KR20210005178A - X-연관 고 igm 증후군에서의 치료적 게놈 편집 - Google Patents

X-연관 고 igm 증후군에서의 치료적 게놈 편집 Download PDF

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KR20210005178A
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데이비드 제이. 롤링스
다니엘 톰슨
이람 에프. 칸
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시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트
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Abstract

X-연관 고 IgM 증후군 (X-HIGM)을 치료, 억제 또는 호전시키는 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 확인 또는 선택된 대상체에서 X-HIGM을 치료, 억제 또는 호전시키기 위한 조성물, 시스템 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 시스템은 내인성 CD40LG 유전자좌를 변형시키도록 공동전달을 위해 구성된 뉴클레아제 및 벡터 공여자 구축물을 포함한다.

Description

X-연관 고 IGM 증후군에서의 치료적 게놈 편집
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 발명의 명칭이 "X-연관 고 IGM 증후군에서의 치료적 게놈 편집"인 2019년 4월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/663485를 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 명시적으로 포함된다.
<서열 목록에 대한 참조>
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2019년 4월 16일에 생성된 파일명 SCRI192WOSEQLIST의 파일로서 제공되며, 이는 크기가 대략 101 Kb이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<발명의 기술분야>
본원에 제공된 개시내용의 측면은 일반적으로 엔도뉴클레아제-기반 유전자 편집 시스템 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원의 대안은 유전자의 효율적인 상동성 지정 복구를 제공하도록 구성된 핵산 및 벡터, 및 유전적 결핍, 예컨대 X-연관 고 IgM 증후군을 복구하는 방법에 관한 것이다.
<배경>
X-연관 고 IgM 증후군 (X-HIGM)은 CD40LG 유전자에서 불활성화 돌연변이에 의해 야기되는 열성 1차 면역결핍이다. 환자는 클래스-스위치 기억 B 세포 및 이뮤노글로불린 G, A 및 E (IgG, IgA 및 IgE)가 결여되어 재발 및 기회 감염에 걸리기 쉽다 (Allen, R.C., et al., Science, 1993. 259(5097): p. 990-993; Aruffo, A., et al., Cell, 1993. 72(2): p. 291-300; Korthauer, U., et al., Nature, 1993. 361(6412): p. 539; Winkelstein, J.A., et al., Medicine, 2003. 82(6): p. 373-384). X-HIGM은 현재 이뮤노글로불린 대체 요법 또는 동종이계 골수 이식으로 치료된다. 그러나, 두 옵션 모두에 합병증이 존재하고, 골수 이식이 치유적이지만, 많은 환자에게는 적합한 공여자가 부족하다 (de la Morena, M.T., et al., J Allergy Clin Immunol, 2017. 139(4): p. 1282-1292).
엔도뉴클레아제-기반 시스템은 생물의학 연구에서 빠르게 유의한 유전자 편집 도구가 되었으며, 유전자 파괴 및/또는 유전자 표적화에 대한 그의 적용은 다양한 배양된 세포 및 모델 유기체 시스템에서 입증되었다.
유전자 편집을 위한 엔도뉴클레아제-기반 시스템은 과학자들이 전례없는 정확성, 효율 및 유연성으로 게놈을 편집하는 것을 허용한다. 유전자 편집을 위한 엔도뉴클레아제-기반 접근법의 예는 제한 없이, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제 (예컨대 MegaTAL) 및 CRISPR/Cas9를 포함하는 시스템을 포함한다. X-HIGM을 억제 및/또는 치료하기 위한 더 많은 접근법에 대한 필요성은 명백하다.
<요약>
본원에 제공된 일부 실시양태는 X-연관 고 IgM 증후군의 치료적 게놈 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태는 (i) 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계, 및 (ii) 주형 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포에서 CD40LG 유전자를 편집하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호(SEQ ID NO):12의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호:12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계는 세포를 CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 리보핵단백질 (RNP)과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 0.1:1 내지 1:10의 비율을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1:1 내지 1:5의 비율을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 약 1:1.2의 비율을 갖는다.
일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 CD40LG 유전자의 적어도 일부 또는 그의 상보체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 야생형 CD40LG 유전자의 적어도 일부 또는 그의 상보체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 CD40LG 유전자의 적어도 약 1 kb를 포함한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터이다.
일부 실시양태에서, 단계 (i)은 단계 (ii) 전에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (i) 및 (ii)는 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 뉴클레오펙션을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오펙션을 수행하는 것은 론자(LONZA) 시스템의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 구형파 펄스의 사용을 포함한다.
일부 실시양태는 또한 세포를 IL-6과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-6은 약 20 ng/ml 내지 약 500 mg/ml 또는 20 ng/ml 내지 500 mg/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-6은 약 50 ng/ml 내지 약 150 mg/ml 또는 50 ng/ml 내지 150 mg/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-6은 약 100 mg/ml 또는 100 mg/ml의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 SFEMII 배지에서 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 세포를 포함하고, 집단은 약 1 X 105개 세포/ml 내지 약 1 X 106개 세포/ml 또는 1 X 105개 세포/ml 내지 1 X 106개 세포/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 집단은 약 1 X 105개 세포/ml 내지 약 5 X 105개 세포/ml 또는 1 X 105개 세포/ml 내지 5 X 105개 세포/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 집단은 약 2.5 X 105개 세포/ml 또는 2.5 X 105개 세포/ml의 농도를 갖는다.
일부 실시양태는 또한 단계 (i) 및 (ii)가 수행된 후 세포 집단을 희석하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 단계 (i) 및 (ii)가 수행된 후 약 16시간 또는 16시간에 희석된다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 약 250,000개 세포/ml 또는 250,000개 세포/ml로 희석된다.
일부 실시양태는 또한 세포를 줄기 세포 인자 (SCF), FMS-유사 티로신 키나제-3 (Flt-3), 트롬보포이에틴 (TPO), TPO 수용체 효능제, UM171 또는 스템레게닌 (SR1)과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TPO 수용체 효능제는 엘트롬보팍(Eltrombopag)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 세포를 HDM2 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, HDM2 단백질은 약 1 nM 내지 약 50 nM 또는 1 nM 내지 50 nM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, HDM2 단백질은 약 6.25 nM 내지 약 25 nM 또는 6.25 nM 내지 25 nM의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 적어도 약 1000 MOI 또는 1000 MOI의 AAV와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포는 적어도 약 2500 MOI 또는 2500 MOI의 AAV와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 세포는 적어도 약 100 μg/ml 또는 100 μg/ml의 RNP와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포는 적어도 약 200 μg/ml 또는 200 μg/ml의 RNP와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 약 1,000,000개 세포/20 μl 뉴클레오펙션 반응물 또는 1,000,000개 세포/20 μl 뉴클레오펙션 반응물을 접촉시키는 것을 포함하며, 뉴클레오펙션 반응물은 gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오펙션 반응은 약 1 ml 또는 1 ml의 부피에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 세포는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간이다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, CD40LG 유전자는 서열식별번호:13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다.
일부 실시양태는 CD40LG 유전자의 상동성 지정 복구 (HDR)를 위한 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 CD40LG 유전자를 코딩하는 제1 서열, 하나 이상의 가이드 RNA 절단 부위를 코딩하는 제2 서열, 및 하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위를 코딩하는 제3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD40LG 유전자는 서열식별번호: 13에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 서열은 서열식별번호: 12에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위는 정방향 및 역방향 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 결합 부위는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복 (CRISPR) 연관 단백질 9 (Cas9) 결합 부위이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 인핸서 요소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 상동성 아암 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 세포에서 CD40L 단백질 발현의 HDR을 촉진하기 위한 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 CD40LG 유전자를 코딩하는 제1 서열, 하나 이상의 가이드 RNA 절단 부위를 코딩하는 제2 서열, 및 하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위를 코딩하는 제3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD40LG 유전자는 서열식별번호: 13에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 서열은 서열식별번호: 12에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위는 정방향 및 역방향 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 결합 부위는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 연관 단백질 9 (Cas9) 결합 부위이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 인핸서 요소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자기-상보적 AAV (scAAV)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ HSC이다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 세포에서 CD40L 단백질 발현의 HDR을 촉진하기 위한 시스템에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 벡터 및 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALEN 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 벡터 및 핵산은 세포로의 공동전달을 위해 구성된다. 일부 실시양태에서, 세포로의 공동전달은 내인성 CD40LG 유전자좌를 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 인간 조혈 세포이다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 CD40L을 발현하기 위한 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD40LG 유전자를 코딩하는 제1 서열, 프로모터를 코딩하는 제2 서열, 하나 이상의 가이드 RNA 절단 부위를 코딩하는 제3 서열, 및 하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위를 코딩하는 제4 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 벡터 내에 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV이다. 일부 실시양태에서, AAV는 scAAV이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 HSC이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ HSC이다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 CD40LG 유전자의 HDR 촉진을 필요로 하는 대상체에서 CD40LG 유전자의 HDR을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 대상체에게 투여하는 단계 및 뉴클레아제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALEN 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 세포 또는 벡터와 함께 대상체에게 공동투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터의 것이고, 여기서 세포는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 세포에 도입함으로써 유전자 변형된다. 일부 실시양태에서, 투여는 입양 세포 전달에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 HSC이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ HSC이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 남성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 X-연관 고 IgM (X-HIGM) 증후군을 앓는다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 X-연관 고 IgM 증후군 (X-HIGM) 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상의 치료, 억제 또는 호전을 필요로 하는 대상체에서 X-연관 고 IgM 증후군 (X-HIGM) 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상을 치료, 억제 또는 호전시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 대상체에게 투여하는 단계 및 뉴클레아제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 X-HIGM 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상을 위한 요법을 받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 대상체를 확인하고/거나, 임의로 상기 대상체에서 X-HIGM 진행의 개선 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상의 개선을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALEN 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 세포 또는 벡터와 함께 대상체에게 공동투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터의 것이고, 여기서 세포는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 세포에 도입함으로써 유전자 변형된다. 일부 실시양태에서, 투여는 입양 세포 전달에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 HSC이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ HSC이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 남성이다. 일부 실시양태에서, 방법은 박테리아성 또는 기회 감염을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 간헐성 호중구감소증을 감소시킨다.
도 1은 CD40LG 유전자의 돌연변이로 인해 IgM이 정상-상승되고, IgG가 낮고, IgE 또는 IgA가 없음을 나타내는 개략도이다. X-연관 고 IgM (X-HIGM) 환자는 박테리아성/기회 감염 및 간헐성 호중구감소증을 앓는다.
도 2는 엑손 및 번역 시작 부위에 비해 리보핵단백질 (RNP) 인식 부위를 나타내는 인간 CD40LG 유전자좌를 나타내는 개략도를 도시하고, 또한 프로모터-적은 CD40L cDNA 및 키메라 3'UTR을 갖는 AAV 공여자 주형을 도시하고; 음영 파선은 CD40LG 상동성의 위치를 나타낸다. Talen 및 CRISPR 뉴클레아제 부위 및 1 Kb CD40LG 상동성 아암을 갖는 AAV6 공여자 주형이 또한 표시된다. 표적화 구축물은 뉴클레아제에 의해 절단불가능하게 만드는 5' UTR의 결실을 함유한다. MND 프로모터는 CD40LG 유전자좌가 조혈 줄기 세포 (HSC)에서 침묵하므로 편집 사건의 추적을 허용한다.
도 3은 CD34+ 세포 편집 프로토콜 방법의 대안의 개략도이다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 동원된 성인 공여자로부터 농축된 동결보존된 CD34+ 세포를 해동하고, 무혈청 줄기 세포 성장 배지 [트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자 및 FLT3 리간드 (페프로텍(PeproTech))(모두 100 ng/ml)를 갖는 셀제닉스(CellGenix) GMP SCGM 배지 (셀제닉스 인크.(CellGenix Inc.))]에 1 x 106개 세포/ml로 플레이팅하였다. IL-3 (60 ng/ml) 또는 IL-6 (100 ng/ml) 중 하나를 나타낸 바와 같이 배지에 첨가하였다. CD34+ 세포를 배지에서 48시간 동안 37℃에서 사전자극한 후, Neon 형질감염 시스템으로 전기천공하였다. 1000 내지 5000의 MOI에서 공여자 주형 AAV를 갖는 400 μL의 배지를 함유하는 24 웰 플레이트에 세포를 분배하였다. 전기천공 및 AAV 형질도입 24시간 후, AAV 함유 배지를 제거하고, 신선한 줄기 세포 성장 배지로 대체하였다. 편집 후 2 및 5일차에 생존율 및 GFP의 분석을 수행하였다.
도 4a 및 도 4b는 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 CD40LG 유전자좌에 GFP 리포터를 도입하기 위한 효율적인 편집의 결과를 도시한다. 도 4a는 편집 2 및 5일 후 생존율 (왼쪽 컬럼) 및 GFP 발현 (오른쪽 컬럼)에 대한 게이팅을 나타내는 모의, 1000 MOI의 AAV 단독, 및 1000 MOI의 AAV + 50 μg/ml TALEN 또는 100 μg/ml RNP 조건에 대한 대표적인 유동 세포계측법 플롯을 도시한다. 도 4b는 세포 생존율 및 % GFP를 도시한다. 막대 그래프는 편집 2일 후 전방 및 측면 산란 기반 생존율 (왼쪽) 및 편집 5일 후 유동 세포계측법에 의해 측정된 바와 같은 편집된 세포 백분율 (% GFP+) (오른쪽)을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. (N=9 4명의 고유한 공여자를 사용한 복제).
도 5는 MND.GFP 리포터 (서열식별번호: 14)의 온-타겟 통합의 확인을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 막대 그래프는 ddPCR 또는 FACS에 의해 결정된 바와 같은 CD34+ 공여자에서 MND.GFP 리포터를 사용한 편집 비율을 나타낸다. 세포를 IL-6을 함유하는 배지에서 성장시키고 2500 MOI의 MND.GFP AAV6 및 200 μg/ml RNP로 처리하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (N=2 2명의 상이한 공여자를 사용한 복제).
도 6a, 도 6b, 도 6c 및 도 6d는 NSG 마우스를 이식하는데 사용된 세포 상의 메틸셀룰로스 콜로니 형성 단위 검정의 결과를 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 도 6a는 메틸셀룰로스에 500 모의 또는 AAV + RNP 처리된 세포를 플레이팅한 14일 후 계수된 유형별 총 콜로니 수를 나타낸다. 도 6b는 콜로니 유형별 총 GFP+ 콜로니를 나타낸다. 도 6c는 각 콜로니 유형에 대한 GFP+ 세포 백분율을 나타낸다. 도 6d는 FACS에 의해 결정된 바와 같은 HDR-편집된 세포 백분율을 나타낸다.
도 7a, 도 7b, 도 7c, 도 7d, 도 7e, 도 7f는 배양 배지에 IL-3 및 IL-6의 첨가를 비교하는 대표적인 결과를 도시한다. 대표적인 FACS 플롯은 AAV + RNP로 처리 24시간 후 60 ng/ml IL-3 (도 7a) 또는 100 ng/ml IL-6 (도 7b)을 함유하는 배지에서 성장한 세포를 도시한다. 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: 전방/측면 산란, CD34+CD38- 염색, 및 CD133+CD90+ (LT-HSC) 염색에 의해 측정된 세포 생존율. 하단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: 모든 생존 세포 중 GFP 발현, 생존 CD34+CD38- 세포 중 GFP 발현, 및 CD34+CD38-CD133+CD90+ 세포 중 GFP 발현. 도 7c는 편집 48시간 후 전방/측면 산란에 의해 측정된 세포 생존율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 1K MOI의 AAV를 받은 세포를 100 ng/ml RNP로 전기천공하고, 2.5K MOI의 AAV를 받은 세포를 200 μg/ml RNP로 전기천공하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 7d는 편집 5일 후 % GFP+에 의해 측정된 HDR-편집된 세포의 백분율을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 7e는 편집 48시간 후 CD34+CD38-CD133+CD90+를 염색하는 세포의 백분율을 도시한다. 상이한 공여자가 CD34+CD38-CD133+CD90+ 염색에서 상당히 다양하기 때문에 데이터는 모의에 비해 배수 변화의 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 7f는 편집 48시간 후 CD34+CD38-CD133+CD90+ 세포 내 GFP+의 백분율을 도시한다 (N=3 공여자, 3개 복제물).
도 8은 인간 코돈-최적화된 CD40L cDNA, WPRE3 요소 및 합성 폴리아데닐화 서열에 플랭킹한 동일한 1 kb 상동성 아암을 함유하는 AAV 공여자 주형을 나타내는 개략도를 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 편집된 세포에서 cDNA의 표적화된 통합의 결과를 도시한다. 도 9a는 모의, AAV 단독, 또는 AAV + RNP 처리된 세포에 대한 편집 48시간 후 유동 세포계측법에 의해 측정된 바와 같은 세포 생존율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다 (FSC/SSC 살아있는 세포 게이트). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 9b는 ddPCR에 의해 결정된 바와 같은 CD34+ 공여자에서의 편집 비율을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다 (N=2 공여자, 3개 복제).
도 10a 및 도 10b는 NSG 마우스로의 투입 이식을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 도 10a는 NSG 생착 실험으로부터 시험관내 유지된 세포의 서브세트에 대한 편집 2일 후 (및 이식 1일 후) 측정된 세포 생존율을 나타낸다. 도 10b는 시험관내 유지된 생착 실험으로부터 세포에 대한 HDR 비율 (5일차에 측정된 % GFP+)을 나타낸다. 표시된 모든 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 11은 NSG 골수 및 비장으로부터 수확된 세포에 대한 예시적인 게이팅 전략을 도시한다. 림프구 및 과립구 집단을 크기 (전방 산란) 및 입상도 (측면 산란)에 기초하여 구별하였다. 그 후, 이들 두 주요 집단을 세포-유형 특이적 표면 마커의 발현에 의해 정의된 바와 같이 별도의 계통으로 나누었다. 각 세포 유형 내의 GFP 발현이 표시된다. 비장 샘플의 경우, 과립구 집단 및 CD34+/CD38- 집단은 분석되지 않았다.
도 12a, 도 12b, 도 12c, 도 12d, 도 12e는 NSG 마우스의 골수에서 편집된 세포의 생착 결과를 도시한다. 도 12a 및 도 12b는 도 11에 기재된 게이팅 전략을 사용하여 이식 16주 후 NSG 마우스의 골수로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯을 도시한다. 도 12a는 비처리된 세포로 이식된 마우스로부터 수확된 골수를 나타낸다. 도 12b는 2.5K MOI AAV + 200 μg/ml RNP로 처리된 세포로 이식된 마우스로부터 수확된 골수를 나타낸다. 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45:mCD45 키메리즘, 인간 CD45-게이팅된 CD33+, CD19+ 및 CD34+ 염색. 하단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45+, CD33+, CD19+ 및 CD34+ 세포 중 GFP 발현. 도 12c는 모의, 1K MOI AAV + 100 μg/ml RNP, 또는 2.5K MOI AAV + 200 μg/ml RNP 처리된 세포로 이식된 NSG 마우스의 골수에서의 총 hCD45+ 생착을 나타낸다. 점은 개별 마우스를 나타낸다. 그래프에 표시된 평균 ± SEM. 도 12d는 총 hCD45+ 집단의 HDR 백분율-편집된 세포 (GFP+)를 나타낸다. 점은 개별 마우스를 나타낸다. 그래프에 표시된 평균 ± SEM. 도 12e는 총 hCD45+ 집단에서의 CD33+ 세포 및 CD19+ 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 이원 ANOVA에 의해 결정된 유의성.
도 13a, 도 13b, 도 13c, 도 13d, 도 13e, 도 13f, 도 13g는 NSG 마우스에서 편집된 세포의 생착에 대한 소분자의 영향을 나타내는 결과를 도시한다. 도 13a는 전방/측면 산란에 의해 결정된 편집 48시간 후 세포 생존율의 막대 그래프를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 13b는 평균 ± SEM으로 표시된 편집 48시간 후 LT-HSC의 백분율을 나타낸다. N=2 공여자, 3개 복제. 도 13c는 UM171 및 SR1을 함유하는 배양 배지에서 성장하고 AAV + RNP로 처리된 CD34+ 세포의 이식 16주 후 NSG 마우스의 골수로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯을 도시한다. 도 13d는 모의 또는 편집된 (2.5K MOI AAV + 200 μg/ml RNP 처리된) 세포로 이식 12-16주 후 NSG 마우스의 골수에서의 총 hCD45+ 생착을 나타낸다. 이식 전, 세포를 표시된 소분자의 다양한 조합을 함유한 배지에서 성장시켰다. 각 점은 개별 마우스를 나타낸다. 표시된 평균 ± SEM. 도 13e는 NSG 마우스의 골수로부터 회수된 hCD45+ 세포 중 HDR-편집 비율 (% GFP+)을 나타낸다. 그래프에 표시된 평균 ± SEM. 도 13f는 골수로부터 회수된 총 hCD45+ 세포 중 백분율 CD33+ 또는 CD19+를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 이원 ANOVA에 의해 결정된 유의성. 도 13g는 NSG 마우스의 골수로부터 회수된 CD19+ 세포, CD33+ 세포, 및 CD34+ 세포 중 HDR-편집 비율 (% GFP+)을 나타낸다. 대응표본 T-검정에 의해 결정된 유의성.
