KR20220023962A - 파브리병을 치료하기 위한 조성물, 디바이스 및 방법 - Google Patents

파브리병을 치료하기 위한 조성물, 디바이스 및 방법 Download PDF

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KR20220023962A
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라우렌 에밀리 바네이
마이클 보우리가드
구일라우메 카르모나
프란시스코 카발레로 곤잘레츠
리차드 하이데브레흐트
에리카 엘렌 존스톤
로버트 제임스 밀러
오웬 오코너
매티아스 알렉산더 오벨리
데이비드 페리트
자레드 에이. 세웰
데빈 맥킨레이 스미스
오미드 베이세
제프리 찰스 웨이
폴 켈빈 워톤
조 인
브라이언 리차드 플루하티
엘리나 마키노
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Abstract

GLA 단백질을 분비하도록 조작된 RPE 세포 및 조작된 RPE 세포를 포함하는 조성물, 약제학적 제제 및 이식 가능한 디바이스, 및 파브리병을 치료하기 위한 이의 제조 및 이용 방법이 본원에 기술된다.

Description

파브리병을 치료하기 위한 조성물, 디바이스 및 방법
우선권의 주장
본 출원은 2019년 3월 27일 출원된 미국 가출원 제62/824,969호 및 2019년 9월 27일 출원된 미국 가출원 제62/907,380호에 대한 우선권을 주장한다. 전술한 출원의 각각의 개시내용은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2020년 3월 25일자 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 S2225-7028WO_SL.txt이며, 79,658 바이트 크기이다.
파브리병은 효소 알파-갈락토시다제 A(GLA 또는 GALA)의 결핍된 활성에 의해 유발되는 희귀한 X-연관, 리소좀 축적 장애이며, 이는 다양한 조직 및 기관에서 글리코스핑고지질 글로보트리아오실세라미드(Gb3)의 축적의 손상을 야기한다. GLA 유전자는 당지질 및 당단백질로부터 말단 알파-갈락토실 모이어티를 가수분해시키는 동종이량체 당단백질을 인코딩하며, 우세한 기질은 글로보트리아오실세라미드(Gb3, 세라미드 트리헥소시드)이다. GLA 유전자 내의 370개 초과의 돌연변이가 파브리병을 갖는 사람들에서 확인된 바 있으며, 이의 다수는 단일의 가족에게 특유하다. GLA 활성을 제거하는 돌연변이는 전형적으로 소아기에서 시작하는 중증의 고전적인 형태의 파브리병을 야기한다. 더욱 경증의 후기-발병 형태의 파브리병은 GLA 활성을 감소시키지만 제거하지는 않는 돌연변이와 관련이 있다.
재조합적으로 생성되는 GLA 단백질은 파브리병을 위한 효소 대체 요법에 사용하기 위하여 승인된 바 있다. 유전자 요법이 GLA 효소를 파브리 환자에 전달하기 위한 대안적인 접근법으로서 조사되고 있다. 그러나, 파브리병을 치료하기 위한 ERT 및 유전자 요법 접근법은 다양한 제조 및 효능 난제를 가지며, 이에 따라, 파브리병을 위한 신규한 치료 양상이 바람직하다.
GLA를 발현하고 분비하도록 조작된 망막 색소 상피(RPE) 세포 및 조작된 RPE 세포를 포함하는 조성물, 약제학적 제품 및 의료 디바이스 및 이들의 제조 및 이용 방법이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 조작된 RPE 세포를 포함하는 조성물, 제품 및 디바이스는 포유동물 대상체에 투여되는, 예를 들어, 그 내측에 배치되는 경우 이물 반응을 완화시키도록 구성된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 전구체 GLA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 프로모터 서열은 도 8b에 나타낸 서열(본원에 SEQ ID NO:18로 나타냄)의 뉴클레오티드 337 내지 2069와 동일하거나 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어진다. 일 구현예에서, 전구체 GLA 코딩 서열은 GLA 융합 단백질을 인코딩한다. 일 구현예에서, GLA 융합 단백질은 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 분비 단백질 유래의 신호 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 전구체 또는 성숙 GLA 코딩 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일 구현예에서, 전구체 GLA 코돈-최적화된 코딩 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6이다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 HSPG2에서 유래된 것이다(예를 들어, 도 4a의 아미노산 1 내지 21). 일 구현예에서, GLA 융합 단백질은 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드(예를 들어, 인간 GLA 또는 HSPG2 유래) 및 GLA 아미노산 서열의 C-말단에 작동 가능하게 연결된 비-GLA 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 비-GLA 폴리펩티드는 융합 단백질에 유리한 특성을 부여하며, 예를 들어, 발현되고/거나 분비되는 단백질의 양을 증가시키거나, 생체내에서 반감기를 연장시키거나, 조직 내로의 융합 단백질의 분배를 향상시키거나, 흡수를 증가시킨다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:47을 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 단리된 이중-가닥 DNA 분자로서 제공되며, 일 구현예에서, DNA 분자는 SEQ ID NO:48을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 전구체 GLA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 RPE 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 염색체외 발현 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 RPE 세포, 예를 들어, ARPE19 세포의 게놈 내의 적어도 하나의 위치 내로 통합된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 조작된 RPE 세포 또는 복수의 이러한 세포를 포함하는 적어도 하나의 세포-함유 구획을 포함하는 디바이스를 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물, 제품 및 디바이스는 조작된 RPE 세포(들)를 캡슐화하는 중합체 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 캡슐화 중합체 조성물은 적어도 하나의 세포-결합 물질(CBS), 예를 들어, 세포 결합 펩티드, 예를 들어, RGD(SEQ ID NO: 28) 또는 RGDSP(SEQ ID NO: 49)를 포함한다. 일 구현예에서, 캡슐화 중합체 조성물은 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)로 공유적으로 변형된 알긴산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 디바이스는 디바이스가 대상체 내측에 배치되는 경우 이물 반응(FBR)을 완화시키기 위한 적어도 하나의 수단을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, FBR을 완화시키기 위한 수단은 디바이스의 외부 표면 상에 및/또는 세포-함유 구획을 둘러싸는 장벽 구획 내에 배치된 본원에 정의된 바와 같은 비섬유성 화합물을 포함한다. 일 구현예에서, 비섬유성 화합물은 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00001
[화학식 I]
상기 식에서, 변수 A, L1, M, L2, P, L3 및 Z, 및 관련 하위변수는 본원에 정의된다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, 화학식 I-a, I-b, I-c, I-d, I-e, I-f, II, II-a, III, III-a, III-b, III-c, 또는 III-d)은 예를 들어, 본원의 표 3에 나타낸 화합물 중 하나를 포함하는 본원에 기재된 화합물이다. 일 구현예에서, 비섬유성 화합물은 표 3에 나타낸 화합물 100, 화합물 101 또는 화합물 102이다.
일 양태에서, 본 개시내용의 디바이스는 복수의 살아있는 조작된 RPE 세포 (및 선택적으로 하나 이상의 결합 물질)를 포함하는 세포-함유 구획(예를 들어, 내부 구획)이 비섬유성 중합체를 포함하는 장벽 구획(예를 들어, 외부 구획)에 의해 둘러싸인 2-구획 하이드로겔 캡슐(예를 들어, 마이크로캡슐(1 mm 미만의 직경) 또는 밀리캡슐(적어도 1 mm의 직경))이다. 일 구현예에서, 비섬유성 화합물은 화학식 I의 화합물이다. 일 구현예에서, 하이드로겔 캡슐은 구형 캡슐이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 본원에 기재된 복수의(적어도 3, 6, 12, 25, 50개 또는 그 이상 중 임의의 것의) RPE 세포-함유 디바이스를 포함하는, 제제(예를 들어, 조성물)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제제는 약제학적으로 허용 가능한 조성물이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 GLA를 발현하고 분비하도록 조작된 복수의 RPE 세포를 포함하는 디바이스의 제조 또는 제작 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 당해 방법은 복수의 조작된 RPE 세포를 제공하는 단계 및 복수의 RPE 세포를 봉입 성분, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 디바이스의 세포-함유 구획에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 봉입 성분은 가요성 중합체(예를 들어, PLA, PLG, PEG, CMC 또는 다당류, 예를 들어, 알긴산염)를 포함한다. 일부 구현예에서, 봉입 성분은 비가요성 중합체 또는 금속 하우징(housing)을 포함한다. 일부 구현예에서, 디바이스의 표면은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 화학식 I의 화합물로 화학적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 조작된 RPE 세포 또는 본원에 기술된 디바이스를 평가하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 당해 방법은 조작된 RPE 세포 또는 디바이스를 제공하는 단계 및 RPE 세포 또는 디바이스의 구조적 또는 기능적 파라미터를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 당해 방법은 조작된 RPE 세포 또는 디바이스를 a) 세포 생존력 및 b) 생성되는 GLA의 양 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 평가는 (i) 디바이스(또는 디바이스의 제제)의 형성 또는 (ii) 대상체로의 디바이스(또는 디바이스의 제제)의 투여 후 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 60, 90 또는 120일에 수행된다. 일 구현예에서, 평가는 대상체로의 투여 후 적어도 30, 60, 90 또는 120일에 섬유증의 양 및/또는 디바이스(또는 제제 내의 디바이스)의 구조적 온전성을 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물(예를 들어, 마우스, 인간)이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 GLA를 발현하고 분비하도록 조작된 RPE 세포를 포함하는 디바이스 또는 디바이스 제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 파브리병을 위한 대상체의 치료 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 투여하는 단계는 각각이 GLA를 생산하는 능력을 갖는 복수의 디바이스를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 제제를 대상체 내에 배치하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 디바이스 또는 디바이스 제제는 중추신경계, 뇌, 척주, 눈 또는 망막 이외의 부위에 투여되거나, 배치되거나, 제공된다. 일부 구현예에서, 이식 가능한 요소는 대상체의 복막강(예를 들어, 작은복막주머니(lesser sac)), 그물막(omentum) 또는 피하 지방에 투여되거나, 배치되거나, 주사된다. 일 구현예에서, 당해 방법은 대상체로부터 제거된 조직 시료에, 예를 들어, 혈액 시료로부터 분리된 혈장, 간 생검에 존재하는 GLA의 양 또는 활성을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 조직 시료는 제15일, 제30일, 제60일 또는 제120일에 제거된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용의 하나 이상의 구현예의 상세사항이 본원에 제시된다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 이점은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면, 실시예 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 예시적인 조작된 인간 RPE 세포에 의해 발현되는 야생형 인간 전구체 GLA 단백질에 대한 아미노산 서열(도 1a, SEQ ID NO:1) 및 뉴클레오티드 코딩 서열(도 1b, SEQ ID NO:2)을 보여주며, 밑줄은 GLA 신호 펩티드에 대한 아미노산 및 코딩 서열을 나타낸다.
도 2는 도 1에 나타낸 야생형 전구체 인간 GLA 단백질을 인코딩하는 예시적인 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:3)을 보여주며, 밑줄은 GLA 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 나타낸다.
도 3은 도 1에 나타낸 야생형 전구체 인간 GLA 단백질을 인코딩하는 또 다른 예시적인 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:4)을 보여주며, 밑줄은 GLA 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 나타낸다.
도 4는 HSPG2 신호 펩티드가 인간 야생형 성숙 GLA 아미노산 서열에 융합된 예시적인 조작된 인간 RPE 세포에 의해 발현되는 GLA 융합 단백질에 대한 아미노산 서열(도 4a, SEQ ID NO:5) 및 코돈-최적화된 뉴클레오티드 코딩 서열(도 4b, SEQ ID NO:6)을 보여주며, 밑줄은 HSPG2 신호 펩티드에 대한 아미노산 및 코딩 서열을 나타낸다(각각 SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16).
도 5는 예시적인 조작된 인간 RPE 세포에 의해 발현되는 예시적인 GLA-IgG 융합 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여주며, 도 5a(SEQ ID NO:7)는 링커 아미노산 링커 서열(이탤릭체)을 통해 IgG의 경쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열(볼드체)에 융합된 인간 야생형 GLA 성숙 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 HSPG2 신호 펩티드(밑줄)를 보여주며, 도 5b(SEQ ID NO:8)는 IgG1 중쇄 불변 영역에 대한 아미노산 서열에 융합된 HSPG2 신호 펩티드(밑줄)를 보여주며, 도 5c(SEQ ID NO:9) 및 도 5d(SEQ ID NO:10)는 각각 도 5a 및 도 5b의 아미노산 서열에 대한 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여주며, HSPG2 신호 펩티드에 대한 코딩 서열은 밑줄로 나타나 있으며, 링커 코딩 서열은 이탤릭체로 나타나 있고, IgG 경쇄 코딩 서열은 볼드체로 나타나 있다.
도 6은 예시적인 조작된 인간 RPE 세포에 의해 발현되는 예시적인 GLA-나노바디-Fc 융합 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여주며, 도 6a(SEQ ID NO:11)는 링커 아미노산 서열(이탤릭체)을 통해 FC5 나노바디(볼드체) 및 인간 IgG1의 Fc 영역(볼드체, 밑줄)에 대한 아미노산 서열에 융합된 인간 야생형 GLA 성숙 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 HSPG2 신호 펩티드(밑줄)를 보여주며, 도 6b(SEQ ID NO:12)는 도 6a의 아미노산 서열에 대한 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여주며, HSPG2 신호 펩티드에 대한 코딩 서열은 밑줄로 나타나 있고, 링커 코딩 서열은 이탤릭체로 나타나 있고, FC5 및 IgG1 Fc 영역에 대한 코딩 서열은 볼드체로 나타나 있다.
도 7은 예시적인 조작된 인간 RPE 세포에 의해 발현되는 예시적인 GLA-Fc 융합 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여주며, 도 7a(SEQ ID NO:13)는 링커(이탤릭체)를 통해 인간 IgG1의 Fc 영역(볼드체)에 융합된 인간 야생형 GLA 성숙 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 HSPG2 신호 펩티드(밑줄)를 보여주며, 도 7b(SEQ ID NO:14)는 도 6a의 아미노산 서열에 대한 뉴클레오티드 코딩 서열을 보여주며, HSPG2 신호 펩티드에 대한 코딩 서열은 밑줄로 나타나 있고, 링커 코딩 서열은 이탤릭체로 나타나 있고, IgG1 Fc 영역에 대한 코딩 서열은 볼드체로 나타나 있다.
도 8은 본원에 기술된 GLA 단백질을 발현하는 조작된 RPE 세포를 생성하는 데 유용한 예시적인 PiggyBac 트랜스포존 발현 벡터를 예시한 것이며, 도 8a는 벡터 맵을 보여주며, 도 8b는 벡터의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:17)을 보여주며, 프로모터 서열은 밑줄 표시되어 있다(SEQ ID NO:18).
도 9는 본 개시내용의 예시적인 2-구획 하이드로겔 캡슐을 예시한 것이며, 선은 하기를 나타낸다: 하이드로겔 형성 중합체 및 세포 결합 펩티드에 공유적으로 부착된 하이드로겔-형성 중합체의 혼합물로부터 형성된 제1 내부 구획에 캡슐화된 조작된 RPE 세포; 제2 구획; 및 제2 구획의 내부, 및 캡슐의 표면 상 둘 모두에 배치된 비섬유성 화합물. 도 9에는 SEQ ID NO: 44로서 "GRGDSP"가 개시되어 있다.
도 10은 도 1 내지 도 7에 나타낸 다양한 GLA 뉴클레오티드 서열 구축물을 사용하여 조작된 RPE 세포에 의해 시험관내에서 분비되는 GLA 단백질의 양을 보여주는 막대 그래프이다: 야생형(GLA 1), 코돈-최적화(GLA 2, GLA 3) 및 코돈-최적화된 GLA 융합체(GLA4-1, GLA 4-2, GLA 5, GLA 6 및 GLA 7).
도 11은 외부 구획이 화학적으로 변형된 알긴산염 용액으로부터 형성되고, 내부 구획이 GLA 4 구축물(GLA)로 트랜스펙션된 클론 세포주의 현탁액이 결여되거나(대조군) 함유된 GRGDSP-변형된 알긴산염(SEQ ID NO: 44로서 개시된 "GRGDSP") 및 미변형된 알긴산염의 배합물을 포함하는 알긴산염 용액으로부터 형성되는 2-구획 알긴산염 하이드로겔 캡슐로의 이식 후 14일째에 파브리 마우스로부터 수득된 조직 시료(간(도 11a) 및 혈장(도 11b)) 내의 인간 GLA 활성을 보여준다.
도 12는 (i) 대조군 캡슐 또는 GLA-생성 캡슐로의 이식 후 14일째에 도 11에 기술된 동일한 파브리 마우스 또는 (ii) 이식되지 않은 야생형 마우스(WT)로부터 수득된 다양한 조직 시료(혈장(도 12a), 간(도 12b), 신장(도 12c) 및 심장(도 12d)) 내의 Gb3 수준을 보여준다.
도 13은 도 12에 기술된 동일한 조직 시료에서의 Lyso-Gb3 감소의 양을 예시한 것이며, 도 13a, 도 13b, 도 13c 및 도 13d는 각각 간 신장, 심장 및 혈장 내의 Lyso-Gb3 수준을 보여준다.
도 14는 저, 중등 또는 고 용량의 도 11에 기술된 GLA-생성 캡슐 또는 고 용량의 대조군 캡슐로의 이식 후 10일째에 파브리 마우스로부터 수득된 다양한 조직 시료(혈장(도 14a), 간(도 14b), 신장(도 14c) 및 심장(도 14d)) 내의 Gb3 감소의 양을 예시한 것이다.
도 15는 도 14에 기술된 동일한 조직 시료 내의 Lyso-Gb3 감소의 양을 예시한 것이며, 도 15a, 도 15b, 도 15c 및 도 15d는 각각 간 신장, 심장 및 혈장 내의 Lyso-GB3 수준을 보여준다.
본 개시내용은 GLA를 발현하고 분비하도록 조작된 망막 색소 상피(RPE) 세포(예를 들어, GLA 세포 요법) 및 그의 조성물, 이러한 조작된 RPE 세포를 포함하는 디바이스, 및 이를 포함하는 디바이스 제제를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 디바이스는 세포 결합 물질 및 조작된 RPE 세포를 포함하는 세포-함유 구획을 포함한다. 일부 구현예에서, 디바이스는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 내측에 배치되는 경우 FBR을 완화시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 조작된 RPE 세포, 조성물 및 디바이스는 파브리병의 치료에 유용하다.
약어 및 정의
본 개시내용의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에 걸쳐 하기의 약어가 사용될 것이다.
CBP 세포-결합 펩티드
CBPP 세포-결합 폴리펩티드
CBP-중합체 링커를 통해 CBP로 공유적으로 변형된 중합체
CBS 세포-결합 물질
CM-Alg 화학적으로 변형된 알긴산염
CM-LMW-Alg 화학적으로 변형된, 저 분자량 알긴산염
CM-LMW-Alg-101 표 3에 나타낸 화합물 101로 화학적으로 변형된 저 분자량 알긴산염
CM-HMW-Alg 화학적으로 변형된 고 분자량 알긴산염
CM-HMW-Alg-101 표 3에 나타낸 화합물 101로 화학적으로 변형된 고 분자량 알긴산염
CM-MMW-Alg 화학적으로 변형된 중등 분자량 알긴산염
CM-MMW-Alg-101 표 3에 나타낸 화합물 101로 화학적으로 변형된 중등 분자량 알긴산염
Gb3 또는 GL3 글로보트리아오실세라미드
LysoGb3 또는 Lyso-Gb3 글로보트리아오실스핑고신
HMW-Alg 고 분자량 알긴산염
MMW-Alg 중등 분자량 알긴산염
RGD-알긴산염 아미노산 서열 RGD(SEQ ID NO: 28 로 기술된 "RGD")를 포함하는 펩티드로 공유적으로 변형된 알긴산염.
U-Alg 미변형된 알긴산염
U-HMW-Alg 미변형된 고 분자량 알긴산염
U-LMW-Alg 미변형된 저 분자량 알긴산염
U-MMW-Alg 미변형된 중등 분자량 알긴산염
70:30 CM-Alg:U-Alg 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은, 화학적으로 변형된 알긴산염 및 미변형된 알긴산염의 70:30 혼합물(V:V)
본 개시내용이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록, 본원에 사용된 소정의 기술적 및 과학적 용어가 구체적으로 하기에 정의된다. 본 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하는 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어, 예컨대 "하나의"("a", "an") 및 상기("the")는 문맥에서 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 그들의 상응하는 복수의 지시대상을 포함한다.
"약" 또는 "대략"은 본원에서 수치적으로 정의된 파라미터(예를 들어, RPE 세포에 의해 분비된 GLA의 양, 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)의 물리적인 설명, 예컨대 직경, 구형도, 그 안에 캡슐화된 세포의 수, 제제 내의 디바이스의 수)를 수식하기 위하여 사용되는 경우, 언급된 수치는 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 정의된 파라미터에 대한 허용 가능한 기능적 범위 이내이며, 이는 수치가 측정되거나 결정되는 방법, 예를 들어, 측정 시스템에 대한 허용 가능한 오차 범위를 포함하는 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것임을 의미한다. 예를 들어, "약"은 언급된 수치의 20% 초과 및 미만의 범위를 의미할 수 있다. 비제한적인 예로서, 약 1.5 밀리미터(mm)의 직경을 갖고, 약 5백만(M)개의 세포를 캡슐화하는 것으로 정의된 디바이스는 1.2 내지 1.8 mm의 직경을 가질 수 있으며, 4 M 내지 6 M개의 세포를 캡슐화할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 약 100개의 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)의 제제는 80 내지 120개의 디바이스를 갖는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 수식된 파라미터가 상기 파라미터에 대하여 언급된 수치를 초과하여 및 그 미만으로 15%, 10% 또는 5% 만큼 달라질 수 있음을 의미한다. 대안적으로, 특히 본원에 기재된 디바이스의 소정의 특성, 예컨대 세포 생산성, 또는 CBP 또는 비섬유성 화합물의 밀도에 관하여, 용어 "약"은 언급된 값을 초과하여 및 그 미만으로 10배 이내, 예를 들어, 5배, 4배, 3배, 2배 또는 1배 이내를 의미할 수 있다.
"획득하다" 또는 "획득하는"은 본원에 사용되는 바와 같이, 값 또는 물리적 엔티티를 "직접적으로 획득"하거나 또는 "간접적으로 획득"함으로써 값, 예를 들어, 수치 또는 이미지 또는 물리적 엔티티(예를 들어, 시료)를 소유하는 것을 지칭한다. "직접적으로 획득하는"은 값 또는 물리적 엔티티를 수득하기 위하여 공정을 수행하는 것(예를 들어, 분석 방법 또는 프로토콜을 수행하는 것)을 의미한다. "간접적으로 획득하는"은 또 다른 단체 또는 공급원(예를 들어, 물리적 엔티티 또는 값을 직접적으로 획득한 제3자 실험실)으로부터 값 또는 물리적 엔티티를 제공받는 것을 지칭한다. 값 또는 물리적 엔티티를 직접적으로 획득하는 것은 물리적 물질의 물리적 변화 또는 기계 또는 디바이스의 사용을 포함하는 공정을 수행하는 것을 포함한다. 값을 직접적으로 획득하는 것의 예는 인간 대상체로부터 시료를 수득하는 것을 포함한다. 값을 직접적으로 획득하는 것은 기계 또는 디바이스를 사용하는 공정을 수행하는 것, 예를 들어, 형광 현미경을 사용하여 형광 현미경 데이터를 획득하는 것을 포함한다.
"투여하다", "투여하는" 또는 "투여"는 본원에 사용되는 바와 같이, 본원에 기재된 엔티티(예를 들어, 디바이스 또는 디바이스의 제제)를 대상체 내로 이식하거나, 흡수시키거나, 섭취시키거나, 주사하거나, 배치하거나 또는 달리 도입하거나, 또는 투여를 위하여 이러한 엔티티를 대상체에게 제공하는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "비섬유성"은 이물 반응(FBR)을 완화시키는 화합물 또는 물질을 의미한다. 예를 들어, 비섬유성 화합물(예를 들어, 표 3에 열거된 화합물로 공유적으로 변형된 중합체를 포함하는 하이드로겔 캡슐)을 포함하는 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)의 생물학적 조직 내로의 이식에 의해 유도되는 생물학적 조직 내의 FBR의 양은 비섬유성-널(null) 참조 디바이스, 즉, 임의의 비섬유성 화합물이 결여되지만, 실질적으로 동일한 조성(예를 들어, 동일한 CBP-중합체, 동일한 세포 유형(들)) 및 구조(예를 들어, 크기, 형상, 구획의 수)의 것인 디바이스의 이식에 의해 유도되는 FBR보다 더 낮다. 일 구현예에서, FBR의 정도는 관련 기술 분야에 알려져 있는, 예를 들어, WO 2017/075630호에 기재된 바와 같은 검정을 사용하여 또는 문헌[Vegas, A., et al., Nature Biotechnol](상기)에 기재된 검정/방법(예를 들어, 이식된 캡슐의 피하 카텝신 측정, 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome; MT), 조직 섹션의 헤마톡실린 또는 에오신 염색, 콜라겐 밀도의 정량화, 대식구(CD68 또는 F4/80), 근섬유아세포(알파-근육 액틴, SMA) 또는 일반 세포 침착에 대한 세포 염색 및 공초점 현미경, 알려져 있는 염증 인자 및 면역 세포 마커의 79 RNA 서열의 정량화 또는 적합한 시험 대상체, 예를 들어, 면역적격 마우스의 복강내 공간에서 14일 후에 회수된 디바이스(예를 들어, 캡슐)에서의 대식구 및 호중구 세포에 대한 FACS 분석) 중 하나 이상을 사용하여, 예를 들어, 단백질 흡착, 대식구, 다핵 이물 거대 세포, 섬유아세포 및 혈관신생을 포함할 수 있는, 이식된 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)를 함유하는 조직에서의 면역학적 반응에 의해 평가된다. 일 구현예에서, FBR은 이식물을 함유하는 조직에서 면역 반응의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 카텝신, TNF-α, IL-13, IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-4, CCL2 또는 CCL4의 수준을 측정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 본원의 디바이스(예를 들어, 그의 외측 표면 상에 배치된 비섬유성 화합물을 포함하는 하이드로겔 캡슐)에 의해 유도된 FBR은 FBR-널 참조 디바이스, 예를 들어, FBR을 완화시키기 위한 수단이 결여된 것을 제외하고 시험 또는 청구된 디바이스와 실질적으로 동일한 디바이스(예를 들어, 비섬유성 화합물을 포함하지 않지만, 달리 청구된 캡슐과 실질적으로 동일한 하이드로겔 캡슐)에 의해 유도되는 FBR보다 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 더 낮다. 일부 구현예에서, FBR(예를 들어, 바이오마커(들)의 수준)은 약 30분, 약 1시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 1주, 약 2주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 6개월 또는 그 이상 후에 측정된다.
"알파-갈락토시다제 A", "α-Gal A", "알파-D-갈락토시다제-A", 알파-갈락토시드 갈락토하이드롤라제", "갈락토시다제 알파" 및 "GLA 단백질"은 본원에 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 야생형 포유동물 GLA 유전자에 의해 인코딩되는 성숙 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 동종이량체 단백질을 나타낸다. 일 구현예에서, 보존적으로 치환된 GLA 단백질은 본원에 기술된 GLA 활성 검정에 의해 측정하여, 대응하는 야생형 포유동물 성숙 GLA 단백질의 80 내지 120%, 85 내지 115%, 90 내지 110% 또는 95 내지 105% 이내인 효소 활성을 갖는다. 야생형 인간 GLA 유전자는 429-아미노산 폴리펩티드를 인코딩하며, 이 중 N-말단 31개 아미노산은 신호 펩티드를 구성한다. 인트론 및 엑손을 포함하는 야생형 인간 GLA 유전자의 전체 DNA 서열은 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 X14448.1에서 입수 가능하다. 야생형 인간 전구체 α-Gal A에 대한 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 X14448.1 및 U78027에서 입수 가능하며, 도 1에 나타나 있다(SEQ ID NO:1). 일부 구현예에서, 용어 "GLA 단백질"(및 전술된 동의어 중 임의의 것)은 야생형 성숙 아미노산 서열을 포함하는, 그리고 선택적으로 GLA 신호 펩티드 또는 상이한 분비 단백질, 예를 들어, RPE 세포에 의해 분비되는 단백질에 대한 신호 펩티드, 예를 들어, HSPG2에 대한 신호 펩티드가 앞에 있는 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포"는 조작된 세포 또는 조작되지 않은 세포를 지칭한다. 일 구현예에서, 세포는 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포로부터 유래되는 조작된 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 생 세포이며, 예를 들어, 본원에 기재된 또는 관련 기술 분야에 알려져 있는 임의의 기법에 의해 측정되는 바와 같이 생존 가능하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포-결합 펩티드(CBP)"는 (예를 들어, 세포-매트릭스 연접 또는 세포-세포 연접을 매개하는) 세포-부착 분자(CAM)에 대한 리간드의 세포 결합 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하는 선형 또는 환형 펩티드를 의미한다. CBP는 50, 40 30, 25, 20, 15 또는 10개 미만의 아미노산 길이이다. 일 구현예에서, CBP는 3 내지 12개 아미노산, 4 내지 10개 아미노산 길이이거나, 또는 3, 4, 5, 6, 7 8, 9 또는 10개 아미노산 길이이다. CBP 아미노산 서열은 자연-발생 결합 도메인 서열과 동일할 수 있거나, 그의 보존적으로 치환된 변이체일 수 있다. 일 구현예에서, CAM 리간드는 포유동물 단백질이다. 일 구현예에서, CAM 리간드는 하기 표 1에 열거된 단백질의 군으로부터 선택되는 인간 단백질이다. 일 구현예에서, CBP는 하기 표 1에 열거된 세포 결합 서열 또는 그의 보존적으로 치환된 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일 구현예에서, CBP는 RGD 펩티드이며, 이는 펩티드가 아미노산 서열 RGD(SEQ ID NO: 28)를 포함하며, N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에 위치한 하나 이상의 추가의 아미노산을 선택적으로 포함하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, CBP는 RGD(SEQ ID NO: 28)를 포함하는 환형 펩티드, 예를 들어, 문헌[Vilaca, H. et al., Tetrahedron 70 (35):5420-5427 (2014)]에 기재된 환형 RGD 펩티드 중 하나이다. 일 구현예에서, CBP는 RGD(SEQ ID NO: 28)를 포함하는 선형 펩티드이며, 6개 미만의 아미노산 길이이다. 일 구현예에서, CBP는 RGD(SEQ ID NO: 28) 또는 RGDSP(SEQ ID NO: 49)로 본질적으로 이루어진 선형 펩티드이다.
[표 1] 예시적인 CAM 리간드 단백질 및 세포 결합 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
본원에 사용되는 바와 같이, "CBP-중합체"는 링커를 통해 중합체에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 세포-결합 펩티드 분자를 포함하는 중합체를 의미한다. 일 구현예에서, CBP-중합체 내의 중합체는 펩티드 또는 폴리펩티드가 아니다. 일 구현예에서, CBP-중합체에서 중합체는 합성 또는 자연 발생 다당류, 예를 들어, 알긴산염, 예를 들어, 알긴산나트륨이다. 일 구현예에서, 링커는 CBP의 N-말단 또는 C-말단에 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 링커(즉, 단일의 아미노산, 또는 몇몇의 동일하거나 상이한 아미노산의 펩티드로 본질적으로 이루어짐)이다. 일 구현예에서, 아미노산 링커의 C-말단은 CBP의 N-말단에 연결되며, 아미노산 링커의 N-말단은 다당류 내의 적어도 하나의 펜던트 카복실기에 아미드 결합을 통해 연결된다. 일 구현예에서, 링커-CBP의 구조는 G(1-4)-CBP로 표현되며, 이는 링커가 1, 2, 3 또는 4개의 글리신 잔기를 갖는 것을 의미한다. 일 구현예에서, CBP-다당류, 예를 들어, CBP-알긴산염에서 단당류 모이어티 중 하나 이상은 CBP로 변형되지 않으며, 예를 들어, 미변형된 모이어티는 유리 카복실기를 갖거나, 변형 가능한 펜던트 카복실기가 결여된다. 일 구현예에서, 공유적으로 부착된 CBP를 갖는 다당류 모이어티의 수는 하기의 값 중 임의의 값 미만이다: 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 30%, 20%, 10%, 5%, 1%.
일 구현예에서, CBP-중합체에서 CBP 변형의 밀도는 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은, 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 추산된다. 일 구현예에서, CBP-중합체는 RGD-중합체(예를 들어, RGD-알긴산염)이며, 이는 링커-RGD 분자(예를 들어, GRGD(SEQ ID NO: 43) 또는 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)로 본질적으로 이루어진 펩티드)로 공유적으로 변형된 중합체(예를 들어, 알긴산염)이며, 링커-RGD 분자를 이용한 변형의 밀도는 본원에 기재된 검정을 사용하여 결정되는 바와 같이 약 0.05% 질소(N) 내지 1.00% N, 약 0.10% N 내지 약 0.75% N, 약 0.20% N 내지 약 0.50% N, 또는 약 0.30% N 내지 약 0.40% N이다. 일 구현예에서, RGD-알긴산염(예를 들어, GRGDSP(SEQ ID NO: 44)로 공유적으로 변형된 MMW 알긴산염)에서 링커-RGD 변형의 컨쥬게이션 밀도는 중합체에 컨쥬게이트된 펩티드의 양을 정량화할 수 있는 임의의 검정, 예를 들어, 본원에 기재된 정량적 펩티드 컨쥬게이션 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 80 내지 120cP의 점도를 갖는 용액(예를 들어, 염수 용액) 중 RGD-중합체 g당 0.2 내지 2.0, 0.2 내지 1.5, 0.2 내지 1.0, 0.3 내지 0.7, 0.3 내지 0.6, 또는 0.4 내지 0.6 마이크로몰의 링커-RGD 모이어티이다. 달리 명시적으로 언급되거나, 문맥으로부터 용이하게 명백해지지 않는 한, CBP-중합체에서 CBP에 대한 구체적으로 열거된 수치 농도, 농도 범위, 밀도 또는 밀도 범위는 CBP-중합체 조성물 중의 컨쥬게이트된 CBP 분자의 농도를 지칭하며, 즉, 그것은 CBP-중합체에 존재할 수 있는 임의의 잔류 유리(예를 들어, 비컨쥬게이트된) CBP를 포함하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포-결합 폴리펩티드(CBPP)"는 적어도 50, 적어도 75 또는 적어도 100개 아미노산 길이이며, CAM 리간드의 세포 결합 도메인의 아미노산 서열 또는 그의 보존적으로 치환된 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 일 구현예에서, CAM 리간드는 포유동물 단백질이다. 일 구현예에서, CBPP 아미노산은 전장 CAM 리간드, 예를 들어, 하기 표 1에 열거된 단백질 중 하나의 자연 발생 아미노산 서열 또는 그의 보존적으로 치환된 변이체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "CBP-밀도"는 본원에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, CBP-중합체 조성물, 예를 들어, G1-3RGD(SEQ ID NO: 50) 또는 G1-3RGDSP(SEQ ID NO: 51)로 변형된 알긴산염에서 링커-CBP 모이어티의 농도를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포-결합 물질(CBS)"은 세포-매트릭스 연접 또는 세포-세포 연접 또는 기타 수용체-매개의 신호전달을 매개하는 세포-부착 분자(CAM) 또는 다른 세포-표면 분자에 대한 리간드의 적어도 하나의 활성을 모방할 수 있는 임의의 화학적, 생물학적 또는 기타 유형의 물질(예를 들어, 작은 유기 화합물, 펩티드, 폴리펩티드)을 의미한다. 일 구현예에서, 생 세포를 캡슐화하는 중합체 조성물에 존재하는 경우, CBS는 세포 중 하나 이상과 일시적인 또는 영구적인 결합 또는 접촉을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, CBS는 중합체 조성물에 캡슐화된 둘 이상의 생 세포 간의 상호작용을 용이하게 한다. 일 구현예에서, 복수의 세포(예를 들어, 생 세포)를 캡슐화하는 중합체 조성물에서의 CBS의 존재는 캡슐화된 세포가 시험 대상체, 예를 들어, 마우스 내로 이식되는 경우 증가된 세포 생산성(예를 들어, 치료제의 발현) 및 증가된 세포 생존력 중 하나 또는 둘 모두와 연관된다. 일 구현예에서, CBS는 중합체 조성물에서 하나 이상의 중합체 분자에 물리적으로 부착된다. 일 구현예에서, CBS는 본원에 정의된 바와 같은, 세포-결합 펩티드 또는 세포-결합 폴리펩티드이다.
