TW202208630A - 針對肌肉營養不良症的腺相關病毒載體遞送 - Google Patents

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克拉帕克 路易斯 羅帝諾
傑瑞 R 麥德爾
伊林 皮特森
瑞秋 波特
丹尼艾爾 葛莉芬
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美國全美兒童醫院之研究學會
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Abstract

本揭示案提供治療有需要之個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與表現小型化人類微肌肉萎縮蛋白基因的基因療法載體（諸如腺相關病毒（AAV）載體）與抑制該個體之免疫系統之步驟的組合。

Description

針對肌肉營養不良症的腺相關病毒載體遞送
本申請案主張2020年6月15日提申之美國臨時申請案第63/039252號、2020年9月27日提申之美國臨時申請案第63/083,953號、2021年3月12日提申之美國臨時申請案第63/160,376號及2021年5月13日提申之美國臨時申請案第63/188,266號的優先權，該等美國臨時申請案各自以全文引用的方式併入本文中。以電子方式提交的材料係以引用的方式併入
本申請案含有呈電腦可讀形式之序列表作為本揭示案之獨立部分，該序列表以全文引用的方式併入本文中且標識如下：檔案名：55714_Seqlisting.txt；大小：83,380個位元組；建立：2021年6月7日。
本揭示案提供治療有需要之個體之病症（諸如肌肉營養不良症）的方法，包含投與表現所關注之轉殖基因（諸如小型化人類微肌肉萎縮蛋白基因或β-肌聚糖基因）的基因療法載體（諸如腺相關病毒（AAV）載體）與抑制個體之免疫系統之步驟的組合。
肌肉質量及力量對於日常活動，諸如行動及呼吸，及對於全身代謝的重要性不言而喻。肌肉功能不足產生肌肉營養不良症（MD），其特徵在於肌無力及消瘦且對生活品質具有嚴重影響。表徵最充分之MD係由編碼肌肉萎縮蛋白相關蛋白複合物（DAPC）成員之基因突變引起。此等MD係由與DAPC繫栓之肌纖維膜-細胞支架之損失相關的膜脆性引起。杜興氏肌肉營養不良症（Duchenne Muscular Dystrophy；DMD）為最具破壞性的肌肉疾病之一，其影響5000分之1男性新生兒。
DMD係由DMD基因突變引起，該等突變導致mRNA減少及肌肉萎縮蛋白（與肌肉萎縮蛋白相關蛋白複合物(DAPC)相關之427 kD肌纖維膜蛋白質）缺乏（Hoffman等人,《細胞（Cell ）》51(6):919-28, 1987）。DAPC係由肌肉肌纖維膜處的多種蛋白質構成，細胞外基質（ECM）與細胞支架之間經由肌肉萎縮蛋白、肌動蛋白結合蛋白及α-肌萎縮蛋白聚糖、層黏連蛋白結合蛋白形成結構聯繫。此等結構聯繫用於使肌肉細胞膜在收縮期間穩定並且防止收縮誘發的損傷。隨著肌肉萎縮蛋白損失，膜脆性引起肌纖維膜撕裂及鈣流入，由此觸發鈣活化蛋白酶及節段性纖維壞死（Straub等人，《神經學新見（Curr Opin.Neurol. ）》10(2): 168-75, 1997）。此失控的肌肉退化與再生循環最終會耗盡肌肉幹細胞群（Sacco等人，《細胞》, 2010.143(7): 第1059-71頁；Wallace等人，《生理學年鑒（Annu Rev Physiol ）》, 2009.71: 第37-57頁），導致漸進性肌無力、肌內膜炎症及纖維化疤痕。
若無肌肉萎縮蛋白或微肌肉萎縮蛋白使膜穩定，則DMD將顯現失控的組織損傷與修復循環，最終經由結締組織增生使纖維化疤痕組織置換失去的肌纖維。纖維化之特徵在於包括膠原蛋白及彈性蛋白在內的ECM基質蛋白過度沈積。ECM蛋白主要由細胞介素產生，諸如活化纖維母細胞響應於應激及發炎而釋放的TGFβ。儘管DMD之主要病理特徵為肌纖維變性及壞死，但纖維化作為病理性後果具有相同影響。在DMD患者中，纖維化組織之過度產生將限制肌肉再生且造成漸進性肌無力。在一項研究中，在第10年隨訪時，初始DMD肌肉切片上存在纖維化與不良的運動後果高度相關（Desguerre等人，《神經病理學與實驗神經病學雜誌（J Neuropathol Exp Neurol ）》, 2009.68(7): 第762-7頁)。此等結果指出，纖維化係DMD肌肉功能障礙之主要促成因素且強調在明顯纖維化之前需要及早介入。
另一組MD為肢帶型MD組（LGMD）。LGMD為罕見的病狀且其發病年齡、肌無力面積、心臟與呼吸受累、惡化速率及嚴重度因人而異。LGMD可始於幼年期、青少年期、青年期或甚至更晚。兩種性別受到的影響相等。LGMD導致肩部與骨盆肢帶無力，大腿與上臂中的鄰近肌肉有時亦隨時間減弱。腿無力通常先於臂出現。面部肌肉通常不受影響。隨著病狀惡化，人們可能會出現行走問題且可能需要長時間使用輪椅。肩與臂肌肉之受累可能導致難以將臂舉過頭頂及提起物體。在一些類型之LGMD中，可能累及心臟與呼吸肌。
LGMD存在至少十九種形式，並且該等形式根據其相關的基因缺陷進行分類。類型 遺傳模式 基因或染色體 LGMD1A      常染色體顯性                肌動蛋白基因 LGMD1B      常染色體顯性                層黏連蛋白A/C基因 LGMD1C      常染色體顯性                小窩蛋白基因 LGMD1D      常染色體顯性                7號染色體 LGMD1E      常染色體顯性                結蛋白基因 LGMD1F      常染色體顯性                7號染色體 LGMD1G      常染色體顯性                4號染色體 LGMD2A      常染色體隱性遺傳               鈣蛋白酶-3基因 LGMD2B      常染色體隱性遺傳               質膜修復蛋白基因 LGMD2C      常染色體隱性遺傳               γ-肌聚醣基因 LGMD2D      常染色體隱性遺傳               α-肌聚醣基因 LGMD2E      常染色體隱性遺傳               β-肌聚醣基因 LGMD2F      常染色體隱性遺傳               δ-肌聚醣基因 LGMD2G      常染色體隱性遺傳               視松蛋白基因 LGMD2H      常染色體隱性遺傳               TRIM32 LGMD2I       常染色體隱性遺傳               FKRP基因 LGMD2J       常染色體隱性遺傳               肌聯蛋白基因 LGMD2K      常染色體隱性遺傳               POMT1基因 LGMD2L      常染色體隱性遺傳               福山蛋白基因
LGMD之專業測試現可經由國家調測組（NCG）國家診斷方案獲得。
隨著用於治療肌肉營養不良症（諸如DMD或LGMD）的基因療法被開發出來，需要最佳化此等療法以及評價免疫抑制對最佳化基因療法載體表現微肌肉萎縮蛋白轉殖基因的影響。
本揭示案係關於治療肌肉營養不良症之表現骨骼肌相關轉殖基因的基因療法載體（例如AAV）與投與免疫抑制劑的組合。另外，本揭示案包括將AAV基因療法再給予個體的方法，其中對個體之血漿進行治療性血漿置換（TPE）以移除響應於AAV基因療法之第一次劑量而產生的AAV抗體。
本揭示案係關於防止肌纖維損傷、增加肌肉強度以及減少及/或預防纖維化之表現骨骼肌（包括隔膜及心肌）微肌肉萎縮蛋白基因的基因療法載體（例如AAV）與投與免疫抑制劑的組合。另外，本揭示案包括將AAV基因療法再給予個體的方法，其中對個體之血漿進行針對抗體的治療性血漿置換（TPE）以移除個體響應於AAV基因療法之第一次劑量而產生的AAV抗體。
另外，本揭示案係關於表現骨骼肌（包括隔膜及心肌）β-肌聚醣基因的基因療法載體（例如AAV）與投與免疫抑制劑的組合。另外，本揭示案包括將AAV基因療法再給予個體的方法，其中對個體之血漿進行針對抗體的治療性血漿置換（TPE）以移除個體響應於AAV基因療法之第一次劑量而產生的AAV抗體。
本揭示案提供使用基因療法載體遞送微肌肉萎縮蛋白以解決在DMD中所觀測到的基因缺陷、由此增強肌肉力量及/或增加肌肉質量的組合療法及方法。特定而言，本揭示案提供一種證明全身遞送之rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白在非人類靈長類動物模型中之基因表現的研究，其使用改變免疫抑制持續時間、劑量及類型的不同免疫抑制方案。本揭示案亦提供一種研究，以證明在使用TPE自先前給藥之非人類靈長類動物移除AAV病毒抗體且使用rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白全身性再給予靈長類動物之後，存在微肌肉萎縮蛋白轉殖基因表現。
本揭示案亦提供一種治療罹患DMD之人類個體的方法，其中在投與rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之前，投與抗AAVrh.74抗體，且在投與rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之前，對個體進行多個療程的TPE。
本揭示案提供包含SEQ ID NO: 3、8或9之核苷酸序列的核酸分子。本揭示案亦提供包含SEQ ID NO: 9之核酸序列或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的rAAV，及包含SEQ ID NO: 9之核酸序列或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的rAAV顆粒。
本揭示案之另一態樣提供組合物，其包含含有SEQ ID NO: 3、8或9之核苷酸序列的核酸分子、含有SEQ ID NO: 9之核酸序列或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的rAAV，及含有SEQ ID NO: 9之核酸序列或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的rAAV顆粒。本文所揭示之任一種方法均可用此等組合物進行。
另外，本揭示案提供包含核酸的組合物，該核酸包含以下AAVrh.74.tMCK.CAP N3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05之一的rAAV基因體。
本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及消炎類固醇的步驟。另外，本揭示案提供包含重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白與消炎類固醇的組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症之藥劑的用途，使得該藥劑中的rAAV與消炎類固醇分開共投與，諸如rAAV與消炎類固醇同時或依序共投與。本揭示案亦提供用於治療肌肉營養不良症的組合療法，其中該療法包含重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及消炎類固醇，其中rAAV與消炎類固醇分開共投與，諸如rAAV與消炎類固醇同時或依序共投與。舉例而言，肌肉營養不良症為DMD或貝克氏肌肉營養不良症(Becker's muscular dystrophy)。舉例而言，消炎類固醇為糖皮質激素。在一些實施例中，消炎類固醇為普賴松（prednisone）、普賴蘇穠（prednisolone）、倍他米松（betamethasone）、地塞米松（dexamethasone）、氫化可的松（hydrocortisone）、甲基普賴蘇穠（methylprednisolone）或地夫可特（deflazacort）。在一些實施例中，消炎類固醇經口投與。消炎類固醇可在rAAV投與之前與之後投與。或者，僅在rAAV投與之前或僅在rAAV投與之後，投與消炎類固醇。
另外，本揭示案提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺相關病毒（rAAV）及消炎類固醇的步驟，其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。另外，本揭示案提供包含重組腺相關病毒（rAAV）及消炎類固醇之組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，使得該藥劑中的rAAV與消炎類固醇分開共投與，諸如rAAV與消炎類固醇同時或依序共投與。本揭示案亦提供用於治療肢帶型肌肉營養不良症的組合療法，其中該組合療法包含重組腺相關病毒（rAAV）及消炎類固醇，其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，其中rAAV與消炎類固醇分開共投與，諸如rAAV與消炎類固醇同時或依序共投與。舉例而言，消炎類固醇為糖皮質激素。在一些實施例中，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠，或地夫可特。在一些實施例中，消炎類固醇經口投與。消炎類固醇可在rAAV投與之前與之後投與。或者，僅在rAAV投與之前或僅在rAAV投與之後，投與消炎類固醇。
舉例而言，在本文所揭示之方法、用途或組合療法中的任一者中，消炎類固醇係在rAAV投與之前的約12小時投與，或在rAAV投與之前的約24小時投與，或在rAAV投與之前的約36小時投與，或在rAAV投與之前的約48小時投與，或在rAAV投與之前的約60小時投與，或在rAAV投與之前的約72小時投與，或在rAAV投與之前的約96小時投與。在一些實施例中，消炎類固醇係在rAAV投與之前的約5天時投與，在rAAV投與之前的約6天時投與，在rAAV投與之前的約7天時投與，或在rAAV投與之前的約8天時投與，或在rAAV投與之前的約9天時投與，或在rAAV投與之前的約10天時投與，或在rAAV投與之前的約11天時投與，或在rAAV投與之前的約12天時投與，或在rAAV投與之前的約13天時投與，或在rAAV投與之前的約14天時投與，或在rAAV投與之前的約30天時投與。
另外，在所揭示之方法、用途或組合療法中的任一者中，在投與rAAV之前，消炎類固醇投與約7天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約14天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇21天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約28天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約30天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約45天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約60天，一天至少一次。在一些實施例中，消炎類固醇係在rAAV投與之前的30至60天投與。
舉例而言，在所揭示之方法、用途或組合療法中的任一者中，消炎類固醇係在rAAV投與之前投與且消炎類固醇係在rAAV投與之後的第1至30天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至60天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至7天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至14天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至21天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至24天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至28天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至30天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的30至60天一天投與至少一次。
在本文所揭示之方法、用途或組合療法中的任一者中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前投與。在一些實施例中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前的至少7天投與。術語抗CD20特異性抗體係指特異性結合至CD20或抑制或減少其表現或活性的抗體。例示性抗CD20抗體包括利妥昔單抗（rituximab）、奧克珠單抗（ocrelizumab）或奧伐木單抗（ofatumumab）。
在所揭示之方法、用途或組合療法中之任一者中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前的約60天投與，或在rAAV投與之前的約45天投與，或在rAAV投與之前的約30天投與，在rAAV投與之前的約14天投與，在rAAV投與之前的約7天投與且在rAAV投與的約24小時內投與。在一些實施例中，抗CD20抗體係在rAAV投與之前的30至60天投與。在一些實施例中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之後投與。舉例而言，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前與之後投與。或者，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前投與，或抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之後投與。
另外，在所揭示之方法、用途或組合療法中的任一者中，可以包含投與免疫抑制性巨環內酯。術語免疫抑制性巨環內酯係指抑制或調節個體之免疫系統的巨環內酯藥劑。巨環內酯為包含與一種或多種去氧糖類（諸如二去氧甲基已糖或去氧胺）連接之大巨環內酯環的一類藥劑。內酯環通常為14員、15員或16員環。巨環內酯屬於聚酮類藥劑且可為天然產物。免疫抑制性巨環內酯之實例包括他克莫司（tacrolimus）、吡美莫司（pimecrolimus）及西羅莫司（sirolimus）。在一些實施例中，免疫抑制性巨環內酯經口投與個體。在一些實施例中，免疫抑制性巨環內酯可以在rAAV投與之前且可以在rAAV投與之後投與。或者，在rAAV投與之前投與免疫抑制性巨環內酯，或在rAAV投與之後投與免疫抑制性巨環內酯。
在一些實施例中，免疫抑制性巨環內酯係在rAAV投與之前投與至少三天，一天至少一次，或在rAAV投與之前的至少4天投與，或在rAAV投與之前的至少5天投與，或在rAAV投與之前的至少6天投與，在rAAV投與之前的至少7天投與，或在rAAV投與之前的至少10天投與，或在rAAV投與之前的至少14天投與，或在rAAV投與之前的至少30天投與，或在rAAV投與之前的至少45天投與，或在rAAV投與之前的至少60天投與。在一些實施例中，免疫抑制性巨環內酯係在rAAV投與之前的30至60天投與。
本揭示案亦提供一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者。本揭示案亦提供包含重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白與免疫抑制療法之組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者，例如在所揭示之藥劑中，rAAV與免疫抑制療法中之一種或多種組分分開共投與，諸如rAAV與免疫抑制療法中之一種或多種組分同時或依序共投與。本揭示案亦提供用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，其中該組合療法包含重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及免疫抑制療法，其中rAAV與免疫抑制療法分開共投與，諸如rAAV與免疫抑制療法中之多種組分之一同時或依序共投與。術語免疫抑制療法係指抑制或調節個體之免疫系統的治療方法或療法。該療法包含投與一種或多種免疫抑制劑。在一些實施例中，免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯。
本揭示案亦提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含投與選自由以下組成之群的重組腺相關病毒（rAAV）：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；以及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者。本揭示案亦提供包含rAAV及免疫抑制療法之組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中該rAAV包含選自由以下組成之群的rAAV重組腺相關病毒（rAAV）：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74. MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；且其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，例如在所揭示之藥劑中，rAAV與免疫抑制療法中之一種或多種組分分開共投與，諸如rAAV與免疫抑制療法中之一種或多種組分同時或依序共投與。本揭示案亦提供用於治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的組合療法，其中該組合療法包含選自由以下組成之群的重組腺相關病毒（rAAV）：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；且其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，其中rAAV與免疫抑制療法中的一種或多種組分分開共投與，諸如rAAV與免疫抑制療法中的一種或多種組分同時或依序共投與。在一些實施例中，免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯。
在一種例示性免疫抑制療法中，在rAAV投與之前的約24小時投與消炎類固醇。在另一種例示性免疫抑制療法中，在rAAV投與之前投與消炎類固醇，且在rAAV投與之後的第1至30天一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1天至60天一天投與消炎類固醇至少一次。
在任一種所揭示的免疫抑制療法中，消炎類固醇為糖皮質激素，諸如普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特。在一些實施例中，消炎類固醇經口投與。
在其他例示性免疫抑制療法中，抗CD20特異性抗體先於rAAV的投與。舉例而言，藉由血管內輸注投與抗CD20抗體。例示性抗CD20特異性抗體包括利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧伐木單抗。
在一個實施例中，在rAAV投與之前的至少14天投與抗CD20特異性抗體。在另一個實施例中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前的約60天投與，或在rAAV投與之前的約45天投與，或在rAAV投與之前的約30天投與，在rAAV投與之前的14天投與，在rAAV投與之前的約7天投與且在rAAV投與的約24小時內投與。另外，在rAAV投與之前，投與抗CD20特異性抗體30至60天。所揭示之免疫抑制療法亦包括在rAAV投與之後投與抗CD20特異性抗體。
另外，所揭示之免疫抑制療法包含在rAAV投與之前，投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次。免疫抑制療法亦可包含在rAAV投與之後，投與免疫抑制性巨環內酯。在任一種所揭示之免疫抑制療法中，免疫抑制性巨環內酯經口投與。例示性免疫抑制性巨環內酯包括他克莫司（tacrolimus）、盤克莫司（pinecrolimus）或西羅莫司（sirolimus）。
在一些實施例中，在rAAV投與之前的30至60天投與所揭示之免疫抑制療法。另外，免疫抑制療法係在rAAV投與之前的約60天投與，在rAAV投與之前的約45天投與，在rAAV投與之前的約30天投與，在rAAV投與之前的約14天投與，在rAAV投與之前的約7天投與，在rAAV投與之前的約24小時投與。
在一個特定實施例中，本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含以下步驟：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，及在rAAV投與之後的第1至30天，一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在rAAV投與之後視情況投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在rAAV投與之後，視情況投與免疫抑制性巨環內酯。舉例而言，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特；抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧法木單抗；在消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者中，免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。在一個例示性實施例中，免疫抑制療法包含消炎類固醇普賴松或普賴蘇穠、抗CD20抗體利妥昔單抗，及免疫抑制性巨環內酯西羅莫司。
亦提供治療包含rAAV及免疫抑制療法之組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中該rAAV為rAAV.MHCK7微肌肉萎縮蛋白且該免疫抑制療法包含：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，及在rAAV投與之後的第1至30天，一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在rAAV投與之後視情況投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在rAAV投與之後，視情況投與免疫抑制性巨環內酯。舉例而言，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特；抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧法木單抗；在消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者中，免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。在一個例示性實施例中，免疫抑制療法包含消炎類固醇普賴松或普賴蘇穠、抗CD20抗體利妥昔單抗，及免疫抑制性巨環內酯西羅莫司。
本揭示案提供一種用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，其包含rAAV及免疫抑制療法，其中該rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白且該免疫抑制療法包含：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，及在rAAV投與之後的第1至30天，一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在rAAV投與之後視情況投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在rAAV投與之後，視情況投與免疫抑制性巨環內酯。舉例而言，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特；抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧法木單抗；在消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者中，免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。在一個例示性實施例中，免疫抑制療法包含消炎類固醇普賴松或普賴蘇穠、抗CD20抗體利妥昔單抗，及免疫抑制性巨環內酯西羅莫司。
在另一特定實施例中，本揭示案提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含投與選自由以下組成之群的重組腺相關病毒（rAAV）：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；以及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含以下步驟：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，且在rAAV投與之後的第1至30天，一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在rAAV投與之後，視情況投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在rAAV投與之後，視情況投與免疫抑制性巨環內酯。
在另一特定實施例中，本揭示案提供包含rAAV與免疫抑制療法之組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；且該免疫抑制療法包含：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，且在rAAV投與之後的第1至30天一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天投與消炎類固醇，一天至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在rAAV投與之後，視情況投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在rAAV投與之後，視情況投與免疫抑制性巨環內酯。
在另一特定實施例中，本揭示案提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的組合療法，其包含rAAV及免疫抑制療法，其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；且該免疫抑制療法包含：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，且在rAAV投與之後的第1至30天，一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在rAAV投與之後，視情況投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在rAAV投與之後，視情況投與免疫抑制性巨環內酯。
在另一個實施例中，本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含在投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的第二次劑量之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE），其中在進行TPE之前，向該個體投與rAAV的第一次劑量。
在另一個實施例中，本揭示案提供組合療法用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的用途，其中該組合療法包含在投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的第二次劑量之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE），其中在進行TPE之前，向個體投與rAAV的第一次劑量。
在另一個實施例中，本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，其中該組合療法包含在投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的第二次劑量之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE），其中在進行TPE之前，向該個體投與rAAV的第一次劑量。
本揭示案提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含在投與選自由以下組成之群之重組腺相關病毒（rAAV）的第二次劑量之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；其中在進行TPE之前，向該個體投與rAAV的第一次劑量。
在另一實施例中，本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟：a）投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的第一次劑量；b） 對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）；及c）  投與rAAV的第二次劑量。在任一種所揭示之方法中，在投與第2次劑量或rAAV之前，對該個體之血漿進行至少兩次TPE或至少三次TPE。在一些實施例中，在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行至少四次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行五次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行六次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行七次TPE。
在另一個實施例中，本揭示案提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟： a）投與選自由以下組成之群之重組腺相關病毒的第一次劑量：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74. MHCK7. huAN05；b）對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）；及c）投與第二次劑量或rAAV。在任一種所揭示之方法中，在投與第2次劑量或rAAV之前，對該個體之血漿進行至少兩次TPE或至少三次TPE。在一些實施例中，在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行至少四次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行五次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行六次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行七次TPE。
在另一實施例中，本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟：a）在投與重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）；及b）    投與rAAV。在任一種所揭示之方法中，在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少三次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少四次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少五次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少六次TPE；或在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少七次TPE。在此等所揭示方法中，在rAAV投與之前的約24小時，向個體投與消炎類固醇。另外，在一些實施例中，rAAV投與之後的第1至60天，向個體投與消炎類固醇，一天至少一次。舉例而言，消炎類固醇經口投與。另外，消炎類固醇為糖皮質激素，諸如普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特。
另外，本揭示案提供治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的步驟，包含以下步驟：a）在投與選自由以下組成之群的重組腺相關病毒（rAAV）之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；b）投與rAAV。在任一種所揭示之方法中，在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少三次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少四次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少五次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少六次TPE；或在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少七次TPE。在此等所揭示方法中，在rAAV投與之前的約24小時，向個體投與消炎類固醇。另外，在一些實施例中，rAAV投與之後的第1至60天，向個體投與消炎類固醇，一天至少一次。舉例而言，消炎類固醇經口投與。另外，消炎類固醇為糖皮質激素，諸如普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特。
在任一種所揭示之方法中，個體之血漿在rAAV投與之前進行TPE至少9天，在投與之前進行TPE至少7天，在投與之前進行TPE 5天，或在投與之前進行TPE 2天。另外，在rAAV投與之前，在對個體之血漿進行的TPE療程之間存在約24至約48小時。在一個特定實施例中，在rAAV投與之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE，其中TPE之間存在約48小時。
在本文所述之任一種方法中，個體在rAAV投與時具有約1:400或更小的抗AAVrh.74抗體水準。舉例而言，個體在rAAV投與時具有約1:100至約1:400的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:100至1:300的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:100至1:200的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:250至1:500的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:200至1:400的抗AAVrh.74抗體水準。抗體效價作為總抗體結合效價測定。在任一種所揭示之肌肉營養不良症治療方法中，此等方法進一步包含測定該個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體的步驟。測定抗AAVrh.74抗體是否存在的步驟可以投與rAAV之前進行，在rAAV投與之後進行，在觀測到免疫反應或不良事件之前或在觀測到免疫反應或不良事件之後進行。另外，測定步驟可以在投與免疫抑制療法或TPE的步驟之前進行。舉例而言，測定步驟係在任何AAV向該個體的任何投與之前進行，或測定步驟係在任何AAVrh.74投與該個體之前進行。
本揭示案亦提供進一步包含將該個體之血清或血漿中之抗AAVrh.74抗體水準與陽性對照組進行比較之步驟的方法。舉例而言，陽性對照組係使用抗AAVrh.74單株抗體。
在任一種所揭示之方法中，測定抗AAVrh.74的存在可以使用免疫螢光分析、免疫組織化學分析、西方墨點法、直接酶聯免疫吸附分析（ELISA）、間接ELISA、夾層ELISA、競爭性ELISA、逆向ELISA、化學螢光分析、放射免疫分析或免疫沈澱分析加以測定。
在任一種所揭示之方法中，測定抗AAVrh.74抗體是否存在的步驟包含使用：包含選自由以下組成之群之VH CDR1胺基酸序列的單株抗體：NYGMN（SEQ ID NO: 20）、DYGMN（SEQ ID NO: 22）、YTFTNYGMN（SEQ ID NO: 21）及YTFTKYGMN（SEQ ID NO: 23）；或包含選自由以下組成之群之VH CDR2胺基酸序列的單株抗體：WINTYTGEPTYADDFKG（SEQ ID NO: 24）、WINTNTGEPTYGDDFKG（SEQ ID NO: 25）及WMGWINTYTGEPTY（SEQ ID NO: 26）；或包含選自由以下組成之群之VH CDR3胺基酸序列的單株抗體：GVAHYSDSRFAFDY（SEQ ID NO: 27）、GNAHPGGSAFVY（SEQ ID NO: 28）、RGSYYYDSSPAWFAY（SEQ ID NO: 29）、RGVDSSGYGAFAY（SEQ ID NO: 30）及TRGTSTMISTFAFVY（SEQ ID NO: 31），或包含選自由以下組成之群之VL CDR1胺基酸序列的單株抗體：SVSSSVSYMH（SEQ ID NO: 32）、SASSGVTYMH（SEQ ID NO: 33）、SSVSYMH（SEQ ID NO: 34）及SSVRYMH（SEQ ID NO: 35）；或包含選自由以下組成之群之VL CDR2胺基酸序列的單株抗體：YTSNLAS（SEQ ID NO: 36）、RTSNLAS（SEQ ID NO: 37）、LWIYSTSNLAS（SEQ ID NO: 38）及VWIYSTSNLAS（SEQ ID NO: 39）；或包含選自由以下組成之群之VH CDR3胺基酸序列的單株抗體：QQRSSYPFT（SEQ ID NO: 40）、QQRSTYPF（SEQ ID NO: 41）、QQRSFYPF（SEQ ID NO: 42）及QQRTYYPF（SEQ ID NO: 43）。
在一個例示性實施例中，所揭示之方法包含使用抗AAVrh.74單株抗體（諸如包含SEQ ID NO: 10、12、14、16或18中所示之可變重鏈（VH）序列的單株抗體，或包含SEQ ID NO: 11、13、15、17或19中所示之可變輕鏈（VL）序列的單株抗體）測定抗AAVrh.74抗體是否存在的步驟。
