JP2023530974A - 筋ジストロフィーのためのアデノ随伴ウイルスベクター送達 - Google Patents
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Abstract
本開示は、対象の免疫系を抑制するステップと組み合わせて、小型化ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子療法ベクターを投与することを含む、必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。
Description
本出願は、２０２０年６月１５日に出願された米国仮出願第６３／０３９，２５２号、２０２０年９月２７日に出願された米国仮出願第６３／０８３，９５３号、２０２１年３月１２日に出願された米国仮出願第６３／１６０，３７６号、及び２０２１年５月１３日に出願された米国仮出願第６３／１８８，２６６号に対する優先権を主張し、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が組み込まれ、ファイル名：５５７１４＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：８３，３８０バイト、作成：２０２１年６月７日として認識されるコンピュータ可読形態の配列表を含む。
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が組み込まれ、ファイル名：５５７１４＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：８３，３８０バイト、作成：２０２１年６月７日として認識されるコンピュータ可読形態の配列表を含む。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療ベクターを投与することと、対象の免疫系を抑制するステップと組み合わせて、小型化ヒトマイクロジストロフィン遺伝子又はβ－サルコグリカン遺伝子などの目的の導入遺伝子を発現させることと、を含む必要とする対象において、筋ジストロフィーなどの疾患を治療する方法を提供する。
運動及び呼吸などの日常活動、並びに全身代謝のための筋肉量及び筋力の重要性は明確である。筋肉機能の欠損は、筋力の低下及び消耗を特徴とし、生活の質に深刻な影響を及ぼす筋ジストロフィー（ＭＤ）を生じさせる。最もよく特性評価されたＭＤは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の変異に起因する。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋細胞膜－細胞骨格係留の喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人に１人の新生児男性が罹患する最も壊滅的な筋肉疾患のうちの１つである。
ＤＭＤは、ｍＲＮＡの減少と、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する４２７ｋＤの筋細胞膜タンパク質であるジストロフィンの欠如をもたらすＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、筋細胞膜の複数のタンパク質で構成され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と、アクチン結合タンパク質であるジストロフィン、及びラミニン結合タンパク質であるアルファジストログリカンを介した細胞骨格との構造的な連結を形成する。これらの構造的な連結は、収縮中に筋肉細胞膜を安定させ、収縮による損傷から保護するように作用する。ジストロフィンの喪失により、膜の脆弱性は筋細胞膜の裂離とカルシウムの流入をもたらし、カルシウム活性化プロテアーゼと分節線維壊死を引き起こす（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－７５，１９９７）。筋肉の変性と再生のこの制御不能のサイクルは、最終的に筋肉幹細胞集団を使い果たし（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９－７１；Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７）、進行性の筋力低下、筋内膜炎、及び線維性瘢痕をもたらす。
ジストロフィン又はマイクロジストロフィンによる膜の安定化がなければ、ＤＭＤは組織損傷と修復の制御不能なサイクルを示し、最終的に、結合組織の増殖を通じて喪失した筋線維を線維性瘢痕組織に置き換える。線維症は、コラーゲン及びエラスチンを含むＥＣＭマトリックスタンパク質の過剰な沈着を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は、主に、ストレス及び炎症に反応する活性化線維芽細胞によって放出されるＴＧＦβなどのサイトカインから生成される。ＤＭＤの主な病理学的特徴は筋線維の変性と壊死であるが、病理学的な結果としての線維症は同等の影響を及ぼす。線維組織の過剰産生は、筋肉の再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性の筋力低下の一因となる。ある研究では、初期のＤＭＤ筋生検での線維症の存在は、１０年間の追跡調査での運動転帰不良と高い相関があった（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７）。これらの結果は、線維症がＤＭＤ筋機能障害の主な原因であることを示しており、顕性線維症の前の早期介入の必要性を強調している。
ＭＤのうちの別のグループは、ＭＤの肢帯型筋群（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤは、まれな状態であり、発症年齢、筋力低下の領域、心臓及び呼吸器の関与、進行速度、並びに重症度に関して、ヒトによって症状が異なる。ＬＧＭＤは、小児期、青年期、若年成人期、又はそれ以降に始まる可能性がある。両方の性別が等しく影響を受ける。ＬＧＭＤは、肩及び骨盤帯に衰弱を引き起こし、上肢及び腕の近くの筋肉も時間とともに衰弱することがある。脚の脱力感は、腕の脱力感よりも前に現れることがよくある。顔の筋肉は、通常影響を受けない。状態が進行するにつれて、人々は、歩行に問題を抱えることがあり、時間の経過とともに車椅子を使用する必要があるかもしれない。肩及び腕の筋肉が関与すると、腕を頭上に上げたり、物を持ち上げたりするのが困難になることがある。ＬＧＭＤのタイプによっては、心臓及び呼吸筋が関与し得る。
ＬＧＭＤのための専門の検査は、診断のための全国的な計画であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＮＣＧ）を通じて現在利用可能である。
ＤＭＤ又はＬＧＭＤなどの筋ジストロフィーを治療するための遺伝子療法が開発されるにつれて、これらの療法を最適化し、最適化された遺伝子療法ベクターによってマイクロジストロフィン導入遺伝子の発現に対する免疫抑制の効果を評価する必要がある。
ＤＭＤ又はＬＧＭＤなどの筋ジストロフィーを治療するための遺伝子療法が開発されるにつれて、これらの療法を最適化し、最適化された遺伝子療法ベクターによってマイクロジストロフィン導入遺伝子の発現に対する免疫抑制の効果を評価する必要がある。
Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８，１９８７
Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－７５，１９９７
Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９－７１
Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７
Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７
本開示は、免疫抑制剤の投与と組み合わせて筋ジストロフィーを治療するために骨格筋に目的の導入遺伝子を発現する遺伝子療法ベクター、例えば、ＡＡＶに関する。加えて、本開示は、対象にＡＡＶ遺伝子療法を再投与する方法を含み、対象の血漿は、ＡＡＶ遺伝子療法の初回投与に応答して産生されるＡＡＶ抗体を除去するために、治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供される。
本開示は、横隔膜及び心筋を含む骨格筋にマイクロジストロフィン遺伝子を発現して、筋線維を損傷から保護し、筋力を増加させ、免疫抑制剤の投与と組み合わせて線維症を低減及び／又は予防する遺伝子療法ベクター、例えば、ＡＡＶに関する。加えて、本開示は、対象にＡＡＶ遺伝子療法を再投与する方法を含み、対象の血漿は、対象が有する抗体への治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供され、ＡＡＶ遺伝子療法の初回投与に応答して産生されるＡＡＶ抗体を除去する。
加えて、本開示は、免疫抑制剤の投与と組み合わせて横隔膜及び心筋を含む骨格筋にβ－サルコグリカン遺伝子を発現する遺伝子治療ベクター、例えば、ＡＡＶに関する。加えて、本開示は、対象にＡＡＶ遺伝子療法を再投与する方法を含み、対象の血漿は、対象が有する抗体への治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供され、ＡＡＶ遺伝子療法の初回投与に応答して産生されるＡＡＶ抗体を除去する。
本開示は、マイクロジストロフィンを送達して、ＤＭＤにおいて観察される遺伝子欠損に対処するために遺伝子療法ベクターを使用して、筋力を増加させる及び／又は筋肉量を増加させるための療法及びアプローチを提供する。特に、本開示は、免疫抑制の持続時間、用量及び種類が変更された異なる免疫抑制療法を使用して、非ヒト霊長類モデルにおけるｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身送達の遺伝子発現を実証する研究を提供する。本開示はまた、ＴＰＥを使用して以前に投与された非ヒト霊長類からＡＡＶウイルス抗体を除去し、かつｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用して霊長類に全身的に再投与した後の、マイクロジストロフィン導入遺伝子発現を実証する研究を提供する。
本開示はまた、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与前に抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体でＤＭＤに罹患しているヒト対象を治療するためのアプローチも提供し、対象は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与前にＴＰＥの複数のセッションに供される。
本開示は、配列番号３、８又は９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示はまた、配列番号９の核酸配列、又は配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ、及び配列番号９の核酸配列、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子も提供する。
本開示の別の態様は、配列番号３、８又は９の核酸配列ヌクレオチド配列、配列番号９の核酸配列を含むｒＡＡＶ、又は配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含む組成物、及び配列番号９の核酸配列、又は配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。本明細書に開示される方法のいずれも、これらの組成物を用いて行うことができる。
加えて、本開示は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰ Ｎ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５のうちの１つのｒＡＡＶゲノムを含む核酸を含む組成物を提供する。
本開示は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び抗炎症ステロイドを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。加えて、本開示は、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドが同時に又は別々に併用投与されるように、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンと、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための抗炎症ステロイドとを含む併用療法の使用を提供し、例えば、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドは、同時に又は別々に併用投与される。本開示は、筋ジストロフィーを治療するための併用療法も提供し、この療法は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び抗炎症ステロイドを含み、かつｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドは、別々に併用投与され、例えば、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドは、同時に又は別々に併用投与される。例えば、筋ジストロフィーは、ＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィーである。例えば、抗炎症ステロイドは、グルココルチコイドである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、経口投与される。抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前及び投与後の両方で投与されてもよい。代替的に、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前のみに又は投与後のみに投与される。
加えて、本開示は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）及び抗炎症ステロイドを投与するステップを含む、肢帯型筋ジストロフィー治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法を提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される。加えて、本開示は、薬剤のｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドが別々に併用投与されるように、例えば、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドが同時に又は連続的に併用投与されるように、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）及び抗炎症ステロイドを含む併用療法の使用であって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される、使用を提供する。本開示は、肢帯型筋ジストロフィーを治療するための併用療法も提供し、併用療法は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）及び抗炎症ステロイドを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択され、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドは、別々に併用投与され、例えば、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドは、同時に又は順次に併用投与される。例えば、抗炎症ステロイドは、グルココルチコイドである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、経口投与される。抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前及び投与後の両方で投与されてもよい。代替的に、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前のみに又は投与後のみに投与される。
例えば、本明細書に開示される方法、使用又は併用療法のいずれにおいても、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の約１２時間前、又はｒＡＡＶの投与の約２４時間前、又はｒＡＡＶの投与の約３６時間前、又はｒＡＡＶの投与の約４８時間前、又はｒＡＡＶの投与の約６０時間前、又はｒＡＡＶの投与の約７２時間前、又は投与の約９６時間前に投与される。いくつかの実施形態では、炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の約５日前、ｒＡＡＶの投与の約６日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、又はｒＡＡＶの投与の約８日前、又はｒＡＡＶの投与の約９日前、又はｒＡＡＶの投与の約１０日前、又はｒＡＡＶの投与の約１１日前、又はｒＡＡＶの投与の約１２日前、又はｒＡＡＶの投与の約１３日前、又はｒＡＡＶの投与の約１４日前、又はｒＡＡＶの投与の約３０日前に投与される。
加えて、開示される方法、使用又は併用療法のいずれにおいても、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の約７日前に少なくとも１日１回投与され、又はｒＡＡＶの投与の約１４前に少なくとも１日１回投与され、又は２１日に少なくとも１日１回投与され、又はｒＡＡＶの投与の約２８日前に少なくとも１日１回投与され、又はｒＡＡＶの投与の約３０日前に少なくとも１日１回投与され、又はｒＡＡＶの投与の約４５日前に少なくとも１日１回投与され、又はｒＡＡＶの投与の約６０日前に少なくとも１日１回投与される。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。
例えば、開示される方法、使用又は併用療法のいずれにおいても、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の前に投与され、かつ抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回、ｒＡＡＶの投与後１～６０日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～７日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～１４日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～２１日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～２４日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～２８日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後少なくとも１～３０日までに、又はｒＡＡＶの投与後少なくとも３０～６０日までに投与される。
本明細書に開示される方法、使用又は併用療法のいずれにおいても、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の少なくとも７日前に投与される。抗ＣＤ２０特異的抗体という用語は、ＣＤ２０に特異的に結合するか、又はＣＤ２０の発現若しくは活性を阻害若しくは低減する抗体を指す。例示的な抗ＣＤ２０抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ、又はオファツムマブが含まれる。
開示される方法、使用又は併用療法のいずれかにおいても、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の約６０日前、又はｒＡＡＶの投与の約４５日前、又はｒＡＡＶの投与の約３０日前、ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与後に投与される。例えば、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前及び投与後の両方で投与される。代替的に、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前に投与されるか、又は抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与後に投与される。
加えて、開示される方法、使用又は併用療法のいずれにおいても、免疫抑制マクロライドを投与することを含んでもよい。免疫抑制マクロライドという用語は、対象の免疫系を抑制又は調節するマクロライド剤を指す。マクロライドは、クラジノース又はデソアミンなどの１つ以上のデオキシ糖が付着した大きな大環状ラクトン環を含む薬剤のクラスである。ラクトン環は通常、１４、１５、又は１６員である。マクロライドは、ポリケチドクラスの薬剤に属し、天然産物であり得る。免疫抑制マクロライドの例には、タクロリムス、ピメクロリムス、及びシロリムスが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫抑制マクロライドは、対象に経口投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与前及びｒＡＡＶの投与後の両方で投与されてもよい。代替的に、免疫抑制マクロライドは、投与前に投与されるか、又はｒＡＡＶ若しくは免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与後に投与される。
いくつかの実施形態では、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与の少なくとも３日前に少なくとも１日１回投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも４日前に投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも５日前に投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも６日前に投与される、ｒＡＡＶの投与の少なくとも７日前に投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも１０日前に投与される、又は投与の少なくとも１４日前に投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも３０日前に投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも４５日前に投与される、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも６０日前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。
本開示はまた、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び免疫抑制レジメンを投与することを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法も提供し、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を投与することを含む。本開示はまた、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンと、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための免疫抑制レジメンとを含む併用療法の使用も提供し、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を投与することを含み、例えば、開示される薬剤において、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの１つ以上の成分は、別々に併用投与され、例えば、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの１つ以上の成分は、同時に又は連続的に併用投与される。本開示はまた、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法も提供し、併用療法は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び免疫抑制レジメンを含み、かつｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンは、別々に併用投与され、例えば、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの１つ以上の成分は、同時に又は連続的に併用投与される。免疫抑制レジメンという用語は、対象の免疫系を抑制又は調節する治療又は療法の方法を指す。このレジメンは、１つ以上の免疫抑制剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドを投与することを含む。
本開示はまた、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）と、免疫抑制レジメンとを投与することを含む、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法も提供し、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を投与することを含む。本開示はまた、必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含む併用療法の使用を提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択されるｒＡＡＶ組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を投与することを含み、例えば、開示される薬剤において、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの１つ以上の成分は、別々に併用投与され、例えば、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンのうちの１つ以上の成分は、同時に又は連続的に併用投与される。本開示はまた、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するための併用療法も提供し、併用療法は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を含み、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を投与することを含み、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの１つ以上の成分は、別々に併用投与され、例えば、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンのうちの１つ以上の成分は、同時に又は連続的に併用投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドを投与することを含む。
１つの例示的な免疫抑制レジメンでは、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に投与される。別の例示的な免疫抑制レジメンでは、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前に投与され、かつ抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回投与されるか、又は抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与される。
開示される免疫抑制レジメンのいずれにおいても、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートなどのグルココルチコイドである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、経口投与される。
更なる例示的な免疫抑制レジメンでは、ｒＡＡＶの投与前に抗ＣＤ２０特異的抗体。例えば、抗ＣＤ２０抗体は、血管内注入によって投与される。例示的な抗ＣＤ２０特異的抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ又はオファツムマブが含まれる。
一実施形態では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の少なくとも１４日前に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の約６０日前、ｒＡＡＶの投与の約４５日前、ｒＡＡＶの投与の約３０日前、ｒＡＡＶの投与の１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に投与される。加えて、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前に３０～６０日間投与される。開示される免疫抑制レジメンはまた、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０特異的抗体を投与することも含む。
加えて、開示される免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回、免疫抑制マクロライドを投与することを含む。免疫抑制レジメンはまた、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与することを含んでもよい。開示される免疫抑制レジメンのいずれにおいても、免疫抑制マクロライドは、経口投与される。例示的な免疫抑制マクロライドには、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスが含まれる。
いくつかの実施形態では、開示される免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。加えて、免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与の約６０日前、ｒＡＡＶの投与の約４５日前、ｒＡＡＶの投与の約３０日前、ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に投与される。
特定の実施形態では、本開示は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び免疫抑制レジメンを投与することを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法を提供し、免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与するか、又はｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与するステップと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、及び約２４時間以内に抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０抗体を投与するステップと、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回、免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与するステップとを含む。例えば、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートであり、抗ＣＤ２０特異的抗体は、リツキシマブ、オクレリズマブ、若しくはオファツムマボン、又はそれ以上の抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、若しくは免疫抑制マクロライドであり、かつ免疫抑制マクロライドは、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである。例示的な実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイドプレドニゾン又はプレドニゾロン、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、及び免疫抑制マクロライドシロリムスを含む。
また、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含む併用療法の使用も提供し、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンであり、免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与するか、又はｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与することと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０抗体を投与することと、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与することとを含む。例えば、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートであり、抗ＣＤ２０特異的抗体は、リツキシマブ、オクレリズマブ、若しくはオファツムマボン、又はそれ以上の抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、若しくは免疫抑制マクロライドであり、かつ免疫抑制マクロライドは、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである。例示的な実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイドプレドニゾン又はプレドニゾロン、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、及び免疫抑制マクロライドシロリムスを含む。
本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するためのｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含む併用療法を提供し、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンであり、かつ免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶ投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、ｒＡＡＶ投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回抗炎症ステロイドを経口投与するか、又はｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回抗炎症ステロイドを投与することと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に、抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０抗体を投与することと、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与することとを含む。例えば、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートであり、抗ＣＤ２０特異的抗体は、リツキシマブ、オクレリズマブ、若しくはオファツムマボン、又はそれ以上の抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、若しくは免疫抑制マクロライドであり、かつ免疫抑制マクロライドは、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである。例示的な実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイドプレドニゾン又はプレドニゾロン、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、及び免疫抑制マクロライドシロリムスを含む。
別の特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）と、免疫抑制レジメンとを投与することを含む、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法を提供し、免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与するか、又は抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与されるステップと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０抗体を投与するステップと、ｉｉｉ）ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回、免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与するステップとを含む。
別の特定の実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含む併用療法の使用を提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択され、免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与するか、又は抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与されることと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０抗体を投与することと、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与することとを含む。
別の特定の実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するためのｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含む併用療法を提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択され、かつ免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶ投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、ｒＡＡＶ投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回抗炎症ステロイドを経口投与するか、又は抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与されることと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に、抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０抗体を投与することと、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与することとを含む。
別の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、アデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの第２の用量の投与前に少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供することを含み、対象が、ＴＰＥに供せられる前にｒＡＡＶの第１の用量を投与された、方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法の使用を提供し、この併用療法は、アデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの第２の用量の投与前に少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供し、対象は、ＴＰＥに供せられる前にｒＡＡＶの第１の用量を投与された。
別の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、この併用療法は、アデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの第２の用量の投与前に少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供し、対象は、ＴＰＥに供せられる前にｒＡＡＶの第１の用量を投与された。
本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）の第２の用量の投与前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供することを含み、対象は、ＴＰＥに供せられる前にｒＡＡＶの第１の用量を投与された、方法を提供する。
更なる実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、ａ）組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの第１の用量を投与するステップと、ｂ）少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿の投与するステップと、ｃ）ｒＡＡＶの第２の用量を投与するステップとを含む、方法を提供する。開示される方法のいずれにおいても、対象の血漿は、第２の用量又はｒＡＡＶの投与前に、少なくとも２回のＴＰＥ又は少なくとも３回のＴＰＥに供される。いくつかの実施形態では、対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に少なくとも４回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に５回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に６回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に７回のＴＰＥに供される。
別の実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法であって、
ａ）ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連の第１の用量を投与するステップと、ｂ）少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供するステップと、ｃ）第２の用量又はｒＡＡＶを投与するステップとを含む、方法を提供する。開示される方法のいずれにおいても、対象の血漿は、第２の用量又はｒＡＡＶの投与前に、少なくとも２回のＴＰＥ又は少なくとも３回のＴＰＥに供される。いくつかの実施形態では、対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に少なくとも４回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に５回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に６回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に７回のＴＰＥに供される。
ａ）ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連の第１の用量を投与するステップと、ｂ）少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供するステップと、ｃ）第２の用量又はｒＡＡＶを投与するステップとを含む、方法を提供する。開示される方法のいずれにおいても、対象の血漿は、第２の用量又はｒＡＡＶの投与前に、少なくとも２回のＴＰＥ又は少なくとも３回のＴＰＥに供される。いくつかの実施形態では、対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に少なくとも４回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に５回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に６回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの第２の用量の投与前に７回のＴＰＥに供される。
