CN108289933B - 作为认知和行为障碍药物的哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开利用哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体(s‑KL)作为预防和/或治疗认知和/或行为障碍的试剂。本发明还涉及用于基因治疗的基因构建体和表达载体，其用于将所述s‑KL变体递送到哺乳动物，特别是啮齿类动物或人类的中枢神经系统。还公开了包含蛋白s‑KL或用于在CNS中表达该蛋白的任何基因构建体的药物组合物。

Description

作为认知和行为障碍药物的哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体
技术领域
本发明涉及用于预防和/或治疗患有与记忆丧失和学习困难相关的疾病和/或神经退行性和/或神经病理学疾病的患者的认知障碍和行为障碍的医学方法领域。
背景技术
众所周知，随着时间的推移，记忆经常丢失，并且某些方面可能会改变从而导致记忆效率的下降。这些方面的实例包括：难以同时将注意力保持集中到多于一件事上；难以学习需要付出努力的新事物；和缓慢的旧信息恢复。随着年龄的增长，口语能力、信息处理、问题解决、工作记忆、长期记忆、空间记忆和能力都会降低，同时语义记忆(词汇)、世界知识和内隐记忆等专业知识和认知能力在没有病理或神经变性存在的情况下随着年龄增长保持稳定或甚至会更好。
关于神经退行性和/或神经病理学疾病，其中许多与衰老相关，也意味着认知障碍。这些的实例包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、抑郁症和精神分裂症。
另外，随着年老或在神经退行性和/或神经病理学疾病的情况下，也观察到行为障碍，如定向障碍增加，对未知的情况或地点发作焦虑症、甚至导致定向障碍本身，以及非理性的恐惧。
所有这些认知和行为障碍不仅是治疗许多神经退行性和/或神经病理学疾病的症状的主要目标，而且也是预防老化过程中认知和行为问题的主要目标。
在衰老期间或神经病理学或神经退行性情况下与记忆丧失相关的几种复杂机制中，已经研究了哺乳动物蛋白Klotho的作用。
在三个独立的人类测定中，发现klotho等位基因中，即体外促进klotho分泌增加的KL-VS klotho等位基因的一些突变可以以与受试者年龄无关的方式在认知测试中获得更好的结果。这些数据来自Deary等人的文献"Klotho genotype and cognitive abilityin childhood and old age in the same individuals",Neurosci Lett-2005,vol.378(1),pp.22-27。
Klotho是主要在肾远曲小管、甲状旁腺激素分泌细胞和脑的脉络丛上皮细胞中检测到的蛋白。在较低程度上，α-klotho基因也在心脏、骨骼肌、膀胱、胎盘、胰腺、睾丸、卵巢、结肠和内耳中表达。小鼠中若干研究已经揭示，通过模仿典型的症状，如动脉粥样硬化、骨质疏松/骨量减少、各种组织中的异位钙化、肺气肿、认知问题和不孕，13号染色体上的单基因α-klotho的突变诱导了加速老化的过程(参见Kuro-o等，Mutation of the mouseklotho gene leads to a syndrome resembling ageing.Nature-1997,vol.no.390,pp.:45-51；和Wang,Y.et al,"Current understanding of klotho",Ageing Res Rev-2009,vol.no.8,pp.:43-511)。此外，敲除α-klotho(kl-/kl-)小鼠在约2个月龄时过早地显示存活率显著降低(Kuro-o等人，同上)。相反，过表达此基因的转基因小鼠的寿命预期增加30％至40％。相似地，一些研究表明人类klotho基因多态性也影响寿命和与衰老相关的疾病的出现。在小鼠和人类中，α-klotho基因编码5.2kb的转录物。在第三个外显子中存在选择性剪接供体位点，其可以产生两种不同的转录物：一种编码跨膜形式(完整转录物或全长，1014个氨基酸)，另一种编码蛋白的分泌形式(半跨膜转录物，550个氨基酸)。全长转录物编码分子量约130kDa的单通跨膜蛋白(m-KL)。该蛋白含有三个结构域：在C-末端的短跨膜结构域、由分别称为KL1和KL2的两个约550个氨基酸的内部重复序列组成的胞外结构域、和10个氨基酸的非常短的胞内结构域。来自选择性剪接的转录物产生截短形式的蛋白(s-KL)，其仅由KL1结构域形成，约70kDa的重量。这种选择性mRNA包括特异性分泌信号，其由在m-KL转录物中未发现的15个氨基酸尾部组成，因此也称为klotho的分泌型同种型，s-KL，或者klotho蛋白的分泌型剪接变体(参见Matsumura等人，"Identification of the human klothogene and its two transcripts encoding membrane and secreted Klotho protein",Biochem Biophvs Res Commun-1998,vol.No.242,pp.:626-630)。然而，关于这种蛋白(s-KL)存在一些争议，因为它在体液中使用抗体未被检测到。它已在mRNA水平上特异性检测到，但在蛋白水平未被检测到，因为可用的抗体不能将其与从跨膜Klotho切割的KL1结构域区分开。
此外，跨膜形式的胞外结构域可被金属蛋白酶ADAM10和ADAM17切割，产生约130kDa的另一种形式的可溶性Klotho(蛋白水解膜同种型的缩写为p-KL)，其已在血清、尿液和脑脊液中检测到。此外，最近的两项研究表明，位于KL1和KL2结构域之间存在蛋白酶ADAM10和17的第二个识别位点，它产生两个新的70kDa同种型，一个仅包含KL1结构域(如从选择性剪接产生但没有特定的氨基酸尾巴的结构域)，另一个含有KL2结构域。因此，Klotho蛋白可能通过两个主要机制进入循环系统：(a)来自选择性剪接(s-KL)，和(b)通过由ADAM10和17介导的蛋白水解切割。然而，这些事件中每一个发生的百分比未知。
为了阐明Klotho作为抗衰老因子以及作为提高学习和记忆能力的药剂的作用，已经获得了系统性过表达Klotho转基因小鼠。Dubai等2014年披露了人类klotho基因KL-VS的变体与杂合载体中增强的认知相关。该等位基因增加了血清中的klotho水平。然后他们分析了全长跨膜klotho的全方位过表达的转基因小鼠，其在多次学习和记忆测试中表现优于对照(Dubai等,"Life Extension Klotho Enhances Cognition",Cell Reports-2014,vol.7,pp.:1065-1076)。
由Dubai等还进行分析的另一转基因小鼠特别关注于阿尔茨海默氏病，并且其显示提高klotho表达可降低人淀粉状蛋白前体蛋白(hAPP)转基因小鼠的过早死亡率、网络功能障碍、认知缺陷和行为异常，并且全部没有改变hAPP的水平(Dubai等,Life Extensionfactor Klotho Prevents Mortality and Enhances Cognition in hAPP TransgenicMice",The Journal of Neuroscience-2015,vol.35/6,pp.:2358-2371)。
在所述转基因模型中，可能评估分子量约130kDa的全长跨膜蛋白(m-KL)的作用，以及是否任何其他同种型对该作用有贡献，特别是加工的Klotho(p-KL)同种型，这不能由作者使用的实验程序确定，因为目前可用的检测系统不能区分不同的klotho同种型。尽管过表达感兴趣蛋白的转基因动物可能是分析其效应的良好模型，但它们也意味着不方便使这种蛋白遍在地表达(身体和大脑)，并且数据可能另外由转基因动物的遗传背景组成。
显示klotho在衰老小鼠模型(命名为SAMP8)中的潜在作用的另一文献是Kuang等"Klotho upregulation contributes to the neuroprotection of ligustilide(LIG)inan Alzheimer's disease mouse model",Neurobiology of Aging-2013,pp.1-10。在该文献中，提出川芎内酯用作治疗阿尔茨海默氏病(AD)以减少记忆缺陷。数据显示，慢性施用LIG可防止衰老中AD样神经病理学的发展和记忆障碍。另外数据表明，可能的潜在机制涉及Klotho上调。因此建议将klotho蛋白作为年龄相关性AD的治疗靶点。根据Kuang等人公开的实验方法(使用Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA的抗体检测Klotho蛋白)，在作用蛋白同种型之间可能不存在区别(m-KL，p-KL)。当Kuang等提到“分泌型klotho”时，它并不是指哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体，而是指klotho的其他可溶形式。事实上，在那个时候，并且直到本发明的发明人的发现为止，选择性分泌型Klotho同种型被认为是非常少的变体，不表达(或以可忽略的水平表达)。事实上，正如Forster等人所报道的：“在血清和脑脊髓液(CSF)中均已经检测到含有KL1和KL2结构域的klotho形式，并且其已被解释为m-KL的蛋白水解片段。在血清或CSF中尚未报道确实对应于由选择性剪接mRNA产生的肽的循环klotho种类的存在(Forster等，“"Vitamin D Receptor Controls Expression ofthe Anti-aging Klotho Gene in Mouse and Human Renal Cells"Biochem Biophys ResCommun.201 1October 28；414(3):557-562)。
尽管有面对由衰老或某些神经退行性疾病引起的认知障碍的几种方法，仍然需要用于改善认知和行为维持的替代性治疗方法。
发明内容
本发明源于发明人确定小鼠野生型脑组织中哺乳动物klotho蛋白的剪接变体在蛋白水平(不仅作为mRNA)的真实表达。使用针对包含在小鼠s-KL的C-末端的最后20个氨基酸中的肽氨基酸序列产生的自制抗体，发明人在野生型小鼠(Harlan Laboratories BV的C57BI6)的全脑中，和在大脑的一些特定部分中，检测到Klotho蛋白的表达同种型是分子量接近70KDa的同种型，可能是s-KL，但具有翻译后修饰。另外，发明人发现(数据未显示)，该蛋白的表达水平在老化和AD进展期间降低。
进一步的测定揭示，在脑中这种剪接变体可以在蛋白水平上确定。此外，发明人已经发现，分泌型klotho同种型在脑中比在肾中至少多十倍，这表明这两种同种型可能具有不同的功能，并且s-KL活性是神经系统中具有重要作用的同种型。
发明人在此已经研究了改变衰老大脑中的s-KL水平在行为水平上的功能相关性。他们使用AAVrh10载体在成年和中年野生型C57BL/6J雄鼠中递送和持续表达s-KL。这项研究第一次在体内证明了在单次注射s-KL到CNS六个月后，发现长效和可量化的学习和记忆能力增强。更重要的是，在中年的被治疗一次的18个月龄的小鼠中，可以观察到认知改善。这些发现证明s-KL作为认知功能下降治疗的治疗潜力。
总之，本文证明，单次施用AAV-sKL载体后在脑中分泌型Klotho同种型的局部过表达防止年龄相关的记忆缺陷，这些效应在老年动物中是持久和可量化的，并且因此提示s-KL对于痴呆的治疗潜力。s-KL在CNS中的局部表达改善了老年小鼠的认知表现。s-KL在CNS中的表达不影响体重或感觉运动技能。在中年时曾接受一次治疗的18个月龄的小鼠中观察到了认知改善。同样重要的是，特定shRNA-sKL在海马体中被特异性s-KL抑制损害了认知表现。因此，发明人通过使用基于以下的双重策略能够证明分泌型Klotho在记忆形成中的关键含义：(1)sKL过表达以增加记忆表现，和(2)sKL抑制以降低记忆表现。
