KR20230035043A

KR20230035043A - 근이영양증을 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 전달

Info

Publication number: KR20230035043A
Application number: KR1020237001636A
Authority: KR
Inventors: 루이스 로디노-클라팍; 제리 알. 멘델; 엘린 피터슨; 레이첼 포터; 다니엘 그리핀
Original assignee: 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈; 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-03-10
Also published as: US20210393801A1; CN116348149A; JP2023530974A; TW202208630A; WO2021257595A1; BR112022025586A2; CA3187353A1; AU2021293197A1; IL299094A; CO2023000156A2; MX2022016332A; EP4164668A1

Abstract

본 개시내용은 대상체의 면역계를 저해하는 단계와 조합하여 소형화된 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 유전자 요법 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

근이영양증을 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 전달

본 출원은 2020년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 63/039,252, 2020년 9월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 63/083,953, 2021년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 63/160,376, 및 2021년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 63/188,266에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 자료를 참조로 포함

본 출원은 개시내용의 별도의 부분으로서 컴퓨터-판독가능 형태의 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전문이 참조로 포함되고 하기와 같이 식별된다: 파일명: 55714_Seqlisting.txt; 크기: 83,380 바이트, 생성; 2021년 6월 7일.

분야

본 개시내용은 대상체의 면역계를 저해하는 단계와 조합하여, 관심 트랜스진, 예컨대 소형화된 인간 마이크로-디스트로핀 유전자 또는 β-사르코글리칸 유전자를 발현하는 유전자 요법 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애, 예컨대 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다.

일상 활동, 예컨대 이동 및 호흡, 및 전신 대사를 위한 근육 질량 및 근육 강도의 중요성은 명백하다. 근육 기능의 결핍은 근육 약화 및 소모에 의해 특징화되는 근이영양증 (MD)을 생성하며 삶의 질에 심각한 영향을 미친다. 가장 잘-특징화된 MD는 디스트로핀-연관 단백질 복합체 (DAPC)의 구성원을 코딩하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 이들 MD는 DAPC에 의한 근형질막-세포골격 테더링의 손실과 연관된 막 취약성으로 인해 발생한다. 뒤시엔느 근이영양증 (DMD)은 신생아 남아 5000명 중 1명에게 영향을 미치는 가장 파괴적인 근육 질환 중 하나이다.

DMD는 디스트로핀-연관 단백질 복합체 (DAPC)와 연관된 427 kD 근형질막 단백질인 디스트로핀의 부재 및 mRNA의 감소를 초래하는 DMD 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다 (Hoffman et al., Cell 51(6):919-28, 1987). DAPC는 액틴 결합 단백질인 디스트로핀 및 라미닌-결합 단백질인 알파-디스트로글리칸을 통해 세포외 매트릭스 (ECM)와 세포골격 사이의 구조적 연결을 형성하는 근육 근형질막에서의 다중 단백질로 구성된다. 이들 구조적 연결은 수축 동안 근육 세포막을 안정화하고 수축-유도 손상으로부터 보호하는 작용을 한다. 디스트로핀 손실과 함께, 막 취약성은 근형질막 파열 및 칼슘 유입을 초래하여, 칼슘-활성화된 프로테아제 및 세그먼트 섬유 괴사를 촉발한다 (Straub et al., Curr Opin. Neurol. 10(2): 168-75, 1997). 이러한 비제어된 근육 변성 및 재생 사이클은 궁극적으로 근육 줄기 세포 집단을 고갈시켜 (Sacco et al., Cell, 2010. 143(7): p. 1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 37-57), 진행성 근육 약화, 근내막 염증 및 섬유성 반흔을 초래한다.

디스트로핀 또는 마이크로-디스트로핀으로부터의 막 안정화 없이, DMD는 비제어된 조직 상해 및 복구 사이클을 나타내고, 궁극적으로 결합 조직 증식을 통해 손실된 근육 섬유를 섬유성 반흔 조직으로 대체할 것이다. 섬유증은 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 ECM 매트릭스 단백질의 과도한 침착에 의해 특징화된다. ECM 단백질은 주로 스트레스 및 염증에 반응하는 활성화된 섬유모세포에 의해 방출되는 시토카인, 예컨대 TGFβ로부터 생성된다. DMD의 주요 병리학적 특색은 근섬유 변성 및 괴사이지만, 병리학적 결과로서의 섬유증은 동일한 영향을 미친다. 섬유성 조직의 과잉-생산은 근육 재생을 제한하고 DMD 환자에서 진행성 근육 약화에 기여한다. 한 연구에서, 초기 DMD 근육 생검에서 섬유증의 존재는 10년 추적조사에서 불량한 운동 결과와 높은 상관관계가 있었다 (Desguerre et al., J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(7): p. 762-7). 이들 결과는 섬유증이 DMD 근육 기능장애의 주요 기여자임을 지적하고, 명백한 섬유증 이전에 조기 개입의 필요성을 강조한다.

MD의 또 다른 그룹은 MD의 지대형 그룹 (LGMD)이다. LGMD는 드문 병태이며, 발병 연령, 근육 약화 구역, 심장 및 호흡기 침범, 진행 속도 및 중증도와 관련하여 상이한 사람에서 상이하게 나타난다. LGMD는 아동기, 청소년기, 청년기 또는 심지어 그 이후에 시작될 수 있다. 두 성별 모두 동등하게 영향을 받는다. LGMD는 어깨 및 골반 거들의 약화를 유발하며, 때때로 시간이 지남에 따라 상부 다리 및 팔의 인근 근육도 약화된다. 다리의 약화는 종종 팔보다 먼저 나타난다. 안면 근육은 일반적으로 영향을 받지 않는다. 병태가 진행됨에 따라, 사람들은 걷는데 문제가 있을 수 있으며, 시간이 지남에 따라 휠체어를 사용해야 할 수도 있다. 어깨 및 팔 근육의 침범으로 인해 팔을 머리 위로 들어 올리거나 물건을 들기가 어려워질 수 있다. LGMD의 일부 유형에서, 심장 및 호흡 근육이 침범될 수 있다.

적어도 19개 형태의 LGMD가 있고, 형태는 연관된 유전적 결함에 의해 분류된다.

LGMD에 대한 특수 테스트는 현재 진단을 위한 국가 제도, 국립 위임 그룹 (NCG)을 통해 이용가능하다.

근이영양증, 예컨대 DMD 또는 LGMD를 치료하기 위한 유전자 요법이 개발됨에 따라, 이들 요법을 최적화하고 최적화된 유전자 요법 벡터에 의한 마이크로-디스트로핀 트랜스진의 발현에 대한 면역저해의 효과를 평가할 필요가 있다.

본 개시내용은 면역저해제의 투여와 조합하여 근이영양증을 치료하기 위해 골격근에 대한 관심 트랜스진을 발현하는 유전자 요법 벡터, 예를 들어 AAV에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 대상체에게 AAV 유전자 요법을 재투약하는 방법을 포함하며, 여기서 대상체의 혈장은 AAV 유전자 요법의 제1 용량에 반응하여 생성된 AAV 항체를 제거하기 위해 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용된다.

본 개시내용은 면역저해제의 투여와 조합하여 근육 섬유를 상해로부터 보호하고 근육 강도를 증가시키고 섬유증을 감소 및/또는 예방하기 위해 횡격막 및 심근을 포함하는 골격근에 대한 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 유전자 요법 벡터, 예를 들어 AAV에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 대상체에게 AAV 유전자 요법을 재투약하는 방법을 포함하며, 여기서 대상체의 혈장은 대상체가 AAV 유전자 요법의 제1 용량에 반응하여 생성된 AAV 항체를 제거하는 항체에 대한 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용된다.

또한, 본 개시내용은 면역저해제의 투여와 조합하여 횡격막 및 심근을 포함하는 골격근에 대한 β-사르코글리칸 유전자를 발현하는 유전자 요법 벡터, 예를 들어 AAV에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 대상체에게 AAV 유전자 요법을 재투약하는 방법을 포함하며, 여기서 대상체의 혈장은 대상체가 AAV 유전자 요법의 제1 용량에 반응하여 생성된 AAV 항체를 제거하는 항체에 대한 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용된다.

본 개시내용은 DMD에서 관찰되는 유전자 결함을 해결하기 위해 마이크로-디스트로핀을 전달하기 위해 유전자 요법 벡터를 사용하여 근육 힘을 증가시키고/거나 근육 질량을 증가시키기 위한 조합 요법 및 접근법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 면역저해의 지속기간, 용량 및 유형이 변경된 상이한 면역저해 레지멘을 사용하여 비인간 영장류 모델에서 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 전달의 유전자 발현을 입증하기 위한 연구를 제공한다. 본 개시내용은 또한 이전에 투약된 비인간 영장류로부터 AAV 바이러스 항체를 제거하고 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 사용하여 영장류에게 전신적으로 재투약하기 위해 TPE의 사용 후 마이크로-디스트로핀 트랜스진 발현을 입증하기 위한 연구를 제공한다.

본 개시내용은 또한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 투여 전에 항-AAVrh.74 항체로 DMD를 앓고 있는 인간 대상체를 치료하기 위한 접근법을 제공하고, 대상체는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 투여 전에 TPE의 다중 세션에 적용된다.

본 개시내용은 서열식별번호(SEQ ID NO): 3, 8 또는 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한 서열식별번호: 9의 핵산 서열 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함하는 rAAV, 및 서열식별번호: 9의 핵산 서열 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함하는 rAAV 입자를 제공한다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 서열식별번호: 3, 8 또는 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 서열식별번호: 9의 핵산 서열 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함하는 rAAV, 및 서열식별번호: 9의 핵산 서열 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함하는 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 임의의 방법은 이들 조성물로 수행될 수 있다.

또한, 본 개시내용은 하기 AAVrh.74.tMCK.CAP N3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05 중 하나의 rAAV 게놈을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 항염증성 스테로이드를 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 의약의 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 본 개시내용은 또한 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 요법은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 항염증성 스테로이드를 포함하고, 여기서 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 예를 들어, 근이영양증은 DMD 또는 베커 근이영양증이다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 경구로 투여된다. 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 및 후 둘 다에 투여될 수 있다. 대안적으로, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전에만 또는 후에만 투여된다.

또한, 본 개시내용은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 및 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 및 항염증성 스테로이드를 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되고, 의약의 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 본 개시내용은 또한 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 및 항염증성 스테로이드를 포함하고, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 항염증성 스테로이드는 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 경구로 투여된다. 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 및 후 둘 다에 투여될 수 있다. 대안적으로, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전에만 또는 후에만 투여된다.

예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조합 요법에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 12시간에 또는 rAAV 투여 전 약 24시간에 또는 rAAV 투여 전 약 36시간에 또는 rAAV 투여 전 약 48시간에 또는 rAAV 투여 전 약 60시간에 또는 rAAV 투여 전 약 72시간에 또는 투여 전 약 96시간에 투여된다. 일부 실시양태에서, 염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 5일에, rAAV 투여 전 약 6일에, rAAV 투여 전 약 7일에, 또는 rAAV 투여 전 약 8일에, 또는 rAAV 투여 전 약 9일에, 또는 rAAV 투여 전 약 10일에, 또는 rAAV 투여 전 약 11일에, 또는 rAAV 투여 전 약 12일에, 또는 rAAV 투여 전 약 13일에, 또는 rAAV 투여 전 약 14일에, 또는 rAAV 투여 전 약 30일에 투여된다.

또한, 임의의 개시된 방법, 용도 또는 조합 요법에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 7일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 14일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 21일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 28일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 30일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 45일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 60일 동안 적어도 1일 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다.

예를 들어, 임의의 개시된 방법, 용도 또는 조합 요법에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전에 투여되고, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 7일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 14일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 21일에 적어도 1일 1회, 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 24일에 적어도 1일 1회, 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 28일에 적어도 1일 1회, 또는 rAAV 투여 후 적어도 1일 내지 30일에, 또는 rAAV 투여 후 적어도 30 내지 60일에 투여된다.

본원에 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조합 요법에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 적어도 7일에 투여된다. 용어 항-CD20 특이적 항체는 CD20에 특이적으로 결합하거나 CD20의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소시키는 항체를 지칭한다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙을 포함한다.

임의의 개시된 방법, 용도 또는 조합 요법에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 약 60일에, 또는 rAAV 투여 전 약 45일에, 또는 rAAV 투여 전 약 30일에, rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 및 후 둘 다에 투여된다. 대안적으로, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전에 투여되거나, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 후에 투여된다.

또한, 임의의 개시된 방법, 용도 또는 조합 요법은 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 용어 면역저해성 마크롤라이드는 대상체의 면역계를 저해 또는 조정하는 마크롤라이드 작용제를 지칭한다. 마크롤라이드는 하나 이상의 데옥시 당, 예컨대 클라디노스 또는 데소아민이 부착된 큰 마크로시클릭 락톤 고리를 포함하는 작용제 부류이다. 락톤 고리는 대개 14-, 15- 또는 16-원이다. 마크롤라이드는 폴리케티드 작용제 부류에 속하고, 천연 생성물일 수 있다. 면역저해성 마크롤라이드의 예에는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 및 시롤리무스가 포함된다. 일부 실시양태에서, 면역저해성 마크롤라이드는 대상체에게 경구로 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전 및 rAAV 투여 후 둘 다에 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전에 투여되거나, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 후에 투여된다.

일부 실시양태에서, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 4일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 5일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 6일에 투여되거나, rAAV 투여 전 적어도 7일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 10일에 투여되거나, 또는 투여 전 적어도 14일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 30일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 45일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 60일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다.

본 개시내용은 또한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하고, 예를 들어 개시된 의약에서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 면역저해 레지멘을 포함하고, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘은 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 용어 면역저해 레지멘은 대상체의 면역계를 저해 또는 조정하는 치료 방법 또는 요법을 지칭한다. 레지멘은 하나 이상의 면역 저해제의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 또한 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV); 및 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 rAAV 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 포함하고; 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하고, 예를 들어 개시된 의약에서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 포함하고; 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 별도로 공동-투여되고, 예컨대 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 일부 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함한다.

한 예시적인 면역저해 레지멘에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 24시간에 투여된다. 또 다른 예시적인 면역저해 레지멘에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전에 투여되고, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 투여되거나, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 투여된다.

임의의 개시된 면역저해 레지멘에서, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 경구로 투여된다.

추가의 예시적인 면역저해 레지멘에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 항-CD20 항체는 혈관내 주입에 의해 투여된다. 예시적인 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 적어도 14일에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 약 60일에, rAAV 투여 전 약 45일에, rAAV 투여 전 약 30일에, rAAV 투여 전 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 투여된다. 또한, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 30 내지 60일 동안 투여된다. 개시된 면역저해 레지멘은 또한 rAAV 투여 후에 항-CD20 특이적 항체를 투여하는 것을 포함한다.

또한, 개시된 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함한다. 면역저해 레지멘은 또한 rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 개시된 면역저해 레지멘에서, 면역저해성 마크롤라이드는 경구로 투여된다. 예시적인 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 개시된 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다. 또한, 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 약 60일에, rAAV 투여 전 약 45일에, rAAV 투여 전 약 30일에, rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에, rAAV 투여 전 약 24시간에 투여된다.

특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하거나, rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이고, 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙이고, 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상, 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스이다. 예시적인 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드 프레드니손 또는 프레드니솔론, 항-CD20 항체 리툭시맙, 및 면역저해성 마크롤라이드 시롤리무스를 포함한다.

본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀이고, 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하거나, rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이고, 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙이고, 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상, 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스이다. 예시적인 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드 프레드니손 또는 프레드니솔론, 항-CD20 항체 리툭시맙, 및 면역저해성 마크롤라이드 시롤리무스를 포함한다.

본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법을 제공하며, 여기서 rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀이고, 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하거나, rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이고, 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙이고, 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상, 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스이다. 예시적인 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드 프레드니손 또는 프레드니솔론, 항-CD20 항체 리툭시맙, 및 면역저해성 마크롤라이드 시롤리무스를 포함한다.

또 다른 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV); 및 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하거나, rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계.

또 다른 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되고; 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하거나, rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계.

또 다른 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법을 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되고; 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하거나, rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 제2 용량의 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받았다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 조합 요법은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 제2 용량의 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받았다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 제2 용량의 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받았다.

본 개시내용은 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 제2 용량의 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며; 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받았다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다: a) 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 제1 용량을 투여하는 단계, b) 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계, 및 c) rAAV의 제2 용량을 투여하는 단계. 임의의 개시된 방법에서, 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 2개의 TPE 또는 적어도 3개의 TPE에 적용된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 4개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 5개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 6개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 7개의 TPE에 적용된다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다: a) AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스의 제1 용량을 투여하는 단계; b) 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계, 및 c) rAAV의 제2 용량을 투여하는 단계. 임의의 개시된 방법에서, 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 2개의 TPE 또는 적어도 3개의 TPE에 적용된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 4개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 5개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 6개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 7개의 TPE에 적용된다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다: a) 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계, 및 b) rAAV를 투여하는 단계. 임의의 개시된 방법에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 3개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 4개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 5개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 6개의 TPE 또는 rAAV 투여 전에 적어도 7개의 TPE에 적용된다. 이들 개시된 방법에서, 대상체는 rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 투여받는다. 또한, 일부 실시양태에서, 대상체는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여받는다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 경구로 투여된다. 또한, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다.

또한, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다: a) AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계; b rAAV를 투여하는 단계. 임의의 개시된 방법에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 3개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 4개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 5개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 6개의 TPE 또는 rAAV 투여 전에 적어도 7개의 TPE에 적용된다. 이들 개시된 방법에서, 대상체는 rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 투여받는다. 또한, 일부 실시양태에서, 대상체는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여받는다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 경구로 투여된다. 또한, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다.

임의의 개시된 방법에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전 적어도 9일 동안, 투여 전 적어도 7일 동안, 투여 전 5일 동안, 또는 투여 전 2일 동안 TPE에 적용된다. 또한, rAAV 투여 전에 대상체의 혈장에서 수행되는 TPE 세션 사이에 약 24 내지 약 48시간이 있다. 특정한 실시양태에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE에 적용되며, 여기서 TPE 사이에 약 48시간이 있다.

본원에 기재된 임의의 방법에서, 대상체는 rAAV 투여 시점에 약 1:400 이하의 항-AAVrh.74 항체 수준을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 rAAV 투여 시점에 약 1:100 내지 약 1:400의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:100 내지 1:300의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:100 내지 1:200의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:250 내지 1:500의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:200 내지 1:400의 항-AAVrh.74 항체 수준을 갖는다. 항체 역가는 총 항체 결합 역가로서 결정된다. 근이영양증을 치료하는 임의의 개시된 방법에서, 이들 방법은 상기 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계는 rAAV 투여 전에, rAAV 투여 후에, 면역 반응 또는 유해 사건이 관찰되기 전에, 또는 면역 반응 또는 유해 사건이 관찰된 후에 수행될 수 있다. 또한, 결정 단계는 면역저해 레지멘 또는 TPE의 투여 단계 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 결정 단계는 상기 대상체에게 임의의 AAV의 임의의 투여 전에 수행되거나, 결정 단계는 상기 대상체에게 임의의 AAVrh.74의 투여 전에 수행된다.

본 개시내용은 또한 상기 대상체의 혈청 또는 혈장 내 항-AAVrh.74 항체 수준을 양성 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 양성 대조군은 항-AAVrh.74 모노클로날 항체를 이용한다.

임의의 개시된 방법에서, 항-AAVrh.74의 존재의 결정은 면역형광 검정, 면역조직화학적 검정, 웨스턴 블롯, 직접 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA, 역 ELISA, 화학발광 검정, 방사면역검정, 또는 면역침전 검정을 이용하여 결정될 수 있다.

임의의 개시된 방법에서, 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계는 NYGMN (서열식별번호: 20), DYGMN (서열식별번호: 22), YTFTNYGMN (서열식별번호: 21), 및 YTFTKYGMN (서열식별번호: 23)으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR1 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체, 또는 WINTYTGEPTYADDFKG (서열식별번호: 24), WINTNTGEPTYGDDFKG (서열식별번호: 25), 및 WMGWINTYTGEPTY (서열식별번호: 26)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR2 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체, 또는 GVAHYSDSRFAFDY (서열식별번호: 27), GNAHPGGSAFVY (서열식별번호: 28), RGSYYYDSSPAWFAY (서열식별번호: 29), RGVDSSGYGAFAY (서열식별번호: 30), 및 TRGTSTMISTFAFVY (서열식별번호: 31)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR3 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체, 또는 SVSSSVSYMH (서열식별번호: 32), SASSGVTYMH (서열식별번호: 33), SSVSYMH (서열식별번호: 34), 및 SSVRYMH (서열식별번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL CDR1 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체, 또는 YTSNLAS (서열식별번호: 36), RTSNLAS (서열식별번호: 37), LWIYSTSNLAS (서열식별번호: 38), 및 VWIYSTSNLAS (서열식별번호: 39)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL CDR2 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체, 또는 QQRSSYPFT (서열식별번호: 40), QQRSTYPF (서열식별번호: 41), QQRSFYPF (서열식별번호: 42), 및 QQRTYYPF (서열식별번호: 43)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR3 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 이용하는 것을 포함한다.

예시적인 실시양태에서, 개시된 방법은 항-AAVrh.74 모노클로날 항체, 예컨대 서열식별번호: 10, 12, 14, 16 또는 18에 제시된 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 모노클로날 항체, 또는 서열식별번호: 11, 13, 15, 17 또는 19에 제시된 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 이용하여 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.

추가 실시양태에서, 개시된 방법은 서열식별번호: 10, 12, 14, 16 또는 18에 제시된 가변 중쇄 (VH) 서열 및 서열식별번호: 11, 13, 15, 17 또는 19에 제시된 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 항-AAVrh.74 모노클로날 항체를 이용하여 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.

임의의 개시된 방법에서, 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계는 정량적이고, 여기서 상기 대상체는 상기 정량화에 기반하여 항-AAVrh.74 항체에 대해 혈청양성으로서 식별되고, 여기서 상기 면역저해 레지멘 또는 TPE는 혈청양성 대상체에게 선택적으로 투여된다. 본원에 개시된 임의의 방법에서, rAAV는 전신 투여 경로에 의해 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵vg/kg의 용량으로 투여된다. 근이영양증은 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증일 수 있다.

예를 들어, 투여되는 rAAV의 용량은 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 2.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹³ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴vg/kg, 또는 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 1.0x10¹⁵, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5 x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5 x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴,또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴,또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 1.0x10¹⁵, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴vg/kg이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 rAAV를 전신적으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 전신 투여 경로는 정맥내 경로이고, 투여되는 rAAV의 용량은 약 2.0 x10¹⁴ vg/kg이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 rAAV를 전신적으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 전신 투여 경로는 정맥내 경로이고, 투여되는 rAAV의 용량은 약 5.0x10¹² vg/kg, 또는 약 6.0x10¹² vg/kg, 또는 약 7.0x10¹² vg/kg, 또는 약 8.0x10¹² vg/kg, 또는 약 9.0x10¹² vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 4.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 6.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 7.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 8.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 9.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1x10¹⁵ vg/kg이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 또는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, rAAV의 용량은 약 5 mL/kg 내지 약 15 mL/kg, 또는 약 8 mL/kg 내지 약 12 mL/kg, 또는 8 mL/kg 내지 약 10 mL/kg, 또는 5 mL/kg 내지 약 10 mL/kg, 또는 약 10 mL/kg 내지 12 mL/kg, 또는 약 10 mL/kg 내지 15 mL/kg, 또는 10 mL/kg 내지 약 20 mL/kg으로 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, rAAV의 용량은 약 10 mL/kg으로 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 또는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 방법, 조합 요법 또는 의약에서, rAAV의 용량은 주사, 주입 또는 이식에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, rAAV의 용량은 대략 1시간에 걸쳐 주입에 의해 투여된다. 또한, rAAV의 용량은 말초 사지 정맥, 예컨대 말초 팔 정맥 또는 말초 다리 정맥을 통한 정맥내 경로에 의해 투여된다. 대안적으로, 주입은 대략 30분, 또는 대략 1.5시간, 또는 대략 2시간, 또는 대략 2.5시간 또는 대략 3시간에 걸쳐 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에 의해 투여되는 rAAV는 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 임의의 방법에 의해 투여되는 rAAV는 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 서열을 포함한다. 예를 들어, rAAV는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다.

