproliferativas, afecciones autoinmunes y deficiencias congenitas.

La terapia genica puede realizarse para potenciar el nivel de expresion de una protema particular, ya sea dentro de una celula o secretada por ella. Los vectores descritos en este documento se pueden utilizar para alterar

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geneticamente las celulas, ya sea para marcaje genico, reposicion de un gen que falta o es defectivo o insercion de un gen terapeutico. Alternativamente, puede proporcionarse un polinucleotido a la celula que reduzca el nivel de expresion. Esto puede utilizarse para la supresion de un fenotipo indeseable, tal como el producto de un gen amplificado o sobreexpresado durante el transcurso de una malignidad, o un gen introducido o sobreexpresado durante el transcurso de una infeccion microbiana. Los niveles de expresion pueden reducirse suministrando un polinucleotido terapeutico que comprenda una secuencia capaz de formar, por ejemplo, un hnbrido estable con el gen diana o transcrito de ARN (terapia anticodificante), capaz de actuar como ribozima para escindir el ARNm relevante o capaz de actuar como reclamo de un producto del gen diana.

Es de particular interes la correccion del defecto genetico de la fibrosis qrnstica suministrando un regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qrnstica (CFTR) apropiadamente funcional al epitelio respiratorio. Afione et al. (J. Virol. 70:3235, 1996) y Conrad et. al. (Gene Therapy: en prensa, 1996) han mostrado una transferencia genica in vivo estable de CFTR a pulmon de primate usando vectores de AAV monodosis. Existe una variedad de polipeptidos de CFTR que son capaces de reconstruir las deficiencias funcionales de CFTR en celulas derivadas de pacientes de fibrosis qrnstica. Rich et al., Science, 253:205 (1991) describieron un derivado de CFTR en el que faltaban los residuos aminoaddicos 708-835 que era capaz de transportar cloruro y capaz de corregir un defecto de CFTR de origen natural. Egan et al.. Nature,358:581 (1992) describieron otro derivado de CFTR (que comprende aproximadamente 25 aminoacidos de una protema no relacionada seguidos de la secuencia de CFTR nativa partiendo del residuo 119) que tambien era capaz de restaurar las caractensticas electrofisiologicas del CFTR normal. Arispe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1539 (1992) mostraron que un fragmento de CFTR que comprende los residuos 433-586 era suficiente para reconstituir un canal de cloruro correcto en bicapas lipfdicas. Sheppard et al., Cell 76:1091 (1994) mostraron que un polipeptido de CFTR truncado en el residuo 836 a aproximadamente la mitad de su longitud segrna siendo capaz de formar un canal de cloruro regulado. Por tanto, se prefieren los vectores de AAV con secuencias de codificacion de protema CFTR nativa y los mutantes y fragmentos de la misma.

Es tambien de interes particular la correccion del gen supresor tumoral p53, localmente defectivo en ciertos tipos de tumor, suministrando un gen p53 apropiadamente funcional al sitio tumoral (Huyghe et al., Human Gene Therapy 6:1403, 1995).

Las composiciones descritas en este documento se pueden utilizar in vivo asf como ex vivo. La terapia genica in vivo comprende administrar los vectores descritos en este documento directamente a un sujeto. Las composiciones farmaceuticas pueden suministrarse como soluciones lfquidas o suspensiones, como emulsiones o como formas solidas adecuadas para disolucion o suspension en lfquido antes del uso. Para administracion en el tracto respiratorio, un modo preferido de administracion es mediante aerosol, utilizando una composicion que proporciona un aerosol solido o lfquido cuando se usa con un dispositivo de aerosol apropiado. Otro modo preferido de administracion en el tracto respiratorio es usando un broncoscopio de fibra optica flexible para instilar los vectores. Tfpicamente, los vectores vmcos estan en un tampon exento de pirogenos farmaceuticamente aceptable tal como disolucion salina equilibrada de Ringer (pH 7,4). Aunque no es necesario, las composiciones farmaceuticas pueden suministrarse opcionalmente en forma de dosificacion unitaria adecuada para la administracion de una cantidad precisa.

Se administra una cantidad eficaz de virus dependiendo de los objetivos del tratamiento. Puede procurarse una dosis eficaz en dosis unica o divididas. Cuando un bajo porcentaje de transduccion puede curar una deficiencia genetica, entonces el objetivo del tratamiento es generalmente satisfacer o superar este nivel de transduccion. En algunos casos, este nivel de transduccion puede conseguirse mediante la transduccion de solo aproximadamente 1 a 5% de las celulas diana, pero es mas tfpicamente un 20% de las celulas del tipo de tejido deseado, habitualmente al menos aproximadamente un 50%, preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 95% e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de las celulas del tipo de tejido deseado. Como grna, el numero de partmulas de vector presentes en una dosis unica procurada por broncoscopio sera generalmente de al menos aproximadamente 1 x 108, y es mas tfpicamente de 5 x 108, 1 x 1010 y en algunas ocasiones 1 x 1011 partmulas, incluyendo tanto partmulas resistentes a DNAsa como sensibles a DNAsa. En terminos de partmulas resistentes a DNAsa, la dosis sera generalmente entre 1 x 106 y 1 x 1014 partmulas, mas generalmente entre aproximadamente 1 x 108 y 1 x 1012 partmulas. El tratamiento puede repetirse tan a menudo como cada dos o tres semanas, segun sea necesario, aunque puede ser suficiente un tratamiento una vez cada 180 dfas.

La eficacia de la alteracion genetica puede monitorizarse mediante varios criterios. Muestras retiradas por biopsia o extirpacion quirurgica pueden analizarse mediante hibridacion in situ, amplificacion por PCR usando sondas espedficas de vector, proteccion de RNAsa, inmunohistologfa o recuento celular por inmunofluorescencia. Cuando el vector se administra mediante broncoscopia, pueden efectuarse ensayos de la funcion pulmonar, y puede valorarse en el lavado bronquial la presencia de citocinas inflamatorias. En el sujeto tratado pueden monitorizarse tambien los rasgos clmicos, y determinar si las celulas expresan la funcion que se pretende transmitir mediante el polinucleotido terapeutico.

La decision de si usar terapia in vivo o ex vivo, y la seleccion de una composicion, dosis y via de administracion

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particular dependera de una serie de diferentes factores incluyendo, pero sin limitacion, los rasgos de la afeccion y el sujeto que se esta tratando. La valoracion de dichos rasgos y el diseno de un regimen terapeutico apropiado son en ultima instancia responsabilidad del facultativo que prescribe.

La descripcion anterior proporciona, entre otros, procedimientos para generar preparados de tftulo alto de vectores de AAV recombinante que estan sustancialmente exentas de virus auxiliares (por ejemplo adenovirus) y de protemas celulares. Se entiende que los expertos en la materia pueden aplicar variaciones a estos metodos sin abandonar el esprntu de la presente invencion.

Los ejemplos presentados a continuacion se proporcionan como grna adicional para un profesional de habilidad corriente en la materia y no se pretende que sean limitantes en modo alguno.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Produccion ilustrativa de vector de AAV recombinante utilizando un virus auxiliar de tipo natural (Ad5) y un virus auxiliar termosensible (Ad ts149)

Este ejemplo ilustra el uso de un virus auxiliar de tipo natural (Ad5) y un virus auxiliar termosensible (Ad ts149) para proporcionar funciones auxiliares para la replicacion de una partfcula de vector de AAV recombinante que comprende un gen terapeutico modelo.

El plasmido ptgAAVCF consiste en la ITR de AAV2 izquierda; un cDNA regulador transmembrana de fibrosis qrnstica completo; una secuencia de poliadenilacion sintetica basada en la secuencia de poliadenilacion 13-globina de raton; secuencias de AAV2 secuencia abajo de las secuencias de codificacion de cap; y la ITR de AAV2 derecha en un esqueleto de plasmido pBR322 (Afione et al., 1996). El plasmido de empaquetamiento pGEM-RS5 se derivo del plasmido pHIV rep (Antoni et al., 1991) y consiste en las regiones U3 y R de lTr de VIH-1; las regiones rep y cap de AAV2 incluyendo los promotores p19 y p40; secuencias de plasmidos pBR322 y pGEM para replicacion y seleccion bacteriana; y una pequena region de ADN celular repetitivo Alu humano secuencia arriba de la LTR de VlH.

El adenovirus de tipo 5 se cultivo a partir de una disolucion madre obtenida de la American Type Culture Collection (Rockville, Md). El Ad5ts149 (Ensinger et al., J. Virol. 10:328,1972) se obtuvo de Harold S. Ginsberg.