更なる実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、ａ）組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与する前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供するステップと、ｂ）ｒＡＡＶを投与するステップとを含む、方法を提供する。開示される方法のいずれにおいても、対象の血漿は、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも２回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも３回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも４回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも５回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも６回のＴＰＥに、又はｒＡＡＶを投与する前に少なくとも７回のＴＰＥに供される。これらの開示された方法では、対象は、ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを投与される。加えて、いくつかの実施形態では、対象は、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与される。例えば、抗炎症ステロイドは、経口投与される。加えて、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートなどのグルココルチコイドである。
加えて、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法であって、ａ）ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス（ｒＡＡＶ）を投与する前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供するステップと、ｂ）ｒＡＡＶを投与するステップとを含む、方法を提供する。開示された方法のいずれにおいても、対象の血漿は、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも２回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも３回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも４回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも５回のＴＰＥに、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも６回のＴＰＥに、又はｒＡＡＶを投与する前に少なくとも７回のＴＰＥに供される。これらの開示された方法では、対象は、ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを投与される。加えて、いくつかの実施形態では、対象は、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与される。例えば、抗炎症ステロイドは、経口投与される。加えて、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートなどのグルココルチコイドである。
開示される方法のいずれにおいても、対象の血漿は、ｒＡＡＶの投与前に少なくとも９日間、投与の少なくとも７日前、投与の５日前、又は投与の２日前に、ＴＰＥに供される。加えて、ｒＡＡＶの投与前に対象の血漿に対して実施されるＴＰＥのセッション間には、約２４～約４８時間がある。特定の実施形態において、被験体の血漿は、ｒＡＡＶの投与前に少なくとも２回のＴＰＥに供され、ＴＰＥの間には約４８時間がある。
本開示に記載の方法のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与時に約１：４００以下の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルを有する。例えば、対象は、ｒＡＡＶの投与時に約１：１００～約１：４００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：１００～１：３００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：１００～１：２００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：２５０～１：５００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：２００～１：４００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルを有する。抗体力価は、総抗体結合力価として決定される。筋ジストロフィーを治療する開示された方法のいずれにおいても、これらの方法は、更に、当該対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップを含む。抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップは、ｒＡＡＶの投与前、ｒＡＡＶの投与後、免疫応答若しくは有害事象が観察される前、又は免疫応答若しくは有害事象が観察された後に、実施され得る。加えて、この決定するステップは、免疫抑制レジメン又はＴＰＥを投与するステップの前に、実行され得る。例えば、この決定するステップは、当該対象への任意のＡＡＶの投与の前に実行されるか、又はこの決定ステップは、当該対象への任意のＡＡＶｒｈ．７４の投与の前に実行される。
本開示はまた、当該対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルを陽性対照と比較するステップを更に含む方法も提供する。例えば、陽性対照は、抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体を利用する。
開示される方法のいずれにおいても、抗ＡＡＶｒｈ．７４の存在の決定は、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ウエスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、リバースＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイを利用して決定されてもよい。
開示された方法のいずれにおいても、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップは、ＮＹＧＭＮ（配列番号２０）、ＤＹＧＭＮ（配列番号２２）、ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号２１）、及びＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号２３）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、又はＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２４）、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号２５）、及びＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号２６）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、又はＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号２７）、ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号２８）、ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号２９）、ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号３０）、及びＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号３１）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、又はＳＶＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３２）、ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号３３）、ＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３４）、及びＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号３５）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、又はＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３６）、ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号３８）、及びＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号３９）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、又はＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号４０）、ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号４１）、ＱＱＲＳＦＹＰＦ（配列番号４２）、及びＱＱＲＴＹＹＰＦ（配列番号４３）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体を利用することを含む。
例示的な実施形態では、開示される方法は、配列番号１０、１２、１４、１６、若しくは１８に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含むモノクローナル抗体、又は配列番号１１、１３、１５、１７、若しくは１９に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含むモノクローナル抗体などの抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体を利用して、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップを含む。
更なる実施形態では、開示される方法は、配列番号１０、１２、１４、１６、又は１８に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体、及び配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を利用して、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップを含む。
開示される方法のいずれにおいても、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップは定量的であり、当該対象は、当該定量に基づいて抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体について血清陽性として特定され、当該免疫抑制レジメン又はＴＰＥは、血清陽性対象に選択的に投与される。本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ｒＡＡＶは、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与の全身経路によって投与される。筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーであり得る。
例えば、投与されるｒＡＡＶの用量は、約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０ｘ１０１４、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１５、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０ｘ１０１４、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇである。
一実施形態では、本開示の方法は、ｒＡＡＶを全身投与することを含み、投与の全身経路は、静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、本開示の方法は、ｒＡＡＶを全身投与することを含み、投与の全身経路は静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約７．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約９．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０１５ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン又はＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、ｒＡＡＶの用量は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、又は約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、又は８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、又は５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、又は約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋ、又は約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ又は１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇで投与され得る。特定の実施形態では、用量又はｒＡＡＶは、約１０ｍＬ／ｋｇで投与される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン又はＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の方法、併用療法又は薬剤のいずれにおいても、ｒＡＡＶの用量は、注射、注入又は移植によって投与され得る。例えば、ｒＡＡＶの用量は、約１時間にわたる注入によって投与される。加えて、ｒＡＡＶの用量は、末梢腕静脈又は末梢脚静脈などの末梢四肢静脈を介する静脈内経路によって投与される。代替的に、注入は、約３０分、又は約１．５時間、又は約２時間、又は約２．５時間、又は約３時間にわたって投与され得る。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の方法、併用療法又は使用のいずれによっても投与されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列、配列番号２又は配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含み得る。加えて、本開示の方法のいずれによっても投与されるｒＡＡＶは、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２又は配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。例えば、ｒＡＡＶは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含み得る。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。
一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、投与されるｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４についての血清型のものである。
いくつかの実施形態では、本開示の方法、併用療法又は使用は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療する。例示的な実施形態は、用量組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを投与するステップを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療を必要とするデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法又は薬剤であり、投与の経路は、静脈内注入であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１時間にわたって約２×１０１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶベクターは、配列番号９の若しくは配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９の、又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
一実施形態では、本開示は、筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列と、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、ｒＡＡＶを提供する。例えば、ヌクレオチド配列は、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードし、ヌクレオチドは、配列番号１に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、更により典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、タンパク質は、マイクロジストロフィン活性を保持する。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋肉収縮時に筋肉膜に安定性を提供し、例えば、マイクロジストロフィンは、筋肉収縮時にショックアブソーバーとして機能する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９の、又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本発明はまた、ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、又はその補体を含み、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードするｒＡＡＶも提供する。
一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２と呼ばれる非複製組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。このベクターゲノムには、ＭＨＣＫ７プロモーター／エンハンサーの制御下にあるＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）、マイクロジストロフィン、ＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）、及び合成ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む、遺伝子発現に必要な最小限の要素が含まれている。ゲノム及び発現カセットの概略図を図１に示す。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、ＩＶ投与後の骨格筋及び心筋における効率的な遺伝子導入を達成するために使用され得る。
別の実施形態では、本開示は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを投与することを含む、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、必要とする対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法、併用療法又は使用であって、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づいて、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ若しくは約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は定量標準としての線状化プラスミドに基づいて約１．８５×１０１３ｖｇ／ｋｇ若しくは約７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、約１～２時間にわたってｒＡＡＶ静脈内注入を対象に投与することを含み、ｒＡＡＶが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、方法、併用療法又は使用を提供する。別の態様では、本開示は、対象の細胞においてベータ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法であって、配列番号１９と少なくとも９０％、９５％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物を対象に投与することを含む、方法を記載する。一態様では、本開示は、対象の筋肉組織においてベータ－サルコグリカン陽性線維を増加させ、及び／又はＣＫレベルを減少させる方法であって、配列番号４４と少なくとも９０％、９５％、又は９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号４５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一の配列を含み、β－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４５に記載のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４５に記載のヌクレオチド配列からなる。
別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４６のアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、更により一般的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一である、β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、β－サルコグリカン活性を保持する。
別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、ストリンジェントな条件下で配列番号４５の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む機能性β－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列、又はその補体を含む、組換えＡＡＶベクターが、本明細書に記載されている。
特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢを投与することを含む、ＬＧＭＤ２Ｅの治療を必要とするヒト対象においてＬＧＭＤ２Ｅを治療するための方法、併用療法又は使用を提供する。例えば、ＬＧＭＤ２Ｅを治療する方法のいずれにおいても、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢは、約０．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ又は約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。すぐ前のものを含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢに関連して本明細書に記載される投与量は、スーパーコイルｑＰＣＲ標準を利用することに基づいている。それぞれ、０．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ及び２ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇは、リニアｑＰＣＲスタンダードを利用して測定した場合、１．８５×１０１３及び７．４１×１０１３ｖｇ／ｋｇに対応する。
特定の実施形態では、ヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、ヒト対象は、ＬＧＭＤ２Ｅに罹患しており、ｒＡＡＶは、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号４４のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢであるｒＡＡＶを含む。
関連する実施形態では、ヒト対象は、筋ジストロフィーＬＧＭＤ２Ｅを患っており、ｒＡＡＶは、約２ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与されるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢであり、この方法は、更に、ｒＡＡＶの投与の１日（１２～２４時間）前に開始し、かつテーパリングの有無にかかわらず６０日間継続する、対象に１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾンを投与することを含む。
別の関連する実施形態では、ヒト対象は、筋ジストロフィーＬＧＭＤ２Ｅを患っており、ｒＡＡＶは、約０．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与されるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢであり、この方法は、更に、ｒＡＡＶの投与の１日（１２～２４時間）前に開始し、かつテーパリングの有無にかかわらず３０日間継続する、対象に１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾンを投与することを含む。
プレドニゾンの３０日及び６０日の投与は、対象の特定の臨床症状に従って、及びそうでなければ本明細書で更に記載されるように、当業者によって、漸減され得ることが認識される。
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム又は０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン筋力、より高いホルムアミド、又は他の変性剤など）も使用することができるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、及び６０℃（２３塩基オリゴの場合）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄が含まれる。
非特異的及び／又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的で、ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液に他の薬剤を含めることができる。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（又は他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランが挙げられるが、他の好適な薬剤も使用され得る。これらの添加物の濃度及びタイプは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を考慮して、異なる配列類似性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者によって調整され得る。
「筋肉特異的制御エレメント」という用語は、筋肉組織での発現に特異的なコード配列の発現を調節するヌクレオチド配列を指す。これらの制御エレメントには、エンハンサー及びプロモーターが含まれる。本開示は、筋肉特異的制御エレメントＭＣＫＨ７プロモーター、ＭＣＫプロモーター及びＭＣＫエンハンサーを含む構築物を提供する。
一態様では、本開示は、筋肉特異的制御エレメントが、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー因子、速筋骨格筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性エレメント、又はグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である、ｒＡＡＶを提供する。
例えば、筋肉特異的制御エレメントは、ＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列の配列番号２であるか、又は、筋肉特異的制御エレメントは、ＭＣＫヌクレオチド配列の配列番号４である。加えて、本開示のｒＡＡＶベクターのいずれにおいても、筋肉特異的制御エレメントヌクレオチド配列、例えば、ＭＨＣＫ７又はＭＣＫヌクレオチド配列は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。例えば、ＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列（配列番号２又は配列番号７）は、図１若しくは図２（配列番号３）又は図１３（配列番号９）に提示される構築物に記述されるように、ヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に操作可能に連結されている。別の例では、ＭＣＫプロモーター（配列番号４）は、図５又は図６（配列番号５）に提示される構築物に記述されるように、ヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に操作可能に連結されている。別の態様では、本開示は、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号１及び配列番号７のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。本発明はまた、配列番号１及び配列番号４のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号３、配列番号５、配列番号６、又は配列番号８のヌクレオチド配列を含むプラスミドに含有されるｒＡＡＶ構築物を提供する。例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号３のＩＴＲ内にあり、かつそれを含み、図２に示されるヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子、ポリＡ、及び３’ＩＴＲのためのコード配列を含む。一実施形態では、このベクターは、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含む。配列番号３に示されるプラスミドは、更に、アンピシリン耐性及びｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。
別の態様では、本開示は、配列番号９のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供し、例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクター構築物は、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、図７に示されている。このｒＡＡＶベクター構築物は、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のためのコード配列、及びポリＡを含む。一実施形態では、ｒＡＡＶベクター構築物は、更に、プロモーターにＩＴＲ５’を、及びポリＡにＩＴＲ３’を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４である。
別の態様では、例えば、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号８のＩＴＲ内にあり、かつそれを含み、図９に示されるヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトＩマイクロジストロフィン遺伝子、ポリＡ、及び３’ＩＴＲのためのコード配列を含む。一実施形態では、このベクターは、配列番号９のヌクレオチド１～４９７７を含む。配列番号３に示されるプラスミドは、更に、カナマイシン耐性及びｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクター構築物を含むプラスミドを提供する。一実施形態では、プラスミドは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子、ポリＡ、及び３’ＩＴＲのためのコード配列を含む。一実施形態では、プラスミドは、カナマイシン耐性を含み、任意選択で、ｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。特定の実施形態では、プラスミドは、配列番号８に示され、図８及び９に示されている。
本開示は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２又は配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。
本開示はまた、配列番号３内にあり、かつそれを含むＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクター構築物ヌクレオチド配列、配列番号８内にあり、かつそれを含むヌクレオチド配列、又は配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。
本開示のｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３などの、任意のＡＡＶ血清型であってもよい。
本開示はまた、本開示のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（又は、本明細書でときどき、単に「組成物」と呼ばれる）も提供する。
別の実施形態では、本開示は、本開示のいずれかのｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収することと、を含む、ｒＡＡＶベクター粒子を産生する方法を提供する。本開示はまた、本開示の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。
筋ジストロフィーを治療する方法のいずれにおいても、対象の細胞において、ベータ－サルコグリカン遺伝子又はマイクロジストロフィン遺伝子発現などの、対象の導入遺伝子のレベルは、ｒＡＡＶの投与後に増加する。ｒＡＡＶの投与の前後に生検された筋肉においてウエスタンブロットにより目的のタンパク質のレベルを測定することにより、細胞内の目的の遺伝子の導入遺伝子の発現が検出される。特に、目的のタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前の目的のタンパク質のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、又は少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、又は少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、目的のタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前の目的のタンパク質のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも約７０％又は少なくとも約７１％又は少なくとも約７２％又は少なくとも約７３％又は少なくとも約７４％又は少なくとも約７５％又は少なくとも約７６％又は少なくとも約７７％又は少なくとも約７８％又は少なくとも約７９％又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％増加する。
加えて、細胞内のマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検における免疫組織化学による目的のタンパク質のレベルを測定することによって検出される。目的のタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前の目的ｍのタンパク質のレベルと比較して、投与後に、少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、又は少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、又は少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、目的のタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前の目的のタンパク質のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも約７０％又は少なくとも約７１％又は少なくとも約７２％又は少なくとも約７３％又は少なくとも約７４％又は少なくとも約７５％又は少なくとも約７６％又は少なくとも約７７％又は少なくとも約７８％又は少なくとも約７９％又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％増加する。
筋ジストロフィーを治療するための方法、併合療法又は使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、対象の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約６５％～約９０％、又は約６５％～約９５％、又は約７５％～約９０％、又は約８０％～約９０％、又は約８５％～約９５％、又は約８７％～約９５％、又は約８７％～約９０％減少する。特に、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約８７％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７２％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７３％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７８％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約９５％減少する。筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象の筋組織における目的のタンパク質の陽性の筋線維の数は、ｒＡＡＶの投与前の目的のタンパク質の陽性の筋線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。例えば、目的のタンパク質の陽性の筋線維の数は、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学により陽性の筋線維の目的のタンパク質のレベルを測定することによって検出される。
筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、ｒＡＡＶの投与は、アルファサルコグリカン又はベータサルコグリカンなどのＤＡＰＣタンパク質の発現をアップレギュレートする。例えば、対象におけるアルファサルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファサルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。加えて、対象におけるベータサルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のベータサルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。アルファサルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶ投与の前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファサルコグリカンタンパク質レベル又はベータサルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
筋ジストロフィーを治療するための方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象における疾患の進行は、６分間歩行テスト、立ち上がり時間、４段上昇、４段昇降、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、１０メートルの時限テスト、１００メートル計時テスト、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、Ｔｉｍｅｄ Ｕｐ ａｎｄ Ｇｏ、及び／又はＧｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｓｕｂｔｅｓｔ Ｓｃａｌｅｄ（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定される場合に、ｒＡＡＶの投与後に遅延する。
例えば、方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、ＮＳＡＡスコアにおいて、少なくとも６ポイントの改善を有する。更に、方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の上昇する時間と比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に上昇する時間において、少なくとも約０．８秒の改善を有する。加えて、方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の４段上昇時間テストと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、４段上昇時間テストにおいて、少なくとも約１．２秒の改善を有する。加えて、方法、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の１００ｍ計時テストと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、１００ｍ計時テストにおいて、少なくとも約７秒の改善を有する。
別の実施形態では、本開示は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を患者に投与することを含む、患者の細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現するための方法、組成物、併用療法又は使用を提供する。例えば、患者の細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。加えて、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、核当たりより多くの数のベクターゲノムを検出することによって患者において測定され、核当たり１ベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、核当たり１コピー超は、マイクロジストロフィン発現レベルと一致している。例えば、細胞は、核当たり１．２個のベクターコピー、又は核当たり１．３個のベクターコピー、又は核当たり１．４個のベクターコピー、又は核当たり１．５個のベクターコピー、又は核当たり１．６個のベクターコピー、又は核当たり１．７個のベクターコピー、又は核当たり１．８個のベクターコピー、又は核当たり１．９個のベクターコピーを有する。