한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 투여되는 rAAV는 AAVrh.74 항체에 대한 혈청형이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법, 조합 요법 또는 용도는 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 치료한다. 예시적인 실시양태는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 치료하기 위한 방법, 조합 요법 또는 의약이며, 여기서 투여 경로는 정맥내 주입이고, 투여되는 rAAV의 용량은 대략 1시간에 걸쳐 약 2x10¹⁴ vg/kg이고, 여기서 rAAV 벡터는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 근육 특이적 제어 요소 뉴클레오티드 서열 및 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV를 제공한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 기능적 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하고, 여기서 뉴클레오티드는 예를 들어 서열식별번호: 1과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 더 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 및 훨씬 더 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 여기서 단백질은 마이크로-디스트로핀 활성을 보유한다. 마이크로-디스트로핀 단백질은 근육 수축 동안 근육막에 안정성을 제공하고, 예를 들어 마이크로-디스트로핀은 근육 수축 동안 충격 흡수제로서 작용한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용은 또한 rAAV를 제공하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 1의 핵산 서열 또는 이의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 기능적 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩한다.

한 실시양태에서, rAAV는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022로 불리는 비복제 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV)이다. 이 벡터 게놈은 AAV2 역전된 말단 반복부 (ITR), 마이크로-디스트로핀, SV40 인트론 (SD/SA) 및 합성 폴리아데닐화 (폴리 A) 신호를 포함하여 유전자 발현에 필요한 최소 요소를 함유하며, 모두 MHCK7 프로모터/인핸서의 제어 하에 있다. 게놈 및 발현 카세트의 개략도는 도 1에 표시되어 있다. AAVrh.74 혈청형은 IV 투여 후 골격근 및 심근에서 효율적인 유전자 전달을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 정량화 표준으로서 슈퍼코일 플라스미드를 기준으로 약 5.0 x 10¹³ vg/kg 또는 약 2.0 x 10¹⁴ vg/kg, 또는 정량화 표준으로서 선형화된 플라스미드를 기준으로 약 1.85 x 10¹³ vg/kg 또는 7.41 x 10¹³ vg/kg의 용량으로 대략 1 내지 2시간에 걸쳐 rAAV 정맥내 주입을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 방법, 조합 요법 또는 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 19와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.MHCK7.hSGCB 구축물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 세포에서 베타-사르코글리칸 유전자를 발현시키는 방법을 기술한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 44와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 scAAVrh74.MHCK7.hSGCB 구축물 뉴클레오티드 서열을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 근육 조직에서 베타-사르코글리칸 양성 섬유를 증가시키고/거나 CK 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 서열식별번호: 45에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 더 전형적으로 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하고, β-사르코글리칸 활성을 보유하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 45에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 45에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 더 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 및 훨씬 더 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 단백질은 β-사르코글리칸 활성을 보유한다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 45의 핵산 서열 또는 이의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능적 β-사르코글리칸을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터가 본원에 기재되어 있다.

특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV scAAVrh74.MHCK7.HSGCB를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 LGMD2E를 치료하기 위한 방법, 조합 요법 또는 용도를 제공한다. 예를 들어, LGMD2E를 치료하는 임의의 방법에서, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB는 약 0.5x 10¹⁴ vg/kg 또는 약 2x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 직전을 포함하여 scAAVrh74.MHCK7.HSGCB와 관련하여 본원에 언급된 투여량은 슈퍼코일 qPCR 표준을 이용하는 것에 기반한다. 0.5x 10¹⁴ vg/kg 및 2x 10¹⁴ vg/kg은 각각 선형 qPCR 표준을 이용함으로써 측정된 바와 같은 1.85 X 10¹³ 및 7.41X 10¹³ vg/kg에 상응한다.

특정한 실시양태에서, 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 인간 대상체는 LGMD2E를 앓고 있고, rAAV는 약 2x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되고, 여기서 rAAV는 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.MHCK7.HSGCB이다.

관련 실시양태에서, 인간 대상체는 근이영양증 LGMD2E를 앓고 있고, rAAV는 약 2x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되는 scAAVrh74.MHCK7.HSGCB이고, 방법은 rAAV 투여 전 1일 (12 내지 24시간)에 시작하여 및 60일 동안 테이퍼링과 함께 또는 없이 계속되는 1mg/kg/일의 프레드니손을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

또 다른 관련 실시양태에서, 인간 대상체는 근이영양증 LGMD2E를 앓고 있고, rAAV는 약 0.5x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되는 scAAVrh74.MHCK7.HSGCB이고, 방법은 rAAV 투여 전 1일 (12 내지 24시간)에 시작하여 및 30일 동안 테이퍼링과 함께 또는 없이 계속되는 1mg/kg/일의 프레드니손을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

프레드니손의 30일 및 60일 투여는 대상체의 특정한 임상적 징후에 따라 및 달리 본 발명의 방법에 대해 본원에 추가로 기재된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 테이퍼링될 수 있음이 인식된다.

용어 "엄격한"은 관련 기술분야에서 일반적으로 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 혼성화 엄격성은 주로 온도, 이온 강도, 및 변성제, 예컨대 포름아미드의 농도에 의해 결정된다. 혼성화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65-68℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 또는 42℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드이다. 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)]을 참조한다. 더 엄격한 조건 (예컨대 더 높은 온도, 더 낮은 이온 강도, 더 높은 포름아미드, 또는 다른 변성제)이 또한 사용될 수 있지만, 혼성화 속도가 영향을 받을 것이다. 데옥시올리고뉴클레오티드의 혼성화가 고려되는 예에서, 추가의 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 37℃ (14-베이스 올리고의 경우), 48℃ (17-베이스 올리고의 경우), 55℃ (20-베이스 올리고의 경우), 및 60℃ (23-베이스 올리고의 경우)에서 6x SSC 0.05% 피로인산나트륨에서의 세척을 포함한다.

비특이적 및/또는 백그라운드 혼성화를 감소시키기 위해 혼성화 및 세척 완충액에 다른 작용제가 포함될 수 있다. 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 0.1% 나트륨 도데실술페이트, NaDodSO4, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (또는 다른 비상보적 DNA), 및 덱스트란 술페이트이지만, 다른 적합한 작용제가 또한 사용될 수 있다. 이들 첨가제의 농도 및 유형은 혼성화 조건의 엄격성에 실질적으로 영향을 미치지 않고 변화될 수 있다. 혼성화 실험은 대개 pH 6.8-7.4에서 수행되지만, 전형적인 이온 강도 조건에서, 혼성화 속도는 pH와 거의 무관하다. 문헌 [Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England)]을 참조한다. 혼성화 조건은 이들 변수를 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하도록 허용하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있다.

용어 "근육 특이적 제어 요소"는 근육 조직에서 발현에 특이적인 코딩 서열의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이들 제어 요소는 인핸서 및 프로모터를 포함한다. 본 개시내용은 근육 특이적 제어 요소 MCKH7 프로모터, MCK 프로모터 및 MCK 인핸서를 포함하는 구축물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 rAAV를 제공하며, 여기서 근육 특이적 제어 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 (MEF), 근육 크레아틴 키나제 (MCK), 말단절단된 MCK (tMCK), 미오신 중쇄 (MHC), 하이브리드 α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터 (MHCK7), C5-12, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 고속-연축 트로포닌 c 유전자 요소, 저속-연축 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 저속-연축 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유도성 핵 인자, 스테로이드-유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)이다.

예를 들어, 근육 특이적 제어 요소는 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7이거나, 근육 특이적 제어 요소는 MCK 뉴클레오티드 서열 서열식별번호: 4이다. 또한, 본 개시내용의 임의의 rAAV 벡터에서, 근육 특이적 제어 요소 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 MHCK7 또는 MCK 뉴클레오티드 서열은 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7)은 도 1 또는 도 2 (서열식별번호: 3) 또는 도 13 (서열식별번호: 9)에 제공된 구축물에 제시된 바와 같이 인간 마이크로-디스트로핀 코딩 서열 (서열식별번호: 1)에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 예에서, MCK 프로모터 (서열식별번호: 4)는 도 5 또는 도 6 (서열식별번호: 5)에 제공된 구축물에 제시된 바와 같이 인간 마이크로-디스트로핀 코딩 서열 (서열식별번호: 1)에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2, 또는 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 또한 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다.

추가 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 함유된 rAAV 구축물을 제공한다. 예를 들어, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 벡터는 서열식별번호: 3의 ITR을 포함하고 그 내에 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 도 2에 표시되어 있다. rAAV 벡터는 5' ITR, MHCK7 프로모터, 키메라 인트론 서열, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자에 대한 코딩 서열, 폴리A, 및 3' ITR을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함한다. 서열식별번호: 3에 제시된 플라스미드는 암피실린 내성 및 pBR322 복제 기점을 갖는 pGEX 플라스미드 백본을 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV를 제공한다. 예를 들어, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 벡터 구축물은 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 도 7에 표시되어 있다. 이러한 rAAV 벡터 구축물은 MHCK7 프로모터, 키메라 인트론 서열, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자에 대한 코딩 서열, 및 폴리A를 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터 구축물은 프로모터에 대한 ITR 5' 및 폴리A에 대한 ITR 3'를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh.74이다.

또 다른 측면에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 벡터는 서열식별번호: 8의 ITR을 포함하고 그 내에 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 도 9에 표시되어 있다. rAAV 벡터는 5' ITR, MHCK7 프로모터, 키메라 인트론 서열, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자에 대한 코딩 서열, 폴리A, 및 3' ITR을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 1-4977을 포함한다. 서열식별번호: 3에 제시된 플라스미드는 카나마이신 내성 및 pBR322 복제 기점을 갖는 pGEX 플라스미드 백본을 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 벡터 구축물을 포함하는 플라스미드를 제공한다. 한 실시양태에서, 플라스미드는 5' ITR, MHCK7 프로모터, 키메라 인트론 서열, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자에 대한 코딩 서열, 폴리A, 및 3' ITR을 포함한다. 한 실시양태에서, 플라스미드는 카나마이신 내성을 포함하고, 임의로, pBR322 복제 기점을 갖는 pGEX 플라스미드 백본을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 플라스미드는 서열식별번호: 8에 제시되고 도 8 및 9에 표시되어 있다.

본 개시내용은 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 이러한 rAAV 벡터는 AAV 혈청형 AAVrh.74이다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 3의 ITR을 포함하고 그 내에 있는 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 8의 ITR을 포함하고 그 내에 있는 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV를 제공한다. 이러한 rAAV 벡터는 AAV 혈청형 AAVrh.74이다.

본 개시내용의 rAAV 벡터는 임의의 AAV 혈청형, 예컨대 혈청형 AAVrh.74, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13일 수 있다.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 제약 조성물 (또는 때때로 본원에서 간단히 "조성물"로 지칭됨)을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 rAAV 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 단계 및 형질감염된 세포의 상청액으로부터 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는, rAAV 벡터 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.

근이영양증을 치료하는 임의의 방법에서, 대상체의 세포에서 관심 트랜스진의 수준, 예컨대 베타-사르코글리칸 유전자 발현 또는 마이크로-디스트로핀 유전자 발현은 rAAV 투여 후에 증가된다. 세포에서 관심 트랜스진 유전자의 발현은 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯에 의해 관심 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 특히, 관심 단백질의 수준은 rAAV 투여 전의 관심 단백질의 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 적어도 약 70% 내지 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 70% 내지 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 80% 내지 적어도 약 90%만큼 증가된다. 예를 들어, 관심 단백질의 수준은 rAAV 투여 전의 관심 단백질의 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%만큼 증가된다.

또한, 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 관심 단백질의 수준을 측정함으로써 검출된다. 관심 단백질의 수준은 rAAV 투여 전의 관심 단백질의 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 적어도 약 70% 내지 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 70% 내지 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 80% 내지 적어도 약 90%만큼 증가된다. 예를 들어, 관심 단백질의 수준은 rAAV 투여 전의 관심 단백질의 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%만큼 증가된다.

근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 감소된다. 예를 들어, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 65% 내지 약 90% 또는 약 65% 내지 약 95% 또는 약 75% 내지 약 90% 또는 약 80% 내지 약 90% 또는 약 85% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 90%만큼 감소된다. 특히, 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 87%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 72%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 73%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 78%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 95%만큼 감소된다. 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 근육 조직에서 관심 단백질에 양성인 근육 섬유의 수는 rAAV 투여 전의 관심 단백질에 양성인 근육 섬유의 수와 비교하여 rAAV 투여 후에 증가된다. 예를 들어, 관심 단백질에 양성인 근육 섬유의 수는 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 관심 단백질에 양성인 근육 섬유 수준을 측정함으로써 검출된다.

근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, rAAV의 투여는 DAPC 단백질, 예컨대 알파-사르코글리칸 또는 베타-사르코글리칸의 발현을 상향조절한다. 예를 들어, 대상체의 알파-사르코글리칸 수준은 rAAV 투여 전의 알파-사르코글리칸 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 증가된다. 또한, 대상체의 베타-사르코글리칸 수준은 rAAV 투여 전의 베타-사르코글리칸 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 증가된다. 알파-사르코글리칸 또는 베타-사르코글리칸의 수준은 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 또는 베타-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 질환 진행은 하기 중 임의의 것에 의해 측정된 바와 같이 rAAV 투여 후에 지연된다: 6분 걷기 테스트, 일어나는 시간, 4 계단 오르기, 4 계단 오르고 내리기, 북극성 보행 평가 (NSAA), 10 미터 시한 테스트, 100 미터 시한 테스트, 휴대용 동력측정법 (HHD), 시한 일어서서 걷기, 및/또는 총 운동 서브테스트 척도 (베일리-III) 스코어.

예를 들어, 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 NSAA 스코어와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 NSAA 스코어의 적어도 6-포인트 개선을 갖는다. 추가로, 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 일어나는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 일어나는 시간의 적어도 약 0.8초 개선을 갖는다. 또한, 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 4 계단 테스트를 오르는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 4 계단 테스트를 오르는 시간의 적어도 약 1.2초 개선을 갖는다. 또한, 임의의 방법, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 100 m 시한 테스트와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 100 m 시한 테스트의 적어도 약 7초 개선을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하기 위한 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도를 제공한다. 예를 들어, 환자 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 rAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 마이크로-디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 또한, 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 핵당 더 많은 수의 벡터 게놈을 검출함으로써 환자에서 측정되며, 여기서 핵당 1 벡터 게놈은 약 50% 마이크로-디스트로핀 발현이고, 핵당 1 초과의 카피는 마이크로-디스트로핀 발현 수준과 일치한다. 예를 들어, 세포는 핵당 1.2 벡터 카피, 또는 핵당 1.3 벡터 카피, 또는 핵당 1.4 벡터 카피, 또는 핵당 1.5 벡터 카피, 또는 핵당 1.6 벡터 카피, 또는 핵당 1.7 벡터 카피, 또는 핵당 1.8 벡터 카피, 또는 핵당 1.9 벡터 카피를 갖는다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 혈청 CK 수준의 감소를 필요로 하는 환자에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도를 제공하며, 방법은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 환자의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 적어도 약 65% 내지 약 90% 또는 약 65% 내지 약 95% 또는 약 75% 내지 약 90% 또는 약 80% 내지 약 90% 또는 약 85% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 90%만큼 감소된다. 특히, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 87%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 72%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 73%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 78%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 95%만큼 감소된다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자 근육 조직에서 마이크로-디스트로핀 양성 섬유를 증가시키기 위한 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도를 제공한다. 예를 들어, 마이크로-디스트로핀 양성 섬유의 수는 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 또한, 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 핵당 더 많은 수의 벡터 게놈을 검출함으로써 환자에서 측정되며, 여기서 핵당 1 벡터 게놈은 약 50% 마이크로-디스트로핀 발현이고, 핵당 1 초과의 카피는 마이크로-디스트로핀 발현 수준과 일치한다. 예를 들어, 세포는 핵당 1.2 벡터 카피, 또는 핵당 1.3 벡터 카피, 또는 핵당 1.4 벡터 카피, 또는 핵당 1.5 벡터 카피, 또는 핵당 1.6 벡터 카피, 또는 핵당 1.7 벡터 카피, 또는 핵당 1.8 벡터 카피, 또는 핵당 1.9 벡터 카피를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 알파-사르코글리칸의 발현의 증가를 필요로 하는 환자에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도를 제공한다. 예를 들어, 알파-사르코글리칸 수준은 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또한, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 베타-사르코글리칸의 발현의 증가를 필요로 하는 환자에서 베타-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도를 제공한다. 예를 들어, 베타-사르코글리칸 수준은 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 베타-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도를 제공하며, 여기서 환자의 질환 진행은 하기 중 임의의 것에 의해 측정된 바와 같이 지연된다: 6분 걷기 테스트, 일어나는 시간, 4 계단 오르기, 4 계단 오르고 내리기, 북극성 보행 평가 (NSAA), 10 미터 시한 테스트, 100 미터 시한 테스트, 휴대용 동력측정법 (HHD), 시한 일어서서 걷기, 및/또는 총 운동 서브테스트 척도 (베일리-III) 스코어.

예를 들어, 임의의 방법, 조성물, 조합 요법 또는 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 NSAA 스코어와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 NSAA 스코어의 적어도 6-포인트 개선을 갖는다. 추가로, 임의의 방법에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 일어나는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 일어나는 시간의 적어도 약 0.8초 개선을 갖는다. 또한, 임의의 방법에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 4 계단 테스트를 오르는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 4 계단 테스트를 오르는 시간의 적어도 약 1.2초 개선을 갖는다. 또한, 임의의 방법에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 100 m 시한 테스트와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 100 m 시한 테스트의 적어도 약 7초 개선을 갖는다.

"섬유증"은 골격근, 심근, 간, 폐, 신장 및 췌장을 포함하여 상해 시 조직에서 세포외 매트릭스 (ECM) 구성성분의 과도한 또는 비조절된 침착 및 비정상적인 복구 프로세스를 지칭한다. 침착되는 ECM 구성성분은 피브로넥틴 및 콜라겐, 예를 들어 콜라겐 1, 콜라겐 2 또는 콜라겐 3을 포함한다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV; 또는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV 벡터의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 감소 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 또 다른 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 또 다른 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5066의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 추가 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 9의 AAV74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV 벡터의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 섬유증 예방을 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 임의의 rAAV는 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어 섬유증 전에 투여되는 인간 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 본 개시내용의 rAAV가 대상체에서 관찰된다. 또한, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 본 개시내용의 rAAV는 섬유증이 발병할 위험이 있는 대상체, 예컨대 근이영양증, 예를 들어 DMD을 앓고 있거나 이로 진단된 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 rAAV는 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다.

본 개시내용은 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에 rAAV를 투여하는 것을 고려한다. 또한, rAAV는 섬유증이 발병할 위험이 있는 대상체, 예컨대 근이영양증, 예를 들어 DMD을 앓고 있거나 이로 진단된 대상체에게 투여될 수 있다. rAAV는 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 섬유증을 이미 발병한 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육 힘 및/또는 근육 질량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에 또는 근육 힘이 감소되기 전에 또는 근육 질량이 감소되기 전에 DMD로 진단된 대상체에게 rAAV 벡터를 투여하는 것을 고려한다.

본 개시내용은 또한 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 또는 이들 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위해 섬유증을 이미 발병한 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 고려한다. 본 개시내용은 또한 근육을 추가 상해로부터 보호하기 위해 이미 감소된 근육 힘을 갖거나 감소된 근육 질량을 갖는 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV 벡터를 투여하는 것을 제공한다.

본 개시내용의 임의의 방법에서, 대상체는 근이영양증, 예컨대 DMD 또는 임의의 다른 디스트로핀-연관 근이영양증을 앓고 있을 수 있다.

본원에 기재된 본 개시내용의 임의의 방법의 다른 실시양태에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 수준만큼 감소된다:

a) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 적어도 78%;

b) 투여 후 270일까지 적어도 46, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 또는 85%;

c) 투여 후 180일까지 적어도 72, 73, 74 또는 95%;

d) 투여 후 90일까지 적어도 87, 88, 93 또는 95%;

e) 투여 후 270일까지 적어도 70%;

f) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 70 내지 95%;

g) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 적어도 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95%; 및

h) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 적어도 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95%.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 용량을 포함하고, 여기서 조성물은 전신 투여 경로를 위해 제형화되고, rAAV의 용량은 약 1x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4x10¹⁴ vg/kg이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 2.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹³ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴vg/kg, 또는 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 1.0x10¹⁵, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5 x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5 x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴,또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴,또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 1.0x10¹⁵, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴vg/kg의 rAAV 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화되고, 약 2.0 x10¹⁴ vg/kg인 rAAV의 용량을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화되고, 약 5.0x10¹² vg/kg, 또는 약 6.0x10¹² vg/kg, 또는 약 7.0x10¹² vg/kg, 또는 약 8.0x10¹² vg/kg, 또는 약 9.0x10¹² vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 4.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 6.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 7.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 8.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 9.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1x10¹⁵vg/kg인 rAAV의 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 또 다른 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 조성물에서, rAAV의 용량은 약 5mL/kg 내지 약 15 mL/kg, 또는 약 8 mL/kg 내지 약 12 mL/kg, 또는 8 mL/kg 내지 약 10 mL/kg, 또는 5 mL/kg 내지 약 10 mL/kg, 또는 약 10 mL/kg 내지 12 mL/kg, 또는 약 10 mL/kg 내지 15 mL/kg, 또는 10 mL/kg 내지 약 20 mL/kg으로 전달된다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 10 mL/kg으로 전달되는 rAAV의 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 또 다른 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여를 위해 제형화된다. 예를 들어, 조성물은 대략 1시간에 걸친 주입에 의한 투여를 위해 제형화된다. 또한, 본 개시내용의 조성물은 말초 사지 정맥, 예컨대 말초 팔 정맥 또는 말초 다리 정맥을 통한 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 대안적으로, 주입은 대략 30분, 또는 대략 1.5시간, 또는 대략 2시간, 또는 대략 2.5시간 또는 대략 3시간에 걸쳐 투여될 수 있다.

본 개시내용의 임의의 조성물은 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 서열을 포함하는 rAAV, 또는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다.

특히, 본 개시내용의 조성물은 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 치료하기 위한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 용량을 포함하고, 여기서 조성물은 대략 1시간에 걸친 정맥내 주입에 의한 투여를 위해 제형화되고, 투여되는 rAAV의 용량은 약 2x 10¹⁴ vg/kg이고, 여기서 rAAV는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 섬유증 감소를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위한 rAAV를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 예방하기 위한 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 또한 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육 힘 및/또는 근육 질량을 증가시키기 위한 rAAV를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 근이영양증의 치료를 위한 본 개시내용의 임의의 rAAV를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 개시내용의 임의의 조성물의 다른 실시양태에서, 근이영양증 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 상기 조성물의 투여 후에, 대상체의 혈청 CK 수준은 조성물 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 수준만큼 감소된다:

a) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 적어도 78%;

b) 투여 후 270일까지 적어도 46, 55, 70 또는 85%;

c) 투여 후 180일까지 적어도 72, 73, 74 또는 95%;

d) 투여 후 90일까지 적어도 87, 99, 93 또는 95%;

e) 투여 후 270일까지 적어도 70%;

f) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 70 내지 95%;

g) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 적어도 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95%; 및

h) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95%.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 용량의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 전신 투여 경로를 위해 제형화되고, rAAV의 용량은 약 1x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4x 10¹⁴ vg/kg이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

예를 들어, 의약은 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 2.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹³ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴vg/kg, 또는 1.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 5.0x10¹³ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 1.0x10¹⁵, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5 x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5 x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴,또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁵ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 4.0x10¹⁴,또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg 내지 약 2.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 1.0x10¹⁵, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 6.0x10¹⁴, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 5.0x10¹⁴,또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.0x10¹⁴ vg/kg 내지 약 3.25x10¹⁴vg/kg의 rAAV 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 의약은 rAAV 용량의 전신 투여를 위해 제형화되고, 여기서 전신 투여 경로는 정맥내 경로이고, 투여되는 rAAV의 용량은 약 2.0 x10¹⁴ vg/kg이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 의약은 rAAV 용량의 전신 투여를 위해 제형화되고, 여기서 전신 투여 경로는 정맥내 경로이고, rAAV의 용량은 약 5.0x10¹² vg/kg, 또는 약 6.0x10¹² vg/kg, 또는 약 7.0x10¹² vg/kg, 또는 약 8.0x10¹² vg/kg, 또는 약 9.0x10¹² vg/kg, 또는 약 1.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 2.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.25x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.5x10¹³ vg/kg, 또는 약 3.75x10¹³ vg/kg, 또는 약 4.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 6.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 7.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 8.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 9.0x10¹³ vg/kg, 또는 약 1.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 2.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.25x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 3.75x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 4.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 6.0x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 1x10¹⁵ vg/kg이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 용도에서, 의약은 약 5mL/kg 내지 약 15 mL/kg, 또는 약 8 mL/kg 내지 약 12 mL/kg, 또는 8 mL/kg 내지 약 10 mL/kg, 또는 5 mL/kg 내지 약 10 mL/kg, 또는 약 10 mL/kg 내지 12 mL/kg, 또는 약 10 mL/kg 내지 15 mL/kg, 또는 10 mL/kg 내지 약 20 mL/kg의 rAAV 용량을 포함한다. 특정한 실시양태에서, rAAV의 용량은 약 10 mL/kg이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022이다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다. 한 실시양태에서, AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 56-4820의 AAVrh74.MCK.마이크로디스트로핀이다.

