CN115485382A - X连锁病症的治疗中的AAV介导的MiRNA靶向 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及靶向miRNA以激活失活的X染色体上的基因的表达。这种基因疗法可用于治疗X连锁病症，包含雷特综合征(Rett syndrome)。

Description

X连锁病症的治疗中的AAV介导的MiRNA靶向
相关申请的交叉引用以及通过引用并入以电子方式提交的材料
本申请要求于2020年2月18日提交的美国临时专利申请第62/978,285号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用以其整体并入。
本申请含有作为本公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：54983_SeqListing.txt；36950字节-ASCII文本文件，创建于2021年2月18日)，所述申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及靶向miRNA以激活失活的X染色体上的基因的表达。这种基因疗法可用于治疗X连锁病症，包含雷特综合征(Rett syndrome)。
背景技术
雷特综合征(RTT)是X连锁神经发育病症，大约10,000名女孩中就有1名受到影响。患者表现出巨大突变和疾病异质性。症状发作的典型特征在于在6-18个月大时丧失先前达到的发育性里程碑以及运动功能和认知功能进行性丧失。美国大约15,000名女孩和妇女以及全球350,000名患者患有RTT。RTT女孩具有各种问题，所述问题可以包含运动问题(失用症、强直、运动障碍、肌张力障碍、震颤)、癫痫、胃肠问题(反流、便秘)、骨科问题(挛缩、脊柱侧凸、髋部问题)、自主神经系统问题(呼吸不规律、心脏问题、吞咽)以及睡眠问题和焦虑。
几乎所有RTT病例都是由X-连锁甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)基因中的新发功能丧失突变引起的。大多数RTT患者是MECP2缺陷杂合的女性，并且由于随机X染色体失活，大约50％的细胞表达突变MECP2基因，而其它50％表达野生型MECP2。
在男性中，雷特综合征的症状通常严重到以至于无法存活。女性的疾病表型由于存在第二X染色体而不那么严重，所述染色体未携带MECP2基因或另一个X连锁基因的突变。在发育期间，每个细胞随机使女性的两条X染色体中的一条失活。因此，女性含有表达MECP2基因的健康拷贝或经突变拷贝的细胞的混合，所述表达取决于细胞是在哪条X染色体上失活的。
RNA干扰(RNAi)是在真核细胞中进行基因调节的机制，其已被视为用于治疗各种疾病。RNAi是指对由微小RNA(miRNA)介导的基因表达的转录后控制。天然miRNA为小的(21-25个核苷酸)非编码RNA，其与同源信使RNA(mRNA)的3'非翻译区共享序列同源性和碱基对，但是在编码区中也可能发生调节。miRNA与mRNA之间的相互作用指导细胞基因沉默机制降解靶mRNA和/或阻止mRNA的翻译。RNAi通路在Duan(编辑),《肌肉基因疗法(Gene Therapy)》中第7章第7.3节,施普林格科学与商业媒体有限责任公司(Springer Science+BusinessMedia,LLC)(2010)汇总。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包含两个145个核苷酸反向末端重复序列(ITR)。AAV存在多种血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,45:555-564{1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,《病毒学杂志》,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》,13(1):67-76(2006)中提供；并且AAV-11基因组在《病毒学(Virology)》,330(2):375-383(2004)中提供。AAVrh.74血清型的克隆在Rodino-Klapac.,等人,《转化医学杂志(Journal ofTranslational Medicine)》5,45(2007)中描述。AAV-B1血清型的分离在Choudhury等人,《分子疗法》24(7):1247-57,2016中描述。在AAV ITR内含有指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)偶联的两个rep启动子(p5和p19)导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶性质，所述酶性质最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性剪接和非共有转译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka,《当前微生物学和免疫学的话题(Current Topics in Microbiology and Immunology)》,158:97-129(1992)中评论。
AAV具有独特的特征，这使其作为例如在基因治疗中将外源DNA递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。将AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA插入，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此一些或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用外源DNA替代。为了产生AAV载体，rep蛋白和cap蛋白可以以反式提供。AAV的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。其易于承受用于使腺病毒失活的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。
需要开发用于治疗X连锁病症，如雷特综合征的治疗方法。
发明内容
本公开提供了一种用于治疗X连锁病症，如由X连锁基因功能丧失突变引起的雷特综合征的新型基因疗法方法。本文提供了靶向一种或多种miRNA的多核苷酸和基因疗法载体，所述一种或多种miRNA已知使X染色体上的一种或多种基因失活。本文公开的多核苷酸和载体被设计成抑制miRNA，并且由此再激活失活的X染色体上的所关注野生型基因。
在各个实施例中，本公开提供了包括微小RNA海绵盒的多核苷酸和载体，其中所述微小RNA海绵盒包括一个或多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列。通过海绵靶向所述所关注miRNA引起所述所关注miRNA的结合和失活、对所述所关注miRNA的表达的抑制和/或增加了与X连锁病症相关的基因(X连锁基因)的表达和/或活性。
如本文所使用的，“靶向”是指与所述所关注miRNA结合、相互作用或杂交。“靶向”所关注miRNA引起或触发所述所关注miRNA的降解或抑制所述所关注miRNA的活性。
在各个实施例中，所述多核苷酸包括一个或多个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列，所述一个或多个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列是与所述所关注微小RNA完全或不完全互补的序列的串联多路复用。在各个实施例中，所述核苷酸包括一个或多个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列，与所关注成熟微小RNA的序列至少85％互补，与所关注成熟微小RNA的序列至少90％互补，与所关注成熟微小RNA的序列至少95％互补，与所关注成熟微小RNA的序列至少96％互补，与所关注成熟微小RNA的序列至少97％互补，与所关注成熟微小RNA的序列至少98％互补，或与所关注成熟微小RNA的序列至少99％互补。
本公开还提供了一种包括微小RNA海绵盒的多核苷酸，其中所述微小RNA海绵盒包括至少2个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列、至少3个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列、至少4个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列或至少2个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列。在相关实施例中，所述微小RNA海绵盒包括2个、4个、6个或8个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列的重复序列。在一些实施例中，海绵序列处于反向朝向，并且因此海绵序列位于所述盒的互补链上。
在各个实施例中，本公开提供了一种包括微小RNA海绵盒的多核苷酸，其中所述微小RNA海绵盒包括一个或多个靶向miR106a的核苷酸序列。例如，所述多核苷酸包括靶向所关注miRNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:1或2中的任一项的核苷酸序列。在各个实施例中，所述多核苷酸包括微小RNA海绵盒，所述微小RNA海绵盒包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、4、5、6、7或8。在各个实施例中，所述海绵盒序列为SEQ ID NO:3、5或7的RNA序列或SEQ ID NO:4、6或8的DNA序列。本公开还提供了一种包括多于一个微小RNA海绵盒的多核苷酸，例如包括两个微小RNA海绵盒、三个微小RNA海绵盒、四个微小RNA海绵盒或五个微小RNA海绵盒的多核苷酸。这些微小RNA海绵盒可以靶向同一微小RNA或不同的微小RNA。
本公开还提供了一种重组AAV病毒(rAAV)，所述rAAV具有基因组，所述基因组包括本文公开的多核苷酸序列中的任何多核苷酸序列。在各个实施例中，所述rAAV基因组包括U6启动子。在替代性实施例中，所述rAAV基因组包括H1启动子、7SK或其它聚合酶3启动子。在这些实施例中的任何实施例中，所述启动子处于反向朝向，并且因此所述U6启动子位于所述基因组的互补链上。在各个实施例中，所述rAAV基因组进一步包括填充物序列。如本文所使用的，所述“填充物序列”是指包含在载体(例如rAAV)中以保持载体构建体的最佳包装长度的可变长度的非编码核苷酸序列。例如，所述rAAV进一步包括包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列的填充物序列。在各个实施例中，所述rAAV基因组包括SEQ ID NO:21的核苷酸序列的核苷酸980至3131。在其它实施例中，所述rAAV基因组包括SEQ ID NO:22的核苷酸序列的核苷酸980至2962。在各个实施例中，载体是血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13、Anc80或AAV7m8或其衍生物。
本公开提供了一种rAAV颗粒，其包括本文公开的rAAV中的任何rAAV。本公开还提供了一种组合物，其包括本文公开的多核苷酸、rAAV或rAAV颗粒中的任一种。
本公开提供了治疗雷特综合征的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文公开的rAAV中的任一种rAAV。本公开还提供了治疗有效量的本文公开的rAAV中的任一种rAAV的用途，其用于制备用于治疗雷特综合征的药物。本公开还提供了一种组合物，其包括用于治疗雷特综合征的本文公开的多核苷酸、rAAV或rAAV颗粒中的任一种。
本公开提供了激活X连锁基因的表达的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文公开的rAAV中的任一种rAAV。本公开还提供了治疗有效量的本文公开的rAAV中的任一种rAAV的用途，其用于制备用于激活X连锁基因的表达的药物。本公开还提供了一种组合物，其包括用于激活X连锁基因的表达的本文公开的多核苷酸、rAAV或rAAV颗粒中的任一种。在各个实施例中，所述X连锁基因为甲基CpG结合蛋白2(MECP2)。
本公开提供了治疗X连锁病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文公开的rAAV中的任一种rAAV以治疗X连锁病症。本公开还提供了治疗有效量的本文公开的rAAV中的任一种rAAV的rAAV的用途，其用于制备用于治疗X连锁病症的药物。在相关实施例中，所述X连锁病症为雷特综合征、A型血友病、B型血友病、登特氏病1(Dent's disease 1)、登特氏病2、DDX3X综合征、白化病-耳聋综合征、奥尔德里奇综合征(Aldrich syndrome)、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、贫血(Anaemia)(遗传性低色素性)、贫血(Anemia)(铁粒幼细胞性以及共济失调)、白内障、夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth)、色盲症、糖尿病(尿崩症，肾源性)、先天性角化不良、外胚层发育不良、面生殖发育不良(Faciogenitaldysplasia)、法布里病(Fabry disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、糖原贮积病VIII型、性腺发育不全、睾丸女性化综合征、伴随脑硬化症的阿狄森氏病(Addison's disease)、肾上腺发育不全、肉芽肿病、赛德瑞斯型X连锁精神迟钝综合征(siderius X-linkedmental retardation syndrome)、布鲁顿型无丙种球蛋白血症(AgammaglobulinaemiaBruton type)、脉络膜视网膜变性、无脉络膜症、白化病(眼)、脆性X综合征、癫痫性脑病(婴儿早期2)、脑积水(导水管狭窄)、血磷酸盐过低性佝偻病、莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhansyndrome)(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺乏症)、色素失调症、卡尔曼综合征(Kallmann syndrome)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脊髓性肌萎缩症2、痉挛性截瘫、棘状毛囊角化病、洛伊(眼脑肾)综合征(Lowe(oculocerebrorenal)syndrome)、门克斯综合征(Menkes syndrome)、Renpenning综合征(Renpenning Syndrome)、精神迟钝、科-勒综合征(Coffin-Lowry syndrome)、小眼症(楞次综合征(Lenz syndrome))、肌营养不良(贝克、杜氏和埃-德二氏型(Becker,Duchenne and Emery—Dreifuss types))、肌管性肌病、夜盲症、诺里氏病(Norrie's disease)(假神经胶质瘤)、眼球震颤、口面指综合征、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(I型高血氨症)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏症、视网膜色素变性、视网膜劈裂症、肌萎缩/二氢睾酮受体缺乏症、脊髓性肌萎缩、迟发性脊椎骨骺发育不良、血小板减少症、甲状腺素结合球蛋白、麦克劳德综合征(McLeod syndrome)。
本公开的其它特征和优点将从以下详细说明中变得显而易见。然而，应当理解，尽管详细描述和具体实例表示本公开的优选实施例，但其仅以说明的方式给出，因为根据此详细描述本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
图1A-1D示出了作为XCI的表观遗传调节因子的miRNA。(图1A)CRISPR/Cas9全基因组筛选的总体示意图。用lentiCRISPRv2文库以0.2的MOI对稳定表达Cas9的BMSL2细胞进行了转导。嘌呤霉素选择后，将具有Xi-Hprt表达的细胞富集在HAT选择培养基中。(图1B)对BMSL2中表达所指示的miRNA的sgRNA的Hprt和MECP2进行的qRT-PCR。结果相对于对照(NS)归一化。(图1C)对用对照或miR106i和野生型(WT)神经元处理的RTT中的MECP2中进行的等位基因特异性Taqman分析。误差条，SD；*，p<0.01。图1D中示出了雄性小鼠和雌性小鼠两者的皮质、脾、肝和肺组织中的miR106a的相对表达水平。
图2A-2D示出了miR106a抑制在不影响生存力的情况下再激活已知靶标。(图2A)对PAK5和Ankrd52进行的qRT PCR，(图2B)对用NS或miR106抑制剂或miR106a sgRNA处理的细胞进行的MTT测定。黑色虚线表示第0天时的接种密度。误差条，SD。图2C-2D示出了在存在和不存在miR106a抑制剂(图2C)或miR106a SgRNA(图2D)的情况下Patski细胞和雷特神经元中的MECP2转录物的相对表达水平。
图3A-3C示出了miR106a与RepA相互作用。(图3A)用于捕获miR106a-RepA复合物的策略。(图3B)使用错配的、完全或不完全互补的寡核苷酸从miR106a-RepA复合物中竞争性洗脱RepA。(图3C)监测用miR106a模拟物处理的BMSL2细胞中的RepA的qRT-PCR。Chr14为阴性对照。误差条，SD；*，p<0.01。
图4A-4C示出了miR106a不调节Xist转录。(图4A)监测H4SV中Xist和Gfp启动子上的PolII结合的ChIP。(图4B)用于用非沉默子(NS)或miR106a抑制剂处理的H4SV中的Xist表达的qRT-PCR。(图4C)在放线菌素D处理后对NS或miR106a缺失的H4SV中的Xist的qRT-PCR分析。GAPDH用作归一化对照。误差条，SD。
图5A-5D监测用对照或miR106i处理的细胞中的Xist的RNA FISH的代表性成像和定量。(图5A)使用图像J对Xist云面积和Xist点状染色进行的定量(图5B)。误差条，SD；*，p<0.01。图5C和5D示出了miR106a-RepA自由能(图5C)和miR106a-RepA结合(图5D)。
图6示出了miRNA海绵对miR106a的抑制。表达对照或miR106sp或miR106sp和miR106i的BMSL2中的海肾活性。误差条，SD；*，p<0.01。
图7A-7C示出了miR106a的丢失在RTT神经元中表达MECP2以挽救表型缺陷。(图7A)对用对照或LTV-miR106sp处理的RTT和野生型(WT)神经元中的MECP2的Taqman分析。(图7B-C)对用对照或LTV-miR106sp处理的MAP2+RTT神经元中的胞体面积(图7B)和神经元分支点的数量(图7C)的定量分析。误差条，SD；*，p<0.01。
图8A-8B示出了miR106a耗竭挽救了RTT神经元中的活性依赖性Ca2+瞬变。(图8A)在Ca2+成像期间获取的代表性图像，其示出了对照RTT(NS)、经miR106sp处理的(miR106sp)和野生型(WT)神经元。颜色的暖度与Ca2+浓度相对应。(图8B)NS、miR106sp和WT神经元中的Ca2+尖峰(左)和神经元信号传导百分比(右)(n＝100)。误差条，SD。*，p<0.01。
图9A-9C示出Mir106a抑制剂在源自XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2小鼠模型的原代小鼠胚胎成纤维细胞中表达Xi连锁的MECP2。(图9A)用于产生XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2的繁殖策略的示意图。(图9B)通过FACS分析对从小鼠的脑细胞中分离的GFP+核进行的定量分析。(图9C)监测在用对照或mir106i处理后Mecp2-Gfp和Mecp2在雌性XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEF中的表达的RT-PCR分析。GAPDH作为上样对照进行监测。
图10A-10C示出了AAV9-mir106sp在XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠的脑中表达Xi连锁MECP2。(图10A)对注射了AAV9-Gfp的小鼠的脑细胞进行的荧光分析。(图10B)对注射了AAV9对照和AAV9-miR106sp的XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠的脑中的Mecp2-Gfp表达进行的荧光分析。(图10C)监测在用对照(媒剂)或mir106sp处理后Mecp2-Gfp和Mecp2在雌性XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠中的表达的RT-PCR分析。GAPDH作为上样对照进行监测。
图11A-11B示出了病毒载体，即pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan图(图11A)和pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan载体序列(图11B)。
图12A-12B示出了病毒载体，即pAAV.miR106a shRNA.填充物.Kan图(图12A)和pAAV.miR106a shRNA.填充物.Kan载体序列(图12B)。
图13A-13D示出了以下的RNA序列：具有8个海绵的mir106a海绵(sp 1)设计1(图13A，海绵序列为[SEQ ID NO:7](下部序列)，其被示出为紧挨着上方的小鼠miR106a-5p靶序列[SEQ ID NO:20])、mir106a海绵(sp 1)设计2(图13B[SEQ ID NO:3])、mir106a海绵(sp1)设计3(图13C[SEQ ID NO:5])以及靶向miR106a的示例性shRNA序列(图13D[SEQ IDNO:15])。
