ES2750008T3 - Células madre mesenquimatosas modificadas genéticamente que expresan klotho - Google Patents

Abstract

Célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente, en la que dicha célula madre comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una región codificante de Klotho unida operativamente a un promotor o una combinación de promotor/potenciador, en la que la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente presenta una expresión aumentada de Klotho en comparación con una célula madre mesenquimatosa no modificada.

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre mesenquimatosas modificadas genéticamente que expresan klotho

La invención se refiere a una célula madre mesenquimatosa (MSC, por sus siglas en inglés) modificada genéticamente, en la que dicha célula madre comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una región que codifica Klotho unida operativamente a un promotor o una combinación de promotor/potenciador, en la que la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente presenta una expresión aumentada de Klotho en comparación con una célula madre mesenquimatosa no modificada. La invención se refiere al uso médico de dichas MSC para el tratamiento de cáncer, fibrosis de órganos, insuficiencia renal, patologías orgánicas relacionadas con la edad, arteriesclerosis, enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer (EA), esclerosis múltiple (EM), enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson y/o esquizofrenia, o demencia, diabetes mellitus, sepsis, disfunción eréctil, enfermedades cardiovasculares y enfermedades autoinmunitarias.

Antecedentes de la invención

Las células madre mesenquimatosas (MSC) son células de origen no hematopoyético que residen en la médula ósea y otros tejidos. Las MSC habitualmente se consideran células progenitoras adultas multipotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en un número limitado de linajes celulares, tales como osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Se han realizados estudios sobre el uso de MSC como entidad terapéutica basándose en esta capacidad de diferenciarse directamente en estos fenotipos de fase final, incluyendo el uso de MSC para promover o aumentar la reparación ósea y para la reparación de defectos del cartílago (Vilquin y Rosset, Regenerative Medicine 2006: 1,4, pág. 589, y Veronesi et al., Stem Cells and Development 2013; 22, pág. 181). El aislamiento y cultivo de MSC para varias indicaciones terapéuticas se ha descrito y representa una estrategia prometedora hacia el tratamiento de trastornos asociados con inflamación (por ejemplo, documento WO 2010/119039).

Se sabe que las MSC muestran propiedades evasivas inmunitarias después de su administración a un paciente. Se ha demostrado que las MSC muestran un efecto inmunomodulador beneficioso en casos de trasplante de material donador alógeno (Le Blanc et al., Lancet 2004: 363, pág. 1439), reduciendo de este modo una alorreactividad potencialmente patógena y rechazo. Además, se sabe que las MSC muestran efectos antitumorigénicos, por ejemplo, contra sarcoma de Kaposi (Khakoo et al., J Exp Med 2006: 203, pág. 1235). El tratamiento con MSC también puede desempeñar una función terapéutica en la curación de heridas. El suministro terapéutico de MSC puede realizarse por inyección sistémica, seguida de migración dirigida de MSC a e injerto en sitios de lesión (Kidd et al., Stem Cells 2009: 27, pág. 2614). Aunque está claro que las MSC tienen un efecto regenerativo sobre tejido lesionado, su uso como vehículo de entrega para proteínas terapéuticas de interés aún no se ha explorado completamente.

El gen de Klotho humana codifica una proteína transmembrana de tipo 1 de 1012 aminoácidos, que también puede expresarse como una forma secretada por corte y empalme alternativo. Ambas formas tienen actividad biológica incluyendo efectos reguladores sobre el metabolismo general. Klotho es una p-glucuronidasa (número de EC 3.2.1.31) capaz de hidrolizar p-glucurónidos esteroideos.

La pérdida de Klotho en ratones da como resultado la aparición precoz de varios fenotipos patológicos que se asemejan al envejecimiento humano, incluyendo una esperanza de vida corta, infertilidad, arterioesclerosis/calcificación vascular, osteoporosis, atrofia de la piel, enfisema pulmonar, lesión renal aguda, enfermedad renal crónica, fibrosis renal, diabetes y cáncer (Kuro-o, M. et al. Nature 1997, 390, pág. 45). Por el contrario, se ha demostrado que la sobreexpresión de Klotho aumenta la esperanza de vida de los ratones (Kurosu, H. et al. Science 2005, 309, pág. 1829).

Klotho se detectó en 1997 por Makoto Kuro-o, quien descubrió que los ratones a los que les faltaba Klotho presentaban síndromes que se asemejaban al envejecimiento humano, incluyendo una esperanza de vida corta. Se ha demostrado que Klotho está implicada en la supresión de varios fenotipos de envejecimiento. Un defecto en la expresión del gen klotho en el ratón da como resultado infertilidad, arteriesclerosis, atrofia de la piel, osteoporosis y enfisema (Kuro-o, M., et al. (1997), Nature 390, 45-51). La proteína Klotho se expresa más altamente en el riñón, el cerebro y la hipófisis, y está presente en niveles más bajos dentro del músculo esquelético, la vejiga urinaria, el ovario y los testículos (Avin, K.G., et al. (2014), Frontiers in physiology 5, 189).

La proteína Klotho existe en dos formas: Klotho de membrana y Klotho secretada. Klotho de membrana funciona como un receptor para una hormona que regula la excreción de fosfato y la síntesis de vitamina D activa en el riñón. Klotho secretada funciona como un factor humoral con actividades pleotrópicas, incluyendo la supresión de la señalización del factor de crecimiento, la supresión del estrés oxidativo y la regulación de los canales iónicos y los transportadores.

FGF23, un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) se identificó como elevado en pacientes con raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (RHAD). De este modo, el FGF23 funciona como una hormona fosfatúrica y una hormona contrarreguladora de la vitamina D (calcitriol) de una manera dependiente de Klotho. La hiperfosfatemia conduce a estenosis de los vasos sanguíneos, infarto de miocardio, ictus y un acortamiento importante en la esperanza de vida en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC). La ausencia de señalización de FGF en el riñón da como resultado un aumento de los niveles séricos de fosfato. Se ha descubierto que la forma de Klotho secretada y la unida a la membrana forman un complejo junto con el receptor de FGF y, por tanto, aumenta la señalización dependiente de FGF23 (Kurosu et al. Journal of Biological 2006), 281 (10) págs. 6120-61). La función de Klotho como cofactor para la señalización de FGF23 es importante para la regulación de los niveles séricos de fosfato.

Además, Klotho actúa a través de la modulación de diversas vías de señalización, incluyendo la del factor de crecimiento de insulina 1 (IGF-1). Un efecto de Klotho es el aumento de la resistencia celular al estrés oxidativo, que está implicado en muchos procesos patológicos diferentes. Se ha demostrado que a través de la modulación de la respuesta celular al estrés oxidativo, Klotho también actúa de manera protectora en el contexto de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer (Zeldich, E. et al. J Biol Chem 2014, 289 (35): 24700) y diabetes mellitus (Lin, Y. et al. Diabetes 2014, DB140632). También se ha sugerido que Klotho es un represor de la síntesis de colágeno y, por tanto, podría ser beneficiosa en el contexto de la fibrosis (Ghosh, A.K. et al. Exp Biol Med 2013, 238 (5): 461).

Se ha demostrado que la expresión de Klotho está silenciada en varios tipos de células cancerosas, lo que se asocia a un crecimiento celular potenciado y a la formación de metástasis de cáncer (Camilli et al. Pigment Cell Melanoma Res 2011, 24 (1), pág. 75; Wang et al, Am J Cancer Res 2011, 1 (1): 111, Lee et al, Molecular Cancer 2010, 9: 109). Por el contrario, la sobreexpresión de Klotho en células cancerosas puede inhibir el crecimiento celular y puede promover la apoptosis de las células cancerosas (Chen, B. et al. J de Exp y Clin Cancer Res 2010, 29: 99). Además, la regulación positiva de Klotho estimulada indirectamente mediante la administración de inhibidores del sistema renina-angiotensina u otros compuestos puede conducir a la supresión de la fibrosis renal (Ming Chang Hu et al, Contrib Nephrol 2013, 180: 47) y parece haber una correlación entre la expresión de Klotho baja en modelos de ratas diabéticas (Meng Fu Cheng et al, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010, 513853).

Antecedentes de la enfermedad renal crónica (ERC):

La ERC es un problema sanitario internacional creciente, que afecta a más de 26 millones de estadounidenses. En pacientes con ERC el ARN de Klotho renal está disminuido. Esta observación clínica se confirmó en numerosos modelos preclínicos, que muestran que la nefrectomía unilateral y la lesión por isquemia-reperfusión contralateral regulan negativamente la proteína klotho renal y la expresión de ARNm. La misma reducción en la expresión de klotho se mostró en un modelo de glomerulonefritis crónica. La sobreexpresión de Klotho mejoró la función renal y mejoró la histología renal en este modelo (Hu, M.C., et al. (2011), Journal of the American Society of Nephrology: 22, 124-136, Haruna, Y., et al. (2007) PNAS, 104, 2331-2336).

En los pacientes con ERC, existe una muy alta prevalencia de calcificación de la arteria coronaria, lo que aumenta la morbilidad y mortalidad cardiovasculares. El eje klotho FGF 23 desempeña una función importante en la mineralización vascular (Stompor, T. (2014) World journal of cardiology 6, 115-129). El aumento de la morbilidad y mortalidad cardiovasculares (CV) está bien documentado en la enfermedad renal crónica (ERC). En una encuesta entre 1.120.295 adultos en el área de la Bahía de San Francisco, se descubrió una fuerte correlación entre la función renal (tasa de filtración glomerular estimada, TFG) y los eventos cardiovasculares (Go, A.S., et al. (2004) The New England journal of medicine 351, 1296-1305).

En el Estudio de ERC del Instituto de Investigación Renal (IRR) de adultos con ERC moderada a grave (Etapas 3-5), inscritos entre junio de 2000 y febrero de 2006 (n = 834), los autores descubrieron que la variabilidad de la frecuencia cardíaca es predictiva para el resultado clínico y la enfermedad cardiovascular (ECV) (Chandra, P., et al. (2012) publicación oficial de la Asociación Europea de Diálisis y Trasplante - Asociación Renal Europea 27, 700-709). La enfermedad renal crónica (ERC) es, por tanto, un factor de riesgo importante para la enfermedad cardiovascular que conduce a una mayor morbilidad y un acortamiento de la esperanza de vida. La expresión de Klotho se reduce notablemente en los riñones de pacientes que padecen ERC. Restablecer la expresión de Klotho por infusión de MSC-Klotho puede mejorar la función renal y, por tanto, reducir el riesgo de muerte cardiovascular.

Antecedentes de la enfermedad cardiovascular:

La enfermedad cardiovascular (ECV) es una afección prevalente en la población general y la primera causa de muerte en general. Se ha propuesto Klotho como un regulador clave del desarrollo de ECV. En los pocos estudios clínicos realizados, se ha observado una relación entre los niveles bajos de Klotho soluble y la aparición y la gravedad de la ECV, así como una reducción del riesgo cardiovascular cuando son altos. Además, se han relacionado diferentes polimorfismos del gen de Klotho humana con la incidencia de eventos cardiovasculares. Además, varios estudios experimentales indican que esta proteína actúa en el mantenimiento de la homeostasis vascular (Yamamoto M. et al., J Biol Chem. 2005; 280: 38029-38034). Klotho mejora la disfunción endotelial a través de la promoción de la producción de NO y media efectos antiinflamatorios y antienvejecimiento, tales como la supresión de la expresión de moléculas de adhesión, la atenuación del factor nuclear-kappa B o la inhibición de la señalización de Wnt. Klotho regula los niveles de expresión de la NO sintasa endotelial (eNOS). Six et al observaron recientemente que la atenuación mediada por Klotho de FGF23 o la vasoconstricción inducida por fosfato se suprimen mediante la adición de nitro-L-arginina, un inhibidor competitivo de NOS. Además, observaron que la exposición de HUVEC a Klotho aumentó la producción de NO e indujo la fosforilación de eNOS y la expresión de iNOS. Curiosamente, Klotho fue capaz de aumentar la producción de H²O² en VSMC humanas cultivadas (HVSMC), lo que sugiere un efecto más complejo de esta proteína sobre la regulación del tono vascular a través de la mediación de un equilibrio ROS/NO (Six I et al. (2014), PLoS One. 2014; 9: e93423.).

Además, esta proteína se relaciona con la atenuación de la calcificación vascular y con la prevención de la hipertrofia cardíaca. La expresión de esta proteína en la pared vascular implica un nuevo escenario para el tratamiento de los trastornos vasculares. Por tanto, la proteína Klotho se relaciona con la ECV y desempeña una función en el mantenimiento de la integridad vascular funcional (Martin-Núñez, M. (2014) World J Cardiol. 6(12): 1262-1269.).

Antecedentes de la enfermedad de Alzheimer (AD):

Las enfermedades neurodegenerativas, especialmente la enfermedad de Alzheimer (EA), están aumentando en el mundo occidental. La asociación de la enfermedad de Alzheimer estima que en los EE.UU. la enfermedad de Alzheimer es la 6a causa de muerte en importancia, que cada 67 segundos a una persona se le diagnostica la enfermedad de Alzheimer y que el coste del tratamiento médico y el cuidado de estos pacientes superará los 1,1 billones de dólares en 2050. La EA se caracteriza a través de la pérdida de neuronas y sinapsis, pero también a través de la generación de péptidos beta amiloides neurotóxicos (placas Ap) y su depósito junto con la formación de ovillos neurofibrilares. Cada vez hay más pruebas de que el depósito de amiloide es el indicio principal de la enfermedad. Los astrocitos activados inician una reacción inflamatoria produciendo citocinas proinflamatorias como Il-6, Il-1 y TNF-a. Todo esto comienza con una reacción inadecuada al estrés oxidativo, la acumulación de radicales libres de oxígeno, la hiperglucemia y la resistencia a la insulina (Rosales-Corral, S., et al. (2015) Oxidative medicine and cellularlongevity, 985845).

Recientemente se demostró que en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EA, la concentración de la proteína antienvejecimiento klotho es significativamente menor que en pacientes más jóvenes o en pacientes de edad avanzada sin EA (Semba, R.D., et al. (2014) Neuroscience letters 558, 37-40).

En el cerebro, proteína Klotho se localiza en el plexo coroideo, donde la proteína se localiza predominantemente en la membrana plasmática apical de los ependimocitos. En el cerebro de ratón kl-/-, la reducción de las sinapsis fue evidente en el hipocampo, lo que sugiere una función de Klotho como factor humoral en el líquido cefalorraquídeo. La proteína Klotho en el riñón se localiza en los túbulos renales distales (Li SA, et al. (2004) Cell Structure and Function 29, 91-99).

Chen et al demostraron que la pérdida de la expresión de Klotho conduce a déficits cognitivos. Descubrieron efectos significativos de Klotho sobre las funciones de los oligodendrocitos, incluyendo la maduración inducida de células progenitoras oligodendrocíticas (OPC) primarias de rata in vitro y mielinización. Klotho aumentó la maduración de OPC. Estudios in vivo de ratones con el gen de Klotho inactivado y compañeros de camada de control revelaron que los ratones con el gen inactivado tienen una reducción significativa en la proteína principal de la mielina y la expresión génica. Mediante inmunohistoquímica, el número de oligodendrocitos totales y maduros fue significativamente menor en ratones con el gen de Klotho inactivado. Al nivel ultraestructural, los ratones con el gen inactivado presentaron una mielinización significativamente alterada del nervio óptico y el cuerpo calloso (Chen, C.D., et al. (2013) The Journal of Neuroscience 33, 1927-1939).

Antecedentes de la esclerosis múltiple (EM):

La EM es una enfermedad compleja del SNC que se caracteriza por patologías heterogéneas compuestas de componentes tanto inflamatorios como neurodegenerativos. La característica histopatológica más común en las etapas precoces de la enfermedad incluye episodios intermitentes de inflamación aguda dentro de parches de materia blanca, dando como resultado desmielinización. La mielina es crítica para mantener una conducción axónica eficiente y los oligodendrocitos, el productor de mielina y el mantenedor de la salud axónica dentro del SNC, están dañados o destruidos en pacientes con EM. Se ha descubierto que las células precursoras de oligodendrocitos endógenos (OPC) se dispersan universalmente dentro del SNC humano y pueden encontrarse en alta densidad dentro de algunas lesiones subagudas durante las primeras etapas de la EM.