본 개시내용의 임의의 용도에서, 의약은 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여를 위해 제형화된다. 예를 들어, 의약은 대략 1시간에 걸친 주입에 의한 투여를 위해 제형화된다. 또한, 의약은 말초 사지 정맥, 예컨대 말초 팔 정맥 또는 말초 다리 정맥을 통한 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 대안적으로, 주입은 대략 30분, 또는 대략 1.5시간, 또는 대략 2시간, 또는 대략 2.5시간 또는 대략 3시간에 걸쳐 투여될 수 있다.

본 개시내용의 임의의 용도에서, 의약은 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 서열 또는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV를 포함한다.

본 개시내용의 특정한 용도는 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 치료료하기 위한 의약의 제조를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀의 용량의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 대략 1시간에 걸친 정맥내 주입에 의한 투여를 위해 제형화되고, 투여되는 rAAV의 용량은 약 2x 10¹⁴ vg/kg이고, 여기서 rAAV는 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함한다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 섬유증 감소를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 rAAV의 용도를 제공한다. 예를 들어, 섬유증 감소를 필요로 하는 대상체는 근이영양증, 예컨대 DMD 또는 임의의 다른 디스트로핀 연관 근이영양증을 앓고 있을 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 예방하기 위한 의약의 제조를 위한 rAAV의 용도를 제공한다.

또한, 본 개시내용은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육 강도 및/또는 근육 질량을 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한 rAAV의 용도를 제공한다.

본 개시내용은 또한 근이영양증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 rAAV의 용도를 제공한다.

본 개시내용은 근이영양증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 용도, 또는 근이영양증의 치료를 위한 서열식별번호: 9의 AAVrf74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는 rAAV 벡터의 용도를 제공한다.

본 개시내용의 임의의 용도의 다른 실시양태에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 대상체에게 rAAV 투여 후에 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 수준만큼 감소된다:

a) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 적어도 78%;

b) 투여 후 270일까지 적어도 46, 55, 70 또는 95%;

c) 투여 후 180일까지 적어도 72, 73, 74 또는 95%;

d) 투여 후 90일까지 적어도 87, 88, 93 또는 95%;

e) 투여 후 270일까지 적어도 70%;

f) 투여 후 90, 180 또는 270일까지 70 내지 95%;

임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자 발현 수준은 조성물 또는 의약의 투여 후에 증가된다. 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 조성물 또는 의약의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯에 의해 마이크로-디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 특히, 마이크로-디스트로핀 단백질의 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 마이크로-디스트로핀의 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후에 적어도 약 70% 내지 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 70% 내지 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 80% 내지 적어도 약 90%만큼 증가된다. 예를 들어, 마이크로-디스트로핀 단백질의 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 마이크로-디스트로핀의 수준과 비교하여 조성물의 투여 후에 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%만큼 증가된다.

또한, 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 조성물 또는 의약의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 면역조직화학에 의해 마이크로-디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 마이크로-디스트로핀 단백질의 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 마이크로-디스트로핀의 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 적어도 약 70% 내지 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 70% 내지 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 80% 내지 적어도 약 90%만큼 증가된다. 예를 들어, 마이크로-디스트로핀 단백질의 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 마이크로-디스트로핀의 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후에 적어도 약 70% 또는 적어도 약 71% 또는 적어도 약 72% 또는 적어도 약 73% 또는 적어도 약 74% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 76% 또는 적어도 약 77% 또는 적어도 약 78% 또는 적어도 약 79% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%만큼 증가된다.

임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 및 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 감소된다. 예를 들어, 대상체의 혈청 CK 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 65% 내지 약 90% 또는 약 65% 내지 약 95% 또는 약 75% 내지 약 90% 또는 약 80% 내지 약 90% 또는 약 85% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 90%만큼 감소된다. 특히, 본 개시내용의 임의의 조합 요법, 조성물 및 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 87%만큼 감소된다. 본 개시내용의 임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 72%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 rAAV 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 73%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 78%만큼 감소되거나, 또는 본 개시내용의 임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 혈청 CK 수준은 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 rAAV 투여 후 60일까지 약 95%만큼 감소된다. 임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 근육 조직에서 마이크로-디스트로핀 양성 섬유의 수는 rAAV 투여 전의 마이크로-디스트로핀 양성 섬유의 수와 비교하여 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 후에 증가된다. 예를 들어, 마이크로-디스트로핀 양성 섬유의 수는 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 마이크로-디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 조성물 또는 의약의 투여는 DAPC 단백질, 예컨대 알파-사르코글리칸 또는 베타-사르코글리칸의 발현을 상향조절한다. 예를 들어, 대상체의 알파-사르코글리칸 수준은 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전의 알파-사르코글리칸 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 증가된다. 알파-사르코글리칸 또는 베타-사르코글리칸의 수준은 rAAV 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 또는 베타-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체의 질환 진행은 하기 중 임의의 것에 의해 측정된 바와 같이 rAAV 투여 후에 지연된다: 6분 걷기 테스트, 일어나는 시간, 4 계단 오르기, 4 계단 오르고 내리기, 북극성 보행 평가 (NSAA), 10 미터 시한 테스트, 100 미터 시한 테스트, 휴대용 동력측정법 (HHD), 시한 일어서서 걷기, 및/또는 총 운동 서브테스트 척도 (베일리-III) 스코어.

예를 들어, 임의의 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도의 투여 후에, 대상체는 rAAV 투여 전의 NSAA 스코어와 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 적어도 270일에 NSAA 스코어의 적어도 6-포인트 개선을 갖는다. 추가로, 임의의 방법, 조합 요법, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물 또는 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 용도에서, 대상체는 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전의 일어나는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 일어나는 시간의 적어도 약 0.8초 개선을 갖는다. 또한, 본 개시내용의 임의의 방법, 조합 요법, 조성물 또는 용도에서, 대상체는 조합 요법, 조성물 또는 의약의 투여 전의 4 계단 테스트를 오르는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 4 계단 테스트를 오르는 시간의 적어도 약 1.2초 개선을 갖는다. 또한, 본 개시내용의 임의의 방법, 조합 요법, 조성물 또는 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전의 100 m 시한 테스트와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 100 m 시한 테스트의 적어도 약 7초 개선을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는, 환자 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하기 위한 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 환자 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하기 위한 의약의 제조를 위한, 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022의 용량의 용도를 제공한다. 예를 들어, 환자 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 rAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 마이크로-디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 또한, 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 핵당 더 많은 수의 벡터 게놈을 검출함으로써 환자에서 측정되며, 여기서 핵당 1 벡터 게놈은 약 50% 마이크로-디스트로핀 발현이고, 핵당 1 초과의 카피는 마이크로-디스트로핀 발현 수준과 일치한다. 예를 들어, 세포는 핵당 1.2 벡터 카피, 또는 핵당 1.3 벡터 카피, 또는 핵당 1.4 벡터 카피, 또는 핵당 1.5 벡터 카피, 또는 핵당 1.6 벡터 카피, 또는 핵당 1.7 벡터 카피, 또는 핵당 1.8 벡터 카피, 또는 핵당 1.9 벡터 카피를 갖는다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 혈청 CK 수준의 감소를 필요로 하는 환자에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공하며, 조성물은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함한다. 또한, 본 개시내용은 혈청 CK 수준의 감소를 필요로 하는 환자에서 혈청 CK 수준을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한, 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022의 용량의 용도를 제공한다. 예를 들어, 환자의 혈청 CK 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 60일까지 적어도 약 65% 내지 약 90% 또는 약 65% 내지 약 95% 또는 약 75% 내지 약 90% 또는 약 80% 내지 약 90% 또는 약 85% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 95% 또는 약 87% 내지 약 90%만큼 감소된다. 특히, 대상체의 혈청 CK 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 60일까지 약 87%만큼 감소되거나, 또는 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 60일까지 약 72%만큼 감소되거나, 또는 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 60일까지 약 73%만큼 감소되거나, 또는 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 60일까지 약 78%만큼 감소되거나, 또는 조성물 또는 의약의 투여 전의 혈청 CK 수준과 비교하여 조성물 또는 의약의 투여 후 60일까지 약 95%만큼 감소된다.

본 개시내용은 또한 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는, 환자 근육 조직에서 마이크로-디스트로핀 양성 섬유를 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 환자 근육 조직에서 마이크로-디스트로핀 양성 섬유를 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한, 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022의 용량의 용도를 제공한다. 예를 들어, 마이크로-디스트로핀 양성 섬유의 수는 조성물 또는 의약의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 디스트로핀 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다. 또한, 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현은 핵당 더 많은 수의 벡터 게놈을 검출함으로써 환자에서 측정되며, 여기서 핵당 1 벡터 게놈은 약 50% 마이크로-디스트로핀 발현이고, 핵당 1 초과의 카피는 마이크로-디스트로핀 발현 수준과 일치한다. 예를 들어, 세포는 핵당 1.2 벡터 카피, 또는 핵당 1.3 벡터 카피, 또는 핵당 1.4 벡터 카피, 또는 핵당 1.5 벡터 카피, 또는 핵당 1.6 벡터 카피, 또는 핵당 1.7 벡터 카피, 또는 핵당 1.8 벡터 카피, 또는 핵당 1.9 벡터 카피를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는, 알파-사르코글리칸의 발현의 증가를 필요로 하는 환자에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 알파-사르코글리칸의 발현의 증가를 필요로 하는 환자에서 알파-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한, 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022의 용량의 용도를 제공한다. 예를 들어, 알파-사르코글리칸 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 알파-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

또한, 본 개시내용은 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022를 포함하는, 베타-사르코글리칸의 발현의 증가를 필요로 하는 환자에서 베타-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 베타-사르코글리칸의 발현의 증가를 필요로 하는 환자에서 베타-사르코글리칸의 발현을 증가시키기 위한 의약의 제조를 위한, 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022의 용도를 제공한다. 예를 들어, 베타-사르코글리칸 수준은 조성물 또는 의약의 투여 전 및 후의 근육 생검에서 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의해 베타-사르코글리칸 단백질 수준을 측정함으로써 검출된다.

본 개시내용은 또한 뒤시엔느 근이영양증 또는 베커 근이영양증을 갖는 환자를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 56-5022의 용량의 용도를 제공하며, 여기서 의약의 투여는 환자의 질환 진행이 하기 중 임의의 것에 의해 측정된 바와 같이 지연되도록 초래한다: 6분 걷기 테스트, 일어나는 시간, 4 계단 오르기, 4 계단 오르고 내리기, 북극성 보행 평가 (NSAA), 10 미터 시한 테스트, 100 미터 시한 테스트, 휴대용 동력측정법 (HHD), 시한 일어서서 걷기, 및/또는 총 운동 서브테스트 척도 (베일리-III) 스코어.

예를 들어, 대상체는 rAAV 투여 전의 NSAA 스코어와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 NSAA 스코어의 적어도 6-포인트 개선을 갖는다. 추가로, 대상체는 rAAV 투여 전의 일어나는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 일어나는 시간의 적어도 약 0.8초 개선을 갖는다. 또한, 대상체는 조성물 또는 의약의 투여 전의 4 계단 테스트를 오르는 시간과 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 4 계단 테스트를 오르는 시간의 적어도 약 1.2초 개선을 갖는다. 또한, 대상체는 조성물 또는 의약의 투여 전의 100 m 시한 테스트와 비교하여 rAAV 투여 후 적어도 270일에 100 m 시한 테스트의 적어도 약 7초 개선을 갖는다.

도 1은 rAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물을 예시한다. 이 구축물에서, cDNA 발현 카세트는 AAV2 역전된 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된다. 구축물은 인프레임 rod 결실 (R4-R23)에 의해 특징화되는 반면, 힌지 1, 2 및 4 (H1, H2 및 H4) 및 시스테인 풍부 도메인은 138 kDa 단백질을 생성하는 상태로 남아있다. 마이크로-디스트로핀 단백질 (3579 bp)의 발현은 MHCK7 프로모터 (795 bp)에 의해 가이드된다. 인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVß (클론테크(Clontech))로부터 유래된다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 시작 바로 앞에 컨센서스 코작(Kozak) 및 mRNA 종결을 위한 작은 53 bp 합성 폴리A 신호를 가졌다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 문헌 [Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002))]에 이전에 기재된 바와 같이 (R4-R23/Δ71-78) 도메인을 함유하였다.
도 2는 핵산 서열 (서열식별번호: 3) rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 제공한다.
도 3은 pNLREP2-Caprh74 AAV 헬퍼 플라스미드 맵을 제공한다.
도 4는 Ad 헬퍼 플라스미드 pHELP를 제공한다.
도 5는 rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드 구축물을 예시한다.
도 6은 핵산 서열 (서열식별번호: 5) rAAVrh74.MCK.마이크로-디스트로핀을 제공한다.
도 7은 핵산 서열 (서열식별번호: 9) rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 제공한다.
도 8은 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 플라스미드 구축물을 예시한다.
도 9는 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 플라스미드 구축물의 핵산 서열 (서열식별번호: 8)을 제공한다.
도 10은 치료용 β-사르코글리칸 트랜스진 카세트의 개략도를 제공한다. 코돈-최적화된 인간 β-사르코글리칸 유전자 (hSGCB)를 함유하는 자기-상보적 AAV 벡터. 근육 특이적 MHCK7 프로모터는 발현을 구동한다. 카세트는 또한 프로세싱을 증대시키는 키메라 인트론 및 안정성을 위한 폴리아데닐화 신호를 함유한다.
도 11은 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 재투약 후 NHP에서의 AAVrh74에 대한 항체 역가의 그래프를 제공한다. 점선은 AAVrh.74에 대한 1:400의 역치인 총 AAVrh.74 항체 역가 수준에 대한 포함 기준을 나타낸다.
도 12는 TPE 후 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 재투약된 NHP에서의 TPE 전과 비교하여 TPE 후 마이크로-디스트로핀 단백질 발현에서의 배수 변화를 제공한다.
도 13은 TPE의 10일 과정에 걸쳐 혈장 부피 (PV) 제거 후 혈장 항체 과정을 제공한다.

본 개시내용은 rAAV.rh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 혈관내 전달 후 유전자 발현을 향상시키기 위한 용량, 지속기간 및 면역저해 레지멘을 식별하는 것; 기존 AAV 항체를 제거하기 위해 TPE를 사용하는 것과 함께 rAAV를 투약 또는 재투약한 후 기술을 식별하고 유전자 발현을 향상시키는 것; 및 TPE를 사용하지 않고 재투약을 평가하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV.rh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05의 임의의 투약 전에 면역저해 레지멘 및/또는 TPE를 투여하는 것을 포함하고; 방법은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV.rh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05의 재투약 전에 면역저해 레지멘 및/또는 TPE를 투여하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 인간 마이크로-디스트로핀을 과발현하는 유전자 요법 벡터, 예를 들어 rAAV 벡터, 및 근이영양증 환자에서 섬유증을 감소 및 예방하는 방법을 제공한다. DMD 진단 초기에 실시한 근육 생검은 두드러진 결합 조직 증식을 나타낸다. 근육 섬유증은 다중 면에서 해롭다. 이는 결합 조직 장벽을 통한 근내막 영양소의 정상적인 이동을 감소시키고, 혈류를 감소시키고, 근육에서 혈관-유래 영양 성분을 박탈하고, 사지 경축을 통한 조기 보행 손실에 기능적으로 기여한다. 시간이 지남에 따라, 근육의 현저한 섬유증으로 인해 치료 문제가 배가된다. 이는 연속적인 시점에서 결합 조직 증식을 비교하는 근육 생검에서 관찰될 수 있다. 상기 프로세스는 계속 악화되어 특히 휠체어-의존적 환자에서 보행 손실을 유발하고 통제 불능 상태가 가속화된다.

섬유증을 감소시키기 위한 평행 접근법을 포함하는 조기 치료 없이, 엑손 스키핑, 정지-코돈 리드-스루, 또는 유전자 대체 요법의 이점이 완전히 달성될 가능성이 거의 없다. 심지어 작은 분자 또는 단백질 대체 전략도 근육 섬유증을 감소시키기 위한 접근법 없이 실패할 가능성이 높다. AAV.마이크로-디스트로핀으로 치료된 기존 섬유증을 갖는 노화된 mdx 마우스의 이전 작업은 본 발명자들이 완전한 기능적 복원을 달성할 수 없음을 입증하였다 (Liu, M., et al., Mol Ther 11, 245-256 (2005)). 또한, DMD 심근병증의 진행은 심실벽의 반흔 및 섬유증을 동반하는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 관련 기술분야의 기술 내에서 바이러스학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (최신판)]; [DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.)]; [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 최신판)]; [Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 최신판)]; [Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 최신판)]; [CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijssen, ed.)]; [Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)]; [Freshney Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, Third Edition)]; 및 [Ausubel et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience, N.Y.)]을 참조한다.

상기 또는 하기에 관계없이 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "배양물"에 대한 언급은 하나 이상의 배양물 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다. "재조합 AAV"에 대한 언급은 2개 이상의 rAAV 비리온의 혼합물 등을 포함한다. 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 달리 명백하게 나타내지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 명시적으로 대안만을 언급하도록 나타내거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만, 본 개시내용은 대안만을 언급하는 정의 및 "및/또는"을 뒷받침한다.

본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 통계적 실험 오차 (오차의 표준 편차)를 포함하는 값을 나타내기 위해 사용된다.

용어 "벡터"는 임의의 유전적 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 의미하며, 이는 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제할 수 있고, 이는 세포 사이에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-연관 바이러스는 공동-감염 헬퍼 바이러스에 의해 특정 기능이 제공되는 세포에서만 성장하는 단일-가닥 DNA 파르보바이러스이다. 현재 특징화된 AAV의 13가지 혈청형이 있다. AAV의 일반적인 정보 및 검토는, 예를 들어, 문헌 [Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228], 및 [Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)]에서 찾을 수 있다. 그러나, 다양한 혈청형이 유전적 수준에서도 구조적으로 및 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 널리 공지되어 있기 때문에 이들 동일한 원리가 추가 AAV 혈청형에 적용가능할 것으로 완전히 예상된다. (예를 들어, 문헌 [Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.]; 및 [Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)] 참조). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 분명히 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 특성을 나타내고; 모두는 3개의 관련 캡시드 단백질, 예컨대 AAV2에서 발현되는 것들을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이의 광범위한 교차-혼성화를 나타내는 이종이중체 분석에 의해 추가로 시사되고; "역전된 말단 반복부 서열" (ITR)에 상응하는 말단에 유사한 자기-어닐링 세그먼트가 존재한다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있음을 시사한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 (또는 트랜스진)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물을 코딩하고 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. 한 실시양태에서, AAV 벡터는 제한 없이 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10 및 AAVrh.74를 포함하는 아데노-연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. AAV 벡터는 전체 또는 일부가 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있지만, 기능적 플랭킹 ITR 서열을 보유한다. 기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 구급, 복제 및 패키징에 필요하다. 그러므로, AAV 벡터는 바이러스의 복제 및 패키징 (예를 들어, 기능적 ITR)을 위해 적어도 시스에서 요구되는 서열을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구급, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.

용어 "AAV 헬퍼 기능"은 차례로 생산적인 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능하는 AAV 유전자 생성물을 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV-유래 코딩 서열을 지칭한다. 그러므로, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 (ORF), reps 및 cap을 포함한다. Rep 발현 생성물은 무엇보다도 DNA 복제의 AAV 기점의 인식, 결합 및 닉킹; DNA 헬리카제 활성; 및 AAV (또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사 조정을 포함하는 많은 기능을 보유하는 것으로 나타났다. Cap 발현 생성물은 필요한 패키징 기능을 공급한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터로부터 누락된 트랜스에서 AAV 기능을 보완하기 위해 본원에서 사용된다.

"재조합 바이러스"는 예를 들어 바이러스 입자로의 이종 핵산 서열의 부가 또는 삽입에 의해 유전적으로 변경된 바이러스를 의미한다.

"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 한 실시양태에서, AAV 비리온은 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 포유동물 세포에 전달될 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 트랜스진)를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 바이러스 입자의 생산은 AAV 벡터의 생산을 포함하며, 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되어 있기 때문이다.

포유동물 세포에 전달될 AAV 게놈, 예컨대 트랜스진은 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로 지칭된다. 그러므로, AAV 벡터 입자의 생산은 AAV 벡터의 생산을 반드시 포함하며, 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되어 있기 때문이다.

예를 들어, AAV 캡시드 단백질 코트와 회합된 선형의 단일-가닥 AAV 핵산 게놈을 포함하는 야생형 (wt) AAV 바이러스 입자. AAV 비리온은 단일-가닥 (ss) AAV 또는 자기-상보적 (SC) AAV일 수 있다. 한 실시양태에서, 상보적 센스, 예를 들어, "센스" 또는 "안티센스" 가닥의 단일-가닥 AAV 핵산 분자는 AAV 비리온으로 패키징될 수 있고, 두 가닥 모두는 동등하게 감염성이다.

용어 "재조합 AAV" 또는 "rAAV"는 본원에서 AAV ITR에 의해 양쪽 측면 상에서 플랭킹된 관심 이종 뉴클레오티드 서열을 캡시드화하는 AAV 단백질 쉘로 구성된 감염성 복제-결함 바이러스로서 정의된다. 한 실시양태에서, rAAV는 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능 및 그 안에 도입된 부속 기능을 갖는 적합한 숙주 세포에서 생산된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포는 후속 유전자 전달을 위해 AAV 벡터 (관심 재조합 뉴클레오티드 서열 함유)를 감염성 재조합 비리온 입자로 패키징하는데 필요한 AAV 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하고, 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되었을 때 세포는 "형질감염"된 것이다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456], [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York], [Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier], 및 [Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티, 예컨대 뉴클레오티드 통합 벡터 및 기타 핵산 분자를 적합한 숙주 세포에 도입하는데 사용될 수 있다.

용어 "형질도입"은 복제-결함 바이러스 벡터를 통해, 예컨대 재조합 AAV 비리온을 통해 생체내 또는 시험관내에서 수용자 세포로의 DNA 분자의 전달을 나타낸다.

용어 "숙주 세포"는 예를 들어 AAV 헬퍼 구축물, AAV 벡터 플라스미드, 부속 기능 벡터 또는 다른 운반 DNA의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 나타낸다. 상기 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 그러므로, 본원에서 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 단일 부모 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태학 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체에서 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다.

