JP2023513932A - Ｘ連鎖障害の治療におけるｍｉＲＮＡのＡＡＶ媒介標的化 - Google Patents

Abstract

本開示は、不活性化されたＸ染色体上の遺伝子の発現を活性化するためのｍｉＲＮＡの標的化に関する。この遺伝子療法は、レット症候群を含む、Ｘ連鎖障害を治療するために有用である。本開示は、Ｘ連鎖遺伝子機能喪失変異によって引き起こされるレット症候群などの、Ｘ連鎖障害を治療するための新規遺伝子療法アプローチを提供する。Ｘ染色体上の１つ以上の遺伝子を不活性化することが知られている１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とするポリヌクレオチドおよび遺伝子療法ベクターが、本明細書で提供される。本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびベクターは、ｍｉＲＮＡを阻害し、それによって不活化されたＸ染色体上の目的の野生型遺伝子を再活性化するように設計されている。

Description

関連出願、および電子的に提出された資料の参照による組み込みへの相互参照
本出願は、その全体が参照によって組み込まれる、２０２０年２月１８日に出願された、米国仮特許出願第６２／９７８，２８５号の優先権を主張する。

本出願は、開示の別個の部分として、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるコンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０２１年２月１８日に作成された、５４９８３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、３６９５０バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含有する。

本開示は、不活性化されたＸ染色体上の遺伝子の発現を活性化するためのｍｉＲＮＡの標的化に関する。この遺伝子療法は、レット症候群を含む、Ｘ連鎖障害を治療するために有用である。

レット症候群（ＲＴＴ）は、約１０，０００人に１人の女児に影響を与えるＸ連鎖神経発達障害である。患者は、膨大な変異および疾患の不均一性を示す。症状の発症は、典型的には、運動機能および認知機能の進行性の喪失を伴う、６～１８か月齢での以前に達成された発達のマイルストーンの喪失によって特徴付けられる。米国では約１５，０００人の女児および女性、世界中では３５０，０００人の患者がＲＴＴに罹患している。ＲＴＴ女児は、運動の問題（失行、硬直、ジスキネジア、ジストニア、振戦）、発作、胃腸の問題（逆流、便秘）、整形外科の問題（拘縮、脊柱側弯症、股関節の問題）、自律神経の問題（呼吸の不規則性、心臓の問題、嚥下）、ならびに睡眠の問題および不安を含み得る様々な問題を有する。

ほぼすべてのＲＴＴ症例は、Ｘ連鎖メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）遺伝子におけるデノボ機能喪失変異によって引き起こされる。ほとんどのＲＴＴ患者は、ＭＥＣＰ２欠損症のヘテロ接合型である女性であり、ランダムなＸ染色体の不活性化により、細胞の約５０％が変異型ＭＥＣＰ２遺伝子を発現し、他の５０％が野生型ＭＥＣＰ２を発現する。

男性では、レット症候群の症状は、通常、重症すぎて生存可能ではない。女性における疾患表現型は、ＭＥＣＰ２遺伝子または別のＸ連鎖遺伝子に変異を保有しない２番目のＸ染色体の存在のため、それほど重症ではない。発生中、各細胞は、女性における２つのＸ染色体のうちの１つをランダムに不活性化する。よって、女性は、不活性化したＸ染色体に応じて、ＭＥＣＰ２遺伝子の健常コピーまたは変異コピーのいずれかを発現する細胞の混合物を含有する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、様々な疾患を治療するために検討されてきた、真核細胞における遺伝子調節機序である。ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって媒介された遺伝子発現の転写後制御を指す。天然ｍｉＲＮＡは、コード領域における調節も発生し得るが、同族メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域と配列相同性および塩基対を共有する小型（２１～２５ヌクレオチド）、非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、細胞遺伝子サイレンシング機構に、標的ｍＲＮＡを分解および／またはｍＲＮＡの翻訳を防止するように指示する。ＲＮＡｉ経路は、Ｄｕａｎ（Ｅｄ．）、Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙの第７章セクション７．３、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０）に要約されている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ＡＡＶ－Ｂ１血清型の単離は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２４（７）：１２４７－５７，２０１６に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と結合した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）を産生する。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントおよび無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして挿入される。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド形成を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部またはすべてが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
レット症候群などのＸ連鎖障害を治療するための治療アプローチを開発する必要がある。

Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４） Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７） Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２４（７）：１２４７－５７，２０１６

本開示は、Ｘ連鎖遺伝子機能喪失変異によって引き起こされるレット症候群などの、Ｘ連鎖障害を治療するための新規遺伝子療法アプローチを提供する。Ｘ染色体上の１つ以上の遺伝子を不活性化することが知られている１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とするポリヌクレオチドおよび遺伝子療法ベクターが、本明細書で提供される。本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびベクターは、ｍｉＲＮＡを阻害し、それによって不活化されたＸ染色体上の目的の野生型遺伝子を再活性化するように設計されている。

様々な実施形態では、本開示は、マイクロＲＮＡスポンジカセットを含むポリヌクレオチドおよびベクターを提供し、マイクロＲＮＡスポンジカセットは、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。スポンジによって目的のｍｉＲＮＡを標的化することは、目的のｍｉＲＮＡの結合および不活性化、目的のｍｉＲＮＡの発現の阻害、ならびに／またはＸ連鎖障害（Ｘ連鎖遺伝子）に関連する遺伝子の発現および／もしくは活性を増加させることをもたらす。

本明細書で使用される「標的」は、目的のｍｉＲＮＡに結合、相互作用、またはハイブリダイズすることを指す。目的のｍｉＲＮＡを「標的とすること」は、目的のｍｉＲＮＡの分解をもたらすか、もしくはそれを誘発するか、または目的のｍｉＲＮＡの活性を阻害する。

様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、目的のマイクロＲＮＡに完全にまたは不完全に相補的な配列のタンデムマルチプレックスである、目的のマイクロＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、ヌクレオチドは、目的のマイクロＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含み、目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも８５％相補的、目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも９０％相補的、目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも９５％相補的、目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも９６％相補的、目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも９７％相補的、目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも９８％相補的、または目的の成熟マイクロＲＮＡの配列に対して少なくとも９９％相補的である。

本開示はまた、マイクロＲＮＡスポンジカセットを含むポリヌクレオチドを提供し、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも２つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも３つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも４つ以上のヌクレオチド配列、または１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも２つ以上のヌクレオチド配列を含む。関連する実施形態では、マイクロＲＮＡスポンジカセットは、目的のマイクロＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列の２、４、６、または８反復を含む。いくつかの実施形態では、スポンジ配列は、逆配向にあり、したがってスポンジ配列は、カセットの相補鎖上にある。

様々な実施形態では、本開示は、マイクロＲＮＡスポンジカセットを含むポリヌクレオチドを提供し、マイクロＲＮＡスポンジカセットは、ｍｉＲ１０６ａを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号１または２のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、目的のｍｉＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、４、５、６、７、または８のヌクレオチド配列を含むマイクロＲＮＡスポンジカセットを含む。様々な実施形態では、スポンジカセット配列は、配列番号３、５、もしくは７のＲＮＡ配列、または配列番号４、６、もしくは８のＤＮＡ配列である。本開示はまた、２つ以上のマイクロＲＮＡスポンジカセットを含むポリヌクレオチド、例えば、２つのマイクロＲＮＡスポンジカセット、３つのマイクロＲＮＡスポンジカセット、４つのマイクロＲＮＡスポンジカセット、または５つのマイクロＲＮＡスポンジカセットを含むポリヌクレオチドを提供する。これらのマイクロＲＮＡスポンジカセットは、同じマイクロＲＮＡまたは異なるマイクロＲＮＡを標的とし得る。

本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかを含むゲノムを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。様々な実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、Ｕ６プロモーターを含む。代替の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、Ｈ１プロモーター、７ＳＫ、または他のポリメラーゼ３プロモーターを含む。これらの実施形態のいずれでも、プロモーターは、逆配向にあり、したがってＵ６プロモーターは、ゲノムの相補鎖上にある。様々な実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、スタッファー配列をさらに含む。本明細書で使用される「スタッファー配列」は、ベクター構築物の最適なパッケージング長を維持するためにベクター（例えば、ｒＡＡＶ）に含まれる可変長の非コードヌクレオチド配列を指す。例えば、ｒＡＡＶは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むスタッファー配列をさらに含む。様々な実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号２１のヌクレオチド配列のヌクレオチド９８０～３１３１を含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号２２のヌクレオチド配列のヌクレオチド９８０～２９６２を含む。様々な実施形態では、ベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、Ａｎｃ８０、もしくはＡＡＶ７ｍ８、またはそれらの誘導体である。

本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのいずれかを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。

本開示は、治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つを投与することを含む、レット症候群を治療する方法を提供する。本開示はまた、治療有効量の、レット症候群を治療するための薬剤の調製のための、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つの使用を提供する。本開示はまた、レット症候群の治療のための、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。

本開示は、治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つを投与することを含む、Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化する方法を提供する。本開示はまた、治療有効量の、Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化するための薬剤の調製のための、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つの使用を提供する。本開示はまた、Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化するための、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。様々な実施形態では、Ｘ連鎖遺伝子は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）である。

本開示は、治療有効量の、Ｘ連鎖障害の治療のための本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つを投与することを含む、Ｘ連鎖障害を治療する方法を提供する。本開示はまた、治療有効量の、Ｘ連鎖障害を治療するための薬剤の調製のための、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれか１つｒＡＡＶの使用を提供する。関連する実施形態では、Ｘ連鎖障害は、レット症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、デント病１、デント病２、ＤＤＸ３Ｘ症候群、白皮症－難聴症候群、アルドリッチ症候群、アルポート症候群、貧血（遺伝性低色素性）、貧血、（運動失調を伴う鉄芽球性）、白内障、シャルコー・マリー・トゥース、色覚異常、糖尿病（尿崩症、腎性）、先天性角化異常症、外胚葉異形成症、顔面生殖器異形成症、ファブリー病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、糖原病ＶＩＩＩ型、性腺形成異常症、精巣性女性化症候群、脳硬化症を伴うアジソン病、副腎低形成症、肉芽腫症、シデリウス（ｓｉｄｅｒｉｕｓ）Ｘ連鎖精神遅滞症候群、無ガンマグロブリン血症ブルトン型、脈絡膜網膜変性症、脈絡膜血症（Ｃｈｏｒｏｉｄａｅｍｉａ）、白皮症（眼）、脆弱Ｘ症候群、てんかん性脳症（早期幼児２）、水頭症（中脳水道狭窄）、低リン酸血症性くる病、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症）、色素失調症、カルマン症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脊髄性筋萎縮症２、痙性対麻痺、棘状毛包性角化症（Ｋｅｒａｔｏｓｉｓ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｐｉｎｕｌｏｓａ）、ロウ（眼脳腎）症候群、メンケス症候群、レンペニング症候群、精神遅滞、コフィン・ローリー症候群、小眼球症（レンツ症候群）、筋ジストロフィー（ベッカー型、デュシェンヌ型、エメリー・ドレイフス型）、筋細管ミオパチー、夜盲症、ノリエ病（偽神経膠腫）、眼振、口顔指症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（Ｉ型高アンモニア血症）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素欠損症、網膜色素変性症、網膜分離症、筋萎縮症／ジヒドロテストステロン受容体欠損症、脊髄性筋萎縮症、遅発性脊椎骨端異形成症、血小板減少症、チロキシン結合グロブリン、マクロード症候群である。

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本開示の好ましい実施形態を示すが、本開示の趣旨および範囲内である様々な変更および修正はこの詳細な説明から当業者には明らかになるため、単に例示としてのみ与えられることを理解されたい。