La EM progresiva es la última etapa de la enfermedad, caracterizada por un empeoramiento gradual de los síntomas sin remisión. Las alteraciones neurológicas graves reducen drásticamente la calidad de vida del individuo y esto se atribuye principalmente a la expansión de las lesiones corticales que afectan la función motora. Patológicamente, existe una degeneración axónica generalizada y neuropatía de la materia gris. Se ha informado una inflamación difusa de la materia blanca y gris, que se correlaciona, en parte, con la activación microglial global, así como con la presencia de linfocitos T, células B y macrófagos cargados de mielina. Además, hay una insuficiencia general de las OPC para remielinizar eficientemente las áreas dañadas de materia blanca y gris, reduciendo drásticamente la posibilidad de recuperación (Chang, A., et al. (2002) The New England journal of medicine 346, 165-173). Klotho potencia la maduración de las OPC en oligodendrocitos maduros (Chen, C.D., et al. (2013) The Journal of Neuroscience 33, 1927­ 1939).

Antecedentes de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA):

La ELA es una enfermedad neurodegenerativa de las neuronas motoras sin tratamiento eficaz. La señalización de Wnt desempeña una función importante en el desarrollo y la función del sistema nervioso, incluyendo la guía del axón, la formación de sinapsis y la plasticidad, y también se ha asociado a enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la ELA. La degeneración axónica es una etapa importante en la progresión de la enfermedad.

Los mecanismos subyacentes a la muerte de las neuronas motoras y la degeneración axónica en la ELA siguen siendo esquivos. Tury et al descubrieron que dos componentes de señalización de Wnt no canónicos, aPKC y Ryk, que son importantes reguladores del crecimiento y la plasticidad del axón tanto en embriones en desarrollo como en el sistema nervioso adulto, estaban claramente regulados positivamente en la médula espinal de ratones SOD1 (G93A), proporcionando pruebas de que la señalización de Wnt está alterada en la ELA y podría estar implicada en la etiología y la patogenia de la enfermedad (Tury, A., et al. (2014) Developmental neurobiology 74, 839-850). Un estudio de coinmunoprecipitación indicó que la klotho soluble se une a diversos miembros de la familia de Wnt, incluyendo Wnt1, Wnt3, Wnt4 y Wnt5a, suprime la transcripción de Wnt e inhibe la actividad biológica de Wnt en la piel. Una sobreexpresión de klotho antagoniza eficazmente la actividad de Wnt endógena y exógena, lo que induce una senescencia celular acelerada tanto in vitro como in vivo (Liu, H., et al. (2007) Science 317, 803-806).

Antecedentes de la enfermedad de Parkinson (EP):

La EP es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado clínicamente por los síntomas cardinales de temblor en reposo, bradicinesia, rigidez en rueda dentada e inestabilidad postural. La capacidad de respuesta a la L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) y las imágenes del cerebro distinguen la EP de otros trastornos. Los indicios patológicos de la EP son la pérdida de células dopaminérgicas en la parte compacta de la sustancia negra y la consiguiente pérdida de inervación de dopamina en el cuerpo estriado. Los síntomas motores son la consecuencia más obvia de esta neurodegeneración nigroestriatal. Sin embargo, no solo se ven afectados los ganglios basales sino también otras partes del sistema nervioso central, así como del sistema nervioso autónomo. Una amplia gama de síntomas no motores resultantes puede afectar a la calidad de vida del paciente. También existe un amplio consenso de que los procesos neurodegenerativos en la EP comienzan muchos años antes de la aparición real de los síntomas clínicos. El solapamiento fenotípico entre la EP familiar e idiopática es suficiente para diseccionar las vías habitualmente implicadas. Estas incluyen disfunción mitocondrial, estrés oxidativo, plegamiento erróneo de proteínas, degradación de proteínas, agregación de proteínas e inflamación.

Kosakai et al demostraron que el número de neuronas dopaminérgicas positivas para tirosina-hidroxilasa en la parte compacta de la sustancia negra y el área tegmentaria ventral y el nivel de dopamina estriatal en ratones con insuficiencia de klotho disminuyeron significativamente en función de la edad. Estas características fenotípicas fueron completamente rescatadas por la restricción de la vitamina D, lo que indica que el aumento anormal de la biosíntesis de vitamina D activa por la insuficiencia de Klotho induce la degeneración de neuronas dopaminérgicas (Kosakai, A., et al. (2011) Brain research 1382, 109-117).

Debido a sus diversos roles funcionales en sistemas de múltiples órganos y su posible efecto beneficioso en diversas enfermedades, los nuevos tratamientos que incorporan la administración de Klotho pueden representar enfoques terapéuticos prometedores. Hasta la actualidad, la administración terapéutica de Klotho permanece en gran parte sin explorar. Las pautas posológicas terapéuticas eficaces, especialmente aquellas que permiten la administración local o la expresión local de Klotho en nichos fisiológicos afectados por la enfermedad, o métodos para proporcionar la expresión continua de la proteína Klotho in vivo, no se han descrito en la técnica.

Sumario de la invención

A la luz de la técnica anterior, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar medios alternativos y/o mejorados para el tratamiento de enfermedades, en particular cáncer, fibrosis de órganos, insuficiencia renal, patologías orgánicas relacionadas con la edad, arteriesclerosis, demencia, enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer (EA), esclerosis múltiple (EM), enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson y/o esquizofrenia, diabetes mellitus, sepsis, disfunción eréctil o enfermedades autoinmunitarias.

Este problema se resuelve por las características de las reivindicaciones independientes. Se proporcionan realizaciones preferidas de la presente invención por las reivindicaciones dependientes.

Por tanto, la invención se refiere a una célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente, en la que dicha célula madre comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una región codificante de Klotho unida operativamente a un promotor o una combinación de promotor/potenciador, en la que la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente presenta una expresión aumentada de Klotho en comparación con una célula madre mesenquimatosa no modificada. Dichas MSC pueden denominarse "MSC modificadas con Klotho" o "MSC-Klotho". Una región codificante de Klotho se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier proteína Klotho dada, abarcando pero sin limitación las variantes de proteína Klotho que se describen en el presente documento.

Una secuencia de aminoácidos preferida de Klotho está disponible con el número de acceso BAA23382 de la base de datos NCBI. Dicha secuencia de aminoácidos corresponde a la isoforma a-Klotho. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes que codifican Klotho pueden ser proporcionadas por un experto en la materia de la biología molecular o la genética. La presente invención también abarca el uso de variantes de secuencia de Klotho que presentan una analogía funcional con la forma humana no modificada.

Además, la invención también se refiere a isoformas adicionales del gen Klotho y abarca p-Klotho y Y-Klotho.

Las secuencias preferidas de la invención se relacionan con las que se proporcionan a continuación en la Tabla 1. La SEQ ID NO 1 se relaciona con una secuencia del gen de Klotho humana completo (ADNc) con la secuencia de origen natural.

La SEQ ID NO 2 se relaciona con una secuencia con codones optimizados (para la traducción en células humanas) del gen de Klotho humana completo (ADNc), como el más preferido de acuerdo con la presente invención. La secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO 1 y la SEQ ID NO 2 son idénticas. La SEQ ID NO 3 se relaciona con una secuencia de la forma soluble del gen de Klotho (ADNc) con la secuencia de origen natural.

La SEQ ID NO 4 se relaciona con una secuencia del gen de p-Klotho humana (ADNc) con la secuencia de origen natural.

La SEQ ID NO 5 se relaciona con una secuencia del gen de Y-Klotho humana (ADNc) con la secuencia de origen natural.

En el presente documento se incorporan variantes de secuencia adicionales en la invención que presentan una secuencia de ácido nucleico alternativa a la SEQ ID NO 1-5 pero codifican la misma secuencia de aminoácidos o una correspondiente o funcionalmente análoga. Se incluyen variantes de secuencia obtenidas a través del uso de la degeneración del código genético. Las secuencias de ácido nucleico de secuencia optimizada de esas secuencias proporcionadas en el presente documento también se incluyen dentro del alcance de la invención.

Tabla 1: Secuencias de Klotho preferidas.

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Por tanto, la invención abarca una MSC modificada como se describe en el presente documento que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Klotho, preferentemente de acuerdo con una secuencia de proteína de la SEQ ID NO 6 a 10, por lo que la secuencia de nucleótidos es preferentemente una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 o 5;

b) una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con a); c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene suficiente identidad de secuencia para que sea funcionalmente análoga/equivalente a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b), que comprende preferentemente una identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b) de al menos un 70 %, un 80 %, preferentemente un 90 %, más preferentemente un 95 %;

d) una molécula de ácido nucleico que, como consecuencia del código, está degenerada en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) a c); y/o

e) una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una secuencia de nucleótidos de a) a d) que está modificada por eliminaciones, adiciones, sustituciones, translocaciones, inversiones y/o inserciones y funcionalmente análoga/equivalente a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) a d).

Las secuencias funcionalmente análogas se refieren a la capacidad de codificar un producto del gen de klotho funcional. Las secuencias funcionalmente análogas se refieren a la capacidad de codificar un producto del gen de Klotho funcional y permitir el efecto funcional igual o similar al de la Klotho humana. La función de Klotho puede determinarse por su actividad p-glucuronidasa o a través de los efectos funcionales que se describen en los ejemplos a continuación. Un experto en la materia conoce los ensayos adecuados para determinar la actividad de pglucuronidasa o para someter a ensayo los efectos funcionales biológicos deseados que se describen en el presente documento y como se muestran en los ejemplos.

Para medir la p-glucuronidasa de Klotho, la proteína recombinante se somete a una reacción in vitro. En esta reacción, el sustrato marcado con fluorescencia glucurónido es hidrolizado por la proteína Klotho. El tampón de reacción contiene 4-metilumbeliferilo (4Mu)-D-glucurónido 0,5 mM (Sigma), tampón de citrato de sodio 0,1 M, pH 5,5, NaCl 0,05 M, Tween 20 al 0,01 % y 20 |jg de proteína Klotho secretada purificada. La reacción se realiza en un volumen final de 100 jl. La función enzimática de Klotho se correlaciona con un aumento en la intensidad de fluorescencia que se mide en varios puntos temporales con un contador ARVOsx (PerkinElmer Life Sciences) de marcadores múltiples a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 470 nm. Los productos hidrolizados se cuantifican en base a la fluorescencia de 4-metilumbeliferona.

La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las SEQ ID NO 1 a 5 codifica una proteína Klotho humana de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 6 a 10, que se prefieren en la presente invención:

T l 2: n i Kl h r f ri .

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Modificaciones de proteína de la proteína klotho, que pueden producirse mediante sustituciones en la secuencia de aminoácidos, y secuencias de ácido nucleico que codifican dichas moléculas, dentro del alcance de la invención. Las sustituciones como se definen en el presente documento son modificaciones hechas a la secuencia de aminoácidos de la proteína, por las que uno o más aminoácidos se remplazan con el mismo número de aminoácidos (diferentes), produciendo una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos diferente a la proteína primaria. La sustitución puede no alterar significativamente la función de la proteína. Como las adiciones, las sustituciones pueden ser naturales o artificiales. Es bien sabido en la técnica que las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse sin alterar significativamente la función de la proteína. Esto es particularmente cierto cuando la modificación se refiere a una sustitución de aminoácido "conservativa", que es la sustitución de un aminoácido por otro de propiedades similares. Dichos aminoácidos "conservados" pueden ser aminoácidos naturales o sintéticos que, a causa del tamaño, carga, polaridad y conformación, pueden sustituirse sin afectar significativamente a la estructura y función de la proteína. Con frecuencia, muchos aminoácidos pueden sustituirse por aminoácidos conservativos sin afectar de forma perjudicial a la función de la proteína. En general, los aminoácidos no polares Gly, Ala, Val, Ile y Leu; los aminoácidos aromáticos no polares Phe, Trp y Tyr; los aminoácidos polares neutros Ser, Thr, Cys, Gln, Asn y Met; los aminoácidos con carga positiva Lys, Arg e His; los aminoácidos cargados negativamente Asp y Glu, representan grupos de aminoácidos conservativos. Esta lista no es exhaustiva. Por ejemplo, es bien sabido que Ala, Gly, Ser y a veces Cys pueden sustituirse entre sí aunque pertenecen a grupos diferentes.

En una realización, la célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicha célula se obtiene de médula ósea, cordón umbilical, tejido adiposo o líquido amniótico.

En una realización, la célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicha célula es CD34-negativa.

En una realización, la célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicha célula es una célula humana.

Debido a su capacidad para migrar a áreas de enfermedad, en áreas de inflamación particulares, las MSC representan sorprendentemente una herramienta adecuada para la entrega de Klotho como agente terapéutico. Sin quedar ligados a teoría alguna, las MSC de la presente invención representan una herramienta o vehículo de entrega de fármacos para la entrega eficaz de un agente terapéutico al sitio de la enfermedad. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el agente terapéutico es la proteína Klotho expresada a partir de un ácido nucleico exógeno en dichas MSC.

Por tanto, las células de la presente invención permiten efectos terapéuticos beneficiosos y sorprendentes. Sorprendentemente, la administración de las MSC que se describen en el presente documento conduce a una migración eficaz al sitio de la enfermedad después de la infección sistémica, preferentemente intravenosa, de las células. Las MSC son capaces de migrar e injertarse potencialmente en áreas de tejido enfermo, incluyendo tumores y otros tejidos inflamados. Las propias MSC proporcionan una señal antiinflamatoria beneficiosa para las patologías incluidas en la invención, además del efecto local potenciado de Klotho a partir de la expresión del transgén presente en las MSC modificadas con Klotho.

La combinación de MSC que presentan una expresión aumentada de Klotho (en comparación con las MSC no modificadas) con el tratamiento de un cáncer, fibrosis de órganos, insuficiencia renal, cambios de relacionados con la edad de los órganos o los sistemas de órganos, arteriesclerosis, demencia, diabetes mellitus, enfermedad neurodegenerativa y enfermedades autoinmunitarias y enfermedades relacionadas con la autoinmunidad muestra una sinergia inesperada. La migración dirigida MSC a áreas de tejido enfermo, además de las propiedades antiinflamatorias de las propias MSC y el efecto terapéutico del transgén de Klotho proporciona un efecto terapéutico sinérgico superior a la suma de cada efecto individual cuando se considera de forma aislada.

Por tanto, las MSC modificadas con Klotho evitan y/o minimizan los posibles efectos secundarios debido a la administración sistémica de la proteína Klotho o los vectores de ácido nucleico que codifican Klotho. El uso de MSC como vehículos para la administración de Klotho proporciona la producción local de Klotho en regiones enfermas del cuerpo debido a las capacidades de migración dirigida de MSC hacia el tejido inflamado.

Además, se sabe que las MSC presentan efectos inmunomoduladores beneficiosos en sujetos y en particular en sujetos que padecen enfermedades inflamatorias y/o una respuesta inmunitaria no deseada. Fue particularmente sorprendente que las MSC modificadas genéticamente mantuviesen las propiedades inmunomoduladoras beneficiosas de las MSC. Un experto en la materia no podría haber sospechado esto, en cambio, se habría esperado que la expresión de Klotho, especialmente en cantidades terapéuticamente eficaces, interfiriese con las propiedades inmunomoduladoras de las MSC. Sin embargo, las Klotho-MSC mantienen una función moduladora beneficiosa, en particular en las células inmunitarias del sujeto. Por tanto, las Klotho-MSC son sorprendentemente eficaces para el tratamiento de enfermedades asociadas a inflamación y/o respuesta inmunitaria no deseada. La expresión de la Klotho terapéuticamente eficaz junto con las propiedades inmunomoduladoras de las Klotho-MSC producen un efecto terapéutico sinérgico superior a la suma de los efectos individuales de ambos agentes terapéuticos cuando se consideran por separado.