"근육 세포" 또는 "근육 조직"은 임의의 종류의 근육 (예를 들어, 골격근 및 평활근 (예를 들어 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직으로부터))으로부터 유래된 세포 또는 세포 그룹을 의미한다. 이러한 근육 세포, 예컨대 근모세포, 근세포, 근관, 심근세포 및 심근모세포는 분화 또는 미분화될 수 있다.

핵산 서열, 예컨대 코딩 서열 및 제어 서열에 관한 용어 "이종"은 정상적으로 함께 연결되지 않고/거나 정상적으로 특정한 세포와 연관되지 않는 서열을 나타낸다. 그러므로, 핵산 구축물 또는 벡터의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 관련하여 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 이에 부착된 핵산의 세그먼트이다. 예를 들어, 핵산 구축물의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과 관련하여 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구축물 (예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포에 정상적으로 존재하지 않는 구축물로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종으로 간주될 것이다. 대립형질 변이 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에서 사용된 바와 같이 이종 DNA를 발생시키지 않는다.

"코딩 서열" 또는 특정한 단백질을 "코딩"하는 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 있을 때 시험관내 또는 생체내에서 전사 (DNA의 경우)되고 폴리펩티드로 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 시작 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 전사 종결 서열은 대개 코딩 서열의 3'에 위치될 것이다.

"핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 핵산은 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, -우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 DNA 및 RNA의 염기 유사체를 포함한다.

용어 DNA "제어 서열"은 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위 ("IRES"), 인핸서 등을 집합적으로 지칭하며, 이는 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한 이들 제어 서열 모두가 항상 존재할 필요는 없다.

용어 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 본원에서 사용되며, 여기서 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 하류 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터" (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물질, 보조인자, 조절성 단백질 등에 의해 유도되는 경우), "억압성 프로모터" (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물질, 보조인자, 조절성 단백질 등에 의해 유도되는 경우), 및 "구성적 프로모터"를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 프로모터는 근육-특이적 프로모터이며, 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 데스민 프로모터, 골격 알파-액틴 (ASKA) 프로모터, 트로포닌 I (TNNI2) 프로모터, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 mef 결합 요소, 근육 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터, 말단절단된 MCK (tMCK) 프로모터, 미오신 중쇄 (MHC) 프로모터, 하이브리드 a-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터 (MHCK7) 프로모터, C5-12 프로모터, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 고속-연축 트로포닌 c 유전자 요소, 저속-연축 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 저속-연축 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증- 유도성 핵 인자 (HIF)-반응 요소 (HRE), 스테로이드-유도성 요소, 및 글루코코르티코이드 반응 요소 (gre)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 MCK 프로모터, tMCK 프로모터, 또는 MHCK7 프로모터이다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기술된 구성성분이 일반적인 기능을 수행하도록 구성된 요소의 배열을 지칭한다. 그러므로, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 그러므로, 예를 들어, 번역되지는 않았지만 전사된 개재 서열은 프로모터 서열 및 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

프로모터는 RNA 폴리머라제가 프로모터 서열에 결합하고 코딩 서열을 mRNA로 전사한 후, 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드로 번역될 때 세포에서 코딩 서열의 "전사를 지시한다".

"발현 카세트" 또는 "발현 구축물"은 관심 서열(들) 또는 유전자(들)의 발현을 지시할 수 있는 어셈블리를 지칭한다. 발현 카세트는 관심 서열(들) 또는 유전자(들)에 작동가능하게 연결된 (이의 전사를 지시하기 위해) 프로모터와 같은 상기 기재된 바와 같은 제어 요소를 포함하고, 종종 폴리아데닐화 서열을 또한 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태 내에서, 본원에 기재된 발현 카세트는 플라스미드 구축물 내에 함유될 수 있다. 발현 카세트의 구성성분에 더하여, 플라스미드 구축물은 또한 하나 이상의 선택가능한 마커, 플라스미드 구축물이 단일-가닥 DNA로서 존재하도록 허용하는 신호, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위, 및 "포유동물" 복제 기점 (예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스 복제 기점)을 포함할 수 있다.

뉴클레오티드 서열을 언급할 때 "단리된"은 표시된 분자가 다른 생물학적 거대분자, 예컨대 다른 뉴클레오티드 서열, 염색질 물질 등의 실질적인 부재 하에 존재함을 의미한다. 그러므로, "특정한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자"는 대상 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭하지만; 분자는 조성물의 기본 특징에 해로운 영향을 미치지 않는 일부 추가 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐 특정한 핵산 분자에서 뉴클레오티드 서열의 상대적 위치를 기술하기 위해, 예컨대 특정한 뉴클레오티드 서열이 또 다른 서열에 대해 "상류", "하류", "3" 또는 "5"에 위치하는 것으로 기술되는 경우, 관련 기술분야에서 통상적인 것으로 지칭되는 DNA 분자의 "센스" 또는 "코딩" 가닥 내의 서열의 위치인 것으로 이해되어야 한다.

핵산 또는 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 최대 일치를 위해 정렬될 때 동일한 두 서열의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장에 걸쳐 있을 수 있거나, 또는 적어도 약 500 내지 5000개 뉴클레오티드의 단편이 바람직하다. 그러나, 더 작은 단편들 사이의 동일성, 예를 들어 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 20 내지 24개의 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32개의 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오티드가 또한 바람직할 수 있다. 서열의 백분율 동일성은 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동체는 서열 정보를 정렬하고 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 ALIGN, ClustalW2 및 BLAST를 사용함으로써 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보의 직접 비교에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, BLAST가 정렬 도구로서 사용되는 경우, 하기 디폴트 파라미터: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50 서열; 분류 기준=높은 스코어; 데이터베이스=중복되지 않음, 진뱅크+EMBL+DDBJ+PDB+진뱅크 CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR.

용어 "대상체"는 제한 없이, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니피그를 포함하는 실험 동물 등을 포함하는 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 출생 내지 2세, 1 내지 10세, 또는 4 내지 15세의 범위, 또는 10 내지 19세의 범위, 또는 20 내지 40세, 또는 15 내지 29세 또는 25-55세, 또는 40 내지 60세의 범위, 또는 50세 이상 또는 60세 이상 또는 65세 이상 또는 70세 이상의 연령 범위의 인간이다.

AAV

아데노-연관 바이러스 (AAV)는 복제-결핍 파르보바이러스이며, 이의 단일-가닥 DNA 게놈은 145개의 뉴클레오티드 역전된 말단 반복부 (ITR)를 포함하여 약 4.7 kb 길이이다. AAV의 다중 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 혈청형 2 (AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌 [Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994)]에 의해 수정된 바와 같이 문헌 [Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983)]에 제시되어 있다. 다른 예로서, AAV-1의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_002077에서 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_1829에서 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_001829에서 제공되고; AAV-5 게놈은 진뱅크 수탁 번호 AF085716에서 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_00 1862에서 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 진뱅크 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에서 제공되고 (또한 AAV-8에 관한 미국 특허 번호 7,282,199 및 7,790,449 참조); AAV-9 게놈은 문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에서 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌 [Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에서 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌 [Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에서 제공된다. AAVrh.74 혈청형의 클로닝은 문헌 [Rodino-Klapac., et al. Journal of translational medicine 5, 45 (2007)]에 기재되어 있다. 바이러스 DNA 복제 (rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 Cis-작용 서열은 ITR 내에 함유되어 있다. 3개의 AAV 프로모터 (상대적 맵 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론 (예를 들어, AAV2 뉴클레오티드 2107 및 2227에서)의 차등 스플라이싱과 커플링된 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)는 rep 유전자로부터의 4개의 rep 단백질 (rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생산을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제를 담당하는 다중 효소적 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 대안적인 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 시작 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치된다. AAV의 생활 주기 및 유전학은 문헌 [Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에서 검토된다.

AAV는 예를 들어 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적으로 만드는 독특한 특색을 보유한다. 배양에서 세포의 AAV 감염은 비세포변성이며, 인간 및 다른 동물의 천연 감염은 조용하고 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체내에서 많은 상이한 조직을 표적화할 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 천천히 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 본질적으로 전사적으로 활성인 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서 이들 세포의 수명 동안 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 재조합 게놈의 구축을 실현가능하게 만드는 플라스미드의 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 또한, AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되어 있기 때문에, 게놈의 내부 대략 4.3 kb (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 코딩함)의 일부 또는 전부가 프로모터, 관심 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트와 같은 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 유의한 특색은 극히 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 불활성화시키는데 사용되는 조건 (몇 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 용이하게 견디므로, AAV의 저온 보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 최종적으로, AAV-감염된 세포는 중복감염에 내성이 없다.

다중 연구는 근육에서 장기간 (> 1.5년) 재조합 AAV-매개 단백질 발현을 입증하였다. 문헌 [Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997)]; [Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996)]; 및 [Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996)]을 참조한다. 또한, 문헌 [Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000)] 및 [Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001)]을 참조한다. 더욱이, 근육은 고도로 혈관화되어 있기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 문헌 [Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997)] 및 [Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997)]에 기재된 바와 같이 근육내 주사 후 전신 순환에서 트랜스진 생성물의 출현을 초래하였다. 더욱이, 문헌 [Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)]은 골격 근섬유가 올바른 항체 글리코실화, 폴딩 및 분비에 필요한 세포 인자를 보유하고 있음을 입증하였으며, 이는 근육이 분비된 단백질 치료제를 안정적으로 발현할 수 있음을 나타낸다.

본 개시내용의 재조합 AAV 게놈은 본 개시내용의 핵산 분자 및 핵산 분자를 플랭킹하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈 내의 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAVrh.74, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAVrh.74를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 슈도타입 rAAV의 생산은, 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어, 문헌 [Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]을 참조한다. 상기 배경 섹션에서 언급한 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 근육-특이적 발현을 촉진하기 위해, AAVrh.74가 사용될 수 있다.

본 개시내용의 DNA 플라스미드는 본 개시내용의 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈의 감염성 바이러스 입자로의 어셈블리를 위해 AAV의 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, E1-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로 감염이 허용되는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 관련 기술분야에서 표준이다. rAAV의 생산은 하기 구성성분가 단일 세포 (패키징 세포로서 본원에 표시됨) 내에 존재할 것을 요구한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 (즉, 그 안에 있지 않은) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하나 이에 제한되지는 않는 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 슈도타입 rAAV의 생산은, 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 생산에 필요한 모든 구성성분을 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자가 결여된 rAAV 게놈을 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 절차, 예컨대 GC 테일링 (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가 (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적인 평활-말단 라이게이션 (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)에 의해 박테리아 플라스미드에 도입되었다. 그 후, 패키징 세포주는 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스로 감염된다. 이 방법의 장점은 세포가 선택가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포에 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 사용한다.

rAAV 생산의 일반적인 원리는, 예를 들어, 문헌 [Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539]; 및 [Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)]에서 검토된다. 다양한 접근법은 문헌 [Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984)]; [Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)]; [Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985)]; [McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988)]; 및 [Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)]; [Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)]; 미국 특허 번호 5,173,414; WO 95/13365 및 대응 미국 특허 번호 5,658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; [Perrin et al. Vaccine 13:1244-1250 (1995)]; [Paul et al. Human Gene Therapy 4:609-615 (1993)]; [Clark et al. Gene Therapy 3:1124-1132 (1996)]; 미국 특허 번호 5,786,211; 미국 특허 번호 5,871,982; 및 미국 특허 번호 6,258,595에 기재되어 있다. 전술한 문서는 rAAV 생산과 관련된 문서의 해당 섹션을 특히 강조하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

그러므로 본 개시내용은 감염성 rAAV를 생산하는 패키징 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 패키징 세포는 안정적으로 형질전환된 암 세포, 예컨대 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포 (동족 293 계통)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 패키징 세포는 형질전환된 암 세포가 아닌 세포, 예컨대 낮은 계대 293 세포 (아데노바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포 (인간 태아 섬유모세포), WI-38 세포 (인간 태아 섬유모세포), Vero 세포 (원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포 (레서스 태아 폐 세포)이다.

본 개시내용의 재조합 AAV (즉, 감염성 캡시드화된 rAAV 입자)는 rAAV 게놈을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, rAAV 둘 다의 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 결여되어 있으며, 즉 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 본 개시내용의 핵산 분자를 포함하도록 구축될 수 있는 rAAV의 예는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352)에 제시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 AAV 벡터는 AAV 벡터 플라스미드 rAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀, pNLRep2-Caprh74 및 pHelp를 사용하여 삼중 형질감염 방법 (Xiao et al., J Virol 72, 2224-2232 (1998)에 의해 생산되며, rAAV는 AAV2 역전된 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 마이크로-디스트로핀 유전자 발현 카세트를 함유한다. AAVrh.74 비리온으로 캡시드화되는 것은 이 서열이다. 플라스미드는 마이크로-디스트로핀 서열 및 유전자 발현을 구동하기 위한 근육 특이적 프로모터의 MHCK7 인핸서 및 코어 프로모터 요소를 함유한다. 발현 카세트는 또한 높은-수준의 유전자 발현을 촉진하기 위한 SV40 인트론 (SD/SA)을 함유하고, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호는 효율적인 전사 종결을 위해 사용된다.

pNLREP2-Caprh74는 혈청형 rh74로부터의 4개의 야생형 AAV2 rep 단백질 및 3개의 야생형 AAV VP 캡시드 단백질을 코딩하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pNLREP2-Caprh74 플라스미드의 개략적 맵은 도 3에 표시되어 있다.

pHELP 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 11,635 bp이고, 어플라이드 비로믹스(Applied Viromics)로부터 수득하였다. 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈 영역, 즉 E2A, E4ORF6 및 VA RNA (아데노바이러스 E1 기능은 293 세포에 의해 제공됨)를 함유한다. 이 플라스미드에 존재하는 아데노바이러스 서열은 아데노바이러스 게놈의 ~40%만을 나타내며, 복제에 중요한 시스 요소, 예컨대 아데노바이러스 말단 반복부를 함유하지 않는다. 따라서, 이러한 생산 시스템으로부터 생성되는 감염성 아데노바이러스는 없을 것으로 예상된다. pHELP 플라스미드의 개략적 맵은 도 4에 표시되어 있다.

rAAV는 관련 기술분야의 표준 방법에 의해, 예컨대 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999)]; [Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002)]; 미국 특허 번호 6,566,118 및 WO 98/09657에 개시된 방법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다. 본 개시내용의 조성물은 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 또한 다른 성분, 예컨대 희석제 및 아주반트를 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 희석제 및 아주반트는 수용자에게 무독성이고, 바람직하게는 사용되는 투여량 및 농도에서 불활성이며, 완충제 및 계면활성제, 예컨대 플루로닉을 포함한다.

본 개시내용의 방법에서 투여되는 rAAV의 역가는 예를 들어 특정한 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체 및 표적화되는 세포 유형(들)에 따라 달라질 것이며, 관련 기술분야의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 ml당 약 1x10⁶, 약 1x10⁷, 약 1x10⁸, 약 1x10⁹, 약 1x10¹⁰, 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³ 내지 약 1x10¹⁴ 또는 그 이상의 DNase 내성 입자 (DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈 (vg) 단위로 표현될 수 있다. 캡시드화된 벡터 게놈 역가를 결정하는 한 가지 예시적인 방법은 정량적 PCR, 예컨대 문헌 (Pozsgai et al., Mol. Ther. 25(4): 855-869, 2017)에 기재된 방법을 사용한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 투여량은 슈퍼코일 DNA 표준에 의해 결정된 바와 같은 용량에 상응한다.

생체내 또는 시험관내에서 rAAV로 표적 세포를 형질도입하는 방법이 본 개시내용에 의해 고려된다. 생체내 방법은 본 개시내용의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효 용량 또는 유효 다중 용량을 이를 필요로 하는 동물 (인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 장애/질환의 발병 전에 용량을 투여하는 경우, 투여는 예방적이다. 장애/질환의 발병 후에 용량을 투여하는 경우, 투여는 치료적이다. 본 개시내용의 실시양태에서, 유효 용량은 치료될 장애/질환 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 경감 (제거 또는 감소)시키고/거나, 장애/질환 상태로의 진행을 늦추거나 방지하고/거나, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 방지하고/거나, 질환의 정도를 감쇠시키고/거나, 질환의 관해 (부분 또는 전체)를 초래하고/거나, 생존을 연장하는 용량이다. 본 개시내용의 방법으로 예방 또는 치료하기 위해 고려되는 질환의 예는 DMD이다.

조합 요법이 또한 본 개시내용에 의해 고려된다. 본원에서 사용된 바와 같은 조합은 동시 치료 및 순차적 치료 둘 다를 포함한다. 본 개시내용의 방법과 표준 의학적 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드)의 조합이 구체적으로 고려되며, 신규 요법과의 조합이 그러하다.

조성물, 조합 요법 또는 의약의 유효 용량의 투여는 근육내, 비경구, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구내, 직장 또는 질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야의 표준 경로에 의한 것일 수 있다. 본 개시내용의 rAAV의 AAV 구성성분 (특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료될 감염 및/또는 질환 상태 및 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현할 표적 세포/조직(들)을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택 및/또는 매칭될 수 있다.

본 개시내용은 본 개시내용의 rAAV, 의약 및 조성물의 유효 용량의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 전신이 영향을 받도록 순환계로의 투여이다. 전신 투여는 장 투여, 예컨대 위장관을 통한 흡수 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다.

특히, 본 개시내용의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 성취될 수 있다. 본 개시내용에 따른 투여는 근육으로의 주사 및 혈류로의 주사를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. rAAV를 포스페이트 완충 염수에 단순히 재현탁시키는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 입증되었으며, rAAV와 공동-투여될 수 있는 담체 또는 다른 구성성분에 대한 공지된 제한은 없다 (DNA를 분해하는 조성물은 rAAV와 함께 정상적인 방식으로 회피되어야 하지만). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 특정한 관심 표적 조직, 예컨대 근육으로 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703을 참조하며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 제약 조성물은 경피 수송에 의해 근육에 전달되는 주사가능한 제형 또는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 다를 위한 수많은 제형이 이전에 개발되었고, 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급의 용이성을 위해 임의의 제약상 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다.

본 개시내용의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀은 20 mM Tris (pH 8.0), 1mM 염화마그네슘 (MgCl₂), 200 mM 염화나트륨 (NaCl) 및 0.001% 폴록사머 188을 함유하는 완충액에서 제형화된다.

본원에 개시된 방법에서 투여되는 rAAV의 용량은 예를 들어 특정한 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체 및 표적화되는 세포 유형(들)에 따라 달라질 것이며, 관련 기술분야의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 각각의 투여되는 rAAV의 역가는 ml당 약 1x10⁶, 약 1x10⁷, 약 1x10⁸, 약 1x10⁹, 약 1x10¹⁰, 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³, 약 1x10¹⁴, 약 2x10¹⁴, 또는 약 1x10¹⁵ 또는 그 이상의 DNase 내성 입자 (DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈 (vg) 단위로 표현될 수 있다 (즉, 각각 1x10⁷ vg, 1x10⁸ vg, 1x10⁹ vg, 1x10¹⁰ vg, 1x10¹¹ vg, 1x10¹² vg, 1x10¹³ vg, 1x10¹⁴ vg, 2x10¹⁴vg, 1x10¹⁵vg). 투여량은 또한 체중 킬로그램 (kg)당 바이러스 게놈 (vg) 단위로 표현될 수 있다 (즉, 각각 1x10¹⁰ vg/kg, 1x10¹¹ vg/kg, 1x10¹² vg/kg, 1x10¹³ vg/kg, 1x10¹⁴ vg/kg, 1.25x10¹⁴ vg/kg, 1.5x10¹⁴ vg/kg, 1.75x10¹⁴ vg/kg, 2.0x10¹⁴ vg/kg, 2.25x10¹⁴ vg/kg, 2.5x10¹⁴ vg/kg, 2.75x10¹⁴ vg/kg, 3.0x10¹⁴ vg/kg, 3.25x10¹⁴ vg/kg, 3.5x10¹⁴ vg/kg, 3.75x10¹⁴ vg/kg, 4.0x10¹⁴ vg/kg, 1x10¹⁵vg/kg). AAV를 적정하는 방법은 문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999)]에 기재되어 있다.

근육내 주사의 목적을 위해, 아주반트, 예컨대 참기름 또는 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜 중 용액은 또한 멸균 수용액으로서 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 원한다면 완충될 수 있으며, 액체 희석제는 먼저 염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 유리산 (DNA는 산성 포스페이트 기를 함유함) 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 rAAV의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용되는 멸균 수성 매질은 모두 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 기술에 의해 쉽게 수득가능하다.

주사가능한 용도에 적합한 제약 담체, 희석제 또는 부형제는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균이어야 하고, 쉽게 주사가능할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정적이어야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 일어날 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 rAAV를 혼입한 후 필터 멸균화에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균화된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

rAAV를 사용한 형질도입은 또한 시험관내에서 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 원하는 표적 근육 세포는 대상체로부터 제거되고, rAAV로 형질도입되고, 대상체에 재도입된다. 대안적으로, 동계 또는 이종 근육 세포는 상기 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우에 사용될 수 있다.

형질도입된 세포를 대상체에 형질도입 및 재도입하기 위한 적합한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 세포는 예를 들어 적절한 배지에서 rAAV를 근육 세포와 조합하고, 통상적인 기술, 예컨대 서던 블롯 및/또는 PCR을 사용하거나 선택가능한 마커를 사용함으로써 관심 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝함으로써 시험관내에서 형질도입될 수 있다. 그 후, 형질도입된 세포는 제약 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은 다양한 기술에 의해, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해, 또는 예를 들어 카테터를 사용하여 평활근 및 심근에 주사함으로써 대상체에 도입될 수 있다.

본 개시내용의 rAAV를 사용한 세포의 형질도입은 마이크로-디스트로핀 단백질의 지속적인 발현을 초래한다. 그러므로, 본 개시내용은 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV를 동물, 바람직하게는 인간에게 투여/전달하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 rAAV를 조직 (조직, 예컨대 근육, 기관, 예컨대 간 및 뇌, 및 분비선, 예컨대 침샘을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 형질도입하는 것을 포함한다. 형질도입은 조직 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 한 실시양태는 액틴 및 미오신 유전자 패밀리, 예컨대 myoD 유전자 패밀리로부터 유래된 것들 (문헌 [Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)] 참조), 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2 (Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)), 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 제어 요소 (Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)), 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나제 서열 요소 (문헌 [Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] 참조) 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 (mCK) 요소, 골격 고속-연축 트로포닌 C 유전자, 저속-연축 심장 트로포닌 C 유전자 및 저속-연축 트로포닌 I 유전자로부터 유래된 제어 요소: 저산소증-유도성 핵 인자 (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), 스테로이드-유도성 요소 및 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)를 포함하는 프로모터 (문헌 [Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)] 참조), 및 다른 제어 요소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 근육 특이적 제어 요소에 의해 지시되는 근육 세포 및 근육 조직을 형질도입하는 방법을 제공한다.

근육 조직은 필수 기관이 아니고 접근하기 쉽기 때문에 생체내 DNA 전달을 위한 매력적인 표적이다. 본 개시내용은 형질도입된 근섬유로부터의 마이크로디스트로핀의 지속적인 발현을 고려한다.

그러므로, 본 개시내용은 마이크로-디스트로핀을 코딩하는 rAAV의 유효 용량 (또는 본질적으로 동시에 투여되는 용량 또는 간격을 두고 제공되는 용량)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다.

면역저해 레지멘

본 개시내용은 근이영양증을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 면역저해 레지멘을 받고 있다. 용어 면역저해 레지멘은 대상체의 면역계를 저해 또는 조정하는 치료 방법을 지칭한다. 레지멘은 하나 이상의 면역 저해제의 투여를 포함한다. 임의의 방법에서, 면역저해 레지멘은 적어도 하나의 면역 저해제, 또는 적어도 2개의 면역 저해제 또는 적어도 3개의 면역 저해제 또는 적어도 4개의 면역 저해제 또는 적어도 5개의 저해제를 포함한다.

면역저해 레지멘은 유전자 요법의 투여 전에, 또는 유전자 요법의 투여 후에 대상체에서 rAAV에 대한 면역 반응의 개시 전에 면역저해 레지멘이 투여된다는 점에서 예방적으로 투여된다. 면역 반응은 투여된 rAAV에 대한 유해 면역 반응 또는 염증 반응을 포함한다. 면역 반응은 투여된 rAAV, 예컨대 항-AAVrh.74 항체에 대한 반응으로 대상체에서 항체의 생산일 수 있다.

