JP2019501643A - 認知及び行動障害のための薬剤としての哺乳動物クロトーの分泌されたスプライシングバリアント - Google Patents
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Abstract
本発明は、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療のための剤としての哺乳動物クロトー(Klotho)の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)の使用を開示する。本発明は、また、哺乳動物、特に齧歯類又はヒトの中枢神経系への該s−KLバリアントの送達のための遺伝子治療で有用な遺伝子構築体及び発現ベクターにも言及する。CNSにおいて蛋白質を発現させるための蛋白質s−KL又はいずれかの遺伝子構築体を含む医薬組成物も開示する。
Description
本発明は、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、記憶喪失に関連する、並びに学習困難に関連する疾患に罹っている患者において認知障害及び行動障害を予防及び/又は治療するための医学的アプローチの分野に関する。
記憶は、年月と共に頻繁に失われ、いくつかの様相は変化しかねず、記憶効率の喪失に至ることが広く知られている。これらの様相の例としては、同時に1を超える物事に対して集中を維持する困難;努力を要する新しい事柄を学習するにおける困難、及びゆっくりとした昔の情報の回復が挙げられる。口頭能力、情報処理、問題解決、作業記憶、長期記憶及び空間的記憶及び能力は年齢と共に低下し、他方、意味記憶(語彙)、世界知識、及び潜在記憶等の専門及び認識能力は、年齢と共に安定したままであり、もし病理又は神経変性が存在しなければより良くなりさえする。
神経変性及び/又は神経病理学的疾患に関連して、老化に関するそれらの多くは認知障害も示唆する。これらの例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、鬱病、及び統合失調症が挙げられる。
加えて、老化と共に、又は神経変性及び/若しくは神経病理学的疾患の場合には、方向感覚喪失の増加、未知の状況又は場所に対する、あるいは方向感覚喪失それ自体さえに対する不安発症、並びに不合理な恐怖等の行動障害も観察される。
全てのこれらの認知及び行動障害は、神経変性及び/又は神経病理学的疾患のうちの多くの総体症状の治療におけるのみならず、加齢の間における認知及び行動の障害の予防にもおける主な目的である。
加齢の間における、又は神経病理学若しくは神経変性の場合における、記憶喪失に伴ういくつかのかつ複雑なメカニズムのうち、哺乳動物蛋白質クロトー(Klotho)の役割が研究されてきた。
3つの独立したヒトアッセイにおいて、クロトー分泌の増加をイン・ビトロ(in・vitro)にて促進するクロトー対立遺伝子、即ち、KL−VSクロトー対立遺伝子におけるいくつかの突然変異により、対象の年齢とは独立して認知試験において良好な結果を得ることが可能であったことが発見された。これらのデータは非特許文献1に由来する。
クロトーは、腎臓の遠位曲尿細管、副甲状腺ホルモン分泌細胞及び脳の脈絡叢上皮に主として検出される蛋白質である。より程度は低いが、α−クロトー遺伝子は、心臓、骨格筋、膀胱、胎盤、膵臓、精巣、卵巣、結腸、及び内耳においても発現されている。マウスにおけるいくつかの研究は、染色体13上の単一遺伝子α−クロトーの突然変異が、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症/骨減少症、種々の組織における異所性石灰化、気腫、認知障害、及び不妊症等の擬態典型兆候を伴って、加速された加齢のプロセスを誘導することを明らかにした(非特許文献2及び3参照)。更に、ノックアウトされたα−クロトー(kl−/kl−)マウスは、2月齢前後で未熟で劇的に低下した生存を示した(Kuro−o,前掲)。対照的に、この遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、30から40%より大きい平均余命を有した。同様に、いくつかの研究は、ヒトクロトー遺伝子多型が、寿命、及び老化に伴う障害の様相にも影響することを示す。マウス及びヒトにおいて、α−クロトー遺伝子は5.2kbの転写体をコードする。第三エクソンにおいて、一方は膜貫通形態(完全な転写体又は全長1014個のアミノ酸)をコードし、他方は該蛋白質の分泌形態(半膜貫通転写体、550個のアミノ酸)をコードする、2つの異なる転写体を生じさせることができる選択的スプライシングドナーがある。全長転写体は、ほぼ130kDaの分子量を持つ単一パス膜貫通蛋白質(m−KL)をコードする。該蛋白質は3つのドメイン:C末端における短い膜貫通ドメイン、各々KL1及びKL2と呼ばれる約550個のアミノ酸の2つの内部反復配列から構成される細胞外ドメイン、並びに10個のアミノ酸の非常に短い細胞内ドメインを含有する。選択的スプライシングからの転写体は、70kDaの近似分子量を持つ、KL1ドメインのみから形成される該蛋白質の切形形態(s−KL)を生じさせる。この選択的mRNAは、m−KL転写体では見出されない15個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを含み、この理由で、クロトーの分泌されたアイソフォーム、s−KL、又はクロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアントとも呼ばれる(非特許文献4参照)。しかしながら、この蛋白質(s−KL)に関してはいくらか論争がある。なぜならば、それは抗体を用いて体液中で検出されていないからである。それはmRNAレベルでは具体的に検出されているが、蛋白質レベルでは検出されておらず、その理由は、入手可能な抗体は、それを、膜貫通クロトーから切断されたKL1ドメインから区別できないからである。
加えて、膜貫通形態の細胞外ドメインはメタロプロテイナーゼADAM10及びADAM17によって切断でき、その結果、約130kDaの可溶性クロトーのもう1つの形態(蛋白質分解された膜アイソフォームにつきp−KLと略する)がもたらされ、これは、血清、尿、及び脳脊髄液で検出されている。更に、2つの最近の研究は、1つは(選択的スプライシングから生じるが、特異的アミノ酸テイル無しのもののような)KL1ドメインのみを含有し、他方はKL2ドメインを含有した、2つの新しい70kDaアイソフォームを生じる、KL1及びKL2ドメインの間に位置するプロテアーゼADAM10及び17についての第二の認識部位があることを示す。かくして、クロトー蛋白質は、(a)選択的スプライシングからの(s−KL)、並びに(b)ADAM10及び17によって媒介された蛋白質分解切断による、2つの主たるメカニズムを通じて循環系に入り得る。しかしながら、これらの事象の各々が起こるパーセンテージは知られていない。
抗老化因子としての、並びに学習及び記憶技量を改善する剤としてのクロトーの役割を明瞭にする目的で、全身で過剰発現するクロトートランスジェニックマウスが得られている。Dubalら、2014は、ヒトクロトー遺伝子KL−VSのバリアントが、ヘテロ接合性キャリアにおいて増強された認知に関連することを開示している。この対立遺伝子は、血清においてクロトーレベルを増加させた。次いで、彼らは、学習及び記憶の多数の試験において対照よりもよく実行する、全長膜貫通クロトーの全体的過剰発現を伴うトランスジェニックマウスを分析した(非特許文献5)。
やはりDubalらによって分析されたもう1つのトランスジェニックマウスは、特に、アルツハイマー病に焦点を当てており、それは、クロトー発現の上昇が、全てhAPPのレベルを変更することなく、ヒトアミロイド前駆体蛋白質(hAPP)トランスジェニックマウスにおいて、若年死亡率、ネットワーク機能不全、認知欠乏、及び行動異常を減少させることを示す(非特許文献6)。
該トランスジェニックモデルにおいては、ほぼ130kDaの分子量を持つ全長膜貫通蛋白質(m−KL)、及びもし他のアイソフォームのいずれかが効果に寄与しているならば、特別には、プロセッシングされたクロトー(p−KL)アイソフォームの効果が評価されているようであり、これは、著者らによって用いられた実験手法からは決定することができない。というのは、現在の入手可能な検出システムは、異なるクロトーアイソフォームの間を区別することができないからである。注目する蛋白質を過剰発現するトランスジェニック動物はその効果の分析のためのよいモデルであり得るが、それらは、この至るところ(身体及び脳)に発現されたこの蛋白質を有することの不便も示唆しており、データは、加えて、トランスジェニック動物の遺伝的背景によって構成され得る。
(SAMP8と命名された)老化のマウスモデルにおけるクロトーの潜在的役割を示すもう1つの文献は、非特許文献7のものである。この文献においては、リグスチリドが、記憶欠乏を低下させるためのアルツハイマー病(AD)における治療法として提案されている。データは、老化における、LIGの慢性的投与がAD様神経病理及び記憶障害の発生を妨げることを示す。加えて、データは、おそらくは根底のメカニズムがクロトーのアップレギュレーションを含むことを示唆する。かくして、クロトー蛋白質は、年齢−関連ADについての治療標的として提案されている。Kuangらによって開示された実験方法(クロトー蛋白質を検出するためのSanta Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USAの抗体の使用)によると、作用する蛋白質アイソフォームの間の識別は可能でない(m−KL、p−KL)。Kuangらが「分泌されたクロトー」という場合、それは、哺乳動物クロトーの分泌されたスプライシングバリアントをいうのではなく、クロトーの他の可溶性形態をいう。事実、その時、本発明の発明者の発見までは、選択的に分泌されたクロトーアイソフォームは、発現されていない(又は無視できるレベルで発現された)非常に目立たないバリアントと考えられていた。事実、Forsterらによって報告されているように:「KL1及びKL2両ドメインを含有するクロトーフォームは血清及び脳脊髄液(CSF)双方で検出されており、m−KLの蛋白質分解断片と解釈されていた。選択的にスプライシングされたmRNAから生産されるであろうペプチドに正確に対応する循環クロトー種の存在は、血清又はCSFで報告されていなかった」(非特許文献8)。
Deary et al.,"Klotho genotype and cognitive ability in childhood and old age in the same individuals",Neurosci Lett−2005,vol.378(1),pp.22−27
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Matsumura et al.,"Identification of the human kloth gene and its two transcripts encoding membrane and secreted Klotho protein",Biochem Biophys Res Commum−1998,vol.No.242,pp.:626−630