更なる実施形態では、本開示は、血清ＣＫレベルの低下を必要とする患者において血清ＣＫレベルを低下させるための方法、組成物、併用療法又は使用を提供し、この方法は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を患者に投与することを含む。例えば、患者の血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、少なくとも約６５％～約９０％、又は約６５％～約９５％、又は約７５％～約９０％、又は約８０％～約９０％、又は約８５％～約９５％、又は約８７％～約９５％、又は約８７％～約９０％減少する。特に、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約８７％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、組成物、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７２％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、組成物、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７３％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、組成物、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７８％減少する、又は、本開示の筋ジストロフィーを治療するための方法、組成物、併用療法若しくは使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約９５％減少する。
本開示はまた、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を患者に投与することを含む、患者の筋細胞においてマイクロジストロフィン陽性線維を増加させるための方法、組成物、併用療法又は使用を提供する。例えば、ベータサルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶ投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。加えて、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、核当たりより多くの数のベクターゲノムを検出することによって患者において測定され、核当たり１ベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、核当たり１コピー超は、マイクロジストロフィン発現レベルと一致している。例えば、細胞は、核当たり１．２ベクターコピー、又は核当たり１．３ベクターコピー、又は核当たり１．４ベクターコピー、又は核当たり１．５ベクターコピー、又は核当たり１．６ベクターコピー、又は核当たり１．７ベクターコピー、又は核当たり１．８ベクターコピー、又は核当たり１．９ベクターコピーを有する。
別の実施形態では、本開示は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を患者に投与することを含む、アルファサルコグリカンの発現の増加を必要とする患者においてアルファサルコグリカンの発現を増加させるための方法、組成物、併用療法又は使用を提供する。例えば、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
加えて、本開示は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を患者に投与することを含む、ベータサルコグリカンの発現の増加を必要とする患者においてベータサルコグリカンの発現を増加させるための方法、組成物、併用療法又は使用を提供する。例えば、ベータサルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶ投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりベータサルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
本開示はまた、対象における疾患の進行が、６分間歩行テスト、立ち上がり時間、４段上昇、４段昇降、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時テスト、１００メートル計時テスト、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、Ｔｉｍｅｄ Ｕｐ ａｎｄ Ｇｏ、及び／又はＧｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｓｕｂｔｅｓｔ Ｓｃａｌｅｄ（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定される場合に、遅延するように、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を患者に投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを有する患者を治療するための方法、組成物、併用療法又は使用も提供する。
例えば、方法、組成物、併用療法又は使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２７０日後に、ＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６ポイントの改善を有する。更に、方法のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の上昇する時間と比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、上昇する時間において、少なくとも約０．８秒の改善を有する。加えて、方法のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の４段上昇時間テストと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、４段上昇時間テストにおいて、少なくとも約１．２秒の改善を有する。加えて、方法のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の１００ｍ計時テストと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、１００ｍ計時テストにおいて、少なくとも約７秒の改善を有する。
「線維症」とは、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰又は無秩序な沈着及び損傷時の組織の異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、フィブロネクチン及びコラーゲン、例えばコラーゲン１、コラーゲン２、又はコラーゲン３が含まれる。
本開示はまた、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む治療有効量のｒＡＡＶ、又は配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含む治療有効量のｒＡＡＶベクターを投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象において線維症を低減又は予防する方法も提供する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０６６のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
別の実施形態では、本開示は、治療有効量の配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、又は配列番号９のＡＡＶ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含むｒＡＡＶベクターを投与することを含む、線維症の予防を必要とする対象において線維症を予防する方法を提供する。例えば、本開示のｒＡＡＶのいずれも、筋ジストロフィーを患っている対象に投与して線維症を予防され得、例えば、ヒトマイクロジストロフィンタンパク質を発現する本開示のｒＡＡＶは、線維症が対象において観察される前に投与される。加えて、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現する本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤを患っているか又は診断された対象などの、線維症を発症するリスクがある対象に投与され得る。本開示のｒＡＡＶは、筋ジストロフィーを患っている対象に投与して、これらの対象における新規の線維症を予防することができる。
本開示は、線維症が対象において観察される前にｒＡＡＶを投与することを企図する。加えて、ｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤを患っているか又は診断された対象などの、線維症を発症するリスクがある対象に投与することができる。ｒＡＡＶは、筋ジストロフィーを患っており、すでに線維症を発症している対象に投与して、これらの対象において新規の線維症を予防することができる。
本開示はまた、治療有効量の配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、又は配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含むｒＡＡＶを投与することを含む、筋ジストロフィーに羅漢している対象において筋力及び／又は筋肉量を増加させる方法を提供する。
本発明は、線維症が対象において観察される前、又は筋力が低減する前、又は筋肉量が低減する前に、ＤＭＤと診断された患者に本発明のｒＡＡＶベクターを投与することを企図する。
本開示はまた、すでに線維症を発症している筋ジストロフィーに罹患している対象に、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、又は配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含むｒＡＡＶを投与して、これらの対象において新たな線維症を予防するか又はこれらの対象において線維症を低減することも含む。本開示はまた、筋力がすでに低減しているか又は筋肉量が低減している、筋ジストロフィーに罹患している対象に、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、又は配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含むｒＡＡＶを投与して、更なる損傷から筋肉を保護することも含む。
本開示の方法のいずれにおいても、対象は、ＤＭＤ又は任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを患っていてもよい。
本明細書に記載される本開示の方法のいずれかの他の実施形態では、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、以下からなる群から選択されるパーセントレベルだけ減少する：
ａ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又は８５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、又は９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、８８、９３又は９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０日、１８０日、又は２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、又は２７０までに少なくとも約５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１，９２、９３、９４、又は９５％；及び
ｈ）投与後９０、１８０、又は２７０までに少なくとも約５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１，９２、９３、９４、又は９５％。
ａ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又は８５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、又は９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、８８、９３又は９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０日、１８０日、又は２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、又は２７０までに少なくとも約５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１，９２、９３、９４、又は９５％；及び
ｈ）投与後９０、１８０、又は２７０までに少なくとも約５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１，９２、９３、９４、又は９５％。
別の実施形態では、本開示は、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための組成物を提供し、組成物は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの用量を含み、組成物は、全身投与経路用に製剤化され、ｒＡＡＶの投与量は、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４×１０１４ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
例えば、本開示の組成物は、約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０ｘ１０１４、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１５、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０ｘ１０１４、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０ｘ１０１４、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０ｘ１０１５、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０ｘ１０１４、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０ｘ１０１４、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
一実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与のために配合され、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。別の実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与のために配合され、約５．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９．０ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．２５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．７５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．２５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．７５ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約４．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約７．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約８．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約９．０ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約４．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の組成物のいずれにおいても、ｒＡＡＶの用量は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、又は約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、又は８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、又は５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、又は約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋｇ、又は約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、又は１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇで送達される。特定の実施形態では、組成物は、約１０ｍＬ／ｋｇで送達されるｒＡＡＶの用量を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の組成物は、注射、注入又は移植による投与のために製剤化される。例えば、組成物は、約１時間にわたる注入による投与のために製剤化される。加えて、本開示の組成物は、末梢腕静脈又は末梢脚静脈などの末梢四肢静脈を介する静脈内投与用に製剤化される。代替的に、注入は、約３０分、又は約１．５時間、又は約２時間、又は約２．５時間、又は約３時間にわたって投与され得る。
本開示の組成物のいずれも、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含むｒＡＡＶ、又は配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７のマイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含むｒＡＡＶを含む。
特に、本開示の組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するためのものである。例えば、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための組成物を提供し、組成物は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの用量を含み、組成物は、約１時間にわたる静脈内注入による投与用に製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含む。
別の実施形態では、本開示は、線維症の低減を必要とする対象において線維症を低減させるためのｒＡＡＶを含む組成物も提供する。更に、本開示は、筋ジストロフィーに罹患している対象において線維症を予防するためのｒＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。
本開示はまた、筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力及び／又は筋肉量を増加させるためのｒＡＡＶを含む組成物を提供する。更なる態様では、本開示は、筋ジストロフィーの治療のための本開示のｒＡＡＶのいずれかを含む組成物を提供する。
本開示の組成物のいずれかの他の実施形態では、筋ジストロフィーのための治療を必要とするヒト対象への当該組成物の投与後に、対象における血清ＣＫレベルは、組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、以下からなる群から選択されたパーセンテージレベルだけ減少する：
ａ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、７０、又は８５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、又は９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、９９、９３又は９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０日、１８０日、又は２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％；及び
ｈ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％。
ａ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、７０、又は８５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、又は９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、９９、９３又は９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０日、１８０日、又は２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％；及び
ｈ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％。
別の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの用量の使用を提供し、薬剤は、全身投与経路用に製剤化され、ｒＡＡＶの用量は、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４×１０１４ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
例えば、薬剤は、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～４．０×１０１４、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１５、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～６．０×１０１４、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５．０×１０１４、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ～約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
一実施形態では、本開示の薬剤は、全身投与経路が静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである、ｒＡＡＶの用量の全身投与用に製剤化される。別の実施形態では、本開示の薬剤は、全身投与経路用に製剤化され、全身投与経路が静脈内経路であり、ｒＡＡＶの用量が、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．２５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約３．７５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約７．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約９．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０１５ｖｇ／ｋｇである、ｒＡＡＶの用量の全身投与用に製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の使用のいずれにおいても、薬剤は、約５ｍＬ／ｋｇ～約１５ｍＬ／ｋｇ、又は約８ｍＬ／ｋｇ～約１２ｍＬ／ｋｇ、又は８ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ、又は５ｍＬ／ｋｇ～約１０ｍＬ／ｋｇ、又は約１０ｍＬ／ｋｇ～１２ｍＬ／ｋ、又は約１０ｍＬ／ｋｇ～１５ｍＬ／ｋｇ、又は１０ｍＬ／ｋｇ～約２０ｍＬ／ｋｇのｒＡＡＶの用量を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。一実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンは、配列番号５のヌクレオチド５６～４８２０のＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンである。
本開示の使用のいずれにおいても、薬剤は、注射、注入又は移植による投与用に製剤化される。例えば、薬剤は、約１時間にわたる注入による投与用に製剤化される。加えて、薬剤は、末梢腕静脈又は末梢脚静脈などの、末梢四肢静脈を介した静脈内投与用に製剤化される。代替的に、注入は、約３０分、又は約１．５時間、又は約２時間、又は約２．５時間、又は約３時間にわたって投与され得る。
本開示の使用のいずれにおいても、薬剤は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列、又は配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しくは配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含むｒＡＡＶを含む。
本開示の特定の使用は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のためのものである。例えば、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの用量の使用を提供し、薬物は、約１時間にわたる静脈内注入による投与用に製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇであり、ｒＡＡＶは、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含む。
更なる実施形態では、本開示は、線維症の低減を必要とする対象において線維症を低減するための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。例えば、必要とする対象は、ＤＭＤ又は任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーに羅漢している可能性がある。
別の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーに羅漢している対象において線維症を予防する薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。
加えて、本開示は、筋ジストロフィーに羅漢している対象において筋力及び／又は筋肉量を増加させるための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。
本発明はまた、筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供する。
本開示は、筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列及び配列番号２若しくは配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターの使用、又は筋ジストロフィーのための、配列番号９のＡＡＶｒｆ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、若しく配列番号６のヌクレオチド５６－５０２２を含むｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
本開示の使用のいずれの他の実施形態では、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、対象へのｒＡＡＶの投与後に、以下からなる群から選択されるパーセントレベルだけ減少する：
ａ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、７０、又は９５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、又は９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、８８、９３又は９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０日、１８０日、又は２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％；及び
ｈ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％。
ａ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも７８％；
ｂ）投与後２７０日までに少なくとも４６、５５、７０、又は９５％；
ｃ）投与後１８０日までに少なくとも７２、７３、７４、又は９５％；
ｄ）投与後９０日までに少なくとも８７、８８、９３又は９５％；
ｅ）投与後２７０日までに少なくとも７０％；
ｆ）投与後９０日、１８０日、又は２７０日までに７０～９５％；
ｇ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに少なくとも６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％；及び
ｈ）投与後９０、１８０、又は２７０日までに６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５％。
併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、又は筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象の細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルは、組成物又は薬剤の投与後に増加する。細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、組成物又は薬剤の投与前後に生検された筋肉においてウエスタンブロットによりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。特に、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物又は薬剤の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、組成物又は薬剤の投与後に、少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、又は少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、又は少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物又は薬剤の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、組成物の投与後に、少なくとも約７０％又は少なくとも約７１％又は少なくとも約７２％又は少なくとも約７３％又は少なくとも約７４％又は少なくとも約７５％又は少なくとも約７６％又は少なくとも約７７％又は少なくとも約７８％又は少なくとも約７９％又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％増加する。
加えて、細胞内のマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、組成物又は薬剤の投与前後の筋肉生検において免疫組織化学によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。マイクロジストロフィンタンパク質のレベルは、組成物又は薬剤の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも約７０％～少なくとも約８０％、又は少なくとも約７０％～少なくとも約９０％、又は少なくとも約８０％～少なくとも約９０％増加する。例えば、マイクロジストロトロフィンタンパク質のレベルは、組成物又は薬剤の投与前のマイクロジストロフィンのレベルと比較して、組成物又は薬剤の投与後に、少なくとも約７０％又は少なくとも約７１％又は少なくとも約７２％又は少なくとも約７３％又は少なくとも約７４％又は少なくとも約７５％又は少なくとも約７６％又は少なくとも約７７％又は少なくとも約７８％又は少なくとも約７９％又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８１％、又は少なくとも約８２％、又は少なくとも約８３％、又は少なくとも約８４％、又は少なくとも約８５％増加する。
併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、及び筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、組成物又は薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に、減少する。例えば、対象における血清ＣＫレベルは、組成物又は薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約６５％～約９０％又は約６５％～約９５％又は約７５％～約９０％又は約８０％～約９０％又は約８５％～約９５％又は約８７％～約９５％又は約８７％～約９０％減少する。特に、本開示の筋ジストロフィーを治療するための併用療法、組成物、及び薬剤の使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに約８７％減少する。本開示の併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、若しくは筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７２％減少する、又は本開示の併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、若しくは筋ジストロフィーを治療するための薬剤のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７３％減少する、又は本開示の筋ジストロフィーを治療するための組成物、若しくは筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、併用療法、組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約７８％減少する、又は本開示の併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、若しくは筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象における血清ＣＫレベルは、併用療法、組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後６０日までに、約９５％減少する。併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、又は筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象の筋組織中のマイクロジストロフィン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のマイクロジストロフィン陽性線維の数と比較して、併用療法、組成物又は薬剤の投与後に増加する。例えば、マイクロジストロフィン陽性線維の数は、併用療法、組成物又は薬剤の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、又は筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、組成物又は薬剤の投与は、アルファサルコグリカン又はベータサルコグリカンなどのＤＡＰＣタンパク質の発現をアップレギュレートする。例えば、対象におけるアルファサルコグリカンのレベルは、併用療法、組成物又は薬剤の投与前のアルファサルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。アルファサルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶ投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファサルコグリカンタンパク質レベル又はベータサルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、又は筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象における疾患の進行は、６分間歩行テスト、立ち上がり時間、４段上昇、４段昇降、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時テスト、１００メートル計時テスト、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、Ｔｉｍｅｄ Ｕｐ ａｎｄ Ｇｏ、及び／又はＧｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｓｕｂｔｅｓｔ Ｓｃａｌｅｄ（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定される場合に、ｒＡＡＶの投与後に遅延する。
例えば、併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、又は筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれかの投与後に、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、組成物又は薬剤の投与後少なくとも２７０日に、ＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６ポイントの改善を有する。更に、方法、併用療法、筋ジストロフィーを治療するための組成物、又は筋ジストロフィーを治療するための薬剤の使用のいずれにおいても、対象は、併用療法、組成物又は薬剤の投与前の上昇する時間と比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、上昇する時間において少なくとも約０．８秒の改善を有する。加えて、本開示の方法、併用療法、組成物又は使用のいずれにおいても、対象は、併用療法、組成物又は薬剤の投与前の４段上昇テストの時間と比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、４段上昇テストの時間において少なくとも約１．２秒の改善を有する。加えて、本開示の方法、併用療法、組成物又は使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与前の１００ｍ計時テストと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、１００ｍ計時テストにおいて少なくとも約７秒の改善を有する。
別の実施形態では、本開示は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２ヌクレオチドを含む患者細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現するための組成物を提供する。更なる実施形態では、本開示は、患者細胞においてマイクロジストロフィン遺伝子を発現するための薬剤の調製のための、組成物配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２ヌクレオチドの用量の使用を提供する。例えば、患者細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりマイクロジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。加えて、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、核当たりより多くの数のベクターゲノムを検出することによって患者において測定され、核当たり１つのベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、核当たり１コピー超は、マイクロジストロフィン発現レベルと一致している。例えば、細胞は、核当たり１．２個のベクターコピー、又は核当たり１．３個のベクターコピー、又は核当たり１．４個のベクターコピー、又は核当たり１．５個のベクターコピー、又は核当たり１．６個のベクターコピー、又は核当たり１．７個のベクターコピー、又は核当たり１．８個のベクターコピー、又は核当たり１．９個のベクターコピーを有する。
更なる実施形態では、本開示は、血清ＣＫレベルの低下を必要とする患者において血清ＣＫレベルを低下させるための組成物を提供し、この組成物は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２ヌクレオチドを含む。加えて、本開示は、血清ＣＫレベルの低下を必要とする患者において血清ＣＫレベルを低下させるための薬剤の調製のための、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２ヌクレオチドの用量の使用を提供する。例えば、患者における血清ＣＫレベルは、組成物又は薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物又は薬剤の投与後６０日までに、少なくとも約６５％～約９０％又は約６５％～約９５％又は約７５％～約９０％又は約８０％～約９０％又は約８５％～約９５％又は約８７％～約９５％又は約８７％～約９０％減少する。特に、対象における血清ＣＫレベルは、組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物若しくは薬剤の投与後６０日までに約８７％減少するか、又は組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物若しくは薬剤の投与後６０日までに約７２％減少するか、又は組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物若しくは薬剤の投与後６０日までに約７３％減少するか、又は組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物若しくは薬剤の投与後６０日までに約７８％減少するか、又は組成物若しくは薬剤の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、組成物若しくは薬剤の投与後６０日までに約９５％減少する。
本開示はまた、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含む患者筋組織においてマイクロジストロフィン陽性線維を増加させる組成物を提供する。加えて、本開示は、患者筋組織においてマイクロジストロフィン陽性線維を増加させる薬剤の調製のための、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２の用量の使用を提供する。例えば、マイクロジストロフィン陽性線維の数は、組成物又は薬剤の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。加えて、マイクロジストロフィン遺伝子の発現は、核当たりより多くの数のベクターゲノムを検出することによって患者において測定され、核当たり１つのベクターゲノムは、約５０％のマイクロジストロフィン発現であり、核当たり１コピー超は、マイクロジストロフィン発現レベルと一致している。例えば、細胞は、核当たり１．２個のベクターコピー、又は核当たり１．３個のベクターコピー、又は核当たり１．４個のベクターコピー、又は核当たり１．５個のベクターコピー、又は核当たり１．６個のベクターコピー、又は核当たり１．７個のベクターコピー、又は核当たり１．８個のベクターコピー、又は核当たり１．９個のベクターコピーを有する。