예방적 투여는 유전자 요법의 투여와 동시에, 예컨대 유전자 요법의 투여 24시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 12시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 6시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 5시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 4시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 3시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 2시간 이내에, 또는 유전자 요법의 투여 1시간 이내에 면역저해 레지멘의 투여를 포함한다. 면역 저해제는 대상체의 면역계를 억제하거나, 대상체의 면역계의 유효성을 감소시키거나, 대상체의 면역계의 활성 또는 유효성을 조정하는 임의의 작용제이다.

다른 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 치료적으로 투여된다. 예를 들어, 면역저해 레지멘은 유전자 요법의 투여 후에 대상체에서 rAAV에 대한 면역 반응의 개시 후에 투여된다. 대상체에서의 면역 반응은 rAAV를 대상체에게 투여한 후 또는 그에 의해 야기된 유해 면역 반응 또는 염증 반응을 포함한다. 면역 반응은 투여된 rAAV, 예컨대 항-AAVrh.74 항체에 대한 반응으로 대상체에서 항체의 생산일 수 있다.

다른 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 유전자 요법의 제2 용량의 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 용량은 치료적 혈장 교환 (TPE) 후에 투여된다.

예시적인 면역 저해제는 글루코코르티코스테로이드, 야누스 키나제 억제제, 칼시뉴린 억제제, mTOR 억제제, 세포정지제, 예컨대 퓨린 유사체, 메토트렉세이트 및 시클로포스파미드, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제 (IMDH) 억제제 및 생물제제, 예컨대 모노클로날 항체 또는 융합 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다.

면역 저해제는 염증을 감소시키고 대상체의 면역계를 저해 또는 조정하는 스테로이드인 항염증성 스테로이드일 수 있다. 예시적인 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 데플라자코트, 부데소니드 또는 프레드니손이다.

야누스 키나제 억제제는 하나 이상의 야누스 키나제 패밀리 효소를 표적화함으로써 JAK/STAT 신호전달 경로의 억제제이다. 예시적인 야누스 키나제 억제제는 토파시티닙, 바리시티닙, 우파다시티닙, 페피시티닙 및 오클라시티닙을 포함한다.

칼시뉴린 억제제는 시클로필린에 결합하여 칼시뉴린의 활성을 억제한다. 예시적인 칼시뉴린 억제제는 시클로스포린, 타크롤리무스 및 피메크롤리무스를 포함한다.

mTOR 억제제는 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나제 mTOR를 감소 또는 억제한다. 예시적인 mTOR 억제제는 시롤리무스, 에베롤리무스 및 템시롤리무스를 포함한다.

면역 저해제는 면역 저해 마크롤라이드를 포함한다. 용어 "면역 저해 마크롤라이드"는 대상체의 면역계를 저해 또는 조정하는 마크롤라이드 작용제를 지칭한다. 마크롤라이드는 하나 이상의 데옥시 당, 예컨대 클라디노스 또는 데소아민이 부착된 큰 마크로시클릭 락톤 고리를 포함하는 작용제 부류이다. 락톤 고리는 대개 14-, 15- 또는 16-원이다. 마크롤라이드는 폴리케티드 작용제 부류에 속하며 천연 생성물일 수 있다. 면역저해성 마크롤라이드의 예에는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 및 시롤리무스가 포함된다.

퓨린 유사체는 뉴클레오티드 합성을 차단하고 IMDH 억제제를 포함한다. 예시적인 퓨린 유사체는 아자티오프린, 미코페놀레이트 및 레푸노미드를 포함한다.

예시적인 면역저해 생물제제는 아바타셉트, 아달리무맙, 아나킨라, 세르톨리주맙, 에타너셉트, 골리무맙, 인플릭시맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 리툭시맙, 세쿠키누맙, 토실리주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 바실릭시맙, 벨라타셉트 및 다클리주맙을 포함한다.

특히, 면역 저해제는 항-CD20 항체이다. 용어 항-CD20 특이적 항체는 CD20에 특이적으로 결합하거나 CD20의 발현 또는 활성을 억제 또는 감소시키는 항체를 지칭한다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙을 포함한다.

면역 저해 항체의 추가 예는 항-CD25 항체 (또는 항-IL2 항체 또는 항-TAC 항체), 예컨대 바실릭시맙 및 다클리주맙, 및 항-CD3 항체, 예컨대 무로모나브-CD3, 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙, 항-CD52 항체, 예컨대 알렘투주맙을 포함한다.

본 발명의 실시양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 방법에서 이용되는 면역 저해제 (면역 저해 항체)는 나노입자로서 투여될 수 있다. 나노입자의 제조 및/또는 제형화 방법, 및 본 개시내용의 방법에서 이용될 수 있는 나노입자는, 예를 들어, 중합체로서 (Patil et al., Pharmaceutical Nanotechnol. 367:195-203, 2009; Yang et al., ACS Appl. Mater. Interfaces, doi: 10.1021/acsami.6b16556, 2017; Perepelyuk et al., Mol. Ther. Nucleic Acids 6:259-268, 2017); 리포좀으로서 (Buyens et al., J. Control Release 158(3): 362-370, 2012; Scarabel et al., Expert Opin. Drug Deliv. 17:1-14, 2017); 미셀로서 (Tangsangasaksri et al., Bio Macromolecules 17:246-255, 2016; Wu et al., Nanotechnology, doi: 10.1088/1361-6528/aa6519, 2017); 마이크로에멀젼으로서 (WO 11/004395), 나노에멀젼 또는 고체 지질 나노입자로서 (문헌 [Sahay et al., Nature Biotechnol. 31:653-658, 2013]; 및 [Lin et al., Nanomedicine 9(1):105-120, 2014])에 기재된 것들; 및 WO 2008/066965, WO 2011/143201, WO2008 /014478, WO 2020/081938, WO 2013/016058, WO 2013/086373, WO 2019/177550, WO 2013/016126, WO 2019//089828, WO 99/39741, WO 2017/1 17528, WO 2017/004143, WO 2017/075531, WO 2015/199952, WO 2014/008334, WO 2013/086373, WO 2013/086322, WO 2013/016058, WO 2013/086373, WO 2011/141705 및 WO 2001/07548; 미국 특허 공개 번호 2004/0142025, 2007/0042031, 2016/0199485, 2016/0009637, 2015/0273068, 2015/0265708, 2015/0203446, 2015/0005363, 2014/0308304, 2014/0200257, 2013/086373, 2013/0338210, 2013/0323269, 2013/0245107, 2013/0195920, 2013/0123338, 2013/0022649, 2013/0017223, 2012/0295832,2012/0183581, 2012/017241 1, 2012/0027803, 2012/0058188, 201 1/031 1583, 201 1/031 1582, 201 1/0262527, 201 1/0216622, 201 1/01 17125, 201 1/0091525,201 1/0076335, 201 1/0060032, 2010/0130588, 2007/0042031, 2006/0240093, 2006/0083780, 2006/0008910, 2005/0175682, 2005/017054, 2005/01 18253, 2005/0064595, 2004/0142025, 2007/0042031, 1999/009076, 및 미국 특허 번호 8,569,256, 5,965,542에 기재된 것들을 포함하며; 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

치료적 혈장 교환

치료적 혈장 교환 (TPE)은 고분자량 물질, 예컨대 항체를 제거하도록 설계된 체외 혈액 정제 기술이다. rAAV 용량의 초기 전신 투여 후, 대상체는 AAV 혈청형에 대한 항체를 발생시킬 수 있으며, 예를 들어 대상체는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 투여 후에 AAVrh74에 대한 항체를 발생시킨다. TPE를 사용하여 이들 항체를 제거하는 것은 rAAV 벡터의 안전하고 효능있는 재투약을 허용한다. TPE 프로세스에서, 혈관 액세스를 통해 전혈을 제거하고, 후속적으로 혈장 (항체)이 제거되는 분리반출술 기계 내의 원심분리기를 통해 회전시킨다. 대상체를 위한 유지 유체에 대한 대체 유체 (인간 알부민)와 함께 적혈구를 다시 전달한다.

TPE 세션에서 교환될 혈장의 양은 대상체의 추정 혈장 부피 (EPV)와 관련하여 결정된다. EPV를 계산하기 위해 다수의 공식이 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Inkley et al., J. Lab Clin. Med. 45:841-850, 1955], [Retzlaff et al., Blood 33: 649-887, 1969], [Feldschuh et al., Circulation 56: 605-612, 1977], [Spenger et al., Predication of patient's plasma volume in plasma exchange therapy. In: Smeby et al. ed. Immune and Metabolic Aspects of Therapeutic Blood Purification Systems. Basel, Switzerland: Krager. 1986, pp. 394-402] 참조). EPV를 추정하는 예시적인 방법은 문헌 [Kaplan et al. Kidney Intl. 38:160-166, 1990]에 기재된 하기 공식에 따라 대상체의 체중 및 헤마토크리트를 사용하여 계산되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다:

EPV = [0.065 x 체중 (kg)] x [1-헤모크리트]

실시예 5에 기재된 프로토콜은 IgG 항체의 동역학에 기반하여 개발되었으며, 이는 48시간 후에 반동이 존재하여 이전 절차로부터 제거된 항체의 대략 50-60%를 되찾았다는 것을 보여준다. 본원에 기재된 방법의 목적을 위해, 한 실시양태에서, 유전자 전달을 허용하기 위해 항체 역가가 AAVrh.74 항체 수준 <1:100으로 감소되어야 한다는 것이 결정되었다.

예를 들어, 대상체의 혈장을 TPE에 적용하는 방법은 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 50%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 55%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 60%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 63%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 64%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 65%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 69%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 70%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 74%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 75%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 85%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 90%를 제거하거나, 또는 대상체의 혈관내 공간 내의 항-rAAV 항체의 적어도 약 95%를 제거한다.

개시된 방법은 대상체의 혈장을 적어도 하나의 TPE 세션, 또는 적어도 2개의 TPE 세션, 또는 적어도 3개의 TPE 세션, 또는 적어도 5개의 TPE 세션, 또는 적어도 6개의 TPE 세션, 또는 적어도 7개의 TPE 세션, 또는 적어도 8개의 TPE 세션, 또는 적어도 9개의 TPE 세션 또는 적어도 10개의 TPE 세션에 적용하는 것을 포함한다. 또한, TPE 세션은 약 1 내지 5일, 또는 약 1 내지 10일, 또는 약 5 내지 10일, 또는 약 5 내지 7일, 또는 약 7 내지 10일에 걸쳐 1일 1회 수행된다. TPE 세션은 연속 2일 동안 1일 1회, 또는 연속 3일 동안 1일 1회, 또는 연속 4일 동안 연속 5일 동안 1일 1회, 또는 연속 6일 동안 1일 1회, 또는 연속 7일 동안 1일 1회, 또는 연속 7일 동안 1일 1회, 또는 연속 8일 동안 1일 1회, 또는 연속 9일 동안 1일 1회, 또는 연속 10일 동안 1일 1회 수행된다.

TPE는 문헌 [Gurland et al., Nephron 36:173-182, 1984]에 기재된 바와 같은 고투과성 필터 및 투석 장비를 사용하는 막 혈장 분리 (MPS)를 사용하여 문헌 [Gurland et al., Int. J. Artif Organs 7:35-38, 1984]에 기재된 바와 같은 선택적 세포 제거 (세포분리반출술)를 사용하는 혈액 은행 절차를 사용하여 수행되는 기술로 수행된다. TPE를 수행하는 추가 방법은 문헌 [Sowada et al. (Available removal systems: state of the art. In Nydegger UE, editor. Therapeuitc Hemapheresis in the 1990s. Current Studies in Hematology and Blood Transfusions, Vol 57. Basal Switzerland: Karger. 1990 pp. 57-113)]에 기재되어 있다. 이들 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 실시양태는 (rAAV) rh74MHCK7.마이크로디스트로핀을 포함하는 (rAAV) rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 유전자 요법을 사용한 대상체의 치료 및 면역저해 레지멘, TPE 또는 둘 다를 사용한 대상체의 추가 치료와 함께 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재의 결정을 포함한다. 인간 환자를 포함하는 대상체의 혈청 또는 혈장은 기존 항-AAVrh.74 항체를 함유할 수 있고, 따라서 임의의 유전자 요법 치료를 받기 전에 AAVrh.74에 대해 혈청양성으로서 식별가능함이 인식된다. 인간 환자를 포함하는 대상체는 AAV-기반 유전자 요법을 받음으로 인해 혈청양성이 될 수 있음이 추가로 인식된다. 따라서, 결정은 이러한 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재 및 수준을 모니터링하는데 사용될 수 있으며, 면역저해 레지멘, TPE, 또는 둘 다가 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀을 포함하는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀을 사용한 치료 전에 이러한 대상체에게 투여되어야 하는지 여부를 결정하는데 추가로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀을 포함하는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀은 최초 유전자 요법 치료 또는 재투약 치료를 포함하는 추가적인 유전자 요법 치료일 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 혈청 또는 혈장에서의 혈청양성의 결정은 대상체가 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀을 포함하는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀을 사용한 최초 유전자 요법에 적격인지 여부; 대상체가 면역저해 레지멘 및/또는 TPE를 필요로 하는지 여부, 및 면역저해 레지멘을 사용한 치료가 대상체가 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀을 포함하는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀을 사용한 치료 또는 재치료에 적격이 되도록 만들기에 충분한 수준으로 항-AAVrh74 항체로부터 대상체 혈청 또는 혈장의 제거를 초래하였는지 여부를 결정하기 위해 사용된다. 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재의 이러한 결정에 유용한 방법 및 조성물은 문헌 [Griffin et al., Adeno-associated Virus Serotype rh74 Prevalence in Muscular Dystrophy Population, American Society of Gene and Cell Therapy, 22^nd annual meeting, 2019]; 및 2021년 6월 15일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2021/037314 (미국 특허 출원 번호 63/038957에 대응함)에 기재된 것들을 포함하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재의 결정에 이용되는 항체의 예는 하기를 포함하거나 달리 본원에 기재된 바와 같다:

대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재의 결정에서 이용되는 항체의 추가 예는 하기를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다: NYGMN (서열식별번호: 20), DYGMN (서열식별번호: 22), YTFTNYGMN (서열식별번호: 20), YTFTKYGMN (서열식별번호: 23), 및 YTFTNYGMN (서열식별번호: 21)으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR1 아미노산 서열, 및/또는 WINTYTGEPTYADDFKG (서열식별번호: 24), WINTNTGEPTYGDDFKG (서열식별번호: 25), 및 WMGWINTYTGEPTY (서열식별번호: 26)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR2 아미노산 서열, 및/또는 GVAHYSDSRFAFDY (서열식별번호: 27), GNAHPGGSAFVY (서열식별번호: 28), RGSYYYDSSPAWFAY (서열식별번호: 29), RGVDSSGYGAFAY (서열식별번호: 30), 및 TRGTSTMISTFAFVY (서열식별번호: 31)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR3 아미노산 서열, 및/또는 SVSSSVSYMH (서열식별번호: 32), SASSGVTYMH (서열식별번호: 33), SSVSYMH (서열식별번호: 34), SSVSYMH (서열식별번호: 34), 및 SSVRYMH (서열식별번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL CDR1 아미노산 서열, 및/또는 YTSNLAS (서열식별번호: 36), RTSNLAS (서열식별번호: 37), LWIYSTSNLAS (서열식별번호: 38), 및 VWIYSTSNLAS (서열식별번호: 39)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL CDR2 아미노산 서열, 및/또는 QQRSSYPFT (서열식별번호: 40), QQRSTYPF (서열식별번호: 41), QQRSFYPF (서열식별번호: 42), 및 QQRTYYPF (서열식별번호: 43)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR3 아미노산 서열.

마이크로디스트로핀을 포함하는 rAAV를 사용한 뒤시엔느 근이영양증 ("DMD") 또는 베커 근이영양증 ("BMD")을 포함하는 근이영양증의 치료

본 발명은 마이크로디스트로핀을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 방법은 마이크로디스트로핀을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 것을 포함하고, 예를 들어 프레드니손을 포함하는 항염증성 스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

마이크로디스트로핀을 포함하는 rAAV로 근이영양증을 치료하고 면역-저해 레지멘 또는 항염증성 스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것에 관한 본 발명의 모든 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 rAAV 또는 마이크로디스트로핀 코딩 뉴클레오티드 서열은 WO-2020/123645, WO-2019/209777, WO-2019/195362, WO-2016/115543, WO-2019118806, WO-2017/221145에 기재된 것들을 포함하고 (이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함됨), SGT-001, 질디스트로겐 바로파르보벡 및 PF-06939926을 포함한다.

지대형 근이영양증의 치료

지대형 근이영양증 ("LGMD")의 치료는 본 발명의 한 측면이다. 본원에 기재된 본 발명의 방법은 이러한 이영양증을 치료하는데 유용한 rAAV 벡터를 사용함으로써 지대형 근이영양증의 치료에 이용될 수 있음이 인식된다. 이러한 rAAV 벡터는 PCT/US2019/039893 (WO 2020/06458) (AAVrh.74.tMCK.CAPN3 포함); 미국 특허 출원 63/024,338 (rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 포함); PCT/US2019/015779 (WO 2019/15474) (scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG 포함); PCT/US2020/47339 (AAVrh74.tMCK.hSCGA 포함); PCT/US2020/019892 (WO2020/176614) (scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 포함); PCT/US2016/061703 (WO2017/083776) (rAAVrh.74.MHCK7.huAN05 포함)에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법

본 개시내용은 DMD, 베커 근이영양증 및 지대형 근이영양증의 치료를 포함하여, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 rAAV 및 항염증성 스테로이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한 DMD, 베커 근이영양증 및 지대형 근이영양증의 치료를 포함하여, 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 rAAV 및 항염증성 스테로이드를 포함하는 조합 요법의 용도를 제공한다.

본 개시내용은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여되는 것을 포함하여 조합으로 투여되는 rAAV rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 항염증성 스테로이드를 포함하는 조합 요법 및 의약을 제공한다. 본 개시내용은 또한 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여되는 것을 포함하여 조합으로 투여되는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 rAAV 및 항염증성 스테로이드를 포함하는 조합 요법 및 의약을 제공한다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다. 일부 실시양태에서, 항염증성 스테로이드는 경구 투여를 위해 제형화된다. 조합 요법 및 의약의 경우, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 및 후에 투여될 수 있다. 대안적으로, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전에만 또는 후에만 투여된다.

일부 조합 요법 및 의약에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 12시간에 또는 rAAV 투여 전 약 24시간에 또는 rAAV 투여 전 약 36시간에 또는 rAAV 투여 전 약 48시간에 또는 rAAV 투여 전 약 60시간에 또는 rAAV 투여 전 약 72시간에 또는 투여 전 약 96시간에 투여된다. 일부 조합 요법 및 의약에서, 염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 5일에, rAAV 투여 전 약 6일에, rAAV 투여 전 약 7일에, 또는 rAAV 투여 전 약 8일에, 또는 rAAV 투여 전 약 9일에, 또는 rAAV 투여 전 약 10일에, 또는 rAAV 투여 전 약 11일에, 또는 rAAV 투여 전 약 12일에, 또는 rAAV 투여 전 약 13일에, 또는 rAAV 투여 전 약 14일에, 또는 rAAV 투여 전 약 30일에 투여된다.

일부 조합 요법 및 의약에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 약 7일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 14일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 21일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 28일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 30일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 45일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 약 60일 동안 적어도 1일 1회 투여된다. 일부 조성물 및 의약에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다.

예시적인 조합 요법 및 의약에서, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 전에 투여되고, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 7일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 14일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 21일에 적어도 1일 1회, 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 24일에 적어도 1일 1회, 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 28일에 적어도 1일 1회, 또는 rAAV 투여 후 적어도 1일 내지 30일에, 또는 rAAV 투여 후 적어도 30 내지 60일에 투여된다.

본원에 개시된 임의의 조합 요법 및 의약에서, 조합 요법 또는 의약은 또한 항-CD20 특이적 항체를 포함할 수 있으며, 이는 rAAV 및 항염증성 스테로이드와 조합하여 투여된다. 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전에 투여된다. 일부 조성물에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 적어도 7일에 투여된다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙을 포함한다.

일부 조합 요법 및 의약에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 약 60일에, 또는 rAAV 투여 전 약 45일에, 또는 rAAV 투여 전 약 30일에, rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 투여된다. 일부 조성물에서, 항-CD20 항체는 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다. 일부 조합 요법 및 의약에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 및 후 둘 다에 투여된다. 대안적으로, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전에 투여되거나, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 후에 투여된다.

또한, 임의의 개시된 조합 요법 및 의약에서, 면역저해성 마크롤라이드는 대상체에게 rAAV 및 항염증성 스테로이드, 및 임의로 항-CD20 항체와 조합하여 투여된다. 면역저해성 마크롤라이드의 예에는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 및 시롤리무스가 포함된다. 일부 조합 요법 및 의약에서, 면역저해성 마크롤라이드는 경구 투여를 위해 제형화된다. 일부 조합 요법 및 의약에서, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전 및 rAAV 투여 후 둘 다에 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전에 투여되거나, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 후에 투여된다.

일부 조합 요법 및 의약에서, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 4일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 5일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 6일에 투여되거나, rAAV 투여 전 적어도 7일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 10일에 투여되거나, 또는 투여 전 적어도 14일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 30일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 45일에 투여되거나, 또는 rAAV 투여 전 적어도 60일에 투여된다. 일부 조합 요법 및 의약에서, 면역저해성 마크롤라이드는 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다.

본 개시내용은 또한 DMD, 베커 근이영양증 및 지대형 근이영양증의 치료를 포함하는, rAAV 및 면역저해 레지멘을 공동-투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여된다. 또한, 본 개시내용은 또한 DMD, 베커 근이영양증 및 지대형 근이영양증의 치료를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용은 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 면역저해 레지멘을 포함하는 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용은 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는, 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여된다.

예를 들어, 본 개시내용은 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용은 근이영양증을 치료하기 위한 rAAV 및 면역저해 레지멘의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 rAAV 및 면역저해 레지멘의 하나 이상의 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 상이한 시점에 투여된다.

용어 면역저해 레지멘은 대상체의 면역계를 저해 또는 조정하는 치료 방법을 지칭한다. 레지멘은 하나 이상의 면역 저해제의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함한다.

예시적인 조합 요법 또는 의약에서, 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 약 24시간에 투여되는 항염증성 스테로이드를 포함한다. 또 다른 예시적인 조합 요법 또는 의약에서, 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전에 투여되는 항염증성 스테로이드를 포함하고, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 투여되거나, 항염증성 스테로이드는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 글루코코르티코이드 항염증성 스테로이드, 예컨대 프레드니손은 1mg/kg으로 rAAV의 투여 후 적어도 60일 동안 투여된다.

임의의 개시된 조합 요법 및 의약에서, 면역저해 레지멘에서, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다. 일부 조합 요법에서, 항염증성 스테로이드는 경구 투여를 위해 제형화된다.

추가의 예시적인 조합 요법 및 의약에서, 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전에 투여되는 항-CD20 특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항-CD20 항체는 혈관내 주입에 의한 투여를 위해 제형화된다. 예시적인 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙을 포함한다.

일부 조합 요법 및 의약에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 적어도 14일에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 약 60일에, rAAV 투여 전 약 45일에, rAAV 투여 전 약 30일에, rAAV 투여 전 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 투여된다. 또한, 항-CD20 특이적 항체는 rAAV 투여 전 30 내지 60일 동안 투여된다. 개시된 면역저해 레지멘은 또한 rAAV 투여 후에 항-CD20 특이적 항체를 투여하는 것을 포함한다.