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 본원에 사용되는 바와 같이, 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고, 참조 분자와 동일한 참조 펩티드 또는 폴리펩티드의 변이체를 지칭한다. 일 구현예에서, 보존적으로 변형된 변이체는 참조 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 특징(예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강성 등)을 갖는 아미노산을 이용한 아미노산의 치환을 지칭하며, 이는 생성되는 치환된 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 최소의 영향을 갖는다. 기능적으로 유사한 아미노산의 보존적 치환 표는 관련 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 기능적 특징에 의해 그룹화된 예시적인 치환은 하기 표 2에 제시되어 있다.
[표 2] 예시적인 보존적 아미노산 치환 기.
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"본질적으로 이루어진다" 및 "본질적으로 이룬다" 또는 "본질적으로 이루어지는"과 같은 변형은, 본 명세서 및 청구범위에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 임의의 열거된 요소 또는 요소의 그룹의 포함, 및 특정 분자, 조성물, 디바이스 또는 방법의 기본적이거나 또는 신규한 특성을 실질적으로 변경하지 않는, 열거된 요소와 유사하거나 상이한 성질의 다른 요소의 선택적인 포함을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 열거된 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 세포-결합 펩티드 또는 GLA 단백질은 각각 세포-결합 펩티드 또는 GLA 단백질의 관련 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기의 열거된 아미노산 서열 내의 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수도 있다.
"로부터 유래된"은 세포 또는 세포들에 관하여 본원에 사용되는 바와 같이, 유래된 세포(들)를 생산하기 위하여, 조직, 세포주 또는 세포로부터 수득되며, 선택적으로 이어서, 배양, 계대, 불멸화, 분화 및/또는 유도되는 등인 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "디바이스"는 디바이스의 이식 후에 GLA 단백질을 발현 및 분비할 수 있는 살아있는 조작된 RPE 세포를 함유하며, 세포 영양소가 디바이스에 유입되게 함으로써 RPE 세포의 생존력을 지원하는 구성을 갖는 임의의 이식 가능한 물체(예를 들어, 입자, 하이드로겔 캡슐, 이식물, 의료 디바이스)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 디바이스는 디바이스로부터, 생 세포에 의해 생성되는 대사 부산물의 방출을 가능하게 한다.
"차등 부피"는 본원에 사용되는 바와 같이, 또 다른 구획(들)이 점유하는 공간을 배제한 본원에 기재된 디바이스 내의 하나의 구획의 부피를 지칭한다. 예를 들어, 내부 및 외부 구획을 갖는 2-구획 디바이스 내의 제2(예를 들어, 외부) 구획의 차등 부피는 제1(내부) 구획이 점유하는 공간을 배제한 제2 구획 내의 부피를 지칭한다.
본원에 사용되는 “유효량"은 원하는 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 하기 중 임의의 것의 양을 나타낸다: GLA를 분비하는 조작된 RPE 세포, GLA를 생성하는 디바이스 제제 또는 디바이스의 성분(예를 들어, 디바이스 내의 조작된 RPE 세포의 수, 디바이스 내의 CBS 및/또는 비섬유성 화합물의 양). 일부 구현예에서, 용어 "유효량"은 디바이스의 성분의 양(예를 들어, 디바이스 내의 세포의 수, 디바이스의 표면 상에 및/또는 장벽 구획 내에 배치된 비섬유성 화합물의 밀도, 세포-함유 구획 내의 CBS의 밀도)을 지칭한다. 일 구현예에서, 원하는 생물학적 반응은 조작된 RPE 세포, 이러한 세포를 함유하는 디바이스 또는 디바이스 제제로 처리된(예를 들어, 이것이 이식된) 대상체로부터 제거된 조직 시료 내의 GLA 수준의 증가이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 유효량은 요망되는 생물학적 종점, 분비된 GLA, 조성물 또는 디바이스, 치료 중인 질환, 투여 방식 및 대상체의 연령 및 건강과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 치료적 및 예방적 처치를 포함한다. 일 구현예에서, 디바이스에 배치되는 화학식 I의 화합물의 유효량은 참조 디바이스에 비하여 이식된 디바이스에 대한 FBR을 감소시키는, 예를 들어, 이식된 디바이스 상에서 또는 그 근처에서 섬유증 또는 섬유성 조직의 양을 감소시키는 양이다. 일 구현예에서, 세포-함유 구획 내의 조작된 RPE 세포와 함께 배치된 CBS의 유효량은 참조 디바이스에 비하여 세포의 생존력(예를 들어, 생 세포의 수)을 향상시키고/거나 참조 디바이스에 비하여 RPE 세포에 의한 GLA의 생성을 증가시키는(예를 들어, 디바이스가 이식된 대상체의 혈장 중 증가된 GLA 수준) 양이다. 디바이스, 조성물 또는 성분(예를 들어, 비섬유성 화합물, CBS, 조작된 세포)의 유효량은 본원에 기재된 관련 기술 분야에 알려져 있는 임의의 기법에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 세포-함유 구획 내의 CBS(예를 들어, RGD 펩티드로 변형된 알긴산염, 예를 들어, GRGDSP-알긴산염)는 본원에서 이하에 정의된 바와 같이, CBS-널 참조 디바이스에 비하여, 디바이스가 면역-약화 또는 면역-적격 동물, 예를 들어, 면역-적격 마우스(예를 들어, 미국 메인주 바 하버 소재의 잭슨 래보러터리(Jackson Laboratory)로부터 입수 가능한 C57BL/6J 마우스 균주) 내로 이식된 이후의 시점에 세포의 생존력을 증가시키고/거나 세포의 생산성을 증가시키기에 유효한 양으로 존재한다. 일 구현예에서, 세포 생존력 및/또는 생산성의 증가는 이식 후 원하는 시점에, 예를 들어, 제1일, 제3일, 제5일, 제1주, 제2주, 제4주, 제8주, 제12주, 제24주, 제36주 및 제48주 중 하나 이상에 검출 가능하다. 일 구현예에서, 유효량의 CBS는 (i) 이식 후 제1주, 제2주, 제4주 또는 제12주에 측정되는 경우, 적어도 10%, 25%, 50% 또는 100%의 세포 생존력의 증가, 및 (ii) 이식 후 제1주, 제2주, 제4주 또는 제12주에 측정되는 경우, 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배, 8배 또는 10배의 세포 생존력의 증가 중 하나 또는 둘 모두를 초래한다. 일 구현예에서, 세포-함유 구획 내의 CBS의 유효량은 최소 유효량 내지 세포 생존력 및/또는 생산성이 CBS-널 참조 디바이스에 비하여 또는 세포-함유 구획 내에 최대 유효량, 예를 들어, 최적의 양의 CBS를 함유하는 디바이스에 비하여 감소되는 더 많은 양의 범위 내에 속한다. 일 구현예에서, 세포-함유 구획 내의 CBS의 양은 최적의 양, 예를 들어, CBS-널 참조 디바이스에 비하여 세포 생존력 및/또는 생산성의 가장 큰 증가를 초래하는 양보다 50%, 25%, 10% 또는 5% 이하로 더 크거나 더 적다.
본원에 기재된 디바이스 내의 생존 가능한(및 선택적으로 사멸) 세포의 개수는 생 및 사멸 세포를 2가지 형광 염료로 차등적으로 표지한 후 검출하고, 선택적으로 형광 현미경관찰을 사용하여 표지된 세포를 정량화하는 검정을 포함하는 관련 기술 분야에 알려져 있는 임의의 기법을 사용하여 추산될 수 있다. 세포 생존력은 또한 에스테라제 활성을 측정하는 것 또는 세포 내의 ATP의 양을 정량화하는 것을 포함하여, 다른 세포 생존력 지표를 평가함으로써 평가될 수 있다.
일 구현예에서, 이식 이후 세포 생산성의 증가는 생체 내 또는 생체 외에서(예를 들어, 디바이스를 동물로부터 회수한 후의 세포 발현) 세포에 의해 발현되는 GLA 단백질의 수준에 대하여 검정함으로써 검출된다. GLA 발현은 세포외이지만 디바이스 내측에서 및/또는 디바이스 외측에서, 예를 들어, 본원에 기재된 디바이스 또는 디바이스 제제로 처리되는 동물(예를 들어, 비-인간 동물)로부터 제거된 조직 시료 내에서 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 세포 생산성은 측정된 GLA 단백질 또는 GLA 활성의 양을 투여되는 디바이스의 수(예를 들어, 동물에 배치된 캡슐의 수)로, 및/또는 투여되는 조작된 RPE 세포의 개수(예를 들어, 투여되는 캡슐 제제 내의 캡슐당 세포 개수 근사치)로 나눈 것으로서 표현된다. 일 구현예에서, 세포 생산성의 증가는, GLA의 결정된 양 또는 활성을 2개의 관심 시점 사이, 예를 들어, 투여와 측정 사이의 시간, 예를 들어, 시간, 일수 또는 주수로 나누어 추가로 정규화된다. 일 구현예에서, 생산성의 증가는, 동물로부터 제거되는 조직 시료(예를 들어, 동물로부터 수집되는 혈액 시료로부터 분리된 혈장) 내의 GLA 단백질의 양 및/또는 활성을 측정하고, 측정되는 양 및/또는 활성을 투여되는 디바이스의 수(예를 들어, 이식되는 2-구획 캡슐의 수)로 나누고, 선택적으로 추가로 결과를 투여와 조직 시료 제거 사이의 일수로 나눔으로써 결정된다.
"내인성 핵산"은 본원에 사용되는 바와 같이, 대상체 세포에서 자연적으로 발생하는 핵산이다.
"내인성 폴리펩티드"는 본원에 사용되는 바와 같이, 대상체 세포에서 자연 발생하는 폴리펩티드이다.
"조작된 RPE 세포"는 본원에 사용되는 바와 같이, 비-자연 발생 변경을 갖는 RPE 세포이고, 전형적으로, 조작되지 않은 유사한 조건 하의 달리 유사한 RPE 세포에 존재하지 않는(또는 그와 상이한 수준으로 존재하는) 핵산 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 폴리펩티드를 포함한다(외인성 핵산 서열). 일 구현예에서, 조작된 RPE 세포는 GLA 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산(예를 들어, 벡터 또는 변경된 염색체 서열)을 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 RPE 세포는 인간 야생형 GLA 아미노산 서열을 포함하는 GLA 단백질 또는 그의 변이체를 분비한다. 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 염색체(예를 들어, 외인성 핵산 서열은 내인성 염색체 서열에 배치된 외인성 서열)이거나 염색체외(예를 들어, 비-통합된 발현 벡터)이다. 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 RNA 서열, 예를 들어, mRNA를 포함한다. 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 RNA, 예를 들어, mRNA 또는 조절 RNA로서 발현되는 서열을 포함하는 염색체 또는 염색체-외 외인성 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 제2 핵산 서열, 예를 들어, GLA 코딩 서열의 입체형태 또는 발현을 조절하는 제1 염색체 또는 염색체-외 외인성 핵산 서열을 포함하고, 여기서 제2 아미노산 서열은 외인성이거나 내인성일 수 있다. 예를 들어, 조작된 RPE 세포는 내인성 서열의 발현을 제어하는 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 RPE 세포는 GLA를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열을 포함하고 자연-발생 GLA 코딩 서열보다 더 높은 GLA의 발현을 달성하는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 코돈 최적화된 서열은 상업적으로 입수 가능한 알고리즘, 예를 들어, 진옵티마이저(GeneOptimizer)(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)), 옵티뭄진(OptimumGene)TM(진스크립트(GenScript), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 진지피에스(GeneGPS)®(ATUM, 미국 캘리포니아주 뉴어크 소재) 또는 자바 코돈 어댑테이션 툴(Java Codon Adaptation Tool)(JCat, www.jcat.de, 문헌[Grote, A. et al., Nucleic Acids Research, Vol 33, Issue suppl_2, pp. W526-W531 (2005)])을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 RPE 세포(예를 들어, 조작된 ARPE-19 세포)는 안정적으로 트랜스펙션된 세포의 집단으로부터 또는 모노클로널 세포주로부터 배양된다.
"외인성 핵산"은 본원에 사용되는 바와 같이, 대상체 세포에서 자연 발생하지 않는 핵산이다.
"외인성 폴리펩티드"는 본원에 사용되는 바와 같이, 대상체 세포, 예를 들어, 조작된 세포에서 자연 발생하지 않는 폴리펩티드이다. 특정 서열의 아미노산 위치에 대한 언급은 참조 아미노산 서열, 예를 들어, (달리 언급되지 않는 한) (신호 펩티드 절단 후의) 전장 성숙 야생형 단백질의 서열 내의 상기 아미노산의 위치를 의미하며, 참조 아미노산 서열 내의 다른 위치에서의 변이, 예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환의 존재를 배제하지 않는다.
"파브리병(Fabry disease/Fabry’s disease)", "GLA 결핍", "알파-갈락토시다제 A 결핍", "앤더슨-파브리병", "광범위 혈관각화종(angiokeratoma corporis diffusum)", "광범위 몸통 혈관각화종(angiokeratoma diffuse)", "유전성 이영양성 지질증(hereditary dystopic lipidosis)"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 리소좀 효소 갈락토시다제 알파(GLA)의 결핍에 의해 야기되는 X-연관 방식으로 유전되는 희귀 유전적 리소좀 축적병을 나타낸다. 이 효소는 당지질로부터 말단 α-D-갈락토스 잔기를 절단한다. GLA 결핍은 혈관 내피 및 기타 조직 내의 글리코스핑고지질, 주로 글로보트리아오실세라미드(Gb3)의 전신 및 평생의 리소좀 축적을 초래한다. 이것은 주로 신장, 심장 및 뇌혈관계에 영향을 미치는 다기관 병증을 야기한다. 파브리병을 갖는 환자는 위장병, 통증, 뇌졸중 및 심장 및 신장 결손을 포함하는 과다한 증상으로 고통 받고, 종종 뇌졸중, 심장병 또는 신부전으로부터의 합병증으로 조기에 사망한다.
1% 미만의 α-Gal A 효소 활성을 갖는 남성에서 발생하는 전형적인 형태의 파브리병은 통상 사지의 심각한 통증(말단지각이상), 혈관 피부 병변(혈관각화종)의 출현, 발한 이상(무한증, 저한증 및 드물게 다한증), 특징적인 각막 및 수정체 혼탁 및 단백뇨의 주기적인 위기와 함께 소아기 또는 청소년기에 발병한다. 말기 신장병(ESRD)으로의 신장 기능의 점진적인 악화는 통상 30대 내지 50대의 남성에서 발생한다. 중년에, ESRD에 대하여 성공적으로 치료된 대부분의 남성은 이환율과 사망률의 주요 원인인 심장 및/또는 뇌혈관 질병이 발생한다. 대조적으로, 1% 초과의 α-Gal A 활성을 갖는 남성은 하기를 가질 수 있다: (1) 좌심실 비대, 심근병증 및 부정맥, 및 단백뇨를 갖지만, ESRD가 없는 통상 60대 내지 80대에 존재하는 심장 변이 표현형; 또는 (2) ESRD와 연관이 있지만, 피부 병변 또는 통증이 없는 신장 변이 표현형; 또는 (3) 뇌졸중 또는 일과성 허혈 발작으로서 존재하는 뇌혈관 질병. 일 구현예에서, "심장 변이" 파브리를 갖는 환자는 정상 α-Gal A 활성의 약 5 내지 15%를 가지며, 좌심실 비대 또는 심근병증이 존재한다. 이형접합성 여성은 전형적으로 남성보다 더 늦은 발병 연령에서 더욱 경증의 증상을 갖는다. 드물게는, 그들은 정상 수명 내내 상대적으로 무증상일 수 있거나, 전형적인 표현형을 갖는 남성에서 관찰되는 것들만큼 중증인 증상을 가질 수 있다.
파브리병의 추정의 진단을 제공할 수 있는 징후 및 증상은 혈관각화종 및 각막 이상(corneal verticillata)을 포함한다. 가족력을 취하여, 조기 신장병, 조기 뇌졸중 및 조기 심장 문제와 같은 증상을 갖는 다른 가족 구성원을 확인하는 것은 추가의 지원을 제공할 수 있다. 생물학적 시료, 예컨대 혈장, 백혈구, 배양된 피부 섬유아세포, 생검된 조직 또는 건조된 혈액에서 결핍된 GLA 효소 활성에 대하여 시험함으로써 확실한 진단이 남성에서 이루어질 수 있다. 여성에서는, 돌연변이 또는 연관 분석에 의해 이형접합성 돌연변이 보인자를 확인할 수 있다. 많은 여성 보인자(증상 존재 또는 부재)는 정상 미만의 수준의 GLA 활성 및/또는 특징적인 각막 혼탁을 갖는다.
본원에 사용되는 "파브리병 환자"는 파브리병을 갖는 것으로 진단받거나, 이를 갖는 것으로 의심되는 개체를 나타낸다. 일 구현예에서, 파브리병 환자는 돌연변이된 GLA 유전자를 갖는다. 파브리병의 특징적인 마커는 남성 반접합체 및 여성 보인자에서 동일한 유병률로 발생할 수 있지만, 여성은 전형적으로 덜 중증으로 이환된다. 여성 보인자는 결함이 있는 α-Gal A 유전자를 갖는 하나의 X 염색체 및 정상 유전자를 갖는 하나의 X 염색체를 가지며, 정상 대립형질의 X 염색체 불활성화가 하나 이상의 세포 유형에서 존재한다. 보인자는 종종 파브리병으로 진단받는다.
"중합체 조성물"은, 본원에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 중합체를 포함하는 조성물(예를 들어, 용액, 혼합물)이다. 한 부류로서, "중합체"는 동종중합체, 이종중합체, 공중합체, 블록 중합체, 블록 공중합체를 포함하며, 천연 및 합성 둘 모두일 수 있다. 동종중합체는 하나의 유형의 빌딩 블록 또는 단량체를 함유하는 한편, 공중합체는 1가지 초과의 유형의 단량체를 함유한다.
"폴리펩티드"는, 본원에 사용되는 바와 같이, 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기를 포함하고, 적어도 2개, 일부 구현예에서 적어도 3개, 4개, 5개, 10개, 50개, 75개, 100개, 150개 또는 200개의 아미노산 잔기를 갖는 중합체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "예방", "예방한다" 및 "예방하는"은 증상(들)의 신체적 소견을 방지하도록 파브리병의 하나 이상의 증상의 발병 이전에 GLA 대체 요법을 투여하거나 적용하는 것, 예를 들어, (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은) 조작된 RPE 세포를 캡슐화하는 디바이스의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 처치를 나타낸다. 일부 구현예에서, "예방", "예방하다" 및 "예방하는"은 파브리병의 증후 또는 증상이 아직 발생하지 않았거나 아직 관찰되지 않은 것이 요구된다. 일부 구현예에서, 치료는 예방을 포함하고, 다른 구현예에서 그것은 예방을 포함하지 않는다.
"참조 디바이스"는, 청구된 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)에 관하여 본원에 사용되는 바와 같이, (i) 청구된 디바이스의 특정 특징부, 예를 들어, 특정 외인성 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현을 증강시키는 요소(예를 들어, 프로모터 서열, 신호 펩티드 서열), 예를 들어, FBR-완화 수단(예를 들어, (본원에 정의된 바와 같은) 비섬유성 화합물을 포함하는 장벽 구획) 또는 (본원에 정의된 바와 같은) CBS(예를 들어, RGD 중합체)가 결여되고, (ii) 청구된 디바이스에서와 동일한 세포 유형(들)의 대략 동일한 양의 세포를 세포-함유 구획 내에 캡슐화하고, (iii) 특정 특징부(예를 들어, 비섬유성 화합물 또는 CBS)가 결여된 것을 제외하고, 청구된 디바이스에서와 실질적으로 유사한 중합체 조성 및 구조를 갖는 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)를 의미한다. 일 구현예에서, 참조 디바이스의 세포-함유 구획 내의 살아있는 조작된 RPE 세포의 개수는 청구된 디바이스의 세포-함유 구획 내의 살아있는 조작된 RPE 세포의 개수의 80% 내지 120% 이내, 또는 90% 내지 110% 이내이다. 일 구현예에서, 참조 및 청구된 디바이스 내의 조작된 세포는 동일한 세포 배양물로부터 수득된다. 일 구현예에서, 실질적으로 유사한 중합체 조성물은 적용 가능한 경우, 동일한 화학 및 분자량 부류의 임의의 CBP-중합체 및 비섬유성 중합체의 중합체 성분(예를 들어, 높은 G 함량 및 동일한 분자량 범위를 갖는 알긴산염)을 포함하는, 참조 및 청구된 디바이스 내의 모든 중합체를 의미한다. 예를 들어, 일 구현예에서, CBP-널 참조 디바이스의 세포-함유 구획은 청구된 다바이스의 세포-함유 구획을 형성하기 위해 사용되는 CBP-중합체에서의 미변형된 버전의 중합체(예를 들어, 알긴산염)로부터 형성된다. 청구된 2-구획 하이드로겔 밀리캡슐이 (i) 복수의 세포를 캡슐화하는 CBP-중합체로부터 형성되는 내부 구획 및 (ii) 화학적으로 변형된 중합체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CM-LMW-알긴산염) 및 미변형된 중합체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 U-HMW-알긴산염)의 혼합물로부터 형성되는 외부 구획을 갖는 일부 구현예에서, 참조 및 청구된 캡슐의 외부 구획은 동일한 중합체 혼합물로부터 형성되는 한편, 참조 캡슐의 내부 구획은 외부 구획을 위해 사용되는 동일한 중합체 혼합물 내의 세포의 현탁액으로부터 형성된다. 일 구현예에서, 실질적으로 유사한 구조는 참조 및 청구된 디바이스가 동일한 수의 구획(예를 들어, 1, 2, 3개 등) 및 대략 동일한 크기 및 형상을 갖는 것을 의미한다.
"RPE 세포"는 본원에 사용되는 바와 같이, 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 세포를 지칭한다: a) 그것은 예를 들어, ARPE-19 세포주로부터 배양된 세포를 GLA 단백질을 인코딩하는 외인성 서열로 안정하게 트랜스펙션시키거나, 다르게는 이러한 배양된 ARPE-19 세포를 조작하여, GLA 단백질을 발현시킴으로써 (ARPE-19 세포주(ATCC® CRL-2302™)를 사용하여 배양되는) 망막 색소 상피 세포(RPE) 또는 그로부터 유래되거나 조작된 세포, RPE 세포의 일차 세포 배양물로부터 유래된 세포, 자연 발생 RPE 세포로부터, 예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물로부터 직접 단리된 세포(단리 이후 장기간 배양 없이, 예를 들어, 5 또는 10회 미만의 계대 또는 5 또는 10회 미만의 세포 분열), 형질전환, 불멸화 또는 장기간(예를 들어, 5 또는 10회 초과의 계대 또는 5 또는 10회 초과의 세포 분열) RPE 세포 배양물로부터 유래된 세포를 포함함; b) 덜 분화된 세포로부터 수득된 세포, 예를 들어, (예를 들어, 시험관 내에서) RPE 세포로 발생되거나, 프로그래밍되거나, 리프로그래밍된 세포 또는 임의의 유전학적 조작을 제외하고, 자연 발생 RPE 세포 중 하나 이상과 실질적으로 유사한 세포 또는 RPE 세포(예를 들어, 세포는 IPS 세포로부터 유래될 수 있음)의 일차 또는 장기간 배양물로부터의 세포; 또는 c) 하기의 특성 중 하나 이상을 갖는 세포: i) 그것은 바이오마커 CRALBP, RPE-65, RLBP, BEST1 또는 αB-크리스탈린 중 하나 이상을 발현함; ii) 그것은 바이오마커 CRALBP, RPE-65, RLBP, BEST1 또는 αB-크리스탈린 중 하나 이상을 발현하지 않음; iii) 그것은 망막에서 천연적으로 발견되며, 부르크막(Bruch's membrane) 내의 맥락막 혈관 위에 단층을 형성함; 또는 iv) 그것은 망막에서 상피 수송, 광 흡수, 분비 및 면역 조절을 담당함; 또는 v) 그것은 합성에 의해 생성되거나, 불멸화된 RPE 세포주(예를 들어, ARPE-19 세포주(ATCC® CRL-2302™))와 동일하거나 실질적으로 동일한 유전학적 내용물 및 선택적으로 동일하거나 실질적으로 동일한 후성유전학적 내용물을 갖도록 자연 발생 세포로부터 변형됨. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RPE는 예를 들어, 새로운 특성을 갖도록 조작되며, 예를 들어, 세포는 GLA를 발현하고 분비하도록 조작된다. 다른 구현예에서, RPE 세포는 조작되지 않는다.
"염수 용액"은, 본원에 사용되는 바와 같이, 달리 특정되지 않는 한, 보통의 염수, 즉, 0.9% NaCl을 함유하는 물을 의미한다.
"서열 동일성" 또는 "동일성 백분율"은 본원에서 2개의 뉴클레오티드 서열 또는 2개의 아미노산 서열을 지칭하기 위해서 사용되는 경우, 2개의 서열이 특정 영역 내에서 동일하거나, 2개의 서열을 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응성을 위해서 비교하고 정렬하는 경우 특정된 영역 내의 특정 백분율의 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 것을 의미한다. 서열 동일성은 미국 특허 출원 공개 제2017/02334455 A1호에 기재된 임의의 알고리즘을 포함하나 이에 제한되지 않는 관련 기술 분야에 알려져 있는 표준 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치의 특정 백분율은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다.
"구형"은 본원에 사용되는 바와 같이, 구체(예를 들어, 완전히 둥근 공) 또는 예를 들어, 표면 상에 웨이브 및 파상을 가질 수 있는 구체 유사 형상을 형성하는 곡면을 갖는 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐 또는 다른 입자)를 의미한다. 구체 및 구체-유사 물체는 수학적으로 원, 타원 또는 3개의 수직 축, a, b 및 c의 각각 둘레의 조합의 회전에 의해 정의될 수 있다. 구체에 있어서, 3개의 축은 동일한 길이이다. 일반적으로, 구체-유사 형상은 서로 10% 또는 5% 또는 2.5% 이내인 준주축을 갖는 타원체(그의 평균 표면에 대하여)이다. 구체 또는 구체-유사 형상의 직경은 평균 직경, 예컨대 준주축의 평균이다.
"스페로이드"는 상기 용어가 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐 또는 다른 입자)를 지칭하기 위하여 본원에 사용되는 바와 같이, 디바이스가 (i) 완벽한 또는 전형적인 편원형 스페로이드 또는 장형 스페로이드 형상을 갖거나, (ii) 대략적으로 스페로이드를 형성하는 표면을 갖고, 예를 들어, 웨이브 및 파상을 가질 수 있고/거나 서로 100% 이내인 준주축을 갖는 타원체(그의 평균 표면에 대하여)일 수 있는 것을 의미한다.
"대상체"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 일 구현예에서, 대상체는 임의의 연령군의 인간(즉, 남성 또는 여성), 예를 들어, 소아 인간 대상체(예를 들어, 유아, 소아, 청소년) 또는 성인 인간 대상체(예를 들어, 성인, 중년 또는 노인)이다. 일 구현예에서, 대상체는 비-인간 동물, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 마우스, 개, 영장류(예를 들어, 시노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) 또는 레서스 원숭이(rhesus monkey)))이다. 일 구현예에서, 대상체는 상업적으로 관련된 포유동물(예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 염소, 고양이 또는 개) 또는 조류(예를 들어, 상업적으로 관련된 조류, 예컨대, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조)이다. 특정 구현예에서, 동물은 포유동물이다. 동물은 임의의 발달 단계의 수컷 또는 암컷일 수 있다. 비-인간 동물은 트랜스제닉 동물일 수 있다.
"총 부피"는 본원에 사용되는 바와 같이, 또 다른 구획이 점유하는 공간을 포함하는 다중-구획 디바이스의 하나의 구획 내의 부피를 지칭한다. 예를 들어, 2-구획 디바이스의 제2(예를 들어, 외부) 구획의 총 부피는 제1 구획이 점유하는 공간을 포함하는 제2 구획 내의 부피를 지칭한다.
"전사 유닛"은 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함하며, 또한 RNA 분자로의 코딩 서열의 전사 또는 폴리펩티드 분자로의 RNA 분자의 번역을 제어하거나 향상시키는 하나 이상의 추가의 요소를 포함할 수 있는, 예를 들어, 외인성 핵산에 존재하는 DNA 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 전사 유닛은 또한 폴리아데닐화(polyA) 신호 서열 및 폴리A 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 전사 유닛은 예를 들어, 도 8에 나타낸 바와 같이 외인성, 염색체외 발현 벡터에 존재하거나, 본원에 기술된 조작된 RPE 세포의 염색체에 통합된 외인성 서열로서 존재한다.
"치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에서 사용되는 바와 같이 파브리병의 증상, 징후 또는 기저 원인 중 하나 이상을 감소시키거나, 역전시키거나, 개선하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이의 진행을 억제하는 것 중 하나 이상을 지칭한다. 일 구현예에서, 치료는 파브리병과 연관된 질환 또는 증상을 감소시키거나, 역전시키거나, 개선하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이의 진행을 억제하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 치료하는 단계는 GLA 수준의 증가를 필요로 하는 대상체의 적어도 하나의 조직에서, 예를 들어, 혈장, 간, 신장 및 심장 중 하나 이상에서 GLA 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, "치료", "치료한다" 및 "치료하는"은 파브리병과 연관된 증후 또는 증상이 발생했거나 발견된 것이 요구된다. 다른 구현예에서, 치료는 예를 들어, 예방적 치료에서 파브리병의 증후 또는 증상의 부재 하에서 시행될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 이전에 (예를 들어, 증상의 이력의 견지에서 그리고/또는 유전적 또는 다른 감수성 인자의 견지에서) 감수성 개체에게 시행될 수 있다. 치료는 또한 증상이 해결된 후에, 예를 들어, 재발을 지연시키거나 예방하기 위해서 계속될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 예방을 포함하고, 다른 구현예에서 그것은 예방을 포함하지 않는다.
선택된 화학적 정의
특정 작용기 및 화학 용어의 정의는 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다. 화학 원소는 문헌[Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed., inside cover]에 따라 확인되며, 특정 작용기는 일반적으로 그 안에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가적으로, 유기 화학의 일반 원리뿐 아니라 특정 작용 모이어티 및 반응성은 문헌[Thomas Sorrell organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999]; 문헌[Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001]; 문헌[Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989]; 및 문헌[Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 약어는 화학 및 생물 분야 내에서 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 본원에 제시된 화학적 구조 및 화학식은 화학 분야에 공지된 화학 원자가의 표준 규칙에 따라 구축된다.
값의 범위가 열거되어 있는 경우, 범위 내의 각각의 값 및 하위범위를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "C1-C6 알킬"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-C6, C1-C5, C1-C4, C1-C3, C1-C2, C2-C6, C2-C5, C2-C4, C2-C3, C3-C6, C3-C5, C3-C4, C4-C6, C4-C5 및 C5-C6 알킬을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다("C1-C24 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬기는 1 내지 12개의 탄소 원자("C1-C12 알킬"), 1 내지 10개의 탄소 원자("C1-C10 알킬"), 1 내지 8개의 탄소 원자("C1-C8 알킬"), 1 내지 6개의 탄소 원자("C1-C6 알킬"), 1 내지 5개의 탄소 원자("C1-C5 알킬"), 1 내지 4개의 탄소 원자("C1-C4알킬"), 1 내지 3개의 탄소 원자("C1-C3 알킬"), 1 내지 2개의 탄소 원자("C1-C2 알킬") 또는 1개의 탄소 원자("C1 알킬")를 갖는다. 일부 구현예에서, 알킬기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-C6알킬"). C1-C6 알킬기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), 이소프로필(C3), n-부틸(C4), tert-부틸(C4), sec-부틸(C4), 이소-부틸(C4), n-펜틸(C5), 3-펜타닐(C5), 아밀(C5), 네오펜틸(C5), 3-메틸-2-부타닐(C5), 3차 아밀(C5) 및 n-헥실(C6)을 포함한다. 알킬기의 추가의 예는 n-헵틸(C7), n-옥틸(C8) 등을 포함한다. 알킬기의 각각의 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 알킬"), 하나 이상의 치환기; 예를 들어, 1 내지 5개의 치환기, 1 내지 3개의 치환기 또는 1개의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 알킬").
본원에서 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 2 내지 24개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 삼중 결합을 갖지 않는 직쇄 또는 분지형 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다("C2-C24 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 12개의 탄소 원자("C2-C12 알케닐"), 2 내지 10개의 탄소 원자("C2-C10 알케닐"), 2 내지 8개의 탄소 원자("C2-C8 알케닐"), 2 내지 6개의 탄소 원자("C2-C6 알케닐"), 2 내지 5개의 탄소 원자("C2-C5 알케닐"), 2 내지 4개의 탄소 원자("C2-C4 알케닐"), 2 내지 3개의 탄소 원자("C2-C3 알케닐") 또는 2개의 탄소 원자("C2 알케닐")를 갖는다. 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부(예컨대 2-부테닐에서) 또는 말단(예컨대 1-부테닐에서)에 존재할 수 있다. C2-C4 알케닐기의 예는 에테닐(C2), 1-프로페닐(C3), 2-프로페닐(C3), 1-부테닐(C4), 2-부테닐(C4), 부타디에닐(C4) 등을 포함한다. C2-C6 알케닐기의 예는, 상기 언급된 C2-C4 알케닐기 및 펜테닐(C5), 펜타디에닐(C5), 헥세닐(C6) 등을 포함한다. 알케닐기의 각 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 알케닐"), 하나 이상의 치환기, 예를 들어, 1 내지 5개의 치환기, 1 내지 3개의 치환기, 또는 1개의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 알케닐").
