KR20180016722A - 재조합 glut1 아데노-관련 바이러스 벡터 작제물 및 glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 Glut1 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV) 작제물 및 Glut1 결핍 포유류에서 Glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, rAAV는 닭 β-액틴 프로모터를 추가로 포함하되, rAAV는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 용기 하우징을 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 BBB에서 Glut1 수송을 회복시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 Glut1 결핍증의 치료가 필요한 대상체에서 Glut1 결핍 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 10일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/130,899호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
정부 지원의 언급
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 등록번호 R01 NS057482 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가질 수 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전체가 참고로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2016년 3월 4일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 01001-003887-WO0_SL.txt이며, 용량이 189,953 바이트이다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 재조합 Glut1 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV) 작제물 및 Glut1 결핍 포유류에서 Glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법에 관한 것이다.
글루코스는 포유류 뇌에 대한 주된 에너지 공급원이다. 용질 담체 패밀리 2로서도 알려진 글루코스 수송체 1(Glut1)은 혈액-뇌 장벽(BBB)에서 발현된 우세한 글루코스 수송체이며, 뇌로의 글루코스 유입을 초래하고, 가능하게 된 글루코스 수송체 패밀리의 처음으로 동정된 구성원(SLC2A)이다. Glut1 단백질을 암호화하는 인간 유전자 SLC2A1은 염색체 1(1p34.2)의 짧은 아암(arm)으로 국소화되었고, 길이가 35kb이며, 492개 아미노산의 단백질을 암호화하는 10개 엑손을 함유한다(서열번호 79). 단백질은 인간, 래트, 마우스 및 돼지를 포함하는 상이한 종 중에서 고도로 보존된다. mGlut1 단백질을 암호화하는 마우스 Slc2a1 유전자는 염색체 4에 대해 국소화되며, 인간 SLC2A1에 대해 매우 유사한 유전자 구조를 가진다(마우스 게놈 정보학)(492개의 아미노산 mGlut1 서열은 서열번호 78이다). 마우스 Slc2a1 cDNA(NM 011400)는 인간 SLC2A1cDNA에 대해 97% 초과로 동일하다. (문헌[Mueckler M et al, 1985; Veggiotti, P et al, 2013; Seidner et al, 1998] 참조).
Glut1 결핍 증후군(Glut1 DS, OMIM 606777)은 SLC2A1 유전자의 단상 부족에 의해 야기되는 희귀하지만 쇠약하게 하는 아동기의 신경학적 장애이다. Glut1 결핍 증후군은 상염색체-우성 장애이다. 가장 우세한 환자 표현형은 영아 발작, 후천적 소두증, 발달지체 및 수액당감소증을 포함한다(De Vivo D.C. et al. 1991).
질환에 대한 현재의 치료는 케톤체 생성성 식사의 사용을 포함하는데, 케톤체가 뇌에서 뉴런에 대한 대안의 에너지 공급원을 형성하기 때문이다. 그러나, 식이요법은 다량의 오일을 삼키는 것을 수반하고, 신경거동적 증상에 대해 단지 보통의 효과를 갖는 것으로 보고된다. 더 양호한 치료에 대한, 특히 환자에서 Glut1 발현을 회복하기 위한 유전자 요법에 대한 진행 중인 필요가 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 Glut1을 암호화하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 벡터(recombinant adeno-associated vector: rAAV)에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, Glut1은 서열번호 78 또는 79를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV는 닭 베타-액틴 프로모터를 추가로 포함하되, rAAV는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식유전자는 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 닭 베타-액틴 프로모터는 서열번호 31, 38, 45, 54, 62 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9이다. 특정 실시형태에서, rAAV는 서열번호 48, 56, 59, 64 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV는 miRNA 요소에 측접하는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 약제학적 담체를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 용기 하우징을 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 용기는 주사기이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 BBB를 가로지를 수 있고 또한 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는 유효량의 본 명세서에 기재된 유효량의 임의의 재조합 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 혈액 뇌 장벽(BBB)에서 Glut1 수송을 회복시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 BBB를 가로지를 수 있고 또한 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는 유효량의 본 명세서에 기재된 유효량의 임의의 재조합 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 Glut1 결핍 증후군의 치료가 필요한 대상체에서 Glut1 결핍 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 수액당감소증, 후천적 소두증, 운동실조 및 실조성 운동 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 Glut1 결핍 증후군과 관련된 증상 중 적어도 하나를 완화시키는 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 BBB를 가로지를 수 있고 또한 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는 본 명세서에 기재된 유효량의 임의의 재조합 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양상에서, 본 발명의 실시형태는 SLC2A1 유전자의 결함 또는 반수체부족성을 특징으로 하는 대상체에서 Glut1 DS를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 목적으로 하는 세포에서 Glut1 생성물을 발현시키는 프로모터 서열의 제어 하에서 정상/야생형 Glut1 단백질을 암호화하는 핵산 서열(즉, 이식유전자)을 운반하는 유효량의 재조합 아데노 관련 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터 서열은 BBB 세포 내 Glut1 생성물의 발현을 제공한다. 특정 실시형태에서, 발현은 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서이다. 특정 실시형태에서, 이식유전자의 발현은 대상체에서 목적으로 하는 Glut1 수준을 회복하거나 또는 유지하는 데 필수적인 생성물을 세포에 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 Glut1 DS의 치료를 위한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 주사에 적합한 담체 및 추가적인 성분과 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 양상 및 이점은 이의 바람직한 실시형태의 다음의 상세한 설명에서 추가로 기재된다.
도 1A 내지 도 1D는 (10개) Glut1 암호화 작제물의 플라스미드 맵을 도시한 도면. 도 1A는 2A 암호화 서열과 함께 Glut1 및 EGFP 리포터 유전자를 운반하는 2개의 EGFP-2A-Glut1 작제물을 나타낸다. 도 1B는 2가지의 Glut1-2A-EGFP 작제물을 나타낸다. 도 1C는 2가지의 천연 Glut1 작제물을 나타낸다. 도 1D는 간 조직 내 Glut1의 발현을 선택적으로 끄는(turn off) 작용을 하는 miRNA-122 결합 부위 (Mir-122BS)를 운반하는 4가지 작제물을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2C는 시험관내 CHO 세포 분석에서 AAV9-hGlut1-eGFP(서열번호 80) 작제물 및 Glut1 기능의 발현을 나타내는 블롯 및 그래프를 도시한 도면. 도 2A는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물의 발현을 입증하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 2B는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물로 형질감염된 CHO 세포 내로의 글루코스의 향상된 흡수를 나타내고; 기능성 분석에서 그의 수행 능력을 입증하는 그래프를 나타낸다. 도 2C는 CHO 세포 내로 형질감염 후에 작제물의 GFP 형광을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3B는 Glut1 DS 마우스 내로 뮤린 slc2a1 유전자의 재도입 후에 향상된 운동 성능을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 도 3A는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리 돌연변이체 마우스에서 개선된 로타로드(rotarod) 수행을 나타내는 그래프이다. 도 3B는 처리된 돌연변이체 마우스에서 mGlut1의 회복 후 개선된 수직 폴 클라이밍(vertical pole climbing)을 나타내는 그래프이다.
도 4A 내지 도 4B는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리된 마우스에서 Glut1의 향상된 조직 특이적 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 도 4A는 처리된 돌연변이체 및 적절한 대조군에서 상대적 slc2a1 유전자 발현을 나타내는 그래프이다. 도 4B는 야생형 Glut1+/+ 마우스의 발현 백분율로서 Glut1 발현을 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 AAV9-mGlut1-처리 돌연변이체 마우스에서 증가된 Glut1 단백질 및 CSF 글루코스 수준을 나타내고; Glut1의 회복이 Glut1 DS 모델 마우스에서 수액당감소증을 완화시킨다는 것을 나타내는 블롯 및 그래프이다. 도 5a는 처리된 Glut1 DS 돌연변이체 마우스 및 적절한 대조군의 뇌 조직에서 Glut1 단백질의 웨스턴 블롯이다. 도 5b는 처리 Glut1 DS 돌연변이체 마우스 및 대조군에서 단백질 수준의 정량화를 나타내는 그래프이다. 도 5c는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리 마우스 및 대조군에서 혈액 및 CSF 글루코스 농도를 나타내는 그래프이다. 도 5d는 다양한 마우스에서 CSF:혈당 농도의 비를 나타내는 상자 수염도이다. 주의: N.S. - 유의하지 않음, *, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001, 일원 ANOVA, N ≥8.
도 2A 내지 도 2C는 시험관내 CHO 세포 분석에서 AAV9-hGlut1-eGFP(서열번호 80) 작제물 및 Glut1 기능의 발현을 나타내는 블롯 및 그래프를 도시한 도면. 도 2A는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물의 발현을 입증하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 2B는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물로 형질감염된 CHO 세포 내로의 글루코스의 향상된 흡수를 나타내고; 기능성 분석에서 그의 수행 능력을 입증하는 그래프를 나타낸다. 도 2C는 CHO 세포 내로 형질감염 후에 작제물의 GFP 형광을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3B는 Glut1 DS 마우스 내로 뮤린 slc2a1 유전자의 재도입 후에 향상된 운동 성능을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 도 3A는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리 돌연변이체 마우스에서 개선된 로타로드(rotarod) 수행을 나타내는 그래프이다. 도 3B는 처리된 돌연변이체 마우스에서 mGlut1의 회복 후 개선된 수직 폴 클라이밍(vertical pole climbing)을 나타내는 그래프이다.
도 4A 내지 도 4B는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리된 마우스에서 Glut1의 향상된 조직 특이적 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 도 4A는 처리된 돌연변이체 및 적절한 대조군에서 상대적 slc2a1 유전자 발현을 나타내는 그래프이다. 도 4B는 야생형 Glut1+/+ 마우스의 발현 백분율로서 Glut1 발현을 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 AAV9-mGlut1-처리 돌연변이체 마우스에서 증가된 Glut1 단백질 및 CSF 글루코스 수준을 나타내고; Glut1의 회복이 Glut1 DS 모델 마우스에서 수액당감소증을 완화시킨다는 것을 나타내는 블롯 및 그래프이다. 도 5a는 처리된 Glut1 DS 돌연변이체 마우스 및 적절한 대조군의 뇌 조직에서 Glut1 단백질의 웨스턴 블롯이다. 도 5b는 처리 Glut1 DS 돌연변이체 마우스 및 대조군에서 단백질 수준의 정량화를 나타내는 그래프이다. 도 5c는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리 마우스 및 대조군에서 혈액 및 CSF 글루코스 농도를 나타내는 그래프이다. 도 5d는 다양한 마우스에서 CSF:혈당 농도의 비를 나타내는 상자 수염도이다. 주의: N.S. - 유의하지 않음, *, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001, 일원 ANOVA, N ≥8.
SLC2A1(또한 Glut1로서 지칭됨) 유전자 내 돌연변이는 Glut1 결핍 증후군(Glut1 DS)(희귀하지만, 엄청난 손상을 가하는 장애)을 초래한다(De Vivo D.C. et al. 1991). 야생형 Glut1 단백질은 광범위하게 발현된다. 그러나, 그의 우세한 세포 작용 부위는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 글루코스의 촉진된 수송에서 작용하는 뇌 미세 혈관의 내피세포가 되는 것으로 나타난다. 단백질의 감소된 수준 또는 상실은 복잡한 표현형을 초래하는데, 이의 특징은 수액당감소증, 발달지체 및 후천적 소두증을 포함한다. 환자는 또한 운동실조뿐만 아니라 근긴장 이상인 운동 표현형을 나타낸다. slc2a1 유전자에 대한 마우스 반가불충분성(haploinsufficient)은 인간 질환의 다수의 특징을 나타낸다. 뮤린 slc2a1 유전자의 동형 접합적 넉아웃은 배아 치명적이다. 반가불충분성 동물 모델은 인간 질환의 다수의 양상을 나타낸다. 본 발명은 뇌에서 Glut1 단백질 발현을 회복하기 위해 AAV9-Glut1 작제물을 이용하는 것에 관한 것이다. 이러한 방법 및 AAV9-Glut1 작제물은 인간 질환에 대해 효과적인 치료일 수 있다는 것이 예상된다. 참고의 용이함을 위해, 본 명세서에 기재된 벡터 작제물은 다양한 AAV9-Glut1 작제물로서 지칭되는데, 이는 요소들 중에서도 마우스 또는 인간 Glut1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV9 작제물을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 SLC2A1은 인간 유전자를 지칭하는 반면, slc2a1은 각각의 Glut1 단백질을 암호화하는 마우스 유전자를 지칭한다.
정의
따라서 본 발명은 이하에 구체적으로 정의되는 특정 기술적 및 과학적 용어를 더 용이하게 이해할 수 있다. 본 문헌의 다른 곳에서 구체적으로 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다.
첨부된 청구범위를 포함하는 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단어의 단수 형태는 달리 문맥이 명확하게 표시하지 않는 한 그들의 대응하는 복수의 언급을 포함한다.
"활성화", "자극" 및 "치료"는 세포에 또는 수용체에 적용될 때, 문맥에 의해 다르게 또는 명확하게 표시되지 않는 한, 예를 들어 리간드에 의한 세포 또는 수용체의 활성화, 자극 또는 치료와 같은 동일한 의미를 가질 수 있다. "리간드"는 천연 및 합성 리간드, 예를 들어, 사이토카인, 사이토카인 변이체, 유사체, 뮤테인, 및 항체로부터 유래된 결합 성분을 포함한다. "리간드"는 또한 소분자, 예를 들어, 사이토카인의 펩타이드 모방체 및 항체의 펩타이드 모방체를 포함한다. "활성화"는 내부 메커니즘뿐만 아니라 외부 또는 환경 인자에 의해 조절되는 세포 활성화를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 "반응"은 변화가 활성화, 자극 또는 치료와, 또는 유전적 프로그래밍과 같은 내부 메커니즘과 상관관계가 있는 경우, 생화학적 또는 생리학적 거동의 변화, 예를 들어, 농도, 밀도, 생물학적 구획 내의 부착 또는 이동, 유전자 발현 속도, 또는 분화 상태를 포함한다.
분자의 "활성"은 리간드에 또는 수용체에, 촉매적 활성에 대한 분자의 결합; 유전자 발현 또는 세포 신호전달, 분화 또는 성숙을 자극하는 능력; 항원 활성, 다른 분자의 활성 조절 등을 기재하거나 또는 지칭할 수 있다. 분자의 "활성"은 또한 세포 대 세포 상호작용을 조절하거나 또는 유지함에 있어서의 활성, 예를 들어, 세포 구조를 유지함에 있어서의 부착 또는 활성, 예를 들어, 세포막 또는 세포골격을 지칭할 수 있다. "활성"은 또한 특이적 활성, 예를 들어, [촉매적 활성]/[㎎ 단백질] 또는 [면역학적 활성]/[㎎ 단백질], 생물학적 구획 내 농도 등을 의미할 수 있다. "활성"은 선천성 또는 적응 면역계의 성분 조절을 지칭할 수 있다.
"투여" 및 "치료"는 그것이 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 약제, 치료제, 진단제의 접촉을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는, 예를 들어, 치료적, 약동학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라 유체가 세포와 접촉되는 경우 유체에 대한 시약의 접촉을 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단, 결합, 결합 화합물에 의한 또는 다른 세포에 의한, 예를 들어, 세포의 시험관내 또는 생체밖 치료를 의미한다. 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 더 바람직하게는 포유류(예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간 환자를 포함하여 인간을 포함한다.
"치료하다" 또는 "치료하는"은 치료제, 예컨대 본 발명의 임의의 rAAV 작제물을 함유하는 조성물을 내적으로 또는 외적으로 상기 제제가 치료적 활성을 갖는 하나 이상의 질환 증상을 갖거나, 또는 질환을 갖는 것으로 의심되거나, 또는 질환을 획득할 위험이 상승된 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 제제는 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도에 의해 이러한 증상(들)의 퇴보를 유도하는 것에 의하든 또는 이러한 증상의 진행을 저해하는 것에 의하든 치료되는 대상체 또는 집단에서 하나 이상의 질환을 완화시키는 데 유효한 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키는데 유효한 치료제의 양(또한 "치료적 유효량"으로서 지칭됨)은 질환은 질환 상태, 환자의 연령 및 체중 및 대상체에서 목적으로 하는 반응을 유발하는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화될 수 있었는지의 여부는 해당 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 숙련된 건강관리 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상적 측정에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 실시형태(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)는 모든 대상체에서 표적 질환 증상(들)을 완화시킴에 있어서 유효하지 않을 수도 있지만, 당업계에 공지된 임의의 통계학적 검정, 예컨대 스튜던트 t-검정, 카이2-검정, 만-휘트니에 따른 U-검정, 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정(H-검정), 존키어-터프스프라(Jonckheere-Terpstra) 및 윌콕슨(Wilcoxon)에 의해 결정된 바와 같은 통계학적으로 유의한 대상체의 수에서 표적 질환 증상(들)을 완화시켜야 한다.
"치료"는 인간, 수의학 또는 연구 대상체에게 적용된다면, 연구 및 진단적 적용에 대한 치료적 치료, 예방적 또는 방지적 측정을 지칭한다. "치료"는 인간, 수의학 또는 연구 대상체, 또는 세포, 조직 또는 기관에 적용된다면, 인간 또는 동물 대상체, 세포 조직, 생리적 구획 또는 생리적 유체에 적용되는 임의의 rAAV 작제물의 형질감염 또는 본 발명의 관련된 방법을 포함한다.
"단리된 핵산 분자"는 폴리뉴클레오타이드의 모두 또는 일부와 관련되지 않은 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 이들의 합성 기점 또는 일부 조합물을 의미하며, 이때 단리된 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 발견되거나, 또는 그것이 천연에서 연결되지 않은 폴리펩타이드에 연결된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정 뉴클레오타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 무손상 염색체를 포함하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 특정 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는, 특정 서열에 추가로, 10개까지 또는 심지어 20개 이상의 다른 단백질 또는 이의 일부 또는 단편에 대한 암호 서열을 포함할 수 있거나, 또는 나열된 핵산 서열의 암호 영역의 발현을 제어하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
어구 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵 생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 선택적으로 작동자(operator) 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우에, 인접하고, 리딩 상(reading phase)에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해서는 안 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실행에 따라 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 호환적으로 사용되며, 모든 이러한 표기는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 수와 관련 없이 주요 대상체 세포 및 그들로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 의도적인 또는 의도하지 않는 돌연변이에 기인하여 모든 자손이 정확히 동일한 DNA 내용물을 갖지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본래 형질전환된 세포에서 선별된 바와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 표기가 의도된다면, 문맥으로부터 분명하게 될 것이다.
재조합 AAV
일부 양상에서, 본 발명은 단리된 AAV를 제공한다. AAV에 대해 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된"은 천연 환경으로부터(예를 들어, 숙주 세포, 조직 또는 대상체로부터) 단리되거나 또는 인공적으로 생성된 AAV를 지칭한다. 단리된 AAV는 재조합 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 AAV는 본 명세서에서 "재조합 AAV"로서 지칭된다. rAAV의 이식유전자가 하나 이상의 사전결정된 조직(들)에 특이적으로 전달되도록 재조합 AAV(rAAV)는 바람직하게는 조직-특이적 표적화 능력을 가진다. AAV 캡시드는 이들 조직-특이적 표적화 능력을 결정함에 있어서 중요한 요소이다. 따라서, 표적화된 조직에 적절한 캡시드를 갖는 rAAV가 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV는 서열번호 97에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 AAV9 캡시드를 암호화하는 서열(예컨대 서열번호 96), 또는 그에 대해 실질적인 상동성을 갖는 단백질을 포함한다.
Glut1 DS를 치료하는 것과 관련하여 목적으로 하는 조직을 표적화하기 위해, 바람직한 rAAV는 본 명세서에 기재된 다양한 rAAV를 생성하는 AAV9 캡시드와 AAV2 골격의 조합이다(표 1 및 서열 목록을 참조).
목적으로 하는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 얻기 위한 방법이 기재되었다(예를 들어, 미국 특허 제2003/0138772호, 이의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 다수의 상이한 AAV 캡시드 단백질은, 예를 들어, 문헌[G. Gao, et al., J. Virol, 78(12):6381-6388 (June 2004); G. Gao, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (May 13, 2003)]; 미국 특허 제2003-0138772호, 미국 특허 제2007/0036760호, 미국 특허 제2009/0197338호에 개시된 것에서 설명되며, AAV 캡시드 단백질 및 관련된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 관한 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 현재 기재된 작제물의 요망되는 패키징 및 방법을 위해, AAV9 벡터 및 캡시드가 바람직하다. 그러나, 다른 적합한 AAV, 예컨대 rAAVrh.8 및 rAAVrh.10, 또는 다른 유사한 벡터가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 주목한다. 전형적으로, 상기 방법은 AAV 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산; 기능성 rep 유전자; AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질 내로 재조합 AAV 벡터의 패키징을 허용하는 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양시키는 단계를 수반한다.