图14A-14D示出了AAV9-miR106sp挽救了雌性ΔCpG-RTT小鼠的行为缺陷。(图14A)注射AAV9对照(圆形)和AAV9-miR106sp(正方形)的雌性小鼠在4周和7周的转棒性能。第1天表示基线性能；最大时间为300秒(虚线)。(图14B-D)第7周的巴恩斯迷宫(Barnes maze)性能，其被绘制为注射AAV9对照(圆形)和AAV9-miR106sp(正方形)的雌性小鼠的平均时延(图14B)、平均速度(图14C)和行进的总距离(图14D)。n＝3。误差条，SD。*，p<0.01。
图15A-15C示出了直至250日龄的存活率以及16周龄的经AAV9.miR106sp处理的动物(小鼠)的表型评分和转棒性能。(图15A)经AAV9对照(空病毒颗粒)处理的动物对健康同窝仔(遗传对照)和经AAV9-miR106sp处理的动物的存活率曲线示出存活率明显提高，直至250天无死亡。(图15B)展示了相比于经AAV9对照处理的动物，经处理的动物直至21周龄的表型评分提高的图。(图15C)经AAV9-miR106sp处理的动物在16周龄时相比于AAV9对照动物或未经处理的动物的转棒性能表明，以秒为单位(p<0.0001)测量的握住旋转轮的能力显著提高，所述能力以每个组中的单独动物的热图形式(上图)呈现并且在图表(下图)中进行量化。误差条表示SEM。
具体实施方式
本公开提供了一种用于治疗X连锁病症，如由X连锁基因功能丧失突变引起的雷特综合征的新型基因疗法方法。例如，雷特综合征是X连锁病症，主要影响女性，是X连锁甲基CpG结合蛋白2(MECP2)基因的杂合性功能丧失突变的结果。本文公开的基因疗法方法利用了每个表达MeCP2的突变形式的细胞还含有失活的X染色体上的基因的天然备份拷贝的事实。因此，对沉默的染色体的一部分的再激活再表达健康基因。
本文提供了靶向已知使X染色体上的基因失活的miRNA的基因疗法载体。本文公开的基因疗法被设计为抑制miRNA，并且由此使失活的X染色体上的所关注野生型基因具有反应性。例如，miRNA106a已知使X染色体的一部分，包含MECP2基因失活，并且靶向miRNA106a的基因疗法方法将再激活X染色体上此簇中的基因的表达。
微小RNA
微小RNA(miRNA)是约22个核苷酸的单链RNA，其通过与mRNA的3'UTR内的碱基配对以转录后水平介导基因沉默，从而抑制翻译或促进mRNA降解。miRNA的5'端处的7bp的种子序列靶向miRNA；通过所靶向序列的其余部分以及其二级结构提供另外的识别。
MiRNA海绵
为了在体内实现高效miRNA抑制，设计了miRNA功能丧失“海绵”。在各个实施例中，本公开提供了一种核酸或核苷酸盒，所述盒充当竞争性地抑制体内的一种或多种成熟miRNA的微小RNA海绵。miRNA海绵是包括多个靶位点的与所关注miRNA互补的核苷酸序列。这些靶位点被设计为与所关注miRNA结合，这进而会引起所靶向miRNA的降解。
例如，本文提供了被设计成靶向与雷特综合征和/或其它X连锁病症相关的miRNA106a的微小RNA海绵。将海绵靶向miRNA106a将诱导miRNA106a降解，并且因此干扰miRNA106a诱导的X染色体沉默，并且由此再激活X染色体上的基因，例如MECP2基因。
如本文所用，“所关注miRNA”是指微小RNA海绵或小RNA与其结合并使其失活或阻止其表达的一种或多种miRNA(即miRNA海绵靶向的miRNA)。在各个实施例中，海绵可以靶向多个所关注微小RNA。
在各个实施例中，海绵盒可以包括与所关注miRNA结合的完全或不完全互补的核苷酸序列的串联多路复用，所述的完全或不完全互补的核苷酸序列“吸干”任何所关注miRNA。在相关实施例中，靶向所关注微小RNA的不完全互补的核苷酸序列可能引起海绵盒“膨胀”。“膨胀”是指海绵盒可以形成的二级核酸结构。
海绵盒包括一个或多个靶向所关注miRNA或与所述所关注miRNA结合的序列。海绵盒可以包括多个靶向单个所关注miRNA的相同核酸或核苷酸序列，或者海绵盒可以包括多个靶向单个所关注miRNA的不同序列。可替代地，海绵盒可以包括多个靶向一种或多种所关注miRNA的不同核苷酸序列。
此外，微小RNA海绵盒可以包括一个或多个靶向所关注miRNA的核苷酸序列。在各个实施例中，一个或多个靶向所关注微小RNA的核苷酸序列与所关注成熟微小RNA序列至少85％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少90％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少95％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少96％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少97％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少98％互补或与所关注成熟微小RNA序列至少99％互补。
在各个实施例中，微小RNA海绵盒包括至少2个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列、至少3个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列、至少4个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列或至少2个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列。
在各个实施例中，海绵盒包括与1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的所关注miRNA结合的核苷酸序列。在某些实施例中，海绵盒包括一个或多个靶向一种所关注miRNA的核苷酸序列。在某些实施例中，海绵盒包括一个或多个靶向两种不同的所关注miRNA或三种不同的所关注miRNA或四种不同的所关注miRNA或五种不同的所关注miRNA的核苷酸序列。
在各个实施例中，海绵盒包括靶向所关注miRNA的核苷酸序列的多个拷贝或“重复序列”，其中“吸干”任何所关注miRNA存在于载体所表达的位点处。在各个实施例中，一个或多个海绵盒可以含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向所关注miRNA的核苷酸序列的重复序列。在某些实施例中，海绵盒含有2个靶向所关注miRNA的核苷酸序列的重复序列。在某些实施例中，海绵盒含有4个靶向所关注miRNA的序列的重复序列。在某些实施例中，海绵盒含有6个靶向所关注miRNA的核苷酸序列的重复序列。在某些实施例中，海绵盒含有8个靶向所关注miRNA的序列的重复序列。
在一些实施例中，rAAV还可以含有填充物序列。填充物序列被包含在载体中以保持病毒载体构建体的最佳包装长度。填充物序列的长度取决于海绵盒的长度。例如，载体含有在长度上长度的范围为1000个到1500个碱基、或长度的范围为500个到2000个碱基或长度的范围为100个到1000个碱基的填充物序列。示例性填充物序列的长度为100个碱基、或长度为200个碱基、或长度为300个碱基、或长度为400个碱基、或长度为500个碱基、或长度为600个碱基、或长度为700个碱基、或长度为800个碱基、或长度为900个碱基、或长度为1000个碱基、或长度为1100个碱基、或长度为1200个碱基、或长度为1300个碱基、或长度为1400个碱基、或长度为1500个碱基、或长度为1600个碱基、或长度为1700个碱基、或长度为1800个碱基、或长度为1900个碱基、或长度为2000个碱基。迄今为止，没有一种FDA批准的填充物序列是容易获得的。然而，有几种已被FDA批准用于人类施用的质粒主链。从这些质粒中挑选出不与质粒或转录单元的元件的选择和复制所需的任何必需DNA序列相对应的小DNA片段。示例性质粒主链列于表1中并且示出于图11A-11B中。将来自不同质粒的DNA元件串联布置以产生完整的1350bp填充物序列(SEQ ID NO:11)。
miRNA106a
大规模的功能丧失筛选鉴定出当受到抑制时允许来自失活的X染色体的MECP2基因再表达的miRNA。基于细胞模型的结果，miRNA海绵被设计成抑制微小RNA106a(也被称为“miRNA106a”或“miR106a”)，并且载体被设计成在体内递送这种海绵。在各个实施例中，本公开提供了载体，如重组AAV载体(rAAV)，所述载体包括一种或多种靶向所关注miRNA，如miR106a的微小RNA海绵盒。MiR106a由X染色体上的miR106a-363簇编码。对可公开获得的miR106a-CLIP数据的分析揭示了XistRNA中的多个miR106a种子区。miR-106a的上调与患有胃癌的患者的肿瘤转移正相关。MiR106a敲除小鼠可存活，并且没有显示出表型。MiR106a在小鼠大脑皮质中高度表达。
在示例性实施例中，海绵盒包括靶向miRNA106a(miR106a)的序列。小鼠miRNA106a-5p的序列在SEQ ID NO:20中提供，并且人miRNA106a-5p的序列在SEQ ID NO:25中提供。靶向miRNA106a的示例性序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示。miRNA106(a)海绵序列可以包括SEQ ID NO:1或2的一个或多个拷贝，或与SEQ ID NO:1或2至少90％相同的序列的一个或多个拷贝。SEQ ID NO:1或2的拷贝可以由间隔子序列，如AGTTA(SEQ IDNO:18)或AGUUA(SEQ ID NO:19)，在SEQ ID NO:1或2中的任一项的拷贝之间分开。在各个实施例中，miR106a海绵是如SEQ ID NO:3、4、5、6、7或8中或SEQ ID NO:21的AAV基因组内所示的核苷酸序列(核苷酸1144-1368)。在各个实施例中，miR106a海绵盒序列包括SEQ ID NO:1或2中任一项所示的核苷酸序列或其变体，所述变体包括与SEQ ID NO:1或2中任一项所示的核苷酸序列至少约90％的同一性。在这些实施例中的任何实施例中，海绵序列处于反向朝向，并且因此海绵序列位于盒的互补链上。
MiRNA小RNA
如上文所述，本公开包含要单独使用或与本文所述的miRNA海绵结合使用的抑制性RNA的用途，其用于进一步降低或抑制所关注miRNA活性和/或表达。因此，在一些方面，本公开的产物和方法还包括用于影响所关注miRNA表达(例如，敲除或抑制表达或使一种或所关注miRNA失活)的短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)。短发夹RNA(shRNA/发夹载体)是具有紧密发夹环的人工RNA分子(核苷酸)，其可以用于通过RNA干扰(RNAi)来沉默靶基因表达。ShRNA是RNAi的有利介体，因为其具有相对低的降解和周转速率，但其需要使用表达载体。在载体转导了宿主基因组后，shRNA随后通过聚合酶II或聚合酶III在细胞核中转录，这取决于启动子选择。所述产物模拟初级微小RNA(pri-miRNA)，并且由Drosha处理。通过输出蛋白5将所得pre-shRNA从细胞核中导出。然后由Dicer对此产物进行处理，并且将其上样到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。有义(过客)链被降解。反义(向导)链将RISC导向到具有互补序列的mRNA。在完全互补的情况下，RISC切割mRNA。在不完全互补的情况下，RISC抑制mRNA的翻译。在这两种情况下，shRNA引起靶基因沉默。在一些方面，本公开包含产生和施用通过shRNA表达一个或多个miRNA靶向反义序列的AAV载体。shRNAs的表达通过使用各种启动子来调节。启动子选择对于实现稳健的shRNA表达是必须的。在各个方面，使用聚合酶II启动子，如U6和H1，以及聚合酶III启动子。在一些方面，使用U6 shRNA。
在各个实施例中，本公开提供了载体，所述载体包括一种或多种靶向一种或多种所关注miRNA的小RNA。在各个实施例中，所述小RNA被设计成靶向一种或多种与X连锁病症(例如雷特综合征)相关的所关注miRNA。在各个实施例中，小RNA与所关注微小RNA的结合将诱导其降解，并且因此干扰X染色体沉默。
在各个实施例中，如本文所使用的，术语“一种小RNA”或“多种小RNA”是指已知触发哺乳动物细胞中的RNAi过程的小RNA，包含短(或小)干扰RNA(siRNA)以及短(或小)发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)。小RNA的长度<200个核苷酸，并且是典型地非编码RNA分子。
在各个实施例中，小RNA是包括靶向一种或多种所关注微小RNA的核苷酸序列的多核苷酸。在相关实施例中，小RNA包括与1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的所关注miRNA结合的核苷酸序列。在某些实施例中，小RNA包括一个或多个靶向一种所关注miRNA的核苷酸序列。在某些实施例中，小RNA包括一个或多个靶向两种不同的所关注miRNA或三种不同的所关注miRNA或四种不同的所关注miRNA或五种不同的所关注miRNA的核苷酸序列。
在一些实施例中，rAAV还可以含有填充物序列。填充物序列被包含在载体中以保持病毒载体构建体的最佳包装长度。填充物序列的长度取决于海绵盒的长度。例如，载体含有在长度上长度的范围为1000个到1500个碱基、或长度的范围为500个到2000个碱基或长度的范围为100个到1000个碱基的填充物序列。示例性填充物序列的长度为100个碱基、或长度为200个碱基、或长度为300个碱基、或长度为400个碱基、或长度为500个碱基、或长度为600个碱基、或长度为700个碱基、或长度为800个碱基、或长度为900个碱基、或长度为1000个碱基、或长度为1100个碱基、或长度为1200个碱基、或长度为1300个碱基、或长度为1400个碱基、或长度为1500个碱基、或长度为1600个碱基、或长度为1700个碱基、或长度为1800个碱基、或长度为1900个碱基、或长度为2000个碱基。迄今为止，没有一种FDA批准的填充物序列是容易获得的。然而，有几种已被FDA批准用于人类施用的质粒主链。从这些质粒中挑选出不与质粒或转录单元的元件的选择和复制所需的任何必需DNA序列相对应的小DNA片段。示例性质粒主链列于表2中并且示出于图12A-12B中。将来自不同质粒的DNA元件串联布置以产生完整的1350bp填充物序列(SEQ ID NO:11)。
因此，在一些方面，本公开使用U6 shRNA分子来进一步抑制、敲除或干扰与X连锁病症相关的所关注miRNA表达。传统小/短发夹RNA(shRNA)序列通常在细胞核内从含有如U6等Pol III启动子的载体开始转录。内源性U6启动子通常控制U6 RNA，即参与剪接的小RNA的表达，并且已被很好地表征[Kunkel等人,《自然(Nature)》322(6074):73-7(1986)；Kunkel等人,《基因与发育(Genes Dev.)》2(2):196-204(1988)；Paule等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》28(6):1283-98(2000)]。在一些方面，U6启动子用于控制哺乳动物细胞中的shRNA分子的基于载体的表达[Paddison等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,99(3):1443-8(2002)；Paul等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》20(5):505-8(2002)]，因为(1)启动子被RNA聚合酶III(poly III)识别并控制shRNA的高水平组成型表达；并且(2)启动子在大多数哺乳动物细胞类型中是有活性的。在一些方面，启动子是III型Pol III启动子，因为控制shRNA的表达所需的所有元件都位于转录起始位点的上游(Paule等人,《核酸研究》28(6):1283-98(2000))。本公开包含鼠和人U6或H1启动子两者。在一些实施例中，U6启动子处于反向朝向，并且其位于AAV基因组的互补链上。将含有来自由环连接的靶基因的有义序列和反义序列的shRNA从细胞核转运到细胞质中，在所述细胞质中Dicer将所述shRNA处理成小/短干扰RNA(siRNA)。在这些实施例中的任何实施例中，shRNA处于反向朝向，并且因此所述shRNA位于AAV基因组的互补链上。
随着对天然RNAi通路的理解发展，研究人员设计了用于在调节靶基因的表达中使用以治疗疾病的人工shRNA。已知几种类别的小RNA触发哺乳动物细胞中的RNAi过程，包含短(或小)干扰RNA(siRNA)和短(或小)发夹RNA(shRNA)以及微小RNA(miRNA)，这些RNA构成了相似类别的载体表达的触发[Davidson等人,《自然评论：遗传学(Nat.Rev.Genet.)》12:329-40,2011；Harper,《神经病学档案(Arch.Neurol.)》,66:933-8,2009]。ShRNA和miRNA在体内由基于质粒或病毒的载体表达，并且因此可以通过单次施用实现长期基因沉默，只要载体存在于靶细胞核内并且驱动启动子是有活性的(Davidson等人,《酶学方法(MethodsEnzymol.)》392:145-73,2005)。重要的是，这种载体表达的方法利用了肌肉基因疗法领域已经取得的长达数十年的进展，但是与表达蛋白质编码基因相反，RNAi治疗策略中的载体货物是靶向所关注疾病基因的人工shRNA或miRNA盒。此策略用于表达天然miRNA。每种shRNA/miRNA都基于hsa-miR-30a序列和结构。天然mir-30a成熟序列被衍生自靶miRNA的独有有义和反义序列取代。
使X染色体上的基因失活的MiRNA
在许多X连锁病症中，在发育期间，每个细胞随机使女性的两条X染色体中的一条失活。因此，女性含有表达X连锁基因的健康拷贝或经突变拷贝的细胞的混合，所述表达取决于细胞是在哪条X染色体上失活的。本文公开的基因疗法方法利用了每个表达X连锁基因的突变形式的细胞还含有失活的X染色体上的X连锁基因的天然备份拷贝的事实。因此，对沉默的染色体的一部分的再激活允许再表达健康基因。
如本文所公开的，进行了基于CRISPR/Cas9的筛选，以鉴定参与失活性X染色体(Xi)的沉默的小非编码RNA。与X连锁病症相关的某些基因(X连锁基因)位于X染色体上，其等位基因特异性表达模式通过X染色体失活(XCI)，即随机使女性X染色体之一失活的表观遗传机制确定。如miRNA等某些小非编码RNA可以是XCI的表观遗传调节因子。这些miRNA(例如miR106a)抑制与X连锁病症相关的基因(例如MECP2)的表达和/或活性。对这些X连锁miRNA靶标的抑制增加了与X连锁病症相关的基因的表达和/或活性。
在各个实施例中，本公开提供了包括靶向一种或多种所关注miRNA的海绵盒的载体。本公开还提供了包括靶向一种或多种所关注miRNA的小RNA的载体。通过海绵或小RNA靶向所关注miRNA引起所关注miRNA的结合和失活、对所关注miRNA的表达的抑制和/或增加了与X连锁病症相关的基因的表达和/或活性。
甲基CpG结合蛋白2
所述甲基CpG结合蛋白2(MECP2)基因编码MECP2蛋白。在基因表达中进行区域和细胞类型特异性改变的情况下，MECP2是充当重要表观遗传读取器和中枢神经系统中的数千个基因的阻遏子的核蛋白。在95％的典型雷特综合征(RTT)病例中，疾病是由MECP2，即中枢神经系统(CNS)中的基因表达的关键调节因子的缺乏引起的。RTT的潜在临床表型是以神经元的致密化为特征的全局神经元表型，所述致密化的特征为较小的胞体和缩短且较少的神经突。此外，在临床上并且动物模型已显示，疾病严重程度与依赖于各种MECP2突变的神经解剖学变化之间的直接连接联系。
使用磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和激活素A受体1型的小分子抑制剂评估了在体内表达Xi连锁MECP2的可行性和安全性(2、3)。Xi连锁基因的表达在经处理的动物中没有引起任何副作用，并且在如肝等组织中没有观察到脱靶效应(2)。
在各个实施例中，本公开提供了载体或组合物，所述载体或组合物包括靶向调节MECP2基因表达的所关注miRNA的海绵盒或小RNA。在各个实施例中，海绵盒或小RNA的表达激活了MECP2基因的表达。
雷特综合征和X连锁病症
本文公开的载体中的任何载体都可以用于治疗X连锁病症。例如，本文公开的载体中的任何载体都可以用于治疗雷特综合征。雷特综合征(RTT)是神经发育病症，其影响女孩，几乎排他地发病率为约10,000例活产中就有1例。
可以用本文公开的载体中的任何载体治疗的X连锁病症包含但不限于雷特综合征、A型血友病、B型血友病、登特氏病1、登特氏病2、白化病-耳聋综合征、奥尔德里奇综合征、奥尔波特综合征、贫血(Anaemia)(遗传性低色素性)、贫血(Anemia)(铁粒幼细胞性以及共济失调)、白内障、夏柯-马利-杜斯氏病、色盲症、糖尿病(尿崩症，肾源性)、先天性角化不良、外胚层发育不良、面生殖发育不良、法布里病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、糖原贮积病VIII型、性腺发育不全、睾丸女性化综合征、伴随脑硬化症的阿狄森氏病、肾上腺发育不全、肉芽肿病、赛德瑞斯型X连锁精神迟钝综合征、布鲁顿型无丙种球蛋白血症、脉络膜视网膜变性、无脉络膜症、白化病(眼)、脆性X综合征、癫痫性脑病(婴儿早期2)、脑积水(导水管狭窄)、血磷酸盐过低性佝偻病、莱施-尼汉综合征(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺乏症)、色素失调症、卡尔曼综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脊髓性肌萎缩症2、痉挛性截瘫、棘状毛囊角化病、洛伊(眼脑肾)综合征、门克斯综合征、Renpenning综合征、精神迟钝、科-勒综合征、小眼症(楞次综合征)、肌营养不良(贝克、杜氏和埃-德二氏型)、肌管性肌病、夜盲症、诺里氏病(假神经胶质瘤)、眼球震颤、口面指综合征、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(I型高血氨症)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏症、视网膜色素变性、视网膜劈裂症、肌萎缩/二氢睾酮受体缺乏症、脊髓性肌萎缩、迟发性脊椎骨骺发育不良、血小板减少症、甲状腺素结合球蛋白、麦克劳德综合征。