Se produjeron disoluciones madre de trabajo de Ad5 y Ad5ts149 (ts149) a 37 °C y 32 °C, respectivamente, infectando celulas 293-1 a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 5 y 1, respectivamente. Despues de 4 horas, se volvieron a alimentar los cultivos con medio reciente y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 10% de CO2. Despues de 72 horas, se retiraron las celulas, se compactaron a 1000 g a 15 °C y se resuspendieron en PBS que contema MgCh 0,1 g/L y CaCh 0,1 g/L. Se congelo y descongelo entonces la suspension celular tres veces, se cizallo tres veces a traves de una aguja de calibre 18 y se clarifico mediante centrifugacion a 1000 g a 15 °C. El lisado clarificado se trato entonces con DNasa I a una concentracion final de 2 mg/mL durante 30 minutos a 37 °C. El lisado tratado se deposito en capas sobre un gradiente de etapa discontinua de CsCl en agua que comprendfa 4,0 mL de CsCl (1,25 g/cm3) en una capa sobre 2,0 mL de CsCl (1,40 g/cm3) en agua y se centrifugo a 35.000 rpm durante 1 a 2 horas en un rotor Beckman SW41. Se retiro la banda de adenovirus de cada tubo, se agrupo, se diluyo en CsCl a 1,35 g/cm3 en agua y se centrifugo durante una noche a 35.000 rpm en un rotor Beckman SW55. Se agrupo la banda de adenovirus, se ajusto a 10% de glicerol y se dializo extensamente frente a tampon Tris 10 mM a pH 7,5 suplementado con MgCl2 1,0 mM y 10% de glicerol.

Se mantuvieron celulas 293-1 (ATCC CRL 1573) en matraces de cultivo tisular en una incubadora humidificada con 10% de CO2 en medio DMEM rico en glucosa (JRH) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Hyclone). Para este ejemplo, se inocularon las celulas 293-1 a 4,4 x 104 celulas/cm2 en matraces de cultivo de tejido con DMEM suplementado con 10% de FBS y L-glutamina 2,0 mM y se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con 10% de CO2.

Se infectaron entonces las celulas (aproximadamente 107 celulas por matraz) con disoluciones madre de trabajo de Ad5 o ts149 durante 1 hora a una MOI de 5, seguido de la transfeccion transitoria plasmidos de vector y de empaquetamiento. Se efectuo la cotransfeccion transitoria de plasmido del vector ptgAAVCF y plasmido del auxiliar pGEM-RS5 utilizando LIPOFECTAMINE™ (Gibco). En ese proceso, se mezclaron 37,5 |jg de cada plasmido junto con 150 jl de LIPOFECTAMINE™ y se diluyeron en 4,75 mL de MEM exento de suero. Se retiro el inoculo de adenovirus y la mezcla de plasmido-LIPOFECTAMINE™ se anadio a las celulas y se incubo durante 4 horas en una incubadora con 5% de CO2 a la temperatura apropiada. Se retiro la mezcla de plasmido-LIPOFECTAMINE™ del cultivo despues de 4 horas y se reemplazo por medio reciente.

Se cultivaron celulas infectadas con virus de tipo natural a 37 °C y se incubaron celulas infectadas con Adts149 a 39,5 °C. Despues de 72 horas, se recolectaron las celulas, se compactaron y se resuspendieron en Tris 10 mM a pH 7,5. La suspension se liso entonces mediante sonicacion en un bano de agua y hielo usando un sonicador de copa y

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husillo de Branson utilizando 4 pulsos de 15 segundos y se ensayo el rAAVCF y la produccion de adenovirus. EJEMPLO 2

Cuantificacion de los tftulos de rAAV y de adenovirus en preparados de vector

Se ensayo en lisados celulares del ejemplo precedente la produccion del vector rAAVCF mediante el ensayo de replicacion de C37 y se analizo la produccion de adenovirus mediante hibridacion slot-blot.

Se construyo C37 de HeLa para permitir la expresion inducible de protemas Rep de AAV para la replicacion de vector de rAAV. Brevemente, se construyo una casete de expresion de Rep/Cap de AAV consistente en el promotor de metalotionema I de raton, los genes rep y cap de AAV2 y el sitio de terminacion de la transcripcion de AAV. Se incluyo tambien en el plasmido un gen de resistencia a neomicina bajo el control del promotor temprano de SV40, el intron T pequeno de SV40 y la senal de poliadenilacion de SV40. Se transfectaron celulas HeLa con el plasmido y se seleccionaron los clones en G418. Se cribo un panel de clones mediante un ensayo de amplificacion de vector de rAAV. Un clon, C37, demostro una amplificacion consistente y dependiente de la dosis de vector de rAAV despues de la transduccion e infeccion con adenovirus.

La deteccion del vector replicante se logra mediante aislamiento de ADN seguido de hibridacion con una sonda de CFTR. Detalladamente, se inocularon celulas C37 de HeLa a 4,4 x 104 celulas/cm2 en matraces de cultivo tisular con DMEM suplementado con 10% de FBS y L-glutamina 2,0 mM y se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Se inocularon entonces las celulas con adenovirus (MOI= 5) y diluciones de muestra de rAAVCF durante 72 horas. Se recolectaron las celulas mediante raspado y se prepararon para analisis de transferencia Southern. Se preparo el ADN celular total, se digirio con EcoRI, se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 1%, se transfirio a una membrana de nailon 66, seguido de hibridacion con un fragmento de restriccion de cADN de CFTR humano marcado con 32P. Esta sonda detecta un fragmento de aproximadamente 1,5 kb del vector de AAVCF (correspondiente al fragmento EcoRI predicho de 1,488 kb). Se cuantifico la replicacion del vector respecto a una banda de CFTR genomico endogeno y se expresa como unidades de replicacion. Se define una unidad de replicacion (UR) como una intensidad de senal equivalente a la banda de CFTR genomico endogeno que es de aproximadamente 1,8 kb. En algunos experimentos, se uso una regresion lineal de patrones de vector conocidos diluidos en serie para extrapolar y calcular la concentracion de vector en las muestras.

Se realizo el ensayo de slot blot de ADN de adenovirus como sigue. Se desnaturalizaron alfcuotas de muestras en NaOH 0,4 M, EDTA 10 mM con ADN de esperma de salmon 1,0 pg/mL a 65 °C. Se diluyeron muestras y patrones de adenovirus y se filtraron por membranas de nailon utilizando un colector de slot blot y se lavaron con NaOH 0,4 M. Se hibrido el filtro con una sonda marcada con 32P correspondiente a la secuencia del gen E1A de adenovirus. El genoma de Ad5 completo esta disponible en Genbank con el numero de acceso X02996. Utilizamos un fragmento de Sspl-Xbal de 1 kb (correspondiente a los nucleotidos 339-1339) y analizamos las manchas en un Phosphorimager (Molecular Dynamics). Se considero que un equivalente genomico era equivalente a una partfcula de adenovirus.

La Figura 1 muestra los resultados del ensayo de replicacion del vector de rAAVCF en lisados preparados con Ad5 o ts149 a temperaturas permisivas (37 °C) y no permisivas (39,5 °C). La produccion de vector recombinante se apoyo con ts149 a 39,5 °C, pero la productividad fue de aproximadamente 2 a 3 veces menor que con Ad5.

La Figura 2 muestra los resultados del ensayo de slot blot para determinar la cantidad de adenovirus. La produccion de genomas de adenovirus se redujo 3-4 unidades logantmicas por el uso de mutante termosensible en comparacion con el de tipo natural.

EJEMPLO 3

Optimizacion de la funcion auxiliar para mejorar la produccion de rAAV

Este ejemplo ilustra diversos intentos de mejorar el nivel de rAAV obtenido cuando se usan virus auxiliares termosensibles. Aumentar los niveles de infeccion del virus auxiliar no fue provechoso, pero ajustar la cinetica fue sorprendentemente eficaz.

Se evaluaron primero los efectos de aumentar la multiplicidad de infeccion sobre la produccion de vector. Se infectaron celulas 293-1 con Ad5 a una MOI de 5 o con ts149 a diversas MOI, seguido de cotransfeccion transitoria con plasmidos de vector y empaquetamiento. Despues de 72 horas, se lisaron las celulas y se ensayo la produccion de vector de rAAVCF mediante el ensayo de replicacion de vector de C37 y se analizo la produccion de adenovirus mediante hibridacion slot blot. Se recogio un punto temporal adicional a las 96 horas para las celulas infectadas con ts149 a una MOI de 5.

La Figura 3 muestra los resultados del ensayo de replicacion de rAAVCF realizado en lisados celulares preparados con ts149 a diversas MOI. Aumentar la MOI de ts149 no recupero la productividad de vector a los niveles

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observados con Ad5 (segun muestra la intensidad de la banda de hibridacion de 1,4 kb). Sin embargo, se observo un mayor nivel de produccion de vector en el punto temporal de 96 horas. La concentracion de ts149 en el lisado detectada por el analisis de slot blot aumento al aumentar la MOI, pero siguio siendo de 3 a 4 unidades logantmicas menor en comparacion con Ad5.

Despues de la observacion de la productividad de vector aumentada con ts149 a las 96 horas en el experimento previo, se efectuo un estudio del transcurso temporal y de cinetica de produccion. Se infectaron celulas 293-1 con Ad5 o ts149 a una MOI de 5 seguido de cotransfeccion transitoria con plasmidos de vector y empaquetamiento. Se cultivaron las celulas infectadas con Ad5 y ts149 a 37 °C y 39,5 °C, respectivamente, durante 6 dfas. Se ensayo en los lisados de los dfas 3, 4, 5 y 6 la produccion de vector mediante un ensayo de replicacion de vector y se analizaron los adenovirus por hibridacion de slot blot.