Además, las MSC modificadas con Klotho producen efectos terapéuticos sorprendentes debido a una producción continua de Klotho. Después de la administración, las MSC modificadas con Klotho pueden actuar como una biobomba o una fábrica de fármacos que proporciona continuamente proteína Klotho al sujeto. De este modo, la cantidad de Klotho puede mantenerse a nivel terapéutico durante períodos de tiempo largos. Como se indica en el presente documento, las capacidades de localización de Klotho-MSC conducen ventajosamente a una expresión localizada de Klotho en regiones enfermas. Sin embargo, la Klotho expresada también puede ser transportada por el sistema vascular por todo el cuerpo del sujeto. Las Klotho-MSC administradas, por tanto, también contribuyen de manera sistémica en gran medida, independientemente de la ubicación de las MSC dentro del cuerpo del sujeto. La producción continua de Klotho por las Klotho-MSC es particularmente ventajosa ya que la proteína Klotho puede sufrir degradación. Por tanto, una administración sistemática directa de la proteína Klotho a un sujeto tendría que realizarse repetidamente a intervalos cortos para mantener niveles terapéuticos suficientes. Es sorprendente que las MSC modificadas genéticamente puedan superar este obstáculo mediante una expresión continua de Klotho durante períodos de más de 7 o más de 10 días, e incluso de más de 30 días. Al actuar como una biobomba, la MSC-Klotho llega a niveles estables de Klotho dentro de un sujeto durante más de 1 semana e incluso más de 1 mes.

Los niveles estables particulares de Klotho terapéuticamente eficaz son resultado de la expresión de Klotho bajo el control de un promotor constitutivamente activo. Para este fin, el promotor EFS, PGK y/o CMV ha demostrado ser particularmente adecuado y permite una expresión prolongada a niveles elevados.

Además, las MSC que expresan Klotho demostraron ser muy eficientes en la entrega de la proteína terapéutica al sistema vascular de un paciente. Por medio del sistema vascular, las proteínas Klotho se transportan por todo el cuerpo del sujeto. Ventajosamente, por tanto, pueden establecerse niveles terapéuticos de Klotho en diferentes órganos, tales como el hígado, los riñones y/o los pulmones, que pueden verse afectados por una enfermedad. La administración de KIotho-MSC también es eficaz para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que afectan al cerebro. Este es incluso el caso si las Klotho-MSC no se han introducido ni migrado hacia las regiones cerebrales afectadas. Por tanto, se sospecha que Klotho puede atravesar ventajosamente la barrera hematoencefálica. Los expertos en la materia conocen métodos para la modificación genética de MSC. Se divulgan ejemplos de métodos adecuados para modificación genética de MSC en el documento WO 2010/119039 y el documento Wo 2008/150368.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza por que el ácido nucleico exógeno comprende un vector vírico, por ejemplo, en forma de una construcción de expresión vírica, más preferentemente un vector retrovírico.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificadas genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza por que el ácido nucleico exógeno es o comprende una construcción de expresión no vírica.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza por que el promotor o combinación de promotor/potenciador es un promotor constitutivo. En otra realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor o la combinación promotor/potenciador es el promotor CMV o EF2.

En una realización preferida, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor constitutivo es el promotor EFS.

En una realización preferida, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor constitutivo es el promotor PGK.

En una realización preferida, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor constitutivo es el promotor EFlalpha.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicho promotor o combinación de promotor/potenciador es un promotor inducible.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor es inducible tras la diferenciación de dicha célula después de la administración.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor es un promotor específico de inflamación, preferentemente en la que dicho promotor se induce por mediadores inflamatorios o citocinas y/o se induce cuando la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente entra en proximidad al tejido inflamado.

Las formas inducibles del promotor se diseñan para presentar expresión específica de inflamación y/o localizada de la proteína Klotho. En combinación con las propiedades de migración dirigida y/o de migración de las MSC, se consigue un efecto sinérgico, de modo que se expresa o produce muy poca proteína Klotho en zonas del organismo del sujeto distintas del tejido u órgano enfermo.

En otras realizaciones, la expresión de Klotho se produce en MSC administradas en una ubicación distinta del sitio de la enfermedad y la proteína se transporta a través del sistema vascular al área de la enfermedad dentro del paciente.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor es el promotor Tie2.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor es el promotor RANTES.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque el promotor es el promotor HSP70.

Fue sorprendente, a la luz de la técnica anterior, que la expresión de los promotores inducibles mencionados en el presente documento condujera a una expresión suficiente de la proteína terapéutica Klotho tras un estímulo apropiado en el sitio de inflamación. Los promotores proporcionados en el presente documento muestran propiedades inducibles adecuadas para una expresión rápida y fuerte de Klotho tras entrar en proximidad con tejido inflamado.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicha célula comprende adicionalmente (iii) un gen marcador de selección unido operativamente a (iv) un promotor constitutivo o una combinación de promotor/potenciador.

En una realización, la célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque la región codificante de Klotho codifica una proteína que comprende o que consiste en una secuencia de acuerdo con una de las SEQ ID NO 6 a 10, en la que la región codificante de Klotho preferentemente comprende o consiste en una secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO 1 a 5.

En otras realizaciones, la región codificante de Klotho codifica una proteína que comprende o que consiste en una secuencia de acuerdo con una de las SEQ ID NO 6 a 10, o una secuencia de al menos un 70 % de identidad de secuencia, o al menos un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia, con una de las SEQ ID NO 6 a 10,

En una realización, la célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque la región codificante de Klotho codifica una forma secretada de la proteína Klotho. Ventajosamente, la forma secretada de Klotho es particularmente eficaz terapéuticamente cuando se expresa mediante células madre mesenquimatosas.

En una realización, la célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento se caracteriza porque la forma secretada de la proteína Klotho comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 % o al menos un 95 % con la SEQ ID NO 8. Se prefiere en particular que la proteína Klotho secretada tenga una secuencia establecida por la SEQ ID No 8 o sea funcionalmente análoga a una proteína con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 8.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento para su uso como medicamento.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicha célula se administra introduciendo un número terapéuticamente eficaz de células en el torrente sanguíneo de un paciente.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza por introducir un número terapéuticamente eficaz de dichas células por vía subcutánea. Adicionalmente, puede preferirse para este fin que las MSC-Klotho estén encapsuladas por una matriz biocompatible y se trasplanten junto con la matriz, preferentemente por vía subcutánea. En una realización la invención se refiere a la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento para su uso en aplicaciones cosméticas o cirugía plástica, por ejemplo, mediante la introducción de un número eficaz de dichas células por vía subcutánea o por vía intradérmica para mejorar la tersura o la blancura de la piel (reducción de arrugas).

En una realización de la invención, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento tiene por objeto su uso en aplicaciones cosméticas o cirugía plástica, tal como mediante la introducción de un número eficaz de dichas células por vía subcutánea o por vía intradérmica para aumentar el volumen de la piel (reducción de arrugas).

En una realización de la invención, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento tiene por objeto su uso para tratar la pérdida de cabello mediante la introducción de un número eficaz de células MSC-Klotho por vía subcutánea o por vía intradérmica.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza por introducir un número terapéuticamente eficaz de dichas células a un sujeto dentro de una matriz biocompatible.

Son materiales preferidos para la matriz biocompatible agarosa, carragenano, alginato, quitosano, goma gellan, ácido hialurónico, colágeno, celulosa y sus derivados, gelatina, elastina, resina epoxi, resinas foto reticulables, poliacrilamida, poliéster, poliestireno y poliuretano o polietilenglicol (PEG). Se prefiere adicionalmente que la matriz biocompatible sea una matriz de hidrogel semipermeable y las Klotho-MSC estén atrapadas por dicha matriz. Ventajosamente, la matriz biocompatible permite una difusión eficiente de nutrientes, oxígenos y otras biomoléculas para garantizar una viabilidad duradera de las Klotho-MSC, inmovilizando al mismo tiempo las células. De este modo, las Klotho-MSC pueden concentrarse en ubicaciones preferidas dentro del sujeto. Por ejemplo, las Klotho-MSC pueden trasplantarse por vía subcutánea y/o en la proximidad de regiones enfermas del sujeto, es decir, el riñón para el tratamiento de enfermedades renales. Es sorprendente que mediante la introducción de Klotho-MSC encapsuladas, las células funcionan de manera particularmente eficiente como biobombas y proporcionan un alto nivel de Klotho terapéutica al sujeto. En primer lugar, la matriz biocompatible permite la liberación de Klotho. En segundo lugar, la concentración elevada de Klotho-MSC dentro de la microencapsulación promueve un mecanismo de retroalimentación que da como resultado la producción aumentada de Klotho en comparación con las Klotho-MSC que migran individualmente. Por tanto, la administración de Klotho-MSC microencapsuladas constituye un tratamiento beneficioso particular de enfermedades que se benefician de niveles elevados estables de Klotho.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la célula se administra por vía intratecal. Para este fin, se prefiere que se introduzca un número terapéuticamente eficaz de Klotho-MSC en el canal espinal, preferentemente en el espacio subaracnoideo del sujeto. De este modo, las Klotho-MSC son capaces de alcanzar el líquido cefalorraquídeo. Las Klotho-MSC administradas por vía intratecal presentan una viabilidad sorprendentemente alta y permiten una provisión continua particular de proteína Klotho terapéuticamente eficaz a la región cerebral de un sujeto. Por tanto, se prefiere que las Klotho-MSC se administren por vía intratecal para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Mucho más preferentemente, las Klotho-MSC se administran por vía intratecal para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer (EA), esclerosis múltiple (EM), enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson y/o esquizofrenia.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque se administra al menos una vez al mes, preferentemente al menos una vez a la semana. La administración de Klotho-MSC con la periodicidad preferida demostró ser adecuada para mantener niveles terapéuticamente eficaces de Klotho durante todo el tratamiento del sujeto.

La administración aislada o repetida puede conducir a efectos beneficiosos, por lo que se prefiere la administración prolongada o continua, por ejemplo, una administración a largo plazo. Un ejemplo de dicha aplicación a largo plazo es que las MSC se administran al paciente en múltiples eventos, por ejemplo, una vez a la semana o una vez al mes, durante al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos once meses, al menos un año, al menos dos años o al menos tres años, o de forma duradera. La administración puede, por ejemplo, realizarse una vez al día, una vez a la semana, una vez cada 7 a 14, o de 7 a 21 días, o una vez al mes o una vez cada dos meses, durante un período de tiempo como se ha mencionado anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento para su uso como medicamento en el tratamiento de una enfermedad.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza por que la enfermedad es cáncer.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es fibrosis de órganos.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es insuficiencia renal.

En un aspecto, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad se asocia a o es provocada por un cambio relacionado con la edad en la fisiología o función de un órgano o sistema de órganos.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es o se asocia a arteriesclerosis.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es demencia.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es diabetes mellitus.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad es una enfermedad pulmonar.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento para su uso como medicamento en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

En realizaciones adicionales, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad inflamatoria es vasculitis, nefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide y/o enfermedad de injerto contra hospedador.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente como se describe en el presente documento para su uso como medicamento en el tratamiento de fibrosis crónica. En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad fibrótica inflamatoria y/o crónica es del riñón, el hígado y/o el colon de un sujeto. Fue sorprendente que la expresión localizada de Klotho en regiones fibróticas pudiese conducir a un efecto terapéutico potenciado. Las MSC podrían mostrar propiedades migratorias inesperadas hacia el tejido fibrótico y, a través de la expresión de Klotho, conducir a una reducción en la formación de tejido fibrótico.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque dicha célula se administra introduciendo un número terapéuticamente eficaz de dichas células en el torrente sanguíneo de un paciente, consiguiendo de este modo la entrega de la proteína Klotho expresada a partir de dichas células por vía local en regiones de enfermedad y/o inflamación. La administración de las MSC de la presente invención también puede tener lugar a través de vías de entrega que incluyen la inhalación, la inyección endoscópica de tejido, la inyección de tejido mediada por catéter, la inyección de líquido cefalorraquídeo, la inyección intraperitoneal, la inyección subcutánea, la inyección intramuscular, opcionalmente en combinación con la introducción de dichas células en el torrente sanguíneo de un paciente.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque la enfermedad que se ha de tratar es una enfermedad neurodegenerativa.

En una realización de la invención, la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer (EA).

En una realización de la invención, la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis múltiple (EM).

En una realización de la invención, la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Huntington.

En una realización de la invención, la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

En una realización de la invención, la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson.

En una realización de la invención, la enfermedad neurodegenerativa es esquizofrenia.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa a través de la administración de las células modificadas genéticamente que se describen en el presente documento que comprenden un transgén de Klotho. La administración puede proporcionarse por vía sistémica, tal como por vía intravenosa, debido a la capacidad de las MSC para atravesar la barrera hematoencefálica. Los métodos alternativos de administración, tales como inyecciones epidurales u otros modos de administración que no requieren el paso de la barrera hematoencefálica, están incluidos en la invención.

En particular, el enfoque terapéutico está destinado a pacientes en etapa precoz con enfermedad neurodegenerativa que no ha progresado a etapas graves o tardías de la enfermedad.

Estudios anteriores han descrito un perfil de seguridad suficiente con respecto a la administración de las MSC a pacientes con EM o ELA. También se han descrito efectos inmunomoduladores de las MSC (Karussis et al., Arch Neurol. 201067 (19), 1187). Estos efectos beneficiosos podrían potenciarse mediante el uso de un transgén de Klotho en las MSC que se describen en el presente documento.

Existen indicaciones adicionales de que Klotho puede mostrar potencial terapéutico en el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa. Se ha sugerido que los potenciadores de molécula pequeña de la función de Klotho muestran una función terapéutica en el tratamiento de la EM u otras enfermedades neurodegenerativas (Abraham et al., Future Med Chem, 4 de septiembre de 2012: 13, 1671), klotho se ha vinculado anteriormente a la mielinización del sistema nervioso central (Chen et al., J Neurosci. enero de 201333 (5): 1927) y se encuentran niveles reducidos de klotho en pacientes con enfermedad de Alzheimer (Semba et al., Neurosci. Lett. 13 de enero de 2014; 558: 37). A pesar de estas sugerencias, el uso de un transgén de Klotho en MSC para el tratamiento de estas afecciones médicas representa un resultado sorprendente teniendo en cuenta las dificultades y la baja expectativa de éxito en la administración de productos terapéuticos transgénicos a través de terapia celular. Sorprendentemente, la Klotho entregada por vía local a través de la expresión transgénica de un vehículo de MSC celular conduce a un posible efecto terapéutico contra la enfermedad neurodegenerativa, cuando dichas MSC se administran por vía sistémica (tal como a través de inyecciones iv) o por vía local (tal como a través de inyección epidural o craneal).

Hay diversos ensayos disponibles para el experto con el fin de evaluar la enfermedad neurodegenerativa y, por tanto, también son adecuados para evaluar el posible efecto terapéutico de las klotho-MSC que se describen en el presente documento. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de atención, que comprenden ensayos de atención previa, prepulso o inhibición de interrogación, ensayos de atención tales como orientación de interrogación, respuestas de opción múltiple, tareas de reacción en serie, ensayos de ir/no ir o ensayos cognitivos, incluyendo la discriminación de objetos de interrogación, transmisión social de preferencias alimentarias, ensayos de patrones transversales o ensayos de aprendizaje y memoria, tales como ensayos asociativos, por ejemplo, evitación pasiva de interrogación, evitación activa de una o dos vías o ensayos espaciales/contextuales, que comprenden el laberinto de brazos radiales, o el laberinto de agua de morris, o respuestas emocionales condicionales, tales como ensayos de aversión al gusto condicionada, sobresalto potenciado, o condicionamiento por miedo.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades del corazón y enfermedades renales a través de la administración de las células modificadas genéticamente que se describen en el presente documento que comprenden un transgén de Klotho. Estos dos grupos de numerosas indicaciones médicas están vinculados por la característica especial de los depósitos de sal o calcificación, en las arterias y venas de pacientes particulares. Klotho está implicada en el metabolismo del fosfato y, por tanto, en el procesamiento de sales en el cuerpo de sujetos mamíferos. En determinados sujetos, las sales de fosfato o calcio no se procesan correctamente y esto conduce al depósito de sales en las arterias y enfermedades arteriales, oclusivas o cardiovasculares asociadas. Dichas enfermedades pueden caracterizarse por el "endurecimiento" de las arterias.

Por tanto, un objeto de la invención es el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, trastornos circulatorios, enfermedades arteriales y/o afecciones isquémicas obstructivas u oclusivas o ictus, preferentemente enfermedades cardíacas coronarias o enfermedades obstructivas arteriales periféricas, ateroesclerosis y/o esclerosis inducida por trasplante; una enfermedad oclusiva cerebral o enfermedad oclusiva renal.

Sorprendentemente, los sujetos con disfunción renal, en particular aquellos en los que la detección de creatina no es capaz de indicar la presencia de dicha disfunción renal, tienen un mayor riesgo de sufrir las enfermedades cardíacas o isquémicas que se describen en el presente documento.