別の実施形態では、本開示は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含む、アルファサルコグリカンの発現を必要とする患者においてアルファサルコグリカンの発現を増加させるための組成物を提供する。本開示はまた、アルファサルコグリカンの発現を必要とする患者においてアルファサルコグリカンの発現を増加させるための薬剤の調製のための、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２の用量の使用を提供する。例えば、アルファサルコグリカンのレベルは、組成物又は薬剤の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりアルファサルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
加えて、本開示は、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２を含む、ベータサルコグリカンの発現を必要とする患者においてベータサルコグリカンの発現を増加させるための組成物を提供する。本開示はまた、ベータサルコグリカンの発現を必要とする患者においてベータサルコグリカンの発現を増加させるための薬剤の調製のための、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２の使用を提供する。例えば、ベータサルコグリカンのレベルは、組成物又は薬剤の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロット又は免疫組織化学によりベータサルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。
本開示はまた、患者における疾患の進行をもたらす薬剤の投与が、６分間歩行テスト、立ち上がり時間、４段上昇、４段昇降、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、１０メートル計時テスト、１００メートル計時テスト、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）、Ｔｉｍｅｄ Ｕｐ ａｎｄ Ｇｏ、及び／又はＧｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｓｕｂｔｅｓｔ Ｓｃａｌｅｄ（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコアのいずれかによって測定されるように、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを有する患者を治療するための薬剤の調製のための、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１、配列番号８のヌクレオチド１～４９７７、又は配列番号６のヌクレオチド５６～５０２２の用量の使用も提供する。
例えば、対象は、ｒＡＡＶの投与前のＮＳＡＡスコアと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日後に、ＮＳＡＡスコアにおいて少なくとも６ポイントの改善を有する。更に、対象は、ｒＡＡＶの投与前の上昇する時間と比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、上昇する時間において少なくとも約０．８秒の改善を有する。加えて、対象は、組成物又は薬剤の投与前の４段上昇テストの時間と比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、４段上昇テストの時間において少なくとも約１．２秒の改善を有する。加えて、対象は、組成物又は薬剤の投与前の１００ｍ計時テストと比較して、ｒＡＡＶの投与後少なくとも２７０日に、１００ｍ計時テストにおいて少なくとも約７秒の改善を有する。
本開示は、ｒＡＡＶ．ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの血管内送達後の遺伝子発現を増強するための用量、期間、及び免疫抑制レジメンを特定することと、ＴＰＥを使用して既存のＡＡＶ抗体を除去することと併せて、ｒＡＡＶの投与後又は再投与後に技術を特定し、遺伝子発現を増強することと、ＴＰＥを使用せずに再投与することを評価することに関する。本発明の方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５のいずれかの投与前に、免疫抑制レジメン及び／又はＴＰＥを投与することを包含し、この方法は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５の再投与前に、免疫抑制レジメン及び／又はＴＰＥを投与することを包含する。
本開示は、ヒトマイクロジストロフィンを過剰発現する遺伝子治療用ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、並びに筋ジストロフィー患者において線維症を軽減及び予防する方法を提供する。ＤＭＤの診断の最も早い年齢で採取された筋生検は、顕著な結合組織の増殖を明らかにする。筋線維症は複数の点で有害である。それは、結合組織関門を介した筋内膜の栄養素の通常の通過を減らし、血流を減らし、筋肉から血管由来の栄養成分を奪い、四肢拘縮による歩行の早期喪失の機能的な一因となる。経時的に、筋肉の顕著な線維化の結果として、治療の課題が増加する。これは、連続した時点での結合組織の増殖を比較する筋生検で観察できる。このプロセスは悪化を続け、特に車椅子依存の患者では、歩行の喪失をもたらし、制御不能を加速する。
線維症を軽減するための並行アプローチを含む早期治療なしでは、エクソンスキッピング、ストップコドンリードスルー、又は遺伝子置換療法の利点が完全に達成される可能性は低いであろう。低分子又はタンパク質置換戦略でさえ、筋線維症を軽減するアプローチなしでは失敗する可能性がある。ＡＡＶ．マイクロジストロフィンで治療した既存の線維症を有する高齢ｍｄｘマウスでの以前の研究では、完全な機能回復を達成できないことが示された（Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１，２４５－２５６（２００５））。ＤＭＤ心筋症の進行は、心室壁の瘢痕化と線維化を伴うことも知られている。
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内で、ウイルス学、微生物学、分子生物学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「培養物」への言及は、１つ以上の培養物及び当業者に周知されるその同等物への言及を含む、などである。「組換えＡＡＶ」への言及は、２つ以上のｒＡＡＶビリオンの混合物を含む、などである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「培養物」への言及は、１つ以上の培養物及び当業者に周知されるその同等物への言及を含む、などである。「組換えＡＡＶ」への言及は、２つ以上のｒＡＡＶビリオンの混合物を含む、などである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替案が相互に排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替案及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されているデバイス又は方法に対する統計的実験誤差（誤差の標準偏差）を含むことを示すために使用される。
「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を移入することができる、任意の遺伝子要素を意味する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特性評価されているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする、ヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。類似感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が類似調節制御下にあることも示唆する。
本明細書で使用される場合の「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ１０、及びＡＡＶｒｈ．７４を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターである。ＡＡＶベクターは、好ましくはｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子で、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上が全部又は一部分において欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持することができる。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列を含むように本明細書で定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製、及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更され得る。
「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、生産的なＡＡＶ複製のために次にトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ、及びｃａｐを含む。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を所有することが示されている。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターから失われたトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
「組換えウイルス」とは、例えば、ウイルス粒子への異種核酸配列の付加又は挿入によって遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシドに包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。一実施形態では、ＡＡＶビリオンは、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の産生には、ＡＡＶベクターの産生が含まれ、例えば、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有される。
哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などのＡＡＶゲノム、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質コートに関連する線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む。ＡＡＶビリオンは、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ又は自己相補的（ＳＣ）ＡＡＶのいずれかであり得る。一実施形態では、相補的センス、例えば「センス」又は「アンチセンス」鎖のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされ得、両方の鎖は、等しく感染性である。
「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプセル化する、ＡＡＶタンパク質シェルからなる感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書で定義される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、好適な宿主細胞で産生され、これは、その中に導入されたＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、及びアクセサリー機能を有する。このようにして、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有する）を感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするために必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードすることができる。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに「トランスフェクト」される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を用いて、ヌクレオチド組み込みベクター及び他の核酸分子などの、１つ以上の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
「形質導入」という用語は、複製欠損ウイルスベクターを介した、例えば、組換えＡＡＶビリオンを介したインビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのＤＮＡ分子の送達を意味する。
「宿主細胞」という用語は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、又はその他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用できるか、又は使用されてきた、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的、又は意図的な変異のために、形態又はゲノム又は全ＤＮＡ補体において必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。
「筋肉細胞」又は「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、又は心臓組織に由来する骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞又は細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞など、分化又は未分化であり得る。
「異種」という用語は、コード配列及び制御配列などの核酸配列に関連するとき、通常は一緒に結合されていない、かつ／又は通常は特定の細胞に関連していない配列を示す。したがって、核酸構築物又はベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見られない、別の核酸分子内又は別の核酸分子に付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、自然界のコード配列に関連して見られない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が自然界で見られない（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、細胞内に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であるとみなされるであろう。本明細書で使用される場合、対立遺伝子変異又は自然に発生する変異事象は、異種ＤＮＡを生じさせない。
「コード配列」又は特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に配置されると、インビトロ又はインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。
「核酸」配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。核酸には、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、及び２，６－ジアミノプリンを含むが、これらに限定されないＤＮＡ及びＲＮＡの塩基類似体が含まれる。
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、集合的に、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指し、これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写、及び翻訳されることができる限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために、その通常の意味で本明細書において使用され、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’－方向）コーディング配列の転写を開始させることができる遺伝子に由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、及び「構成的プロモーター」が含まれ得る。一実施形態では、プロモーターは、筋特異的プロモーターであり、これには、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファアクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格の速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、プロモーターは、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、又はＭＨＣＫ７プロモーターである。
「動作可能にリンクされた」という用語は、そのように記述された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次にコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳されるとき、プロモーターは、細胞内のコード配列の「転写を指示」する。
「発現カセット」又は「発現構築物」は、目的の配列又は遺伝子の発現を指示することができる集合体を指す。発現カセットは、上記のように、目的の配列又は遺伝子に（転写を指示するように）作動可能に連結されるプロモーターなどの制御要素を含み、ポリアデニル化配列も含むことが多い。本発明のある特定の実施形態内で、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル、少なくとも１つのマルチクローニング部位、及び「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
ヌクレオチド配列を指す場合の「単離された」とは、示された分子が、他のヌクレオチド配列、クロマチン材料などの他の生物学的高分子の実質的な不在下に存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、しかしながら、分子は、組成物の基本的な特性に悪影響を及ぼさないいくつかの追加の塩基又は部分を含み得る。
特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３」、又は「５」に位置すると記載されている場合など、本出願全体にわたって特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的で、それは、当技術分野で慣習的であると称されるＤＮＡ分子の「センス」又は「コーディング」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。
核酸配列又はアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「配列同一性の割合」、又は「同一の割合」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長であり得るか、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドなど、より小さいフラグメント間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性の割合は、当技術分野で知られている技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、及びＢＬＡＳＴなどの容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。一実施形態では、ＢＬＡＳＴがアラインメントツールとして使用される場合、次のデフォルトパラメータ、遺伝暗号＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリクッス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；並べ替え＝高得点；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋スイスプロテイン＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを指し、これには、ヒト並びにチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜、イヌ及びネコなどの家畜哺乳動物、マウス、ラット、及びモルモットなどのげっ歯動物を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、出生～２歳、１～１０歳の範囲、又は４～１５歳の範囲、又は１０～１９歳の範囲、又は２０～４０歳、又は１５～２９歳又は２５～５５歳の範囲、又は４０～６０歳の範囲、又は５０歳以上又は６０歳以上又は６５歳以上又は７０歳以上のヒトである。
ＡＡＶ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提示されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提示されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提示されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提示されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００ １８６２に提示されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提示されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９及び同第７，７９０，４４９もまた参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提示されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提示されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提示されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提示されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提示されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提示されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００ １８６２に提示されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提示されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９及び同第７，７９０，４４９もまた参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提示されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提示されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレント及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつか又は全ては、プロモーター、目的のＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡと置換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
複数の研究により、筋肉における長期（１．５年を超える）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。また、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）、及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。更に、筋肉は高度に血管形成されているため、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）、及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入が、筋肉内注射に続いて体循環において導入遺伝子産物の出現をもたらした。更に、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌のための必要な細胞因子を保有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬の安定した発現が可能であることを示した。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本開示の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３及びＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導できる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示される。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。筋肉特異的な発現を促進するために、ＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの方法によって、バクテリアプラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、並びに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
本開示の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態では、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐのＤＮＡが存在しない。本開示の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。
例示的な実施形態では、本開示の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクタープラスミドｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ｐＮＬＲｅｐ２－Ｃａｐｒｈ７４及びｐＨｅｌｐを使用するトリプルトランスフェクション法（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，２２２４－２２３２（１９９８）によって産生され、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接するマイクロジストロフィン遺伝子発現カセットを含有する。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化されるのはこの配列である。プラスミドには、マイクロジストロフィン配列と、遺伝子発現を駆動するＭＨＣＫ７エンハンサー及び筋肉特異的プロモーターのコアプロモーターエレメントが含まれている。発現カセットには、高レベルの遺伝子発現を促進するＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）も含まれており、効率的な転写終結のためにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが使用される。
ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４は、血清型ｒｈ７４由来の４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質と３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４プラスミドの概略図を、図３に示す。
ｐＨＥＬＰアデノウイルスヘルパープラスミドは１１，６３５ｂｐであり、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓから入手した。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１機能は２９３細胞によって提供される）。このプラスミドに存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約４０％に過ぎず、アデノウイルスの末端反復配列などの複製に重要なシスエレメントを含んでいない。したがって、このような生産システムから感染性アデノウイルスが生成されることは予想されない。ｐＨＥＬＰプラスミドの概略図を図４に示す。
ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によってなど、当該技術分野で標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
別の実施形態では、本開示は、本開示のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本開示の組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む。本組成物は、希釈剤及びアジュバントなどの他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに対して無毒であり、好ましくは、採用された投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝液及びプルロニック（登録商標）などの界面活性剤を含む。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、及び細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。カプセル化されたベクターゲノム力価を決定する１つの例示的な方法は、（Ｐｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５－８６９，２０１７）に記載される方法などの定量的ＰＣＲを使用する。特に記載されない限り、本明細書に記載の投与量は、スーパーコイルＤＮＡ標準によって決定される用量に対応する。
インビボ又はインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本開示によって企図される。インビボ方法は、有効用量又は有効複数回用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（人間を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）し、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは予防し、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。本開示の方法による予防又は治療のために企図される疾患の例は、ＤＭＤである。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次的治療の両方を含む。新規の療法との併用など、本開示の方法と標準の医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との併用が特に企図される。
有効用量の組成物、併用療法又は製剤の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与の経路及び血清型は、感染及び／又は治療される疾患状態、並びにマイクロジストロフィンタンパク質を発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者により選択及び／又は適合され得る。
本開示は、本開示のｒＡＡＶ、製剤、及び組成物の有効用量の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管を通した吸収などの経腸投与、及び注射、注入、又は移植を通した非経口投与が含まれる。
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉への注射及び血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の様式で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及び０．００１％のポロキサマー１８８を含有する緩衝液に配合される。
本明細書に開示される方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型に応じて変動し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、２×１０１４から、又は約１×１０１５以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、２×１０１４ｖｇ、１×１０１５ｖｇ）で表されてもよい。投薬量はまた、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．２５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．７５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ）で表されてもよい。ＡＡＶを滴定する方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉への注射及び血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の様式で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射を目的として、ゴマ油若しくは落花生油などのアジュバント溶液、又は水性プロピレングリコール溶液、及び滅菌水溶液を用いることができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
注射用途に好適な薬学的な担体、希釈剤、又は賦形剤には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射器使用可能性が存在する程度に流動性でなければならない。形態は、製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系又は異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。
対象への形質導入及び形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／又はＰＣＲなどの従来の技術を使用して、又は選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射による、又は例えばカテーテルを使用して平滑筋及び心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。
本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、マイクロジストロフィンタンパク質の持続的発現をもたらす。したがって、本開示は、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくは、ヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、本開示の１つ以上のｒＡＡＶで組織（筋肉などの組織、肝臓及び脳などの臓器、並びに唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）を形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本開示の一実施形態は、筋特異的制御要素によって指示される筋細胞及び筋肉組織を形質導入する方法を提供し、これには、限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１））、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御要素（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７））、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい）、並びにマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素、低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５６８０－５６８４（１９９１））、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘発性要素及びプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、並びに他の制御要素が含まれる。
筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本開示は、形質導入筋線維由来のマイクロジストロフィンの持続的発現を企図する。
したがって、本開示は、マイクロジストロフィンをコードする有効用量のｒＡＡＶ（又は、本質的に同時に投与される用量若しくは間隔が置かれる用量）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
免疫抑制レジメン
本開示は、対象が免疫抑制レジメンを受けている筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。免疫抑制レジメンという用語は、対象の免疫系を抑制又は調節する治療方法を指す。このレジメンは、１つ以上の免疫抑制剤の投与を含む。これらの方法のいずれにおいても、免疫抑制レジメンは、少なくとも１つの免疫抑制剤、又は少なくとも２つの免疫抑制剤、又は少なくとも３つの免疫抑制剤、又は少なくとも４つの免疫抑制剤、又は少なくとも５つの免疫抑制剤を含む。
本開示は、対象が免疫抑制レジメンを受けている筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。免疫抑制レジメンという用語は、対象の免疫系を抑制又は調節する治療方法を指す。このレジメンは、１つ以上の免疫抑制剤の投与を含む。これらの方法のいずれにおいても、免疫抑制レジメンは、少なくとも１つの免疫抑制剤、又は少なくとも２つの免疫抑制剤、又は少なくとも３つの免疫抑制剤、又は少なくとも４つの免疫抑制剤、又は少なくとも５つの免疫抑制剤を含む。
免疫抑制レジメンは、遺伝子療法の投与前、又は遺伝子療法の投与後の対象においてｒＡＡＶに対する免疫応答の開始前に免疫抑制レジメンが投与されるという点で、予防的に投与される。免疫応答には、投与されるｒＡＡＶに対する有害免疫応答又は炎症反応が含まれる。免疫応答は、投与されるｒＡＡＶ、例えば、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体に応答する対象における抗体の産生であってもよい。
予防的投与には、遺伝子療法の投与と同時の、例えば、遺伝子療法の投与の２４時間以内、又は遺伝子療法の投与の１２時間以内、又は遺伝子療法の投与の６時間以内、又は遺伝子療法の投与の５時間以内、又は遺伝子療法の投与の４時間以内、又は遺伝子療法の投与の３時間以内、又は遺伝子療法の投与の２時間以内、又は遺伝子療法の投与の我々以内の免疫抑制レジメンの投与が含まれる。免疫抑制剤は、対象の免疫系を阻害する、対象の免疫系の有効性を低減させる、又は対象の免疫系の活性若しくは有効性を調節する任意の薬剤である。
他の実施形態では、免疫抑制レジメンは、治療的に投与される。例えば、免疫抑制剤は、遺伝子療法の投与後の対象においてｒＡＡＶに対する免疫応答の開始後に投与される。対象における免疫応答には、対象へのｒＡＡＶの投与に続くか、又はそれによって引き起こされる、有害な免疫応答又は炎症反応が含まれる。免疫応答は、投与されるｒＡＡＶ、例えば、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体に応答する対象における抗体の産生であってもよい。
他の実施形態では、免疫抑制レジメンは、遺伝子療法の第２の用量を投与する前に投与される。いくつかの実施形態では、第２の用量は、治療的血漿交換（ＴＰＥ）後に投与される。
例示的な免疫抑制剤には、グルココルチコステロイド、ヤヌスキナーゼ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、プリン類似体、メトトレキサート及びシクロホスファミドなどの細胞増殖抑制剤、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＤＨ）阻害剤、モノクローナル抗体又は融合タンパク質及びポリペプチドなどの生物製剤、並びにポリペプチドが含まれる。
免疫抑制剤は、炎症を減少させ、対象の免疫系を抑制又は調節するステロイドである、抗炎症ステロイドであってもよい。例示的な抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ブデソニド又はプレドニゾンなどのグルココルチコイドである。
ヤヌスキナーゼ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素のうちの１つ以上を標的とすることによる、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害剤である。例示的なヤヌスキナーゼ阻害剤には、トファシチニブ、バリシチニブ、ウパダシチニブ、ペフィシチニブ、及びオクラシチニブが含まれる。
カルシニューリン阻害剤は、シクロフィリンに結合し、カルシニューリンの活性を阻害する。例示的なカルシニューリン阻害剤には、シクロスポリン、タクロリムス及びピセクロリムスが含まれる。
ｍＴＯＲ阻害剤は、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼｍＴＯＲを低減又は阻害する。例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、シロリムス、エベロリムス、及びテムシロリムスが含まれる。
免疫抑制剤には、免疫抑制マクロライドが含まれる。「免疫抑制マクロライド」という用語は、対象の免疫系を抑制又は変調するマクロライド剤を指す。マクロライドは、クラジノース又はデソアミンなどの１つ以上のデオキシ糖が付着した大きな大環状ラクトン環を含む薬剤のクラスである。ラクトン環は通常、１４、１５、又は１６員である。マクロライドは、ポリケチドクラスの薬剤に属し、天然産物であり得る。免疫抑制マクロライドの例には、タクロリムス、ピメクロリムス、及びシロリムスが含まれる。
プリン類似体は、ヌクレオチド合成を阻止し、ＩＭＤＨ阻害剤を含む。例示的なプリン類似体には、アザチオプリン、ミコフェノール酸、及びレフノミドが含まれる。
例示的な免疫抑制生物製剤には、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキネヌマブ、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ベラタセプト、及びダクリズマブが含まれる。
特に、免疫抑制剤は、抗ＣＤ２０抗体である。抗ＣＤ２０特異的抗体という用語は、ＣＤ２０に特異的に結合するか、又はＣＤ２０の発現若しくは活性を阻害若しくは低減する抗体を指す。例示的な抗ＣＤ２０抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ、又はオファツムマブが含まれる。
免疫抑制抗体の追加の例には、バシリキシマブ及びダクリズマブなどの抗ＣＤ２５抗体（又は抗ＩＬ２抗体若しくは抗ＴＡＣ抗体）、並びにムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビシリズマブなどの抗ＣＤ３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体が含まれる。