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Dubal et al.,"Life Extension factor Klotho Prevents Mortality and Enhances Cognition in hAPP Transgenic Mice",The Journal of Neuroscience−2015,vol.35/6,pp.;2358−2371
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Forster et al.,"Vitamin D Receptor Controls Expression of the Anti−aging Klotho Gene in Mouse and Human Renal Cells"Biochem Biophys Res Commun.2011 October 28;414(3):557−562
老化又はいくつかの神経変性疾患による直面する認知障害に対するいくつかのアプローチにかかわらず、認知及び行動の維持を改善するための代替処置に対する要望が依然として存在する。
本発明は、マウス野生型脳組織における哺乳動物クロトー蛋白質のスプライシングバリアントの(mRNAとしてのみならず)蛋白質レベルの現実の発現の発明者らの判断に由来する。マウスs−KLのC−末端の最後の20個のアミノ酸に含まれたペプチドアミノ酸配列に対して生起した自作の抗体を用い、発明者らは、野生型マウス(Harian Laboratories BVのC57B16)の全脳において、及び脳のいくつかの特定の部分において、クロトー蛋白質の発現されたアイソフォームが、翻訳後修飾を有するがs−KLと同様に、70kDa近くの分子量を有するアイソフォームであったことを検出した。加えて、発明者らは、この蛋白質の発現レベルが老化の間にADの進行に伴って低下したことを見出した(データは示さず)。
更なるアッセイにより、脳において、このスプライシングバリアントは蛋白質レベルで決定できることが明らかにされた。更に、発明者らは、分泌されたクロトーアイソフォームが、腎臓におけるよりも脳において少なくとも10倍豊富であることを見出し、これは、2つのアイソフォームが異なる機能を有するらしく、s−KL活性は、神経系において重要な役割を持つアイソフォームであることを示唆する。
発明者らは、ここに、老化する脳においてs−KLレベルを修飾することの、行動レベルにおける機能的関連性を研究した。彼らは、AAVrh10ベクターを用いて、成体及び中年の野生型C57BL/6J雄におけるs−KLの発現を生じさせ、維持した。この研究は、イン・ビボにおいて最初に、CNSへのs−KLの単回注入から6カ月後に、学習及び記憶能力の長く継続しかつ定量可能な増強が見出されることを証明している。より重要なことには、認知の改善が、中年において、一回処理された18月齢マウスで観察可能である。これらの知見は、認知低下についての治療法としてのs−KLの治療的潜在能力を証明する。
要約すると、AAV−sKLベクターの単回投与後における脳中の局所的に分泌されたクロトーアイソフォームの局所的過剰発現が、年齢依存的記憶欠乏に対して保護することがここに証明され、これらの効果は老齢の動物において長く継続し且つ定量可能であり、従って、認知症のためのs−KLの治療的存在能力を示唆する。CNSにおけるs−KLの局所的発現は、老齢のマウスにおいて認知能力を改善する。CNSにおけるs−KL発現は、体重又は感覚運動技量に影響しない。認知改善が、中年において、一回処理された18月齢マウスで観察される。重要なものとして、特異的shRNA−sKLによる海馬での特異的s−KL阻害は、認知能力を損なう。従って、発明者らは、(1)記憶力を増大させるsKL過剰発現、及び(2)記憶力を低下させるsKL阻害に基づくデュアル戦略を用いることによって、記憶形成における分泌されたクロトーの鍵となる関与を証明することができる。
かくして、発明者らは、初めて、選択的スプライシングによって生じたクロトー転写体が、彼らが、それが安定であることを示した70KDaの蛋白質を生じさせ、このアイソフォームは身体の他の部分におけるよりも脳においてより豊富であることを見出したと信じる。更に、分泌されたクロトーはイン・ビボで直接的に投与されたのは最初であり、トランスジェニックモデルによって発現されないと信じる。以前に言われていたように、s−KLの投与は認知及び行動能力の改善に導く。かくして、発明者らは、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の新しい治療法としてのs−KLの使用を提供する。これは、これらの疾患についてのより具体的且つCNSに向けられた治療を表す。というのは、本明細書で、s−KLは、天然でs−KLを発現する認知及び行動に関する脳部分における最も圧倒的なアイソフォームであることが証明されているからである。
先に説明したように、先行技術は、クロトーの全長コーディング領域を全身で過剰発現するトランスジェニックマウスに関する。しかしながら、全長コーディング領域は、膜貫通アイソフォームの転写のみならず、選択的にスプライシングされたアイソフォームの転写を可能とし得る。従って、報告された学習及び記憶効果の改善が、一方の又は他方のクロトーアイソフォームによるものが否かを解明することはできない。他方、発明者らは、双方のクロトーアイソフォームが記憶力に参画するように見えるが、興味深いことに、m−KLの過剰発現はこの時点で知られていない他の経路に非特異的に影響し得、その結果、本明細書の実施例2Cに記載されたもの等の関連副作用をもたらし得るが、他方、s−KLの特異的な過剰発現はそうしないことを観察した。加えて、先行技術のトランスジェニックマウスとは異なって、本アプローチは天然のクロトーレベルを動物の誕生から変えず、これは、老化プロセスにおける鍵となる段階に到達するまで、補償効果の出現を誘導し得る。従って、レベルは、ニューロン向性を持つAAVrh10ベクターの投与を通じて脳において特異的に修飾される。
かくして、発明者らは、第一の態様として、哺乳動物において、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療における使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列を提案する。
この態様は、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療のための薬剤の製造のための前記定義のs−KLの使用としても処方することができる。本発明は、ヒトを含めたそれを必要とする対象において、医薬上許容される賦形剤又は担体と共に、治療上有効量の、前記定義のs−KL蛋白質、又はそれをコードする核酸配列を投与することを含む、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害を治療又は予防する方法にも関する。
クロトー蛋白質のスプライシングバリアントs−KLは、先に明らかにしたように、Matsumuraに開示されているようである。加えて、他の文献もまたこのスプライシングバリアントに言及している。例として、文献Shiraki−Iida et al.,“Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted protein”,FEBS Letters−1998,vol 424,pp.:6−10は、mRNAレベルで検出された、想定s−KL1分泌蛋白質を開示している。他方、文献Imura et al.,“Secreted Klotho protein in sera and CSF:implication for post−translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane”,FEBS Letters−2001,vol 565,pp.:143−147は、細胞外流体では検出されない推定分泌アイソフォームにも言及している。これらの文献のいずれも、クロトー蛋白質のスプライシングバリアントs−KLのいずれの役割も指摘していない。
「s−KL」と略される用語「哺乳動物クロトーの分泌されたスプライシングバリアント」とは、70kDaの近似分子量を持つ、KL1ドメインのみによって形成される蛋白質の切形形態(s−KL)を生じる、選択的スプライシングからの転写体から得られる蛋白質をいう。この選択的mRNAは、m−KL転写体では見出されない15個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを誘導し、この理由で、クロトーの分泌アイソフォーム、s−KL、又はクロトー蛋白質の分泌スプライシングバリアントとも呼ばれる。s−KLは、可溶性クロトーの他の形態、即ち、p−KL、p−KL1、及びp−KL2とは異なる。本明細書においては、m−KLは全長膜貫通形態を表し;p−KLは、m−KLの切断によって生じる、可溶性蛋白質分解されたクロトーを表し;並びにp−KL1及びp−KL2は、p−KLのKL1ドメイン及びKL2ドメインからなる可溶性クロトー形態を表す。m−KLは、ほぼ130kDaの分子量を持つ単一パス膜貫通蛋白質(m−KL)をコードする全長転写体に由来する。該蛋白質は3つのドメイン:C末端における短い膜貫通ドメイン、各々、KL1及びKL2と呼ばれる約550個アミノ酸の2つの内部反復配列から構成される細胞外ドメイン、並びに10個アミノ酸の非常に短い細胞内ドメインを含有する。該膜貫通形態の該細胞外ドメインは、メタロプロテイナーゼADAM10及びADAM17によって切断され、(蛋白質分解された膜アイソフォームにつきp−KLと略される)約130kDaの可溶性クロトーのもう1つの形態を得ることができる。更に、該KL1及びKL2ドメインの間に位置する該プロテアーゼADAM10及び17についての第二の認識部位があり、これは、2つの新しい70kDaアイソフォームを生じさせ、1つは、(該特異的アミノ酸テイル無しの選択的スプライシングから生じたもののような)KL1ドメインのみを含有し、他の1つは、KL2ドメインを含有するものであった。しかしながら、p−KLがp−KL1及びp−KL2に蛋白質分解されることは、イン・ビボでは証明されていない。
第二の態様において、本発明は、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列を含む遺伝子構築体に関する。
本発明のもう1つの態様は、前記定義の遺伝子構築体を含む、かくして、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列を含む中枢神経系向性を持つ発現ベクターである。
本発明のなおもう1つの態様は、1種以上の医薬上許容される賦形剤又は担体と共に、治療上有効量の、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び/若しくは前記定義の遺伝子構築体、並びに/又は前記定義のベクターを含む医薬組成物である。
また、患者において、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療のための組合せ療法で用いるための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシング変種バリアント又はそれをコードする核酸配列も本発明の態様であり、ここで、該蛋白質又はそれをコードする該核酸配列は、同一の適応症のためのもう1つの有効な剤と組み合わせて投与される。