因此，据信本发明人首次发现，通过选择性剪接产生的klotho转录体产生了70KDa的蛋白，发明人证明其是稳定的，并且该同种型在脑中比在身体其他部分更丰富。此外，据信这是第一次在体内直接施用分泌型klotho，而不是通过转基因模型表达。如前所述，s-KL的施用导致认知和行为能力的改善。因此，发明人提供了s-KL作为认知和/或行为障碍，和/或与神经变性和/或神经病理学疾病的新治疗方法的应用。这代表了针对这些疾病的更特异性和CNS导向的治疗，因为在此证明s-KL是天然表达s-KL的与认知和行为相关的脑部分中最普遍的同种型。
如上文所解释的，现有技术涉及全身性过表达klotho的全长编码区的转基因小鼠。然而，全长编码区可以允许不仅转录跨膜同种型，而且转录选择性剪接同种型。因此，不可能阐明所报道的学习和记忆效应的改善是否归因于一种还是另一种klotho同种型。另一方面，尽管发明人观察到两种klotho同种型似乎都参与记忆表现，但有趣的是，m-KL的过表达可能以非特异性方式影响此时未知的其他途径，导致相关的副作用，例如在本说明书的实施例2C中描述的那些，而s-KL的特异性过表达则没有。此外，与现有技术的转基因小鼠不同，本方法不会改变动物出生时的天然Klotho水平，其可能导致代偿效应的显现，直至达到衰老过程的关键阶段。然后通过施用具有神经元趋向性的AAVrh10载体在脑中特异性改变该水平。
因此，作为第一方面发明人提出，哺乳动物Klotho蛋白的分泌型剪接变体或编码其的核酸序列，用于在哺乳动物中预防和/或治疗认知和/或行为障碍，和/或神经退行性和/或神经病理学疾病。
这方面还可以被制定为如上定义的s-KL在制造用于预防和/或治疗认知和/或行为障碍，和/或神经退行性和和/或神经病理学疾病的药物中的应用。本发明还涉及用于治疗或预防认知和/或行为障碍的方法，和/或神经退行性和/或神经病理学疾病的方法，所述方法包括对需要的受试者(包括人)施用治疗有效量的如上定义的s-KL蛋白或其核酸编码序列，以及药学上可接受的赋形剂或载剂。
如上所披露，Klotho蛋白的剪接变体s-KL似乎在Matsumura的文章中公开。另外，其他文件也提到这个剪接变体。作为一个实例，文献Shiraki-lida等人，"Structure ofthe mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secretedprotein",FEBS Letters-1998,vol 424,pp.:6-10公开了一种在mRNA水平检测到的假设s-KL1分泌蛋白。另一方面，Imura等人的文献"Secreted Klotho protein in sera and CSF:implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein fromcell membrane",FEBS Letters-2001,vol 565,pp.:143-147也提到在细胞外液中未检测到的推定的分泌同种型。这些文献都没有指出klotho蛋白的剪接变体s-KL的任何作用。
术语“哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体”缩写为“s-KL”，是指由来自选择性剪接的转录物产生的蛋白，其产生仅由KL1结构域形成的蛋白(s-KL)的截短形式，重量约为70kDa。这种选择性mRNA包括特异性分泌信号，其由在m-KL转录物中未发现的15个氨基酸尾部组成，因此也称为klotho的分泌型同种型，s-KL，或者klotho蛋白的分泌型剪接变体。s-KL不同于其他形式的可溶性klotho，即p-KL、p-KL1和p-KL2。在本说明书中，m-KL代表全长跨膜形式；p-KL代表可溶性蛋白水解性klotho，其由对m-KL切割产生；而p-KL1和p-KL2代表由p-KL的KL1结构域和KL2结构域组成的可溶性klotho形式。m-KL来自编码分子量约为130kDa(m-KL)的单次跨膜蛋白的全长转录物。该蛋白含有三个结构域：在C-末端的短跨膜结构域，由分别称为KL1和KL2的两个约550个氨基酸的内部重复序列组成的胞外结构域，以及10个氨基酸的非常短的胞内结构域。跨膜形式的胞外结构域可被金属蛋白酶ADAM10和ADAM17切割，产生约130kDa的另一种形式的可溶性Klotho(蛋白水解膜同种型缩写为p-KL。此外，位于KL1和KL2结构域之间还有蛋白酶ADAM 10和17的第二个识别位点，其产生两个新的70kDa同种型，其中一个仅包含KL1结构域(如由选择性剪接产生的但没有特定氨基酸尾巴的结构域)，另一个包含KL2结构域。然而，在体内没有证明p-KL被蛋白水解成p-KL1和p-KL2。
在第二方面，本发明涉及基因构建体，其包含与表达启动子可操作连接的编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列。
本发明的另一个方面是具有中枢神经系统趋向性的表达载体，其包含如上定义的基因构建体，因此包含与表达启动子可操作连接的编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列。
本发明的又一个方面是药物组合物，其包含治疗有效量的哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体和/或如上定义的基因构建体和/或如上定义的载体，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。
也作为本发明的一方面的是哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体或编码其的核酸序列，其在组合疗法中用于预防和/或治疗患者的认知和/或行为障碍，和/或神经退行性和/或神经病理学疾病，其中所述蛋白或编码其的核酸序列与另一种用于相同适应症的活性剂组合施用。
也作为本发明的一方面的是哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体和/或如上定义的核酸构建体和/或如上定义的载体与另一种活性剂的组合，其用于预防和/或治疗认知和/或行为障碍，和/或神经退行性和和/或神经病理学疾病。该组合涉及药物组合物或制剂，其用于施用s-KL与任何其他活性剂，所述施用可以在治疗有效的时间间隔内以任何顺序分开进行，或者用于同时施用活性剂。
在下文中描述了源自本发明的优点以及从下面提供的实验程序获得的结果。
使用旷场(Open Field)测试来研究s-KL是否能够影响运动、探索性活动、情绪性、新奇恐怖症和焦虑症等行为。简而言之，发明人发现，无论年龄如何，过表达s-KL的动物与对照动物相比都表现出轻微的过度活动，增加的运动活性，并且因此CNS中的s-KL的施用似乎逆转(至少部分地)约12个月龄时观察到的自发活动逐渐减少。此外，s-KL处理的动物中运动等待期(latencies)(作为新奇恐怖症或焦虑症结果的行为抑制的指标)倾向于更短，表明更高的去抑制作用，尽管该效果仅在中年龄动物(6→12设定)中达到统计学显著性，但在老年动物(12→18设定)中没有。一致地，shRNA-sKL介导的对s-KL表达的抑制具有相反的效果。因此，shRNA-sKL组的一些动物在测试开始时表现出行为抑制，表现出冻化或僵化，并且在远离中心区域的等待期大于过表达s-KL的小鼠。
接下来，为了评估s-KL过表达对工作记忆的影响，使用T迷宫测试。再次，结果显示，无论年龄如何，由于s-KL处理的小鼠与对照动物相比在解决任务方面较少犯错，所以施用s-KL提高了认知能力。这些结果与在(12→18个月设定)动物的前额叶皮层中发现的s-KL水平增加一致。鉴于在小鼠中，工作记忆缺陷出现在约24个月龄的时候，Klotho似乎充当认知功能的增强剂。
最后，使用Morris水迷宫测试来评估s-KL过表达/抑制对视觉感知学习和记忆以及学习能力的影响。两次实验的结果再次表明s-KL处理的小鼠在解决任务时更有效，并且它们比对照动物学得更快，表明s-KL显著改善小鼠的长期记忆。相比之下，注射shRNA-sKL的动物在学习任务方面出现问题并且游更远的距离才到达平台。此外，在最后的记忆测试中(最后一次训练后24小时)也观察到这些相反的效果。过表达s-KL的动物优先在平台之前所在的象限中进行搜索，而shRNA-sKL处理的动物对训练象限没有显示特别的偏好，表明了记忆和/或学习问题。正如所料，与对照组相比，治疗后6个月的s-KL水平的定量(mRNA和蛋白)显示与认知能力非常强的正相关，在AAV/s-KL治疗的小鼠中统计学上更高，在AAV/shRNA-sKL处理的小鼠中更低。无论动物是否在成年期(6→12个月)或中年(12→18个月)内进行注射，均观察到这种模式。
总之，这项研究提供了新的证据，表明s-KL在认知功能中的重要作用，而海马体中水平降低与认知功能低下相关。该研究还表明，CNS中单次脑室内(icv)注射s-KL有很大潜力作为一种持久和可量化的药物来刺激认知能力，甚至在小鼠老年治疗时防止年龄依赖性的认知能力下降。据发明人所知，这些是体内获得的第一批数据，其中仅分泌型Klotho蛋白的作用在成年期治疗时改善了老年动物的学习和记忆能力。此外，考虑到这些实验是在原初老年动物(naive aged animal)中进行，结果表明s-KL可能具有治疗痴呆的潜力。这代表了对神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病或多发性硬化症等有希望的新治疗方法。
附图说明
图1是构建作为携带质粒的载体的腺相关病毒的程序的示意图，所述质粒具有用于表达klotho蛋白的不同变体的本发明的基因构建体。在(A)中，部分表示了pUC57-KL合成质粒(GenScript，USA)，显示编码klotho蛋白的插入物并指示限制性位点。KL1表示编码KL1结构域的序列，并且包含表示编码仅存在于klotho s-KL的分泌型剪接变体中的氨基酸尾部的序列的连续正方形。KL2表示编码klotho的KL2结构域的序列。在图(B)中，示意性地显示了从合成的pUC57-pKL获得携带编码klotho蛋白的序列的pGG2-sKL质粒的策略。然后将该质粒导入293-AAV细胞(Stratagene)中。AAV-s-KL(或AAVrh10-s-KL)指示携带具有编码s-KL的基因构建体的质粒的腺相关病毒。该图涉及实施例1。
图2(A，B)分别显示了由Null、m-KL或s-KL 18个月龄的小鼠完成的旷场测试的总距离(cm)(图A)；在1分钟内记录的每种类型的小鼠每分钟产生的总距离(cm)(图B)(X轴，MIN是测定的第1至5分钟，圆圈表示Null，正方形表示m-KL，并且三角形表示s-KL)。该图涉及实施例2C。
图3显示在对照小鼠(正方形)和s-KL小鼠(圆形)中进行的T-迷宫测试的结果。在自由选择测试中成功的百分比沿测试的不同天数(从第1天到第3天)分布。该图涉及实施例2D。
图4描绘了在s-KL小鼠(圆圈)和Null小鼠(正方形)中进行的Morris水迷宫测试的结果。图4(A)描绘了执行的每个地点任务(PT)测试1至4，到达平台的平均速度(以cm/s计)。图4(B)表示达到平台的平均距离(以cm计)。该测试用18个月龄的小鼠进行。该图涉及实施例2D。
图5是显示在Morris水迷宫测试的提示测试部分24小时后进行的长期记忆测试的结果的图。该测试用18个月龄的小鼠进行。在Y轴上记录游泳池的几个方格中距离占总距离的百分比(％)。每组(Null或s-KL)中的左侧条是之前平台所在方格(PTf方格)中的距离百分比；每组第二条显示在相对方格(Opos PTf)中的距离百分比，第三条是在平台右边的方格(R PTf)中完成的距离百分比，每组右侧条是在平台左侧的方格(L PTf)中完成的距离的百分比。该图涉及实施例2D。
图6显示AAV治疗的动物的几个脑部分或切片(前额叶皮质，PFC；皮质，C；海马体，H；和小脑，CB)中s-KL相对于对照的相对表达。该图涉及实施例2E。