En una realización, la presente invención se refiere al tratamiento de la sepsis a través de la administración de las MSC modificadas con Klotho como se describen en el presente documento.

En una realización, la presente invención se refiere al tratamiento de la disfunción eréctil a través de la administración de las MSC modificadas con Klotho como se describen en el presente documento. Se sabe que Klotho desempeña una función en la regulación del monóxido de nitrógeno (NO), influyendo por tanto potencialmente en la función eréctil.

En una realización, las células madre mesenquimatosas modificadas genéticamente para su uso como medicamento se caracterizan porque la enfermedad es un cambio relacionado con la edad de los órganos o los sistemas de órganos. En el presente documento también se desvela el uso médico de las MSC que se describen en el presente documento que se refiere al tratamiento del envejecimiento como tal.

En el presente documento se desvela que la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente se usa como medicamento para tratar y/o prevenir el envejecimiento o la senescencia. Es sorprendente que mediante la administración de Klotho-MSC los procesos de envejecimiento biológico se puedan ralentizar, revertir y/o inhibir eficazmente.

Se sospecha que Klotho tiene propiedades antienvejecimiento positivas. Sin embargo, las MSC modificadas genéticamente que expresan Klotho presentan una función antienvejecimiento particularmente eficaz puesto que las Klotho-MSC se dirigen a células, tejidos y/u órganos de un sujeto afectado por el envejecimiento biológico. De este modo, las Klotho-MSC proporcionan dosis terapéuticamente eficaces por vía local de Klotho a las regiones afectadas por el envejecimiento. Además, las Klotho-MSC conducen al restablecimiento y/o al rejuvenecimiento de la población celular del sujeto y, en particular, de la población de células madre del sujeto. El efecto terapéutico de Klotho hacia la senescencia aumenta en un grado sorprendente, cuando se expresa por MSC modificadas genéticamente.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza por que el sujeto es humano.

En una realización, las células madre mesenquimatosas modificadas genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracterizan porque dichas células modificadas genéticamente son alógenas con respecto al sujeto.

En una realización, la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento como se describe en el presente documento se caracteriza porque dichas células modificadas genéticamente son autólogas con respecto al sujeto.

En un aspecto adicional de la invención, las MSC como se describen en el presente documento pueden comprender un ácido nucleico exógeno que codifica un ligando de quimiocina en combinación con secuencias de ácido nucleico adecuadas para la expresión de dicho ligando. Las secuencias codificantes de quimiocinas pueden estar presentes en la misma molécula de ácido nucleico exógeno que codifica Klotho o en un ácido nucleico exógeno separado. Puede haber múltiples construcciones de ácido nucleico o casetes integrados presentes en las MSC de la presente invención, portando, cada uno, uno o más genes de interés, por ejemplo, genes terapéuticos, tales como Klotho u otros genes implicados en la movilización de las células, tales como una quimiocina. Por tanto, la invención se refiere a las células mesenquimatosas que se describen en el presente documento, en las que el ácido nucleico exógeno codifica preferentemente una quimiocina inflamatoria. Dichas quimiocinas son conocidas por un experto. Los ejemplos de quimiocinas inflamatorias se refieren a CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11 y CXCL10, CXCL1, CXCL2.

La invención se refiere adicionalmente a un vector de ácido nucleico que comprende una región que codifica una proteína Klotho, estando dicha región operativamente unida a un promotor o combinación de promotor/potenciador. En realizaciones preferidas, el promotor o la combinación de promotor/potenciador es uno de los mencionados anteriormente.

La invención también se refiere a un método de entrega de una proteína Klotho a una célula o a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, en el contexto de un uso médico de una proteína Klotho, que comprende administrar el vector de ácido nucleico como se describe en el presente documento a una célula o sujeto, y/o administrar una MSC genéticamente modificada que comprende el vector de ácido nucleico a un sujeto con una o más de las afecciones médicas que se desvelan en el presente documento. La invención también se refiere a un método para la transformación genética de una MSC, que comprende el tratamiento de una MSC con un vector de ácido nucleico como se desvela en el presente documento que codifica una proteína Klotho.

Descripción detallada de la invención

Las "células mesenquimatosas" que se desvelan en el presente documento (también denominadas en algunas realizaciones "células madre mesenquimatosas" o "MSC") pueden dar lugar a tejido conjuntivo, hueso, cartílago y células de los sistemas circulatorio y linfático. Las células madre mesenquimatosas se encuentran en el mesénquima, la parte del mesodermo embrionario que consiste en células no especializadas sueltas, fusiformes o estrelladas. Como se usa en el presente documento, las células madre mesenquimatosas incluyen, sin limitación, células madre CD34-negativas.

En una realización de la invención, las células mesenquimatosas son células adherentes al plástico, de tipo fibroblasto, definidas en algunas realizaciones como células estromales mesenquimatosas multipotentes y también incluyen células CD34-negativas.

Para evitar cualquier duda, la expresión célula mesenquimatosa abarca células estromales mesenquimatosas multipotentes que también incluyen una subpoblación de células mesenquimatosas, MSC y sus precursores, cuya subpoblación está compuesta de células de autorrenovación multipotentes o pluripotentes con capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares in vivo.

Como se usa en el presente documento, célula CD34-negativa indicará una célula que carece de CD34, o que expresa únicamente niveles insignificantes de CD34, en su superficie. Se describen células CD34-negativas y métodos para aislar dichas células, por ejemplo, en Lange C. et al., "Accelerated and safe expansión of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine". J. Cell Physiol. 25 de abril de 2007.

Las células mesenquimatosas pueden diferenciarse a partir de células madre hematopoyéticas (HSC) mediante varios indicadores. Por ejemplo, se sabe que las HSC flotan en cultivo y no se adhieren a superficies plásticas. Por el contrario, las células mesenquimatosas se adhieren a superficies plásticas. Las células mesenquimatosas CD34-negativas de la presente invención son adherentes en cultivo.

Las célula o células modificadas genéticamente que se describen en el presente documento pueden comprenden diferentes tipos de vehículos dependiendo de si tienen que administrarse en forma sólida, líquida o de aerosol, y si tienen que ser estériles para dichas vías de administración como inyección. La presente invención puede administraron por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, por vía oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada que riega células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas) o por otro método o cualquier combinación de los anteriores, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990).

La presente invención abarca el tratamiento de un paciente introduciendo un número terapéuticamente eficaz de células en el torrente sanguíneo de un sujeto. Como se usa en el presente documento, "introducir" células "en el torrente sanguíneo de un sujeto" incluirá, sin limitación, introducir dichas células en una de las venas o arterias del sujeto por inyección. Dicha administración también puede realizarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados. Se prefiere una única inyección, pero pueden ser necesarias inyecciones repetidas a lo largo del tiempo (por ejemplo, trimestralmente, semestralmente o anualmente) en algunos casos. Dicha administración también se realiza preferentemente usando una mezcla de células CD34-negativas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, 0,01-0,1 M y preferentemente tampón fosfato 0,05 M o solución salina al 0,8 %, así como medios de crioconservación patentados usados habitualmente.

La administración también puede producirse de forma local, por ejemplo, por inyección en un área del cuerpo del sujeto en la proximidad a una enfermedad tumoral. Se ha demostrado que las MSC migran hacia tejido canceroso. De todas formas, la administración local de las células como se describe en el presente documento puede dar lugar a niveles elevados de las células en su sitio de acción.

Adicionalmente, dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones, mucho más preferentemente soluciones acuosas. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones y suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, solución de Ringer con dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato y aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de líquidos y nutrientes, reforzadores de electrolitos tales como solución de Ringer con dextrosa, los basados en solución de Ringer con dextrosa y similares. Los líquidos usados habitualmente para administración i.v. se encuentran, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., pág. 808, Lippincott Williams S- Wilkins (2000). También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

Como se usa en el presente documento, un "número terapéuticamente eficaz de células" incluye, sin limitación, las siguientes e intervalos de cantidades: (i) de aproximadamente 1 x 102 a aproximadamente 1 x l08 células/kg de peso corporal; (ii) de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 107 células/kg de peso corporal; (iii) de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 106 células/kg de peso corporal; (iv) de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 105 células/kg de peso corporal; (v) de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 106 células/kg de peso corporal; (vi) de aproximadamente 5 x 104 a aproximadamente 0,5 x 105 células/kg de peso corporal; (vii) aproximadamente 1 x 103 células/kg de peso corporal; (viii) aproximadamente 1 x 104 células/kg de peso corporal; (ix) aproximadamente 5 x 104 células/kg de peso corporal; (x) aproximadamente 1 x 105 células/kg de peso corporal; (xi) aproximadamente 5 x 105 células/kg de peso corporal; (xii) aproximadamente 1 x 106 células/kg de peso corporal; y (xiii) aproximadamente 1 x 107 células/kg de peso corporal. Los pesos corporales humanos previstos incluyen, sin limitación, aproximadamente 5 kg, 10 kg, 15 kg, 30 kg, 50 kg, aproximadamente 60 kg; aproximadamente 70 kg; aproximadamente 80 kg, aproximadamente 90 kg; aproximadamente 100 kg, aproximadamente 120 kg y aproximadamente 150 kg. Estos números se basan en experimentos preclínicos en animales y en ensayos en seres humanos y protocolos convencionales del trasplante de células madre hematopoyéticas CD34+. Las células mononucleares (incluyendo células CD34+) habitualmente contienen entre 1:23000 a 1:300000 células CD34-negativas.

Como se usa en el presente documento, "tratar" un sujeto afectado con un trastorno significa ralentizar, detener o revertir la progresión del trastorno. En la realización preferida, tratar a un sujeto afectado con un trastorno significa revertir la progresión del trastorno, idealmente hasta el punto de eliminar el propio trastorno. Como se usa en el presente documento, mejorar un trastorno y mediar un trastorno son equivalentes. El tratamiento de la presente invención puede referirse también, o como alternativa, a administración profiláctica de dichas células. Una administración profiláctica de este tipo podría relacionarse con la prevención de cualquier trastorno médico dado, o la prevención del desarrollo de dicho trastorno, por lo que prevención o profilaxis no debe interpretarse en sentido estricto en todas las situaciones como prevención absoluta. La prevención o profilaxis también puede referirse a una reducción del riesgo de que un sujeto desarrolle cualquier afección médica dada, preferentemente en un sujeto en riesgo de dicha afección.

Normalmente, el término "inflamación", como se usa en su sentido reconocido en la técnica se refiere a una respuesta protectora localizada o sistémica provocada por lesión, infección o destrucción de tejidos que sirve para proteger al sujeto de un agente perjudicial y al tejido lesionado. La inflamación se caracteriza preferentemente por fenestración de la microvasculatura, filtración de los elementos de la sangre a los espacios intersticiales y migración de leucocitos al tejido inflamado, que puede dar lugar a una secuencia incontrolada de dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón y pérdida de función.

La inflamación puede clasificarse como aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del organismo a un estímulo dañino y se consigue mediante el movimiento aumentado de plasma y leucocitos (especialmente granulocitos) desde la sangre a los tejidos lesionados. Una cascada de eventos bioquímicos se propaga y madura la respuesta inflamatoria, implicando el sistema vascular local, el sistema inmunitario y diversas células dentro del tejido lesionado. La inflamación prolongada, conocida como inflamación crónica, da lugar a un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de inflamación y se caracteriza por destrucción y curación simultánea del tejido desde el proceso inflamatorio.

En algunas realizaciones de la invención, las MSC como se describen en el presente documento migran hacia nichos fisiológicos afectados por una patología, tales como zonas de inflamación, para conferir su efecto terapéutico, por ejemplo, de una manera local.

Como se usa en el presente documento, "migración celular" pretende indicar el movimiento de una célula hacia una señal química o física particular. Las células con frecuencia migran en respuesta a señales externas específicas, incluyendo señales químicas y señales mecánicas. La quimiotaxis es un ejemplo de migración celular respecto a la respuesta a un estímulo químico. Los ensayos de quimiotaxis in vitro tal como los ensayos en cámara de Boyden pueden usarse para determinar si se produce migración celular en cualquier célula dada. Por ejemplo, las células de interés pueden purificarse y analizarse. Los ensayos de quimiotaxis (por ejemplo, de acuerdo con Falk et al., 1980 J. Immuno. Methods 33:239-247) pueden realizarse usando placas donde se ubica una señal química particular con respecto a las células de interés y después se recogen y analizan las células que han migrado. Por ejemplo, los ensayos de cámara de Boyden implican el uso de cámaras aisladas por filtros, usadas como herramientas para la determinación precisa del comportamiento quimiotáctico. El tipo pionero de estas cámaras se construyó por (Boyden (1962) "The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclearleucocytes". J Exp Med 115 (3): 453). Las células móviles se ubican en la cámara superior, mientras que se rellena un líquido que contiene la sustancia de ensayo en la inferior. El tamaño de las células móviles a investigar determina el tamaño de poro del filtro; es esencial elegir un diámetro que permita la migración activa. Para modelar las condiciones in vivo, varios protocolos prefieren la cobertura del filtro con moléculas de matriz extracelular (colágeno, elastina, etc.) La eficiencia de las mediciones puede aumentarse mediante el desarrollo de cámaras de múltiples pocillos (por ejemplo, NeuroProbe), donde se evalúan 24, 96, 384 muestras en paralelo. La ventaja de esta variante es que se ensayan varios análogos en condiciones idénticas.

Como alternativa, pueden obtenerse muestras tisulares de sujetos (por ejemplo, modelos de roedor) después del trasplante de las células y ensayarse para la presencia de las células de interés en tipos tisulares particulares. Dichos ensayos pueden ser de naturaleza molecular, que identifica células basadas en la secuencia de ácido nucleico, o de naturaleza histológica, que evalúa células basándose en marcas fluorescentes después del marcaje del anticuerpo. Dichos ensayos son particularmente útiles para evaluar el injerto de células trasplantadas. Los ensayos para injerto también pueden proporcionar información sobre la migración celular, ya que en algún grado el injerto depende de la localización celular antes del injerto.

En algunas realizaciones de la invención, las MSC como se describen en el presente documento se injertan en nichos fisiológicos afectados por una patología, tales como zonas de inflamación, para conferir su efecto terapéutico, por ejemplo, de una manera local.

Como se usa en el presente documento, "injerto" se refiere al proceso de incorporación de tejido o células injertadas o trasplantadas en el organismo del hospedador. Injerto también puede referirse a la integración de células trasplantadas en tejido hospedador y su supervivencia y en algunas condiciones diferenciación en estados de células que no son madre.

Las técnicas para evaluar el injerto y, de este modo, en algún grado tanto la migración como la biodistribución de las MSC, pueden abarcar métodos in vivo o ex vivo. Los ejemplos de métodos in vivo incluyen bioluminiscencia, por la que las células se transducen para que expresar luciferasa y después pueden tomarse imágenes a través de su metabolismo de luciferina que produce emisión de luz; fluorescencia, por la que las células se ubican con un tinte fluorescente o se transducen para que expresen un indicador fluorescente del que después pueden tomarse imágenes; marcaje de radionúclidos, donde las células se cargan con radionúclidos y se localizan con centelleografía, tomografía de emisión de positrones (PET) o tomografía de emisión monofotónica (SPECT); e imágenes de resonancia magnética (MRI), en la que las células cargadas con compuestos paramagnéticos (por ejemplo, nanopartículas de óxidos de hierro) se rastrean con un analizador de MRI. Los métodos ex vivo para evaluar la biodistribución incluyen PCR cuantitativa, citometría de flujo y métodos histológicos. Los métodos incluyen seguimiento de células marcadas de forma fluorescente; hibridación in situ, por ejemplo, para cromosomas Y y para secuencias ALU específicas humanas; y tinción histoquímica para proteínas específicas de especie o introducidas genéticamente tales como p-gatactosidasa bacteriana. Estos métodos inmunohistoquímicos son útiles para discernir la ubicación del injerto, pero necesitan la escisión de tejido. Para una revisión adicional de estos métodos y su aplicación, véase Kean et al., MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation, Stem Cells International, volumen 2013 (2013).