또한, 개시된 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 면역저해성 마크롤라이드를 포함한다. 면역저해 레지멘은 또한 rAAV 투여 후에 투여되는 면역저해성 마크롤라이드를 포함할 수 있다. 임의의 개시된 면역저해 레지멘에서, 면역저해성 마크롤라이드는 경구 투여를 위해 제형화된다. 예시적인 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 개시된 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 30 내지 60일에 투여된다. 또한, 면역저해 레지멘은 rAAV 투여 전 약 60일에, rAAV 투여 전 약 45일에, rAAV 투여 전 약 30일에, rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에, rAAV 투여 전 약 24시간 또는 약 12시간에 투여된다.

특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하고, 여기서 면역저해 레지멘은 하기를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 경구로 투여되는 항염증성 스테로이드, 및 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 투여되는 항염증성 스테로이드 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 투여되는 항염증성 스테로이드, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 정맥내로 투여되는 항-CD20 항체, 및 임의로, rAAV 투여 후에 투여되는 항-CD20 항체를 포함하고, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 경구로 투여되는 면역저해성 마크롤라이드, 및 임의로, rAAV 투여 후에 투여되는 면역저해성 마크롤라이드를 포함한다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이고, 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙이고, 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상, 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스이다. 예시적인 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드 프레드니손 또는 프레드니솔론, 항-CD20 항체 리툭시맙, 및 면역저해성 마크롤라이드 시롤리무스를 포함한다.

특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 지대형 근이영양증을 치료하기 위한, rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하는 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 조합 요법은 rAAV 및 면역저해 레지멘을 포함하고, 여기서 면역저해 레지멘은 하기를 포함한다: i) rAAV 투여 전 약 24시간에 경구로 투여되는 항염증성 스테로이드, 및 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 투여되는 항염증성 스테로이드 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 투여되는 항염증성 스테로이드, ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 정맥내로 투여되는 항-CD20 항체, 및 임의로, rAAV 투여 후에 투여되는 항-CD20 항체를 포함하고, iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 경구로 투여되는 면역저해성 마크롤라이드, 및 임의로, rAAV 투여 후에 투여되는 면역저해성 마크롤라이드를 포함한다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이고, 항-CD20 특이적 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙이고, 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상, 면역저해성 마크롤라이드는 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스이다. 예시적인 실시양태에서, 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드 프레드니손 또는 프레드니솔론, 항-CD20 항체 리툭시맙, 및 면역저해성 마크롤라이드 시롤리무스를 포함한다.

본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 rAAV의 용량, 예를 들어 제2 용량을 포함하고, 여기서 대상체의 혈장은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 제2 용량의 투여 전에 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용되고, 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받았다. 예를 들어, rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05이다. 근이영양증은 DMD, 베커 근이영양증 또는 지대형 근이영양증이다.

또한, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 조합 요법의 용도를 제공하며, 조합 요법은 대상체에게 투여되는 rAAV의 용량, 예를 들어 "rAAV의 제2 용량"을 포함하고, 여기서 대상체의 혈장은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 제2 용량의 투여 전에 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용되고, 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받았다. 예를 들어, rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05이다. 근이영양증은 DMD, 베커 근이영양증 또는 지대형 근이영양증이다.

임의의 개시된 조합 요법 및 용도에서, 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 2개의 TPE 또는 적어도 3개의 TPE에 적용된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 4개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 5개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 6개의 TPE에 적용되거나, 또는 대상체의 혈장은 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 7개의 TPE에 적용된다.

본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 조합 요법은 대상체에게 투여되는 rAAV를 포함하고, 여기서 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용되고, 여기서 rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05이다. 근이영양증은 DMD, 베커 근이영양증 또는 지대형 근이영양증이다.

본 개시내용은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 조합 요법의 용도를 제공하며, 여기서 조합 요법은 대상체에게 투여되는 rAAV를 포함하고, 여기서 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용되고, 여기서 rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05이다. 근이영양증은 DMD, 베커 근이영양증 또는 지대형 근이영양증이다.

임의의 개시된 조합 요법 및 용도에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 3개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 4개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 5개의 TPE, rAAV 투여 전에 적어도 6개의 TPE 또는 rAAV 투여 전에 적어도 7개의 TPE에 적용된다. 이들 개시된 조합 요법 및 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 투여받았다. 또한, 일부 실시양태에서, 대상체는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여받는다. 예를 들어, 항염증성 스테로이드는 경구 투여를 위해 제형화된다. 또한, 항염증성 스테로이드는 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트이다.

임의의 개시된 조합 요법 및 용도에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전 적어도 9일 동안, 투여 전 적어도 7일 동안, 투여 전 5일 동안, 또는 투여 전 2일 동안 TPE에 적용된다. 또한, rAAV 투여 전에 대상체의 혈장에서 수행되는 TPE 세션 사이에 약 24 내지 약 48시간이 있다. 특정한 실시양태에서, 대상체의 혈장은 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE에 적용되며, 여기서 TPE 사이에 약 48시간이 있다.

본원에 기재된 임의의 조합 요법 및 용도에서, 대상체는 rAAV 투여 시점에 약 1:400 이하의 항-AAVrh.74 항체 수준을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 rAAV 투여 시점에 약 1:100 내지 약 1:400의 항-AAVrh.74 항체 수준 또는 약 1:100 내지 1:300의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:100 내지 1:200의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:250 내지 1:500의 항-AAVrh.74 항체 수준, 또는 약 1:200 내지 1:400의 항-AAVrh.74 항체 수준을 갖는다. 항체 역가는 총 항체 결합 역가로서 결정된다. 임의의 개시된 조합 요법 및 근이영양증을 치료하기 위한 용도에서, 항-AAVrh.74 항체의 존재는 rAAV 투여 전에, rAAV 투여 후에, 면역 반응 또는 유해 사건이 관찰되기 전에, 또는 면역 반응 또는 유해 사건이 관찰된 후에 상기 대상체의 혈청 또는 혈장에서 결정되었다. 또한, 항-AAVrh.74 항체의 존재는 면역저해 레지멘 또는 TPE의 투여 단계 전에 결정된다. 예를 들어, 항-AAVrh.74 항체의 존재는 상기 대상체에게 AAV를 포함하는 임의의 조합 요법 또는 의약의 임의의 투여 전에 또는 상기 대상체에게 AAVrh.74를 포함하는 임의의 조합 요법 또는 의약의 투여 전에 결정된다.

또한, 개시된 조합 요법 및 용도에서, 상기 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체 수준이 양성 대조군으로서 사용된다. 예를 들어, 양성 대조군은 항-AAVrh.74 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 기재된 임의의 항-AAVrh.74 모노클로날 항체를 이용한다.

임의의 개시된 및 용도에서, 대상체에서 항-AAVrh.74 항체의 존재는 정량적 방법을 사용하여 결정되고, 여기서 상기 대상체는 상기 정량화에 기반하여 항-AAVrh.74 항체에 대해 혈청양성으로서 식별되고, 여기서 상기 면역저해 레지멘 또는 TPE는 혈청양성 대상체에게 선택적으로 투여된다.

본 개시내용은 하기 추가 측면을 제공한다:

청구항 1. 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법으로서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 및 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 rAAV는 혈청형 AAVrh.74이고, rAAV는 서열식별번호: 9의 발현 카세트를 포함하는 것인 방법.

청구항 2. 제1항에 있어서, rAAV가 1.33 x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법. 1.33 x 10¹⁴의 용량은 선형 qPCR DNA 표준을 이용하여 결정되며, 역가 결정을 위한 슈퍼코일 qPCR DNA 표준에 의해 결정된 바와 같은 2 x 10¹⁴에 상응한다.

청구항 3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 뒤시엔느 근이영양증을 앓고 있고, 이전에 rAAVrh.74-기반 유전자 요법을 받지 않았고, rAAV.rh74 항체에 대해 혈청양성인 것으로 결정된 것인 방법.

청구항 4. 제3항에 있어서, 대상체가 ELISA 면역검정에 기반하여 rAAVrh.74 항체에 대해 혈청양성인 것으로 결정되었고, 여기서 대상체가 1:400의 혈청 희석에서 ≥2.00의 흡광도 비율을 나타내는 것인 방법.

청구항 5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 rAAVrh74의 임의의 투여 전에 상기 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

청구항 6. 제5항에 있어서, 항-AAVrh.74 항체의 존재의 결정이 ELISA 면역검정에 의해 결정되고, 여기서 대상체가 1:400의 혈청 희석에서 ≥2.00의 흡광도 비율을 나타내는 것인 방법.

청구항 7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 경구로 투여되는 것인 방법.

청구항 8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 약 12시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 적어도 12시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 적어도 12시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 적어도 24시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 1일 내지 약 30일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.

청구항 13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 적어도 30일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.

청구항 14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 적어도 60일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.

청구항 15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 글루코코르티코이드인 방법.

청구항 16. 제13항에 있어서, 글루코코르티코이드가 프레드니손인 방법.

또한, 본 개시내용은 하기 추가 측면을 제공한다:

청구항 1. 하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법:

a) 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계

b) rAAV를 투여하며, 여기서 rAAV는 혈청형 rhAAVrh.74이고, rAAV는 서열식별번호: 9의 발현 카세트를 포함하는 것인 단계.

청구항 2. 제1항에 있어서, 대상체의 혈장이 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE, 적어도 3개의 TPE, 적어도 4개의 TPE, 적어도 5개의 TPE, 적어도 6개의 TPE 또는 적어도 7개의 TPE에 적용되는 것인 방법.

청구항 3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체의 혈장이 rAAV 투여 전 적어도 9일 동안, 투여 전 적어도 7일 동안, 투여 전 5일 동안, 또는 투여 전 2일 동안 TPE에 적용되는 것인 방법.

청구항 4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 혈장이 rAAV가 투여되는 날에 TPE에 적용되는 것인 방법.

청구항 5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 혈장이 적어도 2개의 TPE에 적용되며, 여기서 TPE 사이에 약 48시간이 있는 것인 방법.

청구항 6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 1.33 x 10¹⁴의 용량으로 투여되는 것인 방법. 1.33 x 10¹⁴의 용량은 선형 qPCR DNA 표준을 이용하여 결정되며, 역가 결정을 위한 슈퍼코일 qPCR DNA 표준에 의해 결정된 바와 같은 2 x 10¹⁴에 상응한다.

청구항 7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 뒤시엔느 근이영양증을 앓고 있고, 대상체가 rAAVrh.74 항체에 대해 혈청양성인 것으로 결정된 것인 방법.

청구항 8. 제7항에 있어서, 대상체가 제1b항의 투여 단계 전에 적어도 1회 AAVrh.74를 투여받은 것인 방법.

청구항 9. 제7항에 있어서, 대상체가 ELISA 면역검정에 기반하여 rAAVrh7 항체에 대해 혈청양성인 것으로 결정되었고, 여기서 대상체가 1:100의 혈청 희석에서 ≥2.00의 흡광도 비율을 나타내는 것인 방법.

청구항 10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, rAAVrh.74의 임의의 투여 전에 상기 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

청구항 11. 제10항에 있어서, 항-AAVrh.74 항체의 존재의 결정이 ELISA 면역검정에 의해 결정되고, 여기서 대상체가 1:100의 혈청 희석에서 ≥2.00의 흡광도 비율을 나타내는 것인 방법.

청구항 12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

청구항 13. 제12항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 경구로 투여되는 것인 방법.

청구항 14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 약 12시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 적어도 12시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 16. 제12항 또는 제13항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 적어도 12시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 적어도 24시간에 투여되는 것인 방법.

청구항 18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 1일 내지 약 30일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.

청구항 19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 적어도 30일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.

청구항 20. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 적어도 60일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.

청구항 21. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 글루코코르티코이드인 방법.

청구항 22. 제21항에 있어서, 글루코코르티코이드가 프레드니손인 방법.

하기 실시예는 예시로서 제공되며 제한으로서 제공되지 않는다. 기재된 숫자 범위는 각 범위 내의 각 정수 값을 포함하고, 언급된 최저 및 최고 정수를 포함한다.

실시예

실시예 1

A) AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물의 생성

AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 AAV2 역전된 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 발현 카세트를 함유한다 (도 1 참조). 마이크로-디스트로핀 구축물은 인프레임 rod 결실 (R4-R23)에 의해 특징화된 반면, 힌지 1, 2 및 4 및 시스테인 풍부 도메인은 138 kDa 단백질을 생성하는 상태로 남아있다. 마이크로-디스트로핀 단백질 (3579 bp)의 발현은 MHCK7 프로모터 (792 bp)에 의해 가이드되었다. MCK 프로모터를 제거하고 MHCK7 프로모터를 삽입함으로써 rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드로부터 플라스미드를 구축하였다. 코어 프로모터 후에, 53 bp 내인성 마우스 MCK 엑손1 (비번역된)이 효율적인 전사 개시를 위해 존재하고, SV40 후기 16S/19S 스플라이스 신호 (150 bp) 및 작은 5'UTR (61 bp)이 뒤따른다. 인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVß (클론테크)로부터 유래된다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 시작 바로 앞에 컨센서스 코작(Kozak) 및 mRNA 종결을 위한 작은 53 bp 합성 폴리A 신호를 가졌다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 문헌 [Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002))]에 이전에 기재된 바와 같이 (R4-R23/Δ71-78) 도메인을 함유하였다. 상보적 DNA는 인간 사용을 위해 코돈 최적화되었고, 진스크립트(GenScript) (미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 의해 합성되었다 (Mol Ther 18, 109-117 (2010)). 이 벡터에 포함된 유일한 바이러스 서열은 바이러스 DNA 복제 및 패키징 둘 다에 필요한 AAV2의 역전된 말단 반복부였다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 mRNA 종결을 위한 작은 53 bp 합성 폴리A 신호를 갖는다.

이전 연구는 MHCK7 프로모터를 사용하는 심장 발현 (Salva et al. Mol Ther 15, 320-329 (2007) 및 골격, 횡격막 및 심근 발현을 달성하는 AAVrh.74 (Sondergaard et al. Annals of clinical and Transl Neurology 2 , 256-270 (2015))을 검증하였다. 도 1의 구축물의 서열은 AAVrh.74 비리온으로 캡시드화되었다. AAVrh.74 혈청형의 분자 클론은 레서스 마카크 림프절로부터 클로닝되었으며, 문헌 [Rodino-Klapac et al. Journal of Translational medicine 5, 45 (2007)]에서 논의된다.

표 1은 플라스미드 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 (서열식별번호: 3)의 분자 특색을 보여준다.

B) 카나마이신 (Kan) 내성을 코딩하는 플라스미드로부터 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물의 생성

MHCK7.μDys.KAN의 클로닝은 MHCK7.μDys.AMP 플라스미드 및 카나마이신 백본으로부터 MHCK7.μDys 단편을 단리하고, NEBuilder 클로닝 워크플로우를 사용하여 이들을 어닐링함으로써 달성하였다. MHCK7.μDys 단편을 SnaBI를 사용한 제한 효소 소화를 통해 단리하였다. 1시간 동안 37℃에서 1x CutSmart 완충액 (NEB) 및 1μL SnaBI에서 50μL 총 반응에서 소화를 수행하였다. 생성된 단편을 1.5시간 동안 105 볼트에서 작동하는 1% 아가로스 겔을 사용하는 전기영동을 통해 단리하였다. MHCK7.μDys 삽입물에 상응하는 밴드를 절단하고, 겔 정제 키트 (마슈레이-나겔(Macherey-Nagel))를 사용하여 정제하였다. 생성된 단편은 10ng/μL의 DNA 농도를 가졌다. 37℃에서 1시간 동안 1x CutSmart 완충액 (NEB) 및 1μL XbaI를 사용한 50μL 반응에서 XbaI 제한 효소 소화를 통해 Kan 백본 단편을 단리하였다. 생성된 단편을 1.5시간 동안 105 볼트에서 작동하는 1% 아가로스 겔을 사용하는 전기영동을 통해 단리하였다. Kan 백본에 상응하는 밴드를 절단하고, 겔 정제 키트 (마슈레이-나겔)를 사용하여 정제하였다. 생성된 단편은 8.1ng/μL의 DNA 농도를 가졌다. 중첩 서열로 2개의 단편을 연결시키는 능력을 갖는 NEB Builder 클로닝 워크플로우를 사용하여 2개의 단편을 어닐링하였다. 20μL의 총 반응 부피로 1x NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스에서 MHCK7.μDys 대 카나마이신 백본의 1:1 비율을 사용하여 50℃에서 15분 동안 제조업체 프로토콜에 따라 NEBuilder 클로닝 반응을 수행하였다. 2.5μL 클로닝 생성물을 세포에 첨가한 후 얼음에서 30분, 그 후 42℃에서 30초 및 얼음에서 추가 5분 동안 첨가함으로써 생성된 클론을 NEB® 안정적 적격 이. 콜라이 (C3040)로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 950μL의 성장 배지를 세포에 첨가하고, 225rpm에서 진탕하면서 30℃에서 1.5시간 동안 성장하도록 허용하였다. 성장 후, 450μL의 이들 세포를 50μg/mL 카나마이신 LB 한천 플레이트에 플레이팅하고, 건조 인큐베이터에서 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이 플레이트로부터 콜로니를 선택하고, 50μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB에서 밤새 성장시켰다. QIAprep® 스핀 미니프렙 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 3mL의 이 배양물로부터 DNA를 단리하였다. 클로닝 생성물을 확인하기 위해 이 DNA를 사용하였다. PmeI, MscI 및 SmaI를 사용한 제한 효소 소화, 그 후 겔 전기영동을 통해 클로닝 생성물을 확인하였다. 클로닝 생성물을 시퀀싱을 통해 추가로 확인하였다. 생성된 플라스미드는 서열식별번호: 8에 제시되어 있고, 도 8 및 9에 표시되어 있다. 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1-4977에 상응하는 도 7의 구축물의 서열을 상기 기재된 바와 같이 AAVrh.74 비리온으로 캡시드화하였다.

C) pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 구축물의 생성

코돈 최적화된 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 서열을 구동하는 MCK 발현 카세트를 AAV 클로닝 벡터 psub201에 삽입함으로써 pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드를 구축하였다 (Samulski et al., J. Virol. 61(10):3096-3101). 근육-특이적 유전자 발현을 구동하기 위해 근육-특이적 조절 요소를 구축물에 포함시켰다. 이 조절 요소는 351 bp MCK 코어 프로모터 (근위)에 융합된 마우스 MCK 코어 인핸서 (206 bp)를 포함하였다. 코어 프로모터 후에, 구축물은 효율적인 전사 개시를 위한 53 bp 내인성 마우스 MCK 엑손1 (비번역된), 이어서 SV40 후기 16S/19S 스플라이스 신호 (97 bp) 및 작은 5'UTR (61 bp)을 포함한다. 인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVß (클론테크)로부터 유래되었다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 시작 바로 앞에 컨센서스 코작(Kozak) 및 mRNA 종결을 위한 작은 53 bp 합성 폴리A 신호를 갖는다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 문헌 [Harper et al. Nat. Med. 8(3):253-61, 2002]에 이전에 기재된 바와 같이 (R4-R23/Δ71-78) 도메인을 함유한다.

pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 AAV2 역전된 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 발현 카세트를 함유하였다 (도 5 참조). 이 서열은 AAVrh.74 비리온으로 캡시드화되었다. AAVrh.74 혈청형의 분자 클론은 레서스 마카크 림프절로부터 클로닝되었으며, 문헌 [Rodino-Klapac et al. Journal of Tran. Med. 45 (2007)]에 기재되어 있다.

D) 벡터 생산

연구 등급 조건 하에 HEK293 세포의 삼중-형질감염 방법을 이용하여 본원에 기재된 연구를 위한 벡터를 생산하였다. 생산 후 벡터의 특징화는 슈퍼코일 표준을 사용한 qPCR에 의한 역가 결정, 내독소 수준 결정 (EU/mL) 및 멸균성 평가를 포함한다. 생산된 벡터를 SDS-PAGE에 의해 분석하여 예상되는 rAAV와의 밴딩 패턴 일관성을 입증한다. 이들 연구에서 사용된 대용 벡터 rAAVrh74.MCHK7.uDYS.FLAG는 C-말단 FLAG 태그를 첨가하여 상기 기재된 바와 같이 구축하였다.

실시예 2

비인간 영장류 연구에서 면역저해를 사용한 rAAVrh74.MCHK7.마이크로디스트로핀의 전신 유전자 전달

이 연구의 주요 목표는 최적의 용량, 지속기간 및 면역저해 레지멘을 식별하고, rAAV.rh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 혈관내 전달 후 유전자 발현을 최적화하는 것이었다. 이 연구는 벡터 투여 전 및 후에 다양한 면역저해 지속기간으로 레서스 마카크의 5개 코호트 (각 코호트 n=3)를 사용하여 개시되었다 (표 1). 레서스 마카크는 본원에서 "비인간 영장류" 또는 NHP로 지칭된다.

비인간 영장류에서 트랜스진 전달 최적화 연구

++ 리툭시맙: 주사전 10-14일 2회 및 주사 당일 1회. 시롤리무스: 생검을 통한 주사전 3일. 프레드니솔론: 주사전 1일 내지 주사후 30일.

IF: 면역형광; H&E: 헤마톡실린 및 에오신 염색, Path: 정규 조직병리학

코호트 1에서, 대조군 마카크는 면역저해를 첨가하지 않고 두부 또는 복재 정맥으로 2x10¹⁴ vg/kg의 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 혈관내 투약받았다 (n=2). 다른 모든 코호트에서, 마카크는 또한 면역저해와 함께 두부 또는 복재 정맥으로 전달된 2x10¹⁴ vg/kg의 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 혈관내 주사를 받았다.

코호트 2에서, 전신 유전자 전달 전 1일 내지 유전자 전달 후 30일에 프레드니손 (2mg/kg/일)을 경구로 제공하였다 (n=3). 코호트 3에서, 전신 유전자 전달 전 1일 내지 유전자 전달 후 60일에 프레드니손 (2mg/kg/일)을 경구로 제공하였다 (n=3). 코호트 4에서, 전신 유전자 전달 전 14일 내지 유전자 전달 후 60일에 프레드니손 (2 mg/kg/일)을 경구로 제공하였다 (n=3).

코호트 5 (n=3)는 삼중 면역저해 레지멘을 조사하였다. 이 코호트에서, 벡터 투여 전 14 및 7일인 2개의 용량 세션 동안 혈관내 주입을 통해 리툭시맙 (750 mg/㎡)을 투약하고, 유전자 전달 전 벡터 투여 당일에 제3 용량을 투여하였다. 항체가 처음 3개 용량에 반응하지 않는 경우 리툭시맙을 주입 후 4회 투여할 수 있다. 시롤리무스 (4 mg/㎡/일)를 벡터 투여 전 3일에 경구로 투약하였고, 항체가 감소할 때까지 계속되었다. 벡터 투여 전 1일 내지 벡터 투여 후 30일에 프레드니손을 경구로 투약하였다 (2 mg/kg/일).

치료 후, 모든 코호트는 전경골근 (TA) 및/또는 비복근 (gn)으로부터 수득된 바늘 생검을 받았다. 생검을 유전자 전달 전 및 유전자 전달 후 6, 8 및 12주에 최대 3회 수집하였다. 면역학, CBC 및 화학을 위한 채혈을 적어도 격주로 수행하였다.

혈액 샘플에 대해 하기 혈액학 측정을 수행하였다: 적혈구(red blood cell) (적혈구(erythrocyte)) 수, 헤모글로빈, 헤마토크리트, 평균 혈구 부피, 평균 혈구 헤모글로빈, 평균 혈구 헤모글로빈, 농도, 적혈구 분포 폭, 절대 망상적혈구 수, 혈소판 수, 백혈구 수, 절대 호염기구 수, 절대 큰 비염색된 세포 수 및 혈액 도말.

혈액 샘플에 대해 하기 임상 화학 측정을 수행하였다: 글루코스, 우레아 질소, 총 단백질, 알부민, 글로불린, 알부민:글로불린 비율, 총 빌리루빈, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 글루타메이트 데히드로게나제, 콜레스테롤, 감마 글루타밀트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 알칼리성 포스파타제.