图7(A，B)分别显示了由s-KL、shRNA-sKL和对照12月龄小鼠进行的旷场测试的总距离(cm)(图A)；在1分钟内记录的每种类型的小鼠每分钟产生的总距离(cm)(图B)(在X轴，MIN是测定的第1至5分钟，方块表示Null，三角形表示shRNA-sKL，圆圈表示s-KL)；和不同的参数来评估旷场测试中的探索活动(图C)。该图涉及实施例3B。
图8描绘了在12个月龄的小鼠中进行的Morris水迷宫测试的结果。s-KL小鼠(圆圈)，shRNA-sKL小鼠(三角形)和Null小鼠(正方形)。图8(A)描绘了执行的每个地点任务(PT)测试1至4，达到平台的平均等待期(以秒为单位)。图8(B)表示达到平台的平均距离(cm)。该测试用18个月龄的小鼠进行。图8(C)显示了在12个月龄的小鼠中进行的Morris水迷宫记忆测试的结果，并且该测试在测试的提示测试部分后24小时进行。在Y轴上记录游泳池的几个方格中距离占总距离的百分比(％)。每组(s-KL，shRNA-sKL和对照)中的左侧条是之前平台所在方格(PTf方格)中的距离百分比；每组第二条显示在相对方格(Opos PTf)中的距离百分比，第三条是在平台右边的方格(R PTf)中完成的距离百分比，每组右侧条是在平台左侧的方格(L PTf)中完成的距离的百分比。该图涉及实施例3C。
图9是用市售抗体(KM2076，Cosmobio Japan)在野生型小鼠(C57BI6)组织中进行的检测klotho蛋白的试验的Western印迹图像：肾、全脑和特定脑切片前额叶皮质(CPf)、皮质(Cx)、小脑(CB)和海马体(HC)。脑中的Klotho蛋白的分子量在70-100KDa之间，而在肾中蛋白的分子量接近130KDa。该图涉及实施例4。
图10(A-D)显示了使用兔抗小鼠抗体(自制的并命名为Ab K113)对s-KL蛋白进行的Western印迹分析，所述兔抗小鼠抗体是针对s-KL特异性产生的。6和18个月龄C57BI/6小鼠(年轻6M，年老8M)的前额叶皮质(PfCx，小图(A))，皮质(CX，小图(B))，海马体(HC，小图(C))和小脑(CB，小图(D)。使用肌动蛋白(42kDa)来将所分析蛋白的量标准化。使用ImageJ软件(国家卫生研究院开发的公共领域，基于Java的图像处理程序)通过密度测定法量化样品。对于所分析的每个脑区域，以条形图描绘18个月龄小鼠相对于6个月龄小鼠获得的倍数变化。
图11.AAV处理的小鼠中的s-KL和m-KL表达水平。在海马体施用后6个月，在s-KL、shRNA-sKL和空处理的动物的海马体中定量s-KL水平。将s-KL和m-KL转录物的mRNA水平相对于在对照动物中获得的值归一化。该图涉及实施例5。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的所有术语应以本领域已知的普通含义理解。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在整个说明书和权利要求书中统一适用，除非另有明确阐述的定义提供更宽泛的定义。
根据本发明的“基因构建体”也可以称为“表达盒”。它是指多核苷酸序列，该多核苷酸序列又包括编码目的蛋白的序列，该序列可操作地连接至表达启动子，所述启动子控制编码蛋白的序列的表达。对于“可操作地连接”应理解为编码蛋白的序列在启动子序列(在5'-3'方向)之后，或在包含限制性位点或存在基因构建体的其他稳定化元件的情况下在启动子附近。基因构建体(表达盒)还可以包含具有有用序列的小片段，以使其适应更复杂的表达系统(载体，质粒)或在编码感兴趣蛋白的序列之后设置的聚腺苷酸化尾部。表达盒本身也是一种表达系统，为进一步用于保护基因构建体，或者在病毒载体的情况下促进进入细胞的载体或质粒。
“启动子”是启动特定基因转录的DNA区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的相同链上游(朝向正义链的5'区)。启动子可以长约100-1000个碱基对。“组成型启动子”是在细胞中所有情况下都是有活性的启动子，与其他受调节的启动子相反，其他受调节的启动子在细胞内只在响应特定刺激时才有活性，如“诱导型启动子”。其他启动子是组织或细胞特异性的，如“神经元特异性启动子”。对于“多核苷酸序列”，应理解为包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子(DNA或RNA)。核酸可以是单链或双链，并且它包括但不限于编码多肽的核苷酸序列。
如本文所用的术语“腺相关病毒(AAV)”是指感染分裂和静止的灵长类动物(和人类)细胞的病毒载体。由于它们似乎缺乏任何致病作用，并且通常整合到基因组的相同位置(AAVS1位点，19号染色体)，因此这种病毒载体可以安全地用于在基因治疗应用中将外源DNA转导入人类细胞。“表达载体”也称为“表达构建体”，通常是设计用于在细胞中表达蛋白的质粒或病毒。该载体用于将特定基因导入靶细胞，并可以征用细胞蛋白合成的机制以产生由该基因编码的蛋白。表达载体是生产蛋白的生物技术的基本工具。表达载体具有任何载体可具有的特征，例如复制起点，选择性标记物以及用于插入基因的合适位点如多克隆位点。
两个氨基酸序列之间的“同源性百分比”应理解为序列位置相同或被具有相似特征的侧链(即，根据本领域专家已知的广泛接受的分类，极性，非极性，具有氨基，具有-SH，也就是说相同类别的氨基酸)的其他氨基酸替代的百分比。两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”应理解为具有相同氨基酸的序列位置的百分比。序列之间的同源性和同一性的百分比可以通过“序列比对”来计算。序列比对可以是局部的或全局的。就本发明而言，同源性和同一性的百分比将优选地在整个序列或序列的整个活性片段之间就整体比对进行计算。当序列相似且具有大致相同的大小(长度)时，全局比对更有用。在现有技术中有几种算法可用于执行这些全局比对。还有生物信息学工具使用这种算法来获得序列之间的同一性和同源性的百分比。作为实例，序列之间的全局比对可以通过众所周知的GGSEARCH或GLSEARCH软件来执行。两个氨基酸序列之间的同一性优选通过使用在Altschul,S.F.等"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of蛋白database search programs",Nucleic Acids Research-1997,Vol.No.25,pp.:3389-3402和NCBI http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST中公开的BLASTP算法来确定。
如以下实施例中将描述的，在小鼠脑部注射包含基因构建体的表达载体当这些小鼠进行了几次测试时促进认知和行为功能的改善，所述基因构建体具有编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至表达启动子。这些数据证明s-KL可用于治疗和/或预防认知和/或行为障碍，和/或神经退行性和和/或神经病理学疾病。
本发明包括将s-KL作为蛋白或作为编码其的核酸序列施用，后者以适合的形式施用，例如以基因构建体和/或表达载体的形式施用。因此，本文中的“s-KL”意指两种形式的s-KL。
在特定实施方式中，认知和/或行为障碍与老化相关。术语“与...相关”是指在哺乳动物、特别是人变老(老化)时发生认知和/或行为障碍，如老年痴呆症，并且也可能发生在一些神经退行性和/或神经病理学疾病中，其也是在所述疾病中受影响的生理参数的原因或结果。老年痴呆症与由于自然非病理性老化而出现的病症相关，并且它意味着许多认知和/或行为障碍，例如平衡问题、震颤、记忆扭曲、焦虑症、抑郁、冷漠、激动和烦躁。老年痴呆症也可能与神经退行性疾病如阿尔茨海默病相关。
在特定实施方式中，与衰老相关的认知和/或行为障碍是老年痴呆症中表现出来的障碍之一。
因此，在本发明第一方面的特定实施方式中，s-KL用于预防和/或治疗选自由学习和记忆问题组成的组的认知障碍。更具体地说，用于学习障碍，特别是学习过程障碍，和记忆问题，特别是记忆丧失、工作记忆障碍和长期记忆障碍，后者包括空间和情节记忆障碍。
在另一个具体实施方式中，任选地与上文或下文的任何实施方式组合，s-KL用于预防和/或治疗选自焦虑症和广场恐怖症的行为障碍。
此外在另一具体实施方式中，任选地与上文或下文的任何实施方式组合，s-KL用于预防和/或治疗与神经退行性和/或神经病理学疾病相关的认知和/或行为障碍，所述疾病选自由阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症、具有路易体的痴呆、克雅氏病，多发性硬化症、和共济失调毛细血管扩张症、中风后痴呆，创伤后痴呆、老年性痴呆和颅脑创伤组成的组。
在更具体的实施方式中，s-KL用于预防和/或治疗与阿尔茨海默氏病相关的认知和/或行为障碍。特别是用于预防和/或治疗阿尔茨海默病中焦虑症障碍。
因此，根据本发明使用的s-KL在特定实施方式中用于哺乳动物、特别是人的认知和/或行为障碍的预防和/或治疗。Klotho蛋白在哺乳动物中具有高百分比的同源性，如下表所示(BLAST分析，来自NCBI的氨基酸序列)：
Figure BDA0001660732420000131
在特定的实施方式中，如上使用的s-KL是选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2中任一个具有至少88％同一性百分比的多肽的多肽。通过使用BLASTP算法确定同一性百分比。
在又一个更具体的实施方式中，它是选自氨基酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多肽。在其他特定实施方式中，如上使用的s-KL是SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1的百分比同一性为88％至100％的多肽。同一性百分比的范围包括88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％和100％。在另一个更具体的实施方式中，多肽的同一性百分比为88％至90％；并且更特别地为88％至88.5％。
SEQ ID NO：1是来自α-klotho人基因的选择性剪接的转录物的氨基酸序列，包含KL1结构域序列，其重量约为70kDa，但具有由15个氨基酸尾部组成的特异性分泌信号，其在m-KL转录物中未发现，对于Genome Reference Consortium维护的人类基因组而言，α-klotho人基因是位于组装体GRCh38(24.12.2013)的13号染色体NC_000013.11(33016063..33066145)中的基因。SEQ ID NO：1来源于SEQ ID NO：5的相应cDNA，其源自具有5012个碱基对的GenBank数据库(2014年5月3日版本3)登录号NM_004795，2014年5月3日版本3的mRNA序列的选择性剪接转录物。
SEQ ID NO：2是来自α-klotho小鼠基因的选择性剪接的转录物的氨基酸序列，包含KL1结构域序列，重量约为70kDa，但具有由15个氨基酸尾巴组成的特异性分泌信号，该特异性分泌信号在m-KL转录物中未发现，α-klotho小鼠基因是位于在UCSC Genome Browseron Mouse 2007年7月(NCBI37/mm9)小鼠基因组集合的5号染色体(150,952,607-150,993,809)中的基因。SEQ ID NO：2源自SEQ ID NO：6的相应cDNA，SEQ ID NO：6源自具有5124个碱基对的GenBank数据库登录号NM_013823，2015年2月15日的版本2的mRNA序列的选择性剪接转录物。