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알키닐"은 2 내지 24개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다("C2-C24 알케닐"). 일부 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 12개의 탄소 원자("C2-C12 알케닐"), 2 내지 10개의 탄소 원자("C2-C10 알키닐"), 2 내지 8개의 탄소 원자("C2-C8 알키닐"), 2 내지 6개의 탄소 원자("C2-C6 알키닐"), 2 내지 5개의 탄소 원자("C2-C5 알키닐"), 2 내지 4개의 탄소 원자("C2-C4 알키닐"), 2 내지 3개의 탄소 원자("C2-C3 알키닐") 또는 2개의 탄소 원자("C2 알키닐")를 갖는다. 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합은 내부(예컨대 2-부티닐에서) 또는 말단(예컨대 1-부티닐에서)에 존재할 수 있다. C2-C4 알키닐기의 예는 에티닐(C2), 1-프로피닐(C3), 2-프로피닐(C3), 1-부티닐(C4), 2-부티닐(C4) 등을 포함한다. 알키닐기의 각 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 알키닐"), 하나 이상의 치환기, 예를 들어 1 내지 5개의 치환기, 1 내지 3개의 치환기, 또는 1개의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 알키닐").
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로알킬"은 적어도 하나의 탄소 원자, 및 O, N, P, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 비-사이클릭 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 그의 조합을 지칭하며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, P, S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 위치에 배치될 수 있다. 예시적인 헤테로알킬기에는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3 및 -O-CH2-CH3이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 2 또는 3개 이하의 헤테로원자는 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3과 같이 연속적일 수 있다. "헤테로알킬"이 인용되고, 이어서 -CH2O, -NRCRD 등과 같은 특정 헤테로알킬기가 인용된 경우, 용어 헤테로알킬 및 -CH2O 또는 -NRCRD는 중복되거나 상호 배타적이지 않은 것으로 이해될 것이다. 오히려, 특정 헤테로알킬기는 명확성을 부가하기 위하여 인용된다. 따라서, 용어 "헤테로알킬"은, -CH2O, -NRCRD 등과 같은, 특정 헤테로알킬기를 배제하는 것으로 본원에서 해석되어서는 안된다. 헤테로알킬기의 각각의 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 헤테로알킬") 하나 이상의 치환기, 예를 들어, 1 내지 5개의 치환기, 1 내지 3개의 치환기 또는 1개의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 헤테로알킬").
용어 "알킬렌", "알케닐렌", "알키닐렌" 또는 "헤테로알킬렌"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 다르게 언급되지 않는 한, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로알킬로부터 각각 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌 또는 헤테로알킬렌기는 예를 들어 C1-C6-원 알킬렌, C2-C6-원 알케닐렌, C1-C6-원 알키닐렌 또는 C1-C6-원 헤테로알킬렌으로서 기재될 수 있으며, 여기서 용어 "-원(membered)"은 모이어티 내의 비-수소 원자를 지칭한다. 헤테로알킬렌기의 경우, 헤테로원자는 또한, 어느 하나의 또는 둘 모두의 쇄 말단을 차지할 수 있다(예를 들어 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 더 나아가, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 대해, 연결기의 배향은, 연결기의 화학식이 작성된 방향에 의해 암시되지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 둘 모두를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아릴"은 방향족 고리계에 제공된 6 내지 14개의 고리 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭(예를 들어, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭) 4n+2 방향족 고리계의 라디칼(예를 들어, 사이클릭 어레이에 공유된 6, 10 또는 14개의 π 전자를 가짐)을 지칭한다("C6-C14 아릴"). 일부 구현예에서, 아릴기는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐). 일부 구현예에서, 아릴기는 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C10 아릴"; 예를 들어, 나프틸, 예컨대 1-나프틸 및 2-나프틸). 일부 구현예에서, 아릴기는 14개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C14 아릴"; 예를 들어, 안트라실). 아릴기는 예를 들어 C6-C10-원 아릴로서 기재될 수 있으며, 여기서 용어 "-원"은 모이어티 내의 비-수소 고리 원자를 지칭한다. 아릴기는 페닐, 나프틸, 인데닐 및 테트라하이드로나프틸을 포함한다. 아릴기의 각 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 아릴"), 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 아릴").
본원에서 사용된 바와 같이, "헤테로아릴"은, 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10-원 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 4n+2 방향족 고리계의 라디칼(예를 들어, 사이클릭 어레이에 공유된 6 또는 10개의 π 전자를 가짐)을 지칭하며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 10-원 헤테로아릴"). 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로아릴기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 바와 같이 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로아릴 바이사이클릭 고리계는 하나 또는 둘 모두의 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로아릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 아릴기와 융합되고 부착점이 아릴 또는 헤테로아릴 고리 상에 존재하는 고리계를 포함하며, 그러한 경우에 고리 구성원의 개수는 융합된 (아릴/헤테로아릴) 고리계 내의 고리 구성원의 개수를 지칭한다. 1개의 고리가 헤테로원자를 함유하지 않는 바이사이클릭 헤테로아릴기(예를 들어, 인돌릴, 퀴놀리닐, 카바졸릴 등)에서, 부착점은 고리, 즉, 헤테로원자를 보유하는 고리(예를 들어, 2-인돌릴) 또는 헤테로원자를 함유하지 않는 고리(예를 들어, 5-인돌릴) 상에 존재할 수 있다. 헤테로아릴기는, 예를 들어, 6 내지 10-원 헤테로아릴로서 기재될 수 있으며, 여기서 용어 "-원"은 모이어티 내의 비-수소 고리 원자를 지칭한다.
일부 구현예에서, 헤테로아릴기는 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10-원 방향족 고리계이며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 10-원 헤테로아릴"). 일부 구현예에서, 헤테로아릴기는 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 8-원 방향족 고리계이며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 8-원 헤테로아릴"). 일부 구현예에서, 헤테로아릴기는 방향족 고리계에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 6-원 방향족 고리계이며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 6-원 헤테로아릴"). 일부 구현예에서, 5 내지 6-원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1 내지 3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 5 내지 6-원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1 내지 2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 5 내지 6-원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 헤테로아릴기의 각 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 헤테로아릴") 또는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 헤테로아릴").
1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 피롤릴, 푸라닐 및 티오페닐을 포함한다. 2개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴 및 이소티아졸릴을 포함한다. 3개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴 및 티아디아졸릴을 포함한다. 4개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 테트라졸릴을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 피리디닐을 포함한다. 2개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 피리다지닐, 피리미디닐 및 피라지닐을 포함한다. 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 각각 트리아지닐 및 테트라지닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 7-원 헤테로아릴기는, 제한 없이, 아제피닐, 옥세피닐 및 티에피닐을 포함한다. 예시적인 5,6-바이사이클릭 헤테로아릴기는, 제한 없이, 인돌릴, 이소인돌릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 이소벤조티오페닐, 벤조푸라닐, 벤조이소푸라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤족사디아졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈티아디아졸릴, 인돌리지닐 및 푸리닐을 포함한다. 예시적인 6,6-바이사이클릭 헤테로아릴기는, 제한 없이, 나프티리디닐, 프테리디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐 및 퀴나졸리닐을 포함한다. 다른 예시적인 헤테로아릴기는 헴 및 헴 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아릴렌" 및 "헤테로아릴렌"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 아릴 및 헤테로아릴로부터 각각 유래된 2가 라디칼을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "사이클로알킬"은 비-방향족 고리계 내에 3 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 비-방향족 사이클릭 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다("C3-C10 사이클로알킬"). 일부 구현예에서, 사이클로알킬기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자("C3-C8사이클로알킬"), 3 내지 6개의 고리 탄소 원자("C3-C6 사이클로알킬") 또는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자("C5-C10 사이클로알킬")를 갖는다. 사이클로알킬기는 예를 들어 C4-C7-원 사이클로알킬로서 기재될 수 있으며, 여기서 용어 "-원"은 모이어티 내의 비-수소 고리 원자를 지칭한다. 예시적인 C3-C6 사이클로알킬기는 비제한적으로, 사이클로프로필(C3), 사이클로프로페닐(C3), 사이클로부틸(C4), 사이클로부테닐(C4), 사이클로펜틸(C5), 사이클로펜테닐(C5), 사이클로헥실(C6), 사이클로헥세닐(C6), 사이클로헥사디에닐(C6) 등을 포함한다. 예시적인 C3-C8 사이클로알킬기는, 제한 없이, 상기 C3-C6 사이클로알킬기 뿐만 아니라 사이클로헵틸(C7), 사이클로헵테닐(C7), 사이클로헵타디에닐(C7), 사이클로헵타트리에닐(C7), 사이클로옥틸(C8), 사이클로옥테닐(C8), 큐바닐(C8), 바이사이클로[1.1.1]펜타닐(C5), 바이사이클로[2.2.2]옥타닐(C8), 바이사이클로[2.1.1]헥사닐(C6), 바이사이클로[3.1.1]헵타닐(C7) 등을 포함한다. 예시적인 C3-C10 사이클로알킬기는, 제한 없이, 상기 C3-C8 사이클로알킬기 뿐만 아니라 사이클로노닐(C9), 사이클로노네닐(C9), 사이클로데실(C10), 사이클로데세닐(C10), 옥타하이드로-1H-인데닐(C9), 데카하이드로나프탈레닐(C10), 스피로[4.5]데카닐(C10) 등을 포함한다. 상기 예는 예시적이므로, 특정 구현예에서, 사이클로알킬기는 모노사이클릭이거나("모노사이클릭 사이클로알킬") 또는 융합된, 브리지된 또는 스피로고리계, 예컨대, 바이사이클릭계("바이사이클릭 사이클로알킬")를 함유하고, 포화될 수 있거나, 또는 부분적으로 불포화될 수 있다. "사이클로알킬"은 또한 상기에서 정의된 바와 같은 사이클로알킬 고리가 하나 이상의 아릴기와 융합되고 부착점이 사이클로알킬 고리 상에 존재하는 고리계를 포함하며, 이러한 경우에 탄소의 개수는 계속해서 사이클로알킬 고리계 내의 탄소의 개수를 지칭한다. 사이클로알킬기의 각 예는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 즉, 비치환되거나("비치환된 사이클로알킬") 또는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 사이클로알킬").
"헤테로사이클릴"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 3 내지 10-원 비-방향족 고리계의 라디칼을 지칭하며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소, 황, 붕소, 인 및 규소로부터 독립적으로 선택된다("3 내지 10-원 헤테로사이클릴"). 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로사이클릴기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 바와 같이 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 모노사이클릭("모노사이클릭 헤테로사이클릴") 또는 융합된, 브리지된 또는 스피로 고리계, 예컨대, 바이사이클릭계("바이사이클릭 헤테로사이클릴")일 수 있고, 포화될 수 있거나, 또는 부분적으로 불포화될 수 있다. 헤테로사이클릴 바이사이클릭 고리계는 하나 또는 둘 모두의 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로사이클릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 사이클로알킬기와 융합되고, 부착점이 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴 고리 상에 존재하는 고리계, 또는 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴기와 융합되고 부착점이 헤테로사이클릴 고리 상에 존재하는 고리계를 포함하며, 이러한 경우에, 고리 구성원의 개수는 계속해서 헤테로사이클릴 고리계 내의 고리 구성원의 개수를 지정한다. 헤테로사이클릴기는, 예를 들어, 3 내지 7-원 헤테로사이클릴로서 기재될 수 있고, 여기서 용어 "-원"은 모이어티 내의 비-수소 고리 원자, 즉, 탄소, 질소, 산소, 황, 붕소, 인 및 규소를 지칭한다. 헤테로사이클릴의 각 경우는 독립적으로 선택적으로 치환될 수 있고, 즉, 비치환되거나("비치환된 헤테로사이클릴") 또는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다("치환된 헤테로사이클릴"). 특정 구현예에서, 헤테로사이클릴기는 비치환된 3 내지 10-원 헤테로사이클릴이다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클릴기는 치환된 3 내지 10-원 헤테로사이클릴이다.
일부 구현예에서, 헤테로사이클릴기는 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10-원 비-방향족 고리계이며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소, 황, 붕소, 인 및 규소로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 10-원 헤테로사이클릴"). 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴기는 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 8-원 비-방향족 고리계이며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 8-원 헤테로사이클릴"). 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴기는 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 6-원 비-방향족 고리계이며, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5 내지 6-원 헤테로사이클릴"). 일부 구현예에서, 5 내지 6-원 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1 내지 3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 5 내지 6-원 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1 내지 2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 5 내지 6-원 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다.
1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 3-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 아지르디닐, 옥시라닐, 티오레닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 4-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 아제티디닐, 옥세타닐 및 티에타닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 테트라하이드로푸라닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 디하이드로티오페닐, 피롤리디닐, 디하이드로피롤릴 및 피롤릴-2,5-디온을 포함한다. 2개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 디옥솔라닐, 옥사술푸라닐, 디술푸라닐 및 옥사졸리딘-2-온을 포함한다. 3개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 트리아졸리닐, 옥사디아졸리닐 및 티아디아졸리닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피리디닐 및 티아닐을 포함한다. 2개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 피페라지닐, 모르폴리닐, 디티아닐, 디옥사닐을 포함한다. 2개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 트리아진아닐 또는 티오모르폴리닐-1,1-디옥시드를 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 7-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 아제파닐, 옥세파닐 및 티에파닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 8-원 헤테로사이클릴기는, 제한 없이, 아조카닐, 옥세카닐 및 티오카닐을 포함한다. C6 아릴 고리에 융합된 예시적인 5-원 헤테로사이클릴기(본원에서 5,6-바이사이클릭 헤테로사이클릭 고리로도 지칭됨)는, 제한 없이, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 디하이드로벤조푸라닐, 디하이드로벤조티에닐, 벤족사졸리노닐 등을 포함한다. 아릴 고리에 융합된 예시적인 6-원 헤테로사이클릴기(본원에서 6,6-바이사이클릭 헤테로사이클릭 고리로도 지칭됨)는, 제한 없이, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐 등을 포함한다.
"아미노"는, 본원에서 사용되는 바와 같이 라디칼 -NR70R71을 지칭하며, R70 및 R71은 각각 독립적으로 수소, C1-C8 알킬, C3-C10 사이클로알킬, C4-C10 헤테로사이클릴, C6-C10 아릴 및 C5-C10 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, 아미노는 NH2를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시아노"는 라디칼 -CN을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "할로" 또는 "할로겐"은 독립적으로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서 달리 언급되지 않는 한, 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I) 원자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하이드록시"는 라디칼 -OH를 지칭한다.
알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴기는, 본원에서 정의된 바와 같이 선택적으로 치환된다(예를 들어, "치환된" 또는 "비치환된" 알킬, "치환된" 또는 "비치환된" 알케닐, "치환된" 또는 "비치환된" 알키닐, "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로알킬, "치환된" 또는 "비치환된" 사이클로알킬, "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로사이클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 아릴 또는 "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로아릴기). 일반적으로, 용어 "치환된"은, 용어 "선택적으로"가 선행하던지 그렇지 않던지 간에, 기(예컨대, 탄소 또는 질소 원자)에 존재하는 적어도 하나의 수소가 허용 가능한 치환기, 예를 들어, 치환시 안정한 화합물, 예를 들어, 재배열, 환화, 제거 또는 다른 반응에 의한 변형을 자발적으로 겪지 않는 화합물을 초래하는 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, "치환된" 기는 그 기의 하나 이상의 치환 가능한 위치에서 치환기를 갖고, 주어진 임의의 구조에서 하나 초과의 위치가 치환된 경우, 그 치환기는 각 위치에서 동일하거나 상이하다. 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환기, 예컨대, 안정한 화합물의 형성을 초래하는 본원에 기재된 치환기 중 임의의 것으로의 치환을 포함하는 것으로 고려된다. 본 개시내용은 안정한 화합물에 도달하기 위하여 임의의 그리고 모든 이러한 조합을 고려한다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 헤테로원자, 예컨대, 질소는 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족시키고 안정한 모이어티의 형성을 초래하는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 치환기를 가질 수 있다.
2개 이상의 치환기는 선택적으로 연결되어 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴기를 형성할 수 있다. 이러한 소위 고리-형성 치환기는, 전형적으로, 필수는 아니지만, 사이클릭 베이스 구조에 부착되는 것으로 확인된다. 일 구현예에서, 고리-형성 치환기는 베이스 구조의 인접한 구성원에 부착된다. 예를 들어, 사이클릭 베이스 구조의 인접한 구성원에 부착된 2개의 고리-형성 치환기는 융합된 고리 구조를 생성한다. 또 다른 구현예에서, 고리-형성 치환기는 베이스 구조의 단일의 구성원에 부착된다. 예를 들어, 사이클릭 베이스 구조의 단일의 구성원에 부착된 2개의 고리-형성 치환기는 스피로사이클릭 구조를 생성한다. 또 다른 구현예에서, 고리-형성 치환기는 베이스 구조의 비-인접 구성원에 부착된다.
본원에 기재된 화학식 I의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 따라서, 다양한 이성질체 형태, 예를 들어, 거울상 이성질체 및/또는 부분입체 이성질체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 화합물은 개별 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 기하 이성질체 형태로 존재할 수 있거나, 라세미 혼합물 및 하나 이상의 입체 이성질체가 풍부한 혼합물을 포함하여 입체 이성질체의 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 이성질체는 키랄 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 키랄 염의 형성과 결정화를 포함하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있거나; 바람직한 이성질체는 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)]; 문헌[Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977)]; 문헌[Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962)]; 및 문헌[Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)]을 참조한다. 본 개시내용은 부가적으로, 본원에 기재된 화합물을 다른 이성질체가 실질적으로 없는 개별 이성질체로서, 및 대안적으로 다양한 이성질체의 혼합물로서 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 순수한 거울상 이성질체 화합물에는 화합물의 다른 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체가 실질적으로 없다(즉, 거울상 이성질체적 과량). 다시 말해, 화합물의 "S" 형태에는 화합물의 "R" 형태가 실질적으로 없고, 따라서, 거울상 이성질체적 과량의 "R" 형태가 존재한다. 용어 "거울상 이성질체적으로 순수한" 또는 "순수한 거울상 이성질체"는, 화합물이 75 중량% 초과, 80 중량% 초과, 85 중량% 초과, 90 중량% 초과, 91 중량% 초과, 92 중량% 초과, 93 중량% 초과, 94 중량% 초과, 95 중량% 초과, 96 중량% 초과, 97 중량% 초과, 98 중량% 초과, 99 중량% 초과, 99.5 중량% 초과, 또는 99.9 중량% 초과의 거울상 이성질체를 포함함을 의미한다. 특정 구현예에서, 중량은 화합물의 모든 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체의 총 중량을 기준으로 한다.
본원에 기재된 화학식 I의 화합물은 또한 하나 이상의 동위원소 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, H는 1H, 2H(D 또는 중수소) 및 3H(T 또는 삼중수소)를 포함하는 임의의 동위원소 형태일 수 있고; C는 12C, 13C 및 14C를 포함하는 임의의 동위원소 형태일 수 있으며; O는 16O 및 18O를 포함하는 임의의 동위원소 형태일 수 있는 등이다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본원에 기재된 화합물 상에서 관찰되는 특정 치환기에 따라, 상대적으로 비독성인 산 또는 염기를 이용하여 제조되는 활성 화합물의 염을 포함하는 것이다. 본 개시내용의 디바이스를 제조하기 위해 사용되는 화학식 I의 화합물이 상대적으로 산성 작용기를 함유하는 경우, 중성 형태의 이러한 화합물을 순수한 또는 적합한 비활성 용매 중에서 충분한 양의 요망되는 염기와 접촉시킴으로써 염기 부가염이 수득될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염의 예에는, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염이 포함된다. 본 개시내용에 사용되는 화합물이 비교적 염기성 작용기를 함유하는 경우, 중성 형태의 이러한 화합물을 순수한 또는 적합한 비활성 용매 중에서 충분한 양의 요망되는 산과 접촉시킴으로써 산 부가염이 수득될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염의 예에는, 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 탄산일수소, 인산, 인산일수소, 인산이수소, 황산, 황산일수소, 요오드화수소 또는 인산 등과 같은 무기산으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등과 같은 유기산으로부터 유래된 염이 포함된다. 또한 아미노산의 염, 예컨대, 알긴산염 등, 및 글루쿠론산 또는 갈락투론산과 같은 유기산의 염 등이 포함된다(예를 들어 문헌[Berge et al, Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)] 참조). 본 개시내용의 디바이스(예를 들어, 입자, 하이드로겔 캡슐)에서 사용되는 구체적인 특정 화합물은 화합물이 염기 또는 산 부가염으로 전환되게 하는 염기성 및 산성 작용기 둘 모두를 함유한다. 이들 염은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본 개시내용에 사용하기에 적합하다.
본 개시내용의 디바이스는 전구약물 형태인 화학식 I의 화합물을 함유할 수 있다. 전구약물은 본 개시내용의 디바이스에 대한 FBR을 경감시키는데 유용한 화합물을 제공하도록 생리학적 조건 하에서 화학적 변화를 용이하게 겪는 화합물이다. 또한, 전구약물은 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 유용한 화학식 I의 화합물로 전환될 수 있다.
본원에 기재된 화학식 I의 특정 화합물은 비용매화된 형태뿐만 아니라, 수화된 형태를 포함하는 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 비용매화된 형태와 등가이며, 본 개시내용의 범위 내에 포함된다. 본원에 기재된 화학식 I의 특정 화합물은 다수의 결정질 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본 개시내용에 의해 고려되는 용도에 대해서 등가이며, 본 개시내용의 범위 내인 것으로 의도된다.
용어 "용매화물"은 보통 가용매 분해(solvolysis) 반응에 의해 용매와 회합된 화합물의 형태를 지칭한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 포함할 수 있다. 종래의 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 아세트산, DMSO, THF, 디에틸 에테르 등을 포함한다. 본원에 기재된 화합물은 예를 들어, 결정질 형태로 제조될 수 있으며, 용매화될 수 있다. 적합한 용매화물은 약제학적으로 허용 가능한 용매화물을 포함하며, 화학량론적 용매화물 및 비-화학량론적 용매화물 둘 모두를 추가로 포함한다.
용어 "수화물"은 물과 회합된 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 화합물의 수화물에 함유된 물 분자의 수는 수화물 내의 화합물 분자의 수에 대해 명확한 비로 존재한다. 따라서, 화합물의 수화물은 예를 들어 일반식 R·x H2O로 표시될 수 있으며, 여기서 R은 화합물이고, x는 0 초과의 수이다.
용어 "호변이성질체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 화합물 구조의 상호교환 가능한 형태이고, 수소 원자 및 전자의 치환이 달라지는 화합물을 지칭한다. 따라서, 2개의 구조는 π 전자 및 원자(보통 H)의 이동을 통해 평형으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 에놀 및 케톤은, 이들이 산 또는 염기로의 처리에 의해 신속하게 상호전환되기 때문에 호변이성질체이다. 호변이성질체 형태는 관심 화합물의 최적의 화학적 반응성 및 생물학적 활성의 달성과 관련될 수 있다.
부호 "
Figure pct00005
"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 엔티티, 예를 들어, 중합체(예를 들어, 하이드로겔-형성 중합체, 예컨대 알긴산염) 또는 이식 가능한 요소, 예를 들어, 입자, 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐) 또는 물질의 표면으로의 연결을 지칭한다. "
Figure pct00006
"로 표시된 연결은 엔티티, 예를 들어, 중합체 또는 이식 가능한 요소(예를 들어, 디바이스)로의 직접적인 부착을 지칭할 수 있거나, 혹은 부착기를 통한 엔티티로의 연결을 지칭할 수 있다. "부착기"는 본원에 기재된 바와 같이, 엔티티(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 중합체 또는 이식 가능한 요소)로의 화학식 I의 화합물의 연결을 위한 모이어티를 지칭하며, 당업계에 알려져 있는 임의의 부착 화학을 포함할 수 있다. 예시적인 부착기의 목록은 문헌[Bioconjugate Techniques (3rd ed, Greg T. Hermanson, Waltham, MA: Elsevier, Inc, 2013)]에 요약되어 있으며, 이는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 부착기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, -C(O)-, -OC(O)-, -N(RC)-, -N(RC)C(O)-, -C(O)N(RC)-, -N(RC)N(RD)-, -NCN-, -C(=N(RC)(RD))O-, -S-, -S(O)x-, -OS(O)x-, -N(RC)S(O)x-, -S(O)xN(RC)-, -P(RF)y-, -Si(ORA)2-, -Si(RG)(ORA)-, -B(ORA)- 또는 금속을 포함하며, RA, RC, RD, RF, RG, x 및 y의 각각은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 부착기는 아민, 케톤, 에스테르, 아미드, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 티올을 포함한다. 일부 구현예에서, 부착기는 가교제이다. 일부 구현예에서, 부착기는 -C(O)(C1-C6-알킬렌)-이며, 알킬렌은 R1로 치환되며, R1은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, 부착기는 -C(O)(C1-C6-알킬렌)-이며, 알킬렌은 1 내지 2개의 알킬기(예를 들어, 1 내지 2개의 메틸기)로 치환된다. 일부 구현예에서, 부착기는 -C(O)C(CH3)2-이다. 일부 구현예에서, 부착기는 -C(O)(메틸렌)-이며, 알킬렌은 1 내지 2개의 알킬기(예를 들어, 1 내지 2개의 메틸기)로 치환된다. 일부 구현예에서, 부착기는 -C(O)CH(CH3)-이다. 일부 구현예에서, 부착기는 -C(O)C(CH3)-이다.
GLA 발현 구축물
본 개시내용은 인간 GLA 전구체 단백질 또는 그의 변이체, 예를 들어, GLA 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구현예에서, 프로모터는 인간 GLA 유전자 내의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 GLA 코딩 서열에 비하여 RPE세포(예를 들어, ARPE-19 세포)에서 더 높은 GLA mRNA의 발현을 달성하도록 선택된다. 일 구현예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO:18과 실질적으로 동일한, 예를 들어, SEQ ID NO:18과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:18로 이루어진다.
일 구현예에서, GLA 전구체 단백질은 야생형 인간 GLA 단백질 유래의 성숙 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:1의 32 내지 429 또는 그의 보존적으로 치환된 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 보존적으로 치환된 변이체는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 보존적 치환을 갖는다. 일 구현예에서, GLA 전구체 단백질은 SEQ ID NO:1로 이루어진다.
일 구현예에서, 전구체 GLA 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 포유동물 세포에서의 GLA 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일 구현예에서, 코돈-최적화된 서열은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열이다. 일 구현예에서, 코돈-최적화된 서열은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열이다.
일 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 GLA 융합 단백질을 인코딩한다.
일 구현예에서, GLA 융합 단백질은 성숙 인간 GLA에 대한 아미노산 서열에 작동 가능하게 연결된 GLA 이외의 분비 단백질 유래의 신호 펩티드 또는 그의 보존적으로 치환된 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:15 또는 그의 보존적으로 치환된 변이체로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일 구현예에서, SEQ ID NO:15의 보존적으로 치환된 변이체는 3, 2 또는 1개 이하의 보존적 치환을 갖는다. 일 구현예에서, 신호 펩티드에 대한 코딩 서열(SEQ ID NO:15)은 인간 HSPG2에 대한 야생형 코딩 서열이다. 일 구현예에서, HSPG2 신호 펩티드에 대한 코딩 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되며, 예를 들어, SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:16과 실질적으로 동일한, 예를 들어, SEQ ID NO:16과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열이다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:5를 포함한다. 일 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6과 실질적으로 동일한, 예를 들어, SEQ ID NO:6과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, GLA 융합 단백질은 비-GLA 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열에 작동 가능하게 연결된 GLA 야생형 또는 변이체 아미노산 서열을 포함한다. 비-GLA 폴리펩티드는 더 긴 반감기 또는 다른 원하는 특성을 융합 단백질에 부여하는 임의의 단백질 또는 단백질 도메인, 예를 들어, 알부민, IgG Fc, IgG 경쇄 유래의 불변 도메인, IgG 중쇄의 1, 2 또는 3개의 불변 도메인, 나노바디, 트랜스페린, CTP(그의 4개의 O-글리칸을 갖는 인간 융모생식선 자극 호르몬(hCG)의 28개 아미노산 C-말단 펩티드(CTP)), XTEN, 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌-세린(PAS) 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, GLA 융합 단백질은 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13 중 어느 하나를 포함한다. 일 구현예에서, GLA 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9, 12 또는 14 중 어느 하나를 포함한다.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 코딩 서열 내의 ATG 시작 코돈의 바로 상류에 코작 번역 서열을 추가로 포함하는 전사 유닛을 포함한다. 일 구현예에서, 코작 번역 서열은 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드 2094 내지 2099(본원에서 SEQ ID NO:19로 나타냄), SEQ ID NO:19와 실질적으로 동일한, 예를 들어, SEQ ID NO:19와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 전사 유닛은 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드 2163 내지 2684(본원에서 SEQ ID NO:20으로 나타냄) 또는 SEQ ID NO:20과 실질적으로 동일한, 예를 들어, SEQ ID NO:20과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 폴리A 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3, 4, 6, 9, 12 또는 14 중 어느 하나가 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드 2100과 2101 사이에 삽입된 SEQ ID NO:17을 포함한다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 2, 3개 이상의 전사 유닛을 포함한다. 일 구현예에서, 전사 유닛(들)은 한 쌍의 역위 말단 반복부, 예를 들어, 5' ITR과 3' ITR 사이에 위치한다.
조작된 RPE 세포
상기 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 GLA 단백질을 발현하고 분비하도록 조작된 망막 색소 상피(RPE) 세포 또는 RPE 세포로부터 유래된 세포를 생성하는 데 유용하다. 일 구현예에서, 조작된(예를 들어, 재조합) RPE 세포는 SEQ ID NO 3, 4, 6, 9, 12 및 14 중 하나 이상, 또는 이들 특정 서열 중 어느 하나와 실질적으로 동일한, 예를 들어, 특정 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 RPE 세포는 GLA-IgG 융합 단백질을 생성하며, SEQ ID NO:9를 포함하는 제1 전사 유닛 및 SEQ ID NO:10을 포함하는 제2 전사 유닛을 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 RPE 세포는 본원에 기술된 전사 유닛을 포함하며, 이는 염색체외 발현 벡터에 존재하거나, 세포 핵 내의 하나 이상의 염색체 부위 내로 통합될 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 세포는 세포 핵 내의 동일한 게놈 부위에 탠덤으로 통합되는 전사 유닛 카피를 2, 3, 4개 이상 포함한다.
본원에 기술되는 조작된 RPE 세포는 다양한 균주 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. RPE 세포의 예시적인 스트레인은 ARPE-19 세포, ARPE-19-SEAP-2-neo 세포, RPE-J 세포 및 hTERT RPE-1 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 ARPE-19(ATCC® CRL-2302™) 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 조작된 RPE(예를 들어, ARPE-19) 세포는 모노클로널 세포주로부터 증식된다.
일 구현예에서, 본원에 기술되는 조작된 세포는 RPE 세포, 예를 들어, 자연 발생 RPE 세포의 특징인 바이오마커, 예를 들어, 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 바이오마커(예를 들어, 항원)는 단백질이다. 예시적인 바이오마커는 CRALBP, RPE-65, RLBP, BEST1 또는 αB-크리스탈린을 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 세포는 CRALBP, RPE-65, RLBP, BEST1 또는 αB-크리스탈린 중 적어도 하나를 발현한다. 일 구현예에서, 조작된 세포는 CRALBP 및 RPE-65 중 적어도 하나를 발현한다.
예를 들어, 하이드로겔 캡슐에 함유되거나 이에 캡슐화된 복수의 조작된 세포로서 본원에 기술된 디바이스, 조성물 및 방법에 사용하기 위한 조작된 RPE 세포는 다양한 세포 주기의 단계에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 조작된 세포에서 적어도 하나의 조작된 세포는 세포 분열을 겪고 있다. 세포 분열은 예를 들어, 문헌[DeFazio A et al (1987) J Histochem Cytochem 35:571-577] 및 문헌[Dolbeare F et al (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:5573-5577]에 기술된 바와 같은 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 그 전체가 참조로 포함된다. 일 구현예에서, 세포의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 20%는 예를 들어, 5-에티닐-2'데옥시우리딘(EdU) 검정 또는 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 검정에 의해 결정되는 바와 같이 세포 분열을 겪고 있다. 일부 구현예에서, 세포 증식은 현미경검사(예를 들어, 형광 현미경검사(예를 들어, 저속-촬영 또는 방추사 형성의 평가)) 또는 유세포분석에 의해 가시화되거나 정량화된다. 일부 구현예에서, 복수의 조작된 세포에서 조작된 세포 중 어느 것도 세포 분열을 겪고 있지 않으며, 휴지기이다. 일 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 20% 미만의 세포는 5-에티닐-2'데옥우리딘(EdU) 검정, 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 검정, 현미경검사(예를 들어, 형광 현미경검사(예를 들어, 저속-촬영 또는 방추사 형성의 평가)) 또는 유세포분석에 의해 세포 분열을 겪고 있다.
일 구현예에서, 복수의 조작된 세포에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40 또는 80%의 조작된 RPE 세포는 생존 가능하다. 세포 생존력은 예를 들어, 문헌[Riss, T. et al (2013) "Cell Viability Assays" in Assay Guidance Manual (Sittapalam, G.S. et al, eds)]에 기술된 바와 같은 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포 생존력은 ATP 검정, 5-에티닐-2'데옥시우리딘(EdU) 검정, 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 검정에 의해 측정되거나 정량화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 생존력은 현미경검사(예를 들어, 형광 현미경검사(예를 들어, 저속-촬영 또는 방추사 형성의 평가)) 또는 유세포분석에 의해 가시화되거나 정량화된다. 일 구현예에서, 복수의 조작된 세포에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40 또는 80%의 RPE 세포는 예를 들어, ATP 검정, 5-에티닐-2'데옥시우리딘(EdU) 검정, 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 검정, 현미경검사(예를 들어, 형광 현미경검사(예를 들어, 저속-촬영 또는 방추사 형성의 평가)) 또는 유세포분석에 의해 결정되는 바와 같이 생존 가능하다.
본원에 기술된 파라미터 중 임의의 것은 당업자에게 알려져 있는 표준 기법, 예컨대 조직학, 현미경검사 및 다양한 기능적 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
GLA 활성의 측정
본원에 기술되는 조작된 세포 또는 디바이스에 의해 분비되는 GLA의 활성은 당업계에 알려져 있는 임의의 직접적 또는 간접적 GLA 활성 검정에 의해 측정될 수 있다.
예를 들어, GLA 활성은 세포를 용해시키고, 효소 기질, 예컨대 4-메틸 움벨리페랄 알파-D-갈락토시드 및/또는 N-아세틸갈락토사민의 첨가시의 용해물 내의 효소 활성을 결정하여, 대상체 유래의 혈액 백혈구에서 직접적으로 측정될 수 있다(미국 특허 제6.274,597호 참조). GLA 활성 및 단백질을 측정하여 혈액 및 혈장 중 알파-갈락토시다제의 농도를 결정하기 위한 면역검정은 문헌[Fuller et al., Clin Chem. 2004; 50(11):1979-85]에 기술되어 있다. 일 구현예에서, GLA 활성은 하기 실시예에 기술된 효소 검정을 사용하여 배양 배지 또는 조직 시료(예를 들어, 혈액으로부터 분리된 혈장, 간, 신장 또는 심장 조직 시료의 균질액)에서 측정된다.