在另一實施例中，所揭示之方法包含使用抗AAVrh.74單株抗體測定抗AAVrh.74抗體是否存在的步驟，該單株抗體包含SEQ ID NO: 10、12、14、16或18中所示的可變重鏈（VH）序列及SEQ ID NO: 11、13、15、17或19中所示的可變輕鏈（VL）序列。
在任一種所揭示之方法中，測定抗AAVrh.74抗體是否存在的步驟為定量的，其中基於該定量鑑別該個體對抗AAVrh.74抗體呈血清反應陽性，且其中該免疫抑制療法或TPE選擇性地投與呈血清反應陽性的個體。在任一種本文所揭示之方法中，藉由全身投藥途徑投與約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg之劑量的rAAV。肌肉營養不良症可為杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症。
舉例而言，所投與之rAAV的劑量為約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約5.0x1013 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約2.0x1013 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1013 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg或1.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約5.0x1013 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg或1.0x1013 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg或5.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg或5.0x1013 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約4.0x1014 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.0x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg或1.0x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg或約1.25x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至1.0x1015 ，或約1.25x1014 vg/kg至約3.5 x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg或1.25x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.5 x1014 vg/kg或1.5x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg或1.75x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.25x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至1.0x1015 ，或約2.0x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約2.0x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約2.0x1014 vg/kg至約4.0x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg。
在一個實施例中，本揭示案之方法包含全身投與rAAV，其中該全身投藥途徑係靜脈內途徑且所投與的rAAV之劑量為約2.0×1014 vg/kg。在另一個實施例中，本揭示案之方法包括全身投與rAAV，其中該全身投藥途徑係靜脈內途徑且所投與的rAAV之劑量為約5.0x1012 vg/kg，或約6.0x1012 vg/kg，或約7.0x1012 vg/kg，或約8.0x1012 vg/kg，或約9.0x1012 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg，或約1.25x1013 vg/kg，或約1.5x1013 vg/kg，或約1.75x1013 vg/kg，或約2.25x1013 vg/kg，或約2.5x1013 vg/kg，或約2.75x1013 vg/kg，或約3.0x1013 vg/kg，或約3.25x1013 vg/kg，或約3.5x1013 vg/kg，或約3.75x1013 vg/kg，或約4.0x1013 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg，或約6.0x1013 vg/kg，或約7.0x1013 vg/kg，或約8.0x1013 vg/kg，或約9.0x1013 vg/kg，或約1.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg，或約2.25x1014 vg/kg，或約2.5x1014 vg/kg，或約2.75x1014 vg/kg，或約3.0x1014 vg/kg，或約3.25x1014 vg/kg，或約3.5x1014 vg/kg，或約3.75x1014 vg/kg，或約4.0x1014 vg/kg，或約5.0x1014 vg/kg，或約6.0x1014 vg/kg，或約1x1015 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白或AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在本揭示案之方法、組合療法或用途的任一者中，rAAV可以約5 mL/kg至約15 mL/kg、或約8 mL/kg至約12 mL/kg、或8 mL/kg至約10 mL/kg、或5 mL/kg至約10 mL/kg、或約10 mL/kg至12 mL/kg、或約10 mL/kg至15 mL/kg、或10 mL/kg至約20 mL/kg的劑量投與。在一個特定實施例中，投與的劑量或rAAV係約10 mL/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白或AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在本揭示案之方法、組合療法或藥劑的任一者中，可藉由注射、輸注或植入來投與rAAV的劑量。舉例而言，rAAV之劑量係藉由輸注約一小時來投與。此外，rAAV之劑量係藉由靜脈內途徑，經由周邊肢體靜脈（諸如周邊臂靜脈或周邊腿靜脈）投與。或者，輸注可以投與約30分鐘、或約1.5小時、或約2小時、或約2.5小時或約3小時。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
藉由本揭示案之方法、組合療法或用途中之任一者投與的rAAV可以包含SEQ ID NO: 1之人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。另外，藉由本揭示案之任一種方法投與的rAAV包含SEQ ID NO:1之人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。舉例而言，rAAV可以包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。
在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在本揭示案之方法、組合療法或用途之任一者中，所投與的rAAV係AAVrh.74抗體的血清型。
在一些實施例中，本揭示案的方法、組合療法或用途係治療杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症。一例示性實施例為一種用於治療有需要人類個體之杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症的方法、組合療法或藥劑，其包含投與一定劑量之重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的步驟，其中投藥途徑係靜脈內輸注且所投與之rAAV的劑量為歷經約一小時約2x1014 vg/kg，且其中rAAV載體包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白；在一個實施例中，rAAV為AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在一個實施例中，本揭示案提供一種rAAV，其包含肌肉特異性控制元件核苷酸序列及編碼微肌肉萎縮蛋白之核苷酸序列。舉例而言，核苷酸序列編碼功能性微肌肉萎縮蛋白，其中核苷酸例如與SEQ ID NO: 1至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更典型至少90%、91%、92%、93%或94%且甚至更典型至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致，其中該蛋白質保持微肌肉萎縮蛋白活性。微肌肉萎縮蛋白在肌肉收縮期間向肌肉膜提供穩定性，例如微肌肉萎縮蛋白在肌肉收縮期間充當減震器。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
本揭示案亦提供rAAV，其中核苷酸序列包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 1之核酸序列或其補體雜交的核苷酸序列，且編碼功能性微肌肉萎縮蛋白。
在一個實施例中，rAAV為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的非複製型重組腺相關病毒（AAV），稱為AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。此載體基因體含有基因表現所需的最小元件，包括AAV2反向末端重複序列（ITR）、微肌肉萎縮蛋白、SV40內含子（SD/SA）及合成聚腺苷酸化（Poly A）信號，其皆處於MHCK7啟動子/增強子的控制下。基因體及表現卡匣之示意圖顯示於圖1中。AAVrh.74血清型可用於在IV投與後達成骨骼肌及心肌之高效基因轉移。
在另一個實施例中，本揭示案提供一種治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法，其包含投與含有SEQ ID NO: 44之核苷酸序列的rAAV。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療有需要之個體之肢帶型肌肉營養不良症的方法、組合療法或用途，其包含向該個體投與rAAV靜脈內輸注約1至2小時，基於超螺旋質體作為定量標準，其劑量為約5.0 x 1013 vg/kg或約2.0 x 1014 vg/kg，或基於線性化質體作為定量標準，其劑量為約1.85×1013 vg/kg或7.41×1013 vg/kg，且其中該rAAV包含SEQ ID NO: 44之核苷酸序列。在另一態樣中，本揭示案描述一種表現個體之細胞中之β-肌聚糖基因的方法，其包含向該個體投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構築體，該構築體包含與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%一致的核苷酸序列。在一個態樣中，本揭示案提供一種增加個體之肌肉組織中之β-肌聚糖陽性纖維及/或降低個體之肌肉組織中之CK水準的方法，其包含將與SEQ ID NO: 44至少90%、95%或99%一致的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構築體核苷酸序列投與該個體。
在另一態樣中，本文描述包含編碼β-肌聚糖之聚核苷酸序列的重組AAV載體。在一些實施例中，編碼β-肌聚糖之聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 45中所示之核苷酸序列例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更典型90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的序列且編碼保持β-肌聚糖活性的蛋白質。在一些實施例中，編碼β-肌聚糖之聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 45中所示的核苷酸序列。在一些實施例中，編碼β-肌聚糖的聚核苷酸序列由SEQ ID NO: 45中所示之核苷酸序列組成。
在另一態樣中，本文所述之重組AAV載體包含編碼β-肌聚糖的聚核苷酸序列，該β-肌聚糖與胺基酸序列SEQ ID NO: 46具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更典型至少90%、91%、92%、93%或94%且甚至更典型至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且蛋白質保持β-肌聚糖活性。
在另一態樣中，本文所述之重組AAV載體包含編碼β-肌聚糖的聚核苷酸序列，該肌聚糖具有胺基酸序列SEQ ID NO: 46。
在另一態樣中，本文描述一種重組AAV載體，其包含編碼功能β-肌聚糖之聚核苷酸序列，該聚核苷酸序列包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 45之核酸序列或其補體雜交的核苷酸序列。
在一個特定實施例中，本揭示案提供用於治療有需要之人類個體之LGMD2E的方法、組合療法或用途，其包含投與rAAVscAAVrh74.MHCK7.HSGCB。舉例而言，在任一種LGMD2E治療方法中，以約0.5×1014 vg/kg或約2×1014 vg/kg之劑量、藉由靜脈內輸注投與scAAVrh74.MHCK7.HSGCB。本文中結合scAAVrh74.MHCK7.HSGCB所述的劑量，包括以上剛剛所述的劑量，係基於使用超螺旋qPCR標準。如使用線性qPCR標準所量測，0.5×1014 vg/kg及2×1014 vg/kg分別對應於1.85×1013 及7.41×1013 vg/kg。
在一個特定實施例中，在用於治療人類個體之肢帶型肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途的任一者中，人類個體罹患LGMD2E，且以約2×1014 vg/kg之劑量、藉由靜脈內輸注投與rAAV，且其中rAAV包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 44的rAAV scAAVrh74.MHCK7.HSGCB。
在一相關實施例中，人類個體罹患肌肉營養不良症LGMD2E且rAAV為以約2×1014 vg/kg之劑量藉由靜脈內輸注投與的scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，該方法進一步包含在投與rAAV之前的一天（12至24小時）開始向該個體每天投與1 mg/kg普賴松且持續投與六十天或六十天不遞減。
在另一相關實施例中，人類個體罹患肌肉營養不良症LGMD2E且rAAV為以約0.5×1014 vg/kg之劑量藉由靜脈內輸注投與的scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，該方法進一步包含在投與rAAV之前的一天（12至24小時）開始向該個體每天投與1 mg/kg且持續投與三十天或三十天不遞減。
應認識到，熟習此項技術者可根據個體之具體臨床表現且如本文中另外關於本發明之方法進一步所述，逐漸減少普賴松的三十天及六十天投與。
術語「嚴格」用於指所屬領域中通常理解為嚴格的條件。雜交嚴格度主要由溫度、離子強度及諸如甲醯胺之變性劑之濃度決定。用於雜交及洗滌之嚴格條件的實例為65-68℃、0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉，或42℃、0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉及50%甲醯胺。參見例如Sambrook等人，《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）》，第2版，冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory）(紐約冷泉港（Cold Spring Harbor, N.Y.） 1989)。亦可使用更嚴格的條件（諸如更高的溫度、更低的離子強度、更高濃度的甲醯胺或其他變性劑），不過，雜交速率將受到影響。在有關其中去氧寡核苷酸之雜交的情況下，其他例示性嚴格雜交條件包含在37℃（針對14個鹼基的寡核苷酸）、48℃（針對17個鹼基的寡核苷酸）、55℃（針對20個鹼基的寡核苷酸）及60℃（針對23個鹼基的寡核苷酸）下在6× SSC 0.05%焦磷酸鈉中洗滌。
出於減少非特異性及/或背景雜交之目的，可以在雜交及洗滌緩衝液中包含其他試劑。實例為0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙烯基-吡咯啶酮、0.1%焦磷酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、NaDodSO4 （SDS）、菲科爾（ficoll）、鄧哈特溶液（Denhardt's solution）、音波處理的鮭魚精子DNA（或其他非互補DNA）及硫酸葡聚糖，但亦可使用其他適合之試劑。可以在實質上不影響雜交條件嚴格度的情況下改變此等添加劑的濃度及類型。雜交實驗通常在pH 6.8-7.4下進行，然而，在典型離子強度條件下，雜交速率幾乎與pH無關。參見Anderson等人，《核酸雜交：實用方法（Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach）》，第4章，IRL Press Limited (英格蘭牛津（Oxford, England）)。雜交條件可以由本領域中熟習此項技術者調整，以便適應此等變數且允許具有不同序列相關性的DNA形成雜交體。
術語「肌肉特異性控制元件」係指調控編碼序列之表現的核苷酸序列，該編碼序列對肌肉組織中之表現具有特異性。此等控制元件包含增強子及啟動子。本揭示案提供包含肌肉特異性控制元件MCKH7啟動子、MCK啟動子及MCK增強子的構築體。
在一個態樣中，本揭示案提供一種rAAV，其中肌肉特異性控制元件為人類骨骼肌動蛋白基因元件、心臟肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性增強子結合因子（MEF）、肌肉肌酸激酶（MCK）、截斷之MCK（tMCK）、肌凝蛋白重鏈（MHC）、雜交α-肌凝蛋白重鏈增強子-啟動子/MCK增強子-啟動子（MHCK7）、C5-12、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快肌肌鈣蛋白c基因元件、慢肌肌鈣蛋白c基因元件、慢肌肌鈣蛋白i基因元件、低氧誘導型核因子、類固醇誘導型元件或糖皮質激素反應元件（GRE）。
舉例而言，肌肉特異性控制元件係MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7，或肌肉特異性控制元件係MCK核苷酸序列SEQ ID NO: 4。另外，在本揭示案之任一種rAAV載體中，肌肉特異性控制元件核苷酸序列，例如MHCK7或MCK核苷酸序列，可操作地連接至編碼微肌肉萎縮蛋白之核苷酸序列。舉例而言，如圖1或圖2（SEQ ID NO: 3）或圖13（SEQ ID NO: 9）中所提供之構築體所闡明，MHCK7啟動子核苷酸序列（SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7）可操作地連接至人類微肌肉萎縮蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 1）。在另一個實例中，如圖5或圖6（SEQ ID NO: 5）中所提供之構築體所闡明，MCK啟動子（SEQ ID NO: 4）可操作地連接至人類微肌肉萎縮蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 1）。在另一態樣中，本揭示案提供一種包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 7的rAAV載體。本揭示案亦提供一種包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 4的rAAV載體。
在另一態樣中，本揭示案提供一種包含於質體中之rAAV構築體，該構築體包含核苷酸序列SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8。舉例而言，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白載體包含位於SEQ ID NO: 3之ITR內及端部的核苷酸序列且顯示於圖2中。rAAV載體包含5' ITR、MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人類微肌肉萎縮蛋白基因之編碼序列、聚腺苷酸及3' ITR。在一個實施例中，載體包含SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021。SEQ ID NO: 3中所示的質體進一步包含安比西林（ampicillin）抗性基因及具有pBR322複製起點之pGEX質體主鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供包含核苷酸序列SEQ ID NO: 9的rAAV。舉例而言，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白載體構築體包含核苷酸序列SEQ ID NO: 9且顯示於圖7中。此rAAV載體構築體包含MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人類微肌肉萎縮蛋白基因之編碼序列，及聚腺苷酸。在一個實施例中，rAAV載體構築體進一步包含啟動子5'端之ITR及聚腺苷酸3'端之ITR。在一個實施例中，rAAV為血清型AAVrh.74。
舉例而言，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白載體包含位於SEQ ID NO: 8之ITR內及端部的核苷酸序列且顯示於圖9中。rAAV載體包含5' ITR、MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人類微肌肉萎縮蛋白基因之編碼序列、聚腺苷酸及3' ITR。在一個實施例中，載體包含SEQ ID NO: 9之核苷酸1-4977。SEQ ID NO: 3中所示的質體進一步包含康黴素（kanamycin）抗性基因及具有pBR322複製起點之pGEX質體主鏈。
在另一態樣中，本揭示案提供一種包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白載體構築體的質體。在一個實施例中，質體包含5' ITR、MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人類微肌肉萎縮蛋白基因之編碼序列、聚腺苷酸及3' ITR。在一個實施例中，質體包括康黴素抗性基因且視情況包含具有pBR322複製起點之pGEX質體主鏈。在一個特定實施例中，質體闡述於SEQ ID NO: 8中且顯示於圖8及9中。
本揭示案提供一種重組AAV載體，其包含人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7。此rAAV載體係AAV血清型AAVrh.74。
本揭示案亦提供一種rAAV，其包含位於SEQ ID NO: 3之ITR內及端部的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列、位於SEQ ID NO: 8之ITR內及端部的核苷酸序列，或如SEQ ID NO: 9所示之核苷酸序列。此rAAV載體係AAV血清型AAVrh.74。
本揭示案的rAAV載體可以是任何AAV血清型，諸如血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。
本揭示案亦提供包含本揭示案之任一種rAAV載體的醫藥組合物（或在本文中有時簡稱為「組合物」）。
在另一個實施例中，本揭示案提供用於製備rAAV載體顆粒之方法，其包含培養已經本揭示案之任何rAAV載體轉染的細胞及自經轉染細胞之上清液回收rAAV顆粒。本揭示案亦提供包含本揭示案之任一種重組AAV載體的病毒顆粒。
在治療肌肉營養不良症的任一種方法中，在rAAV投與之後，所關注之轉殖基因（諸如β-肌聚糖基因表現或微肌肉萎縮蛋白基因表現）在個體細胞中的水準提高。所關注基因之轉殖基因在細胞中之表現係藉由在rAAV投與之前及之後用西方墨點法（Western blot）量測所關注之蛋白質在肌肉切片中之水準來偵測。特定而言，相較於所關注之蛋白質在rAAV投與之前的水準，所關注之蛋白質在rAAV投與之後的水準提高至少約70%至至少約80%，或至少約70%至至少約90%，或至少約80%至至少約90%。舉例而言，相較於所關注之蛋白質在rAAV投與之前的水準，所關注之蛋白質在rAAV投與之後的水準提高至少約70%、或至少約71%、或至少約72%、或至少約73%、或至少約74%、或至少約75%、或至少約76%、或至少約77%、或至少約78%、或至少約79%、或至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%。
另外，微肌肉萎縮蛋白基因在細胞中的表現係藉由在rAAV投與之前及之後利用免疫組織化學量測所關注之蛋白質在肌肉切片中的水準來偵測。相較於所關注之蛋白質在rAAV投與之前的水準，所關注之蛋白質在rAAV投與之後的水準提高至少約70%至至少約80%，或至少約70%至至少約90%，或至少約80%至至少約90%。舉例而言，相較於所關注之蛋白質在rAAV投與之前的水準，所關注之蛋白質在rAAV投與之後的水準提高至少約70%、或至少約71%、或至少約72%、或至少約73%、或至少約74%、或至少約75%、或至少約76%、或至少約77%、或至少約78%、或至少約79%、或至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%。
在用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中之任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體在rAAV投與之後的血清CK水準降低。舉例而言，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後60天降低約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。特定而言，在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約87%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約72%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約73%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約78%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約95%。在用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於所關注之蛋白質呈陽性之肌纖維在rAAV投與之前的數目，所關注之蛋白質呈陽性之肌纖維在個體之肌肉組織中的數目在rAAV投與之後增加。舉例而言，藉由在rAAV投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測所關注水準之蛋白質呈陽性之肌纖維在肌肉切片中的數目來偵測所關注之蛋白質呈陽性的肌纖維數目。
在用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，rAAV的投與使DAPC蛋白（α-肌聚糖或β-肌聚糖）的表現上調。舉例而言，相較於rAAV投與之前的α-肌聚糖水準，個體中的α肌聚糖水準在rAAV投與之後提高。另外，相較於rAAV投與之前的β-肌聚糖水準，個體中的β-肌聚糖水準在rAAV投與之後提高。藉由在rAAV投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白質水準來偵測α-肌聚糖或β-肌聚糖水準。
在用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法或用途中的任一者中，rAAV投與之後，個體的疾病惡化延遲，如根據以下中之任一者所量測：六分鐘行走測試、起身時間、上升4個台階、上升且下降4個台階、北極星走動評估（North Star Ambulatory Assessment，NSAA）、10米計時測試、100米計時測試、手握測力法（HHD）、起立-行走計時測試，及/或大肌肉運動分項測試量表（Bayley-III）分數。
舉例而言，在方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的NSAA分數，個體的NSAA分數在rAAV投與之後的至少270天出現至少6分改善。另外，在方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的起身時間，個體的起身時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約0.8秒改善。另外，在方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的上升4個台階測試時間，個體的上升4個台階測試時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約1.2秒改善。另外，在方法、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的100 m計時測試，個體的100 m計時測試在rAAV投與之後的至少270天出現至少約7秒改善。
在另一個實施例中，本揭示案提供用於表現患者細胞中之微肌肉萎縮蛋白基因的方法、組合物、組合療法或用途，包含向患者投與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由在rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之微肌肉萎縮蛋白水準來偵測患者細胞中之微肌肉萎縮蛋白基因表現。此外，亦藉由偵測每個細胞核中之載體基因體的較大數目來量測患者中之微肌肉萎縮蛋白基因表現，其中每個細胞核1個載體基因體為約50%微肌肉萎縮蛋白表現且每個細胞核大於1個複本與微肌肉萎縮蛋白表現水準一致。舉例而言，每個細胞核有1.2個載體複本，或每個細胞核有1.3個載體複本，或每個細胞核有1.4個載體複本，或每個細胞核有1.5個載體複本，或每個細胞核有1.6個載體複本，或每個細胞核有1.7個載體複本，或每個細胞核有1.8個載體複本，或每個細胞核有1.9個載體複本。
在另一個實施例中，本揭示案提供用於降低有需要之患者之血清CK水準的方法、組合物、組合療法或用途，該方法包含向患者投與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，相較於在rAAV投與之前的血清CK水準，患者中之血清CK水準在rAAV投與之後60天降低至少約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。特定而言，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約87%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合物、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約72%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合物、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約73%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合物、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約78%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之方法、組合物、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約95%。
本揭示案亦提供用於增加患者肌肉組織中之微肌肉萎縮蛋白陽性纖維的方法、組合物、組合療法或用途，包含向患者投與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由在rAAV投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之肌肉萎縮蛋白水準來偵測微肌肉萎縮蛋白陽性纖維的數目。此外，亦藉由偵測每個細胞核中之載體基因體的較大數目來量測患者中之微肌肉萎縮蛋白基因表現，其中每個細胞核1個載體基因體為約50%微肌肉萎縮蛋白表現且每個細胞核大於1個複本與微肌肉萎縮蛋白表現水準一致。舉例而言，每個細胞核有1.2個載體複本，或每個細胞核有1.3個載體複本，或每個細胞核有1.4個載體複本，或每個細胞核有1.5個載體複本，或每個細胞核有1.6個載體複本，或每個細胞核有1.7個載體複本，或每個細胞核有1.8個載體複本，或每個細胞核有1.9個載體複本。
在另一個實施例中，本揭示案提供用於增加有需要之患者中之α-肌聚糖表現的方法、組合物、組合療法或用途，其包含向患者投與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由在rAAV投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之α-肌聚糖蛋白質水準來偵測α-肌聚糖水準。
另外，本揭示案提供用於增加有需要之患者中之β-肌聚糖表現的方法、組合物、組合療法或用途，其包含向患者投與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由在rAAV投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之β-肌聚糖蛋白質水準來偵測β-肌聚糖水準。
本揭示案亦提供治療患有杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症之患者的方法、組合物、組合療法或用途，包含向患者投與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列，使得患者之疾病惡化延遲，如根據以下中之任一者所量測：六分鐘行走測試、起身時間、上升4個台階、上升及下降4個台階、北極星走動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手握測力法（HHD）、起立-行走計時測試，及/或大肌肉運動分項測試量表（Bayley-III）分數。
舉例而言，在方法、組合物、組合療法或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的NSAA分數，個體的NSAA分數在rAAV投與之後的至少270天出現至少6分改善。另外，在任一種方法中，相較於rAAV投與之前的起身時間，個體的起身時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約0.8秒改善。另外，在任一種方法中，相較於rAAV投與之前的上升4個台階測試時間，個體的上升4個台階測試時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約1.2秒改善。另外，在任一種方法中，相較於rAAV投與之前的100 m計時測試，個體的100 m計時測試在rAAV投與之後的至少270天出現至少約7秒改善。
「纖維化」係指損傷後之組織（包括骨骼肌、心肌、肝臟、肺、腎臟及胰臟）中出現細胞外基質（ECM）組分的過度或不受調控的沈積以及異常修復過程。沈積之ECM組分包括纖連蛋白及膠原蛋白，例如膠原蛋白1、膠原蛋白2或膠原蛋白3。
本揭示案亦提供減少或預防罹患肌肉營養不良症之個體中之纖維化的方法，其包含投與治療有效量的包含人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7之rAAV；或包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV載體。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白係SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在另一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白係SEQ ID NO: 9之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在另一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白係SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5066的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在另一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在另一個實施例中，本揭示案提供預防有需要之個體中之纖維化的方法，其包含投與治療有效量的人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7；或包含SEQ ID NO: 9之AAV74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的rAAV載體。舉例而言，本揭示案之任一種rAAV可投與罹患肌肉營養不良症之個體以預防纖維化，例如在觀測到個體出現纖維化之前投與本揭示案之表現人類微肌肉萎縮蛋白的rAAV。另外，可將本揭示案之表現人類微肌肉萎縮蛋白基因的rAAV投與有發展纖維化風險的個體，諸如罹患或經診斷患有肌肉營養不良症（例如DMD）的個體。本揭示案之rAAV可投與罹患肌肉營養不良症之個體以便預防此等個體出現新的纖維化。
本揭示案涵蓋在觀測到個體出現纖維化之前投與rAAV。另外，可將rAAV投與有發展纖維化風險之個體，諸如罹患或經診斷患有肌肉營養不良症（例如DMD）的個體。該rAAV可投與已發展纖維化之罹患肌肉營養不良症之個體以便預防此等個體出現新的纖維化。
本揭示案亦提供使罹患肌肉營養不良症之個體之肌肉力量及/或肌肉質量增加的方法，其包含投與治療有效量的人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7；或包含SEQ ID NO: 9之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的rAAV。
本揭示案涵蓋在觀測到個體出現纖維化之前或在肌肉力量已減小之前或在肌肉質量已減少之前，將rAAV載體投與經診斷患有DMD的個體。
本揭示案亦涵蓋向已發展纖維化的罹患肌肉營養不良症之個體投與人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7；或包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的rAAV，以便預防此等個體出現新的纖維化或減少此等個體的纖維化。本揭示案亦提供：將人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7或包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的rAAV載體投與罹患肌肉力量已減小或肌肉質量已減少的個體，以便保護肌肉防止進一步損傷。
在本揭示案之任一種方法中，個體可罹患肌肉營養不良症，諸如DMD，或任何其他肌肉萎縮蛋白相關肌肉營養不良症。
在本文所述之本揭示案之任一種方法的其他實施例中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後降低的百分比水準選自由以下組成之群： a）至少78%，發生於投與之後的90天、180天或270天； b)至少46%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%或85%，發生於投與之後的270天； c）至少72%、73%、74%或95%，發生於投與之後的180天； d）至少87%、88%、93%或95%，發生於投與之後的90天； e）至少70%，發生於投與之後的270天； f）70%至95%，發生於投與之後的90天、180天或270天； g）至少56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%，發生於投與之後的90天、180天或270天；以及 h）至少56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%，發生於投與之後的90天、180天或270天。
在另一個實施例中，本揭示案提供用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合物，其中該組合物包含一定劑量的重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白，其中組合物根據全身投藥途徑調配且rAAV之劑量為約1×1014 vg/kg至約4×1014 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