AAV 캡시드에서 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포 내에서 배양될 성분은 도중에 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 성분 중 임의의 하나 이상(예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능)은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 필요한 성분 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 적합한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에서 필요한 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필요한 성분(들)은 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 것이다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어 하에서 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에서 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포(구성적 프로모터의 제어 하에서 E1 헬퍼 기능을 포함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 제어 하에서 rep 및/또는 cap 단백질을 포함하는 적합한 숙주 세포가 생성될 수 있다.
rAAV를 생성하기 위한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전자 요소(벡터)를 이용하여 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전자 요소는 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌[K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 제5,478,745호 참조.
일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염 방법을 이용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,001,650호에 상세하기 기재된 바와 같음, 삼중 형질감염 방법에 관한 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨). 전형적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자 내로 패키징될 재조합 AAV 벡터(이식유전자를 포함), AAV 헬퍼 기능 벡터 및 부속 기능 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 생성된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 도중에 생산적 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 작용하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열(즉, rep 및 cap)을 암호화한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출 가능한 야생형 AAV 비리온(즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하는 일 없이 효율적인 AAV 벡터 생성을 지원한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적 예는 미국 특허 제6,001,650호에 기재되어 있는 pHLP19 및 미국 특허 제6,156,303호에 기재되어 있는 pRep6cap6 벡터를 포함하며, 이들 둘 다의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다. 부속 기능 벡터는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 AAV가 복제를 위해 의존하는 세포 기능(즉, "부속 기능")에 대한 뉴클레오타이드 서열을 암호화한다. 부속 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화에 수반되는 해당 모이어티, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 산물의 합성, 및 AAV 캡시드 조립체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 AAV 복제에 필요한 해당 기능을 포함한다. 바이러스 기반 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순포진 바이러스 1형 이외), 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
형질감염된 숙주 세포에 대해, 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입되었을 때 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197] 참조. 이러한 기법은 하나 이상의 외인성 핵산, 예컨대 뉴클레오타이드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용할 수 있다.
"숙주 세포"는 관심 대상의 물질을 보유하거나 또는 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유류 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, AAV 미니유전자 플라스미드, 부속 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생성과 관련된 다른 전달 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 본래의 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우연한 또는 고의적인 돌연변이에 기인하여 본래의 모체와 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요가 있지는 않다는 것이 이해된다.
세포에 대해, 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터(예를 들어, 조직 또는 대상체로부터) 단리된 세포를 지칭한다. 용어 "세포주"는 시험관 내에서 지속적 또는 장기간의 성장 및 분화를 할 수 있는 세포 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 전구세포로부터 유래된 클론 집단이다. 자발적 또는 유도된 변화가 이러한 클론 집단의 저장 또는 전달 동안 핵형에서 일어날 수 있다는 것이 추가로 알려져 있다. 따라서, 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지 않을 수도 있는 것으로 언급되고, 세포주는 이러한 변이체를 포함하는 것으로 언급된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 세포"는 외인성 DNA 세그먼트, 예컨대 생물학적으로-활성인 폴리펩타이드의 전사 또는 생물학적으로 활성인 핵산, 예컨대 RNA의 생성을 야기하는 DNA 세그먼트가 도입되는 세포를 지칭한다.
용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 관련될 때 복제할 수 있고, 세포 사이에서 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 세그먼트가 프로모터의 전사적 제어 하에 위치되는 해당 벡터인 것으로 상정된다. "프로모터"는 유전자의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기작, 또는 도입된 합성 기작에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어 하에서" 또는 "전사 제어 하에서"는 RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하는 핵산과 관련하여 프로모터가 정확한 위치 및 배향에 있다는 것을 의미한다. 용어 "발현 벡터 또는 작제물"은 서열을 암호화하는 핵산의 일부 또는 모두가 전사될 수 있는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 발현은, 예를 들어, 전사 유전자로부터 생물학적으로-활성인 폴리펩타이드 생성물 또는 저해 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 생성하기 위한 핵산의 전사를 포함한다.
재조합
AAV
벡터
본 명세서에 기재된 "재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소로, 이식유전자(예를 들어, 암호화 Glut1) 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부(ITR)로 구성된다. 이는 캡시드 단백질 내로 패키징되고 선택된 표적 세포에 전달되는 이런 재조합 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 폴리펩타이드, 단백질, 기능성 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 저해제) 또는 관심 대상의 다른 유전자 산물(예를 들어, Glut1)을 암호화하는 벡터 서열에 대해 이종성인 핵산 서열이다. 핵산 암호 서열은 표적 조직 세포에서 이식유전자 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다.
벡터의 AAV 서열은 시스-작용성 5' 및 3' 역위 말단 반복부 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[B. J. Carter, "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)] 참조). ITR 서열은 전형적으로 길이가 약 145bp이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 암호화하는 전체 서열은, 이들 서열의 일정 정도의 약간의 변형이 허용 가능하다고 할지라도, 분자에서 사용된다. (예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)]과 같은 교재를 참조). 이러한 분자의 예는 이식유전자를 함유하는 "시스-작용성" 플라스미드이며, 이때 선택된 이식유전자 서열 및 관련된 조절 요소는 5' 및 3' AAV ITR 서열에 측접한다. AAV ITR 서열은 현재 동정된 포유류 AAV 유형을 포함하는 임의의 공지된 AAV로부터 얻을 수 있다.
재조합 AAV 벡터에 대해 상기 확인한 요소에 추가로, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 또는 본 발명에 의해 생성된 바이러스에 의해 감염된 세포에서 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 대상의 유전자와 인접한 발현 제어 서열과 도중에 또는 관심 대상의 유전자를 제어하기 위한 거리에서 작용하는 발현 제어 서열을 둘 다 포함한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉., 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요할 때 암호화된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직 특이적인 프로모터를 포함하는 매우 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 핵산 서열(예를 들어, 암호 서열) 및 조절 서열은 조절 서열의 영향 또는 제어 하에서 핵산 서열의 발현 또는 전사를 위치시키는 방법으로 그들이 공유적으로 연결될 때 작동 가능하게 연결되는 것으로 언급된다. 핵산 서열이 기능성 단백질로 번역되는 것이 요망된다면, 두 DNA 서열은 5' 조절 서열 내 프로모터의 유도가 암호 서열의 전사를 초래한다면, 그리고 두 DNA 서열 사이의 연결 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하거나, (2) 암호 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하거나, 또는 (3) 단백질로 번역될 대응하는 RNA 전사체의 능력을 방해한다면, 작동 가능하게 연결되는 것으로 언급된다. 따라서, 얻어진 전사체가 목적으로 하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되도록 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사를 달성할 수 있다면, 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, 2 이상의 암호 영역은, 통상적인 프로모터로부터의 그들의 전사가 프레임 내에서 번역되는 2 이상의 단백질의 발현을 초래하는 방법으로 그들이 연결될 때에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 암호 서열은 융합 단백질을 수득한다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 암호 서열은 기능성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 수득한다.
단백질을 암호화하는 핵산에 대해, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 이식유전자 서열 다음에 그리고3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 발명에서 유용한 rAAV 작제물은 또한 프로모터/인핸서 서열과 이식유전자 사이에 바람직하게 위치되는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되고, SV-40 T 인트론 서열로서 지칭된다. 사용될 수 있는 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)이다. 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩타이드를 생성하기 위해 IRES 서열을 사용한다. 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 단백질을 생성하기 위해 IRES 서열을 사용한다. 이들 및 다른 통상적인 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 다수의 이러한 서열을 이용 가능하다[예를 들어, 문헌[Sambrook et al, 및 그의 참고문헌, 예를 들어, 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조]. 일부 상황에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 폴리단백질에 포함될 수 있으며, 이는 폴리단백질의 절단을 매개하는 것으로 나타난 작은 펩타이드(길이가 대략 18개 아미노산)이다(Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 벡터(AAV 및 레트로바이러스)를 포함하는 인공 시스템에서 이전에 입증되었다(Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; 및 Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).
숙주 세포에서 유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 특성은 종, 조직 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 필요하다면, 전사 및 번역의 개시에 각각 연루된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 포함한다. 특히, 이러한 5' 비전사 조절 서열은 작동 가능하게 결합된 유전자의 전사적 제어를 위해 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 필요하다면 인핸서 서열 또는 상류의 활성체 서열을 포함한다. 벡터는 선택적으로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다.
구성적 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 지님), 거대세포바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 지님)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 다이하이드로엽산 환원효소 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EFla 프로모터[인비트로젠(Invitrogen)]를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인성으로 공급된 화합물, 환경 인자, 예컨대 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 인비트로젠, 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 외인성으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제 시스템(Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도 시스템(Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조), RU486-유도성 시스템(Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 본 내용에서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해 또는, 복제 세포에서만 조절되는 것이다.
다른 실시형태에서, 이식유전자에 대한 천연 프로모터, 또는 이들의 단편이 사용될 것이다. 천연 프로모터는 이식유전자의 발현이 천연 발현을 모방하여야 하는 것이 요망될 때 바람직하다. 이식유전자의 발현이 일시적으로 또는 진행적으로, 또는 조직 특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 할 때, 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 공통 서열은 천연 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적인 조직-특이적 조절 서열은 다음의 조직 특이적 프로모터: 뉴런, 예컨대 뉴런 특이적 엔올라제(NSE) 프로모터(Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경세사 경쇄 유전자 프로모터(Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. IDSA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런 특이적 vgf 유전자 프로모터(Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 뉴런 핵(NeuN), 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP), 선종성 용종증(APC), 및 이온화된 칼슘-결합 연결자 분자 1(Iba-1)로부터 선택된 유전자의 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위는 이식유전자, 예를 들어, 비-CNS 조직을 보유하는 대상체의 하나 이상의 조직에서 이식유전자의 발현을 저해하기 위해 rAAV 벡터의 이식유전자 내에 혼입된다. 당업자는 결합 부위가 조직 특이적 방식으로 이식유전자의 발현을 제어하기 위해 선택될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 이식유전자로부터 발현된 mRNA가 간에서 miR-122에 결합되고 이에 의해 저해되도록 miR-122에 대한 결합 부위를 혼입함으로써 간에서의 이식유전자 발현은 저해될 수 있다. 이식유전자로부터 발현된 mRNA가 심장에서 miR-133a 또는 miR-1에 결합하고, 이에 의해 저해되도록 심장 내 이식유전자의 발현은 miR-133a 또는 miR-1에 대한 결합 무위를 혼입함으로써 저해될 수 있다. mRNA 내의 miRNA 표적 부위는 5' UTR, 3' UTR에 또는 암호 영역에 있을 수 있다. 전형적으로, 표적 부위는 mRNA의 3' UTR에 있다. 더 나아가, 다중 miRNA가 동일 또는 다중 부위를 인식함으로써 mRNA를 조절하도록 이식유전자가 설계될 수 있다. 다중 miRNA 결합 부위의 존재는 다중 RISC의 협동 작용을 초래하고, 발현의 고도로 효율적인 저해를 제공할 수 있다. 표적 부위 서열은 총 5 내지 100, 10 내지 60개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 부위 서열은 표적 유전자의 결합 부위 서열의 적어도 5개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
이식유전자 암호 서열
rAAV 벡터의 이식유전자 서열의 조성은 얻어진 벡터가 놓이는 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 이식유전자 서열 중 하나의 유형은 발현 시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 다른 예에서, 이식유전자는 치료적 Glut1 단백질 또는 치료적 기능성 RNA를 암호화한다. 다른 예에서, 이식유전자는 연구 목적을 위해 사용되도록, 예를 들어, 이식유전자를 보유하는 신체 유전자이식 동물 모델을 생성하도록, 예를 들어, 이식유전자 산물의 기능을 연구하도록 의도되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되도록 의도되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 적절한 이식유전자 암호 서열은 당업자에게 명확할 것이다.
일부 양상에서, 본 발명은 포유류에서의 SLC2A1 유전자 결함(예를 들어, 유전성 유전자 결함, 체세포 유전자 변경), 예컨대, 대상체에서 Glut1 폴리펩타이드 결핍증을 초래하는 유전자 결함을 예방 또는 치료하고, 특히 Glut1 결핍증 나타내는 대상체에서 결핍증의 중증도 또는 정도를 치료하거나 또는 감소시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 rAAV 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 Glut1 장애를 치료하기 위한 충분한 양 및 시간 기간 동안 이러한 장애를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에서, 상기 대상체에게 약제학적으로 허용 가능한 담체 내에서 하나 이상의 치료적 펩타이드, 폴리펩타이드, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 뉴클레오타이드 등을 암호화하는 rAAV 벡터의 투여를 수반한다.
재조합
AAV
투여
rAAV는 목적으로 하는 조직 세포를 형질감염시키기 위한 그리고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기 위한 충분한 양으로 투여된다. 통상적인 및 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로는 선택된 조직(예를 들어, 대뇌내 투여, 척추 강내 투여), 정맥내, 경구, 흡입(비강내 및 기관내 전달), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 종양내, 및 다른 비경구 투여 경로에 대한 직접 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 원한다면 투여 경로는 조합될 수 있다.
대상체에 대한 특정 rAAV의 전달은, 예를 들어, 대상체의 혈류 내로 투여에 의할 수 있다. 혈류 내로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 다른 혈관 내로 주사에 의할 수 있다. 게다가, 특정 예에서, 뇌 조직, 뇌막, 뉴런 세포, 신경교세포, 성상세포, 희돌기교세포, 뇌척수액(CSF), 사이질 공간 등에 rAAV를 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 당업계에 공지된 신경수술 기법을 이용하여, 예컨대 정위 주사에 의해 바늘, 카테터 또는 관련된 장치를 이용하여 심실 영역뿐만 아니라 선조체(예를 들어, 미상핵 또는 선조체의 피곡), 및 신경근 접합부, 또는 소뇌 소엽 내로 주사에 의해 척수 또는 뇌에 직접적으로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; 및 Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000] 참조). 특정 상황에서, 피하로, 췌장내로, 비강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 대뇌내로, 척추 강내로, 대뇌내로, 경구로, 복강내로 또는 흡입에 의해 본 명세서에 개시된 적합하게 제형화된 약제학적 조성물 중에서 rAAV-기반 치료적 작제물을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미국 특허 제5,543,158호; 제5,641,515호 및 제5,399,363호(각각 그의 전문이 본 명세서에 구체적으로 포함됨)에 기재된 바와 같은 투여 양상은 rAAV를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
재조합
AAV
조성물
rAAV는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리적으로 적합한 담체 중에서(예를 들어, 조성물 중에서) 현탁된 rAAV는 대상체, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기닉픽, 햄스터, 닭, 칠면조 또는 비인간 영장류(예를 들어, 마카크)에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 rAAV를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 상이한 이식유전자를 갖도록 암호화한 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다.
적합한 담체는 rAAV가 지시하는 표시를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 식염수를 포함하는데, 이는 다양한 완충제(예를 들어, 인산염 완충 식염수)를 이용하여 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 담체는 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 발명의 제한이 아니다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 rAAV 및 담체(들)에 추가로 다른 통상적인 약제학적 성분, 예컨대 보존제 또는 화학적 아정제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 솔브산칼륨, 솔브산, 이산화황, 갈산프로필, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
목적으로 하는 효과 또는 "치료적 효과"를 달성하기 위해 필요한 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어, 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏)에서 용량 단위는 rAAV 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료 중인 특정 질환 또는 장애 및 유전자 또는 RNA 산물의 안정성을 포함하는 몇몇 인자에 기반하여 다를 것이다. 당업자는 앞서 언급한 인자에 기반한 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 rAAV 비리온 용량 범위뿐만 아니라 당업계에 잘 공지된 다른 인자를 용이하게 결정할 수 있다. 유효량의 rAAV는 일반적으로 약 109 내지 1016개 게놈 복제물/대상체를 함유하는 약 10㎕ 내지 약 100㎖ 용액의 범위에 있다. 다른 용적의 용액이 사용될 수 있다. 사용되는 용적은 전형적으로 특히 대상체의 크기, rAAV의 용량 및 투여 경로에 의존할 것이다. 예를 들어, 척추 강내 또는 대뇌내 투여에 대해, 1㎕ 내지 10㎕ 또는 10㎕ 내지 100㎕ 범위의 용적이 사용될 수 있다. 정맥내 투여에 대해, 10㎕ 내지 100㎕, 100㎕ 내지 1㎖, 1㎖ 내지 10㎖ 이상 범위의 용적이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상체마다 약 1010 내지 1012개 rAAV 게놈 복제물의 투약량이 적절하다. 특정 실시형태에서, 대상체 당 1012개 rAAV 게놈은 CNS 조직을 표적화하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서 rAAV는 대상체 당 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개 게놈의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서 rAAV는 ㎏ 당 1010, 1011, 1012, 1013 또는 1014개 게놈의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, rAAV 조성물은, 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우(예를 들어, 약 1013개 GC/㎖ 이상), 조성물 중의 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 계면활성제의 첨가, pII 조절, 염 농도 조절 등을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Wright F R, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178], 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)
다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 이용하는 것에 대한 적합한 투약 및 치료의 개발되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 변할 수 있고, 편리하게는 총 제형의 중량 또는 용적의 약 1 또는 2% 및 약 70% 내지 80% 이상일 수 있지만, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 성분을 함유할 수 있다. 자연적으로, 적합한 투약량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 얻어질 수 있도록 각각의 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 성분의 양이 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용 가능성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명뿐만 아니라 다른 약학적 고려사항과 같은 인자는 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 그 자체로, 다양한 투약량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
주사 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석의 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 그리고 오일 중에서 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 다수의 경우에, 형태는 멸균이며, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산물 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용 방지는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살 등에 의해 초래될 수 있다. 다수의 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 조성물 중에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
주사 가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 필요하다면 용액은 적절하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 충분한 식염수 또는 글루코스를 이용하여 처음에 등장성으로 제공된다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투약량은 1㎖의 등장성 NaCl 용액 중에서 용해될 수 있고, 1000㎖의 피하 주입 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에서 주사될 수 있다(예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 투약량의 일부 변화는 필연적으로 숙주 조건에 따라서 일어날 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은 임의의 사례에서 개개 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사 용액은 본 명세서에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 rAAV를 혼입한 다음, 필요하다면 멸균 여과에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 이의 이전의 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적으로 하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.
본 명세서에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로-허용 가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)을 포함하고, 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 유리 카복실기에 의해 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물, 및 유기염기, 예컨대 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제형화 시, 용액을 투약량 제형과 양립 가능한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투약 형태, 예컨대 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 보충적인 활성 성분이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다. 어구 "약제학적으로-허용 가능한"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다.
전달 비히클, 예컨대 리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 미소구체, 지질 입자, 소수포 등은 본 발명은의 조성물의 적합한 숙주 세포의 조성물의 도입을 위해 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 유래 이식유전자는 전달을 위해 지질 입자, 리포좀, 소수포, 나노구체 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 제형화될 수 있다.
이러한 제형은 본 명세서에 개시된 핵산 또는 rAAV 작제물의 약제학적으로 허용 가능한 제형의 도입에 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 최근에, 혈정 안정성 및 순환 반감기가 개선된 리포좀이 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 추가로, 잠재적 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
리포좀은 다른 절차에 의해 형질감염에 대해 정상적으로 저항하는 다수의 세포 유형에 의해 성공적으로 사용되었다. 추가로, 리포좀은 전형적인 바이러스 기반 전달 시스템인 DNA 길이 제약이 없다. 리포좀은 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사 인자 및 다른 자리 입체성 효과기를 다양한 배양 세포주 및 동물 내로 도입하기 위해 효과적으로 사용되었다. 추가로, 리포좀-매개 약물 전달의 유효성을 시험함에 있어서 몇몇 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포좀은 수성 매질 중에서 분산되는 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 멀티라멜라 구심성 이중층 소수포(또는 멀티라멜라 소수포(MLV)로 칭해짐)를 형성한다. MLV는 일반적으로 직경이 25㎚ 내지 4㎛이다. MLV의 음파처리는 코어에서 수용액을 함유하는 직경이 200 내지 500Å 범위인 작은 단일 라멜라 소수포(SUV)의 형성을 초래한다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생할 수 있는 방법으로 물질을 잡을 수 있다. 세포내 중합체 과부하에 기인하는 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기가 대략 0.1㎛)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 설계되어야 한다. 이들 필요조건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-사이아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 상정된다.