ＸＣＩのエピジェネティック調節因子としてのｍｉＲＮＡを示す。（図１Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノムワイドスクリーンの一般的な概略図。Ｃａｓ９を安定して発現するＢＭＳＬ２細胞を、０．２のＭＯＩでｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ライブラリーで形質導入した。ピューロマイシン選択後、Ｘｉ－Ｈｐｒｔ発現を有する細胞を、ＨＡＴ選択培地において濃縮した。（図１Ｂ）示されたｍｉＲＮＡについてｓｇＲＮＡを発現するＢＭＳＬ２におけるＨｐｒｔおよびＭＥＣＰ２のｑＲＴ－ＰＣＲ。結果は、対照（ＮＳ）に対して正規化した。（図１Ｃ）対照またはｍｉＲ１０６ｉおよび野生型（ＷＴ）ニューロンで処理されたＲＴＴにおけるＭＥＣＰ２の対立遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎ分析。エラーバー、ＳＤ；＊、ｐ＜０．０１。雄および雌の両方のマウスについての皮質、脾臓、肝臓、および肺組織におけるｍｉＲ１０６ａの相対発現レベルを図１Ｄに示す。 同上。 同上。 同上。 ｍｉＲ１０６ａ阻害が生存率に影響を与えることなく既知の標的を再活性化することを示す。（図２Ａ）ＰＡＫ５およびＡｎｋｒｄ５２のｑＲＴ－ＰＣＲ（図２Ｂ）ＮＳまたはｍｉＲ１０６阻害剤またはｍｉＲ１０６ａ ｓｇＲＮＡで処理された細胞のＭＴＴアッセイ。黒色の点線は、０日目の播種密度を示す。エラーバー、ＳＤ。図２Ｃ～２Ｄは、ｍｉＲ１０６ａ阻害剤（図２Ｃ）またはｍｉＲ１０６ａ ＳｇＲＮＡ（図２Ｄ）の存在下および不在下でのＰａｔｓｋｉ細胞およびＲｅｔｔニューロンにおけるＭＥＣＰ２転写物の相対発現レベルを示す。 同上。 同上。 同上。 ｍｉＲ１０６ａがＲｅｐＡと相互作用することを示す。（図３Ａ）ｍｉＲ１０６ａ－ＲｅｐＡ複合体を捕捉する戦略。（図３Ｂ）ミスマッチ、完全、または不完全相補的オリゴヌクレオチドを使用したｍｉＲ１０６ａ－ＲｅｐＡ複合体からのＲｅｐＡの競合的溶出。（図３Ｃ）ｍｉＲ１０６ａ模倣体で処理されたＢＭＳＬ２細胞におけるＲｅｐＡをモニタするｑＲＴ－ＰＣＲ。Ｃｈｒ１４は、陰性対照である。エラーバー、ＳＤ；＊、ｐ＜０．０１。 同上。 同上。 ｍｉＲ１０６ａがＸｉｓｔ転写を調節しないことを示す。（図４Ａ）Ｈ４ＳＶにおけるＸｉｓｔおよびＧｆｐプロモーター上のＰｏｌＩＩ結合をモニタするＣｈＩＰ。（図４Ｂ）非サイレンサー（ＮＳ）またはｍｉＲ１０６ａ阻害剤のいずれかで処理されたＨ４ＳＶにおけるＸｉｓｔ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。（図４Ｃ）アクチノマイシンＤ処理後のＮＳまたはｍｉＲ１０６ａ枯渇Ｈ４ＳＶにおけるＸｉｓｔのｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨは、正規化対照として使用された。エラーバー、ＳＤ。 同上。 同上。 対照またはｍｉＲ１０６ｉで処理された細胞におけるＸｉｓｔをモニタするＲＮＡ ＦＩＳＨの代表的な画像および定量化。（図５Ａ）Ｉｍａｇｅ Ｊ（図５Ｂ）を使用したＸｉｓｔクラウド面積およびＸｉｓｔ点染色の定量化。エラーバー、ＳＤ；＊、ｐ＜０．０１。図５Ｃおよび５Ｄは、ｍｉＲ１０６ａ－ＲｅｐＡ自由エネルギー（図５Ｃ）およびｍｉＲ１０６ａ－ＲｅｐＡ結合（図５Ｄ）を示す。 同上。 同上。 同上。 ｍｉＲＮＡスポンジによるｍｉＲ１０６ａ阻害を示す。対照またはｍｉＲ１０６ｓｐまたはｍｉＲ１０６ｓｐおよびｍｉＲ１０６ｉを発現するＢＭＳＬ２におけるウミシイタケ活性。エラーバー、ＳＤ；＊、ｐ＜０．０１。 ｍｉＲ１０６ａの喪失がＲＴＴニューロンにおいてＭＥＣＰ２を発現して、表現型の欠陥をレスキューすることを示す。（図７Ａ）対照またはＬＴＶ－ｍｉＲ１０６ｓｐで処理されたＲＴＴおよび野生型（ＷＴ）ニューロンにおけるＭＥＣＰ２のＴａｑｍａｎ分析。（図７Ｂ～Ｃ）対照またはＬＴＶ－ｍｉＲ１０６ｓｐで処理されたＭＡＰ２＋ＲＴＴニューロンにおける細胞体面積（図７Ｂ）およびニューロン分岐点の数（図７Ｃ）の定量分析。エラーバー、ＳＤ；＊、ｐ＜０．０１。 同上。 同上。 ｍｉＲ１０６ａ枯渇がＲＴＴ－ニューロンにおいて活動依存性Ｃａ２＋トランジェントをレスキューすることを示す。（図８Ａ）対照ＲＴＴ（ＮＳ）、ｍｉＲ１０６ｓｐ処理（ｍｉＲ１０６ｓｐ）、および野生型（ＷＴ）ニューロンを示すＣａ２＋イメージング中に取得された代表的な画像。色の暖かさは、Ｃａ２＋濃度に対応する。（図８Ｂ）ＮＳ、ｍｉＲ１０６ｓｐ、およびＷＴニューロン（ｎ＝１００）におけるＣａ２＋スパイク（左）およびニューロンシグナル伝達パーセント（右）。エラーバー、ＳＤ。＊，ｐ＜０．０１． 同上。 Ｍｉｒ１０６ａ阻害剤が、ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２マウスモデル由来の初代マウス胚線維芽細胞においてＸｉ連鎖ＭＥＣＰ２を発現することを示す。（図９Ａ）ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２を生成するための繁殖戦略の概略図。（図９Ｂ）ＦＡＣＳ分析によるマウスの脳細胞から単離されたＧＦＰ＋核の定量分析。（図９Ｃ）対照またはｍｉｒ１０６ｉでの処理後の雌ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－ＧｆｐＭＥＦにおけるＭｅｃｐ２－ＧｆｐおよびＭｅｃｐ２の発現をモニタ－するＲＴ－ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを負荷対照としてモニタした。 同上。 同上。 ＡＡＶ９－ｍｉｒ１０６ｓｐがＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐマウスの脳においてＸｉ連鎖ＭＥＣＰ２を発現することを示す。（図１０Ａ）ＡＡＶ９－Ｇｆｐが注射されたマウスにおける脳細胞の蛍光分析。（図１０Ｂ）ＡＡＶ９－対照およびＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐが注射されたＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐマウスの脳におけるＭｅｃｐ２－Ｇｆｐ発現の蛍光分析。（図１０Ｃ）対照（ビヒクル）またはｍｉｒ１０６ｓｐでの処理後の雌ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－ＧｆｐマウスにおけるＭｅｃｐ２－ＧｆｐおよびＭｅｃｐ２の発現をモニタ－するＲＴ－ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨを負荷対照としてモニタした。 同上。 同上。 ウイルスベクター、ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎマップ（図１１Ａ）およびｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎベクター配列（図１１Ｂ）を示す。 同上。 同上。 ウイルスベクター、ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．Ｋａｎマップ（図１２Ａ）およびｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．Ｋａｎベクター配列（図１２Ｂ）を示す。 同上。 同上。 ８つのスポンジを有するｍｉｒ１０６ａスポンジ（ｓｐ１）デザイン１のＲＮＡ配列（図１３Ａ、スポンジ配列は［配列番号７］（下の配列）であり、上記マウスｍｉＲ１０６ａ－５ｐ標的配列［配列番号２０］の隣に示される）、ｍｉｒ１０６ａスポンジ（ｓｐ１）デザイン２（図１３Ｂ［配列番号３］）、ｍｉｒ１０６ａスポンジ（ｓｐ１）デザイン３（図１３Ｃ［配列番号５］）、およびｍｉＲ１０６ａを標的とする例示的なｓｈＲＮＡ配列（図１３Ｄ［配列番号１５］）を示す。 同上。 同上。 同上。 ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐが雌ΔＣｐＧ－ＲＴＴマウスにおける行動の欠陥をレスキューすることを示す。（図１４Ａ）４週目および７週目のＡＡＶ９－対照（丸）およびＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ（四角）が注射された雌マウスのロータロッド性能。１日目は、ベースライン性能を表し、最大時間は、３００秒である（破線）。（図１４Ｂ～Ｄ）ＡＡＶ９－対照（丸）およびＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ（四角）が注射された雌マウスによる平均潜時（図１４Ｂ）、平均速度（図１４Ｃ）、および総走行距離（図１４Ｄ）としてプロットされた７週でのバーンズ迷路性能。ｎ＝３。エラーバー、ＳＤ。＊，ｐ＜０．０１． 同上。 同上。 同上。 １６週齢のＡＡＶ９．ｍｉＲ１０６ｓｐ処理動物（マウス）の２５０日齢までの生存、ならびに表現型スコア付けおよびロータロッド性能を示す。（図１５Ａ）ＡＡＶ９－対照（空ウイルス粒子）処理動物対健常同腹仔（遺伝子対照）およびＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ処理動物の生存曲線は、２５０日まで死亡なしで生存の強力な改善を示す。（図１５Ｂ）ＡＡＶ９－対照処理動物と比較した２１週齢までの処理動物の表現型スコア付けの改善を示すグラフ。（図１５Ｃ）ＡＡＶ９－対照または未処理動物と比較した１６週齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ処理動物のロータロッド性能は、各群における個々の動物についてのヒートマップ（上パネル）として提示され、グラフ（下パネル）で定量化された秒（ｐ＜０．０００１）で測定された劇的に改善されたスピニングホイールにつかまる能力を示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。 同上。 同上。

本開示は、Ｘ連鎖遺伝子機能喪失変異によって引き起こされるレット症候群などの、Ｘ連鎖障害を治療するための新規遺伝子療法アプローチを提供する。例えば、レット症候群は、Ｘ連鎖メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）遺伝子におけるヘテロ接合性機能喪失変異の結果として、主に女性に影響を与えるＸ連鎖障害である。本明細書に開示される遺伝子療法アプローチは、ＭｅＣＰ２の変異形態を発現する各細胞が、不活性化Ｘ染色体上の遺伝子の天然バックアップコピーも含有するという事実を利用する。よって、サイレンシングされた染色体の一部の再活性化は、健常な遺伝子を再発現する。

Ｘ染色体上の遺伝子を不活性化することが知られているｍｉＲＮＡを標的とする遺伝子療法ベクターが、本明細書で提供される。本明細書に開示される遺伝子療法は、ｍｉＲＮＡを阻害し、それによって、不活化Ｘ染色体上の目的の野生型遺伝子を再活性化するように設計されている。例えば、ｍｉＲＮＡ１０６ａは、ＭＥＣＰ２遺伝子を含むＸ染色体の一部分を不活性化することが知られており、ｍｉＲＮＡ１０６ａを標的とする遺伝子療法方法は、Ｘ染色体上のこのクラスターにおける遺伝子の発現を再活性化するであろう。

マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基との対合、翻訳の阻害、またはｍＲＮＡ分解の促進により、転写後レベルで遺伝子サイレンシングを媒介する約２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの５’末端の７ｂｐのシード配列はｍｉＲＮＡを標的とし、追加の認識は、標的配列の残部、およびその二次構造によって提供される。

ｍｉＲＮＡスポンジ
インビボでの効率的なｍｉＲＮＡ阻害を達成するために、ｍｉＲＮＡ機能喪失「スポンジ」が設計された。様々な実施形態では、本開示は、インビボで１つ以上の成熟ｍｉＲＮＡを競合的に阻害するマイクロＲＮＡスポンジとして作用する核酸またはヌクレオチドカセットを提供する。ｍｉＲＮＡスポンジは、目的のｍｉＲＮＡに相補的な複数の標的部位を含むヌクレオチド配列である。これらの標的部位は、目的のｍｉＲＮＡに結合するように設計されており、これはひいては標的とされたｍｉＲＮＡの分解を引き起こす。

例えば、レット症候群および／または他のＸ連鎖障害に関連するｍｉＲＮＡ１０６ａを標的とするように設計されたマイクロＲＮＡスポンジが本明細書で提供される。スポンジをｍｉＲＮＡ１０６ａに標的化することは、ｍｉＲＮＡ１０６ａの分解を誘導し、したがってｍｉＲＮＡ１０６ａ誘導性Ｘ染色体サイレンシングに干渉し、それによってＸ染色体上の遺伝子、例えば、ＭＥＣＰ２遺伝子を再活性化する。

本明細書で使用される「目的のｍｉＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡスポンジまたは小ＲＮＡが結合し、その発現を不活性化または防止する、１つ以上のｍｉＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡスポンジが標的とするｍｉＲＮＡ）を指す。様々な実施形態では、スポンジは、目的の複数のマイクロＲＮＡを標的とし得る。

様々な実施形態では、スポンジカセットは、任意の目的のｍｉＲＮＡを「吸い上げる」目的のｍｉＲＮＡに結合する、完全にまたは不完全に相補的なヌクレオチド配列のタンデムマルチプレックスを含み得る。関連する実施形態では、目的のマイクロＲＮＡを標的とする不完全に相補的なヌクレオチド配列は、スポンジカセットの「バルジ」をもたらすことができる。「バルジ」は、スポンジカセットが形成することができる二次核酸構造を指す。

スポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とするか、またはそれに結合する１つ以上の配列を含む。スポンジカセットは、単一の目的のｍｉＲＮＡを標的とする複数の同一の核酸もしくはヌクレオチド配列を含み得、またはスポンジカセットは、単一の目的のｍｉＲＮＡを標的とする複数の異なる配列を含み得る。代替的に、スポンジカセットは、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする複数の異なるヌクレオチド配列を含み得る。

加えて、マイクロＲＮＡスポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、目的のマイクロＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列は、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも８５％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９０％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９５％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９６％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９７％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９８％相補的、または目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９９％相補的である。

様々な実施形態では、マイクロＲＮＡスポンジカセットは、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも２つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも３つ以上のヌクレオチド配列、目的の１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも４つ以上のヌクレオチド配列、または目的の１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも２つ以上のヌクレオチド配列を含む。

様々な実施形態では、スポンジカセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なる目的のｍｉＲＮＡに結合するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、スポンジカセットは、１つの目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、スポンジカセットは、２つの異なる目的のｍｉＲＮＡまたは３つの異なる目的のｍｉＲＮＡまたは４つの異なる目的のｍｉＲＮＡまたは５つの異なる目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。

様々な実施形態では、スポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列の複数のコピーまたは「反復」を含み、ベクターが発現される部位に存在する任意の目的のｍｉＲＮＡを「吸い上げる」。様々な実施形態では、１つ以上のスポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０反復を含有し得る。ある特定の実施形態では、スポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列の２反復を含有する。ある特定の実施形態では、スポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とする配列の４反復を含有する。ある特定の実施形態では、スポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列の６反復を含有する。ある特定の実施形態では、スポンジカセットは、目的のｍｉＲＮＡを標的とする配列の８反復を含有する。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、スタッファー配列も含有し得る。スタッファー配列は、ウイルスベクター構築物の最適なパッケージング長を維持するためにベクターに含まれる。スタッファー配列の長さは、スポンジカセットの長さに依存する。例えば、ベクターは、１０００～１５００塩基長の範囲、または５００～２０００塩基長の範囲、または１００～１０００塩基長の範囲の長さのスタッファー配列を含有する。例示的なスタッファー配列は、１００塩基長、または２００塩基長、または３００塩基長、または４００塩基長、または５００塩基長、または６００塩基長、または７００塩基長、または８００塩基長、または９００塩基長、または１０００塩基長、または１１００塩基長、または１２００塩基長、または１３００塩基長、または１４００塩基長、または１５００塩基長、または１６００塩基長、または１７００塩基長、または１８００塩基長、または１９００塩基長、または２０００塩基長である。現在まで、ＦＤＡに承認されたスタッファー配列のいずれも容易に入手可能ではない。しかしながら、ヒト投与についてＦＤＡによって承認されているいくつかのプラスミド骨格がある。小さなＤＮＡ断片は、プラスミドまたは転写単位の要素の選択および複製に必要な任意の必須ＤＮＡ配列に対応しないこれらのプラスミドから抜き取られた。例示的なプラスミド骨格を表１に列挙し、図１１Ａ～１１Ｂに示す。完全な１３５０ｂｐスタッファー配列（配列番号１１）を生成するために、異なるプラスミドからのＤＮＡ要素をタンデムに配置した。