GLA 활성의 간접적인 평가는 대상체로부터 수집되는 혈장 및/또는 소변 시료에서 또는 관심 조직, 예를 들어, 간, 신장, 심장의 생검에서 대용 바이오마커, 예를 들어, Gb3 및/또는 lysoGb3(및 선택적으로 그의 6개의 관련된 유사체)의 수준을 측정하는 것에 기초한다. Gb3 및 lysoGb3 수준은 본원에서 실시예에 기술되는 검정 또는 당업계에 알려져 있는 임의의 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 파브리병에 의해 이환된 인간의 혈장 및 소변 중 Gb3 수준을 측정하기 위한 방법은 예를 들어, 문헌[Boscaro et al., Rapid Commun Mass Spectrom. 2002; 16(16):1507-14]에 기술되어 있다. 이 방법에서, 분석은 유량 주입 분석-전기분무 이온화-탠덤 질량 분석법(flow injection analysis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry; FIA-ESI-MS/MS)을 사용하여 수행한다. “펀치(punch)” 디바이스를 사용하여 수득되는 피부 생검 내의 Gb3 축적은 문헌[Kanekura et al., Br J Dermatol. 2005, 153(3):544-8]에 기술된 바와 같은 면역전자-현미경 방법을 사용하여 검출될 수 있다. Gb3 및 다른 대용 바이오마커를 검출하기 위한 다양한 생검 기법 및 검정은 미국 특허 출원 공개 제US 2010/0113517호에 기술되어 있다. GLA 활성 및/또는 파브리병 진행의 다른 혈장 대용 바이오마커(예를 들어, 다양한 염증 및 심장 리모델링 바이오마커)는 문헌[Yogasundaram, H. et al., J Am Heart Assoc. 2018; 7:e009098]에 기술되어 있다.
디바이스
본원에 기술되는 조작된 RPE 세포 또는 복수의 이러한 세포는 GLA 단백질을 대상체에, 예를 들어, 파브리병 환자에 제공하는 데 사용하기 위하여 이식 가능한 디바이스 내로 혼입될 수 있다.
예시적인 이식 가능한 디바이스는 금속, 금속 합금, 세라믹, 중합체, 섬유, 비활성 물질 및 그의 조합과 같은 물질을 포함한다. 디바이스(예를 들어, 입자)는 의도된 표적 위치 내로의 이식 후에 캡슐화된 세포의 생존력 및 생산성을 지지하기에 적절한 임의의 구조 및 형상을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 디바이스는 하이드로겔 캡슐, 예를 들어, 밀리캡슐 또는 마이크로캡슐(예를 들어, 하이드로겔 밀리캡슐 또는 하이드로겔 마이크로캡슐)이다. 디바이스(예를 들어, 캡슐, 입자)는 조작된 RPE 세포에 의해 발현되지 않는 하나 이상의 외인성 제제를 포함할 수 있으며(그리고 선택적으로 그를 방출하도록 구성됨), 예를 들어, 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA 분자), 단백질(예를 들어, 호르몬, 효소(예를 들어, 글루코스 옥시다제, 키나제, 포스파타제, 옥시게나제, 하이드로게나제, 환원효소) 항체, 항체 단편, 항원 또는 에피토프)), 소분자, 지질, 약물, 백신 또는 그의 임의의 유도체, 소분자, 단백질 또는 폴리펩티드의 활성 또는 비활성 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 디바이스는 이물 반응(FBR)을 완화시키기 위한, 예를 들어, 디바이스가 대상체에 이식되는 경우 FBR을 완화시키기 위한 적어도 하나의 수단을 포함한다.
본원에 기재된 디바이스는 대상체로의 이식 또는 투여를 위한 제제 또는 조성물, 즉, 디바이스 제제 또는 디바이스 조성물로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 디바이스 제제 또는 디바이스 조성물은 적어도 2, 4, 8, 16, 32, 64개 또는 그 이상의 디바이스를 포함하며, 제제 또는 조성물 중 적어도 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 디바이스는 본원에 기재된 바와 같은 특징, 예를 들어, 평균 캡슐 직경 또는 세포-함유 구획 내의 세포의 수를 갖는다.
디바이스, 디바이스 제제 또는 디바이스 조성물은 신체의 임의의 부위 또는 일부에 이식하도록 구성되거나, 이식되거나, 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식 가능한 디바이스 또는 디바이스 제제는 복막강(예를 들어, 그물막주머니(omental bursa) 또는 망낭(bursalis omentum)으로도 알려져 있는 작은복막주머니) 내로의 이식을 위해 구성된다. 디바이스, 디바이스 제제 또는 디바이스 조성물은 주사 또는 카테터를 통해 복강(예를 들어, 그물막, 예를 들어, 작은복막주머니) 내에 이식되거나, 복강(예를 들어, 그물막, 예를 들어, 작은복막주머니) 내의 표면 상에 배치될 수 있다. 그물막(예를 들어, 작은복막주머니) 내로의 디바이스, 디바이스 제제 또는 디바이스 조성물의 이식 또는 배치에 대한 추가의 고려사항은 [M. Pellicciaro et al. (2017) CellR4 5(3):e2410]에 제공된다.
일부 구현예에서, 이식 가능한 디바이스는 중합체 조성물에 의해 캡슐화된 복수의 생 세포를 포함하는 적어도 하나의 세포-함유 구획을 포함한다. 일 구현예에서, 디바이스는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 세포-함유 구획을 함유한다. 각각의 세포-함유 구획은 복수의 생 세포를 포함하며, 구획 중 적어도 하나 내의 세포는 디바이스가 대상체 내로 이식되는 경우 GLA 단백질을 발현 및 분비할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포-함유 구획(들) 내의 중합체 조성물은 다당류 또는 기타 하이드로겔-형성 중합체(예를 들어, 알긴산염, 히알루론산염 또는 콘드로이틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 알긴산염이며, 이는 β-D-만누론산(M) 및 α-L-굴루론산(G)으로 구성된 다당류이다. 일부 구현예에서, 알긴산염은 저 분자량(예를 들어, 75 kD 미만의 분자량 근사치) 및 1.5 이상의 G:M 비를 갖거나, (ii) 예를 들어, 75 내지 150 kDa의 분자량 근사치 및 1.5 이상의 G:M 비를 갖는 중등 분자량 알긴산염이거나, (iii) 예를 들어, 150 kDa 내지 250 kDa의 대략적 MW 및 1.5 이상의 G:M 비를 갖는 고 분자량 알긴산염이거나, (iv) 이들 알긴산염 중 둘 이상의 배합물이다.
일부 구현예에서, 세포-함유 구획(들)은 적어도 하나의 세포-결합 물질(CBS), 예를 들어, 세포-결합 펩티드(CBP) 또는 세포-결합 폴리펩티드(CBPP)를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, CBS는 링커를 통해 중합체 조성물 중의 중합체 분자에 공유적으로 부착된 CBP("CBP-중합체")를 포함한다. 일 구현예에서, CBP-중합체에서 중합체는 다당류(예를 들어, 알긴산염) 또는 기타 하이드로겔-형성 중합체이다. 본 개시내용의 디바이스에 이용하기 위한 다양한 세포-결합 펩티드가 본원에 기재된다. 일 구현예에서, 세포-결합 펩티드는 길이가 25개 또는 그 이하(예를 들어, 20, 15, 10개 또는 그 이하)인 아미노산이며, 세포-부착 분자(CAM)에 대한 리간드의 세포 결합 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 세포-결합 펩티드는 본질적으로 본원의 표 1에 나타낸 세포 결합 서열로 이루어진다. 일 구현예에서, 세포 결합 서열은 RGD(SEQ ID NO: 28) 또는 RGDSP(SEQ ID NO: 49)이다. 일 구현예에서, 세포-결합 펩티드의 아미노 말단은 아미노산 링커를 통해 중합체에 공유적으로 부착된다. 일 구현예에서, 아미노산 링커는 본질적으로 1 내지 3개의 글리신 잔기로 이루어진다. 일 구현예에서, 세포-결합 펩티드는 본질적으로 RGD(SEQ ID NO: 28) 또는 RGDSP(SEQ ID NO: 49)로 이루어지며, 링커는 본질적으로 단일의 글리신 잔기로 이루어진다.
일 구현예에서, 제1 구획에 존재하는 각각의 CBP-중합체는 적어도 0.05%, 0.1%, 0.2% 또는 0.3%이지만, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만인 세포-결합 펩티드 밀도(본원에서 실시예에 기술된 바와 같은 연소 분석에 의해 결정되는 바와 같은 질소%)를 갖는다. 일 구현예에서, 세포 함유 구획 내의 링커-CBP의 총 밀도는 정량적 펩티드 컨쥬게이션 검정, 예를 들어, 본원에 기술된 검정에 의해 결정되는 바와 같이 용액 중 CBP-중합체(예를 들어, GRGD(SEQ ID NO: 43) 또는 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)로 공유적으로 변형된 MMW-알긴산염) g당 약 0.1 내지 약 1.0 마이크로몰의 CBP이다. 일 구현예에서, CBP는 RGDSP(SEQ ID NO: 49)이며, 링커는 G이며, 중합체는 75 kDa 내지 150 kDa의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 갖는 알긴산염이다. 일 구현예에서, 세포-함유 구획은 또한 CBP-중합체에서의 중합체와 동일하거나 상이한 미변형 하이드로겔-형성 중합체를 포함한다. 일 구현예에서, CBP-중합체에서의 중합체 및 미변형된 중합체는 75 kDa 내지 150 kDa의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 갖는 알긴산염이다.
일 구현예에서, 정량적 펩티드 컨쥬게이션 검정은 CPB-중합체의 시료를 산 가수분해로 처리하여, 컨쥬게이트된 펩티드(및 CBP-중합체 내의 임의의 잔류 비컨쥬게이트된 펩티드)로부터 개별 아미노산을 생성하고, 개별 아미노산을 정량화하고, 각각의 아미노산의 몰 농도의 평균을 구하고, 시료 중 총 펩티드 농도를 계산하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 정량화 펩티드 컨쥬게이션 검정은 본원의 하기 실시예에 기재된 공정과 실질적으로 유사하게 수행된다. 일 구현예에서, 정량적 펩티드 컨쥬게이션 검정은 또한, 총 펩티드 농도로부터 시료 내의 임의의 잔류 비컨쥬게이트된 펩티드의 농도를 제하는 것을 포함한다. CBP-중합체 조성물 중 비컨쥬게이트된 펩티드의 농도는 관련 기술 분야에 알려져 있는 임의의 적합한 검정을 사용하여, 예를 들어, 본원에서 하기에 기재된 바와 같은 LC-MS에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 정량적 펩티드 컨쥬게이션 검정은 디바이스를 제조하기 위해 사용되는 CBP-중합체의 염수 용액의 시료 상에서 수행될 뿐 아니라, CBP-중합체의 동결건조된 시료 상에서도 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 디바이스는 이물 반응(FBR)을 완화시키기 위한, 예를 들어, 디바이스가 대상체에 이식되는 경우 FBR을 완화시키기 위한 적어도 하나의 수단을 추가로 포함한다. 디바이스의 FBR을 완화시키기 위한 다양한 수단이 본원에 기술되지만, 참조 디바이스에 비하여 디바이스에 대한 FBR을 감소시킬 수 있는 임의의 생물학적, 화학적 또는 물리학적 요소가 본원에서 고려된다.
예를 들어, 본원에 개시된 디바이스에서 FBR을 완화시키기 위한 수단은 산소, 및 세포 생존 및 기능에 중요한 다른 분자가 반-투과성 막을 통과하여 이동되게 하면서, 면역 세포가 포어를 가로지르는 것을 방지하도록 선택되는 포어 크기를 갖는 반-투과성 생체적합성 막으로 세포를 둘러싸는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 반-투과성 막은 1000 kD 미만 또는 50 내지 700 kD, 70 내지 300 kD 또는 70 내지 150 kD, 또는 70 내지 130 kD의 분자량 컷오프를 갖는다.
또 다른 FBR-완화 수단은 세포-함유 구획을 무세포 생체적합성 물질, 예컨대 문헌[Ma, M et al., Adv. Healthc Mater., 2(5):667-672 (2012)]에 기재된 코어(core)-쉘(shell) 마이크로캡슐로부터 형성된 장벽 구획으로 둘러싸는 것을 포함한다. 이러한 장벽 구획은 반-투과성 부재 수단과 함께 또는 이것 없이 사용될 수 있다. FBR-완화 수단은 예를 들어, 미국 특허 제9,867,781호에 기재된 바와 같이 이식된 디바이스로부터 방출되는 항-염증성 약물을 디바이스 상에 또는 그 내에 배치하여, FBR을 저해하는 것을 포함할 수 있다. 다른 FBR-완화 수단은 제WO 2017/176792호 및 제WO 2017/176804호에 기재된 바와 같이 디바이스 표면 상에 배치되거나, 디바이스 내에 캡슐화된 CSF-1R 저해제를 사용한다. 다른 FBR-완화 수단은 문헌[Veiseh, O., et al., Nature Materials 14:643-652 (2015)]에 기재된 바와 같이, 디바이스를 1 mm 초과의 직경을 갖는 구체 형상으로 구성하는 것을 채용한다. 일부 구현예에서, FBR을 완화시키기 위한 수단은 비섬유성 화합물을 디바이스의 외측 표면 상에 및/또는 세포-함유 구획을 둘러싸는 장벽 구획 내에 배치하는 것을 포함한다. 예시적인 비섬유성 화합물은 본원에서 하기에 기술된 화학식 I의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 디바이스는 상기 FBR-완화 수단 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 디바이스는 세포-함유 내부 구획이 제2의 외부(예를 들어, 장벽) 구획에 의해 완전히 둘러싸인 2개의 하이드로겔 구획을 갖는다. 일 구현예에서, 제2 구획의 내부 경계는 예를 들어, 도 9에 예시된 바와 같이, 제1 구획의 외부 경계와 계면을 형성한다. 이러한 구현예에서, 제2(외부) 구획의 두께는 제2 구획의 외부 경계와 2개의 구획 사이의 계면 사이의 평균 거리를 의미한다. 일부 구현예에서, 외부 구획의 두께는 약 10 나노미터(nm), 바람직하게는 100 nm 초과 또는 그 이상이며, 1 밀리미터(mm)만큼 클 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하이드로겔 캡슐 디바이스 내의 외부 구획의 두께는 10 nm 내지 1 mm, 100 nm 내지 1mm, 500 nm 내지 1 밀리미터, 1 마이크로미터(㎛) 내지 1 mm, 1 ㎛ 내지 1 mm, 1 ㎛ 내지 500 ㎛, 1 ㎛ 내지 250 ㎛, 1 ㎛ 내지 1 mm, 5 ㎛ 내지 500 ㎛, 5 ㎛ 내지 250 ㎛, 10 ㎛ 내지 1 mm, 10 ㎛ 내지 500 ㎛ 또는 10 ㎛ 내지 250 ㎛일 수 있다. 일부 구현예에서, 외부 구획의 두께는 100 nm 내지 1 mm, 1 ㎛ 내지 1 mm, 1 ㎛ 내지 500 ㎛ 또는 5 ㎛ 내지 1 mm이다. 일부 구현예에서, 외부 구획의 두께는 약 50 ㎛ 내지 약 100 ㎛이다.
일부 구현예에서, 디바이스 내의 하나 이상의 구획은 비섬유성 중합체, 예를 들어, CBP-중합체에서의 중합체와 동일하거나 상이한 중합체에 공유적으로 부착된 화학식 I의 비섬유성 화합물을 포함한다. 일 구현예에서, 비섬유성 중합체에서 일부의 또는 모든 단량체는 동일한 화학식 I의 화합물로 변형된다. 일부 구현예에서, 비섬유성 중합체에서 일부의 또는 모든 단량체는 상이한 화학식 I의 화합물로 변형된다. 디바이스가 2-구획 하이드로겔 캡슐인 일부 구현예에서, 비섬유성 중합체는 외부 장벽 구획(외부 표면까지 포함)에만 존재한다.
디바이스 내의 하나 이상의 구획은 CBP-중합체에서의 및 디바이스에 존재하는 임의의 비섬유성 중합체에서의 중합체와 동일하거나 상이한 미변형된 중합체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 디바이스 내의 제1 구획, 제2 구획 또는 모든 구획은 미변형된 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 미변형된 중합체는 미변형된 알긴산염이다. 일 구현예에서, 미변형된 알긴산염은 150 kDa 내지 250 kDa의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 갖는다.
일부 구현예에서, 비섬유성 중합체는 화학식 I의 화합물로 화학적으로 변형된 알긴산염을 포함한다. 비섬유성 중합체에서의 알긴산염은 디바이스에 존재하는 임의의 미변형된 알긴산염과 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물(예를 들어, 표 3의 화합물 101)은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 2.0 % 및 9.0 % 미만의 질소, 또는 2.0% 내지 5% 질소, 3.0% 내지 8.0% 질소, 5% 내지 8.0% 질소, 4.0% 내지 7.0% 질소, 5.0% 내지 7.0% 질소, 또는 약 6.0% 내지 약 7.0% 질소 또는 약 6.8% 질소의 컨쥬게이션 밀도로, 알긴산염(예를 들어, 75 kDa 미만의 분자량 근사치, 1.5 이상인 G:M 비를 갖는 알긴산염)에 공유적으로 부착된다. 일 구현예에서, 화합물 101의 양은 (미변형된 알긴산염과 비교하여) 약 0.5% 내지 2%, 2% 내지 4% N, 약 4% 내지 6% N, 약 6% 내지 8% 또는 약 8% 내지 10% N의 N%의 증가를 야기하며, 여기서, N%은 연소 분석에 의해 결정되며, 변형된 알긴산염 중 화합물 101의 양에 상응한다.
다른 구현예에서, 비섬유성 알긴산염에서 화학식 I의 화합물(예를 들어, 화합물 101)의 밀도(예를 들어, 농도)는 적합한 정량적 아민 컨쥬게이션 검정에 의해(예를 들어, 본원에 기재된 검정에 의해) 결정되는 바와 같이 w/w%, 예를 들어, 용액(예를 들어, 염수) 중 아민의 중량 / 비섬유성 알긴산염의 중량의 %로서 정의되며, 특정 구현예에서, 화학식 I의 화합물(예를 들어, 화합물 101)의 밀도는 약 1.0 w/w% 내지 약 3.0 w/w%, 약 1.3 w/w% 내지 약 2.5 w/w% 또는 약 1.5 w/w% 내지 2.2 w/w%이다. 일 구현예에서, 정량적 아민 컨쥬게이션 검정은 화학적으로 변형된 중합체(예를 들어, 화학식 I의 화합물로 변형된 알긴산염, 예를 들어, CM-LMW-Alg-101)의 시료를 산 가수분해로 처리하여, 유리 아민을 생성하고, 시료 중 총 유리 아민을 정량화하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 정량적 아민 컨쥬게이션 검정은 또한, 총 아민 농도로부터 비가수분해된 시료 중 비컨쥬게이트된 아민(예를 들어, 화학식 I의 화합물)의 농도를 제하는 것을 포함한다. 정량적 아민 컨쥬게이션 검정은 전형적으로 디바이스를 제조하기 위해 사용되는 화학적으로 변형된 알긴산염의 염수 용액의 시료 상에서 수행될 뿐 아니라, 화학적으로 변형된 알긴산염의 동결건조된 시료 상에서도 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 정량적 아민 컨쥬게이션 검정은 본원에서 실시예 9에 기재된 공정과 실질적으로 유사하게 수행된다. 일 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 표 3에 나타낸 화합물 101이다.
비섬유성 중합체에서 알긴산염은 관련 기술 분야에 알려져 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 화학식 I의 화합물로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 알긴산염 카복실산 모이어티를 하나 이상의 아민-작용화된 화합물로의 커플링을 위하여 활성화시켜, 화학식 I의 화합물로 변형된 알긴산염을 달성할 수 있다. 알긴산염 중합체를 수 중에 용해시키고(30 mL/g(중합체)), 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(0.5 당량) 및 N-메틸모르폴린(1 당량)으로 처리할 수 있다. 이 혼합물에, 아세토니트릴(0.3 M) 중 화학식 I의 화합물의 용액을 첨가할 수 있다. 반응물을 16시간 동안 55℃까지 가온시킨 다음, 실온까지 냉각시키고, 회전식 증발을 통해 부드럽게 농축시킨 다음, 잔류물을 예를 들어, 수 중에 용해시킬 수 있다. 그 다음, 혼합물을 예를 들어, 시아노-변형된 실리카 겔(실리사이클(Silicycle))의 층을 통해 여과하고, 여과 케이크를 물로 세척할 수 있다. 그 다음, 생성된 용액을 24시간 동안 물에 대하여 투석하여(10,000 MWCO 멤브레인), 예를 들어, 물을 2회 교체할 수 있다. 생성된 용액을 예를 들어, 동결건조를 통해 농축시켜, 원하는 화학적으로 변형된 알긴산염을 제공할 수 있다.
화학식 I의 화합물
일부 구현예에서, 본원에 기재된 디바이스는 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00007
상기 식에서,
A는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)-, -N(RC)-, -N(RC)C(O)-, -C(O)N(RC)-, -N(RC)C(O)(C1-C6- 알킬렌)-, -N(RC)C(O)(C1-C6-알케닐렌)-, -N(RC)N(RD)-, -NCN-, -C(=N(RC)(RD))O-, -S-, -S(O)x-, -OS(O)x-, -N(RC)S(O)x-, -S(O)xN(RC)-, -P(RF)y-, -Si(ORA)2 -, -Si(RG)(ORA)-, -B(ORA)- 또는 금속이며, 이의 각각은 부착기(예를 들어, 본원에 기재된 부착기)에 선택적으로 연결되며, 하나 이상의 R1에 의해 선택적으로 치환되며;
L1 및 L3은 각각 독립적으로 결합, 알킬 또는 헤테로알킬이며, 각각의 알킬 및 헤테로알킬은 하나 이상의 R2에 의해 선택적으로 치환되며;
L2는 결합이며;
M은 부재이거나, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 하나 이상의 R3에 의해 선택적으로 치환되며;
P는 부재이거나, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 하나 이상의 R4에 의해 선택적으로 치환되며;
Z는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, -ORA, -C(O)RA, -C(O)ORA, -C(O)N(RC)(RD), -N(RC)C(O)RA, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 하나 이상의 R5에 의해 선택적으로 치환되며;
각각의 RA, RB, RC, RD, RE, RF 및 RG는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 아지도, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환되거나;
또는 RC 및 RD는 그들이 부착된 질소 원자와 함께, 선택적으로 하나 이상의 R6으로 치환되는 고리(예를 들어, 5 내지 7원 고리)를 형성하며;
각각의 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 시아노, 아지도, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1, -C(O)RB1,-OC(O)RB1, -N(RC1)(RD1), -N(RC1)C(O)RB1, -C(O)N(RC1), SRE1, S(O)xRE1, -OS(O)xRE1, -N(RC1)S(O)xRE1, - S(O)xN(RC1)(RD1), -P(RF1)y, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 하나 이상의 R7에 의해 선택적으로 치환되며;
각각의 RA1, RB1, RC1, RD1, RE1 및 RF1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴은 하나 이상의 R7에 의해 선택적으로 치환되며;
각각의 R7은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 시아노, 옥소, 하이드록실, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴이며;
x는 1 또는 2이며;
y는 2, 3 또는 4이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-a의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-a]
Figure pct00008
또는 그의 염:
A는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)-, -N(RC)-, -N(RC)C(O)-, -C(O)N(RC)-, -N(RC)N(RD)-, -NCN-, N(RC)C(O)(C1-C6- 알킬렌)-, -N(RC)C(O)(C1-C6-알케닐렌)-, -C(=N(RC)(RD))O-, -S-, -S(O)x-, -OS(O)x-, -N(RC)S(O)x-, -S(O)xN(RC)-, -P(RF)y-, -Si(ORA)2 -, -Si(RG)(ORA)-, -B(ORA)- 또는 금속이며, 이의 각각은 부착기(예를 들어, 본원에 기재된 부착기)에 선택적으로 연결되며, 하나 이상의 R1에 의해 선택적으로 치환되며;
L1 및 L3은 각각 독립적으로 결합, 알킬 또는 헤테로알킬이며, 각각의 알킬 및 헤테로알킬은 하나 이상의 R2에 의해 선택적으로 치환되며;
L2는 결합이며;
M은 부재이거나, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 하나 이상의 R3에 의해 선택적으로 치환되며;
P는 하나 이상의 R4에 의해 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이며;
Z는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 하나 이상의 R5에 의해 선택적으로 치환되며;
각각의 RA, RB, RC, RD, RE, RF 및 RG는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 아지도, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환되거나;
또는 RC 및 RD는 그들이 부착된 질소 원자와 함께, 선택적으로 하나 이상의 R6으로 치환되는 고리(예를 들어, 5 내지 7원 고리)를 형성하며;
각각의 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 시아노, 아지도, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1, -C(O)RB1,-OC(O)RB1, -N(RC1)(RD1), -N(RC1)C(O)RB1, -C(O)N(RC1), SRE1, S(O)xRE1, -OS(O)xRE1, -N(RC1)S(O)xRE1, - S(O)xN(RC1)(RD1), -P(RF1)y, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 하나 이상의 R7에 의해 선택적으로 치환되며;
각각의 RA1, RB1, RC1, RD1, RE1 및 RF1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴은 하나 이상의 R7에 의해 선택적으로 치환되며;
각각의 R7은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 시아노, 옥소, 하이드록실, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴이며;
x는 1 또는 2이며;
y는 2, 3 또는 4이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, A는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O) -, -N(RC)C(O)-, -N(RC)C(O)(C1-C6-알킬렌)-, -N(RC)C(O)(C2-C6-알케닐렌)- 또는 -N(RC)-이다.
일부 구현예에서, A는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O) - 또는 -N(RC)-이다. 일부 구현예에서, A는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬,-O-, -C(O)O-, -C(O)-,-OC(O) - 또는 -N(RC)-이다. 일부 구현예에서, A는 알킬, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O) 또는 -N(RC)-이다. 일부 구현예에서, A는 -N(RC)C(O)-, -N(RC)C(O)(C1-C6-알킬렌)- 또는 -N(RC)C(O)(C2-C6-알케닐렌)-이다. 일부 구현예에서, A는 -N(RC)-이다. 일부 구현예에서, A는 -N(RC) -이며, RC 및 RD는 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 일부 구현예에서, A는 -NH-이다. 일부 구현예에서, A는 -N(RC)C(O)(C1-C6-알킬렌)-이며, 알킬렌은 R1로 치환된다. 일부 구현예에서, A는 -N(RC)C(O)(C1-C6-알킬렌)-이며, R1은 알킬(예를 들어, 메틸)이다. 일부 구현예에서, A는 -NHC(O)C(CH3)2-이다. 일부 구현예에서, A는 -N(RC)C(O)(메틸렌)-이며, R1은 알킬(예를 들어, 메틸)이다. 일부 구현예에서, A는 -NHC(O)CH(CH3)-이다. 일부 구현예에서, A는 -NHC(O)C(CH3)-이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, L1은 결합, 알킬 또는 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, L1은 결합 또는 알킬이다. 일부 구현예에서, L1은 결합이다. 일부 구현예에서, L1은 알킬이다. 일부 구현예에서, L1은 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, L1은 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH2CH2CH2 또는 -CH2CH2-이다.
일부 구현예에서, L1은 -CH2- 또는 -CH2CH2-이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, L3은 결합, 알킬 또는 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 결합이다. 일부 구현예에서, L3은 알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 C1-C12 알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 -CH2-이다. 일부 구현예에서, L3은 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 하나 이상의 R2(예를 들어, 옥소)로 선택적으로 치환되는 C1-C12 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 하나 이상의 R2(예를 들어, 옥소)로 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, L3은 -C(O)OCH2-, -CH2(OCH2CH2)2-, -CH2(OCH2CH2)3-, CH2CH2O- 또는 -CH2O-이다. 일부 구현예에서, L3은 -CH2O-이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, M은 부재이거나, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, M은 헤테로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, M은 부재이다. 일부 구현예에서, M은 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 일부 구현예에서, M은 -CH2-이다. 일부 구현예에서, M은 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬)이다. 일부 구현예에서, M은 (-OCH2CH2-)z이며, z는 1 내지 10으로부터 선택되는 정수이다. 일부 구현예에서, z는 1 내지 5로부터 선택되는 정수이다. 일부 구현예에서, M은 -OCH2CH2-, (-OCH2CH2-)2, (-OCH2CH2-)3, (-OCH2CH2-)4 또는 (-OCH2CH2-)5이다.
일부 구현예에서, M은 -OCH2CH2-, (-OCH2CH2-)2, (-OCH2CH2-)3 또는 (-OCH2CH2-)4이다. 일부 구현예에서, M은 (-OCH2CH2-)3이다. 일부 구현예에서, M은 아릴이다. 일부 구현예에서, M은 페닐이다. 일부 구현예에서, M은 비치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, M은
Figure pct00009
이다. 일부 구현예에서, M은 R7(예를 들어, 1개의 R7)로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, M은
Figure pct00010
이다. 일부 구현예에서, R7은 CF3이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, P는 부재이거나, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 부재이다. 일부 구현예에서, 화학식 I 및 화학식 I-a에 있어서, P는 트리사이클릭, 바이사이클릭 또는 모노사이클릭 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 모노사이클릭 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 질소-함유 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 모노사이클릭, 질소-함유 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 5-원 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 5-원 질소-함유 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, P는 테트라졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴 또는 트리아졸릴, 피롤릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴이다. 일부 구현예에서, P는 테트라졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴 또는 트리아졸릴 또는 피롤릴이다. 일부 구현예에서, P는 이미다졸릴이다. 일부 구현예에서, P는
Figure pct00011
이다. 일부 구현예에서, P는 트리아졸릴이다. 일부 구현예에서, P는 1,2,3-트리아졸릴이다. 일부 구현예에서, P는
Figure pct00012
이다.
일부 구현예에서, P는 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, P는 5-원 헤테로사이클릴 또는 6-원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, P는 이미다졸리디노닐이다. 일부 구현예에서, P는
Figure pct00013
이다. 일부 구현예에서, P는 티오모르폴리닐-1,1-디옥시딜이다.
일부 구현예에서, P는
Figure pct00014
이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, Z는 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, Z는 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 산소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 4-원 헤테로사이클릴, 5-원 헤테로사이클릴 또는 6-원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 6-원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 6-원 산소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 테트라하이드로피라닐이다. 일부 구현예에서, Z는
Figure pct00015
,
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
이다. 일부 구현예에서, Z는 4-원 산소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는
Figure pct00018
이다.
일부 구현예에서, Z는 바이사이클릭 산소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 프탈릭 언하이드릴이다. 일부 구현예에서, Z는 황-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 6-원 황-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 질소 원자 및 황 원자를 함유하는 6-원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 티오모르폴리닐-1,1-디옥시딜이다. 일부 구현예에서, Z는
Figure pct00019
이다. 일부 구현예에서, Z는 질소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 6-원 질소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는
Figure pct00020
이다.
일부 구현예에서, Z는 바이사이클릭 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 하나 이상의 R5로 선택적으로 치환되는 바이사이클릭 질소-함유 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, Z는 2-옥사-7-아자스피로[3.5]노나닐이다. 일부 구현예에서, Z는
Figure pct00021
이다. 일부 구현예에서, Z는 1-옥사-3,8-디아자스피로[4.5]데칸-2-온이다. 일부 구현예에서, Z는
Figure pct00022
이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, Z는 아릴이다. 일부 구현예에서, Z는 모노사이클릭 아릴이다. 일부 구현예에서, Z는 페닐이다. 일부 구현예에서, Z는 (예를 들어, 1개의 R5로) 일치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 질소-함유 기이다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 NH2이다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 산소-함유 기이다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 산소-함유 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는OCH3이다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 오르쏘 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 메타 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, Z는 일치환된 페닐이며, 1개의 R5는 파라 위치에 존재한다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, Z는 알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C12 알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C10 알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C8 알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 1 내지 5개의 R5로 치환된 C1-C8 알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 1개의 R5로 치환된 C1-C8 알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 1개의 R5로 치환된 C1-C8 알킬이며, R5는 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1, -C(O)RB1,-OC(O)RB1 또는 -N(RC1)(RD1)이다. 일부 구현예에서, Z는 1개의 R5로 치환된 C1-C8 알킬이며, R5는 -ORA1 또는 -C(O)ORA1이다. 일부 구현예에서, Z는 1개의 R5로 치환된 C1-C8 알킬이며, R5는 -ORA1 또는 -C(O)OH이다. 일부 구현예에서, Z는 -CH3이다.
일부 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 I-a에 있어서, Z는 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C12 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C10 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C8 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 C1-C6 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 하나 이상의 R5로 선택적으로 치환되는 질소-함유 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 1 내지 5개의 R5로 치환되는 질소 및 황-함유 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, Z는 N-메틸-2-(메틸술포닐)에탄-1-아미닐이다.
일부 구현예에서, Z는 -ORA 또는 -C(O)ORA이다. 일부 구현예에서, Z는 -ORA(예를 들어, -OH 또는 -OCH3)이다. 일부 구현예에서, Z는 -OCH3이다. 일부 구현예에서, Z는 -C(O)ORA(예를 들어, -C(O)OH)이다.
일부 구현예에서, Z는 수소이다.
일부 구현예에서, L2는 결합이며, P 및 L3은 독립적으로 부재이다. 일부 구현예에서, L2는 결합이며, P는 헤테로아릴이며, L3은 결합이며, Z는 수소이다. 일부 구현예에서, P는 헤테로아릴이며, L3은 헤테로알킬이며, Z는 알킬이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-b의 화합물 또는 그의 염이다:
[화학식 I-b]
Figure pct00023
상기 식에서, 고리 M1은 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 1 내지 5개의 R3으로 선택적으로 치환되며; 고리 Z1은 1 내지 5개의 R5로 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; R2a, R2b, R2c 및 R2d의 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로, 시아노, 니트로, 아미노, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이거나, R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d의 각각은 함께 옥소기를 형성하며; X는 부재이거나, N(R10)(R11), O 또는 S이며; RC는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴의 각각은 1 내지 6개의 R6으로 선택적으로 치환되며; 각각의 R3, R5 및 R6은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 시아노, 아지도, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1, -C(O)RB1, -OC(O)RB1, -N(RC1)(RD1), -N(RC1)C(O)RB1, -C(O)N(RC1), SRE1, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; R10 및 R11의 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, -C(O)ORA1, -C(O)RB1, -OC(O)RB1, -C(O)N(RC1), 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; 각각의 RA1, RB1, RC1, RD1 및 RE1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴이며, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴의 각각은 1 내지 6개의 R7로 선택적으로 치환되며; 각각의 R7은 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로겐, 시아노, 옥소, 하이드록실, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴이며; 각각의 m 및 n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00024
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 각각의 R3 및 R5에 있어서, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 옥소, 시아노, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴로 선택적으로 그리고 독립적으로 치환된다.