また、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療における使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び/若しくは前記定義の核酸構築体、並びに/又は前記定義のベクターと、もう1つの活性剤との組合せも本発明の態様である。該組合せは、治療上有効な間隔内で、任意の順序で、別々になすことができる、s−KLと任意の他の活性な剤との投与のための、又は該活性な剤の同時投与のための、医薬組成物又は製剤に関する。
以下、本発明に由来する利点及び以下に提供する実験手法から得られた結果を記載する。
オープンフィールド試験を用いて、s−KLが、運動力、探求活性、情動性、新奇恐怖症、及び不安様行動に影響できるか否かを調べた。簡単に述べると、発明者らは、年齢にかかわらず、s−KLを過剰発現する動物は、対照動物と比較した場合に、温和な活動亢進、増大した自発運動活性を示し、従って、CNSにおけるs−KLの投与は、12月齢前後で観察された自発運動活性の漸次の減少を少なくとも部分的に逆行させるようであることを見出した。加えて、運動の待ち時間(新奇恐怖症又は不安の結果としての行動阻害のインジケーター)は、s−KL処理動物においてより短い傾向があり、これはより高い脱抑制を示すが、この効果は中年動物(6→12設定)においてのみ統計学的有意性に到達したが、老齢の動物(12→18設定)においては到達しなかった。首尾一貫して、shRNA−sKLによって媒介されるs−KL発現の抑制は、反対の効果を有した。かくして、shRNA−sKL群のいくらかの動物は、試験の開始時に行動抑制を呈し、これは、s−KLを過剰発現するマウスよりもかなり優れた、すくみ、硬直、及び中心領域を去るまでの待ち時間を示す。
次に、作業記憶に対するs−KL過剰発現の効果を評価するために、T−迷路試験を用いた。再度、結果は、s−KLの投与が、年齢とは無関係に、認知能力を改善することを示す。というのは、s−KLで処理したマウスは、対照動物と比較して、仕事の解決において誤りを犯すのがより少ないためである。これらの結果は、(12→18月設定)動物の前頭前皮質で見出されたs−KLレベルの増加と一致する。マウスにおいては、作業記憶の不足は、24月齢前後に出現すると仮定すれば、クロトーは、認知機能の増強剤として作用しているように見える。
最後に、モリス水迷路試験を用いて、視覚知覚学習及び記憶及び学習能力に対するs−KL過剰発現/抑制の効果を評価した。双方の実験からの結果は、再度、s−KLで処理したマウスは、仕事の解決においてより効果的であり、それらは、対照動物よりも速く学習することを示し、これは、s−KLがマウスにおいて有意に長期記憶を改善することを示す。対照的に、shRNA−sKLを注射した動物は、仕事を学習するにおいて問題を示し、より長い距離を泳いで、プラットフォームに到達した。更に、これらの反対の効果も、最終の記憶試験(最後の訓練から24時間後)に観察された。s−KLを過剰発現する動物は、プラットフォームが従前に突き止められた四分円における調査を優先させ、他方、shRNA−sKL処理動物は訓練四分円に対して特別な優先は示さず、これは、記憶及び/又は学習の障害を示唆する。予測されるように、対照と比較した場合、処理(mRNA及び蛋白質の双方)から6か月後におけるs−KLレベルの定量は、認知能力と非常に強い正の相関を示し、AAV/s−KL処理マウスにおいて統計学的により高く、AAV/shRNA−sKL処理マウスにおいてより低かった。このパターンは、動物が成体期(6→12月設定)又は中年(12→18月設定)において注入されているか否かにかかわらず観察された。
まとめると、この研究は、低い認知能力に関連する海馬における低下したレベルを伴う、認知機能におけるs−KLの重要な役割を示す新しい証拠を提供する。該研究は、CNSへのs−KLの単回icv注射が、認知技量を刺激するための長く継続し定量可能な剤としての大きな潜在能力を有し、マウスを老齢において処理した場合に年齢−依存的認知減少を保護さえすることも証明する。発明者らの知識の限りでは、これらは、分泌されたクロトー蛋白質のみの作用が、成体期において処理した場合に、老齢動物の学習及び記憶能力を改善する、イン・ビボで得られた最初のデータである。更に、これらの実験がナイーブな年齢の動物で行われたことを考慮すると、該結果は、s−KLが認知症に対する治療的潜在能力を有し得ることを示唆する。これは、とりわけ、アルツハイマー病又は多発性硬化症等の神経変性障害に対する有望な新しい治療アプローチを表す。
本明細書中で用いる全ての用語は、そうでないことが述べられているのでなければ、当該分野で知られたそれらの通常の意味で理解されるべきである。本出願で用いるある種の用語についての他のより具体的な定義を以下に記載し、そうでない明示的に記載された定義がより広い定義を提供しているのでなければ、明細書及び特許請求の範囲を通じて一様に適用されることを意図する。
本発明による「遺伝子構築体」は、「発現カセット」と命名することもできる。それは、発現プロモータに操作可能に連結された、注目する蛋白質をコードする配列を含めたポリヌクレオチド配列をいい、該プロモータは、該蛋白質をコードする配列の発現を制御する。「操作可能に連結された」は、該蛋白質をコードする配列が(5’−3’方向で)プロモータの配列の後に、又は制限部位が含まれるか、あるいは遺伝子構築の他の安定化エレメントが存在する場合は該プロモータの近くに配置されると理解されるべきである。遺伝子構築体(発現カセット)は、それをより複雑な発現系(ベクター、プラスミド)に適合させるための有用な配列を持つ小さな断片、又は注目する蛋白質をコードする配列の後に配置されたポリアデニル化テイルも含んでよい。発現カセットそれ自体は、遺伝子構築体を保護し、又はウイルスベクターの場合には細胞への進入を促進するのに更に用いるベクター又はプラスミドである発現系でもある。「プロモータ」は、特別な遺伝子の転写を開始するDNA領域のものである。プロモータは、同一ストランド上で、且つ(センスストランドの5’領域に向けて)DNAの上流の、遺伝子の転写開始部位近くに位置する。プロモータは約100から1000塩基対の長さとすることができる。「構成的プロモータ」は、「誘導性プロモータ」等の、調節され、特異的な刺激に応答してのみ細胞において活性となる他のものとは反対に、細胞中で全ての状況において活性なプロモータである。他のプロモータは、「ニューロン特異的プロモータ」等、組織又は細胞特異的である。「ポリヌクレオチド配列」については、それは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む核酸分子(DNA又はRNA)と理解されるべきである。核酸は一本鎖又は二本鎖とすることができ、それは限定されるものではないが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
用語「アデノ−関連ウイルス(AAV)」は、本明細書中で用いる場合、分裂中の及び静止霊長類(及びヒト)細胞の双方に感染するウイルスベクターをいう。それらはいずれの病源効果も欠如しているように見え、且つ通常、ゲノムと同一の場所(染色体19においては、AAVS1部位)に一体化されているので、このウイルスベクターは、遺伝子治療適用において、外来性DNAをヒト細胞に導入するのに安全に用いることができる。そうでなければ、「発現構築体」として知られた「発現ベクター」は、通常、細胞における蛋白質発現のために設計されたプラスミド又はウイルスである。該ベクターは、特異的な遺伝子を標的細胞に導入するのに用いられ、細胞のメカニズムに、蛋白質合成について、当該遺伝子によってコードされた蛋白質を生産するように挑発することができる。発現ベクターは、蛋白質の生産のためのバイオテクノロジーにおける基本的なツールである。発現ベクターは、複製起点、選択マーカー、及び多重クローニング部位等の遺伝子の挿入のための適切な部位などの、いずれのベクターも有し得る特徴を有する。
2つのアミノ酸配列の間の「相同性のパーセンテージ」は、当該分野における専門家によって知られた広く受け入れられている分類に従って、同一であるか、あるいは同様な特徴の側鎖を備えた他のアミノ酸(即ち、極性、非極性、アミノ基を持つ、−SH基を持つ、即ち、アミノ酸の同一クラス)で置き換えられた配列位置のパーセンテージと理解されるべきである。2つのアミノ酸配列の間の「同一性のパーセンテージ」は、同一のアミノ酸を備えた配列位置のパーセンテージと理解されるべきである。配列の間の相同性の、及び同一性のパーセンテージは、「配列整列」によって計算され得る。配列整列は局所的又は全体的であってよい。本発明の意味では、相同性及び同一性のパーセンテージは、好ましくは、全配列又は配列の全活性断片の間の、全体的整列にわたって計算される。全体的整列は、配列が同様であって、ほぼ同一のサイズ(長さ)を有する場合により有用である。これらの全体的整列を行うための技術水準で入手できるいくつかのアルゴリズムがある。また、配列の間の同一性及び相同性のパーセンテージを得るためのそのようなアルゴリズムを用いるバイオインフォーマティックスツールもある。例として、配列の間の全体的整列は、よく知られたGGSEARCH又はGLSEARCHソフトウェアによって行ってよい。2つのアミノ酸配列の間の同一性は、好ましくは、Altschul,S.F.et al.,「Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Research−1997,Vol.No.25,pp.:3389−3402、及びNCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTに開示されたBLASTPアルゴリズムを用いることによって決定される。
以下の実施例で示されるように、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列を備えた遺伝子構築体を含む発現ベクターのマウスへの脳注入は、これらのマウスをいくつかの試験に付した場合に、認知及び行動機能の改善に導く。これらのデータは、s−KLを、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の治療及び/又は予防で用いることができることを証明する。
本発明は、蛋白質としての、あるいはそれをコードする核酸配列としての、双方のs−KLの投与を含み、これは、遺伝子構築体及び/又は発現ベクターの形態等の、投与されるべき適切な形態で存続する。かくして、「s−KL」は、本明細書中においては、s−KLの双方の形態を意味する。
特別な実施態様において、認知及び/又は行動障害は老化に関連する。用語「に関連する」は、老人性認知症におけるなどの、認知及び/又は行動障害が、哺乳動物、特に、ヒトが老齢となる(老化)場合に起こり、いくつかの神経変性及び/又は神経病理学的疾患においても起こり得るが、これは、該疾患においてやはり影響された生理学的パラメータの原因又は結果であることを意味する。老人性認知症は、天然の非病理学的老化のため出現する状態であり、それは、バランスの問題、震え、記憶のゆがみ、不安、鬱病、無感動、動揺、及び刺激等の多くの認知及び/又は行動障害を示唆する。老人性認知症は、アルツハイマー病としての神経変性疾患とも関連し得る。
特別な実施態様において、老化に関連する認知及び/又は行動障害は、老人性認知症で発現されるものである。