舉例而言，本揭示案之組合物包含以下劑量的rAAV：約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約5.0x1013 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約2.0x1013 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1013 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或1.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約5.0x1013 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg，或1.0x1013 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或5.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg，或5.0x1013 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約4.0x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.0x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至1.0x1015 ，或約1.25x1014 vg/kg至約3.5 x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或1.25x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.5 x1014 vg/kg，或1.5x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或1.75x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.25x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至1.0x1015 ，或約2.0x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約2.0x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約2.0x1014 vg/kg至約4.0x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在一個實施例中，本揭示案之組合物調配成用於靜脈內投與且包括約2.0×1014 vg/kg劑量之rAAV。在另一個實施例中，本揭示案之組合物調配成用於靜脈內投與且包含以下劑量之rAAV：約5.0x1012 vg/kg，或約6.0x1012 vg/kg，或約7.0x1012 vg/kg，或約8.0x1012 vg/kg，或約9.0x1012 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg，或約1.25x1013 vg/kg，或約1.5x1013 vg/kg，或約1.75x1013 vg/kg，或約2.25x1013 vg/kg，或約2.5x1013 vg/kg，或約2.75x1013 vg/kg，或約3.0x1013 vg/kg，或約3.25x1013 vg/kg，或約3.5x1013 vg/kg，或約3.75x1013 vg/kg，或約4.0x1013 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg，或約6.0x1013 vg/kg，或約7.0x1013 vg/kg，或約8.0x1013 vg/kg，或約9.0x1013 vg/kg，或約1.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg，或約2.25x1014 vg/kg，或約2.5x1014 vg/kg，或約2.75x1014 vg/kg，或約3.0x1014 vg/kg，或約3.25x1014 vg/kg，或約3.5x1014 vg/kg，或約3.75x1014 vg/kg，或約4.0x1014 vg/kg，或約5.0x1014 vg/kg，或約6.0x1014 vg/kg，或約1x1015 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在另一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在本揭示案之任一種組合物中，rAAV以如下劑量遞送：約5 mL/kg至約15 mL/kg、或約8 mL/kg至約12 mL/kg、或8 mL/kg至約10 mL/kg、或5 mL/kg至約10 mL/kg、或約10 mL/kg至12 mL/kg、或約10 mL/kg至15 mL/kg、或10 mL/kg至約20 mL/kg。在一個特定實施例中，該組合物包含以約10 mL/kg劑量遞送之rAAV。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在另一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
本揭示案之組合物調配成藉由注射、輸注或植入投與。舉例而言，該組合物調配成藉由輸注約一小時來投與。另外，本揭示案之組合物調配成經由周邊肢體靜脈（諸如周邊臂靜脈或周邊腿靜脈）進行靜脈內投與。或者，輸注可以投與約30分鐘、或約1.5小時、或約2小時、或約2.5小時或約3小時。
本揭示案之任一種組合物包含含有人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7的rAAV，或含有AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的rAAV載體。
特定而言，本揭示案之組合物用於治療杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症。舉例而言，本揭示案提供用於治療有需要之人類個體之杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症的組合物，其中該組合物包含一定劑量的重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白，其中該組合物調配成藉由靜脈內輸注約一小時投與且所投與之rAAV的劑量為約2×1014 vg/kg，且其中該rAAV包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。
在另一個實施例中，本揭示案亦提供一種包含rAAV之組合物，其用於減少有需要之個體之纖維化。另外，本揭示案提供一種包含rAAV載體之組合物，其用於預防罹患肌肉營養不良症之個體之纖維化。
本揭示案亦提供包含rAAV之組合物，其用於增加罹患肌肉營養不良症之個體之肌肉力量及/或肌肉質量。在另一個實施例中，本揭示案提供包含本揭示案之任一種rAAV的組合物，其用於治療肌肉營養不良症。
在本揭示案之任一種組合物的其他實施例中，相較於該組合物投與之前的血清CK水準，在該組合物投與需要治療肌肉營養不良症之人類個體之後，該個體之血清CK水準降低的百分比水準選自由以下組成之群： a）至少78%，發生於投與之後的90天、180天或270天； b）至少46%、55%、70%或85%，發生於投與之後的270天； c）至少72%、73%、74%或95%，發生於投與之後的180天； d）至少87%、99%、93%或95%，發生於投與之後的90天； e）至少70%，發生於投與之後的270天； f）70%至95%，發生於投與之後的90天、180天或270天； g）至少69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%，發生於投與之後的90天、180天或270天；以及 h）69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%，發生於投與之後的90天、180天或270天。
在另一個實施例中，本揭示案提供一定劑量的重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中該藥劑根據全身投藥途徑調配且rAAV的劑量為約1×1014 vg/kg至約4×1014 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
舉例而言，該藥劑包含以下劑量的rAAV：約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約5.0x1013 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約2.0x1013 vg/kg，或約5.0x1012 vg/kg至約1.0x1013 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或1.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約5.0x1013 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg，或1.0x1013 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或5.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約1.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg，或5.0x1013 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約6.0x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約5.0x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約4.0x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.0x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或1.0x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.25x1014 vg/kg至1.0x1015 ，或約1.25x1014 vg/kg至約3.5 x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或1.25x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg至約3.5 x1014 vg/kg，或1.5x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.5x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或1.75x1014 vg/kg至約1.0x1015 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至4.0x1014 ，或約1.75x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約3.0x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.75x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.25x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg至約2.0x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至1.0x1015 ，或約2.0x1014 vg/kg至6.0x1014 ，或約2.0x1014 vg/kg至5.0x1014 ，或約2.0x1014 vg/kg至約4.0x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.75x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.5x1014 vg/kg，或約2.0x1014 vg/kg至約3.25x1014 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在一個實施例中，本揭示案之藥劑調配成全身投與一定劑量的rAAV，其中全身投藥途徑係靜脈內途徑且所投與的rAAV之劑量為約2.0×1014 vg/kg。在一個實施例中，本揭示案之藥劑經調配以一定劑量的rAAV全身性投與，其中全身投藥途徑為靜脈內途徑且rAAV的劑量為約5.0x1012 vg/kg，或約6.0x1012 vg/kg，或約7.0x1012 vg/kg，或約8.0x1012 vg/kg，或約9.0x1012 vg/kg，或約1.0x1013 vg/kg，或約1.25x1013 vg/kg，或約1.5x1013 vg/kg，或約1.75x1013 vg/kg，或約2.25x1013 vg/kg，或約2.5x1013 vg/kg，或約2.75x1013 vg/kg，或約3.0x1013 vg/kg，或約3.25x1013 vg/kg，或約3.5x1013 vg/kg，或約3.75x1013 vg/kg，或約4.0x1013 vg/kg，或約5.0x1013 vg/kg，或約6.0x1013 vg/kg，或約7.0x1013 vg/kg，或約8.0x1013 vg/kg，或約9.0x1013 vg/kg，或約1.0x1014 vg/kg，或約1.25x1014 vg/kg，或約1.5x1014 vg/kg，或約1.75x1014 vg/kg，或約2.25x1014 vg/kg，或約2.5x1014 vg/kg，或約2.75x1014 vg/kg，或約3.0x1014 vg/kg，或約3.25x1014 vg/kg，或約3.5x1014 vg/kg，或約3.75x1014 vg/kg，或約4.0x1014 vg/kg，或約5.0x1014 vg/kg，或約6.0x1014 vg/kg，或約1x1015 vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在本揭示案之任一種用途中，藥劑包含以下劑量的rAAV：約5 mL/kg至約15 mL/kg、或約8 mL/kg至約12 mL/kg、或8 mL/kg至約10 mL/kg、或5 mL/kg至約10 mL/kg、或約10 mL/kg至12 mL/kg、或約10 mL/kg至15 mL/kg、或10 mL/kg至約20 mL/kg。在一個特定實施例中，該劑量或rAAV係約10 mL/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白為SEQ ID NO: 5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白。
在本揭示案之任一種用途中，該藥劑調配成藉由注射、輸注或植入投與。舉例而言，該藥劑調配成藉由輸注約一小時來投與。另外，該藥劑調配成經由周邊肢體靜脈（諸如周邊臂靜脈或周邊腿靜脈）進行靜脈內投與。或者，輸注可以投與約30分鐘、或約1.5小時、或約2小時、或約2.5小時或約3小時。
在本揭示案之任一種用途中，該藥劑包含含有人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7或AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的rAAV。
本揭示案之特定用途係用於製備供治療杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症用之藥劑。舉例而言，本揭示案提供一定劑量之重組腺相關病毒（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的用途，其用於製備供治療有需要之人類個體之杜興氏肌肉營養不良症或貝克氏肌肉營養不良症的藥劑，其中該藥劑調配成藉由靜脈內輸注約一小時來投與且所投與之rAAV的劑量為約2×1014 vg/kg，且其中該rAAV包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。
在另一個實施例中，本揭示案提供rAAV之用途，其用於製備供減少有需要個體之纖維化用的藥劑。舉例而言，有需要之個體可能罹患肌肉營養不良症，諸如DMD或任何其他肌肉萎縮蛋白相關肌肉營養不良症。
在另一個實施例中，本揭示案提供rAAV之用途，其用於製備供預防罹患肌肉營養不良症之個體之纖維化的藥劑。
另外，本揭示案提供rAAV之用途，其用於製備供增加罹患肌肉營養不良症之個體之肌肉力量及/或肌肉質量的藥劑。
本揭示案亦提供rAAV之用途，其用於製備供治療肌肉營養不良症用的藥劑。
本揭示案提供包含人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1及MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7之rAAV載體用於製備供治療肌肉營養不良症用之藥劑的用途；或包含AAVrf74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022之rAAV載體用於治療肌肉營養不良症的用途。
在本揭示案之任一種用途的其他實施例中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與個體之後降低的百分比水準選自由以下組成之群： a）至少78%，發生於投與之後的90天、180天或270天； b）至少46%、55%、70%或95%，發生於投與之後的270天； c）至少72%、73%、74%或95%，發生於投與之後的180天； d）至少87%、88%、93%或95%，發生於投與之後的90天； e）至少70%，發生於投與之後的270天； f）70%至95%，發生於投與之後的90天、180天或270天； g）至少69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%，發生於投與之後的90天、180天或270天；以及 h）69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%，發生於投與之後的90天、180天或270天。
在用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或用於治療肌肉營養不良症之藥劑用途中的任一者中，投與組合物或藥劑之後，個體細胞中之微肌肉萎縮蛋白基因表現水準提高。微肌肉萎縮蛋白基因於細胞中之表現係藉由在組合物或藥劑投與之前及之後用西方墨點法量測肌肉切片中之微肌肉萎縮蛋白水準來偵測。特定而言，相較於組合物或藥劑投與之前的微肌肉萎縮蛋白水準，組合物或藥劑投與之後的微肌肉萎縮蛋白水準提高至少約70%至至少約80%，或至少約70%至至少約90%，或至少約80%至至少約90%。舉例而言，相較於組合物或藥劑投與之前的微肌肉萎縮蛋白水準，組合物投與之後的微肌肉萎縮蛋白水準提高至少約70%或至少約71%或至少約72%或至少約73%或至少約74%或至少約75%或至少約76%或至少約77%或至少約78%或至少約79%或至少約80%或至少約81%或至少約82%或至少約83%或至少約84%或至少約85%。
另外，藉由在組合物或藥劑之前及之後利用免疫組織化學量測肌肉切片中之微肌肉萎縮蛋白水準來偵測細胞中之微肌肉萎縮蛋白基因表現。相較於組合物或藥劑投與之前的微肌肉萎縮蛋白水準，rAAV投與之後的微肌肉萎縮蛋白水準提高至少約70%至至少約80%，或至少約70%至至少約90%，或至少約80%至至少約90%。舉例而言，相較於組合物或藥劑投與之前的微肌肉萎縮蛋白水準，組合物或藥劑投與之後的微肌肉萎縮蛋白水準提高至少約70%或至少約71%或至少約72%或至少約73%或至少約74%或至少約75%或至少約76%或至少約77%或至少約78%或至少約79%或至少約80%或至少約81%或至少約82%或至少約83%或至少約84%或至少約85%。
在用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物及藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後降低。舉例而言，相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後60天降低約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。特定而言，在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物及藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約87%。在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約72%；在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約73%；在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約78%；或在本揭示案之用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在rAAV投與之後的60天降低約95%。在用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的微肌肉萎縮蛋白陽性纖維數目，個體肌肉組織中的微肌肉萎縮蛋白陽性纖維數目在組合療法、組合物或藥劑投與之後提高。舉例而言，藉由在組合療法、組合物或藥劑之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之微肌肉萎縮蛋白水準來偵測微肌肉萎縮蛋白陽性纖維數目。
在用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，投與組合物或藥劑使諸如α-肌聚糖或β-肌聚糖等DAPC蛋白質之表現上調。舉例而言，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的α-肌聚糖水準，個體中的α-肌聚糖水準在rAAV投與之後提高。另外，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的β-肌聚糖水準，個體的β-肌聚糖水準在rAAV投與之後提高。藉由在rAAV投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白質水準來偵測α-肌聚糖或β-肌聚糖水準。
在用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，rAAV投與之後，個體的疾病惡化延遲，如根據以下中之任一者所量測：六分鐘行走測試、起身時間、上升4個台階、上升且下降4個台階、北極星走動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手握測力法（HHD）、起立-行走計時測試，及/或大肌肉運動分項測試量表（Bayley-III）分數。
舉例而言，在投與用於治療肌肉營養不良症之組合療法、組合物中之任一者或使用藥劑治療肌肉營養不良症之後，相較於rAAV投與之前的NSAA分數，個體的NSAA分數在組合物或藥劑投與之後的至少270天出現至少6分改善。另外，在用於治療肌肉營養不良症之方法、組合療法、組合物或藥劑用於治療肌肉營養不良症之用途中的任一者中，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的起身時間，個體的起身時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約0.8秒改善。另外，在本揭示案之方法、組合療法、組合物或用途中的任一者中，相較於組合療法、組合物或藥劑投與之前的上升4個台階測試時間，個體的上升4個台階測試時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約1.2秒改善。另外，在本揭示案之方法、組合療法、組合物或用途中的任一者中，相較於rAAV投與之前的100 m計時測試，個體的100 m計時測試在rAAV投與之後的至少270天出現至少約7秒改善。
在另一個實施例中，本揭示案提供用於使患者細胞表現微肌肉萎縮蛋白基因的組合物，該等組合物包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。在另一個實施例中，本揭示案提供一定劑量之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022用於製備使患者細胞表現微肌肉萎縮蛋白基因之藥劑的用途。舉例而言，藉由在rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之微肌肉萎縮蛋白水準來偵測患者細胞中之微肌肉萎縮蛋白基因表現。此外，亦藉由偵測每個細胞核中之載體基因體的較大數目來量測患者中之微肌肉萎縮蛋白基因表現，其中每個細胞核1個載體基因體為約50%微肌肉萎縮蛋白表現且每個細胞核大於1個複本與微肌肉萎縮蛋白表現水準一致。舉例而言，每個細胞核有1.2個載體複本，或每個細胞核有1.3個載體複本，或每個細胞核有1.4個載體複本，或每個細胞核有1.5個載體複本，或每個細胞核有1.6個載體複本，或每個細胞核有1.7個載體複本，或每個細胞核有1.8個載體複本，或每個細胞核有1.9個載體複本。
在另一個實施例中，本揭示案提供使有需要之患者之血清CK水準降低的組合物，該組合物包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。另外，本揭示案提供一定劑量之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022用於製備使有需要之患者之血清CK水準降低之藥劑的用途。舉例而言，相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，患者的血清CK水準在組合物或藥劑投與之後的60天降低至少約65%至約90%，或約65%至約95%，或約75%至約90%，或約80%至約90%，或約85%至約95%，或約87%至約95%，或約87%至約90%。特定而言，相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在組合物或藥劑投與之後的60天降低約87%；相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在組合物或藥劑投與之後的60天降低約72%；相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在組合物或藥劑投與之後的60天降低約73%；相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在組合物或藥劑投與之後的60天降低約78%；或相較於組合物或藥劑投與之前的血清CK水準，個體的血清CK水準在組合物或藥劑投與之後的60天降低約95%。
本揭示案亦提供用於增加患者肌肉組織中之微肌肉萎縮蛋白陽性纖維的組合物，該等組合物包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。另外，本揭示案提供一定劑量之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022用於製備供增加患者肌肉組織中之微肌肉萎縮蛋白陽性纖維之藥劑的用途。舉例而言，藉由在組合物或藥劑投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之微肌肉萎縮蛋白水準來偵測微肌肉萎縮蛋白陽性纖維數目。此外，亦藉由偵測每個細胞核中之載體基因體的較大數目來量測患者中之微肌肉萎縮蛋白基因表現，其中每個細胞核1個載體基因體為約50%微肌肉萎縮蛋白表現且每個細胞核大於1個複本與微肌肉萎縮蛋白表現水準一致。舉例而言，每個細胞核有1.2個載體複本，或每個細胞核有1.3個載體複本，或每個細胞核有1.4個載體複本，或每個細胞核有1.5個載體複本，或每個細胞核有1.6個載體複本，或每個細胞核有1.7個載體複本，或每個細胞核有1.8個載體複本，或每個細胞核有1.9個載體複本。
在另一個實施例中，本揭示案提供使有需要之患者之α-肌聚糖表現增加的組合物，該組合物包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。本揭示案亦提供一定劑量之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022用於製備供增加有需要之患者之α-肌聚糖表現之藥劑的用途。舉例而言，藉由在組合物或藥劑投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之α-肌聚糖蛋白質水準來偵測α-肌聚糖水準。
另外，本揭示案提供使有需要之患者之β-肌聚糖表現增加的組合物，該組合物包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977，或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022。本揭示案亦提供AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022用於製備供增加有需要之患者之β-肌聚糖表現之藥劑的用途。舉例而言，藉由在組合物或藥劑投與之前及之後利用西方墨點法或免疫組織化學量測肌肉切片中之β-肌聚糖蛋白質水準來偵測α-肌聚糖水準。
本揭示案亦提供一定劑量之AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022用於製備供治療杜興氏肌肉營養不良症或貝氏肌肉營養不良症患者之藥劑的用途，使得藥劑之投與引起患者之疾病惡化延遲，如根據以下中之任一者所量測：六分鐘行走測試、起身時間、上升4個台階、上升及下降4個台階、北極星走動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手握測力法（HHD）、起立-行走計時測試，及/或大肌肉運動分項測試量表（Bayley-III）分數。
舉例而言，相較於rAAV投與之前的NSAA分數，個體的NSAA分數在rAAV投與之後的至少270天出現至少6分改善。另外，相較於rAAV投與之前的起身時間，個體的起身時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約0.8秒改善。另外，相較於組合物或藥劑投與之前的上升4個台階測試時間，個體的上升4個台階測試時間在rAAV投與之後的至少270天出現至少約1.2秒改善。另外，相較於組合物或藥劑投與之前的100 m計時測試，個體的100 m計時測試在rAAV投與之後的至少270天出現至少約7秒改善。
本揭示案係關於鑑別在血管內遞送rAAV.rh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之後增強基因表現的劑量、持續時間及免疫抑制療法；鑑別出在給予或再次給予rAAV之後（結合使用TPE移除預存AAV抗體）增強基因表現的技術；以及評價在不使用TPE情況下的再次給藥。本發明之方法涵蓋在如本文所述之rAAV.rh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05的任何給予之前，投與免疫抑制療法及/或TPE；並且該等方法涵蓋在如本文所述之rAAV.rh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05再次給予之前，投與免疫抑制療法及/或TPE。
本揭示案提供過度表現人類微肌肉萎縮蛋白之基因療法載體，例如rAAV載體，及減少及預防肌肉營養不良症患者之纖維化的方法。在最早的DMD診斷年齡時獲取的肌肉切片展現顯著的結締組織增生。肌肉纖維化就多個方面而言是有害的。其減少肌內膜營養穿過結締組織障壁正常輸送，減小血流量且剝奪肌肉中來源於血管之營養成分，並經由肢體攣縮而在功能上造成早期無法行走。隨時間推移，肌肉中之明顯纖維化導致治療難度倍增。此可在連續時間點，在肌肉切片中藉由比較結締組織增生而觀測到。該過程繼續惡化，導致無法行走並加速失控，尤其是依賴輪椅的患者。
在早期療法不包括減少纖維化之並行方法的情況下，外顯子跳過、終止密碼子通讀或基因置換療法的益處不大可能會一直充分達成。若不使用減少肌肉纖維化之方法，即使是小分子或蛋白質置換策略亦可能會失敗。對現存纖維化經AAV.微肌肉萎縮蛋白治療之老齡mdx 小鼠的先前研究證明，吾等不可能達成全部功能復原（Liu, M.等人，《分子療法（Mol Ther ）》11, 245-256 (2005)）。亦已知DMD心肌病之惡化伴隨著心室壁之疤痕及纖維化。
除非另外指明，否則本發明的實施將採用本領域之技能範圍內的病毒學、微生物學、分子生物學及重組DNA技術之習知方法。此類技術在文獻中已充分解釋。參見例如Sambrook 等人，《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual ）》（現行版本）；《DNA選殖：實施方法（DNA Cloning: A Practical Approach ）》，I及II卷(D. Glover編)；《寡核苷酸合成（Oligonucleotide Synthesis ）》(N. Gait編，現行版本)；《核酸雜交（Nucleic Acid Hybridization ）》（B. Hames及S. Higgins編，現行版本）；《轉錄及轉譯（Transcription and Translation ）》（B. Hames及S. Higgins編，現行版本）；《CRC小病毒手冊（CRC Handbook of Parvoviruses ）》，I及II卷（P. Tijssen編）；《基本病毒學（Fundamental Virology ）》，第2版，I及II卷（B. N. Fields及D. M. Knipe編）；《弗氏動物細胞培養，基礎技術手冊（Freshney Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique ）》(Wiley-Liss，第三版)；及Ausubel等人(1991)，《分子生物學當前方案（Current Protocols in Molecular Biology ）》（Wiley Interscience, N.Y.）。
本文引用之全部公開案、專利及專利申請案（不管同上或同下）以全文引用的方式併入本文中。定義
除非上下文另外明確指示，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包含複數個指示物。因此，例如，提及「細胞」包含複數個該等細胞，且提及「培養物」包含提及一或多種本領域中熟習此項技術者已知之培養物及其等效物，諸如此類。提及「重組AAV」包含兩種或更多種rAAV病毒粒子之混合物及其類似物。除非另外明確指示，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常理解之意義相同的意義。
儘管本揭示案支持指代僅替代及「及/或」之定義，但除非明確指示為指代僅替代或替代相互排斥，否則術語「或」在申請專利範圍中之使用用於意謂「及/或」。
在整篇本申請案中，術語「約」用於指示值包含用於測定該值之裝置或方法的統計實驗誤差（誤差之標準差）。
術語「載體」意謂任何基因元件，諸如質體、噬菌體、轉位子、黏質體、染色體、病毒、病毒粒子等，其能夠在與適當控制元件結合時複製，且其可在細胞之間轉移基因序列。在一個實施例中，載體為病毒載體。
如本文所用，術語「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為僅在細胞中生長之單股DNA小病毒，在該等細胞中共感染輔助病毒提供特定功能。當前存在十三種已表徵之AAV血清型。AAV之一般資訊及綜述可見於例如Carter, 1989, 《小病毒手冊（Handbook of Parvoviruses）》, 第1卷, 第169-228頁及Berns, 1990, 《病毒學（Virology）》, 第1743-1764頁, 雷文出版社（Raven Press）, (New York)中。然而，完全預期此等相同原理將適用於額外AAV血清型，因為眾所周知各種血清型在結構上及功能上相當密切相關，甚至在基因層面上亦如此。（參見例如Blacklowe, 1988, 《小病毒及人類疾病（Parvoviruses and Human Disease）》之第165-174頁, J. R. Pattison編；及Rose, 《綜合病毒學（Comprehensive Virology）》3:1-61 (1974)）。舉例而言，所有AAV血清型明顯展現由同源rep基因介導之極類似的複製特性；且全部攜帶三種相關衣殼蛋白，諸如在AAV2中表現之衣殼蛋白。異雙螺旋分析進一步表明相關程度，該分析揭露各血清型之間沿著基因體長度存在廣泛的交叉雜交；及在對應於「反向末端重複序列」（ITR）的末端存在類似的自黏接區段。類似感染性模式亦表明各血清型中之複製功能受到類似調節控制。
如本文所用，「AAV載體」係指一種載體，其包含與AAV末端重複序列（ITR）側接的一種或多種所關注聚核苷酸（或轉殖基因）。當感染性病毒顆粒存在於經編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中時，該等AAV載體可複製及封裝至感染性病毒顆粒中。在一個實施例中，AAV載體為衍生自腺相關病毒血清型之載體，該等血清型包括但不限於AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh10及AAV rh74。AAV載體可具有整體或部分缺失之AAV野生型基因中之一者或多者，較佳為rep及/或cap基因，但保留功能性側接之ITR序列。功能性ITR序列對於AAV病毒粒子之拯救、複製及封裝為必需的。因此，AAV載體在本文中定義為至少包含用於病毒之複製及封裝之順式（例如功能性ITR）中所需之彼等序列。ITR無需為野生型核苷酸序列且可變化，例如藉由核苷酸之插入、缺失或取代，只要序列實現功能性拯救、複製及封裝即可。
術語「AAV輔助功能」係指AAV源性編碼序列，其可經表現以提供AAV基因產物，該等產物轉而以反式起作用以進行生產性AAV複製。因此，AAV輔助功能包括主要AAV開放閱讀框架（ORF）rep及cap。已展示Rep表現產物具有許多功能，尤其包含：DNA複製之AAV起點的識別、結合及切口（nicking）；DNA解螺旋酶活性；及AAV（或其他異源）啟動子之轉錄調節。Cap表現產物提供必需的封裝功能。AAV輔助功能在本文中用以補充AAV載體中缺失之反式AAV功能。
「重組病毒」意謂已經基因改變，例如藉由將異源核酸序列添加或插入至病毒顆粒中之病毒。
「AAV病毒粒子」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及衣殼化聚核苷酸AAV載體構成之病毒顆粒。在一個實施例中，AAV病毒粒子包括異源多核苷酸（亦即除野生型AAV基因體外之多核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞中之轉殖基因）。在一些實施例中，AAV病毒顆粒之產生包含AAV載體之產生，因此AAV載體顆粒內含有載體。
AAV基因體，諸如欲遞送至哺乳動物細胞中的轉殖基因，其典型地稱為「AAV載體顆粒」或簡稱「AAV載體」。因此，AAV載體顆粒的製備必然包括AAV載體的製備，因此載體容納於AAV載體顆粒內。
舉例而言，野生型（wt）AAV病毒顆粒包括與AAV衣殼蛋白外殼結合之線性單股AAV核酸基因體。AAV病毒粒子可為單股（ss）AAV或自互補（SC）AAV。在一個實施例中，可將具有互補有義，例如「有義」或「反義」股之單股AAV核酸分子封裝至AAV病毒粒子中，且兩股具有相等的感染性。
術語「重組AAV」或「rAAV」在本文中定義為由AAV蛋白質殼構成之感染性複製缺乏型病毒，其衣殼化利用AAV ITR側接在兩側上之所關注異源核苷酸序列。在一個實施例中，rAAV在其中引入有AAV載體、AAV輔助功能及附屬功能之適合的宿主細胞中產生。以此方式，宿主細胞能夠編碼將AAV載體（含有所關注重組核苷酸序列）封裝至感染性重組病毒顆粒中以用於後續基因遞送所需之AAV多肽。
術語「轉染」係指細胞吸收外來DNA，且在已將外源DNA引入細胞膜內部時，細胞已經「轉染」。多種轉染技術係本領域中通常已知的。參見例如Graham等人(1973)，《病毒學（Virology）》, 52:456, Sambrook等人(1989)，《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning, a laboratory manual）》，冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratories）, New York, Davis等人(1986)，《分子生物學基礎方法（Basic Methods in Molecular Biology）》, Elsevier及Chu等人(1981)，《基因（Gene）》13:197。該等技術可用於將一或多個外源DNA部分，諸如核苷酸整合載體及其他核酸分子，引入適合宿主細胞中。
術語「轉導」表示經由複製缺乏型病毒載體，諸如經由重組AAV病毒粒子將DNA分子活體內或活體外遞送至受體細胞中。
舉例而言，「宿主細胞」表示可用作或已經用作AAV輔助構築體、AAV載體質體、附屬功能載體或其他轉移DNA之受體的微生物、酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。術語包含已轉染之原始細胞之子代。因此，如本文所用之「宿主細胞」一般係指已經外源DNA序列轉染之細胞。應理解，單一親本細胞之子代可歸因於天然、偶發或故意突變而不一定與原始親本細胞具有完全一致之形態或基因體或總DNA補體。
「肌肉細胞」或「肌肉組織」意謂來源於任何種類之肌肉（例如骨胳肌及平滑肌，例如來自消化道、膀胱、血管或心肌組織）之細胞或細胞群。該等肌肉細胞可為分化或未分化的，諸如肌母細胞、肌細胞、肌管、心肌細胞及心肌母細胞（cardiomyoblast）。
在係關於諸如編碼序列及控制序列之核酸序列時，術語「異源」表示不正常地接合在一起及/或不正常地與特定細胞結合之序列。因此，核酸構建體或載體之「異源」區域為在自然界中未發現與另一分子結合之另一核酸分子內或附接至該另一核酸分子的核酸的鏈段。舉例而言，核酸構築體之異源區域可包含在自然界中未發現與編碼序列結合之序列側接的編碼序列。異源編碼序列之另一實例為編碼序列本身在自然界中未發現之構築體（例如，具有不同於天然基因之密碼子的合成序列）。類似地，出於本發明之目的，藉由通常不存在於細胞中之構築體轉型之細胞將被視為異源的。如本文所用，對偶基因變異或天然存在之突變事件不產生異源DNA。
「編碼序列」或「編碼」特定蛋白質之序列為在處於適當的調節序列之控制下時活體外或活體內經轉錄（在DNA之情況下）及經轉譯（在mRNA之情況下）為多肽的核酸序列。編碼序列之邊界藉由5'（胺基）端處之起始密碼子及3'（羧基）端處之轉譯終止密碼子判定。編碼序列可包含但不限於來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因體DNA序列，及甚至合成DNA序列。轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'處。
「核酸」序列係指DNA或RNA序列。核酸包含DNA及RNA之鹼基類似物，包含但不限於4-乙醯基胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、氧丁氧苷、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。