일부 구현예에서, 화학식 I-b의 화합물은 화학식 I-b-i의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-b-i]
Figure pct00025
상기 식에서, 고리 M2는 하나 이상의 R3으로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴이며; 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d의 각각은 함께 옥소기를 형성하며; X는 부재이거나, O 또는 S이며; 각각의 R3 및 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이거나; 각각의 알킬 및 헤테로알킬은 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 2개의 R5는 함께 고리 Z2에 융합된 5 내지 6원 고리를 형성하며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; p는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00026
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I-b-i의 화합물은 화학식 I-b-ii의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-b-ii]
Figure pct00027
상기 식에서, 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R3 및 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 알킬 및 헤테로알킬은 할로겐으로 선택적으로 치환되며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; p 및 q는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00028
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-c의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-c]
Figure pct00029
상기 식에서, 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R3 및 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 알킬 및 헤테로알킬은 할로겐으로 선택적으로 치환되며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; p 및 q는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00030
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-d의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-d]
Figure pct00031
상기 식에서, 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; X는 부재이거나, O 또는 S이며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d의 각각은 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며, 각각의 알킬 및 헤테로알킬은 할로겐으로 선택적으로 치환되며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; p는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00032
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-e의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-e]
Figure pct00033
상기 식에서, 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며; X는 부재이거나, O 또는 S이며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d의 각각은 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; p는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00034
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 I-f의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 I-f]
Figure pct00035
상기 식에서, M은 하나 이상의 R3으로 선택적으로 치환되는 알킬이며; 고리 P는 하나 이상의 R4로 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이며; L3은 하나 이상의 R2로 선택적으로 치환되는 알킬 또는 헤테로알킬이며; Z는 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 하나 이상의 R5로 선택적으로 치환되며; R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2a 및 R2b는 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00036
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 II]
Figure pct00037
상기 식에서, M은 결합, 알킬 또는 아릴이며, 알킬 및 아릴은 하나 이상의 R3으로 선택적으로 치환되며; L3은 하나 이상의 R2로 선택적으로 치환되는 알킬 또는 헤테로알킬이며; Z는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 또는 -ORA이며, 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 하나 이상의 R5로 선택적으로 치환되며; RA는 수소이며; R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2a 및 R2b는 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R2, R3 및 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00038
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 II의 화합물은 화학식 II-a의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 II-a]
Figure pct00039
상기 식에서, L3은 알킬 또는 헤테로알킬이며, 이의 각각은 하나 이상의 R2로 선택적으로 치환되며; Z는 수소, 알킬, 헤테로알킬 또는 -ORA이며, 알킬 및 헤테로알킬은 하나 이상의 R5로 선택적으로 치환되며; R2a 및 R2b의 각각은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이거나, R2a 및 R2b는 함께 옥소기를 형성하며; 각각의 R2, R3 및 R5는 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; RA는 수소이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; "
Figure pct00040
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 III]
Figure pct00041
상기 식에서, Z1은 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 1 내지 5개의 R5로 선택적으로 치환되며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 할로, 시아노, 니트로, 아미노, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이거나; R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; RC는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로알킬이며, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로알킬의 각각은 1 내지 6개의 R6으로 선택적으로 치환되며; R3, R5 및 R6의 각각은 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; q는 0 내지 25의 정수이며; "
Figure pct00042
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 III의 화합물은 화학식 III-a의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 III-a]
Figure pct00043
상기 식에서, 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 1 내지 5개의 R5로 선택적으로 치환되며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 할로이거나; R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; R3 및 R5는 각각 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며; q는 0 내지 25의 정수이며; "
Figure pct00044
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 III-a의 화합물은 화학식 III-b의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 III-b]
Figure pct00045
상기 식에서, 고리 Z2는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 이의 각각은 1 내지 5개의 R5로 선택적으로 치환되며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 할로이거나; R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; R3 및 R5는 각각 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; o 및 p는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며; q는 0 내지 25의 정수이며; "
Figure pct00046
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 III-a의 화합물은 화학식 III-c의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 III-c]
Figure pct00047
상기 식에서, X은 C(R')(R"), N(R') 또는 S(O)x이며; R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 할로겐 또는 사이클로알킬이며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬 또는 할로이거나; R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; R3 및 R5는 각각 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; p는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며; q는 0 내지 25의 정수이며; x는 0, 1 또는 2이며; "
Figure pct00048
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화학식 III-c의 화합물은 화학식 III-d의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[화학식 III-d]
Figure pct00049
상기 식에서, X은 C(R')(R"), N(R') 또는 S(O)x이며; R' 및 R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 할로겐 또는 사이클로알킬이며; R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬 또는 할로이거나; R2a 및 R2b 또는 R2c 및 R2d는 함께 옥소기를 형성하며; R3 및 R5는 각각 독립적으로 알킬, 헤테로알킬, 할로겐, 옥소, -ORA1, -C(O)ORA1 또는 -C(O)RB1이며; 각각의 RA1 및 RB1은 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로알킬이며; m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; p는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며; q는 0 내지 25의 정수이며; x는 0, 1 또는 2이며; "
Figure pct00050
"는 본원에 기재된 부착기 또는 중합체로의 연결을 지칭한다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I의 화합물이다. 일부 구현예에서, L2는 결합이며, P 및 L3은 독립적으로 부재이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-a의 화합물이다. 화학식 II-a의 일부 구현예에서, L2는 결합이며, P는 헤테로아릴이며, L3은 결합이며, Z는 수소이다. 일부 구현예에서, P는 헤테로아릴이며, L3은 헤테로알킬이며, Z는 알킬이다. 일부 구현예에서, L2는 결합이며, P 및 L3은 독립적으로 부재이다. 일부 구현예에서, L2는 결합이며, P는 헤테로아릴이며, L3은 결합이며, Z는 수소이다. 일부 구현예에서, P는 헤테로아릴이며, L3은 헤테로알킬이며, Z는 알킬이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b의 화합물이다. 일부 구현예에서, P는 부재이며, L1은 -NHCH2이며, L2는 결합이며, M은 아릴(예를 들어, 페닐)이며, L3은 -CH2O이며, Z는 헤테로사이클릴(예를 들어, 질소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 티오모르폴리닐-1,1-디옥시드)이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-b의 화합물은 화합물 116이다.
화학식 I-b의 일부 구현예에서, P는 부재이며, L1은 -NHCH2이며, L2는 결합이며, M은 부재이며, L3은 결합이며, Z는 헤테로사이클릴(예를 들어, 산소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸라닐, 옥세타닐 또는 옥시라닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-b의 화합물은 화합물 105이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b-i의 화합물이다. 화학식 I-b-i의 일부 구현예에서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소 또는 CH3이며, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1 또는 2이며, n은 1이며, X는 O이며, p는 0이며, M2는 하나 이상의 R3으로 선택적으로 치환되는 페닐이며, R3은 -CF3이며, Z2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 산소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸라닐, 옥세타닐 또는 옥시라닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-b-i의 화합물은 화합물 100, 화합물 106, 화합물 107, 화합물 108, 화합물 109 또는 화합물 111이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b-ii의 화합물이다. 화학식 I-b-ii의 일부 구현예에서, R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, q는 0이며, p는 0이며, m은 1이며, Z2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 산소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 테트라하이드로피라닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-b-ii의 화합물은 화합물 100이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-c의 화합물이다. 화학식 I-c의 일부 구현예에서, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1이며, p는 1이며, q는 0이며, R5는 -CH3이며, Z는 헤테로사이클릴(예를 들어, 질소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 피페라지닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-c의 화합물은 화합물 113이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-d의 화합물이다. 화학식 I-d의 일부 구현예에서, R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1이며, n은 3이며, X는 O이며, p는 0이며, Z는 헤테로사이클릴(예를 들어, 산소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸라닐, 옥세타닐 또는 옥시라닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-d의 화합물은 화합물 110 또는 화합물 114이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-f의 화합물이다. 화학식 I-f의 일부 구현예에서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소이며, n은 1이며, M은 -CH2-이며, P는 질소-함유 헤테로아릴(예를 들어, 이미다졸릴)이며, L3은 -C(O)OCH2-이며, Z는 CH3이다. 일부 구현예에서, 화학식 I-f의 화합물은 화합물 115이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 II-a의 화합물이다. 화학식 II-a의 일부 구현예에서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소이며, n은 1이며, q는 0이며, L3은 -CH2(OCH2CH2)2이며, Z는 -OCH3이다. 일부 구현예에서, 화학식 II-a의 화합물은 화합물 112이다.
화학식 II-a의 일부 구현예에서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소이며, n은 1이며, L3은 결합 또는 -CH2이며, Z는 수소 또는 -OH이다. 일부 구현예에서, 화학식 II-a의 화합물은 화합물 103 또는 화합물 104이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 III의 화합물이다. 화학식 III의 일부 구현예에서, R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1이며, n은 2이며, q는 3이며, p는 0이며, RC는 수소이며, Z1은 R5(예를 들어, -N(CH3)(CH2CH2)S(O)2CH3)로 선택적으로 치환되는 헤테로알킬이다. 일부 구현예에서, 화학식 III의 화합물은 화합물 120이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 III-b의 화합물이다. 화학식 III-b의 일부 구현예에서, R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 0이며, n은 2이며, q는 3이며, p는 0이며, Z2는 1개의 R5(예를 들어, -NH2)로 치환된 아릴(예를 들어, 페닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 III-b의 화합물은 화합물 102이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 III-b의 화합물이다. 화학식 III-b의 일부 구현예에서, R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1이며, n은 2이며, q는 3이며, p는 0이며, RC는 수소이며, Z2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 질소-함유 헤테로사이클릴, 예를 들어, 질소-함유 스피로 헤테로사이클릴, 예를 들어, 2-옥사-7-아자스피로[3.5]노나닐)이다. 일부 구현예에서, 화학식 III-a의 화합물은 화합물 121이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 III-d의 화합물이다. 화학식 III-d의 일부 구현예에서, R2a, R2b, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1이며, n은 2이며, q는 1, 2, 3 또는 4이며, p는 0이며, X는 S(O)2이다. 화학식 III-d의 일부 구현예에서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 수소이며, m은 1이며, n은 2이며, q는 1, 2, 3 또는 4이며, p는 0이며, X는 S(O)2이다. 일부 구현예에서, 화학식 III-d의 화합물은 화합물 101, 화합물 117, 화합물 118 또는 화합물 119이다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b, I-d 또는 I-e의 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b, I-d 또는 II의 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b, I-d 또는 I-f의 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-b, I-d 또는 III의 화합물이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 WO2012/112982호, WO2012/167223호, WO2014/153126호, WO2016/019391호, WO 2017/075630호, US2012-0213708호, US 2016-0030359호 또는 US 2016-0030360호에 개시된 화합물이 아니다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 표 3에 나타낸 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 외측 표면 및/또는 본원에 기재된 디바이스 내의 하나 이상의 구획은 표 3에 나타낸 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
[표 3] 예시적인 화학식 I의 화합물
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I(예를 들어, 화학식 I-b, I-c, I-d, I-e, I-f, II, II-a, III, III-a, III-b, III-c 또는 III-d)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이며, 하기로부터 선택된다:
Figure pct00054
,
Figure pct00055
및
Figure pct00056
또는 상기 화합물 중 어느 하나의 약제학적으로 허용 가능한 염.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 디바이스는
Figure pct00057
,
Figure pct00058
의 화합물 또는 어느 하나의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 디바이스는 알긴산염 중합체에 공유적으로 결합된 화학식 I의 화합물(예를 들어, 표 3에 나타낸 화합물)을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 예를 들어, 아미드 결합에 의해, 알긴산염 중합체 내의 하나 이상의 굴루론산 및/또는 만누론산 단량체에 공유적으로 결합된 화학식 I의 화합물(예를 들어, 표 3에 나타낸 화합물, 예를 들어, 화합물 101)을 포함한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물(예를 들어, 표 3의 화합물 101)은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 2.0 % 및 9.0 % 미만의 질소, 또는 2.0% 내지 5% 질소, 3.0% 내지 8.0% 질소, 5% 내지 8.0% 질소, 4.0% 내지 7.0% 질소, 5.0% 내지 7.0% 질소, 또는 6.0% 내지 7.0% 질소 또는 약 6.8% 질소의 컨쥬게이션 밀도로, 알긴산염(예를 들어, 75 kDa 미만의 분자량 근사치, 1.5 이상인 G:M 비를 갖는 알긴산염)에 공유적으로 부착된다.
치료 방법
본원에 기술된 바와 같은 GLA 단백질을 발현하고 분비할 수 있는 복수의 조작된 RPE 세포의 투여 또는 이식을 통한 대상체에서의 파브리병의 예방 또는 치료 방법이 본원에 기술된다. 일 구현예에서, 복수의 RPE 세포는 본원에 기술된 이식 가능한 디바이스 내에 함유된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 파브리병의 적어도 하나의 증상을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 완화시키거나, 파브리병의 발병을 예방하거나 늦춘다. 일 구현예에서, 당해 방법은 내부 구획에 본원에 기술된 조작된 RPE 세포 및 세포-결합 중합체를 포함하며, 외부 캡슐 표면 상에 및 선택적으로 외부 구획 내에 화학식 I의 화합물, 예를 들어, 화합물 101을 포함하는 유효량의 2-구획 알긴산염 하이드로겔 캡슐의 조성물을 투여하는(예를 들어, 이식하는) 단계를 포함한다.
열거된 예시적인 구현예
1. 전구체 GLA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 하기 특징 중 적어도 하나 이상을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드:
(a) 프로모터가 SEQ ID NO:18과 동일하거나 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어짐;
(b) 전구체 GLA 코딩 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨;
(c) 전구체 GLA 코딩 서열이 GLA 융합 단백질을 인코딩하며, GLA 융합 단백질이 하기의 특징 중 하나 이상을 가짐:
(i) GLA 융합 단백질이 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 GLA이외의 분비 단백질(예를 들어, 포유동물 HSPG2 단백질, 예를 들어, 인간 HSPG2)로부터의 신호 펩티드를 포함함;
(ii) GLA 융합 단백질은 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드(예를 들어, 인간 GLA 또는 HSPG2 유래) 및 GLA 아미노산 서열의 C-말단에 작동 가능하게 연결된 비-GLA 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열을 포함함.
2. 구현예 1에 있어서, 특징 (a) 및 (c)(i); 특징 (a) 및 (c)(ii); 특징 (b) 및 (c)(i); 특징 (b) 및 (c)(ii); 특징 (a), (b) 및 (c)(i) 또는 및 특징 (a), (b) 및 (c)(ii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징의 조합을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
3. GLA 단백질(예를 들어, 인간 GLA 단백질 또는 그의 변이체)을 분비할 수 있는 복수의 조작된 RPE 세포로서, 복수의 조작된 RPE 세포 중 각각의 세포가 전구체 GLA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 조작된 RPE 세포가 하기의 특징 중 적어도 하나 이상을 갖는 복수의 조작된 RPE 세포:
a) 프로모터가 SEQ ID NO:18과 동일하거나 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어짐;
b) 전구체 GLA 코딩 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨;
c) 전구체 GLA 코딩 서열이 GLA 융합 단백질을 인코딩하며, GLA 융합 단백질이 하기의 특징 중 하나 이상을 가짐:
i) GLA 융합 단백질이 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 GLA 이외의 분비 단백질(예를 들어, 포유동물 HSPG2 단백질, 예를 들어, 인간 HSPG2)로부터의 신호 펩티드를 포함함;
ii) GLA 융합 단백질은 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드(예를 들어, 인간 GLA 또는 HSPG2 유래) 및 GLA 아미노산 서열의 C-말단에 작동 가능하게 연결된 비-GLA 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열을 포함함.
4. 구현예 3에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 특징 (a) 및 (c)(i); 특징 (a) 및 (c)(ii); 특징 (b) 및 (c)(i); 특징 (b) 및 (c)(ii); 특징 (a), (b) 및 (c)(i) 또는 및 특징 (a), (b) 및 (c)(ii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징의 조합을 포함하는 복수의 조작된 RPE 세포.
5. 구현예 4에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 염색체외 발현 벡터를 포함하거나, RPE 세포의 핵 게놈 내의 적어도 하나의 위치 내로 통합되는 복수의 조작된 RPE 세포.
6. 구현예 3 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 트랜스펙션된 ARPE-19 세포로부터 유래되는 복수의 조작된 RPE 세포.
7. 구현예 6에 있어서, 폴리클로널 세포 배양물로서 또는 모노클로널 세포주로서 제공되는 복수의 조작된 RPE 세포.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 전구체 GLA 코돈-최적화된 코딩 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4인 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 조작된 RPE 세포.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 신호 펩티드가 SEQ ID NO:15로 본질적으로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 조작된 RPE 세포.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, GLA 융합 단백질이 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 조작된 RPE 세포.
11. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, SEQ ID NO 3, 4, 6, 9, 12 및 14 중 하나 이상을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 조작된 RPE 세포.
12. 구현예 3 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 하기의 특징 중 하나 이상을 나타내는 복수의 조작된 RPE 세포:
a) 복수의 조작된 RPE 세포가 예를 들어, 시험관내 세포 배양물에서 또는 대상체 내로 이식되는 경우(예를 들어, 본원에 기술된 참조 방법에 의해 평가되는 바와 같이) 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 1개월 또는 적어도 2개월 동안 GLA 단백질을 분비함; 또는
b) 복수의 조작된 RPE 세포가 전구체 GLA를 인코딩하는 야생형 인간 뉴클레오티드 서열로 트랜스펙션된 참조의 복수의 조작된 RPE 세포보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 많은 양의 GLA 단백질을 분비함.
13. 구현예 3 내지 12 중 어느 한 구현예의 복수의 조작된 RPE 세포를 포함하는 적어도 하나의 세포-함유 구획 및 디바이스가 대상체 내로 이식되는 경우 이물 반응(FBR)을 완화시키기 위한 적어도 하나의 수단을 포함하는 이식 가능한 디바이스.
14. 구현예 13에 있어서, 적어도 하나의 세포-함유 구획이 복수의 조작된 RPE 세포를 캡슐화하며 선택적으로 적어도 하나의 세포-결합 물질(CBS)을 포함하는 중합체 조성물을 포함하는 디바이스.
15. 구현예 13 또는 14에 있어서, 세포-함유 구획이 알긴산염 하이드로겔을 포함하며 장벽 구획에 의해 둘러싸이며, 장벽 구획이 알긴산염 하이드로겔을 포함하며, 선택적으로 장벽 구획의 외부 표면 상에 배치된 화학식 I의 화합물, 예를 들어, 표 3의 화합물 101을 포함하는 디바이스.
16. 구현예 14 또는 15에 있어서, 중합체 조성물이 펩티드로 공유적으로 변형된 알긴산염을 포함하며, 펩티드가 GRGDSP(SEQ ID NO:44), GGRGDSP(SEQ ID NO:45) 또는 GGGRGDSP(SEQ ID NO:46)로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 디바이스.
17. 구현예 15 또는 16에 있어서, 장벽 구획이 미변형된 알긴산염 및 화합물 101로 변형된 알긴산염의 혼합물을 포함하며,
(a) 미변형된 알긴산염이 150 kDa 내지 250 kDa의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 가지며,
(b) 변형된 알긴산염에서 알긴산염이 75 kDa 미만의 분자량을 가지며, 1.5 이상의 G:M 비를 갖는 디바이스.
18. 구현예 17에 있어서, 변형된 알긴산염에서 화합물 101의 컨쥬게이션 밀도가 예를 들어, 본원에서 하기 실시예 10에 기술된 바와 같이 정량적 유리 아민 분석에 의해 결정되며, 결정된 컨쥬게이션 밀도가 1.0 w/w% 내지 3.0 w/w%, 1.3 w/w% 내지 2.8 w/w%, 1.3 w/w% 내지 2.6 w/w%, 1.5 w/w% 내지 2.4 w/w%, 1.5 w/w% 내지 2.2 w/w% 또는 1.7 w/w% 내지 2.2 w/w%인 디바이스.
19. 하이드로겔 캡슐로서:
(a) 제1 RGD-중합체를 포함하는 제1 중합체 조성물에 캡슐화된 구현예 3 내지 12 중 어느 한 구현예의 복수의 조작된 세포를 포함하는 내부 세포-함유 구획으로서, 선택적으로, 복수의 세포의 농도가 제1 중합체 조성물 ml당 4000만개 세포이거나; ml당 4000만개 내지 1억개 세포, ml당 6000만개 내지 1억개 세포 또는 제1 중합체 조성물 ml당 8000만개 내지 1억개 세포 중 어느 하나인 내부 세포-함유 구획; 및
(b) 세포-함유 구획을 둘러싸고, 표 3에 나타낸 화합물 100, 화합물 101, 화합물 110, 화합물 112, 화합물 113 및 화합물 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물로 공유적으로 변형된 알긴산염과 미변형된 알긴산염의 혼합물을 포함하는 제2 중합체 조성물을 포함하는 장벽 구획을 포함하며,
하이드로겔 캡슐이 구체 형상을 가지며, 0.5 밀리미터 내지 5 밀리미터의 직경을 갖고, 선택적으로 장벽 구획의 평균 두께가 약 10 내지 약 300 미크론, 약 20 내지 약 150 미크론 또는 약 40 내지 약 75 미크론인 하이드로겔 캡슐.
20. 구현예 19에 있어서, 하이드로겔 캡슐이 GLA 단백질의 증가된 분비를 위한 유효량의 제1 RGD-중합체를 포함하며, 제1 RGD-중합체가 링커를 통해 RGD 펩티드로 공유적으로 변형된 알긴산염으로 본질적으로 이루어지며, 세포-함유 구획에는 임의의 비섬유성 화합물이 실질적으로 없고, 장벽 구획에는 세포 및 RGD 펩티드가 실질적으로 없고, 선택적으로 RGD-중합체의 유효량이 최적의 양인 하이드로겔 캡슐.
21. 구현예 19 또는 구현예 20에 있어서, RGD 펩티드가 RGD(SEQ ID NO: 28) 또는 RGDSP(SEQ ID NO: 49)의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지며, 링커가 RGD 펩티드의 N-말단에 부착된 단일의 글리신 잔기 또는 단일의 베타-알라닌 잔기인 하이드로겔 캡슐.
22. 구현예 19 내지 구현예 21 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 제1 RGD-중합체에서 중합체가 알긴산염이며, 150 내지 250 kDa의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 가지며, 선택적으로 세포-함유 구획이 약 90 cP 내지 약 230 cP 내지 약 300, 350 또는 400 cP, 또는 약 80 cP 내지 약 120 cP의 점도를 갖는 알긴산염 용액으로부터 형성되며;
(b) 장벽 구획 내의 공유적으로 변형된 알긴산염에서 알긴산염은 75 kDa 미만의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 가지며;
(c) 장벽 구획 내의 미변형된 알긴산염이 150 kDa 내지 250 kDa의 분자량 및 1.5 이상의 G:M 비를 가지며;
(d) 선택적으로, 장벽 구획이 공유적으로 변형된 알긴산염 및 미변형된 알긴산염의 혼합물을 포함하며, 250 내지 350 cP의 점도를 갖는 알긴산염 용액으로부터 형성되는 하이드로겔 캡슐.
23. 구현예 22에 있어서,
(a) 캡슐이 1.0 밀리미터 내지 2.0 밀리미터의 직경을 가지며;
(b) 알긴산염 상의 RGD 펩티드의 컨쥬게이션 밀도가 (예를 들어, 본원에서 실시예 1B에 기재된 바와 같이) 불변의 중량으로 동결건조된 RGD-중합체의 연소 분석에 의해 결정되는 질소 백분율이며, 결정된 질소 백분율이 약 0.10% 질소(N) 내지 1.00% N, 약 0.20% N 내지 약 0.80% N, 약 0.30% N 내지 약 0.60% N, 약 0.30% 내지 약 0.50%, 또는 0.33% N 내지 0.46% N이며;
(c) 장벽 구획 내의 공유적으로 변형된 알긴산염이 오직 화합물 101로만 변형되며, 공유적으로 변형된 알긴산염에서 화합물 101의 밀도는 예를 들어, 본원에서 실시예 1A에 기재된 바와 같이, 불변의 중량으로 동결건조된 공유적으로 변형된 알긴산염의 연소 분석에 의해 결정되는 질소 백분율이며; 결정되는 질소 백분율이 적어도 2.0% 및 9.0% 미만이거나, 3.0% 내지 8.0%, 4.0% 내지 7.0%, 5.0% 내지 7.0% 또는 6.0% 내지 7.0% 또는 약 6.8%인 하이드로겔 캡슐.
24. 구현예 23에 있어서,
(a) 캡슐이 약 1.5 밀리미터의 직경을 가지며;
(b) RGD 펩티드가 RGDSP(SEQ ID NO: 49)의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지며, 링커가 단일의 글리신 잔기이며;
(c) 알긴산염 상의 RGD 펩티드의 컨쥬게이션 밀도가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 조작된 RPE 세포의 생존력을 증가시키기에 유효한 양,
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 조작된 RPE 세포의 생산성을 증가시키기에 유효한 양,
(iii) (예를 들어, 본원에서 실시예 1B에 기재된 바와 같이) 불변의 중량으로 동결건조된 RGD-중합체의 연소 분석에 의해 결정되는 질소 백분율로서, 결정된 질소 백분율이 약 0.10% 질소(N) 내지 1.00% N, 약 0.20% N 내지 약 0.80% N, 약 0.30% N 내지 약 0.60% N, 약 0.30% 내지 약 0.50%, 또는 0.33% N 내지 0.46% N인 질소 백분율;
(iv) 예를 들어, 본원에서 실시예 7 및 선택적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이, 용액 중 RGD-중합체 그램당 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 0.8, 0.3 내지 0.7 또는 0.3 내지 0.6 마이크로몰의 GRGDSP(SEQ ID NO: 44); 및
(v) c(i), c(ii), c(iii) 및 c(iv) 중 둘 이상의 임의의 조합; 그리고
(d) 장벽 구획 내의 공유적으로 변형된 알긴산염이 오직 화합물 101로만 변형되며, 공유적으로 변형된 알긴산염에서 화합물 101의 밀도가
(i) 예를 들어, 본원에서 실시예 1A에 기재된 바와 같이, 불변의 중량으로 동결건조된 공유적으로 변형된 알긴산염의 연소 분석에 의해 결정되는 질소 백분율이며, 결정된 질소 백분율이 적어도 2.0% 및 9.0% 미만이거나, 3.0% 내지 8.0%, 4.0% 내지 7.0%, 5.0% 내지 7.0%, 또는 6.0% 내지 7.0% 또는 약 6.8%이거나; 또는
(ii) 예를 들어, 본원에서 실시예 9에 기재된 바와 같이 정량적 유리 아민 분석에 의해 결정되는 바와 같은 중량/중량 기준의 아민%이며, 결정되는 밀도가 1.0% w/w 내지 3.0% w/w, 1.3% w/w 내지 2.8% w/w, 1.3% w/w 내지 2.6% w/w, 1.5% w/w 내지 2.4% w/w, 1.5% w/w 내지 2.2% w/w 또는 1.7% w/w 내지 2.2% w/w인 하이드로겔 캡슐.
25. 구현예 24에 있어서, RGD-중합체에서 알긴산염 상의 RGD 펩티드의 컨쥬게이션 밀도가 용액 내의 RGD-중합체 그램당 0.3 내지 0.6 마이크로몰의 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)인 하이드로겔 캡슐.
26. 디바이스의 제제로서, 제제 내의 각각의 디바이스가 구현예 13 내지 구현예 18 중 어느 한 구현예의 디바이스인 제제.
27. 복수의 하이드로겔 캡슐을 포함하는 조성물로서, 조성물 내의 각각의 캡슐이 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 하이드로겔 캡슐인 조성물.
28. 구현예 27에 있어서, 각각의 캡슐이 0.5 밀리미터 내지 2 밀리미터; 0.7 밀리미터 내지 1.8 밀리미터, 1.0 밀리미터 내지 1.8 밀리미터; 1.2 밀리미터 내지 1.7 밀리미터; 1.3 밀리미터 내지 1.7 밀리미터; 및 1.4 내지 1.6 밀리미터로 이루어진 군으로부터 선택되는 직경을 갖는 구형 하이드로겔 캡슐인 조성물.
29. 구현예 27 또는 28에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 조성물인 조성물.
30. 유효량의 구현예 26의 디바이스의 제제 또는 구현예 27 내지 29 중 어느 한 구현예의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 파브리병을 갖는 환자의 치료 방법.
31. RPE 세포를 구현예 1, 2 또는 8 내지 11 중 어느 한 구현예에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드로 안정적으로 트랜스펙션시키는 단계 및 선택적으로 GLA 단백질을 발현하는 모노클로널 세포주를 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 특성을 갖는 GLA 단백질(예를 들어, 인간 GLA 단백질 또는 그의 변이체)을 생성하기 위한 복수의 RPE 세포의 조작 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 복수의 RPE 세포가 ARPE-19 세포로부터 유래되는 방법.
33. GLA 단백질을 발현하고 분비할 수 있는 조작된 포유동물 세포로서, 세포가 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 전구체 GLA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 포유동물 세포:
(a) 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨;
(b)
(i) 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 GLA 이외의 분비 단백질 유래의 신호 펩티드; 또는
(ii) 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드 및 GLA 아미노산 서열의 C-말단에 작동 가능하게 연결된 비-GLA 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 GLA 융합 단백질을 포함하는 GLA 융합 단백질을 인코딩함.
34. 구현예 33에 있어서, 포유동물 세포가 RPE 세포로부터 유래되며, 선택적으로, 프로모터가 SEQ ID NO:18과 동일하거나, 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어진 조작된 세포.
35. 구현예 33 또는 34에 있어서, 전구체 GLA 코딩 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 조작된 세포.
36. 구현예 33 또는 34에 있어서, 신호 펩티드가 포유동물 HSPG2 단백질에서 유래된 것이며, 선택적으로 신호 펩티드가 SEQ ID NO:15로 본질적으로 이루어진 조작된 세포.
37. 구현예 36에 있어서, 전구체 GLA 코딩 서열이 SEQ ID NO:16을 포함하는 조작된 세포.
38. 구현예 33 또는 34에 있어서, GLA 융합 단백질이 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13을 포함하는 조작된 세포.
39. 구현예 38에 있어서, 전구체 GLA 코딩 서열이 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:14를 포함하는 조작된 세포.
40. 구현예 33 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 포유동물 세포가 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 트랜스펙션된 ARPE-19 세포로부터 유래되는 조작된 세포.
41. 구현예 33 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:47을 포함하는 조작된 세포.
42. 구현예 33 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 염색체외 벡터를 포함하거나, 포유동물 세포 내의 적어도 하나의 염색체 위치 내로 통합되는 조작된 세포.
43. 구현예 33 내지 42 중 어느 한 구현예의 조작된 포유동물 세포를 포함하는 조성물.
44. 구현예 43에 있어서, 폴리클로널 세포 배양물 또는 모노클로널 세포주의 배양물인 조성물.
45. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 이중-가닥 DNA 분자: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:48.
46. 구현예 45에 있어서, SEQ ID NO:48로 본질적으로 이루어진 단리된 DNA 분자.
47. 적어도 하나의 세포-함유 구획을 포함하는 이식 가능한 디바이스로서, 구현예 33 내지 42 중 어느 한 구현예의 조작된 세포 및 디바이스가 대상체 내로 이식되는 경우 이물 반응(FBR)을 완화시키기 위한 적어도 하나의 수단을 포함하는, 이식 가능한 디바이스.
48. 구현예 47에 있어서, 적어도 하나의 세포-함유 구획이 조작된 세포를 캡슐화하며, 선택적으로 적어도 하나의 세포-결합 물질(CBS)을 포함하는 중합체 조성물을 포함하는 이식 가능한 디바이스.
49. 구현예 47 또는 48에 있어서, 세포-함유 구획이 알긴산염 하이드로겔 및 선택적으로 장벽 구획의 외부 표면 상에 배치된 화학식 I의 화합물을 포함하는 장벽 구획에 의해 둘러싸인 이식 가능한 디바이스.
50. 구현예 48 또는 49에 있어서, 중합체 조성물이 펩티드로 공유적으로 변형된 알긴산염을 포함하며, 펩티드가 GRGDSP(SEQ ID NO:44) 또는 GGRGDSP(SEQ ID NO:45)로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지며, 장벽 구획이 하기 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 변형된 알긴산염을 포함하는 이식 가능한 디바이스:
Figure pct00059
.
51. 하이드로겔 캡슐로서:
(a) 하이드로겔-형성 중합체를 포함하는 제1 중합체 조성물에 캡슐화된 구현예 33 내지 42 중 어느 한 구현예의 조작된 세포를 포함하는 내부 구획; 및
(b) 내부 구획을 둘러싸며 제2 중합체 조성물을 포함하는 장벽 구획으로서, 제2 중합체 조성물은 표 3에 나타낸 화합물 100, 화합물 101, 화합물 110, 화합물 112, 화합물 113 및 화합물 114로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물로 공유적으로 변형된 알긴산염을 포함하는 장벽 구획
을 포함하는 하이드로겔 캡슐.
52. 구현예 51에 있어서, 선택된 화합물이 하기의 것인 하이드로겔 캡슐:
Figure pct00060
.
53. 구현예 51 또는 52에 있어서, 내부 구획이 구현예 41의 복수의 조작된 세포를 포함하며, 선택적으로 내부 구획 내의 조작된 세포의 농도가 제1 중합체 조성물 ml당 적어도 4000만개의 세포인 하이드로겔 캡슐.
54. 구현예 51 내지 53 중 어느 한 구현예의 복수의 하이드로겔 캡슐을 포함하는 조성물.
55. 구현예 15 내지 18 중 어느 한 구현예의 이식 가능한 디바이스, 구현예 51 내지 53 중 어느 한 구현예의 하이드로겔 캡슐 또는 구현예 54의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 파브리병을 갖는 환자의 치료 방법.
실시예
본원에 기재된 본 개시내용이 더욱 완전히 이해될 수 있기 위해서, 하기 실시예가 제시된다. 본 출원에 기재된 실시예는 본원에 제공된 조작된 RPE 세포, 이식 가능한 디바이스, 그리고 조성물 및 방법을 설명하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로도 그들의 범주를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 예시적인 조작된 ARPE-19 세포의 생성 및 배양
전구체 GLA 단백질을 인코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 표준 클로닝 방법을 사용하여 삽입한 도 8에 나타낸 발현 벡터를 사용하여 GLA 분비 세포를 생성하였다. 이를 달성하기 위하여, ARPE-19 세포를 GLA 발현 벡터와 함께 트랜스포사제 플라스미드를 함유하는 PiggyBac로 동시-트랜스펙션시켰으며, 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 푸로마이신을 함유하는 완전 성장 배지에서 배양하였다.