可以使用本文公开的载体中的任何载体治疗的另外的X连锁病症列于Germain,“第7章：X连锁疾病的总体方面(Chapter 7:General aspects of X-linked diseases)”,《法布里病：FOS的5年展望(Fabry Disease:Perspectives from 5Years of FOS)》MehtaA、Beck M、Sunder-Plassmann Gc编辑(牛津：牛津泛华医药公司(Oxford:OxfordPharmaGenesis)；2006)；《疾病和病症(Diseases and Disorders)》(Marshall Cavendis出版社,2007)，所述文献均通过引用并入。
在各个实施例中，本公开提供了包括载体或组合物，所述载体或组合物包括rAAV，所述rAAV包括靶向调节X连锁基因表达的一种或多种所关注miRNA的海绵盒或小RNA中的任一种。在各个实施例中，所公开的海绵盒或小RNA的表达激活X连锁基因的表达。
癌症
可以用本文公开的载体中的任何载体治疗的示例性病状或病症包含癌症。在各个实施例中，癌症包含但不限于胃癌、骨癌、肺癌、肝细胞癌、胰腺癌、肾癌、纤维化癌、乳腺癌、骨髓瘤、鳞状细胞癌、结肠直肠癌和前列腺癌。在相关方面，癌症是转移性的。在相关方面，癌转移包含骨或骨骼组织、肝、肺、肾或胰腺的转移。设想的是，本文的方法可以减小受试者的肿瘤大小或肿瘤负荷，和/或减少受试者的转移。在各个实施例中，所述方法将肿瘤大小减小10％、20％、30％或更多。在各个实施例中，所述方法将肿瘤大小减小10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
AAV
在一些方面，本公开提供了一种腺相关病毒(AAV)，所述AAV包括本公开中提供的任何一种或多种核苷酸。在各个实施例中，所述一种或多种核苷酸是本文公开的微小RNA海绵。在各个实施例中，基因疗法载体是单链或自身互补性腺相关病毒载体血清型9(AAV9)或类似载体，如AAV8、AAV10、Anc80和AAV rh74。本公开的重组AAV基因组包括一个或多个miRNA海绵分子和侧接核苷酸分子的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自重组病毒可以衍生自的任何AAV血清型，包含但不限于AAV血清型AAV-B1、AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、Anc80或AAV7m8或其衍生物。在例如WO 01/83692中公开了假型rAAV的产生。还考虑了其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,《分子疗法》,22(11):1900-1909(2014)中评论。如以上“背景技术”部分所提到的，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。
本公开还在组合物中提供了本公开的核苷酸序列中的任何一个或多个核苷酸序列和本公开的AAV中的任何一个或多个AAV。在一些方面，组合物还包括稀释剂、赋形剂和/或可接受的载体。在一些方面，载体为药学上可接受的载体或生理学上可接受的载体。
在各个实施例中，基因疗法载体含有竞争性地抑制成熟miR106a的微小RNA海绵盒。在相关实施例中，所述海绵是与成熟微小RNA 106a完全或不完全互补的序列的串联多路复用。微小RNA 106a先前被鉴定为通过与Xist非编码RNA相互作用来调节X染色体失活。海绵与微小RNA的结合将诱导其降解，并且因此干扰X染色体沉默。在各个实施例中，微小RNA海绵的表达将由U6控制。
在各个实施例中，基因疗法载体可以通过以下注射方法之一或使用注射方法中的几种注射方法的组合来递送：静脉内递送、通过脑脊液(CSF)递送、通过腰鞘内注射或进入CSF的其它注射方法。
在各个实施例中，在人或大型动物物种中进行CSF递送，可以将病毒载体与造影剂(欧乃派克(Omnipaque)或类似物)混合。在相关实施例中，造影剂组合物可以包括非离子低渗透造影剂。在相关实施例中，所述组合物可以包括非离子低渗透造影剂，其中所述非离子低渗透造影剂选自由以下组成的组：碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰和其组合。在某些实施例中，紧接着CSF注射后，可以将患者以头向下倾斜15-30度角保持在特伦德伦伯卧位(Trendelenburg position)持续5分钟、10分钟或15分钟。在相关实施例中，基于年龄组，CSF剂量的范围将为1e13个病毒基因组(vg)/患者-1e15 vg/患者。在各个实施例中，静脉内递送剂量的范围将介于1e13 vg/千克(kg)体重与2e14 vg/kg之间。
在各个实施例中，载体可以用于由X染色体上存在的基因的功能丧失突变引起的另外的疾病，如其它X连锁病症，例如DDX3X综合征和脆性X综合征。
还设想了自身互补性AAV(scAAV)载体用于在本公开中使用。ScAAV载体是通过将载体大小减少至大约2500个碱基对产生的，所述碱基对包括独有转基因序列的2200个碱基对加上包装为二聚体的145个碱基对ITR的两个拷贝。所述scAAV能够再折叠成双链DNA模板以供表达。McCarthy,《分子疗法》16(10):1648-1656,2008。
本公开的DNA质粒包括rAAV基因组。将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配成感染性病毒颗粒。用于产生rAAV颗粒的技术是本领域的已知的，其中将待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自重组病毒可以衍生自的任何AAV血清型并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清，包含但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、以及AAV-13。假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中公开，所述文献通过引用以其整体并入本文。
一种产生包装细胞的方法是创建稳定表达AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因以及可选择的标记物(例如新霉素抗性基因)整合到细胞的基因组中。已经通过如GC拖尾等程序将AAV基因组引入到细菌质粒中(Samulski等人,1982,《美国国家科学院院刊》,79:2077-2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(Laughlin等人,1983,《基因(Gene)》,23:65-73)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter,1984,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,259:4661-4666)。然后用例如腺病毒的等辅助病毒感染包装细胞系。这种方法的优点在于细胞为可选择的并且适合于大规模产生rAAV。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而非质体将rAAV基因组和/或rep及cap基因引入包装细胞。
rAAV产生的一般原理在例如以下中进行了评论：Carter,1992,《生物技术时论(Current Opinions in Biotechnology)》1533-539；以及Muzyczka,1992,《微生物学与免疫学当前课题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》158:97-129)。各种方法描述于Ratschin等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》,81:6466(1984)；Tratschin等人,《分子与细胞生物学》5:3251(1985)；McLaughlin等人,《病毒学杂志》,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,1988《分子与细胞生物学》,7:349(1988)。Samulski等人,(1989,《病毒学杂志》,63:3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和对应的美国专利第5,658.776号；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)《疫苗(Vaccine)》13:1244-1250；Paul等人(1993)《人类基因疗法(Human GeneTherapy)》4:609-615；Clark等人(1996)《基因疗法(Gene Therapy)》3:1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利第6,258,595号。前述文献在此通过引用以其整体并入本文，特别强调与rAAV产生有关的文献的那些部分。
因此，本公开提供了产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一实施例中，包装细胞是未转化的癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人类胚肾细胞)、MRC-5细胞(人类胚胎成纤维细胞)、WI-38细胞(人类胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
本公开的重组AAV(即,感染性衣壳化rAAV颗粒)包括rAAV基因组。实施例包含但不限于命名为“pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan”的编码miR106a海绵的由SEQ ID NO:21中所示的核苷酸序列编码的rAAV。在示例性实施例中，两种rAAV的基因组缺乏AAV rep和capDNA，即，在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。可以被构建成包括本公开的核酸分子的rAAV的实例在国际专利申请第PCT/US2012/047999号(WO 2013/016352)中阐述，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。
rAAV可以通过方法，如通过柱色谱法或氯化铯梯度纯化。用于从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包含在例如Clark等人,《人类基因疗法》,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,《分子医学方法(Methods Mol.Med.)》,69 427-443(2002)；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657中公开的方法。
在另一实施例中，本公开设想了包括所公开的rAAV的组合物。本公开的组合物包括含rAAV的药学上可接受的载体。组合物还可以包括其它成分，如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对受体无毒，并且优选在采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包含缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。
要在本公开的方法中施用的rAAV的滴度将根据例如特定rAAV、施用模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域已知的方法确定。rAAV的滴度的范围可以为每ml约1x106个、约1x107个、约1x108个、约1x109个、约1x1010个、约1x1011个、约1x1012个、约1x1013个到约1x1014个或更多个DNA酶抗性颗粒(DRP)。剂量还可以以病毒基因组(vg)为单位表示。
本公开设想了体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括向有需要的动物(包含人类)施用有效剂量或有效多剂量的包括本公开的rAAV的组合物的步骤。如果在病症/疾病发展之前施用剂量，则施用是预防性的。如果在病症/疾病发展之后施用剂量，则施用是治疗性的。在本公开的实施例中，有效剂量是减轻(消除或减少)至少一种与所治疗的病症/疾病状态相关的症状、减缓或防止向病症/疾病状态发展、减缓或防止病症/疾病状态发展、缩小疾病程度、导致疾病缓解(部分或全部)和/或延长存活的剂量。设想用于用所公开的方法预防或治疗的疾病的实例是FSHD。
本公开还设想了组合疗法。如本文所使用的，组合同时包含同时治疗和顺序治疗。具体设想了本公开的方法与标准医学治疗(例如，皮质类固醇)的组合以及与新颖疗法的组合。
有效剂量的组合物的施用可以通过本领域已知的途径进行，所述途径包含但不限于肌肉内、肠胃外、静脉内、口服、颊、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。本公开的rAAV的AAV组分(具体地AAV ITR和衣壳蛋白)的施用途径和血清型可以由本领域的技术人员将所治疗的感染和/或疾病状态和要表达miRNA海绵或miRNA小RNA的靶细胞/组织考虑在内来进行选择和/或匹配。
本公开提供了有效剂量的本公开的重组AAV和组合物的局部施用和全身施用。例如，全身施用是对循环系统的施用，从而影响整个身体。全身施用包含肠内施用，如通过胃肠道的吸收和通过注射、输注或植入的肠胃外施用。
具体地，可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来完成本公开的rAAV的实际施用。根据本公开的施用包含但不限于注射到肌肉、血流中和/或直接注射到肝中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中已经被证明足以提供用于肌肉组织表达的媒剂，并且对于可以与rAAV共施用的载体或其它成分没有已知的限制(尽管应避免使用与rAAV一起以正常方式降解DNA的组合物)。可以对rAAV的衣壳蛋白进行修饰，使得rAAV靶向所关注特定靶组织如肌肉。参见，例如，WO 02/053703中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。药物组合物可制备成可注射调配物或局部调配物，通过经皮转运递送至肌肉。先前已经开发了用于肌肉内注射和经皮转运的多种调配物，并且所述调配物可用于实践所公开的方法和组合物。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于施用和处理。
作为游离酸的rAAV溶液(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐可在适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备rAAV的分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有用于防止微生物生长的防腐剂。有鉴于此，所采用的无菌水性介质均可通过本领域的技术人员已知的技术容易地获得。
适用于可注射使用的药物形式包含无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水；乙醇；多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)；其合适的混合物和植物油。举例来说，通过使用例如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以带来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射组合物的吸收。
根据需要，通过将rAAV以所需量掺入带有上面列举的各种其它成分的适当溶剂中来制备无菌可注射溶液，然后过滤灭菌。通常，通过将灭菌的活性成分并入到无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。
用rAAV进行的转导也可以在体外进行。在一个实施例中，从受试者中取出所需的靶肌肉细胞，用rAAV转导并重新引入到受试者体内。可替代地，可以使用同基因细胞或异基因肌肉细胞，其中那些细胞将不会在受试者中产生不适当的免疫应答。
用于将经转导的细胞转导和重新引入到受试者体内的合适方法是本领域已知的。在一个实施例中，可以在体外通过将rAAV与肌肉细胞组合，例如在适当的培养基中，并且使用如蛋白质印迹和/或PCR等技术或通过使用可选标志物筛选容纳所关注DNA的那些细胞来转导细胞。然后可以将经转导的细胞调配成药物组合物，并且通过各种技术，如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，或通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中将所述组合物引入到受试者体内。
用本公开的rAAV转导细胞引起微小RNA海绵盒的持续表达。因此，本公开提供了向动物，优选地人施用/递送表达微小RNA海绵的rAAV的方法。这些方法包含用一种或多种公开的rAAV转导组织(包含但不限于如下组织：肌肉、如肝和脑等器官以及如唾液腺等腺体)。转导可以用包括组织特异性控制元件的基因盒进行。
术语“转导”用于指通过复制缺陷型rAAV在体内或在体外向受体细胞施用/递送微小RNA海绵盒，从而引起由受体细胞表达微小RNA海绵。
本发明还提供了药物组合物(或有时在本文中被简单称为“组合物”)，所述药物组合物包括本发明的rAAV载体中的任何rAAV载体。
治疗方法
术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指减轻或改善病症和/或与病症相关的症状(例如，雷特综合征、其它X连锁病症或癌症)。“治疗”可以指在雷特综合征、其它X连锁病症或癌症发作或疑似发作后，向受试者施用组合疗法。“治疗”包含“减轻”的概念，所述减轻是指减少与雷特综合征或其它X连锁病症和/或与这种病症相关的副作用有关的任何症状或其它不良作用发生或复发的频率或任何症状或其它不良作用的严重程度。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，所述管理是指降低患者的特定疾病或病症的严重程度或延迟其复发，例如延长患有所述疾病的患者的缓解时间段。应当理解，尽管不排除，但治疗病症或病状并不要求完全消除所述病症、病状或与其相关的症状。
在各个实施例中，本公开提供了治疗雷特综合征、X连锁病症或癌症的方法。
本公开提供了向有需要的患者施用包括微小RNA海绵盒的重组AAV载体、有效剂量(或基本上同时施用的多个剂量或以一定时间间隔给予的多个剂量)的编码靶向miR106a的一个或多种个微小RNA海绵盒的rAAV。
整个文档旨在作为统一的公开内容而相关，并且应当理解设想了本文所述的特征的所有组合，即使没有在本文档的同一句子或段落或部分中一起发现特征的组合。本公开还包含，例如，以任何方式比以上具体提及的变型在范围上更窄的本公开的所有实施例。关于描述为属的本公开的方面，所有单独物种被认为是本公开的单独方面。关于用“一个(a)”或“一种(an)”描述或要求保护的本公开的各方面，应当理解，除非上下文明确要求更受限制的含义，否则这些术语意指“一种或多种”。如果本公开的各方面被描述为“包括(comprising)”某个特征，则还设想了“由所述特征组成(consisting of)”或“基本上由所述特征组成(consisting essentially of)”的实施例。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指示以与本公开内容不矛盾的程度通过引用以其整体并入。
应当理解，本文中所描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变将启发本领域的技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。
序列
SEQ ID NO:1：靶向miR106a的miR106a海绵RNA序列
CUACCUGCACUGUUAGCACUUUG
SEQ ID NO:2：靶向miR106a的miR106a海绵DNA序列
CTACCTGCACTGTTAGCACTTTG
SEQ ID NO:3：mir106a sp1设计2RNA
CCGGCUACCUGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUCCCGCACUUUGUUUUUG
SEQ ID NO:4：mir106a sp1设计2DNA
CCGGCTACCTGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTCCCGCACTTTGTTTTTG
SEQ ID NO:5：mir106a sp1设计3RNA
ACCGGCUACCUGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCCUGCACUCCCGCACUUUGAGUUACUACUGCACUGUUAGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUCCCGCACUUUGUUUUUAAUUC
SEQ ID NO:6：mir106a sp1设计3DNA
ACCGGCTACCTGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCCTGCACTCCCGCACTTTGAGTTACTACTGCACTGTTAGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTCCCGCACTTTGTTTTTAATTC
SEQ ID NO:7：miR106a海绵盒RNA
CCGGCUACCUGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUCCCGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUCCCGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUCCCGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUGUUAGCACUUUGAGUUACUACCUGCACUCCCGCACUUUGUUUUUG
SEQ ID NO:8：miR106a海绵盒DNA
CCGGCTACCTGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTCCCGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTCCCGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTCCCGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTGTTAGCACTTTGAGTTACTACCTGCACTCCCGCACTTTGTTTTTG
SEQ ID NO:9：mITR
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG
SEQ ID NO:10：U6启动子
GTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTC
SEQ ID NO:11：填充物
ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCCTGCAGGGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGGCGCGCCTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGCCGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCCTAGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGGGCGCGCCGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTCCTGCAGGAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGTCTGGTTCGAGGCGGGATCAGCCACCGCGGTGGCGGCCTAGAGTCGACGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGATCCACCGGTCGCCACCAGCGGCCATCAAGCACGTTATCGATACCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGCTGCAGAAGTTTAAACGCATGC
SEQ ID NO:12：ITR
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG
SEQ ID NO:14：mITR
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG
SEQ ID NO:18：间隔子1
AGTTA
SEQ ID NO:19：间隔子2
AGUUA
SEQ ID NO:20：小鼠miR106a-5p序列
CAAAGUGCUAACAGUGCAGGUAG
SEQ ID NO:21：pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan
GCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGATTCCGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGCCCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGAATTCACGCGTGGATCTGAATTCAATTCACGCGTGGTACCGTCTCGAGGTCGAGAATTCAAAAACAAAGTGCGGGAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCTAACAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCGGGAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCTAACAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCGGGAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCTAACAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCGGGAGTGCAGGTAGTAACTCAAAGTGCTAACAGTGCAGGTAGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCGGTGAAGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCCTGCAGGGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGGCGCGCCTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGCCGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCCTAGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGGGCGCGCCGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTCCTGCAGGAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGTCTGGTTCGAGGCGGGATCAGCCACCGCGGTGGCGGCCTAGAGTCGACGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGATCCACCGGTCGCCACCAGCGGCCATCAAGCACGTTATCGATACCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGCTGCAGAAGTTTAAACGCATGCTGGGGAGAGATCGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGAGACCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATGAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCGTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGCGTTGAAATAAAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGATTTATTGGATGTTGGAATCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA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SEQ ID NO:22：pAAV.miR106a shRNA.填充物.Kan
GCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGATTCCGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGCCCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGAATTCACGCGTGGATCTGAATTCAATTCACGCGTGGTACCGTCTCGAGGTCGAGAATTCAAAAATTAGCACTTTGACATGGCCACTCGAGTGGCCATGTCAAAGTGCTAACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCAAGAAATCGAAATACTTTCAAGTTACGGTAAGCATATGATAGTCCATTTTAAAACATAATTTTAAAACTGCAAACTACCCAAGAAATTATTACTTTCTACGTCACGTATTTTGTACTAATATCTTTGTGTTTACAGTCAAATTAATTCCAATTATCTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGCAAATATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCGGTGAAGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCCTGCAGGGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGGCGCGCCTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGCCGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCCTAGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGGGCGCGCCGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTCCTGCAGGAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGTCTGGTTCGAGGCGGGATCAGCCACCGCGGTGGCGGCCTAGAGTCGACGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGATCCACCGGTCGCCACCAGCGGCCATCAAGCACGTTATCGATACCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGCTGCAGAAGTTTAAACGCATGCTGGGGAGAGATCGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGAGACCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATGAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCGTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGCGTTGAAATAAAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGATTTATTGGATGTTGGAATCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGC
SEQ ID NO:23：miR106a shRNA DNA(shRNA靶序列粗体核苷酸5-24)
Figure BDA0003895684340000311
SEQ ID NO:24：miR106a shRNA RNA(shRNA靶序列粗体核苷酸5-24)
Figure BDA0003895684340000312
SEQ ID NO:25：人mir106a-5p
AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
本公开的另外的方面和细节将根据以下实例而变得显而易见，所述实例旨在是说明性而非限制性的。
实例1
CRISPR/Cas9筛选将miR106a鉴定为XCI的表观遗传调节因子
通过无偏差CRISPR/Cas9筛选鉴定了作为X染色体失活(XCI)的表观遗传调节因子的MiRNA(图1A)。承载Xist启动子和Hprt基因中的缺失的雌性小鼠成纤维细胞报告细胞系(BMSL2)使得能够特异性监测Xi连锁Hprt，从而指示X再激活(5、6)。为了启动筛选，产生了稳定表达野生型Cas9核酸内切酶的BMSL2细胞系。病毒递送单向导RNA(sgRNA)文库后，将来自Xi的表达Hprt的细胞富集在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷选择培养基中(例如，参见(6))。使用下一代测序，将六种miRNA鉴定为XCI调节因子，包含miR106a、miR363、miR181a、miR340、miR34b和miR30e(数据未示出)。与miRNA一起，还鉴定了十九种蛋白质编码XCIF，包含先前通过shRNA筛选鉴定的两个因子ACVR1和STC1(6)，由此验证了筛选。
基于对多个细胞模型中的用针对同一靶标的sgRNA获得的Hprt和MECP2的再激活，对miRNA进行了等级排序(图1B)。焦点变为最高评分候选物miR106a(图1B)，其由X染色体上的miRNA簇编码并在小鼠大脑皮质中高度表达(图1D)。此外，对先前发布的miR106a交联免疫沉淀数据的分析揭示了Xist RNA，即XCI的关键调节因子的5'区中的多个miR106a种子序列(数据未示出)，这支持提出的XCI中的miR106a功能。
接下来，测试了miR106a抑制是否再激活人类有丝分裂后神经元中的Xi连锁MECP2，这是与RTT最相关的细胞类型(8、9)。为此，利用了单链和化学增强的RNA寡核苷酸来抑制miR106a。为方便起见，这些试剂在本文中被称为miR106a抑制剂(miR106i)。使用了在活性X上承载MECP2中的T158M错义突变、但在Xi上承载野生型MECP2基因的RTT神经元(10)。由于雌性是XCI的嵌合体，因此使用了源自同一RTT患者的在活性X上承载野生型MECP2并且在Xi上承载与野生型MECP2完全偏斜的突变MECP2的RTT iPSC克隆作为阳性同基因对照(WT-iPSC，(44))。先前已示出，相比于RTT神经元，WT神经元在表型上是正常的。例如，相对于WT神经元，RTT神经元显示出较慢的生长、较小的胞体大小和较少的分支点，如通过活力和免疫荧光测定确定的(例如，参见(2))。显著地，经miR106i处理的RTT神经元将Xi连锁MECP2表达到在WT神经元中观察到的水平的约12％的水平(图1C)。如所预期的，miR106a抑制上调了已知miR106a靶标PAK5(11)和Ankrd52(7)；(图2A)，但不影响细胞活力(图2B)，这表明miR106a在体外是靶特异性的且安全的。此外，用miR106a抑制剂(图2C)或miR106a特异性sgRNA(图2D)对miR106a的抑制显示出再激活Patski细胞(图2C)和雷特神经元(图2D)中的MECP2。
实例2
高置信度miR106a-Xist相互作用的图谱
鉴于Xist是XCI(12-14)的关键调节因子并且容纳多个miR106a种子序列(7)，因此研究了miR106a是否靶向Xist。使用计算预测算法(15)，在Xist的被定义为重复序列(本文中被称为RepA)的5'区中鉴定了miR106a的五个推定结合位点。尽管RepA的分子功能尚不清楚，但如RBM15/15b(16)和SPEN(17)等蛋白质的RepA介导的募集对XCI的中Xist的功能至关重要。
为了直接证实miR106a-RepA相互作用，使用生物素化的miR106a模拟物在复合物中进行了RepA转录物的竞争性洗脱(图3A)。为了证实miR106a模拟物的靶特异性，将荧光素酶报告基因构建体设计为在psi-CHECK-2报告系统中表达已知miR106a靶，即PAK5。观察到相比于对照荧光素酶信号降低了约80％，这通过添加miR106i得以挽救，从而证实了miR106a模拟物和miR106i的特异性。
接下来，使用五个预测的miR106a结合位点中的每个结合位点的错配、完全和不完全互补捕获寡核苷酸将5'-P32-放射性标记的RepA转录物的洗脱效率进行了比较。如结果的代表性子集所示(图3B)，在用完全和不完全互补性但不用错配捕获寡核苷酸进行洗脱后，在合并的洗涤物中检测到更大的RepA转录物。对证实了miR106a结合的全长RepA转录物进行了类似分析。总之，这些结果表明miR106a与RepA在多个位点处在物理上相互作用。
接下来，为了证实miR106a与内源性RepA结合，使用生物素化的miR106a模拟物进行了细胞中拉下测定。使用链霉亲和素珠粒提取了来自全细胞裂解物的生物素化的miRNA/RNA复合物，并且通过定量RT-PCR(qRT-PCR)对RepA富集进行了分析。将拉下复合物中的RepA富集在miR106a模拟物转染的细胞中，而在阴性对照中未观察到RepA信号(图3C)，这证实了miR106a和RepA在体内形成复合物。
实例3
MiR106a在转录上调节Xist
接下来，研究了miR106a是否可以通过耗竭阻遏子或间接影响Xist稳定性来正调节Xist转录。因此，检查了在miR106a缺失的细胞中通过染色质免疫沉淀(ChIP)在Xist启动子上进行的RNA聚合酶II(PolII)募集。令人惊讶的是，miR106a耗竭不影响Xist启动子上的PolII募集，但是，如所预期的，Gfp启动子(H4SV细胞中的Xi连锁转基因)中的PolII富集，这表明Xi再激活(图4A)。miR106a耗竭降低了Xist水平(图4B)，并且放线菌素D测定显示出Xist的半衰期显著减少(图4C)。
实例4
miR106a与RepA的功能性相互作用
Xist功能和其与Xi的关联性取决于其结构(18、36)。因此，使用RNA原位杂交(RNA-FISH)研究了miR106a耗竭是否影响Xist与Xi的关联性。如所预期的，在对照细胞中观察到约80％的Xist“云”(图5A，左侧)。相反，miR106a的耗竭引起Xist“云”的显著变化，这些云显示为分散在约65％的细胞的整个细胞核中(点的数量，图5A-B)以及在大约45％的细胞中在Xi上扩散更多(云面积，图5A-B)。总之，这些结果表明miR106a对于Xist对Xi的定位至关重要。
实例5
确定对miR106a的抑制是否可以使功能失调的神经元表型正常化
为了在体内实现高效miR106a抑制，miR106a功能丧失“海绵”被设计为容纳与miR106a的核苷酸序列不完全互补的序列的串联多路复用。这种海绵序列被称为miR106sp。基于以下参数证明了miR106sp是完全功能性的：(i)吉布斯自由能：miR106a对miR106sp显示出比对RepA区更低的ΔG总计(ΔGtotal)(图5C)。(ii)功能测定：通过在内源性表达miR106a的BMSL2细胞中通过双荧光素酶报告系统表达海绵序列，证实了miR106sp-miR106a的物理关联性。与空载体相比，具有miR106sp序列的报告载体显示出低约60％的海肾/萤火虫比率，这是通过miR106i挽救的(图6)。(iii)转录效应：miR106a的miR106sp介导的隔离再激活H4SV细胞中的Xi连锁TgGfp和miR106a已知靶标PAK5和Ankrd52。(iii)海绵mRNA，其含有与所关注miRNA互补的多个靶位点，是显性负性方法。海绵与成熟miRNA相互作用，其有效性不受miRNA前体的聚类的影响(图5D)。总之，本文公开的结果证实了miR106sp具有生物活性。
为了使海绵表达最大化并且进行长期miR106a功能丧失研究，对表达miR106sp的慢病毒载体pLKO.1(LTV-miR106sp)进行了工程化。通过将LTV-miR106sp与表达Gfp的pLKO.1共转染使NPC的转导效率得到优化，这产生了约80％的转导效率(数据未示出)。此外，miR106a耗竭不影响神经元分化，如通过NPC和神经元谱系特异性标志物的表达指示的。
测试了由miR106sp对MECP2的再激活是否可使RTT神经元的表型正常化。应认识到，正常化可以是部分矫正而不是完全矫正，但是为了简单起见，术语“正常化”用于表示表型的部分或完全矫正。为了评估RTT神经元表型的挽救，使用以下可量化测量结果对RTT神经元系进行了分析：
(i)神经元表型：RTT-NPC在4周、8周和12周内分化为神经元，并且通过等位基因特异性Taqman测定对野生型MECP2表达进行了证实和定量。接下来，对不同RTT神经元系的胞体大小、分支点、神经元网络、点密度和突触形成进行了分析。
作为概念验证，示出了用LTV-miR106sp处理RTT神经元在处理后约8周将野生型MECP2表达到相对于健康神经元约30％的水平(图7A)，并且最显著地，足以挽救MAP2阳性(神经元标志物)神经元中的胞体大小和分支密度(n＝200；图7B和7C)。
这些结果：(1)支持甚至MECP2的部分再激活对RTT神经元的功能失调表型具有正常化作用的假设，并且(2)证明了达到的MECP2再激活的水平具有强烈的正常化作用。
(ii)活性依赖性钙(Ca2+)瞬变：通过使用gCAMP6，即Ca2+敏感型荧光染料(39)在各个RTT神经元系中进行的Ca2+成像来检查自发电生理活性。使用蔡司公司(Zeiss)正置式荧光转盘共聚焦显微镜，在28Hz下在336×256个像素的区情况下获取了延时图像序列(63X放大率)。在几个独立的实验中随着时间的推移对自发性Ca2+瞬变进行了分析，并且通过ImageJ软件对图像进行了分析。