도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d는 NSG 마우스의 비장에서 편집된 세포의 생착 결과를 도시한다. 도 14a 및 도 14b는 이식 16주 후 NSG 마우스의 비장으로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯을 나타낸다. 도 14a의 유동 플롯은 모의-처리 세포로 이식된 마우스로부터 나온 것이다. 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45:mCD45 키메리즘, 및 인간 CD33+ 및 CD19+ 염색. 하단 행 플롯은 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45+ 세포, CD33+ 세포, 및 CD19+ 세포 중 GFP 발현을 나타낸다. 도 14b의 유동 플롯은 2.5K MOI AAV + 200 μg/ml RNP로 처리된 세포로 이식된 마우스로부터 나온 것이다. 도 14c는 모의, 1K MOI AAV + 100 μg/ml RNP, 또는 2.5K MOI AAV + 200 μg/ml RNP 처리된 세포로 이식된 NSG 마우스의 비장에서의 총 hCD45+ 생착을 나타낸다. 각 점은 개별 마우스를 나타낸다. 그래프에 표시된 평균 ± SEM. 도 14d는 총 hCD45+ 집단 중 HDR 백분율-편집된 세포를 나타낸다. 평균 ± SEM이 그래프에 표시된다.
도 15a, 도 15b, 도 15c, 도 15d, 도 15e는 시험관내 소분자 UM171 및 SR1의 효과를 나타낸다. 도 15a 및 도 15b는 UM171 및 SR1의 부재 (도 15a) 또는 존재 (도 15b) 하에 성장된 세포에 대한 염색 및 GFP 발현을 나타내는 LT-HSC의 편집 후 48시간으로부터의 대표적인 유동 플롯을 도시한다. 상단 행 플롯, 왼쪽으로부터: 플롯상의 숫자는 전방/측면 산란에 의해 정의된 생존 세포, 모든 생존 세포에 게이팅된 CD34+CD38- 집단, 및 CD34+/CD38- 집단 내의 CD133+CD90+ 세포를 나타낸다. 히스토그램은 살아있는 세포 내의 GFP고를 도시한다. 하단 행 플롯, 왼쪽으로부터: 히스토그램은 모든 살아있는 세포, CD34+CD38- 및 CD34+CD38-CD133+CD90+ 세포 중 GFP고 세포를 나타낸다. 도 15c는 편집 48시간 후 표시된 그룹의 벌크 집단에서 GFP 발현을 나타내며, 이는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 15d는 편집 48시간 후 LT-HSC로서 염색된 세포 중 GFP 발현을 나타낸다. 도 15e는 편집 5일 후 GFP 발현에 의해 측정된 바와 같은 HDR-편집 비율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 16a, 도 16b, 도 16c, 도 16d, 도 16e, 도 16f, 도 16g는 편집된 세포의 생착에 대한 엘트롬보팍의 영향을 나타낸다. 도 16a는 3 μg/ml 엘트롬보팍의 존재 또는 부재 하에 성장된 모의 또는 1K MOI AAV + 100 μg/ml RNP 처리된 세포에 대한 편집 48시간 후 세포 생존율을 도시하는 막대 그래프를 표시한다. 표시된 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 도 16b는 편집 5일 후 FACS에 의해 측정된 바와 같은 HDR의 비율 (%GFP+)을 나타낸다. 표시된 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 도 16c는 편집 48시간 후 LT-HSC의 백분율을 나타내며, 이는 평균 ± SEM으로 표시된다. 도 16d는 세포 이식 12주 후 NSG 마우스의 골수에서의 인간 CD45 생착을 나타낸다. 각 점은 개별 마우스를 나타내며, 평균으로 표시된다. 도 16e는 NSG 마우스의 골수로부터 수확된 인간 세포 중 HDR의 비율 (% GFP+)을 나타낸다. 도 16f는 세포 이식 12주 후 NSG 마우스의 비장에서의 hCD45+ 생착을 나타낸다. 도 16g는 NSG 마우스의 비장으로부터 수확된 인간 세포 중 HDR의 비율 (% GFP+)을 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 편집된 세포의 생착에 대한 편집 후 배양 시간의 영향을 도시한다. CD34+ 세포를 편집 1, 2 또는 4일 후 마우스에 이식하였다. 도 17a는 세포 이식 12주 후 NSG 마우스의 골수에서의 인간 CD45 생착을 나타낸다. 각 점은 개별 마우스를 나타내며, 평균으로 표시된다. 도 17b는 NSG 마우스의 골수로부터 수확된 인간 세포 중 HDR의 비율 (% GFP+)을 나타낸다.
도 18은 NSGW41 수용자 마우스의 골수로부터 회수된 총 인간 세포에 대한 CD34+ 세포의 48- 및 72-시간 사전자극의 효과의 비교를 도시한다.
도 19는 W41 마우스의 골수에서 편집된 (GFP+) 세포의 생착에 대한 CD34+ 세포의 48- 및 72-시간 사전자극의 효과의 비교를 도시한다.
도 20은 W41 마우스의 비장에서 총 인간 세포 생착에 대한 CD34+ 세포의 48- 및 72-시간 사전자극의 효과의 비교를 도시한다.
도 21은 NSGW41 마우스의 비장에서 편집된 (GFP+) 세포의 생착에 대한 CD34+ 세포의 48- 및 72-시간 사전자극의 효과의 비교를 도시한다.
도 22는 프로토콜 A 및 B를 사용하여 확립된 생체내 실험 연구의 설계를 나타내는 개략도를 도시한다.
도 23은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 hCD45+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 24는 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 총 hCD45+ 세포 중 GFP+ 백분율의 비교를 도시한다.
도 25는 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 생착된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD19+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 26은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD19+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 27은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 생착된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD33+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 28은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 생착된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD33+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 29는 이식 16주 후 NSGW41 마우스의 골수로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯을 도시한다. 상부 패널은 모의 비처리된 세포로 이식된 마우스로부터 수확된 골수를 나타낸다: 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45:mCD45 키메리즘, 인간 CD45-게이팅된 CD33+ 및 CD19+ 염색; 및 하단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45+, CD33+ 및 CD19+ 세포 중 GFP 발현. 하부 패널은 AAV + RNP로 처리된 세포로 이식된 마우스로부터 수확된 골수를 나타낸다: 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45:mCD45 키메리즘, 인간 CD45-게이팅된 CD33+ 및 CD19+ 염색; 및 하단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45+, CD33+ 및 CD19+ 세포 중 GFP 발현. GFP+ 인간 세포는 CD40L 유전자좌의 HDR-편집으로 장기간 인간 HSC의 지속적인 생착과 일치하는 모든 조혈 계통에 존재하였다.
도 30은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 31은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 32는 론자 시스템에서 다양한 뉴클레오펙션 프로그램 대 NEON 시스템에서 전기천공을 사용한 세포 생존율의 비교를 도시한다. 단일 CD34+ 공여자로부터의 데이터가 막대 그래프에 표시된다.
도 33은 론자 시스템에서 다양한 뉴클레오펙션 프로그램 대 NEON 시스템에서 전기천공을 사용한 HDR 백분율 (GFP 발현)의 비교를 도시한다. 단일 CD34+ 공여자로부터의 데이터가 막대 그래프에 표시된다.
도 34는 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD19+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 35는 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD19+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 36은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD33+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 37은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD33+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 38은 이식 16주 후 NSGW41 마우스의 비장으로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯을 도시한다. 상부 패널은 모의 비처리된 세포로 이식된 마우스로부터 수확된 비장을 나타낸다: 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45:mCD45 키메리즘, 인간 CD45-게이팅된 CD33+ 및 CD19+ 염색; 하단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45+, CD33+ 및 CD19+ 세포 중 GFP 발현. 하부 패널은 AAV + RNP로 처리된 세포로 이식된 마우스로부터 수확된 비장을 나타낸다: 상단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45:mCD45 키메리즘, 인간 CD45-게이팅된 CD33+ 및 CD19+ 염색; 및 하단 행, 왼쪽에서 오른쪽으로: hCD45+, CD33+ 및 CD19+ 세포 중 GFP 발현. GFP+ 인간 세포는 CD40L 유전자좌의 HDR-편집으로 인간 HSC로부터의 이들 세포의 유도와 일치하는 모든 조혈 계통에 존재하였다.
도 39는 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD34+CD38저 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 40은 프로토콜 A (점) 또는 B (사각형)를 사용하여 배양된 CD34 + 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD34+CD38저 CD45+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율의 비교를 도시한다.
도 41은 모의 또는 편집된 세포로 이식된 NSGW41 마우스로부터의 총 인간 CD45+ 세포 상에 게이팅된 CD34+의 대표적인 유동 세포계측법 분석을 도시한다.
도 42는 재조합 HDM2의 뉴클레오펙션에 의한 HDR 비율의 개선을 도시한다.
<상세한 설명>
다음 상세한 설명에서, 그 일부를 형성하는 첨부된 도면을 참조한다. 도면에서, 유사한 기호는 문맥에서 달리 언급하지 않는 한 전형적으로 유사한 구성성분을 확인한다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 기재된 예시적인 대안은 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본원에 제시된 주제의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 다른 대안이 이용될 수 있고 다른 변화가 이루어질 수 있다. 본원에 일반적으로 기재되고 도면에 예시된 바와 같이 본 개시내용의 측면은 다양한 상이한 구성으로 배열, 치환, 조합, 분리 및 설계될 수 있으며, 이들 모두가 본원에서 명백하게 고려된다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
<정의>
다음 설명에서, 수많은 용어가 광범위하게 사용된다. 다음 정의는 본 대안에 대한 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속한 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)]을 참조한다. 본 개시내용의 목적을 위해 다음 용어가 아래 정의된다.
"단수 형태"는 하나 또는 하나 초과 (예를 들어, 적어도 하나)의 그의 문법적 대상을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"약"은 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 많이 다양한 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 과도기적 문구에서든 또는 청구범위의 본문에서든, 용어 "포함하다" 및 "포함하는(comprising)"은 개방형 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 용어는 문구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는(including)"과 동의어로 해석되어야 한다. 프로세스의 맥락에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 프로세스가 적어도 인용된 단계를 포함하지만 추가 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용될 때, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 인용된 특징 또는 구성성분을 포함하지만 또한 추가의 특징 또는 구성성분을 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 기재된 바와 같이, 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. "동물"은 냉혈 및 온혈 척추동물 및 무척추동물, 예컨대 어류, 갑각류, 파충류 및, 특히, 포유동물을 포함한다. "포유동물"은 제한 없이, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 및 유인원, 및 특히, 인간을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
본원에 개시된 일부 대안은 필요로 하는 대상체 또는 환자를 선택하는 것에 관한 것이다. 일부 대안에서, 질환 증상의 치료, 호전, 억제, 진행 또는 개선을 필요로 하거나 치유 요법을 필요로 하는 환자가 선택된다. 일부 대안에서, X-연관 고 IgM 증후군 (X-HIGM)의 증상을 갖거나, X-HIGM으로 진단되었거나, X-HIGM을 갖는 것으로 의심되는 환자가 선택된다. 필요로 하는 상기 대상체 또는 환자의 이러한 확인 또는 선택은 임상적 및/또는 진단적 평가를 통해 이루어질 수 있다.
X-HIGM은 CD40LG 유전자의 돌연변이의 결과로서 결손 CD40 신호전달을 특징으로 하는 1차 면역 결핍 장애를 지칭한다. 세포 표면 분자 CD40은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원이며, 면역, 조혈, 혈관, 상피, 및 광범위한 종양 세포를 포함하는 기타 세포에 의해 광범위하게 발현된다. CD40 자체에는 내인성 키나제 또는 다른 신호 형질도입 활성이 없지만, 세포 유형 및 미세환경에 따라 유전자 발현을 다르게 변경하는 복잡한 일련의 하류 어댑터 분자를 통해 다양한 효과를 매개한다. 신규 암 요법의 잠재적 표적으로서, CD40은 면역 활성화의 간접적 효과 및 CD40-발현 종양에 대한 직접적인 세포독성 효과 둘 모두를 통해 종양 퇴행을 매개할 수 있다.
CD40은 B 림프구, 수지상 세포 및 단핵구 상의 그의 발현을 통해 세포성 및 체액성 면역의 중요한 조절인자로 공지되어 있다 (Grewal and Flavell, Annu Rev Immunol., 16:111 (1998); van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000)).
CD40은 또한 내피 세포, 섬유모세포, 조혈 선조, 혈소판 및 기저 상피 세포를 포함하는 많은 다른 비면역 세포의 세포 표면 상에 발현된다 (Grewal and Flavell, Annu Rev Immunol., 16:111 (1998); van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000); Young et al., Immunol Today, 9:502 (1998); Quezada et al., Annu Rev Immunol., 22:307 (2004)). CD154로도 공지된 CD40 리간드 (CD40L)는 CD40에 대해 설명된 주요 리간드이며, 주로 활성화된 T 림프구 및 혈소판에 의해 발현된다 (van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000); Armitage et al., Nature, 357:80 (1992)). 죽상경화증, 이식 거부, 응고, 감염 제어 및 자가면역은 모두 CD40-CD40L 상호작용에 의해 조절된다 (Grewal and Flavell, Annu Rev Immunol., 16:111 (1998); van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000)).
용어 "공동자극성 분자"는 임의의 단일 분자 또는 분자들의 조합을 포함하며, 이는 T 세포 표면 상의 T 세포 항원 수용체 (TCR)에 의해 결합된 MHC/펩티드 복합체와 함께 작용할 때 펩티드에 결합하는 I 세포의 활성화를 달성하는 공동자극 효과를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 대상체, 특히 X-HIGM을 앓는 대상체에 의해 나타나는 질환, 장애 또는 생리적 상태에 대한 반응으로 이루어지는 개입을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 치료의 목적은 증상의 경감 또는 예방, 질환, 장애 또는 상태의 진행의 늦춤 또는 중지 또는 악화, 질환, 장애 또는 상태의 치유적 치료, 및 질환, 장애 또는 상태의 관해 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, "치료"는 기저 질환의 치료 또는 질환 증상의 치료 둘 모두를 지칭한다. 예를 들어, 일부 대안에서, 치료는 질환의 증상(들)을 감소, 경감, 호전 또는 근절하고/거나 질환의 치유 요법을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 "입양 세포 요법" 또는 "입양 세포 전달"은 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 면역학적 기능성 및 특징을 새로운 숙주로 전달하는 것을 목표로 세포, 가장 일반적으로 면역-유래 세포를 동일한 환자 또는 새로운 수용자 숙주로 역으로 전달하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 입양 세포 요법 또는 입양 세포 전달은 대상체에서 CD40LG 유전자의 상동성 지정 복구를 촉진하기 위한 세포 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성-지정 복구" (HDR)는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, DNA의 이중-가닥 파단 (DSB)의 복구 동안 예를 들어, 세포에서 일어나는 DNA 복구를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. HDR은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, DSB (예를 들어, 표적 DNA 서열 내)가 발생한 서열을 복구하기 위해 공여자 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 DSB를 플랭킹하는 서열과 필요한 서열 상동성을 가져서, 공여자 폴리뉴클레오티드가 복구에 적합한 주형으로 작용할 수 있다. HDR은 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드로부터 DNA 표적 서열로의 유전적 정보의 전달을 초래한다. HDR은 공여자 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 표적 서열과 상이하고 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 DNA 표적 서열에 혼입되는 경우 DNA 표적 서열의 변경 (예를 들어, 삽입, 결실, 돌연변이)을 초래할 수 있다. 일부 대안에서, 전체 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피는 DNA 표적 서열의 부위에서 통합된다.
본원에 사용된 바와 같은 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 핵산 분자는 자연-발생 뉴클레오티드 (예컨대 DNA 및 RNA), 또는 자연-발생 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 자연-발생 뉴클레오티드의 거울상이성질체 형태), 또는 둘 모두의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티의 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 하나 이상의 히드록실 기를 할로겐, 알킬 기, 아민 및 아지도 기로 대체하는 것을 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로 관능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 모이어티는 입체적이고 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 또는 카보시클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 공지된 헤테로시클릭 치환체를 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트 또는 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 소위 "펩티드 핵산"을 포함하며, 이는 폴리아미드 백본에 부착된 자연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 서열은 서열식별번호로 본원에 기재될 수 있고, 본 출원 전반에 걸쳐 기재되고 부록 I에 포함된다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1-9 또는 12-27 중 어느 하나의 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합" 또는 "융합된"은 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 제1 핵산의 3' 말단에 있는 코딩 서열이 제2 핵산의 5' 말단에 있는 코딩 서열과 프레임에 있도록 포스포디에스테르 결합에 의해 제2 핵산에 연결된 제1 핵산을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 더 나아가 제1 폴리펩티드의 C-말단에서 제2 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결된 제1 폴리펩티드를 추가로 지칭할 수 있다. 이와 같이, 본원에 사용된 바와 같은 "융합된" (또는 "그의 융합체") 핵산 또는 펩티드는 분자의 구성을 지칭하며, 반드시 두 분자를 함께 연결하는 작용을 수행하는 것을 포함하는 것은 아니다. 예를 들어, 제2 핵산으로의 제1 핵산의 융합은 제1 폴리펩티드 서열 (제1 핵산에 의해 코딩됨)이 제2 폴리펩티드 서열 (제2 핵산에 의해 코딩됨)에 융합된 단일 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 대안에서, 융합된 핵산을 포함하는 분자는 융합 핵산으로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 참조 폴리뉴클레오티드 (또는 폴리펩티드)와 실질적으로 유사한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (또는 폴리펩티드)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 변이체는 참조 폴리뉴클레오티드와 비교하여 5' 말단, 3' 말단, 및/또는 하나 이상의 내부 부위에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 첨가를 가질 수 있다. 변이체 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이의 서열의 유사성 및/또는 차이는 관련 기술분야에 공지된 통상적인 기술, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 또한 합성적으로 유래된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 생성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, DNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴리뉴클레오티드의 변이체는 통상의 기술자에 의해 공지된 서열 정렬 프로그램에 의해 결정된 바와 같은 참조 폴리뉴클레오티드와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖거나, 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 양을 가질 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 변이체는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가를 가질 수 있다. 변이체 및 참조 폴리펩티드 사이의 서열의 유사성 및/또는 차이는 관련 기술분야에 공지된 통상적인 기술, 예를 들어 웨스턴 블롯을 사용하여 검출될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 변이체는 통상의 기술자에 의해 공지된 서열 정렬 프로그램에 의해 결정된 바와 같은 참조 폴리펩티드와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖거나, 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 양을 가질 수 있다.