안정적으로 트랜스펙션된 ARPE-19 세포를 하기의 프로토콜에 따라 배양하였다. 세포를 150 cm2 세포 배양 플라스크에서 완전 성장 배지(10% FBS 및 1x 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신 항생제를 갖는 DMEM:F12, 집코(Gibco)) 중에서 성장시켰다. 세포를 계대하기 위하여, 배양 플라스크 내의 배지를 흡인시키고, 세포층을 인산염 완충 염수(pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 및 2 mM KH2PO4, 집코)로 간단히 헹구었다. 5 내지 10 mL의 0.25% (w/v) 트립신/ 0.53 mM의 EDTA 용액("TrypsinEDTA")을 플라스크에 첨가하였으며, 세포층이 분산될 때까지, 보통 3 내지 5분 동안 세포를 도립 현미경 하에서 관찰하였다. 응괴를 회피하기 위하여, 세포를 조심히 다루었으며, 분산 기간 동안 플라스크가 부딪히거나 흔들리는 것을 최소화시켰다. 세포가 분리되지 않았다면, 플라스크를 37℃에 배치하여, 분산을 용이하게 하였다. 세포가 분산되면, 10 mL의 완전 성장 배지를 첨가하고, 세포를 부드러운 피펫팅에 의해 흡인하였다. 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 대략 125 x g에서 5 내지 10분 동안 회전 침강시켜, TrypsinEDTA를 제거하였다. 상청액을 폐기하였으며, 세포를 신선한 성장 배지에 재현탁화시켰다. 세포 현탁액의 적절한 분취액을 새로운 배양관에 첨가하였으며, 이를 37℃에서 인큐베이션시켰다. 배지를 주마다 새로 교체하였다.
실시예 2: 예시적인 조작된 ARPE-10 세포로부터 GLA의 분비
세포에서 GLA 발현을 정량화하기 위하여, 다양한 GLA-발현 구축물을 사용하여 조작된 ARPE-19 세포를 상기 기술된 바와 같이 트립신 처리하고, 400,000 개의 세포를 2mL의 완전 배지와 함께 6-웰 플레이트의 웰에 2벌로 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션시키고, 다양한 조작된 세포 배양물에 의하여 시험관내에서 분비되는 GLA 단백질의 양을 청색-형광 기질, 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드를 사용하여 효소적 검정에 의해 정량화하였다. 이 검정은 360nm 광을 사용하여 여기되는 경우 460nm 방출에서의 형광의 증가로서 유리 4-메틸움벨리페릴의 형성을 측정함으로써 GLA의 활성을 측정한다. 세포 배양 배지에서의 이 활성을 상업적으로 입수 가능한 재조합 GLA 단백질(아갈라시다제 베타, 사노피 젠자임(Sanofi Genzyme))을 사용하여 생성된 표준 곡선과 비교하여, 활성 GLA의 농도를 결정하였다.
결과는 도 10에 나타나 있다. GLA 4-1은 인간 야생형 성숙 GLA 아미노산 서열에 대한 코돈-최적화된 코딩 서열에 융합된 인간 HSPG2 신호 펩티드에 대한 코딩 서열인 SEQ ID NO:6을 포함하는 전사 유닛으로 트랜스펙션된 세포의 폴리클로널 배양물이다. GLA-1에서의 코돈-최적화된 서열은 GLA3 구축물에서의 코돈-최적화된 서열의 대응하는 부분과 동일하다. GLA 4-2는 GLA 4-1 폴리클로널 배양물로부터 제한된 희석 클로닝을 사용하여 단리된 클론 세포주의 배양물이다.
실시예 3: 예시적인 화학식 I의 화합물의 합성
일반적인 프로토콜
하기의 절차에는 본원에 기술된 이식 가능한 디바이스의 제조를 위한 예시적인 화합물의 제조 방법이 기술된다. 본원에 제공되는 화합물은 당업자에게 널리 알려져 있을 하기 제시된 구체적인 합성 프로토콜에 대한 변형을 사용하여 용이하게 입수 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적이거나 또는 바람직한 공정 조건(즉, 반응 온도, 시간, 반응물의 몰비, 용매, 압력 등)이 주어지는 경우, 다르게 언급되지 않는 한, 다른 공정 조건도 또한 사용될 수 있는 것을 알 것이다. 최적의 반응 조건은 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 달라질 수 있지만, 이러한 조건은 일상적인 최적화 절차에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
또한, 당업자에게 명백한 것처럼, 특정 작용기가 원치 않는 반응을 겪는 것을 방지하기 위하여 종래의 보호기가 필요할 수 있다. 특정 작용기에 대한 적합한 보호기, 및 보호 및 탈보호에 적합한 조건의 선택은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 수많은 보호기 및 그들의 도입 및 제거는 문헌[Greene et al., Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991] 및 상기 문헌에 언급된 참고문헌에 기술되어 있다.
1,4-치환된 트리아졸을 제공하기 위한 휘스겐(Huisgen) 고리부가
구리-촉매작용된 휘스겐 [3+2] 고리부가를 사용하여, 트리아졸-기반의 화합물 및 그의 조성물, 디바이스 및 물질을 제조하였다. 범주 및 전형적인 프로토콜은 많은 검토의 대상이 되어 왔다(예를 들어, 문헌[Meldal, M. and Tornoe, C. W. Chem. Rev. (2008) 108:2952-3015]; 문헌[Hein, J. E. and Fokin, V. V. Chem. Soc. Rev. (2010) 39(4):1302-1315]; 이의 둘 모두는 본원에 참조로 포함됨).
Figure pct00061
상기 나타낸 실시예에서, 아지드는 연결 요소 A를 함유하는 단편에서의 반응성 모이어티인 한편, 알킨은 펜던트 기 Z의 반응성 성분이다. 하기에 도시된 바와 같이, 이들 작용성 핸들을 교환하여, 구조적으로 관련된 트리아졸 생성물을 생성할 수 있다. 이들 대안의 제조는 유사하며, 특별한 고려사항이 필요하지 않다.
Figure pct00062
요오드화물을 사용하여 시작하는 전형적인 휘스겐 고리부가 절차는 하기에 요약되어 있다. 일부 경우에, 요오드화물을 안전성을 위하여 반응의 과정 동안 아지드로 변환시킨다.
Figure pct00063
메탄올(1.0 M, 제한 시약) 중 아지드화나트륨(1.1 eq), 아스코르브산나트륨 (0.1 eq), 트랜스-N,N'-디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.25 eq), 요오드화구리(I)의 용액을 질소의 버블링을 사용하여 탈기시키고, 아세틸렌(1 eq) 및 요오드화아릴(1.2 eq)로 처리하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 16시간 동안 55℃로 가온시켰다. 그 다음, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 깔때기를 통해 여과하고, 여과 케이크를 메탄올을 사용하여 세척하였다. 합한 여액을 농축하고, 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피(120 g 실리카, 디클로로메탄 중 0 내지 40%의 기울기(3% 수성 수산화암모늄, 22% 메탄올, 나머지 디클로로메탄))를 통해 정제하여, 원하는 표적 물질을 제공하였다.
아지드를 사용하여 시작한 전형적인 휘스겐 고리부가 절차는 하기에 약술되어 있다.
Figure pct00064
메탄올(0.4 M, 제한 시약) 중 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(0.2 eq), 트리에틸아민(0.5 eq), 요오드화구리(I)(0.06 eq)의 용액을 아세틸렌(1.0 eq)을 사용하여 처리하고, 0℃로 냉각시켰다. 반응물을 30분에 걸쳐 실온으로 가온되게 한 다음, 16시간 동안 55℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 농축하고, HPLC(C18 컬럼, 디클로로메탄 중 0 내지 100%의 기울기(3% 수성 수산화암모늄, 22% 메탄올, 나머지 디클로로메탄)를 사용하여 정제하여, 원하는 표적 물질을 제공하였다.
1,5-치환된 트리아졸을 제공하기 위한 휘스겐 고리부가
휘스겐 [3+2] 고리부가를 또한 루테늄 촉매를 사용하여 수행하여, 우선적으로 1,5-이치환된 생성물을 수득하였다(예를 들어, 각각이 그의 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Zhang et al, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 15998-15999]; 문헌[Boren et al, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 8923-8930]에 기술된 바와 같음).
Figure pct00065
이전에 기술된 바와 같이, 아지드 및 알킨기를 교환하여 하기에 도시된 바와 같이 유사한 트리아졸을 형성할 수 있다.
Figure pct00066
전형적인 절차는 하기와 같이 기술된다: 디옥산(0.8M) 중 알킨(1 eq) 및 아지드(1 eq)의 용액을 디옥산(0.16M) 중 펜타메틸사이클로-펜타디에닐비스(트리페닐포스핀) 루테늄(II) 클로라이드(0.02eq)의 용액에 적가하였다. 바이알을 질소를 사용하여 퍼지시키고, 밀봉하고, 혼합물을 12시간 동안 60℃로 가열하였다. 생성된 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여, 필요한 화합물을 제공하였다.
(4-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(3)에 대한 실험적 절차
Figure pct00067
메탄올(9 mL) 및 물(1 mL) 중 (4-아이오도페닐)메탄아민(1, 843 mg, 3.62 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(74 μL, 0.47 mmol, 0.13 eq), 아스코르브산나트륨(72 mg, 0.36 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(69 mg, 0.36 mmol, 0.1 eq), 아지드화나트륨(470 mg, 7.24 mmol, 2.0 eq) 및 1-메틸-4-(프로프-2-인-1-일)피페라진(2, 0.5 g, 3.62 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 55℃로 하룻밤 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에서 농축시키고, 갈색을 띤 슬러리를 디클로로메탄을 사용하여 추출하였다. 셀라이트를 합한 디클로로메탄 상에 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(80 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 7.5 %까지 점차 증가시켜, (4-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(3, 0.45 g, 43 %)을 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C15H22N6에 대한 계산치: 287.2; 실측치: 287.1.
N-(4-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(4)에 대한 실험적 절차
Figure pct00068
CH2Cl2(50 mL) 중 (4-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(3, 1.2 g, 4.19 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.70 mL, 5.03 mmol, 1.2 eq)의 용액을 아이스-배쓰(ice-bath)를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 메타크릴로일 클로라이드(0.43 mL, 4.40 mmol, 5 mL의 CH2Cl2 중 1.05 eq)를 첨가하였다. 반응물을 아이스-배쓰를 사용하여 냉각시키면서 하루 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(80 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 7.5 %까지 점차 증가시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 생성된 고체를 디에틸 에테르와 함께 분쇄하고, 여과하고, 디에틸 에테르를 사용하여 다수회 세척하여, N-(4-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(4, 0.41 g, 28 % 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C19H26N6O에 대한 계산치: 355.2; 실측치: 355.2.
(4-(4-((2-(2-메톡시에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(6)에 대한 실험적 절차
Figure pct00069
메탄올(40 mL) 및 물(4 mL) 중 (4-아이오도페닐)메탄아민(1, 2.95 g, 12.64 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(259 μL, 1.64 mmol, 0.13 eq), 아스코르브산나트륨(250 mg, 1.26 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(241 mg, 1.26 mmol, 0.1 eq), 아지드화나트륨(1.64 g, 25.29 mmol, 2.0 eq) 및 1-메틸-4-(프로프-2-인-1-일)피페라진(5, 2.0 g, 12.64 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 여과하고, 셀라이트(10 g)를 사용하여 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(220 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 6.25 %까지 점차 증가시켜, (4-(4-((2-(2-메톡시에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(6, 1.37 g, 35 %)을 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C15H22N4O3에 대한 계산치: 307.2; 실측치: 307.0.
N-(4-(4-((2-(2-메톡시에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(7)에 대한 실험적 절차
Figure pct00070
CH2Cl2(50 mL) 중 4-(4-((2-(2-메톡시에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(6, 1.69 g, 5.52 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.92 mL, 6.62 mmol, 1.2 eq)의 용액을 아이스-배쓰를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 메타크릴로일 클로라이드(0.57 mL, 5.79 mmol, 1.05 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(80 g) 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 1.25 %까지 점차 증가시켜, N-(4-(4-((2-(2-메톡시에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(7, 1.76 g, 85 % 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C19H26N4O4에 대한 계산치: 375.2; 실측치: 375.0.
3-(프로프-2-인-1-일옥시)옥세탄(9)에 대한 실험적 절차
Figure pct00071
THF(200 mL) 중 수소화나트륨(27.0 g, 675 mmol, 60 % 순도)의 현탁액을 아이스 배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 옥세탄-3-올(8, 25 g, 337 mmol)을 적가 방식으로 첨가하고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 3-브로모프로프1-인(9, 41.2 mL, 371 mmol, 80% 순도)을 이어서 적가 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되게 하면서 하룻밤 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고, THF를 사용하여 세척하고, 셀라이트를 사용하여 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하고, 헥산/EtOAc를 사용하여 용리하였다. 이동상 중 EtOAc의 농도를 0에서 25%까지 증가시켜, (9, 18.25 g 48 %)의 황색 오일을 제공하였다.
3-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로판-1-아민(11)에 대한 실험적 절차
Figure pct00072
메탄올(80 mL) 중 3-(프로프-2-인-1-일옥시)옥세탄(9, 7.96 g, 71 mmol, 1.0 eq), 3-아지도프로판-1-아민(10, 7.82 g, 78 mmol, 1.1 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(8.29 g, 15.6 mmol, 0.22 eq), 요오드화구리(1.35 g, 7.1 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(2.47 mL, 17.8 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 55℃로 가온시키고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트(20 g)를 첨가하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 15 %까지 점차 증가시켜, 3-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로판-1-아민(11, 11.85 g, 79 %)을 황색 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C9H16N4O2에 대한 계산치: 213.1; 실측치: 213.0.
N-(3-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)메타크릴아미드(12)에 대한 실험적 절차
Figure pct00073
CH2Cl2(100 mL) 중 3-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로판-1-아민(11, 3.94 g, 18.56 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.1 mL, 22.28 mmol, 1.2 eq)의 용액을 아이스-배쓰를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 메타크릴로일 클로라이드(1.99 mL, 20.42 mmol, 1.1 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하면서 하룻밤 교반하였다. 20 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/메탄올을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(220 g)에 의해 정제하였다. 메탄올의 농도를 0 %에서 5 %까지 점차 증가시켜, N-(3-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)메타크릴아미드(12, 3.22 g, 62 % 수율)를 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C13H20N4O3 에 대한 계산치: 281.2; 실측치: 281.0.
N-(4-(1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질) 메타크릴아미드(14)에 대한 실험적 절차
Figure pct00074
CH2Cl2(100 mL) 중 (4-(1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(13, 우시(WuXi)로부터 수득, 1.2 g, 5.70 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(15 mL, 107.55 mmol, 18.9 eq)의 용액에 메타크릴로일 클로라이드(893 mg, 8.54 mmol, 1.5 eq)를 적가 방식으로 천천히 첨가하였다. 반응물을 하룻밤 교반하였다. 20 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 1.25 %까지 점차 증가시켜, N-(4-(1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질) 메타크릴아미드(14, 1.38 g, 40 % 수율)를 제공하였다.
(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(15)에 대한 실험적 절차
Figure pct00075
메탄올(50 mL) 및 물(12 mL) 중 (4-아이오도페닐)메탄아민 하이드로클로라이드(5.0 g, 18.55 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.59 mL 3.71 mmol, 0.2 eq), 아스코르브산나트륨(368 mg, 1.86 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(530 mg, 2.78 mmol, 0.15 eq), 아지드화나트륨(2.41 g, 37.1 mmol, 2.0 eq) , Et3N(3.11 mL, 22.26 mmol, 1.2 eq) 및 2-(프로프-2-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란(2.6 g, 18.55 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 413 여과지를 통해 여과하였다. 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(120 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 6.25 %까지 점차 증가시켜, (4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(15, 3.54 g, 66%)을 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C15H20N4O2에 대한 계산치: 289.2; 실측치: 289.2.
N-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(16)에 대한 실험적 절차
Figure pct00076
CH2Cl2(40 mL) 중 (4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(15, 3.46 g, 12.00 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(2.01 mL, 14.40 mmol, 1.2 eq)의 용액을 아이스-배쓰를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 메타크릴로일 클로라이드(1.23 mL, 12.60 mmol, 1.05 eq, 5 mL의 CH2Cl2 중에 희석)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 20 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(80 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 3.75 %까지 점차 증가시켜, N-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(16, 2.74 g, 64 % 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C19H24N4O3에 대한 계산치: 357.2; 실측치: 357.3.
N-(4-(4-(하이드록시메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(17)에 대한 실험적 절차
Figure pct00077
N-(4-(4-(하이드록시메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드( 16 , 1.2 g, 3.37 mmol, 1.0 eq)의 용액을 실온에서 하룻밤 메탄올(6 mL) 및 HCl(1N, 수성, 9 mL) 중에 용해시켰다. 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄 / (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(24 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 12.5 %까지 점차 증가시켜, N-(4-(4-(하이드록시메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드( 17 , 0.85 g, 92 % 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H] + C 14 H 16 N 4 O 2 에 대한 계산치: 273.1; 실측치: 273.1.
(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)벤질)카바메이트(19)에 대한 실험적 절차
Figure pct00078
디클로로메탄(100 mL) 중 벤질 (4-(하이드록시메틸)벤질)카바메이트(2.71 g, 10 mmol, 1 eq), 3,4-디하이드로-2H-피란(1.81 mL, 20 mmol, 2 eq), p-톨루엔술폰산 일수화물(285 mg, 1.5 mmol, 0.15 eq)을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 미정제 생성물을 100 % 헥산에서 시작하고 EtOAc의 농도를 100 %로 점차 증가시켜 용리제로서 헥산/EtOAc를 사용하여, 실리카 겔(24 g) 상에서 정제하여, 벤질 (4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)벤질)-카바메이트(19, 2.4 g, 68%)를 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + Na]+ C21H25NO4에 대한 계산치: 378.17 실측치: 378.17.
(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-페닐)메탄아민(20)에 대한 실험적 절차
Figure pct00079
EtOH 중 (4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)벤질)카바메이트(19, 1.5 g, 4.2 mmol, 1 eq), 탄소상 팔라듐(160 mg, 10 wt.%)을 잠시 배기시킨 다음, 수소를 풍선을 통해 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(12 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 25 %까지 점차 증가시켜, (4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)페닐)메탄아민(20, 890 mg, 95%)을 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C13H19NO2에 대한 계산치: 222.15 실측치: 222.14.
N-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)벤질)-메타크릴아미드(21)에 대한 실험적 절차
Figure pct00080
CH2Cl2(10 mL) 중 (4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)페닐)메탄아민(20, 0.5 g, 2.26 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.47 mL, 3.39 mmol, 1.5 eq)의 용액을 잠시 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.33 mL, 3.39 mmol, 1.5 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 100 % 헥산에서 시작하고 EtOAc의 농도를 100 %로 점차 증가시켜 용리제로서 헥산/EtOAc를 사용하여, 실리카 겔 크로마토그래피(12 g)에 의해 정제하여, N-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)벤질)메타크릴아미드(21, 0.47 g, 72 % 수율)를 무색의 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + Na]+ C17H23NO3에 대한 계산치: 312.16; 실측치: 312.17.
(4-(4-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(22)의 실험적 절차
Figure pct00081
메탄올(20 mL) 및 물(5 mL) 중 (4-아이오도페닐)메탄아민(5.0 g, 21.45 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.44 mL 2.79 mmol, 0.13 eq), 아스코르브산나트륨(425 mg, 2.15 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(409 mg, 2.15 mmol, 0.1 eq), 아지드화나트륨(2.79 g, 42.91 mmol, 2.0 eq) 및 2-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란(3.36 mL, 21.45 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 413 여과지를 통해 여과하였다. 셀라이트(10 g)를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 5 %까지 점차 증가시켜, (4-(4-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(22, 3.15 g, 49%)을 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C16H22N4O2에 대한 계산치: 303.18; 실측치: 303.18.
N-(4-(4-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸) -1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(23)에 대한 실험적 절차
Figure pct00082
CH2Cl2(55 mL) 중 (4-(4-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(22, 3.10 g, 10.25 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(1.71 mL, 12.30 mmol, 1.2 eq)의 용액을 아이스-배쓰를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 메타크릴로일 클로라이드(1.05 mL, 12.30 mmol, 1.2 eq, 5 mL의 CH2Cl2 중에 희석)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 8 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(80 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 2.5 %까지 점차 증가시켜, N-(4-(4-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸) -1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(23, 2.06 g, 54 % 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C20H26N4O3에 대한 계산치: 371.2078; 실측치: 371.2085.
(4-(1-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)페닐)메탄아민(24)의 실험적 절차
Figure pct00083
메탄올(24 mL) 및 물(6 mL) 중 (4-에티닐페닐)메탄아민(2.36 g, 18.00 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.56 mL, 3.60 mmol, 0.2 eq), 아스코르브산나트륨(357 mg, 1.80 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(514 mg, 2.70 mmol, 0.15 eq) 및 2-(2-아지도에톡시)테트라하이드로-2H-피란(3.08, 18.00 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 상에서 여과하고, MeOH(3 x 50 mL)를 사용하여 헹구었다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 중에 재용해시키고, 셀라이트(20 g)를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(120 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 25 %까지 점차 증가시켜, (4-(1-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)페닐)메탄아민(24, 3.51 g, 64%)을 황색을 띤 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C16H22N4O2에 대한 계산치: 303.1816; 실측치: 303.1814.
N-(4-(1-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸) -1H-1,2,3-트리아졸-4-일)벤질)메타크릴아미드(25)에 대한 실험적 절차
Figure pct00084
CH2Cl2(30 mL) 중 (4-(1-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)페닐)메탄아민(24, 1.5 g, 4.96 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(1.04 mL, 7.44 mmol, 1.5 eq)의 용액을 잠시 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.72 mL, 7.44 mmol, 1.5 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 100 % 헥산에서 시작하고 EtOAc의 농도를 100 %로 점차 증가시켜 용리제로서 헥산/EtOAc를 사용하여, 실리카 겔 크로마토그래피(40 g)에 의해 정제하여, N-(4-(1-(2-((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸) -1H-1,2,3-트리아졸-4-일)벤질)메타크릴아미드(25, 0.9 g, 49% 수율)를 무색의 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + Na]+ C20H26N4O3에 대한 계산치: 371.2078; 실측치: 371.2076.
1-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)에탄-1-아민(26)에 대한 실험적 절차
Figure pct00085
메탄올(9 mL) 및 물(1 mL) 중 1-(4-아이오도페닐)에탄-1-아민 하이드로클로라이드(1.0 g, 4.05 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.08 mL 0.53 mmol, 0.13 eq), 아스코르브산나트륨(80 mg, 0.40 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(77 mg, 0.40 mmol, 0.1 eq), 아지드화나트륨(526 g, 8.09 mmol, 2.0 eq) 및 2-(프로프-2-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란(0.57 g, 4.05 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 중에 재용해시키고, 셀라이트의 플러그(plug) 상에서 여과하였다. 셀라이트를 여액에 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(40 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 5 %까지 점차 증가시켜, 1-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)에탄-1-아민(26, 0.62 g, 51%)을 황색을 띠는 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C16H22N4O2에 대한 계산치: 303.2; 실측치: 303.2.
N-(1-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시) 메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)에틸)메타크릴아미드(27)에 대한 실험적 절차
Figure pct00086
CH2Cl2(11 mL) 중 1-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)에탄-1-아민(26, 0.52 g, 1.7 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.29 mL, 2.1 mmol, 1.2 eq)의 용액을 아이스-배쓰를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 메타크릴로일 클로라이드(0.18 mL, 1.8 mmol, 1.05 eq, 11 mL의 CH2Cl2 중에 희석됨)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 오(5) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(40 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 2.5 %까지 점차 증가시켜, N-(1-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시) 메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)에틸)메타크릴아미드(27, 0.49 g, 76 % 수율)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C20H26N4O3에 대한 계산치: 371.2078; 실측치: 371.2087.
(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(트리플루오로메틸)페닐)메탄아민(28)에 대한 실험적 절차
Figure pct00087
메탄올(24 mL) 및 물(6 mL) 중 (4-아이오도-2-(트리플루오로메틸)페닐)메탄아민(3.0 g, 9.97 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2- 디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.31 mL 1.99 mmol, 0.2 eq), 아스코르브산나트륨(197 mg, 1.00 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(285 mg, 1.49 mmol, 0.15 eq), 아지드화나트륨(1.30 g, 19.93 mmol, 2.0 eq) , Et3N(1.67 mL, 11.96 mmol, 1.2 eq) 및 2-(프로프-2-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란(1.40 g, 9.97 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트의 플러그를 통해 여과하고, 메탄올(3 x 50 mL)을 사용하여 헹구었다. 셀라이트를 여액에 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄 / (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(120 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 25 %까지 점차 증가시켜, (4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(트리플루오로메틸)페닐)메탄아민(28, 2.53 g, 71%)을 녹색 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C16H19N4O2F3에 대한 계산치: 357.2; 실측치: 357.1.
N-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2(트리플루오로메틸)벤질) 메타크릴아미드(29)에 대한 실험적 절차
Figure pct00088
CH2Cl2(25 mL) 중 (4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(트리플루오로메틸)페닐) 메탄아민(28, 1.0 g, 2.81 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.59 mL, 4.21 mmol, 1.5 eq)의 용액을 잠시 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.41 mL, 4.21 mmol, 1.5 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 100 % 헥산에서 시작하고 EtOAc의 농도를 100 %로 점차 증가시켜 용리제로서 헥산/EtOAc를 사용하여, 실리카 겔 크로마토그래피(40 g)에 의해 정제하여, N-(4-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2(트리플루오로메틸)벤질) 메타크릴아미드(29, 0.65 g, 55% 수율)를 무색의 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C20H23N4O3F3에 대한 계산치: 425.2; 실측치: 425.1.
3-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로판-1-아민(30)에 대한 실험적 절차
Figure pct00089
메탄올(50 mL) 및 물(6 mL) 중 3-아지도프로판-1-아민 하이드로클로라이드(1.5 g, 14.98 mmol, 1.0 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(1.99 g, 3.75 mmol, 0.25 eq), 요오드화구리(0.29 g, 1.50 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(0.52 mL, 3.75 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 0℃로 냉각시켰다. 2-(프로프-2-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란(2.10 g, 14.98 mmol, 1.0 eq)을 첨가하고, 반응 혼합물을 55℃로 가온시키고, 하룻밤 질소 분위기 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트의 플러그 상에서 여과하고, 메탄올(3 x 50 mL)을 사용하여 헹구었다. 셀라이트(20 g)를 여액에 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(120 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 20 %까지 점차 증가시켜, 3-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로판-1-아민(30, 2.36 g, 66%)을 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C11H20N4O2에 대한 계산치: 241.2; 실측치: 241.2.
N-(3-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸) -1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)메타크릴아미드(31)에 대한 실험적 절차
Figure pct00090
CH2Cl2(20 mL) 중 3-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로판-1-아민(30, 1.0 g, 4.16 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.58 mL, 4.16 mmol, 1.0 eq)의 용액을 잠시 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.40 mL, 4.16 mmol, 1.0 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(40 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 20 %까지 점차 증가시켜, N-(3-(4-(((테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸) -1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)메타크릴아미드(31, 0.96 g, 75% 수율)를 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C15H24N4O3에 대한 계산치: 309.2; 실측치: 309.4.
(4-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(32)에 대한 실험적 절차
Figure pct00091
메탄올(24 mL) 및 물(6 mL) 중 (4-아이오도페닐)메탄아민 하이드로클로라이드(2.64 g, 9.80 mmol, 1.0 eq), (1S,2S)-N1,N2-디메틸사이클로헥산-1,2-디아민(0.31 mL 1.96 mmol, 0.2 eq), 아스코르브산나트륨(198 mg, 0.98 mmol, 0.1 eq), 요오드화구리(279 mg, 1.47 mmol, 0.15 eq), 아지드화나트륨(1.27 g, 19.59 mmol, 2.0 eq) , Et3N(1.64 mL, 11.75 mmol, 1.2 eq) 및 3-(프로프-2-인-1-일옥시)옥세탄(9, 1.10 g, 9.80 mmol, 1.0 eq)의 혼합물을 5분 동안 질소를 사용하여 퍼지시키고, 하룻밤 55℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트의 플러그를 통해 여과하고, 메탄올(3 x 50 mL)을 사용하여 헹구었다. 셀라이트를 여액에 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(120 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 25 %까지 점차 증가시켜, (4-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(32, 1.43 g, 56%)을 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C13H16N4O2에 대한 계산치: 261.1346; 실측치: 261.1342.
N-(4-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(33)에 대한 실험적 절차
Figure pct00092
CH2Cl2(20 mL) 중 (4-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)메탄아민(32, 0.58 g, 2.23 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.47 mL, 3.34 mmol, 1.5 eq)의 용액을 잠시 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.32 mL, 3.34 mmol, 1.5 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 100 % 헥산에서 시작하고 EtOAc의 농도를 100 %로 점차 증가시켜 용리제로서 헥산/EtOAc를 사용하여, 실리카 겔 크로마토그래피(24 g)에 의해 정제하여, N-(4-(4-((옥세탄-3-일옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)벤질)메타크릴아미드(33, 0.48 g, 66% 수율)를 무색의 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C17H20N4O3에 대한 계산치: 329.1608; 실측치: 329.1611.
에틸 1-(2-메타크릴아미도에틸)-1H-이미다졸-4-카르복실레이트(35)에 대한 실험적 절차
Figure pct00093
CH2Cl2(20 mL) 중 에틸 1-(2-아미노에틸)-1H-이미다졸-4-카르복실레이트(34, 2.0 g, 10.91 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.80 mL, 27.29 mmol, 2.5 eq)의 용액을 잠시 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(1.60 mL, 16.37 mmol, 1.5 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 십오(15) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(40 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 25 %까지 점차 증가시켜, 에틸 1-(2-메타크릴아미도에틸)-1H-이미다졸-4-카르복실레이트(35, 1.28 g, 47% 수율)를 무색의 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C12H17N3O3에 대한 계산치: 252.1; 실측치: 252.1.
N-(4-(1,1-디옥시도티오모르폴리노)벤질) 메타크릴아미드(37)에 대한 실험적 절차
Figure pct00094
CH2Cl2(80 mL) 중 4-(4-(아미노메틸)페닐)티오모르폴린 1,1-디옥시드 하이드로클로라이드(36, 1.15 g, 4.15 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(1.39 mL, 9.97 mmol, 2.4 eq)의 용액에 메타크릴로일 클로라이드(0.43 mL, 4.36 mmol, 1.05 eq, CH2Cl2 중, 5 mL)의 용액을 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 22시간 동안 교반하였다. 팔(8) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(80 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 3.75 %까지 점차 증가시켜, N-(4-(1,1-디옥시도티오모르폴리노)벤질) 메타크릴아미드(37, 0.32 g, 25% 수율)를 고체로서 제공하였다.
N-메틸-N-(2-(메틸술포닐)에틸)프로프-2-인-1-아민(38)에 대한 실험적 절차
Figure pct00095
1-메틸술포닐에틸렌(4.99 g, 47.03 mmol, 4.13 mL) 및 암베리스트(Amberlyst)-15((30w/w%))의 혼합물에, N-메틸프로프-2-인-1-아민(2.6 g, 37.62 mmol)을 적가 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과에 의해 제거하고, 여액을 감압 하에서 농축시켜, N-메틸-N-(2-(메틸술포닐)에틸)프로프-2-인-1-아민(38, 6.43 g, 98%)을 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C7H13NSO2에 대한 계산치: 176.11; 실측치: 176.1.
N-((1-(2-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시) 에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)-N-메틸-2-(메틸술포닐)에탄-1-아민(40)에 대한 실험적 절차
Figure pct00096
메탄올(50 mL) 및 물(6 mL) 중 N-메틸-N-(2-(메틸술포닐)에틸)프로프-2-인-1-아민(38, 5.02 g, 28.64 mmol, 1.25 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(3.04 g, 5.73 mmol, 0.25 eq), 요오드화구리(436 mg, 2.29 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(0.8 mL, 5.7 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 배기시키고, 질소를 사용하여 플러싱시키고(3회), 아이스 배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에탄-1-아민(39, 5.02 g, 22.91 mmol, 1.0 eq)을 적가 방식으로 첨가하고, 냉각 배쓰를 제거하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 반응물을 55℃로 가온시키고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트(20 g)를 첨가하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 25 %까지 점차 증가시켜,
N-((1-(2-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)-N-메틸-2-(메틸술포닐)에탄-1-아민( 40 , 4.98 g, 55 %)을 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H] + C 15 H 31 N 5 O 5 S에 대한 계산치: 394.2; 실측치: 394.2.
N-(2-(2-(2-(2-(4-((메틸(2-(메틸술포닐)에틸) 아미노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시) 에틸)메타크릴아미드(41)의 실험적 절차
Figure pct00097
CH2Cl2(15 mL) 중 N-((1-(2-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)-N-메틸-2-(메틸술포닐)에탄-1-아민(40, 1.0 g, 2.54 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.43 mL, 3.05 mmol, 1.2 eq)의 용액에 메타크릴로일 클로라이드(0.30 mL, 3.05 mmol, 1.5 eq)의 용액을 적가 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(40 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 12.5 %까지 점차 증가시켜, N-(2-(2-(2-(2-(4-((메틸(2-(메틸술포닐)에틸) 아미노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시) 에틸)메타크릴아미드(41, 0.86 g, 73% 수율)를 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C19H35N5O6S에 대한 계산치: 462.2; 실측치: 462.2.
7-(프로프-2-인-1-일)-2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난(42)에 대한 실험적 절차
Figure pct00098
3-브로모프로프-1-인(4.4 mL, 39.32 mmol 1.0 eq)을 메탄올(200 mL) 중 2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난(8.54 g, 39.32 mmol, 1.0 eq), 탄산칼륨(17.9 g, 129.7 mmol, 3.3 eq)의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/메탄올을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(220 g)에 의해 정제하였다. 메탄올의 농도를 0 %에서 5 %까지 점차 증가시켜, 7-(프로프-2-인-1-일)-2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난(42, 4.44 g, 68%)을 오일로서 제공하였다.
2-(2-(2-(2-(4-((2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난-7-일) 메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에탄-1-아민(43)에 대한 실험적 절차
Figure pct00099
메탄올(50 mL) 중 7-(프로프-2-인-1-일)-2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난(42, 2.5 g, 15.13 mmol, 1.0 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(1.77 g, 3.33 mmol, 0.22 eq), 요오드화구리(288 mg, 1.51 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(0.53 mL, 3.8 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 아이스 배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에탄-1-아민(39, 3.86 g, 17.70 mmol, 1.17 eq)을 적가 방식으로 첨가하고, 냉각 배쓰를 제거하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 반응물을 55℃로 가온시키고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트(10 g)를 첨가하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 10 %까지 점차 증가시켜, 2-(2-(2-(2-(4-((2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난-7-일) 메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에탄-1-아민(43, 4.76 g, 82 %)을 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C18H33N5O4에 대한 계산치: 384.3; 실측치: 384.2.
N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)메타크릴아미드(44)에 대한 실험적 절차
Figure pct00100
CH2Cl2(100 mL) 중 2-(2-(2-(2-(4-((2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난-7-일) 메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에탄-1-아민(43, 2.65 g, 6.91 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(1.16 mL, 8.29 mmol, 1.2 eq)의 용액을 질소 분위기 하에서 아이스-배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.74 mL, 7.6 mmol, 1.1 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/메탄올을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(120 g)에 의해 정제하였다. 메탄올의 농도를 0 %에서 10 %까지 점차 증가시켜, N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-옥사-7-아자스피로[3.5]노난-7-일)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)메타크릴아미드(44, 1.50 g, 48% 수율)를 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C22H37N5O5에 대한 계산치: 452.29; 실측치: 452.25.