Las células progenitoras o multipotentes, tales como las células mesenquimatosas de la presente invención, por lo tanto, pueden describirse como vehículos de suministro de proteínas, que posibilitan esencialmente la ubicación y la expresión de productos génicos terapéuticos en particular tejidos o regiones del organismo del sujeto. Dichas células terapéuticas ofrecen el potencial de proporcionar tratamientos celulares para enfermedades que son resistentes a otros tratamientos. Para cada tipo de célula terapéutica, el objetivo final es el mismo: la célula debe expresar un repertorio específico de genes, preferentemente ácidos nucleicos exógenos que codifican productos génicos terapéuticos, modificando de este modo la identidad celular para expresar dicho producto génico y proporcionar un efecto terapéutico, tal como un efecto antiinflamatorio. Las células de la invención, cuando se expanden in vitro, representan poblaciones heterogéneas que incluyen múltiples generaciones de descendencia celular mesenquimatosa (estromal), que carecen de la expresión de la mayoría de marcadores de diferenciación como CD34. Estas poblaciones pueden haber retenido un potencial de proliferación limitado y sensibilidad para diferenciación terminal y maduración a lo largo de los linajes mesenquimatoso y no mesenquimatoso.

Como se usa en el presente documento, la expresión "biobomba" o "fábrica de fármacos" describe preferentemente la función de las KIotho-MSC como una fuente de producción continua de Klotho. Mediante la administración de Klotho-MSC a un sujeto pueden proporcionarse niveles particularmente estables de Klotho. En este sentido la biobomba, es decir, las Klotho-MSC, permite un suministro continuo que mantiene los niveles de Klotho en un estado particular, por ejemplo, puede compensar por las pérdidas de Klotho por ejemplo debido a la degeneración de la proteína.

Como se usa en el presente documento, "expresión inducible" o "expresión condicionada" se refiere a un estado, múltiples estados o sistema de expresión génica, en el que el gen de interés, tal como el transgén terapéutico, preferentemente no se expresa, o en algunas realizaciones se expresa a niveles insignificantes o relativamente bajos, salvo que haya presencia de una o más moléculas (un inductor) u otro conjunto de condiciones en la célula que permita la expresión génica. Los promotores inducibles pueden referirse a promotores de origen natural que se expresan a un nivel relativamente mayor en condiciones biológicas particulares, o a otros promotores sintéticos que comprenden cualquier elemento inducible dado. Los promotores inducibles pueden referirse a los inducidos por entornos tisulares o microentornos particulares o combinaciones de señales biológicas presentes en entornos tisulares o microentornos particulares o a promotores inducidos por factores externos, por ejemplo, mediante la administración de una molécula farmacéutica pequeña u otra señal aplicada de forma externa.

Como se usa en el presente documento, en "proximidad con" un tejido incluye, por ejemplo, en 5 mm, en 1 mm del tejido, en 0,5 mm del tejido y en 0,25 mm del tejido.

Dado que las células madre pueden mostrar una migración selectiva a diferentes microentornos tisulares en escenarios normales así como de enfermedad, el uso de promotores específicos de tejido ligados a la ruta de diferenciación iniciada en la célula madre reclutada está abarcado en la presente invención y en teoría podría usarse para dirigir la expresión selectiva de genes terapéuticos únicamente en un contexto biológico definido. Las células madre que se reclutan a otros nichos tisulares, pero no experimentan el mismo programa de diferenciación, no deben expresar el gen terapéutico. Esta estrategia permite un grado significativo de control potencial de la expresión selectiva del gen terapéutico dentro de un microentorno definido y se ha aplicado satisfactoriamente para regular la expresión génica terapéutica durante neovascularización. Se divulgan estrategias potenciales para dichas modificaciones génicas en el documento WO 2008/150368 y el documento WO 2010/119039.

Como se usa en el presente documento, una proteína "secretada" se refiere preferentemente a aquellas proteínas capaces de dirigirse al retículo endoplásmico, las vesículas secretoras o el espacio extracelular como resultado de una secuencia señal, así como aquellas proteínas liberadas en el espacio extracelular sin contener necesariamente una secuencia señal. Si la proteína secretada se libera en el espacio extracelular, la proteína secretada puede experimentar un procesamiento extracelular. La liberación en el espacio extracelular puede producirse preferentemente mediante muchos mecanismos, incluyendo la exocitosis y la escisión proteolítica.

Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" significa cualquier molécula de ácido nucleico, incluyendo, sin limitación, ADN, ARN e híbridos o variantes modificadas de los mismos. Un "ácido nucleico exógeno" o "elemento genético exógeno" se refiere a cualquier ácido nucleico introducido en la célula, que no es un componente del genoma "original" o "natural" de las células. Los ácidos nucleicos exógenos pueden integrarse o no integrarse, o se refieren a ácidos nucleicos transfectados de forma estable.

En el presente documento se desvela cualquier método de entrega de genes dado y preferentemente se refiere a vectores víricos o no víricos, así como métodos bioquímicos o químicos de transfección. Los métodos pueden producir expresión génica estable o transitoria en el sistema usado.

Los virus modificados genéticamente se han aplicado ampliamente para el suministro de genes en células madre. Los vectores víricos preferidos para la modificación genética de las MSC que se describen en el presente documento se refieren a vectores retrovíricos, en particular a vectores retrovíricos gamma. Los retrovirus gamma (a veces mencionados como retrovirus de tipo C de mamífero) es un género hermano al clado de lentivirus, y es un miembro de la subfamilia Orthoretrovirinae de la familia de retrovirus. El virus de la leucemia murina (MLV o MuLV), el virus de la leucemia felina (FeLV), el virus relacionado con el virus de la leucemia murina xenotrópica (XMRV) y el virus de la leucemia del simio gibón (GALV) son miembros del género de retrovirus gamma. Un experto en la materia es consciente de las técnicas requeridas para la utilización de retrovirus gamma en modificación genética de MSC. Por ejemplo, pueden emplearse los vectores descritos por Maetzig et al (Gammaretroviral vectors: biology, technology and application, 2001, Viruses Junio; 3 (6): 677-713) o vectores similares. Por ejemplo, el virus de la leucemia murina (MLV), un retrovirus gamma simple, puede convertirse en un vehículo eficaz de agentes terapéuticos genéticos en el contexto de la creación de MSC modificadas por retrovirus gamma y la expresión de un transgén terapéutico a partir de dichas MSC después del suministro a un sujeto.

Los virus modificados genéticamente se han aplicado ampliamente para el suministro de genes en células madre. Pueden aplicarse adenovirus, o virus de ARN tales como lentivirus, u otros retrovirus. Los adenovirus se han usado para generar una serie de vectores para ingeniería celular por transferencia génica. La generación inicial de vectores de adenovirus se produjo suprimiendo el gen El (requerido para la replicación vírica) generando un vector con una capacidad de clonación de 4 kb. Una supresión adicional de E3 (responsable de la respuesta inmunitaria del hospedador) permitió una capacidad de clonación de 8 kb. Se han producido generaciones adicionales que abarcan eliminaciones de E2 y/o E4. Los lentivirus son miembros de la familia Retroviridae de virus (M. Scherr et al., Gene transfer into hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Curr Gene Ther. Febrero de 2002; 2 (1): 45-55). Los vectores lentivíricos se generan por eliminación de la secuencia vírica completa con la excepción de las LTR y las señales de empaquetado de acción en cis. Los vectores resultantes tienen una capacidad de clonación de aproximadamente 8 kb. Una característica distintiva de estos vectores respecto a los vectores retrovíricos es su capacidad de transducir células en división y células que no están en división, así como células diferenciadas de forma terminal.

También pueden emplearse métodos no víricos, tales como estrategias alternativas que incluyen transferencia convencional de plásmidos y la aplicación de integración génica dirigida mediante el uso de tecnologías de integrasa o transposasa. Estas representan estrategias para la transformación con vectores que tienen la ventaja de ser eficaces, y con frecuencia específicas de sitio en su integración. Los métodos físicos para introducir vectores en células son conocidos para los expertos en la materia. Un ejemplo se refiere a electroporación, que se basa en el uso de pulsos eléctricos breves, de alto voltaje que crean poros transitorios en la membrana al superar su capacitancia. Una ventaja de este método es que puede utilizarse para expresión génica tanto estable como transitoria en la mayoría de tipos celulares. Métodos alternativos se refieren al uso de liposomas o dominios de transducción de proteínas. Los métodos apropiados son conocidos para los expertos en la materia y no se entienden como realizaciones limitantes de la presente invención.

El cáncer comprende un grupo de enfermedades que pueden afectar a cualquier parte del cuerpo y es provocado por un crecimiento y una proliferación celulares anormales. Estas células en proliferación tienen el potencial de invadir el tejido circundante y/o extenderse a otras partes del cuerpo donde forman metástasis. A nivel mundial, hubo 14 millones de casos nuevos de cáncer y 8,2 millones de muertes relacionadas con el cáncer en 2012 (World Cancer Report 2014). La mayoría de los cánceres son provocados por señales ambientales relacionadas con el consumo de tabaco, la obesidad y las infecciones, entre otros, mientras que aproximadamente el 5-10 % son casos genéticos. Los cánceres pueden clasificarse en subcategorías de acuerdo con la célula de origen. Las subcategorías más comunes son carcinomas de células epiteliales, sarcomas de tejido conectivo y linfomas y leucemias de células hematopoyéticas. El cáncer se asocia a una gran diversidad de síntomas locales y sistémicos y en muchos casos no puede curarse. En vista del alto número de nuevos pacientes con cáncer y de muertes relacionadas con el cáncer, se requieren nuevas estrategias de tratamiento.

El cáncer de acuerdo con la presente invención se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasias o tumores malignos que se encuentran en mamíferos, incluyendo leucemias, sarcomas, melanomas y carcinomas. Son ejemplos de cánceres el cáncer de mama, páncreas, colon, pulmón, no microcítico de pulmón, ovario y próstata.

Las leucemias incluyen, pero no se limitan a, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, leucemia aleucémica, leucemia leucocitémica, leucemia basófila, leucemia de citoblastos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinófila, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia blastocítica, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia mieloide granulocítica, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia blastocítica, leucemia subleucémica y leucemia celular indiferenciada.

Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a un condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de las partes blandas, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, carcinoma coriónico, sarcoma embrionario, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de linfocitos B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de linfocitos T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma cerocístico, sarcoma sinovial y sarcoma telangiectásico.

Los melanomas incluyen, pero no se limitan a incluir, por ejemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanocítico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, léntigo, melanoma maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal y melanoma de propagación superficial.

Los carcinomas incluyen, pero no se limitan a carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma adenoideo quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloidal, comedocarcinoma, carcinoma endométrico, carcinoma cribiforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilindrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma ulcerado, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células gigantes, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma mucoso, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodes, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células en avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renales del riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoides, carcinoma schneideriano, carcinoma escirroso, carcinoma de escroto, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma microcítico, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoideas, carcinoma de células en husillo, carcinoma de células fusiformes, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma ganglionar, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectodes, carcinoma de células transicionales, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso y carcinoma velloso.

Los cánceres adicionales incluyen, pero no se limitan a la enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón microcíticos, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoma maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas precancerosas, cáncer de testículo, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer cortical suprarrenal y cáncer de próstata.

La fibrosis es el punto final de muchas enfermedades inflamatorias crónicas y se define por una acumulación anormal de componentes de la matriz extracelular. El término fibrosis designa el aumento de tejido conectivo fibroso y material que incluye colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular en el parénquima de los órganos. Esto puede ocurrir en múltiples órganos en respuesta a la estimulación externa como lesión, infección, inflamación. La fibrosis puede cambiar la arquitectura y la función del tejido afectado, lo que puede interferir con la función del órgano y, por tanto, provocar patología e incluso insuficiencia orgánica. Los ejemplos de fibrosis incluyen fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, fibrosis miocárdica y renal, entre otros. Se necesitan nuevas opciones de tratamiento para este grupo de enfermedades para mejorar la condición de los pacientes afectados. La fibrosis de órganos de acuerdo con la presente invención se refiere, pero no se limita a, a una o más de entre fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis endomiocárdica, infarto de miocardio antiguo, fibrosis auricular, fibrosis mediastinal, mielofibrosis de la médula ósea, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva del pulmón, fibrosis sistémica nefrogénica de la piel, enfermedad de Crohn, queloide, esclerodermia/esclerosis sistémica, artrofibrosis, enfermedad de Peyronie, contractura de Dupuytren o capsulitis adhesiva.

A pesar de su lenta progresión, conduce a un mal funcionamiento de los órganos. La fibrosis puede afectar a casi cualquier tejido. Uno de los principales agentes moleculares que inducen la fibrosis es el TGF-p1, principalmente sintetizado por los linfocitos T durante el proceso de curación. El TGF-p1 se secreta en una forma latente asociado a LAP (péptido asociado a latencia). LAP se escinde para permitir la activación de TGF-p1 que puede unirse a sus receptores TGF-pR1 (receptor del factor de crecimiento transformante p1) y TGF-pR2. Por tanto, existe un gran grupo de TGF-p1 inactivos en el entorno extracelular. Diversos agentes pueden inducir la activación de TGF-p1: Las MMP, las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS), las citocinas u otros estímulos tales como la radiación ionizante. La unión de TGF-p1 a sus receptores activa la vía de señalización de Smad (homólogo de "madre contra decapentapléjico" pequeña) que induce la transcripción de diversos genes, incluyendo los genes que codifican miembros de la matriz extracelular (colágenos en su mayoría). También activa la diferenciación de fibrocitos hacia fibroblastos funcionales (Benoít et al., Break-through Stem Cells International 2014, ID de artículo 340257, 26 páginas).

La expresión insuficiencia renal describe una afección médica en la que el riñón no funciona adecuadamente para cumplir con sus funciones fisiológicas. Las dos formas principales son la enfermedad renal crónica y la lesión renal aguda. La lesión renal aguda se define por una pérdida rápida de la función renal en menos de 3 meses. La enfermedad renal crónica es una enfermedad progresiva asociada a la pérdida gradual de la función renal durante un período de varios meses a años que conduce a la insuficiencia orgánica. Se estima que en los EE.UU., el 16,8 % de los adultos mayores de 20 años se vieron afectados entre 1999 y 2004. Las 3 causas principales de enfermedad renal crónica son la diabetes, la hipertensión y la glomerulonefritis. No se ha demostrado que ningún tratamiento específico reduzca la velocidad de la enfermedad renal crónica y los pacientes en etapa tardía son tratados con una terapia de reemplazo renal costosa que implica diálisis y trasplante. De forma similar, la lesión renal aguda con frecuencia requiere terapia de reemplazo renal. Por tanto, se necesitan estrategias de tratamiento alternativas para curar o retrasar la progresión de la lesión renal aguda y la enfermedad renal crónica.

La insuficiencia renal de acuerdo con la presente invención se refiere, pero no se limita a, a una o más de, lesión renal aguda, enfermedad renal crónica o insuficiencia renal aguda sobre crónica.

En individuos de edad avanzada, la función de casi todos los órganos del cuerpo está en disminución debido a cambios relacionados con la edad también en ausencia de patología. Estos cambios pueden deberse a una diversidad de razones incluyendo la pérdida de la función celular específica del órgano o las células específicas del órgano. Por otro lado, la disminución de la función de un órgano puede afectar a la función de otros órganos del cuerpo. Los cambios relacionados con la edad en los órganos hacen que las personas mayores sean menos capaces de soportar el estrés y los estímulos externos, tales como la actividad física, el tratamiento farmacológico, las infecciones y los cambios de temperatura, entre muchos otros. Si el proceso de envejecimiento de los diversos sistemas de órganos del cuerpo pudiera ralentizarse, esto aumentaría la calidad de vida de las personas mayores y beneficiaría a la sociedad en su conjunto.

Los cambios relacionados con la edad de los órganos y los sistemas de órganos de acuerdo con la presente divulgación se refieren, pero no se limita a, a uno o más de los cambios relacionados con la edad de los huesos, articulaciones, oídos, músculos, grasa corporal, los ojos, boca, nariz, piel, cerebro, sistema nervioso, médula espinal, corazón, vasos sanguíneos, pulmón, intestino, estómago, colon, esófago, riñón, tracto urinario, órganos reproductivos, mamas, sistema endocrino, médula ósea y sistema inmunitario.