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中任一个具有至少88％同一性百分比的多肽包括：衍生自下述序列的氨基酸变异的哺乳动物蛋白，所述序列包括SEQ ID NO：1或2中在序列的任何位置的、一个或两个或三个氨基酸取代、一个或两个氨基酸缺失，一个或两个氨基酸插入，与SEQ ID NO：1或2相关的所有这些氨基酸变化，条件是所得到的蛋白具有与其所衍生自的s-KL相同的功能。与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的任何一个具有至少88％同一性百分比的多肽还包括小鼠和人以外的哺乳动物的s-KL。如上所述，通过借助于BLASTP算法执行的序列之间的全局比对来确定同一性。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中，如上所述使用的s-KL是由SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2组成的多肽。
s-KL可直接以蛋白的形式使用，其方便地指向或最终到达脑或中枢神经系统(CNS)。该蛋白可以例如以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包含治疗量的蛋白，其悬浮或溶于可用于注射入脑中的载剂(溶剂)或可用于静脉注射(主要)的载剂(溶剂)，以及用于稳定蛋白的可接受的赋形剂。
另一方面，s-KL可以通过基因治疗在CNS的靶细胞内表达。为此目的，本发明还提供了新的基因构建体，其包含与表达启动子可操纵地连接的编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列。当在本发明中提到“编码哺乳动物Klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列”时，尤其应理解为由哺乳动物中所述s-KL的mRNA逆转录(RT-PCR)产生的cDNA序列。在具体的实施方式中，可操纵地连接的表达启动子选自组成型表达启动子、诱导型启动子和神经元特异性表达启动子。在具体的实施方式中，根据本发明的基因构建体包含核酸序列SEQ ID NO：3。SEQ ID NO：3包含巨细胞病毒中-早期(CMV IE)启动子，编码s-KL的序列(小鼠s-KL的cDNA)和聚腺苷酸化链(poly A)。在另一具体实施方式中，根据本发明的基因构建体包含核酸序列SEQ ID NO：4，与SEQ ID NO：3等效，但具有人s-KL蛋白的编码序列(人s-KL的cDNA)。
在另一具体实施方式中，基因构建体由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4构成。
所有这些基因构建体都能够在细胞中表达一次感兴趣的蛋白，特别是在CNS细胞中。
为了促进构建体的施用，本发明还提出了具有中枢神经系统趋向性的新表达载体，其包含如上定义的基因构建体，因此包含可操纵地连接到表达启动子、特别是组成型表达启动子的编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列。
用于本发明目的的合适的表达载体是具有中枢神经系统(CNS)趋向性或有效转导CNS细胞的载体。用于基因治疗的表达载体通常是病毒，特别是逆转录病毒、腺病毒、病毒载体的包膜蛋白假型化(nvelope protein pseudotyping)、有复制能力的载体、顺式和反式作用元件、或单纯疱疹病毒。
在这些表达载体的特定实施方式中，它们是病毒载体。
更特别地，表达载体是腺相关病毒，并且更具体地是具有CNS趋向性的腺相关病毒，其可以是血清型1-10。特别是，腺相关病毒属于血清型rh10(AAVrh10)。
用于递送包含s-KL编码序列的基因构建体的其他可能的载体包括可避免基因构造体损伤并且有助于构建体以有效且特异性的方式进入CNS细胞内的脂质体、微粒和纳米颗粒。也可以通过非病毒方法施用质粒或裸DNA形式的s-KL以进行基因治疗，例如裸DNA注射、增强递送的物理方法、电穿孔、基因枪、声孔效应、磁转染或流体动力学递送。其他增强递送的化学方法是使用寡核苷酸、脂质复合物、聚合物囊泡、聚复合物、树状聚合物或无机纳米颗粒。
如上所述，本发明的另一个方面是将哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体和/或如上定义的核酸构建体和/或如上定义的载体与另一种活性剂的组合，用于预防和/或治疗与衰老相关、和/或与神经退行性和和/或神经病理学疾病相关的认知和/或行为障碍。
在一个具体的实施方式中，所述组合用于预防和/或治疗与阿尔茨海默氏病(AD)相关的认知和/或行为障碍。所述组合涉及用于施用s-KL与任何其它活性剂的药物组合物或制剂，所述活性剂例如为盐酸多奈哌齐(Aricept，Pfizer)、美金刚胺(memantine)、雷司替明和川芎内酯，其可以分开地以任何顺序在治疗有效的时间间隔内施用，或者与活性剂同时施用。在又一个更具体的实施方式中，该组合用于预防和/或治疗AD患者中的焦虑症。
s-KL可以通过粘膜(例如鼻腔、舌下、阴道、经颊或直肠)、肠胃外(例如皮下、静脉内、肌内或动脉内注射，可为推注或输注)、口服、透皮或通过例如气溶胶经由吸入而施用。适合肠胃外施用的制剂，例如通过关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径，包括含水和不含水的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。注射液和悬浮液也可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。在一些实施方式中，组合物通过注射施用，例如皮下、腹膜内、膀胱内、静脉内，通过输注，例如使用储库或渗透微型泵或肌内注射。该制剂可以以单位剂量或多剂量密封的容器如安瓿和小瓶提供。
在一个具体的实施方式中，s-KL肠胃外施用至患者，更具体地，静脉内施用。
在其他特定的实施方式中，s-KL以直接递送至中枢神经系统的方式施用，更具体而言，鞘内或脑池内(intracisterna magna)(ICM)注射，特别是通过贴剂、微型泵或微胶囊递送系统使用。
在整个说明书和权利要求中，词语“包括”以及该词语的变体不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包含”涵盖“由...组成”的情况。本发明的其它目的、优点和特征对于本领域技术人员在查阅说明书后将变得显而易见，或者可以通过实施本发明而了解。以下实施例是以说明的方式提供的，并且它们并不意在限制本发明。此外，本发明涵盖了在此描述的特定和优选实施方式的所有可能的组合。
实施例
实施例1.编码分泌型Klotho蛋白的质粒载体的产生。转导用AAV病毒载体的制备。
由合成构建体进行用于基因治疗的病毒载体的产生。基因构建体(质粒)pCR-KL-TOPO-KL(ImaGenes TM，德国)编码Klotho的跨膜蛋白同种型(m-KL)的全长cDNA。然后通过以限制性酶连接将Klotho序列克隆到pGG2质粒(SEQ ID NO：12，Genethon提供)中，所述pGG质粒携带腺相关病毒血清型2(AAV2)基因组的末端反向重复(ITR)序列和多克隆位点(MCS)，其中在巨细胞病毒即早期启动子(CMV IE)的控制下克隆感兴趣的基因。为此，用XbaI/EcoRI限制酶从pCR-KL-TOPO-KL中提取m-KL的cDNA，并使用相同的酶将该片段克隆入载体p123T中，该载体包含CMV IE启动子序列(MoBiTec，Alemania)，EMBL-EBI登录号Z46733，2014年8月29日的第121期)。将包含CMV IE启动子序列和m-KL编码序列的片段(以下称为CMV1E-mKL)克隆到包含CMV IE启动子序列的pGG2质粒中，以获得侧翼具有末端反向重复(ITR)的表达盒。该质粒被称为pGG2-m-KL(SEQ ID NO：13)。
包含编码s-KL的cDNA的基因构建体由SEQ ID NO:14的合成pUC57-KL(GenScript,USA)产生。该质粒含有用于克隆s-KL的合适限制性位点。在图1(A)中示意性描述了质粒图谱。图1(B)显示可由合成pUC57-KL衍生的s-KL同种型的克隆策略。
用Xbal/Bsp1201靶标产生包含s-KL编码序列的质粒(pGG2-s-KL，SEQ ID NO：15)，Xbal/Bsp1201靶标与用于打开pGG2载体的NotI/Xbal相容。
在该具体实施例中pGG2-s-KL和pGG2-m-KL用pGG2质粒获得。无论如何，其他质粒是有用的，同时允许包含CMV IE启动子的基因构建体包封在病毒衣壳中，该CMV IE启动子可操作地连接至编码s-KL的序列和聚腺苷酸化链(对于鼠s-KL为SEQ ID NO：3，对于人类s-KL为SEQ ID NO：4)；并且允许包含m-KL(人或鼠)的相同构建体包装在病毒衣壳中。这些序列的包封产生相同的病毒基因组和病毒衣壳蛋白，与用于产生如下所示的AAV的质粒无关。
包含质粒pGG2-mKL或pGG2-sKL的另外的AAV载体通过用pGG2质粒、携带用于AAV扩增的AAV基因的pXX6质粒(SEQ ID NO：16，由Genethon惠赠)、和质粒pREp2Cap10(SEQ IDNO:17)(MTA Dr.J.M.Wilson,University of Pennsylvania)三重转染来自Stratagene的293-AAV细胞(70％汇合度)来产生，质粒pREp2Cap10携带序列Cap和AAVrh10的Rep。然后病毒使用碘克沙醇梯度超速离心而纯化，用picogreen方法计数(Piedra等,"Development ofa rapid,robust,and universal picogreen-based method to titer adeno-associatedvectors",Hum Gene Ther Methods-2015,vol 26(1),pp:35-42；或doi:10.1089/hgtb.2014.120PMID:25640021)，并在-80℃储存备用。表达载体命名为AAVrh10_pGG2-sKL和AAVrh10_pGG2_mKL。用于将AAVrh10_pGG2_mKL定量的引物为m-KL-正向5'-TTCAAACCCGGAAGTCTTTG-3'(SEQ ID NO:7)和m-KL-反向5'-CCAGGCAGACGTTCACATTA-3'(SEQID NO:8)。
程序如下：通过聚乙烯亚胺PEI(PolyScience)以500μg的pXX6、250μg的pRep2Cap10和250μg的pGG2质粒转染20个15cm直径的带有来自Stratagene的293-AAV细胞(70％汇合度)的板。将三种质粒在培养基DMEM中混合，并加入平板至终体积为14ml/平板。6小时后更换培养基。转染48小时后，将细胞刮下并离心。将它们重悬于裂解缓冲液(50mMTris(Sigma)，20mM NaCl(Panreac)和2mM MgCl2(Panreac))中。对于AAV纯化并在3次冷冻-解冻循环后，通过离心获得细胞残留物并保存上清液。将Benzonase(50U/ml)加入到上清液中以分解细胞DNA。用聚乙二醇(1ml PEG/4ml细胞裂解物)进一步沉淀病毒颗粒。以8000g离心15分钟，得到含有病毒颗粒的沉淀物。将15ml裂解缓冲液加入碘克沙醇梯度管中，并在690000g离心1小时后除去病毒颗粒。
实施例2.在老年小鼠中体内施用AAV s-KL载体
实施例2A:AAV载体的施用
在C57BL/6小鼠中评估klotho过表达在老化CNS中的长期影响，所述C57BL/6小鼠在12个月龄(中年，N＝10)进行注射，并且在6个月后当它们达到老龄(18个月)时通过一系列行为评估和功能分析测试(图2和图3)进行检测。对照组注射编码无关DNA序列的AAVrh10载体，治疗组注射编码分泌型(s-KL)Klotho同种型的AAVrh10载体。将AAV载体脑室内(icv)注射以模拟内源性生产系统，内源性生产系统中CNS中产生的Klotho释放到CSF中并分布在整个脑中。