4-((1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(45)에 대한 실험적 절차
Figure pct00101
메탄올(20 mL) 중 4-(프로프-2-인-1-일)티오모르폴린 1,1-디옥시드(1.14 g, 6.58 mmol, 1.0 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(768 mg, 1.45 mmol, 0.22 eq), 요오드화구리(125 mg, 0.66 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(0.23 mL, 1.65 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 아이스 배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 2-(2-아지도에톡시)에탄-1-아민(1.00 g, 7.70 mmol, 1.17 eq)을 적가 방식으로 첨가하고, 냉각 배쓰를 제거하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 반응물을 55℃로 가온시키고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트(10 g)를 첨가하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(40 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 9.5 %까지 점차 증가시켜, 4-((1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(45, 1.86 g, 93 %)를 백색 고체로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C11H21N5O4S에 대한 계산치: 304.1438; 실측치: 304.1445.
N-(2-(2-(4-((1,1-디옥시도티오모르폴리노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에틸)메타크릴아미드(46)에 대한 실험적 절차
Figure pct00102
CH2Cl2(100 mL) 중 4-((1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(45, 1.32 g, 4.35 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.73 mL, 5.22 mmol, 1.2 eq)의 용액을 질소 분위기 하에서 아이스-배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.47 mL, 4.8 mmol, 1.1 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(120 g)에 의해 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 1.25 %까지 점차 증가시켜, N-(2-(2-(4-((1,1-디옥시도티오모르폴리노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에틸)-메타크릴아미드(46, 0.90 g, 56% 수율)를 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C15H25N5O4S에 대한 계산치: 372.17; 실측치: 372.15.
4-((1-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(47)에 대한 실험적 절차
Figure pct00103
메탄올(80 mL) 중 4-(프로프-2-인-1-일)티오모르폴린 1,1-디옥시드(4.6 g, 26.55 mmol, 1.0 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(3.1 g, 5.84 mmol, 0.22 eq), 요오드화구리(506 mg, 2.66 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(0.93 mL, 6.64 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 아이스 배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에탄-1-아민(5.00 g, 28.68 mmol, 1.08 eq)을 적가 방식으로 첨가하고, 냉각 배쓰를 제거하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 반응물을 55℃로 가온시키고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 첨가하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 10 %까지 점차 증가시켜, 4-((1-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(47, 5.26 g, 57 %)를 황색을 띤 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C13H25N5O4S에 대한 계산치: 348.1700; 실측치: 348.1700.
N-(2-(2-(2-(4-((1,1-디옥시도티오모르폴리노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에틸)메타크릴아미드(48)의 실험적 절차
Figure pct00104
CH2Cl2(50 mL) 중 4-((1-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(47, 1.49 g, 4.29 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.72 mL, 5.15 mmol, 1.2 eq)의 용액을 질소 분위기 하에서 아이스-배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.46 mL, 4.7 mmol, 1.1 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/메탄올을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(80 g)에 의해 정제하였다. 메탄올의 농도를 0 %에서 5 %까지 점차 증가시켜, N-(2-(2-(2-(4-((1,1-디옥시도티오모르폴리노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에틸)-메타크릴아미드(48, 0.67 g, 38% 수율)를 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C17H29N5O5S에 대한 계산치: 416.20; 실측치: 416.20.
4-((1-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(49)에 대한 실험적 절차
Figure pct00105
메탄올(90 mL) 중 4-(프로프-2-인-1-일)티오모르폴린 1,1-디옥시드(5.0 g, 28.86 mmol, 1.0 eq), 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]-아민(3.37 g, 6.35 mmol, 0.22 eq), 요오드화구리(550 mg, 2.89 mmol, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(1.01 mL, 7.22 mmol, 0.25 eq)의 혼합물을 아이스 배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-아민(8.86 g, 33.77 mmol, 1.17 eq)을 적가 방식으로 첨가하고, 냉각 배쓰를 제거하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 반응물을 55℃로 가온시키고, 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트(15 g)를 첨가하고, 감압 하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 이동상으로서 디클로로메탄/(12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)을 사용하여 실리카 겔(220 g) 상에서 정제하였다. (12 %(v/v) 수성 수산화암모늄을 함유하는 메탄올)의 농도를 0 %에서 10 %까지 점차 증가시켜, 4-((1-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(49, 7.56 g, 60 %)를 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C17H33N5O6S에 대한 계산치: 436.2224; 실측치: 436.2228.
N-(14-(4-((1,1-디옥시도티오모르폴리노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)메타크릴아미드(50)의 실험적 절차
Figure pct00106
CH2Cl2(50 mL) 중 4-((1-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)티오모르폴린 1,1-디옥시드(49, 1.95 g, 4.79 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(0.80 mL, 5.74 mmol, 1.2 eq)의 용액을 질소 분위기 하에서 아이스-배쓰를 사용하여 냉각시켰다. 메타크릴로일 클로라이드(0.51 mL, 5.26 mmol, 1.1 eq)를 적가 방식으로 첨가하였다. 냉각 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 십(10) 그램의 셀라이트를 첨가하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 이동상으로서 디클로로메탄/메탄올을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피(80 g)에 의해 정제하였다. 메탄올의 농도를 0 %에서 5 %까지 점차 증가시켜, N-(14-(4-((1,1-디옥시도티오모르폴리노)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)메타크릴아미드(50, 0.76 g, 32% 수율)를 무색의 오일로서 제공하였다. LCMS m/z: [M + H]+ C21H37N5O7S에 대한 계산치: 504.25; 실측치: 504.20.
실시예 4A: 예시적인 변형된 중합체의 제조
1A. 화학적으로 변형된 중합체. 중합체 물질을 본원에 기재된 디바이스(예를 들어, 하이드로겔 캡슐)의 형성 이전에, 화학식 I의 화합물(또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염)로 화학적으로 변형시킬 수 있다. 중합체 물질의 변형을 위한 예시적인 화합물의 합성 프로토콜은 상기 실시예 3에 요약되어 있다. 이들 화합물 또는 기타 화합물을 사용하여, 임의의 중합체 물질을 화학적으로 변형시킬 수 있다.
예를 들어, 알긴산염의 경우에, 알긴산염 카복실산을 하나 이상의 아민-작용화된 화합물로의 커플링을 위하여 활성화시켜, 비섬유성 화합물, 예를 들어, 화학식 I의 화합물로 변형된 알긴산염을 달성한다. 알긴산염 중합체를 수 중에 용해시키고(30 mL/g(중합체)), 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(0.5 당량) 및 N-메틸모르폴린(1 당량)으로 처리한다. 이 혼합물에 아세토니트릴(0.3M) 중 관심 화합물(예를 들어, 표 3에 나타낸 화합물 101)의 용액을 첨가한다.
첨가되는 화합물 및 커플링 시약의 양은 알긴산염에 결합된 화합물의 요망되는 농도, 예를 들어, 컨쥬게이션 밀도에 따라 달라진다. 화합물 101의 중등의 컨쥬게이션 밀도는 전형적으로 2% 내지 5% N의 범위인 한편, 화합물 101의 높은 컨쥬게이션 밀도는 전형적으로 5.1% 내지 8% N의 범위이다. CM-LMW-Alg-101-Medium 중합체 용액을 제조하기 위하여, 용해된 미변형된 저 분자량 알긴산염(75 kDa 미만의 분자량 근사치, 1.5 이상의 G:M 비)을 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(5.1 mmol/g(알긴산염)) 및 N-메틸모르폴린(10.2 mmol/g(알긴산염)) 및 화합물 101(5.4 mmol/g(알긴산염))로 처리한다. CM-LMW-Alg-101-High 중합체 용액을 제조하기 위하여, 용해된 미변형된 저 분자량 알긴산염(75 kDa 미만의 분자량 근사치, 1.5 이상의 G:M 비)을 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(5.1 mmol/g(알긴산염)) 및 N-메틸모르폴린(10.2 mmol/g(알긴산염)) 및 화합물 101(10.5 mmol/g(알긴산염))로 처리한다.
반응물을 16시간 동안 55℃까지 가온시킨 다음, 실온까지 냉각하고, 회전식 증발을 통해 부드럽게 농축시킨 다음, 잔류물을 수 중에 용해시킨다. 혼합물을 시아노-변형된 실리카 겔(실리사이클)의 층을 통해 여과하고, 여과 케이크를 물로 세척한다. 그 다음, 생성된 용액을 광범위하게 투석하고(10,000 MWCO 멤브레인), 알긴산염 용액을 동결건조를 통해 농축시켜 요망되는 화학적으로 변형된 알긴산염을 고체로서 제공하거나, 25 cP 내지 35 cP의 점도를 갖는 화학적으로 변형된 알긴산염 용액을 생산하기에 적합한 임의의 기법을 사용하여 농축시킨다.
화학적으로 변형된 알긴산염의 컨쥬게이션 밀도를 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 측정한다. 화학적으로 변형된 알긴산염의 용액을 24시간 동안 물에 대하여 투석하고(10,000 MWCO 멤브레인), 물을 2회 교체한 후, 불변 중량으로 동결건조시킴으로써 시료를 제조한다.
하기 실시예에 기재된 하이드로겔 캡슐을 생성하는 데 사용하기 위하여, 화학적으로 변형된 알긴산염 중합체를 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 결정되는 바와 같이 중등(2% 내지 5% N) 또는 고(5.1% 내지 8% N) 밀도로 저 분자량 알긴산염(75 kDa 미만의 분자량 근사치, 1.5 이상의 G:M 비)에 컨쥬게이트된 화합물 101(표 3에 나타냄)을 사용하여 제조하였으며, 이는 본원에 CM-LMW-Alg-101-Medium 및 CM-LMW-Alg-101-High로서 지칭된다.
1B. CBP-알긴산염 . 중합체 물질을 관련 기술 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 본원에 기재된 디바이스(예를 들어, 본원에 기재된 하이드로겔 캡슐)의 형성 이전에 세포-결합 펩티드로 공유적으로 변형시킬 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Jeon O, et al., Tissue Eng Part A. 16:2915-2925 (2010)] 및 문헌[Rowley, J.A. et al., Biomaterials 20:45-53 (1999)]을 참조한다.
예를 들어, 알긴산염의 경우에, 알긴산염 용액(1%, w/v)을 pH 6.5의 0.5M NaCl을 함유하는 50 mM의 2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산 수화물 완충 용액을 사용하여 제조하고, 순차적으로 N-하이드록시숙신이미드 및 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카보디이미드(EDC)와 혼합한다. N-하이드록시숙신이미드 대 EDC의 몰 비는 0.5:1.0이다. 관심 펩티드를 알긴산염 용액에 첨가한다. 첨가되는 펩티드 및 커플링 시약의 양은 알긴산염에 결합되는 펩티드의 요망되는 농도, 예를 들어, 펩티드 컨쥬게이션 밀도에 좌우된다. 펩티드 및 커플링 시약의 양을 증가시킴으로써, 더 높은 컨쥬게이션 밀도를 수득할 수 있다. 24시간 동안 반응시킨 후에, 반응물을 3일 동안 탈이온 초순수(diH2O)에 대한 투석(MWCO 3500)에 의해 정제하고, 30분 동안 활성탄으로 처리하고, 여과하고(0.22 mm 필터), 원하는 점도로 농축시킨다.
펩티드-변형된 알긴산염의 컨쥬게이션 밀도를 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 측정한다. 화학적으로 변형된 알긴산염의 용액을 24시간 동안 물에 대하여 투석하고(10,000 MWCO 멤브레인), 물을 2회 교체한 후, 불변 중량으로 동결건조시킴으로써 시료를 제조한다.
또 다른 구현예에서, 펩티드-변형된 알긴산염의 컨쥬게이션 밀도를 실시예 7 및 선택적으로 실시예 8에 기재된 바와 같이 정량적 펩티드-컨쥬게이션 검정을 사용하여 측정한다.
실시예 4B: 하이드로겔 캡슐을 제조하기 위한 예시적인 알긴산염 용액의 제조
화학적으로 변형 및 미변형된 알긴산염의 70:30 혼합물 . 저 분자량 알긴산염(프로노바(PRONOVA)™ VLVG 알긴산염, 노바매트릭스(NovaMatrix), 노르웨이 산드비카 소재, 카탈로그 번호 4200506, 분자량 근사치 < 75 kDa; G:M 비 ≥ 1.5)을 표 3의 화합물 101을 사용하여 화학적으로 변형시켜, 질소 백분율에 대한 연소 분석에 의해 결정되는 바와 같이 25 cp 내지 35 cP의 점도 및 5.1% 내지 8% N의 컨쥬게이션 밀도를 갖는 화학적으로 변형된 저 분자량 알긴산염(CM-LMW-Alg-101) 용액을 생성하였다. 미변형된 알긴산염(PRONOVA TM SLG100, 노바매트릭스, 노르웨이 산드비카 소재, 카탈로그 #4202106, 150 kDa 내지 250 kDa의 분자량 근사치)을 0.9% 염수 중에 3% 중량 대 부피로 용해시킴으로써 고 분자량 미변형된 알긴산염(U-HMW-Alg)의 용액을 제조하였다. CM-LMW-Alg 용액을 U-HMW-Alg 용액과 70% CM-LMW-Alg 대 30% U-HMW-Alg의 부피 비로 배합하였다(본원에 70:30 CM-Alg:UM-Alg 용액으로서 지칭됨).
미변형된 알긴산염 용액 . 미변형된 중등 분자량 알긴산염(SLG20, 노바매트릭스, 노르웨이 산드비카 소재, 카탈로그 #4202006, 75 내지 150 kDa의 분자량 근사치)을 0.9% 염수 중에 1.4% 중량 대 부피로 용해시켜, U-MMW-Alg 용액을 제조하였다.
세포 결합 부위를 포함하는 알긴산염 용액 : SLG20 알긴산염의 용액을 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)로 이루어진 펩티드를 사용하여 변형시키고, 상기 실시예 4A에 기술된 바와 같이 약 100cP의 점도로 농축시켰다. 일 구현예에서, 사용되는 GRGDSP 펩티드(SEQ ID NO: 44) 및 커플링 시약의 양을 상기 실시예 4A에 기술된 바와 같은 연소 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 약 0.2 내지 0.3의 표적 펩티드 컨쥬게이션 밀도를 달성하도록 선택하였다. 또 다른 구현예에서, 사용되는 중등 분자량 알긴산염(75 내지 150 kDa의 분자량 근사치, 1.5 이상의 G:M 비), GRGDSP 펩티드 및 커플링 시약의 양을 80 내지 120 cP의 점도를 갖는 염수 중 GRGDSP-MMW-Alg(SEQ ID NO: 44로 개시된 "GRGDSP") 그램당 0.3 내지 0.6 마이크로몰의 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)의 표적 펩티드 컨쥬게이션 밀도를 갖는 GRGDSP-MMW-Alg 용액(SEQ ID NO: 44로 개시된 "GRGDSP")을 제조하도록 선택한다.
실시예 5: 2-구획 하이드로겔 캡슐의 형성
조작된 ARPE-19 세포(즉, GLA 4-2 세포)의 현탁액을 하기 기술된 프로토콜에 따라 2-구획 하이드로겔 캡슐 내에 단일의 세포로서 캡슐화시켰다.
캡슐화 직전에, 조작된 ARPE-19 세포를 1,400 r.p.m.에서 1분 동안 원심분리하고, 무칼슘 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit)(KH) 완충액(4.7 mM KCl, 25 mM HEPES, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4 × 7H2O, 135 mM NaCl, pH7.4, 290 mOsm)으로 세척하였다. 세척 후에, 세포를 다시 원심분리하고, 상청액 전부를 흡인시켰다. 그 다음, 세포 펠렛을 알긴산염 용액 ml당 약 1억개의 현탁화된 단일의 세포의 밀도로 실시예 4B에 기술된 GRGDSP-변형된 알긴산염 용액 중에 재현탁화시켰다.
하이드로겔 캡슐의 제조 이전에, 완충액 및 알긴산염 용액을 무균 과정을 사용하여 0.2-㎛ 필터를 통한 여과에 의해 멸균시켰다.
약 1.5 ㎜ 직경의 2-구획 하이드로겔 밀리캡슐로서 구성된 입자를 제조하기 위하여, 정전식 액적 발생기를 하기와 같이 설정하였다: ES 시리즈 0-100-kV, 20-와트 고-전력 발생기(EQ 시리즈, 마츄사다(Matsusada), 미국 노스캐롤라이나주 소재)를 동축 니들(22G의 내강, 18G의 외강, 람-아트 인스트루먼트 컴퍼니(Rame-art Instrument Co.), 미국 뉴저지주 수카수나 소재)의 상측과 하측에 연결하였다. 내강을 제1의 5-ml 루어-락 주사기(BD, 미국 뉴저지주 소재)에 부착시켰으며, 이를 수직으로 배향된 주사기 펌프(펌프(Pump) 11 피코 플러스(Pico Plus), 하바드 애파라투스(Harvard Apparatus), 미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재)에 연결하였다. 외강을 수평으로 배향된 제2 주사기 펌프(펌프 11 피코 플러스)에 연결된 제2의 5-ml 루어-락 주사기로의 루어 커플링을 통해 연결하였다. GRGDSP-변형된 알긴산염 용액(SEQ ID NO: 44로 개시된 "GRGDSP") 중에 재현탁화된 조작된 GLA-ARPE-19 세포(단일의 세포로서)를 함유하는 제1 알긴산염 용액을 제1 주사기에 배치하였으며, 화학적으로 변형된 알긴산염 및 미변형된 알긴산염의 혼합물을 포함하는 무세포 알긴산염 용액을 제2 주사기에 배치하였다. 2개의 주사기 펌프는 제1 및 제2 알긴산염 용액을 동축 니들의 두 관강 모두를 통해 주사기로부터 이동시키며, 두 알긴산염 용액 모두를 함유하는 단일의 액적을 니들로부터 교차-결합 용액을 함유하는 유리 접시 내로 압출시킨다. 각각의 피코 플러스 주사기 펌프의 설정은 12.06 mm 직경이었으며, 각각의 펌프의 유량을 조정하여, 2개의 알긴산염 용액에 대하여 1:1의 유량비를 달성하였다. 따라서, 10 ml/h로 설정된 총 유량을 사용하여, 각각의 알긴산염 용액에 대한 유량은 약 5 mL/h였다. 대조군(빈) 캡슐을 내부 구획을 위해 사용된 알긴산염 용액이 무세포 용액이었던 것을 제외하고 동일한 방식으로 제조하였다.
원하는 부피의 알긴산염 용액의 압출 후에, 알긴산염 액적을 25mM HEPES 완충액, 20 mM BaCl2, 0.2M 만니톨, 및 0.01%의 폴록사머 188을 함유하는 교차-결합 용액 중에 5분 동안 교차결합시켰다. 교차결합 관의 하측으로 떨어진 캡슐을 코니컬(conical) 튜브 내로의 피펫팅에 의해 수집하였다. 캡슐을 튜브에서 침강시킨 후에, 교차결합 완충액를 제거하고, 캡슐을 세척하였다. 세포가 없는 캡슐을 HEPES 완충액(2 리터의 탈이온수 중 NaCl 15.428 g, KCl 0.70 g, MgCl2·6H2O 0.488 g, 0 ml의 HEPES(1 M) 완충 용액(집코(Gibco), 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 미국 캘리포니아 소재))으로 4회 세척하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다. 세포를 캡슐화하는 캡슐을 HEPES 완충액에서 4회, 0.9% 염수에서 2회, 그리고 배양 배지에서 2회 세척하였으며, 37℃에서 인큐베이터에 보관하였다.
2-구획의 조성물에서 캡슐의 품질을 시험할 수 있다. 예를 들어, 적어도 200개 캡슐을 함유하는 분취액을 조성물로부터 취하고, 웰 플레이트에 전달하고, 전체 중에 구형 캡슐의 개수를 계수함으로써 전체 분취액을 광학 현미경에 의해 품질에 대하여 시험한다.
실시예 6: 파브리병의 동물 모델에서의 GLA-조작된 RPE 세포를 함유하는 디바이스의 평가
파브리 마우스를 치료하기 위한 예시적인 GLA-생성 이식된 디바이스의 생물학적 활성을 하기 기술된 단일 용량 및 용량-반응 실험에서 평가하였다.
각 실험에서 사용된 파브리 마우스는 잭슨 랩스(Jackson Labs)로부터 구입한 8 내지 11주령 수컷 마우스였다(https://www.jax.org/strain/003535). 이 마우스 스트레인은 갈락토시다제, 알파(Gla) 유전자의 엑손 3 및 인트론 3을 대체함으로써 유전자 발현을 없애는 neo 카세트를 함유한다. 모든 마우스를 IACUC 승인된 프로토콜에 따라 동물 시설에서 병원체-부재의 조건 하에서 가두었다. 마우스와 관련된 절차는 실험실 동물 관리 인증 평가 협회(Association for Assessment of Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)에 의해 확립된 지침을 따랐다.
2-구획 GLA-생성 또는 대조군 하이드로겔 캡슐을 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다. GLA 4-2 클론(예를 들어, GLA 4 발현 구축물을 사용하여 조작된 ARPE-19 세포) 유래의 세포를 캡슐화시킴으로써 GLA-생성 캡슐을 제조하였다. 단일 용량 실험에서, 2개 군의 3마리 파브리 마우스에 약 140개의 GLA-생성 캡슐 또는 대조군 캡슐을 복강내 이식하였다. 용량-반응 실험에서, 4개 군의 5마리 파브리 마우스에 약 40, 70 또는 140개의 GLA-생성 캡슐 또는 약 140개의 대조군 캡슐을 이식하였다.
이식 후 14일째(단일 용량) 또는 10일째(용량-반응)에 마우스를 희생시키고, 혈액, 간, 신장 및 심장 시료를 희생된 마우스로부터 수집하였다. 인간 GLA 활성 및 Gb3 및 Lyso-Gb3 수준을 하기의 검정을 사용하여 시료에서 측정하였다.
GLA 활성에 대한 효소적 검정
혈액 시료를 EDTA 용액 중에 수집하고, 혈장을 표준 프로토콜에 따라 분리하였다.
간, 신장 및 심장 조직 시료를 매트릭스 D와 함께 MP 바이오(Bio) 패스트프렙(FastPrep)-24 조직 균질화기를 사용하여 50 mM 시트르산, 176 mM K2PO4, pH 5.0 중에 균질화시켰다. 시료를 12,000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 검정 완충액(50 mM 시트르산, 176 mM K2PO4, 0.01% Tween-20, pH 5.0) 내로 5배 희석하였다. 40 μl의 희석된 균질액 또는 혈장을 40μL의 1mM 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드 기질을 함유하는 그라이너(Greiner) 블랙(black) 96 웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 pH 11.6의 0.5 M 수산화나트륨 및 0.5 M 글리신 200μL를 사용하여 중단시켰다. 형광 세기를 바이오텍(Biotek) 시너지(Synergy) LX(여기: 360/40, 방출: 460/40) 상에서 측정하였다. 데이터를 균질액의 총 단백질 농도에 대해 정규화시켰다. 효소 활성 수준을 아갈시다제 베타 및 4-메틸움벨리페론을 사용하여 생성된 표준 곡선과 비교하였다.
Lyso Gb3 및 Gb3 검출
간, 신장 및 심장 조직 시료를 MP 바이오메디컬즈 패스트프렙-25 5G 그라인더(Grinder)를 사용하여 MP 바이오메디컬즈에 의해 제공되는 2 mL 매트릭스 D 균질화 튜브를 사용해 균질화시켰다. 그 다음, 균질액을 14,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 LCMS/MS 분석을 위하여 HPLC 바이알에 바로 전달하였다.
혈장 분석을 위하여, 혈장을 메탄올로 20배 희석하였으며, 희석된 혈장을 와류시키고, 격렬하게 초음파분해하였다. 혈장 추출물을 14,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 부드러운 질소의 스트림 하에서 건조시켰다. 건조된 추출물을 100 uL의 메탄올 중에 재구성하고, LCMS/MS 분석을 위하여 HPLC 바이알로 전달하였다.
LCMS 분석
Lyso GB3 및 GB3 아이소형에 대한 측정을 위하여, 써모(Thermo) 밴퀴시(Vanquish) UHPLC 및 써모 Q-Exactive 질량 분석기를 사용하였다. 크로마토그래피 분리를 1.7 um 입자가 팩킹된 워터스(Waters) 2.1 x 100 mm BEH 아미드 컬럼을 사용하여 수행하였다. 컬럼을 60℃의 온도 및 0.3 mL/분의 유속으로 유지하였다. 모든 분리를 95:5 아세토니트릴:H2O로 이루어진 이동상 A 및 수성인 이동상 B를 사용하여 기울기 방식으로 수행하였으며, 두 이동상은 모두 10 mM 포름산암모늄을 함유한다. 질량 스펙트럼 측정을 70,000의 분해능에서 750 내지 1200 m/z의 전체 스캔 모드를 사용하여 수행하였다. 13 GB3 아이소형 및 Lyso GB3의 정량화를 위하여 정확 질량을 사용하였다. 각각의 분석물의 아이덴티티 확인을 위하여, 데이터 의존적 MS2 스캔을 획득하였으며, 각각의 종에 대한 지시적 단편 이온에 대하여 검사하였다. C17 GB3 및 Lyso GB3을 각각의 조직 유형 내로 스파이킹하여 표준 곡선을 생성함으로써 GB3 아이소형 및 Lyso GB3의 정량화를 수행하였다.
단일 용량 실험에 대한 이들 직접적 및 간접적 GLA 활성 검정의 결과는 도 11 내지 도 13에 나타나 있으며, 용량-반응 실험에 대한 간접적 GLA 활성 검정의 결과는 도 14 및 도 15에 나타나 있다. 인간 GLA 활성을 간 및 혈장 시료 둘 모두에서 검출하였다(도 11a 및 도 11b). Gb3은 대조군 파브리 마우스로부터 14일(도 12) 또는 10일(도 14)에 수득되는 혈장, 간, 신장 및 심장 조직에서 용이하게 검출 가능하였으며, 간 및 심장보다 신장에서 더 높은 Gb3 수준이 관찰되었으며, 이는 이 파브리병 모델의 원래의 설명과 일치한다. 단일 용량의 GLA-생성 하이드로겔 캡슐이 이식된 파브리 마우스에서, 혈장, 간, 신장 및 심장 시료 내의 축적된 Gb3 및 Lyso-Gb3 수준의 유의미하고 유사한 감소가 이식 후 14일째에 관찰되었다(도 12 및 도 13). 또한, 10일에 혈장, 간 및 심장 조직 내의 Gb3 및 Lyso-Gb3 수준의 감소의 양은 GLA-생성 캡슐의 용량의 증가에 따라 증가하였다(도 14 및 도 15). 이들 결과는 본원에 기술된 디바이스 제제가 파브리 마우스에 이식되는 경우 생물학적 활성 및 치료적으로 유효한 수준의 인간 GLA를 생성할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 7: 예시적인 정량적 펩티드 컨쥬게이션 검정.
본 검정은 CBP를 개별 아미노산으로서 절단하는 산 가수분해로 CBP-중합체의 시료를 처리함으로써 CBP-중합체에서의 펩티드의 양을 결정한다. 가수분해된 시료에서 개별 아미노산을 프레-컬럼(pre-column) 온-라인 유도체화 및 역상 액체 크로마토그래피-자외선-형광(LC-UV-FLR)(2018년 3월 1일자 공개된 문헌[Agilent Biocolumns Amino Acid Analysis "How-To" Guide, Agilent Technologies, Inc., 5991-7694EN]로부터 조정됨)에 의하여 아미노산 참조물질을 사용하여 분리하고, 정량화하였다. 일차 아미노산(예를 들어, 20개의 표준 L-알파 아미노산 중 프롤린을 제외한 전부)을 오르토-프탈알데히드(OPA)로 유도체화시키고, 이차 아미노산(예를 들어, 프롤린)을 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(FMOC)로 유도체화시킨다. 이어서, 각각의 아미노산의 몰 농도의 평균을 구하여, 시료 내의 총 펩티드의 농도를 계산한다. 예를 들어, 실시예 8에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 분석 기법을 사용하여, CBP-중합체의 비가수분해된 시료 내의 펩티드의 양을 결정하고, 상기 양을 총 펩티드의 양으로부터 제함으로써 이 농도를 CBP-중합체 내의 임의의 잔류 비컨쥬게이트된 CBP의 존재에 대하여 보정할 수 있다.
검정은 GRGDSP-알긴산염(SEQ ID NO: 44) 내의 펩티드 컨쥬게이션 밀도의 결정에 적용하는 것으로서 하기에 추가로 기재되지만; 숙련자는 검정을 용이하게 변형시켜, GRGDSP-알긴산염(SEQ ID NO: 44) 또는 기타 펩티드-변형된 중합체 내의 펩티드 농도를 결정할 수 있되, 단, 미변형된 중합체는 어떠한 아미노산도 함유하지 않는다. 또한, 숙련자는 하기에 특정된 임의의 장비, 재료 또는 화학물질을 검정에서 실질적으로 동일한 기능 또는 역할을 수행하거나 제공할 수 있는 상이한 장비, 재료 또는 화학물질로 용이하게 대체할 수 있다.
정의
Figure pct00107
Figure pct00108
장비, 재료 및 화학물질
장비
● 아질런트(Agilent) 1260 LC 시스템
● 아질런트 다이오드 어레이 검출기(G1315D): 13 μL/10 mm 유동 셀
● 아질런트 형광 검출기(G1321B)
● 어드밴스바이오(AdvanceBio) AA LC 컬럼, 2.7 μm, 4.6x100 mm, 아질런트 655950-80
● 어드밴스바이오 AAA 가드(guard) 컬럼, 2.7 μm, 4.6x5 mm, 아질런트 820750-931
Figure pct00109
절차
LC/MS 절차에서 사용하기 위하여 10mM Na2HPO4 / Na2B4O7 / pH 8.2(수성 이동상) 및 45/45/10 ACN/MeOH/물(유기 이동상)을 제조한다.
예시적인 펩티드-알긴산염 컨쥬게이트의 시료의 산 가수분해
● 마이크로파 반응 바이알 내로 12 내지 16 mg의 동결건조된 펩티드-알긴산염 컨쥬게이트를 시료가 교반되지 않은 것을 보장하면서 칭량한다.
● 하기 단계 3.3.2 내지 3.3.19에 따라 가수분해한다
염수 용액 중 예시적인 펩티드-알긴산염 컨쥬게이트의 시료의 산 가수분해
● 1000 ± 50 mg의 염수 중 펩티드-알긴산염 컨쥬게이트 용액을 마이크로파 반응 바이알 내로 칭량한다
● 10-mL 전달 피펫 또는 부피측정 피펫 및 교반 막대를 사용하여 10.0 mL의 6N HCl을 시료에 첨가하고, 크림퍼(crimper)를 사용하여 PTFE-라이닝된 캡을 밀봉한다.
● 각각의 시료 바이알을 핫(hot)/교반 플레이트 상의 일치하는 가열 블록 내에 배치하고, 6시간 동안 400 rpm에서 교반하면서 120℃로 가열한다.
● 열에서 제거하고, 주위 온도로 냉각되게 한다
● 캡을 제거하고, 전체 용액을 일회용 전달 피펫을 사용하여 반응 바이알로부터 20-mL 용량 플라스크로 전달한다
● 2 mL의 LCMS 등급수를 빈 반응 바이알 내로 피펫팅하고, 내벽을 동일한 일회용 전달 피펫을 사용하여 완전히 헹구고, 헹굼액을 동일한 20-mL 용량 플라스크에 완전히 전달한다
● 상기 단계를 2회 반복한다
● LCMS 등급수를 사용하여 용량 플라스크의 표시선까지 오게 한다
● 플라스크를 캡핑하고, 다수회 역위시켜, 잘 혼합한다
● 50-mL 원심분리기 튜브로 완전히 전달한다
● 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다
● 1 mL의 상청액을 LC 바이알에 정확하게 피펫팅하고, 건조될 때까지(예를 들어, 다음날) 2~8℃에서 보관한다(나머지 상청액을 필요하다면 임의의 반복 시험을 위하여 2-8℃에서 보관한다)
● 1 mL의 상청액을 60℃에서 질소 하에 완전히 건조시키고, 니들이 시료와 접촉하지 않지만, 시료의 신속한 건조를 위하여 충분히 낮은 것을 보장한다
● 건조된 시료가 있는 바이알 내로, 0.25 mL의 0.1 μmol/mL 내부 표준 혼합물을 피펫팅한다
● 완전히 와류시킨다
● 피펫을 사용하여 LC 바이알 인서트가 있는 LC 바이알로 전달한다
● HPLC 분석까지 2-8℃에 보관한다(단계 3.6)
표준 제제
아미노산 표준 원액: 10 μmol/mL
● 각각의 아미노산에 있어서, 분자량에 기초하여 10 μmol/mL 원액을 제조하는 데 필요한 중량을 계산한다
● 하기 예를 참조한다:
Figure pct00110
● 계산된 중량을 50-mL 용량 플라스크 내로 칭량한다
● 용해시키고, 0.1N HCl을 사용하여 표시선까지 오게 한다
● 캡핑 및 역위 또는 와류에 의해 잘 혼합한다
● HPLC 분석까지 2~8℃에 보관한다(단계 3.6)
내부 표준 혼합물: 1 μmol/mL
● 동일한 10-mL 용량 플라스크 내로, 정확히 1.0 mL의 노르발린 원액(10 μmol/mL) 및 1.0 mL의 사르코신 원액(10 μmol/mL) 용액을 피펫팅한다
● 0.1N HCl을 사용하여 표시선까지 오게 한다
● 캡핑 및 역위 또는 와류에 의해 잘 혼합한다
● HPLC 분석까지 2~8℃에 보관한다(단계 3.6)
내부 표준 혼합물: 0.1 μmol/mL
주의: 이 용액은 건조 후에 시료를 재구성하기 위한 것이다
● 10-mL 용량 플라스크 내로, 정확히 1.0 mL의 내부 표준 혼합물(1 μmol/mL)을 피펫팅한다
● 0.1N HCl을 사용하여 표시선까지 오게 한다
● 캡핑 및 역위 또는 와류에 의해 잘 혼합한다
● HPLC 분석까지 2~8℃에 보관한다(단계 3.6)
5 AA 혼합물(+ iSTD 0.1): 0.025/0.1/0.25 μmol/mL
● 동일한 10-mL 용량 플라스크 내로 정확히 xx μL(하기 표 참조)의 D, S, G, R, N-iSTD, S-iSTD 및 P(10 μmol/mL) 용액을 피펫팅한다
● 0.1N HCl을 사용하여 표시선까지 오게 한다
● 캡핑 및 역위 또는 와류에 의해 잘 혼합한다
● HPLC 분석까지 2~8℃에 보관한다(단계 3.6)
Figure pct00111
17 AA 표준(+ iSTD 0.1) 혼합물: 0.1 μmol/mL
● 0.1 μmol/mL 17 AA 표준 용액의 앰플을 파괴하여 개방한다
● 정확히 0.9 mL의 AA 표준 혼합물을 LC 바이알 내로 피펫팅한다
● 동일한 LC 바이알 내로, 정확히 100 μL의 iSTD 혼합물(1 μmol/mL)을 피펫팅한다
● 와류에 의해 잘 혼합한다
● NLT 100 μL를 LC 바이알 인서트가 있는 LC 바이알 내로 분취한다
● HPLC 분석까지 2~8℃에 보관한다(단계 3.6)
HPLC 조건
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
시스템 적합성 기준
표준 주입(UV 및 FLR 둘 모두)에서 정량화에 사용되는 각각의 관심 아미노산(D/S/G/R) 및 내부 표준물질(노르발린 및 사르코신)에 대한 머무름 시간 및 피크 면적을 분석한다.