La Figura 4 ilustra la cinetica de la produccion de vector. Las barras oscuras representan lisados producidos usando Ad5 de tipo natural como auxiliar; las barras claras representan lisados producidos usando ts149 como auxiliar. La produccion maxima de vector cuando se usaba Ad5 era ~2,0 x 106 UR/mL, siendo maxima el dfa 4. En este punto temporal, la produccion de vector obtenida usando ts149 era menor de ~0,3 x 106 UR/mL. Sin embargo, el dia 5, hubo una alteracion drastica de la eficacia relativa de los dos virus auxiliares. La produccion de vector apoyada por Ad5 cayo a menos de 0,3 x 106 UR/mL. En contraposicion, la produccion de vector apoyada por ts149 subio a mas de 2 x 106 UR/mL. Los niveles de genoma de adenovirus observados al utilizar ts149 fueron significativamente menores que con Ad5.

El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

EJEMPLO 4

Ensayo de tftulos vmcos y tecnicas de ensayo de alto rendimiento

Las disoluciones madre de adenovirus termosensibles y de tipo natural usadas en los ejemplos precedentes se produjeron en celulas 293-1 en matraces de cultivo tisular. En este ejemplo, los niveles de adenovirus producidos por celulas 293-1 se cuantificaron mediante el ensayo de punto final TCID50 o ensayo de infectividad.

El ensayo de TCID50 se realizo como sigue: se sembraron 1,0 x 103 celulas 293-1 en placas de microtitulacion de 96 pocillos, se infectaron con diluciones en serie de disolucion madre de adenovirus y se dejaron incubar a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Se inocularon 8 duplicados de 100 pi de cada dilucion en las celulas. Tres dfas despues de la infeccion, se fijaron las celulas con metanol, se lavaron con PBS y se tineron con anticuerpo anti-hexon conjugado con FITC (Biodesign) seguido de tincion con yoduro de propidio para visualizar los nucleos celulares. Despues de aclarar con PBS, se examino la placa con microscopio fluorescente y se puntuo la presencia de celulas que contienen hexones. Se calculo el titulo en el punto final usando una distribucion de Poisson. Una dilucion de virus que proporciona un 50% de muestras de duplicados positivos de hexones tiene 0,5 UI/100 pl de inoculo. El tttulo infeccioso es el producto de la inversa de esta dilucion, 0,5 UI/100 pl y 10 (factor de conversion a mL), dando el tftulo infeccioso final por mL.

Se realizo un ensayo de infectividad por microtitulacion de alto rendimiento para medir los virus infecciosos como sigue. Se inocularon alfcuotas (10 pl) de sobrenadantes exentos de celulas diluidos en serie en celulas HeLa crecidas en placas de microtitulacion de 96 pocillos. Despues de 3 dfas, se trataron las celulas infectadas y se lisaron con una disolucion de desnaturalizacion (adicion de un decimo de volumen de NaOH 4,0 M, ADN de esperma de salmon 10 pg/mL y EDTA 100 mM). Se transfirio el lisado a una placa Silent Monitor BiodyneB (Pall) y se filtro a vacfo en membrana de nailon. Se lavo la membrana, se desnaturalizo, se hibrido con un fragmento de restriccion de cADN de E1A de adenovirus marcado con 32P y se analizo en un Phosphorimager (Molecular Dynamics). Se uso el analisis de regresion lineal de patrones de adenovirus diluidos en serie para calcular los tftulos de adenovirus infecciosos en las muestras, usando patrones de adenovirus titulados por el ensayo de TCID50.

Se calculo la productividad vmca espedfica normalizando los tftulos de virus infecciosos en el lisado a los numeros de celulas en el momento de infeccion. Los resultados se muestran en la Tabla 1:

TABLA 1: Produccion de adenovirus

Adenovirus

Lmea celular Productividad espedfica (UI/celula) Ensayo

Ad5

293-1 125 TCID50

HeLa S3

400 TCID50

Ad5ts149

293-1 10 TCID50

293-1

16 Microtitulacion de infectividad

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TABLA 1: Produccion de adenovirus

Adenovirus

Lmea celular Productividad espedfica (Ul/celula) Ensayo

293-1

10 Microtitulacion de infectividad

Estos resultados muestran que la produccion espedfica de Adts149 en celulas 293-1 era de una a dos unidades logantmicas menor que la de Ad5.

Un preparado de virus Ad5 de titulo conocido mostro un intervalo lineal que se extendfa de 12,5 a 500 Ul/pocillo basandose en la regresion lineal en el ensayo de microtitulacion de infectividad.

Combinar un ensayo de infectividad vmca con un formato de matriz de microtitulacion segun se describe mas arriba dio como resultado una tecnica que es tanto rapida como cuantitativa, y que es altamente adecuada para automatizacion.

El ensayo de infectividad de alto rendimiento descrito mas arriba puede aplicarse tambien al ensayo de otros virus (p.ej., rAAV y wtAAV). El ensayo puede efectuarse esencialmente segun se describe mas arriba usando celulas de mairnfero apropiadas (p.ej., celulas C37 de HeLa para rAAV o celulas 293 para wtAAV) y en condiciones permisivas para la replicacion del virus a ensayar (p.ej., en presencia de virus auxiliar de rAAV y wtAAV); y entonces se pueden preparar los lisados y se pueden transferir los acidos nucleicos de dichos lisados a una membrana segun se describe mas arriba. La hibridacion de la membrana que contiene la matriz de conjuntos de acidos nucleicos unidos (estando liberado cada conjunto de las celulas del correspondiente pocillo de cultivo) se efectua tipicamente con una sonda espedfica de virus adecuada (p.ej., una sonda espedfica de rep y/o cap de AAV podna usarse para detectar wtAAV o una sonda espedfica de un transgen insertado podna usarse en el caso de un vector de AAV recombinante).

El ensayo de infectividad de alto rendimiento anteriormente descrito exhibfa una respuesta lineal en la determinacion de los titulos de rAAV en un intervalo relativamente amplio de concentraciones. Por ejemplo, cuando se hicieron diluciones 1:2 en serie de una preparacion vmca de titulo conocido (determinado mediante un ensayo de centro infeccioso modificado), partiendo de 2400 unidades infecciosas o “Ul/pocillo”, y se uso como patron para la determinacion del titulo de dos preparaciones de tgAAVCF purificado de titulo desconocido, cada una de las cuales estaba diluida en serie 1:5, el ensayo de microtitulacion mostro un intervalo lineal que se extendfa de 75 a 600 Ul/pocillo basandose en la regresion lineal. La determinacion del titulo de wtAAV empleo preferiblemente un formato de dilucion limitante (p.ej., cuando se ensayaron ocho diluciones limitantes en serie de un preparado de wtAAV de titulo conocido, el titulo determinado por el ensayo de microtitulacion fue esencialmente el mismo que el determinado por el ensayo de TCID50 estandar,3 x 109 UI/mL).

Por dilucion limitante o por comparacion con un patron conocido, se puede determinar el titulo de un virus infeccioso, que corresponde a los titulos determinados mediante tecnicas mas clasicas (p.ej., el ensayo de centro infeccioso o el analisis de punto final del 50% TCID50). Ademas de su uso en la determinacion de titulos vtiicos, este ensayo de infectividad de alto rendimiento tiene muchos otros usos incluyendo, pero sin limitacion, el cribado de lmeas celulares permisivas o no permisivas para la replicacion e infectividad vmca (p.ej., incluyendo diversas celulas de mamffero o variantes de las mismas en diferentes pocillos de una matriz de microtitulacion); asf como el cribado de agentes que afectan a la replicacion vmca (p.ej., incluyendo diversos agentes en diferentes pocillos de una matriz de microtitulacion segun se describe mas arriba y determinando el efecto de los agentes sobre el titulo infeccioso resultante de virus). Entre otras cosas, la capacidad de cribar rapidamente agentes o condiciones que potencien la infectividad y/o replicacion vmca es particularmente util en el contexto de desarrollar u optimizar la produccion de vectores vtiicos. A la inversa, la capacidad de cribar rapidamente agentes o condiciones que repriman la infectividad/replicacion vmca es bastante util en el contexto de identificacion de productos terapeuticos antivtiicos.

El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

Ejemplo 5

Desarrollo de cultivos de suspension para producir virus auxiliares

El ejemplo precedente muestra que los niveles de adenovirus termosensibles producidos por tecnicas de cultivo convencionales son bajos. Esto limita la capacidad de usar adenovirus termosensibles como auxiliares en la produccion de vectores de AAV. El presente ejemplo proporciona un procedimiento mejorado que permite la produccion de adenovirus termosensibles en cantidades mucho mayores. Es crucial para la mejora el uso de celulas huespedes cultivadas en cultivo en suspension.

N3S de 293 y S3 de HeLa son variantes en suspension de las lmeas celulares de rinon embrionario humano 293-1 y carcinoma epitelioide humano HeLa respectivamente. Se efectuo el cultivo en suspension en matraces spinner de 500 mL (Bellco) con volumenes de trabajo de 250 a 300 mL. Las celulas S3 de HeLa (ATCC 2.2-CCL) se

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mantuvieron en DMEM/F-12 con HEPES 15 mM suplementado con 7,5% de FBS y L-glutamina 2,0 mM. Las N3S de 293-1 (Microbix Biosystems Inc.) se sometieron a pases con Joklik MEM suplementado con 7,5% de FBS y L- glutamina 2,0 mM. Se agitaron los matraces spinner a 50-65 rpm.