对于体内测定，使用Harlan Laboratories BV的C57B16小鼠(野生型雄性)。根据西班牙适用法律，在巴塞罗那自治大学(Universitat Autonoma de Barcelona)(西班牙)进行所有动物和尸体剖检实验。协议得到了伦理委员会的批准。动物在22℃下在Macrolon笼中任意自由进食，并且从8:00h开始在12小时的黑暗和光照周期中。
通过腹膜内注射氯胺酮(10mg/kg体重；Imalgene 500；Rhone-Merieux)和甲苯噻嗪(1mg/kg体重；Rompun；Bayer)麻醉小鼠，并将其固定到立体定向框架上(David KopfInstruments，CA，USA)。用实施例1的表达载体对野生型小鼠(12个月龄)在脑中注射以达到脑脊液(CSF)。因此，产生s-KL小鼠(注射AAVrh10_pGG2-sKL，也缩写为AAVrh10-s-KL)。作为对照(Null小鼠)，使用编码无关基因的载体。实验组每组10只(n＝10)。借助于立体定位装置在脑的第三侧脑室内进行脑室内注射。表达AAV载体的施用剂量为每只小鼠1.1010个载体基因组(vg/小鼠)，单剂量3μl。
实施例2B.s-KL在CNS中的过表达不影响老年小鼠的体重或感觉运动技能
当小鼠18个月龄时进行行为和认知测试。首先，进行感觉运动测试(第1天)，接着进行角落测试和旷场测试(第2天)。接下来，进行T-迷宫测试(第3-5天)。最后完成Morris水迷宫(MWM)测试(第6-12天)。
从12月龄至19月龄，每月一次监测动物的体重。通过尾巴抓住动物并将其降低慢慢到黑色表面，测量反射(视觉反射和后肢伸展反射测试)三次。运动协调性和平衡通过覆盖的距离和两次连续20s试验中掉落水平木棒(1.3cm宽)的等待期分别进行评估。为了增加任务的难度，在金属线棒(1cm直径)上重复测试。以线悬挂测试所覆盖的距离来衡量抓握性(Prehensility)和运动协调性，该测试包括允许动物从水平线(直径：2mm，长度：40cm，分成8个5cm节段)的中间以它的前爪扒附进行两次5秒的试验和第三次60秒的试验。在60秒的试验中，以直到脱落的时间测定肌肉力量。所有的设备悬挂在衬垫桌上方40cm处。
经处理动物的行为评价从评估s-KL对身体状态(即体重和反射)以及基本感觉运动功能(例如平衡、协调、抓握性、强度和抵抗力)的推定效果开始。这些测定允许检测取决于运动性能的可能随后影响结果的组之间的可能差异。值得注意的是，两组动物的平均体重没有显著差异(p＝0.48)。然而，s-KL处理的小鼠在注射后6个月内具有相对稳定的体重，而空白处理组的体重在中年时逐渐增加，在老年时降低。表1中显示的结果也显示了s-KL治疗组和对照组中通过视觉放置和后肢反射测试(木棒和金属棒测试)；和悬挂测试所测量的类似感觉运动功能。因此，假定所有动物在随后的行为测试中分析时都处于相似的身体状况。
表1:感觉运动试验
对照 s-KL
视觉反射(正确) 100％ 100％
木条(s) 19.0±1.0 17.86±1.25
金属条(s) 3.5±0.67 3.21±1.19
实施例2C:CNS中s-KL过表达改善年龄相关的运动衰退而不影响老年小鼠的焦虑 症样行为。
人类的衰老，无论是正常的还是与年龄相关的疾病中的，都与运动表现高度相关的变化相关，这种变化在认知和行动方面并行改变。因此，由于运动和探索行为随着年龄下降，我们首先试图使用旷场试验确定与对照相比，分泌型Klotho同种型在CNS中的过表达是否可以影响注射的小鼠的运动/探索行为。
这个测试是为了研究新奇恐怖症和焦虑症样行为而开发的，最常在啮齿类动物中用于定性和定量测量一般运动活动(水平和垂直活动)和探索意愿(主要通过垂直活动显示)。为了确定老龄小鼠脑中的sKL过表达是否引起运动、探索活动、情绪和焦虑症状的行为的变化，研究了旷场活动，包括总行程距离、直立探索行为、行为事件的等待期、自我梳理行为和排便。
为了具体了解m-KL和s-KL是否可以在所处理的动物中诱导不同的作用，野生型小鼠(12个月龄)也在脑内以脑室内注射AAVrh10_pGG2_mKL载体(n＝10)。
该测试的结果如图2(A，B)所示。在图2(A)中，在旷场中完成的总距离(cm)用柱状图表示。在图2(B)中记录了每种类型小鼠的每分钟总距离(cm)。在表2中，评估旷场试验中动物的探索活性的不同参数。
表2:旷场试验中的探索活性
对照 s-KL
离开中心的等待期(s) 6.75±1.79 3.98±1.11
到达周边的等待期(s) 9.14±1.36 7.7±1.09
首次立的等待期(s) 18.42±2.91 24.33±3.92
梳理次数 2.86±0.10 2.29±0.12**
首次梳理的等待期(s) 84.17±11.63 90.33±24.06
排便次数 2.13±0.49 1.94±0.32
如图2A所示，在18-19个月龄测试时，与对照小鼠相比，先前用s-KL或m-KL在12个月icv施用的小鼠行进的总距离更远(分别为p<0.01；p<0.001)。有趣的是，在m-KL处理的小鼠中观察到的更大的运动活性似乎与焦虑症相关，因为在测试的前三分钟内未观察到行进距离的差异(图2B)。相比之下，对s-KL小鼠观察到的更大的运动活动与焦虑症无关，因为运行距离在测试结束时在统计学上是显著的，并且因此更多地与探索行为相关联，这是更年轻动物的更典型特征(图2B)。这与测量的其他参数一致，例如行为事件的顺序和排便次数，这表明两组动物在面对开放测试场时表现出相似水平的新奇恐怖症和情绪性(表2)。只有在所处理动物中梳理次数的减少(p＝0.0032)具有统计学显著性。
实施例2D:CNS s-KL过表达改善老年小鼠的认知能力
为了研究Klotho在CNS中可能的持久神经保护作用，在以下两项学习记忆测试中评估动物的认知技能：T-迷宫和Morris水迷宫。
在T形迷宫(臂，长度为25cm)中测试自发探索行为。动物被放置在迷宫的垂直臂内，面向端壁。通过确定动物越过(四爪标准)三条臂的交叉点的经过时间来评估表现。工作记忆范式包括两个连续的试验：一个强制选择和一个自由选择，试验之间间隔90s。在强制选择中，只有一条臂按照随机顺序(每组中对立平衡(contrabalance))可到达(accessible)。每只小鼠被放置在迷宫的“垂直”臂中，其头部朝向端壁并允许探索迷宫。在可达到的臂中花费20s(学习标准)之后，动物被放回到家笼起始盒中。19秒后，其又被允许在自由选择试验中探索迷宫，其中两条臂都可到达。记录小鼠选择的臂和自由选择期间在每条臂中所花费的时间。在探索无法到达的臂之前，选择在此前实验中已经到达过的臂被认为是错误。还记录了完成迷宫中三条臂探索所花费的时间。通过在实验之间间隔期间清洁迷宫的表面来去除嗅觉踪迹。
表3.强制选择和自由选择试验中不同的参数
Figure BDA0001660732420000211
如表3所示，在T迷宫中的强制选择任务中，所有组都相似地符合标准，但并非所有动物都能完成任务。随后，只有那些符合标准的动物接受了第二次试验-记忆任务。结果显示与对照组(误差频率2.94/6)相比，老龄小鼠CNS中s-KL表达的增加显著改善了它们的记忆评分(错误频率为0.65/5)。这可以通过选择迷宫路径的误差显著更少来证明(p＝0.0018)。而且，这种能力连续3天保持不变(图3)。
这些数据表明，CNS中s-KL表达的增加与对照相比允许改善符号记录情况(punctuation)。此外，这意味着更好的工作记忆，所述记忆在老年人和阿尔茨海默病中有特别的兴趣。
在Morris水迷宫中进行对经处理动物的认知能力的进一步分析。该测试包括一个视觉感知学习的提示任务，四天的空间参考学习和记忆的地点任务，然后是长期(24小时)记忆探测试验。在地点学习任务中，训练小鼠在位于具有远端视觉线索的测试室中的圆形水池(Intex Recreation Corp.CA,USA；91cm直径，40cm高度，25℃不透明水)中定位平台(7cm直径，水面下1.5cm，由可见的5x8cm条纹旗标示的位置)。这需要每天四次平台试验期，试验时间间隔为15分钟。在每次试验中，从一个随机选择的起点(N、S、E或W)轻轻地释放小鼠(面向墙壁)并允许其游动直到逃到平台上(总是在SE象限的中间)。在60秒内未能找到平台的小鼠被放置在其上20秒，对于成功的动物允许相同的时间。在最后的提示平台试验后24小时，对动物测试以对由四个隐藏的平台试验(相隔20分钟)组成的视觉平台进行提示学习。平台隐藏在水面下1.5cm处，其新位置(NW)由可见条纹旗(5×8cm)表示，远端线索被移除。在每次试验中，通过计算机化跟踪系统(SMART，Panlab S.A.，Spain)测量逃离等待期、行进距离和平均速度。
值得注意的是，用s-KL处理的组中游泳速度显著更高(图4A)。这与在旷场试验中在这些相同动物中观察到的水平运动行为增加一致。因此，我们认为距离是在评估这些动物学习和记忆能力时比等待期或速度更准确的变量。重要的是，尽管它们的年龄，但是两组在4个训练日中都表现出了学习的效果，这是因为解决任务所覆盖的距离逐渐缩短(图4B，对照的p<0.01；s-KL的p<0.001)。最后，无论哪一组，空间学习的获得都是相似的。这表明在记忆测试之前，所有动物在面对任务时都是平等的。
最后，在最后一次采集后24小时(探测试验24小时)，老年对照小鼠在长期记忆试验中表现较差。它们对训练象限的偏好低于它们在短期记忆试验中显示的偏好。相比之下，s-KL处理组明显偏好训练象限，与对照组相比有统计学显著性(p<0.01，图5)。这些结果表明，CNS中s-KL水平增加的认知效应与长期记忆的选择性改善相关。
实施例2E.病毒基因组在经注射小鼠的CNS中的定量
在所有测试终止后，将小鼠处死，并将脑的一半在多聚甲醛(4％)中固定用于组织学。另一半脑用于测定不同脑区(前额皮层，PFC；皮层，C；海马体，H；和小脑，CB)中病毒基因组(vg)的存在和s-KL的表达水平。
对于这些分析，进行定量PCR。为了检测病毒基因组，进行DNA Hirt提取过程(HirtB等，“Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cultures”，J MolBiol-1967，第26卷，第365-369页)，允许从内部细胞分离病毒附加体。定量PCR用CMV IE启动子的特异性引物进行。用于通过定量PCR(qPCR)检测s-KL水平的引物是：
s-KL-正向5'-TGGCTTTCCTCCTTTACCTG-3'(SEQ ID NO:9)，
s-KL-反向5'-GCCGACACTGGGTTTTGT-3'(SEQ ID NO:10)，
CMV-正向:5'-TACATAACTTACGGTAAATGGC-3'(SEQ ID NO:18)和，
CMV-反向:5'-AAAGTCCCTATTGGCGTTACT-3'(SEQ ID NO:19)。
通过从脑切片中提取RNA来进行病毒表达。使用iTaq Universal SYBR GreenSupermix(BioRad)，热循环仪CFX384TouchTM实时PCR检测系统(BioRad)，Hard-ShellRhin-Wall 384-Weel Skirted PCR板(BioRad)，Microseal“B”粘合密封件(BioRad)，按照供应商的指示进行qPCR。cDNA按照1/5稀释。扩增程序为：98℃2分钟，40个循环：95℃5秒和58℃30秒。
在所有注射的动物中检测到AAV基因组，AAV-s-KL分布类似于AAV-Null对照(数据未显示)。因此，在脑室内施用6个月后，18个月龄小鼠的CNS中仍存在AAVrh10载体。更重要的是，在分析(通过对s-KL mRNA进行的qPCR)的所有脑区域中，s-KL表达增加，从小脑中高2倍到前额皮质和海马体中高4倍(图6)。这些结果证实了上面针对由于s-klotho过表达导致的年老小鼠所公开的行为和认知测试的差异。
实施例3.年轻小鼠中s-KL的体内施用