Figure pct00115
데이터 분석 - 시스템 적합성이 통합 지침을 통과한 경우에만 시료를 분석한다
관심 아미노산의 확인
● 17AA (+iSTD) 표준물질 혼합물에서의 내부 표준물질 및 관심 아미노산의 RT는 5AA(+iSTD) 표준물질 혼합물의 RT와 일치해야 한다
● 각각의 시료에서 아미노산의 RT는 표준물질의 RT(UV/FLR)와 일치해야 한다
상대 면적(D, S, G, R) = 면적(D, S, G, R) / 면적(노르발린)
상대 면적(P) = 면적(P) / 면적(사르코신)
표준 교정 곡선
● 분석 증명서 상의 보고된 값 또는 표준물질 제조 동안 희석 인자에 의해 조정된 실제 중량을 사용하여 표준물질 용액의 농도를 계산한다.
● 표준물질 주입: 0.025, 0.1 및 0.25 μmol/mL으로부터 각각의 관심 아미노산에 대한 농도에 대하여 평균 면적 또는 평균 상대 면적을 플롯팅한다. 선형 회귀를 수행한다.
농도 = m * 면적 또는 상대 면적 + b
상기 식에서, m은 선형 핏팅된 곡선의 기울기이며, b는 선형 핏팅된 곡선의 Y-절편이다.
● RSQ는 0.99 이상이어야 한다.
● 직선성이 실패하면, 신선한 유도체화 시약/표준 용액을 제조하고, 시스템 오작동을 해결하고, 시험을 반복한다.
시료 분석
● 정량화는 UV 및 FLR 둘 모두에 의해 행해질 수 있다
● 정량화는 상대 면적(내부 표준물질에 비한 면적 비)을 사용하여 행해진다
● 선형 핏팅된 표준 곡선을 사용하여 각각의 시료 내의 아미노산: G, R, D, S의 농도를 계산한다:
농도, 아미노산(μmol/mL) = (m * 면적 또는 상대 면적 + b)
● 각각의 아미노산의 농도의 평균을 구함으로써 전체 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)의 농도를 계산한다:
농도, 전체 GRGDSP(SEQ ID NO: 44)(μmol/mL) = (농도, G/2 + 농도, R + 농도, D + 농도, S + 농도, P) / 5
μmol(총 GRGDSP(SEQ ID NO: 44))/g(컨쥬게이트) = 총 GRGDSP 농도(μmol/mL) x 0.25 mL/1.0 mL x 20 mL/중량(g)
μmol(컨쥬게이트된 GRGDSP(SEQ ID NO: 44))/g(컨쥬게이트) = μmol(전체 GRGDSP(SEQ ID NO: 44))/g(컨쥬게이트) - μmol(잔류 유리 GRGDSP(SEQ ID NO: 44))/g(컨쥬게이트)
실시예 8: CBP-중합체 조성물에서 잔류 유리 펩티드를 결정하기 위한 예시적인 검정
본 검정은 예를 들어, 전형적으로 하나 이상의 정제 단계를 수행하여 상당한 부분, 예를 들어, 95%, 98%, 99% 초과 또는 그 이상의 비컨쥬게이트된 펩티드를 제거한 후에, 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법(LC-MS)을 사용하여, 펩티드-중합체 컨쥬게이트를 함유하는 조성물에서 비컨쥬게이트된 잔류 펩티드의 양을 결정한다. 간단하게, 염수 용액 중 컨쥬게이트의 시료를 펩티드의 분자량 초과의 MWCO를 갖는 분자량 컷-오프(MWCO) 튜브에 첨가하고, 튜브를 원심분리하여 컨쥬게이트로부터 잔류 펩티드를 분리하고, 알려져 있는 농도의 동일한 펩티드를 함유하는 참조 조성물을 표준물질로서 사용하여 펩티드의 양을 LC-MS에 의해 정량화한다.
실시예 9: 화학식 I의 화합물로 변형된 비섬유성 중합체에서 아민-컨쥬게이션 밀도를 결정하기 위한 예시적인 정량적 아민 검정.
본 검정은 아민 화합물로 화학적으로 변형된 중합체에서 아민-함유 화합물(예를 들어, 화학식 I의 화합물, 예를 들어, 표 3의 화합물 101)의 양을 결정한다. 화학적으로 변형된 중합체의 시료를, 컨쥬게이트된 아민을 절단하는 산 가수분해로 처리하고, 가수분해된 시료 중 전체 아민의 중량%를 표준물질로서 비컨쥬게이트된 아민 화합물을 사용하여 자외선 검출과 함께 역상 액체 크로마토그래피(LC-UV)에 의해 정량화한다. LC 피크의 아이덴티티를 질량 분광법에 의해 추가로 확인할 수 있다. 전체 아민의 중량%는 화학적으로 변형된 중합체에서의 아민-화합물의 컨쥬게이션%로서 사용될 수 있다. (예를 들어, 하기 기재된 바와 같은) 임의의 적합한 방법을 사용하여 화학적으로 변형된 중합체의 비가수분해된 시료 내의 임의의 잔류 비컨쥬게이트된 아민 화합물의 양을 결정하고, 상기 양을 전체 펩티드 양으로부터 제함으로써 더욱 정밀한 결과를 수득할 수 있다.
검정은 화합물 101로 화학적으로 변형된 알긴산염(즉, CM-LMW-Alg-101)에서 컨쥬게이션 밀도%를 결정하는 데 적용되는 것으로서 추가로 하기 기재되어 있지만; 숙련자는 다당류(예를 들어, 알긴산염) 또는 아민을 함유하지 않는 또 다른 중합체를 화학적으로 변형시키기 위해 사용되는 임의의 화학식 I 화합물의 컨쥬게이션 밀도를 결정하기 위하여 검정을 용이하게 변형시킬 수 있다. 또한, 숙련자는 하기에 특정된 임의의 장비, 재료 또는 화학물질을 검정에서 실질적으로 동일한 기능 또는 역할을 수행하거나 제공할 수 있는 상이한 장비, 재료 또는 화학물질로 용이하게 대체할 수 있다.
정의
Figure pct00116
장비
● 아질런트 1260 LC 시스템(DAD: 13 μL/10 mm 유동 셀)
● 아질런트 SQ MS 검출기(G1956B)
● XBridge C18, 2.5 μm, 4.6 x 50 mm, 워터스(Waters) 186006037
● 소분자 참조 물질(비컨쥬게이트, 표 3의 유리 아민 버전의 화합물 101; 98.0% 초과의 순도)
절차
LC 절차에 사용하기 위하여 수 중 0.1% 암모니아 용액(수성 이동상) 및 ACN 중 0.1% 암모니아 용액(유기 이동상)을 제조한다.
예시적인 고체 알긴산염-소분자 컨쥬게이트 시료의 산 가수분해
● 마이크로파 반응 바이알 내로 50 ± 5 mg의 동결건조된 소분자-알긴산염 컨쥬게이트 고체를 시료가 교반되지 않은 것을 보장하면서 칭량한다.
● 10-mL 전달 피펫 또는 부피측정 피펫 및 교반 막대를 사용하여 10.0 mL의 2N HCl을 첨가하고, 크림퍼를 사용하여 PTFE-라이닝된 캡을 밀봉한다.
● 각각의 시료 바이알을 핫/교반 플레이트 상의 일치하는 가열 블록 내에 배치하고, 120분 동안 400 rpm에서 교반하면서 120℃로 가열한다.
● 열에서 제거하고, 주위 온도로 냉각되게 한다
● 전체 용액을 일회용 전달 피펫을 사용하여 반응 바이알로부터 25-mL 용량 플라스크로 전달한다
● 5 mL의 LCMS 등급수를 빈 반응 바이알 내로 피펫팅하고, 내벽을 동일한 일회용 전달 피펫을 사용하여 완전히 헹구고, 헹굼액을 동일한 25-mL 용량 플라스크에 완전히 전달한다
● 상기 단계를 2회 반복한다
● LCMS 등급수를 사용하여 용량 플라스크의 표시선까지 오게 한다
● 50-mL 원심분리기 튜브로 완전히 전달한다
● 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다
● HPLC 분석을 위하여 상청액을 취한다
● 2 내지 8℃에 보관한다
염수 시료 중 예시적인 소분자-알긴산염 컨쥬게이트의 산 가수분해
● 1000 ± 50 mg의 염수 중 소분자-알긴산염 컨쥬게이트 용액을 마이크로파 반응 바이알 내로 칭량한다
● 10-mL 전달 피펫 또는 부피측정 피펫 및 교반 막대를 사용하여 10.0 mL의 2N HCl을 첨가하고, 크림퍼를 사용하여 PTFE-라이닝된 캡을 밀봉한다.
● 각각의 시료 바이알을 고온/교반 플레이트 상의 일치하는 가열 블록 내에 둔다
● 120℃에서 가열하고, 400 rpm에서 120분 동안 교반한다
● 열에서 제거하고, 주위 온도로 냉각되게 한다
● 전체 용액을 일회용 전달 피펫을 사용하여 반응 바이알로부터 25-mL 용량 플라스크로 전달한다
● 5 mL의 LCMS 등급수를 빈 반응 바이알 내로 피펫팅하고, 내벽을 동일한 일회용 전달 피펫을 사용하여 완전히 헹구고, 헹굼액을 동일한 25-mL 용량 플라스크에 완전히 전달한다
● 상기 단계를 2회 반복한다
● LCMS 등급수를 사용하여 용량 플라스크의 표시선까지 오게 한다
● 50-mL 원심분리기 튜브로 완전히 전달한다
● 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다
● HPLC 분석을 위하여 상청액을 취한다
● 2 내지 8℃에 보관한다
고체 소분자-알긴산염 컨쥬게이트 내의 잔류 유리 아민에 대한 시료 제조
● 50 ± 5 mg의 동결건조된 소분자 알긴산염 컨쥬게이트 고체를 신틸레이션(scintillation) 바이알 내로 칭량한다
● 5.0 mL의 염수를 신틸레이션 바이알 내로 피펫팅한다
● 10분 동안 진탕시키고 와류시킴으로써 완전히 용해시킨다
● MWCO 튜브로 완전히 전달한다
● 5000 rpm에서 60분 동안 원심분리한다
● MWCO 튜브의 상측 부분을 제거하고 폐기한다
● 하측 부분의 시료를 5 mL 용량 플라스크에 완전히 전달한다
● 물 또는 염수를 사용하여 표시선까지 오게 하고, 역위시켜 잘 혼합한다
● 2 내지 8℃에서의 보관을 위하여 신틸레이션 바이알로 전달한다
● HPLC 분석을 위하여 분취액을 전달한다
염수 중 소분자-알긴산염 컨쥬게이트 내의 잔류 유리 아민에 대한 시료 제조
● 1000 ± 50 mg의 염수 중 소분자-알긴산염 컨쥬게이트(또는 미변형된 알긴산염과의 배합물)를 MWCO 튜브 내로 칭량한다
● 4.0 mL의 염수를 MWCO 튜브 내로 피펫팅한다
● 튜브를 5회 또는 유리 아민을 완전히 추출하기 위하여 용액이 잘 혼합될 때까지 역위시키고 와류시킨다
● 5000 rpm에서 90분 동안 원심분리한다
● MWCO 튜브의 상측 부분을 제거하고 폐기한다
● 하측 부분의 시료를 5 mL 용량 플라스크에 완전히 전달한다
● 표시선까지 물로 채우고, 역위시켜 잘 혼합한다
● 2 내지 8℃에서의 보관을 위하여 신틸레이션 바이알로 전달한다
● HPLC 분석을 위하여 분취액을 전달한다
표준 제제
표준물질 용액: 1 mg/mL
● 50.00 ± 5.00 mg의 소분자 참조 물질 표준물을 신틸레이션 바이알 내로 칭량한다
● 약 10 mL의 LCMS-등급수를 첨가하고, 고체를 진탕 및 와류에 의해 완전히 용해시킨다
● 신틸레이션 바이알을 일회용 전달 피펫을 사용하여 LCMS-등급수로 2회 헹굼으로써, 50-mL 용량 플라스크로 완전히 전달한다
● LCMS-등급수로 용량을 맞추고, 잘 혼합한다
● 2 내지 8℃에 보관한다
표준물질 용액: 0.01 mg/mL
● 100 μL의 1 mg/mL 용액을 10-mL 용량 플라스크 내로 피펫팅한다
● LCMS-등급수로 용량을 맞춘다
● 역위에 의해 잘 혼합한다
● 2 내지 8℃에 보관한다
HPLC 조건
Figure pct00117
시스템 적합성 기준
Figure pct00118
데이터 분석 - 시스템 적합성이 통합 지침을 통과한 경우에만 시료를 분석한다
유리 아민의 확인
● 각각의 시료에서 유리 아민 피크의 (선택적인) m/z가 392.1 ± 0.5 이내이어야 한다.
● 각각의 시료에서 UV의 아민 피크의 RT는 표준물질의 RT와 일치한다.
농도, 표준물질(mg/mL) =
중량(mg)/50 mL/희석 배율,
상기 식에서, 희석 배율 = 1.0 mg/mL 표준물질에 대하여 1;
희석 배율 = 0.01 mg/mL 표준물질에 대하여 100
농도, 유리 아민(mg/mL) =
면적, 비-가수분해된 시료/면적, 0.01 표준물질 x 농도, 0.01 표준물질
잔류 유리 아민% =
농도, 유리 아민(mg/mL) x 5 mL /
중량, 비-가수분해된 컨쥬게이트(mg) x 100
농도, 전체 아민(mg/mL) =
면적, 가수분해된 시료/면적, 1.0 표준물질 x 농도, 1.0 표준물질
전체 아민% =
농도, 전체 아민(mg/mL) x 25 mL/중량, 가수분해된 컨쥬게이트(mg) x 100
등가물 및 범주
본 출원은 다양한 등록 특허, 공개된 특허 출원, 저널 기사 및 다른 간행물을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 포함된 참고문헌 중 임의의 것과 본 명세서 간에 충돌이 존재하면, 본 명세서가 우선시되어야 한다. 또한, 선행 기술에 포함된 본 개시내용의 임의의 특정 구현예는 청구범위 중 임의의 하나 이상으로부터 명백하게 제외될 수 있다. 이러한 구현예는 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이러한 제외가 본원에 명백하게 언급되지 않아도 이들은 제외될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 특정 구현예는, 선행 기술의 존재에 관련되든 관련되지 않든 간에, 임의의 이유로 인해서 임의의 청구범위로부터 제외될 수 있다.
당업자는 일상적인 것을 넘어서지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적인 구현예에 대한 다수의 등가물을 인식할 것이거나 알아낼 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예의 범주는 상기 설명, 도면 또는 실시예에 제한되도록 의도되지 않고, 첨부된 청구범위에 언급된 바와 같다. 당업자는 이러한 설명에 대한 다양한 변화 및 변경이 하기 청구범위에 정의된 바와 같은, 본 개시내용의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있음을 인식할 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> SIGILON THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS, DEVICES AND METHODS FOR TREATING FABRY DISEASE <130> S2225-7028WO <140> <141> <150> 62/907,380 <151> 2019-09-27 <150> 62/824,969 <151> 2019-03-27 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 2 <211> 1290 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60 ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180 gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240 tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300 gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360 gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420 acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480 gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540 gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600 tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660 cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720 agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780 ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840 gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900 cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960 caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020 gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080 ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140 gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200 tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260 atgcagatgt cattaaaaga cttactttaa 1290 <210> 3 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 atgcagctga gaaaccccga actgcacctg ggatgtgccc tggctctgag atttctggcc 60 ctggtgtctt gggacatccc tggcgctaga gccctggata atggcctggc cagaacacct 120 acaatgggct ggctgcactg ggagagattc atgtgcaacc tggactgcca agaggaaccc 180 gacagctgca tcagcgagaa gctgttcatg gaaatggccg agctgatggt gtccgaaggc 240 tggaaggatg ccggctacga gtacctgtgc atcgacgact gttggatggc ccctcagaga 300 gactctgagg gcagactgca ggccgatcct cagagatttc cccacggcat tagacagctg 360 gccaactacg tgcacagcaa gggcctgaag ctgggcatct atgccgacgt gggcaacaag 420 acctgtgccg gctttcctgg cagcttcggc tactacgata tcgacgccca gaccttcgcc 480 gattggggag tcgatctgct gaagttcgac ggctgctact gcgacagcct ggaaaatctg 540 gccgacggct acaagcacat gtcactggcc ctgaatcgga ccggcagatc catcgtgtac 600 agctgcgagt ggcccctgta catgtggccc ttccagaagc ctaactacac cgagatcaga 660 cagtactgca accactggcg gaacttcgcc gacatcgacg atagctggaa gtccatcaag 720 agcatcctgg actggaccag cttcaatcaa gagcggatcg tggacgtggc aggacctggc 780 ggatggaacg atcctgacat gctggtcatc ggcaacttcg gcctgagctg gaaccagcaa 840 gtgacccaga tggccctgtg ggccattatg gccgctcctc tgttcatgag caacgacctg 900 agacacatca gccctcaggc caaggctctg ctgcaggaca aggatgtgat cgctatcaac 960 caggatcctc tgggcaagca gggctaccag ctgagacagg gcgacaattt cgaagtgtgg 1020 gaaagacccc tgagcggact ggcttgggcc gtcgccatga tcaacagaca agagatcggc 1080 ggaccccggt cctacacaat tgccgtggct tctctcggca aaggcgtggc ctgtaatccc 1140 gcctgcttta tcacacagct gctgcccgtg aagagaaagc tgggctttta cgagtggacc 1200 agcagactgc ggagccacat caatcctacc ggcacagtgc tgctgcagct ggaaaacacc 1260 atgcagatga gcctgaagga cctgctgtaa 1290 <210> 4 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 atgcagctgc gcaaccccga gctgcacctg ggctgcgccc tggccctgcg cttcctggcc 60 ctggtgagct gggacatccc cggcgcccgc gccctggaca acggcctggc ccgcaccccc 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc tggactgcca ggaggagccc 180 gacagctgca tcagcgagaa gctgttcatg gagatggccg agctgatggt gagcgagggc 240 tggaaggacg ccggctacga gtacctgtgc atcgacgact gctggatggc cccccagcgc 300 gacagcgagg gccgcctgca ggccgacccc cagcgcttcc cccacggcat ccgccagctg 360 gccaactacg tgcacagcaa gggcctgaag ctgggcatct acgccgacgt gggcaacaag 420 acctgcgccg gcttccccgg cagcttcggc tactacgaca tcgacgccca gaccttcgcc 480 gactggggcg tggacctgct gaagttcgac ggctgctact gcgacagcct ggagaacctg 540 gccgacggct acaagcacat gagcctggcc ctgaaccgca ccggccgcag catcgtgtac 600 agctgcgagt ggcccctgta catgtggccc ttccagaagc ccaactacac cgagatccgc 660 cagtactgca accactggcg caacttcgcc gacatcgacg acagctggaa gagcatcaag 720 agcatcctgg actggaccag cttcaaccag gagcgcatcg tggacgtggc cggccccggc 780 ggctggaacg accccgacat gctggtgatc ggcaacttcg gcctgagctg gaaccagcag 840 gtgacccaga tggccctgtg ggccatcatg gccgcccccc tgttcatgag caacgacctg 900 cgccacatca gcccccaggc caaggccctg ctgcaggaca aggacgtgat cgccatcaac 960 caggaccccc tgggcaagca gggctaccag ctgcgccagg gcgacaactt cgaggtgtgg 1020 gagcgccccc tgagcggcct ggcctgggcc gtggccatga tcaaccgcca ggagatcggc 1080 ggcccccgca gctacaccat cgccgtggcc agcctgggca agggcgtggc ctgcaacccc 1140 gcctgcttca tcacccagct gctgcccgtg aagcgcaagc tgggcttcta cgagtggacc 1200 agccgcctgc gcagccacat caaccccacc ggcaccgtgc tgctgcagct ggagaacacc 1260 atgcagatga gcctgaagga cctgctgtaa 1290 <210> 5 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Gly Trp Arg Ala Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Gly Arg Leu Leu Ala Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met 20 25 30 Gly Trp Leu His Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu 35 40 45 Glu Pro Asp Ser Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu 50 55 60 Leu Met Val Ser Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys 65 70 75 80 Ile Asp Asp Cys Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu 85 90 95 Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn 100 105 110 Tyr Val His Ser Lys Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly 115 120 125 Asn Lys Thr Cys Ala Gly Phe Pro Gly Ser Phe 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gaccttcgcc gactggggcg tggacctgct gaagttcgac 480 ggctgctact gcgacagcct ggagaacctg gccgacggct acaagcacat gagcctggcc 540 ctgaaccgca ccggccgcag catcgtgtac agctgcgagt ggcccctgta catgtggccc 600 ttccagaagc ccaactacac cgagatccgc cagtactgca accactggcg caacttcgcc 660 gacatcgacg acagctggaa gagcatcaag agcatcctgg actggaccag cttcaaccag 720 gagcgcatcg tggacgtggc cggccccggc ggctggaacg accccgacat gctggtgatc 780 ggcaacttcg gcctgagctg gaaccagcag gtgacccaga tggccctgtg ggccatcatg 840 gccgcccccc tgttcatgag caacgacctg cgccacatca gcccccaggc caaggccctg 900 ctgcaggaca aggacgtgat cgccatcaac caggaccccc tgggcaagca gggctaccag 960 ctgcgccagg gcgacaactt cgaggtgtgg gagcgccccc tgagcggcct ggcctgggcc 1020 gtggccatga tcaaccgcca ggagatcggc ggcccccgca gctacaccat cgccgtggcc 1080 agcctgggca agggcgtggc ctgcaacccc gcctgcttca tcacccagct gctgcccgtg 1140 aagcgcaagc tgggcttcta cgagtggacc agccgcctgc gcagccacat caaccccacc 1200 ggcaccgtgc tgctgcagct ggagaacacc atgcagatga gcctgaagga cctgctgtaa 1260 <210> 7 <211> 530 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Met Gly Trp Arg Ala Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Gly Arg Leu Leu Ala Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met 20 25 30 Gly Trp Leu His Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu 35 40 45 Glu Pro Asp Ser Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu 50 55 60 Leu Met Val Ser Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys 65 70 75 80 Ile Asp Asp Cys Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu 85 90 95 Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn 100 105 110 Tyr Val His Ser Lys Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly 115 120 125 Asn Lys Thr Cys Ala Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile 130 135 140 Asp Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp 145 150 155 160 Gly Cys Tyr Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His 165 170 175 Met Ser Leu Ala Leu Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys 180 185 190 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gggcaacaag acctgcgccg gcttccccgg cagcttcggc 420 tactacgaca tcgacgccca gaccttcgcc gactggggcg tggacctgct gaagttcgac 480 ggctgctact gcgacagcct ggagaacctg gccgacggct acaagcacat gagcctggcc 540 ctgaaccgca ccggccgcag catcgtgtac agctgcgagt ggcccctgta catgtggccc 600 ttccagaagc ccaactacac cgagatccgc cagtactgca accactggcg caacttcgcc 660 gacatcgacg acagctggaa gagcatcaag agcatcctgg actggaccag cttcaaccag 720 gagcgcatcg tggacgtggc cggccccggc ggctggaacg accccgacat gctggtgatc 780 ggcaacttcg gcctgagctg gaaccagcag gtgacccaga tggccctgtg ggccatcatg 840 gccgcccccc tgttcatgag caacgacctg cgccacatca gcccccaggc caaggccctg 900 ctgcaggaca aggacgtgat cgccatcaac caggaccccc tgggcaagca gggctaccag 960 ctgcgccagg gcgacaactt cgaggtgtgg gagcgccccc tgagcggcct ggcctgggcc 1020 gtggccatga tcaaccgcca ggagatcggc ggcccccgca gctacaccat cgccgtggcc 1080 agcctgggca agggcgtggc ctgcaacccc gcctgcttca tcacccagct gctgcccgtg 1140 aagcgcaagc tgggcttcta cgagtggacc agccgcctgc gcagccacat caaccccacc 1200 ggcaccgtgc tgctgcagct ggagaacacc atgcagatga gcctgaagga cctgctgggc 1260 ggcagcagcc gcaccgtggc cgcccccagc gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag 1320 ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc ctgctgaaca acttctaccc ccgcgaggcc 1380 aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg cagagcggca acagccagga gagcgtgacc 1440 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc 1500 gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc gaggtgaccc accagggcct gagcagcccc 1560 gtgaccaaga gcttcaaccg cggcgagtgc taa 1593 <210> 10 <211> 1056 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 10 atgggctggc gagctgctgg tgcacttctg ctggctctgc tgcttcatgg cagactgctt 60 gctgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 120 ggcggcaccg ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 180 agctggaaca gcggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 240 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 300 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 360 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 420 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccgcacc 480 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac 540 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccgcga ggagcagtac 600 aacagcacct accgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 660 aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 720 agcaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgcgac 780 gagctgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 840 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 900 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagccgc 960 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1020 acccagaaga gcctgagcct gagccccggc aagtaa 1056 <210> 11 <211> 777 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Gly Trp Arg Ala Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala 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ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc 1020 gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt 1080 tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg 1140 tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagg 1200 gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg 1260 ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt 1320 gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg 1380 ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg 1440 gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc 1500 acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg 1560 gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg 1620 gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc 1680 gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa 1740 tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga 1800 agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc 1860 gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg 1920 ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg 1980 ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg 2040 tgctgtctca tcattttggc aaagaattgc aagtttgtac aaaaaagcag gctgccaccg 2100 aattcgcggc cgctaaaccc agctttcttg tacaaagtgg caactttatt atacatagtt 2160 gatcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 2220 cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 2280 cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 2340 aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 2400 aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa 2460 ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc 2520 catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt 2580 tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 2640 tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cctgcagccc 2700 aagcttggat ccctcgagtt aattaacgag agcataatat tgatatgtgc caaagttgtt 2760 tctgactgac taataagtat aatttgtttc tattatgtat aggttaagct aattacttat 2820 tttataatac aacatgactg tttttaaagt acaaaataag tttatttttg taaaagagag 2880 aatgtttaaa agttttgtta ctttatagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata 2940 aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat 3000 aataaaactt aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaac 3060 acatgcgtca attttacgca tgattatctt taacgtacgt cacaatatga ttatctttct 3120 agggttaaat aatagtttct aattttttta ttattcagcc tgctgtcgtg aataccgagc 3180 tccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 3240 gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 3300 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 3360 aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 3420 cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 3480 tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 3540 gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 3600 tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 3660 ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 3720 tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 3780 taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 3840 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 3900 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 3960 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 4020 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 4080 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 4140 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 4200 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 4260 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4320 gcagtgctgc 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ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca 360 tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc 420 tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg 480 actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga tc 522 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ser Trp Glu Leu Tyr Tyr Pro Leu Arg Ala Asn Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 His Ala Val Asp Ile 1 5 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Asp Gly Glu Ala 1 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Phe Tyr Phe Asp Leu Arg 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> 4-hydroxyproline <400> 25 Gly Phe Pro Gly Glu Arg 1 5 <210> 26 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> 4-hydroxyproline <400> 26 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 1 5 10 15 Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 20 25 30 Pro Pro Gly Pro Pro 35 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Val Ala Pro Gly 1 <210> 28 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Arg Gly Asp 1 <210> 29 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gly Pro Arg 1 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Pro His Ser Arg Asn 1 5 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Pro His Ser Arg Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Arg Glu Asp Val 1 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Arg <210> 36 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Leu Arg Glu 1 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Lys Gln Leu Arg Glu Gln 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu 1 5 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Val Thr Cys Gly 1 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ser Val Thr Cys Gly 1 5 <210> 43 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ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240 ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300 tgttatagat atcatcaact ttgtatagaa aagttgctcg acattgatta ttgactagtt 360 attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 420 cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 480 caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 540 tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 600 cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 660 ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 720 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 780 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 840 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 900 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 960 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc 1020 gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60 tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120 gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180 gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240 ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300 tgttatagat atcatcaact ttgtatagaa aagttgctcg acattgatta ttgactagtt 360 attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 420 cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 480 caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 540 tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 600 cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 660 ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 720 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 780 ttttgtattt atttattttt taattatttt 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cctgcgccgg cttccccggc agcttcggct 2520 actacgacat cgacgcccag accttcgccg actggggcgt ggacctgctg aagttcgacg 2580 gctgctactg cgacagcctg gagaacctgg ccgacggcta caagcacatg agcctggccc 2640 tgaaccgcac cggccgcagc atcgtgtaca gctgcgagtg gcccctgtac atgtggccct 2700 tccagaagcc caactacacc gagatccgcc agtactgcaa ccactggcgc aacttcgccg 2760 acatcgacga cagctggaag agcatcaaga gcatcctgga ctggaccagc ttcaaccagg 2820 agcgcatcgt ggacgtggcc ggccccggcg gctggaacga ccccgacatg ctggtgatcg 2880 gcaacttcgg cctgagctgg aaccagcagg tgacccagat ggccctgtgg gccatcatgg 2940 ccgcccccct gttcatgagc aacgacctgc gccacatcag cccccaggcc aaggccctgc 3000 tgcaggacaa ggacgtgatc gccatcaacc aggaccccct gggcaagcag ggctaccagc 3060 tgcgccaggg cgacaacttc gaggtgtggg agcgccccct gagcggcctg gcctgggccg 3120 tggccatgat caaccgccag gagatcggcg gcccccgcag ctacaccatc gccgtggcca 3180 gcctgggcaa gggcgtggcc tgcaaccccg cctgcttcat cacccagctg ctgcccgtga 3240 agcgcaagct gggcttctac gagtggacca gccgcctgcg cagccacatc aaccccaccg 3300 gcaccgtgct gctgcagctg gagaacacca 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ataaataaat tgtttgttga atttattatt 4200 agtatgtaag tgtaaatata ataaaactta atatctattc aaattaataa ataaacctcg 4260 atatacagac cgataaaaca catgcgtcaa ttttacgcat gattatcttt aacgtacgtc 4320 acaatatgat tatctttcta gggttaaata atagtttcta atttttttat tattcagcct 4380 gctgtcgtga ataccgagct ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attcactggc 4440 cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 4500 agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 4560 ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 4620 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 4680 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 4740 aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 4800 acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 4860 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 4920 caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 4980 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 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gctggctggt ttattgctga taaatctgga 5880 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 5940 cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 6000 atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 6060 tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 6120 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 6180 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 6240 tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 6300 ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 6360 ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 6420 gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 6480 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 6540 tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 6600 ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaagag agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 6660 agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> This region may encompass 1-3 residues <400> 50 Gly Gly Gly Arg Gly Asp 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> This region may encompass 1-3 residues <400> 51 Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5

Claims (23)

  1. GLA 단백질을 발현하고 분비할 수 있는 조작된 포유동물 세포로서, 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 전구체 GLA 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 포유동물 세포:
    (a) 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨;
    (b)
    (i) 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 GLA 이외의 분비 단백질 유래의 신호 펩티드; 또는
    (ii) 성숙 인간 GLA 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드 및 GLA 아미노산 서열의 C-말단에 작동 가능하게 연결된 비-GLA 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 GLA 융합 단백질을 포함하는 GLA 융합 단백질을 인코딩함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 RPE 세포로부터 유래되며, 선택적으로 상기 프로모터가 SEQ ID NO:18과 동일하거나 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어진 조작된 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전구체 GLA 코딩 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 조작된 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 포유동물 HSPG2 단백질에서 유래된 것이며, 선택적으로 상기 신호 펩티드가 SEQ ID NO:15로 본질적으로 이루어진 조작된 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전구체 GLA 코딩 서열이 SEQ ID NO:16을 포함하는 조작된 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 GLA 융합 단백질이 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13을 포함하는 조작된 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 전구체 GLA 코딩 서열이 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:14를 포함하는 조작된 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 트랜스펙션된 ARPE-19 세포로부터 유래되는 조작된 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:47을 포함하는 조작된 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열이 염색체외 벡터를 포함하거나, 포유동물 세포 내의 적어도 하나의 염색체 위치 내로 통합되는 조작된 세포.
  11. 제1항의 조작된 포유동물 세포를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 폴리클로널 세포 배양물 또는 모노클로널 세포주의 배양물인 조성물.
  13. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 이중-가닥 DNA 분자: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:48.
  14. 제13항에 있어서, SEQ ID NO:48로 본질적으로 이루어진 단리된 DNA 분자.
  15. 이식 가능한 디바이스로서
    제1항의 조작된 세포를 포함하는 적어도 하나의 세포-함유 구획 및 디바이스가 대상체 내로 이식되는 경우 이물 반응(FBR)을 완화시키기 위한 적어도 하나의 수단을 포함하는 이식 가능한 디바이스.
  16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포-함유 구획이 조작된 세포를 캡슐화하는 중합체 조성물을 포함하며, 선택적으로 적어도 하나의 세포-결합 물질(CBS)을 포함하는 이식 가능한 디바이스.
  17. 제15항에 있어서, 상기 세포-함유 구획이 장벽 구획에 의해 둘러싸이며, 상기 장벽 구획은 알긴산염 하이드로겔 및 선택적으로 장벽 구획의 외부 표면 상에 배치된 화학식 I의 화합물을 포함하는, 이식 가능한 디바이스.
  18. 제16항에 있어서, 상기 중합체 조성물이 펩티드로 공유적으로 변형된 알긴산염을 포함하며, 상기 펩티드가 GRGDSP(SEQ ID NO:44) 또는 GGRGDSP(SEQ ID NO:45)로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어지며, 상기 장벽 구획이 하기 화학식 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 변형된 알긴산염을 포함하는 이식 가능한 디바이스:
    Figure pct00119
    .
  19. 하이드로겔 캡슐로서:
    (a) 하이드로겔-형성 중합체를 포함하는 제1 중합체 조성물에 캡슐화된 제1항의 조작된 세포를 포함하는 내부 구획; 및
    (b) 내부 구획을 둘러싸며 제2 중합체 조성물을 포함하는 장벽 구획으로서, 제2 중합체 조성물은 하기 표에 나타낸 화합물 100, 화합물 101, 화합물 110, 화합물 112, 화합물 113 및 화합물 114 또는 이들 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물로 공유적으로 변형된 알긴산염을 포함하는 장벽 구획
    을 포함하는 하이드로겔 캡슐:
    Figure pct00120
  20. 제19항에 있어서, 상기 선택된 화합물이 하기의 것인 하이드로겔 캡슐:
    Figure pct00121
    .
  21. 제19항에 있어서, 상기 내부 구획이 SEQ ID NO:47을 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 발현하는 복수의 조작된 세포를 포함하며, 선택적으로 내부 구획 내의 조작된 세포의 농도가 제1 중합체 조성물 ml당 적어도 4000만개의 세포인 하이드로겔 캡슐.
  22. 복수의 제19항의 하이드로겔 캡슐을 포함하는 조성물.
  23. 제15항의 이식 가능한 디바이스, 제19항의 하이드로겔 캡슐 또는 제22항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 파브리병을 갖는 환자의 치료 방법.
KR1020217033935A 2019-03-27 2020-03-27 파브리병을 치료하기 위한 조성물, 디바이스 및 방법 KR20220023962A (ko)

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