かくして、本発明の第一の態様の特別な実施態様において、s−KLは、学習及び記憶の障害からなる群から選択される認知障害の予防及び/又は治療で用いられるものである。更に詳しくは、学習障害、特に学習手法障害、及び記憶の障害、特に記憶の喪失、作業記憶の障害、及び長期記憶の障害で用いられるものであり、後者は空間的及び発症記憶障害を含む。
もう1つの特別な実施態様において、所望により、前記又は後記のいずれかの実施態様と組み合わせて、s−KLは、不安及び広場恐怖症から選択される行動障害の予防及び/又は治療で用いられるものである。
また、もう1つの特別な実施態様において、所望により、前記又は後記のいずれかの実施態様と組み合わせて、s−KLは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、発作後認知症、外傷後認知症、老人性認知症、並びに頭蓋脳外傷からなる群から選択される神経変性及び/又は神経病理学的疾患に関連する認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療で用いられるものである。
より特別な実施態様において、s−KLは、アルツハイマー病に関連する認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療で用いられる。特に、それは、アルツハイマー病における不安障害の予防及び/又は治療で用いられる。
かくして、本発明による使用のためのs−KLは、特別な実施態様においては、哺乳動物、特にヒトにおける認知及び/又は行動障害の予防及び/及び治療のためである。クロトー蛋白質は、以下の表(BLASTによる分析、NCBIからのアミノ酸配列)に示されているように、哺乳動物の間で、相同性の高いパーセンテージを有する。
特別な実施態様において、前記で明らかにした使用のためのs−KLは、配列番号1、配列番号2、及び配列番号1又は配列番号2のいずれかに対して少なくとも88%の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドから選択されるポリペプチドである。同一性のパーセンテージは、BLASTPアルゴリズムを用いることによって決定される。
なおより特別な実施態様において、それは、アミノ酸配列、配列番号1及び配列番号2から選択されるポリペプチドである。他の特別な実施態様において、先に明らかとした使用のためのs−KLは、88%から100%までの配列番号1又は配列番号2いずれかとの同一性のあるパーセンテージを持つポリペプチドである。同一性パーセンテージの範囲は、88%、88.5%、89%、89.5%、90%、90.5%、91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%、及び100%を含む。もう1つのより特別な実施態様において、ポリペプチドの同一性のパーセンテージは88%から90%であり;なおより特別には88%から88.5%である。
配列番号1は、70kDaの近似的分子量を持つが、m−KL転写体で見出されない15個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを持たない、KL1ドメイン配列を含む、α−クロトーヒト遺伝子の選択的スプライシングからの転写体のアミノ酸配列である。α−クロトーヒト遺伝子は、ゲノムリファレンスコンソーシアム(Genome Reference Consortium)によって維持されたヒトゲノムについてのアセンブリGRCh38(24.12.2013)の染色体13NC_000013.11(33016063..33066145)に位置するものである。配列番号1は、5012塩基対のGenBankデータベースアクセション番号NM_004795、03.May.2014のバージョン3を持つmRNAの選択的スプライシング転写体に由来する、配列番号5の対応するcDNAに由来する。
配列番号2は、70kDaの近似的分子量を持つが、m−KL転写体に見出されない15個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを有する、KL1ドメイン配列を含む、α−クロトーマウス遺伝子の選択的スプライシングからの転写体のアミノ酸配列である。α−クロトーマウス遺伝子は、マウスゲノムについてのマウス2007年7月(NCBI37/mm9)アセンブリに関するUCSCゲノムブラウザの染色体5に位置するものである(150,952,607−150,993,809)。配列番号2は、5124塩基対のGenBankデータベースアクセション番号NM_013823、15.February.2015のバージョン2を持つmRNA配列の選択的スプライシング転写体から由来する、配列番号6の対応するcDNAに由来する。
配列番号1又は配列番号2のいずれかと少なくとも88%の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドは、配列番号1又は2における単一又は2又は3個のアミノ酸置換、1又は2個のアミノ酸の欠失、配列のいずれかの位置における1又は2個のアミノ酸の挿入、配列番号1又は2に関する全てのこれらのアミノ酸変異を含めた、配列のアミノ酸変異に由来する哺乳動物蛋白質を含み、但し、得られた蛋白質は、それが由来するs−KLと同一の機能を有するものとする。配列番号1又は配列番号2のいずれかと少なくとも88%の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドは、マウス及びヒト以外の哺乳動物のs−KLも含む。先に示したように、同一性は、BLASTPアルゴリズムによって行った配列の間の全体的整列によって決定される。
本発明の第一の態様のもう1つの特別な実施態様において、先に明らかにした使用のためのs−KLは、配列番号1又は配列番号2からなるポリペプチドである。
s−KLは、便宜には、脳又は中枢神経(CNS)に向けられた、あるいは最後にそれに到達する、蛋白質の形態で直接的に用いてよい。この蛋白質は、例えば、当該蛋白質を安定化するための許容される賦形剤と共に、脳への注入で有用な、あるいは(主として)静脈内注射で有用な、担体(溶媒)に懸濁させた又は溶解させた治療量の蛋白質を含む医薬組成物の形態で投与することができる。
他方、s−KLは、遺伝子治療によって、CNSの標的細胞内部で発現させることができる。この目的で、本発明は、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列を含む新しい遺伝子構築体も提供する。本発明において、該「哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列」は、特に、哺乳動物において該s−KLについてmRNAの逆転写(RT−PCR)から得られるcDNA配列と理解されるべきである。特別な実施態様において、操作可能に連結された発現プロモータは、構成的発現プロモータ、誘導性プロモータ、及びニューロン−特異的発現プロモータから選択される。特別な実施態様において、本発明による遺伝子構築体は核酸配列、配列番号3を含む。配列番号3は、サイトメガロウイルス即時型初期(CMV IE)プロモータ、s−KLをコードする配列(マウスs−KLのcDNA)、及びポリアデニル化鎖(ポリA)を含む。もう1つの特別な実施態様において、本発明による遺伝子構築体は、ヒトs−KL蛋白質をコードする配列(ヒトs−KLのcDNA)を含む以外は、配列番号3と同等である核酸配列、配列番号4を含む。
もう1つの特別な実施態様において、遺伝子構築体は、配列番号3又は配列番号4からなる。
全てのこれらの遺伝子構築体は、一旦細胞に入ると、特にCNS細胞に入ると、注目する蛋白質を発現させることができる。
構築体の投与を容易とするために、本発明は、前記定義の遺伝子構築体を含む、かくして、発現プロモータに、特に、構成的発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列を含む中枢神経系向性を持つ新しい発現ベクターも提案する。
本発明の目的で適切な発現ベクターは、中枢神経系(CNS)向性を持つ、又はCNS細胞に効果的に形質導入するベクターである。遺伝子治療のための発現ベクターは通常はウイルスであり、特別には、レトロウイルス、アデノウイルス、ウイルスベクターのエンベロープ蛋白質シュードタイピング、複製能力があるベクター、シス及びトランス−作用性エレメント、単純疱疹ウイルスである。
これらの発現ベクターの特別な実施態様において、それらはウイルスベクターである。更に詳しくは、発現ベクターはアデノ関連ウイルス、より特別には、血清型1から10とすることができる、CNS向性を持つアデノ関連ウイルスである。特に、アデノ関連ウイルスは、血清型rh10(AAVrh10)のものである。
s−KLコーディング配列を含む遺伝子構築体の送達のための他の可能なベクターは、リポソーム、遺伝子構築体の損傷を回避し、更に、CNS細胞内への構築体の進入を有効且つ特異的に容易とするミクロ−及びナノ粒子を含む。プラスミド又は裸のDNAの形態であるs−KLは、裸のDNAの注射、送達を増強するための物理的方法、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、又は水力学送達等の非ウイルス方法によって遺伝子治療のために投与することもできる。送達を増強するための他の化学的方法は、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、又は無機ナノ粒子の使用である。
本発明のもう1つの態様は、先に明らかにしたように、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、老化に関連する認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療における使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び/若しくは前記定義の核酸構築体、並びに/又は前記定義のベクターと、もう1つの活性剤との組合せである。
特別な実施態様において、該組合せは、アルツハイマー病(AD)と関連する認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療のためである。該組合せは、治療上有効な間隔内で、任意の順序で、別々になすことができる、あるいは活性な剤の同時投与のための、ドネペジル塩酸塩(Aricept、Pfizer)、メマンチン、リバスチグミン、及びリグスチリド等の任意の他の活性な剤と共に、s−KLを投与するための医薬組成物又は製剤に関する。なおより特別な実施態様において、該組合せは、ADの患者において、不安の予防及び/又は治療で用いられる。