ｍｉＲＮＡ１０６ａ
大規模な機能喪失スクリーンは、阻害される場合不活性化されたＸ染色体からのＭＥＣＰ２遺伝子の再発現を可能にするｍｉＲＮＡを特定した。細胞モデルの結果に基づいて、ｍｉＲＮＡスポンジは、マイクロＲＮＡ １０６ａ（「ｍｉＲＮＡ１０６ａ」または「ｍｉＲ１０６ａ」とも呼ばれる）を阻害するように設計され、ベクターは、このスポンジをインビボで送達するように設計された。様々な実施形態では、本開示は、ｍｉＲ１０６ａなどの目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のマイクロＲＮＡスポンジカセットを含む組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）などのベクターを提供する。ｍｉＲ１０６ａは、Ｘ染色体上のｍｉＲ１０６ａ－３６３クラスターによってコードされる。公開されているｍｉＲ１０６ａ－ＣＬＩＰデータの分析は、ＸｉｓｔＲＮＡにおける複数のｍｉＲ１０６ａシード領域を明らかにした。ｍｉＲ－１０６ａの上方調節は、胃がんを有する患者における腫瘍転移と正の相関がある。ｍｉＲ１０６ａノックアウトマウスは、生存可能であり、表現型を示さない。ｍｉＲ１０６ａは、マウス脳皮質において高度に発現される。

例示的な実施形態では、スポンジカセットは、ｍｉＲＮＡ１０６ａ（ｍｉＲ１０６ａ）を標的とする配列を含む。マウスｍｉＲＮＡ１０６ａ－５ｐの配列は、配列番号２０で提供され、ヒトｍｉＲＮＡ１０６ａ－５ｐの配列は、配列番号２５で提供される。ｍｉＲＮＡ１０６ａを標的とする例示的な配列は、配列番号１および配列番号２として示される。ｍｉＲＮＡ１０６（ａ）スポンジ配列は、配列番号１もしくは２の１つ以上のコピー、または配列番号１もしくは２と少なくとも９０％同一である配列の１つ以上のコピーを含み得る。配列番号１または２のコピーは、配列番号１または２のうちのいずれか１つのコピー間にある、ＡＧＴＴＡ（配列番号１８）またはＡＧＵＵＡ（配列番号１９）などの、スペーサー配列によって分離され得る。様々な実施形態では、ｍｉＲ１０６ａスポンジは、配列番号３、４、５、６、７、もしくは８に示されるヌクレオチド配列であるか、または配列番号２１のＡＡＶゲノム内にある（ヌクレオチド１１４４～１３６８）。様々な実施形態では、ｍｉＲ１０６ａスポンジカセット配列は、配列番号１もしくは２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、または配列番号１もしくは２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列との少なくとも約９０％の同一性を含むその変異体を含む。これらの実施形態のいずれでも、スポンジ配列は、逆配向にあり、したがってスポンジ配列は、カセットの相補鎖上にある。

ｍｉＲＮＡ小型ＲＮＡ
本明細書において上記に示されるように、本開示は、目的のｍｉＲＮＡの活性および／または発現をさらに低減または阻害するために、単独で、または本明細書に記載されるｍｉＲＮＡスポンジと組み合わせて使用される阻害性ＲＮＡの使用を含む。よって、いくつかの態様では、本開示の産物および方法は、目的のｍｉＲＮＡの発現に影響を与える（例えば、目的のｍｉＲＮＡをノックダウンまたは発現を阻害または不活性化する）ための短鎖ヘアピンＲＮＡまたは小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含む。短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得る、急なヘアピンカーブを有する人工ＲＮＡ分子（ヌクレオチド）である。ｓｈＲＮＡは、比較的低い割合の分解およびターンオーバーを有するという点でＲＮＡｉの有益なメディエーターであるが、発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムを形質導入すると、次にｓｈＲＮＡは、プロモーター選択によってポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。産物は、プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を模倣し、Ｄｒｏｓｈａによって処理される。得られたプレ－ｓｈＲＮＡは、エクスポーチン５によって核から排出される。次にこの産物はＤｉｃｅｒによって処理され、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中へとロードされる。センス（パッセンジャー）鎖は分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的な配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを配向する。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を阻止する。これらの場合ではどちらも、ｓｈＲＮＡは標的遺伝子のサイレンシングを引き起こす。いくつかの態様では、本開示は、ｓｈＲＮＡを介して１つ以上のｍｉＲＮＡ標的アンチセンス配列を発現するＡＡＶベクターの産生および投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、様々なプロモーターの使用によって調節される。プロモーター選択は、頑強なｓｈＲＮＡ発現を得るためには必須である。様々な態様では、Ｕ６およびＨ１などのポリメラーゼＩＩプロモーター、ならびにポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用される。いくつかの態様では、Ｕ６ｓｈＲＮＡが使用される。

様々な実施形態では、本開示は、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上の小型ＲＮＡを含むベクターを提供する。様々な実施形態では、小型ＲＮＡは、Ｘ連鎖障害（例えば、レット症候群）に関連する１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とするように設計される。様々な実施形態では、目的のマイクロＲＮＡへの小型ＲＮＡの結合は、その分解を誘導し、したがってＸ染色体サイレンシングに干渉する。

様々な実施形態では、本明細書で使用される「小型ＲＮＡ（複数可）」という用語は、短鎖（または小型）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに短鎖（または小型）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉプロセスを誘発することが知られている小型ＲＮＡを指す。小型ＲＮＡは、＜２００ヌクレオチド長であり、典型的には、非コードＲＮＡ分子である。

様々な実施形態では、小型ＲＮＡは、１つ以上の目的のマイクロＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。関連する実施形態では、小型ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なる目的のｍｉＲＮＡに結合するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、小型ＲＮＡは、１つの目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、小型ＲＮＡは、２つの異なる目的のｍｉＲＮＡまたは３つの異なる目的のｍｉＲＮＡまたは４つの異なる目的のｍｉＲＮＡまたは５つの異なる目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、スタッファー配列も含有し得る。スタッファー配列は、ウイルスベクター構築物の最適なパッケージング長を維持するためにベクターに含まれる。スタッファー配列の長さは、スポンジカセットの長さに依存する。例えば、ベクターは、１０００～１５００塩基長の範囲、または５００～２０００塩基長の範囲、または１００～１０００塩基長の範囲の長さのスタッファー配列を含有する。例示的なスタッファー配列は、１００塩基長、または２００塩基長、または３００塩基長、または４００塩基長、または５００塩基長、または６００塩基長、または７００塩基長、または８００塩基長、または９００塩基長、または１０００塩基長、または１１００塩基長、または１２００塩基長、または１３００塩基長、または１４００塩基長、または１５００塩基長、または１６００塩基長、または１７００塩基長、または１８００塩基長、または１９００塩基長、または２０００塩基長である。現在まで、ＦＤＡに承認されたスタッファー配列のいずれも容易に入手可能ではない。しかしながら、ヒト投与についてＦＤＡによって承認されているいくつかのプラスミド骨格がある。小さなＤＮＡ断片は、プラスミドまたは転写単位の要素の選択および複製に必要な任意の必須ＤＮＡ配列に対応しないこれらのプラスミドから抜き取られた。例示的なプラスミド骨格を表２に列挙し、図１２Ａ～１２Ｂに示す。完全な１３５０ｂｐスタッファー配列（配列番号１１）を生成するために、異なるプラスミドからのＤＮＡ要素をタンデムに配置した。

よって、いくつかの態様では、本開示は、Ｕ６ ｓｈＲＮＡ分子を使用して、Ｘ連鎖障害に関連する目的のｍｉＲＮＡの発現をさらに阻害、ノックダウン、または妨害する。従来のスモール／ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は通常、Ｕ６などのＰｏｌＩＩＩプロモーターを含むベクターから細胞核内部へ転写される。内因性Ｕ６プロモーターは通常、スプライシングに関与する小型ＲＮＡであるＵ６ ＲＮＡの発現を制御し、十分に特徴付けられている［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様では、（１）プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ポリＩＩＩ）によって認識され、かつｓｈＲＮＡの高レベルの恒常的発現を制御し、（２）プロモーターは大半の哺乳動物細胞型において活性であるため、Ｕ６プロモーターが、哺乳動物細胞のｓｈＲＮＡ分子のベクターに基づく発現を制御するために使用される［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３－８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）］。いくつかの態様では、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するのに必要な全因子が転写開始部位の上流に位置付けられる（Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００））という点で、ＩＩＩ型ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。本開示は、マウスおよびヒトの両方のＵ６またはＨ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、Ｕ６プロモーターは、逆配向にあり、ＡＡＶゲノムの相補鎖上にある。ループによって接続された、標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核からＤｉｃｅｒがこれを低分子／小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと処理する箇所である細胞質内部へと輸送される。これらの実施形態のいずれでも、ｓｈＲＮＡは、逆配向にあり、したがってｓｈＲＮＡは、ＡＡＶゲノムの相補鎖上にある。

天然ＲＮＡｉ経路の理解が進展したため、研究者らは、疾患を治療するために標的遺伝子の発現を調節する際の使用のための人工ｓｈＲＮＡを設計してきた。小分子（または低分子）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに小分子（または低分子）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、哺乳動物細胞でＲＮＡｉプロセスを引き起こすいくつかのクラスの低分子ＲＮＡが知られており、これらは同様のクラスのベクター発現トリガーを構成する［Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３２９－４０，２０１１、Ｈａｒｐｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：９３３－８，２００９］。ＳｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベースのベクターからインビボで発現されるため、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモーターが活性である限り、単回投与で長期の遺伝子サイレンシングを達成し得る（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：１４５－７３，２００５）。重要なことには、このベクター発現アプローチは、筋遺伝子治療分野にて既に行われていた数十年の長さにわたる進歩を強化する。ただし、遺伝子をコードするタンパク質を発現する代わりに、ＲＮＡｉ治療戦略におけるベクターカーゴは、関心対象の疾患遺伝子を標的とする人工ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡカセットである。この戦略は天然ｍｉＲＮＡを発現させるために使用される。各ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ配列および構造に基づいている。天然ｍｉｒ－３０ａ成熟配列は、標的ｍｉＲＮＡに由来する固有のセンスおよびアンチセンス配列によって置き換えられる。

Ｘ染色体上の遺伝子を不活性化するｍｉＲＮＡ
多くのＸ連鎖障害において、発生中、各細胞は、女性における２つのＸ染色体のうちの１つをランダムに不活性化する。よって、女性は、不活性化したＸ染色体に応じて、Ｘ連鎖遺伝子の健常コピーまたは変異コピーのいずれかを発現する細胞の混合物を含有する。本明細書に開示される遺伝子療法アプローチは、Ｘ連鎖遺伝子の変異形態を発現する各細胞が、不活性化Ｘ染色体上のＸ連鎖遺伝子の天然バックアップコピーも含有するという事実を利用する。よって、サイレンシングされた染色体の一部の再活性化は、健常な遺伝子の再発現を可能にする。

本明細書に開示されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのスクリーニングを行って、不活性Ｘ染色体（Ｘｉ）のサイレンシングに関与する小型非コードＲＮＡを特定した。Ｘ連鎖障害に関連する特定の遺伝子（Ｘ連鎖遺伝子）は、Ｘ染色体上に位置し、それらの対立遺伝子特異的発現パターンは、Ｘ染色体不活性化（ＸＣＩ）、女性Ｘ染色体のうちの１つをランダムに不活性化するエピジェネティックなメカニズムによって決定される。ｍｉＲＮＡなどの特定の小型非コードＲＮＡは、ＸＣＩのエピジェネティックな調節因子であり得る。そのようなｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１０６ａ）は、Ｘ連鎖障害に関連する遺伝子（例えば、ＭＥＣＰ２遺伝子）の発現および／または活性を阻害する。これらのＸ連鎖ｍｉＲＮＡ標的の阻害は、Ｘ連鎖障害に関連する遺伝子の発現および／または活性を増加させる。

様々な実施形態では、本開示は、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とするスポンジカセットを含むベクターを提供する。本開示は、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする小型ＲＮＡを含むベクターも提供する。スポンジまたは小型ＲＮＡのいずれかによって、目的のｍｉＲＮＡを標的化することは、目的のｍｉＲＮＡの結合および不活性化、目的のｍｉＲＮＡの発現の阻害、ならびに／またはＸ連鎖障害に関連する遺伝子の発現および／もしくは活性を増加させることをもたらす。

メチルＣｐＧ結合タンパク質２
メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）遺伝子は、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードする。ＭＥＣＰ２は、重要なエピジェネティックリーダーとして機能する核タンパク質であり、遺伝子発現における局所的および細胞型特異的な改変を有する中枢神経系における数千の遺伝子のリプレッサーである。典型的なレット症候群（ＲＴＴ）症例の９５％は、中枢神経系（ＣＮＳ）における遺伝子発現の重要な調節因子であるＭＥＣＰ２の欠乏によって引き起こされる。ＲＴＴの根底にある臨床的表現型は、より小さな細胞体および短縮された、より少ない神経突起によって特徴付けられるニューロンの圧縮を特徴とするグローバルなニューロン表現型である。さらに、臨床的な、動物モデリングは、疾患重症度と様々なＭＥＣＰ２変異に依存する神経解剖学的変化との間の直接関与を示した。

Ｘｉ連鎖ＭＥＣＰ２をインビボで発現する実現可能性および安全性は、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１およびアクチビンＡ受容体１型の小分子阻害剤を使用して評価された（２、３）。Ｘｉ連鎖遺伝子の発現は、治療された動物においていずれの悪影響も及ぼさず、肝臓などの組織におけるオフターゲット効果は観察されなかった（２）。

様々な実施形態では、本開示は、ＭＥＣＰ２遺伝子発現を調節する目的のｍｉＲＮＡを標的とするスポンジカセットまたは小型ＲＮＡを含むベクターまたは組成物を提供する。様々な実施形態では、スポンジカセットまたは小型ＲＮＡの発現は、ＭＥＣＰ２遺伝子の発現を活性化する。

レット症候群およびＸ連鎖障害
本明細書に開示されるベクターのいずれも、Ｘ連鎖障害を治療するために使用され得る。例えば、本明細書に開示されるベクターのいずれも、レット症候群を治療するために使用され得る。レット症候群（ＲＴＴ）は、生児出生約１０，０００人に１人の発生率でほぼ排他的に女児に影響を与える神経発達障害である。