術語DNA「控制序列」共同地指共同地提供受體細胞中之編碼序列之複製、轉錄及轉譯的啟動子序列、多腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調節域、複製起點、內部核糖體進入位點（「IRES」）、增強子及其類似物。此等控制序列並非全部需要始終存在，只要所選編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。
術語「啟動子」在本文中以其通常意義使用指代包括DNA調節序列之核苷酸區域，其中調節序列衍生自能夠結合RNA聚合酶及起始下游（3'方向）編碼序列之轉錄的基因。轉錄啟動子可包含「可誘導啟動子」（其中可操作地連接至啟動子之多核苷酸序列的表現由分析物、輔因子、調節蛋白等誘導）、「可抑制啟動子」（其中可操作地連接至啟動子之多核苷酸序列的表現由分析物、輔因子、調節蛋白等誘導）及「組成型啟動子」。在一個實施例中，啟動子為肌肉特異性啟動子，其包含但不限於人類骨胳肌動蛋白基因元件、心肌肌動蛋白基因元件、肌間線蛋白啟動子、骨骼α-肌動蛋白（ASKA）啟動子、肌鈣蛋白I（TNNI2）啟動子、肌細胞特異性增強子結合因子mef結合元件、肌肉肌酸激酶（MCK）啟動子、截斷的MCK（tMCK）啟動子、肌凝蛋白重鏈（MHC）啟動子、雜合a-肌凝蛋白重鏈增強子-/MCK增強子-啟動子（MHCK7）啟動子、C5-12啟動子、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨胳快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心肌肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白i基因元件、低氧誘導核因子（HIF）-反應元件（HRE）、類固醇誘導元件及糖皮質激素反應元件（gre）。在另一實施例中，啟動子為MCK啟動子、tMCK啟動子或MHCK7啟動子。
術語「可操作地連接」係指元件之排列，其中如此描述之組件經組態以便執行其常用功能。因此，可操作地連接至編碼序列之控制序列能夠實現編碼序列之表現。控制序列不必與編碼序列相鄰，只要其用以引導其表現即可。因此，例如，介入於啟動子序列與編碼序列之間的未轉譯但經轉錄序列可存在，且啟動子序列仍可被視為「可操作地連接」至編碼序列。
當RNA聚合酶將結合啟動子序列且將編碼序列轉錄成mRNA，隨後將其轉譯成由編碼序列編碼之多肽時，啟動子「引導」細胞中之編碼序列「轉錄」。
「表現卡匣」或「表現構築體」係指能夠引導所關注序列或基因表現的組件。如上所述，表現卡匣包含控制元件，諸如可操作地連接至所關注序列或基因（以便引導所關注序列或基因轉錄）的啟動子，且通常亦包含多腺苷酸化序列。在本發明之某些實施例中，本文所述之表現卡匣可以含於質體構築體內。除表現卡匣之組件之外，質體構築體亦可包含一或多種可選標記物、允許質體構築體以單股DNA之形式存在的信號、至少一個多選殖位點及「哺乳動物」複製起點（例如，SV40或腺病毒複製起點）。
「經分離」在提及核苷酸序列時意謂指定分子在諸如其他核苷酸序列、染色質材料等之生物巨分子實質上不存在之情況下存在。因此，「編碼特定多肽之經分離核酸分子」係指實質上不含不編碼目標多肽之其他核酸分子的核酸分子；然而，該分子可包含不會有害地影響組合物之基本特徵之一些額外鹼基或部分。
在整個本申請案中出於描述特定核酸分子中之核苷酸序列之相對位置，諸如當將特定核苷酸序列描述為相對於另一序列位於「上游」、「下游」、「3」或「5」時的目的，應理解，所提及之DNA分子之「有義」或「編碼」股中之序列的位置為在本領域中習知的。
在核酸或胺基酸序列之情況下，術語「序列一致性」、「序列一致性百分比」或「一致百分比」係指在針對最大對應性進行比對時為相同的兩個序列中之殘基。序列一致性比較之長度可能超過基因體之全長、基因編碼序列之全長，或期望至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，亦可期望例如具有至少約九個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36或更多個核苷酸之較小片段中的一致性。序列之一致性百分比可藉由本領域中已知之技術測定。舉例而言，同源性可藉由利用比對序列資訊及使用諸如ALIGN、ClustalW2及BLAST之可易於獲得的電腦程式直接比較兩個多肽分子之間之序列資訊來測定。在一個實施例中，當BLAST用作比對工具時，預設參數如下：遺傳密碼=標準；過濾器=無；股=兩者；截止值=60；期望值=10；矩陣=BLOSUM62；描述=50個序列；排序方式=HIGH SCORE；資料庫=非冗餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS轉譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。
術語「個體」係指動物界之任何成員，其包含但不限於：人類及非人類靈長類動物，諸如黑猩猩及其他猿及猴物種；農畜，諸如牛、綿羊、豬、山羊及馬；家養哺乳動物，諸如狗及貓；實驗室動物，包含嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠及天竺鼠及其類似動物。在一些實施例中，個體為介於出生至2歲、1至10歲之範圍內、或介於4至15歲之範圍內、或介於10至19歲、或20至40歲、或15至29歲或25-55歲之範圍內、或介於40至60歲、或超過50歲、或超過60歲、或超過65歲、或超過70歲之範圍內的人類。AAV
腺相關病毒（AAV）為複製缺乏型小病毒，其單股DNA基因體具有約4.7 kb長度，包括145個核苷酸的反向末端重複序列（ITR）。AAV有多種血清型。AAV血清型基因體的核苷酸序列是已知的。舉例而言，AAV血清型2（AAV2）基因體之核苷酸序列呈現於如Ruffing等人，《普通病毒學雜誌（J Gen Virol ）》，75: 3385-3392 (1994)校正之Srivastava等人，《病毒學雜誌（J Virol ）》，45: 555-564 (1983)中。舉例而言，AAV-1之完整基因體提供於Genbank寄存編號NC_002077中；AAV-3之完整基因體提供於Genbank寄存編號NC_1829中；AAV-4之完整基因體提供於Genbank寄存編號NC_001829中；AAV-5基因體提供於Genbank寄存編號AF085716中；AAV-6之完整基因體提供於Genbank寄存編號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因體之至少一部分分別提供於GenBank寄存編號AX753246及AX753249中(關於AAV-8，亦參見美國專利第7,282,199號及第7,790,449號)；AAV-9基因體提供於Gao等人，《病毒學雜誌》，78 : 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因體提供於《分子療法（Mol. Ther. ）》, 13 (1): 67-76 (2006)中；並且AAV-11基因體提供於《病毒學（Virology ）》, 330 (2): 375-383 (2004)中。AAVrh.74血清型之選殖描述於Rodino-Klapac.等人，《轉化醫學雜誌（Journal of translational medicine ）》5 , 45 (2007)中。指導病毒DNA複製（rep）、衣殼化/封裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列包含在ITR內。三個AAV啟動子（因其相對圖譜位置命名為p5、p19及p40）驅動兩個編碼rep及cap基因之AAV內部開放閱讀框架的表現。兩個rep啟動子（p5及p19）聯合單個AAV內含子之差異性剪接（例如在AAV2核苷酸2107及2227處）使得rep基因產生四種rep蛋白質（rep 78、rep 68、rep 52及rep 40）。Rep蛋白具有多種酶促特性，最終負責複製病毒基因體。cap基因係自p40啟動子表現，且其編碼三個衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯起始位點負責產生三個相關的衣殼蛋白。單個共同聚腺苷酸化位點位於AAV基因體之圖譜位置95。AAV之生命週期和遺傳學綜述於Muzyczka, 《微生物學和免疫學之當前主題（Current Topics in Microbiology and Immunology ）》, 158 : 97-129 (1992)。
AAV具有獨特特徵，使其例如在基因療法中作為將外來DNA遞送至細胞之載體而引人注目。培養物中細胞的AAV感染為非細胞病變的，且對人類及其他動物的自然感染為沉默及無症狀的。此外，AAV感染許多哺乳動物細胞，從而有可能活體內靶向許多不同的組織。此外，AAV轉導緩慢分裂及非分裂細胞，且可作為轉錄活性細胞核游離基因體（染色體外元件）在彼等細胞之生命週期中基本上持續存在。AAV原病毒基因體作為質體中選殖之DNA具有感染性，其使得構築重組基因體變得可行。此外，由於指導AAV複製、基因體衣殼化及整合之信號包含在AAV基因體的ITR內，故基因體內部約4.3 kb中之一些或全部（編碼複製及結構性衣殼蛋白rep-cap）可經外來DNA置換，所述外來DNA諸如含有啟動子、所關注之DNA及聚腺苷酸化信號的基因卡匣。rep與cap蛋白可以反式 提供。AAV之另一個顯著特徵在於其為極其穩定及充滿活力的病毒。其容易耐受用於使腺病毒（56℃至65℃保持數小時）不活化的條件，使得AAV之冷藏並非關鍵。AAV甚至可凍乾。最後，經AAV感染之細胞對重複感染不具有抵抗性。
多項研究表明，肌肉中存在長期（＞ 1.5年）的重組AAV介導蛋白質表現。參見Clark等人，《人類基因療法（Hum Gene Ther 》,8 : 659-669(1997)；Kessler等人，美國國家科學院院刊（Proc Nat.Acad Sc.USA ）,93 : 14082-14087 (1996)；及Xiao等人，《病毒學雜誌》，70 : 8098-8108 (1996)。亦參見Chao等人，《分子療法（Mol Ther ）》，2 :619-623 (2000)及Chao等人，《分子療法》，4 :217-222 (2001)。此外，由於肌肉高度血管化，因此在肌肉內注射後，重組AAV轉導使得全身循環中出現轉殖基因產物，如Herzog等人，《美國國家科學院院刊》，94 : 5804-5809 (1997)及Murphy等人，《美國國家科學院院刊》，94 : 13921-13926 (1997)中所述。此外，Lewis等人， 《病毒學雜誌（J Virol ）》， 76 : 8769-8775 (2002)證明骨胳肌纖維具有正確抗體糖基化、摺疊及分泌所必需的細胞因子，表明肌肉能夠穩定表現所分泌的蛋白質治療劑。
本揭示案之重組AAV基因體包含本揭示案之核酸分子及一個或多個側接核酸分子之AAV ITR。rAAV基因體中之AAV DNA可來自能衍生出重組病毒之任何AAV血清型，包括（但不限於）AAV血清型AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13及AAV rh.74。假模式化rAAV之產生揭示於例如WO 01/83692中。亦涵蓋其他類型之rAAV變異體，例如具有衣殼突變之rAAV。參見例如Marsic等人，《分子療法（Molecular Therapy）》,22 (11): 1900-1909 (2014)。如上文在背景章節中所述，各種AAV血清型基因體之核苷酸序列為此項技術中已知的。為了促進肌肉特異性表現，可以使用AAVrh.74。
本揭示案的DNA質體包含本揭示案的rAAV基因體。將DNA質體轉移至容許經AAV之輔助病毒（例如腺病毒、E1缺失腺病毒或疱疹病毒）感染之細胞，以將rAAV基因體組裝至感染性病毒顆粒中。產生rAAV之技術為本領域中之標準技術，其中將待封裝之AAV基因體、rep及cap基因以及輔助病毒功能提供至細胞。rAAV之產生需要單個細胞（本文指示為封裝細胞）內存在以下組分：rAAV基因體、與rAAV基因體分離之（亦即不在其中之）AAV rep及cap基因及輔助病毒功能。AAV rep及cap基因可來自可衍生出重組病毒之任何AAV血清型，且可來自與rAAV基因體ITR不同的AAV血清型，包括但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12及AAV-13。假型化rAAV之產生揭示於例如WO 01/83692中，其以全文引用的方式併入本文中。
產生封裝細胞之方法為形成穩定表現AAV顆粒產生所必需之所有組分的細胞株。舉例而言，可將包括缺少AAV rep及cap基因之rAAV基因體、與rAAV基因體分離之AAV rep及cap基因及可選標記物（諸如新黴素抗性基因）的質體（或多個質體）整合至細胞之基因體中。AAV基因體已藉由如下程序引入細菌質體中：諸如GC拖尾（Samulski等人，1982，《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad.）》S6 .USA , 79:2077-2081）、添加含有限制性核酸內切酶裂解位點之合成連接子（Laughlin等人，1983，《基因（Gene）》，23:65-73），或直接鈍端連接（Senapathy及Carte，1984，《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》, 259:4661-4666）。封裝細胞株可隨後經諸如腺病毒之輔助病毒感染。此方法之優勢在於該等細胞為可選的且適於大規模生產rAAV。適合之方法之其他實例使用腺病毒或桿狀病毒而非質體將rAAV基因體及/或rep及cap基因引入至封裝細胞中。
rAAV產生之一般原理綜述於例如Carter, 1992, 《生物技術之當前觀點（Current Opinions in Biotechnology）》, 1533-539；及Muzyczka, 1992, 《微生物學及免疫學之當前主題（Curr. Topics in Microbial. and Immunol.）》, 158:97-129）。各種方法描述於Ratschin等人，《分子與細胞生物學（Mol. Cell.Biol.）》4:2072 (1984)；Hermonat等人，《美國國家科學院院刊》, 81:6466 (1984)；Tratschin等人，《分子與細胞生物學（Mol. Cell. Biol .）》5:3251 (1985)；McLaughlin等人，《病毒學雜誌（J. Virol.）》，62:1963 (1988)；及Lebkowski等人，《分子與細胞生物學》，7:349 (1988)。Samulski等人，《病毒學雜誌》，63:3822-3828 (1989)；美國專利第5,173,414號；WO 95/13365及相應的美國專利第5,658.776號、第WO 95/13392號、第WO 96/17947號、第PCT/US98/18600號、第WO 97/09441號（PCT/US96/14423）、第WO 97/08298號（PCT/US96/13872）、第WO 97/21825號（PCT/US96/20777）、第WO 97/06243號（PCT/FR96/01064）、第WO 99/11764號；Perrin等人，《疫苗（Vaccine ）》13:1244-1250 (1995)；Paul等人，《人類基因療法（Human Gene Therapy ）》，4:609-615 (1993)；Clark等人，《基因療法（Gene Therapy ）》3:1124-1132 (1996)；美國專利第5,786,211號；美國專利第5,871,982號；及美國專利第6,258,595號。前述文獻在此以其全文引用之方式併入本文中，其中特定強調文獻中與rAAV產生相關之彼等章節。
本揭示案因此提供產生感染性rAAV之封裝細胞。在一個實施例中，封裝細胞可為經穩定轉型之癌細胞，諸如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞（同源293株）。在另一個實施例中，封裝細胞可為並非經轉型癌細胞的細胞，諸如低傳代293細胞（用腺病毒之E1轉型的人類胚胎腎細胞）、MRC-5細胞（人類胚胎纖維母細胞）、WI-38細胞（人類胚胎纖維母細胞）、Vero細胞（猴腎細胞）及FRhL-2細胞（恆河猴胚胎肺細胞）。
本揭示案之重組AAV（亦即，感染性衣殼化rAAV顆粒）包含rAAV基因體。在例示性實施例中，兩個rAAV之基因體均缺乏AAV rep及cap DNA，亦即，在基因體之ITR之間不存在AAV rep或cap DNA。可以構築以包含本揭示案之核酸分子的rAAV實例闡述於國際專利申請案第PCT/US2012/047999號（WO 2013/016352）中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一例示性實施例中，本揭示案之重組AAV載體藉由三重轉染方法（Xiao等人，《病毒學雜誌》，72 , 2224-2232 (1998)）、使用AAV載體質體pAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、pNLRep2-Caprh74及pHelp製備，pAAV含有與AAV2反向末端重複序列（ITR）側接之微肌肉萎縮蛋白基因表現卡匣。正是此序列被衣殼體包裹於AAVrh74病毒粒子中。質體含有微肌肉萎縮蛋白序列及MHCK7增強子及肌肉特異性啟動子之核心啟動子元件以驅動基因表現。表現卡匣亦含有SV40內含子（SD/SA）以促進高水準基因表現，及牛生長激素聚腺苷酸化信號用於高效的轉錄終止。
pNLREP2-Caprh74為編碼來自血清型rh74之4種野生型AAV2 rep蛋白及3種野生型AAV VP衣殼蛋白的AAV輔助質體。pNLREP2-Caprh74質體之示意性圖譜示於圖3中。
pHELP腺病毒輔助質體係11,635 bp且獲自Applied Viromics。質體含有對AAV複製具有重要作用的腺病毒基因體區，亦即E2A、E4ORF6及VA RNA（腺病毒E1功能由293細胞提供）。此質體中存在之腺病毒序列僅佔腺病毒基因體之約40%，且不含複製必不可少的順式元件，諸如腺病毒末端重複序列。因此，預期此類生產系統不會產生感染性腺病毒。pHELP質體之示意性圖譜示於圖4中。
rAAV可藉由此項技術中標準的方法，諸如藉由管柱層析或氯化銫梯度來純化。自輔助病毒純化rAAV載體之方法為本領域中已知的，且可包含例如Clark等人，《人類基因療法（Hum. Gene Ther. ）》, 10 (6): 1031-1039 (1999)；Schenpp及Clark，《分子醫學方法（Methods Mol. Med. ）》, 69 : 427-443 (2002)；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657中所揭示之方法。
在另一實施例中，本揭示案涵蓋包含本揭示案之rAAV的組合物。本揭示案之組合物包含rAAV及醫藥學上可接受之載劑。組合物亦可包括其他成分，諸如稀釋劑及佐劑。可接受的載劑、稀釋劑及佐劑對接受者是無毒的並且較佳在所用劑量和濃度下呈惰性並且包括緩衝劑及界面活性劑，例如普朗尼克（pluronics）。
在本揭示案之方法待投與之rAAV的效價將視例如特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由本領域術中標準之方法來測定。rAAV之效價可在每毫升約1 × 106 、約1 × 107 、約1 × 108 、約1 × 109 、約1 × 1010 、約1 × 1011 、約1 × 1012 、約1 × 1013 至約1 × 1014 或更多個耐去氧核糖核酸酶顆粒（DRP）之範圍內。劑量可以病毒基因體（vg）為單位來表述。測定衣殼體包裹之載體基因體效價之一種例示性方法使用了定量PCR，諸如（Pozsgai等人，《分子療法》，25(4):855-869, 2017）中所述之方法。除非另有說明，本文所述的劑量對應於根據超螺旋DNA標準測定的劑量。
本揭示案涵蓋用rAAV活體內或活體外轉導靶細胞之方法。活體內方法包含向有需要之動物（(包括人類）投與有效劑量或有效多次劑量之包含本揭示案之rAAV之組合物的步驟。若在罹患病症/疾病之前投與該劑量，則投與係預防性的。若在罹患病症/疾病之後投與該劑量，則投與係治療性的。在本揭示案之實施例中，有效劑量為緩解（消除或減少）至少一種與所治療病症/疾病狀態相關之症狀的劑量、減緩或防止發展成病症/疾病狀態的劑量、減緩或預防病症/疾病狀態惡化的劑量、減輕疾病程度的劑量、引起疾病緩解（局部或總體）的劑量及/或延長存活期的劑量。預期用本揭示案的方法預防或治療的疾病實例是DMD。
本揭示案亦涵蓋組合療法。如本文所用之組合包括同時治療與依序治療。特別考慮本揭示案的方法與標準醫學療法（例如皮質類固醇）的組合，以及與新療法的組合。
有效劑量之組合物、組合療法或藥劑的投與可藉由本領域中之標準途徑進行，包括(但不限於)肌內、非經腸、靜脈內、經口、頰內、鼻、肺、顱內、骨內、眼內、直腸或陰道。本領域中熟習此項技術者考慮所治療之感染及/或疾病狀態以及用於表現微肌肉萎縮蛋白之靶細胞/組織可選擇及/或匹配本揭示案之rAAV（特定而言，AAV ITR及衣殼蛋白）的投與途徑及AAV組分之血清型。
本揭示案提供局部投與及全身投與有效劑量的本揭示案之rAAV、藥劑及組合物。舉例而言，全身投與為投與循環系統中以便影響全身。全身投與包括經由胃腸道之腸內投與，諸如吸收，及經由注射、輸注或植入之非經腸投與。
特定言之，本揭示案之rAAV之實際投與可藉由使用將rAAV重組載體輸送至動物之目標組織中之任何物理方法實現。根據本揭示案的投藥包括但不限於注射至肌肉中及注射至血流中。已證明簡單地將rAAV再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中足以提供適用於肌肉組織表現之媒劑，且對於可與rAAV一起共投與之載劑或其他組分不存在已知限制（但在利用rAAV之正常方式中應避免降解DNA之組合物）。rAAV之衣殼蛋白可經修飾以使得rAAV靶向所關注特定目標組織，諸如肌肉。參見例如WO 02/053703，其揭示內容以引用之方式併入本文中。醫藥組合物可製備為可注射調配物或藉由經皮輸送遞送至肌肉之局部調配物。先前已開發出肌肉內注射與經皮輸送之多種調配物，且可用於本揭示案之實施。為了易於投與及處置，rAAV可與醫藥學上可接受之任何載劑一起使用。
在本揭示案之一個實施例中，本文所述的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白係在含有20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM氯化鎂（MgCl2 ）、200 mM氯化鈉（NaCl）及0.001%泊洛沙姆（poloxamer）188之緩衝液中調配。
在本文所揭示之方法中投與的rAAV之劑量將取決於例如特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由此項技術中之標準方法測定。所投與之各rAAV之效價的範圍可為每毫升約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約1×1013 、約1×1014 、約2×1014 或至約1×1015 或更多個DNA酶抗性顆粒（DRP）。劑量亦可以病毒基因體之單位（vg）表示（亦即，分別為1×107 vg、1×108 vg、1×109 vg、1×1010 vg、1×1011 vg、1×1012 vg、1×1013 vg、1×1014 vg、2×1014 vg、1×1015 vg）。劑量亦可以每公斤（kg）體重之病毒基因體單位（vg）表示（亦即，分別為1×1010 vg/kg、1×1011 vg/kg、1×1012 vg/kg、1×1013 vg/kg、1×1014 vg/kg、1.25×1014 vg/kg、1.5×1014 vg/kg、1.75×1014 vg/kg、2.0×1014 vg/kg、2.25×1014 vg/kg、2.5×1014 vg/kg、2.75×1014 vg/kg、3.0×1014 vg/kg、3.25×1014 vg/kg、3.5×1014 vg/kg、3.75×1014 vg/kg、4.0×1014 vg/kg、1×1015 vg/kg）。用於滴定AAV之方法描述於Clark等人，人類基因療法，10 : 1031-1039 (1999)中。
特定言之，本揭示案之rAAV之實際投與可藉由使用將rAAV重組載體輸送至動物之目標組織中之任何物理方法實現。根據本揭示案之投與包括（但不限於）注射至肌肉中及注射至血流中。已證明簡單地將rAAV再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中足以提供適用於肌肉組織表現之媒劑，且對於可與rAAV一起共投與之載劑或其他組分不存在已知限制（但在利用rAAV之正常方式中應避免降解DNA之組合物）。rAAV之衣殼蛋白可經修飾以使得rAAV靶向所關注特定目標組織，諸如肌肉。參見例如WO 02/053703，其揭示內容以引用之方式併入本文中。醫藥組合物可製備為可注射調配物或藉由經皮輸送遞送至肌肉之局部調配物。先前已開發出肌肉內注射與經皮輸送之多種調配物，且可用於本揭示案之實施。為了易於投與及處置，rAAV可與醫藥學上可接受之任何載劑一起使用。
出於肌肉內注射之目的，可採用佐劑（諸如芝麻油或花生油）或水性丙二醇中之溶液以及無菌水溶液。必要時，該等水溶液可經緩衝，且首先用生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑呈等張性。可在水中適合地與諸如羥丙基纖維素之界面活性劑混合製備作為游離酸（DNA含有酸性磷酸根基）或藥理學上可接受之鹽的rAAV的溶液。rAAV之分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中製備。在一般儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。與此相關，所採用無菌水性介質所有皆可容易地藉由本領域中熟習此項技術者熟知之標準技術獲得。
適合於注射使用之醫藥載劑、稀釋劑或賦形劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，形式必須為無菌的且必須為流體，達到存在可容易注射性之程度。其在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須防止諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物）、其適合的混合物及植物油之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之類塗層、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。微生物作用之預防可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。在多數情況下，其較佳地包含等張劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由使用延緩吸收之藥劑（例如單硬脂酸鋁及明膠）來實現。
無菌可注射溶液藉由以下製備：將所需量之rAAV視需要與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將各種滅菌活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在無菌粉劑用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自其預先無菌過濾之溶液產生活性成分粉劑加任何額外所需成分之粉劑。
用rAAV進行轉導亦可在活體外進行。在一個實施例中，所需目標肌肉細胞自個體移出，經rAAV轉導且再引入個體中。可替代地，可使用同基因型或異種肌肉細胞，在此情況下，彼等細胞在個體中將不會產生不當的免疫反應。
用於轉導且將經轉導細胞再引入個體中之適合方法係本領域中已知的。在一個實施例中，可在活體外，例如在適當媒劑中藉由組合rAAV與肌肉細胞來轉導細胞，且使用習知技術，諸如南方墨點法（Southern blot）及/或PCR，或藉由使用可選標記物篩檢含有所關注的DNA的彼等細胞。然後可將經轉導細胞調配成醫藥組合物，且藉由各種技術將組合物引入個體中，該等技術諸如利用肌肉內、靜脈內、皮下及腹膜內注射，或藉由使用例如導管注射至平滑肌及心肌中。
用本揭示案之rAAV轉導細胞引起微肌肉萎縮蛋白持續表現。本揭示案因此提供將表現微肌肉萎縮蛋白之rAAV投與/遞送至動物（較佳人類）的方法。此等方法包括用本揭示案之一種或多種rAAV轉導組織（包括但不限於組織，諸如肌肉；器官，諸如肝臟及腦；及腺體，諸如唾液腺）。轉導可藉由包括組織特異性控制元件之基因卡匣進行。舉例而言，本揭示案之一個實施例提供轉導肌肉細胞及肌肉組織之方法，該轉導由肌肉特異性控制元件引導，包括但不限於源自肌動蛋白及肌凝蛋白基因家族，諸如源自myoD基因家族的控制元件（參見Weintraub等人，《科學（Science ）》, 251 : 761-766 (1991)]；肌細胞特異性增強子結合因子MEF-2（Cserjesi及Olson，《分子與細胞生物學》，11: 4854-4862 (1991)）；源自人類骨胳肌動蛋白基因之控制元件（Muscat等人，《分子與細胞生物學》， 7 : 4089-4099 (1987)）；心臟肌動蛋白基因、肌肉肌酸激酶序列元件（參見Johnson等人，《分子與細胞生物學》， 9 :3393-3399 (1989)）及鼠類肌酸激酶增強子（mCK）元件；源自骨胳快縮肌鈣蛋白C基因、慢縮心臟肌鈣蛋白C基因及慢縮肌鈣蛋白I基因之控制元件：低氧誘導核因子（Semenza等人，《美國國家科學院院刊》， 88 : 5680-5684 (1991)）；類固醇誘導元件及包含糖皮質激素反應元件（GRE）之啟動子（參見Mader及White；《美國國家科學院院刊》；90: 5603-5607 (1993)），及其他控制元件。
肌肉組織為活體內DNA遞送之誘人標靶，因為其不為生命器官且容易獲取。本揭示案涵蓋來自經轉導之肌纖維之微肌肉萎縮蛋白的持續表現。
因此，本揭示案提供將有效劑量（或基本上同時投與之劑量或以一定時間間隔給與之劑量）之編碼微肌肉萎縮蛋白之rAAV投與有需要之個體的方法。免疫抑制療法
本揭示案提供治療肌肉營養不良症之方法，其中個體正經歷免疫抑制療法。術語免疫抑制療法係指抑制或調節個體之免疫系統的治療方法。該療法包含投與一種或多種免疫抑制劑。在任一種方法中，免疫抑制療法包含至少一種免疫抑制劑或至少兩種免疫抑制劑或至少三種免疫抑制劑或至少四種免疫抑制劑或至少五種抑制劑。
免疫抑制療法係預防性投與，原因在於免疫抑制療法在基因療法投與之前投與，或在基因療法投與之後，在個體之針對rAAV之免疫反應發作之前投與。免疫反應包括針對所投與之rAAV的有害免疫反應或發炎反應。免疫反應可為個體響應於所投與的rAAV（諸如抗AAVrh.74抗體）而產生抗體。
預防性投藥包括免疫抑制療法的投與與基因療法的投與同時進行，諸如在基因療法投與的24小時內，或在基因療法投與的12小時內，或在基因療法投與的6小時內，或在基因療法投與的5小時內，或在基因療法投與的4小時內，或在基因療法投與的3小時內，或在基因療法投與的2小時內，或在基因療法投與的小時內，或在基因療法投與的小時內，或在基因療法投與的小時內，或在基因療法投與的小時內，或在基因療法投與的小時內，或在基因療法投與的一小時內。免疫抑制劑為抑制個體之免疫系統、降低個體之免疫系統之效力或調節個體之免疫系統之活性或效力的任何藥劑。
在其他實施例中，免疫抑制療法係治療性投與。舉例而言，在基因療法投與之後，在個體發生針對rAAV的免疫反應之後，投與免疫抑制療法。個體之免疫反應包括rAAV投與個體之後或因rAAV投與個體而引起的有害免疫反應或發炎反應。免疫反應可為個體響應於所投與的rAAV（諸如抗AAVrh.74抗體）而產生抗體。
在其他實施例中，免疫抑制療法係在基因療法之第二次劑量的投與之前投與。在一些實施例中，第二次劑量係在治療性血漿置換（TPE）之後投與。
例示性免疫抑制劑包括糖皮質類固醇、傑納斯激酶抑制劑（janus kinase inhibitors）、鈣調神經磷酸酶抑制劑、mTOR抑制劑、細胞抑制劑（諸如嘌呤類似物、甲胺喋呤及環磷醯胺）、肌苷單磷酸去氫酶（IMDH）抑制劑，及諸如單株抗體或融合蛋白及多肽等生物製劑。
免疫抑制劑可為消炎類固醇，其為減少發炎且抑制或調節個體免疫系統之類固醇。例示性消炎類固醇為糖皮質激素，諸如普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠、地夫可特、布地奈德或普賴松。
傑納斯激酶抑制劑為JAK/STAT信號傳導路徑抑制劑，其靶向傑納斯激酶之酶家族中的一者或多者。例示性傑納斯激酶抑制劑包括托法替尼（tofacitinib）、巴瑞替尼（baricitinib）、優帕替尼（upadacitinib）、皮非替尼（peficitinib），及奧卡替尼（oclacitinib）。
鈣調神經磷酸酶抑制劑結合至親環素且抑制鈣調神經磷酸酶活性。例示性鈣調神經磷酸酶抑制劑包括環孢靈（cyclosporine）、他克莫司（tacrolimus）及匹克莫司（picecrolimus）。
mTOR抑制劑減少或抑制絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白激酶mTOR。例示性mTOR抑制劑包括西羅莫司（sirolimus）、依維莫司（everolimus）及坦西莫司（temsirolimus）。
免疫抑制劑包括免疫抑制性巨環內酯。術語「免疫抑制性巨環內酯」係指抑制或調節個體之免疫系統的巨環內酯藥劑。巨環內酯為包含與一種或多種去氧糖類（諸如二去氧甲基已糖或去氧胺）連接之大巨環內酯環的一類藥劑。內酯環通常為14員、15員或16員環。巨環內酯屬於聚酮類藥劑且可為天然產物。免疫抑制性巨環內酯之實例包括他克莫司、吡美莫司及西羅莫司。
嘌呤類似物阻斷核苷酸合成且包括IMDH抑制劑。例示性嘌呤類似物包括硫唑嘌呤（azathioprine）、黴酚酸酯（mycophenolate）及來氟米特（lefunomide）。
例示性免疫抑制性生物製劑包括阿巴西普（abatacept）、阿達木單抗（adalimumab）、阿那白滯素（anakinra）、賽妥珠單抗（certolizumab）、依那西普（etanercept）、戈利木單抗（golimumab）、英利昔單抗（infliximab）、伊科奇單抗（ixekizumab）、那他珠單抗（natalizumab）、利妥昔單抗（rituximab）、塞庫金單抗（secukinumab）、托西利單抗（tocilizumab）、烏特金單抗（ustekinenumab）、維多珠單抗（vedolizumab）、巴利昔單抗（basiliximab）、貝拉塞普（belatacep），及達利珠單抗（daclizumab）。
特定而言，免疫抑制劑為抗CD20抗體。術語抗CD20特異性抗體係指特異性結合至CD20或抑制或減少其表現或活性的抗體。例示性抗CD20抗體包括利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧伐木單抗。
免疫抑制抗體之其他實例包括抗CD25抗體（或抗IL2抗體或抗TAC抗體），諸如巴利昔單抗（basiliximab）及達利珠單抗（daclizumab），以及抗CD3抗體，諸如莫羅單抗（muromonab）-CD3、奧昔珠單抗（otelixizumab）、替利珠單抗（teplizumab）及維西珠單抗（visilizumab）；抗CD52抗體，諸如阿侖單抗（alemtuzumab）。
在本發明的實施例中，本揭示案之一種或多種方法中所用的免疫抑制劑（免疫抑制抗體）可作為奈米顆粒投與。用於製備及/或調配可用於本揭示案之方法中之一個或多個奈米顆粒及奈米顆粒的方法包括例如以如下形式所述的彼等方法：聚合物（Patil等人，《醫藥奈米技術（Pharmaceutical Nanotechnol.）》367:195-203, 2009；Yang等人，《ACS應用材料界面（ACS Appl.Mater.Interfaces）》, doi: 10.1021/acsami.6b16556, 2017；Perepelyuk等人，《分子療法-核酸（Mol. Ther. Nucleic Acids）》6:259-268，2017）；脂質體（Buyens等人，《控制釋放（Control Release）》158(3): 362-370, 2012；Scarabel等人，《關於藥物遞送的專家意見（Expert Opin.Drug Deliv.）》17:1-14, 2017）；微胞（Tangsangasaksri等人，《生物巨分子（Bio Macromolecules）》17: 246-255, 2016；Wu等人，《奈米技術（Nanotechnology）》，doi：10.1088/1361-6528/aa6519, 2017）；微乳液（WO 11/004395）、奈米乳液或固體脂質奈米顆粒（Sahay等人，《自然生物技術（Nature Biotechnol）》31:653-658, 2013；及Lin等人，《奈米醫學（Nanomedicine）》9(1):105-120, 2014）；以及WO 2008/066965、WO 2011/143201、WO2008/014478、WO 2020/081938、WO 2013/016058、WO 2013/086373、WO 2019/177550、WO 2013/016126、WO 2019/089828、WO 99/39741、WO 2017/1 17528、WO 2017/004143、WO 2017/075531、WO 2015/199952、WO 2014/008334、WO 2013/086373、WO 2013/086322、WO 2013/016058、WO 2013/086373、WO 2011/141705及WO 2001/07548；美國專利公開案第2004/0142025號、第2007/0042031號、第2016/0199485號、第2016/0009637號、第2015/0273068號、第2015/0265708號、第2015/0203446號、第2015/0005363號、第2014/0308304號、第2014/0200257號、第2013/086373號、第2013/0338210號、第2013/0323269號、第2013/0245107號、第2013/0195920號、第2013/0123338號、第2013/0022649號、第2013/0017223號、第2012/0295832號、第2012/0183581號、第2012/017241 1號、第2012/0027803號、第2012/0058188號、第201 1/031 1583號、第201 1/031 1582號、第201 1/0262527號、第201 1/0216622號、第201 1/01 17125號、第201 1/0091525號、第201 1/0076335號、第號201 1/0060032、第2010/0130588號、第2007/0042031號、第2006/0240093號、第2006/0083780號、第2006/0008910號、第2005/0175682號、第2005/017054號、第2005/01 18253號、第2005/0064595號、第2004/0142025號、第2007/0042031號、第1999/009076號，及美國專利第8,569,256號、第5,965,542號；其全部內容以引用的方式併入本文中。治療性血漿置換
治療性血漿置換（TPE）係體外血液純化技術，其為了移除高分子量物質（諸如抗體）而設計。初始全身投與一定劑量的rAAV之後，個體可能產生針對AAV血清型的抗體，例如個體在rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白投與之後，產生針對AAVrh74的抗體。使用TPE移除此等抗體允許rAAV載體安全且有效地再次給予。在TPE過程中，經由血管通路移除全血且隨後經由血球分離機內的離心機離心，在離心機中移除血漿（抗體）。將紅血細胞連同用於維持個體之體液的置換體液（人類白蛋白）一起遞送回去。
TPE療程中待置換之血漿的量係結合個體之血漿體積估計值（EPV）測定。可以利用多個公式計算EPV（參見例如Inkley等人，《實驗室與臨床醫學雜誌（J. Lab Clin.Med.）》45:841-850, 1955；Retzlaff等人，《血液（Blood）》33: 649-887, 1969；Feldschuh等人，《循環（Circulation）》56: 605-612, 1977；Spenger等人，《預測血漿置換療法中的患者血漿體積（Predication of patients plasma volume in plasma exchange therapy）》.於：Smeby等人編，《治療性血液純化系統的免疫及代謝方面（Immune and Metabolic Aspects of Therapeutic Blood Purification Systems）》.Basel, Switzerland: Krager.1986，第394-402頁）。根據Kaplan等人，《國際腎臟學（Kidney Intl.）》38:160-166, 1990（以全文引用的方式併入本文中）中所述的下式，利用個體之體重及血容比執行計算估計EPV之例示性方法： EPV = [0.065 x 體重(kg)] x [1-血容比]
基於IgG抗體之動力學來開發實例5中所述的方案，表明在48小時之後，存在反彈，先前程序移除的抗體約50-60%恢復。出於本文所述方法之目的，在一個實施例中，已確定抗體效價必須降低至AAVrh.74抗體水準＜1:100，以容許基因遞送。
舉例而言，對個體之血漿進行TPE的方法將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約50%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約55%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約60%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約63%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約64%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約65%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約69%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約70%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約74%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約75%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約85%，或將抗rAAV抗體移除至少約90%，或將個體之血管內空間內的抗rAAV抗體移除至少約95%。
所揭示之方法包含對個體之血漿執行至少一個TPE療程，或至少兩個TPE療程，或至少三個TPE療程，或至少5個TPE療程，或至少6個TPE療程，或至少7個TPE療程，或至少8個TPE療程，或至少9個TPE療程或至少10個TPE療程。另外，TPE療程執行約1至5天，或約1至10天，或約5至10天，或約5至7天，或約7至10天，一天一次。TPE療程執行連續兩天，一天一次，或執行連續三天，一天一次，或執行連續四天，一天一次，執行連續5天，或執行連續6天，一天一次，或執行連續7天，一天一次，或執行連續7天，一天一次，或執行連續8天，一天一次，或執行連續9天，一天一次，或執行連續10天，一天一次。