상기 기재한 전달 방법에 추가로, 숙주에 rAAV 조성물을 전달하는 대안의 방법으로서 다음의 기법이 또한 상정된다. 초음파영동(즉, 초음파)이 사용되며, 이는 순환계 내로 그리고 순환계를 통해 약물 침투 속도 및 효율을 향상시키기 위한 장치로서 미국 특허 제5,656,016호에 기재되어 있다. 상정된 다른 약물 전달 대안은 골내 주사(미국 특허 제5,779,708호), 마이크로칩 장치(미국 특허 제5,797,898호), 안과 제형(Bourlais et al., 1998), 경피 매트릭스(미국 특허 제5,770,219호 및 제5,783,208호) 및 피드백-제어 전달(미국 특허 제5,697,899호)이다.
rAAV
조성물의 전달에 관한 일반적 방법
본 발명은 rAAV 비리온을 포함하는 안정한 약제학적 조성물을 제공한다. 조성물은 냉동/해동 주기를 실시할 때 그리고 유리를 포함하는 다양한 물질로 이루어진 용기 중에서 저장될 때조차 안정하고 활성으로 남아있다.
관심 대상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 AAV 비리온은 유전자 전달을 위해, 예컨대 유전자 요법 용도에서, 유전자이식 동물의 생성을 위해, 핵산 백신 접종, 리보자임 및 안티센스 요법에서뿐만 아니라 다양한 세포 유형에 대한 시험관내 유전자의 전달을 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, rAAV 비리온은 생체내에서 또는 시험관내 형질도입 기법을 이용하여 대상체의 세포 내로 도입된다. 시험관내에서 형질도입된다면, 목적으로 하는 수용자 세포는 대상체로부터 제거되고, rAAV 비리온을 이용하여 형질도입되며, 대상체에게 재도입될 것이다. 대안적으로, 해당 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는다면, 동질유전자적 또는 이종 발생적 세포가 사용될 수 있다.
대상체에게 형질도입된 세포의 전달 및 도입을 위한 적합한 방법이 기재되었다. 예를 들어, 세포는 시험관내에서 재조합 AAV 비리온을 세포와 함께, 예를 들어, 적절한 배지에서 조합함으로써, 그리고 통상적인 기법, 예컨대 사우던 블롯 및/또는 PCR을 이용하거나 또는 선택 가능한 마커를 이용하여 관심 대상의 DNA를 보유하는 해당 세포를 선별함으로써 형질도입될 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 이하에 더 완전하게 기재되는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 상기 조성물은 다양한 경로에 의해, 예컨대 근육내, 정맥내, 동맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해, 또는 평활근 내로, 예를 들어, 카테터를 이용하여 주사에 의해, 또는 기관 내로 직접적으로 도입될 수 있다.
생체내 전달을 위해, rAAV 비리온은 약제학적 조성물 내로 제형화될 수 있고, 일반적으로 비경구로, 예를 들어, 골격근 내로 직접적으로 근육내 주사, 관절내, 정맥내 또는 기관내로 직접적으로 투여될 것이다.
적절한 용량은 특히 치료 중인 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류 또는 다른 포유류), 치료될 대상체의 연령 및 일반적 상태, 치료 중인 병태의 중증도, rAAV 비리온의 투여 방식에 의존할 것이다. 적절한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, "치료적 유효량"은 상대적으로 광범위에 속할 것이며, 이는 임상 시험을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 생체내 주사, 즉, 대상체에게 직접적으로 주사를 위해, 치료적 유효 용량은 대략 약 105 내지 1016개의 rAAV 비리온, 더 바람직하게는 108 내지 1014개의 rAAV 비리온일 것이다. 시험관내 형질도입을 위해, 세포에 전달될 유효량의 rAAV 비리온은 대략 105 내지 1013, 바람직하게는 108 내지 1013개의 rAAV 비리온일 것이다. 조성물이 대상체에게 다시 전달될 형질도입 세포를 포함한다면, 약제학적 조성물 중의 형질도입 세포의 양은 약 104 내지 1010개의 세포, 더 바람직하게는 105 내지 108 세포일 것이다. 용량은 물론 형질도입 효율, 프로모터 강도, 메시지의 안정성 및 단백질 암호화된 요법 등에 의존한다. 유효한 투약량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시험을 통해 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있다.
투약 치료는 상기 구체화된 양을 궁극적으로 전달하기 위한 단일 용량 스케줄 또는 다회 용량 스케줄일 수 있다. 게다가, 대상체는 적절하다면 다회 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 대상체에게, 예를 들어, 단일 용량으로 105 내지 1016개 rAAV 비리온, 또는 총괄적으로, 예를 들어, 105 내지 1016개의 rAAV 비리온의 전달을 초래하는 2, 4, 5, 6회 이상의 용량이 제공될 수 있다. 당업자는 투여하기 위한 적절한 다회 용량을 용이하게 결정할 수 있다.
따라서 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 관심 대상의 단백질, 즉, 당해 질환 상태의 증상을 감소시키거나 또는 개선시키기 위한 충분한 양 또는 목적으로 하는 이점을 부여하기에 충분한 양을 생성하기 위한 충분한 유전자 물질을 포함할 거싱다. 따라서, rAAV 비리온은 1회 이상의 용량으로 주어질 때 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 대상 조성물 중에 존재할 것이다. rAAV 비리온은 동결건조 제제로서 제공되고, 즉시 또는 장래의 사용을 위해 비리온-안정화 조성물 중에서 희석될 수 있다. 대안적으로, rAAV 비리온은 생성 직후에 제공되고, 장래의 사용을 위해 저장될 수 있다.
또한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제는 그 자체가 조성물을 받는 개체에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제학적 제제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 그 안에, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등이 포함될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 철저한 논의는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 특정 핵산 서열, RNA 및/또는 DNA가, 예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 증폭되는 절차 또는 기법을 지칭한다. 일반적으로, 관심 대상 영역의 말단 또는 그 이후로부터의 서열 정보를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계한다. 이들 프라이머는 증폭될 주형의 반대 가닥에 대한 서열에서 동일 또는 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오타이드는 증폭 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌[Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.)] 참조. 본 명세서에 사용된 바와 같은, PCR은 특정 핵산 조각을 증폭시키거나 생성하기 위해 프라이머 및 핵산 중합효소로서 공지된 핵산의 사용을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키는 핵산 중합효소 반응 방법의 하나의 예(그러나 유일하지는 않음)인 것으로 고려된다.
핵산
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 Glut1 단백질을 암호화하는 특정 작제물 및 핵산을 포함한다. 서열번호 28 내지 75, 및 80 내지 97, 및 특정 양상에서 서열번호 2 내지 5, 7 내지 9, 11 내지 14, 16 내지 18, 20 내지 23, 25 내지 27 및 80 내지 95 중 하나 이상을 포함하는 표 1에 열거된 선택 서열을 포함하는 특정 작제물 및 서열은 본 발명의 실시형태에서 유용할 수 있다. 예상치 못하게, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것이 목적으로 하는 수준의 Glut1을 발현시키지 않는다 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 rAAV 작제물은 핵산 서열번호 6, 15 및/또는 24이 없으며, 이들 모두는 2A 암호화 서열에 대응한다.
바람직하게는, 핵산은 낮은, 보통의 또는 고도로 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 생물학적 기능을 유지하는 Glut1 단백질을 암호화한다. 제1 핵산 분자는 제1 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건 하에서 제2 핵산 분자로 어닐링될 수 있을 때, 제2 핵산 분자에 "혼성화할 수 있다"(Sambrook, et al., 상기 참조). 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격성"을 결정한다. 전형적인 낮은 엄격 혼성화 조건은 55℃, 5X SSC, 0.1% SDS(폼아마이드 없음); 또는 42℃에서 30% 폼아마이드, 5X SSC, 0.5% SDS를 포함한다. 전형적인 보통의 엄격 혼성화 조건은 42°C에서 5X 또는 6X SSC 및 0.1% SDS와 함께 40% 폼아마이드이다. 고 엄격 혼성화 조건은 42°C에서 또는, 선택적으로, 더 고온에서(예를 들어, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃) 50% 폼아마이드, 5X 또는 6X SSC이다. 일반적으로, SSC는 0.15M NaC1 및 0.015M 시트르산 Na이다. 혼성화는 혼성화의 엄격도에 따라서, 염기 사이의 미스매치가 가능하다고 할지라도 두 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것을 필요로 한다. 핵산을 혼성화하기 위한 적절한 엄격도는 핵산의 길이 및 상보성 정도, 당업계에 잘 공지된 변수에 의존한다. 두 뉴클레오타이드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 클수록, 핵산이 혼성화할 수 있는 조건 하에 엄격도는 더 크다. 길이가 100개 초과인 뉴클레오타이드의 혼성체에 대해, 용융 온도를 계산하기 위한 식을 유도하였다(문헌[Sambrook, et al., 상기 참조, 9.50-9.51] 참조). 더 짧은 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 혼성화에 대해, 미스매치 위치는 더 중요하게 되며, 올리고뉴클레오타이드 길이는 그의 특이성을 결정한다(문헌[Sambrook, et al., 상기 참조, 11.7-11.8] 참조).
본 명세서에 제공된 mGlut1 또는 hGlut1 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 78 및 서열번호 79)에 대해 적어도 약 70% 동일한, 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 아미노산 서열을 포함하는 Glut1 폴리펩타이드는 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행할 때, Glut1 기능을 회복하는 것에 대해 상정되되, 알고리즘의 매개변수는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 가장 큰 매칭을 제공하도록 선택된다. 비교가 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 때 임의의 기준 Glut1 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 유사한, 바람직하게는 적어도 약 80% 유사한, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 유사한 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 유사한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 또한 본 발명의 작제물 및 방법에 포함되되, 알고리즘의 매개변수는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 가장 큰 매칭을 제공하도록 선택된다.
서열 동일성은 두 서열이 최적으로 정렬될 때 동등한 위치에서 두 폴리펩타이드의 아미노산이 동일한 정도를 지칭한다. 서열 유사성은 동일한 잔기 및 비동일한, 생화학적으로 관련된 아미노산을 포함한다. 유사한 특성을 공유하고, 상호 호환가능할 수 있는 생화학적으로 관련된 아미노산은 상기 논의된다.
"상동성"은 최적으로 정렬될 때 두 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 또는 두 폴리펩타이드 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 두 비교 서열 둘 다에서 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어, 각각의 두 DNA 분자 내 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 분자는 해당 위치에서 상동성이다. 상동성 백분율은 두 서열에 의해 공유되는 상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 총 수로 나누고 ×100을 한 것이다. 예를 들어, 서열이 최적으로 정렬될 때 두 서열에서 위치의 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이라면, 두 서열은 60% 상동성이다. 일반적으로, 최대 상동성 백분율을 제공하도록 두 서열이 정렬될 때 비교가 이루어진다.
다음의 참고문헌은 서열 분석을 위해 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: 문헌[BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) 핵산 Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; 및 Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].
본 발명은 또한 다양한 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하되, 숙주 세포가 벡터에 의해 형질감염될 때 핵산은 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 또한 재조합 AAV 9 및 특정 AAV2 서열뿐만 아니라 닭 -β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서의 지시 하에서 Glut-1을 발현시키기 위한 핵산 서열을 포함하는 비리온이 제공된다. 이들 작제물 내에서, rAAV2 서열은 5' 및 3' ITR 서열, 예를 들어, 서열번호 2, 9, 29, 34, 36, 41 및 표 1에 기재된 바와 같은 다른 것에 대응한다). 이들 서열은 본 발명에서 Glut-1 결핍증에 대한 치료제인 비리온을 형성하기 위해 AAV9 캡시드에 의해 패키징되었다.
약제학적 조성물 및 투여
본 발명의 조성물의 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, AAV9 벡터 또는 관련된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)] 참조.
치료제 및 진단제의 제형은, 예를 들어, 동결건조 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).
단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 투여되는 치료 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유요한 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수(LD50/ ED50)이다. 특정 양상에서, 높은 치료 지수를 나타내는 치료 조성물이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투약량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 다양한 순환 농도 내에 있다. 투약량은 사용되는 투약 형태 및 투여경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 문헌[Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (November 1, 2002))]에 따라 대상체에게 투여된다.
투여 방식은 다를 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 진피내, 골수내, 척추 강내, 직접적 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내, 흡입, 흡입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물 또는 치료제는 침습적 경로에 의해, 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다(상기 참조). 본 발명의 추가적인 실시형태에서, 조성물, 이의 치료적 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 동맥내, 관절내(예를 들어, 관절 조직에서), 종양내 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비침습적 경로(예를 들어, 경구로; 예를 들어, 알약, 캡슐 또는 정제로)에 의한 투여는 또한 본 발명의 범주 내이다.
조성물은 당업자에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 사전충전 주사기 또는 자동주사기를 포함하여 피하 주사기 바늘이 있는 주사에 의해 투여될 수 있다.
약제학적 본 발명의 조성물은 또한 무바늘 피하 주사 장치; 예컨대 미국 특허 제6,620,135호; 제6,096,002호; 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 개시된 장치를 이용하여 투여될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 목적으로 하는 표적 부위에 직접적으로 주사를 통해, 종종 데포 또는 지속 방출 제형으로 전신 방식보다는 국소로 AAV9 벡터 또는 관련된 화합물을 투여할 수 있다. 더 나아가, 예를 들어, 뇌를 표적화하는, 표적화된 약물 전달 시스템 중의, 예를 들어, 조직-특이적 항체로 코팅된 리포좀 중의 조성물을 투여할 수 있다. 리포좀은 목적으로 하는 조직에 대해 표적화되고, 이에 의해 선택적으로 취해질 것이다.
투여 요법은 치료 조성물의 혈청 또는 조직 전환율, 증상 수준 및 생물학적 기질 내 표적 세포의 접근 가능성을 포함하는 몇몇 인자에 의존한다. 바람직하게는, 투여 요법은 표적 질환 상태에서 개선을 달성하는 한편, 동시에 목적으로 하는 부작용을 최소화하기에 충분한 치료적 조성물을 전달한다. 따라서, 생물학적으로 전달되는 양은 특정 치료 조성물 및 치료 중인 병태의 중증도에 부분적으로 의존한다.
적절한 용량의 결정은 임상의에 의해, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 당업계에 알려지거나 또는 의심되는 매개변수 또는 인자를 이용하여 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적의 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 이후에 임의의 부작용에 대해 목적으로 하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 적은 증분에 의해 증가된다. 중요한 진단적 측정은, 예를 들어, 염증 또는 생성되는 염증 사이토카인 수준 증상의 측정을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물 물질은 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래되어, 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "저해하다" 또는 "치료하다" 또는 "치료"는 장애와 관련된 증상 발생의 연기 및/또는 이러한 장애의 중증도 감소를 포함한다. 상기 용어는 존재하는 제어되지 않거나 또는 원치않는 증상을 개선하며, 추가적인 증상을 예방하고, 이러한 증상의 근본적인 원인을 개선하거나 또는 방지하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 상기 용어는 장애, 질환 또는 증상을 갖거나, 또는 이러한 장애, 질환 또는 증상에 대한 가능성을 갖는 척추동물 대상체에 대해 유리한 결과가 부여되었다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치료적 유효량", "치료적 유효 용량" 및 "유효량"은 세포, 조직 또는 대상체에 대해 단독으로 또는 추가적인 치료제와 조합하여 투여될 때, 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 측정 가능한 개선 또는 이러한 질환 또는 병태의 진행을 야기하는 데 유효한 본 발명 rAAV9-Glut1 기반 화합물의 양을 지칭한다. 치료적 유효 용량은 추가로 증상의 적어도 부분적인 개선, 예를 들어, 적절한 의학적 병태의 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 이러한 병태의 치료, 치유, 예방 또는 개선 속도의 증가를 초래하는 데 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는 개개의 활성 성분에 적용될 때, 치료적 유효 용량은 해당 성분 단독을 지칭한다. 조합물에 적용될 때, 치료적 유효 용량은 조합하여, 연속적으로 또는 동시에 투여되든 치료 효과를 초래하는 활성 성분의 조합된 양을 지칭한다. 치료제의 유효량은 적어도 10%만큼; 보통 적어도 20%만큼; 바람직하게는 적어도 약 30%; 더 바람직하게는 적어도 40%, 및 가장 바람직하게는 적어도 50%만큼 진단적 측정 또는 매개변수의 개선을 초래할 것이다. 질환 중증도를 평가하기 위해 주관적 측정이 사용되는 경우에 유효량은 또한 주관적 측정의 개선을 초래할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 키트 형태에서 본 발명의 조합물의 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 명세서에 논의된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 화학치료제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분과 함께 본 명세서에 논의된 바와 같은 rAAV9-Glut1 기반 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 성분을 포함한다. rAAV9-Glut1 기반 화합물 또는 조성물 및/또는 치료제는 순수한 조성물로서 또는 약제학적 조성물 중에서 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 키트는 하나의 용기에서(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에서) 본 발명의 rAAV9-Glut1 기반 화합물/조성물 및 다른 용기에서(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에서) 이의 약제학적 조성물 및/또는 화학치료제를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 키트는 단일의 통상적인 용기에서 선택적으로, 약제학적 조성물 중에서 함께 제형화되는 1종 이상의 화학치료제 성분과 선택적으로 조합되는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 rAAV9-Glut1 기반 화합물을 포함하는 본 발명의 조합물을 포함한다.
키트가 대상체에게 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물을 포함한다면, 상기 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 피하 바늘 또는 상기 논의한 바와 같은 다른 주사 장치를 포함할 수 있다.
키트는 키트 내에 약제학적 조성물 및 투약 형태에 관한 정보를 포함하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약제학적 조성물 및 투약 형태를 효과적이고 안전하게 이용함에 있어서 환자 및 의사에게 도움을 준다. 예를 들어, 본 발명의 조합물에 관한 다음의 정보는 삽입물로 공급될 수 있다: 약동학적, 약력학, 임상 연구, 효능 매개변수, 적응증 및 용법, 금기, 경고, 주의사항, 유해 반응, 과다복용, 적절한 투약량 및 투여, 공급되는 방법, 적절한 저장 조건, 참고사항, 제조업자/유통자 정보 및 환자 정보.
일반적 방법
분자 생물학에서 표준 방법은 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 문헌[Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에서 나타나는데, 이는 박테리아 세포 및 DNA 돌연변이유발에서의 클로닝(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 글리코컨쥬게이트 및 단백질 발현(Vol. 3) 및 생물정보학(Vol. 4)을 기재한다.
면역침강법, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함하는 단백질 정제를 위한 방법이 기재된다(Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역후 변형, 융합 단백질의 생성, 단백질의 글리코실화가 기재된다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Production, purification, and fragmentation of polyclonal and monoclonal antibodies are described (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 참조] 참조). 리간드/수용체 상호작용을 특성규명하기 위한 표준 기법을 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
약어
AAV: 아데노 관련 바이러스
rAAV 재조합 아데노-관련 바이러스 또는 바이러스 벡터
BBB: 혈액 뇌 장벽
FMDV: 구제역 바이러스
GFP: 녹색 형광 단백질
Glut1: 글루코스 수송체 막 1(SLC2A1)에 의해 촉진되는 용질 운반체 패밀리 2로서도 알려진 글루코스 수송체 1은 인간에서 SLC2A1 유전자에 의해 암호화되는 단일운반체 단백질이다. Glut1은 포유류 세포의 혈장막을 가로지르는 글루코스의 수송을 용이하게 한다. Glut1은 특성규명될 첫 번째 글루코스 수송체였다. Glut1 1은 98% 상동성을 공유하는 인간 Glut1 단백질(hGlut1)(수탁 번호: NP_006507.2; 서열번호 79) 및 마우스 Glut1 단백질(mGlut1)(수탁 번호: NP_035530.2; 서열번호 78)에 의해 고도로 보존된다. Glut1은 다른 Glut와 40% 상동성을 나타낸다.
SLC2A1: 인간 글루코스 수송체 1(hGlut1)을 암호화하는 유전자. 인간 SLC2A1(수탁 번호: NG_008232.1; 유전자 ID - 6513).
Slc2a1: 마우스 Glut1 (mGlut1)을 암호화하는 유전자(수탁 번호: 게놈 #: NC_000070.6; 유전자 ID - 20525).