開示されたベクターのいずれかで治療され得るＸ連鎖障害は、これらに限定されないが、レット症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、デント病１、デント病２、白皮症－難聴症候群、アルドリッチ症候群、アルポート症候群、貧血（遺伝性低色素性）、貧血、（運動失調を伴う鉄芽球性）、白内障、シャルコー・マリー・トゥース、色覚異常、糖尿病（尿崩症、腎性）、先天性角化異常症、外胚葉異形成症、顔面生殖器異形成症、ファブリー病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、糖原病ＶＩＩＩ型、性腺形成異常症、精巣性女性化症候群、脳硬化症を伴うアジソン病、副腎低形成症、肉芽腫症、シデリウスＸ連鎖精神遅滞症候群、無ガンマグロブリン血症ブルトン型、脈絡膜網膜変性症、脈絡膜血症、白皮症（眼）、脆弱Ｘ症候群、てんかん性脳症（早期幼児２）、水頭症（中脳水道狭窄）、低リン酸血症性くる病、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症）、色素失調症、カルマン症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脊髄性筋萎縮症２、痙性対麻痺、棘状毛包性角化症、ロウ（眼脳腎）症候群、メンケス症候群、レンペニング症候群、精神遅滞、コフィン・ローリー症候群、小眼球症（レンツ症候群）、筋ジストロフィー（ベッカー型、デュシェンヌ型、エメリー・ドレイフス型）、筋細管ミオパチー、夜盲症、ノリエ病（偽神経膠腫）、眼振、口顔指症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（Ｉ型高アンモニア血症）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素欠損症、網膜色素変性症、網膜分離症、筋萎縮症／ジヒドロテストステロン受容体欠損症、脊髄性筋萎縮症、遅発性脊椎骨端異形成症、血小板減少症、チロキシン結合グロブリン、マクロード症候群を含む。

本明細書に開示されるベクターのいずれかを使用して治療され得るさらなるＸ連鎖障害は、参照によって組み込まれるＧｅｒｍａｉｎ，“Ｃｈａｐｔｅｒ ７：Ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ” ｉｎ Ｆａｂｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ５ Ｙｅａｒｓ ｏｆ ＦＯＳ．Ｍｅｈｔａ Ａ，Ｂｅｃｋ Ｍ，Ｓｕｎｄｅｒ－Ｐｌａｓｓｍａｎｎ Ｇｃ ｅｄｉｔｏｒｓ．（Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ ＰｈａｒｍａＧｅｎｅｓｉｓ；２００６）、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ，２００７）に列挙されている。

様々な実施形態では、本開示は、Ｘ連鎖遺伝子発現を調節する目的の１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とするスポンジカセットまたは小型ＲＮＡのいずれかを含むｒＡＡＶを含むベクターまたは組成物を提供する。様々な実施形態では、開示されたスポンジまたは小型ＲＮＡの発現は、Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化する。

がん
本明細書に開示されるベクターのいずれかで治療することができる例示的な状態または障害は、がんを含む。様々な実施形態では、がんは、これらに限定されないが、胃がん、骨がん、肺がん、肝細胞がん、膵臓がん、腎臓がん、線維性がん、乳がん、骨髄腫、扁平上皮がん、結腸直腸がん、および前立腺がんを含む。関連する態様では、がんは、転移性である。関連する態様では、転移には、骨、または骨組織、肝臓、肺、腎臓、もしくは膵臓への転移が含まれる。本明細書中の方法は、対象における腫瘍サイズもしくは腫瘍量を減少させ、かつ／または対象における転移を減少させると企図される。様々な実施形態において、本方法は腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％以上減少させる。様々な実施形態では、本方法は、腫瘍サイズを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減させる。

ＡＡＶ
いくつかの態様では、本開示は、本開示において提供される任意の１つ以上のヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。様々な実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、本明細書に開示されるマイクロＲＮＡスポンジである。様々な実施形態では、遺伝子療法ベクターは、一本鎖または自己相補的なアデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）または同様のベクター、例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０、Ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ７４である。本開示の組換えＡＡＶゲノムは、ヌクレオチド分子に隣接する１つ以上のｍｉＲＮＡスポンジ分子または１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、Ａｎｃ８０、もしくはＡＡＶ７ｍ８、またはそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

本開示はまた、組成物中に本開示のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つ以上、および本開示のＡＡＶのうちのいずれか１つ以上を提供する。いくつかの態様では、組成物はまた、希釈剤、賦形剤、および／または許容される担体を含む。いくつかの態様では、担体は、薬学的に許容される担体または生理学的に許容される担体である。

様々な実施形態では、遺伝子療法ベクターは、成熟ｍｉＲ１０６ａを競合的に阻害するマイクロＲＮＡスポンジカセットを含有する。関連する実施形態では、スポンジは、成熟マイクロＲＮＡ １０６ａに対して完全にまたは不完全に相補的な配列のタンデムマルチプレックスである。マイクロＲＮＡ １０６ａは、Ｘｉｓｔ非コードＲＮＡと相互作用することによってＸ染色体不活性化を調節することによって以前に特定された。マイクロＲＮＡへのスポンジの結合は、その分解を誘導し、したがってＸ染色体サイレンシングに干渉する。様々な実施形態では、マイクロＲＮＡスポンジの発現は、Ｕ６によって制御されるであろう。

様々な実施形態では、遺伝子療法ベクターは、以下の注射方法の１つを介して、または注射方法のいくつかの組み合わせを使用して送達され得る：静脈内送達、腰椎髄腔内注射または脳脊髄液（ＣＳＦ）にアクセスする他の注射方法を介したＣＳＦを通した送達。

様々な実施形態では、ヒトまたは大型動物種におけるＣＳＦ送達、ウイルスベクターは、造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅまたは同様のもの）と混合され得る。関連する実施形態では、造影剤組成物は、非イオン性、低浸透圧性造影剤を含み得る。関連する実施形態では、組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシラン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性、低浸透圧性造影剤を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＳＦ注射の直後に、患者は、５、１０、または１５分間、頭を１５～３０度の角度で下向きに傾けたトレンデレンブルグ体位に保持され得る。関連する実施形態では、ＣＳＦ用量は、年齢群に基づいて、患者当たり１ｅ１３ウイルスゲノム（ｖｇ）～１ｅ１５ｖｇ／患者の範囲であろう。様々な実施形態では、静脈内送達用量は、１ｅ１ ３ｖｇ／キログラム（ｋｇ）体重～２ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲であろう。

様々な実施形態では、ベクターは、他のＸ連鎖障害、例えば、ＤＤＸ３Ｘ症候群および脆弱Ｘ症候群などの、Ｘ染色体上に見られる遺伝子に対する機能喪失変異によって引き起こされる追加の疾患に使用され得る。

自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターも、本開示における使用に企図される。ＳｃＡＡＶベクターは、ベクターサイズを約２５００塩基対に低減することによって生成され、これは２２００塩基対のユニークな導入遺伝子配列に加えて、二量体としてパッケージングされた１４５塩基対ＩＴＲの２つのコピーを含む。ｓｃＡＡＶは、発現のために二本鎖ＤＮＡテンプレートに再度折り畳む能力を有する。ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．１６（１０）：１６４８－１６５６，２００８。

本開示のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野で知られている。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来し得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含む、プラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。

ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

本開示の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態は、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、ｍｉＲ１０６ａスポンジをコードする「ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎ」と名付けられたｒＡＡＶを含むが、これに限定されない。例示的な実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐとｃａｐの両方のＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐのＤＮＡが存在しない。本開示の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配などの方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。

別の実施形態では、本開示は、開示されたｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本開示の組成物は、薬学的に許容される担体中のｒＡＡＶを含む。本組成物は、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、または他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、および標的化された細胞型に応じて異なり、当該技術分野で知られる方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり、約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４から、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。

インビボまたはインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本開示によって企図される。インビボ方法は、有効用量または有効複数回用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（人間を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除もしくは低減）し、障害／疾患状態への進行を遅延もしくは予防し、障害／疾患状態の進行を遅延もしくは予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分もしくは完全）をもたらし、かつ／または生存を延長する用量である。開示される方法での予防または治療について企図される疾患の一例は、ＦＳＨＤである。

併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療および逐次的治療の両方を含む。新規の療法との併用など、本開示の方法と標準の医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との併用が特に企図される。

組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られる経路により得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、治療される感染症および／または疾患状態、ならびにｍｉＲＮＡスポンジまたはｍｉＲＮＡ小型ＲＮＡを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。

本開示は、有効用量の本開示の組換えＡＡＶおよび組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与および注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。

特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与としては、筋肉への注射、血流への注射、および／または肝臓への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の様式で避けられるべきであるが）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、開示される方法および組成物の実施の際に使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体はすべて、当業者に知られる技法によって容易に入手可能である。

注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。形態は、製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。

対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば、適切な媒体において、ｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲなどの技法を使用して目的のＤＮＡを有する細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによってインビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。

本開示のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、マイクロＲＮＡスポンジカセットの持続的発現をもたらす。本開示は、よって、マイクロＲＮＡスポンジを発現するｒＡＡＶを動物、好ましくは、ヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、１つ以上の開示されるｒＡＡＶで組織（筋肉などの組織、肝臓および脳などの臓器、ならびに唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）を形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットで行われ得る。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるマイクロＲＮＡスポンジの発現をもたらす、複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞へのマイクロＲＮＡスポンジカセットの投与／送達を指すように使用される。

本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（または、本明細書ではしばしば、単に「組成物」と呼ばれる）も提供する。

治療の方法
「治療する」、「治療される」、「治療すること」、「治療」などの用語は、障害および／またはそれに関連する症状（例えば、レット症候群、他のＸ連鎖障害またはがん）を低減または改善することを指すことを意味する。「治療すること」は、レット症候群、他のＸ連鎖障害、またはがんの発症または発症の疑い後の対象への併用療法の投与を指し得る。「治療すること」は、「緩和すること」の概念を含み、これは、レット症候群もしくは他のＸ連鎖障害に関連した任意の症状もしくは他の悪影響および／またはそのような障害に関連した副作用の発生もしくは再発の頻度、または重症度を軽減することを指す。「治療すること」という用語は、患者における特定の疾患もしくは障害の重症度を低減すること、またはその再発を遅らせること、例えば、疾患に罹患した患者における寛解期間を延長することを指す「管理すること」の概念も包含する。除外するものではないが、障害または状態を治療することは、障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解される。

様々な実施形態では、本開示は、レット症候群、Ｘ連鎖障害、またはがんを治療する方法を提供する。

本開示は、マイクロＲＮＡスポンジカセットを含む組換えＡＡＶベクターを、ｍｉＲ１０６ａを標的とする１つ以上のマイクロＲＮＡスポンジカセットをコードするｒＡＡＶの有効用量（または本質的に同時に投与される用量、または間隔をおいて与えられる用量）で、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。

この文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、または段落、またはセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載の特徴のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形例よりも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。属として記載される開示の態様に関して、すべての個々の種は、本開示の別個の態様と見なされる。「ａ」または「ａｎ」で記載または請求される本開示の態様に関して、文脈がより限定された意味を明確に要求しない限り、これらの用語は「１つ以上」を意味することを理解されたい。本開示の態様が特徴を「含む」と記載される場合、実施形態もその特徴「からなる」または「から本質的になる」と企図される。

本明細書で引用されるすべての出版物、特許、および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、本開示と矛盾しない範囲内において、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。

配列
配列番号１．ｍｉＲ１０６ａを標的とするｍｉＲ１０６ａスポンジＲＮＡ配列
ＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧ

配列番号２．ｍｉＲ１０６ａを標的とするｍｉＲ１０６ａスポンジＤＮＡ配列
ＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧ

配列番号３．ｍｉｒ１０６ａ ｓｐ１デザイン２ＲＮＡ
ＣＣＧＧＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＵＵＵＵＵＧ

配列番号４．ｍｉｒ１０６ａ ｓｐ１デザイン２ＤＮＡ
ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧ

配列番号５．ｍｉｒ１０６ａ ｓｐ１デザイン３ＲＮＡ ＡＣＣＧＧＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＵＵＵＵＵＡＡＵＵＣ

配列番号６．ｍｉｒ１０６ａ ｓｐ１デザイン３ＤＮＡ
ＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣ

配列番号７．ｍｉＲ１０６ａスポンジカセットＲＮＡ
ＣＣＧＧＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＵＡＧＣＡＣＵＵＵＧＡＧＵＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＣＧＣＡＣＵＵＵＧＵＵＵＵＵＧ

配列番号８．ｍｉＲ１０６ａスポンジカセットＤＮＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧ

配列番号９．ｍＩＴＲ
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ

配列番号１０．Ｕ６プロモーター
ＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＡＧＴＴＡＣＧＧＴＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＡＡＣＡＧＣＣＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣＣＣＴＣ

配列番号１１．スタッファー
ＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧＣＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＣＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＴＣＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＧＴＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＣＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＴＧＣ

配列番号１２．ＩＴＲ
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ

配列番号１４．ｍＩＴＲ
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ

配列番号１８スペーサー１
ＡＧＴＴＡ

配列番号１９スペーサー２
ＡＧＵＵＡ

配列番号２０マウスｍｉＲ１０６ａ－５ｐ配列
ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＡＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ

配列番号２１．ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎ
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配列番号２２．ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．ＫａｎＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＧＣＧＡＣＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＴＡＡＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＡＣＧＡＧＧＡＡＡＧＣＡＣＧＴＴＡＴＡＣＧＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＧＣＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＣＧＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＧＴＡＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＡＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＡＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＡＧＴＴＡＣＧＧＴＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＴＡＣＴＡＡＴＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＡＡＣＡＧＣＣＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧＣＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＣＧＣＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＴＣＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＴＧＴＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＣＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＡＣＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＡＧＣＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＡＣＣＴＡＣＡＣＡＴＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＧＴＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＡＧＣＴＴＴＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＴＣＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＴＴＴＣＧＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡ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配列番号２３．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ ＤＮＡ（ｓｈＲＮＡ標的配列太字ヌクレオチド５－２４）