使用血庫程序，使用如Gurland等人，《國際人工器官雜誌（Int. J. Artif Organs）》7:35-38, 1984中所述的選擇性細胞移除（細胞分離術），使用膜血漿分離（MPS），利用血庫程序執行TPE技術，該膜血漿分離係使用如Gurland等人，《腎元（Nephron）》36:173-182, 1984中所述的高度滲透性過濾器及透析設備。執行TPE之其他方法描述於Sowada等人（《可利用的移除系統：技術現狀（Available removal systems: state of the art）》.於Nydegger UE編輯.《二十世紀九十年代的治療型血液離析術 （Therapeuitc Hemapheresis in the 1990s ）》.《血液學及輸血之當前研究（Current Studies in Hematology and Blood Transfusions）》，第57卷，Basal Switzerland: Karger.1990 第57-113頁）。此等參考文獻皆以全文引用之方式併入本文中。
本發明之實施例包括測定個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體，以及用（rAAV）rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白基因療法（包括（rAAV）rh74MHCK7.微肌肉萎縮蛋白）治療個體，以及進一步用免疫抑制療法、TPE或兩者治療個體，應認識到，個體（包括人類患者）之血清或血漿可以含有預先存在的抗AAVrh.74抗體，且因此在已接受任何基因療法治療之前，可鑑別為對AAVrh.74呈血清反應陽性。進一步認識到，個體（包括人類患者）因接受基於AAV之基因療法而可變成血清反應陽性。因此，該測定可用於監測此類個體之血清或血漿中之抗AAVrh.74抗體的存在及水準，且進一步用於測定在rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白（包括AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白）治療之前，是否應將免疫抑制療法、TPE或兩者投與此類個體。就此而言，rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白（包括AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白）可為第一時間基因療法治療或另一種基因療法治療，包括再給藥治療。就此而言，測定此類血清或血漿之血清陽性係用於測定：個體是否有資格接受rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白（包括AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白）之第一時間基因療法；個體是否需要免疫抑制療法及/或TPE；以及免疫抑制療法治療是否已將個體血清或血漿中之抗AAVrh74抗體清除至足以使個體有資格接受rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白（包括AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白）治療或再治療的水準。適用於對個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體進行此類測定的方法及組合物包括以下文獻中所述的彼等方法及組合物：Griffin等人，《肌肉營養不良症人群中之腺相關病毒血清型rh74盛行率（Adeno-associated Virus Serotype rh74 Prevalence in Muscular Dystrophy Population）》，美國基因及細胞療法學會（American Society of Gene and Cell Therapy），第22屆年會，2019；以及與美國專利申請案第63/038957號對應的國際專利申請案--------------，其全部內容以引用的方式併入本文中。
用於測定個體之血清或血漿是否存在抗AAVrh.74抗體的抗體實例包括以下或如本文另外所描述：
抗體 序列
A VH: MDWLWNLLFLMAAAQSAQTQIQLVQSGPELRKPGETVKISCKASGYSFTNYGMNWVKQTPGKDLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLEASANTAYLQINDLKNEDMATYFCARGVAHYSDSRFAFDYWGQGTTLTVPS （SEQ ID NO: 10）    VL: MHFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSVSSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYYTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIK （SEQ ID NO: 11）
B VH: MDWLWNLLFLMAAAQSAQTQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAAGYTFTDYGMNWVKQAPGEGLKWMGWINTNTGEPTYGDDFKGRFAFSLEASASTAHLQINNLKNDDMAIYFCARGNAHPGGSAFVYWGQGTLVTVSA （SEQ ID NO: 12）    VL: MHFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASPGESVTITCSASSGVTYMHWFQQKPGTSPKNWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIK （SEQ ID NO: 13）
C VH: QVKLEESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSARKVYLQINNLKNEDMATYFCARGSYYYDSSPAWFAYWGQGTLVTVSA （SEQ ID NO: 14）    VL: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSTYPFTFGSGTKLEIKR （SEQ ID NO: 15）
D VH: QVKLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTKYGMNWVKQAPGEGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLKTSASTAYLQINNLKNEGTTTYFCARGVDSSGYGAFAYWGQGTLVTVSA （SEQ ID NO: 16）    VL: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSFYPFTFGSGTKLEIKR （SEQ ID NO: 17）
E VH: EVQLQESGSDLKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKYEDTGTYFCTRGTSTMISTFAFVYWGQGTLVTVSA （SEQ ID NO: 18）    VL: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVRYMHWFQQKPGTSPKVWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRTYYPFTFGSGTKLEIKR （SEQ ID NO: 19）
用於測定個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體的其他抗體實例包括單株抗體，該等單株抗體包含：選自由以下組成之群的VH CDR1胺基酸序列：NYGMN（SEQ ID NO: 20）、DYGMN（SEQ ID NO: 22）、YTFTNYGMN（SEQ ID NO: 20）、YTFTKYGMN（SEQ ID NO: 23）及YTFTNYGMN（SEQ ID NO: 21）；及/或選自由以下組成之群的VH CDR2胺基酸序列：WINTYTGEPTYADDFKG（SEQ ID NO: 24）、WINTNTGEPTYGDDFKG（SEQ ID NO: 25）及WMGWINTYTGEPTY（SEQ ID NO: 26），及/或選自由以下組成之群的VH CDR3胺基酸序列：GVAHYSDSRFAFDY（SEQ ID NO: 27）、GNAHPGGSAFVY（SEQ ID NO: 28）、RGSYYYDSSPAWFAY（SEQ ID NO:29）、RGVDSSGYGAFAY（SEQ ID NO: 30）及TRGTSTMISTFAFVY（SEQ ID NO: 31），及/或選自由以下組成之群的VL CDR1胺基酸序列：SVSSSVSYMH（SEQ ID NO: 32）、SASSGVTYMH（SEQ ID NO: 33）、SSVSYMH（SEQ ID NO: 34）、SSVSYMH（SEQ ID NO: 34）及SSVRYMH（SEQ ID NO: 35），及/或選自由以下組成之群的VL CDR2胺基酸序列：YTSNLAS（SEQ ID NO: 36）、RTSNLAS（SEQ ID NO: 37）、LWIYSTSNLAS（SEQ ID NO: 38）及VWIYSTSNLAS（SEQ ID NO: 39），及/或選自由以下組成之群的VH CDR3胺基酸序列：QQRSSYPFT（SEQ ID NO: 40）、QQRSTYPF（SEQ ID NO: 41）、QQRSFYPF（SEQ ID NO: 42）及QQRTYYPF（SEQ ID NO: 43）。用包含微肌肉萎縮蛋白的 rAAV 治療肌肉營養不良症，包括杜興氏肌肉營養不良症（「 DMD 」）或貝克氏肌肉營養不良症（「 BMD 」）
本發明涵蓋一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟：投與包含編碼微肌肉萎縮蛋白之異源核苷酸序列的重組腺相關病毒（rAAV）且進一步包含投與免疫抑制療法。在本發明之各種實施例中，方法包含：投與包含編碼微肌肉萎縮蛋白之異源核苷酸序列的重組腺相關病毒（rAAV）且進一步包含投與消炎類固醇，包括例如普賴松。
在關於用包含微肌肉萎縮蛋白之rAAV治療肌肉營養不良症且進一步包含投與免疫抑制療法或消炎類固醇的本發明所有實施例中，可用於本發明之方法中的rAAV或編碼微肌肉萎縮蛋白之核苷酸序列包括以下文獻中所述的彼等物：WO-2020/123645、WO-2019/209777、WO-2019/195362、WO-2016/115543、WO-2019118806、WO-2017/221145（該等文獻各自的內容以引用的方式併入本文中），且包括SGT-001、滋迪瓦羅（zildistrogene varoparvovec）及PF-06939926。肢帶型肌肉營養不良症的治療
肢帶型肌肉營養不良症（「LGMD」）的治療為本發明之一態樣。應認識到，本文所述之本發明方法可用於治療肢帶型肌肉營養不良症，其係利用適用於治療此類營養不良症的rAAV載體。此類rAAV載體包括以下文獻中所述的彼等rAAV載體：PCT/US2019/039893（WO 2020/06458），包括AAVrh.74.tMCK.CAPN3；美國專利申請案63/024,338，包括rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV；PCT/US2019/015779（WO2019/15474），包括scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG；PCT/US2020/47339，包括AAVrh74.tMCK.hSCGA；PCT/US2020/019892（WO2020/176614），包括scAAVrh74.MHCK7.HSGCB；PCT/US2016/061703（WO2017/083776），包括rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，該等文獻各自的內容以引用的方式併入本文中。治療肌肉營養不良症的組合療法
本揭示案提供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，包括用於治療DMD、貝克氏肌肉營養不良症及肢帶型肌肉萎縮症的組合療法，其中組合療法包含rAAV及消炎類固醇。本揭示案亦提供包含rAAV及消炎類固醇之組合療法用於製備供治療肌肉營養不良症（包括用於治療DMD、貝克氏肌肉營養不良症及肢帶型肌肉萎縮症）之藥劑的用途。
本揭示案提供包含組合投與（包括同時、依序或在不同時間點投與）之rAAV rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白與消炎類固醇的組合療法及藥劑。本揭示案亦提供包含組合投與（包括同時、依序或在不同時間點投與）之rAAV與消炎類固醇的組合療法及藥劑，該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。舉例而言，消炎類固醇為糖皮質激素。在一些實施例中，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠，或地夫可特。在一些實施例中，消炎類固醇調配成經口投與。就組合療法及藥劑而言，消炎類固醇可在rAAV投與之前與之後投與。或者，僅在rAAV投與之前或僅在rAAV投與之後，投與消炎類固醇。
在一些組合療法及藥劑中，消炎類固醇係在rAAV投與之前的約12小時投與，或在rAAV投與之前的約24小時投與，或在rAAV投與之前的約36小時投與，或在rAAV投與之前的約48小時投與，或在rAAV投與之前的約60小時投與，或在rAAV投與之前的約72小時投與，或在rAAV投與之前的約96小時投與。在一些組合療法及藥劑中，消炎類固醇係在rAAV投與之前的約5天時投與，在rAAV投與之前的約6天時投與，在rAAV投與之前的約7天時投與，或在rAAV投與之前的約8天時投與，或在rAAV投與之前的約9天時投與，或在rAAV投與之前的約10天時投與，或在rAAV投與之前的約11天時投與，或在rAAV投與之前的約12天時投與，或在rAAV投與之前的約13天時投與，或在rAAV投與之前的約14天時投與，或在rAAV投與之前的約30天時投與。
在一些組合療法及藥劑中，在投與rAAV之前，消炎類固醇投與約7天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約14天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇21天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約28天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約30天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約45天，一天至少一次；或在投與rAAV之前，投與消炎類固醇約60天，一天至少一次。在一些組合物及藥劑中，消炎類固醇係在rAAV投與之前的30至60天投與。
在例示性組合療法及藥劑中，消炎類固醇係在rAAV投與之前投與且消炎類固醇係在rAAV投與之後的第1至30天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至60天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至7天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至14天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至21天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至24天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的1至28天一天投與至少一次，或在rAAV投與之後的至少1至30天，或在rAAV投與之後的至少30至60天投與。
在本文所揭示之組合療法及藥劑中之任一者中，組合療法或藥劑亦可包含抗CD20特異性抗體，其與rAAV及消炎類固醇組合投與。抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前投與。在一些組合物中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前的至少7天投與。例示性抗CD20抗體包括利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧伐木單抗。
在一些組合療法及藥劑中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前的約60天投與，或在rAAV投與之前的約45天投與，或在rAAV投與之前的約30天投與，在rAAV投與之前的約14天投與，在rAAV投與之前的約7天投與且在rAAV投與的約24小時內投與。在一些組合物中，抗CD20抗體係在rAAV投與之前的30至60天投與。在一些組合療法及藥劑中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之後投與。舉例而言，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前與之後投與。或者，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前投與，或抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之後投與。
另外，在所揭示之組合療法及藥劑中之任一者中，免疫抑制性巨環內酯與rAAV及消炎類固醇且視情況與抗CD-20抗體組合投與個體。免疫抑制性巨環內酯之實例包括他克莫司、吡美莫司及西羅莫司。在一些組合療法及藥劑中，免疫抑制性巨環內酯調配成經口投與。在一些組合療法及藥劑中，免疫抑制性巨環內酯可以在rAAV投與之前且在rAAV投與之後投與。或者，在rAAV投與之前投與免疫抑制性巨環內酯，或在rAAV投與之後投與免疫抑制性巨環內酯。
在一些組合療法及藥劑中，免疫抑制性巨環內酯係在rAAV投與之前投與至少三天，一天至少一次，或在rAAV投與之前的至少4天投與，或在rAAV投與之前的至少5天投與，或在rAAV投與之前的至少6天投與，在rAAV投與之前的至少7天投與，或在rAAV投與之前的至少10天投與，或在rAAV投與之前的至少14天投與，或在rAAV投與之前的至少30天投與，或在rAAV投與之前的至少45天投與，或在rAAV投與之前的至少60天投與。在一些組合療法及藥劑中，免疫抑制性巨環內酯係在rAAV投與之前的30至60天投與。
本揭示案亦提供用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，包含共投與rAAV及免疫抑制療法，包括治療DMD、貝克氏肌肉營養不良症及肢帶型肌營養不良症，其中rAAV與免疫抑制療法中之一種或多種組分同時、依序或在不同時間點投與。另外，本揭示案亦提供包含rAAV及免疫抑制療法之組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症（包括治療DMD、貝克氏肌肉營養不良症及肢帶型肌營養不良症）之藥劑的用途，其中rAAV與免疫抑制療法中之一種或多種組分同時、依序或在不同時間點投與。舉例而言，本揭示案提供用於治療肌肉營養不良症之包含rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及免疫抑制療法的組合療法，其中免疫抑制療法包含消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，其中rAAV與免疫抑制療法中的一種或多種組分同時、依序或在不同時間點投與。舉例而言，本揭示案提供用於治療肌肉營養不良症的組合療法，其包含選自由以下組成之群的rAAV及免疫抑制療法：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，其中免疫抑制療法包含消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，其中rAAV及免疫抑制療法中的一種或多種組分同時、依序或在不同時間點投與。
舉例而言，本揭示案提供包含rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白及免疫抑制療法的組合療法用於製備供治療肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中免疫抑制療法包含消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，其中rAAV與免疫抑制療法中的一種或多種組分同時、依序或在不同時間點投與。舉例而言，本揭示案提供rAAV及免疫抑制療法用於治療肌肉營養不良症的用途，其中rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，且其中免疫抑制療法包含消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，其中rAAV及免疫抑制療法中的一種或多種組分同時、依序或在不同時間點投與。
術語免疫抑制療法係指抑制或調節個體之免疫系統的治療方法。該療法包含投與一種或多種免疫抑制劑。在一些實施例中，免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯。
在例示性組合療法或藥劑中，免疫抑制療法包含在投與rAAV之前的約24小時投與消炎類固醇。在另一種例示性組合療法或藥劑中，免疫抑制療法包含在rAAV投與之前投與消炎類固醇，且在rAAV投與之後的第1至30天一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天一天投與消炎類固醇至少一次。在另一個實施例中，以1 mg/kg投與rAAV之後，投與糖皮質激素消炎類固醇（諸如普賴松）至少60天。
在所揭示之組合療法及藥劑中的任一者中，在免疫抑制療法中，消炎類固醇為糖皮質激素，諸如普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠，或地夫可特。在一些組合療法中，消炎類固醇調配成經口投與。
在其他例示性組合療法及藥劑中，免疫抑制療法包含在rAAV投與之前投與抗CD20特異性抗體。舉例而言，抗CD20抗體調配成藉由血管內輸注投與。例示性抗CD20特異性抗體包括利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧伐木單抗。
在一些組合療法及藥劑中，在rAAV投與之前的至少14天投與抗CD20特異性抗體。在另一個實施例中，抗CD20特異性抗體係在rAAV投與之前的約60天投與，或在rAAV投與之前的約45天投與，或在rAAV投與之前的約30天投與，在rAAV投與之前的14天投與，在rAAV投與之前的約7天投與且在rAAV投與的約24小時內投與。另外，在rAAV投與之前，投與抗CD20特異性抗體30至60天。所揭示之免疫抑制療法亦包括在rAAV投與之後投與抗CD20特異性抗體。
另外，所揭示之免疫抑制療法包含在rAAV投與之前，投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次。免疫抑制療法亦可包含在rAAV投與之後，投與免疫抑制性巨環內酯。在任一種所揭示之免疫抑制療法中，免疫抑制性巨環內酯調配成經口投與。例示性免疫抑制性巨環內酯包括他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。
在一些實施例中，在rAAV投與之前的30至60天投與所揭示之免疫抑制療法。另外，免疫抑制療法係在rAAV投與之前的約60天投與，在rAAV投與之前的約45天投與，在rAAV投與之前的約30天投與，在rAAV投與之前的約14天投與，在rAAV投與之前的約7天投與，在rAAV投與之前的約24小時或約12小時投與。
在一個特定實施例中，本揭示案提供用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，其中組合療法包含rAAV及免疫抑制療法，其中免疫抑制療法包含：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，及在rAAV投與之後的第1至30天，一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且視情況在rAAV投與之後投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且視情況包含在rAAV投與之後，投與免疫抑制性巨環內酯。舉例而言，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特；抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧法木單抗；在消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者中，免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。在一個例示性實施例中，免疫抑制療法包含消炎類固醇普賴松或普賴蘇穠、抗CD20抗體利妥昔單抗，及免疫抑制性巨環內酯西羅莫司。
在一個特定實施例中，本揭示案提供包含rAAV與免疫抑制療法之組合療法用於治療有需要之人類個體之肢帶型肌肉萎縮症的用途，其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；且其中組合療法包含rAAV及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含：i）在rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，且在rAAV投與之後的第1至30天一天投與消炎類固醇至少一次，或在rAAV投與之後的第1至60天一天投與消炎類固醇至少一次；ii）在rAAV投與之前的約14天，在rAAV投與之前的約7天且在rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且視情況包含在rAAV投與之後，投與抗CD20抗體；iii）在rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且視情況包含在rAAV投與之後，投與免疫抑制性巨環內酯。舉例而言，消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特；抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧法木單抗；在消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中之一者或多者中，免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。在一個例示性實施例中，免疫抑制療法包含消炎類固醇普賴松或普賴蘇穠、抗CD20抗體利妥昔單抗，及免疫抑制性巨環內酯西羅莫司。
本揭示案亦提供用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，其中該組合療法包含一定劑量的rAAV，例如第二次劑量，其中在投與重組腺相關病毒（rAAV）的第二次劑量之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE），且其中在進行TPE之前，向個體投與rAAV的第一次劑量。舉例而言，rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌肉營養不良症為DMD、貝克氏肌肉營養不良症或肢帶型肌營養不良症。
另外，本揭示案提供組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症之藥劑的用途，該組合療法包含向個體投與一定劑量的rAAV，例如「rAAV的第二次劑量」，其中在重組腺相關病毒（rAAV）之第二次劑量投與之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）且其中在進行TPE之前，向個體投與rAAV的第一次劑量。舉例而言，rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌肉營養不良症為DMD、貝克氏肌肉營養不良症或肢帶型肌營養不良症。
在所揭示之組合療法及用途中之任一者中，在投與第2次劑量或rAAV之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE或至少三次TPE。在一些實施例中，在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行至少四次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行五次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行六次TPE，或在投與rAAV的第2次劑量之前，對個體之血漿進行七次TPE。
本揭示案提供用於治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的組合療法，其中組合療法包含向個體投與rAAV且其中在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）且其中rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌肉營養不良症為DMD、貝克氏肌肉營養不良症或肢帶型肌營養不良症。
本揭示案提供組合療法用於製備供治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症之藥劑的用途，其中組合療法包含向個體投與rAAV，且其中在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）且其中rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌肉營養不良症為DMD、貝克氏肌肉營養不良症或肢帶型肌營養不良症。
在所揭示之組合療法及用途中的任一者中，在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少三次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少四次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少五次TPE；在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少六次TPE；或在投與rAAV之前，對個體之血漿進行至少七次TPE。在這些公開的聯合療法和用途中，在施用rAAV前約24小時向受試者施用抗炎類固醇。另外，在一些實施例中，rAAV投與之後的第1至60天，向個體投與消炎類固醇，一天至少一次。舉例而言，消炎類固醇調配成經口投與。另外，消炎類固醇為糖皮質激素，諸如普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠或地夫可特。
在所揭示之組合療法及用途中之任一者中，個體之血漿在rAAV投與之前進行TPE至少9天，在投與之前進行TPE至少7天，在投與之前進行TPE 5天，或在投與之前進行TPE 2天。另外，在rAAV投與之前，在對個體之血漿進行的TPE療程之間存在約24至約48小時。在一個特定實施例中，在rAAV投與之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE，其中TPE之間存在約48小時。
在本文所述之組合療法及用途中之任一者中，個體在rAAV投與時具有約1:400或更小的抗AAVrh.74抗體水準。舉例而言，個體在rAAV投與時具有約1:100至約1:400的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:100至1:300的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:100至1:200的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:250至1:500的抗AAVrh.74抗體水準，或約1:200至1:400的抗AAVrh.74抗體水準。抗體效價作為總抗體結合效價測定。在所揭示之用於治療肌肉營養不良症之組合療法及用途中的任一者中，在rAAV投與之前，在rAAV投與之後，在觀測到免疫反應或不良事件之前，或在觀測到免疫反應或不良事件之後，測定該個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體。另外，在投與免疫抑制療法或TPE的步驟之前，測定抗AAVrh.74抗體的存在。舉例而言，在包含AAV之任何組合療法或藥劑向該個體的任何投與之前或在包含AAVrh.74之任何組合療法或藥劑投與該個體之前，測定抗AAVrh.74抗體的存在。
另外，在所揭示之組合療法及用途中，該個體之血清或血漿中的抗AAVrh.74抗體水準用作陽性對照。舉例而言，陽性對照係使用抗AAVrh.74單株抗體，諸如本文所述之任一種抗AAVrh.74單株抗體。
在所揭示者及用途中之任一者中，使用定量方法測定個體中是否存在抗AAVrh.74抗體，其中基於該定量鑑別該個體對抗AAVrh.74抗體呈血清反應陽性，且其中該免疫抑制療法或TPE選擇性地投與呈血清反應陽性的個體。
本揭示案提供以下其他態樣：
技術方案1.    一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺相關病毒（rAAV）及消炎類固醇的步驟，其中該rAAV為血清型AAVrh.74且該rAAV包含SEQ ID NO: 9之表現卡匣。
技術方案2.    如技術方案1之方法，其中該rAAV係以1.33×1014 vg/kg之劑量投與。1.33×1014 之劑量係利用線性qPCR DNA標準測定，其對應於如根據用於測定效價之超螺旋qPCR DNA標準所測定的2×1014 。
技術方案3.    如技術方案1或2之方法，其中該個體罹患杜興氏肌肉營養不良症，先前尚未接受基於rAAVrh.74之基因療法，且已測定對rAAV.rh74抗體呈血清反應陽性。
技術方案4.    如技術方案3之方法，其中該個體已基於ELISA免疫分析測定對rAAVrh.74抗體呈血清反應陽性，且其中該個體在1:400的血清稀釋度下展現≥2.00的吸光度比。
技術方案5.    如技術方案1至3中任一項之方法，其進一步包含在將rAAVrh74投與個體之前，測定該個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體的步驟。
技術方案6.    如技術方案5之方法，其中測定抗AAVrh.74抗體的存在係藉由ELISA免疫分析來測定，且其中該個體在1:400之血清稀釋度下展現≥2.00的吸光度比。
技術方案7.    如技術方案1至6中任一項之方法，其中該消炎類固醇經口投與。
技術方案8.    如技術方案1至7中任一項之方法，其中該消炎類固醇在該rAAV投與之前的約12小時投與。
技術方案9.    如技術方案1至7中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的至少12小時投與。
技術方案10.  如技術方案1至7中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的至少12小時投與。
技術方案11.  如技術方案1至7中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的至少24小時投與。
技術方案12.  如技術方案1至11中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之後的第1至約30天一天投與至少一次，或在該rAAV投與之後的1至60天一天投與至少一次。
技術方案13.  如技術方案1至11中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在rAAV投與之後投與至少30天，一天至少一次。
技術方案14.       如技術方案1至11中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在rAAV投與之後投與至少60天，一天至少一次。
技術方案15.  如技術方案1至14中任一項之方法，其中該消炎類固醇為糖皮質激素。
技術方案16.  如技術方案13之方法，其中該糖皮質激素為普賴松。
另外，本揭示案提供以下其他態樣：
技術方案1.    一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟： a）   在重組腺相關病毒（rAAV）之前，對個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）； b）   投與rAAV，其中該rAAV為血清型rhAAVrh.74且該rAAV包含SEQ ID NO: 9之表現卡匣。
技術方案2.    如技術方案1之方法，其中在投與之前，對個體之血漿進行至少兩次TPE、至少三次TPE、至少四次TPE、至少五次TPE rAAV、至少六次TPE或至少七次TPE。
技術方案3.    如技術方案1或2之方法，其中該個體之血漿在rAAV投與之前進行TPE至少9天，在投與之前進行TPE至少7天，在投與之前進行TPE 5天，或在投與之前進行TPE 2天。
技術方案4.    如技術方案1至3中任一項之方法，其中在投與該rAAV的當天，對該個體的血漿進行TPE。
技術方案5.    如技術方案1至4中任一項之方法，其中對該個體之血漿進行至少兩次TPE，其中TPE相隔約48小時。
技術方案6.    如技術方案1至5中任一項之方法，其中該rAAV以1.33×1014 之劑量投與。1.33×1014 之劑量係利用線性qPCR DNA標準測定，其對應於如根據用於測定效價之超螺旋qPCR DNA標準所測定的2×1014 。
技術方案7.    如技術方案1至6中任一項之方法，其中該個體罹患杜興氏肌肉營養不良症，且該個體已測定對rAAVrh.74抗體呈血清反應陽性。
技術方案8.    如技術方案7之方法，其中在技術方案1b之投與步驟之前，向該個體投與AAVrh.74至少一次。
技術方案9.    如技術方案7之方法，其中該個體已基於ELISA免疫分析測定對rAAVrh7抗體呈血清反應陽性，且其中該個體在1:100的血清稀釋度下展現≥2.00的吸光度比。
技術方案10.  如技術方案1至9中任一項之方法，其進一步包含在rAAVrh.74的任何投與之前，測定該個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體的步驟。
技術方案11.  如技術方案10之方法，其中測定抗AAVrh.74抗體的存在係藉由ELISA免疫分析來測定，且其中該個體在1:100之血清稀釋度下展現≥2.00的吸光度比。
技術方案12.  如技術方案1至11中任一項之方法，其進一步包含投與消炎類固醇。
技術方案13.  如技術方案12之方法，其中該消炎類固醇經口投與。
技術方案14.  如技術方案12或13之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的約12小時投與。
技術方案15.  如技術方案12或13之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的至少12小時投與。
技術方案16.  如技術方案12或13之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的至少12小時投與。
技術方案17.  如技術方案12或13之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的至少24小時投與。
技術方案18   如技術方案12至17中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之後的第1至約30天一天投與至少一次，或在該rAAV投與之後的1至30天一天投與至少一次。
技術方案19.  如技術方案12至17中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在rAAV投與之後投與至少30天，一天至少一次。
技術方案20.  如技術方案12至17中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在rAAV投與之後投與至少60天，一天至少一次。
技術方案21.  如技術方案12至17中任一項之方法，其中該消炎類固醇為糖皮質激素。
技術方案22.  如技術方案21之方法，其中該糖皮質激素為普賴松。
以下實例係為了說明，而非為了限制而提供。所述數值範圍包括各範圍內之各整數值且包括所述最低與最高整數。實例 實例 1 A)    AAVrh74.MHCK7. 微肌肉萎縮蛋白構築體的產生
AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白質體含有側接AAV2反向末端重複序列（ITR）之人類微肌肉萎縮蛋白cDNA表現卡匣（參見圖1）。微肌肉萎縮蛋白構築體之特徵在於框內桿缺失（R4-R23），而鉸鏈1、2及4及半胱胺酸富集域仍產生138 kDa蛋白質。微肌肉萎縮蛋白（3579 bp）之表現係由MHCK7啟動子（792 bp）引導。利用rAAV.MCK.微肌肉萎縮蛋白質體，藉由移除MCK啟動子且插入MHCK7啟動子來構築質體。在核心啟動子之後，存在53 bp內源小鼠MCK外顯子1（非轉譯）用於高效起始轉錄，繼之為SV40晚期16S/19S剪接信號（150 bp）及小5'UTR（61 bp）。內含子及5' UTR來源於質體pCMVβ（Clontech）。微肌肉萎縮蛋白卡匣具有緊接著ATG起點之前的共同Kozak，及用於mRNA終止的小型53 bp合成聚腺苷酸信號。人類微肌肉萎縮蛋白卡匣含有先前如以下文獻所述的（R4-R23/Δ71-78）域：Harper等人，（《自然醫學（Nature Medicine ）》8 , 253-261 (2002)）。互補DNA經密碼子最佳化以供人類使用且由GenScript（Piscataway, NJ）（《分子療法（Mol Ther ）》18 , 109-117 (2010)）合成。此載體中所含的唯一病毒序列係AAV2反向末端重複序列，其為病毒DNA複製與封裝所必需的。微肌肉萎縮蛋白卡匣具有用於mRNA終止的小型53 bp合成多聚腺苷酸信號。