Por tanto, las MSC de la presente invención pueden usarse como un agente antienvejecimiento, por ejemplo, en el tratamiento del envejecimiento, por ejemplo, el envejecimiento relacionado con la senescencia. "Envejecimiento relacionado con la senescencia" se refiere a la senescencia, que generalmente significa "envejecer" o "envejecimiento". El envejecimiento biológico es el proceso de cambios acumulativos en la estructura molecular y celular que interrumpe el metabolismo con el paso del tiempo, lo que da como resultado deterioro y muerte. La senescencia ocurre tanto a nivel de todo el organismo (senescencia orgánica) como a nivel de sus células individuales (senescencia celular). El tratamiento de la senescencia (antienvejecimiento) es un aspecto de la presente divulgación. El tratamiento del envejecimiento, o el tratamiento de la senescencia, se relaciona en algunos aspectos con el enlentecimiento, la reversión y/o la inhibición del proceso de envejecimiento.

Durante el envejecimiento, la incidencia de afecciones agudas y crónicas, tales como trastornos neurológicos, diabetes, artritis degenerativa e incluso cáncer, aumenta en los individuos, por lo que el envejecimiento se ha denominado el sustrato en el que crecen las enfermedades asociadas a la edad. Por tanto, la divulgación se refiere a métodos profilácticos para prevenir enfermedades asociadas al envejecimiento.

Las vías moleculares subyacentes al envejecimiento no se comprenden bien, ya que se observa una gran heterogeneidad individual del proceso de envejecimiento biológico. Se propone que estas diferencias interindividuales derivan de la acumulación de daño estocástico que se contrarresta mediante sistemas de reparación genéticamente codificados y regulados ambientalmente. A nivel de moléculas, la reparación trabaja mediante sistemas enzimáticos, mientras que a nivel celular trabaja mediante replicación y diferenciación para mantener la homeostasis tisular. Sin embargo, el potencial replicativo de las células madre somáticas y adultas se ve limitado por la senescencia celular y las pruebas recientes muestran que contrarrestar la senescencia o retirar las células senescentes retrasa la aparición de patologías asociadas a la edad. Por tanto, la presente divulgación proporciona medios para el tratamiento y/o la prevención y/o la reducción del riesgo de envejecimiento como tal, además de afecciones médicas relacionadas con la edad.

El término arteriesclerosis describe el engrosamiento patológico, el endurecimiento y la pérdida de elasticidad de las paredes arteriales que pueden conducir a la estenosis y al posterior suministro insuficiente de sangre de los tejidos corriente abajo dando como resultado isquemia. Este proceso con frecuencia se asocia a calcificación de la pared arterial. Existen diferentes tipos de arteriesclerosis que afectan a diferentes ubicaciones anatómicas y tienen diferentes etiologías. La ateroesclerosis es un tipo específico de arteriesclerosis, que se define por la acumulación de glóbulos blancos en la pared arterial y la formación de placas ateromatosas. La ateroesclerosis es una enfermedad crónica que puede permanecer asintomática durante períodos de tiempo prolongados hasta que se produce una estenosis de la luz de la arteria afectada. Adicionalmente, las rupturas de las lesiones ateroscleróticas pueden conducir a la formación de trombos y al consiguiente tromboembolismo, lo que puede conducir a infarto/necrosis de tejidos en todas las partes del cuerpo. Son ejemplos drásticos de dichos eventos el infarto de miocardio y el ictus, estos efectos posteriores de la ateroesclerosis representan la causa más común de muerte en los países industrializados y, por tanto, se necesitan urgentemente mejores estrategias de tratamiento. La arteriesclerosis de acuerdo con la presente invención se refiere, pero no se limita a, a una o más de, ateroesclerosis, arteriesclerosis obliterante y arteriesclerosis de Monckeberg.

Las expresiones trastornos circulatorios, enfermedad cardiovascular, afecciones de las arterias o vasos sanguíneos y/o enfermedades o afecciones obstructivas u oclusivas isquémicas se refieren a estados del tejido vascular donde el flujo sanguíneo está, o puede llegar a estar, afectado o alterado con respecto a los niveles normales. Muchas afecciones patológicas pueden conducir a enfermedades vasculares que se asocian a alteraciones en la condición vascular normal de los tejidos y/o sistemas afectados. Los ejemplos de afecciones vasculares o enfermedades vasculares a las que se aplican los métodos de la invención son aquellas en las que la vasculatura del tejido o sistema afectado es senescente o está alterada de alguna otra forma de manera que el flujo sanguíneo al tejido o sistema se reduce o está en peligro de verse reducido o aumentado por encima de los niveles normales. Se refiere a cualquier trastorno en cualquiera de las diversas partes del sistema cardiovascular, que consiste en el corazón y todos los vasos sanguíneos que se encuentran en todo el cuerpo. Las enfermedades del corazón pueden incluir la arteriopatía coronaria, c C, cardiomiopatía, cardiopatía valvular, enfermedad pericárdica, cardiopatía congénita (por ejemplo, estrechamiento aórtico, defectos septales auriculares o ventriculares) e insuficiencia cardíaca. Las enfermedades de los vasos sanguíneos pueden incluir arteriesclerosis, ateroesclerosis, hipertensión, ictus, demencia vascular, aneurisma, enfermedad de las arterias periféricas, claudicación intermitente, vasculitis, incompetencia venosa, trombosis venosa, venas varicosas y linfedema.

Fue un aspecto sorprendente de la presente invención que las MSC que se describen en el presente documento se localizasen in vivo en áreas de ateroesclerosis después de la administración sistémica. Las MSC se produjeron en un transgén localizado de manera suficiente para proporcionar un efecto terapéutico sin expresión sistémica y no controlada no deseada de dicho transgén.

Enfermedad neurodegenerativa o neurodegeneración es una expresión para afecciones médicas en las que se produce la pérdida progresiva de estructura o función de las neuronas, incluyendo la muerte de las neuronas. Muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ELA, el Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Huntington, se producen como resultado de procesos neurodegenerativos. Dichas enfermedades habitualmente se consideran incurables, dando como resultado una degeneración progresiva y/o la muerte de las células neuronales. Hay presente una serie de similitudes en las características de estas enfermedades, vinculando estas enfermedades a nivel subcelular. Algunos de los paralelismos entre los diferentes trastornos neurodegenerativos incluyen el ensamblaje de proteínas atípicas, así como la muerte celular inducida.

La demencia es un grupo de enfermedades cerebrales que provocan una disminución gradual de las funciones cognitivas. La mayoría de estas enfermedades son enfermedades neurodegenerativas crónicas y se asocian a síntomas neuroconductuales y/o neuropsiquiátricos que incapacitan a los pacientes para realizar independientemente actividades de la vida diaria. La enfermedad de Alzheimer es la forma más común de demencia con 25 millones de personas afectadas en todo el mundo en el año 2000. Se espera que este número aumente a 114 millones de casos en 2050, a menos que surjan enfoques terapéuticos preventivos o neuroprotectores.

La demencia de acuerdo con la presente invención se refiere, pero no se limita a, a una o más de, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia post ictus, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, enfermedad de Huntington y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

La disfunción eréctil es un trastorno multifactorial asociado al envejecimiento y a una diversidad de afecciones orgánicas y psicógenas, incluyendo hipertensión, hipercolesterolemia, diabetes mellitus, enfermedad cardiovascular y depresión. Se cree que el óxido nítrico (NO) es un importante neurotransmisor vasoactivo y mediador químico de la erección del pene. La bioactividad de NO deteriorada es un mecanismo patógeno de la disfunción eréctil. La eficacia de los inhibidores de PDE-5 en el tratamiento de la disfunción eréctil sirve para ilustrar la importancia de la regulación de NO en la función eréctil, puesto que estos agentes contrarrestan la degradación de la GMPc generada por NO. Sin embargo, no todos los pacientes responden a los inhibidores de la PDE-5, de manera que se requieren terapias adicionales (Burnett AL, J Clin Hypertens, diciembre de 2006; 8 (12 Supl. 4): 53-62).

La diabetes mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas crónicas que se asocian a altos niveles de azúcar en sangre durante períodos de tiempo prolongados, lo que puede conducir a complicaciones graves que incluyen enfermedades cardiovasculares, ictus, insuficiencia renal, úlceras en los pies y ojos dañados. Los dos subtipos principales son diabetes mellitus de tipo 1 y de tipo 2. La diabetes mellitus de tipo 1 se caracteriza por la pérdida de células productoras de insulina en el páncreas. Representa aproximadamente el 10 % de los casos de diabetes en los EE.UU. y Europa, afecta principalmente a niños y con frecuencia se asocia a patologías autoinmunitarias. La diabetes mellitus de tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina. La diabetes mellitus representa un problema de salud masivo con más de 350 millones de personas afectadas en 2013 en todo el mundo.

La diabetes mellitus de acuerdo con la presente invención se refiere, pero no se limita a, a una o más de, diabetes mellitus de tipo 1, diabetes mellitus de tipo 2, diabetes gestacional y diabetes autoinmunitaria latente de adultos.

Las enfermedades autoinmunitarias son un grupo de enfermedades provocadas por una respuesta inmunitaria anormal del cuerpo contra moléculas o células específicas que normalmente están presentes en el cuerpo y, por tanto, deberían ser toleradas por el sistema inmunitario en condiciones fisiológicas. La reacción patológica del sistema inmunitario del cuerpo contra sus propios componentes puede conducir a afecciones físicas graves. Una gran cantidad de enfermedades se han identificado como provocadas por reacciones autoinmunitarias y se sospecha que muchas patologías de etiología poco clara tienen componentes autoinmunitarios y, por tanto, se denominan enfermedades relacionadas con la autoinmunidad. Por tanto, se necesita con urgencia el desarrollo de estrategias de tratamiento eficaces y específicas para este grupo de enfermedades.

Las enfermedades autoinmunitarias y las enfermedades relacionadas con la autoinmunidad de acuerdo con la presente invención se refieren, pero no se limita a, a una o más de, encefalomielitis diseminada aguda, leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, espondilitis anquilosante, nefritis anti-GBM/anti-TBM, síndrome antifosfolípido (APS), angioedema autoinmunitario, anemia aplásica autoinmunitaria, disautonomía autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hiperlipidemia autoinmunitaria, inmunodeficiencia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, miocarditis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, retinopatía autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, urticaria autoinmunitaria, neuropatías axónicas y neuronales, enfermedad de balo, enfermedad de Behget, pénfigo ampolloso, cardiomiopatía, enfermedad de Castleman, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, osteomielitis crónica recurrente multifocal, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide benigno de las mucosas, enfermedad de Crohn, síndrome de Cogan, enfermedad de las aglutininas frías, bloqueo cardiaco congénito, miocarditis coxsackie, enfermedad de CREST, crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmielinizantes, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, esofagitis eosinófila, fascitis eosinofílica, eritema nudoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes, miocarditis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, púrpura trombocitopénica idiopática, nefropatía por IgA, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, miositis de cuerpos de inclusión, cistitis intersticial, artritis juvenil, diabetes juvenil (diabetes de tipo 1), miositis juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad de IgA lineal (EAL), lupus (LES), enfermedad de Lyme (crónica), enfermedad de Meniere, poliangeítis microscópica, enfermedad mixta del tejido conectivo, úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple, miastenia grave, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica, neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, reumatismo palindrómico, trastornos neuropsiquiátricos autoinmunitarios pediátricos asociados a estreptococo, degeneración cerebelosa paraneoplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna, síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars planitis (uveítis periférica), pénfigo, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarios de tipo I, II y III, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome postinfarto de miocardio, síndrome postpericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, Aplasia pura de células rojas, fenómeno de Raynaud, artritis reactiva, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de las piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, Síndrome de Schmidt, escleritis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunidad del esperma y testicular, síndrome de persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (EBS), síndrome de Susac, oftalmia del simpático, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, púrpura tromobocitopénica, síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, diabetes de tipo 1, colitis ulcerosa, enfermedad indiferenciada del tejido conectivo, uveítis, vasculitis, dermatosis vesiculobulosa, vitíligo o granulomatosis de Wegener.

En realizaciones preferidas, la enfermedad pulmonar se selecciona entre una enfermedad pulmonar inflamatoria o restrictiva, una infección del tracto respiratorio, un tumor maligno o benigno del pulmón y/o una enfermedad o afección vascular pulmonar.

Ejemplos

La invención se describe además por los siguientes ejemplos. Estos no pretenden limitar el alcance de la invención. Los ejemplos experimentales se relacionan con el desarrollo de tecnología que permite la expresión de Klotho a partir de MSC modificadas genéticamente. Los ejemplos se relacionan adicionalmente con ensayos en modelos adecuados para someter a ensayo el tratamiento de diversas afecciones médicas.

En realizaciones preferidas, los ejemplos se refieren al desarrollo preclínico de un nuevo producto de terapia génica que combina los múltiples efectos beneficiosos de Klotho en el contexto de la patología con las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimatosas (MSC) humanas primarias para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente.

Preparación de células madre mesenquimatosas humanas:

Se aíslan células humanas de médula ósea por adherencia a plástico y se cultivan en medio de crecimiento, por ejemplo, FBS que contiene DMEM como se describe por Pittinger, M.F. (2008) Mesenchymal stem cells from adult bone marrow, En D.J. Prockop, D. G. Phinney, B.A. Bunnell, Methods in Molecular Biology 449, Mesenchymal stem cells, Totowa: Humana Press). Se aíslan células de ratón de acuerdo con los métodos establecidos. Se conocen en la técnica métodos para el aislamiento de MSC de ratones, por ejemplo, como se describe en Soleimani (Nat Protocol.

2009; 4 (1): 102-6) o Zhu (Nat Protoc. 2010; 5, 550-560).

Generación de vectores para la expresión de Klotho:

Los casetes de expresión transgénica que comprenden un promotor y una región codificante (por ejemplo, ADNc) para la expresión del gen de Klotho humana (longitud completa o forma soluble) se construyen usando técnicas de clonación convencionales como se describen en Julia Lodge, Peter Lund, Steve Minchin (2007) Gene Cloning, Nueva York: Tylor and Francis Group.

Los promotores evaluados durante la evaluación se refieren a los promotores inducibles Tie2, RANTES o el promotor HSP70, o los promotores constitutivos CMV o PGK.

En algunas realizaciones, el gen se fusiona con secuencias de marcadores (por ejemplo, proteínas/péptidos marcadores como el marcador hemaglutinina o el marcador HIS) para permitir la detección fácil de la expresión del transgén de Klotho (Hinrik Garoff, 1985, Annual Review of Cell Biology, Vol. 1: 403-445). En particular, a continuación se describen ejemplos que han implementado la versión de Klotho marcada con hemaglutinina para la detección de la expresión de Klotho.

En algunos ejemplos, el péptido señal del gen Klotho se reemplaza por otras secuencias señal. Además, en algunos ejemplos, pueden emplearse secuencias de genes que estén codificadas para permitir una traducción potenciada. Los ejemplos que incorporan secuencias empleadas de Klotho humana de acuerdo con la SEQ ID NO 2 o 3.

El transgén se inserta después en un sistema de vector adecuado (por ejemplo, vector lentivírico o gamma-retrovírico) mediante técnicas de clonación convencionales. Baum, por ejemplo, describe un vector adecuado (solicitud de Patente EP 1757703 A2). El vector comprende preferentemente un segundo casete transgénico que consiste en un promotor, una secuencia IRES y un gen marcador seleccionable (marcador de superficie celular o gen de resistencia, por ejemplo, el gen pac para conferir resistencia a la puromicina) para permitir el enriquecimiento de células modificadas genéticamente más adelante en el proceso (David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, 2009, Biotechnology: Applying the Genetic Revolution, Londres: Elsevier).

Modificación genética de las células madre mesenquimatosas:

La transducción se realiza con modificaciones como se describen por Murray et al., 1999 Human Gene Therapy.

10(11): 1743-1752 y Davis et al., 2004 Biophysical Journal Volumen 861234-1242. En detalle:

se recubren placas de cultivo celular de 6 pocillos (por ejemplo, Corning) con poli-L-lisina (PLL) (por ejemplo, Sigma-Aldrich, P4707-50ML): La solución de PLL (0,01 %) se diluye a una concentración final de entre el 0,0001 % y el 0,001 % con PBS. Se usan 2 ml de PLL diluida para cada pocillo. La placa se incuba al menos durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavan cuidadosamente con PBS.