s−KLは、粘膜を介して(例えば、鼻、舌下、膣、頬、又は直腸)、非経口(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、若しくは動脈内注射、ボーラス又は点滴のいずれか)、経口、経皮、あるいは、例えば、エアロゾルによる吸入を介して患者に投与することができる。例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路による等の、非経口投与に適した剤型は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び当該剤型を意図した受容者の血液と等張とする溶質を含有することができる、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、及び懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、並びに保存剤を含むことができる、水性及び非水性滅菌懸濁剤を含む。注射溶液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することもできる。いくつかの実施態様において、該組成物は、例えば、貯蔵器又は浸透圧ミニポンプ又は筋注器を用い、注射によって、例えば、皮下投与、腹腔内投与、膀胱内投与、静脈内投与、点滴によって投与される。該剤型は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量及び多回用量のシールされた容器中にて供することができる。
特別な実施態様において、s−KLは患者に非経口、より特別には静脈内投与される。
他の特別な実施態様において、s−KLは、直接送達にて中枢神経系に投与され、より特別には、くも膜下腔内又は槽内マグナ(intracisterna magna)(ICM)、特に、パッチ、マイクロポンプ、又はマイクロカプセル送達系によって注射される。
明細書及び特許請求の範囲を通じて、用語「含む」及び該用語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を排除することを意図しない。更に、用語「含む」は、「からなる」の場合を含む。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、明細書を精査すると、当業者に明らかになり、又は本発明の実施によって学習できる。以下の実施例は例示によって提供され、それらは、本発明を限定する意図ではない。更に、本発明は、本明細書中に記載された特別な及び好ましい実施態様の全ての可能な組合せをカバーする。
実施例1;分泌されたクロトー蛋白質をコードするプラスミドベクターの生成。導入のためのAAVウイルスベクターの生産
遺伝子治療のためのウイルスベクターの生成は、合成構築体から行った。遺伝子構築体(プラスミド)pCR−KL−TOPO−KL(ImaGenes(商標)、ドイツ国)は、クロトーの膜貫通蛋白質アイソフォーム(m−KL)の全長cDNAをコードした。次いで、クロトー配列を、制限酵素での連結によって(配列番号12の、及びGenthonの好意による)pGG2プラスミドにクローン化し、該pGGsプラスミドは、アデノ−関連ウイルス血清型2(AAV2)ゲノムの逆位末端反復(ITR)配列、及び注目する遺伝子が、サイトメガロウイルス即時型プロモータ(CMV IE)の制御下でクローン化される場所である多重クローニング部位(MCS)を運ぶ。これを行うために、同酵素を用い、m−KLのcDNAを、XbaI/EcoRI制限酵素でpCR−KL−TOPO−KLから抽出し、CMV IEプロモータ(MoBiTec、Alemania)の配列、EMBL−EBIアクセション番号Z46733、29.Aug2014のリリース121を含むベクターp123Tに該断片をクローン化した。CMV IEプロモータの配列及び(ここではCMV IE−mKLという)m−KLをコードする配列を含む断片を、CMV IEプロモータの配列を含むpGG2プラスミドにクローン化して、逆位末端反復(ITR)で隣接して挟まれた発現カセットを得た。このプラスミドを(配列番号13の)pGG2−m−KLと命名した。
s−KLをコードするcDNAを含む遺伝子構築体は、配列番号14の合成pUC57−KL(GenScript、USA)から生じさせた。このプラスミドは、s−KLをコードする適切な制限部位を含有した。図1(A)においては、プラスミドマップが模式的に描かれている。図1(B)は、合成pUC57−KLから由来することができたs−KLアイソフォームをクローン化する戦略を示す。
s−KLコーディング配列を含むプラスミド(pGG2−s−KL、配列番号15)は、pGG2ベクターを開くためのNotI/XbaIに適合するXbaI/Bsp120I標的にて生成させた。
pGG2−s−KL及びpGG2−m−KLは、この特別な実施例において、pGG2プラスミドで得た。それにもかかわらず、他のプラスミドは、s−KLをコードする配列に操作可能に連結されたCMV IEプロモータ及びポリアデニル化鎖(ネズミs−KLについては配列番号3、及びヒトs−KLについては配列番号4)を含む遺伝子構築体の;並びにm−KL/ヒト又はネズミ)についての同構築体のウイルスキャプシドにパッケージングすることを可能としつつ、有用である。これらの配列のパッケージングは、以下に例示されるAAVの生成で用いたプラスミドとは独立して、同ウイルスゲノム及びウイルスキャプシド蛋白質に導く。
プラスミドpGG2−mKL又はpGG2−sKLいずれかを含む更なるAAVベクターは、pGG2プラスミド、AAV増幅用のAAV遺伝子を運ぶpXX6プラスミド(配列番号16、Genethonの好意)、及びプラスミドpREp2Cap10(配列番号17)(MTA G.M.Wilsol博士、ペンシルベニア大学)での、Stratageneからの293−AAV細胞(70%密集)の三重トランスフェクションによって生成させ、この後者はAAVrh10の配列Cap及びRepを運ぶ。次いで、イオジキサノールグラジエントでの超遠心を用いてウイルスを精製し、ピコグリーン方法(Piedra et al.,“Development of a rapid,robust,and universal picogreen−based method to titer adeno−associated vectors”,Hum Gene Ther Methods−2015,vol 26(1),pp:35−42;or doi:10.1089/hgtb.2014.120 PMID:25640021)によってカウントし、使用の瞬間まで−80℃で貯蔵した。この発現ベクターをAAVrh10_pGG2−sKL及びAAVrh10_pGG2_mKLと命名した。AAVrh10_pGG2_mKLの定量のためのプライマーは、m−KL−順方向5’−TTCAAACCCGGAAGTCTTTG−3’(配列番号7)、及びm−KL−逆方向5’−CCAGGCAGACGTTCACATTA−3’(配列番号8)である。
手法は以下の通りであった:Stratageneからの293−AAV細胞(70%密集)を含む15cmの直径の20枚のプレートを、500μgのpXX6、250μgのpRep2Cap10及び250μgのpGG2プラスミドを含むポリエチレンイミンPEI(Polyscience)でトランスフェクトした。該3つのプラスミドを培地DMEM中で混合し、該プレートに、14ml/プレートの最終容量まで加えた。6時間後に、該培地を交換した。48時間のポスト−トランスフェクション細胞を掻き取り、遠心した。それらを溶解緩衝液(50mM Tris(Sigma)、20mM NaCl(Panreac)、及び2mM MgCl2(Panreac))中に再懸濁した。AAV精製のため、フロスト及びデフロストの3サイクル後に、遠心によって細胞残渣が得られ、上清を貯蔵した。ベンゾナーゼ(50U/ml)を上清に加えて、細胞DNAを分解した。ウイルス粒子をポリエチレングリコール(1ml/4mlの細胞溶解物におけるPEG)で更に沈殿させた。15分間の8000gでの遠心により、ウイルス粒子を含むペレットを得た。15mlの溶解緩衝液をイオジキサノールグラジエント管に加え、1時間の690000gにおける遠心後にウイルス粒子を除去した。
実施例2 老齢マウスにおけるAAV s−KLベクターのイン・ビボ投与
実施例2A:AAVベクターの投与
老化しているCNSにおけるクロトー過剰発現の長期効果を、12月齢(中年、N=10)において注射したC57BL/6マウスで評価し、それらが老齢(18月)に達すると、行動評価及び機能分析のための一連の試験を通じて6月後に試験した(図2及び図3)。対照群に、無関係なDNA配列をコードするAAVrh10ベクターを注射し、処理群に、分泌された(s−KL)クロトーアイソフォームをコードするAAVrh10ベクターを注射した。AAVベクターを脳心室(icv)注射して、CNSで生じたクロトーをCSFに放出させ、脳全体に分布させる内因性生産システムを模倣した。
イン・ビボアッセイでは、Harlan LaboratoriesBVのC57B16マウス(野生型雄)を用いた。動物での全ての実験及び剖検は、スペイン国で適用される法律に従って、バルセロナの自治大学(スペイン国)で行った。プロトコルは、倫理委員会によって承認された。動物には、8:00時間で開始し、22℃及び12時間の暗及び明サイクルにてMacrolonケージ中で自由に食料を与えた。
ケタミン(10mg/kg体重;Imalgene500;Rhone−Merieux)及びキシラジン(1mg/kg体重;Rompun;Bayer)の腹腔内注射によってマウスを麻酔し、定位フレーム(David Kopf Instruments,CA,USA)に設置した。野生型マウス(12月齢)の脳に注射して、実施例1の発現ベクターを含む脳脊髄液(CSF)に到達させた。従って、(AAVrh10−s−KLとも略されるAAVrh10_pGG2−sKLを注射した)s−KLマウスを生じた。対照(Nullマウス)として、無関係な遺伝子をコードするベクターを用いた。実験群は、群当たり10匹の動物からなるものであった(n=10)。脳室内注射を、定位固定デバイスの助けを借りて第三側脳室で行った。発現AAVベクターの投与された用量は、3μLの単一用量中、マウス当たり1.1010ベクターゲノムであった。
実施例2B;CNS中のs−KLの過剰発現は、老齢マウスにおいて体重又は感覚運動に影響しない。
行動及び認知試験を、マウスが18月齢になると行った。最初に、感覚運動試験を行い(1日)、続いて、コーナー試験及びオープンフィールド試験を行った(2日)。次に、T−迷路試験を行った(3から5日)。モリス水迷路(MWM)試験は最後に行った(6から12日)。
動物の体重は、12から19月齢に、月当たり1回モニターした。反射(視覚性反射及び後脚伸展反射試験)は、動物を自己の尾によって保持し、それをゆっくりと黒い表面まで降下させることによって3回測定した。運動協調性及び平衡は、各々、カバーされた距離、及び2回の連続20秒のトライアルにて水平木製ロッド(1.3cm幅)から落ちるまでの待ち時間によって評価した。仕事の困難性を増加させるために、試験は、金属ワイヤロッド(1cm直径)上で反復した。把握性及び運動協調性は、ワイヤ吊り下げ試験でカバーされた距離として測定し、これは、5秒の2回のトライアル及び第三の60秒のトライアルにつき、動物にその前足で水平ワイヤ(直径:2mm、長さ:40cm、8つの5cmセグメントに分割)の中央からしがみつかせることよりなるものであった。筋肉の強さは、60秒のトライアルにおいてワイヤから落ちるまでの時間として測定した。全ての装置を、詰め物をしたテーブル上方40cmに吊り下げた。
処理された動物の行動評価は、身体の状態、即ち、体重及び反射並びにバランス、協調性、把握性、強さ及び抵抗性等の基本的な感覚運動機能における、s−KLの推定効果の評価で開始した。これらの測定は、運動力に依存して引き続いて結果に影響し得る群の間の可能な差を検出することを可能とする。注目すべきは、動物の双方の群の間で平均体重の有意な差はなかった(p=0.48)。しかしながら、s−KL処理マウスは、6か月の後注射を通じて比較的安定した体重を有し、他方、null処理群の体重は中年の間に徐々に増加し、老齢では減少した。表1に示す結果は、視覚性置き直し及び後肢反射試験、木製及び金属ロッド試験;並びに吊り下げ試験によって測定した、s−KL処理及び対照群において同様な感覚運動機能も示す。従って、全ての動物は、引き続いての行動試験で分析した場合、同様な身体の条件であったと推定される。