GLUT1 DS: Glut1 결핍 증후군
PND: 출생일 후
PND3: 출생 3일 후
실시예
재조합 AAV 작제물 연구
도 1A 내지 도 1B에 나타내는 바와 같은 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 암호화하는 뉴클레오타이드 카세트에 연결된 뮤린 또는 인간 SLC2A1 유전자 중 하나를 운반하는 4개의 DNA 작제물이 생성되었다. 이들 4가지 작제물은 또한 Glut1과 GFP 오픈 리딩 프레임 사이에 혼입된 구제역 바이러스(FMDV)로부터의 16개 아미노산 길이의 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 2A 펩타이드는 Glut1-GFP 융합 단백질이 Glut1 단백질의 구조 또는 활성을 변경할 가능성을 피하기 위해 작제물에 포함된다. 2A 펩타이드는 궁극적으로 성숙 FMDV 단백질을 생성하는 가공 사건의 캐스케이드에서 FMDV 폴리단백질의 1차 시스-'절단'을 매개한다(Donnelly, M.L. et al. (2001)). 이 전략은 Glut1 단백질이 그의 천연 상태에서 생성되는 작제물을 생성하는 것으로 예상된다. 그러나, 이하에 기재하는 바와 같이, 이들 작제물 중 어떤 것도 만족스러운 수준에서 Glut1을 발현시키지 않았다.
6개의 추가적인 DNA 작제물은 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 없이 발생되었는데(도 1C 내지 도 1D), 이중 몇몇은 SLC2A1 유전자의 발현이 간에서 선택적으로 일어나지 않도록 제공하는 요소를 포함한다(도 1D). 이들 작제물은 장래 유전자 요법 실험에서 SLC2A1 유전자를 전체적으로 증강시키는 것이 간에서 고수준의 단백질이 발현되는 것을 초래하고, 이것이 글리코겐 합성 과정을 증가시키고, 따라서 저혈당증 상태를 유도할 수 있다는 가능성을 처리하도록 발생되었다. 최종적으로, 천연 마우스 또는 인간 SLC2A1 유전자를 배타적으로 함유하는 작제물은 또한 제어 목적을 위해 생성되었다(도 1C). pAAV9 CB6 PI hGlut1, pAAV9 CB6 PI hGlut1 out3xmiR122BS, 및 pAAV9 CB6 PI hGlut1 in3xmiR122BS는 타당성 실험에서 이용될 것이다. 이들 작제물의 서열 및 중요한 특징을 표 1에서, 그리고 대응하는 서열목록 1 내지 97에서 열거한다.
CHO 세포 내로 형질감염된 rAAV 플라스미드의 초기 발현 분석
세포 배양물 중의 다양한 재조합 플라스미드를 평가하기 위해 2종의 세포주를 사용하였다. 하나의 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이고, 다른 하나는 Glut1 환자로부터 유래된 섬유아세포주이다(Yang et al. 2011). 세포 배양 실험 및 후속적 웨스턴 블롯은 2A 펩타이드를 함유하는 플라스미드 작제물이 Glut1도 GFP도 만족스러운 수준에서 발현시키지 않았다는 것을 나타내었다. 예상치 못하였지만, SLC2A1/slc2A1 유전자와 관련하여, 2A 펩타이드는 단백질의 발현에 유해하게 영향을 미칠 수 있다. 대조적으로, 마우스 또는 인간 SLC2A1 유전자만을 함유하는 대조군 작제물은 강한 수준의 단백질을 발현시키는 것을 발견하였다. Glut1 작제물을 함유하는 2A 중 어떤 것도(도 1A 내지 도 1B) 돌연변이체 모델 시스템에서 Glut1 발현을 회복하기 위해 추가로 추구하지 않았다.
처음 4가지 작제물 내 2A 펩타이드의 존재에 의해 도입된 발현 곤란을 회피하기 위해(도 1A 내지 도 1B), hGlut1-eGFP 융합 단백질(phGlut1::eGFP로서 지칭됨)을 시험하였다. 세포 배양 실험은 융합 단백질이 발현될 뿐만 아니라 글루코스 흡수 분석에서 기능적이라는 것을 나타내었다. 마우스 slc2a1 또는 인간 SLC2A1 유전자만을 함유하는 작제물과 함께 이 작제물(phGlut1::eGFP)은 Glut1 모델 마우스의 유전자 요법을 수반하는 생체내 실험에서 사용에 대해 상정된다.
AAV9 플라스미드 클로닝 및 후속적 바이러스 벡터 패키징
hGlut1-eGFP 융합 단백질 작제물(phGlut1::eGFP)은 바이러스 벡터 내로 후속적 패키징을 위해 AAV9 플라스미드 내로 재클로닝되었다. 재클로닝된 작제물이 단백질을 계속해서 발현시키는 것을 보장하기 위해, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다(도 2A). CHO 세포 내 단백질 발현 분석은 상이한 프로모터 요소에 의해 유발된 cDNA 또는 hGlut-eGFP 융합을 암호화하는 hGlut1만을 발현시키는 작제물에 대해, AAV9-hGlut1-eGFP 플라스미드가 더 낮은 수준의 Glut1을 발현시켰다는 것을 나타내었다(도 2A). 그러나, 변형된(AAV9-hGlut1-eGFP) 융합 작제물은 효과적이고 만족스러운 양으로 Glut1 단백질을 계속해서 발현시켰다. 더 나아가, 융합 단백질은 Glut1 cDNA의 3' 말단에서 GFP 태그에 기인하여 예상되는 바와 같이 천연 hGlut1 단백질보다 상당히 더 큰 것으로 나타났다(도 2A). 이들 결과는 글루코스 흡수 분석과 일치되는데, 이때 hGlut-eGFP 단백질은 CHO 세포 내로 글루코스의 흡수를 증가시키는 것을 발견하였다(도 2B). 도 2C는 CHO 세포 내로 형질감염 후에 이 작제물의 GFP 형광을 나타낸다. 병행해서, 인간 SLC2A1 및 마우스 slc2a1 유전자를 또한 AAV9 플라스미드 내로 클로닝시키고, 환자 섬유아세포 내로 형질감염 시, Glut1 발현을 유도하고 글루코스 흡수를 증가시키는 것을 발견하였다. 따라서, 각각을 AAV9 캡시드 내로 패키징하고 나서, 대략 1013개의 게놈 복제물을 Glut1 DS 모델 마우스 내로 투여를 위해 제조하였다. (미국 특허 제8,734,809호에서, 그리고 문헌[Grieger and Samulski 2005 및 Grieger and Samulski 2012]에 기재된 바와 같은 방법에 따름).
패키징 조건/분포
AAV9 벡터에서 패키징된 Glut1 발현 작제물의 투여를 위한 조건을 최적화시키기 위해, 야생형 마우스에서 AAV9-GFP(Foust, K.D. et al. 2009) 벡터의 분포를 분석하였다. (문헌[Gao, G.P., and Sena-Esteves, M. (2012), In Molecular Cloning, Vol 2: A Laboratory Manual (M.R. Green and J. Sambrook eds.)]에 기재된 바와 같은 방법에 따름).
야생형 성체 또는 신생아 마우스에서의 상이한 조직에서 AAV9-GFP 작제물의 분포를 평가하였다. AAV9-GFP 주사 마우스의 시험 조직에서 밝은 녹색 형광을 발견하였지만, PBS/대조군 주사 마우스에서는 발견하지 못하였다. 본질적으로, 벡터의 대략 4 x 1012개 게놈 복제물을 안구뒤 및 측두정맥을 통해 마우스 내로 대략 40㎕의 용적으로 전신 투여하였다. 이들 실험으로부터의 결과는 AAV9 바이러스가 다양한 신경 및 비신경 조직으로 분포한다는 것을 나타낸다. 특히, 골격근, 심장 및 간을 표적화하기 위한 고수준을 발견하였다. 그러나, 실질적인 GFP 형광은 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 Glut1-양성 내피세포에서를 포함하여, 뇌조직에서 보였다. 중요하게는, 이들 세포는 Glut1 DS에 대한 표적화된 요법의 추정 부위이다.
대조군 AAV9-mGlut1 작제물
목적으로 하는 양의 mGlut1 단백질을 발현시킨 작제물 중 하나를 AAV9 바이러스 벡터 내로 패키징하였다. 이 작제물은 표지된 태그(예를 들어, GFP)를 갖지 않지만, 모델 마우스에서 이 작제물로부터의 Glut1 발현 다음에 웨스턴 블롯 분석 및 면역조직 화학적 실험에 의해 총 mGlut1 단백질을 평가하는 것이 이어질 수 있다.
작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)을 2 돌연변이체 Glut1 마우스 새끼에게 출생 후(PND) 안구뒤를 통해 도입하였다. 이 작제물을 주사한 마우스는 AAV9-hGlut1-eGFP 주사 돌연변이체에 대한 대조군으로서 작용한다(서열번호 80; 특징 서열번호 81 내지 87을 참조). 9마리의 돌연변이체 마우스에게 AAV9-mGlut1 작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1을 주사하였다(표 2). 추가적인 대조군으로서, 7마리 돌연변이체에게 비히클(PBS) 단독을 주사하였다. 이들 마우스는 질환 표현형의 기능성 개선에 대해 시험할 것이다. 이를 PET 스캔에 의해, 그리고 표준 기법에 따라 로타로드 또는 수직 막대 시험에 대한 수행을 모니터링함으로써 뇌조직 내 글루코스 흡수 수준을 결정함으로써 수행할 것이다(문헌[Kariya et al, 2012] 참조).
Glut1DS 모델 마우스에 의한 유전자 대체 실험에서 사용하는 작제물 중 하나는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물이다(서열번호 80). 이 작제물로부터 생성된 태그된 Glut1 단백질은 실험 마우스 뇌의 Glut1-발현 내피세포를 포함하는 이어질 다음의 기관계에서 단백질의 분포를 허용할 것이다. 이는 마우스 뇌에서 mGlut1의 검출을 위한 최적화 조건을 허용할 것이다. 뇌에서 mGlut1 단백질의 강한 발현은 특정 항체를 이용하여 검출 가능하다.
Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 보행 기능장애를 구하는 것으로 예시되는 바와 같이 질환 표현형을 구한다
다중 세포 유형을 감염시키는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)의 능력을 인간 질환의 마우스 모델 내로 뮤린 Slc2a1 유전자를 재도입하기 위한 특징으로서 이용하였다. 하나의 야생형 Slc2a1 대립유전자가 없을 때, Glut1 DS 마우스는 로타로드 분석에서 운동 거동 결함을 모델링하는 것으로 여겨지는 결과 측정, 즉, 인간 환자에서 관찰된 운동 표현형을 불량하게 수행한다. 돌연변이체 마우스에 PND3에 작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)에 의해 제공되는 AAV9-Glut1의 대략 4 x 1011개 게놈 복제물, 또는 비히클(PBS)을 주사하였다. 일원 ANOVA를 이용하여 P값을 계산하였다. PND3에 돌연변이체 마우스 내로 Slc2a1 유전자를 회복시키는 것은 6주령만큼 일찍 로타로드에서 수행의 상당한 개선을 초래하였다(표준 조건 하에 수행--문헌[Wang et al. 2006] 참조)(도 3A). 실험을 종료한 시점인 20주령까지 향상된 수행은 지속되었다.
로타로드 분석에 대한 개선된 수행에 추가로(도 3A), 치료 마우스는 또한 그들의 비히클 처리 상대보다 더 큰 민첩성으로 수직 막대를 넘는다(도 3B). 코호트를 6 내지 12주령에 시험하였을 때 야생형 대조군 한배새끼와 구별되게 처리 돌연변이체를 수행하였다. 이들 결과는 Glut1 DS 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 인간 질환의 운동 표현형 특징을 완화시킨다는 강한 증거를 제공하는데, 이는 돌연변이체 모델 마우스에 대해 Slc2a1 유전자를 회복시키는 것이 치료적 값을 나타낸다는 것을 표시한다.
Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 다중 조직에서 유전자의 향상된 발현을 초래한다
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AAV9-Glut1 처리 동물의 개선된 성능의 분자적 기반을 탐구하기 위해, 동물의 뇌 및 간 조직에서 뮤린 Slc2a1 유전자의 발현을 평가하였다. pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)로 처리한 돌연변이체 동물은 뇌 및 간 조직에서 더 큰 수준의 Slc2a1 유전자를 압박하였다(도 4A 내지 도 4B). 뇌 및 간 조직을 처리 및 대조군 마우스로부터 추출하고 나서, RNA를 준비하고, 이어서, Q-PCR 분석에서 Slc2a1 전사체를 증폭시키기 전에 역전사시켰다. β-액틴을 사용하여 Slc2a1 유전자 발현을 정규화시켰다. 도 4A는 처리 돌연변이체 및 적절한 대조군에서의 상대적 Slc2a1 유전자 발현을 나타낸다. 도 4B는 야생형 Glut1+/+ 마우스에서 발현 백분율로서 Slc2a1 발현을 나타낸다. 처리 돌연변이체(Glut1+/-) 및 적절한 대조군(Glut1+/+ 및 PBS 처리 Glut1+/- 돌연변이체)에서 정량적 PCR에 의해 Glut1 암호화 전사체를 증폭시키기 위해 인트론 1을 확장하는 프라이머를 사용하였다. 마우스를 안락사시키고 나서, PBS를 이용하는 경심 관류 후에 조직을 추출하였다. 제조업자의 설명서에 따라 RNAeasy 키트(캘리포니아주 발렌시아에 소재한 퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 RNA를 준비하였다. 표준 절차에 따라 RNA를 역전사시키고, 다음 프라이머를 사용하여 Glut1 암호화 전사체를 증폭시켰다: Glut1QPCR F1: 5' CTT GCT TGT AGA GTG ACG ATC 3' (서열번호 76) 및 Glut1QPCR R1: 5' CAG TGA TCC GAG CAC TGC TC 3' (서열번호 77). 예상된 212bp 밴드를 에펜도르프 리얼플렉스 사이클러(Eppendorf Realplex Cycler)(독일에 소재한 에펜도르프(Eppendorf))에서 정량화하였다.
예상치 못하게, 처리 돌연변이체 간에서 유전자의 발현은 Glut1+/+ 대조군의 동일한 조직에서의 수준을 초과하였는데, 이는 AAV9-Glut1 바이러스가 간에 대한 특정 굴성을 가진다는 이전의 보고(Foust et al, 2010)와 일치된다. WT 마우스 투여 바이러스의 작은 코호트에서, 이는 또한 이 조직에서 Slc2a1 상향조절의 결과와 유사하게 저혈당증을 유도하며, 따라서 혈액으로부터 글루코스의 제거를 유도한다. 따라서, miRNA-122 결합 부위를 함유하는 작제물(도 1D에 나타내고 서열번호 42 내지 75에 의해 포함되는 바와 같음)을 이용하여 Slc2a1의 발현 억제를 상정한다. miRNA-122는 간에서 특이적으로 발현되며, 그의 전사체가 결합하는 유전자의 발현을 억제한다(Xie et al, 2011). 이 발견의 생리적 결과는 추가적인 연구 대상일 것이다.
AAV9-Glut1로 처리한 돌연변이체 마우스에서 향상된 Glut1 뇌 단백질 및 CSF 글루코스 ; Glut1을 회복시키는 것은 Glut1 DS 모델 마우스에서 수액당감소증을 완화시킨다.
Glut1 DS의 정의적 세부 특징은 수액당감소증(저 뇌척수액 글루코스)이다. Glut1 DS 모델 마우스는 이 표현형을 나타낸다. 모델 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것이 수액당감소증을 반전시키거나 또는 완화시키는지의 여부를 결정하기 위해, 혈액 및 뇌척수액(CSF)을 동물로부터 추출하고 나서, 글루코스 수준을 측정하였다. 측정하기 전에 모든 마우스를 밤새 금식시켰다. 본질적으로 앞서 기재한 바와 같이 CSF를 소뇌연수조로부터 단리시켰다(Wang et al., 2006; Fleming et al., 1983). 간략하게, 두개골 상부로부터 등쪽 흉곽까지 절개하고 나서, 두개골의 기저로부터 제1 척추골까지의 근육계를 제거하여 소뇌연수조 위에 가로놓인 뇌척수막을 노출시켰다. 반투명 뇌척수막에 구멍을 내지 않도록 조심하면서 소뇌연수조 위의 조직을 절개하였다. 일단 주위 영역에서 잔여 혈액/사이질액을 세정하면, 30G 바늘에 부착된 마이크로피펫을 사용하여 소뇌연수조을 뒤덮고 있는 지주막에 구멍을 내고, 5 내지 15㎕의 CSF를 뽑아내었다. 전체 절차를 5분 내에 완료하고 나서, 아센시아 엘리트 XL 글루코스 미터(Ascensia Elite XL glucose meter)(바이엘 코포레이션(Bayer Corp.))를 이용하여 CSF 글루코스를 측정하였다 CSF 추출 전에 꼬리 절개로부터 대략 10㎕의 혈액을 뽑아냄으로써 유사하게 혈당을 결정하였다. 2회 판독(각각의 마우스에 대한 각각 혈액 및 CSF 글루코스 농도)을 평가하였다. 평균 값을 보고할 것이다.
CSF 글루코스 값 및 병기에 대해, 다음의 범위가 전형적이다: Glut1 환자의 90% 이상은 CSF 글루코스 값이 40㎎/㎗(2.2mM) 미만이며, 남아있는 환자는41 내지 52㎎/㎗ 범위에 속한다. 따라서, CSF 글루코스 수준에 대한 정상 범위는 약 53㎎/㎗ 이상이다. Glut1 DS 모델 마우스에 대해, 전형적인 CSF 글루코스 수준은 약 23.3±7.17㎎/㎗(25.0±8.00㎎/㎗ 미만의 범위에 속함)인 반면; 야생형 마우스에 대한 수준은 약 74.6±14.1㎎/㎗(약 70.0±15.0㎎/㎗ 이상의 범위 내에 속함)이다.
추가적으로, RBC 글루코스 흡수 기능 분석을 종종 Glut1 반수체부족성에 대한 대용으로 사용한다. 이 분석에서, Glut1 DS를 나타내는 환자는 36 내지 73% 범위로 대략 50% 흡수에서 무리를 이룬다. 75% 이상의 활성은 정상 범위와 일치되는 것으로 추정된다. 25% 미만은 중증이며, 배아 치사율은 0%에 접근한다는 것을 주목한다.
작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)을 이용하는 형질감염에 의해Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 slc2a1 유전자를 회복시키는 것은 Glut1의 증가된 발현을 초래한다(도 5a). 추가적으로, 처리된 Glut1 DS 돌연변이체 마우스는 뇌 조직에서 증가된 수준의 Glut1 단백질을 발현시킨다(도 5b). 도 5c에서, 처리된 돌연변이체에서 CSF 글루코스 농도는 비처리 돌연변이체의 농도보다 상당히 더 높았지만, 야생형 대조군에서 관찰된 수준에 도달되지 않았다. 회복된 slc2a1 돌연변이체 마우스는 증가된 수준의 CSF/혈당을 나타내었다(도 5d). 샘플 크기는 비처리 돌연변이체 마우스에 대해 n=8이고, 처리된 돌연변이체 마우스에 대해 n=9이다. 추가적으로, 야생형 코호트는 n=18이다. 이들 데이터는 Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것이 CSF 글루코스 수준을 증가시키고 병에 걸린 동물의 수액당감소증을 완화한다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이들 결과는 Glut1 결여 대상체에서 Glut1을 회복시키는 것의 치료적 이점의 분명한 표시이다. 이들 실험으로부터의 예비적 결과는 이들 증상을 나타내는 성체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것이 마우스에서 그리고, 인간도 유사하게 제한된 기회의 치료적 창을 나타내는 질환 표현형을 구하지 못한다는 것을 나타낸다.
징후를 나타내는 마우스에 대한 Glut1의 회복―Glut1 투여 시간
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Glut1 DS 마우스에서 질환 과정 동안 초기에 모델 마우스에 대한 Glut1 발현의 회복(AAV9-mGlut1 작제물의 PN3 주사에 의해 예시)은 분명한 치료적 값을 가진다. 징후를 나타내는 마우스에서 Glut1 회복 기간을 결정하기 위해, 8주령의 돌연변이체 마우스에게 pAAV CB6 PI mGlut1 작제물(서열번호 35)을 주사하는 단계를 수반하는 실험을 개시하였다. Glut1 DS 마우스는 이 시점에서 분명하게 징후를 나타내며 로타로드 상에서 대조군인 야생형 한배새끼보다 잘 수행하지 못하였다. 따라서, Glut1 DS 마우스의 코호트에게 비히클 또는 AAV9-mGlut1의 1 x 1012개 게놈 복제물을 전신 주사하였다. 모든 마우스 성체 설치류에서 바이러스 주사가 안전하다는 것을 나타내는 절차를 견뎠다. Glut1 결핍증 증상을 치료/완화하는 것을 허용하는 기간뿐만 아니라 질환 표현형의 과정을 반전시키기 위한 임의의 시간 제한을 결정하기 위해 상기 기재한 것과 유사한 분자적, 세포적 및 거동적 분석을 평가하였다.