Se añade sobrenadante de vector vírico en un volumen final de 2 ml a cada pocillo recubierto con PLL. El número de partículas debe estar entre 2x10e3 y 1x10e6 por pocillo, lo que dará como resultado una multiplicidad de infección de 0,25 y 10. La placa cargada se centrifuga durante 2000x g, 30 min, 4 °C. Después el sobrenadante se desecha y se siembran 1x10e5 células madre mesenquimatosas por pocillo. Las placas se incuban a 37 ° con CO2 al 5 % para su uso posterior.

Análisis de la expresión transgénica en MSC:

Citometría de flujo:

Para demostrar que se expresa la Klotho, se realizan ensayos de citometría de flujo intracelular de MSC. 3 días después de la transducción, el medio de MSC se intercambia con medio que contiene 1 pl de BD Golgi Plug (N.° de cat. 555029) por 1 ml de Medio para enriquecer la Klotho expresada en el aparato de Golgi de las células transducidas.

Las células se incuban durante 16 h a 37 °C y después se inmunotiñen para la expresión del transgén de Klotho. Las MSC se recogen. Las células se permeabilizan usando la solución de permeabilización celular/fijación BD Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson, 554722) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para permitir la tinción intracelular de la proteína Klotho diana.

Se usa un anticuerpo específico de marcador de hemaglutinina marcado con Ficoeritrina (PE) (Milteny, 120-002-687) para la detección de la Klotho expresada. Se tiñen 2x10e5 MSC con 100 pl de anticuerpo (1:75 diluido con solución Perm/lavado, Becton Dickinson, 554723).

Como alternativa, se usan anticuerpos directamente dirigidos contra Klotho de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, ProSci 45-810). Las células teñidas se lavan y se resuspenden en PBS. Las células se analizan después en un citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter).

ELISA para determinar niveles de Klotho en el sobrenadante:

Las MSC transducidas se siembran en placas de 6 pocillos (1x10e5 MSC por pocillo). Las MSC transducidas, que llevan el gen de resistencia a la puromicina pac, se enriquecen mediante la selección de puromicina. Se añade puromicina (3 pg/ml de medio) al medio y las células se cultivan durante un período de 5 días a 37 °C y CO2 al 5 % con intercambios de medio cada 2 días para agotar las células no transducidas del cultivo. A continuación, se usa medio sin puromicina para el cultivo. Las MSC se vuelven a sembrar a un número de células definido de 1x10e5 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se incuban durante 72 h. Se recoge el medio y se usa para el ELISA específico de Klotho para la cuantificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, R&D Systems DY5334-05).

La Klotho expresada en MSC protege a las células de la apoptosis inducida por H2O2:

Los mecanismos de defensa desequilibrados contra los antioxidantes o la sobreproducción o incorporación de radicales libres, conducen a la neurodegeneración, por la que las células neuronales sufren pérdida funcional o sensorial en enfermedades neurodegenerativas. El estrés oxidativo (EO) conduce a un ataque de radicales libres en las células neurales y contribuye a la neurodegeneración; El metabolismo desequilibrado y el exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) generan una diversidad de trastornos tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, envejecimiento y muchos otros trastornos neurodegenerativos (Uttara et al., Curr Neuropharmacol. Marzo de 2009; 7 (1): 65-7). La capacidad de Klotho para proteger las células del daño provocado por especies reactivas de oxígeno representa un modelo terapéutico útil para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

Hay disponibles marcadores de estrés oxidativo en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) y han confirmado la creencia de que la ERC es un estado prooxidante. Estudios recientes sugieren que el vínculo entre el estrés oxidativo y la inflamación en la ERC emerge como un proceso clave que contribuye a la patogenia del estrés oxidativo en estos pacientes (Massy et al., Semin Dial. julio-agosto de 2009; 22 (4): 405-8). La capacidad de Klotho para proteger las células del daño provocado por especies reactivas de oxígeno representa un modelo terapéutico útil para el tratamiento de la enfermedad renal crónica.

Klotho es capaz de proteger las células de los efectos de las especies reactivas de oxígeno:

Se siembran MSC transducidas y seleccionadas (como se ha descrito anteriormente) y MSC de control no transducidas en placas de 6 pocillos (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban 16 h a 37 °C, 5 °C. Las células transducidas y no transducidas se tratan posteriormente con peróxido de hidrógeno (H2O2, Roth, N.° de cat. 8070.2) durante un período de 2-8 h. La concentración final de H²O² en el cultivo está entre 10 y 100 pM. Además, muestras seleccionadas de MSC no se tratan con H²O² y sirven como control. Todas las muestras se tripsinizan para separar la MSC de las placas.

La supervivencia de MSC se determina mediante citometría de flujo. Las muestras se someten al kit Dead Cell Apoptosis (ThermoFisher Scientific, V13241) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El kit permite la detección de células muertas y apoptóticas en las muestras mediante tinción con anexina V Alexa Flúor 488 y yoduro de propidio (PI) (Vermes et al. (1995) Journal of Immunological Methods, Volumen 184, Número 1, Páginas 39-51). Las muestras se analizan por citometría de flujo. Las MSC que expresan Klotho tratadas con H²O² muestra una mayor supervivencia y una apoptosis reducida en comparación con las MSC nativas tratadas con H²O².

La Klotho secretada de MSC transducidas protege las células HUVEC de la apoptosis inducida por H2O2:

Klotho es capaz de proteger las células de los efectos de las especies reactivas de oxígeno:

Las MSC transducidas y seleccionadas (como se ha descrito anteriormente) y las MSC de control no transducidas se siembran en placas de 6 pocillos (50000-200000 células por cm2). Además, muestras seleccionadas de MSC no se tratan con H²O² y sirven como control. Las células se incuban 16-48 h a 37 °C, 5 °C. El sobrenadante se recoge, se filtra (0,25 pm) de las células y se almacena.

Se siembran células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en placas de 6 pocillos (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban durante 16 h a 37 °C para permitir que las células se fijen a las placas. Las células se tratan con peróxido de hidrógeno (H²O² , Roth, N.° de cat. 8070.2). La concentración final de H²O² en el cultivo está entre 10 y 100 pM. Se añaden diferentes diluciones del sobrenadante que contiene Klotho y el sobrenadante de control a las células HUVEC (volumen de 2-4 ml). Las muestras se incuban durante 2-8 h. Todas las muestras se tripsinizan para separar las células HUVEC de las placas.

La supervivencia de las células HUVEC se determina mediante citometría de flujo. Las muestras se someten al kit Dead Cell Apoptosis (ThermoFisher Scientific, V13241) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El kit permite la detección de células muertas y apoptóticas en las muestras mediante tinción con anexina V Alexa Flúor 488 y yoduro de propidio (PI) (Vermes et al. (1995) Journal of Immunological Methods, Volumen 184, Número 1, Páginas 39-51). Las muestras se analizan por citometría de flujo. Las células HUVEC tratadas con sobrenadante de MSC que expresan Klotho muestran una mayor supervivencia y una apoptosis reducida en comparación con las HUVEC no tratadas, cuando se cultivan en presencia de H²O².

La Klotho expresada en MSC aumenta la producción de óxido nítrico (NO) en las MSC:

La producción global de óxido nítrico (NO) disminuye en la enfermedad renal crónica (ERC), lo que contribuye a eventos cardiovasculares y una progresión adicional del daño renal. Es probable que las intervenciones que pueden restaurar la producción de NO reduzcan las complicaciones cardiovasculares de la ERC, así como también disminuyan la tasa de progresión (Baylis, Am J Physiol Renal Physiol. enero de 2008; 294 (1): F1-9). La capacidad de Klotho para restaurar los niveles de NO representa un modelo terapéutico útil para el tratamiento de la enfermedad renal.

Como se analiza en el presente documento, se cree que el óxido nítrico (NO) es un importante neurotransmisor vasoactivo y mediador químico de la erección del pene, por lo que la bioactividad de NO deteriorada es un mecanismo patógeno de la disfunción eréctil. La capacidad de Klotho para restaurar los niveles de NO representa un modelo terapéutico útil para el tratamiento de la disfunción eréctil.

El óxido nítrico (NO) es un mensajero intercelular que realiza una serie de funciones, incluyendo la neurotransmisión, vasodilatación, inhibición de la agregación plaquetaria y modulación de la adhesión de leucocitos. Recientemente se ha demostrado que el NO actúa como una molécula efectora citotóxica potente y desempeña una función importante en la patogenia de la autoinmunidad específica de órganos. El NO también puede modular la respuesta inmunitaria interfiriendo con el equilibrio Th1/Th2 en enfermedades autoinmunitarias (Singh et al., Immunol Res. 2000; 22 (1): 1­ 19). La capacidad de Klotho para restablecer los niveles de NO representa un modelo terapéutico útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Klotho aumenta la producción de NO, un importante mensajero intercelular, en MSC:

Se siembran MSC transducidas y seleccionadas (como se han descrito anteriormente) y MSC de control no transducidas en placas de 6 pocillos (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban durante 48 h a 37 °C/CO² al 5 %.

Para evaluar la producción de NO, se transfieren 100 pl de sobrenadante de cada pocillo de la placa de cultivo a una nueva placa de 96 pocillos. Se añade al sobrenadante la misma cantidad de reactivo de Griess (sulfanilamida al 1 %, diclorhidrato de naftilendiamina al 0,1 % y ácido fosfórico al 2,5 %). Las concentraciones de nitrito en los sobrenadantes se obtienen mediante análisis de regresión lineal de la curva patrón usando diluciones dobles en serie de nitrito de sodio desde 200 mmol/l hasta la 11a dilución. La absorbancia se determina a 540 nm usando un lector de microplacas (Spectramax 190-Molecular Device, Sunnyvale, California). La concentración de NO es mayor en las muestras recogidas de MSC transducidas.

La Klotho secretada de MSC transducidas induce una mayor producción de óxido nítrico en células HUVEC:

Se siembran MSC transducidas y seleccionadas (como se han descrito anteriormente) y MSC de control no transducidas en placas de 6 pocillos (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban durante 48 h a 37 °C/CO² al 5 %. El sobrenadante se recoge, se filtra (0,25 pm) de las células y se almacena.

Se siembran células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en placas de 6 pocillos (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban durante 16 h a 37 °C para permitir que las células se fijen a las placas. Se añaden diferentes diluciones del sobrenadante que contiene Klotho y el sobrenadante de control a las células HUVEC (volumen de 2-4 ml). Las muestras se incuban durante 6-48 h. Para evaluar la producción de NO, se transfieren 100 pl de sobrenadante de cada pocillo de HUVEC de la placa de cultivo a una nueva placa de 96 pocillos. Se añade al sobrenadante la misma cantidad de reactivo de Griess (sulfanilamida al 1 %, diclorhidrato de naftilendiamina al 0,1 % y ácido fosfórico al 2,5 %). Las concentraciones de nitrito en los sobrenadantes se obtienen mediante análisis de regresión lineal de la curva patrón usando diluciones dobles en serie de nitrito de sodio desde 200 mmol/l hasta la 11a dilución. La absorbancia se determina a 540 nm usando un lector de microplacas (Spectramax 190-Molecular Device, Sunnyvale, California). La concentración de NO es mayor en las células HUVEC tratadas con sobrenadante de MSC que expresan Klotho.

La Klotho secretada de MSC transducidas suprime la señalización de TGF-beta en células diana

Se siembran MSC transducidas y seleccionadas (como se han descrito anteriormente) y MSC de control no transducidas en placas de 6 pocillos (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban durante 48 h a 37 °C/CO² al 5 %. El sobrenadante se recoge, se filtra (0,25 pm) de las células y se almacena.

Las células epiteliales renales NRK52E se tratan con los sobrenadantes recogidos durante 30 min y después se estimulan con TGF-beta (10 ng/ml) durante 30 minutos. Las células se lisan y se usan para el análisis por inmunotransferencia. Para detectar la activación de la cascada de señalización de TGF-beta en las células renales, se usa un anticuerpo contra Smad2 fosforilada (pSmad2) o un anticuerpo que reconoció Smad2 independientemente de su estado de fosforilación (Smad2). Un aumento en la fracción de Smad2 fosforilada en comparación con Smad2 total indica la activación de la señalización de TGF-beta. El sobrenadante que contiene Klotho suprime la activación de la señalización de TGF-beta en comparación con las células tratadas con sobrenadantes desprovistos de Klotho o controles no tratados.

La Klotho secretada de MSC transducidas aumenta la señalización de FGF-23 en células diana

Se siembran MSC transducidas y seleccionadas (como se han descrito anteriormente) y MSC de control no transducidas en placas de 6 pocilios (5000-50000 células por cm2). Las células se incuban durante 48 h a 37 °C/CO² al 5 %. El sobrenadante se recoge, se filtra (0,25 |jm) de las células y se almacena.

Se siembran células 293, que expresan el receptor de FGF, en placas de 6 pocillos (5000 células por cm2) y se incuban durante la noche. El medio se intercambia por sobrenadante que contiene Klotho o sin Klotho y las células se incuban durante 30 min. Después se añade FGF23 de ratón (R179Q) (10 ng/ml) y las células se incuban durante 15 min adicionales. Las células se recogen y se lisan usando tampón de lisis (reactivo de extracción de proteína de mamífero M PER) que contiene inhibidores de fosfatasa y proteinasa (cóctel inhibidor de proteasa de detención, sin EDTA (100X)). La señalización de FGF se determina mediante análisis por inmunotransferencia usando anticuerpo anti-fosfo-FRS2a (p-FRS2a), anticuerpo anti-fosfo-ERK1/2 (p-ERK1/2) o anticuerpo anti-ERK1/2 (ERK1). El sobrenadante que contiene Klotho activa la señalización de FGF23 en comparación con las células que se tratan con sobrenadantes desprovistos de Klotho o controles no tratados.

Estudios en modelos animales para determinar la función de Klotho cuando se expresa en MSC transgénicas:

Los experimentos que se describen en el presente documento se basan en el hecho de que los ratones viejos carecen de klotho en el riñón y que la deficiencia de Klotho en ratones viejos puede restablecerse mediante la aplicación i.v. de MSC modificadas con Klotho. En modelos murinos, se emplearon MSC de ratón, obtenidas mediante los métodos descritos anteriormente y se usó la secuencia de Klotho de ratón. Las MSC modificadas con Klotho mejoran la función renal, mejoran la variabilidad de la frecuencia cardíaca y prolongan la esperanza de vida en ratones viejos.

Enfoque experimental:

Se obtienen ratones a la edad de 12-15 meses de Jackson Laboratories. Todos los animales se colocan en jaulas metabólicas una vez a la semana para medir la función renal. Después del sacrificio, se determinará la expresión de klotho en el riñón por inmunohistología.

Se realizan dos Experimentos diferentes en 6 grupos.

Experimento A:

Grupo 1: Se colocan ratones de 12-15 meses de edad en jaulas metabólicas una vez a la semana. No se realizará ningún tratamiento adicional hasta que mueran.

Grupo 2: Se tratan ratones de 12-15 meses de edad con MSC no transducidas (células madre mesenquimatosas que se han obtenido de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad). Reciben 1x106 MSC una vez al mes hasta la muerte. Todos los animales se colocan en jaulas metabólicas una vez a la semana.

Grupo 3: Se tratan ratones de 12-15 meses de edad con MSC modificadas con Klotho (células madre mesenquimatosas que se han obtenido de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, se modifican genéticamente de acuerdo con los protocolos que se describen en el presente documento para expresar klotho transgénica). Reciben 1x106 MSC modificadas con Klotho una vez al mes hasta la muerte. Todos los animales se colocan en jaulas metabólicas una vez a la semana.

Resultados: Los animales del grupo 3 muestran una función renal significativamente mejorada y viven significativamente más tiempo en comparación con los animales de los grupos 1 y 2. La expresión de Klotho en el riñón es significativamente mayor en los animales del grupo 3 que en los otros dos grupos.

Experimento B:

Grupo 1: Se implantan ratones de 12-15 meses de edad con un transmisor ETA-F10 (DSI, St. Paul, MN, EE.UU.). Una vez a la semana se mide el ECG y la variabilidad de la frecuencia cardíaca.

Grupo 2: Se implantan ratones de 12-15 meses de edad con un transmisor ETA-F10 (DSI, St. Paul, MN, EE.UU.). Todos los animales se tratan con MSC no transducidas (células madre mesenquimatosas que se han obtenido de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad). Los ratones tratados reciben 1x106 MSC una vez al mes hasta la muerte. Una vez a la semana se mide el ECG y la variabilidad de la frecuencia cardíaca.