実施例2C:CNSでのs−KL過剰発現は、老齢マウスにおける不安様行動に影響することなく、年齢関連運動低下を改善する。
ヒトの老化、正常及び年齢関連病の双方は、認知及び動機付けの変化に平行する運動行為のかなり相関する変化に関連する。従って、運動力及び探求行動は年齢と共に減少するので、我々は、まず、オープンフィールド試験を用い、CNSにおける分泌されたクロトーアイソフォームの過剰発現が、対照と比較して、注射したマウスにおいて運動/探求行動に影響し得るか否かを決定することを求めた。
この試験は、新奇恐怖症及び不安様行動を調べるために開発され、最もしばしば、齧歯類で用いて、一般的な自発運動活動(水平方向及び垂直方向活動)及び(垂直方向活動によってほとんどは示される)探求する意欲を定性的に及び定量的に測定する。進んだ合計距離、立ち上がり探求行動、行動事象の待ち時間、自己−毛づくろい行動、及び排便を含めたオープンフィールド活動を調べて、老齢マウスの脳におけるsKL過剰発現が、運動力、探求活性、情動、及び不安様行動の変化を誘導するか否かを判断した。
m−KL及びs−KLが処理された動物において異なる効果を誘導し得るか否かを具体的に知るために、また、野生型マウス(12月齢)に、AAVrh10_pGG2_mKLベクターを脳室内注射した(n=10)。
この試験の結果を図2(A、B)に示す。図2(A)において、オープンフィールドでなされた合計距離(cm)を棒線で描く。図2(B)において、マウスの各型について、1分当たりになされた合計距離(cm)を記録する。表2における、オープンフィールド試験での動物の探求活動を評価するための異なるパラメータ。
図2Aに示されるように、18から19月齢に試験すると、従前にs−KL又はm−KLを12月にてicv投与されたマウスは、対照マウスと比較してより長い合計距離を進んだ(各々、p<0.01;p<0.001)。興味深いことには、m−KL処理マウスで観察されたより大きな自発運動活動は不安に関連するように見える。というのは、進んだ距離の差は試験の最初の3分で観察されなかったからである(図2B)。比較において、s−KLマウスで観察されたより大きな自発運動活動は不安に関連しない。というのは、該距離の走行は、試験の最後において統計学的に有意だからであり、従って、より若い動物により典型的な探求行動により関連しているからである(図2B)。これは、行動事象の順番、及び排便の数等の測定された他のパラメータに合致し、これは、オープンアリーナに向かい合う場合、動物の双方の群において新奇恐怖症及び情動性の同様なレベルを示す(表2)。唯一、処理した動物における毛づくろいの数の低下(p=0.0032)は統計学的に有意であった。
実施例2D:CNS s−KL過剰発現は、老齢のマウスにおいて認知能力を改善する。
CNSにおけるクロトーの可能な長く継続する神経保護効果を調べるために、2つの学習及び記憶試験:T−迷路及びモリス水迷路において動物の認知技量を評価した。
自然発生的な探求行動を、T−形状迷路(アーム、長さ25cm)で試験した。動物を、末端壁に向かい合った垂直アームの内側に置いた。動物が3つのアームの交点を横切るまで(4足動物の基準)経過した時間を決定することによって、能力を評価した。作業記憶パラダイムは、2つの連続試行:90秒の試行間の間隔で、1つは強制選択であり、1つは自由選択、からなるものであった。強制選択においては、(各群においてバランスしていない)ランダムな順序に従って、アームのうちの1つのみがアクセス可能であった。各マウスを、その頭部を末端壁に向けて、迷路の「垂直」アームに入れ、迷路を探求させた。アクセス可能なアーム(学習の基準)において20秒費やした後、動物をホームケージ出発ボックスに戻した。19秒後に、それを、再度、双方のアームがアクセス可能な自由選択試行で迷路を探求させた。マウスによって選択されたアーム及び自由選択の間に各アームで消費された時間を記録した。アクセス不可能であったアームを探求する前に従前の試行において既に訪問したアームの選択は誤りと考えた。また、迷路において3つのアームの探求を完了するのに費やした時間を記録した。嗅覚試行は、試行間の間隔の間に迷路の表面を清掃することによって除外した。
表3に示されたように、全ての動物が仕事を完了することができたのではないが、T−迷路における強制選択の仕事においては、全ての群が同様に基準を満足した。引き続いて、基準を満足した動物のみに、記憶仕事である第二の試行を与えた。結果は、老齢のマウスにおけるCNSでのs−KL発現の増加が、対照群(2.94/6の誤りの頻度)と比較して、それらの記憶スコアを統計学的に改善した(0.65/5の誤りの頻度)。これは、迷路経路を選択するにおける有意により少ない誤りによって証明される(p=0.0018)。更に、この能力は、3連続日にわたって維持された(図3)。
これらのデータは、CNSにおけるs−KLの発現の増加が、対照に対して中断を改善することを可能とすることを示した。これは更に、良好な作業記憶、老化している人々及びアルツハイマー病における特に興味深い該記憶を示唆する。
処理された動物における認知能力の更なる分析を、モリス水迷路で行った。この試験は、視覚知覚学習のための1つの手掛り仕事、空間参照学習及び記憶のための4日間の場所仕事、続いての、長期(24時間)記憶についての探索試行からなる。場所−学習仕事においては、遠位の視覚的手掛りを備えた試験室中に位置した循環プール(Intex Recreation Corp.CA,USA;91cm直径、40cm高さ、25℃の濁水)中のプラットフォーム(7cm直径、水面下1.5cm、目に見える5×8cmの縞模様の旗によって示された位置)を突き止めるようにマウスを訓練した。これは、15分間隔の試行にて、1日当たり4回のプラットフォーム試行セッションを必要とした。各試行においては、マウスを、1つのランダムに選択された出発点(N、S、E、又はW)から(壁に向かって)穏やかに放し、(常に、SE四分円の中央にある)プラットフォームに逃げるまで泳がせた。60秒以内にプラットフォームを見つけられなかったマウスを、20秒間その上に置いたが、これは、成功した動物に許容されたのと同一の期間である。最後の手掛り付きプラットフォーム試行から24時間後に、動物を、4つの隠れたプラットフォーム試行からなる目に見えるプラットフォームの手掛り学習について試験した(20分間隔)。プラットフォームは、水面から1.5センチ下に隠れており、その新しい位置(NW)は目に見える縞模様の旗(5×8cm)によって示され、遠位手掛りは取り除いた。各試行の間に、逃避待ち時間、移動した距離、及び平均速度を、コンピュータ化追跡システム(SMART、Panlab S.A.,スペイン国)によって測定した。
注目すべきことには、泳ぐ速度は、s−KLで処理した群において有意により高かった(図4A)。これは、オープンフィールド試験においてこれらの同一動物で観察された増加した水平方向自発運動活動と合致する。我々は、従って、これらの動物において、距離は、学習及び記憶の技量を評価するための待ち時間又は速度よりも正確な変数であると考えた。重要なことには、それらの年齢にかかわらず、両方の群は、訓練の4日間にわたった学習を示した。というのは、仕事を解決するためにカバーされた距離の漸進的な低下があったからである(図4B、対照ではp<0.01;s−KLではp<0.001)。最後に、空間学習の獲得は、群にかかわらず同様であった。これは、記憶試験前に、全ての動物は、仕事に直面すると同等であったことを示す。
最後に、獲得の最後のセッションから24時間後に(探索試行24時間)、老齢の対照マウスは、長期記憶試行においてより貧弱な成績を有した。それらは、それらが短期記憶試行において示したのより、訓練四分円ではより低い成績を示した。対照的に、s−KL処理群は、訓練四分円について明瞭な優先性を有しており、対照よりも統計学的に有意であった(p<0.01、図5)。これらの結果は、CNSにおけるs−KLの増大したレベルの認知効果が長期記憶における選択的改善と結び付けられることを示す。
実施例2E 注射されたマウスのCNSにおけるウイルスゲノムの定量
全ての試験を終了させた後、マウスを犠牲にし、脳の半分の一方を組織学のためにパラホルムアルデヒド(4%)中で固定した。脳の他の半分は、異なる脳切片(前頭前皮質、PFC;皮質、C;海馬、H;及び小脳、CB)において、ウイルスゲノム(vg)の存在及びs−KLの発現レベルを決定するのに用いた。
これらの分析では、定量的PCRを行った。ウイルスゲノムの検出では、DNA Hirt抽出プロセス(Hirt B et al.,“Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures”,J Mol Biol−1967,vol 26,pp:365−369)を行い、細胞内部からウイルスエピソームを単離させた。定量的PCRを、CMV IEプロモータ用の特異的プライマーで行った。s−KLの定量的PCR(qPCR)レベルによって検出するのに用いたプライマーは以下の通りであった:
s−KL−順方向 5’−TGGCTTTCCTCCTTTACCTG−3’(配列番号9)、
s−KL−逆方向 5’−GCCGACACTGGGTTTTGT−3’(配列番号10)、
CMW−順方向: 5’−TACATAACTTACGGTAAATGGC−3’(配列番号18)、及び
CMV−逆方向: 5’−AAAGTCCCTATTGGCGTTACT−3’(配列番号19)。
s−KL−順方向 5’−TGGCTTTCCTCCTTTACCTG−3’(配列番号9)、
s−KL−逆方向 5’−GCCGACACTGGGTTTTGT−3’(配列番号10)、
CMW−順方向: 5’−TACATAACTTACGGTAAATGGC−3’(配列番号18)、及び
CMV−逆方向: 5’−AAAGTCCCTATTGGCGTTACT−3’(配列番号19)。
ウイルス発現は、RNAを脳切片から抽出することによって行った。qPCRは、iTaq Universal SYBR Green Supermix(BioRad)、サーモサイクラーCFX384 TouchTMリアルタイムPCR検出システム(BioRad)、Hard−Shell Rhin−Wall 384−WeelスカーテッドPCRプレート(BioRad)、Microseal「B」接着シール(BioRad)にて、供給業者の指示に従って行った。cDNAを1/5希釈した。増幅プログラムは、2分間の98℃、40サイクルの5秒間の95℃及び30秒間の58℃であった。
AAVゲノムは全ての注射された動物で検出され、AAV−s−KLはAAV−Null対照と同様に分布していた(データは示さず)。かくして、脳室内投与から6か月後に、AAVrh10ベクターは、18月齢マウスのCNSに依然として存在した。より重要なことには、s−KL発現は、(s−KL mRNAに関するqPCRによって)分析した全ての脳領域で増加し、小脳における2倍高いから前頭前皮質及び海馬における4倍高いまでの範囲であった(図6)。これらの結果により、老齢マウスについて先に開示した行動及び認知試験における差は、s−クロトー過剰発現によるものであったことが確認される。