配列番号２４．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ標的配列太字ヌクレオチド５－２４）

配列番号２５．ヒトｍｉｒ１０６ａ－５ｐ
ＡＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ

本開示のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図される以下の実施例から明白であろう。

実施例１
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーンはｍｉＲ１０６ａをＸＣＩのエピジェネティックな調節因子として特定する
Ｘ染色体不活性化（ＸＣＩ）のエピジェネティックな調節因子としてのｍｉＲＮＡは、偏りのないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングを通して特定した（図１Ａ）。ＸｉｓｔプロモーターおよびＨｐｒｔ遺伝子に欠失を有する雌マウス線維芽細胞レポーター細胞株（ＢＭＳＬ２）は、Ｘｉ連鎖Ｈｐｒｔの特異的なモニタリングを可能にし、Ｘ－再活性化を示した（５、６）。スクリーニングを開始するために、野生型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを安定して発現するＢＭＳＬ２細胞株を生成した。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリーのウイルス送達後、ＸｉからＨｐｒｔを発現する細胞をヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン選択培地で濃縮した（例えば、（６）を参照されたい）。次世代シーケンシングを使用して、ｍｉＲ１０６ａ、ｍｉＲ３６３、ｍｉＲ１８１ａ、ｍｉＲ３４０、ｍｉＲ３４ｂ、およびｍｉＲ３０ｅを含む、６つのｍｉＲＮＡを、ＸＣＩ調節因子として特定した（データは示されない）。ｍｉＲＮＡに加えて、ｓｈＲＮＡスクリーニングを通して以前に特定された２つの因子、ＡＣＶＲ１およびＳＴＣ１（６）を含み、それによってスクリーニングを検証する、１９個のタンパク質コードＸＣＩＦも特定した。

ｍｉＲＮＡは、複数の細胞モデルにおいて同じ標的に対するｓｇＲＮＡで得られたＨｐｒｔおよびＭＥＣＰ２の再活性化に基づいてランク付けした（図１Ｂ）。焦点は、Ｘ染色体上のｍｉＲＮＡクラスターによってコードされ、マウス脳皮質において高度に発現される、最高スコアの候補であるｍｉＲ１０６ａ（図１Ｂ）となった（図１Ｄ）。さらに、以前に公開されたｍｉＲ１０６ａ架橋免疫沈降データの分析は、ＸＣＩにおける重要な調節因子であるＸｉｓｔ ＲＮＡの５’領域における複数のｍｉＲ１０６ａシード配列を明らかにし（データは示されず）、ＸＣＩにおける提案されたｍｉＲ１０６ａ機能を支持した。

次に、ｍｉＲ１０６ａ阻害が、ＲＴＴに最も関連する細胞型であるヒト有糸分裂後ニューロンにおいてＸｉ連鎖ＭＥＣＰ２を再活性化するか試験された（８、９）。この目的のために、一本鎖、および化学的に強化されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを利用して、ｍｉＲ１０６ａを阻害した。便宜上、これらの薬剤は、本明細書ではｍｉＲ１０６ａ阻害剤（ｍｉＲ１０６ｉ）と呼ばれる。Ｔ１５８Ｍミスセンス変異を活性Ｘ上のＭＥＣＰ２に有し、Ｘｉ上の野生型ＭＥＣＰ２遺伝子には有さないＲＴＴニューロンを使用した（１０）。女性はＸＣＩについてモザイクであるため、同じＲＴＴ患者に由来し、活性Ｘ上の野生型ＭＥＣＰ２および野生型ＭＥＣＰ２に対して完全に歪んでいるＸｉ上の変異型ＭＥＣＰ２を有する、ＲＴＴ ｉＰＳＣクローンを、陽性同質遺伝子対照（ＷＴ－ｉＰＳＣ、（４４））として使用する。ＷＴニューロンは、ＲＴＴニューロンと比較して表現型的に正常であることが以前に示されている。例えば、ＲＴＴニューロンは、生存率および免疫蛍光アッセイによって決定されるように、ＷＴニューロンと比較して、より遅い成長、より小さい細胞体サイズ、およびより少ない分岐点を示した（例えば、（２）を参照されたい）。重要なことに、ｍｉＲ１０６ｉ処理ＲＴＴニューロンは、約１２％のレベル～ＷＴニューロンで観察されたレベルまでＸｉ連鎖ＭＥＣＰ２を発現した（図１Ｃ）。予想通り、ｍｉＲ１０６ａ阻害は、既知のｍｉＲ１０６ａ標的、ＰＡＫ５（１１）およびＡｎｋｒｄ５２（７）を上方調節したが（図２Ａ）、細胞生存率に影響を及ぼさず（図２Ｂ）、ｍｉＲ１０６ａが標的特異的であり、インビトロで安全であることを示した。さらに、ｍｉＲ１０６ａ阻害剤（図２Ｃ）またはｍｉＲ１０６ａ特異的ｓｇＲＮＡ（図２Ｄ）でのｍｉＲ１０６ａの阻害は、Ｐａｔｓｋｉ細胞（図２Ｃ）およびレットニューロン（図２Ｄ）においてＭＥＣＰ２を再活性化することが示された。

実施例２
信頼性の高いｍｉＲ１０６ａ－Ｘｉｓｔ相互作用のマッピング
ＸｉｓｔがＸＣＩの重要な調節因子であり（１２－１４）、複数のｍｉＲ１０６ａシード配列を保有する（７）ことを考慮して、ｍｉＲ１０６ａがＸｉｓｔを標的とするか調査された。計算予測アルゴリズム（１５）を使用して、ｍｉＲ１０６ａについての５つの推定結合部位を、反復（本明細書ではＲｅｐＡと呼ばれる）として定義されるＸｉｓｔの５’領域で特定した。ＲｅｐＡの分子機能は不明であるが、ＲＢＭ１５／１５ｂ（１６）およびＳＰＥＮ（１７）などの、タンパク質のＲｅｐＡ媒介性動員は、ＸＣＩにおけるＸｉｓｔ機能にとって重要である。

ｍｉＲ１０６ａ－ＲｅｐＡ相互作用を直接確認するために、ＲｅｐＡ転写物の競合的溶出をビオチン化ｍｉＲ１０６ａ模倣体との複合体で実施した（図３Ａ）。ｍｉＲ１０６ａ模倣体の標的特異性を立証するために、ｐｓｉ－ＣＨＥＣＫ－２レポーターシステムにおいて既知のｍｉＲ１０６ａ標的、ＰＡＫ５を発現するルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を設計した。ｍｉＲ１０６ｉの付加によってレスキューされた、対照と比較して、ルシフェラーゼシグナルの約８０％の減少が観察され、ｍｉＲ１０６ａ模倣体およびｍｉＲ１０６ｉの特異性を確認した。

次に、５’－Ｐ３２放射性標識ＲｅｐＡ転写物の溶出効率を、５つの予測されたｍｉＲ１０６ａ結合部位のそれぞれについて、ミスマッチ、完全、および不完全な相補的捕捉オリゴヌクレオチドを使用して比較した。結果の代表的なサブセット（図３Ｂ）に示されるように、ミスマッチ捕捉オリゴヌクレオチドではなく、完全および不完全な相補性での溶出後にプールされた洗浄液においてより大きなＲｅｐＡ転写物が検出された。同様の分析をｍｉＲ１０６ａ結合を確認した全長ＲｅｐＡ転写物で行った。結論として、これらの結果は、ｍｉＲ１０６ａが複数の部位でＲｅｐＡと物理的に相互作用することを実証する。

次に、内因性ＲｅｐＡへのｍｉＲ１０６ａ結合を確認するために、ビオチン化されたｍｉＲ１０６ａ模倣体を使用した細胞内プルダウンアッセイを実施した。全細胞溶解物からのビオチン化されたｍｉＲＮＡ／ＲＮＡ複合体を、ストレプトアビジンビーズを使用して抽出し、ＲｅｐＡ濃縮について定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって分析した。ｍｉＲ１０６ａ模倣体トランスフェクト細胞ではＲｅｐＡについてプルダウン複合体が濃縮されたが、陰性対照ではＲｅｐＡシグナルは観察されず（図３Ｃ）、ｍｉＲ１０６ａおよびＲｅｐＡがインビボで複合体を形成することを確認した。

実施例３
ＭｉＲ１０６ａはＸｉｓｔを転写的に調節する
次に、リプレッサーを枯渇させるか、またはＸｉｓｔ安定性に間接的に影響を与えるかのいずれかによって、ｍｉＲ１０６ａがＸｉｓｔ転写をプラスに調節することができるか調査された。したがって、ｍｉＲ１０６ａ枯渇細胞におけるクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によるＸｉｓｔプロモーターでのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）動員を調査した。驚くべきことに、ｍｉＲ１０６ａ枯渇は、Ｘｉｓｔプロモーター上のＰｏｌＩＩ動員に影響を与えなかったが、予想通り、Ｇｆｐプロモーター（Ｈ４ＳＶ細胞におけるＸｉ連鎖導入遺伝子）は、ＰｏｌＩＩについて濃縮され、Ｘｉ再活性化を示した（図４Ａ）。ｍｉＲ１０６ａ枯渇は、Ｘｉｓｔレベルを低減し（図４Ｂ）、アクチノマイシンＤアッセイは、Ｘｉｓｔの有意に低減した半減期を示した（図４Ｃ）。

実施例４
ｍｉＲ１０６ａのＲｅｐＡとの機能的相互作用
Ｘｉｓｔ機能およびＸｉとのその関連は、その構造に依存する（１８、３６）。したがって、ｍｉＲ１０６ａ枯渇がＸｉとのＸｉｓｔ関連に影響するかＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）を使用して調査した。予想通り、Ｘｉｓｔ「クラウド」の約８０％が対照細胞において観察された（図５Ａ、左）。対照的に、ｍｉＲ１０６ａの枯渇は、Ｘｉｓｔ「クラウド」における劇的な変化を引き起こし、これは細胞の約６５％において核全体に分散しているように見え（点の数、図５Ａ－Ｂ）、細胞の約４５％においてＸｉでより拡散しているように見えた（クラウドの領域、図５Ａ－Ｂ）。全体として、これらの結果は、ｍｉＲ１０６ａがＸｉへのＸｉｓｔ局在化に重要であることを示す。

実施例５
ｍｉＲ１０６ａの阻害が機能不全ニューロン表現型を正常化することができるか決定すること
インビボでの効率的なｍｉＲ１０６ａ阻害を達成するために、ｍｉＲ１０６ａのヌクレオチド配列に対する不完全な相補配列のタンデムマルチプレックスを保有するｍｉＲ１０６ａ機能喪失「スポンジ」が設計された。このスポンジ配列は、ｍｉＲ１０６ｓｐと呼ばれる。以下のパラメーターに基づいて、ｍｉＲ１０６ｓｐが完全に機能的であることが実証された。（ｉ）ギブズ自由エネルギー：ｍｉＲ１０６ａは、ＲｅｐＡ領域よりもｍｉＲ１０６ｓｐに対して低いΔＧｔｏｔａｌを示した（図５Ｃ）。（ｉｉ）機能的アッセイ：ｍｉＲ１０６ｓｐ－ｍｉＲ１０６ａの物理的会合は、ｍｉＲ１０６ａを内因的に発現するＢＭＳＬ２細胞においてデュアルルシフェラーゼレポーターシステムを通してスポンジ配列を発現させることによって確認された。空ベクターと比較して、ｍｉＲ１０６ｓｐ配列を有するレポーターベクターは、約６０％のより低いウミシイタケル／ホタル比を示し、これはｍｉＲ１０６ｉによってレスキューされる（図６）。（ｉｉｉ）転写効果：ｍｉＲ１０６ａのｍｉＲ１０６ｓｐ媒介性隔離は、Ｈ４ＳＶ細胞において、Ｘｉ連鎖ＴｇＧｆｐおよびｍｉＲ１０６ａの既知標的、ＰＡＫ５およびＡｎｋｒｄ５２を再活性化する。（ｉｉｉ）目的のｍｉＲＮＡに相補的な複数の標的部位を含有する、スポンジｍＲＮＡは、ドミナントネガティブ法である。スポンジは、成熟ｍｉＲＮＡと相互作用し、それらの有効性は、ｍｉＲＮＡ前駆体のクラスタリングによって影響を受けなかった（図５Ｄ）。合わせて、本明細書に開示される結果は、ｍｉＲ１０６ｓｐが生物学的に活性であることを確認した。

スポンジ発現を最大化し、長期ｍｉＲ１０６ａ機能喪失試験を実施するために、ｍｉＲ１０６ｓｐ（ＬＴＶ－ｍｉＲ１０６ｓｐ）を発現するレンチウイルスベクターｐＬＫＯ．１を操作した。ＮＰＣの形質導入効率は、ＬＴＶ－ｍｉＲ１０６ｓｐを、約８０％の形質導入効率をもたらすＧｆｐを発現するｐＬＫＯ．１と同時トランスフェクトすることによって最適化した（データは示さず）。さらに、ｍｉＲ１０６ａ枯渇は、ＮＰＣおよびニューロン系統特異的マーカーの発現によって示されるようにニューロン分化に影響を与えない。

ｍｉＲ１０６ｓｐによるＭＥＣＰ２の再活性化がＲＴＴニューロンの表現型を正常化することができるか試験される。正常化は、完全ではなく部分的な修正であり得ることが認識されるが、簡潔さのために、「正常化する」という用語は、表現型の部分的または完全な修正を意味するために使用される。ＲＴＴニューロン表現型のレスキューを評価するために、ＲＴＴニューロン株は、以下の定量化可能な測定値を使用して分析される。

（ｉ）ニューロン表現型：ＲＴＴ－ＮＰＣを４、８、および１２週間ニューロンに分化し、野生型ＭＥＣＰ２発現を確認し、対立遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎアッセイによって定量化する。次に、細胞体サイズ、分岐点、ニューロン網、点密度、およびシナプス形成について、異なるＲＴＴニューロン株をアッセイする。

概念実証として、ＬＴＶ－ｍｉＲ１０６ｓｐでのＲＴＴニューロンの処理は、処理後約８週で野生型ＭＥＣＰ２を健常ニューロンと比較して約３０％のレベルで発現し（図７Ａ）、最も重要なことには、ＭＡＰ２陽性（ニューロンマーカー）ニューロンにおける細胞体サイズおよび分岐密度をレスキューするのに十分であった（ｎ＝２００、図７Ｂおよび７Ｃ）ことが示された。

これらの結果：（１）ＭＥＣＰ２の部分的な再活性化でさえ、ＲＴＴニューロンの機能不全の表現型に対して正常化効果を有するという仮説を支持し、（２）達成されたＭＥＣＰ２再活性化のレベルが強力な正常化効果を有することを実証する。