在经LTV-miR106sp处理的8周大RTT神经元中对接下来的活性依赖性Ca2+瞬变进行监测。简而言之，用GCaMP6转导RTT神经元，并且使用高速成像监测随时间的推移细胞内Ca2+波动。图8A示出，在miR106sp中耗竭而不是在对照RTT神经元中耗竭的Ca2+振荡的振幅和频率急剧增加。值得注意的是，经miR106sp处理的细胞中的Ca2+瞬时强度与WT神经元相当(图8B)。虽然在miR106sp处理后MECP2表达得到了优化，但结果表明，miR106a抑制改善了活性依赖性Ca2+瞬变，并且还证明了所提出的方法的可行性。
(iii)兴奋性突触信号传导：使用电生理方法确定MECP2恢复对RTT神经元的功能成熟的影响。对已经分化了至少6周的神经元进行全细胞记录。在野生型MECP2表达后，评估了RTT神经元中的自发性突触后电流的频率和振幅的变化。
实例6
基因疗法构建体的构建
在U6启动子下将实例4中描述的海绵盒(miR106sp)亚克隆到自身互补性AAV9基因组中。质粒构建体包含U6启动子、miR106a海绵盒(miR106sp)、填充物序列、反向末端重复序列(ITR)、突变ITR(mITR)、复制起点(Ori)和卡那霉素抗性盒(kanamycin resistancecassette，KanR)。质粒构建体的示意图在图11A中被称为pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan提供。pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan组分的精确序列范围、链方向和长度在表1中提供。pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan的质粒序列在图11B中提供，并且提供在SEQ ID NO:21中。将pAAV.miR106a海绵.填充物.Kan构建体包装到AAV9基因组中，并且相应地根据本领域已知的常规方法进行表达。
表1
Figure BDA0003895684340000361
还产生了mIRNA106a的短发夹RNA构建体。在U6启动子下将mIRNA106a shRNA亚克隆到自身互补性AAV9基因组中。质粒构建体包含U6启动子、miR106a shRNA、填充物序列、反向末端重复序列(ITR)、突变ITR(mITR)、复制起点(Ori)和卡那霉素抗性盒(KanR)。质粒构建体的示意图在图12A中被称为pAAV.miR106a shRNA.填充物.Kan提供。pAAV.miR106ashRNA.填充物.Kan组分的精确序列范围、链方向和长度在表2中提供。pAAV.miR106ashRNA.填充物.Kan的质粒序列在图12B中提供，并且提供在SEQ ID NO:22中。将pAAV.miR106a shRNA.填充物.Kan构建体包装到AAV9基因组中，并且相应地根据本领域已知的常规方法进行表达。表达miR106sp的高效腺相关病毒血清型9(AAV9)载体被称为AAV9-miR106sp。将由U6启动子驱动的miR106sp表达包装在自身互补性AAV9载体中。所述表达盒还含有用于确保包装的最佳大小的填充物(40、41)。
表2
Figure BDA0003895684340000362
Figure BDA0003895684340000371
实例7
为了确定miR106a的抑制是否可以使雌性ΔCpG RTT临床前模型中的行为缺陷正常化
如实例5中所描述的，将表达miR106sp的高效AAV9载体(称为AAV9-miR106sp)工程化为研究在体内对miR106a的抑制。作为阴性对照，使用了空病毒颗粒(AAV9对照)。使用三重转染方法用转移质粒和辅助质粒产生了AAV9-miR106sp颗粒(42)。通过silvergel和Taqman qRT-PCR确定了病毒载体浓度。
接下来检测AAV9-mir106sp是否再激活XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠(2、3)的脑中的MECP2。通过将Xist:Mecp2-Gfp/Y小鼠与XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2小鼠杂交的最近的XCI小鼠模型(图9A，(2))。证明了此模型允许对Xi连锁Mecp2再激活进行准确且稳健的定量，主要有两个原因：(i)结果未通过在Xi上100％承载Mecp2-Gfp的细胞的GFP的嵌合体表达而被排除在外。重要的是，建立了基于FACS的方法，并且所述方法显示来自XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2的所有皮质细胞核均为Gfp阴性，而来自Xist:Mecp2-Gfp/Xist:Mecp2-Gfp的100％细胞核为Gfp阳性，这表示实验中的理论最大值(图9B)。(ii)Mecp2的基因标记允许用Gfp使单独神经元直接可视化，由此使细胞的实验操纵最小化(2)。为了评估XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠模型用于监测Xi连锁Mecp2去抑制的可行性以及用对照或miR106i从雌性XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp胚胎(d15.5)中分离的经处理的小鼠胚胎成纤维细胞，miR106i处理而非对照对Xi-Mecp2-Gfp去阻遏(图9C)。
接下来，如先前所述，通过ICV途径在新生儿体内施用单个剂量的5.0e+10载体基因组/kg AAV9-miR106sp或AAV9对照(42)。使用表达Gfp的AAV9(AAV9-Gfp),证实了AAV9载体的高效转导效率，并且证明了在XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2小鼠的脑中的均匀分布(n＝2；图10A)。显著地，在5周时AAV9-miR106sp注射的小鼠体内检测到Xi-Mecp2-Gfp表达，但在AAV9对照注射的小鼠中没有检测到(图10B)。使用RT-PCR还证实了从小鼠脑中分离的RNA中的Mecp2-Gfp的表达(图10C)。值得注意的是，在RTT小鼠体内正在进行的实验中，在约15周的miR106a后抑制中未观察到痛苦的迹象。
以上呈现的结果为AAV9-miR106sp在体内抑制miR106a的可行性提供了令人信服的证据；有力地支持抑制性miR106a由Xi再激活Mecp2的假设；并且表明Xi再激活在体内耐受良好。
AAV9-miR106sp的最佳剂量和CSF递送：接下来，使用三种不同的浓度和通过脑脊液进行的注射证实了AAV9-miR106sp表达XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp小鼠中的最大Xi连锁Mecp2的最有效剂量。在出生后第1天使用脑室内注射以每只动物范围为1e10 vg、2.5e10 vg和5e10 vg的剂量向小鼠的CSF中进行注射。在RNA水平(qRT-PCR)和蛋白质水平(流式细胞术、免疫荧光和免疫组织化学)上对Mecp2-Gfp表达进行定量。
实例8
通过AAV9-miR106sp挽救RTT模型的行为缺陷并提高存活率
通过AAV9-miR106sp挽救ΔCpG-RTT模型的行为缺陷：对表型雌性RTT小鼠模型进行的全面评估对于向RTT患者翻译所公开的疗法至关重要。因此，在经AAV9-miR106sp处理的TsixΔCpG:Mecp2/Tsix:Mecp2无效(ΔCpG-RTT，《美国国家科学院院刊》2018年8月7日；115(32):8185-8190)雌性小鼠体内在标准C57BL/6J背景下评估了跨发育的广泛行为量度的挽救。ΔCpG-RTT雌性小鼠是相对X染色体上的Tsix和MECP2缺陷的，并且因此，无效MECP2等位基因优先表达。对经处理的雌性小鼠的已知由MECP2破坏引起并且在RTT患者中呈现的症状进行评分：运动无力、震颤增加、步态障碍、重复行为和自我伤害(《美国国家科学院院刊》2018年8月7日；115(32):8185-8190；《人类分子遗传学(Hum Mol Genet.)》2018年12月1日；27(23):4077-4093)。
先前的工作已鉴定出MECP2突变小鼠中使人联想到在RTT女孩中观察到的运动损伤的运动功能异常(《人类分子遗传学》2018年12月1日；27(23):4077-4093)。使用加速转棒进行概念验证实验以评估运动协调和学习的改善(平均每天三次试验，持续连续三天)。如图14A所示，在4周和7周两者时的第2天和第3天，AAV9-miR106sp注射的小鼠均胜过AAV9对照注射的小鼠。在7周龄时，相比于经AAV9对照处理的小鼠，AAV9-miR106sp注射的小鼠显示出相对于第1天的基线的显著改善，这表明运动协调和学习方面的改善。这些数据还在16周龄的小鼠中得到证实，其中相比于AAV9对照或未经处理的小鼠，经AAV9-miR106sp处理的小鼠表现出转棒性能的显著改善(图15C)。
同样，在巴恩斯迷宫上(平均每天三次试验，在7周内持续连续五天)，AAV9-miR106sp处理产生了认知的显著改善，如通过以下证明的：1)鉴定先前奖励的应答的空间位置的时延减少(图14B)以及2)完成应答的速度增加(图14C)。训练期间移动的距离的统计学上显著的提升揭示了相比于具有高水平不动性的对照，经处理的小鼠显示出更多探索行为和更多焦虑减少(图14D)。相比之下，AAV9对照注射的小鼠比AAV9-miR106sp注射的小鼠在竞技场中花费的时间更多，这也在旷场探索试验中得到证实。
还评估了经AAV9.miR106sp处理的动物对对照的生存率和表型严重程度。如图15A所示，相比于经AAV9对照(空病毒颗粒)处理的动物，其显示出约80至100天的存活(中值存活91天)，AAV9-miR106sp注射的小鼠显示出至多250天的显著改善的存活。还通过表型评分评估了经AAV9.miR106sp处理的动物对对照的表型严重程度，所述表型评分表明相比于经AAV9对照处理的动物，经AAV9.miR106sp处理的动物表现出直至21周龄时表型严重程度降低。
总之，这些初步结果显示，通过miR106a抑制得到的MECP2恢复挽救了ΔCpG-RTT雌性小鼠的神经运动和学习缺陷。
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<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
cuaccugcac uguuagcacu uug 23
<210> 2
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
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ctacctgcac tgttagcact ttg 23
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
<400> 3
ccggcuaccu gcacuguuag cacuuugagu uacuaccugc acucccgcac uuuguuuuug 60
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
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ccggctacct gcactgttag cactttgagt tactacctgc actcccgcac tttgtttttg 60
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
accggcuacc ugcacuguua gcacuuugag uuacuaccug ccugcacucc cgcacuuuga 60
guuacuacug cacuguuagc acuguuagca cuuugaguua cuaccugcac ucccgcacuu 120
uguuuuuaau uc 132
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<211> 132
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
accggctacc tgcactgtta gcactttgag ttactacctg cctgcactcc cgcactttga 60
gttactactg cactgttagc actgttagca ctttgagtta ctacctgcac tcccgcactt 120
tgtttttaat tc 132
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
<400> 7
ccggcuaccu gcacuguuag cacuuugagu uacuaccugc acucccgcac uuugaguuac 60
uaccugcacu guuagcacuu ugaguuacua ccugcacucc cgcacuuuga guuacuaccu 120
gcacuguuag cacuuugagu uacuaccugc acucccgcac uuugaguuac uaccugcacu 180
guuagcacuu ugaguuacua ccugcacucc cgcacuuugu uuuug 225
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
<400> 8
ccggctacct gcactgttag cactttgagt tactacctgc actcccgcac tttgagttac 60
tacctgcact gttagcactt tgagttacta cctgcactcc cgcactttga gttactacct 120
gcactgttag cactttgagt tactacctgc actcccgcac tttgagttac tacctgcact 180
gttagcactt tgagttacta cctgcactcc cgcactttgt ttttg 225
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgg 106
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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gtcctttcca caagatatat aaagccaaga aatcgaaata ctttcaagtt acggtaagca 60
tatgatagtc cattttaaaa cataatttta aaactgcaaa ctacccaaga aattattact 120
ttctacgtca cgtattttgt actaatatct ttgtgtttac agtcaaatta attccaatta 180
tctctctaac agccttgtat cgtatatgca aatatgaagg aatcatggga aataggccct 240
c 241
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成多核苷酸
<400> 11
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcctgcagg gacgtcgacg gatcgggaga tctcccgatc ccctatctgc tccctgcttg 120
tgtgttggag gtcgctgagt agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt 180
gaccgacaat tgcatgaaga atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcggcgc 240
gccttttaag gcagttattg gtgcccttaa acgcctggtg ctacgcctga ataagtgata 300
ataagcggat gaatggcaga aattcgccgg atctttgtga aggaacctta cttctgtggt 360
gtgacataat tggacaaact acctacagag atttaaagct ctaatgtaag cagacagttt 420
tattgttcat gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac 480
aacgtggctt tccccccccc cccctagggt gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc 540
gctggaggat catccagccg gcgtcccgga aaacgattcc gaagcccaac ctttcataga 600
aggcggcggt ggaatcgaaa tctcgtgatg gcaggttggg cgtcgcttgg tcggtcattt 660
cgaaccccag agtcccgctc agggcgcgcc gggggggggg gcgctgaggt ctgcctcgtg 720
aagaaggtgt tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc atcatccagc cagaaagtga 780
gggagccacg gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gtcctgcagg agcataaagt 840
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 900
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc cgcccagtct agctatcgcc atgtaagccc 960
actgcaagct acctgctttc tctttgcgct tgcgttttcc cttgtccaga tagcccagta 1020
gctgacattc atccggggtc agcaccgttt ctgcggactg gctttctacg tgtctggttc 1080
gaggcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga aaaaccagaa 1140
agttaactgg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc 1200
ggccgatcca ccggtcgcca ccagcggcca tcaagcacgt tatcgatacc gtcgactaga 1260
gctcgctgat cagtgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 1320
aatagcagct gcagaagttt aaacgcatgc 1350
<210> 12
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg g 141
<210> 13
<211> 5468
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct 60
aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 120
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 180
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 240
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 300
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 360
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 420
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 480
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 540
aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt 600
ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc 660
cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 720
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tcacgcgtgg 780
atctgaattc aattcacgcg tggtaccgtc tcgaggtcga gaattcaaaa acaaagtgcg 840
ggagtgcagg tagtaactca aagtgctaac agtgcaggta gtaactcaaa gtgcgggagt 900
gcaggtagta actcaaagtg ctaacagtgc aggtagtaac tcaaagtgcg ggagtgcagg 960
tagtaactca aagtgctaac agtgcaggta gtaactcaaa gtgcgggagt gcaggtagta 1020
actcaaagtg ctaacagtgc aggtagccgg tgtttcgtcc tttccacaag atatataaag 1080
ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatt ttaaaacata 1140
attttaaaac tgcaaactac ccaagaaatt attactttct acgtcacgta ttttgtacta 1200