Se evaluo el rendimiento del crecimiento en el siguiente experimento. Se sometieron N3S de 293 y S3 de HeLa en serie a pases en suspension en matraces spinner de 500 mL duplicados y se monitorizo el crecimiento y viabilidad celular. Se inocularon los matraces a densidades celulares de 2 a 5 x 105 celulas/mL y se cultivaron entonces durante 2 a 3 dfas. Para controlar las diferencias de densidad de siembra, se compararon los niveles de duplicacion de poblacion (PDLs) para los cultivos duplicados. El PDL medio fue de 2,0 ± 0,49 (media de SD) y de 1,1 ± 0,62 para S3 de HeLa y N3S de 293, respectivamente (n= 14). Se observaron consistentemente duplicaciones celulares mayores con las celulas S3 de HeLa. La morfologfa celular en suspension era drasticamente diferente para las dos lmeas. Las celulas HeLa crecieron como celulas individuales o agregados pequenos. En contraposicion, las celulas N3S de 293 formaban agregados grandes de 50 a 100 celulas cada uno. Se observaron numeros significativos de celulas no viables en el centro de las grandes agrupaciones. Se subcultivaron las disoluciones madre mediante centrifugacion seguida de disgregacion suave con una pipeta, liberando las celulas no viables de los agregados. Las viabilidades de cultivo iniciales de N3S de 293 eran consistentemente menores en comparacion con S3 de HeLa.

Basandose en el crecimiento, viabilidad y morfologfa celular en suspension, se selecciono la lmea celular S3 de HeLa para un desarrollo adicional del proceso. Se evaluaron crecimiento y viabilidad a temperaturas permisivas. Se sembraron celulas S3 de HeLa en matraces spinner de 500 mL a 5 x 105 celulas/mL y se monitorizaron diariamente durante 7 dfas.

La Figura 5 muestra la densidad de celulas viables (DCV) de celulas S3 de HeLa, crecidas a 32 °C (cuadrados) y 37 °C (drculos). Las barras alrededor de los puntos temporales a 32 °C indican el intervalo de valores observados en matraces spinner de 500 mL duplicados. Las celulas crecidas a 37 °C alcanzaban el maximo de 2,5 x 106 celulas/mL el dfa 5, mientras que las celulas crecidas a 32 °C alcanzaban el maximo de 2 x 106 celulas/mL el dfa 6. La viabilidad (determinada mediante exclusion con azul de tripano) era al menos de aproximadamente un 90% en total.

La filtracion de flujo tangencial o flujo cruzado es una tecnica versatil para una amplia variedad de aplicaciones biofarmaceuticas a gran escala, incluyendo la concentracion o retirada de celulas, la concentracion de macromoleculas e intercambio de medios/tampon. El procesamiento por flujo tangencial es necesario para concentrar celulas para infeccion y para recolectar celulas infectadas a gran escala.

Se evaluo el efecto del cizallamiento laminar sobre la viabilidad celular en filtracion de flujo tangencial concentrando y diafiltrando las celulas S3 de HeLa. Se inocularon las celulas S3 de HeLa a una densidad de 4 x 105 celulas/mL en biorreactores Applilon de tres litros y se cultivaron a 2 x 106 celulas/mL en DMEM/F-12 con HEPES 15 mM (JRH) suplementado con 7,5% de FBS, glutamina 2,0 mM, aminoacidos 1 X MEM, aminoacidos no esenciales 1 X MEM, 0,1% de poliol Pluronic F-68 y glucosa 2 g/L. El volumen de trabajo del biorreactor era de dos litros. Se controlaron el oxfgeno disuelto, pH, temperatura y agitacion a 60% (respecto a la saturacion del aire), 7,2, 37 °C y 100 rpm, respectivamente, usando el sistema controlador FERMCON™ (Scius Corporation).

Se efectuaron los experimentos de flujo tangencial con membranas de fibra hueca de ester de celulosa mixto (Microgon). El tamano de poro y area superficial eran de 0,2 pm y 725 cm2, respectivamente. Se selecciono un filtro de 0,2 pm para retener las celulas dejando pasar los medios agotados. Se bombearon las celulas (Cole Palmer) a traves del diametro interno de las fibras huecas. Se ajustaron las velocidades de recirculacion para proporcionar tasas de cizallamiento de pared medias de 750 y 1500 s-1. Una vez establecido el flujo cruzado, se consiguio un control de flujo permeado de 30 y 90 mL/min, respectivamente, con una bomba (Cole Palmer) localizada en la lmea de permeado. Durante la concentracion celular, continuo la extraccion de permeado hasta que se alcanzo la multiplicacion de concentracion deseada. Durante la diafiltracion, se activo la alimentacion de medios que entran en el biorreactor hasta que se alcanzo la multiplicacion del intercambio de medio deseada. Se contaron las celulas viables antes y despues de cada tratamiento.

La Figura 6 muestra las curvas de crecimiento de celulas S3 de HeLa antes y despues del procesamiento por flujo tangencial en un experimento ejemplar. Se cultivaron 2 litros de celulas en biorreactores de 3 L. El dfa 3 (flecha), se concentraron las celulas 7 veces a partir del volumen de trabajo de 2 L, diafiltrado frente a 6 volumenes de medio de crecimiento y se llevaron al volumen de trabajo original. Los resultados muestran que las celulas no se danaron por un cizallamiento de pared de 750 s-1 (cuadrados) ni 1500 s-1 (drculos) y siguieron creciendo a altas densidades celulares.

Se ensayaron entonces los cultivos en suspension de celulas S3 de HeLa como celulas huespedes para la produccion de ts149, o se investigo su capacidad en cultivo en suspension de 300 mL. Se centrifugaron celulas S3 de HeLa de cultivo en suspension de 300 mL (1 x 106 celulas/mL), se concentraron y se infectaron con ts149 (MOI = 3). Despues de 1 hora, se transfirio el cultivo a un matraz spinner, se resuspendio en medios y se cultivo durante 7 dfas a 32 °C. Las celulas S3 de HeLa siguieron creciendo desde aproximadamente 1 x 106 celulas/mL en el momento de infeccion hasta aproximadamente 2 x 106 celulas/mL el dfa 5. La viabilidad se redujo a ~60% el dfa 7.

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La Figura 7 muestra la produccion de ts149 por cultivos de celulas S3 de HeLa. Se muestreo diariamente el cultivo y se prepararon lisados mediante congelacion-descongelacion para analisis de la produccion vffica por el ensayo de infectividad de adenovirus. La produccion de virus alcanzo ~4,5 x 107 UI/mL de cultivo aproximadamente el dfa 3-5. El d^a 7, se recogieron las celulas mediante centrifugacion, se resuspendieron en tampon TMEG y se lisaron mediante microfluidificacion (MF). El tffulo infeccioso del lisado microfluidificado fue comparable a los de la muestra de lisado congelada-descongelada, indicando que la recuperacion mediante microfluidificacion era comparable a los procedimientos de congelacion-descongelacion.

El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

EJEMPLO 6

Procedimiento de purificacion mejorado para la produccion de un virus auxiliar termosensible (Ad ts149)

La purificacion mediante gradientes de CsCl es costosa para la produccion a gran escala. Este ejemplo ilustra la purificacion de ts149 mediante cromatograffa de intercambio ionico.

Se efectuo la cromatograffa en una estacion de trabajo de cromatograffa Perseptive Biosystem BIOCAD™. La resina usada era un intercambiador de aniones debil de polietilenimina (PI) (POROS™ 50 PI). Se equilibro la columna con TMEG (Tris 50 mM, pH 8,0, MgCh 5 mM, EDTA 1 mM, 5% de glicerol). Se monitorizo pH, conductividad y densidad optica a 280 nm de la cromatograffa en lmea.

Se recolecto la suspension de S3 de HeLa infectada con ts149 a una MOI de 2 y se centrifugo. Se resuspendio el sedimento en TMEG y se liso mediante cavitacion a 3000 PSI usando un microfluidificador (Microfluidics). Se clarifico el lisado mediante filtracion a traves de un filtro de jeringuilla de 5 pm (Millex SV) seguida de un filtro de jeringuilla de 0,45 pm (Acrodisc). Se cargo el lisado clarificado en una columna de intercambio de aniones POROS™ 50 PI de 1,6 mL procesada a 1 mL/min. Se lavo la columna con 10 volumenes de columna de TMEG con NaCl 900 mM y se eluyo el ts149 con un gradiente lineal de NaCl 900 a 1300 mM. Se recogieron fracciones de 0,5 mL y se ensayo mediante el ensayo de infectividad y slot blot la presencia de adenovirus.

La Figura 8 muestra los resultados del ensayo de infectividad realizado en fracciones de columna consecutivas. La mayona del adenovirus infeccioso se encontro en las fracciones 26 a 28, coincidentes con el pico de absorbancia que eluye a aproximadamente 100 ms aproximadamente a los 25 minutos. El ts149 eluyo justo antes del pico grande a mayor concentracion salina. Los ensayos de infectividad y slot blot realizados en paralelo confirmaron que las partmulas y virus infecciosos estaban en las mismas fracciones de pico.

Se ensayo tambien en lisado y fracciones de pico de PI la protema total mediante el procedimiento de Bradford. La concentracion de protema fue de 1,8 mg/mL en el lisado y de menos de 30.0 pg/mL en el conjunto de PI. Se separaron los viriones de la mayona de la protema celular en una sola etapa y se eluyeron como un solo pico. Los viriones mostraron una afinidad muy alta por la matriz de PI, segun se evidencia por la concentracion salina relativamente alta necesaria para eluirlos de la columna.