（ｉｉ）活動依存性カルシウム（Ｃａ^２＋）トランジェント：自発性電気生理学的活動は、Ｃａ^２＋感受性蛍光色素であるｇＣＡＭＰ６ｓを使用して、様々なＲＴＴニューロン株におけるＣａ^２＋イメージングの手段によって調査される（３９）。タイムラプス画像シーケンス（６３Ｘ倍率）は、Ｚｅｉｓｓ直立蛍光スピンディスク共焦点顕微鏡を使用して、３３６×２５６ピクセルの領域で２８Ｈｚで取得される。自発性Ｃａ^２＋トランジェントは、時間をかけていくつかの独立した実験において分析され、画像はＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって分析される。

次の活動依存性Ｃａ^２＋トランジェントは、ＬＴＶ－ｍｉＲ１０６ｓｐ処理８週齢ＲＴＴニューロンにおいてモニタした。簡単に言えば、ＲＴＴニューロンをＧＣａＭＰ６で形質導入し、細胞内Ｃａ^２＋変動を、高速イメージングを使用して経時的にモニタした。図８Ａは、ｍｉＲ１０６ｓｐではＣａ^２＋振動の振幅および周波数の急激な増加が枯渇したが、対照ＲＴＴニューロンでは枯渇していないことを示す。特に、ｍｉＲ１０６ｓｐ処理細胞におけるＣａ^２＋トランジェント強度は、ＷＴニューロンに相当した（図８Ｂ）。ＭＥＣＰ２発現は、ｍｉＲ１０６ｓｐ処理後に最適化されるが、結果は、ｍｉＲ１０６ａ阻害が活動依存性Ｃａ^２＋トランジェントを改善したことを示し、提案されたアプローチの実現可能性も実証する。

（ｉｉｉ）興奮性シナプスシグナル伝達：ＲＴＴニューロンの機能的成熟に対するＭＥＣＰ２復元の効果は、電気生理学的方法を使用して決定される。全細胞記録は、少なくとも６週間分化されたニューロンについて行われる。自発性シナプス後電流の周波数および振幅の変化は、野生型ＭＥＣＰ２発現後のＲＴＴニューロンで評価される。

実施例６
遺伝子療法構築物の構築
実施例４に記載されるスポンジカセット（ｍｉＲ１０６ｓｐ）を、Ｕ６プロモーター下で自己相補的ＡＡＶ９ゲノムにサブクローニングした。プラスミド構築物は、Ｕ６プロモーター、ｍｉＲ１０６ａスポンジカセット（ｍｉＲ１０６ｓｐ）、スタッファー配列、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、変異型ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）、複製起点（Ｏｒｉ）、およびカナマイシン耐性カセット（ＫａｎＲ）を含んだ。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎと呼ばれるプラスミド構築物の概略図を図１１Ａに提供する。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎ成分の正確な配列範囲、鎖方向、および長さを表１に提供する。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎのプラスミド配列は、図１１Ｂに提供され、配列番号２１に提供される。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａスポンジ．スタッファー．Ｋａｎ構築物を、ＡＡＶ９ゲノムにパッケージングし、当該技術分野で知られている常法に従って発現させた。

ｍＩＲＮＡ１０６ａの短鎖ヘアピンＲＮＡ構築物も生成した。ｍＩＲＮＡ１０６ａ ｓｈＲＮＡを、Ｕ６プロモーター下で自己相補的ＡＡＶ９ゲノムにサブクローニングした。プラスミド構築物は、Ｕ６プロモーター、ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ、スタッファー配列、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、変異型ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）、複製起点（Ｏｒｉ）、およびカナマイシン耐性カセット（ＫａｎＲ）を含んだ。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．Ｋａｎと呼ばれるプラスミド構築物の概略図を図１２Ａに提供する。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．Ｋａｎ成分の正確な配列範囲、鎖方向、および長さを表２に提供する。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．Ｋａｎのプラスミド配列を図１２Ｂに提供し、配列番号２２に提供する。ｐＡＡＶ．ｍｉＲ１０６ａ ｓｈＲＮＡ．スタッファー．Ｋａｎ構築物を、ＡＡＶ９ゲノムにパッケージングし、当該技術分野で知られている常法に従って発現させた。効率的なアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）ベクター発現ｍｉＲ１０６ｓｐは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐと呼ばれた。Ｕ６プロモーターによって駆動される、ｍｉＲ１０６ｓｐ発現を、自己相補的ＡＡＶ９ベクターにパッケージングした。発現カセットは、パッケージングに最適なサイズを確保するためにスタッファーも含有した（４０、４１）。

実施例７
ｍｉＲ１０６ａの阻害が雌ΔＣｐＧ ＲＴＴ前臨床モデルにおける行動障害を正常化することができるか決定すること
実施例５に記載されるように、効率的なＡＡＶ９ベクター発現ｍｉＲ１０６ｓｐ（ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐと呼ばれる）は、インビボでｍｉＲ１０６ａの阻害を調査するように操作された。陰性対照として、空ウイルス粒子を使用した（ＡＡＶ９－対照）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ粒子は、トランスファープラスミドおよびヘルパープラスミドでのトリプルトランスフェクション法を使用して産生した（４２）。ウイルスベクター濃度は、シルバーゲルおよびＴａｑｍａｎ ｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した。

次に、ＡＡＶ９－ｍｉｒ１０６ｓｐがＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐマウスの脳においてＭＥＣＰ２を再活性化するか試験された（２、３）。より最近では、Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐ／ＹマウスをＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２マウスと交配することによる、ＸＣＩマウスモデル（図９Ａ、（２））。このモデルは、主に２つの理由から、Ｘｉ連鎖Ｍｅｃｐ２再活性化の正確で堅牢な定量化を可能にすることが実証された。（ｉ）結果は、１００％の細胞がＸｉにＭｅｃｐ２－Ｇｆｐを有するＧＦＰのモザイク発現によって排除されない。重要なことに、ＦＡＣＳベースのアプローチが確立され、ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２からのすべての皮質核がＧｆｐ陰性であるのに対し、Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐ／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐからの核の１００％がＧｆｐ陽性であることを示し、これは実験における理論上の最大値を表す（図９Ｂ）。（ｉｉ）Ｍｅｃｐ２の遺伝子標識は、Ｇｆｐを有する個々のニューロンの直接的な可視化を可能にし、それによって細胞の実験的操作を最小限に抑える（２）。Ｘｉ連鎖Ｍｅｃｐ２抑制解除および対照またはｍｉＲ１０６ｉのいずれかを有する雌ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐ胚（ｄ１５．５）から単離された処理マウス胚線維芽細胞をモニタするためのＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐマウスモデルの実現可能性を評価するため、ｍｉＲ１０６ｉ処理は、Ｘｉ－Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐを抑制解除したが、対照はしなかった（図９Ｃ）。

次に、５．０ｅ＋１０ベクターゲノム／ｋｇ ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐまたはＡＡＶ９－対照の単回用量を、新生児において、以前に記載されたようにＩＣＶ経路を通して投与した（４２）。Ｇｆｐを発現するＡＡＶ９（ＡＡＶ９－Ｇｆｐ）を用いて、ＡＡＶ９ベクターの効率的な形質導入効率が確認され、ＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２マウス（ｎ＝２、図１０Ａ）の脳における均一な分布が示された。重要なことに、Ｘｉ－Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐ発現は、５週でＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐが注射されたマウスでは検出されるが、ＡＡＶ９－対照が注射されたマウスでは検出されない（図１０Ｂ）。マウス脳から単離されたＲＮＡにおけるＭｅｃｐ２－Ｇｆｐの発現も、ＲＴ－ＰＣＲを使用して確認された（図１０Ｃ）。特に、ＲＴＴマウスにおける進行中の実験では、苦痛の兆候は、ｍｉＲ１０６ａ阻害後約１５週間観察されていない。

上記に示される結果は、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐがインビボでｍｉＲ１０６ａを阻害する実現可能性についての有力な証拠を提供し、ｍｉＲ１０６ａを阻害することがＸｉからＭｅｃｐ２を再活性化するという仮説を強く支持し、Ｘｉ再活性化がインビボで十分に許容されることを示す。

ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐの最適用量およびＣＳＦ送達：次に、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐがＸｉｓｔΔ：Ｍｅｃｐ２／Ｘｉｓｔ：Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐマウスにおいて最大Ｘｉ連鎖Ｍｅｃｐ２を発現する最も有効な用量を、３つの異なる濃度および脳脊髄液を介した注射を使用して確認する。マウスは、生後１日目に、動物当たり１ｅ１０ｖｇ、２．５ｅ１０ｖｇ、および５ｅ１０ｖｇの範囲の用量で脳室内注射を用いてＣＳＦに注射される。Ｍｅｃｐ２－Ｇｆｐ発現は、ＲＮＡレベル（ｑＲＴ－ＰＣＲ）およびタンパク質レベル（フローサイトメトリー、免疫蛍光、および免疫組織化学）で定量化する。

実施例８
ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐによるＲＴＴモデルにおける行動障害のレスキューおよび生存の改善
ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐによるΔＣｐＧ－ＲＴＴモデルにおける行動障害のレスキュー：表現型雌ＲＴＴマウスモデルの包括的な評価は、開示される療法のＲＴＴ患者への翻訳に重要である。結果として、発達にわたる広範囲の行動測定のレスキューを、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ処理Ｔｓｉｘ^ΔＣｐＧ：Ｍｅｃｐ２／Ｔｓｉｘ：Ｍｅｃｐ２^ｎｕｌｌ（ΔＣｐＧ－ＲＴＴ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８ Ａｕｇ ７；１１５（３２）：８１８５－８１９０）雌マウスにおいて標準Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで評価した。ΔＣｐＧ－ＲＴＴ雌マウスは、反対側のＸ染色体上のＴｓｉｘおよびＭＥＣＰ２が欠損しているため、ヌルＭＥＣＰ２対立遺伝子が優先的に発現される。処理された雌マウスは、ＭＥＣＰ２破壊から生じることが知られ、ＲＴＴ患者において示された症状：運動麻痺、振戦の増加、歩行障害、反復行動、および自傷についてスコア付けした（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．２０１８ Ａｕｇ ７；１１５（３２）：８１８５－８１９０、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ １；２７（２３）：４０７７－４０９３）。

以前の研究は、ＲＴＴ女児において観察された運動障害を連想させるＭＥＣＰ２変異型マウスにおける運動機能の異常を特定した（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ １；２７（２３）：４０７７－４０９３）。概念実証実験を、加速ロータロッドを使用して運動協調および学習の改善を評価するために行った（１日当たり３回の試行、平均、３日間連続）。図１４Ａに示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ注射マウスは、４週および７週の両方で２日目および３日目にＡＡＶ９－対照注射マウスよりも優れていた。７週齢で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ注射マウスは、ＡＡＶ９－対照処理マウスと比較して、１日目のベースラインからの劇的な改善を示し、運動協調および学習の改善を示した。これらのデータは、１６週齢のマウスでも確認され、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ処理マウスは、ＡＡＶ９対照または未処理マウスと比較して、ロータロッド性能の強力な改善を示した（図１５Ｃ）。

同様に、バーンズ迷路（１日当たり３回の試行、平均、７週で５日間連続）では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ処理は、１）以前に報酬が与えられた応答の空間位置を特定する潜時の減少（図１４Ｂ）および２）応答を完了する速度の増加（図１４Ｃ）によって証明されるように、認知の有意な改善をもたらした。トレーニング中の移動距離の統計的に有意な上昇は、処理されたマウスが、高レベルの不動性を有する対照と比較して、より探索的な行動および不安のより大幅な低減を示したことを明らかにする（図１４Ｄ）。対照的に、ＡＡＶ９対照注射マウスは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ注射マウスよりも多くの時間をアリーナで過ごし、これはオープンフィールド探索試験でも確認された。

生存および表現型重症度も、ＡＡＶ９．ｍｉＲ１０６ｓｐ処理動物対対照で評価した。図１５Ａに示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ１０６ｓｐ注射マウスは、約８０～１００日の生存を示した（生存中央値９１日）、ＡＡＶ９－対照（空ウイルス粒子）処理動物と比較して、２５０日まで劇的に改善された生存を示した。ＡＡＶ９．ｍｉＲ１０６ｓｐ処理動物対対照の表現型重症度も、表現型スコア付けによって評価し、ＡＡＶ９．ｍｉＲ１０６ｓｐ処理動物が、ＡＡＶ９－対照処理動物と比較して２１週齢まで低減した表現型重症度を示したことを実証した。