Glut1 DS 모델에서 기회의 치료적 창의 개선
본 데이터는 신생아(PND3) Glut1 DS 마우스에서 Glut1(뮤린) 단백질의 AAV9-매개 고갈이 Glut1 발현을 증가시키고, 질환에서 특징적으로 관찰된 수액당감소증을 완화하며, 뇌 크기를 회복시키고, 운동 성능의 현저한 개선을 초래한다는 것을 입증한다. 대조적으로, 8주령에 Glut1 고갈은 질환 표현형을 구하지 못한다. 이들 결과는 인간 병태를 반영할 가능성이 있는 발견인 Glut1 DS 모델 마우스에서 제한된 기회의 치료적 창이 있다는 것을 시사한다. 예비 데이터는 또한 2주령의 돌연변이체 마우스에서 상당히 저하된 CSF 글루코스 수준을 나타낸다(돌연변이체: 23.25±3.77㎎/㎗; 대조군: 53.33±5.20㎎/㎗, P < 0.01, t 검정). 또한, 식별할 수 있는 명시적 표현형 전에 이 시점에 Glut1을 회복하는 것이 치료적 이점을 제공하는지의 여부는 불분명하다.
질환의 이런 초기 단계에서 Glut1을 회복하는 것의 결과를 결정하기 위해 - 아동기에 진단되었지만 영아기 동안 Glut1 결핍증의 질환의 원인이 되는 효과가 결코 실행된 적이 없는 환자를 치료하는 것과 유사, 돌연변이체 마우스에 pAAV9 CB6 PI mGlut1 벡터(서열번호 35)를 전신으로 형질도입할 것이다. 간략하게, 대략 50㎕ 용적 중의 비히클의 치료 벡터의 대략 1012개 게놈 복제물을 2주령 마우스의 측두정맥에 주사할 것이다. 동물을 후속적으로 분자의 포괄적 배터리(웨스턴 블롯 분석, Q-PCR 분석, CSF 및 혈당 수준), 영상화(PET 스캔) 및 거동(로타로드 분석, 수직 막대 시험) 분석을 이용하여 평가하여 마우스에서 이런 "청소년" 기에 기능성 단백질을 회복하는 것의 결과를 결정하였다. 이들 실험은 한편으로 신생아(PND3) 에서 다른 한편으로 성체 모델(8주)에서 치료 후에 얻은 결과를 보충하며, Glut1 DS에 대한 기회의 치료적 창을 개선한다.
Glut1 DS 모델 마우스에서 케톤체 생성성 식사에 의한 초기 치료와 Glut1 단백질의 후기 만복의 조합 효과의 평가
성체 마우스(8주)에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 Glut1 DS 표현형을 완화시키지 않는다는 것이 분명하지만, 고지방식에 의한 이들 마우스의 사전 처리는 더 바람직한 결과를 생성할 수 있다. 이러한 식이요법 중인 마우스는 처리의 이상적인 치료적 창이 상실될 수 있지만 케톤체 생성성 식사의 초기 보호 효과에 기인하여 Glut1 단백질의 후기 회복에 결코 유리하지 않은 더 고령의 Glut1 DS 환자 코호트를 더 정확하게 나타낸다. 이러한 식이요법은 단일 카복실산 수송체를 통해 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 불완전한 에너지 공급원일지라도, 교번으로 뇌에 케톤체를 공급한다. 따라서, 2주령의 마우스에서 본 발명자들의 실험에 추가로, 본 발명자들은 (PND7에 시작해서) 7C 트라이글라이세라이드 트라이헵타노인을 받은 성체(6 내지 8주령) 돌연변이체에 대해 Glut1을 회복시키는 효과를 시험할 것이다. 현재 Glut1 DS에 대한 임상 시험에서 트라이헵타노인은 TCA 회로에 대해 아세틸 CoA로 대사될 뿐만 아니라, 세포 에너지 필요를 공급하기 위해 영양소가 종국적으로 분해됨에 따라 회로에 대한 본질적인 보충 경로 물질을 제공하는 것으로 생각된다. 간략하게, 이 실험은 그들에게 AAV9-Glut1(pAAV9 CB6 PI mGlut1) 작제물을 투여할 때까지 트라이헵타노인(82㎎/g)으로 또는 트라이헵타노인 없이 돌연변이체를 처리하는 단계를 수반할 것이다. 이어서, 현재 이용 가능한(케톤체 생성성 식사) 치료에 대해 더 고령의 환자에서 Glut1 발현을 회복시킨 것의 치료적 결과를 예측하는 수단으로서 마우스의 상이한 코호트를 상기 기재한 바와 같이 평가할 것이다.
임상 시험을 위한 Glut1 작제물의 최적화
지금까지 Glut1 DS 마우스에서 slc2a1 발현의 뜻밖의 효과는 관찰되지 않았지만, 작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1 벡터(서열번호 35)을 투여한 야생형 마우스의 작은 샘플에 대한 예비 연구는 더 낮은 CSF 및 혈당 수준을 나타내었다. 이 예상치 못한 사건은 바람직한 AAV9 표적 기관인 간에서의 증가된 slc2a1 발현으로부터 초래되고, 결과적으로 이 조직 내로 글루코스의 수송을 향상시킬 수 있었다. 순 결과는 저혈당 상태에서 반영된 순환 글루코스에 속한다. 이러한 사건의 예상에서, hGlut1 작제물(pAAV CB6 PI hGlut1)은 간(AAV9이 특히 높은 굴성을 갖는 기관)에서 고수준으로 그의 발현을 불가능하게 하도록 변형될 것이다(Zincarelli et al, 2008; Pacak et al, 2006). 그렇게 하기 위해, miRNA에 대한 결합 부위(BS)(miR-122)(간세포에서 특이적으로 발현됨)는 작제물 내로 도입될 것이다. 이 전략은 이전에 성공적으로 실행되었고(문헌[Xie et al, 2011] 참조), 표적 mRNA의 miRNA-매개 내부핵산 절단의 이점을 취하고, 관심대상의 조직에 대한 전사체의 발현을 제한한다. 도 1D 및 표 1에 나타낸 이러한 작제물(pAAV CB6 PI hGlut1-in3xmiR-122 BS, pAAV CB6 PI hGlut1-out3xmiR-122 BS, pAAV CB6 PI mGlut1-in3xmiR-122, pAAV CB6 PI mGlut1-out3xmiR-122)은 마우스 마우스의 서브세트에서 본래의 (비변형) Glut1 발현 벡터와 나란히 시험하여, Glut1 발현 수준 및 치료 효능에 대해 각각 시험할 것이다. 본래의 작제물이 저혈당증을 야기하는 것의 증가된 경향은 후속 실험 및 시행에서 새로운 Glut1-miRNA-BS 작제물을 이용하는 것의 이점을 나타낼 것이다.
제조 과정 동안 바이러스 역가를 감소시키는 수단으로서뿐만 아니라, 큰 농도의 바이러스와 관련된 안전성 문제를 처리하기 위해 본 명세서에 기재된 시험 작제물의 발현을 최적화하기 위하여, 자유롭게 이용 가능한 소프트웨어를 이용하여 코돈 최적화 과정을 이용해서 SLC2A1 및 slc2a1 유전자를 평가할 것이다(https://www.idtdna.com/CodonOpt). 추가로, 필요하다면 공통 코작 서열을 작제물 내로 도입할 것이다. 따라서, 표 1에 기재한 임의의 작제물 또는 요소는 이런 방식으로 코돈 최적화될 수 있다. 각각의 변형된 작제물은 마우스에서 모 작제물과 병행하여 시험할 것이다. 간략하게, PND3 마우스 새끼 내로 측두 정맥을 통해 작제물을 전신으로 투여할 것이다. 이어서, 동물들을 2주 또는 3주 후에 안락사시키고, Q-PCR 및 웨스턴 블롯팅에 의해 각각의 작제물로부터의 단백질 수준을 결정하였다. 가장 빠르고 높은 발현 수준을 전달하는 작제물은 비인간 영장류 연구에서 종국 적인 용도에 대해 그리고 종국적으로 인간 환자에 대한 임상 시험에서 고려할 것이다.
비-인간 영장류 연구
거대 포유류 모델에서 본 발명자들의 선택 작제물(들)의 생체 분포, 발현 및 독성을 결정하기 위해, 바이러스 벡터를 사이노몰거스 원숭이의 코호트에 투여할 것이다. 간략하게, PND1, PND90 및 2세의 각각 6마리 동물에 5 x 1013개 게놈 복제물/㎏의 용량으로 AAV9 벡터를 전신으로 투여할 것이다. 작제물(들)의 정확한 독성을 결정하기 위해, 벡터 투여 후 1일, 3일 및 7일에 동물을 방혈시킬 것이다. 추가적으로, 벡터 주사 후 2, 3 및 4주에 동물을 방혈시킬 것이다. 모든 경우에, 중요한 임상 화학 및 혈액학 매개변수를 평가할 것이다. AAV9에 대한 중화 항체의 역가는 형질도입 기반 정량적 중화 항체 분석에 의해 혈청 샘플에서 모니터링할 것이며(Rapti et al, 2012), ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색 기법 및 유세포 분석을 이용하여 PBMC에서 이식유전자 또는 캡시드 특이적 T 세포의 존재를 결정한다(Walker et al, 2001). 상기 면역학적 연구를 보완하기 위해, 모든 주요 기관계에서의 조직 병리학, 벡터 생체 분포 연구 및 이식유전자 발현 분석을 위해 각각의 코호트로부터의 3마리 동물을 4주에 안락사시킬 것이다. 이들 실험은 또한 바이러스 투여 후 초기 대 후기에 혈청, 림프구 및 PBMC에서 캡시드 또는 이식유전자에 대한 B 및 T 세포 면역 반응의 시험 및 비교를 가능하게 할 것이다. 장기간 안전성 연구를 수행하기 위해, 각각의 그룹에서 남아있는 3마리 동물은 그들이 상기 기재한 바와 같은 임상 화학 및 혈액학 연구를 위해 매달 방혈시키는 동안 3개월의 기간에 걸쳐 따를 것이다. 이들 동물을 종국적으로 주사 3개월 후에 안락사시키고, 급성 독성 연구에서 기재한 바와 같이 분석할 것이다. 사이노몰거스 Glut1과 대략 99% 상동성을 공유함에도 불구하고 인간 Glut1 단백질은 공격적 면역 반응을 유발할 수 있다. 이를 불가능하게 하기 위해, miR-142-3p 및 miR-155에 대한 두 miRNA 결합 부위를 시험 작제물 내로 도입할 것이다. 독립적 연구로부터의 예비 결과는 이들 miRNA가 항원 제시 세포에서 발현되고, 결과적으로, 전사체가 miRNA에 대한 결합 부위를 함유하는 단백질의 발현을 억제한다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이들 연구는 인간 임상 시험에서 본 명세서에 기재된 시험 Glut1 작제물의 종국적인 사용을 용이하게 할 것이다.
참고문헌
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ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 540
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatgtcgag 600
gccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 660
tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggcgc gcgccaggcg 720
gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 780
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 840
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcaa gctttattgc ggtagtttat cacagttaaa 900
ttgctaacgc agtcagtgct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc agaagttggt 960
cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga 1020
aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta 1080
ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt 1140
aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagtaa tacgactcac tatagatggt 1200
gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 1260
cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1320
gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1380
gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1440
cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1500
ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1560
ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 1620
ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1680
caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1740
ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1800
gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1860
ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agaattttga 1920
ccttcttaag cttgcgggag acgtcgagtc caaccctggg cccatggagc ccagcagcaa 1980
gaagctgacg ggtcgcctca tgctggccgt gggaggagca gtgcttggct ccctgcagtt 2040
tggctacaac actggagtca tcaatgcccc ccagaaggtg atcgaggagt tctacaacca 2100
gacatgggtc caccgctatg gggagagcat cctgcccacc acgctcacca cgctctggtc 2160
cctctcagtg gccatctttt ctgttggggg catgattggc tccttctctg tgggcctttt 2220
cgttaaccgc tttggccggc ggaattcaat gctgatgatg aacctgctgg ccttcgtgtc 2280
cgccgtgctc atgggcttct cgaaactggg caagtccttt gagatgctga tcctgggccg 2340
cttcatcatc ggtgtgtact gtggcctgac cacaggcttc gtgcccatgt atgtgggtga 2400
agtgtcaccc acagcccttc gtggggccct gggcaccctg caccagctgg gcatcgtcgt 2460
cggcatcctc atcgcccagg tgttcggcct ggactccatc atgggcaaca aggacctgtg 2520
gcccctgctg ctgagcatca tcttcatccc ggccctgctg cagtgcatcg tgctgccctt 2580
ctgccccgag agtccccgct tcctgctcat caaccgcaac gaggagaacc gggccaagag 2640
tgtgctaaag aagctgcgcg ggacagctga cgtgacccat gacctgcagg agatgaagga 2700
agagagtcgg cagatgatgc gggagaagaa ggtcaccatc ctggagctgt tccgctcccc 2760
cgcctaccgc cagcccatcc tcatcgctgt ggtgctgcag ctgtcccagc agctgtctgg 2820
catcaacgct gtcttctatt actccacgag catcttcgag aaggcggggg tgcagcagcc 2880
tgtgtatgcc accattggct ccggtatcgt caacacggcc ttcactgtcg tgtcgctgtt 2940
tgtggtggag cgagcaggcc ggcggaccct gcacctcata ggcctcgctg gcatggcggg 3000
ttgtgccata ctcatgacca tcgcgctagc actgctggag cagctacccc ggatgtccta 3060
tctgagcatc gtggccatct ttggctttgt ggccttcttt gaagtgggtc ctggccccat 3120
cccatggttc atcgtggctg aactcttcag ccagggtcca cgtccagctg ccattgccgt 3180
tgcaggcttc tccaactgga cctcaaattt cattgtgggc atgtgcttcc agtatgtgga 3240
gcaactgtgt ggtccctacg tcttcatcat cttcactgtg ctcctggttc tgttcttcat 3300
cttcacctac ttcaaagttc ctgagactaa aggccggacc ttcgatgaga tcgcttccgg 3360
cttccggcag gggggagcca gccaaagtga caagacaccc gaggagctgt tccatcccct 3420
gggggctgat tcccaagtgt gagtcgcccc agatcaccag cccggcctgc tcccagcagc 3480
cctaaggatc tctcaggagc acaggcagct ggatgagact tccaaacctg acagatgtca 3540
gccgagccgg gcctggggct cctttctcca gccagcaatg atgtccagaa gaatattcag 3600
gacttaacgg ctccaggatt ttaacaaaag caagactgtt gctcaaatct attcagacaa 3660
gcaacaggtt ttataatttt tttattactg attttgttat ttttatatca gcctgagtct 3720
cctgtgccca catcccaggc ttcaccctga atggttccat gcctgagggt ggagactaag 3780
ccctgtcgag acacttgcct tcttcaccca gctaatctgt agggctggac ctatgtccta 3840
aggacacact aatcgaacta tgaactacaa agcttctatc ccaggaggtg gctatggcca 3900
cccgttctgc tggcctggat ctctcgagga cggggtgaac tacgcctgag gatccgatct 3960
ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg 4020
ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact 4080
cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat acccattacc ctggtagata 4140
agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc 4200
cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg 4260
gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa cctaattcac 4320
tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 4380
ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 4440
cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4500
gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4560
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 4620
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 4680
aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 4740
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 4800
cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 4860
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 4920
cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 4980
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 5040
ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 5100
ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 5160
tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 5220
gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 5280
gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 5340
acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 5400
tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 5460
caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 5520
gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 5580
cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 5640
tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 5700
agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 5760
tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 5820
ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 5880
acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 5940
ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 6000
gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 6060
gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 6120
ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 6180
gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 6240
tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 6300
cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 6360
cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 6420
ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 6480
tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 6540
cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 6600
ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 6660
aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 6720
ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 6780
tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 6840
gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 6900
gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 6960
caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 7020
tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 7080
tgaccatgat tacgccagat ttaattaag 7109
<210> 2
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 2
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 3
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 3
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 4
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 4
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 5
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> eGFP
<400> 5
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> 2A-linker
<400> 6
aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c 51
<210> 7
<211> 1959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> hGlut1 cDNA and 3'UTR
<400> 7
atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60
cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120
gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180
ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240
ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300
ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420
cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480
cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540
ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600
tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720
ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780
gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900
gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020
ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080
ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200
ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320
ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtgag tcgccccaga tcaccagccc 1500
ggcctgctcc cagcagccct aaggatctct caggagcaca ggcagctgga tgagacttcc 1560
aaacctgaca gatgtcagcc gagccgggcc tggggctcct ttctccagcc agcaatgatg 1620
tccagaagaa tattcaggac ttaacggctc caggatttta acaaaagcaa gactgttgct 1680
caaatctatt cagacaagca acaggtttta taattttttt attactgatt ttgttatttt 1740
tatatcagcc tgagtctcct gtgcccacat cccaggcttc accctgaatg gttccatgcc 1800
tgagggtgga gactaagccc tgtcgagaca cttgccttct tcacccagct aatctgtagg 1860
gctggaccta tgtcctaagg acacactaat cgaactatga actacaaagc ttctatccca 1920
ggaggtggct atggccaccc gttctgctgg cctggatct 1959
<210> 8
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 8
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 9
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 9
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 10
<211> 7503
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI EGFP-2A-mGlut1
<400> 10
gccttaatta ggctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt 60
cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 120
aactccatca ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctacc 180
agggtaatgg ggatcctcta gaactatagc tagtcgacat tgattattga ctagttatta 240
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 300
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 360
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 420
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 480
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 540
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatgtcgag 600
gccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta 660
tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggcgc gcgccaggcg 720
gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 780
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 840
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcaa gctttattgc ggtagtttat cacagttaaa 900
ttgctaacgc agtcagtgct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc agaagttggt 960
cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga 1020
aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta 1080
ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt 1140
aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagtaa tacgactcac tatagatggt 1200
gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 1260
cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1320
gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1380
gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1440
cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1500
ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1560
ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 1620
ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1680
caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1740
ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1800
gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1860
ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agaattttga 1920
ccttcttaag cttgcgggag acgtcgagtc caaccctggg cccatggatc ccagcagcaa 1980
gaaggtgacg ggccgcctca tgttggctgt gggaggagca gtgctcggat cactgcagtt 2040
cggctataac actggtgtca tcaacgcccc ccagaaggtt attgaggagt tctacaatca 2100
aacatggaac caccgctacg gagagcccat cccatccacc acactcacca cgctttggtc 2160
tctctccgtg gccatcttct ctgtcggggg catgattggt tccttctctg tcggcctctt 2220
tgttaatcgc tttggcaggc ggaactccat gctgatgatg aacctgttgg cctttgtggc 2280
tgctgtgctt atgggcttct ccaaactggg caagtccttt gagatgctga tcctgggccg 2340
cttcatcatc ggtgtgtact gcggcctgac tactggcttt gtgcccatgt atgtgggaga 2400
ggtgtcacct acagctctac gtggagccct aggcacactg caccagctgg gaatcgtcgt 2460
tggcatcctt attgcccagg tgtttggctt agactccatc atgggcaatg cagacttgtg 2520
gcctctgctg ctcagtgtca tcttcatccc agccctgcta cagtgtatcc tgttgccctt 2580
ctgccccgag agcccccgct tcctgctcat caatcgtaac gaggagaacc gggccaagag 2640
tgtgctgaag aagcttcgag ggacagccga tgtgacccga gacctgcagg agatgaaaga 2700
agagggtcgg cagatgatgc gggagaagaa ggtcaccatc ttggagctgt tccgctcacc 2760
cgcctaccgc cagcccatcc tcatcgctgt ggtgctgcag ctgtcccagc agctgtcggg 2820
tatcaatgct gtgttctact actcaacgag catcttcgag aaggcaggtg tgcagcagcc 2880
tgtgtacgcc accatcggct ccggtatcgt caacacggcc ttcactgtgg tgtcgctgtt 2940
tgttgtagag cgagctggac gacggaccct gcacctcatt ggcctggctg gcatggcagg 3000
ctgtgctgtg ctcatgacca tcgccctggc cttgctggaa cggctgcctt ggatgtccta 3060
tctgagcatc gtggccatct ttggctttgt ggccttcttt gaagtaggcc ctggtcctat 3120
tccatggttc attgtggccg agctgttcag ccaggggccc cgtcctgctg ctattgctgt 3180
ggctggcttc tccaactgga cctcaaactt cattgtgggc atgtgcttcc agtatgtgga 3240
gcaactgtgc ggcccctacg tcttcatcat cttcacggtg ctcctcgtgc tcttcttcat 3300
cttcacctac ttcaaagtcc ctgagaccaa aggccgaacc ttcgatgaga tcgcttccgg 3360
cttccggcag gggggtgcca gccaaagtga caagacaccc gaggagctct tccaccctct 3420
gggggcggac tcccaagtgt gaggagcccc acacccagcc cggcctgctc cctgcagccc 3480
aaggatctct ctggagcaca ggcagctaga tgagacctct tccgaaccga cagatctcgg 3540
gcaagccggg cctgggcgcc tttcctcagc cagcagtgaa gtccaggagg atattcagga 3600
ctttgatggc tccagaattt ttaatgaaag caagactgct gctcagatct attcagataa 3660
gcagcaggtt ttataatttt tttattactg attttgttat tttttttttt tatcagccac 3720
tctcctatct ccacactgta gtcttcacct tgattggccc agtgcctgag ggtggggacc 3780
acgccctgtc cagacacttg ccttctttgc caagctaatc tgtagggctg gacctatggc 3840
caaggacaca ctaataccga actctgagct aggaggcttt accgctggag gcggtagctg 3900
ccacccactt ccgcaggcct ggacctcggc accatagggg tccggactcc attttaggat 3960
tcgcccattc ctgtctcttc ctacccaacc actcaattaa tctttccttg cctgagacca 4020
gttggaagca ctggagtgca gggaggagag ggaagggcca ggctgggctg ccaggttcta 4080
gtctcctgtg cactgagggc cacacaaaca ccatgagaag gacctcggag gctgagaact 4140
taactgctga agacacggac actcctgccc tgctgtgtat agatggaaga tatttatata 4200
ttttttggtt gtcaatatta aatacagaca ctaagttata gtatatctgg acaaacccac 4260
ttgtaaatac accaacaaac tcctgtaact ttacctaagc agatataaat ggctggctcg 4320
aggacggggt gaactacgcc tgaggatccg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg 4380
acatcatgaa gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg 4440
caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag caattcgttg atctgaattt 4500
cgaccaccca taatacccat taccctggta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac 4560
tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact 4620
gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 4680
gagcgagcgc gcagccttaa ttaacctaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 4740
tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 4800
tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 4860
ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 4920
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 4980
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 5040
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 5100
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 5160
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 5220
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 5280
caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc 5340
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 5400
cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 5460
gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 5520
ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 5580
tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 5640
aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 5700
ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 5760
agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 5820
gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 5880
gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 5940
gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 6000
tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 6060
ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 6120
cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 6180
gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 6240
cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 6300
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 6360
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 6420
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 6480
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 6540
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 6600
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 6660
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 6720
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 6780
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 6840
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 6900
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 6960
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 7020
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 7080
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 7140
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 7200
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 7260
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 7320
acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 7380
ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 7440
tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt 7500
aag 7503
<210> 11
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 11
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 12
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 12
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 13
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 13
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 14
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> eGFP
<400> 14
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> 2A-linker
<400> 15
aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c 51
<210> 16
<211> 2353
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> mGlut1 cDNA and 3'UTR
<400> 16
atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60
ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120
gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180
ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240
ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300
ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420
cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480
cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540
ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600
tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720
ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780
gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900
gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020
ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080
ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200
cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320
ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtgag gagccccaca cccagcccgg 1500
cctgctccct gcagcccaag gatctctctg gagcacaggc agctagatga gacctcttcc 1560
gaaccgacag atctcgggca agccgggcct gggcgccttt cctcagccag cagtgaagtc 1620
caggaggata ttcaggactt tgatggctcc agaattttta atgaaagcaa gactgctgct 1680
cagatctatt cagataagca gcaggtttta taattttttt attactgatt ttgttatttt 1740
ttttttttat cagccactct cctatctcca cactgtagtc ttcaccttga ttggcccagt 1800
gcctgagggt ggggaccacg ccctgtccag acacttgcct tctttgccaa gctaatctgt 1860
agggctggac ctatggccaa ggacacacta ataccgaact ctgagctagg aggctttacc 1920
gctggaggcg gtagctgcca cccacttccg caggcctgga cctcggcacc ataggggtcc 1980
ggactccatt ttaggattcg cccattcctg tctcttccta cccaaccact caattaatct 2040
ttccttgcct gagaccagtt ggaagcactg gagtgcaggg aggagaggga agggccaggc 2100
tgggctgcca ggttctagtc tcctgtgcac tgagggccac acaaacacca tgagaaggac 2160
ctcggaggct gagaacttaa ctgctgaaga cacggacact cctgccctgc tgtgtataga 2220
tggaagatat ttatatattt tttggttgtc aatattaaat acagacacta agttatagta 2280
tatctggaca aacccacttg taaatacacc aacaaactcc tgtaacttta cctaagcaga 2340
tataaatggc tgg 2353
<210> 17
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 17
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 18
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 18
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 19
<211> 6844
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI hGlut1-2A-EGFP
<400> 19
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattgatc cactagtaac 1200
ggccgccagt gtgctggaag caggagacca aacgacgggg gtcggagtca gagtcgcagt 1260
gggagtcccc ggaccggagc acgagcctga gcgggagagc gccgctcgca cgcccgtcgc 1320
cacccgcgta cccggcgcag ccagagccac cagcgcagcg ctgccatgga gcccagcagc 1380
aagaagctga cgggtcgcct catgctggcc gtgggaggag cagtgcttgg ctccctgcag 1440
tttggctaca acactggagt catcaatgcc ccccagaagg tgatcgagga gttctacaac 1500
cagacatggg tccaccgcta tggggagagc atcctgccca ccacgctcac cacgctctgg 1560
tccctctcag tggccatctt ttctgttggg ggcatgattg gctccttctc tgtgggcctt 1620
ttcgttaacc gctttggccg gcggaattca atgctgatga tgaacctgct ggccttcgtg 1680
tccgccgtgc tcatgggctt ctcgaaactg ggcaagtcct ttgagatgct gatcctgggc 1740
cgcttcatca tcggtgtgta ctgtggcctg accacaggct tcgtgcccat gtatgtgggt 1800
gaagtgtcac ccacagccct tcgtggggcc ctgggcaccc tgcaccagct gggcatcgtc 1860
gtcggcatcc tcatcgccca ggtgttcggc ctggactcca tcatgggcaa caaggacctg 1920
tggcccctgc tgctgagcat catcttcatc ccggccctgc tgcagtgcat cgtgctgccc 1980
ttctgccccg agagtccccg cttcctgctc atcaaccgca acgaggagaa ccgggccaag 2040
agtgtgctaa agaagctgcg cgggacagct gacgtgaccc atgacctgca ggagatgaag 2100
gaagagagtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcctggagct gttccgctcc 2160
cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca gcagctgtct 2220
ggcatcaacg ctgtcttcta ttactccacg agcatcttcg agaaggcggg ggtgcagcag 2280
cctgtgtatg ccaccattgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt cgtgtcgctg 2340
tttgtggtgg agcgagcagg ccggcggacc ctgcacctca taggcctcgc tggcatggcg 2400
ggttgtgcca tactcatgac catcgcgcta gcactgctgg agcagctacc ccggatgtcc 2460
tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtggg tcctggcccc 2520
atcccatggt tcatcgtggc tgaactcttc agccagggtc cacgtccagc tgccattgcc 2580
gttgcaggct tctccaactg gacctcaaat ttcattgtgg gcatgtgctt ccagtatgtg 2640
gagcaactgt gtggtcccta cgtcttcatc atcttcactg tgctcctggt tctgttcttc 2700
atcttcacct acttcaaagt tcctgagact aaaggccgga ccttcgatga gatcgcttcc 2760
ggcttccggc aggggggagc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct gttccatccc 2820
ctgggggctg attcccaagt gaccggtaat tttgaccttc ttaagcttgc gggagacgtc 2880
gagtccaacc ctgggcccgc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 2940
cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 3000
ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 3060
ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 3120
cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 3180
gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 3240
aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 3300
gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 3360
atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 3420
gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 3480
gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 3540
gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 3600
atggacgagc tgtacaagta aagcggccat caagcttatc ggccgttact agtggatcga 3660
ggacggggtg aactacgcct gaggatccga tctttttccc tctgccaaaa attatgggga 3720
catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta ttttcattgc 3780
aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagc aattcgttga tctgaatttc 3840
gaccacccat aatacccatt accctggtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact 3900
acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 3960
aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4020
agcgagcgcg cagccttaat taacctaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4080
gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4140
ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4200
gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 4260
gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 4320
ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 4380
tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 4440
gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 4500
ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 4560
ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 4620
aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg 4680
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 4740
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 4800
tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 4860
tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 4920
gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 4980
acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 5040
tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 5100
gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 5160
tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 5220
accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 5280
ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 5340
agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 5400
gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 5460
ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg 5520
tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 5580
ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 5640
gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 5700
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 5760
aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 5820
atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 5880
gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 5940
tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 6000
ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 6060
ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 6120
ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 6180
aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 6240
cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 6300
gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 6360
ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 6420
cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 6480
tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 6540
cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg 6600
cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga 6660
caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac 6720
tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt 6780
gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca gatttaatta 6840
aggc 6844
<210> 20
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 20
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 21
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 21
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 22
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 22
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 23
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> hGlut1 cDNA
<400> 23
atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60
cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120
gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180
ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240
ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300
ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420
cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480
cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540
ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600
tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720
ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780
gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900
gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020
ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080
ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200
ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320
ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtga 1479
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> 2A-linker
<400> 24
aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c 51
<210> 25
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> eGFP
<400> 25
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 26
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 26
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 27
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 27
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 28
<211> 6568
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI hGlut1
<400> 28
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattggcc gccagtgtga 1200
tggatatctg cagaattcgc ccttagcagg agaccaaacg acgggggtcg gagtcagagt 1260
cgcagtggga gtccccggac cggagcacga gcctgagcgg gagagcgccg ctcgcacgcc 1320
cgtcgccacc cgcgtacccg gcgcagccag agccaccagc gcagcgctgc catggagccc 1380
agcagcaaga agctgacggg tcgcctcatg ctggccgtgg gaggagcagt gcttggctcc 1440
ctgcagtttg gctacaacac tggagtcatc aatgcccccc agaaggtgat cgaggagttc 1500
tacaaccaga catgggtcca ccgctatggg gagagcatcc tgcccaccac gctcaccacg 1560
ctctggtccc tctcagtggc catcttttct gttgggggca tgattggctc cttctctgtg 1620
ggccttttcg ttaaccgctt tggccggcgg aattcaatgc tgatgatgaa cctgctggcc 1680
ttcgtgtccg ccgtgctcat gggcttctcg aaactgggca agtcctttga gatgctgatc 1740
ctgggccgct tcatcatcgg tgtgtactgt ggcctgacca caggcttcgt gcccatgtat 1800
gtgggtgaag tgtcacccac agcccttcgt ggggccctgg gcaccctgca ccagctgggc 1860
atcgtcgtcg gcatcctcat cgcccaggtg ttcggcctgg actccatcat gggcaacaag 1920
gacctgtggc ccctgctgct gagcatcatc ttcatcccgg ccctgctgca gtgcatcgtg 1980
ctgcccttct gccccgagag tccccgcttc ctgctcatca accgcaacga ggagaaccgg 2040
gccaagagtg tgctaaagaa gctgcgcggg acagctgacg tgacccatga cctgcaggag 2100
atgaaggaag agagtcggca gatgatgcgg gagaagaagg tcaccatcct ggagctgttc 2160
cgctcccccg cctaccgcca gcccatcctc atcgctgtgg tgctgcagct gtcccagcag 2220
ctgtctggca tcaacgctgt cttctattac tccacgagca tcttcgagaa ggcgggggtg 2280
cagcagcctg tgtatgccac cattggctcc ggtatcgtca acacggcctt cactgtcgtg 2340
tcgctgtttg tggtggagcg agcaggccgg cggaccctgc acctcatagg cctcgctggc 2400
atggcgggtt gtgccatact catgaccatc gcgctagcac tgctggagca gctaccccgg 2460
atgtcctatc tgagcatcgt ggccatcttt ggctttgtgg ccttctttga agtgggtcct 2520
ggccccatcc catggttcat cgtggctgaa ctcttcagcc agggtccacg tccagctgcc 2580
attgccgttg caggcttctc caactggacc tcaaatttca ttgtgggcat gtgcttccag 2640
tatgtggagc aactgtgtgg tccctacgtc ttcatcatct tcactgtgct cctggttctg 2700
ttcttcatct tcacctactt caaagttcct gagactaaag gccggacctt cgatgagatc 2760
gcttccggct tccggcaggg gggagccagc caaagtgaca agacacccga ggagctgttc 2820
catcccctgg gggctgattc ccaagtgtga gtcgccccag atcaccagcc cggcctgctc 2880
ccagcagccc taaggatctc tcaggagcac aggcagctgg atgagacttc caaacctgac 2940
agatgtcagc cgagccgggc ctggggctcc tttctccagc cagcaatgat gtccagaaga 3000
atattcagga cttaacggct ccaggatttt aacaaaagca agactgttgc tcaaatctat 3060
tcagacaagc aacaggtttt ataatttttt tattactgat tttgttattt ttatatcagc 3120
ctgagtctcc tgtgcccaca tcccaggctt caccctgaat ggttccatgc ctgagggtgg 3180
agactaagcc ctgtcgagac acttgccttc ttcacccagc taatctgtag ggctggacct 3240
atgtcctaag gacacactaa tcgaactatg aactacaaag cttctatccc aggaggtggc 3300
tatggccacc cgttctgctg gcctggatct ccaagaaaca aagggcgaat tccagcacac 3360
tggcggccgt tactagtgga tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt 3420
tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta 3480
ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 3540
aagcaattcg ttgatctgaa tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt 3600
agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 3660
ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 3720
ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg 3780
ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 3840
cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 3900
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 3960
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 4020
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 4080
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 4140
aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 4200
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 4260
tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 4320
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc 4380
ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 4440
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 4500
atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 4560
tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 4620
tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 4680
ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 4740
atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 4800
ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 4860
catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 4920
cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 4980
ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 5040
cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 5100
cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 5160
tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 5220
agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 5280
ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 5340
gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 5400
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 5460
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 5520
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 5580
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 5640
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 5700
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 5760
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 5820
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 5880
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 5940
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 6000
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 6060
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 6120
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 6180
ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 6240
taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 6300
agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 6360
gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 6420
cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 6480
ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 6540
ccatgattac gccagattta attaaggc 6568
<210> 29
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 29
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 30
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 30
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 31
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 31
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 32
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> hGlut1 cDNA
<400> 32
atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60
cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120
gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180
ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240
ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300
ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420
cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480
cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540
ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600
tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720
ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780
gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900
gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020
ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080
ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200
ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320
ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtga 1479
<210> 33
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 33
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 34
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 34
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 35
<211> 7057
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI mGlut1
<400> 35
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
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ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
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gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
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ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320
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tcccagcagc aagaaggtga cgggccgcct catgttggct gtgggaggag cagtgctcgg 1440
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gttctacaat caaacatgga accaccgcta cggagagccc atcccatcca ccacactcac 1560
cacgctttgg tctctctccg tggccatctt ctctgtcggg ggcatgattg gttccttctc 1620
tgtcggcctc tttgttaatc gctttggcag gcggaactcc atgctgatga tgaacctgtt 1680
ggcctttgtg gctgctgtgc ttatgggctt ctccaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740
gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgcggcctg actactggct ttgtgcccat 1800
gtatgtggga gaggtgtcac ctacagctct acgtggagcc ctaggcacac tgcaccagct 1860
gggaatcgtc gttggcatcc ttattgccca ggtgtttggc ttagactcca tcatgggcaa 1920
tgcagacttg tggcctctgc tgctcagtgt catcttcatc ccagccctgc tacagtgtat 1980
cctgttgccc ttctgccccg agagcccccg cttcctgctc atcaatcgta acgaggagaa 2040
ccgggccaag agtgtgctga agaagcttcg agggacagcc gatgtgaccc gagacctgca 2100
ggagatgaaa gaagagggtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcttggagct 2160
gttccgctca cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220
gcagctgtcg ggtatcaatg ctgtgttcta ctactcaacg agcatcttcg agaaggcagg 2280
tgtgcagcag cctgtgtacg ccaccatcgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340
ggtgtcgctg tttgttgtag agcgagctgg acgacggacc ctgcacctca ttggcctggc 2400
tggcatggca ggctgtgctg tgctcatgac catcgccctg gccttgctgg aacggctgcc 2460
ttggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtagg 2520
ccctggtcct attccatggt tcattgtggc cgagctgttc agccaggggc cccgtcctgc 2580
tgctattgct gtggctggct tctccaactg gacctcaaac ttcattgtgg gcatgtgctt 2640
ccagtatgtg gagcaactgt gcggccccta cgtcttcatc atcttcacgg tgctcctcgt 2700
gctcttcttc atcttcacct acttcaaagt ccctgagacc aaaggccgaa ccttcgatga 2760
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ctattcagat aagcagcagg ttttataatt tttttattac tgattttgtt attttttttt 3120
tttatcagcc actctcctat ctccacactg tagtcttcac cttgattggc ccagtgcctg 3180
agggtgggga ccacgccctg tccagacact tgccttcttt gccaagctaa tctgtagggc 3240
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aggcggtagc tgccacccac ttccgcaggc ctggacctcg gcaccatagg ggtccggact 3360
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gatatttata tattttttgg ttgtcaatat taaatacaga cactaagtta tagtatatct 3660
ggacaaaccc acttgtaaat acaccaacaa actcctgtaa ctttacctaa gcagatataa 3720
atggctggtt tttagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actgtctcgc tgcggccgct ctagagtatc 3840
cctcgactct agagtcgacc cgggcggcct cgaggacggg gtgaactacg cctgaggatc 3900
cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 3960
ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 4020
ctcactcgga agcaattcgt tgatctgaat ttcgaccacc cataataccc attaccctgg 4080
tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg 4140
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 4200
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagcctt aattaaccta 4260
attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 4320
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 4380
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg 4440
cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 4500
tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 4560
gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 4620
accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 4680
tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 4740
gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 4800
cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 4860
tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 4920
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 4980
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 5040
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 5100
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tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 5400
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accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 5580
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taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 5760
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 5820
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 5880
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 5940
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 6000
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 6060
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 6120
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 6180
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 6240
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tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 6360
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 6420
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 6480
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 6540
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 6600
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 6660
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 6720
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cagctatgac catgattacg ccagatttaa ttaaggc 7057
<210> 36
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 36
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 37
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 37
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
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ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 38
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 38
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
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cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 39
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> mGlut1 cDNA
<400> 39
atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60
ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120
gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180
ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240
ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300
ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420
cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480
cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540
ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600
tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720
ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780
gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900
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ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080
ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200
cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320
ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtga 1479
<210> 40
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 40
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 41
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 41
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 42
<211> 6641
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI hGlut1-out3xmiR-122 BS
<400> 42
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcagctc ttaaggctag 1140
agtacttaat acgactcact ataggctagc gcgccgaatt ggccgccagt gtgatggata 1200
tctgcagaat tcgcccttag caggagacca aacgacgggg gtcggagtca gagtcgcagt 1260
gggagtcccc ggaccggagc acgagcctga gcgggagagc gccgctcgca cgcccgtcgc 1320
cacccgcgta cccggcgcag ccagagccac cagcgcagcg ctgccatgga gcccagcagc 1380
aagaagctga cgggtcgcct catgctggcc gtgggaggag cagtgcttgg ctccctgcag 1440
tttggctaca acactggagt catcaatgcc ccccagaagg tgatcgagga gttctacaac 1500
cagacatggg tccaccgcta tggggagagc atcctgccca ccacgctcac cacgctctgg 1560
tccctctcag tggccatctt ttctgttggg ggcatgattg gctccttctc tgtgggcctt 1620
ttcgttaacc gctttggccg gcggaattca atgctgatga tgaacctgct ggccttcgtg 1680
tccgccgtgc tcatgggctt ctcgaaactg ggcaagtcct ttgagatgct gatcctgggc 1740
cgcttcatca tcggtgtgta ctgtggcctg accacaggct tcgtgcccat gtatgtgggt 1800
gaagtgtcac ccacagccct tcgtggggcc ctgggcaccc tgcaccagct gggcatcgtc 1860
gtcggcatcc tcatcgccca ggtgttcggc ctggactcca tcatgggcaa caaggacctg 1920
tggcccctgc tgctgagcat catcttcatc ccggccctgc tgcagtgcat cgtgctgccc 1980
ttctgccccg agagtccccg cttcctgctc atcaaccgca acgaggagaa ccgggccaag 2040
agtgtgctaa agaagctgcg cgggacagct gacgtgaccc atgacctgca ggagatgaag 2100
gaagagagtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcctggagct gttccgctcc 2160
cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca gcagctgtct 2220
ggcatcaacg ctgtcttcta ttactccacg agcatcttcg agaaggcggg ggtgcagcag 2280
cctgtgtatg ccaccattgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt cgtgtcgctg 2340
tttgtggtgg agcgagcagg ccggcggacc ctgcacctca taggcctcgc tggcatggcg 2400
ggttgtgcca tactcatgac catcgcgcta gcactgctgg agcagctacc ccggatgtcc 2460
tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtggg tcctggcccc 2520
atcccatggt tcatcgtggc tgaactcttc agccagggtc cacgtccagc tgccattgcc 2580
gttgcaggct tctccaactg gacctcaaat ttcattgtgg gcatgtgctt ccagtatgtg 2640
gagcaactgt gtggtcccta cgtcttcatc atcttcactg tgctcctggt tctgttcttc 2700
atcttcacct acttcaaagt tcctgagact aaaggccgga ccttcgatga gatcgcttcc 2760
ggcttccggc aggggggagc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct gttccatccc 2820
ctgggggctg attcccaagt gtgagtcgcc ccagatcacc agcccggcct gctcccagca 2880
gccctaagga tctctcagga gcacaggcag ctggatgaga cttccaaacc tgacagatgt 2940
cagccgagcc gggcctgggg ctcctttctc cagccagcaa tgatgtccag aagaatattc 3000
aggacttaac ggctccagga ttttaacaaa agcaagactg ttgctcaaat ctattcagac 3060
aagcaacagg ttttataatt tttttattac tgattttgtt atttttatat cagcctgagt 3120
ctcctgtgcc cacatcccag gcttcaccct gaatggttcc atgcctgagg gtggagacta 3180
agccctgtcg agacacttgc cttcttcacc cagctaatct gtagggctgg acctatgtcc 3240
taaggacaca ctaatcgaac tatgaactac aaagcttcta tcccaggagg tggctatggc 3300
cacccgttct gctggcctgg atctcccaag aaacaaaggg cgaattccag cacactggcg 3360
gcccgaaaca aacaccattg tcacactcca acaaacacca ttgtcacact ccaacaaaca 3420
ccattgtcac actccattcg ggttactagt ggatcgagga cggggtgaac tacgcctgag 3480
gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 3540
tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 3600
gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat acccattacc 3660
ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 3720
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 3780
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa 3840
cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 3900
cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 3960
accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 4020
ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 4080
gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 4140
ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 4200
ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 4260
acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 4320
actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 4380
atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 4440
aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 4500
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 4560
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 4620
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 4680
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 4740
acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 4800
ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 4860
gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 4920
atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 4980
acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 5040
tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 5100
ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 5160
aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 5220
aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 5280
ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 5340
atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 5400
aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 5460
accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 5520
tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 5580
tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 5640
tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 5700
cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 5760
caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 5820
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 5880
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 5940
gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 6000
acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 6060
atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 6120
cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 6180
gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 6240
tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 6300
tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 6360
agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 6420
ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 6480
gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 6540
actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 6600
gaaacagcta tgaccatgat tacgccagat ttaattaagg c 6641
<210> 43
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 43
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 44
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 44
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 45
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 45
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 46
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> hGlut1 cDNA
<400> 46
atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60
cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120
gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180
ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240
ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300
ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420
cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480
cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540
ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600
tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720
ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780
gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900
gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020
ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080
ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200
ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320
ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtga 1479
<210> 47
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3'UTR
<400> 47
gtcgccccag atcaccagcc cggcctgctc ccagcagccc taaggatctc tcaggagcac 60
aggcagctgg atgagacttc caaacctgac agatgtcagc cgagccgggc ctggggctcc 120
tttctccagc cagcaatgat gtccagaaga atattcagga cttaacggct ccaggatttt 180
aacaaaagca agactgttgc tcaaatctat tcagacaagc aacaggtttt ataatttttt 240