Los procedimientos a gran escala para virus auxiliares termosensibles pueden incorporar todas las mejoras descritas en estos ejemplos. En una ilustracion, la produccion de virus comprendena las siguientes etapas:

• Cultivo celular en un biorreactor en suspension

• Concentracion/intercambio de medio

• Infeccion con virus auxiliar

• Produccion de virus

• Recoleccion: concentracion/diafiltracion

• Lisis por microfluidificacion

• Cromatograffa de intercambio ionico en PI

• Concentracion/diafiltracion

• Esterilizacion por filtracion

Este tipo de enfoque es inherentemente escalable y adaptable a las Buenas Practicas de Fabricacion actuales.

Se proporcionan a continuacion ilustraciones ejemplares adicionales de dichas tecnicas.

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El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

EJEMPLO 7

Comparacion de procesos de primera y segunda generacion para la produccion de virus auxiliares

A. Produccion y procesamiento de virus auxiliar ilustrativos de primera generacion

En un proceso ejemplar “de primera generacion” para la produccion de virus auxiliar, se cultivaron celulas de mairnfero en 40 matraces T225 y luego se infectaron con Ad5 a una MOI de aproximadamente 1. Despues de incubar, se recolectaron las celulas mediante centrifugacion y se lisaron mediante congelacion-descongelacion y pase a traves de una aguja. Se sometio el lisado a tratamiento con DNasa I y se proceso entonces en un gradiente de etapas de CsCl y un gradiente isopmnico. El material purificado se dializo y se esterilizo por filtracion.

Usando este proceso de primera generacion, se obtuvieron aproximadamente 1 x 1012 partfculas (o aprox. 1 x 1011 unidades infecciosas) a partir de 4 x 108 celulas.

B. Produccion y procesamiento de virus auxiliar ilustrativos de segunda generacion

En un proceso ejemplar “de segunda generacion” para la produccion de virus auxiliar, se cultivaron celulas de mamffero (S3 de HeLa) en biorreactores de 10 litros y luego se infectaron con Ad5 (de ATCC, purificado en placa posteriormente en celulas 293, expandidos en serie en celulas HeLa S3 y purificados doblemente por centrifugacion en gradiente de CsCl) a una MOl de aproximadamente 1. Despues de incubar, se concentraron las celulas, se recolectaron mediante diafiltracion y se lisaron mediante microfluidificacion. Se sometio el lisado a tratamiento con benzonasa (nucleasa) y entonces se filtro. Se proceso entonces el filtrado en una columna de intercambio de aniones (PI), se concentro, se diafiltro y finalmente se esterilizo por filtracion.

Usando este proceso de segunda generacion, obtuvimos aproximadamente 1 x 1014 partroulas (o aprox. 5 x 1012 unidades infecciosas) a partir de 1 x 1010 celulas.

La Figura 9 ilustra los resultados del procesamiento posterior de virus auxiliar utilizando cromatograffa de intercambio de aniones segun se describe mas arriba. Barras: actividad vmca medida en un ensayo de infectividad; lmea continua: A280; lmea de puntos: conductividad del tampon (mS).

Como resulta evidente de la comparacion del fraccionamiento de la actividad vmca frente a la absorbancia A280, estos procedimientos de procesamiento tuvieron como resultado una separacion sustancial del virus auxiliar del grueso de los materiales contaminantes que se esperana que contuvieran protemas y acidos nucleicos celulares.

Ejemplo 8

Comparacion de procesos de primera y segunda generacion para la produccion de vectores de AAV recombinantes

A. Produccion y procesamiento de rAAV ilustrativos de primera generacion

En un proceso ejemplar “de primera generacion” para la produccion de vector de rAAV, se cultivaron celulas de marnffero en 40 matraces T225 y luego se infectaron con Ad5 a una MOI de aproximadamente 5. Despues de incubar, se recolectaron las celulas mediante centrifugacion y se lisaron mediante sonicacion. Se sometio el lisado a tratamiento con DNasa 1 y se proceso entonces en una serie de dos gradientes de CsCl. Se dializo el material purificado y se esterilizo por filtracion. Usando este proceso de primera generacion, obtuvimos aproximadamente 5 x 106 unidades replicativas URs a partir de 4 x 108 celulas.

B. Produccion y procesamiento de rAAV ilustrativos de segunda generacion

En un proceso ejemplar “de segunda generacion” para la produccion de vector de rAAV, se cultivaron celulas de mamffero en biorreactores de 10 L y luego se infectaron con Ad5 a una MOI de aproximadamente 5. Despues de incubar, se concentraron las celulas, se recolectaron mediante diafiltracion y se lisaron mediante microfluidificacion. Se sometio el lisado a tratamiento con benzonasa (nucleasa) y luego se filtro. Se proceso entonces el filtrado en una columna de intercambio de aniones, seguida de una columna de intercambio de cationes. Se agruparon las fracciones de eluyente que conternan AAV, se concentraron, se diafiltraron y finalmente se esterilizaron por filtracion. Este proceso de segunda generacion se espera que proporcione mas de 1 x 1011 unidades replicativas UR a partir de 1 x 1010 celulas.

La Figura 10 muestra los resultados del fraccionamiento secuencial en columnas de intercambio ionico: en primer lugar, en una matriz de intercambio de aniones (panel superior) y luego en una matriz de intercambio de cationes (panel inferior). Barras: actividad vmca medida en un ensayo de infectividad para adenovirus o AAV; lmea continua:

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A280 (una medida de la protema total); lmea de puntos: conductividad del tampon (mS). Como resulta evidente por las fracciones analizadas, es posible obtener niveles extremadamente altos de separacion entre AAV y adenovirus, asf como entre AAV y material absorbente de A280 (mayormente protemas) utilizando las tecnicas de la presente invencion. En particular, los resultados revelaron que los vectores de AAV pueden retenerse tanto en columnas de intercambio de aniones como de cationes y que la elucion diferencial de AAV usando intercambio tanto de aniones como de cationes daba como resultado una capacidad potenciada drasticamente de separar AAV de todos los contaminantes principales de interes (incluyendo adenovirus asf como protemas celulares).

En otro proceso ejemplar de segunda generacion para la produccion de vector de rAAV, se preparo el filtrado segun se describe mas arriba y se proceso entonces en una columna de intercambio de aniones, seguida de agrupamiento de las fracciones eluyentes que contienen AAV, y se sometieron entonces los eluyentes de intercambio de aniones agrupados a filtracion de flujo tangencial (TFF). Segun se describe a continuacion, se encontro que este procedimiento de intercambio de aniones a TFF daba como resultado un preparado altamente concentrado y purificado de AAV.

Un analisis detallado del AAV obtenido usando dicha tecnologfa de segunda generacion, usando tecnicas segun se describen mas arriba y en el estado de la tecnica (incluyendo ensayos de infectividad, analisis de slot blot y electroforesis en gel con SDS) proporciono la confirmacion adicional de que el material era de alta calidad y estaba sustancialmente exento de partmulas adenovmcas contaminantes (y protema y ADN de adenovirus) y tambien sustancialmente exento de protemas y ADN celulares contaminantes. Los geles de SDS revelaron la presencia de bandas correspondientes a VP1, VP2 y VP3 (es decir, las protemas de capside de AAV). No eran visibles otras bandas despues de tincion con Coomasie. Estos datos son consistentes con los resultados de los analisis de fraccionamiento de columna segun se muestra en las Figuras 10-11.

Como procedimiento de intercambio de aniones a TFF ilustrativo, el siguiente es un proceso de purificacion y concentracion ejemplar que parte de un litro de fracciones agrupadas de cromatograffa de intercambio de aniones. Si se desea (segun se observa mas arriba), este conjunto puede someterse a inactivacion termica seguida de una etapa de filtracion (p.ej., utilizando un filtro de 0,22 pm). Para la filtracion de flujo tangencial (TFF), empleamos un sistema Pellicon XL esterilizado equipado con una membrana de corte de peso molecular de 300.000 que funcionaba a 40/0 para presiones de entrada y salida. Se cargo un litro de material agrupado en el sistema a un volumen de 500 mL y se concentro entonces a 250 mL. Se efectuo la diafiltracion con 5 diavolumenes (1250 mL) de disolucion de Ringer modificada + 5% de glicerol. Despues de la diafiltracion, se concentro el retenido a un volumen final de 14 mL. El tiempo de proceso total fue de aproximadamente 3,25 horas (no incluyendo el tiempo de esterilizacion). Los geles de SDS tenidos con plata, los slot blot y los ensayos de infectividad confirmaron que la preparacion de AAV (que contema aproximadamente 1010 unidades replicativas) estaba sustancialmente exenta de adenovirus contaminantes asf como de protemas adenovmcas y celulares.