本発明の実施形態では、本開示の１つ以上の方法で利用される免疫抑制剤（免疫抑制抗体）は、ナノ粒子として投与され得る。ナノ粒子を作製及び／又は調合する方法、並びに本開示の方法で利用できるナノ粒子には、例えば、ポリマーとして（Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６７：１９５－２０３，２００９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓａｍｉ．６ｂ１６５５６，２０１７；Ｐｅｒｅｐｅｌｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ６：２５９－２６８，２０１７）、リポソームとして（Ｂｕｙｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １５８（３）：３６２－３７０，２０１２；Ｓｃａｒａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．１７：１－１４，２０１７）、ミセルとして（Ｔａｎｇｓａｎｇａｓａｋｓｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １７：２４６－２５５，２０１６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０８８／１３６１－６５２８／ａａ６５１９，２０１７）、マイクロエマルションとして（ＷＯ １１／００４３９５）、ナノエマルション又は固体脂質ナノ粒子として（Ｓａｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：６５３－６５８，２０１３；ａｎｄ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（１）：１０５－１２０，２０１４）、並びにＷＯ２００８／０６６９６５、ＷＯ２０１１／１４３２０１、ＷＯ２００８／０１４４７８、ＷＯ２０２０／０８１９３８、ＷＯ２０１３／０１６０５８、ＷＯ２０１３／０８６３７３、ＷＯ２０１９／１７７５５０、ＷＯ２０１３／０１６１２６、ＷＯ２０１９／０８９８２８、ＷＯ９９／３９７４１、ＷＯ２０１７／１１７５２８、ＷＯ２０１７／００４１４３、ＷＯ２０１７／０７５５３１、ＷＯ２０１５／１９９９５２、ＷＯ２０１４／００８３３４、ＷＯ２０１３／０８６３７３、ＷＯ２０１３／０８６３２２、ＷＯ２０１３／０１６０５８、ＷＯ２０１３／０８６３７３、ＷＯ２０１１／１４１７０５及びＷＯ２００１／０７５４８、米国特許出願第２００４／０１４２０２５号、同第２００７／００４２０３１号、同第２０１６／０１９９４８５号、同第２０１６／０００９６３７号、同第２０１５／０２７３０６８号、同第２０１５／０２６５７０８号、同第２０１５／０２０３４４６号、同第２０１５／０００５３６３号、同第２０１４／０３０８３０４号、同第２０１４／０２００２５７号、同第２０１３／０８６３７３号、同第２０１３／０３３８２１０号、同第２０１３／０３２３２６９号、同第２０１３／０２４５１０７号、同第２０１３／０１９５９２０号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１３／００２２６４９号、同第２０１３／００１７２２３号、同第２０１２／０２９５８３２号、同第２０１２／０１８３５８１号、同第２０１２／０１７２４１１号、同第２０１２／００２７８０３号、同第２０１２／００５８１８８号、同第２０１１／０３１１５８３号、同第２０１１／０３１１５８２号、同第２０１１／０２６２５２７号、同第２０１１／０２１６６２２号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１１／００９１５２５号、同第２０１１／００７６３３５号、同第２０１１／００６００３２号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２００７／００４２０３１号、同第２００６／０２４００９３号、同第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０００８９１０号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００５／０１７０５４号、同第２００５／０１１８２５３号、同第２００５／００６４５９５号、同第２００４／０１４２０２５号、同第２００７／００４２０３１号、同第１９９９／００９０７６、及び米国特許第８，５６９，２５６号、同第５，９６５，５４２号に記載されるものが含まれ、それらの全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
治療的血漿交換
治療的血漿交換（ＴＰＥ）は、抗体などの、高分子量物質を除去するように設計された体外血液浄化技術である。ある用量のｒＡＡＶの初期の全身投与後、対象は、ＡＡＶ血清型に対する抗体を作ることができ、例えば、対象は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与後にＡＡＶｒｈ７４に対する抗体を作る。ＴＰＥを使用してこれらの抗体を除去することにより、ｒＡＡＶベクターの安全で効果的な再投与が可能になる。ＴＰＥプロセスでは、全血が、バスキュラーアクセスを介して除去され、続いて、血漿（抗体）が除去されるアフェレーシスマシン内の遠心分離機により回転される。赤血球は、対象の維持液用の補充液（ヒトアルブミン）とともに戻るように送達される。
治療的血漿交換（ＴＰＥ）は、抗体などの、高分子量物質を除去するように設計された体外血液浄化技術である。ある用量のｒＡＡＶの初期の全身投与後、対象は、ＡＡＶ血清型に対する抗体を作ることができ、例えば、対象は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与後にＡＡＶｒｈ７４に対する抗体を作る。ＴＰＥを使用してこれらの抗体を除去することにより、ｒＡＡＶベクターの安全で効果的な再投与が可能になる。ＴＰＥプロセスでは、全血が、バスキュラーアクセスを介して除去され、続いて、血漿（抗体）が除去されるアフェレーシスマシン内の遠心分離機により回転される。赤血球は、対象の維持液用の補充液（ヒトアルブミン）とともに戻るように送達される。
ＴＰＥセッションで交換される血漿の量は、対象の推定血漿量（ＥＰＶ）に関連して決定される。ＥＰＶを計算するために、多くの式を使用することができる（例えば、Ｉｎｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．４５：８４１－８５０，１９５５，Ｒｅｔｚｌａｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ３３：６４９－８８７，１９６９、Ｆｅｌｄｓｃｈｕｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ５６：６０５－６１２，１９７７、Ｓｐｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ ｐｌａｓｍａ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｉｎ： Ｓｍｅｂｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．Ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｌｏｏｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ： Ｋｒａｇｅｒ．１９８６， ｐｐ． ３９４－４０２を参照されたい）。ＥＰＶを推定する例示的な方法は、Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．３８：１６０－１６６，１９９０に記載される次式にしたがった対象の体重及びヘマトクリットを使用して計算され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＰＶ＝［０．０６５ｘ体重（ｋｇ）］ｘ［１－ヘモクリット］
ＥＰＶ＝［０．０６５ｘ体重（ｋｇ）］ｘ［１－ヘモクリット］
実施例５に記載のプロトコルは、ＩｇＧ抗体の動力学に基づいて開発され、４８時間後にリバウンドがあり、前の手順から除去された抗体の約５０～６０％がリバウンドすることを示している。本明細書に記載の方法の目的のために、一実施形態では、遺伝子送達を可能にするＡＡＶｒｈ．７４抗体レベル＜１：１００まで抗体力価を低減させなければならないことが決定された。
例えば、対象の血漿をＴＰＥに供する方法は、対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約５０％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約５５％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約６０％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約６３％を除去するか、又は抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約６４％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約６５％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約６９％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約７０％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約７４％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約７５％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約８５％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約９０％を除去するか、又は対象の血管内空間内の抗ｒＡＡＶ抗体の少なくとも約９５％を除去する。
開示された方法は、対象の血漿を、少なくとも１回のＴＰＥセッション、又は少なくとも２回のＴＰＥセッション、又は少なくとも３回のＴＰＥセッション、又は少なくとも５回のＴＰＥセッション、又は少なくとも６回のＴＰＥセッション、又は少なくとも７回のＴＰＥセッション、又は少なくとも８回のＴＰＥセッション、又は少なくとも９回のＴＰＥセッション、又は少なくとも１０回のＴＰＥセッションに供することを含む。加えて、ＴＰＥセッションは、約１～５日、又は約１～１０日、又は約５～１０日、又は約５～７日又は約７～１０日にわたって１日に１回実施される。ＴＰＥセッションは、２日間連続で１日に１回、又は３日間連続で１日に１回、又は４日間連続で１日に１回、又は５日間連続で１日に１回、又は６日間連続で１日に１回、又は７日間連続で１日に１回、又は７日間連続で１日に１回、又は８日間連続で１日に１回、又は９日間連続で１日に１回、又は１０日間連続で１日に１回実施される。
ＴＰＥは、Ｇｕｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ ３６：１７３－１８２，１９８４に記載される透過性の高いフィルター及び透析機器を使用する膜血漿分離（ＭＰＳ）を使用する、Ｇｕｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ ７：３５－３８，１９８４に記載される選択的細胞除去（細胞吸着除去療法）を使用する血液バンク手順を使用して実施される技術を用いて実施される。ＴＰＥを実施する追加の方法は、Ｓｏｗａｄａ ｅｔ ａｌ．（利用可能な除去システム：最先端技術。Ｉｎ Ｎｙｄｅｇｇｅｒ ＵＥ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｉｔｃ Ｈｅｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ １９９０ｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ，Ｖｏｌ ５７．Ｂａｓａｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：Ｋａｒｇｅｒ．１９９０ ｐｐ．５７－１１３））に記載されている。これらの参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、（ｒＡＡＶ）ｒｈ７４ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含む（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン遺伝子療法での対象の治療と、ヒト患者を含む、対象の血清又は血漿が、既存の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体を含有し得、したがって、任意の遺伝子療法治療を受ける前にＡＡＶｒｈ．７４について血清陽性として特定され得ることが認識される免疫抑制レジメン、ＴＰＥ、又は両方で対象を更に治療することと、関連した対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在の決定を含む。ヒト患者を含む対象は、ＡＡＶベースの遺伝子治療を受けることにより、血清陽性になり得ることが、更に認識される。したがって、その決定は、そのような対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在及びレベルを監視するように使用され得、免疫抑制レジメン、ＴＰＥ、又は両方を、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンでの治療の前にそのような対象に投与すべきかどうかを決定する際に更に使用され得る。この関連では、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、初回の遺伝子療法治療、又は再投与治療を含む追加の遺伝子療法治療であり得る。この関連では、そのような血清又は血漿における血清陽性の決定を使用して、対象が、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンでの初回の遺伝子療法治療に好適であるかどうか、対象が、免疫抑制レジメン及び／又はＴＰＥを必要としているかどうか、並びに、免疫抑制レジメンによる治療により、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンでの治療か若しくは再治療について対象を好適にするのに十分なレベルに抗ＡＡＶｒｈ７４抗体由来の血清又は血漿での対象の清澄化がもたらされたかどうかを決定するように使用される。対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在のそのような決定に有用な方法及び組成物には、Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｈ７４ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２ｎｄａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ，２０１９、及び米国特許出願第６３／０３８９５７号に対応する２０２１年６月１５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０３７３１４に記載されるものが含まれ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在の決定に利用される抗体の例には、以下が含まれるか、又は本明細書に別途記載される：
対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在の決定に利用される抗体の更なる例には、ＮＹＧＭＮ（配列番号２０）、ＤＹＧＭＮ（配列番号２２）、ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号２０）、ＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号２３）、及びＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号２１）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列、及び／又はＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２４）、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号２５）、及びＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号２６）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び／又はＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号２７）、ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号２８）、ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号２９）、ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号３０）、及びＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号３１）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列、及び／又はＳＶＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３２）、ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号３３）、ＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３４）、ＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３４）、及びＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号３５）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列、及び／又はＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３６）、ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号３８）、及びＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号３９）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び／又はＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号４０）、ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号４１）、ＱＱＲＳＦＹＰＦ（配列番号４２）、及びＱＱＲＴＹＹＰＦ（配列番号４３）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列が含まれる。
マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶによる、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（「ＤＭＤ」）又はベッカー型筋ジストロフィー（「ＢＭＤ」）を含む筋ジストロフィーの治療
本発明は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、マイクロジストロフィンをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与するステップを含み、更に免疫抑制レジメンを投与することを含む、方法を包含する。本発明の様々な実施形態において、方法は、マイクロジストロフィンをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、更に、例えばプレドニゾンを含む抗炎症ステロイドを投与することを含む。
本発明は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、マイクロジストロフィンをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与するステップを含み、更に免疫抑制レジメンを投与することを含む、方法を包含する。本発明の様々な実施形態において、方法は、マイクロジストロフィンをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、更に、例えばプレドニゾンを含む抗炎症ステロイドを投与することを含む。
マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶで筋ジストロフィーを治療することを対象とし、更に免疫抑制レジメン又は抗炎症ステロイドを投与することを含む本発明の全ての実施形態において、本発明の方法で利用できるヌクレオチド配列をコードするｒＡＡＶ又はマイクロジストロフィンには、各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ－２０２０／１２３６４５、ＷＯ－２０１９／２０９７７７、ＷＯ－２０１９／１９５３６２、ＷＯ－２０１６／１１５５４３、ＷＯ－２０１９１１８８０６、ＷＯ－２０１７／２２１１４５に記載されているものが含まれ、ＳＧＴ－００１、ｚｉｌｄｉｓｔｒｏｇｅｎｅ ｖａｒｏｐａｒｖｏｖｅｃ、及びＰＦ－０６９３９９２６が含まれる。
肢帯型筋ジストロフィーの治療
肢帯型筋ジストロフィー（「ＬＧＭＤ」）の治療は、本発明の態様である。本明細書に記載の本発明の方法は、そのようなジストロフィーを治療するのに有用なｒＡＡＶベクターを用いることによって、肢帯型筋ジストロフィーの治療に利用できることが認識されている。このようなｒＡＡＶベクターには、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を含むＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３９８９３（ＷＯ２０２０／０６４５８）、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶを含む米国特許出願第６３／０２４，３３８号、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを含むＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５７７９（ＷＯ２０１９／１５４７４）、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを含むＰＣＴ／ＵＳ２０２０／４７３３９、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢを含むＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１９８９２（ＷＯ２０２０／１７６６１４）、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５を含むＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６１７０３（ＷＯ２０１７／０８３７７６）に記載されるものが含まれ、これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
肢帯型筋ジストロフィー（「ＬＧＭＤ」）の治療は、本発明の態様である。本明細書に記載の本発明の方法は、そのようなジストロフィーを治療するのに有用なｒＡＡＶベクターを用いることによって、肢帯型筋ジストロフィーの治療に利用できることが認識されている。このようなｒＡＡＶベクターには、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を含むＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３９８９３（ＷＯ２０２０／０６４５８）、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶを含む米国特許出願第６３／０２４，３３８号、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを含むＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１５７７９（ＷＯ２０１９／１５４７４）、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを含むＰＣＴ／ＵＳ２０２０／４７３３９、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢを含むＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１９８９２（ＷＯ２０２０／１７６６１４）、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５を含むＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６１７０３（ＷＯ２０１７／０８３７７６）に記載されるものが含まれ、これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
筋ジストロフィーを治療するための併用療法
本開示は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィーを治療することを含む、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、併用療法は、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドを含む。本開示はまた、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィーを治療することを含む、筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドを含む併用療法の使用を提供する。
本開示は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィーを治療することを含む、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、併用療法は、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドを含む。本開示はまた、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィーを治療することを含む、筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドを含む併用療法の使用を提供する。
本開示は、同時に、連続して又は異なる時点で投与されることを含む、組み合わせて投与されるｒＡＡＶ ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び抗炎症ステロイドを含む併用療法及び薬剤を提供する。本開示は、同時に、連続して又は異なる時点で投与されることを含む、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択されるｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドを組み合わせて含む併用療法及び薬剤を提供する。例えば、抗炎症ステロイドは、グルココルチコイドである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである。いくつかの実施形態では、抗炎症ステロイドは、経口投与用に配合される。併用療法及び薬剤の場合、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前及び投与後の両方で投与され得る。代替的に、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前のみに又は投与後のみに投与される。
いくつかの併用療法及び薬剤では、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の約１２時間前、又はｒＡＡＶの投与の約２４時間前、又はｒＡＡＶの投与の約３６時間前、又は投与の約４８時間前、又はｒＡＡＶの投与の約６０時間前、又はｒＡＡＶの投与の約７２時間前、又は投与の約９６時間前に投与される。いくつかの併用療法及び薬剤では、炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の約５日前、ｒＡＡＶの投与の約６日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、又はｒＡＡＶの投与の約８日前、又はｒＡＡＶの投与の約９日前、又はｒＡＡＶの投与の約１０日前、又はｒＡＡＶの投与の約１１日前、又はｒＡＡＶの投与の約１２日前、又はｒＡＡＶの投与の約１３日前、又はｒＡＡＶの投与の約１４日前、又はｒＡＡＶの投与の約３０日前に投与される。
いくつかの併用療法及び薬剤では、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前に約７日間、少なくとも１日１回投与されるか、又はｒＡＡＶの投与前に約１４日間、少なくとも１日１回投与されるか、又は２１日間、少なくとも１日１回投与されるか、又はｒＡＡＶの投与前に約２８日間、少なくとも１日１回投与されるか、又はｒＡＡＶの投与前に約３０日間、少なくとも１日１回投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の約４５日前に、少なくとも１日１回投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の約６０日前に、少なくとも１日１回投与される。いくつかの組成物及び薬剤では、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与の３０から６０日前に投与される。
例示的な併用療法及び薬剤では、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与前に投与され、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～６０日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～７日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～１４日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～２１日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～２４日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～２８日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後少なくとも１～３０日までに、又はｒＡＡＶの投与後少なくとも３０～６０日までに投与される。
本明細書に開示される併用療法及び薬剤のいずれにおいても、併用療法又は薬剤はまた、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイドと組み合わせて投与される抗ＣＤ２０特異的抗体を含んでもよい。抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前に投与される。いくつかの組成物では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の少なくとも７日前に投与される。例示的な抗ＣＤ２０抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ、又はオファツムマブが含まれる。
いくつかの併用療法及び薬剤では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の約６０日前、又はｒＡＡＶの投与の約４５日前、又はｒＡＡＶの投与の約３０日前、又はｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に投与される。いくつかの組成物では、抗ＣＤ２０抗体は、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。いくつかの併用療法及び薬剤では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与後に投与される。例えば、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前及び投与後の両方で投与される。代替的に、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前に投与されるか、又は抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与後に投与される。
加えて、開示された併用療法及び薬剤のいずれにおいても、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶ及び抗炎症ステロイド、並びに任意選択で、抗ＣＤ－２０抗体と組み合わせて、対象に投与される。免疫抑制マクロライドの例には、タクロリムス、ピメクロリムス、及びシロリムスが含まれる。いくつかの併用療法及び薬剤では、免疫抑制マクロライドは、経口投与のために配合される。いくつかの併用療法及び薬剤では、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与前及びｒＡＡＶの投与後の両方で投与され得る。代替的に、免疫抑制マクロライドは、投与前に投与されるか、又はｒＡＡＶ若しくは免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与後に投与される。
いくつかの併用療法及び薬剤では、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも４日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも５日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも６日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも７日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも１０日前に投与されるか、又は投与の少なくとも１４日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも３０日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも４５日前に投与されるか、又はｒＡＡＶの投与の少なくとも６０日前に投与される。いくつかの併用療法及び薬剤では、免疫抑制マクロライドは、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。
本開示はまた、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィーを治療することを含む、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを同時投与することを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメン１つ以上の成分は、同時に、連続して又は異なる時点で投与される。加えて、本開示はまた、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー及び肢帯型筋ジストロフィーの治療を含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含む併用療法の使用を提供し、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの１つ以上の成分は、同時に、連続して又は異なる時点で投与される。例えば、本開示は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及び免疫抑制レジメンを含む筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を含み、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの成分の１つ以上は、同時に、連続して又は異なる時点で投与される。例えば、本開示は、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択されるｒＡＡＶ、及び免疫抑制レジメンを含む、筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を含み、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの成分の１つ以上は、同時に、連続して又は異なる時点で投与される。
例えば、本開示は、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンと、筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための免疫抑制レジメンとを含む併用療法の使用を提供し、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を含み、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの成分の１つ以上は、同時に、連続して又は異なる時点で投与される。例えば、本開示は、筋ジストロフィーを治療するためのｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの使用を提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択され、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を含み、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンの成分の１つ以上は、同時に、連続して又は異なる時点で投与される。
免疫抑制レジメンという用語は、対象の免疫系を抑制又は調節する治療方法を指す。このレジメンは、１つ以上の免疫抑制剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドを投与することを含む。
例示的な併用療法又は薬剤では、免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に投与される抗炎症ステロイドを含む。別の例示的な併用療法又は薬剤では、免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与前に投与される抗炎症ステロイドを含み、抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回投与されるか、又は抗炎症ステロイドは、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与される。別の実施形態では、プレドニゾンなどのグルココルチコイド抗炎症ステロイドは、１ｍｇ／ｋｇでのｒＡＡＶの投与後、少なくとも６０日間投与される。
開示される併用療法及び薬剤のいずれにおいても、免疫抑制療法において、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートなどのグルココルチコイドである。いくつかの併用療法では、抗炎症ステロイドは、経口投与のために配合される。
更なる例示的な併用療法及び薬剤では、免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与前に投与される抗ＣＤ２０特異的抗体を含む。例えば、抗ＣＤ２０抗体は、血管内注入による投与のために配合される。例示的な抗ＣＤ２０特異的抗体には、リツキシマブ、オクレリズマブ又はオファツムマブが含まれる。
いくつかの併用療法及び薬剤では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の少なくとも１４日前に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与の約６０日前、ｒＡＡＶの投与の約４５日前、ｒＡＡＶの投与の約３０日前、ｒＡＡＶの投与の１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に投与される。加えて、抗ＣＤ２０特異的抗体は、ｒＡＡＶの投与前に３０～６０日間投与される。開示される免疫抑制レジメンはまた、ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０特異的抗体を投与することも含む。
加えて、開示される免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回投与される免疫抑制マクロライドを含む。免疫抑制レジメンはまた、ｒＡＡＶの投与後に投与される免疫抑制マクロライドを含んでもよい。開示される免疫抑制レジメンのいずれにおいても、免疫抑制マクロライドは、経口投与のために配合される。例示的な免疫抑制マクロライドには、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスが含まれる。
いくつかの実施形態では、開示される免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与の３０～６０日前に投与される。加えて、免疫抑制レジメンは、ｒＡＡＶの投与の約６０日前、ｒＡＡＶの投与の約４５日前、ｒＡＡＶの投与の約３０日前、ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、約２４時間、又はｒＡＡＶの投与の約１２時間前に投与される。
特定の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、併用療法は、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含み、免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に経口投与される抗炎症ステロイド、及びｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回投与される抗炎症ステロイド、又はｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与される抗炎症ステロイドと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に静脈内投与される抗ＣＤ２０抗体（及び任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に投与される抗ＣＤ２０抗体を含む）と、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、１日１回経口投与される免疫抑制マクロライド（及び任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に投与される免疫抑制マクロライドを含む）と、を含む。例えば、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートであり、抗ＣＤ２０特異的抗体は、リツキシマブ、オクレリズマブ、若しくはオファツムマボン、又はそれ以上の抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドであり、かつ免疫抑制マクロライドは、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである。例示的な実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイドプレドニゾン又はプレドニゾロン、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、及び免疫抑制マクロライドシロリムスを含む。