"조절성 요소"는 코어 프로모터의 활성을 조정하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 조절성 요소는 특정 세포, 조직, 또는 소기관에서 배타적으로 또는 우선적으로 전사를 가능하게 하는 세포 인자와 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이들 유형의 조절성 요소는 "세포-특이적", "조직-특이적" 또는 "소기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 정상적으로 연관된다. 일부 대안에서, 세포에서 적어도 하나의 표적 유전자를 편집하기 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 CRISPR 가이드 RNA를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하며, 여기서 CRISPR 가이드 RNA는 세포에서 적어도 하나의 표적 유전자에 상보적이고, 여기서 상기 제1 핵산 서열은 벡터에 존재하고; 상기 시스템은 또한 Cas9 단백질을 코딩하는 제2 핵산 서열, 제1 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열, 및 제2 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 제4 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 서열은 진핵생물 세포, 예컨대 인간 세포에서 작동가능한 조절성 요소에 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절성 요소 및 유전자 또는 그의 코딩 영역 사이의 연결을 설명하는데 사용된다. 전형적으로, 유전자 발현은 하나 이상의 조절성 요소, 예를 들어, 제한 없이, 구성적 또는 유도성 프로모터, 조직-특이적 조절성 요소, 또는 인핸서의 제어하에 배치된다. 유전자 또는 코딩 영역은 조절성 요소에 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동적으로(operatively) 연결된" 또는 "작동가능하게 연관된"이라고 언급되며, 이는 유전자 또는 코딩 영역이 조절성 요소에 의해 제어되거나 영향을 받는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현을 수행하는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 "상류"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 상의 위치의 위치 5', 및 폴리펩티드 상의 위치의 N-말단을 향한 위치를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "하류"는 뉴클레오티드 상의 위치의 위치 3', 및 폴리펩티드 상의 위치의 C-말단을 향한 위치를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "구축물"은 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 특이적 뉴클레오티드 서열(들)의 발현의 목적을 위해 생성되거나, 다른 재조합 뉴클레오티드 서열의 구축에 사용되는 재조합 핵산을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
"프로모터"는 구조적 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 대안에서, 프로모터는 구조적 유전자의 전사 시작 부위에 근접한 유전자의 5' 비-코딩 영역에 위치한다. 전사 개시에서 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 종종 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소는 RNA 폴리머라제 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소 (DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993); 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 시클릭 AMP 반응 요소 (CRE), 혈청 반응 요소 (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990); 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE), 및 다른 전사 인자에 대한 결합 부위, 예컨대 CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) 및 팔량체 인자 (일반적으로, 문헌 [Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)], 및 [Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)] 참조; 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 프로모터는 구성적으로 활성, 억압성 또는 유도성일 수 있다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도가 증가한다. 대조적으로, 프로모터가 구성적 프로모터인 경우 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억압성 프로모터가 또한 공지되어 있다. 일부 대안에서, 조절성 요소는 비번역된 영역일 수 있다. 일부 대안에서, 비번역된 영역은 5' 비번역된 영역이다. 일부 대안에서, 비번역된 영역은 3' 비번역된 영역이다. 일부 대안에서, 5' 또는 3' 비번역된 영역이 사용된다. 일부 대안에서, 5' 및 3' 비번역된 영역 둘 모두가 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원의 대안에서 사용되는 바와 같은 비번역된 영역의 의미를 이해할 것이다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 프로모터는 MND 프로모터일 수 있다. MND 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 대조군 영역, 치환된 dl587rev 프라이머-결합 부위로부터 그 명칭이 유래하며, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMulv LTR의 U3 영역을 함유하는 감마 레트로바이러스 합성 프로모터이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인핸서"는 전사의 시작 부위에 비해 인핸서의 거리 또는 배향에 관계없이 전사의 효율을 조정할 수 있는 조절성 요소의 한 유형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염"은 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예컨대 세포를 본원에 기재된 바와 같은 재조합 AAV 벡터와 접촉시킴으로써 예를 들어, 숙주 세포로 핵산을 도입하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "일시적 형질감염"은 일반적으로 일시적으로 형질감염된 숙주 세포의 게놈으로의 외인성 핵산의 통합을 초래하지 않는 방법에 의해 숙주 세포로 외인성 핵산(들)을 도입하는 것을 지칭한다. 일부 대안에서, 핵산은 RNA이다. 일부 대안에서, 핵산은 DNA이다. 일부 대안에서, 핵산이 RNA인 경우, 핵산은 일반적으로 일시적으로 형질감염된 세포의 게놈에 통합되지 않는다. 일부 대안에서, 핵산이 DNA인 경우, 핵산은 일시적으로 형질감염된 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물, 전형적으로 유전 물질을 숙주 세포로 전달하는데 사용되는 플라스미드 또는 바이러스를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 예를 들어, 바이러스, 플라스미드, 코스미드 또는 파지일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 벡터는 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있다. 일부 대안에서, 벡터는 DNA로 구성된다. "발현 벡터"는 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현을 지시할 수 있는 벡터이다. 벡터는 바람직하게는 자율 복제가 가능하다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 제어하에 배치되며, 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결"되어 있다고 언급된다.
본원에 사용된 바와 같은 "AAV 시스템" 또는 "AAV 발현 시스템"은 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 적어도 하나의 전사체-코딩 핵산을 발현하기 위한 것이고 하나 이상의 AAV 벡터에 배치된 핵산을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은, "활성-의존적 발현" (및 이 어근 용어의 변동)은 핵산을 함유하는 세포의 특정 유형의 활성의 변화, 예를 들어 세포의 탈분극시 유도될 핵산 발현을 지칭한다. 일부 대안에서, 세포는 뉴런이고, 자극에 대한 반응으로 뉴런의 탈분극은 "활성-의존적" 핵산 발현을 유도한다. 일부 대안에서, AAV 벡터는 서열식별번호: 15, 16 또는 17에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 본 대안에 따른 Cas9-mRNA/AAV-가이드 RNA가 도입된 세포, 뿐만 아니라 본원의 시스템이 제공된 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 원핵생물 숙주 세포의 예는 이. 콜라이(E. coli), 질소 고정 박테리아, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 알부스(Staphylococcus albus), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 마이코플라스마(mycoplasma) 및/또는 시아노박테리아(cyanobacteria)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 진핵생물 숙주 세포의 예는 원생동물, 진균, 조류, 식물, 곤충, 양서류, 새 및 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 세포에서 적어도 하나의 표적 유전자를 편집하기 위한 시스템이 제공되며, 여기서 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 형질전환된 세포가 아니다. 일부 대안에서, 세포는 1차 림프구이다. 일부 대안에서, 세포는 1차 림프구, CD34+ 줄기 세포, 간세포, 심근세포, 뉴런, 아교 세포, 근육 세포 또는 장 세포이다.
"원핵생물" 세포에는 진정한 핵이 없다. 원핵생물 세포의 예는 박테리아 (예를 들어, 시아노박테리아, 락토바실루스 아시도필루스, 질소-고정 박테리아, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스타필로코쿠스 아우레우스, 바실루스 안트락스(Bacillus anthrax), 클로스트리디움 테타니, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 뉴모니아에, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) 및/또는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)) 및/또는 고세균(archaea) (예를 들어, 크렌고세균(Crenarchaeota), 유리고세균(Euryarchaeota), 및/또는 코르고세균(Korarchaeota))이다. 본원에 기재된 Cas9 단백질은 원핵생물 세포로부터의 단백질이다.
"진핵생물" 세포는 조류 세포, 진균 세포 (예컨대 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 또는 인간 세포 (예를 들어, T-세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 "T 세포 전구체"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어 흉선으로 이동하고 T 세포 수용체를 발현하지 않는 T 세포 전구체가 될 수 있는 림프성 전구체 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 모든 T 세포는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 유래한다. 조혈 줄기 세포로부터의 조혈 선조 (림프성 선조 세포)는 흉선에 집단을 형성하고 세포 분열에 의해 확장하여 미성숙 흉선세포의 큰 집단을 생성한다. 최초의 흉선세포는 CD4도 발현하지 않고 CD8도 발현하지 않으므로, 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 이들의 발달을 통해 진행되기 때문에, 이들은 이중-양성 흉선세포 (CD4+CD8+)가 되고, 최종적으로 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선세포로 성숙하여, 그 후 흉선으로부터 말초 조직으로 방출된다.
본원에 기재된 바와 같은 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 골수성 세포 예컨대, 예를 들어, 대식세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포 또는 림프계 계통 (예컨대, 예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포)을 생성할 수 있는 전구체 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. HSC는 세 가지 부류의 줄기 세포가 존재하는 이질적인 집단을 가지며, 이는 혈액내 림프성 대 골수성 자손의 비율 (L/M)로 구별된다. 일부 대안에서, 제공된 세포는 HSC 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 1차 림프구 또는 CD34+ 줄기 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은 "자가(autologous)"는 줄기 세포의 공여자 및 수용자가 동일한 것을 지칭하며, 예를 들어, 환자 또는 대상체가 세포의 공급원이다.
본원에 기재된 바와 같은 "1차 인간 세포"는 그의 공급원 장기 조직 또는 혈액 세포로부터 직접 배양된다. 불멸화된 세포주와 비교하여, 1차 인간 세포는 향상된 생체내 복제를 제공한다. 일부 대안에서, 제공된 세포는 1차 인간 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공동전달"은 본원에 기재된 바와 같이 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 2개 이상의 별도의 화학적 실체의 시험관내 또는 생체내 전달을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 공동전달은 별도의 작용제의 동시 전달; 작용제들의 혼합물의 동시 전달; 뿐만 아니라 하나의 작용제의 전달에 이어 제2 작용제 또는 추가 작용제의 전달을 지칭한다. 모든 경우에, 공동전달된 작용제는 서로 함께 작용하도록 의도된다. 일부 대안에서, 예를 들어, 공동전달은 관심있는 mRNA 및 AAV 벡터의 전달을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "엔도뉴클레아제"는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 DNA (dsDNA), 단일-가닥 DNA (ssDNA), RNA, DNA 및 RNA의 이중-가닥 하이브리드, 또는 합성 DNA (예를 들어, A, C, G 및 T 이외의 염기를 함유함)일 수 있다. 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드를 대칭적으로 절단하여, "평활" 말단을 남기거나, 직접 대향하지 않는 위치에서 "점착성 말단"으로 지칭될 수 있는 오버행을 생성할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 절단 부위에 적용될 수 있다. 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제 (예컨대 MegaTAL) 또는 CRISPR/Cas9를 포함하는 엔도뉴클레아제, 또는 엔도뉴클레아제의 도메인, 예를 들어, Cas9, TALEN, 또는 MegaTAL, 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 제공할 수 있다. 이들 예는 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 다른 엔도뉴클레아제 및 다른 엔도뉴클레아제를 포함하는 시스템 및 방법의 대안 및 이들 예시적인 대안의 변동 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 (TAL) 이펙터 뉴클레아제" (TALEN)는 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 뉴클레아제 도메인에 융합된 TAL-이펙터 도메인을 포함하는 뉴클레아제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. TAL-이펙터 DNA 결합 도메인은 원하는 표적에 결합하도록 조작되고 뉴클레아제 도메인, 예컨대 Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합되어 TAL 이펙터 도메인-뉴클레아제 융합 단백질을 유도할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 시스템은 TAL 이펙터 뉴클레아제에 의해 생성된 절단 부위에 적용될 수 있다. 본원에 제공된 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 TALEN 뉴클레아제 또는 TALEN 뉴클레아제를 코딩하는 벡터 또는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법의 일부 대안에서, 방법은 뉴클레아제, 예컨대 TALEN 뉴클레아제를 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
MegaTAL은 2개의 별개의 부류의 DNA 표적화 효소의 조합으로부터 유래된다. 메가뉴클레아제 (귀소 엔도뉴클레아제라고도 함)는 동일한 도메인에서 DNA 인식 및 뉴클레아제 기능 둘 모두의 특징을 갖는 단일 펩티드 쇄이다. 본원에 제공된 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 MegaTAL 뉴클레아제 또는 MegaTAL 뉴클레아제를 코딩하는 벡터 또는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법의 일부 대안에서, 방법은 MegaTAL 뉴클레아제 또는 MegaTAL 뉴클레아제를 코딩하는 벡터 또는 핵산을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)은 염기 서열의 짧은 반복부를 함유하는 원핵생물 DNA의 세그먼트이다. 각 반복 다음에 박테리아 바이러스 또는 플라스미드에 대한 이전 노출로부터 "스페이서 DNA"의 짧은 세그먼트가 이어진다.
Cas9 (CRISPR 연관 단백질 9)는 다른 박테리아 중에서 스트렙토코쿠스 피오게네스에서 CRISPR 적응 면역 체계와 연관된 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다. 에스. 피오게네스는 Cas9를 사용하여, 외래 DNA, 예컨대 침입 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA를 기억하고 나중에 심문하고 절단한다. Cas9는 외래 DNA를 풀고 가이드 RNA의 20개 염기 쌍 스페이서 영역에 상보적인지 확인하여 이 심문을 수행한다. DNA 기질이 가이드 RNA에 상보적인 경우, Cas9는 침입 DNA를 절단한다.
본원에 기재된 바와 같은 CRISPR/Cas 시스템은 유전자 편집 (특정 유전자의 서열의 첨가, 파괴 또는 변화) 및 유전자 조절에 사용된다. Cas9 단백질, 그의 유도체 또는 단편 및 적절한 가이드 RNA를 세포에 전달함으로써, 유기체의 게놈은 임의의 원하는 위치에서 절단될 수 있다. CRISPR을 사용하여 전체 집단의 게놈을 변경할 수 있는 RNA-가이드된 유전자를 구축하는 것이 가능할 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템의 기본 구성성분은 표적 유전자, 가이드 RNA, 및 Cas9 엔도뉴클레아제, 그의 유도체 또는 단편을 포함한다. 유전자 편집을 위해 CRISPR/Cas9를 적용하는 중요한 측면은 가이드 RNA를 다양한 세포 유형에 효율적으로 전달하기 위한 시스템에 대한 필요성이다. 이는 예를 들어 핵산으로서 시험관내 생성된 가이드 RNA의 전달을 포함할 수 있다 (시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 생성된 가이드 RNA). 일부 대안에서 가이드 RNA를 코딩하는 핵산은 변형된 염기, 예컨대 2'O-메틸 염기의 혼입에 의해 뉴클레아제 내성이 된다. 일부 대안에서, CRISPR/Cas9 시스템이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 Cas9 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 유도체 또는 기능적 단편 (예를 들어, Cas9를 갖는 mRNA 벡터의 20개 핵산 서열)은 원하는 길이의 폴리(T) 또는 폴리(A) 테일이 제공되고, 본원에 기재된 교시내용에 따라 제조되며, 예를 들어, 하나 이상의 변형된 염기, 예컨대 본원에 기재된 변형된 염기 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA가 제공된다.
일부 대안에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA의 사용이 고려된다. 화학적으로-변형된 가이드 RNA는 인간 1차 세포에서 CRISPR-Cas 게놈 편집에 사용되어 왔다 (Hendel, A. et al., Nat Biotechnol. 2015 Sep; 33(9):985-9). 가이드 RNA의 화학적 변형은 뉴클레아제 내성을 부여하는 변형을 포함할 수 있다. 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 또는 엑소뉴클레아제, 또는 둘 모두일 수 있다. 일부 화학적 변형은 제한 없이 2'-플루오로, 2'O-메틸, 포스포로티오에이트 디티올 3'-3' 말단 연결, 2-아미노-dA, 5-메틸-dC, C-5 프로피닐-C, 또는 C-5 프로피닐-U, 모르폴리노 등을 포함한다. 이들 예는 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 다른 화학적 변형 및 이들 예시적인 대안의 변동 및 변형이 또한 고려된다.
본원에 기재된 대안에 유용한 예시적인 가이드 RNA는 본원에 기재된 변형된 염기 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 일부 대안에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 12에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다. 또한, 이 문맥에서 가이드 RNA를 발현하기 위한 중요한 시스템은 AAV 벡터가 광범위한 1차 세포를 형질도입할 수 있기 때문에 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터의 사용을 기반으로 한다. AAV 벡터는 감염을 유발하지 않으며 게놈에 통합하는 것으로 공지되지 않았다. 따라서, AAV 벡터의 사용은 안전하고 효능있다는 이점을 갖는다.
용어 "엑소뉴클레아제"는 3' 또는 5' 말단에서 포스포디에스테르 결합을 파괴하는 가수분해 반응을 통해 폴리뉴클레오티드 쇄의 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 DNA (dsDNA), 단일-가닥 DNA (ssDNA), RNA, DNA 및 RNA의 이중-가닥 하이브리드, 또는 합성 DNA (예를 들어, A, C, G 및 T 이외의 염기를 함유함)일 수 있다. 용어 "5' 엑소뉴클레아제"는 5' 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제를 지칭한다. 용어 "3' 엑소뉴클레아제"는 3' 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제를 지칭한다. 엑소뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 폴리뉴클레오티드 쇄의 말단에서 또는 다른 화학적 또는 기계적 수단, 예컨대 전단 (예를 들어 미세-게이지 바늘을 통한 통과, 가열, 초음파처리, 미니 비드 텀블링, 또는 연무에 의해), 전리 방사선, 자외 방사선, 산소 라디칼, 화학적 가수분해 또는 화학요법제에 의해 생성된 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있다. 엑소뉴클레아제는 평활 말단 또는 점착성 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있다. 이. 콜라이 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 III은 3'-외핵분해성 단일-가닥 분해 활성을 갖는 2개의 일반적으로 사용되는 3'-엑소뉴클레아제이다. 3'-엑소뉴클레아제의 다른 예는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 (NDK), NDK1 (NM23-H1), NDK5, NDK7, 및 NDK8 (Yoon J-H, et al., Characterization of the 3' to 5' exonuclease activity found in human nucleoside diphosphate kinase 1 (NDK1) and several of its homologues. (Biochemistry 2005:44(48):15774-15786.), WRN (Ahn, B., et al., Regulation of WRN helicase activity in human base excision repair. J. Biol. Chem. 2004, 279:53465-53474) 및 3 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (Trex2) (Mazur, D. J., Perrino, F. W., Excision of 3' termini by the Trex1 and TREX2 3'→5' exonucleases. Characterization of the recombinant proteins. J. Biol. Chem. 2001, 276:17022-17029; 두 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 포함한다. 이. 콜라이 엑소뉴클레아제 VII 및 T7-엑소뉴클레아제 유전자 6은 5% 외핵분해성 단일-가닥 분해 활성을 갖는 2개의 일반적으로 사용되는 5'-3' 엑소뉴클레아제이다. 엑소뉴클레아제는 원핵생물, 예컨대 이. 콜라이 엑소뉴클레아제, 또는 진핵생물, 예컨대 효모, 벌레, 뮤린, 또는 인간 엑소뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 본원에 제공된 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 엑소뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 코딩하는 벡터 또는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 엑소뉴클레아제는 Trex2이다. 본원에 제공된 방법의 일부 대안에서, 방법은 엑소뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제, 예컨대 Trex2를 코딩하는 벡터 또는 핵산을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "가이드"는 본원에 기재된 바와 같이 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 뉴클레아제를 표적 핵산 서열에 부위-특이적으로 가이드하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 가이드는 RNA, DNA, 또는 RNA 및 DNA의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 변형된 염기 중 하나 이상을 함유할 수 있는 본원에 기재된 대안에 유용한 예시적인 가이드 RNA는 서열식별번호: 12에 기재된 바와 같은 서열에 제공된다.
"게놈 영역"은 표적 핵산 서열 부위의 양쪽에 존재하는 숙주 세포의 게놈에 있는 염색체의 세그먼트이거나, 대안적으로, 또한 표적 부위의 일부를 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 상동성 아암은 상응하는 게놈 영역과 상동성 재조합을 수행하기에 충분한 상동성을 갖는다. 일부 대안에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 상동성 아암은 표적 부위를 바로 플랭킹하는 게놈 영역과 상당한 서열 상동성을 공유하고; 상동성 아암은 표적 부위로부터 멀리 떨어진 게놈 영역과 충분한 상동성을 갖도록 설계될 수 있음이 인식된다.
본원에 사용된 바와 같은, "비상동성 말단 연결" (NHEJ)은 본원에 기재된 바와 같이 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드의 필요 없이 파단의 하나의 말단을 파단의 다른 말단으로 직접 라이게이션함으로써 DNA에서 DSB를 복구하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. NHEJ는 복구 주형의 사용 없이 DNA를 복구하는 세포에 이용가능한 DNA 복구 경로이다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 부재하에 NHEJ는 종종 뉴클레오티드가 DSB의 부위에서 무작위로 삽입되거나 결실되는 결과를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같은 "절단 부위"는 그렇지 않으면 제2 폴리펩티드에 대해 시스로 있는 제1 폴리펩티드의 분리를 매개하는 서열을 지칭한다. 따라서, 단순화를 위해, 본원에 사용된 바와 같은 "절단", "절단 부위" 등은 시스에서 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 임의의 2개의 폴리펩티드의 분리를 지칭한다. 그러므로, "절단" 및 "절단 부위"는 단백질분해 부위 및 사건을 지칭할 수 있으나 반드시 지칭하는 것은 아니고, 또한 폴리펩티드의 분리를 매개하기 위한 다른 메커니즘, 예를 들어 리보솜 스키핑을 지칭할 수 있다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 모두가 가능하고, 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 사건의 결과로 발생할 수 있다. 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단의 생성을 유발할 수 있다.
용어 "상보적"은 상보적 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 하나 이상의 부분과 상동성이 있음을 의미한다. 예시를 위해, 뉴클레오티드 서열 "CATTAG"는 참조 서열 "CATTAG"에 상응하고, 참조 서열 "GTAATC"에 상보적이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지"는 검출가능한 분자를 지칭한다. 수많은 적합한 표지는 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같이, 본원에 사용된 바와 같은 "표지 핵산"은 표지를 코딩하는 핵산을 지칭한다. 일부 대안에서, AAV 벡터 시스템은 표지 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러므로, 일부 대안에서, 프로모터 (예컨대, MND 프로모터)는 표지 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되어, 본원에 기재된 AAV 벡터가 리포터를 포함한다. 본원의 대안에 따라 적합한 예시적인 표지는 예를 들어, 아에쿠오리아 빅토리아(Aequoria victoria) GFP, 레닐라 무엘레리(Renilla muelleri) GFP, 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) GFP, 레닐라 프틸로사르쿠스(Renilla ptilosarcus)를 포함하는 녹색 형광 단백질 (GFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 또는 주황색 형광 단백질 (OFP)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가 리포터 유전자는 네오마이신, 포스포로-트랜스퍼라제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 티미딘 키나제, 루시퍼라제, β-글루쿠로니다제, 아미노글리코시드, 포스포트랜스퍼라제, 히그로마이신 B, 잔틴-구아닌 포스포리보실, 루시퍼라제 (예를 들어, 레닐라, 반딧불이 등), DHFR/메토트렉세이트, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 터보 및/또는 tagRFP, 또는 상기 언급된 임의의 리포터 유전자의 핵 표적화된 버전을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 관심있는 폴리펩티드는 예를 들어 활성 세포에서 표지의 생성이 요구되는 경우 표지 자체를 포함한다. 일부 대안에서, 본원에 제공된 AAV 구축물은 MND 프로모터 구동된 GFP 카세트를 포함하고, 여기서 MND 프로모터 구동 GFP 카세트는 AAV 형질도입 효율의 추적을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "유전자 발현"은 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 가지며, 예를 들어, 유전자 생성물의 생합성을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 구조적 유전자의 경우, 유전자 발현은 mRNA로의 구조적 유전자의 전사 및 하나 이상의 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 포함한다.