tattactgat tttgttattt ttatatcagc ctgagtctcc tgtgcccaca tcccaggctt 300
caccctgaat ggttccatgc ctgagggtgg agactaagcc ctgtcgagac acttgccttc 360
ttcacccagc taatctgtag ggctggacct atgtcctaag gacacactaa tcgaactatg 420
aactacaaag cttctatccc aggaggtggc tatggccacc cgttctgctg gcctggatct 480
cc 482
<210> 48
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> 3xmiR-122 BS
<400> 48
cgaaacaaac accattgtca cactccaaca aacaccattg tcacactcca acaaacacca 60
ttgtcacact ccattcg 77
<210> 49
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 49
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 50
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 50
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 51
<211> 7137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI hGlut1-in3xmiR-122 BS
<400> 51
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200
aggcagctcc gcgcgctctc ccccaagagc agaggcttgc ttgtagagtg acgatctgag 1260
ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320
cgtccgttct ccgtctcgca gccggcacag ctagagcttc gagcgcagcg cggccatgga 1380
gcccagcagc aagaagctga cgggtcgcct catgctggcc gtgggaggag cagtgcttgg 1440
ctccctgcag tttggctaca acactggagt catcaatgcc ccccagaagg tgatcgagga 1500
gttctacaac cagacatggg tccaccgcta tggggagagc atcctgccca ccacgctcac 1560
cacgctctgg tccctctcag tggccatctt ttctgttggg ggcatgattg gctccttctc 1620
tgtgggcctt ttcgttaacc gctttggccg gcggaattca atgctgatga tgaacctgct 1680
ggccttcgtg tccgccgtgc tcatgggctt ctcgaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740
gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgtggcctg accacaggct tcgtgcccat 1800
gtatgtgggt gaagtgtcac ccacagccct tcgtggggcc ctgggcaccc tgcaccagct 1860
gggcatcgtc gtcggcatcc tcatcgccca ggtgttcggc ctggactcca tcatgggcaa 1920
caaggacctg tggcccctgc tgctgagcat catcttcatc ccggccctgc tgcagtgcat 1980
cgtgctgccc ttctgccccg agagtccccg cttcctgctc atcaaccgca acgaggagaa 2040
ccgggccaag agtgtgctaa agaagctgcg cgggacagct gacgtgaccc atgacctgca 2100
ggagatgaag gaagagagtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcctggagct 2160
gttccgctcc cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220
gcagctgtct ggcatcaacg ctgtcttcta ttactccacg agcatcttcg agaaggcggg 2280
ggtgcagcag cctgtgtatg ccaccattgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340
cgtgtcgctg tttgtggtgg agcgagcagg ccggcggacc ctgcacctca taggcctcgc 2400
tggcatggcg ggttgtgcca tactcatgac catcgcgcta gcactgctgg agcagctacc 2460
ccggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtggg 2520
tcctggcccc atcccatggt tcatcgtggc tgaactcttc agccagggtc cacgtccagc 2580
tgccattgcc gttgcaggct tctccaactg gacctcaaat ttcattgtgg gcatgtgctt 2640
ccagtatgtg gagcaactgt gtggtcccta cgtcttcatc atcttcactg tgctcctggt 2700
tctgttcttc atcttcacct acttcaaagt tcctgagact aaaggccgga ccttcgatga 2760
gatcgcttcc ggcttccggc aggggggagc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct 2820
gttccatccc ctgggggctg attcccaagt gtgaggagcc ccacacccag cccggcctgc 2880
tccctgcagc ccaaggatct ctctggagca caggcagcta gatgagacct cttccgaacc 2940
gacagatctc gggcaagccg ggcctgggcg cctttcctca gccagcagtg aagtccagga 3000
ggatattcag gactttgatg gctccagaat ttttaatgaa agcaagactg ctgctcagat 3060
ctattcagat aagcagcagg ttttataatt tttttattac tgattttgtt attttttttt 3120
tttatcagcc actctcctat ctccacactg tagtcttcac cttgattggc ccagtgcctg 3180
agggtgggga ccacgccctg tccagacact tgccttcttt gccaagctaa tctgtagggc 3240
tggacctatg gccaaggaca cactaatacc gaactctgag ctaggaggct ttaccgctgg 3300
aggcggtagc tgccacccac ttccgcaggc ctggacctcg gcaccatagg ggtccggact 3360
ccattttagg attcgcccat tcctgtctct tcctacccaa ccactcaatt aatctttcct 3420
tgcctgagac cagttggaag cactggagtg cagggaggag agggaagggc caggctgggc 3480
tgccaggttc tagtctcctg tgcactgagg gccacacaaa caccatgaga aggaccgaaa 3540
caaacaccat tgtcacactc caacaaacac cattgtcaca ctccaacaaa caccattgtc 3600
acactccatt cggacctcgg aggctgagaa cttaactgct gaagacacgg acactcctgc 3660
cctgctgtgt atagatggaa gatatttata tattttttgg ttgtcaatat taaatacaga 3720
cactaagtta tagtatatct ggacaaaccc acttgtaaat acaccaacaa actcctgtaa 3780
ctttacctaa gcagatataa atggctggtt tttagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actgtctcgc 3900
tgcggccgct ctagagtatc cctcgactct agagtcgacc cgggcggcct cgaggacggg 3960
gtgaactacg cctgaggatc cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg 4020
aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 4080
tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga agcaattcgt tgatctgaat ttcgaccacc 4140
cataataccc attaccctgg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 4200
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 4260
gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 4320
gcgcagcctt aattaaccta attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 4380
ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 4440
tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 4500
ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 4560
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 4620
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 4680
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 4740
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 4800
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 4860
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 4920
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat 4980
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5040
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 5100
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5160
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 5220
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 5280
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 5340
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 5400
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 5460
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 5520
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 5580
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 5640
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 5700
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5760
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 5820
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 5880
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 5940
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6000
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6060
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6120
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6180
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6240
agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6300
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6360
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 6420
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 6480
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 6540
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 6600
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 6660
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 6720
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 6780
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 6840
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 6900
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 6960
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 7020
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 7080
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccagatttaa ttaaggc 7137
<210> 52
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 52
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 53
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 53
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 54
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 54
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 55
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> hGlut1 cDNA
<400> 55
atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60
cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120
gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180
ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240
ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300
ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420
cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480
cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540
ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600
tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720
ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780
gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900
gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020
ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080
ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200
ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320
ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtga 1479
<210> 56
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' UTR and 3xmiR-122
<400> 56
ggagccccac acccagcccg gcctgctccc tgcagcccaa ggatctctct ggagcacagg 60
cagctagatg agacctcttc cgaaccgaca gatctcgggc aagccgggcc tgggcgcctt 120
tcctcagcca gcagtgaagt ccaggaggat attcaggact ttgatggctc cagaattttt 180
aatgaaagca agactgctgc tcagatctat tcagataagc agcaggtttt ataatttttt 240
tattactgat tttgttattt ttttttttta tcagccactc tcctatctcc acactgtagt 300
cttcaccttg attggcccag tgcctgaggg tggggaccac gccctgtcca gacacttgcc 360
ttctttgcca agctaatctg tagggctgga cctatggcca aggacacact aataccgaac 420
tctgagctag gaggctttac cgctggaggc ggtagctgcc acccacttcc gcaggcctgg 480
acctcggcac cataggggtc cggactccat tttaggattc gcccattcct gtctcttcct 540
acccaaccac tcaattaatc tttccttgcc tgagaccagt tggaagcact ggagtgcagg 600
gaggagaggg aagggccagg ctgggctgcc aggttctagt ctcctgtgca ctgagggcca 660
cacaaacacc atgagaagga ccgaaacaaa caccattgtc acactccaac aaacaccatt 720
gtcacactcc aacaaacacc attgtcacac tccattcgga cctcggaggc tgagaactta 780
actgctgaag acacggacac tcctgccctg ctgtgtatag atggaagata tttatatatt 840
ttttggttgt caatattaaa tacagacact aagttatagt atatctggac aaacccactt 900
gtaaatacac caacaaactc ctgtaacttt acctaagcag atataaatgg ctggttttta 960
gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaa 1035
<210> 57
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 57
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 58
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 58
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 59
<211> 7137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI mGlut1-in3xmiR-122 BS
<400> 59
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200
aggcagctcc gcgcgctctc ccccaagagc agaggcttgc ttgtagagtg acgatctgag 1260
ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320
cgtccgttct ccgtctcgca gccggcacag ctagagcttc gagcgcagcg cggccatgga 1380
tcccagcagc aagaaggtga cgggccgcct catgttggct gtgggaggag cagtgctcgg 1440
atcactgcag ttcggctata acactggtgt catcaacgcc ccccagaagg ttattgagga 1500
gttctacaat caaacatgga accaccgcta cggagagccc atcccatcca ccacactcac 1560
cacgctttgg tctctctccg tggccatctt ctctgtcggg ggcatgattg gttccttctc 1620
tgtcggcctc tttgttaatc gctttggcag gcggaactcc atgctgatga tgaacctgtt 1680
ggcctttgtg gctgctgtgc ttatgggctt ctccaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740
gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgcggcctg actactggct ttgtgcccat 1800
gtatgtggga gaggtgtcac ctacagctct acgtggagcc ctaggcacac tgcaccagct 1860
gggaatcgtc gttggcatcc ttattgccca ggtgtttggc ttagactcca tcatgggcaa 1920
tgcagacttg tggcctctgc tgctcagtgt catcttcatc ccagccctgc tacagtgtat 1980
cctgttgccc ttctgccccg agagcccccg cttcctgctc atcaatcgta acgaggagaa 2040
ccgggccaag agtgtgctga agaagcttcg agggacagcc gatgtgaccc gagacctgca 2100
ggagatgaaa gaagagggtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcttggagct 2160
gttccgctca cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220
gcagctgtcg ggtatcaatg ctgtgttcta ctactcaacg agcatcttcg agaaggcagg 2280
tgtgcagcag cctgtgtacg ccaccatcgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340
ggtgtcgctg tttgttgtag agcgagctgg acgacggacc ctgcacctca ttggcctggc 2400
tggcatggca ggctgtgctg tgctcatgac catcgccctg gccttgctgg aacggctgcc 2460
ttggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtagg 2520
ccctggtcct attccatggt tcattgtggc cgagctgttc agccaggggc cccgtcctgc 2580
tgctattgct gtggctggct tctccaactg gacctcaaac ttcattgtgg gcatgtgctt 2640
ccagtatgtg gagcaactgt gcggccccta cgtcttcatc atcttcacgg tgctcctcgt 2700
gctcttcttc atcttcacct acttcaaagt ccctgagacc aaaggccgaa ccttcgatga 2760
gatcgcttcc ggcttccggc aggggggtgc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct 2820
cttccaccct ctgggggcgg actcccaagt gtgaggagcc ccacacccag cccggcctgc 2880
tccctgcagc ccaaggatct ctctggagca caggcagcta gatgagacct cttccgaacc 2940
gacagatctc gggcaagccg ggcctgggcg cctttcctca gccagcagtg aagtccagga 3000
ggatattcag gactttgatg gctccagaat ttttaatgaa agcaagactg ctgctcagat 3060
ctattcagat aagcagcagg ttttataatt tttttattac tgattttgtt attttttttt 3120
tttatcagcc actctcctat ctccacactg tagtcttcac cttgattggc ccagtgcctg 3180
agggtgggga ccacgccctg tccagacact tgccttcttt gccaagctaa tctgtagggc 3240
tggacctatg gccaaggaca cactaatacc gaactctgag ctaggaggct ttaccgctgg 3300
aggcggtagc tgccacccac ttccgcaggc ctggacctcg gcaccatagg ggtccggact 3360
ccattttagg attcgcccat tcctgtctct tcctacccaa ccactcaatt aatctttcct 3420
tgcctgagac cagttggaag cactggagtg cagggaggag agggaagggc caggctgggc 3480
tgccaggttc tagtctcctg tgcactgagg gccacacaaa caccatgaga aggaccgaaa 3540
caaacaccat tgtcacactc caacaaacac cattgtcaca ctccaacaaa caccattgtc 3600
acactccatt cggacctcgg aggctgagaa cttaactgct gaagacacgg acactcctgc 3660
cctgctgtgt atagatggaa gatatttata tattttttgg ttgtcaatat taaatacaga 3720
cactaagtta tagtatatct ggacaaaccc acttgtaaat acaccaacaa actcctgtaa 3780
ctttacctaa gcagatataa atggctggtt tttagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actgtctcgc 3900
tgcggccgct ctagagtatc cctcgactct agagtcgacc cgggcggcct cgaggacggg 3960
gtgaactacg cctgaggatc cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg 4020
aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 4080
tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga agcaattcgt tgatctgaat ttcgaccacc 4140
cataataccc attaccctgg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 4200
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 4260
gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 4320
gcgcagcctt aattaaccta attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 4380
ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 4440
tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 4500
ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 4560
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 4620
cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 4680
tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 4740
gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 4800
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 4860
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 4920
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat 4980
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5040
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 5100
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5160
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 5220
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 5280
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 5340
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 5400
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 5460
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 5520
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 5580
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 5640
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 5700
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5760
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 5820
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 5880
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 5940
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6000
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6060
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6120
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6180
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6240
agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6300
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6360
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 6420
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 6480
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 6540
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 6600
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 6660
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 6720
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 6780
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 6840
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 6900
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 6960
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 7020
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 7080
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccagatttaa ttaaggc 7137
<210> 60
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 60
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 61
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 61
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 62
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 62
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 63
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> mGlut1 cDNA
<400> 63
atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60
ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120
gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180
ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240
ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300
ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420
cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480
cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540
ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600
tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720
ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780
gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900
gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020
ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080
ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200
cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320
ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtga 1479
<210> 64
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3'UTR and 3x-miR122BS
<400> 64
ggagccccac acccagcccg gcctgctccc tgcagcccaa ggatctctct ggagcacagg 60
cagctagatg agacctcttc cgaaccgaca gatctcgggc aagccgggcc tgggcgcctt 120
tcctcagcca gcagtgaagt ccaggaggat attcaggact ttgatggctc cagaattttt 180
aatgaaagca agactgctgc tcagatctat tcagataagc agcaggtttt ataatttttt 240
tattactgat tttgttattt ttttttttta tcagccactc tcctatctcc acactgtagt 300
cttcaccttg attggcccag tgcctgaggg tggggaccac gccctgtcca gacacttgcc 360
ttctttgcca agctaatctg tagggctgga cctatggcca aggacacact aataccgaac 420
tctgagctag gaggctttac cgctggaggc ggtagctgcc acccacttcc gcaggcctgg 480
acctcggcac cataggggtc cggactccat tttaggattc gcccattcct gtctcttcct 540
acccaaccac tcaattaatc tttccttgcc tgagaccagt tggaagcact ggagtgcagg 600
gaggagaggg aagggccagg ctgggctgcc aggttctagt ctcctgtgca ctgagggcca 660
cacaaacacc atgagaagga ccgaaacaaa caccattgtc acactccaac aaacaccatt 720
gtcacactcc aacaaacacc attgtcacac tccattcgga cctcggaggc tgagaactta 780
actgctgaag acacggacac tcctgccctg ctgtgtatag atggaagata tttatatatt 840
ttttggttgt caatattaaa tacagacact aagttatagt atatctggac aaacccactt 900
gtaaatacac caacaaactc ctgtaacttt acctaagcag atataaatgg ctggttttta 960
gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaa 1035
<210> 65
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 65
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 66
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3'ITR
<400> 66
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 67
<211> 7138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI mGlut1-out3xmiR-122 BS
<400> 67
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200
aggcagctcc gcgcgctctc ccccaagagc agaggcttgc ttgtagagtg acgatctgag 1260
ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320
cgtccgttct ccgtctcgca gccggcacag ctagagcttc gagcgcagcg cggccatgga 1380
tcccagcagc aagaaggtga cgggccgcct catgttggct gtgggaggag cagtgctcgg 1440
atcactgcag ttcggctata acactggtgt catcaacgcc ccccagaagg ttattgagga 1500
gttctacaat caaacatgga accaccgcta cggagagccc atcccatcca ccacactcac 1560
cacgctttgg tctctctccg tggccatctt ctctgtcggg ggcatgattg gttccttctc 1620
tgtcggcctc tttgttaatc gctttggcag gcggaactcc atgctgatga tgaacctgtt 1680
ggcctttgtg gctgctgtgc ttatgggctt ctccaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740
gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgcggcctg actactggct ttgtgcccat 1800
gtatgtggga gaggtgtcac ctacagctct acgtggagcc ctaggcacac tgcaccagct 1860
gggaatcgtc gttggcatcc ttattgccca ggtgtttggc ttagactcca tcatgggcaa 1920
tgcagacttg tggcctctgc tgctcagtgt catcttcatc ccagccctgc tacagtgtat 1980
cctgttgccc ttctgccccg agagcccccg cttcctgctc atcaatcgta acgaggagaa 2040
ccgggccaag agtgtgctga agaagcttcg agggacagcc gatgtgaccc gagacctgca 2100
ggagatgaaa gaagagggtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcttggagct 2160
gttccgctca cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220
gcagctgtcg ggtatcaatg ctgtgttcta ctactcaacg agcatcttcg agaaggcagg 2280
tgtgcagcag cctgtgtacg ccaccatcgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340
ggtgtcgctg tttgttgtag agcgagctgg acgacggacc ctgcacctca ttggcctggc 2400
tggcatggca ggctgtgctg tgctcatgac catcgccctg gccttgctgg aacggctgcc 2460
ttggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtagg 2520
ccctggtcct attccatggt tcattgtggc cgagctgttc agccaggggc cccgtcctgc 2580
tgctattgct gtggctggct tctccaactg gacctcaaac ttcattgtgg gcatgtgctt 2640
ccagtatgtg gagcaactgt gcggccccta cgtcttcatc atcttcacgg tgctcctcgt 2700
gctcttcttc atcttcacct acttcaaagt ccctgagacc aaaggccgaa ccttcgatga 2760
gatcgcttcc ggcttccggc aggggggtgc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct 2820
cttccaccct ctgggggcgg actcccaagt gtgaggagcc ccacacccag cccggcctgc 2880
tccctgcagc ccaaggatct ctctggagca caggcagcta gatgagacct cttccgaacc 2940
gacagatctc gggcaagccg ggcctgggcg cctttcctca gccagcagtg aagtccagga 3000
ggatattcag gactttgatg gctccagaat ttttaatgaa agcaagactg ctgctcagat 3060
ctattcagat aagcagcagg ttttataatt tttttattac tgattttgtt attttttttt 3120
tttatcagcc actctcctat ctccacactg tagtcttcac cttgattggc ccagtgcctg 3180
agggtgggga ccacgccctg tccagacact tgccttcttt gccaagctaa tctgtagggc 3240
tggacctatg gccaaggaca cactaatacc gaactctgag ctaggaggct ttaccgctgg 3300
aggcggtagc tgccacccac ttccgcaggc ctggacctcg gcaccatagg ggtccggact 3360
ccattttagg attcgcccat tcctgtctct tcctacccaa ccactcaatt aatctttcct 3420
tgcctgagac cagttggaag cactggagtg cagggaggag agggaagggc caggctgggc 3480
tgccaggttc tagtctcctg tgcactgagg gccacacaaa caccatgaga aggacctcgg 3540
aggctgagaa cttaactgct gaagacacgg acactcctgc cctgctgtgt atagatggaa 3600
gatatttata tattttttgg ttgtcaatat taaatacaga cactaagtta tagtatatct 3660
ggacaaaccc acttgtaaat acaccaacaa actcctgtaa ctttacctaa gcagatataa 3720
atggctggtt tttagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actgtctcgc tgcggcccga aacaaacacc 3840
attgtcacac tccaacaaac accattgtca cactccaaca aacaccattg tcacactcca 3900
ttcgggccgc tctagagtat ccctcgactc tagagtcgac ccgggcggcc tcgaggacgg 3960
ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat 4020
gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 4080
gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aagcaattcg ttgatctgaa tttcgaccac 4140
ccataatacc cattaccctg gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 4200
aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 4260
ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 4320
cgcgcagcct taattaacct aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 4380
accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 4440
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 4500
gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4560
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 4620
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 4680
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 4740
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 4800
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 4860
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 4920
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa 4980
tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 5040
gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 5100
acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 5160
cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 5220
catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 5280
tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 5340
cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 5400
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 5460
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 5520
ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 5580
accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 5640
ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 5700
attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 5760
ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 5820
tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 5880
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 5940
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 6000
tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 6060
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 6120
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 6180
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 6240
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 6300
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 6360
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 6420
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 6480
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 6540
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 6600
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 6660
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 6720
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 6780
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 6840
ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 6900
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 6960
tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 7020
ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 7080
ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccagattta attaaggc 7138
<210> 68
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 68
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 69
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 69
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 70
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 70
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 71
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> mGlut1 cDNA
<400> 71
atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60
ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120
gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180
ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240
ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300
ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420
cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480
cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540
ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600
tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720
ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780
gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900
gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020
ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080
ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200
cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320
ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtga 1479
<210> 72
<211> 955
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3'UTR
<400> 72
ggagccccac acccagcccg gcctgctccc tgcagcccaa ggatctctct ggagcacagg 60
cagctagatg agacctcttc cgaaccgaca gatctcgggc aagccgggcc tgggcgcctt 120
tcctcagcca gcagtgaagt ccaggaggat attcaggact ttgatggctc cagaattttt 180