为了研究s-KL的长期表达是否可以改善中年动物的身体、非认知和认知状态，第二组小鼠(n＝11-14)在6个月龄时进行治疗。然后在12个月时通过同样的一系列测试对它们进行的评估。与年轻脑相比，年老者中AAV转导的效率低得多。通过测试一组相对年轻的成年动物，我们可以避免这种限制。另外，对于这组，AAV被特异性地注射到海马体内。主要原因是(i)klotho基因在海马体中大量表达；(ii)海马体参与学习和记忆过程；和(iii)在小鼠中，海马体在结构上发展直至12个月龄，后来发生年龄依赖性功能下降。实际上，还有其他大脑区域，其中klotho也高度表达(例如脉络丛和小脑)。然而，我们有兴趣了解在可塑性期间特异性增强海马体中的s-KL是否可以改善海马体依赖性学习和记忆过程，从而减少未来功能衰退的影响。
在相同的实验设计中，我们还比较了相对于对照处理和s-KL处理的动物，原初小鼠(native mice)中s-KL抑制是否加剧认知缺陷。为了实现对分泌型Klotho同种型的特异性抑制，我们施用了携带针对s-KL的shRNA的AAV载体。shRNA序列针对m-KL中不存在的s-KL尾部中的额外序列而设计。携带shRNA-扰乱序列的AAV用作对照。
实施例3A.AA载体的施用
如实施例2中那样进行体内测定，但采用年轻动物进行(当注射包含s-KL的编码序列的AAV载体或作为对照的扰乱DNA时，为6个月龄)。在这种情况下，对动物在海马体进行注射(2次注射：5x109vg/小鼠，每个半球注射一次)。在实验开始时(6个月)、在9月龄和12月龄时测量动物体重。当小鼠12个月龄时，进行相同的行为和认知测试。如实施例2中那样，在测定过程中体重(每月测定)如预期增加。值得注意的是，s-KL随时间持续的过表达或抑制没有显著影响，并且所有组均显示稳定的相似的体重增加(数据未显示)。
表4.感觉运动功能
Figure BDA0001660732420000241
与之前以老年动物进行的实验相同，在6-12个月龄持续过表达或抑制s-KL不影响所有组的反射和感觉运动技能，所有组的反射和感觉运动技能都没有受到影响(表4)。
实施例3B.海马中s-KL过表达导致水平活动增加并且对中年成年小鼠具有轻微的 抗焦虑作用。
在旷场试验中(图7)，也可以观察到，与野生型小鼠相比，klotho的过表达引起了自发活动的变化。与之前在老龄小鼠中的结果一致，通过基因治疗方法改变s-KL水平在旷场实验中能够改变水平运动活性(图7A，7B)，但不能改变小鼠的垂直活性(数据未显示)。因此，当s-KL cDNA在海马体中过表达时，小鼠行进的总距离显著高于其他两组(p<0.0001)(对照：1365±14cm；s-KL：1734±8cm；shRNA/s-KL：1259±27cm)。另一方面，在测试的第一分钟内，一些对照动物冻结了一段时间，这是焦虑症增加的直接度量。在过表达s-KL的小鼠的情况下，记录到离开中心区域的更短的等待期，虽然这种差异仅对于注射shRNA-sKL的小鼠具有统计学显著性(p＝0.0008)(表5)。在所分析的其他变量的组之间没有检测到差异。
表5:旷场测试中的探索活性
对照 s-KL shRNA-sKL
离开中心的等待期(s) 5.18±1.60 3.00±0.97*** 8.00±0.78
到达边缘的等待期(s) 9.12±1.57 7.33±1.22 10.34±1.09
首次直立的等待期(s) 27.63±3.96 26.92±4.08 23.80±2.74
梳理次数 1.81±0.42 1.42±0.32 1.81±0.31
首次梳理的等待期(s) 115.54±25.49 164.92±23.16 112.36±18.43
排便次数 2.33±0.47 1.96±0.35 2.4±0.40
实施例3C.海马体s-KL过表达改善中年成年小鼠的认知表现，而s-KL抑制损害该 能力。
当在T迷宫测试中评价工作记忆时，在治疗组和对照组动物之间也观察到有意义的差异。
结果表示为3个测试日中的每一个获得的平均值。首先，在强制选择试验中，所有对照动物和过表达s-KL的那些动物都能够符合标准。相反，约10％的shRNA-sKL处理的动物没有，因此被放弃。此外，在第一个试验中，与注射shRNA-sKL的小鼠相比，过表达s-KL的小鼠到达迷宫交叉点需要的时间更少(p＝0.009)(表6)。此后，在自由选择试验中，所有动物均符合所有既定标准，但在选择正确路径的效率方面观察到组间差异。对照组解决了任务，错误率为36.36％。该评分在s-KL过表达组中得到改善，错误率为21.42％。相反，沉默S-KL将错误的百分比提高到40％(表6)。
表6.在对照、s-KL和shRNA-sKL小鼠中进行的T迷宫测试的强制选择和自由选择试验中的不同参数
Figure BDA0001660732420000261
最后在Morris水迷宫测试中，在提示学习任务等待期没有观察到有意义的差异，这可能是由于小鼠年轻。
在地点任务中，所有组都在训练进行时表现出了学习曲线，表现为到达平台的距离较近。相对于对照，m-KL和s-KL小鼠日复一日地有更快的学习曲线。
在记忆测试中，在最后一次提示测定后2小时，移除平台，评估小鼠是否能记住平台的位置。这样做的目的是确定小鼠在平台所在的方块(PTf)中的距离，相反方块(OposPTf)中的距离，右平台的方块(R PTf)中的距离和左平台(L PTf)的方块中的距离。虽然数据未显示，但所有组(null和s-KL)都能够优先考虑PTf方块。
另一方面，如果在最后一次提示测试后24小时进行测试(长期记忆测试)，则klotho处理组能够以比对照更有效的方式优先考虑PTf方块(对于s-KL注射的小鼠，p<0.001)。图8中描绘了图形数据，其中描绘了每个小鼠类型在每个方块中的总距离的百分比。
再次，可以得出结论，如同在老年小鼠中一样，klotho治疗改善了记忆能力(在此情况下为长期记忆)。
视觉感知学习和空间参考学习和记忆在Morris水迷宫中按照之前使用的方案相同的方案进行评估。在地点学习任务(PT)中，所有小组都显示了学习任务的能力，反映在到达平台的等待期(图8A)以及到达平台的距离(图8B)逐渐减少。最后，在最后训练期后24小时进行的记忆探测试验允许我们评估s-KL在12月龄小鼠的长期记忆中的作用。图9C显示过表达s-KL的小鼠对训练象限有更大的偏好(相对于对照，p＝0.0003，相对于shRNA-sKL，p<0.0001)。如前所述，shRNA-sKL处理的动物显示出对训练象限的偏好最低和对其他象限的随机偏好(相对于对照动物，p<0.0001)。因此，我们得出结论，与老年动物中一样，s-KL水平的升高增强了区分象限的能力，尤其是在长期的情况下。此外，将S-KL沉默会恶化动物的表现，确认其在认知功能中发挥作用。
实施例4.以特异性抗体检测s-KL蛋白同种型。
来自组织样品的蛋白提取物(每个样品15-25g)在变性丙烯酰胺凝胶中运行，然后电转移到PDVF膜(GE Healthcare)。用含有5％脱脂乳的TBS-T(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.2％Tween-20)封闭膜，并与一抗K113抗体一起孵育。用合适的辣根过氧化物酶缀合的二抗(EZBiolab,IN,USA)和增强化学发光试剂(GE Healthcare)进行检测。K113抗体以1/5000稀释度使用；KM2076抗体以1/1000使用；多克隆兔抗肌动蛋白抗体(SigmaA2066,USA)以1/1000使用；和二抗HRP-抗Ig抗体以1/10,000使用((Dako-Cytomation,P0399,Denmark)。
如上所述，本发明源自发明人在小鼠野生型脑组织中对Klotho同种型的蛋白水平(不仅是mRNA)的真实表达的确定，该Klotho同种型可能是哺乳动物klotho蛋白的剪接变体。
该假设来自对野生型小鼠组织中可检测的klotho蛋白的分析。使用商业抗体(KM2076，Cosmobio Japan)，可以在Western印迹测定(图9)中确定在肾脏中存在130kDa的膜同种型，而在脑中仅可以检测到分子量与70KDa同种型(klotho或s-KL变体的KL1结构域的近似重量)相似的同种型。脑可检测的klotho同种型的分子量具有70KDa至100KDa之间的分子量，可能是由于氨基酸序列中的转录后修饰造成。图9显示了在全脑中的检测，但也显示了在前额叶皮层(CPf)、皮层(Cx)、小脑(CB)和海马体(HC)中的检测。
此外，在平行测定中，发明人用对小鼠s-KL具有特异性的自制多克隆抗体测定该同种型是否位于不同的脑区中。针对s-KL的该特异性多克隆抗体(以下称为Ab K113)使用设计的SEQ ID NO：11(SPLTKPSVGLLLPH)的免疫原性肽作为抗原，由EZBiolab公司(Carmel，USA)在兔中产生。该SEQ ID NO：11序列不存在于m-KL或任何p-KL中，因此抗体对s-KL同种型具有特异性。
使用该K113抗体在6个月龄和18个月龄小鼠的前额皮质(PfCX s-KL)、皮质(CX s-KL)、海马体(HC s-KL)和小脑(CB s-KL)中特别分析s-KL蛋白的水平。数据描绘于图10中，其中显示每个区域的Western印迹分析以及密度测定分析(使用Image J软件)。图10(A)描绘来自PfCX的数据，图10(B)来自CX的数据，图10(C)描绘来自HC的数据和来自CB的图10(D)数据。
所有这些数据可以得出结论：脑中由商业抗体检测到的70-100KDa的同种型可能是s-KL，与图10的平行测定中由本发明人的K113抗体特异性检测的那种相同。
因此，如果于脑中内源性表达的klotho蛋白的变体主要是s-KL，将它用于预防和/或治疗与衰老和/或与神经退行性和/或神经病理学疾病相关的认知和/或行为障碍设想会有真正的优点。
首先，因为根据本发明实施例2和3的数据可推断s-KL治疗与未处理的动物相比设想改善技能(记忆和行为)。
其次，由Kurosu等"Regulation of fibroblast growth factor-23signallingby klotho",J Biol Chem-2006,vol 281(10),pp.:6120-3可知：m-KL充当FGF23的成纤维细胞生长因子受体(FGF23R)的共受体。该受体参与钙稳态。因此，通过使用与m-KL具有相似效果的s-KL，这将避免任何对钙稳态的干扰，因为s-KL不是FGF23R的共受体。
据发明人所知，这是s-KL首次施用(在这种情况下通过基因治疗)于野生型动物(小鼠)。此外，已认为可信的是该蛋白在保持和/或改善与衰老(特别是老年痴呆)以及与如阿尔茨海默病(AD)等某些神经退行性疾病相关的认知和行为障碍方面有疗效。特别是，在保护记忆力障碍方面具有治疗效果，如记忆力丧失和焦虑症，所有这些在老年人和AD人群中通常都很常见。
在神经退行性疾病和神经病理疾病的情况下，强烈推荐将s-KL作为伴随治疗(如果有任何治疗的话)。
实施例5.在海马体中施用s-KL和shRNA-sKL表达载体特异性改变了s-KL而不是m- KL的表达水平。
在处理的动物的海马体中定量s-KL水平，以确定在认知方面观察到的效果是否由s-KL过表达和/或s-KL抑制诱导。因此，相对于注射AAV-对照的动物(p＝0.035)，AAV/s-KL注射组中的s-KL的mRNA水平增加了7.25±2.0倍，而在AAV/shRNA-sKL动物中，s-KL表达水平降低了13.6±2.5倍(p＝0.007)(图11)。这些变化对分泌型Klotho同种型是特异的，因为m-KL跨膜同种型的表达不受s-KL过表达(1.15±1.1倍vs对照)或特异性s-KL抑制(-1.24±0.27倍vs对照)的影响。
统计分析
数值以平均值±SEM表示。使用G-Stat版本2.0和Prism 5.04程序进行统计分析和计算。各组之间的统计分析通过双尾不成对学生t-检验或单因素方差分析进行，然后进行Tukey事后检验。在所有情况下，如果p<0.05，则平均值差异被认为是统计学显著的。
本申请中引用的参考文献
-Deary等,“Klotho genotype and cognitive ability in childhood and oldage in the same individuals”,Neurosci Lett–2005,vol.378(1),pp.22-27.