"폴리펩티드"는 자연적으로 또는 합성적으로 생성되는지 여부에 관계없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 10개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 일반적으로 "펩티드"로 지칭된다. 폴리펩티드는 단백질로서 간주될 수 있다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드 구성성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 단백질은 그의 아미노산 백본 구조의 관점에서 본원에서 정의되며; 치환체, 예컨대 탄수화물 기는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다. 일부 대안에서, 세포에서 적어도 하나의 표적 유전자를 편집하기 위한 시스템이 제공되며, 여기서 방법은 CRISPR 가이드 RNA를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하며, 여기서 CRISPR 가이드 RNA는 세포에서 적어도 하나의 표적 유전자에 상보적이고, 여기서 상기 제1 핵산 서열은 벡터에 존재하고; 상기 시스템은 또한 Cas9 단백질을 코딩하는 제2 핵산 서열, 제1 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열, 및 제2 아데노바이러스 단백질을 코딩하는 제4 핵산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 서열식별번호로 본원에 기재될 수 있고, 본 출원 전반에 걸쳐 기재되고 부록 I에 포함된다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 서열식별번호: 10-11 중 어느 하나의 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
본원에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 문맥 및/또는 적용에 적절한 대로 복수로부터 단수로 및/또는 단수로부터 복수로 번역할 수 있다. 명확성을 위해 다양한 단수/복수 순열이 본원에 명시적으로 기재될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로, 본원 및 특히 첨부된 청구범위 (예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에 사용된 용어가 일반적으로 "개방" 용어로 의도된다는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "포함하는(including)"은 "포함하나 이에 제한되지는 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는(having)"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다(includes)"는 "포함하나 이에 제한되지는 않는다"로 해석되어야 함 등). 특정 수의 도입된 청구항 인용이 의도된 경우 이러한 의도가 청구항에 명백하게 인용될 것이며, 이러한 인용이 없는 경우 이러한 의도가 존재하지 않는다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 하기 첨부된 청구범위는 청구항 인용을 도입하기 위해 도입 문구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 문구의 사용은 "단수 형태"에 의한 청구항 인용의 도입이 이러한 도입된 청구항 인용을 함유하는 임의의 특정 청구항을 오직 하나의 이러한 인용을 함유하는 대안으로 제한함을 의미하는 것으로 해석되어서는 안되며 (동일한 청구항이 도입 문구 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 단수 형태, 예컨대 "하나"를 포함하더라도 (예를 들어, "하나"는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 함)); 동일한 것이 청구항 인용을 도입하는데 사용되는 정관사의 사용에 적용된다. 또한, 특정 수의 도입된 청구항 인용이 명백하게 인용되더라도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 인용이 적어도 인용된 숫자를 의미하는 것으로 해석되어야 함을 인식할 것이다 (예를 들어, 다른 수식어 없이 "2개의 인용"의 있는 그대로의 인용은 적어도 2개의 인용, 또는 2개 이상의 인용을 의미함). 또한, "A, B 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구축은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 규칙을 이해할 것이라는 의미로 의도된다 (예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않음). "A, B 또는 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구축은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 규칙을 이해할 것이라는 의미로 의도된다 (예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않음). 설명, 청구범위 또는 도면에 있든간에, 2개 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접적 접속사 단어 및/또는 문구가 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나 또는 두 용어 모두를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
X-연관 고 IgM 증후군
X-연관 고-이뮤노글로불린 M (IgM) 증후군 (X-HIGM)은 CD40LG의 돌연변이를 보유한 인간에서 발생하며, 정상 또는 상승된 IgM 수준, 감소된 기억 B 세포 수, 및 클래스-스위치 기억 B 세포의 부재와 함께 저 혈청 이뮤노글로불린 G, A 및 E (IgG, IgA 및 IgE), 재발성 감염을 특징으로 한다 (도 1). CD40L 기능을 적절한 조혈 계통으로 재구성할 수 있는 유전자 요법은 이들 환자의 치료 옵션을 크게 개선시킬 수 있다.
흥미롭게도, X-HIGM의 여성 보균자의 연구는 CD40LG 유전자의 X-불활성화가 무작위 및 고도로 이질적이며, 일부 보균자는 T 세포의 5-10%에서만 비-돌연변이된 CD40L을 발현한다는 것을 나타내었다. 또한, T 세포의 5%에서만 발현된 비-돌연변이된 CD40L을 갖는 X-HIGM의 여성 보균자는 고-IgM 증후군의 증상 특징을 나타내었다. T 세포의 12%에서 발현된 비-돌연변이된 CD40L을 갖는 여성 보균자는 증상을 나타내지 않으며, 이는 역치가 비손상된 면역 기능에 필요한 비-돌연변이된 CD40L 발현에 대해 5-12% 사이에 존재할 수 있음을 시사한다. 그러므로, 유전자 요법은 상대적으로 낮은 백분율의 보정된 세포에서도 임상적 이점을 제공할 수 있다 (Hollenbaugh, D., et al., The Journal of clinical investigation, 1994. 94(2): p. 616-622; de Saint Basile, G., et al., European journal of immunology, 1999. 29(1): p. 367-373).
CD40:CD40 리간드 (CD40L) 공동자극성 신호는 항원 인식시 B 세포 및 T 세포 사이의 혼선에서 본질적인 역할을 한다 (Banchereau, J., et al., Annual review of immunology, 1994. 12(1): p. 881-926; Foy, T.M., et al., Annual review of immunology, 1996. 14(1): p. 591-617; Elgueta, R., et al., Immunol Rev, 2009. 229(1): p. 152-72). CD40L은 주로 활성화된 T 세포 상에서 발현되지만, 또한 염증 상태하에 다른 면역 세포, 예컨대 수지상 세포 및 대식세포에 의해 발현되는 반면, CD40은 B 세포 상에서 구성적으로 발현된다 (Schonbeck, U. and P. Libby, The CD40/CD154 receptor/ligand dyad. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 2001. 58(1): p. 4-43; van Kooten, C. and J. Banchereau, Current opinion in immunology, 1997. 9(3): p. 330-337). CD40L에 의한 CD40의 활성화는 B 세포 발달의 본질적인 단계이며, B 세포 증식을 촉진하고 이뮤노글로불린 클래스 스위칭 및 체세포 과돌연변이에 대한 중요한 체크포인트로서 작용한다 (Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, Nature, 1994. 367(6462): p. 425; Bishop, G.A. and B.S. Hostager, Cytokine & growth factor reviews, 2003. 14(3-4): p. 297-309; Crotty, S., Nature Reviews Immunology, 2015. 15(3): p. 185; Kawabe, T., et al., Immunity, 1994. 1(3): p. 167-178).
X-HIGM에 대한 유전자 요법을 개발하려는 이전 시도는 CD40L cDNA 발현 카세트를 Cd40l-/- 마우스의 골수 조혈 줄기 세포 (HSC)에 전달하기 위해 γ-레트로바이러스를 사용하였다. 그러나, 이는 대부분의 마우스에서 T 세포 림프증식성 장애를 초래하였으며, 이는 CD40L의 내인성 전사 조절이 중요한 안전성 고려사항이 될 수 있음을 시사한다 (Sacco, M.G., et al., Cancer gene therapy, 2000. 7(10): p. 1299; Brown, M.P., et al., Nature medicine, 1998. 4(11): p. 1253).
이전 연구는 1차 인간 T 세포에서 내인성 프로모터의 하류에 직접 CD40L 코딩 서열을 전달하기 위한 유전자 편집 접근법과 관련이 있었다 (Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22). 이 접근법은 CD40LG-특이적 TALE-뉴클레아제 (TALEN) 및 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6)-전달된 CD40L cDNA를 CD40LG 상동성 아암과 함께 사용하는 상동성-지정 복구 (HDR)를 기반으로 한다. 유전자-편집된 T 세포에서 CD40L의 발현 동역학은 비편집된 T 세포에서 내인성 단백질을 반영하였다. 또한, 유전자 편집은 시험관내에서 X-HIGM 환자 T 세포에서 CD40L 발현 및 기능을 구제하였다. T 세포 요법으로 유망하지만, 문헌 [Hubbard]에 기재된 방법은 X-HIGM에 대한 잠재적 치유적 치료로서 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)를 사용하는 유전자 편집 접근법으로 번역하지 않는다.
T 세포와 비교하여, HDR-기반 유전자 편집은 CD34+ HSPC에서 달성하기 어려웠다 (Sather, B.D., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(307): p. 307ra156). 또한, 유전자-편집된 HSPC는 비편집된 세포와 비교하여 면역결핍 인간화 마우스에 불량하게 생착한다 (De Ravin, S.S., et al., Nat Biotechnol, 2016. 34(4): p. 424-9; Dever, D.P., et al., Nature, 2016. 539(7629): p. 384-389; De Ravin, S.S., et al., Sci Transl Med, 2017. 9(372): p. eaah3480; Hoban, M.D., et al., Blood, 2015. 125(17): p. 2597-604). 지속적인 편집된 세포의 높은 비율을 검출하는 것은 임상적으로 더 관련된 공급원인 G-CSF 동원된 말초 혈액으로부터의 HSPC를 사용하여 특히 어려웠다.
따라서, 본원에 제공된 일부 대안은 치료적 게놈 편집 접근법을 사용하여 X-HIGM을 치료, 호전, 억제 또는 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 대안에서, HSPC에서 내인성 프로모터 및 인핸서의 제어하에 무손상 CD40LG cDNA를 도입하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 CD40L에서 면역학적 및 기능적 결함을 구제하고 치유 요법을 제공한다.
일부 대안은 예를 들어, CD34+ 조혈 줄기 세포에서 상동성 지정 복구-기반 유전자 편집 접근법에 관한 것이며, 여기서 CD40L을 코딩하는 cDNA는 내인성 프로모터의 제어하에 있다. 인간 말초 혈액 줄기 세포의 최대 30%에서 CD40L 또는 대조군 GFP 코딩 서열의 온-타겟 통합. 편집된 세포의 생착 잠재력의 평가를 허용하기 위해, GFP-발현 CD34+ 세포를 면역결핍 마우스에 이식하였다. 이식된 인간 세포는 마우스 골수로부터 회수된 세포의 실질적인 비율을 구성하였으며, 그 중 1.5%는 원하는 편집을 함유한다. 회수된 편집된 세포는 골수성, B, 및 CD34+ 세포를 포함하는 상이한 계통의 세포를 포함하였다. 이러한 생체외 편집 프로토콜에 소분자를 첨가하는 것은 인간 세포 생착을 증가시켰으나, 원하는 편집을 함유하는 생착된 세포의 백분율에 대한 영향은 없었다. 이들 발견은 인간 조혈 줄기 세포에서 CD40LG 유전자좌의 편집을 입증한다.
또한, 본원에 제공된 개시내용은 인간 말초 혈액 HSPC의 CD40LG 유전자좌의 효율적인 배양 및 편집을 위한 방법, 시스템 및 조성물, 및 면역결핍 마우스에서 편집된 만능 줄기 세포의 생착에 관한 것이다.
일부 대안에서, 인간 조혈 줄기 세포 (HSC)에서 AAV-지원 HDR의 효율은 2개의 뉴클레아제 플랫폼: Cas9 RNP 및 TALEN 사이에서 나타난다. RNP 가이드 RNA (gRNA)는 동일한 공여자 주형을 사용하여 뉴클레아제를 비교하기 위해 TALEN의 15 bp 이내로 Cas9 절단을 표적화하도록 설계되었다. CD40LG 프로모터가 HSC에서 활성이 아니기 때문에, AAV6 공여자는 양쪽에 1 kb의 CD40LG 상동성을 갖는 MND 프로모터-GFP 발현 카세트를 전달하도록 설계되었다 (도 2) (Challita, P.-M., et al., Journal of virology, 1995. 69(2): p. 748-755). 표적화 구축물에서 CD40LG 상동성 아암은 TALEN 및 Cas9 gRNA 결합 부위가 결실되어, 두 뉴클레아제에 의해 절단불가능하게 되었다.
일부 대안은 성인 동원된 CD34+ 세포의 사용 방법 및 프로모터-구동 형광 마커의 표적화된 통합을 위한 TALEN mRNA 또는 Cas9/gRNA 리보핵단백질 복합체 (RNP) 및 AAV 공여자의 공동전달에 관한 것이다. 일부 대안에서, 본원에 제공된 방법은 TALEN의 경우 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상의 효율 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 효율로 및 RNP의 경우 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상의 효율 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 효율로 여러 공여자에 걸쳐 효율적인 상동성 지정 복구 비율을 달성한다. 일부 대안에서, 최고 수준의 세포 생존율은 RNP/AAV 공동전달을 사용하여 관찰된다. 일부 대안에서, 편집된 HSC는 콜로니 형성 단위 검정에서 여러 계통을 생성할 잠재력을 유지한다. 일부 대안에서, 본원에 제공된 시스템은 면역-결핍 마우스에서 장기간 생착 및 분화 잠재력을 제공한다. 일부 대안에서, CD40LG cDNA를 운반하는 AAV 벡터는 CD40LG 결핍 세포에서 발현을 복원한다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 환자에서 질환 또는 질환 증상의 치료적 보정을 제공한다.
상동성 지정 복구
상동성 지정 복구 (HDR)는 상동성 핵산 (예를 들어, 자매 염색분체 또는 외인성 핵산)을 사용하여 DNA 손상을 복구하는 과정을 지칭한다. 정상 세포에서, HDR은 전형적으로 일련의 단계, 예컨대 파단 인식, 파단 안정화, 절제(resection), 단일 가닥 DNA 안정화, DNA 교차 중간체 형성, 교차 중간체 분해, 및 라이게이션을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, HDR은 표적 서열을 변경하고 게놈의 돌연변이를 보정 (예를 들어, 복구 또는 편집)하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 표적 서열의 변경은 공여자 주형 또는 주형 핵산을 사용하여 HDR에 의해 발생한다고 여겨진다. 예를 들어, 공여자 주형 또는 주형 핵산은 표적 위치의 변경을 제공한다.
본원에 제공된 일부 대안은 X-HIGM과 연관된 유전자의 상동성 지정 복구를 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 일부 대안에서, 유전자는 CD40LG 유전자이다. 일부 대안에서, 방법은 인간 조혈 세포에서 CD40LG 유전자의 HDR을 포함한다. 일부 대안에서, 방법 및 시스템은 CD40LG 유전자의 뉴클레아제-기반 HDR을 포함한다. 일부 대안에서, 뉴클레아제 기반 HDR은 TALEN 기반 뉴클레아제를 포함한다. 일부 대안에서, 뉴클레아제 기반 HDR은 CRISPR/Cas 기반 뉴클레아제를 포함한다.
TALEN
전사 활성인자-유사 (TAL) 이펙터-DNA 변형 효소 (TALEN)는 DNA의 특이적 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. TALEN은 TAL-이펙터 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합함으로써 제조된다.
일부 대안에서, CD40LG TALEN으로 표적화하는데 사용되는 CD40LG 유전자좌는 AAV 공여자와 함께 공동전달된다.
일부 대안에서 CD40LG TALEN 정방향 서열은 서열식별번호: 10 및 21에 의해 정의된다. 일부 대안에서, CD40LG TALEN 역방향 서열은 서열식별번호: 11 및 22에 의해 정의된다. 일부 대안에서, 정방향 서열 및/또는 역방향 서열은 서열식별번호: 10, 21, 11 또는 22 중 어느 하나의 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
일부 대안에서, AAV 공여자는 MND 프로모터의 제어하에 GFP 카세트를 포함한다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 MND 프로모터 구동된 GFP 카세트 (서열식별번호: 14)를 플랭킹하는 1 kb 상동성 아암을 갖는다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 서열식별번호: 14 및 15에 기재된 바와 같은 TALEN 및 가이드 서열에 의한 절단을 폐지하기 위한 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함한다. 일부 대안에서, MND 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 14 또는 15 중 어느 하나의 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
본원에 제공된 일부 대안은 CD40LG 유전자 (서열식별번호: 13)의 HDR에서 사용하기 위한 TALEN 뉴클레아제에 관한 것이다. 일부 대안에서, TALEN은 CD40LG 유전자에서 TALEN 결합 부위에 결합한다. 일부 대안에서, CD40LG TALEN은 천연 CD40LG 서열 (서열식별번호: 13)에 결합한다. 일부 대안에서, CD40LG 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 13 중 어느 하나의 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
CD40LG TALEN으로 표적화하는데 사용되는 CD40LG 유전자좌는 5'에서 3'로 다음 구성성분을 포함한다: 상류 상동성 아암 (서열식별번호: 18); 가이드 RNA (서열식별번호: 12)를 포함하는 엑손 1 (서열식별번호: 26); T-for (TALEN 정방향 결합 부위; 서열식별번호: 23); 절단 부위 (서열식별번호: 25); T-rev (TALEN 역방향 결합 부위; 서열식별번호: 24); 엑손 2 (서열식별번호: 27); 및 하류 상동성 아암 (서열식별번호: 19). 일부 대안에서, 상기 언급된 구성성분 (상류 상동성 아암, 엑손 1, 가이드 RNA, T-for, 절단 부위, T-rev, 엑손, 또는 하류 상동성 아암 중 어느 하나 이상 포함) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 19를 포함하는 각 서열식별번호 중 어느 하나의 서열과 각각 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
일부 대안에서, CD40LG TALEN으로 표적화하는데 사용되는 CD40LG 유전자좌는 AAV 공여자와 함께 공동전달된다. 일부 대안에서 CD40LG TALEN 정방향 서열은 서열식별번호: 10에 의해 정의된다. 일부 대안에서, CD40LG TALEN 역방향 서열은 서열식별번호: 11에 의해 정의된다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 MND 프로모터의 제어하에 GFP 카세트를 포함한다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 MND 프로모터 구동된 GFP 카세트 (서열식별번호: 14)를 플랭킹하는 1 kb 상동성 아암을 갖는다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 서열식별번호: 14 및 15에 기재된 바와 같은 TALEN 및 가이드 서열에 의한 절단을 폐지하기 위한 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함한다.
CRISPR/Cas
본원에 제공된 일부 대안은 관심있는 유전자의 HDR에 사용하기 위한 Cas 뉴클레아제에 관한 것이다. 일부 대안에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. Cas9는 다른 박테리아 중에서 스트렙토코쿠스 피오게네스에서 CRISPR (클러스터링된 규칙적 산재성 회문식 반복부) 적응 면역 체계와 연관된 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다. 에스. 피오게네스는 Cas9를 사용하여, 외래 DNA, 예컨대 침입 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA를 기억하고 나중에 심문하고 절단한다. Cas9는 외래 DNA를 풀고 가이드 RNA의 20개 염기 쌍 스페이서 영역에 상보적인지 확인하여 이 심문을 수행한다. DNA 기질이 가이드 RNA에 상보적인 경우, Cas9는 침입 DNA를 절단한다.
일부 대안에서, Cas 뉴클레아제는 리보핵단백질 복합체 (RNP)로서 단일 가이드 RNA와 복합체로 전달된다. 일부 대안에서, CRISPR 가이드 서열은 서열식별번호: 12에 의해 정의된다. 일부 대안에서, RNP는 AAV 공여자와 공동전달된다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 자기-상보적 AAV (scAAV)이다. 일부 대안에서, AAV 공여자는 MND 프로모터의 제어하에 GFP 카세트를 포함하며, 여기서 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM) 부위는 결실된다.
일부 대안에서, 핵산은 단일 가이드 RNA (sgRNA), 예컨대 서열식별번호: 12 중 어느 하나에 의해 코딩된 것을 포함한다. 일부 대안에서, sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 12의 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일하다.
세포
본원에 제공된 일부 대안은 세포에서 내인성 CD40LG 유전자좌를 변형시키기 위한 뉴클레아제, 예컨대 TALEN 또는 Cas 뉴클레아제, 및 AAV 공여자 주형의 공동전달에 관한 것이다. 일부 대안에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 자가 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 림프구이다. 일부 대안에서, 세포는 형질전환된 세포가 아니다. 일부 대안에서, 세포는 1차 림프구이다. 일부 대안에서, 세포는 림프구 전구체 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 T 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 조혈 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 CD34+ 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 1차 인간 조혈 세포이다.