Grupo 3: Se implantan ratones de 12-15 meses de edad con un transmisor ETA-F10 (DSI, St. Paul, MN, EE.UU.). Todos los animales se tratan con MSC modificadas con Klotho (células madre mesenquimatosas que se han obtenido de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, se modifican genéticamente para expresar klotho como se describe en el presente documento). Los ratones tratados reciben 1x106 MSC modificadas con Klotho una vez al mes. Una vez a la semana se mide el ECG y la variabilidad de la frecuencia cardíaca.

Resultados: Los animales del grupo 3 muestran una variabilidad significativa de la frecuencia cardíaca en comparación con los animales de los grupos 1 y 2.

Las MSC que expresan Klotho mejoran la fibrosis renal en un modelo murino

Para inducir la fibrosis renal, se usan ratones 129S1/SvlmJ (de 7-10 semanas de edad). El uréter derecho se expone quirúrgicamente y se liga (obstrucción ureteral unilateral, UUO). Tras la cirugía, los ratones se inyectan por vía intravenosa o intraperitoneal con MSC que expresan Klotho (5 x 10A5 - 2 x10A6 células por ratón) o con PBS. El tratamiento se repite cada 3 días.

Después de 14 días postcirugía, los ratones se sacrifican y el riñón se prepara para la histología. Los marcadores de fibrosis renal, tales como el número de fibroblastos intersticiales, el volumen intersticial, la expresión de colágeno I, aumentan en los animales OUU tratados solo con PBS. Por el contrario, los animales OUU que reciben MSC que expresan Klotho muestran niveles marcadamente disminuidos de fibrosis renal.

Estudios en modelos animales para determinar la función de Klotho cuando se expresa en MSC transgénicas en la enfermedad de Alzheimer (EA):

Los siguientes ejemplos describen enfoques que demuestran que las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal inducen la maduración de células progenitoras oligodendrocíticas (OPC), las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal aumentan el número de oligodendrocitos totales, las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal mejoran la mielinización de los oligodendrocitos, las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal reducen las placas en un modelo de ratón de ratones transgénicos dobles APPswe/PS1(M146V), las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal restablecen la cognición en un modelo de ratón de ratones transgénicos dobles APPswe/PS1(M146V), las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal inducen la recuperación del comportamiento elevando los niveles de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en los cerebros de ratones transgénicos dobles APPswe/PS1(M146V), y que las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal promueven la activación de microglía que secreta agentes neurotróficos y da como resultado mejoras cognitivas y una reducción en la patología Ap en ratones transgénicos dobles APPswe/PS1(M146V).

Configuración experimental

Se emplean tres cepas de ratón diferentes (C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax, C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax, B6;129-Psenltm lMpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax) que se asemejan a la enfermedad de Alzheimer.

Se realizarán tres experimentos diferentes en 18 grupos.

Experimento A:

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar klotho. Se inyectan 1x106 MSC-Klotho por vía intravenosa una vez al mes.

Ratones Grupo 1C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 2C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 3B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax

Los ratones se inyectan con solución salina por vía intravenosa una vez al mes.

Ratones Grupo 4C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 5C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 6B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax

Se inyectan 1x106 de células madre mesenquimatosas no transducidas de animales jóvenes (de 6 semanas de edad) por vía intravenosa en los ratones una vez al mes.

Ratones Grupo 7C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 8C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 9B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax

Los ensayos cognitivos se realizan una vez a la semana durante un período de 3 meses.

Resultados: Los animales de los grupos 1-3 muestran una mejora significativa de la atención, el aprendizaje y la memoria en comparación con los animales de los grupos 4-6 y los grupos 7-9.

Experimento B:

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar klotho. Se inyectan 1x106 MSC-Klotho por vía intratecal una vez al mes.

Ratones Grupo 1C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 2C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 3B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax

Los ratones se inyectan con solución salina por vía intratecal una vez al mes

Ratones Grupo 4C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 5C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 6B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax

Se inyectan 1x106 de células madre mesenquimatosas no transducidas de animales jóvenes (de 6 semanas de edad) por vía intravenosa en los ratones una vez al mes.

Ratones Grupo 7C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 8C3B6-Tg(APP695)3Dbo/Mmjax

Ratones Grupo 9B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax

Se sacrificarán tres animales de cada grupo cada semana durante 3 meses. Se realizará inmunohistoquímica, microscopía electrónica, HPLC, PCR-TIc y transferencia Western de tejido cerebral.

Resultados: Los animales de los grupos 1-3 muestran una mejora significativa en la maduración de células progenitoras oligodendrocíticas (OPC), un mayor número de oligodendrocitos totales, una mielinización mejorada de los oligodendrocitos, placas de Ap reducidas, una elevación de los niveles de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), en comparación con los animales de los grupos 4-6 y los grupos 7-9.

Estudios en modelos animales para determinar la función de Klotho cuando se expresa en MSC transgénicas en la esclerosis múltiple (EM):

Los siguientes ejemplos describen enfoques que demuestran que las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal inducen la maduración de células progenitoras oligodendrocíticas (OPC), las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal aumentan el número de oligodendrocitos totales, las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal mejoran la mielinización de los oligodendrocitos, Las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal reducen la inflamación y esas MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal reducen el número de linfocitos T y B activados en el cerebro de pacientes con EM.

Configuración experimental:

Se usa un modelo en ratón de encefalomielitis autoinmunitaria (EAE). Se inmunizan ratones C57BL/6 (H-2b) con proteína de oligodendrocitos de mielina (MOG^35-55).

Se realizan dos Experimentos diferentes en 6 grupos.

Experimento A:

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar klotho. Se inyectan 1x106 MSC-Klotho por vía intravenosa una vez a la semana.

Grupo 1C57BL/6 (H-2b) inmunizado con (MOG^35-55)

A los ratones se les inyecta solución salina por vía intravenosa una vez a la semana

Grupo 2C57BL/6 (H-2b) inmunizado con (MOG^35-55)

Se inyectan 1x106 de células madre mesenquimatosas no transducidas de animales jóvenes (de 6 semanas de edad) por vía intravenosa en los ratones una vez al mes.

Grupo 3C57BL/6 (H-2b) inmunizado con (MOG^35-55)

Experimento B:

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar klotho. Se inyectan 1x106 MSC-Klotho por vía intratecal una vez a la semana.

Grupo 4C57BL/6 (H-2b) inmunizado con (MOG^35-55)

A los ratones se les inyecta solución salina por vía intratecal una vez a la semana.

Grupo 5C57BL/6 (H-2b) inmunizado con (MOG^35-55)

Se inyectan 1x106 de células madre mesenquimatosas no transducidas de animales donantes jóvenes (de 6 semanas de edad) por vía intratecal en los ratones una vez al mes.

Grupo 6C57BL/6 (H-2b) inmunizado con (MOG^35-55)

Todos los animales de los grupos 1-6 se siguen diariamente para determinar la parálisis que comienza en la cola y las extremidades posteriores y progresa a las extremidades anteriores con pérdida de peso simultánea. Una vez a la semana se sacrifican 3 animales de cada grupo y se realiza inmunohistoquímica, microscopía electrónica, HPLC, PCR-TIc y transferencia Western de tejido cerebral.

Estudios en modelos animales para determinar la función de Klotho cuando se expresa en MSC transgénicas en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA):

Los siguientes ejemplos describen enfoques que demuestran que las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal inducen la maduración de células progenitoras oligodendrocíticas (OPC), las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal aumentan el número de oligodendrocitos totales, las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal mejoran la mielinización de los oligodendrocitos, las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal reducen la degeneración axónica, las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa o intratecal inhibirán la señalización de Wnt.

Configuración experimental:

Se utilizan ratones SOD1 (G93A). Se realizarán dos experimentos diferentes en 6 grupos.

Experimento A:

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar klotho. Se inyectan 1x106 MSC-Klotho por vía intravenosa una vez a la semana.

Grupo 1SOD1 (G93A)

A los ratones se les inyecta solución salina por vía intravenosa una vez a la semana

Grupo 2SOD1 (G93A)

Se inyectan 1x106 de células madre mesenquimatosas no transducidas de animales jóvenes (de 6 semanas de edad) por vía intravenosa en los ratones una vez al mes.

Grupo 3SOD1 (G93A)

Experimento B:

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar klotho. Se inyectan 1x106 MSC-Klotho por vía intratecal una vez a la semana.

Grupo 4SOD1 (G93A)

A los ratones se les inyecta solución salina por vía intratecal una vez a la semana. Grupo 5 SOD1 (G93A) Se inyectan 1x106 de células madre mesenquimatosas no transducidas de animales donantes jóvenes (de 6 semanas de edad) por vía intratecal en los ratones una vez al mes.

Grupo 6SOD1 (G93A)

Una vez a la semana se sacrifican 3 animales de cada grupo y se recogerá el cerebro y la médula espinal. Se realizará inmunohistoquímica, microscopía electrónica, HPLC, PCR-TIc y transferencia Western de cerebro y médula espinal.

Estudios en modelos animales para determinar la función de Klotho cuando se expresa en MSC transgénicas en la diabetes de tipo 1

Los siguientes ejemplos describen enfoques que demuestran que las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa retrasan la aparición de diabetes de tipo 1 en ratones.

Configuración experimental:

Para evaluar el efecto de KIotho-MSC en el desarrollo de diabetes in vivo, se realiza un modelo de ratón diabetes de tipo 1 acelerada por ciclofosfamida (adaptado de Brode et al., The Journal of Immunology 2006). Se obtienen ratones NOD, donde la incidencia de la diabetes en ratones hembra es de un 75 % a las 40 semanas de edad. Para acelerar y sincronizar la diabetes, se tratan ratones NOD hembra de 8 semanas de edad con una única inyección i.p. de ciclofosfamida (CY) (200 mg/kg de peso corporal en solución salina normal al 0,9 %). Los ratones después se dividieron aleatoriamente en grupos de tratamiento y de control.

De uno a cinco días después del tratamiento con ciclofosfamida, cada animal recibe 200 pl de PBS por inyección intravenosa o intraperitoneal. Los ratones se controlan semanalmente para determinar la hiperglucemia hasta que llegan a ser diabéticos, definida por dos niveles consecutivos (con >24 h de diferencia) de glucosa en sangre no en ayunas >240 mg/dl.

Grupo 1NOD después del tratamiento con ciclofosfamida

De uno a cinco días después del tratamiento con ciclofosfamida, el animal recibe 200 pl de 1x106 MSC (de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad) en 200 pl de PBS por inyección intravenosa o intraperitoneal. Los ratones se controlan semanalmente para determinar la hiperglucemia hasta que llegan a ser diabéticos, definida por dos niveles consecutivos (con >24 h de diferencia) de glucosa en sangre no en ayunas >240 mg/dl.

Grupo 2 NOD después del tratamiento con ciclofosfamida

Se modifican genéticamente células madre mesenquimatosas de animales donantes jóvenes, de 6 semanas de edad, para expresar Klotho. De uno a cinco días después del tratamiento con ciclofosfamida, el animal recibe 1x106 Klotho-MSC en 200 pl de PBS por inyección intravenosa o intraperitoneal. Los ratones se controlan semanalmente para determinar la hiperglucemia hasta que llegan a ser diabéticos, definida por dos niveles consecutivos (con >24 h de diferencia) de glucosa en sangre no en ayunas >240 mg/dl.

Grupo 3 NOD después del tratamiento con ciclofosfamida

Los ratones del grupo 1 desarrollan diabetes a los 30 días, mientras que la aparición de diabetes en ratones tratados con MSC (grupo 2) o Klotho-MSC (grupo 3) se retrasa. Curiosamente, para los ratones del grupo 3, el retraso en el desarrollo de la diabetes aumenta en 2 semanas en comparación con el grupo 2.

Estudios en modelos animales para determinar la función de Klotho cuando se expresa en MSC transgénicas en la diabetes de tipo 2

Los siguientes ejemplos describen enfoques que demuestran que las MSC-Klotho administradas por vía intravenosa mejorarán el metabolismo de glucosa en diabetes de tipo 2 en ratones. Un modelo similar se describe en Chen et al. (J Diabetes Research, 2015, Art ID 796912).

Configuración experimental:

Se alimentan ratones C57BL/6 con una dieta convencional (DC) o alta en grasas (DAG). Después de 4 semanas, los ratones se dividen en 6 grupos

Grupo 1: Ratones alimentados con DC reciben solución salina por vía intravenosa una

vez a la semana durante 8 semanas

Grupo 2: Ratones alimentados con DAG reciben solución salina por vía intravenosa

una vez a la semana durante 8 semanas

Ratones alimentados con DC reciben 1x106 MSC una vez a la semana

Grupo 3:

durante 8 semanas

Grupo 4: Ratones alimentados con DAG reciben 1x106 MSC una vez a la semana

durante 8 semanas

Grupo 5: Ratones alimentados con DC reciben 1x106 MSC-Klotho una vez a la semana

durante 8 semanas

Grupo 6: Ratones alimentados con DAG reciben 1x106 MSC-Klotho una vez a la

semana durante 8 semanas

Los ratones de los grupos 4 y 6 muestran un metabolismo de glucosa mejorado (hiperglucemia, hiperinsulinemia, peso corporal y/o masa de células beta) en comparación con los ratones del grupo 2.

Las Klotho-MSC (grupo 6) muestran un metabolismo de glucosa mejorado adicionalmente en comparación con ratones

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente, en la que dicha célula madre comprende un ácido nucleico exógeno que comprende una región codificante de Klotho unida operativamente a un promotor o una combinación de promotor/potenciador, en la que la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente presenta una expresión aumentada de Klotho en comparación con una célula madre mesenquimatosa no modificada.

2. La célula modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico exógeno comprende un vector vírico, más preferentemente un vector retrovírico.

3. La célula modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el promotor es un promotor constitutivo, en la que el promotor constitutivo es preferentemente el promotor EFS, PGK o EF1 alfa.

4. La célula modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula comprende adicionalmente (iii) un gen marcador de selección unido operativamente a (iv) un promotor constitutivo o una combinación de promotor/potenciador.

5. La célula modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la región codificante de Klotho codifica una proteína de acuerdo con una de las SEQ ID NO 6 a 10, en la que la región codificante de Klotho preferentemente comprende o consiste en una secuencia de acuerdo con las SEQ Id NO 1 a 5.

6. La célula modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la región codificante de Klotho codifica una forma secretada de la proteína Klotho.

7. La célula modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente presenta una expresión aumentada de una forma secretada de proteína Klotho en comparación con una célula madre mesenquimatosa no modificada, en la que la forma secretada de la proteína Klotho comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 80 %, preferentemente de al menos un 90 %, con respecto a la SEQ ID NO 8, o una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 8.

8. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como medicamento.

9. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación anterior, en la que dicha célula se administra mediante la introducción de un número terapéuticamente eficaz de dichas células en el torrente sanguíneo de un paciente, mediante la introducción de un número terapéuticamente eficaz de dichas células por vía subcutánea, o en la que dicha célula se administra por vía intratecal.

10. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en la que dicha célula se administra en múltiples eventos de administración, por ejemplo, al menos una vez al mes, preferentemente durante un período de tiempo de 3 meses, preferentemente al menos una vez a la semana.

11. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como medicamento en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.

12. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como medicamento en el tratamiento de cáncer, enfermedad renal, arterioesclerosis, diabetes mellitus, disfunción eréctil, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades autoinmunitarias, una enfermedad inflamatoria del pulmón, sepsis y/o demencia.

13. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como medicamento en el tratamiento de fibrosis de órganos.

14. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento en el tratamiento de cáncer, fibrosis de órganos, insuficiencia renal, arteriesclerosis, demencia, diabetes mellitus y enfermedades autoinmunitarias, enfermedades relacionadas con la autoinmunidad o enfermedades pulmonares de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dichas células se administran mediante la introducción de un número terapéuticamente eficaz de células mediante inhalación, inyección endoscópica de tejido, inyección de tejido mediada por catéter, inyección de líquido cefalorraquídeo, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intramuscular, opcionalmente en combinación con la introducción de dicha célula en el torrente sanguíneo de un paciente.

15. La célula madre mesenquimatosa modificada genéticamente para su uso como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14,

a) en la que el sujeto es humano; y/o

b) en la que dicha célula modificada genéticamente es alógena con respecto al sujeto; y/o c) en la que dicha célula modificada genéticamente es autóloga con respecto al sujeto.