안전성 프로파일 및 형질도입 효율

AAVrh.74에 대한 총 항체 반응 (항-AAVrh.74 항체)은 AAVrh.74에 대한 항체 반응을 개시하지 않은 코호트 2 (NHP_03)로부터의 하나의 NHP를 제외하고는 비정상적인 관찰의 증거 없이 코호트에 걸쳐 유사하였다. 또한, 삼중 면역저해 레지멘으로 치료받았음에도 불구하고 코호트 5로부터의 NHP는 코호트 1-4의 NHP에서 관찰된 것과 AAVrh.74에 대한 유사한 항체 반응을 나타내었다. 코호트 1-4로부터의 NHP가 경험한 유해 효과는 일시적으로 상승된 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 간 효소를 포함하였다. 코호트 1로부터의 2마리 NHP (NHP_12, NHP_13), 코호트 3으로부터의 1마리 NHP (NHP_06) 및 코호트 4로부터의 1마리 (NHP_07)는 유전자 전달 후 12주에 상승된 ALT 및 AST 간 효소를 나타내었다. 형질도입 효율과 관련하여, 유전자 전달 후 12주에 NHP 코호트 1-5 사이에서 벡터 게놈 카피 (vg 카피/μg DNA)의 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (P>0.05).

실시예 3

치료적 혈장 교환 (TPE)을 사용한 투여

이 연구의 주요 목표는 기존 AAV 항체를 제거하기 위해 치료적 혈장 교환 (TPE)을 사용하여 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 재투약한 후 기술 및 유전자 발현 둘 다를 최적화하고, TPE를 사용하지 않고 재투약을 평가하는 것이었다.

실시예 2에 기재된 연구에서 이전에 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 주사받은 비인간 영장류 (코호트 2, 3 및 4로부터)는 하나의 분리반출술 절차 동안 2-3개의 TPE를 받았다. TPE 전 4주 및 2주에, 영장류는 최대 채혈 (영장류 체중의 10%)을 받았다. 혈액을 최대 30일 동안 ACDA 용액에 보존하였고, 절차 동안 과도한 혈액 손실을 방지하기 위해 TPE 당일에 분리반출술 기계를 프라이밍하는데 사용하였다. 또한, AAVrh.74 결합 항체 역가의 결정을 측정하여 역가가 현재 임상 시험에서 포함 기준의 역치인 1:400보다 큰지 입증하였다. TPE 후, 2x10¹⁴ vg/kg rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 또는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀.FLAG를 복재 또는 두부 정맥을 통해 전신적으로 전달하였다.

이들 NHP는 또한 TPE 전 1일 및 TPE 및 유전자 전달 후 30일 동안 1일 1회 프레드니손 (2mg/kg)을 받았다. 화학, CBC, ELISA 및 ELISpot 검정을 위한 채혈을 TPE 전, 재투약 전 TPE 후, 및 종점까지 적어도 격주로 수행하였다. 종점은 제2 유전자 전달 후 8주 내지 12주 사이였으며, 전체 부검을 포함한다. 효능을 평가하기 위해, 벡터 게놈에 대한 웨스턴 블롯 및 qPCR 및 FLAG 면역형광을 수행하였다.

또한, 실시예 2에 기재된 면역저해 레지멘 동안 이전에 주사받은 비인간 영장류 (코호트 5)는 AAVrh.74에 대한 기존 항체를 낮추기 위해 TPE를 사용하지 않고 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 재투약받았다. 구체적으로, 리툭시맙 (750 mg/㎡/일)을 유전자 전달 전 7일 및 14일에, 주사 당일에 1회 및 유전자 전달 후 1회 혈관내 (IV) 전달하였고, 시롤리무스 (4 mg/㎡/일)를 유전자 전달 전 3일에 전달하였고, 연구 종결까지 계속하였다. 시롤리무스 수준을 혈액 수집을 통해 모니터링하였으며, 3 내지 14 ng/mL로 다양하였다. 화학, CBC, 시롤리무스 혈액 수준, ELISA 및 ELISpot 검정을 위한 채혈을 종점까지 적어도 격주로 수행하였다. 종점은 제2 유전자 전달 후 8주 내지 12주 사이였으며, 전체 부검을 포함한다. 각 동물의 관찰을 매일 수행하였다. NHP 체중을 격주로 모니터링하고, 이에 따라 면역저해 약물의 투약을 조정하였다.

치료적 혈장 교환 절차:

TPE 프로세스에서, 혈관 액세스를 통해 전혈을 제거하고, 후속적으로 혈장 (항체)이 제거되는 분리반출술 기계 내의 원심분리기를 통해 회전시켰다. 영장류를 위한 유지 유체에 대한 대체 유체 (인간 알부민)와 함께 적혈구를 다시 전달하였다. 비인간 영장류의 작은 크기 (10 kg 미만)로 인해, 보존된 혈액과의 혈장 교환 전에 분리반출술 기계의 프라이밍을 수행하여 안전성을 보장하고 영장류로부터 회수된 혈액의 양을 감소시켰다. 분리반출술 전 28일 및 14일에, 최대 혈액 수집 (비인간 영장류 순환 혈액의 10%)을 수행하였다. 수집된 전혈을 4℃에서 항응고제 산-시트레이트-덱스트로스 (ACDA) 용액에서 30일 이하 동안 보존 및 저장하였다. 또한, NHP는 여분의 철-풍부 보충제 및 농축물을 제공받았다. 분리반출술 당일에, 비인간 영장류를 텔라졸 (3-6mg/kg)로 근육내 진정시키고, 삽관하고, 가열된 절차 테이블에 고정시켰다. 마취 유지를 산소 1-4% 중 이소플루란으로 달성하였다. 양쪽 다리 (복재 정맥)에 혈관카테터를 배치하였으며, 하나는 전혈을 회수하기 위한 액세스 포트이고, 다른 하나는 반대쪽 다리에 적혈구 및 대체 유체를 재전달하기 위한 것이다. 절차 전반에 걸쳐 유체 및 채혈을 지원하기 위해 추가 카테터를 팔 (두부 정맥)에 배치하였다. 혈관 액세스를 수득한 후, 적절한 혈류를 유지하고 분리반출술 동안 응고를 방지하기 위해 동물은 헤파린 (50-100U/kg)을 투약받았다. 적절한 마취면을 결정하기 위해 온도, ECG 및 호흡을 사용하여 NHP를 모니터링하였다.

NHP를 카테터를 통해 COBE 스펙트라 분리반출술 기계에 연결하고, 기계를 상기 언급된 바와 같이 미리 수집된 혈액으로 프라이밍하였다. 하나의 총 혈장 교환은 한번에 제거되고 대체되는 순환 혈액의 전체 양과 동일하다. 98%의 추정 항체 제거를 달성하기 위해 2 내지 3개의 혈장 교환을 수행하였다. 혈액 화학 분석 및 혈청 항체 테스트를 위해 각 완료된 교환 후 혈액을 수집하였다. 혈장 교환 직후, NHP를 분리반출술 유닛으로부터 분리하고, rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 전신적으로 재투약하였다. 벡터 전달 후, 모든 카테터를 제거하고, 압력을 제공하여 출혈을 제어하였다. 완전히 보행할 수 있을 때까지 동물을 모니터링하였다.

부검 분석

부검을 위해, NHP는 종점 (재투약 후 8-12주 사이에 발생할 수 있음)에서 유타솔 (1mL/101b)을 투약받았다. 혈액을 수집하고, 전혈구수 (CBC) 분석, 시롤리무스 테스트 수준 및 혈청 화학을 위해 전혈을 보내었다. 그 후, 조직을 수집하고, 독립적인 수의 조직병리학자에 의한 분석을 위해 보냈고, 유전자 및 단백질 발현을 분석하여 효능 및 독성을 평가하였다.

유전자 발현 최적화를 평가하기 위해, 2x10¹⁴ vg/kg rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 또는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀.FLAG를 정맥내 투약 및 재투약받은 NHP로부터의 사전 및 사후 근육 생검을 수집하였다. 벡터 DNA의 특정 서열을 검출하기 위해 실시간 정량적 qPCR을 위해 사전 및 모든 사후 근육 조직으로부터의 DNA를 추출하였다. 수집된 모든 근육으로부터 단백질을 추출하고, 생검전 조직과 비교하여 마이크로-디스트로핀 단백질 (138 kD)을 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 또한, 나이브 전장 디스트로핀 (427 kD)을 정상 대조군으로서 사용하고, 유전자 발현으로서의 결과 척도로서 마이크로-디스트로핀 단백질과 정량적으로 비교하였다. FLAG 발현의 존재를 관찰하기 위한 면역형광 염색을 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀.FLAG 주입된 영장류에 대해 수행하였다.

면역저해 레지멘, 벡터 투여 및 재투약의 안전성을 평가하기 위해, 기준선에서 및 종점까지 격주로 채혈을 수행하였다. 혈청 화학, CBC 및 시롤리무스 수준을 연구의 두 가지 목표에 걸쳐 격주로 모니터링하였다. ELISpot 분석을 이용하여 AAVrh.74 펩티드 및 마이크로디스트로핀 펩티드 둘 다에 대한 T 세포 반응을 평가하였다. 최종적으로, 항-AAVrh.74 항체 반응을 연구의 두 가지 목표에 걸쳐 격주로 모니터링하였다.

결과

TPE 전 및 TPE 후 (rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 재투약 전)의 NHP에서의 AAVrh.74에 대한 총 항체 역가가 하기 표에 제공된다. 도 11은 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 재투약 후 NHP에서의 AAV74에 대한 항체 역가를 제공한다. NHP에서 수행할 수 있는 TPC 사이클의 수는 이용가능한 공여자 혈액의 결여로 인해 제한된다. 인간에서, 다중 라운드의 TPE를 투여할 수 있다. 실시예 2에서 검출된 역가를 초기 유전자 전달 후 12주에 수득하였다 (*). 실시예 3에서 검출된 역가를 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 재투약 주사 전에 수득하였다 (+). NHP_03은 AAVrh.74에 대한 항체 반응의 결여로 인해 사전 TPE 없이 재투약받았다. NHP_06은 작은 크기 및 불량한 혈관 액세스로 인해 TPE의 0.5 사이클만을 받았다.

TPE 절차는 일반적으로 잘 용인되었다. 말초 혈액 단핵 세포로부터의 AAVrh.74 및 마이크로-디스트로핀 펩티드에 대한 IFN-γ 반점 형성 세포 (SCF) 수준에 의해 평가된 바와 같이 비정상적인 면역학적 관찰은 없었다. TPE 후 재투약은 하기 NHP: NHP_01 및 NHP_02, 코호트 2; NHP_04, 코호트 3; NHP_08 및 NHP_09, 코호트 4)에서 증가된 간 효소 수준 (ALT/AST)을 초래하였다. 이는 지속적인 프레드니손 매일 투여로 해결되었다.

코호트 5로부터의 NHP는 리툭시맙을 사용한 이전 치료와의 비호환성으로 인해 TPE를 받지 않았고, 2마리의 NHP (NHP_10, NHP_11)는 재투약받았다. 코호트 5는 재투약 전 1:51,200보다 높은 AAVrh.74에 대한 총 항체 역가를 가졌다. 높은 항체 역가에서 재투약받은 NHP (코호트 5)는 하기 유해 사건을 경험하였다: 증가된 심박수 및 환기 속도, 구토, 전달 부위 근처 발진, 창백하고 얕은 호흡; 디펜히드라민 및 덱사메타손의 투여 후 해결됨.

7마리의 NHP는 TPE의 2-3회 연속 사이클을 받았고, 이는 AAVrh.74에 대한 순환 항체의 감소된 수준을 초래하였다. TPE 직후, NHP는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 성공적으로 재투약받았다. 코호트 4로부터의 2마리의 NHP (NHP_08 및 NHP_09)에서, 1:200의 항체 역가가 달성되었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 마이크로-디스트로핀 단백질의 증가된 발현은 12주차의 생검으로부터의 TPE 전 발현과 비교할 때 TPE 후 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 재투약받은 모든 NHP로부터의 조직 샘플에서 관찰되었다 (실시예 2에 기재된 바와 같이). 증가된 마이크로-디스트로핀 단백질 발현이 골격근 (예를 들어 비복근), 심장 및 횡격막에서 관찰되었다.

실시예 4

상기 실시예 2 및 3에 기재된 시험 및 연구는 서열식별번호: 9에 제시된 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물; 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 1-4977; 또는 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 56-5022를 이용하여 대안적으로 수행된다.

실시예 5

치료적 혈장 교환 (TPE) 후 기존 AAVrh.74 항체를 사용한 DMD에 대한 유전자 요법

치료적 혈장 교환 (TPE) 후 기존 AAVrh.74 항체를 갖는 환자에서 DMD의 유전자 요법을 조사하기 위해 1상 임상 시험을 인간에서 수행한다. 5회 사이클의 TPE가 AAVrh.74에 대한 결합 항체 (또한 본원에서 "항-AAVrh.74 항체"로 지칭됨)를 낮추어, AAVrh74.MHCK7.마이크로-dys를 사용하여 근육의 안전하고 효율적인 형질도입을 허용하여 기준선과 비교하여 >50%의 평균 발현 수준을 달성할 것이라는 가설이 있다.

연구 목적 및 1차 결과는 마이크로-디스트로핀 유전자 (AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀)를 운반하는 rAAV의 안전한 전달이다. 2차 목적은 DMD를 앓고 있는 대상체의 근육에서 마이크로-dys 유전자 발현 및 기능적 결과 척도로서 근이영양증에 대한 북극성 보행 평가 (NSAA)를 사용한 임상적 개선이다.

치료 계획은 AAVrh74.MHCK7.마이크로-dys의 정맥내 전달이 뒤따르는 10일 스케줄에 걸쳐 분리반출술에 의해 먼저 AAVrh.74 항체를 감소시키기 위해 안전성 및 효능 (표 1)을 병합하는 2-단계 (주) 프로토콜이다. 1주차에, TPE는 3일 동안 격일로, 예컨대 월요일 (유전자 요법의 주입일에 대해 -9일차), 수요일 (-7일차) 및 금요일 (-5일차)에 투여된다. 2주차에, TPE를 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 정맥내 주입에 의해 2일 동안 격일로 예컨대 월요일 (-2일차), 수요일 (1일차)에 투여하고, TPE 후 동일한 날에 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 (1일차)을 전달한다. 환자를 표 1의 스케줄에 따라 외래 환자 분리반출술 유닛으로 이송한다. 환자는 입원 환자 유전자 요법 주입을 위해 1일차에 소아 집중 치료실 (PICU)에 입원하고, 2일차에 퇴원할 계획이다.

표 1. 분리반출술 스케줄

* 절차 전 Lab은 피브리노겐 및 차등을 갖는 CBC 및 혈소판; 절차 동안 주기적으로 측정되는 이온화된 칼슘을 포함한다.

** 유전자 전달을 허용하기 위한 AAVrh.74 항체 수준 <1:100

*** 유전자 전달

****대기 스케줄

이 프로토콜은 IgG 항체의 동역학에 기반하여 개발되었으며, 48시간 후 반동이 있으며, 이전 절차로부터 제거된 항체의 대략 50-60%를 되찾았다는 것을 보여주며; 그러므로 TPE의 최종 일 (유전자 요법과 관련하여 1일차로 지정됨)의 유전자 전달이 뒤따르는 격일로 10일 과정에 걸쳐 TPE를 지원한다 (도 13 및 부피 교환 참조). 이들 절차의 시기는 다른 공지된 항체-매개 의학적 병태에 대한 유사한 과정을 따른다 (Padmanabhan et al., J Clin Apheresis 34:171-354, 2019).

이 프로토콜은 새로운 적응증에 대해 개발되었기 때문에, 5-6 (Padmanabhan et al., J Clin Apheresis 34:171-354, 2019) 내지 5-7 치료 (Pham et al., Transfusion and Apheresis Science 58:237-246, 2019)를 반복적으로 권장하는 이전에 확립된 가이드라인을 따르는 것이 적절하다. 면역 저해를 위해 프레드니손을 복용하는 이 프로토콜에서 대상체에게 적용되는 추가 지원은 하기와 같이 언급한다: "공동 면역저해 요법의 결과로, 이뮤노글로불린의 무시가능한 생산률, 및 시간당 대략 1 내지 2 퍼센트의 혈관외 대 혈관내 평형 비율을 가정하면, 총 초기 신체 이뮤노글로불린 부담의 90 퍼센트를 제거하기 위해 7 내지 10일에 걸쳐 5개의 별도의 절차가 필요하다. 새로운 항체 생산이 발생하면 추가 치료가 필요할 수 있다. (Fridey & Kaplan Therapeutic apheresis (plasma exchange or cytapheresis): Indications and technology. American Society for Apheresis Guidelines UPTODATE May 2020 (온라인 이용가능) (Kaplan et al. J Clin Apheresis 28:3-10, 2013)

프로토콜

이 프로토콜에 대한 환자 특징:

포함 기준

· 보행가능한 남성 대상체, 임의의 인종 그룹, 스크리닝 시점에 4-10세 포함

· 확인된 DMD 프레임시프트 또는 조기 정지 코돈 유전자 돌연변이

· CK >1000 U/L

· 증상이 있는 질환을 나타내는 100m 걷기 테스트에서 연령에 대해 예측된 95번째 백분위수 미만

· 운동 평가 테스트에 협력하는 능력

· 달리기, 점프 및 계단 오르기의 어려움 이력에 기반하여 입증된 약화

· 스크리닝 전 적어도 12주 동안 경구용 코르티코스테로이드와 동등한 안정적 용량 및 용량은 연구 전반에 걸쳐 일정하게 유지할 것으로 예상된다 (체중 변화를 수용하기 위한 잠재적 변형 제외)

· 기준선 스크리닝 (-40일차 내지 -10일차)에서 ELISA 면역검정에 의해 결정된 바와 같은 AAVrh.74 항체 역가 > 1:400을 갖는 환자

배제 기준

· LVEF < 40%를 갖는 ECHO를 포함하는 심근병증 징후

· 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염 또는 B형 또는 C형 간염 감염의 혈청학적 증거

· 자가면역 질환의 진단 (또는 진행 중인 치료)

· 임상적으로 유의한 것으로 간주되는 비정상적인 실험실 값 (감마-글루타밀 트랜스퍼라제, > 3 × 정상 상한, 빌리루빈 ≥ 3 mg/dL, 크레아티닌 ≥ 1.8 mg/dL, 헤모글로빈 < 8 또는 > 18 g/dL, 백혈구 수 > 18,500/cmm, 혈소판 ≤ 50,000/마이크로리터.

· PI의 의견에 따라 유전자 전달에 불필요한 위험을 초래하는 수반되는 질병 또는 만성 약물 치료가 필요한 경우.

· 이전 4주 이내의 중증 감염 (예를 들어, 폐렴, 신우신염 또는 수막염).

· 스크리닝 6개월 이내에 임의의 임상시험용 약제 (코르티코스테로이드 제외) 또는 엑손 스키핑 약제 (엑손디스(EXONDYS) 51® 포함)를 실험적이든 아니든 받았다.

· 임의의 유형의 유전자 요법, 세포-기반 요법 (예를 들어, 줄기 세포 이식) 또는 CRISPR/Cas9 요법을 받았다.

· 가족은 주치의 및 다른 의료 제공자에게 환자의 연구 참여를 개시하기를 원하지 않는다.

스크리닝/기준선 기간

스크리닝/기준선 기간은 -9일차 전 최대 4주이다. 동의서를 얻은 후, 환자를 적격성에 대해 평가한다. 스크리닝은 인구통계 및 병력 수집, 활력 징후 측정, 신체 검사, 심전도 (ECG) 및 심초음파도 (ECHO) 및 심장 MRI를 포함한다. 임상 및 안전성 실험실 평가를 위해 혈액 및 소변 샘플을 수집한다. 혈액 샘플은 또한 B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 AAVrh.74에 대한 항체 및 AAVrh.74 캡시드 및 마이크로-디스트로핀에 대한 항원-특이적 T-세포에 대해 수집한다. 전처리 근육 생검은 비복근, 또는 연구 책임자 (PI)에 의해 선택된 근육을 포함하고, 적격성 후 그러나 -9일차 전에 수행된다. 부모/간병인은 PROMIS 설문지를 작성하도록 요청받는다. 신체 기능 평가는 근이영양증에 대한 북극성 보행 평가 (NSAD), 및 바닥에서 일어나기, 4 표준 계단 오르기, 10-미터 및 100-미터 걷기/달리기 테스트를 포함하는 시한-기능적 테스트를 포함한다.

치료적 혈장 교환

TPE는 환자 혈장의 제거 및 5% 알부민으로의 대체를 포함한다. 신선 동결 혈장 (FFP)은 환자 안전성을 위해 필요한 경우 임의의 TPE 절차 동안 사용될 수 있다. 혈장 교환 동안 제거된 혈장은 미국 식품의약국 (FDA)의 규정에 따라 또 다른 개체에게 수혈하는데 사용되지 않는다.

프로토콜

TPE는 가능한 경우 말초 정맥을 통해 수행된다. 더 가능성이 높은 환자는 중재 방사선과의사에 의해 삽입된 터널형 중심선을 갖게 될 것이다. 부모는 약속 사이에 카테터를 관리하는 방법에 대해 지시받는다.

부피 교환 -

절차당 1.0 내지 1.5 혈장 부피 교환의 혈장 교환을 수행한다. 단일 혈장 교환은 혈장 거대분자 수준을 63%만큼 낮춘다 (J Clin Apheresis 2019;34:171-354). 혈관내 및 혈관외 구획 둘 다에 분포된 IgG 항체는 총 체내 저장량을 감소시키기 위해 다중 교환을 필요로 하며, 대개 두 구획 사이에 재분포를 허용하도록 격일로 수행된다. 처음 1.0 내지 1.5 혈장 부피의 교환은 표적 물질의 가장 높은 부피를 제거하며, 각 후속 교환으로 제거되는 양을 감소시킨다. 각 단일 혈장 부피 교환에 대해, 동일한 부피의 대체 유체가 사용된다. 이 프로토콜의 경우, 5% 알부민이 대체 유체로서 사용된다.

지속적인 반응을 수득하기 위해 면역저해 레지멘이 권고된다. 면역 저해 없이는 교환 후 반동이 있을 수 있지만 이 프로그램에 참여하는 모든 DMD 소년은 질환에 대한 표준 치료로서 글루코코르티코이드를 투여받게 될 것이다. 혈장 교환을 위한 실험 프로토콜 동안, 환자는 TPE 전 1일에 글루코코르티코이드 (프레드니손 1 mg/kg 또는 등가의 코르티코스테로이드)를 투여받는다. PI가 조기 테이퍼링이 환자에게 최선의 이익이라고 판단하지 않는 한, 환자는 유전자 전달 후에 유전자 전달 후 적어도 60일 동안 이 용량을 유지할 것이다 (표 1).

환자의 추가 관심사항으로, 유전자 전달을 지연시키고 유전자 요법이 진행되는 것을 허용하도록 #7 TPE를 제공할 수 있는 대체 계획 ("대기 스케줄"로 지칭됨)이 제공된다. 표적 AAVrh.74 역가가 분리반출술 #4 후 -1일차에 도달하지 않으면, TPE #5는 수행될 것이나 유전자 전달은 진행되지 않을 것이다. AAV 항체 수준을 2일차 (목요일)에 수득한 후, 금요일에 분리반출술, TPE#6 및 유전자 전달을 수행한다. 그러나, 역가가 목요일 (2일차)에 1:100의 표적에 도달하지 않으면, 금요일에 TPE 또는 유전자 전달을 진행하지 않을 것이다.

유전자 전달

이는 52주 공개-라벨 임상 시험이다. 적격성 요구사항을 충족하는 6명 내지 12명의 환자가 등록되어 IV AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 받는다. -1일차에, 외래 환자로서, 신체 검사를 수행하고 활력 징후, 혈액 샘플 및 소변 샘플을 수집한다. 1일차에, 환자는 병원에 입원한다. 제5 및 최종 TPE를 아침에 수행하고, 동일한 날 나중에 IRB 및 FDA에 의해 승인된 사전 프로토콜에 사용된 연구 운영 매뉴얼에 따라 1 내지 2시간에 걸쳐 IV 투여된 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 받는다. 주입 다음날 (2일차)에, 환자는 신체 검사를 받고, 활력 징후를 수집하고, 퇴원하기 전에 혈액 및 소변 샘플을 제공한다.