일부 대안에서, 세포는 세포에서 내인성 CD40LG 유전자좌를 변형시키기 위한 뉴클레아제, 예컨대 TALEN 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제, 및 AAV 공여자 주형의 공동전달에 의해 형질전환된다. 일부 대안에서, 세포에서 CD40LG 유전자를 편집하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 가이드 RNA, 예컨대 TALEN 가이드 RNA 또는 CRISPR 가이드 RNA를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터를 세포에 도입하는 단계 (여기서 가이드 RNA는 상기 세포에서 적어도 하나의 표적 유전자에 상보적임), 및 뉴클레아제, 예컨대 TALEN 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제, 그의 유도체 또는 단편을 코딩하는 제2 핵산 서열을 상기 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 세포가 제공되며, 여기서 세포는 상기 방법에 의해 제조된다. 일부 대안에서, 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 핵산 조성물, 예컨대 서열식별번호: 1-27 중 하나 이상에 따른 서열 또는 이에 의해 코딩된 서열, 또는, 예를 들어, 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및/또는 27 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이에 의해 코딩된 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에서 동일한 서열을 세포에 제공하는 단계를 포함한다.
요법 방법
본원에 제공된 일부 대안은 CD40LG 유전자의 HDR 촉진을 필요로 하는 대상체에서 CD40LG 유전자의 HDR을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 일부 대안에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체를 선택 또는 확인하는 단계를 포함한다. 선택 또는 확인된 이를 필요로 하는 대상체는 X-HIGM의 증상을 나타내는 대상체, 또는 X-HIGM으로 진단된 대상체이다. 이러한 평가는 임상적으로 또는 진단 시험에 의해 이루어질 수 있다.
일부 대안에서, 방법은 필요로 하는 대상체에게 처리된 세포의 입양 세포 요법 또는 입양 세포 전달을 포함한다. 일부 대안에서, 입양 세포 요법 또는 입양 세포 전달은 대상체에서 CD40LG 유전자의 상동성 지정 복구를 촉진하기 위한 세포 투여를 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체로부터 세포를 얻는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 필요로 하는 대상체로부터의 세포는 1차 인간 조혈 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 세포에서 내인성 CD40LG 유전자좌를 변형시키는, 뉴클레아제, 예컨대 TALEN 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제, 및 AAV 공여자의 공동전달에 의해 형질전환된다. 일부 대안에서, 방법은 형질전환된 세포를 확장하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 세포에서 CD40LG 유전자좌의 성공적인 변형을 갖는 형질전환된 세포를 선택하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 형질전환된 세포는 환자에게 투여된다.
일부 대안에서, 환자에게 형질전환된 세포를 투여하는 것은 환자에게 자가 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 환자에게 형질전환된 세포를 투여하는 것은 X-HIGM의 증상을 치료, 억제 또는 호전시킨다. 일부 대안에서, 환자에게 형질전환된 세포를 투여하는 것은 X-HIGM을 치료한다. 일부 대안에서, 방법은 박테리아성 또는 기회 감염을 감소시킨다. 일부 대안에서, 방법은 간헐성 호중구감소증을 감소시킨다.
일부 대안에서, 처리된 세포의 양이 조성물로 투여된다. 일부 대안에서, 투여되는 세포의 양은 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 또는 1×109개 또는 그 초과의 세포, 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 양이다.
일부 대안에서, 처리된 세포는 장애의 증상을 치료하기 위해 사용되거나 장애를 치료하기 위해 사용되는 추가 요법과 함께 공동요법으로 대상체에게 투여된다. 일부 대안에서, 추가 요법은 이뮤노글로불린 요법, 항생제 요법, 항미생물 요법, 골수 자극 요법 (예컨대, 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 요법), 골수 이식 요법, 코르티코스테로이드 요법, 또는 수혈 요법을 포함한다.
제약 조성물
본원에 제공된 시스템 또는 방법에 의해 제조된 세포는 CD40LG 유전자좌의 표적화된 상동성 지정 복구 및 치료적 또는 예방적 적용, 예를 들어, X-HIGM의 치료, 억제 또는 호전을 위해 환자에게 직접 투여될 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 본원에 제공된 시스템에 의해 제조된다. 일부 대안에서, 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 조성물은 X-HIGM을 치료, 예방, 호전 또는 억제하는 방법 또는 X-HIGM과 연관된 질환 상태 또는 증상을 호전시키는 방법에 사용될 수 있다.
세포를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 방식으로, 및 일부 대안에서 제약상 허용되는 담체와 함께 투여된다. 세포를 포함하는 이러한 조성물을 투여하는 적합한 방법이 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 초과의 경로가 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 부분적으로 투여될 특정 조성물, 뿐만 아니라 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 이용가능한 제약 조성물의 다양한 적합한 제형이 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조).
비경구 투여, 예컨대, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 및/또는 피하 경로에 의한 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제, 및/또는 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및/또는 비수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및/또는 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있는 수성 및/또는 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 개시된 조성물은 예를 들어, 정맥내 주입에 의해, 경구로, 국소로, 복강내로, 방광내로 또는 경막내로 투여될 수 있다. 화합물의 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉된 컨테이너, 예컨대 앰플 또는 바이알에 제공될 수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및/또는 정제로부터 제조될 수 있다.
일부 대안에서, 비경구, 피하, 관절내, 기관지내, 복강내(intraabdominal), 관절낭내, 연골내, 강내, 복내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액낭내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 투여 경로 중 하나 이상이 고려된다. 일부 대안에서, 투여될 조성물은 상기 언급된 경로 중 하나 이상을 통한 전달을 위해 제제화될 수 있다.
세포에서 CD40LG 유전자를 편집하는 특정 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 세포에서 CD40LG 유전자를 편집하는 방법을 포함한다. 이러한 일부 실시양태는 (i) 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하거나, TALEN을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계, 및 (ii) 주형 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD40LG 유전자는 서열식별번호:13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호:12의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계는 세포를 CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 리보핵단백질 (RNP)과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP는 0.1:1 내지 1:10의 비율, 1:1 내지 1:5의 비율, 약 1:1.2의 비율을 갖는 CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 CD40LG 유전자의 적어도 일부 또는 그의 상보체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 야생형 CD40LG 유전자의 적어도 일부 또는 그의 상보체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 CD40LG 유전자의 적어도 또는 적어도 약 1 kb를 포함한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터이다.
일부 실시양태에서, 단계 (i)은 단계 (ii) 전에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (i) 및 (ii)는 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 뉴클레오펙션을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오펙션을 수행하는 것은 론자 시스템의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 구형파 펄스의 사용을 포함한다.
일부 실시양태는 또한 세포를 IL-6과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-6은 약 20 ng/ml 내지 약 500 mg/ml 또는 20 ng/ml 내지 500 mg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 150 mg/ml 또는 50 ng/ml 내지 150 mg/ml, 또는 약 100 mg/ml 또는 100 mg/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-6은 적어도 또는 적어도 약 1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 500 ng/ml의 농도, 또는 전술한 농도 중 임의의 2개의 범위 내의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 무혈청 확장 배지 II (SFEMII) 배지에서 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 세포를 포함하고, 집단은 약 1 X 105개 세포/ml 내지 약 1 X 106개 세포/ml 또는 1 X 105개 세포/ml 내지 1 X 106개 세포/ml, 약 1 X 105개 세포/ml 내지 약 5 X 105개 세포/ml 또는 1 X 105개 세포/ml 내지 5 X 105개 세포/ml, 또는 약 2.5 X 105개 세포/ml 또는 2.5 X 105개 세포/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 2,000,000개 세포/ml, 1,000,000개 세포/ml, 500,000개 세포/ml, 250,000개 세포/ml, 100,000개 세포/ml, 50,000개 세포/ml, 10,000개 세포/ml, 1000개 세포/ml 미만 또는 약 2,000,000개 세포/ml, 약 1,000,000개 세포/ml, 약 500,000개 세포/ml, 약 250,000개 세포/ml, 약 100,000개 세포/ml, 약 50,000개 세포/ml, 약 10,000개 세포/ml, 약 1000개 세포/ml 미만의 밀도, 또는 전술한 밀도 중 임의의 2개의 범위 내의 밀도를 갖는다.
일부 실시양태는 또한 단계 (i) 및 (ii)가 수행된 후 세포 집단을 희석하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 단계 (i) 및 (ii)가 수행된 후 약 16시간 또는 16시간에 희석된다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 약 250,000개 세포/ml 또는 250,000개 세포/ml로 희석된다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 2,000,000개 세포/ml, 1,000,000개 세포/ml, 500,000개 세포/ml, 250,000개 세포/ml, 100,000개 세포/ml, 50,000개 세포/ml, 10,000개 세포/ml, 1000개 세포/ml 미만 또는 약 2,000,000개 세포/ml, 약 1,000,000개 세포/ml, 약 500,000개 세포/ml, 약 250,000개 세포/ml, 약 100,000개 세포/ml, 약 50,000개 세포/ml, 약 10,000개 세포/ml, 약 1000개 세포/ml 미만으로, 또는 전술한 밀도 중 임의의 2개의 범위 내의 밀도로 희석된다.
일부 실시양태는 또한 세포를 줄기 세포 인자 (SCF), FMS-유사 티로신 키나제-3 (Flt-3), 트롬보포이에틴 (TPO), TPO 수용체 효능제, UM171 또는 스템레게닌 (SR1)과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TPO 수용체 효능제는 엘트롬보팍을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 세포를 HDM2 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, HDM2 단백질은 약 1 nM 내지 약 50 nM 또는 1 nM 내지 50 nM, 또는 약 6.25 nM 내지 약 25 nM 또는 6.25 nM 내지 25 nM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, HDM2 단백질은 적어도 또는 적어도 약 1 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM의 농도, 또는 전술한 농도 중 임의의 2개의 범위 내의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 적어도 또는 적어도 약 1000 MOI의 AAV, 또는 적어도 또는 적어도 약 2500 MOI의 AAV와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포를 포함하는 세포 집단은 적어도 또는 적어도 약 10 MOI, 100 MOI, 200 MOI, 500 MOI, 1000, 2000, 5000 MOI 또는 10000 MOI의 AAV의 양 또는 농도, 또는 전술한 숫자 중 임의의 2개의 범위 내의 양 또는 농도와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 세포는 적어도 또는 적어도 약 100 μg/ml의 RNP, 또는 적어도 또는 적어도 약 200 μg/ml의 RNP와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포는 적어도 또는 적어도 약 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml 또는 1000 μg/ml의 농도, 또는 전술한 농도 중 임의의 2개의 범위 내의 농도를 갖는 RNP와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 약 1,000,000개 세포/20 μl 뉴클레오펙션 반응물 또는 1,000,000개 세포/20 μl 뉴클레오펙션 반응물을 접촉시키는 것을 포함하며, 뉴클레오펙션 반응물은 gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오펙션 반응은 10 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 500 μl, 1000 μl, 1500 μl, 2000 μl, 50000 μl 또는 약 10 μl, 약 50 μl, 약 100 μl, 약 200 μl, 약 500 μl, 약 1000 μl, 약 1500 μl, 약 2000 μl, 약 50000 μl의 부피, 또는 전술한 부피 중 임의의 2개의 범위 내의 부피에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 세포는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간이다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외이다.
<실시예>
실험 방법
비-비만 당뇨병 (NOD) scid 감마 마우스 (NSG) 마우스를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)에서 구입하였다. 모든 동물 연구를 실험 동물 관리 평가 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC) 표준에 따라 수행하고, SCRI 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)의 승인을 받았다. 6 내지 10주령 마우스를 포스페이트-완충 염수에 1:1 희석된 25 또는 35 mg/kg의 BUSULFEX (헨리 샤인 인크.(Henry Schein Inc.))를 복강내 주사를 통해 처리하였다. 24시간 후, 포스페이트-완충 염수 중 2 × 106개 모의 또는 유전자 편집된 조혈 줄기 세포를 안구뒤 주사를 통해 전달하였다. 동물을 이식 12 내지 16주 후 안락사시키고, 대퇴골 및 비장을 인간 세포의 생착에 대해 분석하였다.
CD34+ 조혈 줄기/선조 세포의 생체외 배양. PBMC 동원된 성인 공여자로부터 농축된 동결보존된 CD34+ 세포를 프레드 허친슨 암 연구 센터의 혈액학 우수 코어 센터(Core Center for Excellence in Hematology at the Fred Hutchinson Cancer Research Center)에서 수득하였다. 세포를 해동하고, 무혈청 줄기 세포 성장 배지 [트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자 및 FLT3 리간드 (페프로텍(PeproTech))를 갖는 셀제닉스 GMP SCGM 배지 (셀제닉스 인크.(CellGenix Inc.)), 모두 100 ng/ml임]에서 1 × 106개 세포/ml로 플레이팅하였다. IL-3 (60 ng/ml) 또는 IL-6 (100 ng/ml)을 나타낸 바와 같이 배지에 첨가하였다. 소분자 스템레게닌 1 (스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies)), UM171 (에이펙스바이오(ApexBio)), 및 엘트롬보팍 (셀렉켐(Selleckchem))을 전체 실험에 걸쳐 사용된 줄기 세포 성장 배지에 각각 1 μM, 35 nM, 및 3 μg/ml로 첨가하였다.
유전자 편집 CD34+ 조혈 줄기/선조 세포. CD34+ 세포를 줄기 세포 성장 배지에서 시토카인으로 48시간 동안 37℃에서 사전자극시킨 후, Neon 형질감염 시스템 및 10-μl 팁 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 전기천공하였다. 세포를 1000 내지 5000의 MOI 공여자 주형 AAV와 함께 400 μL의 배지를 함유하는 24 웰 플레이트에 분배하였다. 전기천공 및 AAV 형질도입 24시간 후, AAV 함유 배지를 제거하고, 신선한 줄기 세포 성장 배지로 대체하였다. 생존율 및 GFP의 분석을 편집 후 2 및 5일차에 수행하였다. 줄기 세포 표현형 (CD34+CD38-CD90+CD133+)의 분석을 편집 24 또는 48시간 후 수행하였다. 뮤린 생착 실험을 스케일 업 할 때, 다음 변화를 제외하고 동일한 편집 조건을 사용하였다: 동일한 농도의 세포 및 뉴클레아제를 사용하여 전기천공에 100 μL Neon 팁을 사용하였다. 세포를 6 웰 플레이트에서 AAV를 함유하는 4 mL의 배지에 분배하였다. 24시간 후, 세포를 수집하고, 주사 전에 PBS로 2회 세척하였다.
AAV 스톡을 이전에 기재된 바와 같이 생산하였다 (Khan, I.F., R.K. Hirata, and D.W. Russell, Nat Protoc, 2011. 6(4): p. 482-501). AAV 벡터, 혈청형 헬퍼, 및 아데노바이러스 헬퍼 (HgT1-아데노) 플라스미드를 HEK293T 세포로 형질감염시켰다. 세포를 48시간 후에 수집하고, 3회 동결-해동 사이클로 용해시켰다. 용해물을 후속적으로 벤조나제로 처리하고, 아이오딕사놀 밀도 구배를 통해 정제하였다. 도립 말단 반복부 (ITR)-특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 AAV 게놈의 qPCR에 의해 바이러스 스톡의 역가를 결정하였다 (Aurnhammer, C., et al., Hum Gene Ther Methods, 2012. 23(1): p. 18-28).
재조합 AAV 벡터. 이전에 문헌 [Hubbard et al. (Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22)]에 기재된 것으로부터 모든 플라스미드를 적응시켰다. pAAV.MND.GFP.WPRE 리포터 구축물을 생성하기 위해, MND 변형된 레트로바이러스 프로모터를 이전에 기재된 pAAV CD40LG[GFP.WPRE] 플라스미드 (서열식별번호: 16)에 삽입하였다.
코돈-최적화된 CD40L, 말단절단된 Woodchuck 간염 바이러스 전사 후 조절성 요소 3 (WPRE3), 및 추가 상류 서열 요소를 함유하는 후기 SV40 폴리아데닐화 신호를 플랭킹하는 1kb 상동성 영역을 갖도록 pAAV.CD40L.cDNA.WPRE3 (서열식별번호: 15) 공여자 주형을 설계하였다 (Choi, J.-H., et al., Molecular brain, 2014. 7(1): p. 17). 전체 CD40L.cDNA.WPRE3.synPolyA를 유전자 합성하고 (진아트(GeneArt)), 주입 클로닝 (클론테크(Clontech))에 의해 CD40LG 유전자좌에 대해 2개의 플랭킹 1kb 상동성 영역을 갖는 pAAV 백본으로 클로닝하였다.
그래프패드(GraphPad) 프리즘(Prism) 7 (그래프패드(GraphPad), 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 다중 비교의 경우, 일원 ANOVA를 사용하여 p-값을 계산하였다. 달리 언급되지 않는 한, 2개의 그룹을 비교하는 경우, 독립표본 양측 t 검정을 사용하여 p 값을 계산하였다. 모든 막대 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
Neon 형질감염 시스템 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 모든 전기천공을 수행하였다. 전기천공 전에, 세포를 수집하고, PBS로 세척하였다. 세포를 Neon 버퍼 T에 재현탁시켜, Cas9 RNP (100 또는 200 μg의 Cas9 단백질/총 반응 부피 ml) 또는 mRNA (50 μg의 각 CD40L TALEN/총 반응 부피 ml)의 첨가 후, 최종 농도는 2.5 × 107개 세포/ml였다. 뉴클레아제와 혼합한 후, 10 μL Neon 팁 당 2.5 x 105개 세포를 전기천공하였다 (1400 V, 20 ms, 1 펄스).
마우스 생착 연구를 위해 스케일 업 할 때, 모든 시약 농도는 동일하였지만, 총량은 전기천공 당 10배 증가하였으며, 100 μL Neon 팁을 사용하였다. 그러므로, 2.5 × 106개 세포를 Cas9 RNP (100 또는 200 μg/ml) 또는 mRNA (50 μg/ml 각 CD40L TALEN)와 혼합하고, 100 μL Neon 팁을 사용하여 전기천공하였다. 각 조건에 대해 다중 100 μL 반응을 수행하였다.
콜로니 형성 단위. 모의 또는 유전자-편집된 HSPC를 볼텍싱에 의해 메틸셀룰로스-기반 메토컬트(MethoCult) H4034 옵티멈(Optimum) 배지 (스템셀 테크놀로지스)와 격렬하게 혼합하였다. 혼합 후, 1.1 ml의 메틸셀룰로스-기반 배지 중 500개 세포를 35 mm 격자 접시에 분배하였다. 세포를 14일 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 콜로니를 분류하고, 제조 문서 (스템셀 테크놀로지스)에 기초하여 정량화하였다. EVOS fl 도립 현미경 (AMG)을 사용하여 GFP 발현 콜로니를 정량화하였다.
DNeasy 혈액 및 조직 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)로부터 게놈 DNA를 단리하였다. CD40LG 유전자좌에서 편집 비율을 평가하기 위해, AAV 삽입 내에 결합하는 정방향 프라이머 및 상동성 영역 외부의 CD40LG 유전자좌에 결합하는 역방향 프라이머로 "인-아웃" 액적 디지털 PCR을 수행하였다. 대조군으로서 작용하기 위해 ActB 유전자 (서열식별번호: 17)에 대해 유사한 크기 (1.3 kb)의 대조군 앰플리콘을 생성하였다. 두 앰플리콘 모두에 대한 프로브를 FAM으로 표지하고, 반응을 별도의 웰에서 수행하였다. 각 HDR 및 대조군 반응에 대해 별도의 웰에서 2개의 이중을 수행하였다. QX200 액적 생성기 (바이오-래드(Bio-Rad))를 사용하여 PCR 반응물을 액적으로 분배하였다. UTP가 없는 프로브용 ddPCR 수퍼믹스 (바이오-래드), 900 nM의 프라이머, 250 nM의 프로브, 50 ng의 게놈 DNA, 및 1% DMSO를 사용하여 증폭을 수행하였다. 액적을 QX200 액적 디지털 PCR 시스템 (바이오-래드)을 사용하여 분석하고, 콴타소프트(QuantaSoft) 소프트웨어 (바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. CD40LG가 X 염색체에 존재하기 때문에, 남성 공여자 세포로부터의 편집 비율을 CD40LG/ActB 양성 액적으로부터의 카피/μl 비율에 2를 곱하여 계산하였다.