先前研究已證實使用MHCK7啟動子達成心臟表現（Salva等人，分子療法（Mol Ther ）15 , 320-329 (2007)及AAVrh.74達成骨骼、隔膜及心肌表現（Sondergaard等人，《臨床及轉化神經學年鑒（Annals of clinical and Transl Neurology ）》 2 , 256-270 (2015)），圖1的構築體序列經衣殼體包裹於AAVrh.74病毒粒子中。自恆河猴淋巴結選殖AAVrh.74血清型之分子純系且論述於Rodino-Klapac等人，《轉化醫學雜誌（Journal of Translational medicine ）》5 , 45 (2007)中。表 1 顯示質體AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白（SEQ ID NO: 3）之分子特徵
表1.質體rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之分子特徵
類型 起點 終點 名稱 描述
區域 55 182 5' ITR 野生型AAV2反向末端重複序列
區域 244 1035 MHCK7 小鼠肌凝蛋白重鏈複合物 - E盒肌肉肌酸激酶融合增強子/啟動子
區域 1045 1194 嵌合內含子 來自人類β-血球蛋白基因之5'供體位點以及來自IgG重鏈可變區之分支點及3'剪接受體位點
基因 1205 4783 huDys cDNA 人類微肌肉萎縮蛋白cDNA
區域 4786 4838 聚腺苷酸 合成聚腺苷酸
區域 4894 5021 3' ITR 野生型AAV2反向末端重複序列
基因 6760 7619 AmpR β-內醯胺酶基因
區域 7823 8442 Ori 質體複製起點
B) 由編碼康黴素（ Kan ）抗性基因之質體產生 AAVrh74.MHCK7. 微肌肉萎縮蛋白構築體及編碼康黴素（ Kan ）抗性基因之質體
藉由自MHCK7.µDys.AMP質體及康黴素主鏈分離MHCK7.µDys片段且使用NEBuilder選殖工作流程將其黏接來達成MHCK7.µDys.KAN的選殖。MHCK7.μDys片段係經由SnaBI限制酶消化來分離。在37℃下，在1×CutSmart緩衝液（NEB）及1 μL SnaBI中，以50 μL總反應物進行消化1小時。所得片段經由電泳，使用1%瓊脂糖凝膠在105伏下跑電泳1.5小時來分離。切下對應於MHCK7.μDys插入物的色帶並且使用凝膠純化套組（Macherey-Nagel）進行純化。所得片段具有10 ng/µL的DNA濃度。在37℃下，在含有1×CutSmart緩衝液（NEB）及1 μL XbaI的50 μL反應物中，經由XbaI限制酶消化1小時，分離出Kan主鏈片段。所得片段經由電泳，使用1%瓊脂糖凝膠在105伏下跑電泳1.5小時來分離。切下對應於Kan主鏈之色帶並且經由凝膠純化套組（Macherey-Nagel）進行純化。所得片段具有8.1 ng/µL的DNA濃度。使用NEB Builder選殖工作流程將兩個片段黏接，該選殖工作流程能夠將兩個片段經由重疊序列接合。根據製造商方案，在1×NEBuilder HiFi DNA組裝預混液中使用1:1比率之MHCK7.μDys與康黴素主鏈，在50℃下執行NEBuilder選殖反應15分鐘，總反應體積為20 μL。藉由將2.5 μL選殖產物添加至細胞中，隨後在冰上保持30分鐘，接著在42℃下保持30秒且在冰上再保持5分鐘，將所得純系轉型至NEB®穩定感受態大腸桿菌（C3040）中。轉型之後，將950 μL生長培養基添加至細胞中並且允許在225 rpm振盪下，在30℃下生長1.5小時。生長之後，將450 μL此等細胞接種於50 μg/mL康黴素LB瓊脂盤上並且在乾燥培育箱中在30℃下培育隔夜。自此盤中挑選群落並且使其在含有50 μg/mL康黴素之LB中生長隔夜。使用QIAprep® Spin Miniprep套組（Qiagen）自3 mL此培養物中分離出DNA。使用此DNA確認選殖產物。經由PmeI、MscI及SmaI進行限制酶消化，隨後凝膠電泳來確認選殖產物。另外，經由定序確認選殖產物。所得質體闡述於SEQ ID NO: 8中且顯示於圖8及9中。如上文所述，將對應於SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977之序列的圖7之構築體序列經衣殼體包裹於AAVrh.74病毒粒子中。C ） pAAV.MCK. 微肌肉萎縮蛋白構築體的產生
藉由將驅動密碼子最佳化之人類微肌肉萎縮蛋白cDNA序列之MCK表現卡匣插入AAV選殖載體psub201（Samulski等人，《病毒學雜誌（J. Virol.）》61(10):3096-3101）中來構築pAAV.MCK.微肌肉萎縮蛋白質體。構築體中包括肌肉特異性調控元件以驅動肌肉特異性基因表現。此調控元件包含與351 bp MCK核心啟動子（近端）融合的小鼠MCK核心增強子（206 bp）。在核心啟動子之後，構築體包含53 bp內源小鼠MCK外顯子1（非轉譯）用於高效起始轉錄，繼之為SV40晚期16S/19S剪接信號（97 bp）及小5'UTR（61 bp）。內含子及5' UTR來源於質體pCMVβ（Clontech）。微肌肉萎縮蛋白卡匣具有緊接著ATG起點之前的共同Kozak，及用於mRNA終止的小型53 bp合成聚腺苷酸信號。人類微肌肉萎縮蛋白卡匣含有先前如Harper等人，《自然醫學（Nat. Med. ）》8(3):253-61, 2002所述的（R4-R23/Δ71-78）域。
pAAV.MCK.微肌肉萎縮蛋白質體含有側接AAV2反向末端重複序列（ITR）之人類微肌肉萎縮蛋白cDNA表現卡匣（參見圖5）。此序列經衣殼體包裹於AAVrh.74病毒粒子中。自恆河猴淋巴結選殖AAVrh.74血清型之分子純系且描述於Rodino-Klapac等人，《轉化醫學雜誌（Journal of Tran.Med. ）》 45 (2007)。D ）載體製備
在研究級條件下，利用HEK293細胞三重轉染方法來製備本文所述之研究用的載體。載體在製備之後的表徵包括用超螺旋標準藉由qPCR測定效價、內毒素水準測定（EU/mL）及無菌評估。所製成之載體藉由SDS-PAGE加以分析以驗證色帶圖案與所預期rAAV之一致性。此等研究中所用的替代載體rAAVrh74.MCHK7.uDYS.FLAG係如上文所述經由添加C端FLAG標籤來構築。實例 2 在非人類靈長類動物研究中具有免疫抑制性之 rAAVrh74.MCHK7. 微肌肉萎縮蛋白的全身基因遞送
此研究之原則目標係鑑別rAAV.rh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的最佳劑量、持續時間及免疫抑制療法，以及在血管內遞送之後最佳化基因表現。此研究初始使用5組恆河猴（每組n=3），載體投與之前與之後的免疫抑制持續時間不同（表1）。恆河猴在本文中稱為「非人類靈長類動物」或NHP。 非人類靈長類動物之轉殖基因遞送最佳化研究
遞送途徑 免疫抑制治療計劃 持續時間 動物品系 劑量 （vg kg） # 治療終點 分析
IM (效能) N/A 30天 mdx 1 x 1011 3 1 mo IF
IV (功效) 普賴松 基因轉移前的1天至基因轉移後的30天 恆河猴 - 3 3 mo H&E、Path、生物分佈、西方墨點法、化學、免疫學
IV (功效) 普賴松 基因轉移前的1天至基因轉移後的60天 恆河猴 2 x 1014 3 3 mo H&E、Path、生物分佈、西方墨點法、化學、免疫學
IV (功效) 普賴松 基因轉移前的14天至基因轉移後的60天 恆河猴 2 x 1014 3 3 mo H&E、Path、生物分佈、西方墨點法、化學、免疫學
IV (功效) 利妥昔單抗， 西羅莫司，普賴松 ++ 恆河猴 2 x 1014 3 3 mo H&E、Path、生物分佈、西方墨點法、化學、免疫學
IV (對照) N/A N/A 恆河猴 2 x 1014 3 3 mo H&E、Path、生物分佈、西方墨點法、化學、免疫學
++ 利妥昔單抗：兩次。注射前的10-14天以及注射當天一次。西羅莫司：注射前的3天直至活檢。普賴蘇穠：注射前的1天直至注射後的30天。 IF：免疫螢光。H&E： 蘇木精-伊紅染色。Path：正式組織病理學
在第1組中，對照獼猴血管內給予2x1014 vg/kg的rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白至頭靜脈或隱靜脈，而不添加免疫抑制劑（n=2）。在所有其他群組中，獼猴亦接受2x1014 vg/kg之rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白的靜脈內注射，連同免疫抑制劑一起遞送至頭靜脈或隱靜脈。
在第2組（n=3）中，全身性基因轉移之前的1天直至基因轉移後的30天，經口給予普賴松（每天2 mg/kg）。在第3組（n=3）中，在全身性基因轉移之前的1天直至基因轉移後的60天，經口給予普賴松（每天2 mg/kg）。在第4組（n=3）中，在全身性基因轉移之前的14天直至基因轉移後的60天，經口給予普賴松（每天2 mg/kg）。
第5組（n=3）研究三重免疫抑制療法。在此組中，利妥昔單抗（750 mg/m2）經由血管內輸注給予兩個劑量療程（在載體投與之前的14天及7天），以及基因轉移之前，投與載體當天的第三次劑量。若抗體對前三次劑量無反應，則可在輸注後，第四次投與利妥昔單抗。投與載體之前的3天，經口給予西羅莫司（每天4 mg/m2 ）且繼續給予直至抗體減少。投與載體之前的1天直至投與載體之後的30天，經口給予普賴松（每天2 mg/kg）。
治療之後，所有群組經歷脛前肌（TA）及/或腓腸肌（gn）的穿刺活組織切片檢查。基因轉移之前收集切片且在第6、8及12週，在基因轉移後收集至多三次。抽取血液用於免疫學、CBC及化學分析，至少兩週一次。
對血液樣品執行以下血液學量測：紅血細胞（紅血球）計數、血紅素、血容比、平均紅血球體積、平均紅血球血紅素、平均紅血球血紅素、濃度、紅血球分佈寬度、絕對網狀紅血球計數、血小板計數、白血細胞計數、絕對嗜鹼性球計數、絕對大未染色細胞計數及血液塗片。
對血液樣品執行以下臨床化學量測：葡萄糖、尿素氮、總蛋白質、白蛋白、球蛋白、白蛋白:球蛋白比率、總膽紅素、丙胺酸轉胺酶、麩胺酸去氫酶、膽固醇、γ麩胺醯基轉移酶、天冬胺酸轉胺酶及鹼性磷酸酶。安全概況及轉導效率
所有群組對AAVrh.74的總抗體反應（抗AAVrh.74抗體）相似，無證據表明異常觀測，但第2組之一個NHP（NHP_03）對AAVrh.74未建立抗體反應。另外，第5組NHP儘管正用三重免疫抑制療法治療，但對AAVrh.74展現的抗體反應與第1組至第4組NHP中所觀測到的抗體反應相似。第1組至第4組NHP所經歷的副作用包括短暫升高的丙胺酸轉胺酶（ALT）及天冬胺酸轉胺酶（AST）肝酶。第1組兩個NHP（NHP_12、NHP_13）、第3組一個NHP（NHP_06）及第4組一個NHP（NHP_07）在基因轉移後的第12週顯示升高的ALT及AST肝酶。就轉導效率而言，在基因轉移後的第12週，未觀測到第1組至第5組NHP之間在載體基因體複本數（vg複本/µg DNA）上存在統計學顯著差異（P＞0.05）。實例 3 治療性血漿置換（ TPE ）的投與
此研究的原則目標是，在使用治療性血漿置換（TPE）移除預先存在之AAV抗體的情況下再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之後，使技術與基因表現均最佳化；以及評價在不使用TPE情況下的再次給藥。
實例2所述之研究中先前注射rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之非人類靈長類動物（來自第2組、第3組及第4組）在一個血球分離程序期間經歷2-3次TPE。TPE之前的四週及兩週，靈長類動物經歷最多的血液抽取（靈長類動物體重的10%）。血液在ACDA溶液中保存最多30天且在TPE當天用於灌注血球分離機，以便防止在程序期間發生過度的血液損失。另外，為了驗證效價而量測之AAVrh.74結合抗體效價測定大於1:400，此為當前臨床試驗中之納入準則的臨限值。TPE後，經由隱靜脈或頭靜脈全身性遞送2x1014 vg/kg rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白或rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白.FLAG。
此等NHP在TPE之前1天直至TPE及基因轉移後的第30天亦接受普賴松（2 mg/kg），每天一次。TPE前、TPE後且再次給藥之前，至少兩週一次抽取血液供化學、CBC、ELISA及ELISpot分析，直至終點。終點介於第二次基因轉移後的第8週與第12週之間且包括充分的屍體剖檢。為了評價功效，針對載體基因體及FLAG免疫螢光執行西方墨點法及qPCR。
另外，實例2中所述之預先注射同時接受免疫抑制療法的非人類靈長類動物（第5組）再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白，而不使用TPE降低預先存在之針對AAVrh.74的抗體。特定而言，利妥昔單抗（每天750 mg/m2 ）在基因轉移之前的第7及14天血管內（IV）遞送，注射當天一次且在基因轉移之後一次，西羅莫司（每天4 mg/m2 ）在基因轉移前的3天遞送且持續至研究結束。經由血液收集來監測西羅莫司水準，其在3至14 ng/mL之間變化。抽取血液供化學、CBC、西羅莫司血液水準、ELISA及ELISpot分析，至少兩週一次，直至終點。終點介於第二次基因轉移後的第8週與第12週之間且包括充分的屍體剖檢。每天對每個動物進行觀測。監測NHP體重，兩週一次，且相應地調整免疫抑制藥物的劑量。 治療性血漿置換程序 ：
在TPE過程中，經由血管通路移除全血且隨後經由血球分離機內的離心機離心，在離心機中移除血漿（抗體）。將紅血細胞連同用於維持靈長類動物之體液的置換體液（人類白蛋白）一起遞送回去。由於非人類靈長類動物體型小（小於10 kg），因此為了確保安全及減少自靈長類動物所抽取之血液的量，在進行血漿置換之前用保藏的血液灌注血球分離機。血球分離術之前的第28及14天，進行最大量血液收集（非人類靈長類動物循環血液之10%）。所收集之全血在抗凝血劑酸-檸檬酸鹽-右旋糖（ACDA）溶液中、在4℃下保存且儲存不超過30天。另外，向NHP提供額外的富鐵增補劑及富集。在血球分離術當天，非人類靈長類動物肌內接受鎮靜劑特拉唑（3-6mg/kg），插管且緊固至加熱的手術台。使用含有異氟醚的氧氣1-4%來維持麻醉。將血管導管置於雙腿（隱靜脈）中，一個出入孔抽出全血且第二個出入孔位於另一腿中以再次遞送紅血細胞及置換液。在整個手術期間，將其他導管置於臂（頭靜脈）中用於支持體液及血液抽吸。獲得血管通路之後，向動物給予肝素（50-100 U/kg）以在血球分離術期間維持充分的血液流動且防止凝固。利用體溫、ECG及呼吸來監測NHP，以確定適當的麻醉平面。
如上文所提及，經由導管將NHP連接至COBE Spectra血球分離機且用預先收集的血液灌注機器。一次總血漿置換量等於被移除與被置換一次之循環血液的總量。為了達成98%的抗體移除估計值，進行兩至三次血漿置換。每次完成置換之後，收集血液用於血液化學分析及血清抗體測試。血漿置換後立即將NHP與血球分離單元斷開連接且全身性再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。載體遞送後，移除所有導管，提供壓力以控制出血。監測動物直至完全走動。 屍體剖檢分析
就屍體剖檢而言，在終點時，將優沙索（Euthasol）（1mL/101b）給予NHP（可在再投藥後的8-12週之間進行）。收集血液且將全血送交全血球計數（CBC）分析、西羅莫司測試水準及血清化學分析。接著收集組織且送交獨立獸醫學組織病理學家分析且分析基因及蛋白質表現以評價功效及毒性。
為了評價基因表現最佳化，自靜脈內給予及再次給予2x1014 vg/kg rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白或rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白.FLAG的NHP收集給藥前及給藥後肌肉切片。自給藥前及所有給藥後肌肉組織中提取DNA用於即時定量qPCR以偵測載體DNA之特定序列。自所收集的所有肌肉中提取蛋白質且相較於給藥前的切片組織，執行西方墨點分析以偵測微肌肉萎縮蛋白（138 kD）。另外，未處理的全長肌肉萎縮蛋白（427 kD）用作正常對照且與微肌肉萎縮蛋白進行定量比較，作為基因表現的結果量度。對rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白.FLAG輸注的靈長類動物進行免疫螢光染色以觀測FLAG表現的存在。
為了評價免疫抑制療法、載體投與及再次給藥的安全，在基線時及兩週一次抽取血液直至終點。在兩種目標的研究期間，兩週一次監測血清化學、CBC及西羅莫司水準。利用ELISpot分析評價針對AAVrh.74肽與微肌肉萎縮蛋白肽的T細胞反應。最後，在兩種目標的研究期間，兩週一次監測抗AAVrh.74抗體反應。
對血液樣品執行以下血液學量測：紅血細胞（紅血球）計數、血紅素、血容比、平均紅血球體積、平均紅血球血紅素、平均紅血球血紅素、濃度、紅血球分佈寬度、絕對網狀紅血球計數、血小板計數、白血細胞計數、絕對嗜鹼性球計數、絕對大未染色細胞計數及血液塗片。
對血液樣品執行以下臨床化學量測：葡萄糖、尿素氮、總蛋白質、白蛋白、球蛋白、白蛋白:球蛋白比率、總膽紅素、丙胺酸轉胺酶、麩胺酸去氫酶、膽固醇、γ麩胺醯基轉移酶、天冬胺酸轉胺酶及鹼性磷酸酶。結果
NHP在TPE之前及TPE之後（再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之前）針對AAVrh.74的總抗體效價提供於下表中。圖11提供NHP在再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之後針對AAV74的抗體效價。NHP中可執行的TPC循環次數因缺乏可利用的供者血液而受到限制。在人類中可投與多輪TPE。實例2中偵測的效價係在初始基因轉移後的12週獲得（*）。實例3中偵測的效價係在再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白注射之前獲得（+）。NHP_03因缺乏針對AAVrh.74的抗體反應而再次給藥，但不預先進行TPE。NHP_06因體型小且血管通路不良而僅經歷0.5個TPE循環。
NHP (群組) 基因療法之後的效價(實例2)* TPE之後的效價(實例3)+ TPE循環次數
NHP_01(2) 1:51200 1:800 2.5
NHP_02(2) 1:6400 1:400 3
NHP_03(2) 1:50 NA NA
NHP_04(3) 1:12800 1:800 3
NHP_05(3) 1:25600 1:400 3
NHP_06(3) 1:25600 NA 0.5
NHP_07(4) 1:12800 1:1600 3
NHP_08(4) 1:12800 1:200 3
NHP_09(4) 1:12800 1:200 3
TPE程序通常具有良好耐受性。不存在異常的免疫觀測，如根據針對AAVrh.74及來自周邊血液單核細胞之微肌肉萎縮蛋白肽的IFN-ꝩ斑點形成細胞（SCF）水準所評估。TPE之後的再次給藥使得以下NHP中的肝酶水準（ALT/AST）提高：NHP_01及NHP_02（第2組）；NHP_04（第3組）；NHP_08及NHP_09（第4組）。此經由持續每天投與普賴松而解決。
第5組NHP因與利妥昔單抗之先前治療的不相容性而不接受TPE且兩個NHP（NHP_10、NHP_11）再次給藥。第5組之針對AAVrh.74的總抗體效價高於再次給藥之前的1:51,200。以高抗體效價（第5組）再次給藥的NHP經歷以下不良事件：心率及通氣率提高、嘔吐、遞送部位附近出現皮疹、蒼白，及呼吸較淺；在苯海拉明（diphenhydramine）及地塞米松（dexamethasone）投與之後解決。
七個NHP經歷2-3次連續TPE循環，使得針對AAVrh.74之循環抗體水準降低。緊接著TPE之後，將rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白成功地再次給予NHP。在來自第4組的兩個NHP（NHP_08及NHP_09）中，達成1:200的抗體效價。
如圖12中所示，相較於TPE之前來自第12週時之切片之表現，在TPE之後再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之所有NHP的組織樣品中觀測到微肌肉萎縮蛋白的表現增加（如實例2中所述）。觀測到骨骼肌（例如腓腸肌）、心臟及隔膜中的微肌肉萎縮蛋白表現增加。實例 4
可替代地，利用SEQ ID NO: 9中所示、SEQ ID NO: 8、核苷酸1-4977中所示或SEQ ID NO: 6、核苷酸56-5022中所示之rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體執行上述實例2及3中所述的試驗及研究。實例 5 治療性血漿置換（ TPE ）之後，針對預先存在 AAVrh.74 抗體之 DMD 的基因療法
對人執行1期臨床試驗，以便研究治療性血漿置換（TPE）之後，針對預先存在AAVrh.74抗體之患者之DMD的基因療法。假設五次TPE循環將降低抗體對AAVrh.74的結合（在本文中亦稱為「抗AAVrh.74抗體」），從而允許使用AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之肌肉達成安全且高效的轉導，以相較於基線達成＞50%的平均表現量。
研究目標及主要結果為攜載微肌肉萎縮蛋白基因（AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白）之rAAV的安全遞送。次要目標為罹患DMD之個體之肌肉中的微肌肉萎縮蛋白基因表現及針對肌肉營養不良症（NSAA）使用北極星走動評估作為功能結果量度的臨床改善。
治療計劃為兩步（週）方案，其合併了安全及功效（表1）以首先藉由10天時程的血球分離術減少AAVrh.74抗體，隨後靜脈內遞送AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。第1週，隔日投與TPE 3天，諸如星期一（第-9天，相對於基因療法輸注日）、星期三（第-7天）、星期五（第-5天）。第2週，隔日投與TPE兩天，隨後靜脈內輸注AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白，諸如星期一（第-2天）、星期三（第1天），TPE之後的同一天遞送AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白（第1天）。根據表1中的時程，將患者帶到門診血球分離單位。患者在第1天住入兒科加護病房（PICU）進行住院患者基因療法輸注，第2天計劃出院。表 1. 血球分離時程
   星期一 星期二 星期三 星期四 星期五 星期六 星期日
第1週 血球分離術 （#1） *實驗室 結合Abs AAV** 血球分離術 （#2） *實驗室    血球分離術 （#3） *實驗室      
第2週 血球分離術 （#4） *實驗室 結合 Abs AAV** 血球分離術 （#5） *實驗室 ***基因療法      
Figure 02_image001
* 手術之前的實驗包括纖維蛋白原及差分CBC及血小板；在手術期間定期量測離子化鈣 ** AAVrh.74抗體水準＜1:100以容許基因遞送 ***基因遞送 ****替補時程
此方案已基於IgG抗體之動力學開發，表明在48小時之後存在反彈，先前程序移除的抗體約50-60%恢復；因此支持10天療程隔日進行TPE，隨後在最終的TPE當天（就基因療法而言為指定的第1天）進行基因遞送（圖13且參見置換體積）。此等程序的時序與其他已知的抗體介導醫學病狀遵循類似的療程（Padmanabhan等人，《臨床血球分離術雜誌（J Clin Apheresis）》34:171-354, 2019）。
由於此方案是針對新的適應症開發，因此遵循先前已確立的指導原則是適當的，該等指導原則反覆地推薦5-6次（Padmanabhan等人，《臨床血球分離術雜誌（J Clin Apheresis）》34:171-354, 2019）至5-7次治療（Pham等人，《輸注及血球分離術科學（Transfusion and Apheresis Science）》58:237-246, 2019）。此方案中適用於服用普賴松以達成免疫抑制狀態之個體的其他證據在於，作為並行免疫抑制療法的結果，假設免疫球蛋白的產生速率可以忽略，並且血管外相對於血管內平衡的速率為每小時約1至2%，接著需要7至10天的五次各別手術以移除身體免疫球蛋白初始總負荷的90%。若出現新的抗體產生，則可能需要額外的治療。（Fridey及Kaplan，治療性血球分離術（血漿置換或細胞分離術）：適應症及技術（Therapeutic apheresis (plasma exchange or cytapheresis): Indications and technology）美國血球分離術協會指導原則（American Society for Apheresis Guidelines），2020年5月更新（可在線獲取）（Kaplan等人，《臨床血球分離術雜誌（J Clin Apheresis）》28:3-10, 2013）方案
用於此方案的患者特徵：納入準則 ● 篩選時年齡4-10歲（包括端點）的能走動男性個體，任何種族 ● 經確認的DMD 框移或過早的終止密碼子基因突變 ● CK ＞1000 U/L ● 根據年齡進行100 m行走測試時預測的低於95百分位數指示有症狀的疾病 ● 能夠配合運動評估測試 ● 基於跑步、跳躍及爬樓困難之歷史證明的無力 ● 篩選之前口服穩定劑量當量之皮質類固醇至少12週，且預計該劑量在整個研究期間保持恆定（為了適應體重變化而進行的潛在修改除外）。 ● 如在基線篩選時（第-40天至第-10天）藉由ELISA免疫分析所測定，AAVrh.74抗體效價＞1:400的患者排除標準 ● 心肌病跡象，包括LVEF＜40%的ECHO ● 人類免疫缺乏病毒（HIV）感染或B型或C型肝炎感染的血清學證據 ● 自身免疫疾病之診斷（或持續存在之治療）。 ● 被認為臨床上顯著的異常實驗室值（γ-麩胺醯基轉移酶＞3×正常值上限，膽紅素≥3 mg/dL，肌酐≥1.8 mg/dL，血紅素＜8或＞18 g/dL，白血細胞計數＞18,500/cmm，血小板≤50,000/微升。 ● PI認為對基因轉移產生不必要風險之伴隨疾病或需要慢性藥物治療。 ● 前4週內的重度感染（例如肺炎、腎盂腎炎或腦膜炎）。 ● 在篩選6個月內，在實驗或其他方面已接受任何研究性藥物（除皮質類固醇之外）或外顯子跳過藥物（包括EXONDYS 51®）。 ● 已接受任何類型的基因療法、基於細胞的療法（例如幹細胞移植）或CRISPR/Cas9療法。 ● 家人不希望主治醫師及其他醫療提供者披露患者參與研究的情況。篩選 / 基線期
篩選/基線期為第-9天之前至多4週。獲得知情同意書之後，評價患者的資格。篩選包括收集人口統計資料及病歷、生命跡象量測值、體檢、心電圖（ECG）及心臟超音波檢查（ECHO）及心臟MRI。收集血液及尿液樣品用於臨床及安全實驗室評估。亦收集血液樣品用於量測B型及C型肝炎、人類免疫缺乏病毒（HIV），以及針對AAVrh.74的抗體及針對AAVrh.74衣殼及微肌肉萎縮蛋白的抗原特異性T細胞。預處理的肌肉切片涉及腓腸肌肌肉，或主要研究者（PI）選擇的肌肉，且在資格審查之後，但在第-9天之前執行。要求父母/照護者完成PROMIS問卷。身體功能評估包括針對肌肉營養不良症的北極星走動評估（NSAD），及計時功能測試，包括自地板上起身、上升4個標準台階、10公尺及100公尺行走/跑步測試。治療性血漿置換
TPE涉及移除患者血漿及用5%白蛋白置換。若患者安全需要，則在任一個TPE程序期間可以使用新鮮冷凍血漿（FFP）。根據美國食品及藥物管理局（FDA）的規定，在血漿置換期間移除的血漿不得用於輸注至另一位個體。方案
可能時，經由周邊靜脈執行TPE。更多可能的患者將由介入放射醫師置於穿隧中心線。向父母說明在約診之間如何注意導管。置換體積 -
根據程序執行1.0至1.5個血漿置換體積的血漿置換。單次血漿置換將血漿巨分子水準降低63%（《臨床血球分離術雜誌（J Clin Apheresis）》2019;34:171-354）。分佈於血管內與血管外隔室中的IgG抗體需要多次置換來減少身體總儲備且通常隔日執行以允許在兩種隔室之間再分佈。最初1.0至1.5個血漿體積的置換可移除最高體積的目標物質，隨後每次置換所移除的量遞減。每次單一血漿體積置換均使用相同體積的置換液。就此方案而言，使用5%白蛋白作為置換液。
為了獲得持續反應，建議免疫抑制性療法。若無免疫抑制，則置換後會存在反彈，但參與此計劃的所有DMD男孩將服用糖皮質激素作為標準疾病療法。在血漿置換實驗方案期間，安排患者在TPE之前的一天服用糖皮質激素（1 mg/kg普賴松，或等效的皮質類固醇）。除非PI判斷為最受患者關注的較早縮減，否則患者將在基因轉移之後、基因遞送後維持此劑量至少60天。（表1）.
在患者的進一步關注中，提供一種替代計劃（稱為「替補時程」），其可能會延遲基因遞送且提供#7 TPE以允許基因療法繼續進行。若血球分離術#4之後的第-1天未達到標靶AAVrh.74效價，則將執行TPE #5，而不進行基因遞送。第2天（星期四）獲得AAV抗體水準，隨後在星期五進行血球分離術、TPE#6及基因遞送。然而，若在星期四（第2天），效價尚未達到1:100目標，則吾等在星期五不進行TPE或基因遞送。基因遞送
此為52週開放標記臨床試驗。招募六至十二位符合資格要求的患者來接受IV AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。第-1天，作為門診患者，進行體檢，收集生命跡象、血樣和尿樣。第1天，患者入院。根據IRB及FDA核准之先前方案所用的研究操作手冊，早晨執行第五次及最終TPE且同一天稍晚接受靜脈內投與1至2小時的AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。在輸注之後的當天（第2天），患者接受體檢，收集生命跡象且在出院之前提供血液及尿液樣品。
追蹤患者452週且接著轉至長期隨訪研究5年。患者在基因遞送後完成臨床隨訪問診：第1、2、4、6、8、10、12、24、36及48週（相對於第1天的輸注）。另外，在第3及5週，患者完成隨訪問診用於評估肝功能測試。第12週獲取所有患者的肌肉切片。切片涉及腓腸肌肌肉，或PI選擇的肌肉。 藉由監測治療引發的不良事件（TEAE）、SAE及所選實驗室評估來評估安全。實例 6 夾層 ELISA 測定血清中的抗體
用於夾層ELISA分析的材料如下： ● 捕捉抗體 = 抗AAVrh.74 mAb ● 測試樣品 = 血清或血漿，將用於偵測 ● 抗原 = AAVrh.74衣殼 ● 阻斷溶液 = 5%乳粉、1%山羊血清、100 mL PBS ● 洗滌緩衝液 = 0.05% PBS-Tween ● 陽性對照 = 已知含有抗AAVrh.74抗體的血清 ● 二級抗體 = 抗人類-HRP偶聯抗體 ● 受質 = TMB ● 終止溶液 = 硫酸方法
96孔盤的所有孔在4℃下用碳酸鹽緩衝液中稀釋的捕捉抗體塗佈隔夜。丟棄內含物，且在37℃下用阻斷溶液阻斷培養盤1小時。丟棄阻斷溶液，將AAVrh.74衣殼雙重複添加至捕捉抗體塗佈的孔中。另外，將碳酸鹽緩衝液添加至雙重複孔中以測定背景值。丟棄未結合的衣殼且以1:25之起始稀釋度將測試血清添加至阻斷溶液中且連續稀釋。陽性對照物在阻斷溶液中稀釋以1:400稀釋度稀釋。培養盤用洗滌緩衝液洗滌，隨後在阻斷溶液中以1:10,000之稀釋度進行二次培育。洗滌培養盤且丟棄緩衝液，且添加受質，隨後用硫酸終止分析。在450 nm讀取培養盤吸光度。分析及結果
藉由自抗原塗佈孔之平均OD減去非抗原塗佈孔之平均光學密度（OD）且除以非抗原塗佈孔之平均值（OD）來測定吸光度比。≥2.00的比值視為陽性抗體反應。藉由鑑別產生≥2.00比值之最後一次血清稀釋度來測定終點效價。在＞1:400的血清稀釋度下定義抗體截止值。實例 8 ：間接 ELISA ：測定血清中的抗 AAVrh.74 抗體
材料 ● 抗原 = AAVrh.74衣殼 ● 阻斷溶液 = 5%乳粉、1%山羊血清、100 mL不含鈣及鎂的PBS ● 洗滌緩衝液 = 0.05% PBS-Tween ● 一級抗體 = 人類測試血清或血漿 ● 陽性對照 = 抗AAVrh74 mAb或視情況為含有抗rh74抗體的血清（或血漿） ● 陰性對照：不含抗AAVrh74抗體的個體血清可作為陰性對照納入 ● 二級抗體 = 抗人類抗體 ● 受質 = 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB） ● 終止溶液 = 硫酸
方法
96孔盤內的雙重複孔用碳酸鹽緩衝液中稀釋之濃度為每孔2x109 vg之抗原塗佈隔夜。另外，將碳酸鹽緩衝液添加至雙重複孔中以測定背景值。丟棄抗原且用阻斷溶液阻斷孔。丟棄阻斷溶液且一級抗體（測試血清）以1:25之起始稀釋度添加於阻斷溶液中且連續稀釋。陽性對照物在阻斷溶液中以1:400稀釋度稀釋（若使用血清）或例如以1:1,000-1:10,000稀釋度稀釋（若使用AAVrh.74 mAb）。應認識到，抗AAVrh.74 mAb的特定稀釋度可視情況利用含有抗AAVrh.74抗體作為參考物的血清或血漿來確定。培養盤用洗滌緩衝液洗滌，隨後在阻斷溶液中以1:10,000之稀釋度進行二次培育。洗滌培養盤且丟棄緩衝液，且添加受質，隨後用硫酸終止分析。在450 nm讀取培養盤吸光度。
分析及結果
藉由自抗原塗佈孔之平均OD減去非抗原塗佈孔之平均光學密度（OD）且除以非抗原塗佈孔之平均值（OD）來測定吸光度比。比值≥2.00視為陽性抗體反應，且出現此類陽性反應的血漿或血清樣品視為血清反應陽性。藉由鑑別產生≥2.00比值之最後一次血清稀釋度來測定終點效價。在＞1:400的血清稀釋度下定義抗體效價截止值。換言之，在1:400之血清稀釋度下具有≥2.00之比值的個體被認為呈血清反應陽性且排除接受基於rAAVrh.74的基因療法。實例 8 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 構築
構築含有密碼子最佳化全長人類SCGB cDNA的轉殖基因卡匣，如圖10中所示。卡匣包括共同Kozak序列（CCACC）、SV40嵌合內含子、合成聚腺苷酸化位點，及用於驅動卡匣表現的肌肉特異性MHCK7。此為基於MCK的啟動子，其使用獲自轉錄起點5'約1.2 kb的206-bp增強子，該轉錄起點位於具有近端啟動子的內源肌肉肌酸激酶基因（enh358MCK，584-bp）內。卡匣封裝於與AAV8 93%同源的自互補（SC）AAVrh.74載體內。AAVrh.74在小鼠及非人類靈長類動物中已顯示為安全且有效的，尤其是當經由循環遞送至肌肉時，在穿越血管障壁時為安全且有效的。
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atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca gaagaagact       60 tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat cgagaatctg      120 ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact gactggccag      180 aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaagct      240 ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac tgatatcgtg      300 gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca ctggcaggtg      360 aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga gaagatcctg      420 ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat taacttcact      480 acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag gcctgatctg      540 ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga acatgccttc      600 aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga tgtggacact      660 acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca ggtgctgcca      720 cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc ccccaaagtg      780 actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca gattaccgtg      840 agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa gtcctacgct      900 tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt tccatcccag      960 cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag cgaggtgaat     1020 ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag tgctgaagac     1080 acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga tcagttccac     1140 acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg caatatcctg     1200 cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga aacagaagtg     1260 caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc tagtatggag     1320 aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact gaaagagctg     1380 aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga gccactggga     1440 cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca ggaggatctg     1500 gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt ggacgaatct     1560 agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg ggaccggtgg     1620 gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat cctgctgaaa     1680 tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga gaaagaggac     1740 gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct gtctagcctg     1800 cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat gggcaaactg     1860 tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac ccagaagaca     1920 gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa actggagaaa     1980 agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac ccagacaacc     2040 gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa acatgcccag     2100 gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct gcaggagctg     2160 caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat taaggggtct     2220 tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga aaaggtgaag     2280 gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa cgatctggct     2340 agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac actggaggac     2400 ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg gcagctgcat     2460 gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc cgtgcagggg     2520 ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca cgagacccag     2580 accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc cgatctgaac     2640 aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca gaaggccctg     2700 tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca taatctgaag     2760 cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac tatctacgac     2820 aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga tatgtgcctg     2880 aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt gctgagtttt     2940 aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag gtacctgttc     3000 aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact gctgctgcat     3060 gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg atctaacatc     3120 gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat cgaggctgct     3180 ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc tgtgctgcac     