환자를 452주 동안 추적조사한 후, 5년 동안 장기간 추적조사 연구를 진행한다. 환자는 유전자 전달 후 클리닉 추적조사 방문을 완료한다: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 및 48주차 (1일차의 주입에 대해). 또한, 3 및 5주차에, 환자는 간 기능 테스트 평가를 위한 추적조사 방문을 완료한다. 모든 환자는 12주차에 수행되는 근육 생검을 받는다. 생검은 비복근 또는 PI에 의해 선택된 근육을 포함한다.

안전성을 치료-유도 유해 사건 (TEAE), SAE 및 선택된 실험실 평가의 모니터링에 의해 평가한다.

실시예 6

혈청 내 항체의 샌드위치 ELISA 결정

샌드위치 ELISA 검정을 위한 재료는 하기와 같다:

· 포획 항체 = 항-AAVrh.74 mAb

· 테스트 샘플 = 혈청 또는 혈장, 검출에 사용될 것임

· 항원 = AAVrh.74 캡시드

· 차단 용액 = 5% 분유, 1% 염소 혈청, 100mL PBS

· 세척 완충액 = 0.05% PBS-Tween

· 양성 대조군 = 항-AAVrh.74 항체를 갖는 것으로 공지된 혈청

· 2차 항체 = 항-인간-HRP 접합된 항체

· 기질 = TMB

· 정지 용액 = 황산

방법

96-웰 플레이트의 모든 웰을 4℃에서 카르보네이트 완충액에 희석된 포획 항체로 밤새 코팅한다. 내용물을 버리고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 차단 용액으로 차단한다. 포획 항체 코팅된 웰에 이중으로 AAVrh.74 캡시드를 첨가하기 위해 차단 용액을 버린다. 또한, 백그라운드 값을 결정하기 위해 카르보네이트 완충액을 복제 웰에 첨가한다. 결합되지 않은 캡시드를 버리고, 테스트 혈청을 차단 용액에서 1:25의 시작 희석으로 첨가하고 연속적으로 희석한다. 양성 대조군을 차단 용액에서 1:400 희석으로 희석한다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척한 후, 차단 용액에서 1:10,000 희석으로 2차 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고, 완충액을 버리고, 기질을 첨가한 후, 황산으로 검정을 종료한다. 플레이트 흡광도를 450nm에서 판독한다.

분석 및 결과

항원 코팅된 웰의 평균 OD에서 비-항원 코팅된 웰의 평균 광학 밀도 (OD)를 빼고 비-항원 코팅된 웰의 평균 (OD)으로 나누어 흡광도 비율을 결정한다. ≥2.00의 비율은 양성 항체 반응으로 간주된다. ≥2.00의 비율을 산출하는 마지막 혈청 희석을 식별함으로써 종점 역가를 결정한다. >1:400의 혈청 희석에서 항체 컷오프를 정의한다.

실시예 7

간접 ELISA: 혈청 내 항-AAVrh.74 항체의 결정

재료

· 항원 = AAVrh.74 캡시드

· 차단 용액 = 5% 분유, 1% 염소 혈청, 100mL PBS (칼슘 및 마그네슘 없음)

· 세척 완충액 = 0.05% PBS-Tween

· 1차 항체 = 인간 테스트 혈청 또는 혈장

· 양성 대조군 = 항-AAVrh74 mAb 또는 임의로 항-rh74 항체를 함유하는 혈청 (또는 혈장)

· 음성 대조군: 항-AAVrh74 항체가 없는 대상체로부터의 혈청은 음성 대조군으로서 포함될 수 있다

· 2차 항체 = 항-인간 항체

· 기질 = 3, 3', 5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)

· 정지 용액 = 황산

방법

카르보네이트 완충액에 희석된 2x10⁹ vg/웰의 농도로 항원으로 밤새 코팅된 96 웰 플레이트 내의 웰을 복제한다. 또한, 백그라운드를 결정하기 위해 카르보네이트 완충액을 복제 웰에 첨가한다. 항원을 버리고, 웰을 차단 용액으로 차단한다. 차단 용액을 버리고, 1차 항체 (테스트 혈청)를 차단 용액에서 1:25의 시작 희석으로 첨가하고 연속적으로 희석한다. 혈청을 사용하는 경우 1:400 희석으로 또는 예를 들어 AAVrh.74 mAb를 사용하는 경우 1:1,000 - 1:10,000 희석으로 양성 대조군을 차단 용액에 희석한다. 항-AAVrh.74 mAb의 특정한 희석은 참조로서 항-AAVrh.74 항체를 함유하는 혈청 또는 혈장을 이용하여 임의로 결정될 수 있음이 인식된다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척한 후, 차단 용액에서 1:10,000 희석으로 2차 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고, 완충액을 버리고, 기질을 첨가한 후, 황산으로 검정을 종료한다. 플레이트 흡광도를 450nm에서 판독한다.

분석 및 결과

항원 코팅된 웰의 평균 OD에서 비-항원 코팅된 웰의 평균 광학 밀도 (OD)를 빼고 비-항원 코팅된 웰의 평균 (OD)으로 나누어 흡광도 비율을 결정한다. ≥2.00의 비율은 양성 항체 반응으로 간주되며, 이러한 양성 반응을 갖는 혈장 또는 혈청 샘플은 혈청양성인 것으로 간주된다. ≥2.00의 비율을 산출하는 마지막 혈청 희석을 식별함으로써 종점 역가를 결정한다. >1:400의 혈청 희석에서 항체 역가 컷오프를 정의한다. 즉, 1:400의 혈청 희석에서 ≥2.00의 비율을 갖는 대상체는 혈청양성으로 간주되어 rAAVrh.74-기반 유전자 요법을 받는 것으로부터 배제될 것이다.

실시예 8

scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 구축

도 10에 나타낸 바와 같이 코돈-최적화된 전장 인간 SCGB cDNA를 함유하는 트랜스진 카세트를 구축하였다. 카세트는 컨센서스 코작(Kozak) 서열 (CCACC), SV40 키메라 인트론, 합성 폴리아데닐화 부위, 및 카세트의 발현을 구동하는데 사용되는 근육-특이적 MHCK7을 포함한다. 이는 근위 프로모터 (enh358MCK, 584-bp)와 함께 내인성 근육 크레아틴 키나제 유전자 내의 전사 시작 부위의 ~1.2kb 5'로부터 취한 206-bp 인핸서를 이용하는 MCK 기반 프로모터이다. 카세트를 AAV8과 93% 상동성인 자기-상보적 (sc) AAVrh.74 벡터로 패키징하였다. AAVrh.74는 특히 순환을 통해 근육으로 전달될 때 혈관 장벽을 통과할 때 안전하고 효과적인 것으로 마우스 및 비인간 영장류에서 나타났다.

참고문헌

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gagacaatat ggagaccgat acaatgtgag cggccgcaat 4740 aaaagatctt tattttcatt agatctgtgt gttggttttt tgtgtgtcta gagtcgacca 4800 gagcatggct acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta 4860 gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 4920 aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 4977 <210> 10 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 10 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln Thr Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Asp Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val Ala His Tyr Ser Asp Ser 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Polypeptide <400> 40 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 41 Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Phe 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 42 Gln Gln Arg Ser Phe Tyr Pro Phe 1 5 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 43 Gln Gln Arg Thr Tyr Tyr Pro Phe 1 5 <210> 44 <211> 2303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 44 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg 120 cggccgcaag cttgcatgtc taagctagac ccttcagatt aaaaataact gaggtaaggg 180 cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc tctatctgcc catcggccct 240 ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca tggagccaga ggggcgaggg 300 caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc tagcatgccc cactacgggt 360 ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 420 acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctctaaaa ataaccctgt 480 ccctggtgga tcccctgcat gcgaagatct tcgaacaagg ctgtggggga ctgagggcag 540 gctgtaacag gcttgggggc cagggcttat acgtgcctgg gactcccaaa gtattactgt 600 tccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca cttagtttag 660 gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg ctgggcaagc 720 tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag ctcatctgct 780 ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt aggctcctct 840 atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca gcacagacag 900 acactcagga gcagccagcg gcgcgcccag gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca 960 ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta 1020 cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccggta 1080 ccaccatggc agcagcagcc gccgcagccg ccgagcagca gtcaagcaat ggaccagtga 1140 aaaaatcaat gagagaaaaa gccgtcgaga ggagatcagt gaataaggag cacaacagca 1200 atttcaaagc cggctacatc cctattgacg aagatcgcct gcataagaca ggcctgaggg 1260 ggcgcaaagg aaacctggca atctgcgtca tcattctgct gtttatcctg gccgtgatta 1320 atctgatcat tactctggtg atttgggctg tcatccgcat tggcccaaac gggtgtgact 1380 ctatggagtt ccacgaaagt ggcctgctgc gatttaagca ggtgtccgat atgggggtca 1440 tccatccact gtacaaatct actgtcggcg ggcggagaaa cgagaatctg gtgatcaccg 1500 ggaacaatca gcccattgtg ttccagcagg gaaccacaaa gctgtctgtg gaaaacaata 1560 aaacatcaat cactagcgac attggcatgc agttctttga tccccggacc cagaatatcc 1620 tgttcagtac cgactatgag acacacgaat ttcatctgcc ttccggggtg aagtctctga 1680 acgtccagaa agccagcact gagagaatca ccagtaacgc tacatcagac ctgaatatca 1740 aggtggatgg acgagctatt gtccggggaa atgagggcgt gttcatcatg ggcaagacaa 1800 ttgaatttca catgggaggc aacatggagc tgaaagcaga aaacagcatc attctgaatg 1860 ggagcgtgat ggtctccact accagactgc ccagctcctc tagtggagac cagctggggt 1920 ccggagattg ggtcaggtat aagctgtgca tgtgtgccga tggcaccctg tttaaagtgc 1980 aggtcaccag ccagaatatg ggatgtcaga ttagcgataa cccttgtggg aatactcatt 2040 aaaagcttgg ccgcaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt 2100 gtgtcctgca ggggcgcgcc tctagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta 2160 atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 2220 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 2280 tcagtgagcg agcgagcgcg cag 2303 <210> 45 <211> 957 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Beta-sarcoglycan <400> 45 atggcagcag cagccgccgc agccgccgag cagcagtcaa gcaatggacc agtgaaaaaa 60 tcaatgagag aaaaagccgt cgagaggaga tcagtgaata aggagcacaa cagcaatttc 120 aaagccggct acatccctat tgacgaagat cgcctgcata agacaggcct gagggggcgc 180 aaaggaaacc tggcaatctg cgtcatcatt ctgctgttta tcctggccgt gattaatctg 240 atcattactc tggtgatttg ggctgtcatc cgcattggcc caaacgggtg tgactctatg 300 gagttccacg aaagtggcct gctgcgattt aagcaggtgt ccgatatggg ggtcatccat 360 ccactgtaca aatctactgt cggcgggcgg agaaacgaga atctggtgat caccgggaac 420 aatcagccca ttgtgttcca gcagggaacc acaaagctgt ctgtggaaaa caataaaaca 480 tcaatcacta gcgacattgg catgcagttc tttgatcccc ggacccagaa tatcctgttc 540 agtaccgact atgagacaca cgaatttcat ctgccttccg gggtgaagtc tctgaacgtc 600 cagaaagcca gcactgagag aatcaccagt aacgctacat cagacctgaa tatcaaggtg 660 gatggacgag ctattgtccg gggaaatgag ggcgtgttca tcatgggcaa gacaattgaa 720 tttcacatgg gaggcaacat ggagctgaaa gcagaaaaca gcatcattct gaatgggagc 780 gtgatggtct ccactaccag actgcccagc tcctctagtg gagaccagct ggggtccgga 840 gattgggtca ggtataagct gtgcatgtgt gccgatggca ccctgtttaa agtgcaggtc 900 accagccaga atatgggatg tcagattagc gataaccctt gtgggaatac tcattaa 957 <210> 46 <211> 318 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Beta-sarcoglycan <400> 46 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gln Gln Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Pro Val Lys Lys Ser Met Arg Glu Lys Ala Val Glu Arg Arg Ser Val 20 25 30 Asn Lys Glu His Asn Ser Asn Phe Lys Ala Gly Tyr Ile Pro Ile Asp 35 40 45 Glu Asp Arg Leu His Lys Thr Gly Leu Arg Gly Arg Lys Gly Asn Leu 50 55 60 Ala Ile Cys Val Ile Ile Leu Leu Phe Ile Leu Ala Val Ile Asn Leu 65 70 75 80 Ile Ile Thr Leu Val Ile Trp Ala Val Ile Arg Ile Gly Pro Asn Gly 85 90 95 Cys Asp Ser Met Glu Phe His Glu Ser Gly Leu Leu Arg Phe Lys Gln 100 105 110 Val Ser Asp Met Gly Val Ile His Pro Leu Tyr Lys Ser Thr Val Gly 115 120 125 Gly Arg Arg Asn Glu Asn Leu Val Ile Thr Gly Asn Asn Gln Pro Ile 130 135 140 Val Phe Gln Gln Gly Thr Thr Lys Leu Ser Val Glu Asn Asn Lys Thr 145 150 155 160 Ser Ile Thr Ser Asp Ile Gly Met Gln Phe Phe Asp Pro Arg Thr Gln 165 170 175 Asn Ile Leu Phe Ser Thr Asp Tyr Glu Thr His Glu Phe His Leu Pro 180 185 190 Ser Gly Val Lys Ser Leu Asn Val Gln Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ile 195 200 205 Thr Ser Asn Ala Thr Ser Asp Leu Asn Ile Lys Val Asp Gly Arg Ala 210 215 220 Ile Val Arg Gly Asn Glu Gly Val Phe Ile Met Gly Lys Thr Ile Glu 225 230 235 240 Phe His Met Gly Gly Asn Met Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ser Ile Ile 245 250 255 Leu Asn Gly Ser Val Met Val Ser Thr Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser 260 265 270 Ser Gly Asp Gln Leu Gly Ser Gly Asp Trp Val Arg Tyr Lys Leu Cys 275 280 285 Met Cys Ala Asp Gly Thr Leu Phe Lys Val Gln Val Thr Ser Gln Asn 290 295 300 Met Gly Cys Gln Ile Ser Asp Asn Pro Cys Gly Asn Thr His 305 310 315

Claims

치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법으로서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 및 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 근이영양증이 뒤시엔느 근이영양증이고, rAAV가 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀인 방법.
제1항에 있어서, 근이영양증이 지대형 근이영양증이고, rAAV가 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 약 24시간에 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 약 14일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전에 투여되고, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 경구로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 글루코코르티코이드인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 투여 전에 항-CD20 특이적 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 rAAV 투여 전 적어도 7일에 투여되는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 rAAV 투여 전 적어도 14일에 투여되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 투여되는 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 투여 후에 항-CD20 특이적 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 rAAV 투여 후에 투여되는 것인 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 경구로 투여되는 것인 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스인 방법.
치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법으로서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV); 및 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 면역저해 레지멘은 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 rAAV는 AAVrh.74.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 근이영양증이 뒤시엔느 근이영양증이고, rAAV가 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀인 방법.
제21항에 있어서, 근이영양증이 지대형 근이영양증이고, rAAV가 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05인 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해 레지멘이 항염증성 스테로이드, 항-CD20 항체 및 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전 약 24시간에 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 전에 투여되고, 항염증성 스테로이드가 rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 경구로 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 글루코코르티코이드인 방법.
제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트인 방법.
제21항 내지 제295항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 rAAV 투여 전에 투여되는 것인 방법.
제30항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 rAAV 투여 전 적어도 14일에 투여되는 것인 방법.
제30항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해 레지멘이 rAAV 투여 후에 항-CD20 특이적 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 항체가 혈관내 주입에 의해 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙인 방법.
제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해 레지멘이 rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 경구로 투여되는 것인 방법.
제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스인 방법.
치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법으로서, AAVrh.74.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV); 및 면역저해 레지멘을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 면역저해 레지멘은 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
i) rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 경구로 투여하고, rAAV 투여 후 1일 내지 30일에 또는 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여하는 단계,
ii) rAAV 투여 전 약 14일에, rAAV 투여 전 약 7일에 및 rAAV 투여 약 24시간 이내에 항-CD20 항체를 정맥내로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 항-CD20 항체를 투여하는 단계,
iii) rAAV 투여 전 적어도 3일 동안 적어도 1일 1회 면역저해성 마크롤라이드를 경구로 투여하고, 임의로, rAAV 투여 후에 면역저해성 마크롤라이드를 투여하는 단계.
제40항에 있어서, 근이영양증이 뒤시엔느 근이영양증이고, rAAV가 AAVrh.74.MHCK7.마이크로디스트로핀인 방법.
제40항에 있어서, 근이영양증이 지대형 근이영양증이고, rAAV가 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05인 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트인 방법.
제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 특이적 항체가 리툭시맙, 오크렐리주맙 또는 오파투무맙인 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 면역저해성 마크롤라이드가 타크롤리무스, 피메크롤리무스 또는 시롤리무스인 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 프레드니솔론이고, 항-CD20 항체가 리툭시맙이고, 면역저해성 마크롤라이드가 시롤리무스인 방법.
치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법으로서, AAVrh.74.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 제2 용량의 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 TPE에 적용되기 전에 rAAV의 제1 용량을 투여받은 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법:
a) AAVrh.74.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 아데노-연관 바이러스의 제1 용량을 투여하는 단계;
b) 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계, 및
c) rAAV의 제2 용량을 투여하는 단계.
제47항 또는 제48항에 있어서, 근이영양증이 뒤시엔느 근이영양증이고, rAAV가 AAVrh.74.MHCK7.마이크로디스트로핀인 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 근이영양증이 지대형 근이영양증이고, rAAV가 AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 및 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05인 방법.
제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 혈장이 rAAV의 제2 용량의 투여 전에 적어도 2개의 TPE 또는 적어도 3개의 TPE에 적용되는 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 근이영양증을 치료하는 방법으로서:
a) 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 투여 전에 대상체의 혈장을 적어도 하나의 치료적 혈장 교환 (TPE)에 적용하는 단계
b) rAAV를 투여하는 단계,
여기서 rAAV는 rAAV.MHCK7.마이크로디스트로핀, AAVrh.74.tMCK.CAPN3, rAAVrh.74.MHCK7.DYSF, scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG, AAVrh74.tMCK.hSCGA, scAAVrh74.MHCK7.HSGCB 또는 rAAVrh.74.MHCK7.huAN05인
방법.
제52항에 있어서, 대상체의 혈장이 rAAV 투여 전에 적어도 2개의 TPE, 적어도 3개의 TPE, 적어도 4개의 TPE, 적어도 5개의 TPE, 적어도 6개의 TPE 또는 적어도 7개의 TPE에 적용되는 것인 방법.
제52항 또는 제53항에 있어서, 대상체의 혈장이 rAAV 투여 전 적어도 9일 동안, 투여 전 적어도 7일 동안, 투여 전 5일 동안, 또는 투여 전 2일 동안 TPE에 적용되는 것인 방법.
제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 혈장이 rAAV가 투여되는 날에 TPE에 적용되는 것인 방법.
제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 혈장이 적어도 2개의 TPE에 적용되며, 여기서 TPE 사이에 약 48시간이 있는 것인 방법.
제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 rAAV 투여 전 약 24시간에 항염증성 스테로이드를 투여받는 것인 방법.
제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 rAAV 투여 후 1일 내지 60일에 적어도 1일 1회 항염증성 스테로이드를 투여받는 것인 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 경구로 투여되는 것인 방법.
제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 글루코코르티코이드인 방법.
제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증성 스테로이드가 프레드니손, 프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론 또는 데플라자코트인 방법.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 전신 투여 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
제62항에 있어서, 전신 투여 경로가 정맥내 경로이고, 투여되는 rAAV의 용량이 약 2x 10¹⁴ vg/kg인 방법.
제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV의 용량이 약 10 mL/kg의 농도로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 주사, 주입 또는 이식에 의해 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 대략 1시간에 걸쳐 주입에 의해 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 말초 사지 정맥을 통한 정맥내 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 혈청형 AAVrh.74인 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 서열식별번호: 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 MHCK7 프로모터 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체가 뒤시엔느 근이영양증을 앓고 있고, rAAV가 약 2x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 대략 1시간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여되고, 여기서 rAAV가 서열식별번호: 9의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 구축물 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 55-5021을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 근이영양증이 LGMD2E이고, rAAV가 scAAVrh74.MHCK7.HSGCB인 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체가 LGMD2E를 앓고 있고, rAAV가 약 2x 10¹⁴ vg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되고, 여기서 rAAV가 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 scAAVrh74.MHCK7.HSGCB인 방법.
제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 세포에서 마이크로-디스트로핀 유전자 발현 수준이 rAAV 투여 전의 마이크로-디스트로핀 유전자 발현 수준과 비교하여 rAAV 투여 후에 증가되는 것인 방법.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 혈청 또는 혈장에서 항-AAVrh.74 항체의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제77항에 있어서, 결정 단계가 면역저해 레지멘 또는 TPE의 투여 단계 전에 수행되는 것인 방법.
제78항에 있어서, 결정 단계가 상기 대상체에게 AAV의 임의의 투여 전에 수행되는 것인 방법.
제79항에 있어서, 결정 단계가 상기 대상체에게 aAAVrh.74의 투여 전에 수행되는 것인 방법.
제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정이 정량적인 것인 방법.
제81항에 있어서, 상기 대상체의 혈청 또는 혈장 내 항-AAVrh.74 항체 수준을 양성 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제82항에 있어서, 상기 양성 대조군이 항-AAVrh.74 모노클로날 항체를 이용하는 것인 방법.
제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 결정 단계가 항-AAVrh.74 모노클로날 항체를 이용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정 단계가 면역형광 검정, 면역조직화학적 검정, 웨스턴 블롯, 직접 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA, 역 ELISA, 화학발광 검정, 방사면역검정, 또는 면역침전 검정을 이용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 NYGMN (서열식별번호: 20), DYGMN (서열식별번호: 22), YTFTNYGMN (서열식별번호: 21), 및 YTFTKYGMN (서열식별번호: 23)으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR1 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 WINTYTGEPTYADDFKG (서열식별번호: 24), WINTNTGEPTYGDDFKG (서열식별번호: 25), 및 WMGWINTYTGEPTY (서열식별번호: 26)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR2 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 GVAHYSDSRFAFDY (서열식별번호: 27), GNAHPGGSAFVY (서열식별번호: 28), RGSYYYDSSPAWFAY (서열식별번호: 29), RGVDSSGYGAFAY (서열식별번호: 30), 및 TRGTSTMISTFAFVY (서열식별번호: 31)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 SVSSSVSYMH (서열식별번호: 32), SASSGVTYMH (서열식별번호: 33), SSVSYMH (서열식별번호: 34), 및 SSVRYMH (서열식별번호: 35)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL CDR1 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 YTSNLAS (서열식별번호: 36), RTSNLAS (서열식별번호: 37), LWIYSTSNLAS (서열식별번호: 38), 및 VWIYSTSNLAS (서열식별번호: 39)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL CDR2 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 QQRSSYPFT (서열식별번호: 40), QQRSTYPF (서열식별번호: 41), QQRSFYPF (서열식별번호: 42), 및 QQRTYYPF (서열식별번호: 43)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열식별번호: 10, 12, 14, 16 또는 18에 제시된 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열식별번호: 11, 13, 15, 17 또는 19에 제시된 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열식별번호: 10, 12, 14, 16 또는 18에 제시된 가변 중쇄 (VH) 서열, 및 서열식별번호: 11, 13, 15, 17 또는 19에 제시된 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 것인 방법.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정이 정량적이고, 여기서 상기 대상체가 상기 정량화에 기반하여 항-AAVrh.74 항체에 대해 혈청양성으로서 식별되고, 여기서 상기 면역저해 레지멘 또는 TPE가 혈청양성 대상체에게 선택적으로 투여되는 것인 방법.