atatctttgt gtttacagtc aaattaattc caattatctc tctaacagcc ttgtatcgta 1260
tatgcaaata tgaaggaatc atgggaaata ggccctcggt gaagactagt tattaatagt 1320
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcctg cagggacgtc 1380
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct 1440
gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg 1500
aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg gcgcgccttt taaggcagtt 1560
attggtgccc ttaaacgcct ggtgctacgc ctgaataagt gataataagc ggatgaatgg 1620
cagaaattcg ccggatcttt gtgaaggaac cttacttctg tggtgtgaca taattggaca 1680
aactacctac agagatttaa agctctaatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat 1740
atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttccccc 1800
ccccccccta gggtgggcga agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca 1860
gccggcgtcc cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg cggtggaatc 1920
gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc ccagagtccc 1980
gctcagggcg cgccgggggg gggggcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga 2040
ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat 2100
gagagctttg ttgtaggtgg accagtcctg caggagcata aagtgtaaag cctggggtgc 2160
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 2220
aaacctgtcg tgcccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 2280
tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 2340
ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgtctg gttcgaggcg ggatcagcca 2400
ccgcggtggc ggcctagagt cgacgaggaa ctgaaaaacc agaaagttaa ctggcctgta 2460
cggaagtgtt acttctgctc taaaagctgc ggaattgtac ccgcggccga tccaccggtc 2520
gccaccagcg gccatcaagc acgttatcga taccgtcgac tagagctcgc tgatcagtgg 2580
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc agctgcagaa 2640
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tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 2760
gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccccccc 2820
cccccccccc ccggcgattc tcttgtttgc tccagactct caggcaatga cctgatagcc 2880
tttgtagaga cctctcaaaa atagctaccc tctccggcat gaatttatca gctagaacgg 2940
ttgaatatca tattgatggt gatttgactg tctccggcct ttctcacccg tttgaatctt 3000
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cttgcgttga aataaaggct tctcccgcaa aagtattaca gggtcataat gtttttggta 3120
caaccgattt agctttatgc tctgaggctt tattgcttaa ttttgctaat tctttgcctt 3180
gcctgtatga tttattggat gttggaatcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3240
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3300
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atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 3600
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gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 3720
ccatattcaa cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata 3780
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aacagcgttc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct 4080
ggcagtgttc ctgcgccggt tgcactcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga 4140
tcgcgtattt cgcctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag 4200
tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa 4260
acttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct 4320
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gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca 4500
tttgatgctc gatgagtttt tctaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 4560
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gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 4860
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gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4980
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 5040
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 5100
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 5160
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 5220
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agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 5460
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
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gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct 60
aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 120
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 180
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 240
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 300
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 360
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 420
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 480
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 540
aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt 600
ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc 660
cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 720
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tcacgcgtgg 780
atctgaattc aattcacgcg tggtaccgtc tcgaggtcga gaattcaaaa attagcactt 840
tgacatggcc actcgagtgg ccatgtcaaa gtgctaaccg gtgtttcgtc ctttccacaa 900
gatatataaa gccaagaaat cgaaatactt tcaagttacg gtaagcatat gatagtccat 960
tttaaaacat aattttaaaa ctgcaaacta cccaagaaat tattactttc tacgtcacgt 1020
attttgtact aatatctttg tgtttacagt caaattaatt ccaattatct ctctaacagc 1080
cttgtatcgt atatgcaaat atgaaggaat catgggaaat aggccctcgg tgaagactag 1140
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcct 1200
gcagggacgt cgacggatcg ggagatctcc cgatccccta tctgctccct gcttgtgtgt 1260
tggaggtcgc tgagtagtgc gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg 1320
acaattgcat gaagaatctg cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc ggcgcgcctt 1380
ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc tggtgctacg cctgaataag tgataataag 1440
cggatgaatg gcagaaattc gccggatctt tgtgaaggaa ccttacttct gtggtgtgac 1500
ataattggac aaactaccta cagagattta aagctctaat gtaagcagac agttttattg 1560
ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacaacgt 1620
ggctttcccc ccccccccct agggtgggcg aagaactcca gcatgagatc cccgcgctgg 1680
aggatcatcc agccggcgtc ccggaaaacg attccgaagc ccaacctttc atagaaggcg 1740
gcggtggaat cgaaatctcg tgatggcagg ttgggcgtcg cttggtcggt catttcgaac 1800
cccagagtcc cgctcagggc gcgccggggg ggggggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa 1860
ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag 1920
ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagtcct gcaggagcat aaagtgtaaa 1980
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 2040
ttccagtcgg gaaacctgtc gtgcccgccc agtctagcta tcgccatgta agcccactgc 2100
aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc cagtagctga 2160
cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgtct ggttcgaggc 2220
gggatcagcc accgcggtgg cggcctagag tcgacgagga actgaaaaac cagaaagtta 2280
actggcctgt acggaagtgt tacttctgct ctaaaagctg cggaattgta cccgcggccg 2340
atccaccggt cgccaccagc ggccatcaag cacgttatcg ataccgtcga ctagagctcg 2400
ctgatcagtg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 2460
cagctgcaga agtttaaacg catgctgggg agagatcgat ctgaggaacc cctagtgatg 2520
gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc 2580
gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga 2640
gtggcccccc cccccccccc cccggcgatt ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg 2700
acctgatagc ctttgtagag acctctcaaa aatagctacc ctctccggca tgaatttatc 2760
agctagaacg gttgaatatc atattgatgg tgatttgact gtctccggcc tttctcaccc 2820
gtttgaatct ttacctacac attactcagg cattgcattt aaaatatatg agggttctaa 2880
aaatttttat ccttgcgttg aaataaaggc ttctcccgca aaagtattac agggtcataa 2940
tgtttttggt acaaccgatt tagctttatg ctctgaggct ttattgctta attttgctaa 3000
ttctttgcct tgcctgtatg atttattgga tgttggaatc gcctgatgcg gtattttctc 3060
cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 3120
gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac tatggtgcac tctcagtaca 3180
atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 3240
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 3300
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 3360
gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 3420
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 3480
aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 3540
aagagtatga gccatattca acgggaaacg tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 3600
gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 3660
tatcgcttgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 3720
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcca 3780
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 3840
atccccggaa aaacagcgtt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 3900
gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcactcga ttcctgtttg taattgtcct 3960
tttaacagcg atcgcgtatt tcgcctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 4020
gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 4080
gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 4140
cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 4200
ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 4260
ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 4320
ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaactgt cagaccaagt ttactcatat 4380
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 4440
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 4500
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 4560
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 4620
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 4680
gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 4740
ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 4800
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 4860
acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 4920
tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 4980
gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 5040
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 5100
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 5160
ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 5220
gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 5280
agcgaggaag cggaagagc 5299
<210> 18
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 18
agtta 5
<210> 19
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 19
aguua 5
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 20
caaagugcua acagugcagg uag 23
<210> 21
<211> 5786
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成
<400> 21
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcgta 60
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 120
ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag caaggccgat 180
agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag tattgcgaca 240
acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac 300
acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt 360
agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata 420
gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 480
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 540
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 600
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 660
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 720
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 780
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 840
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 900
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 960
acgattaccg ttcatcgccc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc 1020
cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg 1080
agtggaattc acgcgtggat ctgaattcaa ttcacgcgtg gtaccgtctc gaggtcgaga 1140
attcaaaaac aaagtgcggg agtgcaggta gtaactcaaa gtgctaacag tgcaggtagt 1200
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tccacaagat atataaagcc aagaaatcga aatactttca agttacggta agcatatgat 1440
agtccatttt aaaacataat tttaaaactg caaactaccc aagaaattat tactttctac 1500
gtcacgtatt ttgtactaat atctttgtgt ttacagtcaa attaattcca attatctctc 1560
taacagcctt gtatcgtata tgcaaatatg aaggaatcat gggaaatagg ccctcggtga 1620
agactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 1680
tccgcctgca gggacgtcga cggatcggga gatctcccga tcccctatct gctccctgct 1740
tgtgtgttgg aggtcgctga gtagtgcgcg agcaaaattt aagctacaac aaggcaaggc 1800
ttgaccgaca attgcatgaa gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct gcttcgcggc 1860
gcgcctttta aggcagttat tggtgccctt aaacgcctgg tgctacgcct gaataagtga 1920
taataagcgg atgaatggca gaaattcgcc ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg 1980
gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaatgta agcagacagt 2040
tttattgttc atgatgatat atttttatct tgtgcaatgt aacatcagag attttgagac 2100
acaacgtggc tttccccccc cccccctagg gtgggcgaag aactccagca tgagatcccc 2160
gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg gaaaacgatt ccgaagccca acctttcata 2220
gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga tggcaggttg ggcgtcgctt ggtcggtcat 2280
ttcgaacccc agagtcccgc tcagggcgcg ccgggggggg gggcgctgag gtctgcctcg 2340
tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt 2400
gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagtcctgca ggagcataaa 2460
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 2520
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg cccgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc 2580
ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag 2640
tagctgacat tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgtctggt 2700
tcgaggcggg atcagccacc gcggtggcgg cctagagtcg acgaggaact gaaaaaccag 2760
aaagttaact ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg aattgtaccc 2820
gcggccgatc caccggtcgc caccagcggc catcaagcac gttatcgata ccgtcgacta 2880
gagctcgctg atcagtgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 2940
acaatagcag ctgcagaagt ttaaacgcat gctggggaga gatcgatctg aggaacccct 3000
agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 3060
aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 3120
agagggagtg gccccccccc cccccccccc ggcgattctc ttgtttgctc cagactctca 3180
ggcaatgacc tgatagcctt tgtagagacc tctcaaaaat agctaccctc tccggcatga 3240
atttatcagc tagaacggtt gaatatcata ttgatggtga tttgactgtc tccggccttt 3300
ctcacccgtt tgaatcttta cctacacatt actcaggcat tgcatttaaa atatatgagg 3360
gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc tcccgcaaaa gtattacagg 3420
gtcataatgt ttttggtaca accgatttag ctttatgctc tgaggcttta ttgcttaatt 3480
ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt tggaatcgcc tgatgcggta 3540
ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat 3600
ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacactat ggtgcactct 3660
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 3720
tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 3780
ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 3840
gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 3900
gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 3960
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 4020
aaaaaggaag agtatgagcc atattcaacg ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa 4080
catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc 4140
gacaatctat cgcttgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa 4200
aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt 4260
tatgccactt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac 4320
cactgcgatc cccggaaaaa cagcgttcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga 4380
aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cactcgattc ctgtttgtaa 4440
ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg cctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa 4500
cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt 4560
ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga 4620
tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg 4680
acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga 4740
gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat 4800
gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taactgtcag accaagttta 4860
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 4920
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 4980
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 5040
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 5100
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 5160
tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 5220
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 5280
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 5340
ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 5400
tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 5460
cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 5520
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 5580
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 5640
ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 5700
tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 5760
gtcagtgagc gaggaagcgg aagagc 5786
<210> 22
<211> 5617
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成
<400> 22
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcgta 60
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 120
ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag caaggccgat 180
agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag tattgcgaca 240
acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac 300
acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt 360
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cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 540
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 600
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 660
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 720
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 780
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 840
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 900
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 960
acgattaccg ttcatcgccc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc 1020
cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg 1080
agtggaattc acgcgtggat ctgaattcaa ttcacgcgtg gtaccgtctc gaggtcgaga 1140
attcaaaaat tagcactttg acatggccac tcgagtggcc atgtcaaagt gctaaccggt 1200
gtttcgtcct ttccacaaga tatataaagc caagaaatcg aaatactttc aagttacggt 1260
aagcatatga tagtccattt taaaacataa ttttaaaact gcaaactacc caagaaatta 1320
ttactttcta cgtcacgtat tttgtactaa tatctttgtg tttacagtca aattaattcc 1380
aattatctct ctaacagcct tgtatcgtat atgcaaatat gaaggaatca tgggaaatag 1440
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caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg cgttttgcgc 1680
tgcttcgcgg cgcgcctttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg gtgctacgcc 1740
tgaataagtg ataataagcg gatgaatggc agaaattcgc cggatctttg tgaaggaacc 1800
ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaatgt 1860
aagcagacag ttttattgtt catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga 1920
gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc ccccccctag ggtgggcgaa gaactccagc 1980
atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat tccgaagccc 2040
aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt gggcgtcgct 2100
tggtcggtca tttcgaaccc cagagtcccg ctcagggcgc gccggggggg ggggcgctga 2160
ggtctgcctc gtgaagaagg tgttgctgac tcataccagg cctgaatcgc cccatcatcc 2220
agccagaaag tgagggagcc acggttgatg agagctttgt tgtaggtgga ccagtcctgc 2280
aggagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 2340
ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gcccgcccag tctagctatc 2400
gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt tcccttgtcc 2460
agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga ctggctttct 2520
acgtgtctgg ttcgaggcgg gatcagccac cgcggtggcg gcctagagtc gacgaggaac 2580
tgaaaaacca gaaagttaac tggcctgtac ggaagtgtta cttctgctct aaaagctgcg 2640
gaattgtacc cgcggccgat ccaccggtcg ccaccagcgg ccatcaagca cgttatcgat 2700
accgtcgact agagctcgct gatcagtggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 2760
ggattgggaa gacaatagca gctgcagaag tttaaacgca tgctggggag agatcgatct 2820
gaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2880
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2940
cgagcgcgca gagagggagt ggcccccccc cccccccccc cggcgattct cttgtttgct 3000
ccagactctc aggcaatgac ctgatagcct ttgtagagac ctctcaaaaa tagctaccct 3060
ctccggcatg aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt 3120
ctccggcctt tctcacccgt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa 3180
aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa 3240
agtattacag ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt 3300
attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat ttattggatg ttggaatcgc 3360
ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 3420
ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacacta 3480
tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 3540
ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 3600
gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 3660
gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 3720
gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 3780
tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 3840
caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagc catattcaac gggaaacgtc gaggccgcga 3900
ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg 3960
caatcaggtg cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg 4020
aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg 4080
ctgacggaat ttatgccact tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca 4140
tggttactca ccactgcgat ccccggaaaa acagcgttcc aggtattaga agaatatcct 4200
gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcactcgatt 4260
cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gcctcgctca ggcgcaatca 4320
cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct 4380
gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc 4440
actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt 4500
attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac 4560
tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat 4620
aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaactgtca 4680
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 4740
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 4800
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4860
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4920
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4980
ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 5040
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 5100
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 5160
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 5220
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 5280
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 5340
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5400
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5460
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 5520
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5580
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagc 5617
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成
<400> 23
ccggttagca ctttgacatg gccactcgag tggccatgtc aaagtgctaa tttttg 56
<210> 24
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成
<400> 24
ccgguuagca cuuugacaug gccacucgag uggccauguc aaagugcuaa uuuug 55
<210> 25
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 25
aaaagugcuu acagugcagg uag 23

Claims (31)

1.一种多核苷酸，其包括微小RNA海绵盒，其中所述微小RNA海绵盒包括一个或多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中一个或多个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列是所述所关注微小RNA的完全或不完全互补序列的串联多路复用。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中一个或多个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列与所关注成熟微小RNA序列至少85％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少90％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少95％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少96％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少97％互补、与所关注成熟微小RNA序列至少98％互补或与所关注成熟微小RNA序列至少99％互补。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述微小RNA海绵盒包括至少2个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列、至少3个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列、至少4个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列或至少2个或更多个靶向一种或多种所关注miRNA的核苷酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述微小RNA海绵盒包括2个、4个、6个或8个靶向所述所关注微小RNA的核苷酸序列的重复序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述微小RNA海绵盒包括一个或多个靶向miR106a的核苷酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述靶向所关注miRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述微小RNA海绵盒包括SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
9.一种重组AAV(rAAV)，其具有基因组，所述基因组包括权利要求1至11中任一项的多核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的rAAV，其中所述基因组包括U6启动子或H1启动子。
11.根据权利要求9或10所述的rAAV，其中所述基因组进一步包括填充物序列。
12.根据权利要求11所述的rAAV，其中所述填充物序列包括SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的rAAV，其中所述基因组包括SEQ ID NO:21的核苷酸序列的核苷酸980至3131。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的rAAV，其中载体为血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13、Anc80或AAV7m8或其衍生物。
15.一种rAAV颗粒，其包括根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV。
16.一种组合物，其包括根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV或根据权利要求15所述的rAAV颗粒。
17.一种治疗雷特综合征(Rett syndrome)的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物。
18.一种激活X连锁基因的表达的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述X连锁基因为甲基CpG结合蛋白2(MECP2)。
20.一种治疗X连锁病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述X连锁病症为雷特综合征、A型血友病、B型血友病、登特氏病1(Dent's disease 1)、登特氏病2、DDX3X综合征、白化病-耳聋综合征、奥尔德里奇综合征(Aldrich syndrome)、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、贫血(Anaemia)(遗传性低色素性)、贫血(Anemia)(铁粒幼细胞性以及共济失调)、白内障、夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth)、色盲症、糖尿病(尿崩症，肾源性)、先天性角化不良、外胚层发育不良、面生殖发育不良(Faciogenital dysplasia)、法布里病(Fabry disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、糖原贮积病VIII型、性腺发育不全、睾丸女性化综合征、伴随脑硬化症的阿狄森氏病(Addison's disease)、肾上腺发育不全、肉芽肿病、赛德瑞斯型X连锁精神迟钝综合征(siderius X-linked mental retardation syndrome)、布鲁顿型无丙种球蛋白血症(Agammaglobulinaemia Bruton type)、脉络膜视网膜变性、无脉络膜症、白化病(眼)、脆性X综合征、癫痫性脑病(婴儿早期2)、脑积水(导水管狭窄)、血磷酸盐过低性佝偻病、莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhan syndrome)(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺乏症)、色素失调症、卡尔曼综合征(Kallmann syndrome)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脊髓性肌萎缩症2、痉挛性截瘫、棘状毛囊角化病、洛伊(眼脑肾)综合征(Lowe(oculocerebrorenal)syndrome)、门克斯综合征(Menkes syndrome)、Renpenning综合征(Renpenning Syndrome)、精神迟钝、科-勒综合征(Coffin-Lowry syndrome)、小眼症(楞次综合征(Lenz syndrome))、肌营养不良(贝克、杜氏和埃-德二氏型(Becker,Duchenne andEmery—Dreifuss types))、肌管性肌病、夜盲症、诺里氏病(Norrie's disease)(假神经胶质瘤)、眼球震颤、口面指综合征、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(I型高血氨症)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏症、视网膜色素变性、视网膜劈裂症、肌萎缩/二氢睾酮受体缺乏症、脊髓性肌萎缩、迟发性脊椎骨骺发育不良、血小板减少症、甲状腺素结合球蛋白、麦克劳德综合征(McLeod syndrome)。
22.一种治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物的用途，其用于制备用于治疗雷特综合征的药物。
23.一种治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物的用途，其用于制备用于激活X连锁基因的表达的药物。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述X连锁基因为甲基CpG结合蛋白2(MECP2)。
25.一种治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物的用途，其用于制备用于治疗X连锁病症的药物。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述X连锁病症为雷特综合征、A型血友病、B型血友病、登特氏病1、登特氏病2、DDX3X综合征、白化病-耳聋综合征、奥尔德里奇综合征、奥尔波特综合征、贫血(Anaemia)(遗传性低色素性)、贫血(Anemia)(铁粒幼细胞性以及共济失调)、白内障、夏柯-马利-杜斯氏病、色盲症、糖尿病(尿崩症，肾源性)、先天性角化不良、外胚层发育不良、面生殖发育不良、法布里病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、糖原贮积病VIII型、性腺发育不全、睾丸女性化综合征、伴随脑硬化症的阿狄森氏病、肾上腺发育不全、肉芽肿病、赛德瑞斯型X连锁精神迟钝综合征、布鲁顿型无丙种球蛋白血症、脉络膜视网膜变性、无脉络膜症、白化病(眼)、脆性X综合征、癫痫性脑病(婴儿早期2)、脑积水(导水管狭窄)、血磷酸盐过低性佝偻病、莱施-尼汉综合征(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺乏症)、色素失调症、卡尔曼综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脊髓性肌萎缩症2、痉挛性截瘫、棘状毛囊角化病、洛伊(眼脑肾)综合征、门克斯综合征、Renpenning综合征、精神迟钝、科-勒综合征、小眼症(楞次综合征)、肌营养不良(贝克、杜氏和埃-德二氏型)、肌管性肌病、夜盲症、诺里氏病(假神经胶质瘤)、眼球震颤、口面指综合征、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(I型高血氨症)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏症、视网膜色素变性、视网膜劈裂症、肌萎缩/二氢睾酮受体缺乏症、脊髓性肌萎缩、迟发性脊椎骨骺发育不良、血小板减少症、甲状腺素结合球蛋白、麦克劳德综合征。
27.一种用于治疗雷特综合征的组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物。
28.一种用于激活X连锁基因的表达的组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述X连锁基因为甲基CpG结合蛋白2(MECP2)。
30.一种用于治疗X连锁病症的组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求9至14中任一项所述的rAAV、根据权利要求15所述的rAAV颗粒或根据权利要求16所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述X连锁病症为雷特综合征、A型血友病、B型血友病、登特氏病1、登特氏病2、DDX3X综合征、白化病-耳聋综合征、奥尔德里奇综合征、奥尔波特综合征、贫血(Anaemia)(遗传性低色素性)、贫血(Anemia)(铁粒幼细胞性以及共济失调)、白内障、夏柯-马利-杜斯氏病、色盲症、糖尿病(尿崩症，肾源性)、先天性角化不良、外胚层发育不良、面生殖发育不良、法布里病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、糖原贮积病VIII型、性腺发育不全、睾丸女性化综合征、伴随脑硬化症的阿狄森氏病、肾上腺发育不全、肉芽肿病、赛德瑞斯型X连锁精神迟钝综合征、布鲁顿型无丙种球蛋白血症、脉络膜视网膜变性、无脉络膜症、白化病(眼)、脆性X综合征、癫痫性脑病(婴儿早期2)、脑积水(导水管狭窄)、血磷酸盐过低性佝偻病、莱施-尼汉综合征(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺乏症)、色素失调症、卡尔曼综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脊髓性肌萎缩症2、痉挛性截瘫、棘状毛囊角化病、洛伊(眼脑肾)综合征、门克斯综合征、Renpenning综合征、精神迟钝、科-勒综合征、小眼症(楞次综合征)、肌营养不良(贝克、杜氏和埃-德二氏型)、肌管性肌病、夜盲症、诺里氏病(假神经胶质瘤)、眼球震颤、口面指综合征、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(I型高血氨症)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏症、视网膜色素变性、视网膜劈裂症、肌萎缩/二氢睾酮受体缺乏症、脊髓性肌萎缩、迟发性脊椎骨骺发育不良、血小板减少症、甲状腺素结合球蛋白、麦克劳德综合征。
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