まとめると、これらの予備的な結果は、ｍｉＲ１０６ａ阻害を通したＭＥＣＰ２復元が、ΔＣｐＧ－ＲＴＴ雌マウスにおける神経運動障害および学習障害をレスキューすることを示す。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．Ｎｅｕｌ ＪＬ，Ｚｏｇｈｂｉ ＨＹ．Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．２００４；１０（２）：１１８－２８．ｄｏｉ：１０．１１７７／１０７３８５８４０３２６０９９５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１５０７０４８６．
２．Ｐｒｚａｎｏｗｓｋｉ Ｐ，Ｗａｓｋｏ Ｕ，Ｚｈｅｎｇ Ｚ，Ｙｕ Ｊ，Ｓｈｅｒｍａｎ Ｒ，Ｚｈｕ ＬＪ，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ＭＪ，Ｔｕｓｈｉｒ－Ｓｉｎｇｈ Ｊ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ，Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍｅｃｐ２ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８０３７９２１１５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：３００１２５９５．
３．Ｐｒｚａｎｏｗｓｋｉ Ｐ，Ｚｈｅｎｇ Ｚ，Ｗａｓｋｏ Ｕ，Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｓ．Ａ Ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｃｐ２ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｘ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１９（１４７）．Ｅｐｕｂ ２０１９／０６／１１．ｄｏｉ：１０．３７９１／５９４４９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：３１１８０３５４．
４．Ｙｉｌｄｉｒｉｍ Ｅ，Ｋｉｒｂｙ ＪＥ，Ｂｒｏｗｎ ＤＥ，Ｍｅｒｃｉｅｒ ＦＥ，Ｓａｄｒｅｙｅｖ ＲＩ，Ｓｃａｄｄｅｎ ＤＴ，Ｌｅｅ ＪＴ．Ｘｉｓｔ ＲＮＡ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（４）：７２７－４２． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０１．０３４．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３４１５２２３；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８７５３５６．
５．Ｋｏｍｕｒａ Ｊ，Ｓｈｅａｒｄｏｗｎ ＳＡ，Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ Ｎ，Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ Ｊ，Ｒｉｇｇｓ ＡＤ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ａｎｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ５’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｉｌｅｎｔ Ｘｉｓｔ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２（１６）：１０９７５－８０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９０９９７５７．
６．Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｓ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｏｕ Ｊ，Ｌｉｎ Ｌ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ Ｌ，Ｚｈｕ ＬＪ，Ｗａｊａｐｅｙｅｅ Ｎ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４；１１１（３５）：１２５９１－８．Ｅｐｕｂ ２０１４／０８／２０．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１３６２０１１１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５１３６１０３；ＰＭＣＩＤ：Ｐｍｃ４１５６７６５．
７．Ｉｍｉｇ Ｊ，Ｂｒｕｎｓｃｈｗｅｉｇｅｒ Ａ，Ｂｒｕｍｍｅｒ Ａ，Ｇｕｅｎｎｅｗｉｇ Ｂ，Ｍｉｔｔａｌ Ｎ，Ｋｉｓｈｏｒｅ Ｓ，Ｔｓｉｋｒｉｋａ Ｐ，Ｇｅｒｂｅｒ ＡＰ，Ｚａｖｏｌａｎ Ｍ，Ｈａｌｌ Ｊ．ｍｉＲ－ＣＬＩＰ ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｏｍｅ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ａ ｌｉｎｃＲＮＡ Ｈ１９－ｍｉＲ－１０６ａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；１１（２）：１０７－１４．Ｅｐｕｂ ２０１４／１２／２３． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．１７１３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５５３１８９０．
８．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＭＶ，Ｂｌｕｅ ＭＥ，Ｎａｉｄｕ Ｓ．Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；２０（９）：７５９－６３．Ｅｐｕｂ ２００５／１０／１８．ｄｏｉ：１０．１１７７／０８８３０７３８０５０２０００９１１０１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１６２２５８３２．
９．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＭＶ，Ｍｕｌｌａｎｅｙ Ｂ，Ｂｌｕｅ ＭＥ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００３；１８（１０）：６８８－９２．Ｅｐｕｂ ２００３／１２／０３． ｄｏｉ：１０．１１７７／０８８３０７３８０３０１８０１００５０１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１４６４９５５０．
１０．Ｍａｒｃｈｅｔｔｏ ＭＣ，Ｃａｒｒｏｍｅｕ Ｃ，Ａｃａｂ Ａ，Ｙｕ Ｄ，Ｙｅｏ ＧＷ，Ｍｕ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｇ，Ｇａｇｅ ＦＨ，Ｍｕｏｔｒｉ ＡＲ．Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ．２０１０；１４３（４）：５２７－３９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．１０．０１６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１０７４０４５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３００３５９０．
１１．Ｐａｎ ＹＪ，Ｗｅｉ ＬＬ，Ｗｕ ＸＪ，Ｈｕｏ ＦＣ，Ｍｏｕ Ｊ，Ｐｅｉ ＤＳ．ＭｉＲ－１０６ａ－５ｐ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＡＫ５．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１７；８（１０）：ｅ３１５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１７．５６１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２９０７２６８８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５６８０９２６．
１２．Ａｒｔｈｏｌｄ Ｓ，Ｋｕｒｏｗｓｋｉ Ａ，Ｗｕｔｚ Ａ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｘ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１；１３０（２）：２９５－３０５．Ｅｐｕｂ ２０１１／０５／１４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４３９－０１１－１００２－０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１５６７１７８．
１３．Ｐｏｎｔｉｅｒ ＤＢ，Ｇｒｉｂｎａｕ Ｊ．Ｘｉｓｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｅｘｐｌｏｒｅｄ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１１；１３０（２）：２２３－３６．Ｅｐｕｂ ２０１１／０６／０１．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４３９－０１１－１００８－７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１６２６１３８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３１３２４２８．
１４．Ｗｕｔｚ Ａ．Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｘ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１；１２（８）：５４２－５３．Ｅｐｕｂ ２０１１／０７／１９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３０３５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１７６５４５７．
１５．Ｒｉｆｆｏ－Ｃａｍｐｏｓ ＡＬ，Ｒｉｑｕｅｌｍｅ Ｉ，Ｂｒｅｂｉ－Ｍｉｅｖｉｌｌｅ Ｐ．Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ｗｈａｔ ｔｏ Ｃｈｏｏｓｅ？Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１６；１７（１２）．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１７１２１９８７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７９４１６８１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５１８７７８７．
１６．Ｐａｔｉｌ ＤＰ，Ｃｈｅｎ ＣＫ，Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ＢＦ，Ｃｈｏｗ Ａ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃ，Ｇｕｔｔｍａｎ Ｍ，Ｊａｆｆｒｅｙ ＳＲ．ｍ（６）Ａ ＲＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＸＩＳＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６；５３７（７６２０）：３６９－７３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９３４２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７６０２５１８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５５０９２１８．
１７．Ｌｕ Ｚ，Ｚｈａｎｇ ＱＣ，Ｌｅｅ Ｂ，Ｆｌｙｎｎ ＲＡ，Ｓｍｉｔｈ ＭＡ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＪＴ，Ｄａｖｉｄｏｖｉｃｈ Ｃ，Ｇｏｏｄｉｎｇ ＡＲ，Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ＫＪ，Ｍａｔｔｉｃｋ ＪＳ，Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ，Ｃｅｃｈ ＴＲ，Ｃｈａｎｇ ＨＹ．ＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ Ｍａｐ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｈｉｇｈｅｒ－Ｏｒｄｅｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６５（５）：１２６７－７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０４．０２８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７１８０９０５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５０２９７９２．
１８．Ｗｕｔｚ Ａ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ＴＰ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｒｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｘｉｓｔ ＲＮＡ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２；３０（２）：１６７－７４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ８２０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１１７８０１４１．
１９．Ｄｕｓｚｃｚｙｋ ＭＭ，Ｗｕｔｚ Ａ，Ｒｙｂｉｎ Ｖ，Ｓａｔｔｌｅｒ Ｍ．Ｔｈｅ Ｘｉｓｔ ＲＮＡ Ａ－ｒｅｐｅａｔ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ＡＵＣＧ ｔｅｔｒａｌｏｏｐ ｆｏｌｄ ａｎｄ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．ＲＮＡ．２０１１；１７（１１）：１９７３－８２．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．２７４７４１１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１９４７２６３；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３１９８５９１．
２０．Ｄｅｉｇａｎ ＫＥ，Ｌｉ ＴＷ，Ｍａｔｈｅｗｓ ＤＨ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ＳＨＡＰＥ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６（１）：９７－１０２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０６９２９１０６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１９１０９４４１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２６２９２２１．
２１．Ｓｍｏｌａ ＭＪ，Ｃｈｒｉｓｔｙ ＴＷ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＣＯ，Ｆｒｉｅｄｅｒｓｄｏｒｆ Ｍ，Ｋｅｅｎｅ ＪＤ，Ｌｅｅ ＤＭ，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ ＪＭ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．ＳＨＡＰＥ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ｗｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｏｍａｉｎｓ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ Ｘｉｓｔ ｌｎｃＲＮＡ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１６；１１３（３７）：１０３２２－７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６００００８１１３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７５７８８６９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５０２７４３８．
２２．Ｓｍｏｌａ ＭＪ，Ｒｉｃｅ ＧＭ，Ｂｕｓａｎ Ｓ，Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ ＮＡ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ２’－ｈｙｄｒｏｘｙｌ ａｃｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ （ＳＨＡＰＥ－ＭａＰ） ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ，ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１５；１０（１１）：１６４３－６９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．１０３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６４２６４９９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４９００１５２．
２３．Ｄｕｎｃａｎ ＣＤ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．ＳＨＡＰＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ａ ｆｒａｇｉｌｅ ｇｒｏｕｐ Ｉ ｉｎｔｒｏｎ ＲＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００８；４７（３３）：８５０４－１３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ８００２０７ｂ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８６４２８８２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４９００１５８．
２４．Ｇｈｅｒｇｈｅ ＣＭ，Ｓｈａｊａｎｉ Ｚ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ＫＡ，Ｖａｒａｎｉ Ｇ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｓｔｒｏｎｇ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＨＡＰＥ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ＮＭＲ ｏｒｄｅｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒ（Ｓ２） ｉｎ ＲＮＡ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００８；１３０（３７）：１２２４４－５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ８０４５４１ｓ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８７１０２３６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７１２６２９．
２５．Ｇｒｏｈｍａｎ ＪＫ，Ｋｏｔｔｅｇｏｄａ Ｓ，Ｇｏｒｅｌｉｃｋ ＲＪ，Ａｌｌｂｒｉｔｔｏｎ ＮＬ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ ＳＨＡＰＥ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ＸＭＲＶ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１１；１３３（５０）：２０３２６－３４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ２０７０９４５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２１２６２０９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３２４１８７０．
２６．Ｈａｊｄｉｎ ＣＥ，Ｂｅｌｌａｏｕｓｏｖ Ｓ，Ｈｕｇｇｉｎｓ Ｗ，Ｌｅｏｎａｒｄ ＣＷ，Ｍａｔｈｅｗｓ ＤＨ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ＳＨＡＰＥ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３；１１０（１４）：５４９８－５０３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１９９８８１１０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３５０３８４４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３６１９２８２．
２７．Ｌａｖｅｎｄｅｒ ＣＡ，Ｌｏｒｅｎｚ Ｒ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｔａｍａｙｏ Ｒ，Ｈｏｆａｃｋｅｒ ＩＬ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｍｏｄｅｌ－Ｆｒｅｅ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＳＨＡＰＥ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ １６Ｓ ｒＲＮＡ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２０１５；１１（５）：ｅ１００４１２６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００４１２６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５９９２７７８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４４３８９７３．
２８．Ｌｅｏｎａｒｄ ＣＷ，Ｈａｊｄｉｎ ＣＥ，Ｋａｒａｂｉｂｅｒ Ｆ，Ｍａｔｈｅｗｓ ＤＨ，Ｆａｖｏｒｏｖ ＯＶ，Ｄｏｋｈｏｌｙａｎ ＮＶ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ＳＨＡＰＥ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３；５２（４）：５８８－９５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ３００７５５ｕ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３３１６８１４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３５７８２３０．
２９．Ｌｏｗ ＪＴ，Ｋｎｏｅｐｆｅｌ ＳＡ，Ｗａｔｔｓ ＪＭ，ｔｅｒ Ｂｒａｋｅ Ｏ，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ Ｂ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．ＳＨＡＰＥ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｈＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＨＩＶ－１．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２；２０（４）：８２０－８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１．２９９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２３１４２８９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３３２１５９６．
３０．Ｌｏｗ ＪＴ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．ＳＨＡＰＥ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０；５２（２）：１５０－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１０．０６．００７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０５５４０５０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９４１７０９．
３１．ＭｃＧｉｎｎｉｓ ＪＬ，Ｄｕｎｃａｎ ＣＤ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＨＡＰＥ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００９；４６８：６７－８９．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００７６－６８７９（０９）６８００４－６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０９４６７６５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４８９０５７５．
３２．ＭｃＧｉｎｎｉｓ ＪＬ，Ｄｕｎｋｌｅ ＪＡ，Ｃａｔｅ ＪＨ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＲＮＡ ＳＨＡＰＥ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２；１３４（１５）：６６１７－２４． ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ２１０４０７５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２４７５０２２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４３３７２２９．
３３．ＭｃＧｉｎｎｉｓ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｑ，Ｌａｖｅｎｄｅｒ ＣＡ，Ｄｅｖａｒａｊ Ａ，ＭｃＣｌｏｒｙ ＳＰ，Ｆｒｅｄｒｉｃｋ Ｋ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｉｎ－ｃｅｌｌ ＳＨＡＰＥ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｆｒｅｅ ３０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５；１１２（８）：２４２５－３０．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１１５１４１１２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５６７５４７４；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４３４５６１０．
３４．Ｍｅｒｉｎｏ ＥＪ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ＫＡ，Ｃｏｕｇｈｌａｎ ＪＬ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ２’－ｈｙｄｒｏｘｙｌ ａｃｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＨＡＰＥ）．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００５；１２７（１２）：４２２３－３１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ０４３８２２ｖ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１５７８３２０４．
３５．Ｓｍｏｌａ ＭＪ，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ ＪＭ，Ｗｅｅｋｓ ＫＭ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＳＨＡＰＥ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１５；５４（４６）：６８６７－７５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．５ｂ００９７７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６５４４９１０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４９００１６５．
３６．Ｍａｅｎｎｅｒ Ｓ，Ｂｌａｕｄ Ｍ，Ｆｏｕｉｌｌｅｎ Ｌ，Ｓａｖｏｙｅ Ａ，Ｍａｒｃｈａｎｄ Ｖ，Ｄｕｂｏｉｓ Ａ，Ｓａｎｇｌｉｅｒ－Ｃｉａｎｆｅｒａｎｉ Ｓ，Ｖａｎ Ｄｏｒｓｓｅｌａｅｒ Ａ，Ｃｌｅｒｃ Ｐ，Ａｖｎｅｒ Ｐ，Ｖｉｓｖｉｋｉｓ Ａ，Ｂｒａｎｌａｎｔ Ｃ．２－Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｘｉｓｔ ＲＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＰＲＣ２ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１０；８（１）：ｅ１０００２７６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１０００２７６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２００５２２８２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７９６９５３．
３７．Ｍａｖｒａｋｉｓ ＫＪ，Ｗｏｌｆｅ ＡＬ，Ｏｒｉｃｃｈｉｏ Ｅ，Ｐａｌｏｍｅｒｏ Ｔ，ｄｅ Ｋｅｅｒｓｍａｅｃｋｅｒ Ｋ，ＭｃＪｕｎｋｉｎ Ｋ，Ｚｕｂｅｒ Ｊ，Ｊａｍｅｓ Ｔ，Ｋｈａｎ ＡＡ，Ｌｅｓｌｉｅ ＣＳ，Ｐａｒｋｅｒ ＪＳ，Ｐａｄｄｉｓｏｎ ＰＪ，Ｔａｍ Ｗ，Ｆｅｒｒａｎｄｏ Ａ，Ｗｅｎｄｅｌ ＨＧ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｉＲ－１９ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｎｏｔｃｈ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０；１２（４）：３７２－９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ２０３７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０１９０７４０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９８９７１９．
３８．Ｍｕ Ｐ，Ｈａｎ ＹＣ，Ｂｅｔｅｌ Ｄ，Ｙａｏ Ｅ，Ｓｑｕａｔｒｉｔｏ Ｍ，Ｏｇｒｏｄｏｗｓｋｉ Ｐ，ｄｅ Ｓｔａｎｃｈｉｎａ Ｅ，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ Ａ，Ｓａｎｄｅｒ Ｃ，Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉＲ－１７～９２ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｍｙｃ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００９；２３（２４）：２８０６－１１．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１８７２９０９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０００８９３１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８０００９５．
３９．Ｃｈｅｎ ＴＷ，Ｗａｒｄｉｌｌ ＴＪ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｐｕｌｖｅｒ ＳＲ，Ｒｅｎｎｉｎｇｅｒ ＳＬ，Ｂａｏｈａｎ Ａ，Ｓｃｈｒｅｉｔｅｒ ＥＲ，Ｋｅｒｒ ＲＡ，Ｏｒｇｅｒ ＭＢ，Ｊａｙａｒａｍａｎ Ｖ，Ｌｏｏｇｅｒ ＬＬ，Ｓｖｏｂｏｄａ Ｋ，Ｋｉｍ ＤＳ．Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；４９９（７４５８）：２９５－３００．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３５４．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３８６８２５８；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３７７７７９１．
４０．Ｓｉｎｎｅｔｔ ＳＥ，Ｈｅｃｔｏｒ ＲＤ，Ｇａｄａｌｌａ ＫＫＥ，Ｈｅｉｎｄｅｌ Ｃ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｚａｒｉｃ Ｖ，Ｂａｉｌｅｙ ＭＥＳ，Ｃｏｂｂ ＳＲ，Ｇｒａｙ ＳＪ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＣＰ２ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＭｅＣＰ２－Ｎｕｌｌ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｐｐａｒｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７；５：１０６－１５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１７．０４．００６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２８４９７０７２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５４２４５７２．
４１．Ｉａｎｎｉｔｔｉ Ｔ，Ｓｃａｒｒｏｔｔ ＪＭ，Ｌｉｋｈｉｔｅ Ｓ，Ｃｏｌｄｉｃｏｔｔ ＩＲＰ，Ｌｅｗｉｓ ＫＥ，Ｈｅａｔｈ ＰＲ，Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｔｏｍ Ａ，Ｍｙｓｚｃｚｙｎｓｋａ ＭＡ，Ｍｉｌｏ Ｍ，Ｈａｕｔｂｅｒｇｕｅ ＧＭ，Ｍｅｙｅｒ Ｋ，Ｋａｓｐａｒ ＢＫ，Ｆｅｒｒａｉｕｏｌｏ Ｌ，Ｓｈａｗ ＰＪ，Ａｚｚｏｕｚ Ｍ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ＳＯＤ１ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ：Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ，Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ－ｆｒｅｅ，ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ－Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｆＡＬＳ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１８；１２：７５－８８．Ｅｐｕｂ ２０１８／０９／１０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１８．０４．０１５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：３０１９５７９９；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６０２３７９０．
４２．Ｆｏｕｓｔ ＫＤ，Ｓａｌａｚａｒ ＤＬ，Ｌｉｋｈｉｔｅ Ｓ，Ｆｅｒｒａｉｕｏｌｏ Ｌ，Ｄｉｔｓｗｏｒｔｈ Ｄ，Ｉｌｉｅｖａ Ｈ，Ｍｅｙｅｒ Ｋ，Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ Ｌ，Ｂｒａｕｎ Ｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＤＷ，Ｋａｓｐａｒ ＢＫ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＡＡＶ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＳＯＤ１ ｓｌｏｗｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ＡＬＳ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３；２１（１２）：２１４８－５９．Ｅｐｕｂ ２０１３／０９／０７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１３．２１１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４００８６５６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８６３７９９．
４３．Ｃａｒｒｅｔｔｅ ＬＬＧ，Ｂｌｕｍ Ｒ，Ｍａ Ｗ，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ＲＪ，３ｒｄ， Ｌｅｅ ＪＴ．Ｔｓｉｘ－Ｍｅｃｐ２ ｆｅｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｌｏｗ－ｌｅｖｅｌ ＭＥＣＰ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｘｔｅｎｄｓ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｕｒｏｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１８；１１５（３２）：８１８５－９０．Ｅｐｕｂ ２０１８／０７／２５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８００９３１１１５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：３００３８００１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６０９４１４９．
４４．Ｇｕｙ Ｊ，Ｈｅｎｄｒｉｃｈ Ｂ，Ｈｏｌｍｅｓ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ ＪＥ，Ｂｉｒｄ Ａ．Ａ ｍｏｕｓｅ Ｍｅｃｐ２－ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｔｈａｔ ｍｉｍｉｃ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２７（３）：３２２－６．Ｅｐｕｂ ２００１／０３／１０．ｄｏｉ：１０．１０３８／８５８９９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１１２４２１１７．
４５．Ｇｕｙ Ｊ，Ｇａｎ Ｊ，Ｓｅｌｆｒｉｄｇｅ Ｊ，Ｃｏｂｂ Ｓ，Ｂｉｒｄ Ａ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）．２００７；３１５（５８１５）：１１４３－７．Ｅｐｕｂ ２００７／０２／１０．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１３８３８９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７２８９９４１．
４６．Ｈｏｆｓｅｔｈ ＬＪ．Ｇｅｔｔｉｎｇ ｒｉｇｏｒｏｕｓ ｗｉｔｈ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｉｇｏｒ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１８；３９（１）：２１－５．Ｅｐｕｂ ２０１７／１０／０３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｘ０８５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２８９６８７８７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５８６２２４４．
４７．Ｓａｍｓａ Ｇ，Ｓａｍｓａ Ｌ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｃａｄ Ｍｅｄ．２０１９；９４（１）：４７－５２．Ｅｐｕｂ ２０１８／０７／１２．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＡＣＭ．００００００００００００２３５１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２９９９５６６７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６３１４４９９．