aatgaaagca agactgctgc tcagatctat tcagataagc agcaggtttt ataatttttt 240
tattactgat tttgttattt ttttttttta tcagccactc tcctatctcc acactgtagt 300
cttcaccttg attggcccag tgcctgaggg tggggaccac gccctgtcca gacacttgcc 360
ttctttgcca agctaatctg tagggctgga cctatggcca aggacacact aataccgaac 420
tctgagctag gaggctttac cgctggaggc ggtagctgcc acccacttcc gcaggcctgg 480
acctcggcac cataggggtc cggactccat tttaggattc gcccattcct gtctcttcct 540
acccaaccac tcaattaatc tttccttgcc tgagaccagt tggaagcact ggagtgcagg 600
gaggagaggg aagggccagg ctgggctgcc aggttctagt ctcctgtgca ctgagggcca 660
cacaaacacc atgagaagga cctcggaggc tgagaactta actgctgaag acacggacac 720
tcctgccctg ctgtgtatag atggaagata tttatatatt ttttggttgt caatattaaa 780
tacagacact aagttatagt atatctggac aaacccactt gtaaatacac caacaaactc 840
ctgtaacttt acctaagcag atataaatgg ctggttttta gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 955
<210> 73
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> 3xmiR-122BS
<400> 73
cgaaacaaac accattgtca cactccaaca aacaccattg tcacactcca acaaacacca 60
ttgtcacact ccattcg 77
<210> 74
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 74
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 75
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3'ITR
<400> 75
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<220>
<223> Glut1QPCR F1
<400> 76
cttgcttgta gagtgacgat c 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<220>
<223> Glut1QPCR R1
<400> 77
cagtgatccg agcactgctc 20
<210> 78
<211> 492
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> mGlut1 amino acid sequence; solute carrier family 2,
facilitated glucose transporter member 1
<400> 78
Met Asp Pro Ser Ser Lys Lys Val Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val
20 25 30
Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp
35 40 45
Asn His Arg Tyr Gly Glu Pro Ile Pro Ser Thr Thr Leu Thr Thr Leu
50 55 60
Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser
65 70 75 80
Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met
85 90 95
Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ala Ala Val Leu Met Gly Phe
100 105 110
Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile
115 120 125
Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val
130 135 140
Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His
145 150 155 160
Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Met Gly Asn Ala Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Val
180 185 190
Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Leu Leu Pro Phe Cys Pro
195 200 205
Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala
210 215 220
Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr Arg Asp
225 230 235 240
Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Gly Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys
245 250 255
Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile
260 265 270
Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn
275 280 285
Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln
290 295 300
Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe
305 310 315 320
Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu
325 330 335
His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Val Leu Met Thr
340 345 350
Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Arg Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser
355 360 365
Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly
370 375 380
Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg
385 390 395 400
Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe
405 410 415
Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr
420 425 430
Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr
435 440 445
Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala
450 455 460
Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu
465 470 475 480
Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val
485 490
<210> 79
<211> 492
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> hGlut1 amino acid sequence; solute carrier family 2,
facilitated glucose transporter member 1
<400> 79
Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val
20 25 30
Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp
35 40 45
Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu
50 55 60
Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser
65 70 75 80
Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met
85 90 95
Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe
100 105 110
Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile
115 120 125
Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val
130 135 140
Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His
145 150 155 160
Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Met Gly Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Ile
180 185 190
Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Val Leu Pro Phe Cys Pro
195 200 205
Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala
210 215 220
Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr His Asp
225 230 235 240
Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys
245 250 255
Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile
260 265 270
Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn
275 280 285
Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln
290 295 300
Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe
305 310 315 320
Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu
325 330 335
His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr
340 345 350
Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser
355 360 365
Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly
370 375 380
Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg
385 390 395 400
Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe
405 410 415
Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr
420 425 430
Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr
435 440 445
Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala
450 455 460
Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu
465 470 475 480
Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val
485 490
<210> 80
<211> 6834
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI hGlut1- EGFP
<400> 80
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200
aggcagctcc gcgcgctctc ccccaagagc agaggcttgc ttgtagagtg acgatctgag 1260
ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320
cgtccgttct ccgtctcgca gccggcacag ctagagcttc gagcgcagcg cggccatgga 1380
tcccagcagc aagaaggtga cgggccgcct catgttggct gtgggaggag cagtgctcgg 1440
atcactgcag ttcggctata acactggtgt catcaacgcc ccccagaagg ttattgagga 1500
gttctacaat caaacatgga accaccgcta cggagagccc atcccatcca ccacactcac 1560
cacgctttgg tctctctccg tggccatctt ctctgtcggg ggcatgattg gttccttctc 1620
tgtcggcctc tttgttaatc gctttggcag gcggaactcc atgctgatga tgaacctgtt 1680
ggcctttgtg gctgctgtgc ttatgggctt ctccaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740
gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgcggcctg actactggct ttgtgcccat 1800
gtatgtggga gaggtgtcac ctacagctct acgtggagcc ctaggcacac tgcaccagct 1860
gggaatcgtc gttggcatcc ttattgccca ggtgtttggc ttagactcca tcatgggcaa 1920
tgcagacttg tggcctctgc tgctcagtgt catcttcatc ccagccctgc tacagtgtat 1980
cctgttgccc ttctgccccg agagcccccg cttcctgctc atcaatcgta acgaggagaa 2040
ccgggccaag agtgtgctga agaagcttcg agggacagcc gatgtgaccc gagacctgca 2100
ggagatgaaa gaagagggtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcttggagct 2160
gttccgctca cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220
gcagctgtcg ggtatcaatg ctgtgttcta ctactcaacg agcatcttcg agaaggcagg 2280
tgtgcagcag cctgtgtacg ccaccatcgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340
ggtgtcgctg tttgttgtag agcgagctgg acgacggacc ctgcacctca ttggcctggc 2400
tggcatggca ggctgtgctg tgctcatgac catcgccctg gccttgctgg aacggctgcc 2460
ttggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtagg 2520
ccctggtcct attccatggt tcattgtggc cgagctgttc agccaggggc cccgtcctgc 2580
tgctattgct gtggctggct tctccaactg gacctcaaac ttcattgtgg gcatgtgctt 2640
ccagtatgtg gagcaactgt gcggccccta cgtcttcatc atcttcacgg tgctcctcgt 2700
gctcttcttc atcttcacct acttcaaagt ccctgagacc aaaggccgaa ccttcgatga 2760
gatcgcttcc ggcttccggc aggggggtgc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct 2820
cttccaccct ctgggggcgg actcccaagt gaccggtgcc atggtgagca agggcgagga 2880
gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 2940
gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 3000
catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 3060
cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 3120
cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 3180
caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 3240
gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 3300
cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 3360
gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 3420
ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 3480
cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 3540
cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa agcggccatc aagcttatcg 3600
ggccgctcta gagtatccct cgactctaga gtcgacccgg gcggcctcga ggacggggtg 3660
aactacgcct gaggatccga tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag 3720
ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt 3780
tggaattttt tgtgtctctc actcggaagc aattcgttga tctgaatttc gaccacccat 3840
aatacccatt accctggtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact acaaggaacc 3900
cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 3960
accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 4020
cagccttaat taacctaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 4080
tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 4140
cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga 4200
cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc 4260
tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac 4320
gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag 4380
tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc 4440
atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg 4500
actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata 4560
agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa 4620
cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 4680
cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 4740
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 4800
ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 4860
gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 4920
gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 4980
atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 5040
caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 5100
gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 5160
accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 5220
ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 5280
gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 5340
acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 5400
atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 5460
ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 5520
gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 5580
gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 5640
tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 5700
taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 5760
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 5820
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 5880
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 5940
agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 6000
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 6060
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 6120
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 6180
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 6240
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 6300
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 6360
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 6420
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 6480
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 6540
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 6600
aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 6660
gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 6720
ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 6780
caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca gatttaatta aggc 6834
<210> 81
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
<220>
<223> 5'ITR
<400> 81
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 82
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 82
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 83
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 83
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 84
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> eGFP
<400> 84
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 85
<211> 1959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> hGlut1 cDNA and 3'UTR
<400> 85
atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60
cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120
gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180
ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240
ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300
ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420
cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480
cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540
ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600
tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720
ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780
gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900
gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020
ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080
ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200
ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320
ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtgag tcgccccaga tcaccagccc 1500
ggcctgctcc cagcagccct aaggatctct caggagcaca ggcagctgga tgagacttcc 1560
aaacctgaca gatgtcagcc gagccgggcc tggggctcct ttctccagcc agcaatgatg 1620
tccagaagaa tattcaggac ttaacggctc caggatttta acaaaagcaa gactgttgct 1680
caaatctatt cagacaagca acaggtttta taattttttt attactgatt ttgttatttt 1740
tatatcagcc tgagtctcct gtgcccacat cccaggcttc accctgaatg gttccatgcc 1800
tgagggtgga gactaagccc tgtcgagaca cttgccttct tcacccagct aatctgtagg 1860
gctggaccta tgtcctaagg acacactaat cgaactatga actacaaagc ttctatccca 1920
ggaggtggct atggccaccc gttctgctgg cctggatct 1959
<210> 86
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 86
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 87
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 87
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 88
<211> 6885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> pAAV CB6 PI mGlut1-2A- EGFP
<400> 88
cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180
ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720
gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780
agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840
aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900
gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960
tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020
ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080
gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140
ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200
aggcagctcc gcgcgctctc ccccaagagc agaggcttgc ttgtagagtg acgatctgag 1260
ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320
cgtccgttct ccgtctcgca gccggcacag ctagagcttc gagcgcagcg cggccatgga 1380
tcccagcagc aagaaggtga cgggccgcct catgttggct gtgggaggag cagtgctcgg 1440
atcactgcag ttcggctata acactggtgt catcaacgcc ccccagaagg ttattgagga 1500
gttctacaat caaacatgga accaccgcta cggagagccc atcccatcca ccacactcac 1560
cacgctttgg tctctctccg tggccatctt ctctgtcggg ggcatgattg gttccttctc 1620
tgtcggcctc tttgttaatc gctttggcag gcggaactcc atgctgatga tgaacctgtt 1680
ggcctttgtg gctgctgtgc ttatgggctt ctccaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740
gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgcggcctg actactggct ttgtgcccat 1800
gtatgtggga gaggtgtcac ctacagctct acgtggagcc ctaggcacac tgcaccagct 1860
gggaatcgtc gttggcatcc ttattgccca ggtgtttggc ttagactcca tcatgggcaa 1920
tgcagacttg tggcctctgc tgctcagtgt catcttcatc ccagccctgc tacagtgtat 1980
cctgttgccc ttctgccccg agagcccccg cttcctgctc atcaatcgta acgaggagaa 2040
ccgggccaag agtgtgctga agaagcttcg agggacagcc gatgtgaccc gagacctgca 2100
ggagatgaaa gaagagggtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcttggagct 2160
gttccgctca cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220
gcagctgtcg ggtatcaatg ctgtgttcta ctactcaacg agcatcttcg agaaggcagg 2280
tgtgcagcag cctgtgtacg ccaccatcgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340
ggtgtcgctg tttgttgtag agcgagctgg acgacggacc ctgcacctca ttggcctggc 2400
tggcatggca ggctgtgctg tgctcatgac catcgccctg gccttgctgg aacggctgcc 2460
ttggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtagg 2520
ccctggtcct attccatggt tcattgtggc cgagctgttc agccaggggc cccgtcctgc 2580
tgctattgct gtggctggct tctccaactg gacctcaaac ttcattgtgg gcatgtgctt 2640
ccagtatgtg gagcaactgt gcggccccta cgtcttcatc atcttcacgg tgctcctcgt 2700
gctcttcttc atcttcacct acttcaaagt ccctgagacc aaaggccgaa ccttcgatga 2760
gatcgcttcc ggcttccggc aggggggtgc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct 2820
cttccaccct ctgggggcgg actcccaagt gaccggtaat tttgaccttc ttaagcttgc 2880
gggagacgtc gagtccaacc ctgggcccgc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac 2940
cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt 3000
gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac 3060
caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca 3120
gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc 3180
cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg 3240
cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga 3300
cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa 3360
cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca 3420
caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg 3480
cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa 3540
agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat 3600
cactctcggc atggacgagc tgtacaagta aagcggccat caagcttatc gggccgctct 3660
agagtatccc tcgactctag agtcgacccg ggcggcctcg aggacggggt gaactacgcc 3720
tgaggatccg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag 3780
catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 3840
ttgtgtctct cactcggaag caattcgttg atctgaattt cgaccaccca taatacccat 3900
taccctggta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat 3960
ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt 4020
cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagccttaa 4080
ttaacctaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 4140
ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 4200
ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg 4260
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 4320
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 4380
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 4440
gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 4500
atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 4560
ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 4620
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 4680
taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 4740
cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 4800
tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 4860
gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 4920
gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 4980
ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 5040
acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 5100
ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 5160
aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 5220
gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 5280
tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 5340
gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 5400
cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 5460
atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 5520
attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 5580
ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 5640
gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 5700
tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 5760
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 5820
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 5880
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 5940
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 6000
ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 6060
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 6120
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 6180
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 6240
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 6300
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 6360
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 6420
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 6480
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 6540
tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 6600
accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct 6660
ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 6720
gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 6780
ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 6840
acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt aaggc 6885
<210> 89
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 5'ITR
<400> 89
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 90
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CMV IE enhancer
<400> 90
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 91
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> CB promoter
<400> 91
ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt ac 382
<210> 92
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> eGFP
<400> 92
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 93
<211> 1476
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> mGlut1 cDNA and 3'UTR
<400> 93
atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60
ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120
gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180
ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240
ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300
ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360
atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420
cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480
cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540
ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600
tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660
gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720
ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780
gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840
tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900
gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960
actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020
ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080
ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140
gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200
cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260
tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320
ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380
gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440
gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtg 1476
<210> 94
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> Poly A signal
<400> 94
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 95
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> 3' ITR
<400> 95
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130
<210> 96
<211> 2208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<223> AAV9 DNA
<400> 96
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60
gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120
aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180
aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240
cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300
caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360
gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420
ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480
aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540
tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600
cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660
gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780
tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840
tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900
ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960
caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020
acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080
gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140
acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200
ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260
cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320
gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380
ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440
ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500
tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560
ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620
ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680
accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740
gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800
atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860
aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920
aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980
gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040
gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100
tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160
tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctg 2208
<210> 97
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> AAV9 protein
<400> 97
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
Claims (23)
- Glut1을 암호화하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 아데노-관련 벡터(recombinant adeno-associated vector: rAAV).
- 제1항에 있어서, 닭 베타-액틴 프로모터를 더 포함하되, 상기 rAAV는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)을 가로지를 수 있는, 재조합 AAV.
- 제2항에 있어서, 상기 이식유전자는 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는, 재조합 AAV.
- 제2항에 있어서, 상기 닭 베타-액틴 프로모터는 서열번호 31, 38, 45, 54, 62 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 AAV.
- 제1항에 있어서, 상기 AAV는 AAV8 또는 AAV9인, 재조합 AAV.
- 제1항에 있어서, 상기 Glut1은 서열번호 78 또는 79를 포함하는, 재조합 AAV.
- 제1항에 있어서, 서열번호 48, 56, 59, 64 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 요소를 더 포함하는, 재조합 AAV.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 miRNA 요소에 측접하는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)를 더 포함하는, 재조합 AAV.
- 제1항의 재조합 AAV를 포함하는 조성물.
- 제9항에 있어서, 약제학적 담체를 더 포함하는, 조성물.
- 제9항의 조성물을 포함하는 용기 하우징을 포함하는 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 용기는 주사기인, 키트.
- 대상체의 혈액 뇌 장벽(BBB)에서 Glut1 수송을 회복하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- Glut1 결핍 증후군의 치료가 필요한 대상체에서 Glut1 결핍 증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 수액당감소증, 후천적 소두증, 운동실조 및 실조성 운동 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 Glut1 결핍 증후군과 관련된 증상 중 적어도 하나를 완화시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 닭 베타-액틴 프로모터를 더 포함하고, 상기 rAAV는 상기 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 이식유전자는 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 닭 베타-액틴 프로모터는 서열번호 31, 38, 45, 54, 62 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 AAV8 또는 AAV9인, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Glut1은 서열번호 78 또는 79를 포함하는, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 서열번호 48, 56, 59, 64 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 요소를 더 포함하는, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 miRNA 요소에 측접하는 역위 말단 반복부(ITR)를 더 포함하는, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 약제학적 담체를 더 포함하는 조성물 내에 포함되는, 방법.
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