3240 agagtggctg ccgccgaaac tgccaagcac caggctaaat gcaacatctg caaggaatgt     3300 cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat ttgccagagc     3360 tgcttctttt ccggaagagt ggccaaagga cacaagatgc actaccctat ggtggaatat     3420 tgcaccccaa ctacatctgg cgaagatgtg cgcgattttg ccaaggtgct gaagaataag     3480 tttcggacta agaggtactt cgccaagcac ccccgcatgg ggtatctgcc agtgcagaca     3540 gtgctggaag gagacaatat ggagaccgat acaatgtga                            3579 ＜210＞  SEQ ID NO: 2 ＜211＞  810 ＜212＞  DNA ＜213＞  腺相關病毒 ＜400＞  2 gtttaaacaa gcttgcatgt ctaagctaga cccttcagat taaaaataac tgaggtaagg       60 gcctgggtag gggaggtggt gtgagacgct cctgtctctc ctctatctgc ccatcggccc      120 tttggggagg aggaatgtgc ccaaggacta aaaaaaggcc atggagccag aggggcgagg      180 gcaacagacc tttcatgggc aaaccttggg gccctgctgt ctagcatgcc ccactacggg      240 tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt      300 aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctctaaa aataaccctg      360 tccctggtgg atcccctgca tgcgaagatc ttcgaacaag gctgtggggg actgagggca      420 ggctgtaaca ggcttggggg ccagggctta tacgtgcctg ggactcccaa agtattactg      480 ttccatgttc ccggcgaagg gccagctgtc ccccgccagc tagactcagc acttagttta      540 ggaaccagtg agcaagtcag cccttggggc agcccataca aggccatggg gctgggcaag      600 ctgcacgcct gggtccgggg tgggcacggt gcccgggcaa cgagctgaaa gctcatctgc      660 tctcaggggc ccctccctgg ggacagcccc tcctggctag tcacaccctg taggctcctc      720 tatataaccc aggggcacag gggctgccct cattctacca ccacctccac agcacagaca      780 gacactcagg agccagccag cggcgcgccc                                       810 ＜210＞  SEQ ID NO: 3 ＜211＞  8562 ＜212＞  DNA ＜213＞  腺相關病毒 ＜400＞  3 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgcgcgc       60 tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc      120 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc      180 cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctacg tagccatgct ctagagttta      240 aacaagcttg catgtctaag ctagaccctt cagattaaaa ataactgagg taagggcctg      300 ggtaggggag gtggtgtgag acgctcctgt ctctcctcta tctgcccatc ggccctttgg      360 ggaggaggaa tgtgcccaag gactaaaaaa aggccatgga gccagagggg cgagggcaac      420 agacctttca tgggcaaacc ttggggccct gctgtctagc atgccccact acgggtctag      480 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc      540 agacatgtgg ctgccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct      600 ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg      660 taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca      720 tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac      780 cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca      840 cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca      900 ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat      960 aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac     1020 tcaggagcag ccagcggcgc gcccaggtaa gtttagtctt tttgtctttt atttcaggtc     1080 ccggatccgg tggtggtgca aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg cctttacttc     1140 taggcctgta cggaagtgtt acttctgctc taaaagctgc ggaattgtac ccgcggccgc     1200 caccatgctg tggtgggagg aggtggagga ttgttatgaa agggaggacg tgcagaagaa     1260 gacttttacc aagtgggtga acgctcagtt cagcaaattt gggaagcagc acatcgagaa     1320 tctgttttcc gacctgcagg atgggagacg gctgctggat ctgctggaag gactgactgg     1380 ccagaagctg cccaaagaga aggggagcac tagggtgcac gccctgaaca acgtgaacaa     1440 agctctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggatctggtg aatattggca gtactgatat     1500 cgtggacggg aaccacaaac tgacactggg cctgatctgg aacattattc tgcactggca     1560 ggtgaaaaat gtgatgaaga acatcatggc cgggctgcag cagaccaatt ccgagaagat     1620 cctgctgtct tgggtgcggc agagcacccg caactatccc caggtgaacg tgattaactt     1680 cactacatcc tggagcgacg ggctggccct gaatgctctg attcacagcc acaggcctga     1740 tctgttcgac tggaatagcg tggtgtgcca gcagtctgcc acacagcgcc tggaacatgc     1800 cttcaatatc gctcggtacc agctggggat cgaaaaactg ctggacccag aggatgtgga     1860 cactacatac ccagataaaa agtctattct gatgtacatt actagcctgt tccaggtgct     1920 gccacagcag gtgtctattg aagccattca ggaggtggaa atgctgcccc gcccccccaa     1980 agtgactaaa gaggagcatt ttcagctgca tcatcagatg cattacagcc agcagattac     2040 cgtgagcctg gctcagggat atgagcgcac cagtagtcca aaaccacggt tcaagtccta     2100 cgcttatacc caggctgcct acgtgacaac tagcgaccct actagatccc cctttccatc     2160 ccagcacctg gaggccccag aggacaagag ctttgggtcc agcctgatgg aaagcgaggt     2220 gaatctggat cggtaccaga cagccctgga ggaggtgctg agctggctgc tgagtgctga     2280 agacacactg caggcccagg gcgaaatttc caatgacgtg gaagtggtga aggatcagtt     2340 ccacacacac gagggctata tgatggacct gacagctcac caggggcgcg tgggcaatat     2400 cctgcagctg ggctctaaac tgatcggcac cgggaaactg agtgaggacg aggaaacaga     2460 agtgcaggag cagatgaacc tgctgaacag ccgctgggag tgtctgagag tggctagtat     2520 ggagaagcag tccaacctgc accgggtgct gatggacctg cagaaccaga aactgaaaga     2580 gctgaacgac tggctgacaa agactgagga acgcacaagg aagatggagg aggagccact     2640 gggacccgac ctggaggatc tgaagagaca ggtgcagcag cataaggtgc tgcaggagga     2700 tctggaacag gagcaggtgc gggtgaactc cctgacacat atggtggtgg tggtggacga     2760 atctagtgga gatcacgcca ccgccgccct ggaggaacag ctgaaggtgc tgggggaccg     2820 gtgggccaac atttgccggt ggaccgagga caggtgggtg ctgctgcagg acatcctgct     2880 gaaatggcag aggctgaccg aggagcagtg tctgtttagt gcttggctga gcgagaaaga     2940 ggacgccgtg aacaagatcc acacaaccgg ctttaaggat cagaacgaaa tgctgtctag     3000 cctgcagaaa ctggctgtgc tgaaggccga tctggagaaa aagaagcaga gcatgggcaa     3060 actgtatagc ctgaaacagg acctgctgag caccctgaag aacaagagcg tgacccagaa     3120 gacagaagcc tggctggata actttgcccg ctgctgggac aacctggtgc agaaactgga     3180 gaaaagtaca gctcagatct ctcaggctgt gaccacaacc cagcctagcc tgacccagac     3240 aaccgtgatg gaaaccgtga ccaccgtgac aacccgcgaa cagatcctgg tgaaacatgc     3300 ccaggaagag ctgccacctc cacctcccca gaagaagaga accctggagc ggctgcagga     3360 gctgcaggaa gccactgacg aactggacct gaagctgagg caggccgaag tgattaaggg     3420 gtcttggcag cctgtgggcg atctgctgat tgattccctg caggaccacc tggaaaaggt     3480 gaaggctctg agaggcgaaa ttgctccact gaaggagaac gtgagtcatg tgaacgatct     3540 ggctagacag ctgacaacac tgggcatcca gctgagccca tacaatctga gcacactgga     3600 ggacctgaat accaggtgga agctgctgca ggtggctgtg gaagaccggg tgcggcagct     3660 gcatgaggcc catcgcgact tcggaccagc cagccagcac tttctgagca catccgtgca     3720 ggggccctgg gagagggcca tttctcccaa caaggtgccc tactatatta atcacgagac     3780 ccagaccact tgttgggacc atcccaagat gacagaactg taccagtccc tggccgatct     3840 gaacaacgtg aggtttagcg cttacagaac cgctatgaag ctgagacggc tgcagaaggc     3900 cctgtgcctg gatctgctgt ccctgtccgc cgcctgcgat gccctggatc agcataatct     3960 gaagcagaac gatcagccaa tggatatcct gcagatcatc aactgcctga ccactatcta     4020 cgacaggctg gagcaggagc acaacaacct ggtgaacgtg cctctgtgcg tggatatgtg     4080 cctgaactgg ctgctgaacg tgtatgacac tgggcgcacc ggccggatca gagtgctgag     4140 ttttaaaact gggattatct ccctgtgtaa ggcccacctg gaggacaagt acaggtacct     4200 gttcaagcag gtggctagta gcactggatt ttgtgaccag cgccgcctgg gactgctgct     4260 gcatgatagt atccagattc ctagacagct gggagaggtg gctagtttcg gaggatctaa     4320 catcgaaccc agcgtgcgca gctgtttcca gtttgccaat aacaaacctg aaatcgaggc     4380 tgctctgttc ctggattgga tgcgcctgga accacagagc atggtgtggc tgcctgtgct     4440 gcacagagtg gctgccgccg aaactgccaa gcaccaggct aaatgcaaca tctgcaagga     4500 atgtcccatt atcggctttc gctacaggag tctgaaacat tttaactacg atatttgcca     4560 gagctgcttc ttttccggaa gagtggccaa aggacacaag atgcactacc ctatggtgga     4620 atattgcacc ccaactacat ctggcgaaga tgtgcgcgat tttgccaagg tgctgaagaa     4680 taagtttcgg actaagaggt acttcgccaa gcacccccgc atggggtatc tgccagtgca     4740 gacagtgctg gaaggagaca atatggagac cgatacaatg tgagcggccg caataaaaga     4800 tctttatttt cattagatct gtgtgttggt tttttgtgtg tctagagcat ggctacgtag     4860 ataagtagca tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca     4920 ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc     4980 cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctggcgt aatagcgaag     5040 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgattcc     5100 gttgcaatgg ctggcggtaa tattgttctg gatattacca gcaaggccga tagtttgagt     5160 tcttctactc aggcaagtga tgttattact aatcaaagaa gtattgcgac aacggttaat     5220 ttgcgtgatg gacagactct tttactcggt ggcctcactg attataaaaa cacttctcag     5280 gattctggcg taccgttcct gtctaaaatc cctttaatcg gcctcctgtt tagctcccgc     5340 tctgattcta acgaggaaag cacgttatac gtgctcgtca aagcaaccat agtacgcgcc     5400 ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact     5460 tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc     5520 cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt     5580 acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc     5640 ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt     5700 gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat     5760 tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa     5820 ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta aatatttgct tatacaatct tcctgttttt     5880 ggggcttttc tgattatcaa ccggggtaca tatgattgac atgctagttt tacgattacc     5940 gttcatcgat tctcttgttt gctccagact ctcaggcaat gacctgatag cctttgtaga     6000 gacctctcaa aaatagctac cctctccggc atgaatttat cagctagaac ggttgaatat     6060 catattgatg gtgatttgac tgtctccggc ctttctcacc cgtttgaatc tttacctaca     6120 cattactcag gcattgcatt taaaatatat gagggttcta aaaattttta tccttgcgtt     6180 gaaataaagg cttctcccgc aaaagtatta cagggtcata atgtttttgg tacaaccgat     6240 ttagctttat gctctgaggc tttattgctt aattttgcta attctttgcc ttgcctgtat     6300 gatttattgg atgttggaat cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta     6360 tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc     6420 agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat     6480 ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt     6540 catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg     6600 tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa     6660 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac     6720 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg     6780 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc     6840 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg     6900 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga     6960 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc     7020 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag     7080 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga     7140 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg     7200 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga     7260 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt     7320 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact     7380 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt     7440 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg     7500 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta     7560 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac     7620 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta     7680 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt     7740 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt     7800 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt     7860 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc     7920 agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg     7980 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg     8040 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt     8100 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac     8160 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg     8220 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg     8280 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat     8340 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt     8400 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg     8460 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa     8520 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gc                        8562 ＜210＞  SEQ ID NO: 4 ＜211＞  564 ＜212＞  DNA ＜213＞  腺相關病毒 ＜400＞  4 cagccactat gggtctaggc tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg       60 cctggttata attaacccag acatgtggct gctccccccc cccaacacct gctgcctgag      120 cctcaccccc accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac accatggagg agaagctcgc      180 tctaaaaata accctgtccc tggtgggctg tgggggactg agggcaggct gtaacaggct      240 tgggggccag ggcttatacg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc atgttcccgg      300 cgaagggcca gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa ccagtgagca      360 agtcagccct tggggcagcc 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tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca     5580 ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact     5640 acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg     5700 gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt     5760 ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct     5820 tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga     5880 gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa     5940 tctaaagtat atatgagtaa aaatattccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag     6000 gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc     6060 aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat     6120 ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca     6180 caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg     6240 gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg     6300 cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact     6360 gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatcc     6420 caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg     6480 cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt     6540 actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc     6600 gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc     6660 gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga     6720 ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc     6780 cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt     6840 atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga     6900 accggtaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg     6960 aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac     7020 ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga     7080 ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc     7140 cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg     7200 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg     7260 tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc     7320 gcatcaggcg attccaacat ccaataaatc atacaggcaa ggcaaagaat tagcaaaatt     7380 aagcaataaa gcctcagagc ataaagctaa atcggttgta ccaaaaacat tatgaccctg     7440 taatactttt gcgggagaag cctttatttc aacgcaagga taaaaatttt tagaaccctc     7500 atatatttta aatgcaatgc ctgagtaatg tgtaggtaaa gattcaaacg ggtgagaaag     7560 gccggagaca gtcaaatcac catcaatatg atattcaacc gttctagctg ataaattcat     7620 gccggagagg gtagctattt ttgagaggtc tctacaaagg ctatcaggtc attgcctgag     7680 agtctggagc aaacaagaga atcgatgaac ggtaatcgta aaactagcat gtcaatcata     7740 tgtaccccgg ttgataatca gaaaagcccc aaaaacagga agattgtata agcaaatatt     7800 taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca     7860 ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag     7920 atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc     7980 aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc     8040 taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc     8100 ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa     8160 gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc     8220 acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgagcac     8280 gtataacgtg ctttcctcgt tagaatcaga gcgggagcta aacaggaggc cgattaaagg     8340 gattttagac aggaacggta cgccagaatc ctgagaagtg tttttataat cagtgaggcc     8400 accgagtaaa agagtctgtc catcacgcaa attaaccgtt gtcgcaatac ttctttgatt     8460 agtaataaca tcacttgcct gagtagaaga actcaaacta tcggccttgc tggtaatatc     8520 cagaacaata ttaccgccag ccattgcaac ggaatcgcca ttcgccattc aggctgcgca     8580 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagct                 8629 ＜210＞  SEQ ID NO; 9 ＜211＞  4977 ＜212＞  DNA ＜213＞  康黴素卡匣 ＜400＞  9 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg       60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag      120 gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag      180 agtttaaaca agcttgcatg tctaagctag acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag      240 ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc      300 ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag      360 ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg      420 gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat      480 taacccagac atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct      540 gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc      600 aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact      660 gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag cacttagttt      720 aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa      780 gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg      840 ctctcagggg cccctccctg gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct gtaggctcct      900 ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca cagcacagac      960 agacactcag gagcagccag cggcgcgccc aggtaagttt agtctttttg tcttttattt     1020 caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt     1080 tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc     1140 ggccgccacc atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca     1200 gaagaagact tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat     1260 cgagaatctg ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact     1320 gactggccag aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt     1380 gaacaaagct ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac     1440 tgatatcgtg gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca     1500 ctggcaggtg aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga     1560 gaagatcctg ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat     1620 taacttcact acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag     1680 gcctgatctg ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga     1740 acatgccttc aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga     1800 tgtggacact acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca     1860 ggtgctgcca cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc     1920 ccccaaagtg actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca     1980 gattaccgtg agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa     2040 gtcctacgct tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt     2100 tccatcccag cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag     2160 cgaggtgaat ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag     2220 tgctgaagac acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga     2280 tcagttccac acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg     2340 caatatcctg cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga     2400 aacagaagtg caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc     2460 tagtatggag aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact     2520 gaaagagctg aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga     2580 gccactggga cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca     2640 ggaggatctg gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt     2700 ggacgaatct agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg     2760 ggaccggtgg gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat     2820 cctgctgaaa tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga     2880 gaaagaggac gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct     2940 gtctagcctg cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat     3000 gggcaaactg tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac     3060 ccagaagaca gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa     3120 actggagaaa agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac     3180 ccagacaacc gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa     3240 acatgcccag gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct     3300 gcaggagctg caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat     3360 taaggggtct tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga     3420 aaaggtgaag gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa     3480 cgatctggct agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac     3540 actggaggac ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg     3600 gcagctgcat gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc     3660 cgtgcagggg ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca     3720 cgagacccag accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc     3780 cgatctgaac aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca     3840 gaaggccctg tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca     3900 taatctgaag cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac     3960 tatctacgac aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga     4020 tatgtgcctg aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt     4080 gctgagtttt aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag     4140 gtacctgttc aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact     4200 gctgctgcat gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg     4260 atctaacatc gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat     4320 cgaggctgct ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc     4380 tgtgctgcac agagtggctg ccgccgaaac tgccaagcac caggctaaat gcaacatctg     4440 caaggaatgt cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat     4500 ttgccagagc tgcttctttt ccggaagagt ggccaaagga cacaagatgc actaccctat     4560 ggtggaatat tgcaccccaa ctacatctgg cgaagatgtg cgcgattttg ccaaggtgct     4620 gaagaataag tttcggacta agaggtactt cgccaagcac ccccgcatgg ggtatctgcc     4680 agtgcagaca gtgctggaag gagacaatat ggagaccgat acaatgtgag cggccgcaat     4740 aaaagatctt tattttcatt agatctgtgt gttggttttt tgtgtgtcta gagtcgacca     4800 gagcatggct acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta     4860 gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca     4920 aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc        4977 SEQ ID NO:44(對應於PCT/US2020/019892中之SEQ ID NO: 19). ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg      120 cggccgcaag cttgcatgtc taagctagac ccttcagatt aaaaataact gaggtaaggg      180 cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc tctatctgcc catcggccct      240 ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca tggagccaga ggggcgaggg      300 caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc tagcatgccc cactacgggt      360 ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta      420 acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctctaaaa ataaccctgt      480 ccctggtgga tcccctgcat gcgaagatct tcgaacaagg ctgtggggga ctgagggcag      540 gctgtaacag gcttgggggc cagggcttat acgtgcctgg gactcccaaa gtattactgt      600 tccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca cttagtttag      660 gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg ctgggcaagc      720 tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag ctcatctgct      780 ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt aggctcctct      840 atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca gcacagacag      900 acactcagga gcagccagcg gcgcgcccag gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca      960 ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta     1020 cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccggta     1080 ccaccatggc agcagcagcc gccgcagccg ccgagcagca gtcaagcaat ggaccagtga     1140 aaaaatcaat gagagaaaaa gccgtcgaga ggagatcagt gaataaggag cacaacagca     1200 atttcaaagc cggctacatc cctattgacg aagatcgcct gcataagaca ggcctgaggg     1260 ggcgcaaagg aaacctggca atctgcgtca tcattctgct gtttatcctg gccgtgatta     1320 atctgatcat tactctggtg atttgggctg tcatccgcat tggcccaaac gggtgtgact     1380 ctatggagtt ccacgaaagt ggcctgctgc gatttaagca ggtgtccgat atgggggtca     1440 tccatccact gtacaaatct actgtcggcg ggcggagaaa cgagaatctg gtgatcaccg     1500 ggaacaatca gcccattgtg ttccagcagg gaaccacaaa gctgtctgtg gaaaacaata     1560 aaacatcaat cactagcgac attggcatgc agttctttga tccccggacc cagaatatcc     1620 tgttcagtac cgactatgag acacacgaat ttcatctgcc ttccggggtg aagtctctga     1680 acgtccagaa agccagcact gagagaatca ccagtaacgc tacatcagac ctgaatatca     1740 aggtggatgg acgagctatt gtccggggaa atgagggcgt gttcatcatg ggcaagacaa     1800 ttgaatttca catgggaggc aacatggagc tgaaagcaga aaacagcatc attctgaatg     1860 ggagcgtgat ggtctccact accagactgc ccagctcctc tagtggagac cagctggggt     1920 ccggagattg ggtcaggtat aagctgtgca tgtgtgccga tggcaccctg tttaaagtgc     1980 aggtcaccag ccagaatatg ggatgtcaga ttagcgataa cccttgtggg aatactcatt     2040 aaaagcttgg ccgcaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt     2100 gtgtcctgca ggggcgcgcc tctagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta     2160 atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc     2220 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc     2280 tcagtgagcg agcgagcgcg cag SEQ ID NO: 45: (PCT/US2020/019892之SEQ ID NO: 1) β-肌聚糖 atggcagcag cagccgccgc agccgccgag cagcagtcaa gcaatggacc agtgaaaaaa tcaatgagag aaaaagccgt cgagaggaga tcagtgaata aggagcacaa cagcaatttc aaagccggct acatccctat tgacgaagat cgcctgcata agacaggcct gagggggcgc aaaggaaacc tggcaatctg cgtcatcatt ctgctgttta tcctggccgt gattaatctg atcattactc tggtgatttg ggctgtcatc cgcattggcc caaacgggtg tgactctatg gagttccacg aaagtggcct gctgcgattt aagcaggtgt ccgatatggg ggtcatccat ccactgtaca aatctactgt cggcgggcgg agaaacgaga atctggtgat caccgggaac aatcagccca ttgtgttcca gcagggaacc acaaagctgt ctgtggaaaa caataaaaca tcaatcacta gcgacattgg catgcagttc tttgatcccc ggacccagaa tatcctgttc agtaccgact atgagacaca cgaatttcat ctgccttccg gggtgaagtc tctgaacgtc cagaaagcca gcactgagag aatcaccagt aacgctacat cagacctgaa tatcaaggtg gatggacgag ctattgtccg gggaaatgag ggcgtgttca tcatgggcaa gacaattgaa tttcacatgg gaggcaacat ggagctgaaa gcagaaaaca gcatcattct gaatgggagc gtgatggtct ccactaccag actgcccagc tcctctagtg gagaccagct ggggtccgga gattgggtca ggtataagct gtgcatgtgt gccgatggca ccctgtttaa agtgcaggtc accagccaga atatgggatg tcagattagc gataaccctt gtgggaatac tcattaa SEQ ID NO: 46 (PCT/US2020/019892之SEQ ID NO: 2) β-肌聚糖 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gln Gln Ser Ser Asn Gly Pro Val Lys Lys Ser Met Arg Glu Lys Ala Val Glu Arg Arg Ser Val Asn Lys Glu His Asn Ser Asn Phe Lys Ala Gly Tyr Ile Pro Ile Asp Glu Asp Arg Leu His Lys Thr Gly Leu Arg Gly Arg Lys Gly Asn Leu Ala Ile Cys Val Ile Ile Leu Leu Phe Ile Leu Ala Val Ile Asn Leu Ile Ile Thr Leu Val Ile Trp Ala Val Ile Arg Ile Gly Pro Asn Gly Cys Asp Ser Met Glu Phe His Glu Ser Gly Leu Leu Arg Phe Lys Gln Val Ser Asp Met Gly Val Ile His Pro Leu Tyr Lys Ser Thr Val Gly Gly Arg Arg Asn Glu Asn Leu Val Ile Thr Gly Asn Asn Gln Pro Ile Val Phe Gln Gln Gly Thr Thr Lys Leu Ser Val Glu Asn Asn Lys Thr Ser Ile Thr Ser Asp Ile Gly Met Gln Phe Phe Asp Pro Arg Thr Gln Asn Ile Leu Phe Ser Thr Asp Tyr Glu Thr His Glu Phe His Leu Pro Ser Gly Val Lys Ser Leu Asn Val Gln Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ile Thr Ser Asn Ala Thr Ser Asp Leu Asn Ile Lys Val Asp Gly Arg Ala Ile Val Arg Gly Asn Glu Gly Val Phe Ile Met Gly Lys Thr Ile Glu Phe His Met Gly Gly Asn Met Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ser Ile Ile Leu Asn Gly Ser Val Met Val Ser Thr Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser Ser Gly Asp Gln Leu Gly Ser Gly Asp Trp Val Arg Tyr Lys Leu Cys Met Cys Ala Asp Gly Thr Leu Phe Lys Val Gln Val Thr Ser Gln Asn Met Gly Cys Gln Ile Ser Asp Asn Pro Cys Gly Asn Thr His
圖 1 說明rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體。在此構築體中，cDNA表現卡匣側接AAV2反向末端重複序列（ITR）。該構築體之特徵在於框內桿缺失（R4-R23），而鉸鏈1、2及4（H1 、H2 及H4 ）及半胱胺酸富集域仍產生138 kDa蛋白質。微肌肉萎縮蛋白（3579 bp）之表現係由MHCK7啟動子（795 bp）引導。內含子及5' UTR來源於質體pCMVβ（Clontech）。微肌肉萎縮蛋白卡匣具有緊接著ATG起點之前的共同Kozak，及用於mRNA終止的小型53 bp合成聚腺苷酸信號。人類微肌肉萎縮蛋白卡匣含有先前如以下文獻所述的（R4-R23/Δ71-78）域：Harper等人，（《自然醫學（Nature Medicine ）》8, 253-261 (2002)）。
圖 2 提供rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之核酸序列（SEQ ID NO: 3）。
圖 3 提供pNLREP2-Caprh74 AAV輔助質體圖譜。
圖 4 提供Ad輔助質體pHELP。
圖 5 說明rAAV.MCK.微肌肉萎縮蛋白質體構築體。
圖 6 提供rAAVrh74.MCK.微肌肉萎縮蛋白之核酸序列（SEQ ID NO: 5）。
圖 7 提供rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之核酸序列（SEQ ID NO: 9）。
圖 8 說明AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白質體構築體。
圖 9 提供包含康黴素抗性基因之rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白質體構築體的核酸序列（SEQ ID NO: 8）。
圖 10 提供治療性β-肌聚糖轉殖基因卡匣示意圖。自互補AAV載體含有密碼子最佳化之人類β-肌聚糖基因（hSGCB））肌肉特異性MHCK7啟動子驅動表現。卡匣亦含有可增強處理及聚腺苷酸化信號以達成穩定性的嵌合內含子。
圖 11 提供rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白再次給予之後，NHP中之針對AAVrh74之抗體效價的圖。點劃線代表總AAVrh.74抗體效價水準的納入準則，其針對AAVrh.74的臨限值為1:400。
圖 12 提供在TPE之後再次給予rAAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白之NHP中，TPE後之微肌肉萎縮蛋白表現相較於TPE之前的變化倍數。
圖 13 提供在10天的TPE療程中移除血漿體積（PV）之後的血漿抗體療程。
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Claims (95)

  1. 一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺相關病毒（rAAV）及消炎類固醇的步驟，其中該rAAV選自由以下組成之群：rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  2. 如請求項1之方法，其中該肌肉營養不良症為杜興氏肌肉營養不良症且該rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。
  3. 如請求項1之方法，其中該肌肉營養不良症為肢帶型肌營養不良症且其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的約24小時投與。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前投與約14天，一天至少一次。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前投與，且該消炎類固醇在該rAAV投與之後的第1至30天一天投與至少一次或在該rAAV投與之後的1至60天一天投與至少一次。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該消炎類固醇經口投與。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該消炎類固醇為糖皮質激素。
  9. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該消炎類固醇為普賴松（prednisone）、普賴蘇穠（prednisolone）、倍他米松（betamethasone）、地塞米松（dexamethasone）、氫化可的松（hydrocortisone）、甲基普賴蘇穠（methylprednisolone），或地夫可特（deflazacort）。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其進一步包含在該rAAV投與之前投與抗CD20特異性抗體的步驟。
  11. 如請求項10之方法，其中該抗CD-20特異性抗體係在該rAAV投與之前的至少7天投與。
  12. 如請求項10或11之方法，其中該抗CD20特異性抗體係在該rAAV投與之前的至少14天投與。
  13. 如請求項10之方法，其中該抗CD20特異性抗體係在該rAAV投與之前的約14天、該rAAV投與之前的約7天及該rAAV投與約24小時內投與。
  14. 如請求項10至13中任一項之方法，其進一步包含在該rAAV投與之前投與抗CD20特異性抗體的步驟。
  15. 如請求項10至14之方法，其中該抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗（rituximab）、奧克珠單抗（ocrelizumab）或奧伐木單抗（ofatumumab）。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其進一步包含投與免疫抑制性巨環內酯之步驟。
  17. 如請求項16之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯係在該rAAV投與之前投與至少三天，一天至少一次。
  18. 如請求項16或17之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯係在該rAAV投與之後投與。
  19. 如請求項16至18中任一項之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯經口投與。
  20. 如請求項16至19中任一項之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯為他克莫司（tacrolimus）、盤克莫司（pinecrolimus）或西羅莫司（sirolimus）。
  21. 一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與重組腺相關病毒（rAAV）及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體及免疫抑制性巨環內酯中的一者或多者，且其中該rAAV選自由以下組成之群：AAVrh.74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  22. 如請求項21之方法，其中該肌肉營養不良症為杜興氏肌肉營養不良症且該rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。
  23. 如請求項21之方法，其中該肌肉營養不良症為肢帶型肌肉營養不良症且該rAAV為AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  24. 如請求項21至23中任一項之方法，其中該免疫抑制療法包含投與消炎類固醇、抗CD20抗體，及免疫抑制性巨環內酯。
  25. 如請求項21至24中任一項之方法，其中該消炎類固醇係在該rAAV投與之前的約24小時投與。
  26. 如請求項21至25中任一項之方法，其中該消炎類固醇在該rAAV投與之前投與，且該消炎類固醇在該rAAV投與之後的第1至30天一天投與至少一次。
  27. 如請求項21至26中任一項之方法，其中該消炎類固醇經口投與。
  28. 如請求項21至27中任一項之方法，其中該消炎類固醇為糖皮質激素。
  29. 如請求項21至28中任一項之方法，其中該消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠，或地夫可特。
  30. 如請求項21至295中任一項之方法，其中該抗CD20特異性抗體係在該rAAV投與之前投與。
  31. 如請求項30之方法，其中該抗CD20特異性抗體係在該rAAV投與之前的至少14天投與。
  32. 如請求項30之方法，其中該抗CD20特異性抗體係在該rAAV投與之前的約14天、該rAAV投與之前的約7天及該rAAV投與約24小時內投與。
  33. 如請求項21至32中任一項之方法，其中該免疫抑制療法進一步包含在該rAAV投與之後，投與抗CD20特異性抗體。
  34. 如請求項21至33中任一項之方法，其中該抗CD20抗體藉由血管內輸注投與。
  35. 如請求項21至34中任一項之方法，其中該抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧伐木單抗。
  36. 如請求項21至35中任一項之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯係在該rAAV投與之前投與至少三天，一天至少一次。
  37. 如請求項21至36中任一項之方法，其中該免疫抑制療法進一步包含在該rAAV投與之後，投與免疫抑制性巨環內酯。
  38. 如請求項21至37中任一項之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯經口投與。
  39. 如請求項21至38中任一項之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。
  40. 一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含投與選自由以下組成之群的重組腺相關病毒（rAAV）：AAVrh.74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；以及免疫抑制療法，其中該免疫抑制療法包含以下步驟： i）在該rAAV投與之前的約24小時經口投與消炎類固醇，且在該rAAV投與之後的第1至30天，或在該rAAV投與之後的第1至60天，一天投與消炎類固醇至少一次； ii）在該rAAV投與之前的約14天，在該rAAV投與之前的約7天且在該rAAV投與的約24小時內，靜脈內投與抗CD20抗體，且在該rAAV投與之後，視情況投與該抗CD20抗體； iii）在該rAAV投與之前，經口投與免疫抑制性巨環內酯至少三天，一天至少一次，且在該rAAV投與之後，視情況投與該免疫抑制性巨環內酯。
  41. 如請求項40之方法，其中該肌肉營養不良症為杜興氏肌肉營養不良症且該rAAV為AAVrh.74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。
  42. 如請求項40之方法，其中該肌肉營養不良症為肢帶型肌營養不良症且該rAAV為AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  43. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠，或地夫可特。
  44. 如請求項40至43中任一項之方法，其中該抗CD20特異性抗體為利妥昔單抗、奧克珠單抗或奧伐木單抗。
  45. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該免疫抑制性巨環內酯為他克莫司、盤克莫司或西羅莫司。
  46. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該消炎類固醇為普賴蘇穠，該抗CD20抗體為利妥昔單抗，且該免疫抑制性巨環內酯為西羅莫司。
  47. 一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含在投與選自由以下組成之群之重組腺相關病毒（rAAV）的第二次劑量之前，對該個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）：AAVrh.74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，其中在進行TPE之前，向該個體投與rAAV的第一次劑量。
  48. 一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟： a）   投與選自由以下組成之群之重組腺相關病毒的第一次劑量：AAVrh.74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05； b）  對該個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）；以及 c）   投與第二次劑量或rAAV。
  49. 如請求項47或48之方法，其中該肌肉營養不良症為杜興氏肌肉營養不良症且該rAAV為AAVrh.74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白。
  50. 如請求項47或48之方法，其中該肌肉營養不良症為肢帶型肌營養不良症且該rAAV為AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，及rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  51. 如請求項47至50中任一項之方法，其中在投與該第2次劑量或rAAV之前，對該個體之血漿進行至少兩次TPE或至少三次TPE。
  52. 一種治療有需要之人類個體之肌肉營養不良症的方法，其包含以下步驟： a）   在投與重組腺相關病毒（rAAV）之前，對該個體之血漿進行至少一次治療性血漿置換（TPE）； b）  投與rAAV，且 其中該rAAV為rAAV.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
  53. 如請求項52之方法，其中在投與之前，對該個體之血漿進行至少兩次TPE、至少三次TPE、至少四次TPE、至少五次TPE rAAV、至少六次TPE或至少七次TPE。
  54. 如請求項52或53之方法，其中該個體之血漿在該rAAV投與之前進行TPE至少9天，在投與之前進行TPE至少7天，在投與之前進行TPE 5天，或在投與之前進行TPE 2天。
  55. 如請求項52至54中任一項之方法，其中在該rAAV投與的當天，對該個體的血漿進行TPE。
  56. 如請求項52至55中任一項之方法，其中對該個體之血漿進行至少兩次TPE，其中該TPE相隔約48小時。
  57. 如請求項52至56中任一項之方法，其中在該rAAV投與之前的約24小時，向該個體投與消炎類固醇。
  58. 如請求項52至57中任一項之方法，其中在該rAAV投與之後的第1至60天，向該個體投與消炎類固醇，一天至少一次。
  59. 如請求項57或58之方法，其中該消炎類固醇經口投與。
  60. 如請求項57至59中任一項之方法，其中該消炎類固醇為糖皮質激素。
  61. 如請求項57至60中任一項之方法，其中該消炎類固醇為普賴松、普賴蘇穠、倍他米松、地塞米松、氫化可的松、甲基普賴蘇穠，或地夫可特。
  62. 如請求項1至61中任一項之方法，其中該rAAV藉由全身性投藥途徑投與。
  63. 如請求項62之方法，其中該全身性投藥途徑為靜脈內途徑且所投與的該rAAV之劑量為約2×1014 vg/kg。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該rAAV之劑量係以約10 mL/kg之濃度投與。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該rAAV係藉由注射、輸注或植入投與。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該rAAV係利用輸注約一小時來投與。
  67. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該rAAV係經由周邊肢體靜脈、利用靜脈內途徑投與。
  68. 如請求項1至67中任一項之方法，其中該rAAV係血清型AAVrh.74。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該rAAV包含人類微肌肉萎縮蛋白核苷酸序列SEQ ID NO: 1。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。
  71. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 44之核苷酸序列。
  72. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該rAAV包含AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9，或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021。
  73. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該人類個體罹患杜興氏肌肉營養不良症，且該rAAV係藉由以約2×1014 vg/kg之劑量靜脈內輸注約一小時來投與，且其中該rAAV包含該AAVrh74.MHCK7.微肌肉萎縮蛋白構築體核苷酸序列SEQ ID NO: 9，或SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021。
  74. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該肌肉營養不良症為LGMD2E且該rAAV為scAAVrh74.MHCK7.HSGCB。
  75. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該人類個體罹患LGMD2E，且該rAAV藉由以約2×1014 vg/kg之劑量靜脈內輸注來投與，且其中該rAAV包含該rAAV為包含核苷酸序列SEQ ID NO: 44之scAAVrh74.MHCK7.HSGCB。
  76. 如請求項1至75中任一項之方法，其中相較於該rAAV投與之前的微肌肉萎縮蛋白基因表現水準，該個體之細胞中的微肌肉萎縮蛋白基因表現水準在該rAAV投與之後提高。
  77. 如請求項1至76中任一項之方法，其進一步包含測定該個體之血清或血漿中是否存在抗AAVrh.74抗體的步驟。
  78. 如請求項77之方法，其中該測定步驟係在投與免疫抑制療法或TPE之該投與的步驟之前執行。
  79. 如請求項78之方法，其中該測定步驟係在AAV向該個體的任何投與之前執行。
  80. 如請求項79之方法，其中該測定步驟係在aAAVrh.74投與該個體之前執行。
  81. 如請求項77至80中任一項之方法，其中該測定為定量的。
  82. 如請求項81之方法，其進一步包含將該個體之血清或血漿中的抗AAVrh.74抗體水準與陽性對照進行比較的步驟。
  83. 如請求項82之方法，其中該陽性對照係使用抗AAVrh.74單株抗體。
  84. 如請求項77至83中任一項之方法，其中該測定步驟包含使用抗AAVrh.74單株抗體。
  85. 如請求項77至84中任一項之方法，其中該測定步驟包含使用免疫螢光分析、免疫組織化學分析、西方墨點法、直接酶聯免疫吸附分析（ELISA）、間接ELISA、夾層ELISA、競爭性ELISA、逆向ELISA、化學發光分析、放射免疫分析，或免疫沈澱分析。
  86. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含選自由以下組成之群的VH CDR1胺基酸序列：NYGMN（SEQ ID NO: 20）、DYGMN（SEQ ID NO: 22）、YTFTNYGMN（SEQ ID NO: 21），以及YTFTKYGMN（SEQ ID NO: 23）。
  87. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含選自由以下組成之群的VH CDR2胺基酸序列：WINTYTGEPTYADDFKG（SEQ ID NO: 24）、WINTNTGEPTYGDDFKG（SEQ ID NO: 25），以及WMGWINTYTGEPTY（SEQ ID NO: 26）。
  88. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含選自由以下組成之群的VH CDR3胺基酸序列：GVAHYSDSRFAFDY（SEQ ID NO: 27）、GNAHPGGSAFVY（SEQ ID NO: 28）、RGSYYYDSSPAWFAY（SEQ ID NO: 29）、RGVDSSGYGAFAY（SEQ ID NO: 30），以及TRGTSTMISTFAFVY（SEQ ID NO: 31）。
  89. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含選自由以下組成之群的VL CDR1胺基酸序列：SVSSSVSYMH（SEQ ID NO: 32）、SASSGVTYMH（SEQ ID NO: 33）、SSVSYMH（SEQ ID NO: 34），及SSVRYMH（SEQ ID NO: 35）。
  90. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含選自由以下組成之群的VL CDR2胺基酸序列：YTSNLAS（SEQ ID NO: 36）、RTSNLAS（SEQ ID NO: 37）、LWIYSTSNLAS（SEQ ID NO: 38），及VWIYSTSNLAS（SEQ ID NO: 39）。
  91. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含選自由以下組成之群的VH CDR3胺基酸序列：QQRSSYPFT（SEQ ID NO: 40）、QQRSTYPF（SEQ ID NO: 41）、QQRSFYPF（SEQ ID NO: 42），及QQRTYYPF（SEQ ID NO: 43）。
  92. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含SEQ ID NO: 10、12、14、16或18中所示的可變重鏈（VH）序列。
  93. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含SEQ ID NO: 11、13、15、17或19中所示的可變輕鏈（VL）序列。
  94. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體包含SEQ ID NO: 10、12、14、16或18中所示的可變重鏈（VH）序列，及SEQ ID NO: 11、13、15、17或19中所示的可變輕鏈（VL）序列。
  95. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該測定為定量的，其中基於該定量，鑑別出該個體對抗AAVrh.74抗體呈血清反應陽性，且其中將該免疫抑制療法或TPE選擇性地投與呈血清反應陽性的該個體。
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