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序列表
<110> 巴塞罗那自治大学
<120> 作为认知和行为障碍药物的哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体
<130> T 2015/033
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 549
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg
            20                  25                  30
Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Val Ser Arg Pro
        35                  40                  45
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly
    50                  55                  60
Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp
65                  70                  75                  80
Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His
                85                  90                  95
Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser
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Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr
            180                 185                 190
His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala
        195                 200                 205
Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe
    210                 215                 220
Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro
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Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly
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Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu
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Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro
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Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn
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<211> 550
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
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1               5                   10                  15
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<210> 3
<211> 3024
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 包含编码小家鼠klotho分泌型剪接变体的核苷酸序列的基因构建体
<400> 3
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<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 包含编码智人klotho分泌型剪接变体的核苷酸序列的基因构建体
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cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 300
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ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac 840
agtctcgaac ttaagctgca gtgactctct taaggtagcc ttgcagaagt tggtcgtgag 900
gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg 960
gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca 1020
tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt caattacagc tcttaaggct 1080
agagtactta atacgactca ctataggcta gcaatgcccg ccagcgcccc gccgcgccgc 1140
ccgcggccgc cgccgccgtc gctgtcgctg ctgctggtgc tgctgggcct gggcggccgc 1200
cgcctgcgtg cggagccggg cgacggcgcg cagacctggg cccgtgtctc gcggcctcct 1260
gcccccgagg ccgcgggcct cttccagggc accttccccg acggcttcct ctgggccgtg 1320
ggcagcgccg cctaccagac cgagggcggc tggcagcagc acggcaaggg tgcgtccatc 1380
tgggacacgt tcacccacca ccccctggca cccccgggag actcccggaa cgccagtctg 1440
ccgttgggcg ccccgtcgcc gctgcagccc gccaccgggg acgtagccag cgacagctac 1500
aacaacgtct tccgcgacac ggaggcgctg cgcgagctcg gggtcactca ctaccgcttc 1560
tccatctcgt gggcgcgagt gctccccaat ggcagcgcgg gcgtccccaa ccgcgagggg 1620
ctgcgctact accggcgcct gctggagcgg ctgcgggagc tgggcgtgca gcccgtggtc 1680
accctgtacc actgggacct gccccagcgc ctgcaggacg cctacggcgg ctgggccaac 1740
cgcgccctgg ccgaccactt cagggattac gcggagctct gcttccgcca cttcggcggt 1800
caggtcaagt actggatcac catcgacaac ccctacgtgg tggcctggca cggctacgcc 1860
accgggcgcc tggcccccgg catccggggc agcccgcggc tcgggtacct ggtggcgcac 1920
aacctcctcc tggctcatgc caaagtctgg catctctaca atacttcttt ccgtcccact 1980
cagggaggtc aggtgtccat tgccctaagc tctcactgga tcaatcctcg aagaatgacc 2040
gaccacagca tcaaagaatg tcaaaaatct ctggactttg tactaggttg gtttgccaaa 2100
cccgtattta ttgatggtga ctatcccgag agcatgaaga ataacctttc atctattctg 2160
cctgatttta ctgaatctga gaaaaagttc atcaaaggaa ctgctgactt ttttgctctt 2220
tgctttggac ccaccttgag ttttcaactt ttggaccctc acatgaagtt ccgccaattg 2280
gaatctccca acctgaggca actgctttcc tggattgacc ttgaatttaa ccatcctcaa 2340
atatttattg tggaaaatgg ctggtttgtc tcagggacca ccaagagaga tgatgccaaa 2400
tatatgtatt acctcaaaaa gttcatcatg gaaaccttaa aagccatcaa gctggatggg 2460
gtggatgtca tcgggtatac cgcatggtcc ctcatggatg gtttcgagtg gcacagaggt 2520
tacagcatca ggcgtggact cttctatgtt gactttctaa gccaggacaa gatgttgttg 2580
ccaaagtctt cagccttgtt ctaccaaaag ctgatagaga aaaatggctt ccctccttta 2640
cctgaaaatc agcccctaga agggacattt ccctgtgact ttgcttgggg agttgttgac 2700
aactacattc agctgagtcc tttgacaaaa cccagtgtcg gcctcttgct tcctcactaa 2760
gggccgcttc cctttagtga gggttaatgc ttcgagcaga catgataaga tacattgatg 2820
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 2880
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 2940
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg agatgtggga ggttttttaa agcaagtaaa 3000
acctctacaa atgtggta 3018
<210> 5
<211> 1650
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
atgcccgcca gcgccccgcc gcgccgcccg cggccgccgc cgccgtcgct gtcgctgctg 60
ctggtgctgc tgggcctggg cggccgccgc ctgcgtgcgg agccgggcga cggcgcgcag 120
acctgggccc gtgtctcgcg gcctcctgcc cccgaggccg cgggcctctt ccagggcacc 180
ttccccgacg gcttcctctg ggccgtgggc agcgccgcct accagaccga gggcggctgg 240
cagcagcacg gcaagggtgc gtccatctgg gacacgttca cccaccaccc cctggcaccc 300
ccgggagact cccggaacgc cagtctgccg ttgggcgccc cgtcgccgct gcagcccgcc 360
accggggacg tagccagcga cagctacaac aacgtcttcc gcgacacgga ggcgctgcgc 420
gagctcgggg tcactcacta ccgcttctcc atctcgtggg cgcgagtgct ccccaatggc 480
agcgcgggcg tccccaaccg cgaggggctg cgctactacc ggcgcctgct ggagcggctg 540
cgggagctgg gcgtgcagcc cgtggtcacc ctgtaccact gggacctgcc ccagcgcctg 600
caggacgcct acggcggctg ggccaaccgc gccctggccg accacttcag ggattacgcg 660
gagctctgct tccgccactt cggcggtcag gtcaagtact ggatcaccat cgacaacccc 720
tacgtggtgg cctggcacgg ctacgccacc gggcgcctgg cccccggcat ccggggcagc 780
ccgcggctcg ggtacctggt ggcgcacaac ctcctcctgg ctcatgccaa agtctggcat 840
ctctacaata cttctttccg tcccactcag ggaggtcagg tgtccattgc cctaagctct 900
cactggatca atcctcgaag aatgaccgac cacagcatca aagaatgtca aaaatctctg 960
gactttgtac taggttggtt tgccaaaccc gtatttattg atggtgacta tcccgagagc 1020
atgaagaata acctttcatc tattctgcct gattttactg aatctgagaa aaagttcatc 1080
aaaggaactg ctgacttttt tgctctttgc tttggaccca ccttgagttt tcaacttttg 1140
gaccctcaca tgaagttccg ccaattggaa tctcccaacc tgaggcaact gctttcctgg 1200
attgaccttg aatttaacca tcctcaaata tttattgtgg aaaatggctg gtttgtctca 1260
gggaccacca agagagatga tgccaaatat atgtattacc tcaaaaagtt catcatggaa 1320
accttaaaag ccatcaagct ggatggggtg gatgtcatcg ggtataccgc atggtccctc 1380
atggatggtt tcgagtggca cagaggttac agcatcaggc gtggactctt ctatgttgac 1440
tttctaagcc aggacaagat gttgttgcca aagtcttcag ccttgttcta ccaaaagctg 1500
atagagaaaa atggcttccc tcctttacct gaaaatcagc ccctagaagg gacatttccc 1560
tgtgactttg cttggggagt tgttgacaac tacattcaag taagtcagct gacaaaacca 1620
atcagcagtc tcaccaagcc ctatcactag 1650
<210> 6
<211> 1653
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
atgctagccc gcgcccctcc tcgccgcccg ccgcggctgg tgctgctccg tttgctgttg 60
ctgcatctgc tgctgctcgc cctgcgcgcc cgctgcctga gcgctgagcc gggtcagggc 120
gcgcagacct gggctcgctt cgcgcgcgct cctgccccag aggccgctgg cctcctccac 180
gacaccttcc ccgacggttt cctctgggcg gtaggcagcg ccgcctatca gaccgagggc 240
ggctggcgac agcacggcaa aggcgcgtcc atctgggaca ctttcaccca tcactctggg 300
gcggccccgt ccgactcccc gatcgtcgtg gcgccgtcgg gtgccccgtc gcctcccctg 360
tcctccactg gagatgtggc cagcgatagt tacaacaacg tctaccgcga cacagagggg 420
ctgcgcgaac tgggggtcac ccactaccgc ttctccatat cgtgggcgcg ggtgctcccc 480
aatggcaccg cgggcactcc caaccgcgag gggctgcgct actaccggcg gctgctggag 540
cggctgcggg agctgggcgt gcagccggtg gttaccctgt accattggga cctgccacag 600
cgcctgcagg acacctatgg cggatgggcc aatcgcgccc tggccgacca tttcagggat 660
tatgccgagc tctgcttccg ccacttcggt ggtcaggtca agtactggat caccattgac 720
aacccctacg tggtggcctg gcacgggtat gccaccgggc gcctggcccc gggcgtgagg 780
ggcagctcca ggctcgggta cctggttgcc cacaacctac ttttggctca tgccaaagtc 840
tggcatctct acaacacctc tttccgcccc acacagggag gccgggtgtc tatcgcctta 900
agctcccatt ggatcaatcc tcgaagaatg actgactata atatcagaga atgccagaag 960
tctcttgact ttgtgctagg ctggtttgcc aaacccatat ttattgatgg cgactaccca 1020
gagagtatga agaacaacct ctcgtctctt ctgcctgatt ttactgaatc tgagaagagg 1080
ctcatcagag gaactgctga cttttttgct ctctccttcg gaccaacctt gagctttcag 1140
ctattggacc ctaacatgaa gttccgccaa ttggagtctc ccaacctgag gcagcttctg 1200
tcttggatag atctggaata taaccaccct ccaatattta ttgtggaaaa tggctggttt 1260
gtctcgggaa ccaccaaaag ggatgatgcc aaatatatgt attatctcaa gaagttcata 1320
atggaaacct taaaagcaat cagactggat ggggtcgacg tcattgggta caccgcgtgg 1380
tcgctcatgg acggtttcga gtggcatagg ggctacagca tccggcgagg actcttctac 1440
gttgactttc tgagtcagga caaggagctg ttgccaaagt cttcggcctt gttctaccaa 1500
aagctgatag aggacaatgg ctttcctcct ttacctgaaa accagcccct tgaagggaca 1560
tttccctgtg actttgcttg gggagttgtt gacaactacg ttcaagtaag tcctttgaca 1620
aaacccagtg tcggcctctt gcttcctcac taa 1653
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 正向引物(forward primer)
<400> 7
ttcaaacccg gaagtctttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 反向引物(Reverse primer)
<400> 8
ccaggcagac gttcacatta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 正向引物(forward primer)
<400> 9
tggctttcct cctttacctg 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 反向引物(Reverse primer)
<400> 10
gccgacactg ggttttgt 18
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Val Gly Leu Leu Leu Pro His
1               5                   10
<210> 12
<211> 5421
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 质粒pGG2
<220>
<221> 启动子
<222> (206)..(955)
<223> CMV IE 增强子/启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (1095)..(1227)
<223> 来自pCl-neo的内含子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1227)..(1334)
<223> 多克隆位点(MCS)
<220>
<221> polyA_信号
<222> (1369)..(1590)
<223> SV40 晚期poly A信号
<400> 12
cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60
acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 120
atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc tacgtagcca 180
tgctctagac atggctcgac agatctcaat attggccatt agccatatta ttcattggtt 240
atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta tatcataata 300
tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttggcattga ttattgacta 360
gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 420
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 480
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 540
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 600
gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 660
tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 720
tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 780
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 840
actttccaaa atgtcgtaac aactgcgatc gcccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag 900
gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcactag 960
aagctttatt gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcagtg cttctgacac 1020
aacagtctcg aacttaagct gcagtgactc tcttaaggta gccttgcaga agttggtcgt 1080
gaggcactgg gcaggtaagt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac caatagaaac 1140
tgggcttgtc gagacagaga agactcttgc gtttctgata ggcacctatt ggtcttactg 1200
acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca gttcaattac agctcttaag 1260
gctagagtac ttaatacgac tcactatagg ctagcctcga cctcgagacg cgtgatatcg 1320
gatcccggcc ggcggccgct tccctttagt gagggttaat gcttcgagca gacatgataa 1380
gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 1440
gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 1500
acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt 1560
aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta aaatccgata agggactaga gcatggctac 1620
gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg 1680
gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga 1740
cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgccagct ggcgtaatag 1800
cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggaa 1860
ttccagacga ttgagcgtca aaatgtaggt atttccatga gcgtttttcc gttgcaatgg 1920
ctggcggtaa tattgttctg gatattacca gcaaggccga tagtttgagt tcttctactc 1980
aggcaagtga tgttattact aatcaaagaa gtattgcgac aacggttaat ttgcgtgatg 2040
gacagactct tttactcggt ggcctcactg attataaaaa cacttctcag gattctggcg 2100
taccgttcct gtctaaaatc cctttaatcg gcctcctgtt tagctcccgc tctgattcta 2160
acgaggaaag cacgttatac gtgctcgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc 2220
gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 2280
ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 2340
cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 2400
gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 2460
gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 2520
ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 2580
tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa 2640
atattaacgt ctacaattta aatatttgct tatacaatct tcctgttttt ggggcttttc 2700
tgattatcaa ccggggtaca tatgattgac atgctagttt tacgattacc gttcatcgat 2760
tctcttgttt gctccagact ctcaggcaat gacctgatag cctttgtaga gacctctcaa 2820
aaatagctac cctctccggc atgaatttat cagctagaac ggttgaatat catattgatg 2880
gtgatttgac tgtctccggc ctttctcacc cgtttgaatc tttacctaca cattactcag 2940
gcattgcatt taaaatatat gagggttcta aaaattttta tccttgcgtt gaaataaagg 3000
cttctcccgc aaaagtatta cagggtcata atgtttttgg tacaaccgat ttagctttat 3060
gctctgaggc tttattgctt aattttgcta attctttgcc ttgcctgtat gatttattgg 3120
atgttggaat cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 3180
catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 3240
cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 3300
acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 3360
acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 3420
aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 3480
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 3540
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 3600
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 3660
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 3720
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 3780
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 3840
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 3900
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 3960
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4020
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 4080
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 4140
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 4200
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 4260
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4320
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 4380
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 4440
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 4500
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 4560
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 4620
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 4680
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 4740
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 4800
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 4860
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 4920
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 4980
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 5040
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 5100
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 5160
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 5220
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 5280
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 5340
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 5400
gcgttggccg attcattaat g 5421
<210> 13
<211> 8335
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 包含 CMV IE启动子序列和小鼠m-KL编码序列的pGG2质粒(pGG2-m-KL)
<400> 13
cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60
acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 120
atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc tacgtagcca 180
tgctctagac atggctcgac agatctcaat attggccatt agccatatta ttcattggtt 240
atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta tatcataata 300
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<211> 5640
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<213> 人工(Artificial)
<220>
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<400> 14
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cattgtaaaa atctgctcca gagcgccctc caccttcagc ctcaagcagc gaatcatgat 17460
tgcaaaaatt caggttcctc acagacctgt ataagattca aaagcggaac attaacaaaa 17520
ataccgcgat cccgtaggtc ccttcgcagg gccagctgaa cataatcgtg caggtctgca 17580
cggaccagcg cggccacttc cccgccagga accttgacaa aagaacccac actgattatg 17640
acacgcatac tcggagctat gctaaccagc gtagccccga tgtaagcttt gttgcatggg 17700
cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga 17760
aagcacatcg tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga 17820
aaaagacacc atttttctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa 17880
taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata 17940
agcataagac ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta 18000
aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac 18060
acatcaggtt gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca 18120
tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg 18180
agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg 18240
ctccagaaca acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt accagtaaaa 18300
aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta 18360
aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag 18420
tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga aagccaaaaa 18480
acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact tcccatttta 18540
agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 18600
ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 18660
atccaaaata aggtatatta ttgatgatg 18689
<210> 17
<211> 7335
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 质粒pREp2Cap10
<400> 17
gattaaggtc cccagcgacc ttgacgagca tctgcccggc atttctgaca gctttgtgaa 60
ctgggtggcc gagaaggaat gggagttgcc gccagattct gacatggatc tgaatctgat 120
tgagcaggca cccctgaccg tggccgagaa gctgcagcgc gactttctga cggaatggcg 180
ccgtgtgagt aaggccccgg aggctctttt ctttgtgcaa tttgagaagg gagagagcta 240
cttccacatg cacgtgctcg tggaaaccac cggggtgaaa tccatggttt tgggacgttt 300
cctgagtcag attcgcgaaa aactgattca gagaatttac cgcgggatcg agccgacttt 360
gccaaactgg ttcgcggtca caaagaccag aaatggcgcc ggaggcggga acaaggtggt 420
ggatgagtgc tacatcccca attacttgct ccccaaaacc cagcctgagc tccagtgggc 480
gtggactaat atggaacagt atttaagcgc ctgtttgaat ctcacggagc gtaaacggtt 540
ggtggcgcag catctgacgc acgtgtcgca gacgcaggag cagaacaaag agaatcagaa 600
tcccaattct gatgcgccgg tgatcagatc aaaaacttca gccaggtaca tggagctggt 660
cgggtggctc gtggacaagg ggattacctc ggagaagcag tggatccagg aggaccaggc 720
ctcatacatc tccttcaatg cggcctccaa ctcgcggtcc caaatcaagg ctgccttgga 780
caatgcggga aagattatga gcctgactaa aaccgccccc gactacctgg tgggccagca 840
gcccgtggag gacatttcca gcaatcggat ttataaaatt ttggaactaa acgggtacga 900
tccccaatat gcggcttccg tctttctggg atgggccacg aaaaagttcg gcaagaggaa 960
caccatctgg ctgtttgggc ctgcaactac cgggaagacc aacatcgcgg aggccatagc 1020
ccacactgtg cccttctacg ggtgcgtaaa ctggaccaat gagaactttc ccttcaacga 1080
ctgtgtcgac aagatggtga tctggtggga ggaggggaag atgaccgcca aggtcgtgga 1140
gtcggccaaa gccattctcg gaggaagcaa ggtgcgcgtg gaccagaaat gcaagtcctc 1200
ggcccagata gacccgactc ccgtgatcgt cacctccaac accaacatgt gcgccgtgat 1260
tgacgggaac tcaacgacct tcgaacacca gcagccgttg caagaccgga tgttcaaatt 1320
tgaactcacc cgccgtctgg atcatgactt tgggaaggtc accaagcagg aagtcaaaga 1380
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gggtggagcc aagaaaagac ccgcccccag tgacgcagat ataagtgagc ccaaacgggt 1500
gcgcgagtca gttgcgcagc catcgacgtc agacgcggaa gcttcgatca actacgcaga 1560
caggtaccaa aacaaatgtt ctcgtcacgt gggcatgaat ctgatgctgt ttccctgcag 1620
acaatgcgag agaatgaatc agaattcaaa tatctgcttc actcacggac agaaagactg 1680
tttagagtgc tttcccgtgt cagaatctca acccgtttct gtcgtcaaaa aggcgtatca 1740
gaaactgtgc tacattcatc atatcatggg aaaggtgcca gacgcttgca ctgcctgcga 1800
tctggtcaat gtggatttgg atgactgcat ctttgaacaa taaatgattt aaatcaggta 1860
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agtggtggga cttgaaacct ggagccccga aacccaaagc caaccagcaa aagcaggacg 1980
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ttgttaatca ataaaccggt tgattcgttt cagttgaact ttggtctctg catatggcga 4140
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accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5400
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5460
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5520
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5580
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5640
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5700
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5760
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5820
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5880
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5940
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 6000
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6060
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tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6540
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actcactata gggcgaattg ggtaccgggc cccccctcga tcgaggtcga cggtatcggg 7260
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<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 正向引物(forward primer)
<400> 18
tacataactt acggtaaatg gc 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 反向引物(Reverse primer)
<400> 19
aaagtcccta ttggcgttac t 21

Claims (13)

1.哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体或编码其的核酸序列在制备用于治疗患者中的记忆丧失的药物中的用途，
其中所述剪接变体为选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的哺乳动物klotho蛋白多肽。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述患者患有阿尔茨海默氏病。
3.基因构建体在制备用于治疗患者中的记忆丧失的药物中的用途，所述基因构建体包含可操作地连接至表达启动子的编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列，其中所述剪接变体为选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽，并且其中所述基因构建体包含选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列。
4.如权利要求3所述的用途，其中，所述基因构建体由SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4组成。
5.具有中枢神经系统趋向性的表达载体在制备用于治疗患者中的记忆丧失的药物中的用途，所述表达载体为包含基因构建体的腺相关病毒，所述基因构建体包含可操作地连接至表达启动子的编码哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)的核酸序列，其中所述剪接变体为选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述表达载体包含权利要求3至4中任一项所定义的用途中的基因构建体。
7.如权利要求6所述的用途，其中，所述表达载体为血清型AAVrh10的腺相关病毒。
8.药物组合物在制备用于治疗患者中的记忆丧失的药物中的用途，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求3所定义的用途中的基因构建体和/或权利要求5所定义的用途中的表达载体，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。
9.哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体和/或权利要求3所定义的用途中的基因构建体和/或权利要求5所定义的用途中的表达载体与另一种活性剂的组合在制备用于治疗患者中的记忆丧失的药物中的用途，
其中所述剪接变体为选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽。
10.如权利要求1所述的用途，其中，所述患者患有阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、具有路易体的痴呆、克雅氏病、多发性硬化症、共济失调毛细血管扩张症、中风后痴呆、创伤后痴呆、老年性痴呆或颅脑创伤。
11.如权利要求1所述的用途，所述药物被构造成注射到脑中或肌内注射或静脉内注射或直接递送到中枢神经系统(CNS)。
12.如权利要求11所述的用途，其中，注射到脑中通过静脉内注射或脑室内注射进行。
13.如权利要求11所述的用途，其中，直接递送到CNS包括鞘内注射、脑池内注射、贴剂、微型泵或微胶囊递送。
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