유동 세포계측법 분석을 LSR II 유동 세포계측기 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에서 수행하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))를 사용하여 데이터를 분석하였다. 골수 및 비장 내의 다양한 조혈 계통에서 편집된 세포의 생착을 평가하기 위해, 세포를 다음 형광단-접합 항체로 염색하였다: 인간 CD45-eFluor450 (클론 HI30, 이바이오사이언스(eBioscience)), 마우스 CD45-APC (클론 30-F11, 이바이오사이언스), CD33-PE (클론 WM53, BD 바이오사이언시스), 및 CD19-Pe/Cy7 (클론 HIB19, 이바이오사이언스) (상세한 게이팅 전략에 대해 도 11 참조). 조혈 줄기 세포 표현형을 평가하기 위해, 세포를 다음 형광단-접합 항체로 염색하였다: CD34-APCCy7 (클론 581, 바이오레전드(BioLegend)), CD38-PerCPCy5.5 (클론 HIT2, BD 바이오사이언시스), CD90-APC (클론 5E10, BD 바이오사이언시스), 및 CD133-PE (클론 AC133, 밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec)).
mRNA 합성. pEVL CD40LG.TALEN (서열식별번호: 21 및 22) 구축물을 BsaI를 사용하여 선형화하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 T7 mScript 표준 mRNA 생성 시스템 (셀스크립트(Cellscript))을 사용하여 시험관내 전사 및 5'-캡핑을 수행하였다. 선형화된 주형을 비변형된 mRNA 전사체로 시험관내 전사하고, 제공된 효소를 사용하여 캡-1 mRNA 구조 (2'-O-메틸트랜스퍼라제)로 캡핑하였다 (5'-7-메틸구아닐레이트 캡). 뉴클레오스핀(NucleoSpin) RNA 클린-업(Clean-up) 키트 (마커리 네이겔(Machery Nagel))를 사용하여 최종 정제를 수행하였다.
뉴클레아제 설계. CD40LG TALEN은 pUC57 백본이 아닌 pEVL 백본 (서열식별번호: 20)에 클로닝된 점을 제외하고 문헌 [Hubbard et al.]에서 이전에 기재된 것과 동일하였다 (Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22; Grier, A.E., et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2016. 5).
2개의 뉴클레아제 플랫폼의 비교를 편향하지 않도록 CD40LG TALEN 쌍에 의해 생성된 DSB 부위에 가능한 한 근접하게 이중-가닥 파단 (DSB)을 생성하도록 CRISPR sgRNA (서열식별번호: 12)를 설계하였다. 합성 sgRNA (5' - AAAGUUGAAAUGGUAUCUUC - 3', 서열식별번호:28)를 신테고(Synthego)(미국 캘리포니아주 플레전턴)에서 구입하고, 5' 및 3' 말단 둘 모두에서 2'-O-메틸 유사체 및 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결로 화학적으로 변형시켰다. 전기천공 직전에 15분 동안 Cas9 단백질 (통합된 DNA Technologies)을 sgRNA와 1:1.2 몰비로 인큐베이션함으로써 Cas9 RNP를 제조하였다.
실시예 1-CD34+ 조혈 줄기 세포에서 CD40LG-표적화 HDR
본 실시예는 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 CD40LG 유전자좌에 GFP 리포터를 도입하는 방법을 설명한다. 본원에 기재된 시스템, 방법 및 조성물의 측면은 시토카인 사전자극 조건, 최적의 세포 밀도, 전기천공 조건, 및 AAV 및 뉴클레아제 전달의 상대적 타이밍을 포함하여 건강한 공여자로부터 농축된 혈액 동원된 CD34+ 세포를 편집하는 효율을 개선시키는 것에 관한 것이다 (도 3). 동결된 CD34+ 세포를 해동하고, 뉴클레아제 및 AAV의 이중 전달 전에 48시간 동안 배양하였다. AAV6 공여자 주형 및 TALEN 또는 RNP 뉴클레아제의 이중 전달 2일 후, 세포를 단리하고 전달을 분석하였다 (도 3). 세포는 모의 처리된 세포와 비교하여 생존율의 오직 20% 감소를 나타내었다 (도 4a). 유전자 편집 5일 후, 비-통합된 AAV로부터의 발현을 나타내는 AAV 단독 대조군에서의 배경 GFP 발현은 거의 0으로 감소되었다 (도 4a). 동시에, AAV + TALEN (AAV/TALEN) 처리된 세포의 약 20%, 및 AAV/RNP 처리된 세포의 약 30%는 HDR을 나타내는 높은 MFI로 GFP를 발현하였다 (도 4b). AAV/RNP로 처리된 세포의 액적-디지털 PCR (ddPCR)에 의해 MND.GFP 리포터 주형의 이음매 없는 온-타겟 통합을 확인하였다 (도 5). 또한, AAV/RNP로 처리된 세포는 메틸셀룰로스 콜로니 형성 단위 (CFU) 검정에 의해 결정된 바와 같이 모의 처리된 세포 (도 6a 및 도 6b)와 비교하여 총 콜로니 수 또는 콜로니 유형의 차이가 없었다. 또한, HDR-편집된 콜로니의 백분율은 콜로니 유형에 의해 왜곡되지 않았으며, 유동 세포계측법에 의해 검출된 GFP+ 콜로니의 백분율과 유사하였다 (도 6c, 도 6c, 도 6d). TALEN과 비교하여 RNP에 의한 증가된 생존율 및 HDR 비율로 인해, RNP 뉴클레아제를 사용하여 모든 후속 실험을 수행하였다.
실시예 2-조혈 줄기 세포에서 HDR을 위한 시토카인 조건
본 실시예는 조혈 줄기 세포에서 HDR을 위한 시토카인 반응을 조정하는 방법을 설명한다. CD34+ 세포에 대한 생체외 배양에 사용하기 위한 2개의 시토카인 칵테일을 시험하였다. 2개의 칵테일은 100 ng/ml의 줄기 세포 인자 (SCF), FMS-유사 티로신 키나제-3 (Flt-3), 및 트롬보포이에틴 (TPO)을 포함하였으며, 여기에 60 ng/ml의 인터루킨-3 (IL-3) 또는 100 ng/ml의 인터루킨-6 (IL-6)을 첨가하여 세포 확장을 촉진하였다. IL-3을 함유하는 배지에서 성장한 세포는 편집 48시간 후 더 높은 생존율을 나타내고 (도 7a, 도 7b, 도 7c, 도 7d), 벌크 집단에서 더 높은 HDR 비율을 나타내었다 (도 7e). 그러나, IL-6과 함께 배양했을 때, LT-HSC 집단 (CD34+, CD38-, CD90+, 및 CD133+)은 IL-3-처리 세포 수의 2배로 회수되었다. 또한, IL-3과 비교하여 IL-6의 존재하에 배양된 세포의 약간 더 높은 백분율이 LT-HSC 집단 내에서 GFP를 발현하였다. 또한, AAV 용량을 세포 2500개 바이러스 입자로 증가시키고 RNP 용량을 200 μg/ml로 증가시킴으로써 IL-6을 갖는 벌크 세포 집단에서 강력한 HDR 비율이 달성되었다.
실시예 3-내인성 프로모터에 의해 조절되는 CD40L cDNA의 삽입
본 실시예는 내인성 CD40LG 프로모터의 하류에서 CD40L cDNA의 효율적인 혼입 방법을 설명한다. 본 실시예는 치료 목적을 위한 CD40L cDNA의 내인성 프로모터-구동 발현을 설명한다. 내인성 프로모터의 하류에 도입된 CD40L cDNA로 편집된 T 세포는 비편집된 세포와 동등한 CD40L 표면 발현을 나타낸다 (Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22). 조혈 줄기 세포를 편집하기 위해, 코돈-최적화된 CD40L cDNA, WPRE3 요소, 및 합성 폴리아데닐화 서열에 플랭킹한 동일한 1 kb 상동성 아암을 함유하는 AAV 공여자 주형 (서열식별번호: 15)을 설계하였다 (도 8) (Choi, J.-H., et al., Molecular brain, 2014. 7(1): p. 17). ddPCR에 의해 측정된 바와 같이 세포의 약 25%에서 cDNA의 표적화된 통합이 관찰되었다 (도 9a 및 도 9b). 그러므로, CD40L cDNA는 내인성 CD40LG 프로모터의 하류에 성공적으로 도입되었다.
실시예 4-NOD-scid-IL2RgNULL 마우스에서 편집된 세포의 생착
본 실시예는 NSG 마우스의 골수에서 편집된 세포의 생착을 위한 방법을 설명한다. CD34+ 세포의 강력한 편집 후, 편집된 세포의 장기간 재증식 잠재력을 결정하기 위해 세포를 NOD-scid-IL2RgNULL (NSG) 마우스에 이식하였다. 편집된 세포의 표현형을 용이하게 추적하고 결정하기 위해 MND.GFP 리포터 구축물을 사용하여 이들 세포를 편집하였다. 이를 달성하기 위해, 편집 시약을 "고용량" (2.5K MOI AAV 및 200 μg/ml RNP) 또는 "저용량" (1K MOI AAV 및 100 μg/ml RNP)으로 사용하였다. 생체내 실험을 위해 스케일 업 할 때, 더 작은 규모의 연구와 비교하여 편집 후 증가된 생존율과 함께 필적하는 HDR 비율 (도 10a 및 도 10b). 배양 시간을 단축하기 위해, AAV 및 RNP의 전달 24시간 후 편집된 세포를 NSG 마우스에 이식하였다. 각 동물로부터의 골수 및 비장을 이식 12-16주 후 수확하고, HDR-편집된 인간 세포의 존재에 대해 분석하였다 (도 11).
1K MOI AAV 및 100 μg/ml RNP로 처리된 세포는 비처리된 세포에서 59%와 비교하여 골수에서 47.7%의 평균 hCD45 생착을 가졌다 (도 12c). 반면에, 2.5K MOI AAV 및 200 μg/ml RNP로 처리된 세포는 비처리된 CD34+ 세포 (59%)와 비교하여 hCD45 생착 (16.2%)의 더 현저한 감소를 나타내었다. GFP 발현은 고용량 AAV + RNP로 편집된 인간 세포의 1.4%에서 검출되었으며, 이는 마우스가 HDR-편집된 장기간 재증식 조혈 줄기 세포를 수용하였음을 나타낸다. 이에 비해, 저용량 AAV + RNP로 처리된 세포의 오직 5.0e-3%만이 마우스로부터 회수될 때 GFP를 발현하였다 (도 12d). 이식 당시 두 세포 집단 간의 HDR 비율의 차이는 고용량의 경우 26.8% 대 저용량-처리 세포의 경우 4.9%라는 점을 감안할 때 골수에서 유지된 편집된 세포의 백분율의 이러한 거의 3-log 차이는 놀라운 것이었다 (도 10a 및 도 10b).
AAV + RNP로 처리된 세포의 표현형은 비처리된 대조군 세포와 유사하였다. AAV + RNP 처리된 세포 또는 비처리된 세포를 수용한 마우스에서, CD33+, CD19+ 및 CD34+의 비율은 유의하게 상이하지 않았다 (도 12e). 또한, 편집된 GFP+ 세포는 각각의 CD33+, CD19+ 및 CD34+ 집단에서 유사한 비율로 발견되었다 (도 12a, 도 12b, 및 도 13g). 이는 편집이 조혈 세포의 분화 잠재력을 파괴하지 않았으며 진정한 LT-HSC가 편집되고 있음을 시사하였다.
hCD45 생착 및 GFP 발현의 유사한 패턴이 비장에서 발견되었다. 저용량 편집된 세포로 이식된 마우스는 비처리된 세포를 수용한 마우스와 비교하여 비장 hCD45+ 세포의 백분율의 최소 감소 (27.4% vs. 36%)를 나타내었다 (도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d). 고용량 편집된 세포로 이식된 마우스의 비장은 13.1% hCD45+ 세포로 이루어졌다. hCD45+ 세포의 GFP-발현 분획은 고용량 편집된 세포를 수용한 마우스에서 0.9%였지만, 저용량 편집된 세포를 수용한 마우스는 hCD45+ 세포 중에서 0.03% GFP 양성만을 가졌다 (도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d).
실시예 5-편집된 세포의 생착에 대한 소분자의 효과
본 실시예는 NSG 마우스에서 편집된 세포의 생착에 대한 소분자의 영향을 설명한다. 이식 후 최대 16주까지 NSG 마우스에서 편집된 세포가 검출되었다. 본 실시예는 편집되고 생착할 수 있는 LT-HSC의 수를 추가로 증가시키는 방법을 설명한다. 생체외 LT-HSC의 자기-재생을 촉진하는 소분자를 배양 시스템에 도입하였다 (Fares, I., et al., Science, 2014. 345(6203): p. 1509-12; Sun, H., et al., Stem Cell Res, 2012. 9(2): p. 77-86). 자기-재생의 유도는 2배 이점을 제공하였으며: HDR을 겪기 위해 세포가 순환 (G 또는 S2 단계에서)하는 것이 유용하였고, 자기-재생 줄기 세포는 골수에 생착하고 장기간 지속되는 능력을 유지하였다.
소분자 UM171 및 SR-1은 조혈 줄기 세포의 자기-재생을 증가시키고, 조합을 최근 HDR-편집된 세포의 생착을 지원하는데 사용하였다 (Schiroli, G., et al., Sci Transl Med, 2017. 9(411); Bak, R.O. and M.H. Porteus, Cell Rep, 2017. 20(3): p. 750-756; Bak, R.O., et al., Elife, 2017, 6; Fares I., et al., (2013) Blood 122:798). 편집 비율 및 편집된 세포의 생착에 대한 이들 소분자의 효과를 분석하였다. UM171 및 SR-1을 배양 배지에 첨가하는 것은 편집 후 세포 생존율을 약간 증가시켰지만, 벌크 집단에서 또는 LT-HSC로 염색된 세포에서 HDR 비율에 대한 유의한 효과를 갖지 않았다 (도 13a 및 도 15a, 도 15b, 도 15c, 도 15d, 도 15e). 특히, 편집 48시간 후 LT-HSC로 염색되는 세포의 백분율은 소분자의 첨가로 2배 초과로 증가하였다 (도 13b). 종합적으로, 이들 데이터는 본원에 기재된 배양 시스템의 일부 대안에서 UM171 및 SR-1의 첨가가 시토카인 단독보다 HSC의 줄기성을 더 많이 유지하였지만, HDR 비율에 영향을 미치지 않았다는 증거를 제공하였다.
또 다른 소분자인 엘트롬보팍은 CD34+/CD38- 세포를 확장할 수 있다 (Sun, H., et al., Stem Cell Res, 2012. 9(2): p. 77-86). 재생불량성 빈혈 치료를 위해 승인된 약물인 엘트롬보팍은 TPO 수용체, c-mpl의 효능제이다. 엘트롬보팍의 첨가는 생존율에 유의한 영향 없이 편집된 세포의 백분율을 약 5%만큼 증가시켰다 (도 16a, 도 16b, 도 16c, 도 16d, 도 16e, 도 16f, 도 16g). 약물로 LT-HSC로 염색된 세포의 백분율의 약간 증가가 있었다.
NSG 마우스에서 생착하는 편집된 세포의 능력에 대한 이들 소분자의 영향을 시험하였다. UM171 및 SR-1의 첨가는 AAV + RNP로 처리된 세포에 대한 골수에서 전체 hCD45 생착을 16.2%에서 25.4%로 약간 증가시켰다 (도 13d). GFP+인 인간 세포의 백분율은 2개의 소분자가 있거나 없는 상태에서 유사하였다 (도 13e). 골수에서 인간 세포 중 CD33+ 골수성 및 CD19+ B 세포의 백분율은 또한 유의하게 상이하지 않았고, 편집된 세포가 두 집단에서 거의 동일한 비율로 검출되었다 (도 13f 및 도 13g). 또한, UM171 및 SR-1의 존재하에, 골수에서 편집된 세포의 백분율은 2일 또는 4일이 아닌 편집 1일 후에 세포를 이식했을 때 가장 높았다 (도 17a, 도 17b).
엘트롬보팍을 배양 배지에 첨가하였을 때, 골수 또는 비장에서 전체 hCD45 생착에 대한 영향이 없었다 (도 16a, 도 16b, 도 16c, 도 16d, 도 16e, 도 16f, 도 16g). 그러나, 저용량 AAV + RNP에서는, 골수 및 비장 둘 모두에서 GFP+ 세포의 백분율이 약간 증가하였다. 대조적으로, 고용량 AAV + RNP를 UM171 및 SR1과 함께 사용하였을 때, 엘트롬보팍으로 편집된 세포의 백분율이 증가하지 않았다 (도 13e). 엘트롬보팍으로 인한 HDR 비율의 증가는 기준선 HDR 비율이 낮을 때 생체내에서만 검출가능할 수 있었다. 종합적으로, 이들 데이터는 엘트롬보팍이 LT-HSC 중 hCD45+ 세포의 생착 또는 편집 비율에 유의한 영향을 미치지 않았다는 증거를 제공하였다. UM171 및 SR1의 소분자 조합은 조혈 줄기 세포에서 HDR 비율을 증가시키지 않았지만, NSG 마우스에 이식했을 때 hCD45+ 생착의 전체 비율을 증가시켰다.
실시예 6-생체내 생착 잠재력에 대한 사전자극 시간의 효과
HDR 편집된 동원된 인간 CD34+ 세포의 생체내 생착 잠재력에 대한 더 긴 사전자극 시간의 효과를 시험하였다. 성인 동원된 인간 CD34+ 세포를 TPO, SCF, FLT3L 및 IL6 (100 ng/ml) + 35 nM UM171, 1 μM SR1로 보충된 SCGM 배지에서 48시간 또는 72시간 동안 1 x106개 세포/ml의 농도로 배양하였다. 그 후, Neon 시스템을 사용하여 배양된 세포를 200 μg/ml의 RNP로 전기천공한 다음, 1K의 MOI에서 GFP 리포터 카세트를 함유하는 rAAV6 표적화 벡터로 형질도입하였다. 24시간 후, 형질도입된 세포를 NSGW41 수용자 마우스에 이식하였다. 이식 1일 전에 마우스에 12.5 mg/kg 부설판을 주사하고, 이식 16주 후에 희생시켰다.
인간 세포의 총 생착은 골수 및 비장 둘 모두에서 72시간 동안 사전자극된 세포와 비교하여 48시간 동안 시토카인으로 사전자극된 CD34+ 세포에서 상대적으로 더 낮았다 (도 18 및 20). 그러나, 편집된 (GFP+) 세포의 생착은 더 긴 사전자극에서 상대적으로 더 높았다 (도 19 및 도 21).
실시예 7-배양 프로토콜의 비교
CD34+ 세포를 배양하기 위한 두 가지 대안적인 프로토콜 (프로토콜 A 또는 B)을 조사하였다. 표 1 및 도 22는 HDR-기반 유전자 편집을 위해 동원된 CD34+ HSC를 배양하기 위한 각 프로토콜에 대한 조건의 개요를 설명한다.
<표 1>
Figure pct00001
프로토콜 A의 경우, 동원된 인간 CD34+ 세포를 TPO, SCF, FLT3L 및 IL6 (100 ng/ml) + 35 nM UM171 1 μM SR1로 보충된 SCGM 배지에서 48시간 동안 1 x106개 세포/ml의 농도로 배양한 후, 론자 시스템을 사용하여 200 μg/ml의 RNP의 뉴클레오펙션을 수행하였다. 후속적으로 세포를 1K의 MOI에서 AAV 표적화 벡터로 형질도입하였다. 프로토콜 B의 경우, CD34+ 세포를 상기와 동일한 보충제를 함유하는 SFEMII 배지에서 배양하였다. 사전자극 동안 세포 밀도는 2.50E+05/ml였다. 48시간 사전자극 후, 론자 시스템을 사용하여 세포를 200 μg/ml의 RNP로 뉴클레오펙션하고, 2.5K의 MOI에서 AAV로 형질도입 전에 1 x106개 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. 다음 날 세포를 W41 마우스에 이식하였다. 세포 이식 1일 전에 마우스에 12.5 mg/kg 부설판을 주사하였다.
실시예 1-5에서, 프로토콜 A를 사용하고, Neon 전기천공 시스템을 사용하여 전기천공을 수행하였다. Neon 시스템에 의한 전기천공과 비교하여 론자 시스템에서 다양한 뉴클레오펙션 프로그램을 사용하여 세포 생존율의 비교를 수행하였다 (도 32). 성인 동원된 인간 CD34+ 세포를 SCGM 배지에서 배양한 후, Neon 또는 론자 기기에 의해 모의 형질감염 또는 RNP (200 μg/ml)의 형질감염을 수행하였다. Neon 시스템에 의한 전기천공과 비교하여 론자 시스템에서 다양한 뉴클레오펙션 프로그램을 사용하여 HDR 백분율 (GFP 발현)의 비교를 또한 수행하였다 (도 33). 성인 동원된 인간 CD34+ 세포를 SCGM 배지에서 배양한 후, Neon을 사용한 RNP (200 μg/ml) 전기천공 또는 론자에 의한 뉴클레오펙션을 수행하였다. 전기천공에 이어, AAV 표적화 벡터로 형질도입하였다. HDR 비율을 5일차에 GFP 발현에 의해 결정하였다. CM149는 최적의 생존율 및 HDR 비율을 유도하므로, 최적화된 생체내 연구에 사용하였다. 론자 시스템 및 전기천공 프로그램 CM149를 사용하여 증가된 CD34+ 세포 생존율 및 HDR 비율을 갖는 조건을 확인하였다 (도 32 및 도 33). 장기간 생착된, HDR-편집된 세포 GFP+ 세포의 평균 수의 증가는 뉴클레아제 전달을 위한 론자 뉴클레오펙터 시스템의 사용을 반영한 것으로 보였다.