特定の実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において肢帯型筋ジストロフィーを治療するためのｒＡＡＶ及び疫抑制レジメンを含む併用療法の使用を提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択され、併用療法は、ｒＡＡＶ及び免疫抑制レジメンを含み、免疫抑制レジメンは、ｉ）ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に経口投与される抗炎症ステロイド、及びｒＡＡＶの投与後１日目～３０日までに少なくとも１日１回投与される抗炎症ステロイド、又はｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回投与される抗炎症ステロイドと、ｉｉ）ｒＡＡＶの投与の約１４日前、ｒＡＡＶの投与の約７日前、及びｒＡＡＶの投与の約２４時間以内に静脈内投与される抗ＣＤ２０抗体（及び任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に投与される抗ＣＤ２０抗体を含む）と、ｉｉｉ）ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、１日１回経口投与される免疫抑制マクロライド（及び任意選択で、ｒＡＡＶの投与後に投与される免疫抑制マクロライドを含む）と、を含む。例えば、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートであり、抗ＣＤ２０特異的抗体は、リツキシマブ、オクレリズマブ、若しくはオファツムマボン、又はそれ以上の抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドであり、かつ免疫抑制マクロライドは、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである。例示的な実施形態では、免疫抑制レジメンは、抗炎症ステロイドプレドニゾン又はプレドニゾロン、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、及び免疫抑制マクロライドシロリムスを含む。
本開示はまた、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、併用療法は、ｒＡＡＶの用量、例えば、第２の用量を含み、対象の血漿は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）の第２の用量の投与の前に少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供せられ、かつ対象は、ＴＰＥに供せられる前に、ｒＡＡＶの第１の用量を投与された。例えば、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５である。筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー又は肢帯型筋ジストロフィーである。
加えて、本開示は、必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための併用療法の使用を提供し、併用療法は、ｒＡＡＶの用量、例えば、ｒＡＡＶの第２の用量を含み、対象の血漿は、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）の第２の用量の投与前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供され、かつ対象は、ＴＰＥに供される前に、ｒＡＡＶの第１用量を投与された。例えば、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５である。筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー又は肢帯型筋ジストロフィーである。
開示される併用療法及び使用のいずれにおいても、対象の血漿は、２回目の用量又はｒＡＡＶの投与前に、少なくとも２回のＴＰＥ又は少なくとも３回のＴＰＥに供せられる。いくつかの実施形態では、対象の血漿は、ｒＡＡＶの２回目の用量の投与前に少なくとも４回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの２回目の用量の投与前に５回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの２回目の用量の投与前に６回のＴＰＥに供されるか、又は対象の血漿は、ｒＡＡＶの２回目の用量の投与前に７回のＴＰＥに供される。
本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための併用療法を提供し、併用療法は、対象に投与されるｒＡＡＶを含み、対象の血漿は、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供され、ｒＡＡＶ ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５。筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー又は肢帯型筋ジストロフィーである。
本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のための併用療法の使用を提供し、併用療法は、対象に投与されるｒＡＡＶを含み、対象の血漿は、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に供され、ｒＡＡＶ ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５。筋ジストロフィーは、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー又は肢帯型筋ジストロフィーである。
開示された併用療法及び使用のいずれにおいても、対象の血漿は、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも２回のＴＰＥ、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも３回のＴＰＥ、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも４回のＴＰＥ、少なくとも５回のＴＰＥ、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも６回のＴＰＥ、ｒＡＡＶを投与する前に少なくとも７回のＴＰＥに供される。これらの開示された併用療法及び使用では、対象は、ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを投与された。加えて、いくつかの実施形態では、対象は、ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日までに少なくとも１日１回、抗炎症ステロイドを投与される。例えば、抗炎症ステロイドは、経口投与のために配合される。加えて、抗炎症ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートなどのグルココルチコイドである。
開示される併用療法及び使用のいずれにおいても、対象の血漿は、ｒＡＡＶの投与の少なくとも９日前、投与の少なくとも７日前、投与の５日前、又は投与の２日前に、ＴＰＥに供される。加えて、ｒＡＡＶの投与前に対象の血漿に対して実施されるＴＰＥのセッション間には、約２４～約４８時間がある。特定の実施形態では、対象の血漿は、ｒＡＡＶの投与前に少なくとも２回のＴＰＥに供され、ＴＰＥの間には、約４８時間がある。
本明細書に記載の併用療法及び使用のいずれにおいても、対象は、ｒＡＡＶの投与時に約１：４００以下の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルを有する。例えば、対象は、ｒＡＡＶの投与時に約１：１００～約１：４００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：１００～１：３００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：１００～１：２００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：２５０～１：５００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベル、又は約１：２００～１：４００の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルを有する。抗体力価は、総抗体結合力価として決定される。筋ジストロフィーを治療するための開示される併用療法及び使用のいずれにおいても、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在は、ｒＡＡＶの投与前、ｒＡＡＶの投与後、免疫応答若しくは有害事象が観察される前、又は免疫応答若しくは有害事象が観察された後に、当該対象の血清又は血漿中で決定された。加えて、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在は、免疫抑制レジメン又はＴＰＥを投与するステップの前に決定される。例えば、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在は、ＡＡＶを含む任意の併用療法若しくは薬剤の当該対象への任意の投与前に、又はＡＡＶｒｈ．７４を含む任意の併用療法若しくは薬剤の当該対象への投与前に決定される。
加えて、開示された併用療法及び使用では、当該対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルは、陽性対照として使用される。例えば、陽性対照は、本明細書に記載される抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体のいずれかなどの抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体を利用する。
開示されるもの及び使用のいずれにおいても、対象における抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在は、定量的方法を使用して決定され、当該対象は、当該定量に基づいて抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体について血清陽性として特定され、かつ当該免疫抑制レジメン又はＴＰＥは、血清陽性対象に選択的に投与される。
本開示は、次の追加の態様を提供する。
請求項１．換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）及び抗炎症ステロイドを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４であり、ｒＡＡＶが、配列番号９の発現カセットを含む、方法。
請求項２．ｒＡＡＶが、１．３３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。１．３３×１０１４の用量は、力価決定のためのスーパーコイルｑＰＣＲ ＤＮＡスタンダードによって決定される２×１０１４に対応する線形ｑＰＣＲ ＤＮＡスタンダードを利用して決定される。
請求項３．対照が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに羅漢しており、ｒＡＡＶｒｈ．７４ベースの遺伝子治療を以前に受けておらず、ｒＡＡＶ．ｒｈ７４抗体について血清陽性であると判定されている、請求項１又は２に記載の方法。
請求項４．対象が、ＥＬＩＳＡイムノアッセイに基づいてｒＡＡＶｒｈ．７４抗体について血清陽性であると判定されており、対象が、１：４００以上の血清希釈で２．００の吸光度比を示す、請求項３に記載の方法。
請求項５．対象へのｒＡＡＶｒｈ７４の任意の投与前に、当該対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を判定するステップを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
請求項６．抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在の判定が、ＥＬＩＳＡイムノアッセイによって決定され、対象が、１：４００の血清希釈で２．００以上の吸光度比を示す、請求項５に記載の方法。
請求項７．抗炎症ステロイドが、経口投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
請求項８．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の約１２時間前に投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
請求項９．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の少なくとも１２時間前に投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
請求項１０．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の少なくとも１２時間前に投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
請求項１１．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２４時間前に投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
請求項１２．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後１日目～約３０日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１～６０日に少なくとも１日１回投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１３．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後少なくとも３０日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１４．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後少なくとも６０日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１５．抗炎症ステロイドが、グルココルチコイドである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
請求項１６．免疫細胞が、プレドニゾンである、請求項１３に記載の方法。
加えて、本開示は、次の追加の態様を提供する。
請求項１．筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、
ａ）組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与する前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供するステップと、
ｂ）ｒＡＡＶを投与することであって、ｒＡＡＶが、血清型ｒｈＡＡＶｒｈ．７４であり、ｒＡＡＶが、配列番号９の発現カセットを含む、投与するステップとを含む、方法。
ａ）組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与する前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に対象の血漿を供するステップと、
ｂ）ｒＡＡＶを投与することであって、ｒＡＡＶが、血清型ｒｈＡＡＶｒｈ．７４であり、ｒＡＡＶが、配列番号９の発現カセットを含む、投与するステップとを含む、方法。
請求項２．対象の血漿が、投与前に少なくとも２回のＴＰＥ、少なくとも３回のＴＰＥ、少なくとも４回のＴＰＥ、少なくとも５回のＴＰＥ ｒＡＡＶ、少なくとも６回のＴＰＥ、又は少なくとも７回のＴＰＥに供される、請求項１に記載の方法。
請求項３．対象の血漿が、ｒＡＡＶの投与の少なくとも９日前、投与の少なくとも７日前、投与の５日前、又は投与の２日前に、ＴＰＥに供される、請求項１又は２に記載の方法。
請求項４．対象血漿が、ｒＡＡＶが投与される日にＴＰＥに供される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
請求項５．対象の血漿が、少なくとも２回のＴＰＥに供され、ＴＰＥの間に約４８時間がある、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
請求項６．ｒＡＡＶが、１．３３×１０１４の用量で投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。１．３３×１０１４の用量は、力価決定のためのスーパーコイルｑＰＣＲ ＤＮＡスタンダードによって決定される２×１０１４に対応する線形ｑＰＣＲ ＤＮＡスタンダードを利用して決定される。
請求項７．対照が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しており、対照が、ｒＡＡＶｒｈ．７４抗体について血清陽性である決定されている、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
請求項８．対象が、請求項１ｂの投与するステップの前に少なくとも１回ＡＡＶｒｈ．７４を投与された、請求項７に記載の方法。
請求項９．対象が、ＥＬＩＳＡイムノアッセイに基づいてｒＡＡＶｒｈ７抗体について血清陽性であると決定されており、対象が、１：１００の血清希釈で２．００以上の吸光度比を示す、請求項７に記載の方法。
請求項１０．ｒＡＡＶｒｈ．７４の投与前に、当該対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
請求項１１．抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在の決定が、ＥＬＩＳＡイムノアッセイによって判定され、対象が、１：１００の血清希釈で２．００以上の吸光度比を示す、請求項１０に記載の方法。
請求項１２．抗炎症ステロイドを投与することを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１３．抗炎症ステロイドが、経口投与される、請求項１２に記載の方法。
請求項１４．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の約１２時間前に投与される、請求項１２又は１３に記載の方法。
請求項１５．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の少なくとも１２時間前に投与される、請求項１２又は１３に記載の方法。
請求項１６．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の少なくとも１２時間前に投与される、請求項１２又は１３に記載の方法。
請求項１７．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与の少なくとも２４時間前に投与される、請求項１２又は１３に記載の方法。
請求項１８抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後１日目～約３０日までに少なくとも１日１回、又はｒＡＡＶの投与後１日目～約３０日までに少なくとも１日１回投与される、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
請求項１９．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後少なくとも３０日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
請求項２０．抗炎症ステロイドが、ｒＡＡＶの投与後少なくとも６０日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
請求項２１．抗炎症ステロイドが、グルココルチコイドである、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
請求項２２．免疫細胞が、プレドニゾンである、請求項２１に記載の方法。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。記載された数値範囲には、各範囲内の各整数値が含まれ、記述される整数の最小及び最大が含まれる。
実施例１
Ａ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン対照の生成
ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドには、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットが含まれる（図１を参照されたい）。マイクロジストロフィン構築物は、インフレームロッド欠失（Ｒ４～Ｒ２３）を特徴とし、ヒンジ１、２、及び４、並びにシステインリッチドメインが１３８ｋＤａタンパク質を産生することを維持する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によって誘導された。ＭＣＫプロモーターを除去しかつＭＨＣＫ７プロモーターを挿入することによって、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドからプラスミドを構築した。コアプロモーターの後、５３ｂｐの内在性マウスＭＣＫ Ｅｘｏｎ１（非翻訳）がＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（１５０ｂｐ）及び小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）に続いて、効率的な転写開始のために存在する。イントロン及び５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有していた。Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２））によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含んでいた。相補的ＤＮＡは、ヒトでの使用のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８，１０９－１１７（２０１０））。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスＤＮＡの複製とパッケージングの両方に必要なＡＡＶ２の末端逆位配列であった。マイクロジストロフィンカセットは、ｍＲＮＡ終結のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。
Ａ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン対照の生成
ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドには、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットが含まれる（図１を参照されたい）。マイクロジストロフィン構築物は、インフレームロッド欠失（Ｒ４～Ｒ２３）を特徴とし、ヒンジ１、２、及び４、並びにシステインリッチドメインが１３８ｋＤａタンパク質を産生することを維持する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によって誘導された。ＭＣＫプロモーターを除去しかつＭＨＣＫ７プロモーターを挿入することによって、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドからプラスミドを構築した。コアプロモーターの後、５３ｂｐの内在性マウスＭＣＫ Ｅｘｏｎ１（非翻訳）がＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（１５０ｂｐ）及び小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）に続いて、効率的な転写開始のために存在する。イントロン及び５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有していた。Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２））によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含んでいた。相補的ＤＮＡは、ヒトでの使用のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８，１０９－１１７（２０１０））。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスＤＮＡの複製とパッケージングの両方に必要なＡＡＶ２の末端逆位配列であった。マイクロジストロフィンカセットは、ｍＲＮＡ終結のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。
以前の研究では、ＭＨＣＫ７プロモーター（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３２０－３２９（２００７））を使用する心臓での発現が立証され、ＡＡＶｒｈ．７４が、骨格筋、横隔膜、及び心筋での発現を達成し（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－－２７０ （２０１５））、図１の構築物の配列は、ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化された。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンは、ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅのリンパ節からクローン化され、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）で議論されている。
Ｂ）ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン対照及びカナマイシン（Ｋａｎ）耐性をコードするプラスミドの生成
ＭＨＣＫ７μＤｙｓ．ＫＡＮのクローニングは、ＭＨＣＫ７．μＤｙｓフラグメントをＭＨＣＫ７．μＤｙｓ．ＡＭＰプラスミド及びカナマイシン骨格から単離し、かつＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用してそれらをアニーリングすることによって達成された。ＭＨＣＫ７．μＤｙｓフラグメントは、ＳｎａＢＩによる制限酵素消化によって単離された。消化は、１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）及び１μＬのＳｎａＢＩ中の５０μＬの全反応において、３７℃で１時間実行した。得られたフラグメントを、１０５ボルトで１．５時間実行する、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって単離した。ＭＨＣＫ７μＤｙｓインサートに対応したバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。得られたフラグメントのＤＮＡ濃度は、１０ｎｇ／μＬであった。Ｋａｎ骨格フラグメントは、１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）及び１μＬＸｂａＩを使用した５０μＬ反応液中のＸｂａＩ制限酵素消化により、３７℃で１時間、分離した。得られたフラグメントを、１０５ボルトで１．５時間実行する、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって単離した。Ｋａｎ骨格に対応するバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。得られたフラグメントのＤＮＡ濃度は、８．１ｎｇ／μＬであった。２つのフラグメントは、重複配列を有する２つのフラグメントを結合する機能を有するＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用して、アニーリングされた。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニング反応は、総反応量２０μＬについての１ｘＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ中のＭＨＣＫ７．μＤｙｓのカナマイシン骨格の比を使用して、５０℃で１５分間、製造自動化に従って実行された。得られたクローンは、続いて、氷上で３０分間、次いで、４２℃で３０秒間、及び氷上で追加の５分間、細胞に２．５μＬのクローニング産物を加えることによって、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃ３０４０）に形質転換された。形質転換後、９５０μＬの増殖培地を細胞に加え、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１．５時間増殖させた。増殖後、４５０μＬのこれらの細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンＬＢ寒天プレートに播種し、乾燥インキュベーター内で３０℃で一晩インキュベートした。このプレートからコロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ内で一晩増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、この培養物３ｍＬからＤＮＡを単離した。このＤＮＡは、クローニング産物を確認するために使用された。クローニング産物を、ＰｍｅＩ、ＭｓｃＩ、及びＳｍａＩによる制限酵素消化と、それに続くゲル電気泳動によって確認した。クローニング産物は、配列決定によって追加的に確認された。得られたプラスミドは、配列番号８に示され、図８及び９に示されている。配列番号９の配列に対応する図７の構築物の配列、及び配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を、上記のＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシド化した。
ＭＨＣＫ７μＤｙｓ．ＫＡＮのクローニングは、ＭＨＣＫ７．μＤｙｓフラグメントをＭＨＣＫ７．μＤｙｓ．ＡＭＰプラスミド及びカナマイシン骨格から単離し、かつＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用してそれらをアニーリングすることによって達成された。ＭＨＣＫ７．μＤｙｓフラグメントは、ＳｎａＢＩによる制限酵素消化によって単離された。消化は、１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）及び１μＬのＳｎａＢＩ中の５０μＬの全反応において、３７℃で１時間実行した。得られたフラグメントを、１０５ボルトで１．５時間実行する、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって単離した。ＭＨＣＫ７μＤｙｓインサートに対応したバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。得られたフラグメントのＤＮＡ濃度は、１０ｎｇ／μＬであった。Ｋａｎ骨格フラグメントは、１ｘＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）及び１μＬＸｂａＩを使用した５０μＬ反応液中のＸｂａＩ制限酵素消化により、３７℃で１時間、分離した。得られたフラグメントを、１０５ボルトで１．５時間実行する、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって単離した。Ｋａｎ骨格に対応するバンドを切り出し、ゲル精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。得られたフラグメントのＤＮＡ濃度は、８．１ｎｇ／μＬであった。２つのフラグメントは、重複配列を有する２つのフラグメントを結合する機能を有するＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒクローニングワークフローを使用して、アニーリングされた。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニング反応は、総反応量２０μＬについての１ｘＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ中のＭＨＣＫ７．μＤｙｓのカナマイシン骨格の比を使用して、５０℃で１５分間、製造自動化に従って実行された。得られたクローンは、続いて、氷上で３０分間、次いで、４２℃で３０秒間、及び氷上で追加の５分間、細胞に２．５μＬのクローニング産物を加えることによって、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃ３０４０）に形質転換された。形質転換後、９５０μＬの増殖培地を細胞に加え、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１．５時間増殖させた。増殖後、４５０μＬのこれらの細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンＬＢ寒天プレートに播種し、乾燥インキュベーター内で３０℃で一晩インキュベートした。このプレートからコロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ内で一晩増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、この培養物３ｍＬからＤＮＡを単離した。このＤＮＡは、クローニング産物を確認するために使用された。クローニング産物を、ＰｍｅＩ、ＭｓｃＩ、及びＳｍａＩによる制限酵素消化と、それに続くゲル電気泳動によって確認した。クローニング産物は、配列決定によって追加的に確認された。得られたプラスミドは、配列番号８に示され、図８及び９に示されている。配列番号９の配列に対応する図７の構築物の配列、及び配列番号８のヌクレオチド１～４９７７を、上記のＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシド化した。
Ｃ）ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン構築物の生成
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列を駆動するＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１０）：３０９６－３１０１）に挿入することにより構築された。筋肉特異的な遺伝子発現を駆動するために、筋肉特異的な調節エレメントが構築物に含まれていた。この調節エレメントは、３５１ｂｐのＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）で構成されていた。コアプロモーターの後、構築物には、効率的な転写開始のための５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が含まれ、その後にＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）及び小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロン及び５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来した。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有している。Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２５３－６１，２００２によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含んでいる。
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列を駆動するＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１０）：３０９６－３１０１）に挿入することにより構築された。筋肉特異的な遺伝子発現を駆動するために、筋肉特異的な調節エレメントが構築物に含まれていた。この調節エレメントは、３５１ｂｐのＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）で構成されていた。コアプロモーターの後、構築物には、効率的な転写開始のための５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が含まれ、その後にＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）及び小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロン及び５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来した。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有している。Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２５３－６１，２００２によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含んでいる。
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドには、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットが含まれていた（図５を参照されたい）。この配列はＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化された。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンはｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅのリンパ節からクローン化され、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎ．Ｍｅｄ．４５（２００７）に記載されている。
Ｄ）ベクター産生
本明細書に記載される研究のためのベクターは、研究グレードの条件下で、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクション法を利用して産生された。産生後のベクターの特性評価には、スーパーコイルスタンダード、エンドトキシンレベル測定（ＥＵ／ｍＬ）及び無菌性評価を伴う、ｑＰＣＲによる力価決定が含まれる。産生されたベクターを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、予想されるｒＡＡＶとのバンドパターンの一致性を検証した。これらの研究で使用される代理ベクターｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＨＫ７．ｕＤＹＳ．ＦＬＡＧは、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを追加して、上記のように構築された。
本明細書に記載される研究のためのベクターは、研究グレードの条件下で、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクション法を利用して産生された。産生後のベクターの特性評価には、スーパーコイルスタンダード、エンドトキシンレベル測定（ＥＵ／ｍＬ）及び無菌性評価を伴う、ｑＰＣＲによる力価決定が含まれる。産生されたベクターを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、予想されるｒＡＡＶとのバンドパターンの一致性を検証した。これらの研究で使用される代理ベクターｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＨＫ７．ｕＤＹＳ．ＦＬＡＧは、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを追加して、上記のように構築された。
実施例２
非ヒト霊長類研究における免疫抑制によるｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＨＫ７．マイクロジストロフィンの全身遺伝子送達
この研究の主な目標は、最適な用量、期間、及び免疫抑制レジメンを特定し、ｒＡＡＶ．ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの血管内送達後の遺伝子発現を最適化することであった。この研究は、アカゲザルの５つのコホート（各コホートｎ＝３）を使用して開始し、ベクター投与前後の免疫抑制期間を変化させた（表１）。アカゲザルは、本明細書では「非ヒト霊長類」又はＮＨＰと呼ばれる。
非ヒト霊長類研究における免疫抑制によるｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＨＫ７．マイクロジストロフィンの全身遺伝子送達
この研究の主な目標は、最適な用量、期間、及び免疫抑制レジメンを特定し、ｒＡＡＶ．ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの血管内送達後の遺伝子発現を最適化することであった。この研究は、アカゲザルの５つのコホート（各コホートｎ＝３）を使用して開始し、ベクター投与前後の免疫抑制期間を変化させた（表１）。アカゲザルは、本明細書では「非ヒト霊長類」又はＮＨＰと呼ばれる。
コホート１では、対照のサルに、免疫抑制剤を加えずに、頭静脈又は伏在静脈にｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを２×１０１４ｖｇ／ｋｇで血管内投与した（ｎ＝２）。他の全てのコホートでは、アカゲザルは、免疫抑制とともに、頭静脈又は伏在静脈に送達される２×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの血管内注射も受けた。
コホート２では、全身遺伝子導入の１日前から遺伝子導入後３０日まで、プレドニゾン（２ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与した（ｎ＝３）。コホート３では、全身遺伝子導入の１日前から遺伝子導入後６０日まで、プレドニゾン（２ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与した（ｎ＝３）。コホート４では、全身遺伝子導入の１４日前から遺伝子導入の６０日後まで、プレドニゾン（２ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与した（ｎ＝３）。
コホート５（ｎ＝３）では、３重免疫抑制レジメンが調査された。このコホートでは、リツキシマブ（７５０ｍｇ／ｍ２）は、ベクター投与の１４日前及び７日前の２回の投与セッションで血管内注入により投与され、３回目の投与は遺伝子導入前のベクター投与の日に投与された。抗体が最初の３回の投与に反応しない場合は、リツキシマブを注入後に４回投与することができる。ベクター投与の３日前にシロリムス（４ｍｇ／ｍ２／日）を経口投与し、抗体が減少するまで続けた。ベクター投与の１日前からベクター投与後３０日まで、プレドニゾンを経口投与した（２ｍｇ／ｋｇ／日）。
治療後、全てのコホートは、前脛骨筋（ＴＡ）及び／又は腓腹筋（ｇｎ）から得られた針生検を受けました。生検は、遺伝子導入前、及び遺伝子導入後６、８、及び１２週で最大３回収集された。免疫学、ＣＢＣ及び化学検査のための採血は、少なくとも隔週で行われた。
以下の血液学測定を、血液サンプルに関して実施した：赤血球（赤血球）数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン、濃度、赤血球分布幅、絶対網状赤血球数、血小板数血球数、好塩基球の絶対数、大きな染色されていない細胞の絶対数、及び血液塗抹標本。
以下の臨床化学測定を、血液サンプルに関して実施した：グルコース、尿素窒素、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、アルブミン：グロブリン比、総ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロール、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアルカリホスファターゼ。
安全性プロファイル及び形質導入効率