Los siguientes son resultados de dicho procedimiento que muestran el tttulo vmco infeccioso y total como UR (unidades replicantes) y DRP (partmulas resistentes a DNasa) respectivamente:

TFF DE 300K

Volumen UR totales DRP totales P/I % de UR % de DRP

Conjunto de entrada

1000 mL 8,9 x 1010 3,1 x 1014 3483 100 100

Producto bruto purificado

12,5 mL 7,3 x 1010 2,3 x 1014 3103 82 74

Los datos presentados en la Figura 12 ilustran los resultados de una rutina de produccion de AAV que utiliza filtracion de flujo tangencial despues de una columna de intercambio de aniones. Se concentro material purificado en la columna POROS 50 PI utilizando una membrana de corte de peso molecular de 300.000 (Millipore Pellicon XL). Se diafiltro el material concentrado con cinco volumenes sucesivos de solucion salina equilibrada de Ringer + 5% de glicerol. Se concentro entonces el material en la membrana 10 veces. La Figura 12, una reproduccion a medio tono de un gel de poliacrilamida-SDS tenido con una tincion de plata, muestra las protemas de capside de AAV altamente purificadas VP1 (85 kDa), VP2 (72 kDa) y VP3 (62 kDa) en el material bruto purificado final.

Como resulta evidente por los datos presentados en el presente documento, estas tecnicas de segunda generacion para la preparacion y purificacion de AAV dan como resultado procedimientos sustancialmente mejorados en comparacion con los descritos anteriormente.

Se detallan en la siguiente tabla medios ejemplares para el crecimiento de adenovirus auxiliar y para preparar rAAV:

TABLA 2:

Medio Ad Medio rAAV

SALES INORGANICAS

CaCI

116,61

CuSO4*5H20

0,00125 0,00125

Fe(NOa)3-9H20

0,05 0,05

FeSO4-7H20

0,417 0,417

KCI

311,8 311,8

MgCl2

28,61

MgSO4

48,84

NaCI

* *

NaHCO3

2200 2200

NaH2PO4H20

62,5 62,5

Na2HP04

71,02 71,02

Zn2SO4-7H20

0,4315 0,4315

Otros componentes

Glucosa

4500 4500

HEPES

3575 3575

Hipoxantina Na

2,39 2,39

Acido linoleico

0,042 0,042

Acido lipoico

0,105 0,105

Rojo fenol, sal sodica

Putrescina2HCL

0,081 0,081

Piruvato de sodio

55 55

Poliol Pluronic F-68

100 100

Aminoacidos

L- Alanina

4,455 4,455

L-ArgininaHCL

273,9 273,9

L-AsparaginaH20

22,5 22,5

L-Aspartico

19,95 19,95

L-Cisteina-HCL^

17,56 17,56

L-Cistina2HCL

52,29 52,29

Acido L-Glutamico

22,05 22,05

L-Glutamina

657 657

Glicina

26,25 26,25

L-HistidinaHCLH20

73,48 73,48

L-Isoleucina

106,97 106,97

L-Leucina

111,45 111,45

L-LysinaHCL

163,75 163,75

L-Metionina

32,34 32,34

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Medio Ad Medio rAAV

L-Fenilalanina

68,48 68,48

L-Prolina

17,25 17,25

L-Serina

36,75 36,75

L-Treonina

101,05 101,05

L-Triptofano

19,22 19,22

L-Tirosina

91,79 91,79

L-Valina

99,65 99,65

Vitaminas

d-Biotina

0,00365 0,00365

D-Pantotenato de Ca

2,24 1,00

Colina Cloruro

8,98 8,98

Acido Folico

2,65 2,65

mio-inositol

12,6 12,6

Niacinamida

2,0185 2,0185

PiridoxalHCL

2 2

PiridoxinaHCL

0,031 0,031

Riboflavina

0,219 0,219

TiaminaHCL

2,17 2,17

Timidina

0,365 0,365

Vitamina B12

0,68 0,68

* anadir una cantidad apropiada de NaCl para osmolalidad a 300 mOsm (+ o - 20 mOsm)

C. Purificacion de vector de AAV utilizando cromatograffa de sulfato de heparina

Segun se examina mas arriba, las tecnicas cromatograficas pueden emplearse para purificar adicionalmente y concentrar preparaciones de AAV de acuerdo con la presente invencion. A modo de ilustracion, un preparado de AAV que esta en forma bruta (p.ej. lisado) o que se ha eluido de una columna de intercambio de aniones o intercambio de cationes y/o concentrado mediante filtracion de flujo tangencial puede purificarse mediante union con una columna que comprende sulfato de heparina. El AAV puede eluirse entonces de dicha columna usando un tampon que contiene una sal (p.ej., un gradiente lineal de NaCl).

Como ilustracion del uso de cromatograffa de sulfato de heparina, en primer lugar se concentro cuatro veces el AAV obtenido de un conjunto de “PI” (segun se describe a continuacion en el Ejemplo 9) y se diafiltro con TMEG + NaCl 100 mM usando una membrana de filtracion de flujo tangencial de 300K. Se inyecto entonces el concentrado en una columna de sulfato de heparina de 1 mL (columna de Pharmacia "Hi-Trap Heparin") y se eluyo usando un gradiente lineal de NaCl.

La Figura 13 es un cromatograma que muestra la concentracion resultante de AAV en la columna de sulfato de heparina. El pico estrecho de absorbancia a 280 nm (eje izquierdo) a aproximadamente 18 minutos de tiempo de elucion representa la fraccion de AAV eluida de sulfato de heparina con un gradiente lineal de NaCl 0 a 1 M (la conductividad se muestra en mS en el eje derecho).

EJEMPLO 9

Produccion y ensayo de vector de AAV recombinante

En otro grupo de rutinas de produccion, se usaron 3-4 x 109 celulas cultivadas en una Cell Factory, usando DMEM + 10% FBS como medio de cultivo. Se infectaron las celulas con Ad a una MOI de aproximadamente 20 y se recolectaron a las 72 horas despues de la infeccion. Se suspendieron las celulas recolectadas en TMEG + NaCl a una concentracion de aproximadamente 5 x 106 celulas/mL. Despues de lisis mecanica (microfluidificacion, 2 pases

5

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20

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40

45

50

a 8000 psi), se trataron los lisados con benzonasa (25 unidades/mL, 37 °C, 1 hora) y se filtraron entonces a traves de un filtro de 5 pm (Pall Profile II).

Como columna de intercambio de aniones ejemplar, se empleo la columna POROS 50 PI (disponible en Perseptive Biosystems). Brevemente, se cargo el filtrado en la columna en aproximadamente 100 mL y se eluyo con un gradiente de NaCl hasta 500 mM. Se determinaron (por ensayo de infectividad) las fracciones que conteman la mayona del AAV, se recogieron y se agruparon (designado como “conjunto de PI”).

Se diluyo entonces el conjunto de PI aproximadamente a 1:7 con TMEG, se cargo en una columna de 50 mL Toso Haas SP650C y se eluyo con un gradiente de NaCl hasta 500 mM. Se determinaron (por ensayo de infectividad) las fracciones que conteman la mayona del AAV, se recogieron y se agruparon (designado como “conjunto de SP”). Se concentro el conjunto de SP usando un filtro Centriprep 10K y luego se esterilizo por pasada a traves de un filtro de 0,2 pm.

Los resultados revelaron que el AAV recombinante estaba esencialmente exento de adenovirus infecciosos detectables (determinado por analisis de lfmite de deteccion con amplificacion en serie en celulas 293 y ensayo de TCID50). La preparacion estaba tambien esencialmente exenta de aDn de adenovirus (determinado por analisis de slot blot), esencialmente exenta de protemas celulares (determinado por analisis de gel PAGE-SDS), de ADN celular (determinado por analisis de PCR) y estaba tambien esencialmente exenta de AAV de tipo fenotfpicamente natural (determinado mediante amplificacion en serie y analisis Southern).

El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

EJEMPLO 10

Potenciacion de la produccion de AAV por estres nutricional

Segun se examina mas arriba, se cree que la produccion de AAV puede potenciarse usando cualquiera de una variedad de agentes y/o condiciones que estresan eficazmente (o desoptimizan) el crecimiento o metabolismo de celulas productoras de AAV. En este ejemplo, se muestra que el agotamiento de ciertos aminoacidos que ocurre durante el cultivo esta asociado a una potenciacion relativa de la produccion de AAV y, a la inversa, que los suplementos de medios para retirar el estres nutricional dan como resultado realmente una drastica reduccion del rendimiento de vector.

(a) Estres nutricional durante el cultivo por lotes y por perfusion

Se inocularon celulas JL14 a aproximadamente 4x105 celulas/mL en biorreactores de 2 litros y se cultivaron en el medio de rAAV mostrado en la Tabla 2 en modo por lotes o por perfusion (usando filtracion por flujo tangencial, dfa 1 a 0,4 volumenes/dfa, dfas 2-3 a 1-2 vol.Ma, dfa 4 a 2 vol./dfa y dfa 5 a 4 vol./dfa). Se monitorizaron en los cultivos densidad celular, glucosa, lactato y aminoacidos usando tecnicas estandares.

Los analisis revelaron que la densidad celular alcanzaba un maximo en el cultivo por lotes de 1 x 106 celulas/mL el dfa 2 y en el cultivo por perfusion de 8 x 106 celulas/mL el dfa 6. La glucosa no era limitante en ningun caso (>1 g/L) y el lactato no era inhibidor.