다음에서, CD34+ 세포를 프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양하고, 론자 뉴클레오펙션 시스템을 사용하여 형질감염하였다.
골수로부터 회수된 세포와 관련하여, 프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양된 CD34+ 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 hCD45+ 세포 백분율을 결정하고 (도 23), 회수된 총 hCD45+ 세포 중 GFP+ 백분율을 결정하였다 (도 24). 인간 CD45+ 세포 중 CD19+ 세포 백분율을 결정하고 (도 25), 인간 CD19+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율을 결정하였다 (도 26). 프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양된 CD34+ 세포로 생착된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD33+ 세포 백분율을 결정하고 (도 27), 인간 CD33+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율을 결정하였다 (도 28). 이식 16주 후 NSGW41 마우스의 골수로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯은 도 29에 나타낸다.
비장으로부터 회수된 세포와 관련하여, 프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양된 CD34+ 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 백분율을 결정하고 (도 30), 회수된 인간 CD45+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율을 결정하였다 (도 31). 프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양된 CD34+ 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD19+ 세포 백분율을 결정하고 (도 34), 인간 CD19+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율을 결정하였다 (도 35). 프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양된 CD34+ 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 비장으로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD33+ 세포 백분율을 결정하고 (도 36), 인간 CD33+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율을 결정하였다 (도 37). 이식 16주 후 NSGW41 마우스의 비장으로부터 수확된 세포의 대표적인 유동 플롯은 도 38에 나타낸다.
프로토콜 A 또는 B를 사용하여 배양된 CD34+ 세포로 이식된 NSGW41 마우스의 골수로부터 회수된 인간 CD45+ 세포 중 CD34+CD38저 세포 백분율을 결정하고 (도 39), 인간 CD34+CD38저 CD45+ 세포 중 GFP+ 세포 백분율을 결정하였다 (도 40). 모의 또는 편집된 세포로 이식된 NSGW41 마우스로부터의 총 인간 CD45+ 세포에 게이팅된 CD34+의 대표적인 유동 세포계측법 분석은 도 41에 나타내며, 여기서 이식 16주 후 이식된 NSGW41 마우스로부터 골수 세포를 수확하고, LT-HSC (장기간 재증식 조혈 줄기 세포)의 존재에 대해 분석하였다. LT-HSC는 CD38의 낮은 발현 및 CD34 마커의 발현을 특징으로 하였다. 이러한 집단 내에서 편집된 세포의 존재를 나타내는 GFP+ 세포의 존재에 대해 이들 세포를 추가로 분석하였다. GFP+ 세포는 인간 HSC에서 CD40L 유전자좌의 지속적인 HDR-편집을 나타내는 이러한 장기간 HSC 집단 내에 존재한다.
이전 연구와 비교하여 두 프로토콜 (도 24, 도 31)을 사용한 HDR-편집된 (GFP+) 세포의 생착의 증가. 모든 수용자 NSG 동물은 골수 및 비장에서 골수성 및 B 세포 집단 둘 모두에서 생착된, HDR-편집된 인간 세포를 보유하였다 (도 25, 도 27, 도 34, 도 36). 이들 계통은 모의-편집된 인간 CD34+ 세포의 수용자와 동등한 비율로 존재하였다. 이들 데이터는 다능성 HSC의 편집과 일치하였고, HDR-편집된 줄기 세포의 분화 능력이 편집시 손상되지 않았음을 나타내었다. HDR-편집된 (GFP+) 세포는 모든 세포 계통 (B 및 골수성)에 존재하였고, 모의 세포와 동등한 비율로 존재하였다 (도 26, 도 28, 도 35, 도 37, 도 38). 특히, 골수 내에 생착된 인간 CD45+ 조혈 줄기 세포 (HSC)의 백분율 (CD38저 CD34+의 발현에 의해 정의된 바와 같음)은 모의 및 HDR-편집된 수용자에서 동등하였다 (도 39). GFP+ 세포는 생체내에서 장기간 지속될 수 있는 HSC의 편집과 일치하는 이 집단 내에 존재하였다 (도 40, 도 41). 이들 연구에서 관찰된 생착된, HDR-편집된 HSC의 비율은 CD40L 결핍을 갖는 환자로부터의 자가 HSC의 편집 후 임상적 이점을 제공할 것으로 예측된 수준과 일치하였다. 이들 조합된 발견은 이 기술이 이 접근법으로 치료된 환자에게 임상적 이점을 제공할 수 있음을 나타내었다.
실시예 8-HDM2 단백질과 함께 공동전달
HDM2는 프로테아좀에 의한 분해를 유도하는 p53/TP53의 유비퀴틴화를 매개하는 E3 유비퀴틴-단백질 리가제이다. CD34+ 세포에서 관찰된 HDR 비율에 대한 RNP + AAV와 함께 HDM2 단백질의 공동전달의 효과를 시험하였다. 성인 동원된 인간 CD34+ 세포를 프로토콜 B를 사용하여 48시간 동안 배양한 다음, HDM2 (6.25 nM -25 nM)의 존재 또는 부재하에 RNP의 뉴클레오펙션을 수행하였다. AAV를 1K의 MOI로 첨가하였다. HDR 비율을 5일차에 GFP 발현에 의해 평가하였다.
HDR 비율은 오직 RNP 및 AAV 벡터만으로 처리된 것과 비교하여 HDM2 단백질로 공동-형질감염된 세포에 대해 현저하게 더 높았다 (최대 3배) (도 42). 이들 데이터는 HDM2가 CD34+ 세포에서 CD40L 유전자좌에서 HDR 편집 비율을 개선시키는데 사용될 수 있고, 장기간 HSC에서 HDR 비율을 증가시키기 위해 상기 방법과 함께 사용될 수 있음을 나타내었다.
설명, 특정 예 및 데이터는 예시적인 대안을 나타내지만 예시로서 제공되며 본 개시내용의 다양한 대안을 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 개시내용 내의 다양한 변화 및 변형은 본 명세서 및 본원에 포함된 데이터로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이며, 따라서 본 개시내용의 다양한 대안의 일부로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> David J. Rawlings Daniel Thomson Iram F. Khan <120> THERAPEUTIC GENOME EDITING IN X-LINKED HYPER IGM SYNDROME <130> SCRI.192WO <150> 62/663485 <151> 2018-04-27 <160> 28 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer CD40L MND.GFP (HDR) <400> 1 acctgtcagc tcctttcc 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer CD40L cDNA (HDR) <400> 2 agtgtcttcg tcaacgtgac ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer ActB <400> 3 actctgcagg ttctatttgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer CD40L MND.GFP (HDR) <400> 4 ggtccagatc ctaagagagg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer CD40L cDNA (HDR) <400> 5 tccctgataa agtgcaatca tcc 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer ActB <400> 6 aatgatctga ggagggaagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<223> CRISPR AAV donor template, 1 kb homology arms, codon-optimized CD40L cDNA, a WPRE3 element, and a synthetic polyadenylation sequence <400> 15 cagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180 tctagcggcc tcggcctctg cataaataaa aaaaattagt cagccatgag cttggacgcg 240 ttgcttaacg tgtttcaaat ttcttccatg cacatcttta ttagatcttc acagcaacct 300 acaggataag caagacaggt gcaagtgcct cctttgggta tgaggaaact gaggtctaaa 360 gagatgaagt gatttgccca aggctcatag caatttattg gtagagcaaa gactagaatt 420 cagatctctt aactgcagcc tattttccct attctgaact gttacatcag catcaacaat 480 tatctaatgg attggaacag tgtacacagg cagcttagct acgtcaagtc acgattttta 540 ctttaacttc aattccagag tcttggcctg atttccctca agaccctact tatctttgcc 600 tttgcaaaat ttatttttct tgcattatct ttccagctaa attttattta ataaccatca 660 gcatgctttt tttgctttat gccatgtaga cttgacctga aaacctgcca ggctttcatt 720 gagtttagtg 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cctgggcagg tcggctgtgg ggtcctgtgg 1080 tgtgtgggga gctgtcacat ccagggtcct cactgcctgt ccccttccct cctcagatca 1140 tt 1142 <210> 18 <211> 999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream homology arm <400> 18 tgcttaacgt gtttcaaatt tcttccatgc acatctttat tagatcttca cagcaaccta 60 caggataagc aagacaggtg caagtgcctc ctttgggtat gaggaaactg aggtctaaag 120 agatgaagtg atttgcccaa ggctcatagc aatttattgg tagagcaaag actagaattc 180 agatctctta actgcagcct attttcccta ttctgaactg ttacatcagc atcaacaatt 240 atctaatgga ttggaacagt gtacacaggc agcttagcta cgtcaagtca cgatttttac 300 tttaacttca attccagagt cttggcctga tttccctcaa gaccctactt atctttgcct 360 ttgcaaaatt tatttttctt gcattatctt tccagctaaa ttttatttaa taaccatcag 420 catgcttttt ttgctttatg ccatgtagac ttgacctgaa aacctgccag gctttcattg 480 agtttagtga ttaaagaagt aaagttctga gaagcaatta gttgatggga caccagtcat 540 aaaatcaatc caaacttttg ttgacatgtg tttctttctc catataccag gttcccgctt 600 cgtattagta agattgaaat tgaaataagt ctattgctgg tggatgaatt tgtcactttc 660 cttgaaactg 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ggtgagttga tcaacacgct tgtgaatgag 240 gtagaggcaa ttgatgcctc agaccgccca caaggcgaca aaacgaagag aattaaagcc 300 gcagccgcac ggtataagaa cgcgttattt aatgataaaa gaaagttccg tgggaaagga 360 ttgcagaaaa gaataaccgc gaatactttt aacgcctata tgagcagggc aagaaagcgg 420 tttgatgata aattacatca tagctttgat aaaaatatta ataaattatc ggaaaagtat 480 cctctttaca gcgaagaatt atcttcatgg ctttctatgc ctacggctaa tattcgccag 540 cacatgtcat cgttacaatc taaattgaaa gaaataatgc cgcttgccga agagttatca 600 aatgtaagaa taggctctaa aggcagtgat gcaaaaatag caagactaat aaaaaaatat 660 ccagattgga gttttgctct tagtgattta aacagtgatg attggaagga gcgccgtgac 720 tatctttata agttattcca acaaggctct gcgttgttag aagaactaca ccagctcaag 780 gtcaaccatg aggttctgta ccatctgcag ctaagccctg cggagcgtac atctatacag 840 caacgatggg ccgatgttct gcgcgagaag aagcgtaatg ttgtggttat tgactaccca 900 acatacatgc agtctatcta tgatattttg aataatcctg cgactttatt tagtttaaac 960 actcgttctg gaatggcacc tttggccttt gctctggctg cggtatcagg gcgaagaatg 1020 attgagataa tgtttcaggg tgaatttgcc gtttcaggaa 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ccgaagagga agggccagaa 1920 gaacatcagc caactgctct aaaacccgtc ttcaagcctg caaaaaataa cggggacgga 1980 acgtacaaga tagagtttga atacgatgga aagcattatg cctggtccgg ccccgccgat 2040 agccctatgg ccgcaatgcg atccgcatgg gaaacgtact acagctaaaa gaaaagccac 2100 cggtgttaat cggtggcttt tttattgagg cctgtcccta cccatcccct gcaagggacg 2160 gaaggattag gcggaaactg cagctgcaac tacggacatc gccgtcccga ctgcagggac 2220 ttccccgcgt aaagcggggc ttaaattcgg gctggccaac cctatttttc tgcaatcgct 2280 ggcgatgtta gtttcgtgga tagcgtttcc agcttttcaa tggccagctc aaaatgtgct 2340 ggcagcacct tctccagttc cgtatcaata tcggtgatcg gcagctctcc acaagacata 2400 ctccggcgac cgccacgaac tacatcgcgc agcagctccc gttcgtagac acgcatgttg 2460 cccagagccg tttctgcagc cgttaatatc cggcgcagct cggcgatgat tgccgggaga 2520 tcatccacgg ttattgggtt cggtgatggg ttcctgcagg cgcggcggag agccatccag 2580 acgccgctaa cccatgcgtt acggtactga aaactttgtg ctatgtcgtt tatcaggccc 2640 cgaagttctt ctttctgccg ccagtccagt ggttcaccgg cgttcttagg ctcaggctcg 2700 acaaaagcat actcgccgtt tttccggata gctggcagaa cctcgttcgt cacccacttg 2760 cggaaccgcc aggctgtcgt cccctgtttc accgcgtcgc ggcagcggag gattatggtg 2820 tagaggccag attccgatac cacatttact tccctggcca tccgatcaag tttttgtgcc 2880 tcggttaaac cgagggtcaa tttttcatca tgatccagct tacgcaatgc atcagaaggg 2940 ttggctatat tcaatgcagc acagatatcc agcgccacaa accacgggtc accaccgaca 3000 agaaccaccc gtatagggtg gctttcctga aatgaaaaga cggagagagc cttcattgcg 3060 cctccccgga tttcagctgc tcagaaaggg acagggagca gccgcgagct tcctgcgtga 3120 gttcgcgcgc gacctgcaga agttccgcag cttcctgcaa atacagcgtg gcctcataac 3180 tggagatagt gcggtgagca gagcccacaa gcgcttcaac ctgcagcagg cgttcctcaa 3240 tcgtctccag caggccctgg gcgtttaact gaatctggtt catgcgatca cctcgctgac 3300 cgggatacgg gctgacagaa cgaggacaaa acggctggcg aactggcgac gagcttctcg 3360 ctcggatgat gcagtggtgg aaaggcggtg gatatgggat tttttgtccg tgcggacgac 3420 agctgcaaat ttgaatttga acatggtatg cattcctatc ttgtataggg tgctaccacc 3480 agagttgaga atctctatag gggtggtagc ccagacaggg ttctcaacac cggtacaaga 3540 agaaaccggc ccaaccgaag ttggccccat ctgagccacc 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ccatcagcaa ataaagcttc atactcggac accggcaggc ggcttccacg 4560 gattgaaagg tcaagccaac cacgtccaga tgggtcagcc ttatccgatt cttcccaccg 4620 ttctgcagct gtagcaacca ggcattctac cgccttcatg tagtcttctg tacggaacca 4680 gccgtagtta atgccaccat cagtaactgc ccaggccatc tttttctctt cggcctcaat 4740 agcccggatg cggttatcgc acagctcgcg acagtacttc agctgttcgt aatccagttg 4800 cttcaggaac tctggtgtcg acgtcatagt ggcttcacct tataggcttt tagaagcgcc 4860 ctggcttcgt ctgtgtggtc ttccatgctc ttatcgctgg caatgcagca ataaactccc 4920 tcactatctg agaacccgtt catccgaatg atcgtgaatg gaagttcccg gccagtttta 4980 taatcgctat agcttgtcgc gtcgtggctg accttgacca cataagggtc gtagccctcc 5040 acgatgacaa ggcattcccg ttgttttccc attacccctc cggttatatc gccacggctt 5100 gccgctggct tagaaacgct ttcagcagcc ttatttcgcg tactgatagc aggtccataa 5160 attcggtcat gtacagcgag gcgaacgttc tcgcgatgct ggccactggc cacaggcgta 5220 ccgcctccat ttcggttgct ggcaacgcgt tctccgccca cgcctccggt accgccaccg 5280 ggatagcctc cagtgcctgg ataattactg attgtggggc gtccggaacg tgctctgttt 5340 tggatcgagg gttaccatgt atatctatat ttagatccaa atcgcgatcc acttcgatgg 5400 tggttttttc caccttacgt gcgtgaattg ataaaccggc ctcgcggcgc ttctccacga 5460 tattcatgag gaactcgacc gagtccgggt caatggaacg catcgtgggg cgtgcatcgc 5520 cgtctctggc gcgtctggtc ttactggata gccccataga ctccaggatg cctatgcaga 5580 ggtctgcagg cgctttcttc ttgcctttct ctgtgttgaa gccgccgatg cgtaaaacgt 5640 tgtttagcag atcgcgccgt tccggcgtga gcaggttatc tctggcgcgt ttgagggcgt 5700 ccatgtctgc ttcaccttcc agggtttttg gatcgatacc gcagtcgcgg aagtactgct 5760 gcagcgtcgc cgatttgagg gtgtagaaac cacgcatgcc tatctcaaca gcaggggtcg 5820 atttcactcg gtaatcggtt atggccggga atttagcctg gaactctgcg tcggcctgtt 5880 cccgcgtcat ggccgtagtg acgaactgct gccatcttcc ggcaacgcga taagcgtagg 5940 taaagtgaat caacgcttct tcacggtcaa ggcgacgggc ggttatctca tccagctgca 6000 tggtttcaaa caggcgcact tttttcaggc cgccgtcgaa atagaatttt aacgccacct 6060 cgtcgacatc cagctgcagc tccttttcga tgtcccagcg gaccagctgg gcctgctcat 6120 ccagggacag ggtgcgtttt tttatcaact catcgtgttc ggcctggtca ggagtatcga 6180 cactcaggtg gcgctccata agctgctcaa agaccagttc acgggcttct ttacgtaaat 6240 ccttaccgat gctgtttgca agcgcgtcgg tggccatagg cgcgacctga tagccatcat 6300 catgcatgat gcaaatcatg ttgctggcat aatcatttct ggccgatgcc tcgagcgcgg 6360 cggctttaat tttgagctgc atgaatgaag agttagccac gccgagtgaa attcggtcac 6420 cgtcaaagac aacgtctgtc agcagcccgg agtggccagc cgtttcgagc aaggcctgcg 6480 cgtaggcgcg tttgattttt tccggatcgg tttcacgttt accgcgaagc ttgtcgaaac 6540 cgataatgta ttcctgagct gtacggtcgc ggcgcagcat ctggatggcg tcgctgggga 6600 ccacttcgcc gcagaacatg ccgaaatggc ggtggaagtg tttctcctca atcgatacac 6660 ctgaagatat cgacgggctg tagatgaggc cgtcatattt tttcaccatc actttaggct 6720 ggttggtgaa atcgtcgact tccttctcct gtttgttttt ctggttaacg cagagaaact 6780 ttttgtcagg gaactgtagt ctcagctgca tggtaacgtc ttcggcgaac gtcgaactgt 6840 cggtggccag catgattcgt tcgccgcgtt gcactgcagc gataacctcg gtcatgatcc 6900 gatttttctc ggtataaaat acgcggatag gcttgttggt ttcgcggttg cgaacgtcga 6960 ccgggagttc aatcacgtga atttgcagcc aggcaggtag gcccagctcc tcgcgtcgct 7020 tcatcgccag ttcagccagg tcaacaagca gatcgttggc atcggcatcc accataatgg 7080 catgctcttc agtacgcgcc agcgcgtcga taagcgtgtt gaatacgcct accgggtttt 7140 ccatcgcacg cccggccaga atggcacgca ggccctgtgt tgcttcatcg aagccgaaga 7200 agtcatgctg gcgcatcagc ggttgccagc agcctttaag tatggagttg atgcaaatag 7260 tcagcttgtt ggcatatggc gccatttcct gatagccggg atcctgataa tgcagaatgt 7320 cggctttcgc gcctttccct tcggtcatca tttcatgcag gccgcctatc agggatacgc 7380 ggtgcgcgac ggaaacgcca cgcgtggact gcagcatcag tggacgcagg aggcctgtcg 7440 atttacccga ccccatcccg gcgcggacaa taacgatgcc ctgcagctgt gcggcgtatg 7500 tcatcacctc atcggtcatc ctggaggttt caaaccgttt gtaagtgatg tgtgacgggc 7560 gaaggttcgg gttggtgatg cgttcactga acgaacgtga tgtttgcgcg gcacggcatt 7620 tgcgattcaa ccggcgcgta atgtgatctt taacggtacc gttataaatt tctgcgatac 7680 ccatatcccg cagcgtgctg ctgaaaaggc gcataagttc tttcgggctg tttggtaccg 7740 ggcatgtcag catgccaata tcaacggcgc gaagcagttc tttggcaaaa gtgcgtctgt 7800 tcagacgcgg gagagtacgc agcttattca gcgtgatcga caacagatcg gttgcacggc 7860 tcagatgatt tctcgttaac tggcgagcga cttccttcag ccctctcagg ctgtgcaggt 7920 cgttaaaatc gctgcattcc agctcagggt catcctcaaa agttgggtaa acacatttga 7980 cgccggaaaa cttctccatg atgtcgaatc cggtgcggag gcctgtgttg ccttttcctt 8040 cagctgagga tttgcggtcg ttatcgagag cgcaagtgat ttgcgcagcc gggtacatgt 8100 tcaccagctg ctcgacaacg tgaatcatgt tgttagcgga aaccgcaatg actaccgcgt 8160 caaagcgttt tttcgggtcg tttctggtcg ccagccagat ggatgccccg gtggcgaaac 8220 cctctgcagt cgcaattttt tgcgccccct gcaggtcgcc aataacaaag catgcaccga 8280 cgaaatcacc gttagtgatg gcgctggtct ggaacttgcc accattcaga tcgatacgtt 8340 gccagccaac aatccgcccg tcttttcttc cgtccaggtg ggacagaggt atcgccatgt 8400 aagttgttgg tccacggctc catttcgcac tgtcgtgact ggtcacgcga cgtatatcac 8460 aagcgccaaa tacgtcacga attccctttt ttaccgcata aggccaggag ccatcttcag 8520 ctggcgaatg ttcccaggcg cgatggaaag ccaaccatcc aagcaggcgt tcctgctcca 8580 tctgattgtt ttttaaatca ttaacgcgtt gttgttcagc tcggaggcgg cgtgcttcag 8640 cctggcgctc catgcgtgca cgttcttctt ccggctgagc gaccacggtc gcaccattcc 8700 gttgctgttc acggcgatac tccgaaaaca ggaatgaaaa gccactccag gagccagcgt 8760 catgcgcttt ttcaacgaag ttaacgaaag gataactgat gccatccttg ctctgctcaa 8820 ggcgtgaata gatttccaca cggcctttaa ggctcttctg cagagcttcc ggggaggaat 8880 tattgtaggt ggtatagcgc tctacaccac cgcgcggatt gagctgaatc ttatcagcac 8940 acgcaggcca gttgataccg gccatcttcg ccagctcagt cagctcatca cgtgccgcgt 9000 caagcagtga aaacggatcg ctgccaaagc gctccgcgta gaattcttgt aaggtcattt 9060 tttagccttt ccatgcgaat tagcattttt tcgggttgaa aaaatccgca ggagcagcca 9120 caataaacgc actatctttc tgaaggacgt atctgcgtta tcgtggctac ttcctgaaaa 9180 aggcccgagt ttgccgactc ggtttttttt tcgtcttttt tcggctgcta cggtctggtt 9240 caaccccgac aaagtataga tcggattaaa ccagaattat agtcagcaat aaaccctgtt 9300 attgtatcat ctaccctcaa ccatgaacga tttgatcgta ccgactactt ggtgcacaaa 9360 ttgaagatca cttttatcat ggataacccg ttgagagtta gcactatcaa ggtagtaatg 9420 ctgctcgtca taacgggcta atcgttgaat tgtgatctcg ccgttattat cacaaaccag 9480 tacatcctca cccggtacaa gcgtaagtga agaatcgacc aggataacgt ctcccggctg 9540 gtagtttcgc tgaatctggt tcccgaccgt cagtgcgtaa acggtgttcc gttgactcac 9600 gaacggcagg aatcgctctg tgttggcagg ttctccaggc tgccagtctc tatccggtcc 9660 tgtctctgtc gtaccaataa caggaacgcg gtctggatca gattcagtgc catacagtat 9720 ccattgcacg ggcttacgca ggcattttgc cagcgatagc ccgatctcca gcgacggcat 9780 cacgtcgcca cgttctaagt tttggacgcc cggaagagag attcctacag cttctgccac 9840 ttgcttcagc gtcagtttca gctctaaacg gcgtgctttc agtcgttcgc ctcgtgtttt 9900 cataccctta atcataaatg atctctttat agctggctat aatttttata aattatacct 9960 agctttaatt ttcacttatt gattataata atccccatga aacccgaaga acttgtgcgc 10020 catttcggcg atgtggaaaa agcagcggtt ggcgtgggcg tgacacccgg cgcagtctat 10080 caatggctgc aagctgggga gattccacct ctacgacaaa gcgatataga ggtccgtacc 10140 gcgtacaaat taaagagtga tttcacctct cagcgcatgg gtaaggaagg gcataacaag 10200 gggatcctct agacgcagaa aggcccaccc gaaggtgagc cagtgtgatt acatttgcgg 10260 cctaactgtg gccagtccag ttacgctgga gtcactagtg cggccgcgac aacttgtcta 10320 gggcccaatg gcccatacac ttagtgtaat acgactcact atagggagag cggccgcttt 10380 ttcagcaaga ttaagccgcc