ＡＡＶｒｈ．７４（抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体）に対する総抗体反応は、ＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体反応を起こさなかったコホート２（ＮＨＰ＿０３）からの１つのＮＨＰを除いて、異常な観察の証拠がなく、コホート間で同様であった。加えて、コホート５のＮＨＰは、３重免疫抑制レジメンで治療されているにもかかわらず、コホート１～４のＮＨＰで観察されたものと同様のＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体反応を示した。コホート１～４からＮＨＰが経験した悪影響には、一過性のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）肝酵素の上昇が含まれていた。コホート１からの２つのＮＨＰ（ＮＨＰ＿１２、ＮＨＰ＿１３）、コホート３からの１つのＮＨＰ（ＮＨＰ＿０６）、及びコホート４からの１つ（ＮＨＰ＿０７）は、遺伝子導入後１２週間でＡＬＴ及びＡＳＴ肝臓酵素の上昇を示した。形質導入効率に関しては、遺伝子導入後１２週間でＮＨＰコホート１～５間でベクターゲノムコピー（ｖｇコピー／μｇＤＮＡ）における統計的に有意な差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＡＡＶｒｈ．７４（抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体）に対する総抗体反応は、ＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体反応を起こさなかったコホート２（ＮＨＰ＿０３）からの１つのＮＨＰを除いて、異常な観察の証拠がなく、コホート間で同様であった。加えて、コホート５のＮＨＰは、３重免疫抑制レジメンで治療されているにもかかわらず、コホート１～４のＮＨＰで観察されたものと同様のＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体反応を示した。コホート１～４からＮＨＰが経験した悪影響には、一過性のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）肝酵素の上昇が含まれていた。コホート１からの２つのＮＨＰ（ＮＨＰ＿１２、ＮＨＰ＿１３）、コホート３からの１つのＮＨＰ（ＮＨＰ＿０６）、及びコホート４からの１つ（ＮＨＰ＿０７）は、遺伝子導入後１２週間でＡＬＴ及びＡＳＴ肝臓酵素の上昇を示した。形質導入効率に関しては、遺伝子導入後１２週間でＮＨＰコホート１～５間でベクターゲノムコピー（ｖｇコピー／μｇＤＮＡ）における統計的に有意な差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。
実施例３
治療的血漿交換（ＴＰＥ）による投与
この研究の主な目的は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ジストロフィンを再投与した後、既存のＡＡＶ抗体を除去し、ＴＰＥを使用せずに再投与を評価する治療的血漿交換（ＴＰＥ）を使用して、技術及び遺伝子発現の両方を最適化することであった。
治療的血漿交換（ＴＰＥ）による投与
この研究の主な目的は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ジストロフィンを再投与した後、既存のＡＡＶ抗体を除去し、ＴＰＥを使用せずに再投与を評価する治療的血漿交換（ＴＰＥ）を使用して、技術及び遺伝子発現の両方を最適化することであった。
実施例２に記載される研究においてｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを予め注射された非ヒト霊長類（コホート２、３及び４由来）は、１回のアフェレーシス手順中に２～３回のＴＰＥを受けた。ＴＰＥの４週間前及び２週間前に、霊長類は、最大の採血を受けた（霊長類の体重の１０％）。血液は、ＡＣＤＡ溶液で最大３０日間保存し、ＴＰＥの日に使用して、手順中の過度の失血を防ぐためにアフェレーシスマシンをプライミングした。加えて、ＡＡＶｒｈ．７４結合抗体力価の判定を決定して、力価が現在の臨床試験の選択基準の閾値である１：４００を超えていることを確認した。ＴＰＥ後、２×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン又はｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン．ＦＬＡＧを、伏在静脈又は頭静脈を介して全身送達した。
これらのＮＨＰはまた、ＴＰＥの１日前からＴＰＥ及び遺伝子導入の３０日後まで、１日１回、プレドニゾン（２ｍｇ／ｋｇ）も受けた。化学、ＣＢＣ、ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイのための採血は、ＴＰＥ前、再投与前のＴＰＥ後、及びエンドポイントまで少なくとも隔週で行われた。エンドポイントは、２回目の遺伝子導入後８～１２週の間にあり、完全な剖検が含まれていた。有効性を評価するために、ベクターゲノムについてのウエスタンブロット及びｑＰＣＲ、並びにＦＬＡＧ免疫蛍光法を実施した。
追加的に、実施例２に記載される免疫抑制療法中に以前に注射された非ヒト霊長類（コホート５）に、ＴＰＥを使用せずにｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンが再投与されて、ＡＡＶｒｈ．７４に向かう既存の抗体を低下させた。具体的には、リツキシマブ（７５０ｍｇ／ｍ２／日）を遺伝子導入の７及び１４日前に、注射の日に１回、及び遺伝子導入後に１回、血管内（ＩＶ）に送達し、シロリムス（４ｍｇ／ｍ２／日）を、遺伝子導入の３日前に送達し、研究終了まで継続した。シロリムスのレベルは、３～１４ｎｇ／ｍＬの間で変化する採血によって監視された。化学、ＣＢＣ、シロリムス血中濃度、ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイのための採血は、エンドポイントまで少なくとも隔週で行われた。エンドポイントは、２回目の遺伝子導入後８～１２週の間にあり、完全な剖検が含まれていた。各動物の観察は、毎日実行された。ＮＨＰの体重を隔週で監視し、それに応じて免疫抑制薬の投与量を調整した。
治療的血漿交換手順：
ＴＰＥプロセスでは、血管アクセスを介して全血を取り出し、続いて血漿（抗体）を除去するアフェレーシスマシン内の遠心分離機で遠心分離した。赤血球は、霊長類の維持液用の補充液（ヒトアルブミン）と一緒に戻るように送達された。ヒト以外の霊長類はサイズが小さい（１０ｋｇ未満）ため、安全性を確保し、霊長類から引き出される血液の量を低減させるために、血漿交換の前に保存血でアフェレーシス装置のプライミングを実行した。アフェレーシスの２８及び１４日前に、最大の採血（非ヒト霊長類循環血液の１０％）を実行した。採取した全血は、４℃で抗凝固酸－クエン酸－デキストロース（ＡＣＤＡ）溶液中に３０日以内の間、保存及び保管された。追加的に、ＮＨＰには、余分な鉄リッチなサプリメント及び濃縮物が供給された。アフェレーシスの日に、非ヒト霊長類を、テラゾール（３～６ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内鎮静し、挿管し、加熱されたプロシージャテーブルに固定した。麻酔の維持は、酸素１～４％のイソフルランで達成された。血管カテーテルを両脚（伏在静脈）に配置し、１つのアクセスポートで全血を回収し、もう１つのアクセスポートを反対側の脚に配置して、赤血球及び補充液を再送達した。追加のカテーテルを腕（橈側皮静脈）に配置して、手順全体を通して流体及び採血をサポートした。血管アクセスが得られた後、動物にヘパリン（５０～１００Ｕ／ｋｇ）を投与して、十分な血流を維持し、アフェレーシス中の凝固を防いだ。ＮＨＰは、温度、ＥＣＧ、及び呼吸を使用して監視して、適切な麻酔面を決定した。
ＴＰＥプロセスでは、血管アクセスを介して全血を取り出し、続いて血漿（抗体）を除去するアフェレーシスマシン内の遠心分離機で遠心分離した。赤血球は、霊長類の維持液用の補充液（ヒトアルブミン）と一緒に戻るように送達された。ヒト以外の霊長類はサイズが小さい（１０ｋｇ未満）ため、安全性を確保し、霊長類から引き出される血液の量を低減させるために、血漿交換の前に保存血でアフェレーシス装置のプライミングを実行した。アフェレーシスの２８及び１４日前に、最大の採血（非ヒト霊長類循環血液の１０％）を実行した。採取した全血は、４℃で抗凝固酸－クエン酸－デキストロース（ＡＣＤＡ）溶液中に３０日以内の間、保存及び保管された。追加的に、ＮＨＰには、余分な鉄リッチなサプリメント及び濃縮物が供給された。アフェレーシスの日に、非ヒト霊長類を、テラゾール（３～６ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内鎮静し、挿管し、加熱されたプロシージャテーブルに固定した。麻酔の維持は、酸素１～４％のイソフルランで達成された。血管カテーテルを両脚（伏在静脈）に配置し、１つのアクセスポートで全血を回収し、もう１つのアクセスポートを反対側の脚に配置して、赤血球及び補充液を再送達した。追加のカテーテルを腕（橈側皮静脈）に配置して、手順全体を通して流体及び採血をサポートした。血管アクセスが得られた後、動物にヘパリン（５０～１００Ｕ／ｋｇ）を投与して、十分な血流を維持し、アフェレーシス中の凝固を防いだ。ＮＨＰは、温度、ＥＣＧ、及び呼吸を使用して監視して、適切な麻酔面を決定した。
上記のように、ＮＨＰをカテーテルを介してＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａアフェレーシス装置に接続し、装置を事前に採取した血液でプライミングした。１回の総血漿交換は、循環血液の全量が１回で除去及び交換されることに相当する。推定抗体除去率９８％を達成するために、２～３回の血漿交換を実行した。血液化学分析及び血清抗体検査のための各完了した交換後に、血液を採取した。血漿交換の直後に、ＮＨＰをアフェレーシスユニットから外し、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを全身に再投与した。ベクター送達後、全てのカテーテルが外され、出血を制御するために圧力が加えられた。動物を、完全に歩けるようになるまで監視した。
剖検分析
剖検では、ＮＨＰは、エンドポイント（再投与後８～１２週の間で発生し得る）でＥｕｔｈａｓｏｌ（１ｍＬ／１０１ｂ）を投与された。血液を採取し、全血を全血球計算（ＣＢＣ）分析、シロリムス検査レベル、及び血清化学のために送信した。次いで、組織を収集し、独立した獣医組織病理学者による分析のために送り、遺伝子及びタンパク質の発現を、有効性及び毒性を評価するために分析した。
剖検では、ＮＨＰは、エンドポイント（再投与後８～１２週の間で発生し得る）でＥｕｔｈａｓｏｌ（１ｍＬ／１０１ｂ）を投与された。血液を採取し、全血を全血球計算（ＣＢＣ）分析、シロリムス検査レベル、及び血清化学のために送信した。次いで、組織を収集し、独立した獣医組織病理学者による分析のために送り、遺伝子及びタンパク質の発現を、有効性及び毒性を評価するために分析した。
遺伝子発現の最適化を評価するために、２×１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン又はｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン．ＦＬＡＧが静脈内に投与及び再投与されたＮＨＰ由来の前後の筋生検を、収集した。ベクターＤＮＡの特定の配列を検出するために、前の及び全ての後の筋肉組織由来のＤＮＡを、リアルタイムの定量的ｑＰＣＲのために抽出した。収集した全ての筋肉由来のタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを実行して、生検前の組織と比較して、マイクロジストロフィンタンパク質（１３８ｋＤ）を検出した。追加的に、ナイーブな全長ジストロフィン（４２７ｋＤ）を、正常な対照として使用し、遺伝子発現としての結果の尺度としてのマイクロジストロフィンタンパク質と定量的に比較した。ＦＬＡＧ発現の存在を観察するための免疫蛍光染色は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン．ＦＬＡＧが注入された霊長類において実行された。
免疫抑制レジメン、ベクター投与、及び再投与の安全性を評価するために、採血を、ベースラインで、エンドポイントまで隔週で行った。血清化学、ＣＢＣ、及びシロリムスレベルは、研究の両方の目的を通して隔週で監視された。ＥＬＩＳｐｏｔ分析を利用して、ＡＡＶｒｈ．７４ペプチド及びマイクロジストロフィンペプチドの両方に対するＴ細胞応答を評価した。最後に、抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体応答を、研究の両方の目的を通じて隔週で監視した。
以下の血液学測定を、血液サンプルに関して実施した：赤血球（赤血球）数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン、濃度、赤血球分布幅、絶対網状赤血球数、血小板数血球数、好塩基球の絶対数、大きな染色されていない細胞の絶対数、及び血液塗抹標本。
以下の臨床化学測定を、血液サンプルに関して実施した：グルコース、尿素窒素、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、アルブミン：グロブリン比、総ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロール、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアルカリホスファターゼ。
結果
ＴＰＥ前及びＴＰＥ後（ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる再投与前）のＮＨＰにおけるＡＡＶｒｈ．７４に対する総抗体力価を、下の表に示す。図１１は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの再投与後のＮＨＰにおけるＡＡＶ７４に対する抗体力価を提供する。ＮＨＰで実行できるＴＰＣサイクルの数は、利用可能なドナー血液が不足しているために制限されている。ヒトでは、複数ラウンドのＴＰＥを投与することができる。実施例２で検出された力価は、最初の遺伝子導入の１２週間後に得られた（＊）。実施例３で検出された力価は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの再投与注射前に得られた（＋）。ＮＨＰ＿０３は、ＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体応答が不足しているために、事前のＴＰＥなしで再投与された。ＮＨＰ＿０６は、サイズが小さく、血管へのアクセスが悪いため、０．５サイクルのＴＰＥのみを受けた。
ＴＰＥ前及びＴＰＥ後（ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる再投与前）のＮＨＰにおけるＡＡＶｒｈ．７４に対する総抗体力価を、下の表に示す。図１１は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの再投与後のＮＨＰにおけるＡＡＶ７４に対する抗体力価を提供する。ＮＨＰで実行できるＴＰＣサイクルの数は、利用可能なドナー血液が不足しているために制限されている。ヒトでは、複数ラウンドのＴＰＥを投与することができる。実施例２で検出された力価は、最初の遺伝子導入の１２週間後に得られた（＊）。実施例３で検出された力価は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの再投与注射前に得られた（＋）。ＮＨＰ＿０３は、ＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体応答が不足しているために、事前のＴＰＥなしで再投与された。ＮＨＰ＿０６は、サイズが小さく、血管へのアクセスが悪いため、０．５サイクルのＴＰＥのみを受けた。
ＴＰＥ手順は、一般に、良好な耐容性を示した。ＡＡＶｒｈ．７４に対するＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＣＦ）レベル及び末梢血単核細胞由来のマイクロジストロフィンペプチドによって評価される異常な免疫学的観察はなかった。ＴＰＥ後の再投与によって、次のＮＨＰ：ＮＨＰ＿０１及びＮＨＰ＿０２、コホート２；ＮＨＰ＿０４、コホート３；ＮＨＰ＿０８及びＮＨＰ＿０９、コホート４）において肝酵素レベル（ＡＬＴ／ＡＳＴ）の増加がもたらされた。これは、プレドニゾンの毎日の投与を継続することで解決された。
コホート５由来のＮＨＰは、リツキシマブによる以前の治療との不適合性のためにＴＰＥを受けず、２つのＮＨＰ（ＮＨＰ＿１０、ＮＨＰ＿１１）が再投与された。コホート５は、再投与前のＡＡＶｒｈ．７４に対する総抗体価が１：５１，２００を超えていた。高抗体価で再投与されたＮＨＰ（コホート５）は、次の有害事象を経験した：心拍数及び人工呼吸数、嘔吐、送達部位近くの発疹、蒼白、並びに浅呼吸の増加；ジフェンヒドラミン及びデキサメタゾンの投与後に解決した。
７つのＮＨＰが２～３サイクルのＴＰＥを連続して受けた結果、ＡＡＶｒｈ．７４に対する循環抗体のレベルが低下した。ＴＰＥの直後に、ＮＨＰは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの再投与に成功した。コホート４由来の２つのＮＨＰ（ＮＨＰ＿０８及びＮＨＰ＿０９）では、１：２００の抗体価が達成された。
図１２に示すように、１２週目の生検からのＴＰＥ前の発現と比較した場合、ＴＰＥ後にｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを再投与した全てのＮＨＰ由来の組織サンプルで、マイクロジストロフィンタンパク質の発現の増加が観察された（実施例２に記載）。骨格筋（卵腹筋）、心臓、及び横隔膜において、マイクロジストロフィンタンパク質発現の増加が観察された。
実施例４
代替的に、上記の実施例２及び３に記載される試験及び研究は、配列番号９に記載のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物、配列番号８に記載のヌクレオチド１～４９７７、配列番号６に記載のヌクレオチド５６～５０２２を利用して実施される。
代替的に、上記の実施例２及び３に記載される試験及び研究は、配列番号９に記載のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物、配列番号８に記載のヌクレオチド１～４９７７、配列番号６に記載のヌクレオチド５６～５０２２を利用して実施される。
実施例５
治療的血漿交換（ＴＰＥ）後の既存のＡＡＶｒｈ．７４抗体によるＤＭＤについての遺伝子治療
第１相臨床試験は、治療的血漿交換（ＴＰＥ）後の既存のＡＡＶｒｈ．７４抗体による患者におけるＤＭＤの遺伝子治療を調査するために、ヒトで実施される。５サイクルのＴＰＥが、ＡＡＶｒｈ．７４（本明細書では、「抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体」とも呼ばれる）への抗体の結合を低下させ、ベースラインと比較して、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用して安全かつ効率的な筋肉の形質導入を可能にして、発現レベルの平均値＞５０％を達成するという仮説が立てられる。
治療的血漿交換（ＴＰＥ）後の既存のＡＡＶｒｈ．７４抗体によるＤＭＤについての遺伝子治療
第１相臨床試験は、治療的血漿交換（ＴＰＥ）後の既存のＡＡＶｒｈ．７４抗体による患者におけるＤＭＤの遺伝子治療を調査するために、ヒトで実施される。５サイクルのＴＰＥが、ＡＡＶｒｈ．７４（本明細書では、「抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体」とも呼ばれる）への抗体の結合を低下させ、ベースラインと比較して、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用して安全かつ効率的な筋肉の形質導入を可能にして、発現レベルの平均値＞５０％を達成するという仮説が立てられる。
研究の目的及び主要な結果は、マイクロジストロフィン遺伝子（ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）を運ぶｒＡＡＶの安全な送達である。二次的な目的は、ＤＭＤに羅漢している対象の筋肉におけるマイクロジストロフィン遺伝子の発現、及び機能的転帰尺度としての筋ジストロフィーについてのＮｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）を使用した臨床的改善である。
治療計画は、最初に１０日間のスケジュールでアフェレーシスによってＡＡＶｒｈ．７４抗体を低減し、続いて、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの静脈内送達を行う、安全性と有効性を組み合わせた２段階（週）プロトコル（表１）である。１週目に、月曜日（遺伝子治療の注入日から９日目）、水曜日（７日目）、金曜日（５日目）の３日間、別の日にＴＰＥを投与する。第２週に、ＴＰＥを隔日で２日間投与し、続いて月曜日（２日目）、水曜日（１日目）にＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを静脈内注入し、続くＴＰＥの同日にＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン（１日目）を送達する。患者は、表１のスケジュールに従って、外来アフェレーシスユニットに運ばれる。患者は、１日目に入院遺伝子治療注入のために小児集中治療室（ＰＩＣＵ）に入院し、２日目に退院予定である。
このプロトコルは、ＩｇＧ抗体の動態に基づいて開発されており、４８時間後にリバウンドがあり、前の手順で除去された抗体の約５０～６０％が回復し、したがって、隔日で１０日間のコースにわたってＴＰＥを支持し、ＴＰＥの最終日（遺伝子療法に関して１日目に指定される）の遺伝子送達が続くことが示されている（図１３及びＥｘｃｈａｎｇｅ Ｖｏｌｕｍｅｓを参照されたい）。これらの手順のタイミングは、他の既知の抗体介在性病状と同様の経過をたどる（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ３４：１７１－３５４，２０１９）。
このプロトコルは新しい適応症のために開発されているため、５～６回の治療（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ３４：１７１－３５４，２０１９）から５～７回の治療（Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５８：２３７－２４６、２０１９）を繰り返して推奨する既存の確立されたガイドラインに従うことが適切である。免疫抑制のためにプレドニゾンを服用しているこのプロトコルにおける対象に適用される追加のサポートには、同時の免疫抑制療法の結果として、無視できる免疫抑制の産生率、及び１時間当たり約１～２パーセントである血管内平衡化率に対する血管外平衡化率が仮定され、次いで、７～１０日間にわたって５回の個別の手順が、最初の身体の免疫グロブリン負荷全体の９０パーセントを除去する必要があることが記載されている。新しい抗体産生が発生した場合は、追加の治療が必要になる場合がある。（Ｆｒｉｄｅｙ ＆ Ｋａｐｌａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ（ｐｌａｓｍａ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｒ ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）：Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＵＰＴＯＤＡＴＥ Ｍａｙ ２０２０（ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎ－ｌｉｎｅ）（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２８：３－１０，２０１３）
プロトコル
このプロトコルについての患者の特徴：
選択基準
・歩行可能な男性対象、いずれかの民族、スクリーニング時の年齢４～１０歳（境界値を含む）
・ＤＭＤフレームシフト又は早期終止コドン遺伝子変異を確認
・ＣＫ＞１０００Ｕ／Ｌ
・症候性疾患を示す１００ｍ歩行テストにおける年齢について予測される９５のパーセンタイル未満
・運動能力評価テストへの協力能力
・困難な走る、跳ぶ、及び階段を上る履歴に基づいて示される弱さ
・スクリーニング前少なくとも１２週間の経口コルチコステロイド相当量が安定しており、研究全体を通して用量が一定に維持される（体重の変化に対応する潜在的な変更を除く）ことが予想される。
・ベースラインスクリーニング時のＥＬＩＳＡイムノアッセイで決定されるＡＡＶｒｈ．７４抗体価が１：４００超である患者（４０～１０日目）
除外基準
・ＬＶＥＦが４０％未満であるＥＣＨＯを含む心筋症の徴候
・ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、又はＢ型若しくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠
・自己免疫疾患の診断（又はその継続治療）
・臨床的に重要と考えられる臨床検査値の異常（ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、正常値上限の３倍超、３ｍｇ／ｄＬ以上のビリルビン、１．８ｍｇ／ｄＬ以上のクレアチニン、８ｇ／ｄＬ未満又は１８ｇ／ｄＬ超のヘモグロビン、１８，５００／ｃｍｍ超の白血球数、５０，０００／マイクロリットル以下の血小板）。
・ＰＩの意見では、遺伝子導入の不必要なリスクを生み出す併発疾患又は慢性薬物治療の必要性。
・４週間前以内の重度の感染症（例えば、肺炎、腎盂腎炎、髄膜炎）。
・スクリーニングから６か月以内に、いずれかの治験薬剤（コルチコステロイド以外）又はエクソンスキッピング薬剤（ＥＸＯＮＤＹＳ５１（登録商標）を含む）が投与された。
・任意の種類の遺伝子療法、細胞ベースの療法（例えば、幹細胞移植）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９療法を受けた。
・家族は、かかりつけ医及び他の医療提供者による患者の研究参加を開示したくない。
このプロトコルについての患者の特徴：
選択基準
・歩行可能な男性対象、いずれかの民族、スクリーニング時の年齢４～１０歳（境界値を含む）
・ＤＭＤフレームシフト又は早期終止コドン遺伝子変異を確認
・ＣＫ＞１０００Ｕ／Ｌ
・症候性疾患を示す１００ｍ歩行テストにおける年齢について予測される９５のパーセンタイル未満
・運動能力評価テストへの協力能力
・困難な走る、跳ぶ、及び階段を上る履歴に基づいて示される弱さ
・スクリーニング前少なくとも１２週間の経口コルチコステロイド相当量が安定しており、研究全体を通して用量が一定に維持される（体重の変化に対応する潜在的な変更を除く）ことが予想される。
・ベースラインスクリーニング時のＥＬＩＳＡイムノアッセイで決定されるＡＡＶｒｈ．７４抗体価が１：４００超である患者（４０～１０日目）
除外基準
・ＬＶＥＦが４０％未満であるＥＣＨＯを含む心筋症の徴候
・ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、又はＢ型若しくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠
・自己免疫疾患の診断（又はその継続治療）
・臨床的に重要と考えられる臨床検査値の異常（ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、正常値上限の３倍超、３ｍｇ／ｄＬ以上のビリルビン、１．８ｍｇ／ｄＬ以上のクレアチニン、８ｇ／ｄＬ未満又は１８ｇ／ｄＬ超のヘモグロビン、１８，５００／ｃｍｍ超の白血球数、５０，０００／マイクロリットル以下の血小板）。
・ＰＩの意見では、遺伝子導入の不必要なリスクを生み出す併発疾患又は慢性薬物治療の必要性。
・４週間前以内の重度の感染症（例えば、肺炎、腎盂腎炎、髄膜炎）。
・スクリーニングから６か月以内に、いずれかの治験薬剤（コルチコステロイド以外）又はエクソンスキッピング薬剤（ＥＸＯＮＤＹＳ５１（登録商標）を含む）が投与された。
・任意の種類の遺伝子療法、細胞ベースの療法（例えば、幹細胞移植）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９療法を受けた。
・家族は、かかりつけ医及び他の医療提供者による患者の研究参加を開示したくない。
スクリーニング／ベースライン期間
スクリーニング／ベースライン期間は、最長９日目の４週間前までである。インフォームドコンセントを得た後、患者は、適格性について評価される。スクリーニングには、人口統計及び病歴の収集、バイタルサイン測定、身体検査、心電図（ＥＣＧ）、並びに心エコー図（ＥＣＨＯ）及び心臓ＭＲＩが含まれる。血液及び尿のサンプルは、臨床及び安全性検査評価のために収集される。血液サンプルを、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、並びにＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体とＡＡＶｒｈ．７４キャプシド及びマイクロジストロフィンに対する抗原特異的Ｔ細胞についても、収集する。治療前の筋生検は、腓腹筋、又は主治医（ＰＩ）によって選択された筋肉を含み、適格後、９日目より前に実行される。親／介護者は、ＰＲＯＭＩＳアンケートに記入するよう求められる。身体機能性評価には、筋ジストロフィーのＮｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＤ）と、床からの立ち上がり、標準的な４段の上昇、１０メートル歩行／走行テスト及び１００メートル歩行／走行テストを含む計時機能性テストとが含まれる。
スクリーニング／ベースライン期間は、最長９日目の４週間前までである。インフォームドコンセントを得た後、患者は、適格性について評価される。スクリーニングには、人口統計及び病歴の収集、バイタルサイン測定、身体検査、心電図（ＥＣＧ）、並びに心エコー図（ＥＣＨＯ）及び心臓ＭＲＩが含まれる。血液及び尿のサンプルは、臨床及び安全性検査評価のために収集される。血液サンプルを、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、並びにＡＡＶｒｈ．７４に対する抗体とＡＡＶｒｈ．７４キャプシド及びマイクロジストロフィンに対する抗原特異的Ｔ細胞についても、収集する。治療前の筋生検は、腓腹筋、又は主治医（ＰＩ）によって選択された筋肉を含み、適格後、９日目より前に実行される。親／介護者は、ＰＲＯＭＩＳアンケートに記入するよう求められる。身体機能性評価には、筋ジストロフィーのＮｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＤ）と、床からの立ち上がり、標準的な４段の上昇、１０メートル歩行／走行テスト及び１００メートル歩行／走行テストを含む計時機能性テストとが含まれる。
治療的血漿交換
ＴＰＥは、患者の血漿を除去し、５％アルブミンでの置換に関与する。新鮮な凍結血漿（ＦＦＰ）は、患者の安全のために必要な場合、ＴＰＥ手順中に使用され得る。血漿交換中に除去された血漿は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の規制に従って、別の個体への輸血には使用されない。
ＴＰＥは、患者の血漿を除去し、５％アルブミンでの置換に関与する。新鮮な凍結血漿（ＦＦＰ）は、患者の安全のために必要な場合、ＴＰＥ手順中に使用され得る。血漿交換中に除去された血漿は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の規制に従って、別の個体への輸血には使用されない。
プロトコル
ＴＰＥは、可能であれば、末梢静脈を介して実施される。より可能性の高い患者には、介入放射線科医によって入れられたトンネル化中心線を有する。親は、予定の合間にカテーテルの手入れ方法について説明を受ける。
ＴＰＥは、可能であれば、末梢静脈を介して実施される。より可能性の高い患者には、介入放射線科医によって入れられたトンネル化中心線を有する。親は、予定の合間にカテーテルの手入れ方法について説明を受ける。
交換体積－
１．０～１．５血漿体積交換の血漿交換が、手順ごとに実行される。単回の血漿交換で、血漿高分子レベルは６３％低下する（Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２０１９；３４：１７１－３５４）。血管内コンパートメント及び血管外コンパートメントの両方に分布するＩｇＧ抗体は、総身体貯蔵量を減少させる複数回交換を必要とし、通常は、両方のコンパートメント間の再分布を可能にするように１日おきに実行される。最初の１．０～１．５血漿体積の交換で、最大量の標的物質が除去され、除去量はその後の交換ごとに減少する。単回の血漿量交換ごとに、同じ量の交換液が使用される。このプロトコルでは、５％のアルブミンが補液として使用される。
１．０～１．５血漿体積交換の血漿交換が、手順ごとに実行される。単回の血漿交換で、血漿高分子レベルは６３％低下する（Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２０１９；３４：１７１－３５４）。血管内コンパートメント及び血管外コンパートメントの両方に分布するＩｇＧ抗体は、総身体貯蔵量を減少させる複数回交換を必要とし、通常は、両方のコンパートメント間の再分布を可能にするように１日おきに実行される。最初の１．０～１．５血漿体積の交換で、最大量の標的物質が除去され、除去量はその後の交換ごとに減少する。単回の血漿量交換ごとに、同じ量の交換液が使用される。このプロトコルでは、５％のアルブミンが補液として使用される。
免疫抑制レジメンが、持続的な反応を得るために推奨されている。免疫抑制がない場合、交換後にリバウンドする可能性があるが、このプログラムに参加する全てのＤＭＤ少年には、疾病についての標準治療としてグルココルチコイドが投与される。血漿交換についての実験プロトコル中に、患者には、ＴＰＥの１日前に、グルココルチコイド（１ｍｇ／ｋｇのプレドニゾン、又は同等のコルチコステロイド）が投与される。患者は、初期のテーパリングが患者の最良の関心内にあるとＰＩが判断しない場合に、遺伝子導入後の遺伝子送達後に少なくとも６０日間はこの用量を維持する。（表１）。
患者の更なる関心のために、遺伝子送達を遅らせ、＃７ＴＰＥが遺伝子療法を進めることができるように提供され得る代替計画（「代用スケジュール」と呼ばれる）が提供される。標的のＡＡＶｒｈ．７４力価が、アフェレーシス＃４に続く１日目に到達されない場合、ＴＰＥ＃５は実施されるが、遺伝子送達には進められない。ＡＡＶ抗体レベルが２日目（木曜日）に得られ、金曜日のアフェレーシス、ＴＰＥ＃６及び遺伝子送達が続けられる。ただし、力価が木曜日（２日目）に標的の１：１００に達していない場合、金曜日のＴＰＥ又は遺伝子送達には進められない。
＊＊＊遺伝子送達
これは、５２週間の非盲検臨床治験である。適格要件を満たす６～１２人の患者が登録され、ＩＶ ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンが投与される。１日目に、外来患者として、身体検査が実施され、バイタルサイン、血液サンプル、及び尿サンプルが収集される。１日目に、患者は入院する。５回目で最後のＴＰＥが、午前中に実施され、同日遅くに、ＩＲＢ及びＦＤＡによって承認された以前のプロトコルに使用されたスタディオペレーションマニュアルに従って、１～２時間にわたってＩＶ投与されるＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンが投与される。注入の翌日（２日目）に、患者は、健康診断を受け、バイタルサインが収集され、退院前に血液及び尿サンプルを提供する。
これは、５２週間の非盲検臨床治験である。適格要件を満たす６～１２人の患者が登録され、ＩＶ ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンが投与される。１日目に、外来患者として、身体検査が実施され、バイタルサイン、血液サンプル、及び尿サンプルが収集される。１日目に、患者は入院する。５回目で最後のＴＰＥが、午前中に実施され、同日遅くに、ＩＲＢ及びＦＤＡによって承認された以前のプロトコルに使用されたスタディオペレーションマニュアルに従って、１～２時間にわたってＩＶ投与されるＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンが投与される。注入の翌日（２日目）に、患者は、健康診断を受け、バイタルサインが収集され、退院前に血液及び尿サンプルを提供する。
患者は、４５２週間追跡され、次いで、５年間の長期追跡調査に進む。患者は、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、３６、及び４８週間（１日目の注入と比較して）の遺伝子送達後、追跡調査来院を完了する。加えて、３週目及び５週目に、患者は、肝機能検査の評価のための追跡調査来院を完了する。全ての患者には、１２週目に筋生検が実行される。生検には、腓腹筋、又はＰＩが選択する筋肉が含まれる。
安全性は、治療に起因する有害事象（ＴＥＡＥ）、ＳＡＥ、及び選択された検査室評価の監視によって評価される。
安全性は、治療に起因する有害事象（ＴＥＡＥ）、ＳＡＥ、及び選択された検査室評価の監視によって評価される。
実施例６
血清中の抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ決定
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの材料は次のとおりである。
・キャプチャー抗体＝抗ＡＡＶｒｈ．７４ ｍＡｂ
・試験サンプル＝血清又は血漿、検出に役立つ
・抗原＝ＡＡＶｒｈ．７４キャプシド
・ブロッキング溶液＝５％のドライミルク、１％のヤギ血清、１００ｍＬのＰＢＳ
・洗浄緩衝液＝０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
・陽性対照＝抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体を有することが知られている血清
・二次抗体＝抗ヒトＨＲＰ結合抗体
・基質＝ＴＭＢ
・停止液＝硫酸
血清中の抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ決定
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの材料は次のとおりである。
・キャプチャー抗体＝抗ＡＡＶｒｈ．７４ ｍＡｂ
・試験サンプル＝血清又は血漿、検出に役立つ
・抗原＝ＡＡＶｒｈ．７４キャプシド
・ブロッキング溶液＝５％のドライミルク、１％のヤギ血清、１００ｍＬのＰＢＳ
・洗浄緩衝液＝０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
・陽性対照＝抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体を有することが知られている血清
・二次抗体＝抗ヒトＨＲＰ結合抗体
・基質＝ＴＭＢ
・停止液＝硫酸
方法
９６ウェルプレートの全てのウェルは、４Ｃで炭酸緩衝液で希釈したキャプチャー抗体で一晩コーティングされる。内容物を廃棄し、プレートをブロッキング溶液で３７Ｃで１時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を廃棄して、キャプチャー抗体でコーティングされたウェルにＡＡＶｒｈ．７４キャプシドを２つ追加する。追加的に、ウェルを複製してバックグラウンド値を決定するために、炭酸緩衝液を加える。非結合キャプシドを廃棄し、試験血清をブロッキング溶液中１：２５の開始希釈で添加し、連続的に希釈する。陽性対照は、ブロッキング溶液中１：４００希釈で希釈する。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、ブロッキング溶液中１：１０，０００の希釈で二次インキュベーションを行う。プレートを洗浄し、緩衝液を廃棄し、基質を加えた後、硫酸でアッセイを終了する。プレートの吸光度を、４５０ｎｍで読み取る。
９６ウェルプレートの全てのウェルは、４Ｃで炭酸緩衝液で希釈したキャプチャー抗体で一晩コーティングされる。内容物を廃棄し、プレートをブロッキング溶液で３７Ｃで１時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を廃棄して、キャプチャー抗体でコーティングされたウェルにＡＡＶｒｈ．７４キャプシドを２つ追加する。追加的に、ウェルを複製してバックグラウンド値を決定するために、炭酸緩衝液を加える。非結合キャプシドを廃棄し、試験血清をブロッキング溶液中１：２５の開始希釈で添加し、連続的に希釈する。陽性対照は、ブロッキング溶液中１：４００希釈で希釈する。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、ブロッキング溶液中１：１０，０００の希釈で二次インキュベーションを行う。プレートを洗浄し、緩衝液を廃棄し、基質を加えた後、硫酸でアッセイを終了する。プレートの吸光度を、４５０ｎｍで読み取る。
分析及び結果
吸光度比は、抗原をコーティングされたウェルの平均光学密度（ＯＤ）から抗原をコーティングされていないウェルのＯＤを減算し、抗原をコーティングされていないウェルの平均（ＯＤ）で除算することによって決定される。２．００以上の比は、陽性抗体応答とみなされる。エンドポイントの力価は、２．００以上の比をもたらす最後の血清希釈を特定することによって決定される。抗体のカットオフは、１：４００超の血清希釈で定義されている。
吸光度比は、抗原をコーティングされたウェルの平均光学密度（ＯＤ）から抗原をコーティングされていないウェルのＯＤを減算し、抗原をコーティングされていないウェルの平均（ＯＤ）で除算することによって決定される。２．００以上の比は、陽性抗体応答とみなされる。エンドポイントの力価は、２．００以上の比をもたらす最後の血清希釈を特定することによって決定される。抗体のカットオフは、１：４００超の血清希釈で定義されている。
実施例７
間接ＥＬＩＳＡ：血清中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の決定
材料
・抗原＝ＡＡＶｒｈ．７４キャプシド
・ブロッキング溶液＝５％のドライミルク、１％のヤギ血清、カルシウム及びマグネシウムを含まない１００ｍＬのＰＢＳ
・洗浄緩衝液＝０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
・一次抗体＝ヒト試験用血清又は血漿
・陽性対照＝抗ＡＡＶｒｈ７４ ｍＡｂ、又は任意選択での抗ｒｈ７４抗体を含有する血清（又は血漿）
・陰性対照：抗ＡＡＶｒｈ７４抗体を含まない対象由来の血清を陰性対照として含めることができる
・二次抗体＝抗ヒト抗体
・基質＝３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
・停止液＝硫酸
間接ＥＬＩＳＡ：血清中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の決定
材料
・抗原＝ＡＡＶｒｈ．７４キャプシド
・ブロッキング溶液＝５％のドライミルク、１％のヤギ血清、カルシウム及びマグネシウムを含まない１００ｍＬのＰＢＳ
・洗浄緩衝液＝０．０５％のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）
・一次抗体＝ヒト試験用血清又は血漿
・陽性対照＝抗ＡＡＶｒｈ７４ ｍＡｂ、又は任意選択での抗ｒｈ７４抗体を含有する血清（又は血漿）
・陰性対照：抗ＡＡＶｒｈ７４抗体を含まない対象由来の血清を陰性対照として含めることができる
・二次抗体＝抗ヒト抗体
・基質＝３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
・停止液＝硫酸
方法
炭酸緩衝液で希釈した２ｘ１０９ｖｇ／ウェルの濃度の抗原で一晩コーティングした９６ウェルプレート内のウェルを複製する。追加的に、炭酸緩衝液を、ウェルを複製して、バックグラウンドを決定するために加える。抗原を廃棄し、ウェルをブロッキング溶液でブロックする。ブロッキング溶液を廃棄し、一次抗体（試験血清）をブロッキング溶液中１：２５の開始希釈で添加し、連続的に希釈する。陽性対照は、血清を使用する場合は、１：４００希釈で、ＡＡＶｒｈ．７４ ｍＡｂを使用する場合は、例えば、１：１，０００～１：１０，０００希釈で、ブロッキング溶液中に希釈する。抗ＡＡＶｒｈ．７４ ｍＡｂの特定の希釈は、参照としての抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体を含有する血清又は血漿を利用して、任意に決定できることが認識されている。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、ブロッキング溶液中１：１０，０００の希釈で二次インキュベーションを行う。プレートを洗浄し、緩衝液を廃棄し、かつ基質を加えた後に、硫酸でアッセイを終了する。プレートの吸光度を、４５０ｎｍで読み取る。