実施例3;若いマウスにおけるs−KLのイン・ビボ投与
s−KLの長期発現が中年動物の身体的、非認知及び認知状態を改善できるか否かを調べるために、マウスの第二の組(n=11から14)を6月齢で処理した。次いで、それらを同一の一連の試験によって12月において評価した。より若い脳と比較して、より高齢において、AAV導入のかなり低い有効性がある。比較的若い成体動物の群を試験することによって、我々はこの制限を回避することができた。加えて、この群では、AAVを特異的に海馬に注射した。主な理由は、(i)クロトー遺伝子は海馬において豊富に発現されていること;(ii)海馬は学習及び記憶プロセスに関与していること;並びに(iii)マウスにおいては、海馬は12月齢まで構造的に発生し、後に、年齢依存性機能低下を受けることである。現実には、クロトーがやはり高度に発現されている他の脳領域がある(例えば、脈絡叢、及び小脳)。しかしながら、我々は、塑性の期間の間に海馬においてs−KLを特異的に増強させることが、海馬依存性学習及び記憶プロセスを改善し、それにより、機能の低下の将来のインパクトを低下させるかを見るのに興味を覚えた。
同一の実験の設計において、我々は、s−KL阻害が、対照処理及びs−KL処理動物に対して、ナイーブなマウスで認知欠乏を悪化させるか否かも比較した。分泌されたクロトーアイソフォームの特異的阻害を達成するために、我々は、s−KLに対するshRNAを運ぶAAVベクターを投与した。shRNA配列は、m−KLに存在しないs−KLのテイル中の余分な配列に対して設計した。shRNA−スクランブル配列を運ぶAAVを対照として用いた。
実施例3A AAベクターの投与
イン・ビボアッセイを実施例2のように行ったが、若い動物(s−KLについてのコーディング配列又は対照としてのスクランブルDNAを含むAAVベクターを注射したときに6月齢)についてであった。この場合、動物の海馬に注射した(5×109vg/マウスの2回の注射、半球当たり1回の注射)。動物の体重を実験の開始時(6月齢)、並びに9及び12月齢に測定した。同一の行動及び認知試験を、マウスが12月齢となると行った。実施例2におけるように、(毎月決定した)体重は、予測されたように、アッセイの間に増加した。注目すべきは、経時的なs−KLの維持された過剰発現又は阻害は有意な効果を有さず、全ての群はむらのない同様な体重増加を示した(データは示さず)。
同様に、より老齢の動物での従前の実験においては、6から12月齢でのs−KLの維持された過剰発現又は阻害は、全ての群の反射及び感覚運動技量に影響せず、全ての群の反射及び感覚運動技量は影響されなかった(表4)。
実施例3B;海馬s−KL過剰発現の結果、水平活動の増加がもたらされ、中年成体マウスにおいて温和な不安効果を有する。
オープンフィールド試験(図7)においては、クロトーの過剰発現は、野生型マウスに対して、自然発生活動の変化を誘導することも観察できた。老齢のマウスでの従前の結果と合致して、遺伝子治療アプローチによるs−KLレベルの修飾は、オープンフィールド試験において、水平方向自発運動活動を変化させることができた(図7A、7B)が、マウスの垂直方向活動はそうでなかった(データは示さず)。かくして、s−KL cDNAが海馬で過剰発現されると、マウスが移動した合計距離は他の2つの群におけるよりも有意に高かった(p<0.0001)(対照:1365±14cm;s−KL:1734±8cm;shRNA/s−KL:1259±27.cm)。他方、最初の1分の試験の間に、何匹かの対照動物はしばらくすくみ、これは増大した不安の直接的な尺度である。s−KLを過剰発現するマウスの場合、中心領域を去るまでのより短い待ち時間が記録されたが、この差は、shRNA−sKLを注射したマウスに関して統計学的に有意であったに過ぎない(p=0.0008)(表5)。分析した他の変数においては、群間で差は検出されなかった。
実施例3C;海馬のs−KL過剰発現は、中年成体マウスにおける認知能力を改善し、他方、s−KL阻害はそれを損なう。
作業記憶をT迷路試験で評価すると、処理及び対照動物の間で意味がある差がやはり観察される。
結果は、3試験日の各々で得られた平均値として表す。まず、強制選択試行では、全ての対照動物及びs−KLを過剰発現する動物は基準を満たすことができた。対照的に、shRNA−sKL処理動物の約10%は満足せず、従って、捨てた。加えて、最初の試行において、s−KLを過剰発現するマウスは、shRNA−sKLを注射したマウスと比較して、迷路の交差点に到達するまでに要する時間が短かった(p=0.009)(表6)。その後、自由選択試行において、全ての動物は全ての確立された基準を満たしたが、群間の差が、正しい経路を選択する効率において観察された。対照群は仕事を解決し、36.36%の誤り率であった。このスコアは、21.42%の誤り率にて、s−KL過剰発現群において改善された。対照的に、s−KLの発現停止は40%まで誤りパーセンテージを増大させた(表6)。
最後に、モリス水迷路試験において、学習仕事待ち時間の間に、おそらくは、マウスが若いため、意味がある差は観察されなかった。
場所仕事において、全ての群は、訓練を行う時の学習曲線を示し、これは、プラットフォームに到達するまでのより短い距離として見られる。対照に対して、m−KL及びs−KLマウスは、日ごとに、より速い学習曲線を有した。
記憶試験において、最後の手掛りアッセイから2時間後に、プラットフォームを取り除き、マウスが、プラットフォームがどこにあるかを思い出せるかを見るためにマウスを評価した。これを行い、プラットフォームがある四角(PTf)、反対の四角における距離(Opos PTf)、右側のプラットフォームの四角(R PTf)、及び左側のプラットフォームの四角(L PTf)でマウスになされた距離を決定した。データは示さないが、全ての群(null、及びs−KL)はPTf四角を優先することができた。他方、もしテストを最後の手掛り試験(長期記憶試験)から24時間後に行えば、クロトー処理群は、対照よりも効率的にPTf四角を優先することができた(s−KL注射マウスにつきp<0.001)。グラフデータは図8に示し、そこでは、四角の各々でなされた合計距離のパーセンテージを各マウス型について示す。
再度、より老齢のマウスにおけるように、クロトー処理は記憶技量(この場合、長期記憶)を改良すると結論できた。
視覚的知覚学習、並びに空間参照学習及び記憶を、先に用いたのと同一のプロトコルに従い、モリス水迷路で評価した。場所学習仕事(PT)においては、全ての群は、プラットフォームに到着するまでの待ち時間(図8A)及びそこまで移動した距離(図8B)の漸次の低下によって反映された、仕事を学習する能力を示した。最後に、最後の訓練セッションから24時間後に行った記憶探索試験により、我々は、12月齢マウスにおける長期記憶でのs−KLの効果を評価することができた。図9Cは、s−KLを過剰発現するマウスは、訓練四分円についてより大きな能力を有することを示す(p=0.0003−対−対照及びp<0.0001−対−shRNA−sKL)。以前のように、shRNA−sKL処理動物は、訓練四分円につき最低の優先傾向、及び他の四分円につきランダムな優先傾向を示した(p<0.0001−対−対照動物)。従って、我々は、老齢の動物におけるように、s−KLレベルの上昇が、特に長期において、四分円を識別する能力を増強すると結論する。更に、s−KLの発現停止させることは動物の能力を悪化させ、それは認知機能で役割を有することが確認される。
実施例4 特異的抗体でのs−KL蛋白質アイソフォームの検出
組織試料からの蛋白質抽出物(試料当たり15から25μg)を、変性アクリルアミドゲル中に流し、次いで、PDVF膜まで電気移動させた(GE Healthcare)。膜を、5%スキムミルクを含有するTBS−T(20mM Tris−HCl pH7.5、150mM NaCl、0.2% Tween−20)でブロックし、一次K113抗体と共にインキュベートした。検出は、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合二次抗体(EZBiolab,IN,USA)及び増強されたケミルミネセンス試薬(GE Healthcare)で行った。K113抗体は1/5,000希釈で用い;KM2076抗体は1/1000希釈で用い;ポリクローナルウサギ抗−アクチン抗体(Sigma A2066,USA)は1/1,000希釈で用い;及び二次HRP−抗−Ig抗体(Dako−Cytomation,P0399,デンマーク国)は1/10,000希釈で用いた。
前記で示したように、本発明は、クロトーアイソフォーム、おそらくは、哺乳動物クロトー蛋白質のスプライシングバリアントの(mRNAとしてのみならず)蛋白質レベルでの現実の発現のマウス野生型脳組織における発明者らの判断に由来する。
この仮説は、野生型マウス組織で検出可能なクロトー蛋白質の分析に由来する。市販の抗体(KM2076、Cosmobio Japan)を用い、腎臓においては、130kDaの膜アイソフォームが存在し、他方、脳においては、70kDa(クロトー又はs−KLバリアントのKL1ドメインの近似的分子量)のそれと同様な分子量を持つアイソフォームを検出することができたに過ぎないと、ウエスタンブロットアッセイ(図9)で判断することができた。脳検出可能クロトーアイソフォームの分子量は、おそらくは、アミノ酸配列における転写後修飾のため、70KDa及び100KDaの間の分子量を有していた。図9は、全脳における、また、前頭前皮質(CPf)、皮質(Cx)、小脳(CB)、及び海馬(HC)における検出を示す。
それに加えて、平行アッセイにおいて、発明者らは、マウスs−KLに特異的な自己作成ポリクローナル抗体で、このアイソフォームが異なる脳切片に存在するかを判断した。s−KLに対する(ここではAb K113と命名する)この特異的ポリクローナル抗体を、抗原としての配列番号11(SPLTKPSVGLLLPH)の設計された免疫原性ペプチドを用い、EZBiolab company(Carmel,USA)によるウサギで生じさせた。この配列は、m−KL又はいずれのp−KLでも存在せず、該抗体がs−KLアイソフォームに特異的なのはこの理由である。
s−KL蛋白質のレベルを、そのK113抗体を用い、6月齢及び18月齢マウスの前頭前皮質(PfCX s−KL)、皮質(CX s−KL)、海馬(HC s−KL)、及び小脳(CB s−KL)において特に分析した。データは図10に示し、そこでは、ウエスタンブロット分析が、(Image Jソフトウェアを用いる)デンシトメトリーアッセイと共に、各領域について示される。図10(A)はPfCXからのデータを示し、図10(B)はCXからのデータを示し、図10(C)はHCからのデータを示し、及び図10(D)はCBからのデータを示す。
全てのこれらのデータは、脳において市販の抗体によって検出された70から100KDaの間のアイソフォームが、図10の平行アッセイにおいて発明者らのK113抗体によって特異的に検出されたもののように、s−KLだったようであると結論することを可能とする。
従って、もし脳において内因的に発現されるクロトー蛋白質のバリアントが主としてs−KLであれば、それを、神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、老化に関連する認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療で用いると、現実の利点が想定される。