Sin embargo, el analisis de aminoacidos revelo que tanto glutamato como aspartato se agotaban rapidamente en ambos cultivos por lotes y por perfusion, segun se muestra en las siguientes tablas:

TABLA 3:

Analisis de aminoacidos del medio de cultivo por LOTES (transcurso temporal- pmol/L)

PM Dfa 0 Dfa 1 Dfa 2 Dfa 3 Dfa 4

Acido aspartico

133 96 10 4 9 7

Treonina

119 687 644 606 552 533

Serina

105 271 230 157 117 98

Asparagina

132 130 113 96 68 69

Acido glutamico

147 90 2 1 1 1

Glutamina

146 3424 2987 2450 1989 1843

Prolina

115 135 143 162 164 185

Glicina

75 288 241 194 151 130

Alanina

89 189 306 438 644 681

Valina

117 692 631 518 417 342

5

10

15

20

25

Cistina

121 143 133 120 107 99

Metionina

149 160 132 100 74 58

Isoleucina

131 617 531 383 264 182

Leucina

131 645 538 374 248 161

Tirosina

181 407 379 355 329 315

Fenilalanina

165 323 289 259 231 214

Triptofano

204 47 41 33 28 26

Amoniaco

17 760 816 941 1021 1033

Ornitina

71 89 110 128 144

Lisina-HCl

572 521 463 415 384

Histidina

155 276 257 243 229 211

Arginina

174 1020 943 870 791 747

TABLA 4:

Analisis de aminoacidos del medio de cultivo por PERFUSION (curso temporal- pmol/l)

PM Dfa 0 Dfa 1 Dfa 2 Dfa 3 Dfa 4 Dfa 5 Dfa 6

Acido-aspartico

133 95 12 5 10 10 10 10

Treonina

119 709 691 560 596 651 641 657

Serina

105 281 264 147 156 180 199 185

Asparagina

132 130 124 75 78 109 119 119

Acido-glutamico

147 88 1 0 1 1 1 0

Glutamina

146 3525 3299 2517 2640 2906 2986 3082

Prolina

115 145 165 163 174 177 157 171

Glicina

75 304 267 189 205 217 227 230

Alanina

89 190 340 341 384 423 333 330

Valina

117 678 635 485 500 532 551 561

Cistina

121 141 136 112 118 123 119 118

Metionina

149 157 133 91 99 107 108 107

Isoleucina

131 616 543 369 401 430 432 442

Leucina

131 649 554 364 400 430 438 444

Tirosina

181 413 398 328 355 379 373 386

Fenilalanina

165 336 16 244 268 291 287 292

Triptofano

204 58 47 36 41 48 44 47

Amoniaco

17 831 1182 956 1202 1219 931 990

Ornitina

42 97 74 115 112 56 44

Lisina-HCl

718 651 528 594 643 617 628

Histidina

155 284 310 223 243 262 266 265

Arginina

174 1058 948 826 901 978 974 1016

(b) Estres nutricional asociado a una produccion potenciada de AAV

Se efectuaron estudios de seguimiento para confirmar la importancia de la escasez relativa de glutamato y aspartato en los medios de cultivo. Se tomaron celulas JL 14 de un matraz spinner y se dividieron en dos grupos. Se inoculo cada grupo con 3 x 109 unidades infecciosas de 170-37 Ad5. Se resuspendio un grupo de celulas a 106 celulas/mL en medio de rAAV (Tabla 2) que contema 10% de FBS y 1% de L-glutamina (300 mL). Se resuspendio el otro en medio de rAAV que contema 10% de FBS,1% de L-glutamina, acido aspartico 10 mg/l y acido glutamico 110 mg/l.

Se incubo cada grupo a 37 °C durante 72 horas en un matraz spinner. Se recolectaron las celulas, se microfluidificaron dos veces a 8000 psi, se sometieron a benzonasa, se sembraron en un ensayo de infectividad, se recolectaron y sondearon.

Los resultados mostraron que el matraz spinner de control produjo 6,2 UR por celula. El matraz spinner suplementado con acidos aspartico y glutamico produjo 0,94 UR por celula.

Esto indica que cuando se evita el agotamiento de los acidos aspartico y glutamico proporcionando estos aminoacidos en exceso, se compromete la produccion de rAAV debido a la incapacidad de someter las celulas a estres nutricional.

Se efectuaron ensayos adicionales usando una lmea celular D6 derivada de HeLa que tiene un vector de rAAV integrado (ITR- (promotor de CMV) - (gen informador de 13-gal) -ITR), asf como copias de los genes rep y cap de AAV de tipo natural.

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35

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45

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55

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Se sembraron las celulas a 5 x 106 celulas por matraz T-225 en 30 mL de DMEM completo (10% de FBS, L- glutamina 2 mM) y se incubaron a 37 °C en 10% de CO2 durante 2 d^as, tras de lo cual las celulas alcanzaron una densidad de 2 x 107 celulas por matraz. Se infectaron celulas en dos matraces duplicados con Ad5 a una MOI de 10. Un matraz contema DMEM completo, el otro contema DMEM completo suplementado con 5 x acido aspartico y acido glutamico. Se recolectaron las celulas y se contaron despues de 72 horas de cultivo.

El DMEM completo proporciono 2,6 x 107 celulas con 88% de viabilidad. El medio suplementado con aspartato/glutamato proporciono 3,8 x 107 celulas con 91% de viabilidad. Se resuspendieron las celulas, se sometieron a sonicacion, se trataron con benzonasa (25 U/mL), se clarificaron y se ensayaron mediante analisis de slot blot.

Los resultados fueron los siguientes: se produjo virus D6 en DMEM completo (no suplementado) a 1,8 x 1010 DRP/mL (1800 DRP por celula). Se produjo virus D6 en DMEM suplementado con asparato/glutamato a 1,4 x 109 DRP/mL (140 DRP/celula).

El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

EJEMPLO 11

Produccion de vector de AAV recombinante bajo estres serico

Como ejemplo de la produccion de rAAV bajo condiciones de estres, hemos utilizado el estres por suero reducido junto con tecnicas segun se describen anteriormente. Brevemente, se cultivaron celulas JL 14 en matraces spinner en DMEM modificado + 10% de FBS en modo de cultivo en serie continuo, y se dividieron cada 3-4 dfas. Se dispusieron las celulas del cultivo en suspension en 16 dispositivos Cell Factory de Nunc de 10 apilamientos, a 3 x 108 celulas/Factory en una rotacion de 3 a 4 dfas. El medio usado para crecimiento tema una reduccion de 10 veces del suero (es decir, DMEM + 1% de FBS), situando asf las celulas bajo estres serico.

A las 24 horas despues de la siembra, se retiro el medio en los dispositivos y se anadio medio reciente que contema 3 x 109 unidades de Ad/mL. Despues de 72 horas de cultivo a 37 °C, se desalojaron las celulas de los dispositivos Factory golpeando suavemente, se recolecto el medio que contema celulas se sedimentaron las celulas, se resuspendieron en TMEG + NaCl 100 mM y luego se lisaron mediante pase a traves de un microfluidificador a 8000 psi. Se clarifico el lisado a traves de un filtro de 5 pm y se cargo el lisado clarificado en una columna de intercambio de aniones de PI de 500 mL. Se eluyo la columna con un gradiente creciente de NaCl (hasta 500 mM) en tampon TMEG. Se recogieron las fracciones y se ensayaron usando un ensayo de clon 37 como se describe por Allen et al. (WO96/17947, supra). Se agruparon entonces las fracciones que conteman la mayona del vector de AAV y se concentraron 10 veces usando un concentrador centnfugo Centriprep a 1000 x g durante 30 minutos. Se dializo el material concentrado frente a disolucion salina equilibrada de Ringer con 5% de glicerol y se almaceno a -70 °C. Se ensayo el AAV mediante el ensayo de clon 37, asf como mediante slot blot y PAGE-SDS. En el material puede ensayarse tambien la presencia de adenovirus, protemas adenovmcas y ADN celular, asf como otros contaminantes potenciales.

La Figura 11 muestra los resultados obtenidos usando celulas productoras GAK-0003 dispuestas en matraces T-225 a 10rcelulas por matraz e inoculadas el dfa 2 con adenovirus DAB-003 a una MOI de 10. Se cultivaron diferentes matraces durante 72 horas a 37 °C en DMEM reciente que contema un porcentaje diferente de FBS, segun se muestra en la figura. El dfa 5, se recolecto cada matraz, se contaron las celulas, se resuspendieron, se sometieron a sonicacion, a benzonasa y se sembraron para medir la produccion de vector como anteriormente.

Se observo una produccion optima de vector a un porcentaje de FBS de 1%. Por consiguiente, se prefiere medio deficiente en FBS (menos de 2,5%, preferiblemente menos de 2%, pero mas de 0%) como condicion para someter las celulas productoras a estres serico.

El siguiente ejemplo se aporta unicamente con fines de referencia y no forma parte de la invencion.