accatggcgc cgcggcctcc taagaagaag cggaaagtcg 10440 aattcgtgga tctgcgaaca ctgggctata gccagcagca gcaggagaag atcaaaccca 10500 aggtgaggtc cacagtcgca cagcaccatg aagccctggt gggccacggg ttcactcacg 10560 ctcatattgt cgcactgtct cagcatccag ccgctctggg aaccgtggca gtcacatacc 10620 agcacatcat tactgccctg cccgaggcta cccatgaaga catcgtggga gtcggcaaac 10680 agtggagcgg cgcacgggcc ctggaggctc tgctgaccga cgcaggggaa ctgagaggac 10740 cccctctgca gctggataca gggcagctgg tgaagattgc taagagggga ggggtgacag 10800 caatggaagc cgtccacgca agcaggaacg cactgacagg ggcccccctg aacctgaccc 10860 cggaccaagt ggtggctatc gccagcaaca atggcggcaa gcaagcgctc gaaacggtgc 10920 agcggctgtt gccggtgctg tgccaggacc atggcctgac cccggaccaa gtggtggcta 10980 tcgccagcaa cattggcggc aagcaagcgc tcgaaacggt gcagcggctg ttgccggtgc 11040 tgtgccagga ccatggcctg accccggacc aagtggtggc tatcgccagc aacattggcg 11100 gcaagcaagc gctcgaaacg gtgcagcggc tgttgccggt gctgtgccag gaccatggcc 11160 tgaccccgga ccaagtggtg gctatcgcca gcaacattgg cggcaagcaa gcgctcgaaa 11220 cggtgcagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggaccatgg cctgaccccg gaccaagtgg 11280 tggctatcgc cagcaacggt ggcggcaagc aagcgctcga aacggtgcag cggctgttgc 11340 cggtgctgtg ccaggaccat ggcctgaccc cggaccaagt ggtggctatc gccagcaaca 11400 atggcggcaa gcaagcgctc gaaacggtgc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggacc 11460 atggcctgac cccggaccaa gtggtggcta tcgccagcaa caatggcggc aagcaagcgc 11520 tcgaaacggt gcagcggctg ttgccggtgc tgtgccagga ccatggcctg accccggacc 11580 aagtggtggc tatcgccagc aacggtggcg gcaagcaagc gctcgaaacg gtgcagcggc 11640 tgttgccggt gctgtgccag gaccatggcc tgaccccgga ccaagtggtg gctatcgcca 11700 gcaacattgg cggcaagcaa gcgctcgaaa cggtgcagcg gctgttgccg gtgctgtgcc 11760 aggaccatgg cctgaccccg gaccaagtgg tggctatcgc cagcaacggt ggcgcgccag 11820 ccacgatggc ggcaagcaag cgctcgaaac ggtgcagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca 11880 ggaccatggc ctgaccccgg accaagtggt ggctatcgcc agcaacggtg gcggcaagca 11940 agcgctcgaa acggtgcagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggaccatg gcctgacccc 12000 ggaccaagtg gtggctatcg ccagcaacgg tggcggcaag caagcgctcg aaacggtgca 12060 gcggctgttg ccggtgctgt gccaggacca tggcctgact ccggaccaag tggtggctat 12120 cgccagccac gatggcggca agcaagcgct cgaaacggtg cagcggctgt tctatcgcca 12180 gcaacggtgg cggcaagcaa gcgctcgaaa gcattgtggc ccagctgagc cggcctgatc 12240 cggcgttggc cgcgttgacc aacgaccacc tggtcgctct ggcttgcctg ggaggacgcc 12300 ctgctatgga cgctgtgaag aaaggactgc cccacgcacc cgaactgatt agacgggtga 12360 accggagaat cggcgagaga acatcccata gggtggcaat ctctagaact cagctggtca 12420 agagtgaact ggaggaaaag aaatcagagc tgcgccacaa gctgaaatac gtgcctcatg 12480 agtatatcga actgatcgag attgctcgca attcaaccca ggaccggatc ctggaaatga 12540 aagtgatgga gttctttatg aaagtctacg gatatcgggg gaaacacctg ggagggagca 12600 gaaagccaga tggggccatc tacacagtgg gatcccccat cgactatggc gtgattgtcg 12660 atactaaagc ctacagcgga ggctataacc tgcctatcgg ccaggctgac gagatgcaga 12720 gatacgtgga ggaaaaccag acccgcaata agcatattaa ccccaatgaa tggtggaaag 12780 tgtatcctag ctccgtcaca gagttcaagt ttctgttcgt gagcggacac tttaagggca 12840 actacaaagc acagctgact aggctgaatc atatcaccaa ctgcaatgga gccgtgctgt 12900 ctgtcgagga actgctgatc gggggagaga tgattaaggc tggcacactg actctggagg 12960 aagtgaggcg caagttcaac aatggggaaa tcaacttcta acctgcagga tgataagcta 13020 gccccgggcg tacggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 13080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 13140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 13200 aaaaacgaga ccttagggcc attagacttg aagtcaagcg gccgcttaca actggacctt 13260 gctggtacat agaactgatt aactgaccat ttaaatcata ccaacatggt caaataaaac 13320 gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttaatct gatcggcacg taagaggttc 13380 caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttgagtta tcgagatttt 13440 caggagctaa ggaagctaaa atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc 13500 gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg 13560 ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc 13620 tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc aggctaaact 13680 ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg 13740 catggttact caccactgcg atcccaggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc 13800 ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga 13860 ttcctgtttg taattgtcct tttaacggcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat 13920 cacgaatgaa taacggtttg gttggtgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc 13980 ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg 14040 tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt 14100 gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga 14160 actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg 14220 ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc acttgatgct cgatgagttt ttctaaccta 14280 ggtgacagaa gtcaaaagcc tccggtcgga ggcttttgac tttctgctag atctgtttca 14340 atgcggtgaa gggccaggca gctggggatt atgtccagac ccggccagca tgttggtttt 14400 atcgcatatt cagcgttgtc gcgtttaccc aggtaaaatg gaagcagtgt atcgtctgcg 14460 tgaatgtgca aatcaggaac gtaaccgtgg tacatagatg cagtcccttg cgggtcgttc 14520 ccttcaacga gtaggacgcg gtgcccttgc aaggctaacc attgcgcctg gtgtactgca 14580 gatgaggttt tataaacccc tcccttgtgt gacataacgg aaagtacaac cgggttttta 14640 tcgtcaggtc tttggtttgg gttaccaaac acactccgca tatggctaat ttggtcaatt 14700 gtgtagccag cgcgacgttc tactcggccc ctcatctcaa aatcaggagc cggtagacga 14760 ccagcttttt ccgcgtctct gatagcctgc ggtgttacgc cgatcaggtc tgcaacttct 14820 gttatacccc agcggcgagt aatacgacgc gcttccgggc tgtcatcgcc gaactgtgcg 14880 atggcaatag cgcgcgtcat ttcctgaccg cgattgatac agtctttcag caaattaatt 14940 aacgacatcc tgtttcctct caaacatgcc cttatctttg tgtttttcat catactttac 15000 gtttttaaag caaagcaaca taaaaaaagc aaagtgactt agaaaacgca aagttaaggt 15060 tcaaatcaat tttttgatgc gctacagaag ctatttagct tcatctaagc gcaacggtat 15120 tacttacgtt ggtatattta aaacctaact taatgatttt aaatgataat aaatcatacc 15180 aattgctatc aaaagttaag cgaacatgct gattttcacg ctgtttatac actttgaggc 15240 atctctatct cttccgtctc tatattgaaa cacaatcaaa gaacatcaat ccatgtgaca 15300 tcccccacta tctaagaaca ccataacaga acacaacata ggaatgcaac attaatgtat 15360 caataattcg gaacatatgc actatatcat atctcaatta cggaacatat cagcacacaa 15420 ttgcccatta tacgc 15435 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TALEN forward binding site <400> 23 cttctcatgc tgcct 15 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TALEN reverse binding site <400> 24 agaagatacc atttc 15 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TALEN cleavage site <400> 25 ctgccacctt ctctgcc 17 <210> 26 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40LG exon 1 <400> 26 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaag 156 <210> 27 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40LG exon 2 <400> 27 atagaagatg aaaggaatct tcatgaagat tttgtattca tgaaaacgat acagagatgc 60 aacacaggag aaagatcctt atccttactg aactgtgagg agattaaaag ccagtttgaa 120 ggctttgtga ag 132 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sgRNA <400> 28 aaaguugaaa ugguaucuuc 20

Claims (106)

  1. (i) 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계, 및
    (ii) 주형 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계
    를 포함하는, 세포에서 CD40LG 유전자를 편집하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, gRNA가 서열식별번호(SEQ ID NO):12의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, gRNA가 서열식별번호:12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계가 세포를 CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 리보핵단백질 (RNP)과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 0.1:1 내지 1:10의 비율을 갖는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 1:1 내지 1:5의 비율을 갖는 것인 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CAS9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 약 1:1.2의 비율을 갖는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드가 CD40LG 유전자의 적어도 일부 또는 그의 상보체를 코딩하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드가 야생형 CD40LG 유전자의 적어도 일부 또는 그의 상보체를 코딩하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드가 CD40LG 유전자의 적어도 약 1 kb를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호:15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호:15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 주형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 벡터가 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)이 단계 (ii) 전에 수행되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및 (ii)가 동시에 수행되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)가 뉴클레오펙션을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 뉴클레오펙션을 수행하는 것이 론자(LONZA) 시스템의 사용을 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 시스템이 구형파 펄스의 사용을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 IL-6과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, IL-6이 약 20 ng/ml 내지 약 500 mg/ml 또는 20 ng/ml 내지 500 mg/ml의 농도를 갖는 것인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, IL-6이 약 50 ng/ml 내지 약 150 mg/ml 또는 50 ng/ml 내지 150 mg/ml의 농도를 갖는 것인 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6이 약 100 mg/ml 또는 100 mg/ml의 농도를 갖는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 SFEMII 배지에서 인큐베이션되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 세포를 포함하고, 집단이 약 1 X 105개 세포/ml 내지 약 1 X 106개 세포/ml 또는 1 X 105개 세포/ml 내지 1 X 106개 세포/ml의 농도를 갖는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 집단이 약 1 X 105개 세포/ml 내지 약 5 X 105개 세포/ml 또는 1 X 105개 세포/ml 내지 5 X 105개 세포/ml의 농도를 갖는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 집단이 약 2.5 X 105개 세포/ml 또는 2.5 X 105개 세포/ml의 농도를 갖는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및 (ii)가 수행된 후 세포 집단을 희석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 세포 집단이 단계 (i) 및 (ii)가 수행된 후 약 16시간 또는 16시간에 희석되는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 세포 집단이 약 250,000개 세포/ml 또는 250,000개 세포/ml로 희석되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 줄기 세포 인자 (SCF), FMS-유사 티로신 키나제-3 (Flt-3), 트롬보포이에틴 (TPO), TPO 수용체 효능제, UM171 또는 스템레게닌 (SR1)과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, TPO 수용체 효능제가 엘트롬보팍을 포함하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)가 세포를 HDM2 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, HDM2 단백질이 약 1 nM 내지 약 50 nM 또는 1 nM 내지 50 nM의 농도를 갖는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, HDM2 단백질이 약 6.25 nM 내지 약 25 nM 또는 6.25 nM 내지 25 nM의 농도를 갖는 것인 방법.
  37. 제14항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 적어도 또는 적어도 약 1000 MOI의 AAV와 접촉되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 세포가 적어도 또는 적어도 약 2500 MOI의 AAV와 접촉되는 것인 방법.
  39. 제4항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 적어도 또는 적어도 약 100 μg/ml의 RNP와 접촉되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 세포가 적어도 또는 적어도 약 200 μg/ml의 RNP와 접촉되는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)가 약 1,000,000개 세포/20 μl 뉴클레오펙션 반응물 또는 1,000,000개 세포/20 μl 뉴클레오펙션 반응물을 접촉시키는 것을 포함하며, 뉴클레오펙션 반응물이 gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 뉴클레오펙션 반응이 약 1 ml 또는 1 ml의 부피에서 수행되는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 조혈 줄기 세포 (HSC)인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포 또는 B 세포인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CD34+ 세포인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체외인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, CD40LG 유전자가 서열식별번호:13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 것인 방법.
  51. CD40LG 유전자의 적어도 일부를 코딩하는 제1 서열;
    하나 이상의 가이드 RNA 절단 부위를 코딩하는 제2 서열; 및
    하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위를 코딩하는 제3 서열
    을 포함하는, CD40LG 유전자의 상동성 지정 복구 (HDR)를 위한 핵산.
  52. 제51항에 있어서, CD40LG 유전자의 적어도 일부가 서열식별번호: 13에 기재된 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하는 것인 핵산.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, CD40LG 유전자의 적어도 일부가 CD40LG 유전자의 적어도 또는 적어도 약 1 kb를 포함하는 것인 핵산.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 서열이 서열식별번호: 12에 기재된 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 서열이 서열식별번호: 12에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레아제 결합 부위가 정방향 및 역방향 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 결합 부위를 포함하는 것인 핵산.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 핵산 결합 부위가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 연관 단백질 9 (Cas9) 결합 부위인 핵산.
  58. 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 인핸서 요소를 추가로 포함하는 핵산.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 아암 서열을 추가로 포함하는 핵산.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 세포에서 CD40L 단백질 발현의 HDR을 촉진하기 위한 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV)인 벡터.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 자기-상보적 AAV (scAAV)인 벡터.
  64. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 세포.
  65. 제64항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 1차 세포인 세포.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 자가 세포인 세포.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포인 세포.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포 (HSC)인 세포.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, CD34+인 세포.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외인 세포.
  72. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항의 벡터 및 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는, 세포에서 CD40L 단백질 발현의 HDR을 촉진하기 위한 시스템.
  73. 제72항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN 뉴클레아제인 시스템.
  74. 제72항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas 뉴클레아제인 시스템.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 및 핵산이 세포로의 공동전달을 위해 구성된 것인 시스템.
  76. 제75항에 있어서, 세포로의 공동전달이 내인성 CD40LG 유전자좌를 변형시키는 것인 시스템.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 인간 조혈 세포인 시스템.
  78. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항의 세포 또는 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항의 벡터를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    뉴클레아제를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, CD40LG 유전자의 HDR 촉진을 필요로 하는 대상체에서 CD40LG 유전자의 HDR을 촉진하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN 뉴클레아제인 방법.
  80. 제78항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas 뉴클레아제인 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 세포 또는 벡터와 함께 대상체에게 공동투여되는 것인 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체로부터의 것이고, 세포가 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항의 핵산을 세포에 도입함으로써 유전자 변형되는 것인 방법.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 입양 세포 전달에 의해 수행되는 것인 방법.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 방법.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자가 세포인 방법.
  87. 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
  88. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 HSC인 방법.
  89. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CD34+인 방법.
  90. 제78항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 남성인 방법.
  91. 제78항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 X-연관 고 IgM (X-HIGM) 증후군을 앓는 것인 방법.
  92. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항의 세포 또는 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항의 벡터를 대상체에게 투여하는 단계;
    뉴클레아제를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    임의로 X-연관 고 IgM 증후군 (X-HIGM) 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상을 위한 요법을 받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 대상체를 확인하고/거나, 임의로 상기 대상체에서 X-HIGM 진행의 개선 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상의 개선을 측정하는 단계
    를 포함하는, X-HIGM 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상의 치료, 억제 또는 호전을 필요로 하는 대상체에서 X-HIGM 또는 X-HIGM과 연관된 질환 증상을 치료, 억제 또는 호전시키는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN 뉴클레아제인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 뉴클레아제가 CRISPR/Cas 뉴클레아제인 방법.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 세포 또는 벡터와 함께 대상체에게 공동투여되는 것인 방법.
  96. 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체로부터의 것이고, 세포가 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항의 핵산을 세포에 도입함으로써 유전자 변형되는 것인 방법.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 입양 세포 전달에 의해 수행되는 것인 방법.
  98. 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 방법.
  100. 제92항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 자가 세포인 방법.
  101. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
  102. 제92항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 HSC인 방법.
  103. 제92항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CD34+인 방법.
  104. 제92항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 남성인 방법.
  105. 제92항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아성 또는 기회 감염을 감소시키는 방법.
  106. 제92항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 간헐성 호중구감소증을 감소시키는 방법.
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