まず、なぜならば、本発明の実施例2及び3のデータから、s−KL処理が非処理動物との関係で、改善技量(記憶及び挙動)を想定させることが導かれるからである。
第二に、Kurosu et al.,“Regulation of fibroblast growth factor−23 signaling by klotho”,J Biol Chem−2006,vol 281(10),pp.:6120−3から、m−KLが、FGF23の線維芽細胞成長因子受容体(FGF23R)の共受容体として作用することが知られている。この受容体はカルシウムのホメオスタシスに関与している。従って、s−KLを用いることによって、m−KLと同様な効果でもって、これは、カルシウムホメオスタシスとの何らかの干渉を回避するであろう。というのは、s−KLはFGF23Rの共受容体ではないからである。
発明者らの知識によると、これは、s−KLが野生型動物(マウス)に(この場合、遺伝子治療によって)投与された最初である。更に、この蛋白質は、アルツハイマー病(AD)等のいくつかの神経変性疾患を伴う、老化(特に、老人性認知症)に関連する認知及び行動障害を予防し、並びに/又は改善するにおいて治療的に有効であることはもっともらしいとされている。特に、記憶喪失及び不安等の記憶技量における障害を予防するにおいて治療的に効果的であり、それらの全ては、通常は、老齢の人々及びADの人々において共通する。
神経変性疾患及び神経病理学的疾患の場合には、もしあれば、付随的処置としてs−KLを提案するのは、かなり推奨できる。
実施例5;海馬においてベクターを発現するs−KL及びshRNA−sKLの投与は、s−KLの発現レベルを特異的に修飾するが、m−KLの発現レベルは修飾しない。
s−KLレベルを処理した動物の海馬において定量して、認知で観察された効果がs−KL過剰発現及び/又はs−KL阻害によって誘導されるか否かを判断した。よって、AAV/s−KL注射群におけるs−KLのmRNAレベルは、AAV−対照を注射した動物に対して7.25±2.0倍増加し(p=0.035)、他方、AAV/shRNA−sKL動物において、s−KL発現レベルは13.6±2.5倍低下した(p=0.007)(図11)。これらの変化は、分泌されたクロトーアイソフォームに特異的であった。というのは、m−KL膜貫通アイソフォームの発現は、s−KL過剰発現によっても(1.15±1.1倍 vs 対照)、又は特異的s−KLの阻害によっても(−1.24±0.27倍 vs 対照)影響されなかったからである。
統計学的解析
値は平均値±SEMとして表される。統計学的解析及び計算は、G−Statバージョン2.0及びPrism5.04プログラムを用いて行った。個々の群の間の統計学的解析は、両側独立スチューデントt−検定又は一元配置偏差ANOVA、続いて、テューキー事後検定によって行った。全ての場合において、平均の差は、p<0.05であれば、統計学的に有意と考えた。
出願で引用した文献
−Deary et al.,“Klotho genotype and cognitive ability in childhood and old age in the same individuals”,Neurosci Lett−2005,vol.378(1),pp.22−27.
−Kuro−o,et al.,Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging.Nature−1997,vol.no.390,pp.:45−51.
−Wang,Y.et al.,“Current understanding of klotho”, Ageing Res Rev−2009,vol.no.8,pp.:43−511.
−Matsumura et al.,“Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted Klotho protein”,Biochem Biophys Res Commun−1988,vol.No.242,pp.:626−630.
−Dubal et al.,“Life Extension Klotho Enhances Cognition”,Cell Reports−2014,vol.7,pp.:1065−1076.
−Dubal et al.,“Life Extension factor Klotho Prevents Mortality and Enhances Cognition in hAPP Transgenic Mice”,The Journal of Neuroscience−2015,vol.35/6,pp.:2358−2371.
−Kuang et al.,“Klotho upregulation contributes to the neuroprotection of ligustilide in an Alzheimer´s disease mouse model”,Neurobiology of Aging−2013,pp.1−10.
−Forster et al.,“Vitamin D Receptor Controls Expression of the Anti−aging Klotho Gene in Mouse and Human Renal Cells”,Biochem Biophys Res Commun.2011 October 28;414(3):557−562
−Siraki−Iida et al.,“Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding mambrane and secreted protein”,FEBS Letters−1998,vol 424,pp.:6−10.
−Imura et al.,“Secreted Klotho protein in sera and CSF:implication for post−translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane”,FEBS Letters−2001,vol 565,pp.:143−147.
−Altschul,S.F.,et al.“Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of proteina database search programs”,Nucleic Acids Research−1997,Vol.No.25,pp.:3389−3402.
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−Piedra et al.,“Development of a rapid,robust,and universal picogreen−based method to titer adeno−associated vectors”,Hum Gene Ther Methods−2015,vol26(1),pp:35−42;or doi:10.1089/hgtb.2014.120 PMID:25640021.
−Hirt B et al.,“Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures”,J Mol Biol−1967,vol 26,pp:365−369.
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Claims (16)
- 哺乳動物における神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療に使用するための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- 前記認知障害が学習及び記憶の障害からなる群から選択される、請求項1に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- 前記行動障害が不安及び広場恐怖症から選択される、請求項1に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- 前記認知及び/又は前記行動障害が老化に関連する、請求項1に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- 前記神経変性及び/又は神経病理学的疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および筋委縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、及び毛細血管拡張性運動失調症、発作後認知症、外傷後認知症、老人性認知症、及び頭蓋脳外傷からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアントまたはそれをコードする核酸配列。
- 前記神経変性及び/又は神経病理学的疾患がアルツハイマー病である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- アルツハイマー病における不安の予防及び/又は治療における使用である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- 前記スプライシングバリアントが、配列番号1、配列番号2、及び配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも88%の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドから選択されるポリペプチドである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
- 発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント(s−KL)をコードする核酸配列を含む、遺伝子構築体。
- 配列番号3の核酸配列を含む、請求項9に記載の遺伝子構築体。
- 配列番号3からなる、請求項9から10のいずれか1項に記載の遺伝子構築体。
- 請求項9〜11のいずれか一項に記載の遺伝子構築体を含む、中枢神経系向性を持つ発現ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項12に記載の発現ベクター。
- 血清型AAVrh10のアデノ−関連ウイルスである、請求項13に記載の発現ベクター。
- 1種以上の医薬上許容される賦形剤又は担体と共に、治療上有効量の、請求項9〜11のいずれか1項に記載の哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び/若しくは遺伝子構築体、並びに/又は請求項12〜14のいずれか1項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
- 神経変性及び/又は神経病理学的疾患を伴う及び/又は伴わない、認知及び/又は行動障害の予防及び/又は治療における使用のための、請求項9〜11のいずれか1項に記載の哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び/若しくは遺伝子構築体、並びに/又は請求項12〜14のいずれか1項に記載のベクターと、他の活性剤との組合せ。
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