Claims (31)

1. マイクロＲＮＡスポンジカセットを含むポリヌクレオチドであって、前記マイクロＲＮＡスポンジカセットが、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
2. 前記目的のマイクロＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列が、前記目的のマイクロＲＮＡに完全にまたは不完全に相補的な配列のタンデムマルチプレックスである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記目的のマイクロＲＮＡを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列が、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも８５％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９０％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９５％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９６％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９７％相補的、目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９８％相補的、または目的配列の成熟マイクロＲＮＡに対して少なくとも９９％相補的である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記マイクロＲＮＡスポンジカセットが、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも２つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の目的のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも３つ以上のヌクレオチド配列、目的の１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも４つ以上のヌクレオチド配列、または目的の１つ以上のｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも２つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記マイクロＲＮＡスポンジカセットが、目的のマイクロＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列の２、４、６、または８反復を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記マイクロＲＮＡスポンジカセットが、ｍｉＲ１０６ａを標的とする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
7. 目的のｍｉＲＮＡを標的とする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１または２のヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記マイクロＲＮＡスポンジカセットが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
9. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
10. 前記ゲノムが、Ｕ６またはＨ１プロモーターを含む、請求項９に記載のｒＡＡＶ。
11. 前記ゲノムが、スタッファー配列をさらに含む、請求項９または１０に記載のｒＡＡＶ。
12. 前記スタッファー配列が、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記ゲノムが、配列番号２１のヌクレオチド配列のヌクレオチド９８０～３１３１を含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
14. 前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、Ａｎｃ８０、もしくはＡＡＶ７ｍ８、またはそれらの誘導体である、請求項９～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
15. 請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む、ｒＡＡＶ粒子。
16. 請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
17. 治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物を投与することを含む、レット症候群を治療する、方法。
18. 治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物を投与することを含む、Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化する、方法。
19. 前記Ｘ連鎖遺伝子が、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）である、請求項１８に記載の方法。
20. 治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物を投与することを含む、Ｘ連鎖障害を治療する、方法。
21. 前記Ｘ連鎖障害が、レット症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、デント病１、デント病２、ＤＤＸ３Ｘ症候群、白皮症－難聴症候群、アルドリッチ症候群、アルポート症候群、貧血（遺伝性低色素性）、貧血、（運動失調を伴う鉄芽球性）、白内障、シャルコー・マリー・トゥース、色覚異常、糖尿病（尿崩症、腎性）、先天性角化異常症、外胚葉異形成症、顔面生殖器異形成症、ファブリー病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、糖原病ＶＩＩＩ型、性腺形成異常症、精巣性女性化症候群、脳硬化症を伴うアジソン病、副腎低形成症、肉芽腫症、シデリウス（ｓｉｄｅｒｉｕｓ）Ｘ連鎖精神遅滞症候群、無ガンマグロブリン血症ブルトン型、脈絡膜網膜変性症、脈絡膜血症（Ｃｈｏｒｏｉｄａｅｍｉａ）、白皮症（眼）、脆弱Ｘ症候群、てんかん性脳症（早期幼児２）、水頭症（中脳水道狭窄）、低リン酸血症性くる病、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症）、色素失調症、カルマン症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脊髄性筋萎縮症２、痙性対麻痺、棘状毛包性角化症（Ｋｅｒａｔｏｓｉｓ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｐｉｎｕｌｏｓａ）、ロウ（眼脳腎）症候群、メンケス症候群、レンペニング症候群、精神遅滞、コフィン・ローリー症候群、小眼球症（レンツ症候群）、筋ジストロフィー（ベッカー型、デュシェンヌ型、エメリー・ドレイフス型）、筋細管ミオパチー、夜盲症、ノリエ病（偽神経膠腫）、眼振、口顔指症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（Ｉ型高アンモニア血症）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素欠損症、網膜色素変性症、網膜分離症、筋萎縮症／ジヒドロテストステロン受容体欠損症、脊髄性筋萎縮症、遅発性脊椎骨端異形成症、血小板減少症、チロキシン結合グロブリン、マクロード症候群である、請求項２０に記載の方法。
22. レット症候群を治療するための薬剤の調製のための、治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物の、使用。
23. Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化するための薬剤の調製のための、治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物の、使用。
24. 前記Ｘ連鎖遺伝子が、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）である、請求項２３に記載の使用。
25. Ｘ連鎖障害の治療のための薬剤の調製のための、治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物の、使用。
26. 前記Ｘ連鎖障害が、レット症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、デント病１、デント病２、ＤＤＸ３Ｘ症候群、白皮症－難聴症候群、アルドリッチ症候群、アルポート症候群、貧血（遺伝性低色素性）、貧血、（運動失調を伴う鉄芽球性）、白内障、シャルコー・マリー・トゥース、色覚異常、糖尿病（尿崩症、腎性）、先天性角化異常症、外胚葉異形成症、顔面生殖器異形成症、ファブリー病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、糖原病ＶＩＩＩ型、性腺形成異常症、精巣性女性化症候群、脳硬化症を伴うアジソン病、副腎低形成症、肉芽腫症、シデリウスＸ連鎖精神遅滞症候群、無ガンマグロブリン血症ブルトン型、脈絡膜網膜変性症、脈絡膜血症、白皮症（眼）、脆弱Ｘ症候群、てんかん性脳症（早期幼児２）、水頭症（中脳水道狭窄）、低リン酸血症性くる病、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症）、色素失調症、カルマン症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脊髄性筋萎縮症２、痙性対麻痺、棘状毛包性角化症、ロウ（眼脳腎）症候群、メンケス症候群、レンペニング症候群、精神遅滞、コフィン・ローリー症候群、小眼球症（レンツ症候群）、筋ジストロフィー（ベッカー型、デュシェンヌ型、エメリー・ドレイフス型）、筋細管ミオパチー、夜盲症、ノリエ病（偽神経膠腫）、眼振、口顔指症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（Ｉ型高アンモニア血症）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素欠損症、網膜色素変性症、網膜分離症、筋萎縮症／ジヒドロテストステロン受容体欠損症、脊髄性筋萎縮症、遅発性脊椎骨端異形成症、血小板減少症、チロキシン結合グロブリン、マクロード症候群である、請求項２５に記載の使用。
27. レット症候群を治療するための、治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物を含む、組成物。
28. Ｘ連鎖遺伝子の発現を活性化するための、治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物を含む、組成物。
29. 前記Ｘ連鎖遺伝子が、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）である、請求項２８に記載の組成物。
30. Ｘ連鎖障害を治療するための、治療有効量の請求項９～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項１６に記載の組成物を含む、組成物。
31. 前記Ｘ連鎖障害が、レット症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、デント病１、デント病２、ＤＤＸ３Ｘ症候群、白皮症－難聴症候群、アルドリッチ症候群、アルポート症候群、貧血（遺伝性低色素性）、貧血、（運動失調を伴う鉄芽球性）、白内障、シャルコー・マリー・トゥース、色覚異常、糖尿病（尿崩症、腎性）、先天性角化異常症、外胚葉異形成症、顔面生殖器異形成症、ファブリー病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、糖原病ＶＩＩＩ型、性腺形成異常症、精巣性女性化症候群、脳硬化症を伴うアジソン病、副腎低形成症、肉芽腫症、シデリウスＸ連鎖精神遅滞症候群、無ガンマグロブリン血症ブルトン型、脈絡膜網膜変性症、脈絡膜血症、白皮症（眼）、脆弱Ｘ症候群、てんかん性脳症（早期幼児２）、水頭症（中脳水道狭窄）、低リン酸血症性くる病、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症）、色素失調症、カルマン症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、脊髄性筋萎縮症２、痙性対麻痺、棘状毛包性角化症、ロウ（眼脳腎）症候群、メンケス症候群、レンペニング症候群、精神遅滞、コフィン・ローリー症候群、小眼球症（レンツ症候群）、筋ジストロフィー（ベッカー型、デュシェンヌ型、エメリー・ドレイフス型）、筋細管ミオパチー、夜盲症、ノリエ病（偽神経膠腫）、眼振、口顔指症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（Ｉ型高アンモニア血症）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホリボシルピロリン酸合成酵素欠損症、網膜色素変性症、網膜分離症、筋萎縮症／ジヒドロテストステロン受容体欠損症、脊髄性筋萎縮症、遅発性脊椎骨端異形成症、血小板減少症、チロキシン結合グロブリン、マクロード症候群である、請求項３０に記載の組成物。

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