炭酸緩衝液で希釈した２ｘ１０９ｖｇ／ウェルの濃度の抗原で一晩コーティングした９６ウェルプレート内のウェルを複製する。追加的に、炭酸緩衝液を、ウェルを複製して、バックグラウンドを決定するために加える。抗原を廃棄し、ウェルをブロッキング溶液でブロックする。ブロッキング溶液を廃棄し、一次抗体（試験血清）をブロッキング溶液中１：２５の開始希釈で添加し、連続的に希釈する。陽性対照は、血清を使用する場合は、１：４００希釈で、ＡＡＶｒｈ．７４ ｍＡｂを使用する場合は、例えば、１：１，０００～１：１０，０００希釈で、ブロッキング溶液中に希釈する。抗ＡＡＶｒｈ．７４ ｍＡｂの特定の希釈は、参照としての抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体を含有する血清又は血漿を利用して、任意に決定できることが認識されている。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、ブロッキング溶液中１：１０，０００の希釈で二次インキュベーションを行う。プレートを洗浄し、緩衝液を廃棄し、かつ基質を加えた後に、硫酸でアッセイを終了する。プレートの吸光度を、４５０ｎｍで読み取る。
分析及び結果
吸光度比は、抗原をコーティングされたウェルの平均光学密度（ＯＤ）から抗原をコーティングされていないウェルのＯＤを減算し、抗原をコーティングされていないウェルの平均（ＯＤ）で除算することによって決定される。２．００以上の比は、陽性抗体反応とみなされ、そのような陽性反応を示す血漿又は血清サンプルは、血清陽性であるとみなされる。エンドポイントの力価は、２．００以上の比をもたらす最後の血清希釈を特定することによって決定される。抗体価のカットオフは、１：４００超の血清希釈で定義されている。換言すれば、１：４００の血清希釈での２．００以上の比を有する対象は、血清陽性とみなされ、ｒＡＡＶｒｈ．７４ベースの遺伝子治療を受けることから除外される。
吸光度比は、抗原をコーティングされたウェルの平均光学密度（ＯＤ）から抗原をコーティングされていないウェルのＯＤを減算し、抗原をコーティングされていないウェルの平均（ＯＤ）で除算することによって決定される。２．００以上の比は、陽性抗体反応とみなされ、そのような陽性反応を示す血漿又は血清サンプルは、血清陽性であるとみなされる。エンドポイントの力価は、２．００以上の比をもたらす最後の血清希釈を特定することによって決定される。抗体価のカットオフは、１：４００超の血清希釈で定義されている。換言すれば、１：４００の血清希釈での２．００以上の比を有する対象は、血清陽性とみなされ、ｒＡＡＶｒｈ．７４ベースの遺伝子治療を受けることから除外される。
実施例８
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの構築
図１０に示されるコドン最適化全長ヒトＳＣＧＢ ｃＤＮＡを含有する導入遺伝子カセットを構築した。カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位、及びカセットの発現を駆動するのに使用される筋特異的ＭＨＣＫ７を含む。これは、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４ｂｐ）内の転写開始部位の約１．２ｋｂの５’から採取した２０６ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである。カセットを、ＡＡＶ８に対して９３％相同である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ．７４は、マウス及び非ヒト霊長類において、特に、循環によって筋肉に送達される場合に血管バリアを通過する際に、安全かつ効果的であることが示されている。
参考文献
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５．Ｚｈｏｕ，Ｌ．＆ Ｌｕ，Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６９，７７１－７７６（２０１０）．
６．Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｍｙｓｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｐｏｏｒ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６８， ７６２－７７３（２００９）．
７．ＤｉＰｒｉｍｉｏ，Ｎ．，ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．Ｗ．＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｔｏｗａｒｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １２，５５３－５６０（２０１０）．
８．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ｔｙｐｅ ２Ｄ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６８，６２９－６３８（２０１０）．
９．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２Ｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６，２９０－２９７（２００９）．
１０．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １／２ａ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌ ｆｏｒ ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３，１９２－２０１（２０１５）．
１１．Ｃａｒｎｗａｔｈ，Ｊ．Ｗ．＆ Ｓｈｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ： ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｅｕｓ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｌｏｎｇｕｓ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ８０，３９－５４（１９８７）．
１２．Ｃｏｕｌｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａ．＆ Ｓｌｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｐａｔｈｙ：Ｉ．Ａ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ，ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １４，５３－７０（１９８８）．
１３．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｊａｒｏｓ，Ｅ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ（ｍｄｘ）ｍｏｕｓｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ７７，６９－８１（１９８８）．
１４．Ｄｕｐｏｎｔ－Ｖｅｒｓｔｅｅｇｄｅｎ，Ｅ．Ｅ．＆ ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｖｅｒｓｕｓ ｈｉｎｄｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １５，１１０５－１１１０（１９９２）．
１５．Ｓｔｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２，５３６－５３９（１９９１）．
１６．Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０，７１７－７２７（１９９７）．
１７．Ｇｒａｄｙ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０，７２９－７３８（１９９７）．
１８．Ｌｏｖｅ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３３９，５５－５８（１９８９）．
１９．Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３６０，５９１－５９３（１９９２）．
２０．Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ４，１４４１－１４４４（１９９８）．
２１．Ｓｑｕｉｒｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｕｔｒｏｐｈｉｎ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１，３３３３－３３４４（２００２）．
２２．Ｒａｆａｅｌ，Ｊ．Ａ．，Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．＆ Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｅ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｒｅｓｃｕｅｓ ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９，７９－８２（１９９８）．
２３．Ｚｈｏｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｏｒｓｅｎｓ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２６４，１０６－１１１（２００８）．
２４．Ｇｕｔｐｅｌｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｈｒｉｎｉｖｉｃｈ，Ｗ．Ｔ．＆ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－Ｍｏｕｓｅ Ｖａｌｉｄａｔｅｓ Ｉｔｓ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０，ｅ０１１７３０６（２０１５）．
２５．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｄ ＤＭＤ ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２，４９２９－４９３７（２０１３）．
２６．Ｎｅｖｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｆａｒｎｅｓｙｌｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＦＴＳ），ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｄｙ／ｄｙ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６，ｅ１８０４９（２０１１）．
２７．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，４５（２００７）．
２８．Ｍｕｌｉｅｒｉ，Ｌ．Ａ．，Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ，Ｇ．，Ｉｔｔｌｅｍａｎ，Ｆ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｅ．Ｍ．＆ Ａｌｐｅｒｔ，Ｎ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｆｒｏｍ ｃｕｔｔｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ ｍｏｎｏｘｉｍｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ６５，１４４１－１４４９（１９８９）．
２９．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８，１０９－１１７（２０１０）．
３０．Ｇｒｏｓｅ，Ｗ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ５ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７，ｅ３９２３３（２０１２）．
３１．Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｙｏｕｎｇ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１，２４５－２５６（２００５）．
３２．Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２）．
３３．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８，１０９－１１７（２０１０）．
３４．Ｓａｌｖａ，Ｍ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｒＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３２０－３２９（２００７）．
３５．Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎｏｐａｔｈｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－２７０（２０１５）．
３６．Ｄｅ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｈ．１０ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３，６７－７６（２００６）．
３７．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）．
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配列表
ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢの構築
図１０に示されるコドン最適化全長ヒトＳＣＧＢ ｃＤＮＡを含有する導入遺伝子カセットを構築した。カセットは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位、及びカセットの発現を駆動するのに使用される筋特異的ＭＨＣＫ７を含む。これは、近位プロモーターを有する内因性筋クレアチンキナーゼ遺伝子（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４ｂｐ）内の転写開始部位の約１．２ｋｂの５’から採取した２０６ｂｐエンハンサーを利用するＭＣＫベースのプロモーターである。カセットを、ＡＡＶ８に対して９３％相同である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶｒｈ．７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ．７４は、マウス及び非ヒト霊長類において、特に、循環によって筋肉に送達される場合に血管バリアを通過する際に、安全かつ効果的であることが示されている。
参考文献
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１１．Ｃａｒｎｗａｔｈ，Ｊ．Ｗ．＆ Ｓｈｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ： ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｅｕｓ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｌｏｎｇｕｓ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ８０，３９－５４（１９８７）．
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１３．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｊａｒｏｓ，Ｅ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ（ｍｄｘ）ｍｏｕｓｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ７７，６９－８１（１９８８）．
１４．Ｄｕｐｏｎｔ－Ｖｅｒｓｔｅｅｇｄｅｎ，Ｅ．Ｅ．＆ ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｖｅｒｓｕｓ ｈｉｎｄｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １５，１１０５－１１１０（１９９２）．
１５．Ｓｔｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２，５３６－５３９（１９９１）．
１６．Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０，７１７－７２７（１９９７）．
１７．Ｇｒａｄｙ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０，７２９－７３８（１９９７）．
１８．Ｌｏｖｅ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３３９，５５－５８（１９８９）．
１９．Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３６０，５９１－５９３（１９９２）．
２０．Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ４，１４４１－１４４４（１９９８）．
２１．Ｓｑｕｉｒｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｕｔｒｏｐｈｉｎ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１，３３３３－３３４４（２００２）．
２２．Ｒａｆａｅｌ，Ｊ．Ａ．，Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．＆ Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｅ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｒｅｓｃｕｅｓ ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９，７９－８２（１９９８）．
２３．Ｚｈｏｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｏｒｓｅｎｓ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２６４，１０６－１１１（２００８）．
２４．Ｇｕｔｐｅｌｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｈｒｉｎｉｖｉｃｈ，Ｗ．Ｔ．＆ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－Ｍｏｕｓｅ Ｖａｌｉｄａｔｅｓ Ｉｔｓ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０，ｅ０１１７３０６（２０１５）．
２５．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｄ ＤＭＤ ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２，４９２９－４９３７（２０１３）．
２６．Ｎｅｖｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｆａｒｎｅｓｙｌｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＦＴＳ），ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｄｙ／ｄｙ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６，ｅ１８０４９（２０１１）．
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２８．Ｍｕｌｉｅｒｉ，Ｌ．Ａ．，Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ，Ｇ．，Ｉｔｔｌｅｍａｎ，Ｆ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｅ．Ｍ．＆ Ａｌｐｅｒｔ，Ｎ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｆｒｏｍ ｃｕｔｔｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ ｍｏｎｏｘｉｍｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ６５，１４４１－１４４９（１９８９）．
２９．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８，１０９－１１７（２０１０）．
３０．Ｇｒｏｓｅ，Ｗ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ５ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７，ｅ３９２３３（２０１２）．
３１．Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｙｏｕｎｇ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１，２４５－２５６（２００５）．
３２．Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２）．
３３．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８，１０９－１１７（２０１０）．
３４．Ｓａｌｖａ，Ｍ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｒＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３２０－３２９（２００７）．
３５．Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎｏｐａｔｈｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－２７０（２０１５）．
３６．Ｄｅ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｈ．１０ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３，６７－７６（２００６）．
３７．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）．
３８．Ｂｕｌｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ｍｄｘ） ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８４；８１（４）：１１８９－１１９２．
３９．Ｓｉｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ：ａ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９ ３０；２４４（４９１２）：１５７８－８０
配列表
Claims (95)
- 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）及び抗炎症ステロイドを投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される、方法。
- 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである、請求項１に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与前の約１４日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与前に投与され、前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日まで少なくとも１日１回又は前記ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日まで少なくとも１日１回投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 抗炎症ステロイドが、経口投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、グルココルチコイドである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶの投与前に、抗ＣＤ２０特異的抗体を投与するステップを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ－２０特異的抗体が、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも７日前に投与される、請求項１０に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも１４日前に投与される、請求項１０又は１１に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、前記ｒＡＡＶの投与の約１４日前、前記ｒＡＡＶの投与の約７日前、及び前記ｒＡＡＶの前記投与の約２４時間以内に投与される、請求項１０に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０特異的抗体を投与するステップを更に含む、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、リツキシマブ、オクレリズマブ又はオファツムマブである、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫抑制マクロライドを投与するステップを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、前記ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１６に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、前記ｒＡＡＶの投与後に投与される、請求項１６又は１７に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、経口投与される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）、及び免疫抑制レジメンを投与することを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記免疫抑制レジメンが、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドのうちの１つ以上を投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される、方法。
- 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである、請求項２１に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５である、請求項２１に記載の方法。
- 前記免疫抑制レジメンが、抗炎症ステロイド、抗ＣＤ２０抗体、及び免疫抑制マクロライドを投与することを含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に投与される、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与前に投与され、前記抗炎症ステロイドが、前記ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日まで少なくとも１日１回投与される、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、経口投与される、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、グルココルチコイドである、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、前記ｒＡＡＶの投与前である、請求項２１～２９５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも１４日前に投与される、請求項３０に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、前記ｒＡＡＶの投与の約１４日前、前記ｒＡＡＶの投与の約７日前、及び前記ｒＡＡＶの前記投与の約２４時間以内に投与される、請求項３０に記載の方法。
- 前記免疫抑制レジメンが、前記ｒＡＡＶの投与後に抗ＣＤ２０特異的抗体を投与することを更に含む、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体が、静脈内注入によって投与される、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０特異的抗体が、リツキシマブ、オクレリズマブ又はオファツムマブである、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、前記ｒＡＡＶの投与前に少なくとも３日間少なくとも１日１回投与される、請求項２１～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制レジメンが、前記ｒＡＡＶの投与後に免疫抑制マクロライドを投与することを更に含む、請求項２１～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、経口投与される、請求項２１～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである、請求項２１～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される、組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）、及び免疫抑制レジメンを投与することを含み、前記免疫抑制レジメンが、
ｉ）前記ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを経口投与し、前記ｒＡＡＶの投与後１日目～３０日まで、又は前記ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日まで少なくとも１日１回抗炎症ステロイドを投与するステップと、
ｉｉ）前記ｒＡＡＶの投与の約１４日前、前記ｒＡＡＶの投与の約７日前、及び前記ｒＡＡＶの前記投与の約２４時間以内に抗ＣＤ２０抗体を静脈内投与し、任意選択で、前記ｒＡＡＶの投与後に前記抗ＣＤ２０抗体を投与するステップと、
ｉｉｉ）前記ｒＡＡＶの投与前に、少なくとも３日間少なくとも１日１回免疫抑制マクロライドを経口投与し、任意選択で、前記ｒＡＡＶの投与後に前記免疫抑制マクロライドを投与するステップと、を含む、方法。 - 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである、請求項４０に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５である、請求項４０に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 抗ＣＤ２０特異的抗体が、リツキシマブ、オクレリズマブ又はオファツムマボンである、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制マクロライドが、タクロリムス、ピネクロリムス又はシロリムスである、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、プレドニゾロンであり、前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブであり、前記免疫抑制マクロライドが、シロリムスである、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）の第２の用量の投与前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に前記対象の血漿を供することを含み、前記対象が、ＴＰＥに供せられる前にｒＡＡＶの第１の用量を投与された、方法。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、
ａ）ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５からなる群から選択される組換えアデノウイルス関連の第１の用量を投与するステップと、
ｂ）少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に前記対象の血漿を供するステップと、
ｃ）第２の用量又はｒＡＡＶを投与するステップと、を含む、方法。 - 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンである、請求項４７又は４８に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーであり、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５である、請求項４７又は４８に記載の方法。
- 前記対象の血漿が、前記第２の用量又はｒＡＡＶの投与前に、少なくとも２回のＴＰＥ又は少なくとも３回のＴＰＥに供される、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、
ａ）組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与する前に、少なくとも１回の治療的血漿交換（ＴＰＥ）に前記対象の血漿を供するステップと、
ｂ）ｒＡＡＶを投与するステップと、を含み、
前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢ、又はｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮ０５である、方法。 - 前記対象の血漿が、投与前に、少なくとも２回のＴＰＥ、少なくとも３回のＴＰＥ、少なくとも４回のＴＰＥ、少なくとも５回のＴＰＥ ｒＡＡＶ、少なくとも６回のＴＰＥ又は少なくとも７回のＴＰＥに供される、請求項５２に記載の方法。
- 前記対象の血漿が、前記ｒＡＡＶの投与の少なくとも９日前、投与の少なくとも７日前、投与の５日前、又は投与の２日前にＴＰＥに供される、請求項５２又は５３に記載の方法。
- 前記対象の血漿が、前記ｒＡＡＶが投与される日にＴＰＥに供される、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の血漿が、少なくとも２回のＴＰＥに供され、前記ＴＰＥ間に約４８時間ある、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、前記ｒＡＡＶの投与の約２４時間前に抗炎症ステロイドを投与される、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、前記ｒＡＡＶの投与後１日目～６０日まで少なくとも１日１回抗炎症ステロイドを投与される、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、経口投与される、請求項５７又は５８に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、グルココルチコイドである、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗炎症ステロイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン又はデフラザコートである、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、全身投与経路によって投与される、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記全身投与経路が、静脈内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇである、請求項６２に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶの用量が、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、注射、注入又は移植によって投与される、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、約１時間にわたって注入によって投与される、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、末梢四肢静脈を介する静脈内経路によって投与される、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列を含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、配列番号２又は配列番号７のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しており、前記ｒＡＡＶが、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で約１時間にわたって静脈内注入によって投与され、前記ｒＡＡＶが、配列番号９のＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド５５～５０２１を含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記筋ジストロフィーが、ＬＧＭＤ２Ｅであり、前記ｒＡＡＶが、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢである、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト対象が、ＬＧＭＤ２Ｅに罹患しており、前記ｒＡＡＶが、約２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、前記ｒＡＡＶが含む、前記ｒＡＡＶが配列番号４４のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＢであるｒＡＡＶである、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の細胞におけるマイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記マイクロジストロフィン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体の存在を決定するステップを更に含む、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定するステップが、免疫抑制レジメン又はＴＰＥの前記投与を投与する前記ステップの前に実行される、請求項７７に記載の方法。
- 前記決定するステップが、前記対象へのＡＡＶのいずれかの投与の前に実行される、請求項７８に記載の方法。
- 前記決定するステップが、前記対象にａＡＡＶｒｈ．７４を投与する前に実行される、請求項７９に記載の方法。
- 前記決定が、定量的である、請求項７７～８０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の血清又は血漿中の抗ＡＡＶｒｈ．７４抗体のレベルを陽性対照と比較するステップを更に含む、請求項８１に記載の方法。
- 前記陽性対照が、抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体を利用する、請求項８２に記載の方法。
- 前記決定するステップが、抗ＡＡＶｒｈ．７４モノクローナル抗体を利用することを含む、請求項７７～８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定ステップが、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ウエスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、リバースＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイを利用することを含む、請求項７７～８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ＮＹＧＭＮ（配列番号２０）、ＤＹＧＭＮ（配列番号２２）、ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号２１）、及びＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号２３）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２４）、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号２５）、及びＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号２６）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号２７）、ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号２８）、ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号２９）、ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号３０）、及びＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号３１）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ＳＶＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３２）、ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号３３）、ＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３４）、及びＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号３５）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３６）、ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号３８）、及びＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号３９）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号４０）、ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号４１）、ＱＱＲＳＦＹＰＦ（配列番号４２）、及びＱＱＲＴＹＹＰＦ（配列番号４３）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、又は１８に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号１０、１２、１４、１６、又は１８に示される可変重鎖（ＶＨ）配列、及び配列番号１１、１３、１５、１７、又は１９に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定が、定量的であり、前記対象が、前記定量に基づく抗ＡＡＶｒｈ．７４について血清陽性として特定され、前記免疫抑制レジメン又はＴＰＥが、前記血清陽性対象に選択的に投与される、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
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