EJEMPLO 12

Produccion de vector de AAV recombinante bajo estres de pH

Como ejemplo adicional de la produccion de rAAV bajo condiciones de estres, se uso el estres de pH junto con tecnicas segun se describen mas arriba. Brevemente, se cultivaron celulas productoras de AAV en biorreactores segun se describe mas arriba. Se infectaron entonces las celulas con Ad5 a una MOI de 10 y se inocularon en medios bajos en suero (como en el Ejemplo 11) en suspension en biorreactores de 1,5 L. Se mantuvieron los cultivos a diversos niveles de pH elevados (de 7,2 a 8,0). Se monitorizaron entonces en los cultivos diariamente el numero de celulas, viabilidad, consumo de glucosa, produccion de lactato, pH, osmolaridad y produccion de AAV. Segun se muestra a continuacion, hubo un aumento de la produccion de AAV cuando el pH se elevo a 7,4, acoplado

con un aumento aun mas drastico del numero de partfculas de AAV liberadas al sobrenadante (que aumentaba a medida que se elevaba el pH) :

pH del cultivo

Partfculas asociadas a celulas Partfculas sobrenadantes Partfculas totales % asociadas a celulas % en sobrenadante

7.2

4.70E + 12 1.90E + 09 4.70E + 12 100% 0%

7.4

6.50E + 12 1.30E + 13 1.95E + 13 33% 67%

7.6

3.40E + 12 1.50E + 13 1.84E + 13 18% 82%

8.0

1.30E + 12 1.50E + 13 1.63E + 13 8% 92%

5 En suma, a medida que creda el pH se observamos un fuerte aumento del numero de partfculas de AAV liberadas al sobrenadante y un desplazamiento del porcentaje de partfculas en sobrenadante: asociadas a celula (de casi todas asociadas a celula a pH 7,2 a mayoritariamente en sobrenadante (92%) a pH 8,0). La capacidad de recuperar las partfculas de AAV directamente del sobrenadante sin necesidad de lisar las celulas productoras representa una poderosa ventaja en terminos de produccion y purificacion de AAV. El AAV aislado del sobrenadante usando estres 10 de pH puede concentrarse facilmente y purificarse usando tecnicas segun se describen en el presente documento (p.ej., cromatograffa de intercambio ionico y/o filtracion de flujo tangencial).

Claims (29)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) que comprende las etapas de:

   (a) incubar la celula productora de AAV en condiciones que sean permisivas para la replicacion de AAV, donde dicha celula productora de AAV comprende:

   (i) uno o mas genes de empaquetamiento de AAV, en el que cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica una protema de replicacion o encapsidacion de AAV;

   (ii) un provector de AAV recombinante (rAAV) que comprende un polinucleotido no de AAV heterologo flanqueado por al menos una repeticion terminal invertida (ITR) de AAV; y

   (iii) un virus auxiliar de AAV;

   (b) lisar la celula productora despues de la incubacion de la etapa a) para producir un lisado de celula productora de AAV;

   (c) Cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa b) mediante varias cromatograffas de intercambio de iones que comprenden al menos una cromatograffa positivamente cargada de intercambio de aniones y al menos una cromatograffa negativamente cargada de intercambio de cationes, o cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa b) por cromatograffa de intercambio de aniones seguida de filtracion de flujo tangencial para generar una poblacion purificada de parffculas de vector de rAAV.
2. 2. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun la reivindicacion 1, donde las celulas productoras de AAV se concentra antes de la lisis, opcionalmente mediante centrifugacion o mediante filtracion de flujo tangencial.
3. 3. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicha etapa de lisis de la celula productora de AAV se realiza sometiendo la celula a una tecnica fftica seleccionada de microfluidificacion, sonicacion y congelacion-descongelacion.
4. 4. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el lisado de las celulas productoras de AAV de la etapa b):

   (i) se trata con una nucleasa, opcionalmente benzonasa, antes de la cromatograffa; y/o

   (ii) se clarifica antes de la cromatograffa, opcionalmente mediante filtracion o centrifugacion.
5. 5. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las celulas productoras de AAV se concentran antes de la lisis, se resuspenden en un tampon que comprende disolucion salina a una fuerza ionica de al menos la de una disolucion de NaCl 50 mM, se lisan y luego se clarifican mediante filtracion antes de la cromatograffa.
6. 6. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha cromatograffa de intercambio de aniones se efectua en una resina amino o imino N- cargada, opcionalmente seleccionada entre una resina POROS 50 PI, una resina de dietilaminoetilo (DEAE), una resina de trimetilaminoetilo (TMAE), una resina de amina cuaternaria y una resina de polietilenimina (PEI).
7. 7. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha cromatograffa de intercambio de cationes se efectua en una resina cationica basada en sulfo-, fosfo- o carboxilo, opcionalmente seleccionada de una resina de HS, una resina de SP y una resina de carboximetilo (CM).
8. 8. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha etapa a) de incubacion de la celula productora se realiza en un recipiente seleccionado de un matraz de cultivo tisular, una botella roller, un matraz spinner, un tanque de reaccion, un fermentador tal como un fermentador de levantamiento por aire, un biorreactor tal como un biorreactor de fibra hueca, de lecho empaquetado o lecho fluidificado o un biorreactor multilecho, biorreactor multilecho en el que se afslan al menos aproximadamente 109 unidades replicativas de rAAV por litro de volumen de biorreactor despues de la etapa c).
9. 9. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha etapa a) de incubacion de la celula productora se realiza utilizando un microportador.

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   65
10. 10. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha etapa a) de incubacion de la celula productora se realiza en el medio de rAAV segun se muestra en la Tabla 2.
11. 11. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha etapa a) de incubacion de la celula productora se realiza durante al menos 5 dfas.
12. 12. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha poblacion purificada de parffculas de vector de rAAV esta exenta de AAV competente para la replicacion y de virus auxiliar y protemas celulares.
13. 13. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la elucion de la cromatograffa de intercambio de aniones y/o intercambio de cationes se realiza aumentando la concentracion salina y los eluyentes cromatograficos que comprenden las parffculas de rAAV se tratan posteriormente para reducir la concentracion salina eficaz mediante dilucion, dialisis, diafiltracion o concentracion.
14. 14. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que incluye la etapa de someter una fraccion que comprende parffculas de AAV a cromatograffa de sulfato de heparina.
15. 15. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho provector de rAAV comprende un polinucleotido no de AAV heterologo flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR).
16. 16. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha celula productora de AAV comprende al menos un gen de empaquetamiento de AAV que se integra establemente en el genoma de dicha celula productora de AAV y/o un gen rep de AAV y un gen cap de AAV que pueden estar integrados establemente en el genoma de dicha celula productora de AAV.
17. 17. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho metodo comprende proporcionar dicha celula productora de AAV mediante un proceso que comprende:

    (i) introducir el virus auxiliar en la celula productora que comprende el gen o genes de empaquetamiento de AAV y el provector de rAAV;

    (ii) introducir el provector de rAAV y el virus auxiliar simultanea o secuencialmente en la celula productora que comprende el gen o genes de empaquetamiento de AAV; o

    (iii) introducir el gen o genes de empaquetamiento de AAV y el provector de rAAV simultanea o secuencialmente en la celula huesped que comprende el virus auxiliar.
18. 18. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la celula productora se proporciona mediante un proceso que comprende introducir en la celula productora al menos un gen de division-empaquetamiento de AAV.
19. 19. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho virus auxiliar es un adenovirus, un adenovirus termosensible o adenovirus Ad-ts149.
20. 20. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho virus auxiliar es un virus auxiliar termosensible y dicha etapa de incubacion de la celula productora se realiza a una temperatura que es permisiva para la replicacion de AAV pero no permisiva para la replicacion del virus auxiliar termosensible.
21. 21. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la celula productora es una lmea celular de mairfffero dependiente de union, una ffnea celular de mairfffero adaptada a suspension, una celula N3S de 293 o una celula S3 de HeLa.
22. 22. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun la reivindicacion 1, donde cromatografiar el lisado de celulas productoras de AAV de la etapa c) comprende una combinacion de una cromatograffa de intercambio de aniones cargada positivamente y una cromatograffa de intercambio de cationes cargada negativamente para generar una poblacion purificada de parffculas de rAAV.
23. 23. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun la reivindicacion 22, donde dicha cromatograffa de intercambio de aniones cargada positivamente se efectua antes de dicha cromatograffa de

    5

    10

    15

    20

    25

    intercambio de cationes cargada negativamente.
24. 24. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun la reivindicacion 22, donde dicha cromatograffa de intercambio de cationes cargada negativamente se efectua antes de dicha cromatograffa de intercambio de aniones cargada positivamente.
25. 25. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, que comprende adicionalmente la etapa de someter a cromatograffa el lisado que contiene parffculas de rAAV en sulfato de heparina, efectuandose dicha etapa despues de dicha cromatograffa de intercambio de aniones cargada positivamente y de dicha cromatograffa de intercambio de cationes cargada negativamente.
26. 26. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, que comprende adicionalmente la etapa de someter las celulas productoras a filtracion de flujo tangencial tras al incubacion de la etapa a), pero antes de la lisis de la etapa b).
27. 27. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, donde dicha cromatograffa de intercambio de aniones se efectua en una resina de amino o imino N- cargada, opcionalmente seleccionada entre una resina POROS 50 PI, una resina de dietilaminoetilo (DEAE), una resina de trimetilaminoetilo (TMAE), una resina de amina cuaternaria y una resina de polietilenimina (PEI).
28. 28. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, donde dicha cromatograffa de intercambio de cationes se efectua en una resina cationica basada en sulfo-, fosfo- o carboxilo, opcionalmente seleccionada de una resina de sulfato de heparina (HS), una resina de sulfopropilo (SP) y una resina de carboximetilo (CM).
29. 29. Un metodo de generacion de una poblacion de parffculas de rAAV segun cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, donde se utiliza cultivo de suspension.